WO2010146210A1 - Composición fotoprotectora - Google Patents

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WO2010146210A1
WO2010146210A1 PCT/ES2010/070397 ES2010070397W WO2010146210A1 WO 2010146210 A1 WO2010146210 A1 WO 2010146210A1 ES 2010070397 W ES2010070397 W ES 2010070397W WO 2010146210 A1 WO2010146210 A1 WO 2010146210A1
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WO
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imidazole
diphenyl
compound
nitrophenyl
skin
Prior art date
Application number
PCT/ES2010/070397
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English (en)
French (fr)
Inventor
Juan Pablo Pivel Ranieri
Juan Manuel Ferrer Cuesta
Diego Fort
Carlos Tabarez
Patrick Moyna
Original Assignee
Apoteknos Para La Piel, S.L.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/64—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms, e.g. histidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A61K8/494—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with more than one nitrogen as the only hetero atom
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    • A61K8/4946—Imidazoles or their condensed derivatives, e.g. benzimidazoles
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D235/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings
    • C07D235/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings condensed with carbocyclic rings or ring systems

Definitions

  • the present invention relates to a photoprotective composition useful for preventing or minimizing the harmful effects produced by solar radiation on the skin or hair.
  • the electromagnetic radiation emitted by the sun is directly responsible for the harmful effects of the sun on the skin and hair. Its consequences at the skin level depend on multiple factors, mainly the type of radiation (wavelength, exposure time and level of skin penetration), skin phototype and individual susceptibility. Likewise, the solar radiations that reach the earth depend on various factors such as latitude, altitude above sea level, time of year, time of day, thickness of the ozone layer, etc.
  • the region of the electromagnetic spectrum called near-visible ultraviolet can in turn be divided into four regions (UVC, UVB, UVA and near visible), the characteristics of which are described below.
  • UVC rays (200-280 nm) emitted by the sun constitute ultraviolet radiation with a higher energy content.
  • this radiation is not dangerous since UVC solar rays seep through the ozone layer in the stratosphere, not reaching the earth's surface.
  • UVB radiation (280-320 nm), with an intermediate energy between the rays
  • UVC and UVA rays reach the earth's surface quite filtered. This type of radiation penetrates the skin little and causes direct damage to the DNA. They are responsible for example of burns, erythema, increased skin thickness and skin cancer.
  • UVA rays can be divided into two types of radiation: UV A2 (320-340 nm) and UVAl (340-400 nm). They are responsible for pigmentation immediate skin and tanning delay. Although they have less energy than UVB radiation, they are also susceptible to inducing an alteration of the skin, especially in the case of a sensitive skin or a skin continuously exposed to solar radiation. In this sense, the UVA radiation emitted by the sun is permanent, since it is poorly filtered. On the other hand, it does not produce an alarm signal (erythema), so its effect is not noticed in the first instance.
  • UVA rays are associated with indirect damage to DNA, since in the presence of photosensitizers, both endogenous and environmental, generate reactive oxygen species, such as singlet or free radicals, whose oxidizing action with oxygen from the air It is very powerful. UVA rays penetrate the deepest layers of the skin and are responsible, for example, for photocarcinogenesis and photoaging.
  • the hair fiber As with the skin, solar radiation aggregates the hair fiber, alternating it from the surface (cuticle) to the heart (cortex). Ultraviolet and visible near radiation damage the intercellular cement, which ensures the cohesion of the scales that protect the hair. As a result, it loses its strength, solidity, shine and softness.
  • the hair fiber When the cuticle is damaged, the hair fiber has no protection against external agents and undergoes deeper changes in the cortex: on the one hand, the keratin degrades causing the hair to become more fragile and the ends to open ; on the other, melamine is also altered causing distortions in the original color.
  • UVA-UVB ultraviolet radiation
  • near visible radiation represent a serious danger. Therefore, it is desirable that the three types of radiation be filtered, thus avoiding their harmful effects on the skin and hair.
  • photoprotective compositions that absorb UVA and UVB rays as a whole, commonly referred to as broad-spectrum photoprotective compositions (Pathak MA, "Sunscreens: Progress and perspectives on photoprotection of human skin against UVB and UVA radiation” , J Dermatol 1996, 23 (11), 783-800; Gilaberte Y, Coscojuela C, Saenz de Santamar ⁇ a MC, González S, "Photoprotectors", Proceedings Dermosifiliogr 2003, 94 (5), 271-293).
  • Said broad spectrum compositions comprise different molecules to be able to filter a wide range of wavelengths.
  • the trademark registered as Helioplex® contains avobenzone, which is a photoprotector of UVA radiation, and oxybenzone, which is a photoprotector of the UVB radiation, also showing some absorbance in the UVA region.
  • broad-spectrum photoprotective compositions have not paid attention to near visible radiation.
  • its photostability is poorly described, and, in addition, there is evidence that its components are hormonal disruptors. Therefore, it would be desirable to develop new photoprotective compositions that do not exhibit these drawbacks.
  • the lophine (2,4,5-triphenylimidazole) can be prepared by heating hydrobenzamide about 300 0 C.
  • the lophine and its derivatives are chemiluminescent, ie they cause the emission of light by a chemical reaction at temperatures low.
  • the oxidation of lofine leads to the formation of an excited compound that decomposes by emitting light (Philbrook, GE Photochemisty and Photobiology 1965, 4, 1175-1183).
  • the authors of the present invention have developed new cosmetic and / or pharmaceutical compositions intended for photoprotection of the skin and / or hair against solar radiation, in particular against ultraviolet radiation and near visible radiation.
  • the present invention is directed to said photoprotective compositions as well as their use in the aforementioned cosmetic and / or pharmaceutical application. More particularly, the present invention relates to photoprotective compositions that absorb both the near A-visible UV region and the UVB region comprising at least one derivative of the fine of formula (I).
  • Some of said compounds of formula (I) are soluble in polar solvents, which facilitates their galenic formulation.
  • its low chemical reactivity and its low decomposition by the action of light give stability to the photoprotective composition.
  • the compounds of formula (I) do not have estrogenic activity, whereby the photoprotective composition can be used in subjects at risk of hormonal disruption.
  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising (i) a compound A that primarily absorbs in the region of the nearby visible UVA and (ii) a compound B that primarily absorbs in the UVB region, wherein at least one of said compounds A or B is a compound of formula (I)
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 independently of each other represent, H, OH, ORa, NH 2 , NHRa, NRaRb, NO 2 or halogen; where Ra and Rb independently of each other represent C 1 -C 10 alkyl; Y
  • R 5 and R 6 independently of each other represent, H, or R 5 and R 6 together form a CC bond between the carbon atoms to which they are attached.
  • the invention relates to a compound of formula (I ")
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 independently of each other represent the values defined for formula (I).
  • the invention relates to the use of a compound of formula (I), as defined above, in the preparation of a photoprotective composition or composition of the invention.
  • the invention in another aspect, relates to a method of cosmetic treatment to protect the skin or hair from solar radiation or to prevent or minimize the harmful effects produced by solar radiation on the skin or hair, which comprises applying on the skin. skin or hair an effective amount of a composition, as defined above.
  • FIG 1 Emission spectrum of the UVB light bulb used during exposure in photoprotection tests (figure provided by the manufacturer).
  • Figure 2 Detector response spectrum used to determine the dose applied in photoprotection tests (figure provided by the manufacturer).
  • Figure 3 Photographs showing the appearance of the skin on the back of mice on which 0.5% p-nitrolophine has been applied, exposed to UVB. The product application area is indicated by an arrow.
  • Figure 4 Photographs showing the appearance of the skin on the backs of mice on which 0.5% m-nitrolophine has been applied, exposed to UVB. The product application area is indicated by an arrow.
  • Figure 5 Photographs showing the appearance of the skin on the back of mice on which 4% methylbenzylidene camphor (P5000) has been applied, exposed to UVB.
  • the product application area is indicated by an arrow.
  • FIG. 6 Photographs showing the appearance of the skin on the back of mice on which 0.5% butyl methoxybenzoylmethane (P1789) has been applied, exposed to UVB. The product application area is indicated by an arrow.
  • Figure 7 Comparative UV-visible absorption spectrum of p-nitrolophine
  • Figure 8 Comparative UV-visible absorption spectrum of m-nitrolophine (MNLof) (black triangle), 4-methylbenzylidene camphor (Parsol 5000) (black square) and butyl methoxy dibenzoylmethane (Parsol 1789) (black circle).
  • Figure 9 UV-visible absorption spectrum of sterile thin.
  • Figure 10 Representation in the study of the anti-inflammatory properties of the average and SEM of the difference in weight between the right ear and the left ear for each group of mice: positive control (A), negative control (B) (indomethacin treatment 0 , 5 mg), treatment with 0.5 mg of p-nitrolophine (C) and treatment with 1 mg of p-nitrolophine (D).
  • A positive control
  • B negative control
  • C treatment with 0.5 mg of p-nitrolophine
  • D p-nitrolophine
  • the present invention describes photoprotective compositions useful for absorbing UVB (280-320 nm) and near A-visible UV radiation (320-450 nm).
  • UVB 280-320 nm
  • A-visible UV radiation 320-450 nm
  • the wavelength ranges expressed in the present invention to differentiate the different types of radiation correspond to approximate values, commonly accepted in the state of the art.
  • the term "sunscreen” refers to a compound that, chemically or physically, absorbs or blocks some type of ultraviolet and / or visible near radiation, both from the sun and other natural or artificial sources.
  • “Complementary” sunscreen is any sunscreen whose chemical formula is different from formula (I).
  • photoprotective composition refers to a cosmetic and / or pharmaceutical composition intended for photoprotection of the skin and / or hair against nearby ultraviolet-visible radiation.
  • composition of the invention comprises (i) a compound A that mainly absorbs in the near visible A-UV region and (ii) a compound B that mainly absorbs in the UVB region, wherein at least one of said compounds A or B is a compound of formula (I), as described above.
  • a compound that mainly absorbs in the near A-visible UV or UVB region refers to a compound that has a maximum absorption in the near A-visible UV or UVB region, respectively. This fact does not imply that said compound also has absorption in other regions.
  • Y, R 5 R 5 R 5 R 5 R and R represent the values defined for formula (I).
  • a procedure for preparing microwave-assisted lofin, as well as references to other synthesis protocols, are shown in: Crouch et al., "Microwave-Mediated Synthesis of Lophine: Developing a Mechanism to Explain a Product", Journal of Chemical Education 2006 , 83, 1658-1660.
  • the composition of the invention comprises a single compound of formula (I).
  • the composition of the invention comprises two or more compounds of formula (I).
  • said compound (s) of formula (I) is selected from the group consisting of:
  • the composition of the invention comprises at least one compound of formula (I) selected from 2- (3-nitrophenyl) -4,5-diphenyl-lH-imidazole, 2- (4-nitrophenyl) -4,5-diphenyl-lH-imidazole, 2- [4- (N, N-dimethylamino) phenyl] -4,5-diphenyl-lH-imidazole, (E) -2-styryl-4,5-diphenyl- lH-imidazole, (E) -2- (4-nitrostyryl) -4,5-diphenyl-lH-imidazole, 2,4,5-tris (4-nitrophenyl) -lH-imidazole, 2- (4-nitrophenyl) -lH- phenanthro [9,10-d] imidazole, and mixtures thereof.
  • formula (I) selected from 2- (3-nitrophenyl) -4,5-diphenyl-lH-imidazole, 2- (4
  • the compound of formula (I) is a compound of formula (F)
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 independently of each other represent, H, OH, ORa, NH 2 , NHRa, NRaRb, NO 2 or halogen; where Ra and Rb independently of each other represent Ci-Cio alkyl.
  • the compound of formula (I) is a compound of formula (I ")
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 independently of each other represent, H, OH, ORa, NH 2 , NHRa, NRaRb, NO 2 or halogen; where Ra and Rb independently from each other represent C1-C10 alkyl; Y R 5 and R 6 , independently of each other represent, H, or R 5 and R 6 together form a CC bond between the carbon atoms to which they are attached.
  • the composition of the invention comprises at least one compound of formula (I) that mainly absorbs near visible A-UV radiation.
  • said compound (s) A of formula (I) is selected from 2- (4-nitrophenyl) -4,5-diphenyl-lH-imidazole, 2- [4- (N, N-dimethylamino) fenü] -4,5- diphenyl-lH-imidazole, (E) -2-styryl-4,5-diphenyl-lH-imidazole, (E) -2- (4-nitro-styryl) -4.5 - diphenyl-lH-imidazole, 2,4,5-tris (4-nitrophenyl) -lH-imidazole, 2- (4-nitrophenyl) -lH- phenanthro [9,10-d] imidazole, and mixtures thereof.
  • the composition of the invention comprises at least one compound of formula (I) that mainly absorbs UVB radiation.
  • said compound (s) B of formula (I) is selected from 2,4,5-triphenyl-lH-imidazole, 2- (4-hydroxyphenyl) -4,5-diphenyl- lH-imidazole, 2- (4-methoxyphenyl) -4,5-diphenyl-lH-imidazole, 2- (3-nitrophenyl) -4,5-diphenyl-lH-imidazole, 2- (4-chlorophenyl) -4, 5- diphenyl-lH-imidazole, 2- (4-fluorophenyl) -4,5-diphenyl-lH-imidazole, and mixtures thereof.
  • the composition of the invention comprises, at least, a compound of formula (I) that mainly absorbs near A-visible UV radiation and, at least, a compound of formula (I) that mainly absorbs UVB radiation.
  • said compound (s) A and B of formula (I) are selected respectively from:
  • B general formula (I) selected from 2,4,5-triphenyl-lH-imidazole, 2- (4-hydroxyphenyl) -4,5-diphenyl-lH-imidazole, 2- (4-methoxyphenyl) ) -4,5- diphenyl-lH-imidazole, 2- (3-nitrophenyl) -4,5-diphenyl- 1 H-imidazole, 2- (4- chlorophenyl) -4,5-diphenyl-lH-imidazole, 2 - (4-fluorophenyl) -4,5-diphenyl-lH-imidazole, and mixtures thereof.
  • B general formula (I) selected from 2,4,5-triphenyl-lH-imidazole, 2- (4-hydroxyphenyl) -4,5-diphenyl-lH-imidazole, 2- (4-methoxyphenyl) ) -4,5- diphenyl-lH-imidazole, 2- (3-nitrophenyl) -4,5
  • Preferred compounds of formula (I) in the composition of the invention are those where R 1 , R 2 , R 3 and R 4 , independently of each other represent, H, OH, OMe, NH 2 , NHMe, NMe 2 , NO 2 , fluorine or chlorine
  • composition of the invention in addition to at least one compound of formula (I), may comprise a complementary sunscreen.
  • Said complementary sunscreen is optional when the composition of the invention comprises a compound of formula (I) that absorbs in the near A-visible UV region and another compound of formula (I) that absorbs in the UVB region.
  • the presence of a complementary sunscreen is necessary when the compound or compounds of formula (I) included in the composition only absorb in a certain region, such that said sunscreen covers the other region, thus offering protection in both regions
  • UVA filters mainly absorb radiation in the region between 320 and 400 nm of the spectrum.
  • UVA filters that can act as complementary sunscreens in the composition of the present invention are for example: benzophenones, camphor derivatives, dibenzoylmethane derivatives, anthranilates, bisimidazilate.
  • UVB filters mainly absorb radiation in the region between 280 and 320 nm of the ultraviolet spectrum.
  • UVB filters that can act as complementary sunscreens in the composition of the present invention are for example: 1,3,5-triazines, cinnamates, p-aminobenzoic acid (PABA) and its derivatives, salicylates, camphor derivatives, benzimidazole and their derivatives, octocrylene and urocanic acid.
  • PABA p-aminobenzoic acid
  • Physical sunscreens correspond to photoprotective agents, such as pigments or nanopigments of metal oxides capable of physically blocking, by diffusion and / or reflection, UV radiation, both of type A and B, and near visible.
  • Examples of physical sunscreens that can act as complementary sunscreens in the composition of the present invention are oxides of titanium, zinc, iron, zirconium, cerium and mixtures thereof, optionally coated. These physical sunscreens have been used in the state of the art in different suspensions and particle sizes. The following reference offers an extensive review of physical sunscreens: "Sun Protection Effect of Nonorganic Materials" S. Nakada & H.
  • complementary sunscreens that can be formulated in the compositions of the present invention include 1,3,5-triazines, cinnamates, p-aminobenzoic acid (PABA) and its derivatives, salicylates, camphor derivatives, benzimidazole and its derivatives, octocrylene, urocanic acid, benzophenones, dibenzoylmethane derivatives, anthranilates, bisimidazylate, anisotriazine, drometrizol trisiloxane, methylene bisbenzotriazolyl tetramethylbutylphenol, titanium dioxide, zinc oxide, and mixtures thereof.
  • PABA p-aminobenzoic acid
  • salicylates camphor derivatives
  • benzimidazole and its derivatives octocrylene
  • urocanic acid benzophenones, dibenzoylmethane derivatives, anthranilates, bisimidazylate, anisotri
  • said complementary sunscreen is selected from: p-aminobenzoic acid (PABA), camphor benzalkonium methosulfate, salicylic acid ester and 3,3,5-trimethylcyclohexanol (homosalate), benzophenone-3, 2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonic acid (potassium salt, sodium salt and triethane lamina) terephthalene dicanfor sulfonic acid and salts, butyl methoxy dibenzoylmethane, benzylidene camphor sulfonic acid and salts, octocrylene, camphor benzylidene polyacrylamide methyl, octyl methoxycinnamate,
  • PABA p-aminobenzoic acid
  • camphor benzalkonium methosulfate salicylic acid ester and 3,3,5-trimethylcyclohexanol (homosalate)
  • benzophenone-3
  • PEG-25 PABA isoamyl p-methoxycinnamate, octyl triazone, drometrizol trisiloxane, di-octyl butamide triazone,
  • compositions of the invention are formulated in a topical administration form.
  • Such forms of administration can be both liquid and semi-solid.
  • suitable topical liquid administration forms are: liniment, lotion and the like.
  • Suitable forms of administration by topical semi-solid route are: emulsion, cream, milk, gel, gel-cream, suspension, foam, powder, ointment, ointment, paste, plaster and the like.
  • Preferred topical administration forms include an oil-in-water emulsion, a water-in-oil emulsion and an alcoholic solution.
  • sunscreens included in the composition of the invention are typically in an amount between about 0.01% and about 10%, and preferably, between about 0.1% and about 5%, by weight of the composition.
  • composition of the invention typically comprises a cosmetic and / or pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • a cosmetic and / or pharmaceutically acceptable carrier or excipient is one, for cosmetic and / or pharmaceutical use, which is physiologically tolerable and does not normally cause an allergic reaction or a similar adverse reaction when administered to animals, more particularly humans.
  • the choice of these ingredients is a routine task for the person skilled in the art that depends on the type of product in which the composition is formulated.
  • a fatty body an organic solvent, a thickener (ionic or non-ionic), a softener, an antioxidant, an opacifier, a stabilizer, an emollient, an anti- agent foam, a moisturizing agent, a vitamin, a flavoring agent, a preservative, a surfactant, a dye, a sequestrant, an alkalizing agent, an acidifying agent, and mixtures thereof.
  • the invention relates to a compound of formula (I ")
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 independently of each other represent, H, OH, ORa, NH 2 , NHRa, NRaRb, NO 2 or halogen; where Ra and Rb independently from each other represent C1-C10 alkyl; Y
  • R 5 and R 6 independently of each other represent, H, or R 5 and R 6 together form a CC bond between the carbon atoms to which they are attached.
  • Preferred compounds of formula (I ") are those where R 1 , R 2 , R 3 and R 4 , independently of each other represent, H, OH, OMe, NH 2 , NHMe, NMe 2 , NO 2 , fluorine or chlorine.
  • Compounds of formula (I ") even more preferred are those where R 1 , R 2 , R 3 and R 4 , independently of each other, represent H, NMe 2 or NO 2 .
  • Particular examples of preferred compounds of formula (I ") include (E) -2-styryl-4,5-diphenyl-lH-imidazole and (E) -2- (4-nitrostyryl) -4,5-diphenyl-lH- imidazole.
  • the compounds of formula (I ") have a conjugated double bond between the imidazole central ring and a phenyl. This increase in electronic delocalization favors absorption at ⁇ greater, that is, more towards the visible one. In this sense, the compounds of formula (I ") are especially useful for achieving a batochromic effect, thus providing photoprotection at longer wavelengths compared to compounds that do not exhibit said conjugated double bond.
  • the invention relates to the use of a compound of formula (I), as defined above, in the preparation of a photoprotective composition.
  • the compound of formula (I) used in the preparation of the photoprotective composition is selected from the group consisting of:
  • the invention relates to a compound of formula (I) for use in photoprotection.
  • the compound of formula (I) can be used in the preparation of a photoprotective composition in combination with another or other compounds of formula (I), as well as with one or more complementary sunscreens.
  • the photoprotective composition comprising at least one compound of formula (I) is used to protect the skin or hair from solar radiation.
  • the harmful solar radiation that reaches the earth is composed of UVB, UVA and near visible radiation. Therefore, the photoprotective composition of the invention is useful for protecting the skin or hair from ultraviolet radiation of type A and B and visible near the sun.
  • the use of the photoprotective composition of the invention is not only limited to solar radiation, but also includes other types of radiation of both natural and artificial origin comprising UVB, UVA and / or visible near rays.
  • sources of artificial radiation are, for example, those received in hospitals, industries, cosmetic treatments (UVA cabins), etc.
  • the invention is also directed to a method of cosmetic treatment to protect the skin or hair from solar radiation or other radiation of natural or artificial origin or to prevent or minimize the harmful effects produced by solar radiation or other radiation of natural origin or artificial on the skin or hair, which comprises applying on the skin or hair an effective amount of a composition as defined above.
  • the photoprotective composition of the invention can be used in the field of cosmetics or for pharmaceutical purposes to prevent or minimize such effects as for example erythema, deep sunburn, premature aging of the skin induced by the sun, regulation of the biochemical deterioration caused for free radicals, photocarcinogenesis, melanoma, nonmelanoma skin cancer, etc.
  • the photoprotective composition is applicable, both to healthy subjects in order to prevent the harmful effects produced by solar radiation or other radiation of natural or artificial origin, and to subjects affected by any of these effects in order to minimize them. .
  • the compounds of formula (I) do not have estrogenic activity and therefore can be used by subjects at risk of hormonal disruption.
  • the photoprotective composition is used to prevent or minimize the harmful effects produced by solar radiation or other radiation of natural or artificial origin on the skin or hair in subjects at risk of hormonal disruption such as children and pregnant women.
  • Table 1 shows the appearance of the solids obtained, their performance, as well as the wavelengths of the absorption maxima (nm) and their corresponding absorbance (absorbance units) [UV spectrum obtained in a Cecil 2021 UV-Visible Spectrophotometer unit ].
  • the solvent used in the photostability test was methanol [MeOH] (ppa) (250 mL), using a concentration of 1 g / mL of p-nitrolophine. The solution was irradiated for 2 hours, taking samples at 10 minutes, 20 minutes, 1 hour and 2 hours, and drying them on a rotary evaporator.
  • transactivation assay In order to evaluate the possible estro genicity of p-nitrolophin, its ability to bind to estrogenic receptors and activate the expression of specific genes of hormonal activity was investigated, using various in vitro estrogenicity bioassays of recognized sensitivity and specificity. Briefly, transactivation bioassays ("Transactivation assay" or
  • Reporter gene assay used are based on the use of breast and uterine cancer cell lines transfected with various hormonal receptors, whether native or modified.
  • the resulting cell lines also contain a estrogen-regulated reporter gene through the estrogen response element, the globin promoter and the luciferase gene.
  • the set obtained responds specifically to the stimulation of natural estrogen (estradiol) or any estrogenic mimicor that induces the expression of the reporter gene that is made visible by triggering a colorimetric reaction.
  • FBS fetal bovine serum
  • MELN cells were obtained by transfecting the MCF-7 breast cancer cell line [which endogenously express the estrogen receptor alpha (ERa)] with an estrogen sensitive response element (ERE- ⁇ Glob- Luc-SV-Neo). The selection of geneticin resistant clones was performed using a concentration of 1 mg / mL.
  • the maintenance medium of this cell line is DMEM F12 (Dulbecco's modified eagle medium) with phenol red, supplemented with 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin and 1 mg / mL of geneticin. Due to the estrogenic activity of phenol red as well as FBS, the experiments are carried out in an experimentally-called medium, that is, culture medium without phenol red and estrogen-free FBS.
  • the experimental medium for this line is DMEM without phenol red supplemented with 3% FBS treated with carbon-dextran. The basal activity of these cells is around 15% of the maximum activity, obtained with 10 nM of E 2 .
  • the HELN-ER ⁇ and HELN-ER ⁇ cell lines were obtained by transfecting the HeLa cell line of uterine cancer. In a first phase, said cells were transfected with an estrogen sensitive response element and then with the alpha or beta estrogen receptor (ERa or ER ⁇ ). The selection of clones resistant to geneticin and pyromycin was performed using a concentration of 1 mg / mL and 0.5 mg / mL, respectively.
  • the maintenance medium as well as the experimental medium of these 2 cell lines is DMEM F12 without phenol red, supplemented with 6% FBS (devoid of estrogen), 1% penicillin / streptomycin, 1 mg / mL geneticin and 0.5 ⁇ g / mL of pyromycin.
  • the basal activity of these cells is around 10% of the maximum activity, obtained with 10 nM of E 2 .
  • Estro genicity bioassay luciferase activity
  • the cells were seeded at a density of 5x10 4 cells per well, in opaque white plates of 96 wells, in 150 ⁇ l of experimental medium. After 8 hours, the compounds to be tested (p-nitrolophin and estradiol) were prepared (4x concentrates) in the same medium and added to each well (50 ⁇ l). The cells were incubated for 16 hours at 37 ° C. At the end of the incubation, the medium was removed and replaced by fresh medium containing 0.3 nM luciferin [at that concentration the luciferin diffuses into the cell interior producing a luminescent signal that is stable after 5 minutes and for at least 2 hours] . Next, the plates were introduced into the luminometer to measure the luminescence for 2 seconds. A YicroBeta Trilux luminometer (EGG Wallac) was used to detect luciferase activity.
  • EMG Wallac YicroBeta Trilux luminometer
  • the tests were performed in quadruplicate for each concentration (0.01-10 ⁇ M) in at least three independent experiments. The results were expressed as a percentage of the maximum luciferase activity (100%), which corresponded to that obtained in the presence of 10 nM E 2 . The luciferase activity values obtained were analyzed using the one-way ANOVA statistical test. The differences were considered significant when P was less than 0.5 (P ⁇ 0.05).
  • the MELN cell line has been used, usually used to identify the hormonal activity of compounds that interact specifically with the estrogen receptor alpha.
  • p-nitrolophin was not able to induce luciferase expression beyond the value obtained with the negative control (hormone-free culture medium) even at the highest concentration tested (10 ⁇ M) . This test shows that p-nitrolophine is not an estrogenic compound.
  • Negative control (Culture medium is ⁇ s) pNO 2 Lofina (IxIO “8 M) 15.2 ⁇ 0.6 pNO 2 Lofina (3x10 “ 8 M) 15.3 ⁇ 0.5 pNO 2 Lofina (IxIO “7 M) 15.6 ⁇ 0.3 pNO 2 Lofina (3x10 “7 M) 15.5 ⁇ 0.9 pNO 2 Lofina (IxIO “ 6 M) 16 ⁇ 0.4 pNO 2 Lofina (3x10 “6 M) 15, 2 ⁇ 0.4 pNO 2 Lofina (IxIO "5 M) 15.6 ⁇ 0.9
  • MELN cells were treated with said compound at the indicated concentrations.
  • the results are expressed as a percentage of maximum luciferase activity (100%), which was obtained in the presence of 10 nM E 2
  • the product was tested in two other bioassays based on the use of HELN-ER ⁇ and -ER ⁇ cell lines, through which it is possible to differentiate estrogenicity dependent on alpha or beta estrogen receptors, respectively.
  • the results obtained in the bioassay based on which the HELN-ER ⁇ line is used indicate, again, that the compound is not estrogenic (Table 4), thus confirming the above results.
  • Negative control (Medium i of ⁇ - 1 - culture) pNO 2 Lofina (1x10 8 M) 11.1 ⁇ 0.9 pNO 2 Lofina (3x10 8 M) 11.7 ⁇ 0.9 pNO 2 Lofina (1x10 7 M) 10.7 ⁇ 1, 1 pNO 2 Lofina (3x10 7 M) 11.3 ⁇ 1.5 pNO 2 Lofina (1x10 6 M) 11.1 ⁇ 1.1 pNO 2 Lofina (3x10 6 M) 11.2 ⁇ 1.4 pNO 2 Lofina ( 1x10 5 M) 11.6 ⁇ 1.5
  • HELN-ER ⁇ cells were treated with said compound at the indicated concentrations.
  • the results are expressed as a percentage of maximum luciferase activity (100%), which was obtained in the presence of 10 nM E 2 .
  • Negative control (Medium of Q c + 1 1 culture) and p ⁇ i> i pNO 2 Lofina (IxIO- 8 M) 9.6 ⁇ 1.4 pNO 2 Lofina (3x10 "8 M) 10.0 ⁇ 0.8 pNO 2 Lofina (IxIO "7 M) 10.2 ⁇ 1.3 pNO 2 Lofina (3x10 " 7 M) 10.3 ⁇ 1.1 pNO 2 Lofina (IxIO "6 M) 10.1 ⁇ 1.3 pNO 2 Lofina (3x10 "6 M) 10.2 ⁇ 1.9 pNO 2 Lofina (IxIQ- 5 M) 10.6 ⁇ 1.2 HELN-ER ⁇ cells were treated with said compound at the indicated concentrations.
  • E-Screen in vitro estrogenicity test
  • MCF-7 which endogenously express the estrogen receptor alpha (ERa)]
  • ERa estrogen receptor alpha
  • ERa estrogen receptor alpha
  • These cells are considered estrogen-dependent, which does not proliferate when exposed to a culture medium supplemented with serum to which estrogens have been removed, only natural or synthetic estrogens cancel this inhibition and induce maximum proliferation. Taking advantage of these characteristics Soto et al.
  • a stock solution of m-nitrolophine at 30 mg / ml in ethanol was prepared and tested in the range 300-0.003 ⁇ g / ml. Furthermore, 17 ⁇ - estradiol stock solutions (10 mM) in ethanol was also prepared and maintained at -20 0 C until use. Successive dilutions of both the test compound and estradiol were made in the culture medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • Estradiol-17 ⁇ , L-glutamine, Hepes and sodium bicarbonate were purchased from Sigma-Aldrich Inc. All the plastic material for the culture was obtained from Falcon (Merck Eurolab) except the 24-well plates, which were obtained from Greiner Labortechnik.
  • the human cancer cell line MCF-7 is used. This line was established by Soule et al. ["A human cell line from a pleural effusion derived from a breast carcinoma”. J. Nati. Cancer Inst. 51: 1400-1413; 1973] from a human breast carcinoma. Its widespread diffusion as an experimental model of breast cancer can be attributed to the fact that it is the first documented cell line as a positive estrogenic receptor, which responds with metabolic and structural changes to the action of estrogens [Soto et al. "The E-Screen as a tool to identify estrogens: an update on oestrogenic environment pollutants". Environ. Health Perspect 103: 113-122, 1995].
  • the MCF-7 cell line also has specific receptors for other hormonal agents, including androgens, progestogens, glucocorticoids, vitamin D3, thyroid hormones, pro lactin, insulin, calcitonin and cell growth stimulating factors.
  • a) Maintenance medium Maintenance in culture of the MCF-7 cells was carried out in DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium medium) minimum essential medium supplemented with 10% FBS plus phenol red (RF), L-glutamine and sodium bicarbonate; and b) Experimental medium: Due to estrogenic activity of phenol red as well as FBS, the experiments are carried out in a medium called experimental, that is, culture medium without phenol red, being here indicated in the text as DMEM without RF. In this case, the regulation of the pH of the medium was carried out using as buffer, sodium bicarbonate and Hepes, at final concentrations of 4.2 ⁇ l and 20 mM, respectively. The experimental medium is supplemented with 10% human serum devoid of estrogen (10% CDHuS).
  • the E-Screen test was performed following the methodology previously described by Soto et al. ["An in culture bioassay to assess the estrogenicity of xenobiotics. In: Chemically Induced Alterations in sexual Development: The Wildlife / Human Connection; Colborn T, Clement CR, eds; Princeton, NJ: Princeton Scientific Publishing, 295-309; 1992] modified by Villalobos et al. ["The E-SCREEN assay: comparison among different MCF7 cell stocks, Environ. Health Perspect 103: 844-850; nineteen ninety five].
  • the MCF-7 cells at confluence, were trypsinized and aliquots of said suspension were seeded in 24-well plates at initial concentrations of 20,000-40,000 cells per well in maintenance medium, DMEM with RF, supplemented with 10% FBS.
  • maintenance medium DMEM with RF, supplemented with 10% FBS.
  • the maintenance medium was removed and DMEM experimental medium without RF supplemented with 10% CDHuS was added.
  • 17 ⁇ -estradiol and the compounds to be tested were added to the culture medium at the required concentrations.
  • the test ended at 144 hours of subculture (exponential phase) after aspiration of the medium and the fixation of the cells for the application of the sulforrodamine-B technique.
  • cell growth for each experimental group refers to the growth obtained for the negative control (absence of hormone) and with respect to estradiol (positive control). Analysis of the results: Biological activity parameters
  • the maximum cell proliferation rate induced by the compound also called proliferative effect (EP), calculated as the ratio between the maximum proliferation rate obtained for the compound and the rate was established. proliferation achieved by the negative control.
  • the proliferation data corresponding to the successive dilutions of the compound were transformed after the application of the correction factor for the dilution of each experimental point, proceeding with the calculation of the arithmetic mean of the data obtained.
  • Another parameter is relative proliferative efficacy (RPE). For this, the maximum rate of cell proliferation obtained was divided by the maximum rate of cell proliferation reached by 17 ⁇ -estradiol (which is around 6.2 ⁇ 0.3 over the control). The resulting value was expressed as a percentage, estimating 100% for 17 ⁇ -estradiol.
  • the relative proliferative potency was also estimated, calculated as the ratio between the concentration at which the product tested had the maximum proliferative capacity and that at which 17 ⁇ -estradiol had its maximum proliferative effect. The resulting value was expressed as a percentage, estimating 100% for 17 ⁇ -estradiol.
  • the estrogenicity test E-Screen has been used, usually used to identify the hormonal activity of compounds that interact specifically with the estrogen receptor alpha (ERa).
  • the tests were performed in triplicate for each concentration (range: 300-0.003 ⁇ g / ml) in at least three independent experiments.
  • MCF-7 cells were treated with said compound at the indicated concentrations.
  • the results are expressed as the maximum cell proliferation rate induced by the compound (proliferative effect), calculated as the ratio between the maximum proliferation rate obtained for the compound and the proliferation rate achieved by the negative control.
  • mice 35 male mice, weighing more than 20 grams, have been used. After his
  • the animals acclimatized for 7 days to the place where the tests were performed, being located in a room with the controlled temperature (22 0 C) with humidity relative between 50% and 75%, with approximately 10 times per hour replacement of filtered fresh air and with 12 h light / dark cycles (7.00 - 19.00 light and from 19.00 to 7.00 darkness ).
  • the animals were fed ad libitum with a standard rodent diet and running water as a drink.
  • the animals were randomly distributed in 4 experimental groups, as shown in Table 7.
  • the products to be tested were used directly by applying them in gel form on an area of the skin, so that each animal constitutes its own control.
  • the exposure was maintained until all animals received an approximate total dose of 2.5 kJ / m 2 .
  • the irradiation dose applied was determined by an ultraviolet light detector, whose response curve is shown in Figure 2.
  • the skin fragments on which these gels were deposited had an almost normal appearance, although a very light erythema could be seen. 100% of the animals They were described as "protected” because the intensity of the erythema was considerably reduced with respect to the surrounding areas. However, the deletion was not complete. The intensity of erythema is between 60% and 80% lower than in the surrounding areas (see Figures 3 and 4 for the p-nitrolophin and m-nitro compounds, respectively).
  • UVB-UV A2 and lets the portion of the UVAl pass almost intact. Part of its effects could be due to a screen effect on the UVB-UV A2 region. Comparing the maximums obtained with the two standards and m-nitrolophine, it is observed that, at the concentration used (10 mg / ml), the blockade of UVB by m-nitrolophin is higher than that of P5000, while in Compared with P 1789, the blockade observed for m-nitrolophine is similar in the UV A2 region and much lower in the UVA1 region. (see Figure 8).
  • Each mouse was administered in the right ear 20 ⁇ L of 25 mg / mL solution of forbol 13-acetate-12-myristate (MPA) [Fluka cod 79346] (10 ⁇ L on each side).
  • the positive control group was not given anything else; to the negative control group, 20 ⁇ L of the 25 mg / mL solution of indomethacin was administered, and to the treated groups 20 ⁇ L of the 25 or 50 mg / mL solution of A-nitrolophin was administered equally, immediately after of managing the MPA. Animals that had no lesion or irritation to the skin and ears were used.
  • mice After 4 hours post-treatment, the mice were sacrificed by cervical dislocation and a 6 mm diameter portion of each ear was obtained with a punch, which was weighed on a precision analytical balance. The differences in weight ( ⁇ ) between the right (treated) and left (untreated) ear were calculated for each animal and for each group. The percent inhibition (% inh) was estimated and calculated according to the following equation:
  • % inh 100 (l- ⁇ t / ⁇ c) where ⁇ t represents the difference in the treated groups and ⁇ c the difference for the negative control group.

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Abstract

La presente invención se refiere a una composición que comprende (i) un compuesto A que absorbe en la región del ultravioleta A (UVA)-visible cercana y (ii) un compuesto B que absorbe en la región del ultravioleta B (UVB), en donde, al menos, uno de dichos compuestos A o B es un compuesto de fórmula (I) donde Y representa un grupo arilo o estiril-arilo opcionalmente sustituido, R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí representan, H, OH, ORa, NH2, NHRa, NHRaRb, NO2 o halógeno; donde R3 y R1, independientemente entre sí representan alquilo C1-C10; y R5 y R6, independientemente entre sí representan, H, o bien R5 y R6 juntos forman un enlace C-C entre los átomos de carbono a los que están unidos; así como al empleo de dicho compuesto de fórmula (I) en la elaboración de una composición fotoprotectora y al tratamiento cosmético relacionado. Formula (I)

Description

COMPOSICIÓN FOTOPROTECTORA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una composición fotoprotectora útil para prevenir o minimizar los efectos dañinos producidos por la radiación solar sobre la piel o el pelo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las radiaciones electromagnéticas emitidas por el sol son las responsables directas de los efectos nocivos del sol sobre la piel y el pelo. Sus consecuencias a nivel cutáneo dependen de múltiples factores, principalmente el tipo de radiación (longitud de onda, tiempo de exposición y nivel de penetración en la piel), el fototipo cutáneo y la susceptibilidad individual. Asimismo, las radiaciones solares que alcanzan la tierra dependen de diversos factores como la latitud, altitud sobre el nivel del mar, época del año, hora del día, espesor de la capa de ozono, etc.
La región del espectro electromagnético denominada ultravioleta- visible cercana puede ser divida a su vez en cuatro regiones (UVC, UVB, UVA y visible cercana), cuyas características se describen a continuación.
Los rayos UVC (200-280 nm) emitidos por el sol constituyen la radiación ultravioleta con un mayor contenido energético. Sin embargo, esta radiación no es peligrosa ya que los rayos solares UVC se filtran a través de la capa de ozono en la estratosfera, no llegando a la superficie de la tierra.
La radiación UVB (280-320 nm), con una energía intermedia entre los rayos
UVC y los rayos UVA, llega bastante filtrada a la superficie terrestre. Este tipo de radiación penetra poco en la piel y ocasiona un daño directo sobre el ADN. Son responsables por ejemplo de quemaduras, eritemas, del incremento del grosor de la piel y del cáncer de piel.
Los rayos UVA (320-400 nm) pueden ser divididos en dos tipos de radiación: UV A2 (320-340 nm) y UVAl (340-400 nm). Son los responsables de la pigmentación inmediata de la piel y del bronceado de retardo. Aunque poseen menor energía que la radiación UVB, también son susceptibles de inducir una alteración de la piel, sobre todo en el caso de una piel sensible o una piel expuesta continuamente a la radiación solar. En este sentido, la radiación UVA emitida por el sol es permanente, ya que se encuentra poco filtrada. Por otro lado, no produce señal de alarma (eritema), por lo que su efecto no es advertido en primera instancia. Además del daño directo, los rayos UVA llevan asociado un daño indirecto sobre el ADN, ya que en presencia de fotosensibilizadores, tanto endógenos como ambientales, generan con el oxígeno del aire, especies reactivas de oxígeno, como singlete o radicales libres, cuya acción oxidante es muy potente. Los rayos UVA penetran en las capas más profundas de la piel y son responsables por ejemplo de la fotocarcinogénesis y el fotoenvejecimiento.
La radiación visible cercana (400-450 nm) procedente del sol también supone un gran peligro para la piel, principalmente debido a su baja filtración atmosférica. No obstante, el menor contenido energético de este tipo de radiación en comparación con los rayos UV ha provocado que durante mucho tiempo no fuera objeto de interés por los expertos.
Al igual que sucede con la piel, la radiación solar agrede la fibra capilar, alterándola desde la superficie (cutícula) hasta el corazón (córtex). La radiación ultravioleta y visible cercana dañan el cemento intercelular, que asegura la cohesión de las escamas que protegen el cabello. Como consecuencia, éste pierde su resistencia, solidez, brillo y suavidad. Cuando se daña la cutícula, la fibra capilar no tiene ninguna protección frente a los agentes externos y sufre alteraciones más profundas, en el córtex: por un lado, la queratina se degrada provocando que el cabello se vuelva más frágil y que las puntas se abran; por otro, la melamina también se altera originando distorsiones en el color original.
Las siguientes referencias proporcionan información complementaria sobre los efectos adversos asociados con la exposición a radiación solar: DeSimone, "Sunscreen and Suntan Products", Handbook of Nonprescription Drugs, 8a Ed., Capítulo 26, páginas 533-546 (American Pharmaceutical Association, Washington, D. C; 1986); Grove and Forbes, "A Method for Evaluating the Photoprotection Action of Sunscreen Agents Against UV-A Radiation", International Journal of Cosmetic Science 1982 , 4, 15-24; US 4,387,089; De Meo y col., "Genotoxicity of visible light (400-800 nm) and photoprotection assesment of ectoin, L-ergothioneine and mannitol and four sunscreens", Journal ofPhotochemistry and Photobiology B: Biology 2008, 91, 24-34; Parrish JA y col., "The Optics of Human Skin", The Journal of Investigative Dermatology 1981, 77, 13-19.
Por lo tanto, aunque los efectos inmediatos de la radiación solar se relacionen con el bronceado de la piel, tanto la radiación ultravioleta (UVA-UVB) como la radiación visible cercana representan un serio peligro. Por consiguiente, es deseable que los tres tipos de radiaciones sean filtradas, evitando así sus efectos nocivos sobre la piel y el pelo.
Entre las distintas técnicas de protección frente a las radiaciones solares, la forma más sencilla consiste en minimizar el tiempo de exposición al sol, o bien la protección física frente a sus radiaciones mediante el uso de, por ejemplo, ropas, gorros, gafas de sol o cristales tintados. Sin embargo, existe un gran número de actividades que requieren largos periodos de exposición al sol y además la protección física no es apropiada en muchas ocasiones. Por ello, surgieron composiciones cosméticas fotoprotectoras constituidas por filtros físicos, tales como pigmentos, que actuaban como barreras de los rayos solares. No obstante, hay estudios que demuestran que algunos filtros físicos actúan como catalizadores de fotooxidación, siendo por tanto necesaria la aplicación conjunta de antioxidantes para paliar dicho efecto. Posteriormente, se incorporaron filtros químicos en las composiciones fotoprotectoras, que en un principio sólo absorbían radiación UVB, ya que se consideraba que era la radiación solar más perjudicial. En los últimos tiempos, se han desarrollado composiciones fotoprotectoras que absorben en su conjunto rayos UVA y rayos UVB, denominadas comúnmente como composiciones fotoprotectoras de amplio espectro (Pathak M A, "Sunscreens: Progress and perspectives on photoprotection of human skin against UVB and UVA radiation", J Dermatol 1996, 23(11), 783-800; Gilaberte Y, Coscojuela C, Saenz de Santamaría M C, González S, "Photoprotectores", Actas Dermosifiliogr 2003, 94(5), 271-293). Dichas composiciones de amplio espectro comprenden distintas moléculas para poder filtrar un amplio rango de longitudes de onda. Por ejemplo, la marca registrada como Helioplex® contiene avobenzona, que es un fotoprotector de la radiación UVA, y oxibenzona, que es un fotoprotector de la radiación UVB, mostrando también cierta absorbancia en la región UVA. Sin embargo, en líneas generales, las composiciones fotoprotectoras de amplio espectro no han prestado atención a la radiación visible cercana. Por otro lado, su fotoestabilidad está poco descrita, y, además, existen evidencias de que sus componentes son disruptores hormonales. Por lo tanto, sería deseable desarrollar nuevas composiciones fotoprotectoras que no presenten estos inconvenientes.
La lofina (2,4,5-trifenilimidazol) puede ser preparada calentando hidrobenzamida a unos 3000C. Desde hace años se conoce que la lofina y sus derivados son quimioluminiscentes, es decir, provocan la emisión de luz mediante una reacción química a temperaturas bajas. Así, la oxidación de la lofina conduce a la formación de un compuesto excitado que se descompone emitiendo luz (Philbrook, G E Photochemisty and Photobiology 1965, 4, 1175-1183).
Figure imgf000006_0001
Lofina En base a estos antecedentes, resultaría necesario desarrollar composiciones fotoprotectoras de amplio espectro para prevenir o minimizar los efectos dañinos de la radiación solar sobre la piel o el pelo alternativas a las existentes, que proporcionaran simultáneamente protección frente a radiaciones UVB, UVA y visible cercana y que además presentaran una alta estabilidad sin afectar al sistema hormonal.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han desarrollado nuevas composiciones cosméticas y/o farmacéuticas destinadas a la fotoprotección de la piel y/o de los cabellos contra la radiación solar, en particular contra la radiación ultravioleta y la radiación visible cercana. La presente invención se dirige a dichas composiciones fotoprotectoras así como a su utilización en la aplicación cosmética y/o farmacéutica anteriormente mencionada. Más particularmente, la presente invención se relaciona con composiciones fotoprotectoras que absorben tanto en la región UV A-visible cercana como en la región UVB que comprenden al menos un derivado de lo fina de fórmula (I). Algunos de dichos compuestos de fórmula (I) son solubles en disolventes polares, lo que facilita su formulación galénica. Además, su poca reactividad química y su escasa descomposición por acción de la luz confieren estabilidad a la composición fotoprotectora. Por otro lado, los compuestos de fórmula (I) no tienen actividad estrogénica, por lo que la composición fotoprotectora se puede utilizar en sujetos en riesgo de disrupción hormonal.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende (i) un compuesto A que absorbe principalmente en la región del UVA- visible cercana y (ii) un compuesto B que absorbe principalmente en la región del UVB, en donde, al menos, uno de dichos compuestos A o B es un compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000007_0001
donde
Y representa
Figure imgf000007_0002
R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí representan, H, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, NO2 o halógeno; donde Ra y Rb independientemente entre sí representan alquilo C1-C10; y
R5 y R6, independientemente entre sí representan, H, o bien R5 y R6 juntos forman un enlace C-C entre los átomos de carbono a los que están unidos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un compuesto de fórmula (I")
(I") donde
R1, R2, R3, R4, R5 y R6, independientemente entre sí representan los valores definidos para la fórmula (I).
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un compuesto de fórmula (I), tal como se ha definido anteriormente, en la elaboración de una composición fotoprotectora o composición de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de tratamiento cosmético para proteger la piel o el pelo de la radiación solar o para prevenir o minimizar los efectos dañinos producidos por la radiación solar sobre la piel o el pelo, que comprende aplicar sobre la piel o el pelo una cantidad eficaz de una composición, tal como se ha definido anteriormente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1: Espectro de emisión del foco luminoso UVB empleado durante la exposición en los ensayos de fotoprotección (figura proporcionada por el fabricante).
Figura 2: Espectro de respuesta del detector utilizado para determinar la dosis aplicada en los ensayos de fotoprotección (figura proporcionada por el fabricante). Figura 3: Fotografías que muestran el aspecto de la piel del dorso de ratones sobre los que ha aplicado p-nitrolofina al 0,5%, expuestos a UVB. La zona de aplicación del producto se indica con una flecha. Figura 4: Fotografías que muestran el aspecto de la piel del dorso de ratones sobre los que ha aplicado m-nitrolofina al 0,5%, expuestos a UVB. La zona de aplicación del producto se indica con una flecha.
Figura 5: Fotografías que muestran el aspecto de la piel del dorso de ratones sobre los que ha aplicado 4-metilbenciliden alcanfor (P5000) al 0,5%, expuestos a UVB. La zona de aplicación del producto se indica con una flecha.
Figura 6: Fotografías que muestran el aspecto de la piel del dorso de ratones sobre los que ha aplicado metoxidibenzoilmetano de butilo (P1789) al 0,5%, expuestos a UVB. La zona de aplicación del producto se indica con una flecha. Figura 7: Espectro comparativo de absorción UV-visible de p-nitrolofina
(PNLof) (triángulo negro), 4-metilbenciliden alcanfor (Parsol 5000) (cuadrado negro) y metoxi-dibenzoilmetano de butilo (Parsol 1789) (círculo negro).
Figura 8: Espectro comparativo de absorción UV-visible de m-nitrolofina (MNLof) (triángulo negro), 4-metilbenciliden alcanfor (Parsol 5000) (cuadrado negro) y metoxidibenzoilmetano de butilo (Parsol 1789) (círculo negro).
Figura 9: Espectro de absorción UV-visible de estiril lo fina.
Figura 10: Representación en el estudio de las propiedades antiinflamatorias del promedio y EEM de la diferencia de peso entre la oreja derecha y la oreja izquierda para cada grupo de ratones: control positivo (A), control negativo (B) (tratamiento con indometacina 0,5 mg), tratamiento con 0,5 mg de p-nitrolofina (C) y tratamiento con 1 mg de p-nitrolofina (D).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe composiciones fotoprotectoras útiles para absorber radiación UVB (280-320 nm) y UV A-visible cercano (320-450 nm). Los rangos de longitud de onda expresados en la presente invención para diferenciar los distintos tipos de radiaciones se corresponden con valores aproximados, comúnmente aceptados en el estado de la técnica. En la presente invención el término "filtro solar" se refiere a un compuesto que, química o físicamente, absorbe o bloquea algún tipo de radiación ultravioleta y/o visible cercana, tanto aquella proveniente del sol como de otras fuentes naturales o artificiales.
Filtro solar "complementario" es cualquier filtro solar cuya fórmula química es distinta de la fórmula (I).
En la presente invención el término "composición fotoprotectora" se refiere a una composición cosmética y/o farmacéutica destinada para la fotoprotección de la piel y/o de los cabellos contra la radiación ultravioleta-visible cercana.
La composición de la invención comprende (i) un compuesto A que absorbe principalmente en la región UV A- visible cercana y (ii) un compuesto B que absorbe principalmente en la región UVB, en donde, al menos, uno de dichos compuestos A o B es un compuesto de fórmula (I), tal como se ha descrito anteriormente.
En la presente invención, un compuesto que absorbe principalmente en la región UV A-visible cercana o UVB se refiere a un compuesto que presenta un máximo de absorción en la región UV A- visible cercana o UVB, respectivamente. Este hecho no implica que dicho compuesto también presente absorción en otras regiones.
Aunque más adelante se proporcionarán ejemplos de preparación de algunos compuestos de fórmula (I) representativos, de manera general la preparación de dichos compuestos puede ser llevada a cabo mezclando un aldehido aromático, un derivado de bencilo y un exceso de acetato amónico, y a continuación haciendo reaccionar dicha mezcla en ácido acético glacial a reflujo, tal como muestra el esquema de reacción 1.
Figure imgf000010_0001
Esquema de reacción 1 donde
Y, R 5 R 5 R 5 R 5 R y R representan los valores definidos para la fórmula (I). Un procedimiento de preparación de lofina asistido por microondas, así como referencias a otros protocolos de síntesis, se muestran en: Crouch y col., "Microwave- Mediated Synthesis of Lophine: Developing a Mechanism to Explain a Product", Journal of Chemical Education 2006, 83, 1658-1660. En una realización particular, la composición de la invención comprende un único compuesto de fórmula (I). En otra realización particular, la composición de la invención comprende, dos o más compuestos de fórmula (I). De manera preferida, dicho(s) compuesto(s) de fórmula (I) se selecciona(n) del grupo formado por:
2,4,5-trifenil-lH-imidazol; 2-(4-hidroxifenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(4-metoxifenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(3-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(4-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(4-clorofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol; 2-(4-fluorofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-[4-(N,N-dimetilamino)fenil]-4,5-difenil-lH-imidazol;
(E)-2-estiril-4,5-difenil-lH-imidazol;
(E)-2-(4-nitroestiril)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2,4,5-tris(4-nitrofenil)-lH-imidazol; 2-(4-nitrofenil)-lH-fenantro[9,10-d]imidazol; y sus mezclas.
En una realización más particular, la composición de la invención comprende, al menos, un compuesto de fórmula (I) seleccionado entre 2-(3-nitrofenil)-4,5-difenil-lH- imidazol, 2-(4-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol, 2-[4-(N,N-dimetilamino)fenil]-4,5- difenil-lH-imidazol, (E)-2-estiril-4,5-difenil-lH-imidazol, (E)-2-(4-nitroestiril)-4,5- difenil-lH-imidazol, 2,4,5-tris(4-nitrofenil)-lH-imidazol, 2-(4-nitrofenil)-lH- fenantro[9,10-d]imidazol, y sus mezclas.
En una realización aún más particular, el compuesto de fórmula (I) es un compuesto de fórmula (F)
Figure imgf000012_0001
donde
R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí representan, H, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, NO2 o halógeno; donde Ra y Rb independientemente entre sí representan alquilo Ci -Cío.
En otra realización aún más particular, el compuesto de fórmula (I) es un compuesto de fórmula (I")
Figure imgf000012_0002
donde
R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí representan, H, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, NO2 o halógeno; donde Ra y Rb independientemente entre sí representan alquilo C1-C10; y R5 y R6, independientemente entre sí representan, H, o bien R5 y R6 juntos forman un enlace C-C entre los átomos de carbono a los que están unidos.
Según otra realización particular, la composición de la invención comprende, al menos, un compuesto de fórmula (I) que absorbe principalmente radiación UV A- visible cercana. De manera preferida, dicho(s) compuesto(s) A de fórmula (I) se selecciona(n) entre 2-(4-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol, 2-[4-(N,N-dimetilamino)fenü]-4,5- difenil-lH-imidazol, (E)-2-estiril-4,5-difenil-lH-imidazol, (E)-2-(4-nitroestiril)-4,5- difenil-lH-imidazol, 2,4,5-tris(4-nitrofenil)-lH-imidazol, 2-(4-nitrofenil)-lH- fenantro[9,10-d]imidazol, y sus mezclas. Según otra realización particular, la composición de la invención comprende, al menos, un compuesto de fórmula (I) que absorbe principalmente radiación UVB. De manera preferida, dicho(s) compuesto(s) B de fórmula (I) se selecciona(n) entre 2,4,5- trifenil-lH-imidazol, 2-(4-hidroxifenil)-4,5-difenil-lH-imidazol, 2-(4-metoxifenil)-4,5- difenil-lH-imidazol, 2-(3-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol, 2-(4-clorofenil)-4,5- difenil-lH-imidazol, 2-(4-fluorofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol, y sus mezclas.
Según otra realización más particular, la composición de la invención comprende, al menos, un compuesto de fórmula (I) que absorbe principalmente radiación UV A-visible cercana y, al menos, un compuesto de fórmula (I) que absorbe principalmente radiación UVB. De manera preferida, dicho(s) compuesto(s) A y B de fórmula (I) se selecciona(n) respectivamente entre:
(i) un compuesto A de fórmula (I) seleccionado entre 2-(4-nitrofenil)-4,5- difenil-lH-imidazol, 2-[4-(N,N-dimetilamino)fenil]-4,5-difenil-lH-imidazol,
(E)-2-estiril-4,5-difenil-lH-imidazol, (E)-2-(4-nitroestiril)-4,5-difenil-lH- imidazol, 2,4,5-tris(4-nitrofenil)-lH-imid a z o 1 , 2-(4-nitrofenil)-lH- fenantro[9,10-d]imidazol, y sus mezclas; y
(ii) un compuesto de B fórmula general (I) seleccionado entre 2,4,5-trifenil-lH- imidazol, 2-(4-hidroxifenil)-4,5-difenil-lH-imidazol, 2-(4-metoxifenil)-4,5- difenil- lH-imidazol, 2-(3-nitrofenil)-4,5-difenil- 1 H-imidazol, 2-(4- clorofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol, 2-(4-fluorofenil)-4,5-difenil-lH- imidazol, y sus mezclas. Tal como se ha indicado anteriormente, el hecho de que en la presente invención se defina que un compuesto absorbe principalmente radiación UV A-visible cercana, o bien, que absorbe principalmente radiación UVB, no implica que no absorba otras radiaciones. Por ejemplo, el (E)-2-(4-nitroestiril)-4,5-difenil-lH-imidazol presenta un máximo de absorción en ambas regiones, UV A-visible cercana y UVB.
Compuestos de fórmula (I) preferidos en la composición de la invención son aquellos donde R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí representan, H, OH, OMe, NH2, NHMe, NMe2, NO2, flúor o cloro.
La composición de la invención, además de, al menos, un compuesto de fórmula (I), puede comprender un filtro solar complementario. Dicho filtro solar complementario es opcional cuando la composición de la invención comprende un compuesto de fórmula (I) que absorbe en la región UV A-visible cercano y otro compuesto de fórmula (I) que absorbe en la región UVB. Sin embargo, la presencia de un filtro solar complementario es necesaria cuando el o los compuestos de fórmula (I) comprendidos en la composición únicamente absorben en una determinada región, de tal modo que dicho filtro solar cubra la otra región, ofreciendo así protección en ambas regiones.
Entre los filtros solares complementarios adecuados en la presente invención se encuentran tanto filtros químicos como físicos. Los filtros solares químicos se corresponden con compuestos de naturaleza orgánica que absorben en un determinado rango de longitudes de onda. Es bien conocido que dichos filtros químicos se clasifican como filtros UVA y filtros UVB. Los filtros UVA absorben principalmente radiación en la región entre 320 y 400 nm del espectro. Filtros UVA que pueden actuar como filtros solares complementarios en la composición de la presente invención son por ejemplo: benzofenonas, derivados del alcanfor, derivados del dibenzoilmetano, antranilatos, bisimidazilato. Los filtros UVB absorben principalmente radiación en la región entre 280 y 320 nm del espectro ultravioleta. Filtros UVB que pueden actuar como filtros solares complementarios en la composición de la presente invención son por ejemplo: 1,3,5-triazinas, cinamatos, ácido p-aminobenzoico (PABA) y sus derivados, salicilatos, derivados del alcanfor, bencimidazol y sus derivados, octocrileno y ácido urocánico. También existen filtros solares químicos de radiación visible cercana y filtros solares químicos capaces de absorber radiación UVA y UVB útiles en la presente invención, como por ejemplo: anisotriazina, drometrizol trisiloxano, metilen bisbenzotriazolil tetrametilbutilfenol.
La clasificación de los filtros solares químicos en función del rango de longitudes de onda a las que absorben es comúnmente aceptada en la industria. Sin embargo, existe una clasificación más precisa en función de sus propiedades químicas
("Sunscreens: Development, Evaluation and Regulatory Aspects" N. Shaath y col., 2a
Ed, páginas 269-273, Marcel Dekker, Inc. (1997)).
Los filtros solares físicos se corresponden con agentes fotoprotectores, tales como pigmentos o nanopigmentos de óxidos metálicos capaces de bloquear físicamente, por difusión y/o reflexión, la radiación UV, tanto de tipo A como B, y visible cercana.
Ejemplos de filtros solares físicos que pueden actuar como filtros solares complementarios en la composición de la presente invención son óxidos de titanio, zinc, hierro, zirconio, cerio y sus mezclas, opcionalmente revestidos. Estos filtros solares físicos han sido empleados en el estado de la técnica en diferentes suspensiones y tamaños de partícula. La siguiente referencia ofrece una extensa revisión sobre filtros solares físicos: "Sun Protection Effect of Nonorganic Materials" S. Nakada & H.
Konishi, Fragance Journal, volumen 15, páginas 64-70 (1987).
Ejemplos representativos de filtros solares complementarios que pueden ser formulados en las composiciones de la presente invención incluyen 1,3,5-triazinas, cinamatos, ácido p-aminobenzoico (PABA) y sus derivados, salicilatos, derivados del alcanfor, bencimidazol y sus derivados, octocrileno, ácido urocánico, benzofenonas, derivados del dibenzoilmetano, antranilatos, bisimidazilato, anisotriazina, drometrizol trisiloxano, metilen bisbenzotriazolil tetrametilbutilfenol, dióxido de titanio, óxido de zinc, y sus mezclas.
De manera todavía más preferente, dicho filtro solar complementario se selecciona entre: ácido p-aminobenzoico (PABA), metosulfato de alcanfor benzalconio, éster del ácido salicílico y 3,3,5-trimetilciclohexanol (homosalato), benzofenona-3, ácido 2-fenilbencimidazol-5-sulfónico (sal de potasio , sal de sodio y trietano lamina) ácido tereftalideno dicanfor sulfónico y sales, metoxidibenzoilmetano de butilo, ácido benciliden alcanfor sulfónico y sales, octocrileno, alcanfor benciliden poliacrilamido metilo, metoxicinamato de octilo,
PEG-25 PABA, p-metoxicinamato de isoamilo, octil triazona, drometrizol trisiloxano, di-octil butamido triazona,
4-metilbenciliden alcanfor, 3 -benciliden alcanfor, octil salicilato, isopropilbencil salicilato, octil dimetil PABA, benzofenona-4, benzofenona-5,
2,2'-metilen-bis-6(2h-benzotriazol-2-il)-4-(tetrametilbutil)-l,l,3,3-fenol, sal monosódica del ácido 2,2'-bis-(l,4-fenilen)-lH-benzimidazol-4,6- disulfónico,
(l,3,5)-triazina-2,4-bis{(4-2-etil-hexiloxi)2-hidroxi)fenilo}-6-(4-metoxifenilo), dimeticodietilbenzalmalonato, dióxido de titanio , y sus mezclas.
Particularmente, las composiciones de la invención se formulan en una forma de administración por vía tópica. Dichas formas de administración pueden ser tanto líquidas como semisólidas. Entre las formas de administración por vía tópica líquidas adecuadas se encuentran: linimento, loción y similares. Entre las formas de administración por vía tópica semisólidas adecuadas se encuentran: emulsión, crema, leche, gel, gel-crema, suspensión, espuma, pulverizado, ungüento, pomada, pasta, emplasto y similares.
Formas de administración tópica preferidas incluyen una emulsión de aceite en agua, una emulsión de agua en aceite y una solución alcohólica. Aunque las necesidades individuales pueden variar, por ejemplo en función del sujeto o del tipo de formulación, la determinación de los intervalos óptimos para las cantidades eficaces de los filtros solares forma parte de la experiencia general de los expertos en la técnica. Cada uno de los filtros solares incluidos en la composición de la invención se encuentran típicamente en una cantidad entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 10%, y preferiblemente, entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 5%, por peso de la composición.
La composición de la invención típicamente comprende un vehículo o excipiente cosmética y/o farmacéuticamente aceptable. Un vehículo o excipiente cosmética y/o farmacéuticamente aceptable es aquel, para uso cosmético y/o farmacéutico, que es fisiológicamente tolerable y no causa normalmente una reacción alérgica ni una reacción adversa similar cuando se administra a animales, más particularmente seres humanos. La elección de estos ingredientes es una tarea rutinaria para el experto en la materia que depende del tipo de producto en el que se formula la composición. En CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, T Ed, 1997, y también, 8a Ed, 2000, se describen una amplia variedad de ingredientes cosmética y farmacéuticamente aceptables usados habitualmente en composiciones del cuidado de la piel, que se pueden incorporar en las composiciones de la presente invención. A continuación se describen algunos ejemplos no limitativos de vehículos y excipientes adecuados: un cuerpo graso, un disolvente orgánico, un espesante (iónico o no iónico), un suavizante, un antioxidante, un opacificante, un estabilizante, un emoliente, un agente anti-espuma, un agente hidratante, una vitamina, un agente aromatizante, un conservante, un agente tensioactivo, un colorante, un secuestrante, un agente alcalinizante, un agente acidulante, y sus mezclas.
Según otro aspecto, la invención se relaciona con un compuesto de fórmula (I")
Figure imgf000018_0001
(I") donde
R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí representan, H, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, NO2 o halógeno; donde Ra y Rb independientemente entre sí representan alquilo C1-C10; y
R5 y R6, independientemente entre sí representan, H, o bien R5 y R6 juntos forman un enlace C-C entre los átomos de carbono a los que están unidos.
Compuestos de fórmula (I") preferidos son aquellos donde R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí representan, H, OH, OMe, NH2, NHMe, NMe2, NO2, flúor o cloro. Compuestos de fórmula (I") aún más preferidos son aquellos donde R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí representan, H, NMe2 o NO2. Ejemplos particulares de compuestos de fórmula (I") preferidos incluyen (E)-2-estiril-4,5-difenil-lH-imidazol y (E)-2-(4-nitroestiril)-4,5-difenil-lH-imidazol. Los compuestos de fórmula (I") poseen un doble enlace conjugado entre el anillo central de imidazol y un fenilo. Este aumento de la deslocalización electrónica favorece la absorción a λ mayores, es decir, más hacia el visible. En este sentido, los compuestos de fórmula (I") son especialmente útiles para conseguir un efecto batocrómico, proporcionando así fotoprotección en longitudes de onda mayores en comparación a los compuestos que no presentan dicho doble enlace conjugado.
Según otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un compuesto de fórmula (I), tal como se ha definido anteriormente, en la elaboración de una composición fotoprotectora. En una realización particular, el compuesto de fórmula (I) empleado en la elaboración de la composición fotoprotectora se selecciona del grupo formado por:
2,4,5-trifenil-lH-imidazol;
2-(4-hidroxifenil)-4,5-difenil-lH-imidazol; 2-(4-metoxifenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(3-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(4-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(4-clorofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(4-fluorofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol; 2-[4-(N,N-dimetilamino)fenil]-4,5-difenil-lH-imidazol;
(E)-2-estiril-4,5-difenil-lH-imidazol;
(E)-2-(4-nitroestiril)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2,4,5-tris(4-nitrofenil)-lH-imidazol; y
2-(4-nitrofenil)-lH-fenantro[9,10-d]imidazol. En otro aspecto, la invención se relaciona con un compuesto de fórmula (I) para uso en fotoprotección.
Asimismo, el compuesto de fórmula (I) se puede usar en la elaboración de una composición fotoprotectora en combinación con otro u otros compuestos de fórmula (I), así como con uno o más filtros solares complementarios. Tanto desde un punto de vista farmacéutico como cosmético, la composición fotoprotectora que comprende al menos un compuesto de fórmula (I) se emplea para proteger la piel o el pelo de la radiación solar. Tal como se ha comentado en los antecedentes, la radiación solar dañina que llega a la tierra se compone de rayos UVB, UVA y de radiación visible cercana. Por ello, la composición fotoprotectora de la invención es útil para proteger la piel o el pelo de la radiación ultravioleta de tipo A y B y visible cercana del sol. No obstante, el uso de la composición fotoprotectora de la invención no se limita únicamente a radiación solar, sino que también incluye otros tipos de radiaciones tanto de origen natural como artificial que comprenden rayos UVB, UVA y/o visible cercana. Entre las fuentes de radiación artificial encontramos por ejemplo las recibidas en hospitales, industrias, tratamientos cosméticos (cabinas de rayos UVA), etc. La invención también se dirige a un método de tratamiento cosmético para proteger la piel o el pelo de la radiación solar u otra radiación de origen natural o artificial o para prevenir o minimizar los efectos dañinos producidos por la radiación solar u otra radiación de origen natural o artificial sobre la piel o el pelo, que comprende aplicar sobre la piel o el pelo una cantidad eficaz de una composición tal como se ha definido anteriormente.
Existen diversos efectos dañinos producidos por la radiación solar u otra radiación de origen natural o artificial sobre la piel o el pelo. La composición fotoprotectora de la invención se puede emplear en el campo de la cosmética o con una finalidad farmacéutica para prevenir o minimizar tales efectos como por ejemplo eritema, quemaduras solares profundas, envejecimiento prematuro de la piel inducido por el sol, regulación del deterioro bioquímico causado por los radicales libres, fotocarcinogénesis, melanoma, cáncer cutáneo no melanoma, etc.
Por lo tanto, la composición fotoprotectora es aplicable, tanto a sujetos sanos con objeto de prevenir los efectos dañinos producidos por la radiación solar u otra radiación de origen natural o artificial, como a sujetos afectados por alguno de esos efectos con objeto de minimizar los mismos.
Los compuestos de fórmula (I) no presentan actividad estro génica y por tanto pueden ser utilizados por sujetos en riesgo de disrupción hormonal. En una realización particular la composición fotoprotectora se emplea para prevenir o minimizar los efectos dañinos producidos por la radiación solar u otra radiación de origen natural o artificial sobre la piel o el pelo en sujetos en riesgo de disrupción hormonal tales como niños y mujeres embarazadas.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención, permiten al experto en la materia desarrollar la presente invención, y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.
EJEMPLOS
En los siguientes ejemplos, "ppa" significa "producto puro para análisis". EJEMPLO 1 Síntesis de compuestos de fórmula (T)
1.1 Procedimiento general de síntesis
La lofina y sus derivados mono sustituidos p-hidroxi (R1= OH), p-metoxi (R1= OMe), m-nitro (R2= NO2), p-nitro (R1= NO2), p-cloro (R1= Cl) y p-flúor (R1= F) se prepararon siguiendo el procedimiento general descrito en el esquema de reacción 1.
Más concretamente, una mezcla del aldehido correspondiente (1 mmol), bencilo (210 mg, 1 mmol) y exceso de acetato de amonio (350 mg, 4,5 mmoles) se calentaron a reflujo en ácido acético glacial durante 4 horas. La mezcla se enfrió y se agregaron 30 mL de agua utilizando un ecualizador. El precipitado se filtró, se lavó con agua y se secó en desecador. El producto se recristalizó en etanol.
1.2 Síntesis de 2-[4-(N,N-dimetilamino)fenil]-4,5-difenil-lH-imidazol
Se colocaron 30 mL de ácido acético glacial, 0,64 g (3,06 mmol) de bencilo y 1,08 g (13,90 mmol) de acetato de amonio en un matraz de dos bocas con refrigerante.
El baño se calentó y una vez alcanzado el reflujo se agregaron 0,44 g (2,99 mmol) de p- dimetilamino benzaldehído, manteniendo el reflujo durante 4 horas. La reacción se dejó enfriar y a continuación se extrajo usando acetato de etilo como disolvente. La fase orgánica se llevó a sequedad por rotaevaporación. Se tomaron 335 mg del crudo de reacción, disueltos en cloroformo para la siembra, y se purificaron por columna de
Sílica flash usando éter de petróleo: acetato de etilo (1 :1) como eluyente y obteniéndose
95 mg del producto puro (28,4%).
1.3 Síntesis de (E)-2-estiril-4,5-difenil-lH-imidazol Se colocaron 30 mL de ácido acético glacial, 0,66 g (3.1 mmol) de bencilo y
1,08 g (13,90 mmol) de acetato de amonio en un matraz de dos bocas con refrigerante. El baño se calentó y una vez alcanzado el reflujo se agregaron 0,42 g (3,2 mmol) de cinamaldehído, manteniendo el reflujo durante 3 horas. La reacción se dejó enfriar y a continuación se volcó en un baño de agua/hielo. El precipitado se filtró a vacío y se retomó en acetato de etilo. La fase orgánica se llevó a sequedad por rotaevaporación. Se tomaran 868 mg del crudo de reacción, que se purificaron por columna de Sílica flash usando éter de petróleo: acetato de etilo (4:1) como eluyente y obteniéndose 422 mg del producto puro (42.2%).
1.4 Síntesis de (E)-2-(4-nitroestiril)-4,5-difenil-lH-imidazol
Se colocaron 30 mL de ácido acético glacial, 0,64 g (3,06 mmol) de bencilo y 1,08 g (13,90 mmol) de acetato de amonio en un matraz de dos bocas con refrigerante. El baño se calentó y una vez alcanzado el reflujo se agregaron 0,44 g (2,5 mmol) de p- nitrocinamaldehído, manteniendo el reflujo durante 1 hora y media. La reacción se dejó enfriar y se volcó en un baño de agua/hielo. El precipitado se filtró a vacío, se lavó con agua caliente y se secó en desecador. Se tomaron 503 mg del crudo de reacción, que se purificaron por columna de Sílica flash usando éter de petróleo: acetato de etilo (1 :1) como eluyente y obteniéndose 265 mg del producto puro (52,7%).
1.5 Síntesis de 2,4,5-tris(4-nitrofenil)-lH-imidazol
Se colocaron 202 mg de p-nitrolofina obtenida según el procedimiento de síntesis general anterior, 41 mg de urea, 0,62 mL de H2SO4 98% en un matraz de dos bocas con refrigerante y bola de bromo, en un baño de aceite y se agregaron 0,50 mL de HNO3 70% gota a gota a temperatura ambiente. El baño se calentó lentamente hasta alcanzar una temperatura de 630C, que se mantuvo durante 45 minutos. La reacción se dejó enfriar y a continuación se volcó en agua- hielo. Posteriormente, el precipitado se filtró a vacío, se lavó con agua caliente y se secó en desecador para obtener 246 mg del crudo de reacción (96,5%). Una muestra de 52 mg del crudo se purificó mediante columna de Sílica flash usando éter de petróleo: acetato de etilo (3:1) como eluyente, obteniéndose 16 mg del producto puro (30%).
1.6 Síntesis de 2-(4-nitrofenil)-lH-fenantro[9,10-d]imidazol
Se calentaron a reflujo 100 mL de ácido acético glacial con 1,53 g (0,001 mol) de p-nitro benzaldehído. Una vez alcanzado el reflujo, se le agregaron 2,08 g (0,001 mol) de 9,10-fenantroquinona y 1,55 g (0,002 mol) de acetato de amonio (en exceso). Se dejó a reflujo durante 1 hora. Luego se dejó enfriar y se filtró. Se agregaron 150 mL de agua y NH4OH a las aguas madres hasta neutralización. El precipitado formado se filtró y se reunió con el anterior, lavando con agua. Del crudo de reacción se tomaron 360 mg para purificar por columna de Silica flash para obtener 69 mg del producto
(17,52%).
La Tabla 1 muestra el aspecto de los sólidos obtenidos, su rendimiento, así como las longitudes de onda de los máximos de absorción (nm) y su correspondiente absorbancia (unidades de absorbancia) [espectro UV obtenido en un equipo Cecil 2021 UV- Visible Spectrophotometer].
Tabla 1
Figure imgf000023_0001
Todos los derivados de lofina monosustituidos anteriores, con excepción de la m-nitrolofina, son muy solubles o solubles en disolventes como acetato de etilo o acetona.
EJEMPLO 2 Evaluación de la fotoestabilidad de compuestos de fórmula (I)
Todas las irradiaciones realizadas en los estudios de fotoestabilidad se llevaron a cabo en un fotorreactor ACE 7840, que usa una lámpara ACE 7825 de 450W de potencia.
2.1 Evaluación de la fotoestabilidad del 2-(4-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol (4Nθ2-Lofina o p-nitrolofina)
Como paso previo, en el caso de la p-nitrolofina se determinó su absortividad molar específica de la molécula (ε) (A1 I). Para ello, se pesaron 50,4 mg de p-nitrolofina, que se disolvieron en 100,0 mL de MeOH (ppa); a continuación, se realizaron 4 diluciones, tomando 1,0, 2,0, 5,0 y 10,0 mL de esta solución madre y llevando cada una a un volumen de 100,0 mi con MeOH (ppa). La Tabla 2 muestra los valores de absorbancia para cada una de las muestras.
Tabla 2
Figure imgf000024_0001
La pendiente de la recta obtenida a partir de estos puntos (y= 16.717x + 0,03; R2 = 0,9993) coincide por tanto con el valor de la absortividad molar específica de la p- nitro lo fina a 379 nm ε (379 nm) = 16.717 U.A.L/mol El disolvente usado en el ensayo de fotoestabilidad fue metanol [MeOH] (ppa) (250 mL), utilizando una concentración de 1 g/mL de p-nitrolofina. Se irradió la solución durante 2 horas, tomándose muestras a los 10 minutos, 20 minutos, 1 hora y 2 horas, y llevándolas a sequedad en un evaporador rotatorio. Cada muestra se analizó por cromatografía en capa fina (TLC en Sílica GeI) utilizando éter de petróleo :acetato de etilo (4:1) corno eluyente. Las placas cromatográficas se revelaron con una lámpara 254 nm y con una lámpara de 366 nm, así como mediante revelado simultáneo con ambas lámparas (254 y 366 nm).
Al cabo del experimento (2 horas) existía una alta concentración del producto de partida, lo que indica que la fotodescomposición es lenta. En concreto, se pudieron resolver tres fotoproductos (tres manchas), que fueron aislados por TLC preparativa. Una valoración aproximada de la suma total de dichos fotoproductos indica que la p- nitrolofina ha sufrido una degradación inferior al 5%. Además, el número de manchas que apareció en la placa, es decir 3, se mantuvo constante, demostrando que los fotoproductos aislados no experimentaron fotodescomposición secundaria.
2.2 Evaluación de la fotoestabilidad del 2-(3-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol (3NC>2-Lofina o m-nitrolofina)
Se preparó una disolución saturada de m-nitrolofina en MeOH para realizar el estudio, ya que la solubilidad en este disolvente es baja (aproximadamente 0,2 mg/mL).
Brevemente, se procedió dejando en agitación una cantidad de m-nitrolofina suficiente para asegurar la saturación en 200 mL de MeOH durante toda la noche. Se filtró y se irradió la solución durante 2 horas, tomándose muestras de 10 mL a los 10 minutos, 20 minutos, 1 hora y 2 horas, y llevándolas a sequedad en evaporador rotatorio. Cada muestra se analizó por cromatografía en capa fina (TLC en Sílica GeI) utilizando éter de petróleo :acetato de etilo (2:1) corno eluyente y se reveló con lámpara UV a 254 nm.
Tras 2 horas únicamente apareció una mancha de interés, que se aisló. Para ello se tomó el producto a las 2 horas de irradiación, se llevó a sequedad por rotaevaporación y se purificó mediante cromatografía en columna (Silica flash) usando como eluyente la mezcla utilizada para realizar la TLC, resultando en 5,7 mg de producto de fotodescomposición. Además, la ausencia de nuevas manchas indica que no existe fotodescomposición secundaria. EJEMPLO 3 Evaluación de la actividad hormonal estrogénica
3.1 Evaluación de la actividad hormonal estrogénica del 2-(4-nitrofenil)-4,5-difenil- lH-imidazol (p-nitrolofina)
Con objeto de evaluar la posible estro genicidad de la p-nitrolofina se investigó su capacidad de unirse a receptores estrogénicos y activar la expresión de genes específicos de la actividad hormonal, empleando diversos bioensayos de estrogenicidad in vitro de reconocida sensibilidad y especificidad. Brevemente, los bioensayos de transactivación ("Transactivation assay" o
"Repórter gene assay") utilizados se basan en el empleo de líneas celulares de cáncer de mama y de útero transfectadas con diversos receptores hormonales, ya sean nativos o modificados. Las líneas celulares resultantes contienen, además, un gen repórter regulado por los estrógenos a través del elemento de respuesta estrogénico, el promotor de la globina y el gen de la luciferasa. El conjunto obtenido responde de forma específica al estímulo del estrógeno natural (estradiol) o de cualquier mimetizador estrogénico que induce la expresión del gen repórter que se hace ostensible desencadenando una reacción colorimétrica.
Materiales y métodos
Compuestos químicos
Se prepararon soluciones stock (10 nM) en etanol (EtOH) tanto de p-nitrolofina como de estradiol, las cuales se mantuvieron a -200C hasta su uso. Las sucesivas diluciones fueron realizadas en el medio de cultivo.
Los medios de cultivo celular y el suero bovino fetal (FBS) fueron obtenidos de
Life Technologies Inc. El antibiótico geneticina y la luciferina fueron comprados a
Promega. El 17β-estradiol (E2) y el antibiótico piromicina fueron comprados a Sigma-
Aldrich Inc. Todo el material plástico para el cultivo fue obtenido de Falcon (Merck Eurolab) excepto las placas de 96 pocilios, las cuales fueron obtenidas de Greiner Labortechnik. Líneas celulares y condiciones de cultivo
Las células MELN fueron obtenidas mediante la transfección de la línea celular MCF-7 de cáncer de mama [las cuales expresan de forma endógena el receptor de los estrógenos alfa (ERa)] con un elemento de respuesta sensible a los estrógenos (ERE- βGlob-Luc-SV-Neo). La selección de clones resistentes a la geneticina se realizó empleando una concentración de 1 mg/mL. El medio de mantenimiento de esta línea celular es DMEM F12 (Dulbecco's modified eagle médium) con rojo fenol, suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 1 mg/mL de geneticina. Debido a la actividad estrogénica del rojo fenol así como del FBS, los experimentos son realizados en medio denominado experimental, esto es, medio de cultivo sin rojo fenol y FBS desprovisto de estrógenos. El medio experimental para esta línea es DMEM sin rojo fenol suplementado con 3% de FBS tratado con carbón-dextrano. La actividad basal de estas células está alrededor del 15% de la máxima actividad, obtenida con 10 nM de E2.
Las líneas celulares HELN-ERα y HELN-ERβ fueron obtenidas mediante la transfección de la línea celular HeLa de cáncer de útero. En una primera fase, dichas células fueron transfectadas con un elemento de respuesta sensible a los estrógenos y a continuación con el receptor de los estrógenos alfa o beta (ERa o ERβ). La selección de clones resistentes a la geneticina y piromicina se realizó empleando una concentración de 1 mg/mL y 0,5 mg/mL, respectivamente. El medio de mantenimiento así como el medio experimental de estas 2 líneas celulares es DMEM F12 sin rojo fenol, suplementado con 6% de FBS (desprovisto de estrógenos), 1 % de penicilina / estreptomicina, 1 mg/mL de geneticina y 0,5 μg/mL de piromicina. La actividad basal de estas células está alrededor del 10% de la máxima actividad, obtenida con 10 nM de E2.
Bioensayo de estro genicidad: actividad luciferasa
Las células se sembraron a una densidad de 5x104 células por pocilio, en placas blancas opacas de 96 pocilios, en 150 μl de medio experimental. Transcurridas 8 horas, los compuestos a ensayar (p-nitrolofina y estradiol) se prepararon (4x concentrados) en el mismo medio y se añadieron a cada pocilio (50 μl). Las células fueron incubadas durante 16 horas a 37°C. Al final de la incubación, se eliminó el medio se reemplazó por medio fresco conteniendo luciferina 0,3 nM [a esa concentración la luciferina difunde al interior celular produciendo una señal luminiscente que es estable tras 5 minutos y durante, al menos, 2 horas]. A continuación, las placas fueron introducidas en el luminómetro para medir la luminiscencia durante 2 segundos. Se utilizó un aparato YicroBeta Trilux luminometer (EGG Wallac) para detectar la actividad luciferasa.
Análisis de los resultados
Los ensayos fueron realizados por cuadruplicado para cada concentración (0,01- 10 μM) en, al menos, tres experimentos independientes. Los resultados fueron expresados corno porcentaje de la actividad máxima de luciferasa (100%), que correspondía a la obtenida en presencia de E2 10 nM. Los valores de actividad luciferasa obtenidos fueron analizados usando el test estadístico one-way ANOVA. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando P era menor de 0,5 (P < 0,05).
Resultados y Discusión
En primer lugar, con objeto de investigar la estrogenicidad de la p-nitrolofina se ha utilizado la línea celular MELN, empleada habitualmente para identificar la actividad hormonal de compuestos que interaccionan específicamente con el receptor de los estrógenos alfa. Corno se muestra en la Tabla 3, la p-nitrolofina no fue capaz de inducir la expresión de la luciferasa más allá del valor obtenido con el control negativo (medio de cultivo libre de hormona) incluso a la concentración más alta ensayada (10 μM). Este ensayo evidencia que la p-nitrolofina no es un compuesto estrogénico.
Tabla 3 Actividad transcripcional de ERa en respuesta a p-nitrolofina (pNO2 Lofina)
„ , Actividad Lucíferas a
Compuesto (0/ .
Control positivo E2 (1x10 M) 100
Control negativo (Medio de i s + π s cultivo) pNO2 Lofina (IxIO"8 M) 15,2 ± 0,6 pNO2 Lofina (3x10"8 M) 15,3 ± 0,5 pNO2 Lofina (IxIO"7 M) 15,6 ± 0,3 pNO2 Lofina (3x10"7 M) 15,5 ± 0,9 pNO2 Lofina (IxIO"6 M) 16 ± 0,4 pNO2 Lofina (3x10"6 M) 15,2 ± 0,4 pNO2 Lofina (IxIO"5 M) 15,6 ± 0,9
Las células MELN fueron tratadas con dicho compuesto a las concentraciones indicadas. Los resultados son expresados corno porcentaje de máxima actividad luciferasa (100%), que fue aquella obtenida en presencia de 10 nM E2
A continuación, con objeto de confirmar los resultados obtenidos y para categorizar el perfil estrogénico de la p-nitrolofina, se ensayó el producto en otros dos bioensayos basados en el empleo de las líneas celulares HELN-ERα y -ERβ, mediante los cuales se puede diferenciar la estrogenicidad dependiente de los receptores de estrógenos alfa o beta, respectivamente. Los resultados obtenidos en el bioensayo basado en el que se utiliza la línea HELN-ERα indican, de nuevo, que el compuesto no es estrogénico (Tabla 4), confirmando así los resultados anteriores.
Tabla 4 Actividad transcripcional de ERa en respuesta a p-nitrolofina (pNO2 Lofina)
Figure imgf000030_0001
Control negativo (Medio i de
Figure imgf000030_0002
± -1- cultivo) pNO2 Lofina (1x10 8 M) 11,1 ± 0,9 pNO2 Lofina (3x10 8 M) 11,7 ± 0,9 pNO2 Lofina (1x10 7 M) 10,7 ± 1,1 pNO2 Lofina (3x10 7 M) 11,3 ± 1,5 pNO2 Lofina (1x10 6 M) 11,1 ± 1,1 pNO2 Lofina (3x10 6 M) 11,2 ± 1,4 pNO2 Lofina (1x10 5 M) 11,6 ± 1,5
Las células HELN-ERα fueron tratadas con dicho compuesto a las concentraciones indicadas. Los resultados son expresados corno porcentaje de máxima actividad luciferasa (100%), que fue aquella obtenida en presencia de 10 nM E2.
Por otro lado, la p-nitrolofina tampoco induce un incremento en la actividad luciferasa cuando es ensayado en el bioensayo basado en el empleo de la línea HELN- ERβ (Tabla 5). Por tanto, también este ensayo apunta a que la p-nitrolofina no es un compuesto estrogénico.
Tabla 5 Actividad transcripcional de ERa en respuesta a p-nitrolofina (pNO2 Lofina)
„ , Actividad Luciferasa
Compuesto
Control positivo E2 (1x10 6 M) 100
Control negativo (Medio de Q c + 1 1 cultivo) yp ± i > i pNO2 Lofina (IxIO-8 M) 9,6 ± 1,4 pNO2 Lofina (3x10"8 M) 10,0 ± 0,8 pNO2 Lofina (IxIO"7 M) 10,2 ± 1,3 pNO2 Lofina (3x10"7 M) 10,3 ± 1,1 pNO2 Lofina (IxIO"6 M) 10,1 ± 1,3 pNO2 Lofina (3x10"6 M) 10,2 ± 1,9 pNO2 Lofina (IxIQ-5 M) 10,6 ± 1,2 Las células HELN-ERβ fueron tratadas con dicho compuesto a las concentraciones indicadas. Los resultados son expresados corno porcentaje de máxima actividad luciferasa (100%), que fue aquella obtenida en presencia de 10 nM E2 Dada la sensibilidad y especificad de la metodología empleada, la ausencia de actividad estrogénica en ensayos de estrogenicidad en cultivo, permite concluir que es muy improbable que la p-nitrolofina tenga comportamiento estrogénico en modelos animales.
3.2 Evaluación de la actividad hormonal estrogénica del 2-(3-nitrofenil)-4,5-difenil- lH-imidazol (3Nθ2-Lofina o m-nitrolofina)
Con objeto de evaluar la posible actividad hormonal estrogénica de la m- nitrolofina, se investigó su capacidad para unirse al receptor estrogénico y activar la proliferación celular tras 144 horas de subcultivo, en ausencia (control negativo) o presencia (control positivo) del 17β-estradiol, mediante un test de estrogenicidad in vitro (E-Screen) que utiliza la línea celular de cáncer de mama denominada MCF-7 [Experimentos de proliferación celular: Test E-Screen].
El test de proliferación E-Screen se basa en el empleo de la línea celular MCF-7 de cáncer de mama. Las células MCF-7 [las cuales expresan de forma endógena el receptor de los estrógenos alfa (ERa)], responden al tratamiento con estradiol incrementando su ritmo proliferativo, sintetizando nuevas proteínas y procediendo a la transcripción de ciertos genes específicos. Estas células son consideradas estrógeno- dependientes, con lo cual no proliferan cuando se exponen a un medio de cultivo suplementado con suero al que se le han eliminado los estrógenos, solamente estrógenos naturales o sintéticos cancelan esta inhibición e inducen proliferación máxima. Aprovechando estas características Soto et al. ["An in culture bioassay to assess the estrogenicity of xenobiotics" ; en Chemically Induced Alterations in Sexual Development: The Wildlife/Human Connection; Colborn T, Clement CR, eds; Princeton, NJ: Princeton Scientific Publishing, 295-309; 1992] desarrollaron un ensayo biológico bajo el nombre de E-screen (US 4.859.585). El test compara el número de células o la proliferación celular obtenida después de 6 días de cultivo. Las células crecen en medio de cultivo suplementado con suero humano desprovisto de estrógenos, en presencia y/o ausencia de estradiol, así como, de los compuestos químicos de sospechada actividad estrogénica.
Materiales y métodos Compuestos químicos
Se preparó una solución stock de m-nitrolofina a 30 mg/ml en etanol y se ensayó en el intervalo 300-0,003 μg/ml. Por otro lado, se prepararon soluciones stock de 17β- estradiol (10 mM) también en etanol y se mantuvieron a -200C hasta su uso. Las sucesivas diluciones tanto del compuesto problema como de estradiol, fueron realizadas en el medio de cultivo.
Los medios de cultivo celular y el suero bovino fetal (FBS) fueron obtenidos de
Life Technologies Inc. Estradiol- 17β, L-glutamina, Hepes y bicarbonato sódico fueron comprados a Sigma-Aldrich Inc. Todo el material plástico para el cultivo fue obtenido de Falcon (Merck Eurolab) excepto las placas de 24 pocilios, las cuales fueron obtenidas de Greiner Labortechnik.
Líneas celulares y condiciones de cultivo Se utiliza la línea celular de cáncer humano MCF-7. Esta línea fue establecida por Soule et al. ["A human cell line from a pleural effusion derived from a breast carcinoma". J. Nati. Cáncer Inst. 51 :1400-1413; 1973] a partir de un carcinoma de mama humano. Su gran difusión como modelo experimental de cáncer de mama puede ser atribuido a que se trata de la primera línea celular documentada como receptor estrogénico positivo, que responde con cambios metabólicos y estructurales a la acción de los estrógenos [Soto et al. "The E-Screen as a tool to identify estrogens: an update on oestrogenic environment pollutants". Environ. Health Perspect. 103:113-122, 1995]. La línea celular MCF-7 presenta, además, receptores específicos para otros agentes hormonales, entre los cuales se encuentran los andrógenos, progestágenos, glucocorticoides, vitamina D3, hormonas tiroideas, pro lactina, insulina, calcitonina y factores estimuladores del crecimiento celular.
En el presente estudio se utilizó el stock de las células MCF-7 BUS cedidas por el Dr. C. Sonnenschein (Tufts University, Boston, EE.UU.) y clonadas como C7MCF-7 a partir del pase 173 de la MCF-7 original cedida por el Dr. McGrath de la Michigan Cáncer Foundation.
Como medio nutriente de la línea celular ensayada, se utilizaron los siguientes medios sintéticos: a) Medio de mantenimiento: El mantenimiento en cultivo de las células MCF-7 se efectuó en medio mínimo esencial DMEM (Dulbecco's modified Eagle médium) suplementado con 10% de FBS más rojo fenol (RF), L-glutamina y bicarbonato sódico; y b) Medio experimental: Debido a actividad estrogénica del rojo fenol así como del FBS, los experimentos son realizados en medio denominado experimental, esto es, medio de cultivo sin rojo fenol, quedando en este caso indicado en el texto como DMEM sin RF. En este caso, la regulación del pH del medio se efectuó utilizando como tampón, bicarbonato sódico y Hepes, a concentraciones finales de 4,2 μl y 20 mM, respectivamente. El medio experimental se suplemento con 10% de suero humano desprovisto de estrógenos (10% CDHuS).
Bioensayo de estro genicidad
El test E-Screen se realizó siguiendo la metodología previamente descrita por Soto et al. ["An in culture bioassay to assess the estrogenicity of xenobiotics. In: Chemically Induced Alterations in Sexual Development: The Wildlife/Human Connection; Colborn T, Clement CR, eds; Princeton, NJ: Princeton Scientific Publishing, 295-309; 1992] modificada por Villalobos et al. ["The E-SCREEN assay: comparison among different MCF7 cell stocks, Environ. Health Perspect. 103:844-850; 1995]. Las células MCF-7, en confluencia, fueron tripsinizadas y se sembraron alícuotas de dicha suspensión en placas de 24 pocilios a concentraciones iniciales de 20.000- 40.000 células por pocilio en medio de mantenimiento, DMEM con RF, suplementado con el 10% de FBS. Cuando las células estaban adheridas al soporte plástico de la placa (generalmente 24-48 horas) se retiraba el medio de mantenimiento y se añadía medio experimental DMEM sin RF suplementado con el 10% de CDHuS. El 17β-estradiol y los compuestos a ensayar se añadieron al medio de cultivo en las concentraciones requeridas. El ensayo finalizó a las 144 horas de subcultivo (fase exponencial) tras la aspiración del medio y la fijación de las células para la aplicación de la técnica de la sulforrodamina-B. Por último, el crecimiento celular para cada grupo experimental se refiere al crecimiento obtenido para el control negativo (ausencia de hormona) y con respecto al estradiol (control positivo). Análisis de los resultados: Parámetros de actividad biológica
Una vez realizado el ensayo E-Screen, se procedió a establecer la tasa máxima de proliferación celular inducida por el compuesto, también llamada efecto proliferativo (EP), calculada como la relación existente entre la máxima tasa de proliferación obtenida para el compuesto y la tasa de proliferación alcanzada por el control negativo. Los datos de proliferación correspondientes a las sucesivas diluciones del compuesto se transformaron tras la aplicación del factor de corrección para la dilución de cada punto experimental, procediendo al cálculo de la media aritmética de los datos obtenidos. Otro parámetro es la eficacia proliferativa relativa (EPR). Para ello, se dividió la tasa máxima de proliferación celular obtenida entre la tasa máxima de proliferación celular alcanzada por el 17β-estradiol (que se sitúa en torno a 6,2 ± 0,3 sobre el control). El valor resultante se expresó en tanto por ciento, estimando el 100% para el 17β-estradiol. Por último, se estimó también la potencia proliferativa relativa (PPR), calculada como la relación existente entre la concentración a la cual el producto ensayado presentaba la máxima capacidad proliferativa y aquella a la que el 17β-estradiol presentaba su máximo efecto proliferativo. El valor resultante se expresó en tanto por ciento, estimando el 100% para el 17β-estradiol. Cuando el efecto proliferativo relativo de un compuesto, o mezcla de ellos, es en torno a 100 se le considera como un agonista completo, si el valor está alrededor de 1 se le considera como un compuesto que carece de actividad estrogénica, para valores intermedios se habla de agonistas parciales.
Resultados y Discusión
En este ensayo se ha utilizado el test de estro genicidad E-Screen, empleado habitualmente para identificar la actividad hormonal de compuestos que interaccionan específicamente con el receptor de los estrógenos alfa (ERa). Los ensayos fueron realizados por triplicado para cada concentración (rango: 300-0,003 μg/ml) en, al menos, tres experimentos independientes.
Los resultados obtenidos tras la realización del bioensayo (Tabla 6) expresados como efecto proliferativo, indican claramente que la m-nitrolofina no induce una proliferación celular significativa con respecto al control negativo (medio de cultivo libre de hormona), presentando un efecto proliferativo inferior a 1,5 en todo el rango de concentraciones testadas. Por lo general, se considera que un compuesto tiene actividad estrogénica cuando su efecto proliferativo es de 2 ó superior, por lo que se puede considerar que la m-nitrolofina no es un compuesto estrogénico para el receptor alfa.
¡ Tabla 6
Crecimiento celular relativo obtenido en el bioensayo E-screen para la m-nitrolofina (mNO2 Lofina) Efecto proliferativo (EP)
Media Desviación Estándar
Control positivo E2 (IxIO"10 M) 6,62" 0,41 γ Q Control negativo (Medio de cultivo) 1 0,11 mNO2 Lofina (3XlO"1 mg/ml) 1,45 0,10 mNO2 Lofina (3x10"2 mg/ml) 1,30 0,07 mNO2 Lofina (3x10"3 mg/ml) 1,19 0,13 mNO2 Lofina (3x10"4 mg/ml) 1,10 0,12 mNO2 Lofina (3x10"5 mg/ml) 1,08 0,09 mNO2 Lofina (3x10"6 mg/ml) 1,06 0,13
*: Diferencia significativa frente al control estimando un crecimiento igual a 1; p< 0,05
Las células MCF-7 fueron tratadas con dicho compuesto a las indicadas concentraciones. Los resultados son expresados como la tasa máxima de proliferación celular inducida por el compuesto (efecto proliferativo), calculada 15 como la relación existente entre la máxima tasa de proliferación obtenida para el compuesto y la tasa de proliferación alcanzada por el control negativo.
EJEMPLO 4 0 Evaluación de la fotoprotección
En estos ensayos se ha estudiado el efecto de p-nitrolofina y m-nitrolofina sobre el eritema debido a la exposición de la piel de ratón a una fuente de irradiación con máximo en la región UVB. Los resultados obtenidos se han comparado con el efecto del 4-metilbenciliden alcanfor (P5000), sustancia considerada como un filtro solar UVB, y 5 con el efecto del metoxidibenzoilmetano de butilo (P 1789), filtro tipo UVA, ambos productos muy utilizados en cosmética antisolar.
Materiales y Métodos
Se han utilizado 35 ratones macho, de peso superior a 20 gramos. Tras su
30 recepción, los animales se aclimataron durante 7 días al lugar donde se realizaron los ensayos, ubicándose en una sala con la temperatura controlada (220C) con humedad relativa entre el 50% y el 75%, con recambio de 10 veces por hora aproximadamente de aire fresco filtrado y con ciclos luz/oscuridad de 12 h (7,00 - 19,00 luz y de 19,00 a 7,00 oscuridad). Durante este periodo y durante el periodo experimental, los animales fueron alimentados ad libitum con dieta estándar para roedores y agua corriente como bebida.
Los animales se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos experimentales, según lo expuesto en la Tabla 7. Los productos a probar se utilizaron directamente aplicándolos en forma de gel sobre un área de la piel, de forma que cada animal constituya su propio control.
Tabla 7 n° de Vía de
Grupo Tratamiento Concentración Exp a UVB Dosis Animales Admón
100 mi. en
1 GeI p-mtroloñna* 0,5% Sí 10 Tópica
2x2 cm 100 mi. en
2 GeI m-nitroloñna** 0,5% Sí 10 Tópica
2x2 cm 100 mi. en
3 GeI P5000* 0,5% Sí 10 Tópica
2x2 cm 100 mi. en
4 Gel P1789* 0,5% Sí 5 Tópica
2x2 cm
* 10 mg de sustancia + 50 mg de carbopol 941 disueltos en 2 mi de etanol y agitados hasta geliñcación. ** 10 mg de m-nitroloñna en 2 mi de una mezcla de disolventes (300 mi de octil-dodecanol + 300 mi de hexilenglicol + 400 mi de metanol)
La prueba se realizó siguiendo el método descrito por Winder et al. ["A study of Pharmacological influences on ultraviolet erythema in guinea pigs". Arch. Int Pharmacodyn, 116:261-292; 1958] y por otros autores [Wendy et al. "The local antinociceptive and topical antiifnlamatory effects of propyl gállate in rodents". Br. J. Pharmacol, 58:573 -581; 1976; Katiyar et al. " Protective Effects of Silymarin Against Photocarcinogenesis in a Mouse Skin Model". J Nati Cáncer Inst 89:556-65; 1997] con ligeras modificaciones. El día anterior al del ensayo, los animales se depilaron lo mejor posible aplicando una capa de crema depilatoria comercial para eliminar todo el rastro de pelo y dejar la piel del dorso completamente al descubierto. Los restos de crema depilatoria se eliminaron mediante lavado y enjuague con agua corriente y a continuación los animales se devolvieron a sus caj as correspondientes, donde permanecieron hasta el día siguiente. El día del ensayo, las sustancias a ensayar se aplicaron sobre el lomo de los animales previamente marcados, siguiendo una pauta aleatoria (randomizada) y a ciegas. Tras aplicar los tratamientos correspondientes, los animales se colocaron y se fijaron en la plataforma de exposición del equipo. A continuación, los animales se situaron a 8 cm de una fuente de luz ultravioleta de 4*40w, de 313 nm de emisión fundamental y rango comprendido entre 290 y 350 nm aproximadamente y con un filtro anti-UVC. El espectro de emisión de dicho foco luminoso se representa en la Figura 1.
La exposición se mantuvo hasta que todos los animales recibieron una dosis total aproximada de 2,5 kJ/m2. La dosis de irradiación aplicada, se determinó mediante un detector de luz ultravioleta, cuya curva de respuesta se expone en la Figura 2.
Veinticuatro horas después de terminar la exposición, se fotografió el dorso de los animales y se devolvieron a sus jaulas. La evaluación del eritema se realizó mediante un criterio de positivo/negativo, obteniéndose el porcentaje de animales protegidos. La significación estadística de las diferencias se evaluó mediante la prueba no paramétrica "Test de Fisher".
Para determinar el espectro de absorción, de cada una de las sustancias se preparó una solución de 10 mg/ml de metanol. El metanol, a su vez, se utilizó para ajustar el cero de absorbancia en cada una de las longitudes de onda en el rango 195 - 400 nm. El estudio se realizó según las directrices de "Buenas Prácticas de Laboratorio".
Resultados
A las 24 horas de la exposición, todos los animales mostraron un eritema intenso acompañado de evidentes signos inflamatorios, muy intensos en algunas ocasiones y con zonas de extravasación hemática variable, que iban desde pequeñas petequias hasta lesiones claramente hemorrágicas.
El resultado de la aplicación de p-nitrolofina y m-nitrolofina fue comparable.
Los fragmentos de piel sobre los que se depositaron estos geles, presentaron un aspecto casi normal, aunque pudo apreciarse un eritema muy ligero. El 100% de los animales fueron calificados como "protegidos" porque la intensidad del eritema se redujo considerablemente con respecto a las zonas circundantes. Sin embargo, la supresión no fue completa. La intensidad del eritema es entre un 60% y un 80% menor que en las zonas colindantes (véanse las Figuras 3 y 4 para los compuestos p-nitrolofina y m- nitro lo fina, respectivamente).
La aplicación de P5000 protegió de forma eficaz frente al eritema al 100% de los animales, en los que la piel presentó un aspecto sonrosado muy próximo a la normalidad que puede evaluarse de forma subjetiva en un 70-90% de supresión del eritema (véase la Figura 5). De manera similar, el tratamiento con P 1789 redujo el eritema de forma visible en todos los animales, aunque la supresión lograda fue considerablemente menor que la obtenida por p-nitrolofina, m-nitrolofina y por el P5000. De forma subjetiva se evalúa que la supresión alcanzada osciló entre un 10% y un 30% con respecto a las zonas vecinas (véase la Figura 6). El espectro del 4-metilbenciliden alcanfor (P5000) es característico ya que presenta un máximo de absorción entre aproximadamente 245 y 325 nm (295 nm), mientras que el metoxidibenzoilmetano de butilo (P 1789) presenta su máximo entre aproximadamente 305 y 395 nm (360 nm). Esta característica define a estas sustancias como filtros específicos de UVB y de UVA, respectivamente. El espectro de absorción de la p-nitrolofina muestra un máximo de absorción en la región UVA comprendido entre aproximadamente 320 y 450 nm (379 nm), si bien en la región UVB también muestra absorción. Por tanto, la p-nitrolofina ofrece una absorbancia que bloquea de forma simultánea la luz UVB y la luz UVA, llegando incluso hasta longitudes del visible cercano. Parte de sus efectos podrían ser debidos a un efecto pantalla de amplio espectro que impide que la radiación ultravioleta incida sobre la piel. Comparando los máximos obtenidos con los dos patrones y la p- nitrolofina, se observa que, a la concentración utilizada (10 mg/ml), el bloqueo de la UVB por parte de la p-nitrolofina es inferior al del P5000 pero superior al del P 1789, mientras que en la región UVA la p-nitrolofina ofrece una protección muy amplia, que cubre también la región visible cercana (véase la Figura 7). El espectro de absorción de la m-nitrolofina muestra un máximo de absorción a longitudes de onda comprendidas entre aproximadamente 250 y 350 nm (309 nm). Por tanto, la m-nitrolofina ofrece una absorbancia que bloquea principalmente a la luz
UVB-UV A2 y deja pasar casi intacta la porción de los UVAl . Parte de sus efectos podrían ser debidos a un efecto pantalla sobre la región UVB-UV A2. Comparando los máximos obtenidos con los dos patrones y la m-nitrolofina, se observa que, a la concentración utilizada (10 mg/ml), el bloqueo de la UVB por parte de la m-nitrolofina es superior al del P5000, mientras que en comparación con P 1789, el bloqueo observado para la m-nitrolofina es similar en la región UV A2 y muy inferior en la región UVAl . (véase la Figura 8).
La Tabla 8 resume estos resultados.
Tabla 8 Eritema inducido por irradiación UVB en ratón
Figure imgf000039_0001
' ρ<-0 05 contra Ia zois ηo "ratada
Efecto fotoprotector de p-nitrolofina, m-nitrolofina, 4-metilbenciliden alcanfor (P5000) y metoxidibenzoilmetano de butilo (P 1789) todos ellos a 0,5%. Resultados expresados como presencia (+) o ausencia (-) de eritema o sus manifestaciones en la zona de tratamiento. El término "protegidos" se refiere al número de animales que no muestran signos en el área de aplicación y si aparecen son de poca importancia (criterio subjetivo). El término "supresión" se refiere a la intensidad de los signos eritematosos en el área de aplicación con relación al área circundante que no fue tratada (criterio subjetivo). EJEMPLO 5 Evaluación de la propiedad antiinflamatoria tópica
En este estudio se ha analizado la actividad antiinflamatoria tópica de la p- nitrolofina dado que el eritema es un proceso inflamatorio. Concretamente, se evaluó la inhibición de la inflamación inducida por 13-acetato-12-miristato de forbol (MPA) y se comparó con un producto antiinflamatorio de referencia (indometacina). Se dividieron 37 ratones en los siguientes grupos: grupo control positivo (MPA 0,5 mg); grupo control negativo (indometacina 0,5 mg); grupos tratados (0,5 mg y 1 mg de p- nitrolofina). Todas las soluciones fueron preparadas usando acetona (ppa) como vehículo. A cada ratón se le administró en la oreja derecha 20 μL de solución de 25 mg/mL de 13-acetato-12-miristato de forbol (MPA) [Fluka cod 79346] (10 μL en cada cara). Al grupo control positivo no se le administró nada más; al grupo control negativo, se le administró 20 μL de la solución de 25 mg/mL de indometacina, y a los grupos tratados se les administró de igual forma 20 μL de la solución de 25 ó 50 mg/mL de A- nitrolofina, inmediatamente después de administrar el MPA. Se usaron animales que no tuvieran ninguna lesión o irritación en la piel y orejas.
Transcurridas 4 horas post-tratamiento los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y con un sacabocados se obtuvo una porción de cada oreja de 6 mm de diámetro las cuales fueron pesadas en balanza analítica de precisión. Se calcularon las diferencias en peso (Δ) entre, la oreja derecha (tratada) e izquierda (sin tratar) para cada animal y para cada grupo. Se estimó y se calculó el porcentaje de inhibición (% inh) según la siguiente ecuación:
% inh = 100 (l-Δt/Δc) donde Δt representa la diferencia en los grupos tratados y Δc la diferencia para el grupo control negativo.
Para el análisis de resultados se utilizó un ANOVA de una vía y test de Dunnet de múltiple comparación, valores de P<0,05 se consideraron significativos. A tales efectos se utilizó un software Graphpad lnstat Versión 3.06. Los datos de pesos de los animales y pesos de las orejas, derecha e izquierda, se recogen en la Tabla 9.
Tabla 9
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
Todos los animales tuvieron un comportamiento normal durante todo el periodo del estudio. Los resultados surgen de la diferencia en peso entre oreja derecha e izquierda (Δ = OD - Oí) para cada ratón y de cada grupo acorde a la metodología descrita. En la Tabla 10 y en la Figura 10 se muestran los promedios y EEM de (Δ = OD
- Oí) para cada grupo (valores de p < 0,05 se consideraron significativos).
Tabla 10
Figure imgf000042_0002
P< 0,01 (q> 2,47)
El grupo D tenía pocos anímales (n=4) por lo que, aunque no se comparó estadísticamente, se ob serva una tendencia a inhibir la inflamación (90% aproximadamente). Al comparar el tratamiento con indometacina (Grupo B) con el de
4-nitrolofina (C) a la misma dosis (0,5 mg), no se observan diferencias significativas (q = 1,3, p > 0,05).
Por tanto, utilizando este ensayo preliminar, se puede concluir que la 4-nitro lo fina a la dosis de 0,5 mg inhibe la inflamación inducida por MPA. ejemplos anteriormente descritos evidencian que los compuestos de fórmula sente invención proporcionan un doble mecanismo de protección: por un lado, son útiles bloqueando el acceso de la radiación ultravioleta y visible cercana a la superficie de la piel; y por otro, son útiles reduciendo la inflamación producida por aquellas radiaciones que hubieran logrado alcanzar la piel.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende (i) un compuesto A que absorbe en la región del ultravioleta A (UVA)-visible cercana y (ii) un compuesto B que absorbe en la región del ultravioleta B (UVB), en donde, al menos, uno de dichos compuestos A o B es un compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000044_0001
donde
Y representa
Figure imgf000044_0002
R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí representan, H, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, NO2 o halógeno; donde Ra y Rb independientemente entre sí representan alquilo C1-C10; y
R5 y R6, independientemente entre sí representan, H, o bien R5 y R6 juntos forman un enlace C-C entre los átomos de carbono a los que están unidos.
2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo formado por:
2,4,5-trifenil-lH-imidazol;
2-(4-hidroxifenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(4-metoxifenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(3-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(4-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol; 2-(4-clorofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol; 2-(4-fluorofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol; 2-[4-(N,N-dimetilamino)fenil]-4,5-difenil-lH-imidazol; (E)-2-estiril-4,5-difenil-lH-imidazol; (E)-2-(4-nitroestiril)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2,4,5-tris(4-nitrofenil)-lH-imidazol; y 2-(4-nitrofenil)-lH-fenantro[9,10-d]imidazol.
3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende dos o más compuestos de fórmula (I), seleccionados preferentemente del grupo definido en la reivindicación 2 y sus mezclas.
4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende
(i) un compuesto de fórmula (I) seleccionado entre 2-(4-nitrofenil)-4,5-difenil- lH-imidazol, 2-[4-(N,N-dimetilamino)fenil]-4,5-difenil-lH-imidazol, (E)-2- estiril-4,5-difenil-lH-imidazol, (E)-2-(4-nitroestiril)-4,5-difenil-lH- imidazol, 2,4,5-tris(4-nitrofenil)-lH-i m i d a z o 1 , 2-(4-nitrofenil)-lH- fenantro[9,10-d]imidazol, y sus mezclas; y
(ii) un compuesto de fórmula general (I) seleccionado entre 2,4,5-trifenil-lH- imidazol, 2-(4-hidroxifenil)-4,5-difenil-lH-imidazol, 2-(4-metoxifenil)-4,5- difenil- lH-imidazol, 2-(3-nitrofenil)-4,5-difenil- 1 H-imidazol, 2-(4- clorofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol, 2-(4-fluorofenil)-4,5-difenil-lH- imidazol, y sus mezclas.
5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende, además, un filtro solar complementario.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en una forma de administración por vía tópica.
7. Un compuesto de fórmula (I")
Figure imgf000046_0001
donde
R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí representan, H, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, NO2 o halógeno; donde Ra y Rb independientemente entre sí representan alquilo C1-C10; y
R5 y R6, independientemente entre sí representan, H, o bien R5 y R6 juntos forman un enlace C-C entre los átomos de carbono a los que están unidos.
8. Compuesto según la reivindicación 7, donde R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí representan, H, OH, OMe, NH2, NHMe, NMe2, NO2, flúor o cloro; preferentemente el compuesto es (E)-2-estiril-4,5-difenil-lH-imidazol o (E)-2-(4- nitroestiril)-4,5-difenil-lH-imidazol.
9. Empleo de un compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000046_0002
donde
Y representa
Figure imgf000047_0001
R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí representan, H, OH, ORa, NH2, NHRa, NRaRb, NO2 o halógeno; donde Ra y Rb independientemente entre sí representan alquilo C1-C10; y R5 y R6, independientemente entre sí representan, H, o bien R5 y R6 juntos forman un enlace C-C entre los átomos de carbono a los que están unidos., en la elaboración de una composición fotoprotectora.
10. Empleo según la reivindicación 9, en el que dicho compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo formado por: 2,4,5-trifenil-lH-imidazol;
2-(4-hidroxifenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(4-metoxifenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(3-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(4-nitrofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol; 2-(4-clorofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-(4-fluorofenil)-4,5-difenil-lH-imidazol;
2-[4-(N,N-dimetilamino)fenil]-4,5-difenil-lH-imidazol;
(E)-2-estiril-4,5-difenil-lH-imidazol;
(E)-2-(4-nitroestiril)-4,5-difenil-lH-imidazol; 2,4,5-tris(4-nitrofenil)-lH-imidazol; y
2-(4-nitrofenil)-lH-fenantro[9,10-d]imidazol.
11. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, de dicha composición fotoprotectora para proteger la piel o el pelo de la radiación solar o de otra radiación de origen natural o artificial.
12. Empleo según la reivindicación 11, de dicha composición fotoprotectora para proteger la piel o el pelo de la radiación ultravioleta de tipo A, B y/o visible cercana.
13. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, de dicha composición fotoprotectora para prevenir o minimizar los efectos dañinos producidos por dicha radiación sobre la piel o el pelo, donde dichos efectos dañinos se seleccionan preferentemente entre eritema, quemaduras solares profundas, envejecimiento prematuro de la piel inducido por el sol, regulación del deterioro bioquímico causado por los radicales libres, fotocarcinogénesis, melanoma y cáncer cutáneo no melanoma.
14. Empleo según la reivindicación 13, de dicha composición fotoprotectora para prevenir o minimizar los efectos dañinos producidos por dicha radiación sobre la piel o el pelo en sujetos en riesgo de disrupción hormonal.
15. Un método de tratamiento cosmético para proteger la piel de la radiación solar u otra radiación de origen natural o artificial o para prevenir o minimizar los efectos dañinos producidos por la radiación solar u otra radiación de origen natural o artificial sobre la piel o el pelo, que comprende aplicar sobre la piel o el pelo una cantidad eficaz de una composición tal como la definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
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