WO2010133740A1 - Célula del smf modificada genéticamente para sobreexpresar ngal y su uso como medicamento - Google Patents

Célula del smf modificada genéticamente para sobreexpresar ngal y su uso como medicamento Download PDF

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WO2010133740A1
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genetically modified
cell according
cell
smf
polynucleotide
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PCT/ES2010/070334
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English (en)
French (fr)
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Georgina Hotter Corripio
Anna SOLA MARTÍNEZ
Michaela Jung
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
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    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention falls within the field of biomedicine. Specifically, the present invention refers to a System cell
  • Phagocytic mononuclear or SMF preferably a monocyte or a macrophage, genetically modified to overexpress the lipocalin associated with neutrophil gelatinase (NGAL), to a method for obtaining it and its use for the preparation of a medicament for Ia prevention or treatment of damage caused by ischemia, ischemia followed by reperfusion or toxins, acute failure or rejection of an organ transplant.
  • NGAL neutrophil gelatinase
  • AAF acute renal failure
  • Normally, patients with clinical symptoms of renal failure are treated after the damage has developed, except in the case of patients who are going to have a kidney transplant. Since the disease is developed when the patient arrives at the hospital, it is urgently necessary to have healing routes by stimulating the regenerative and healing process in general.
  • a therapeutic approach aimed at reducing inflammation and kidney damage has been cell therapy with genetically modified macrophages.
  • the genetic alteration of the macrophages towards an anti-inflammatory phenotype through treatment with recombinant adenovirus to express IL-1 ra and its subsequent injection in inflammatory models of kidney disease can reduce infiltration, glomerular inflammation and even proteinuria ( Holdsworth et al. Lab Invest. 1984, 51: 172-180; Kitamura et al. Kidney Int. 2000, 57: 709-716; Kluth et al. Gene Ther. 2000, 7: 263-270).
  • NGAL is a 25 kDa protein from the lipocalin superfamily (Flower. FEBS Lett. 1994, 354: 7-11) that acts on proliferation in multiple cell types (Cowland et al. J Immunol. 2003, 171: 6630- 6639; Gwira et al. J Biol Chem. 2005, 280: 7875-7882). It is a protein expressed in tubular cells, which increases markedly in response to harmful stimuli such as ischemia or toxicity. It has also been described that improves the apoptosis of the tubular cell (Mishra et al. J Am Soc Nephrol. 2004, 15: 3073-3082).
  • the present invention relates to an SMF cell, preferably a monocyte or a macrophage, genetically modified to overexpress NGAL, a method for obtaining it and its use for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of ischemia damage. , ischemia followed by reperfusion or toxins, an acute failure or an organ transplant rejection.
  • genetically modified macrophages to overexpress NGAL are capable of reducing inflammation and renal damage, in addition to inducing regeneration in an animal model of renal ischemia-reperfusion, when administered in the inflammatory phase of damage renal.
  • the invention therefore, provides a therapy that reduces inflammation and kidney damage, enhancing renal regeneration during the inflammatory phase of kidney damage.
  • This therapy can also be used in the prevention or treatment of ischemia damage, ischemia followed by reperfusion or caused by toxins, acute failure or rejection of transplantation of other organs.
  • the macrophage has its origin in the granulo-monocytic pluripotential progenitor cells (CGp-GM) of the bone marrow.
  • CSF colonial stimulation
  • the CGp-GM is differentiated into monocyte monopotential progenitor cell (CGm-M), which is differentiated in monoblast, and this, in turn, in promonocyte, the first cell Morphologically identifiable as a precursor of the macrophage and that already has some of its characteristics, such as adhesion to glass and phagocytic capacity.
  • promonocyte the first cell Morphologically identifiable as a precursor of the macrophage and that already has some of its characteristics, such as adhesion to glass and phagocytic capacity.
  • Circulating monocytes go through diafugdesis through the vascular endothelium, migrating to the tissues in which they will differentiate into macrophages, which, in turn, can occur in different functional states: residents, inflammatory and activated.
  • the set formed by spinal precursors, monocytes and tissue macrophages, is currently encompassed under the name of Phagocytic Mononuclear System (SMF).
  • SMF Phagocytic Mononuclear System
  • a first aspect of the invention relates to a cell of the isolated Phagocytic Mononuclear System (SMF) genetically modified characterized in that it comprises an exogenous polynucleotide (hereinafter, the polynucleotide of the invention) that has an identity with the SEQ ID NO: 1 selected from The list consisting of:
  • SMF Phagocytic Mononuclear System
  • SMF cell is capable of inducing renal regeneration during the inflammatory phase of renal damage.
  • Said capacity can be determined by conventional methods such as the tests described in the Example accompanying this description.
  • inflammatory phase refers to a first phase of renal damage characterized by an increase in inflammatory mediators, typically during the first 24 hours after an ischemic insult. In turn, this environment promotes kidney tissue damage by apoptosis and necrosis.
  • the regenerative phase begins with a change in the inflammatory environment.
  • the macrophage plays an important role in eliminating dead cells which, in turn, stimulate their change of phenotype towards anti-inflammatory and pro-proliferative, also allowing the induction of renal regeneration.
  • genetically modified includes here any SMF cell in which the genotype has been altered so that it comprises an exogenous experimentally introduced polynucleotide that has an identity with SEQ ID NO : 1 selected from the list consisting of:
  • SMF cell is capable of inducing renal regeneration during the inflammatory phase of renal damage.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • the genetically modified SMF cell is characterized in that it comprises the exogenous polynucleotide with SEQ ID NO: 1, which corresponds to the nucleotide sequence of the human NGAL protein cDNA (Number of Genbank reference: NM_005564).
  • the genetically modified SMF cell is characterized in that It comprises the exogenous polynucleotide with SEQ ID NO: 2, of the mouse NGAL protein cDNA (Genbank reference number: NM_008491).
  • the genetically modified SMF cell is characterized in that it comprises the polynucleotide of the invention operatively linked to at least one control sequence of the list comprising:
  • a promoter that directs the transcription of said polynucleotide
  • b. a start signal of transcription c. a termination signal of the transcript
  • d. a polyadenylation signal e. a transcriptional activator.
  • Control sequence refers to polynucleotide sequences that affect the expression of the sequences to which they are linked. In eukaryotic cells, generally, said control sequences include promoters, termination signals, enhancers or silencers. It is intended that the term “control sequences” includes, at a minimum, all components whose presence is necessary for expression, and may also include additional components whose presence is advantageous.
  • Operaationally linked refers to a juxtaposition in which the components thus described have a relationship that allows them to function in the intended way.
  • a control sequence "operatively linked" to the polynucleotide is linked to it in such a way that expression of the coding sequence of the polynucleotide is achieved.
  • promoter refers to a region of the DNA located in position 5 'with respect to the starting point of the transcription and which is necessary or facilitates said transcription in an animal cell. This term includes, for example, but not limited to, constitutive promoters, specific cell or tissue promoters or inducible or repressible promoters.
  • the genetically modified SMF cell is characterized in that it comprises an exogenous polynucleotide that encodes the NGAL protein.
  • the genetically modified SMF cell is characterized in that it comprises an exogenous polynucleotide that encodes an amino acid sequence that has an identity with SEQ ID NO: 3 selected from the list consisting of:
  • SMF cell is capable of inducing renal regeneration during the inflammatory phase of renal damage.
  • Said capacity can be determined by conventional methods such as the tests described in the Example that accompanies this description.
  • amino acid sequence refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may or may not be chemical or biochemically modified.
  • the genetically modified SMF cell is characterized in that it comprises an exogenous polynucleotide that encodes the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, which corresponds to the amino acid sequence of the human NGAL protein (Genbank reference number: NP_005555).
  • the genetically modified SMF cell is characterized in that it comprises an exogenous polynucleotide that encodes the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, which corresponds to the amino acid sequence of the mouse NGAL protein ( Genbank reference number: NP_032517).
  • NGAL lipocalin associated with neutrophil gelatinase
  • lipocalin-2 refer to a 25 kDa protein of the lipocalin superfamily.
  • identity refers to the proportion of identical nucleotides or amino acids between two nucleotide or amino acid sequences that are compared. The percentage of identity existing between two sequences can be easily verified by a person skilled in the art, for example, with the help of an appropriate computer program to compare sequences.
  • the SMF cell is a mammalian cell, and more, preferably, of a human. Even more preferably, the SMF cell is a monocyte or a macrophage.
  • Another aspect of the present invention refers to the use of the SFM cell, preferably, a monocyte or a macrophage, genetically modified as described above in this document (hereinafter, cell of the invention) for the preparation of a medicine.
  • SFM cell preferably, a monocyte or a macrophage, genetically modified as described above in this document (hereinafter, cell of the invention) for the preparation of a medicine.
  • gene therapy medication means any product obtained by means of a set of manufacturing processes intended to transfer, either in vivo or ex vivo, a prophylactic, diagnostic or therapeutic nucleic acid to animal cells, preferably human, and their subsequent expression in vivo.
  • Gene therapy drugs include, but are not limited to, naked nucleic acid, non-viral vectors, viral vectors or genetically modified cells.
  • the term "gene therapy medicine” refers to any medicine that comprises a modified SMF cell characterized in that it comprises the polynucleotide of the invention. They can be gene therapy drugs based on autologous cells (from the patient himself), such as allogeneic (from another human being) or xenogeneic (from animals).
  • tissue or organ is from the list comprising: kidney, liver, brain, heart, lung, stomach, intestine, colon, pancreas, bladder, uterus or skin. More preferably, the organ is the kidney.
  • ischemia refers to a temporary or permanent decrease in blood flow in a tissue or an organ, with the consequent decrease in oxygen supply.
  • the set of damage suffered by tissue or organ due to ischemia is known as "damage caused by ischemia.”
  • the term "reperfusion” refers to the restoration of the blood supply to a tissue or an organ that is ischemic as a result of a decrease in normal blood flow.
  • the recovery of blood flow restores the supply of oxygen and nutrients to the tissue, allowing the recovery of tissue or ischemic organ.
  • reperfusion itself it can injure the tissue or ischemic organ, causing what is known as “reperfusion damage”.
  • ischemia-reperfusion damage refers to all the damage suffered by a tissue or an organ due to a decrease in blood flow (ischemia) followed by a restoration of blood flow (reperfusion).
  • damage caused by toxins refers to the set of damages suffered by a tissue or an organ as a result of its exposure to toxins such as, but not limited to, antibiotics, anesthetics, chemotherapeutics, radiological contrasts, heavy metals, fungicides, pesticides, organic solvents, animal poisons, fungal or toxic toxins of endogenous origin.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the cell of the invention for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of damage caused by kidney ischemia or renal ischemia.
  • Renal ischemia consists of a temporary or permanent decrease in blood flow, with the consequent decrease in the oxygen supply to the kidney, as a consequence, for example, but not limited to a decrease in total blood volume, a redistribution of the blood or an obstruction .
  • the decrease in blood flow can be unilateral, when it affects only one kidney, or bilateral, when it affects the two kidneys.
  • the set of damages suffered by tissue or organ due to ischemia is known as "damage caused by renal ischemia.”
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the cell of the invention for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of damage caused by kidney ischemia-reperfusion or renal ischemia-reperfusion.
  • the term "renal ischemia reperfusion damage” refers to all the damage suffered by the kidney due to to a decrease in blood flow (renal ischemia) followed by a restoration of blood flow (reperfusion).
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the cell of the invention for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of the damage suffered by renal tissue or kidney as a result of its exposure to toxins such as, for example, but not limited to antibiotics, anesthetics, chemotherapeutics, radiological contrasts, heavy metals, fungicides, pesticides, organic solvents, animal poisons, fungal or toxic toxins of endogenous origin.
  • toxins such as, for example, but not limited to antibiotics, anesthetics, chemotherapeutics, radiological contrasts, heavy metals, fungicides, pesticides, organic solvents, animal poisons, fungal or toxic toxins of endogenous origin.
  • acute organic failure As a consequence of the damage caused by ischemia, ischemia reperfusion or toxins in an organ, an acute organic failure can occur.
  • acute failure refers to a clinical syndrome characterized by a sharp deterioration of the function of a certain organ.
  • tissue or organ is from the list comprising: kidney, liver, brain, heart, lung, stomach, intestine, colon, pancreas, bladder, uterus or skin. More preferably, the organ is the kidney.
  • acute renal failure As a result of damage caused by ischemia, ischemia-reperfusion or toxins in the kidney, acute renal failure (ARF) may occur.
  • Acute renal failure refers to a clinical syndrome characterized by an abrupt deterioration of renal function that results in a decrease in glomerular filtration and a accumulation of serum nitrogen products (such as, for example, urea or creatinine), alterations in the hydroelectrolytic balance and acid balance may also occur base.
  • the FRA can be classified into three main groups: functional FRA, parenq u matoso FRA or obstructive FRA.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the cell of the invention for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of an ARF.
  • tissue or organ is from the list comprising: kidney, liver, brain, heart, lung, stomach, intestine, colon, pancreas, bladder, uterus or skin. More preferably, the organ is the kidney.
  • the ARF associated with the damage caused by ischemia-reperfusion is one of the main causes for the initial delay in the function or rejection of a transplanted kidney.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of the cell of the invention for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of rejection of a transplanted kidney.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising the cell of the invention.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the cell of the invention for the prevention or treatment of damage caused by ischemia, ischemia-reperfusion or toxins in a tissue or an organ.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the cell of the invention for the prevention or treatment of damage caused by ischemia, ischemia-reperfusion or toxins in an organ of the list comprising: kidney, liver, brain, heart, lung, stomach, intestine, colon, pancreas, bladder, uterus or skin.
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the cell of the invention for the prevention or treatment of damage caused by ischemia, ischemia-reperfusion or toxins in the kidney.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the cell of the invention for the prevention or treatment of an acute failure of an organ.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the cell of the invention for the prevention or treatment of an acute failure of an organ of the list comprising: kidney, liver, brain, heart, lung , stomach, intestine, colon, pancreas, bladder, uterus or skin.
  • a more preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a Pharmaceutical composition comprising the cell of the invention for the prevention or treatment of an ARF.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the cell of the invention for the prevention or treatment of rejection of a transplanted organ.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the cell of the invention for the prevention or treatment of rejection of a transplanted organ of the list comprising kidney, liver, brain, heart, lung, stomach , intestine, colon, pancreas, bladder, uterus or skin.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the cell of the invention for the prevention or treatment of rejection of a transplanted kidney.
  • the pharmaceutical composition as described above in this document also comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition also comprises another active ingredient.
  • the pharmaceutical composition comprises together with a pharmaceutically acceptable carrier, in addition, another active ingredient.
  • active substance refers to any component that potentially provides a pharmacological activity or other different diagnostic effect , cure, mitigation, treatment or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of the human being or other animals.
  • compositions can be formulated for administration in a variety of ways known in the state of the art.
  • compositions and / or their formulations may be administered to an animal and, more preferably, to a mammal, including a human, by a variety of routes, including, but not limited to parenteral, intraperitoneal, intravenous, intradermal, epidural, intraspinal, intrastromal, intraaricular, intrasynovial, intrathecal, intralesional, intraarterial, intracapsular, intracardiac, intramuscular, intranasal, intracranial, subcutaneous, intraorbital, intracapsular or topical.
  • routes including, but not limited to parenteral, intraperitoneal, intravenous, intradermal, epidural, intraspinal, intrastromal, intraaricular, intrasynovial, intrathecal, intralesional, intraarterial, intracapsular, intracardiac, intramuscular, intranasal, intracranial, subcutaneous, intraorbital, intracapsular or topical.
  • the dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as, for example, age, weight, sex or tolerance of the animal.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of the pharmaceutically effective composition that produces the desired effect and, in general, will be determined among other causes, by the characteristics of said pharmaceutical composition and of the therapeutic effect to be achieved.
  • pharmaceutically acceptable “adjuvants” or “vehicles” that can be used in said compositions are the vehicles known in the state of the art.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for obtaining the cell of the invention comprising:
  • step (a) transfecting the cell of step (a) with a nucleic acid comprising a polynucleotide, wherein said polynucleotide has an identity with SEQ ID NO: 1 selected from the list consists of:
  • the polynucleotide comprised in the nucleic acid transfected in step (b) of the method of the invention is SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide comprised in the nucleic acid transfected in step (b) of the method of the invention is SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide comprised in the nucleic acid transfected in step (b) is operatively linked to at least one control sequence of the list comprising:
  • a promoter that directs the transcription of said polynucleotide
  • b. a start signal of transcription c. a termination signal of the transcript
  • d. a polyadenylation signal e. a transcriptional activator.
  • transfect refers to introducing an exogenous nucleic acid into a eukaryotic cell.
  • the nucleic acid of step (b) of the method of the present invention can be introduced into the cell of the isolated SFM obtained in step (a), for example, but not limited, as a naked nucleic acid or by a vector.
  • vector or “gene transfer vector” refer to systems used in the process of transfection of an exogenous nucleic acid into a cell, thus allowing the vehiculation of the nucleic acid into the cell.
  • the SFM cell is contacted with a gene transfer vector, which comprises the nucleic acid comprising the polynucleotide of step (b), such that the nucleic acid is introduced into the cell under the appropriate conditions for said polynucleotide to be expressed inside the cell.
  • the vector can be viral or non-viral. There are numerous viral and non-viral vectors to introduce exogenous DNA into the stem cells that are well known to those skilled in the art.
  • Appropriate viral vectors for practicing this embodiment of the invention include, but are not limited to the following: adenoviral vectors, adeno-associated vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors, alpha-viral vectors, herpesviral vectors and coronavirus-derived vectors.
  • Non-viral type vectors suitable for practicing this embodiment of the invention include, but are not limited to the following: gene gun, liposomes, polyamines, peptides, dendrimers, cationic glycopolymers, liposome-polycation complexes, proteins and gene transfer systems receiver-mediated
  • the transfection of the nucleic acid of step (b) is performed using an adenoviral vector.
  • the SMF cell obtained in step (a) is a mammalian cell, and more, preferably, of a human. Even more preferably, the SMF cell is a monocyte or a macrophage.
  • Figure 1 Shows the effect of the administration of genetically modified macrophages to overexpress NGAL on renal damage.
  • A Effect on the expression of the functional damage marker of the BUN kidney.
  • B Effect on the expression of the functional damage marker of the creatine kidney.
  • C Effect on histological damage analyzed in tissue sections stained with hematoxylin-eosin. Original magnification x 400.
  • Figure 2 It shows the effect of the administration of genetically modified macrophages to overexpress NGAL on proliferation and renal regeneration.
  • A Effect on the expression of the proliferation and renal regeneration marker Ki67.
  • B Effect on the expression of the creatine renal proliferation and regeneration marker.
  • C Effect on the expression of the regenerative markers PCNA and Statmina analyzed by immunofluorescence.
  • the PCNA is characterized by a nuclear staining of the cells during the late G1 phase and the S phase.
  • Statmina is a cytosolic protein that acts in the transition from the G2 phase to M (see arrows).
  • Original magnification x 400 is a nuclear staining of the cells during the late G1 phase and the S phase.
  • EXAMPLE 1 Genetically modified macrophages for the overexpression of NGAL to induce regeneration in an animal model of renal ischemia-reperfusion.
  • Rats of the strain Sprague Dawley were used, males weighing approximately 225-25Og (Charles River, France). All interventions were carried out under the supervision of the ethical committee of our institution and followed the guidelines of the European Union. The environmental conditions were kept constant, the temperature was 21-22 ° C, the relative humidity of 70% and the alternative light / dark cycles of 12h. The animals were fed a standard AO4 feed diet (Panlab, Barcelona) and water from the Barcelona ad libitum network.
  • the animals were anesthetized with Isoflurane, were placed supine and the body temperature was maintained between 36 and 37 ° C. After performing a middle laparotomy to access the kidney by carefully removing the intestinal package, bilateral ischemia was induced by clamping both renal arteriovenous pedicles for 45 minutes with a nontraumatic microvascular clamp. Subsequently the period of reperfusion, with the removal of the clamp and was verified visually with the observation of the return of blood flow to the kidney. The animal was then sutured and subcutaneous Buprex (4.16 ⁇ g / 100g weight) was administered. Animals subject to a sham operation were used as controls. During the entire operation process, the animals were well hydrated and the body temperature was maintained around 37 ° C.
  • the animals were housed under the control of a veterinarian. After 24h of reperfusion, the animal was sacrificed for the extraction of the kidneys and blood. The tissue was immediately stored in formalin for histological tests or frozen in carbonic snow and subsequently stored at - 80 0 C.
  • I / R NGAL. Animals subjected to I / R but with injection of 10x10 6 genetically modified macrophages to express NGAL per animal, by direct puncture of the inferior vena cava, 1 hour after the onset of reperfusion time.
  • Bgal I / R. Animals subjected to I / R but with injection of 10x10 6 macrophages with the control virus to express ⁇ -Galactosidase per animal, by direct puncture of the inferior vena cava, 1 hour after the start of reperfusion time .
  • DMEM Modified Eagle Medium
  • F-12 1 1 (volume / volume) with high glucose concentration, 15mM Hepes and stable glutamine, supplemented with 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 10%
  • GM-CSF granulocyte and monocyte colony stimulating factor
  • the cells were kept in teflon flashes, non-adherent, for 7 days for macrophage maturation.
  • the macrophages were separated by differential adhesion.
  • the cells were kept in an atmosphere with 5% CO2 in air, at 37 ° C.
  • NGAL adenovirus
  • Ad-NGAL adenovirus
  • Viraquest adenovirus
  • Ad-bgal ⁇ -Galactosidase
  • the titer of each virus was determined by plaque analysis in HeLa cells.
  • the efficiency of each transfection was measured by the determination of protein by ELISA in the cell culture supernatant.
  • Viral transfection was established with a multiplicity of infection (MOI) of 50. At 48 hours post-transfection, macrophages were collected in a tube and kept in PBS until subsequent infusion into the animal. Markers of functional kidney damage.
  • MOI multiplicity of infection
  • Blood urea nitrogen (BUN) and plasma creatinine were analyzed as markers of renal function using an ADVIA 2400 (Siemens Medical Diagnostics) of the Clinical Hospital of Barcelona.
  • the samples were incubated with secondary fluorescent antibodies to reveal staining with PCNA and Statmina in the tissue (rabbit anti-goat IgG conjugated with Alexa Fluor 488 for Statmina and goat anti-mouse IgG conjugated with Alexa Fluor 568 for PCNA; Molecular Probes) during two hours at room temperature in darkness.
  • the cuts were mounted with mowiol (Calbiochem) and the images were obtained by means of a Leica TCS NT laser confocal microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) at an original magnification of x400. RT-PCR in real time.
  • RNA from the kidney samples was extracted using the TRIzol reagent according to the manufacturer's instructions (Invitrogen, Barcelona). Total RNA was extracted from the cells with the RNeasy mini Kit from Qiagen (Madrid) according to the manufacturer's instructions. RNA concentrations were calculated by absorbance determination at 260 nm. The integrity of the RNA thus obtained was examined by analysis of the 18S ribosomal RNA bands and
  • the expression of the genes analyzed was measured by real-time quantitative RT-PCR normalized with the constituent (or houskeeping) gene of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH).
  • GPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • Real-time RT-PCRs were carried out in a Bio-Rad Thermocycler (iCycler iQ Real-Time PCR detection System, Bio-Rad, Barcelona) and amplifications were made in 20 ⁇ l reactions with the RT-PCR Kit with SYBR-Green in two steps (Bio-Rad) according to the manufacturer's instructions.
  • the primers were the following: Ki-67: direct, SEQ ID NO: 5; reverse, SEQ ID NO: 6; PCNA: direct, SEQ ID NO: 7; reverse, SEQ ID NO: 8; NGAL: direct, SEQ ID NO: 9; reverse, SEQ ID NO: 10; TNF-a: direct, SEQ ID NO: 11; reverse, SEQ ID NO: 12; GAPDH: direct, SEQ ID NO: 13; reverse, SEQ ID NO: 14.
  • the data from the other cytokines (IL-1, IL-10, ⁇ L-4) were obtained using pre-validated primers from Qiagen (Barcelona, Spain) with reference numbers QT00181657, QT00106169 and QT00160678, respectively.
  • the cell supernatant was collected, centrifuged and stored at -80 0 C until use.
  • the 96-well ELISA plate was pre-incubated with Anti-mouse
  • Lipocalin-2 / NGAL Lipocalin-2 / NGAL (R&D Systems, Madrid), by adding 1 ⁇ l of the antibody's stock solution, diluted in 99 ⁇ l of 1: 100 carbonate buffer for 18 hours at 4 0 C. After washing the plate, the nonspecific junctions were blocked for 1 h at room temperature.
  • the data are shown as mean +/- the standard error of the mean (SEM), and the values of p> 0.05 were considered significant.
  • the statistical differences between groups were analyzed with an analysis of variance (ANOVA), and in case of significance the t-Student was applied.
  • FIG. 1C Histological analysis of renal tissue sections ( Figure 1C) reveals that the most affected area is in the kidney medulla. After 24 hours of reperfusion, severe interstitial edema, cell infiltration, necrosis, and the deposition of protein material in the tubular lumen are observed. However, treatment with macrophages previously modified to overexpress the NGAL preserves the integrity of the renal tissue. Macrophages treated with the control virus do not have this protective effect and a degree of damage similar to 24 hours of reperfusion is observed.
  • Figure 1C shows representative photos of the three main groups (Sham; I / R; I / R NGAL). Effect of the administration of genetically modified macrophages to overexpress NGAL on proliferation and regeneration.
  • Figure 2A shows the expression of Ki-67, a marker of cell proliferation and regeneration that is expressed during all phases of the cell cycle, except GO.
  • Ki-67 a marker of cell proliferation and regeneration that is expressed during all phases of the cell cycle, except GO.
  • the results of real-time RT-PCR show that after 24 hours of reperfusion Ki-67 is not expressed in the tubular epithelial cells of the kidney and therefore there is no regeneration at this time when the cells are probably dying by apoptosis induced by ischemia-reperfusion.
  • NGAL a marker of cell proliferation and regeneration that is expressed during all phases of the cell cycle, except GO.
  • the results of real-time RT-PCR show that after 24 hours of reperfusion Ki-67 is not expressed in the tubular epithelial cells of the kidney and therefore there is no regeneration at this time when the cells are probably dying by apoptosis induced by ischemia-reperfusion.
  • macrophages treated with the control virus did not have the ability to induce proliferation in
  • Figure 2B shows the expression of PCNA (proliferating cell nuclear antigen), a marker of cell proliferation and regeneration that has a peak of expression in the S phase of the cell cycle, and therefore in mitotically active cells.
  • PCNA proliferation factor receptor
  • the results of real-time RT-PCR show that it is only overexpressed in the group of macrophages overexpressing NGAL. Data are shown as mean +/- SEM, and p values> 0.05 were considered significant. Statistical differences between groups were analyzed with an ANOVA analysis, and in case of significance the t-Student was applied.
  • FIG. 2C shows the regeneration profile by immunofluorescence of PCNA and Statmina.
  • Statmina has been discovered as new proliferation marker in repair after an acute insult for renal ischemia. It is a cytosolic phosphoprotein and is associated with the induction of proliferation and the re-entry of cells in the cell cycle.
  • the PCNA interacts with various molecules, and affects cellular metabolism, DNA repair mechanisms and their synthesis.
  • Figure 3 shows the results of RT-PCR indicating the expression of both pro and anti-inflammatory cytokines after treatment with genetically modified macrophages with Ad-NGAL.
  • the results show a decrease in proinflammatory cytokines, represented by TNF- ⁇ and IL-1, when we administer macrophages treated with the NGAL carrier virus (in animals of the NGAL I / R group) compared to 24-hour inflammation levels. reperfusion in animals not treated (I / R) or treated with the control virus (I / R bgal).
  • anti-inflammatory cytokines represented by IL-10 and IL-4, show an increase after treatment with macrophages that overexpress NGAL.

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Abstract

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biomedicina. Específicamente, la presente invención se refiere a una célula del Sistema Mononuclear Fagocítico o SMF, preferiblemente un monocito o un macrófago, modificada genéticamente para sobreexpresar la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL, en sus siglas en inglés), a un método para su obtención y a su uso para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia seguida de reperfusión o toxinas, fallo agudo o rechazo al transplante de un órgano.

Description

CÉLULA DEL SMF MODIFICADA GENÉTICAMENTE PARA SOBREEXPRESAR NGAL Y SU USO COMO MEDICAMENTO.
La presente invención se encuadra dentro del campo de Ia biomedicina. Específicamente, Ia presente invención se refiere a una célula del Sistema
Mononuclear Fagocítico o SMF, preferiblemente un monocito o un macrófago, modificada genéticamente para sobreexpresar Ia lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL, en sus siglas en inglés), a un método para su obtención y a su uso para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia seguida de reperfusión o toxinas, fallo agudo o rechazo al transplante de un órgano.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La patología de origen isquémico es Ia principal causa de muerte en los países desarrollados. En el caso del riñon, el fallo renal agudo (FRA) es una enfermedad que conlleva una mortalidad de más del 50%, cifra que no ha experimentado cambios significativos en las 4 últimas décadas. Normalmente los pacientes con síntomas clínicos de fallo renal, son tratados después de que el daño se haya desarrollado, excepto en el caso de pacientes a los que se les va practicar un trasplante renal. Puesto que Ia enfermedad está desarrollada cuando el paciente llega al hospital, se requiere urgentemente disponer de vías de curación mediante Ia estimulación del proceso regenerativo y curativo en general.
Una aproximación terapéutica dirigida a disminuir Ia inflamación y el daño renal ha sido Ia terapia celular con macrófagos modificados genéticamente. En este sentido, Ia alteración genética de los macrófagos hacia un fenotipo antiinflamatorio, mediante el tratamiento con adenovirus recombinante para expresar IL-1 ra y su posterior inyección en modelos inflamatorios de enfermedad renal puede reducir Ia infiltración, Ia inflamación glomerular e incluso Ia proteinuria (Holdsworth et al. Lab Invest. 1984, 51 :172-180; Kitamura et al. Kidney Int. 2000, 57:709-716; Kluth et al. Gene Ther. 2000, 7:263-270).
En cuanto a Ia regeneración del riñon dañado, las medidas terapéuticas empleadas hasta ahora, han sido: Ia aplicación de factores de crecimiento (Hirschberg et al. Kidney Int. 1999, 55:2423-2432; Miller y Padanilam. Chapter 17: Molecular responses and growth factors, in : Atlas if diseases of the kidney, Robert W Schrier, p. 17.1-17.16, Blackwell Science Press, Philadelphia, USA. 1999) o ensayos con células madre (Brodsky et al. Am J Physiol Renal Physiol. 2002, 282: F1140-F1149; KaIe et al. J Clin Invest. 2003, 112:42-49; Lin F et al. J Am Soc Nephrol. 2003, 14:1188-1199; Gupta et al. Kidney Int. 2002, 62: 1285-1290; Oliver et al. Clin Invest. 2004, 114: 795-803), pero no se ha conseguido el resultado regenerativo deseado. Estudios previos han demostrado Ia capacidad de Ia terapia con macrófagos para inducir Ia regeneración en modelos animales de isquemia/reperfusión (I/R), si éstos eran administrados en Ia fase no inflamatoria (Vinuesa et al. Journal of Pathology; 2007, 213: 2008 Jan; 214(1 ):104-13).
NGAL es una proteína de 25 kDa de Ia superfamilia de las lipocalinas (Flower. FEBS Lett. 1994, 354: 7-11 ) que actúa sobre Ia proliferación en múltiples tipos celulares (Cowland et al. J Immunol. 2003, 171 : 6630-6639; Gwira et al. J Biol Chem. 2005, 280: 7875-7882). Se trata de una proteína expresada en células tubulares, que aumenta notablemente en respuesta a estímulos dañinos como Ia isquemia o toxicidad. También se ha descrito que mejora Ia apoptosis de Ia célula tubular (Mishra et al. J Am Soc Nephrol. 2004, 15: 3073-3082). Estudios previos han demostrado Ia capacidad de NGAL para inducir Ia regeneración en modelos animales de isquemia/reperfusión (I/R) en Ia fase no inflamatoria del daño renal, pero el efecto es el contrario en Ia fase inflamatoria (Vinuesa E et al. Am J Physiol Renal Physiol. 2008 Nov; 295(5):F1554-62.).
Por tanto, existen estudios que indican Ia capacidad del macrófago para modular y resolver Ia inflamación renal, dependiendo de su fenotipo, y también existen estudios que indican que se puede regenerar el riñon dañado, pero no se conocen terapias que posean Ia doble función antiinflamatoria por una parte y potenciadora de Ia regeneración por otra. Existe por tanto Ia necesidad de disponer de terapias que permitan reducir Ia inflamación y el daño renal, potenciando Ia regeneración renal durante Ia fase inflamatoria del daño renal.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una célula del SMF, preferiblemente un monocito o un macrófago, modificada genéticamente para sobreexpresar NGAL, a un método para su obtención y a su uso para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia seguida de reperfusión o toxinas, de un fallo agudo o del rechazo al transplante de un órgano.
En Ia presente invención se demuestra que macrófagos modificados genéticamente para que sobreexpresen NGAL, son capaces de disminuir Ia inflamación y el daño renal, además de inducir Ia regeneración en un modelo animal de isquemia-reperfusión renal, cuando son administrados en Ia fase inflamatoria del daño renal. La invención, por tanto, provee una terapia que reduce Ia inflamación y el daño renal, potenciando Ia regeneración renal durante Ia fase inflamatoria del daño renal. Esta terapia asimismo puede emplearse en Ia prevención o el tratamiento del daño por isquemia, isquemia seguida de reperfusión o causada por toxinas, de un fallo agudo o del rechazo al transplante de otros órganos.
El macrófago tiene su origen en las células progenitoras pluripotenciales granulo-monocíticas (CGp-GM) de Ia médula ósea. Por acción de los factores de estimulación colonial (CSF), Ia CGp-GM se diferencia en célula progenitora monopotencial monocítica (CGm-M), Ia cual, se diferencia en monoblasto, y éste, a su vez, en promonocito, Ia primera célula morfológicamente identificable como precursora del macrófago y que ya posee algunas de sus características, como adherencia al vidrio y capacidad fagocítica. Por división del promonocito y posterior diferenciación aparecen los monocitos, que abandonan Ia médula ósea pasando a Ia sangre. Los monocitos circulantes pasan por diapédesis a través del endotelio vascular, emigrando hacia los tejidos en los que se diferenciarán en macrófagos, que, a su vez, pueden presentarse en diferentes estados funcionales: residentes, inflamatorios y activados. El conjunto formado por los precursores medulares, los monocitos y los macrófagos tisulares, se engloba actualmente bajo Ia denominación de Sistema Mononuclear Fagocítico (SMF).
Un primer aspecto de Ia invención se refiere a una célula del Sistema Mononuclear Fagocítico (SMF) aislada modificada genéticamente caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno (en adelante, el polinucleótido de Ia invención) que presenta una identidad con Ia SEQ ID NO: 1 seleccionada de Ia lista que consiste en:
a. al menos, un 50 %, b. al menos, un 60 %, c. al menos, un 70 %, d. al menos, un 80 %, y e. al menos, un 90 %,
donde dicha célula del SMF es capaz de inducir Ia regeneración renal durante Ia fase inflamatoria del daño renal. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los ensayos descritos en el Ejemplo que acompaña esta descripción.
La expresión "fase inflamatoria" tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a una primera fase del daño renal caracterizada por un aumento de mediadores inflamatorios, típicamente durante las primeras 24 horas después de un insulto isquémico. A su vez, este ambiente promueve el daño del tejido renal por apoptosis y necrosis. La fase regenerativa se inicia con un cambio del ambiente inflamatorio. El macrófago juega un papel importante en eliminar células muertas que a su vez, estimulan su cambio de fenotipo hacía antiinflamatorio y pro-proliferativo, permitiendo asimismo Ia inducción de Ia regeneración renal.
La expresión "modificada genéticamente" tal y como se utiliza en Ia presente descripción, incluye aquí cualquier célula del SMF en Ia cual el genotipo ha sido alterado de manera que comprende un polinucleótido exógeno, introducido experimentalmente, que presenta una identidad con Ia SEQ ID NO: 1 seleccionada de Ia lista que consiste en:
a. al menos, un 50 %, b. al menos, un 60 %, c. al menos, un 70 %, d. al menos, un 80 %, y e. al menos, un 90 %,
donde dicha célula del SMF es capaz de inducir Ia regeneración renal durante Ia fase inflamatoria del daño renal.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN ó DNA).
En una primera realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende el polinucleótido exógeno con Ia SEQ ID NO: 1 , que corresponde a Ia secuencia nucleótidica del cDNA de Ia proteína NGAL humana (Número de referencia del Genbank: NM_005564).
En una segunda realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende el polinucleótido exógeno con Ia SEQ ID NO: 2, del cDNA de Ia proteína NGAL de ratón (Número de referencia del Genbank: NM_008491 ).
En una tercera realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende el polinucleótido de Ia invención unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de Ia lista que comprende:
a. un promotor que dirija Ia transcripción de dicho polinucleótido, b. una señal de inicio de Ia transcripción, c. una señal de terminación de Ia transcripción, d. una señal de poliadenilación, o e. un activador transcripcional.
"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que afectan Ia expresión de las secuencias a las que están ligadas. En células eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores o silenciadores. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para Ia expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.
"Unidos operativamente" se refiere a una yuxtaposición en Ia que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en Ia manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" al polinucleótido, está ligada al mismo de tal manera que se consigue Ia expresión de Ia secuencia codificadora del polinucleótido.
Como se usa aquí, el término "promotor" hace referencia a una región del DNA situada en posición 5' con respecto al punto de inicio de Ia transcripción y que resulta necesaria o facilita dicha transcripción en una célula animal. Este término incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicos de tipo celular o de tejido o promotores inducibles o reprimibles.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno que codifica Ia proteína NGAL.
En una cuarta realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno que codifica una secuencia aminoacídica que presenta una identidad con Ia SEQ ID NO: 3 seleccionada de Ia lista que consiste en:
a. al menos, un 50 %, b. al menos, un 60 %, c. al menos, un 70 %, d. al menos, un 80 %, y e. al menos, un 90 %,
donde dicha célula del SMF es capaz de inducir Ia regeneración renal durante Ia fase inflamatoria del daño renal. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los ensayos descritos en el Ejemplo que acompaña a esta descripción.
Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados.
En una quinta realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno que codifica Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3, que corresponde a Ia secuencia aminoacídica de Ia proteína NGAL humana (Número de referencia del Genbank: NP_005555).
En una sexta realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia célula del SMF modificada genéticamente está caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno que codifica Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4, que corresponde a Ia secuencia aminoacídica de Ia proteína NGAL de ratón (Número de referencia del Genbank: NP_032517).
Los términos "NGAL", "lipocalina asociada a Ia gelatinasa de neutrófilos" o "lipocalina-2" se refieren a una proteína de 25 kDa de Ia superfamilia de las lipocalinas.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a Ia proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan. El tanto por ciento de identidad existente entre dos secuencias puede ser verificado fácilmente por un experto en Ia materia, por ejemplo, con Ia ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.
Preferiblemente, Ia célula del SMF es una célula de mamífero, y más, preferiblemente, de un humano. Aún más preferiblemente, Ia célula del SMF es un monocito o un macrófago.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia célula del SFM, preferiblemente, un monocito o un macrófago, modificada genéticamente según se ha descrito anteriormente en este documento (de ahora en adelante, célula de Ia invención) para Ia elaboración de un medicamento.
Otro aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento de terapia génica. En general, se entiende por medicamento de terapia génica cualquier producto obtenido mediante un conjunto de procesos de fabricación destinados a transferir, bien in vivo bien ex vivo, un ácido nucleico profiláctico, de diagnóstico o terapéutico a células animales, preferiblemente humanas, y su posterior expresión in vivo. Entre los medicamentos de terapia génica se encuentran, pero sin limitarse los siguientes, ácido nucleico desnudo, vectores no virales, vectores virales o células modificadas genéticamente. Tal y como se utiliza en Ia presente descripción, el término "medicamento de terapia génica", se refiere a cualquier medicamento que comprende una célula del SMF modificada caracterizada porque comprende el polinucleótido de Ia invención. Puede tratarse de medicamentos de terapia génica basados en células autólogas (procedentes del propio paciente), como alogénicas (de otro ser humano) o xenogénicas (de animales).
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento de terapia génica para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia- reperfusión o toxinas en un tejido o un órgano. Preferiblemente, el tejido o el órgano es de Ia lista que comprende: riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Más preferiblemente, el órgano es el riñon.
El término "isquemia" se refiere a una disminución transitoria o permanente del riego sanguíneo en un tejido o un órgano, con Ia consecuente disminución del aporte de oxígeno. El conjunto de los daños que sufre el tejido o el órgano debido a Ia isquemia se conoce como "daño causado por isquemia".
El término "reperfusión" se refiere a Ia restauración del suministro de sangre a un tejido o un órgano que está isquémico como consecuencia de una disminución del riego normal de sangre. La recuperación del riego sanguíneo restaura el aporte de oxígeno y nutrientes al tejido, permitiendo Ia recuperación del tejido o del órgano isquémico. Sin embargo, Ia reperfusión en sí misma puede lesionar el tejido o el órgano isquémico, ocasionando Io que se conoce como "daño causado por reperfusión".
La expresión "daño por isquemia-reperfusión" se refiere al conjunto de los daños que sufre un tejido o un órgano debido a una disminución del riego sanguíneo (isquemia) seguida de una restauración del riego sanguíneo (reperfusión).
La expresión "daño causado por toxinas" se refiere al conjunto de los daños que sufre un tejido o un órgano como consecuencia de su exposición a toxinas como, por ejemplo, pero sin limitarse, antibióticos, anestésicos, quimioterapéuticos, contrastes radiológicos, metales pesados, fungicidas, pesticidas, solventes orgánicos, venenos animales, tóxicos fúngicos o tóxicos de origen endógeno.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia en el riñon o isquemia renal. La isquemia renal consiste en una disminución transitoria o permanente del riego sanguíneo, con Ia consecuente disminución del aporte de oxígeno al riñon, como consecuencia, por ejemplo, pero sin limitarse de una disminución del volumen sanguíneo total, una redistribución de Ia sangre o una obstrucción. La disminución del riego sanguíneo puede ser unilateral, cuando afecta únicamente a un riñon, o bilateral, cuando afecta a los dos ríñones. El conjunto de los daños que sufre el tejido o el órgano debido a Ia isquemia se conoce como "daño causado por isquemia renal".
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia-reperfusión en el riñon o isquemia-reperfusión renal. La expresión "daño por isquemia- reperfusión renal" se refiere al conjunto de los daños que sufre el riñon debido a una disminución del riego sanguíneo (isquemia renal) seguida de una restauración del riego sanguíneo (reperfusión).
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del daño que sufre el tejido renal o el riñon como consecuencia de su exposición a toxinas como, por ejemplo, pero sin limitarse, antibióticos, anestésicos, quimioterapéuticos, contrastes radiológicos, metales pesados, fungicidas, pesticidas, solventes orgánicos, venenos animales, tóxicos fúngicos o tóxicos de origen endógeno.
Como consecuencia de los daños causados por isquemia, isquemia- reperfusión o toxinas en un órgano puede producirse un fallo agudo orgánico. Los términos "fallo agudo", "fallo orgánico agudo" o "fracaso orgánico agudo", se refieren a un síndrome clínico que se caracteriza por un deterioro brusco de Ia función de un determinado órgano.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de un fallo agudo de un órgano. Preferiblemente, el tejido o el órgano es de Ia lista que comprende: riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Más preferiblemente, el órgano es el riñon.
Como consecuencia de los daños causados por isquemia, isquemia- reperfusión o toxinas en el riñon puede producirse un fallo renal agudo (FRA). Los términos "fallo renal agudo", "fracaso renal agudo" o "insuficiencia renal aguda (IRA)" se refieren a un síndrome clínico que se caracteriza por un deterioro brusco de Ia función renal que tiene como consecuencia una disminución del filtrado glomerular y una acumulación de productos nitrogenados séricos (como, por ejemplo, urea o creatinina), pudiendo también producirse alteraciones del equilibrio hidroelectrolítico y del equilibrio ácido base. El FRA puede clasificarse en tres grandes grupos: FRA funcional, FRA parenq u ¡matoso o FRA obstructivo. En el FRA funcional existe una inadecuada perfusión renal que compromete el filtrado glomerular, pero el parénquima glomerular está íntegro. La insuficiencia renal que se produce durante el FRA funcional es reversible tras restaurar el flujo plasmático, pero si persiste Ia situación que Io ha desencadenado evolucionará hacia un FRA parenquimatoso. En el FRA parenquimatoso Ia causa del deterioro de Ia función renal es un daño en las diferentes estructuras anatómicas renales, que da lugar a diferentes síndromes clínicos: el túbulo (necrosis tubular aguda), el glomérulo (necrosis glomerular), el intersticio tubular (necrosis tubular intersticial) o los vasos sanguíneos. En el FRA obstructivo se produce un aumento de Ia presión en Ia vía urinaria, que se transmite retrógradamente, comprometiendo el filtrado glomerular normal, como consecuencia de Ia obstrucción de alguno de los conductos del riñon.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de un FRA.
Una de las situaciones más frecuentes de daño causado por isquemia- reperfusión tiene lugar en el transplante de órganos. De hecho, el fallo orgánico agudo es una de las primeras causas por las que se produce el rechazo de órganos transplantados.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado. Preferiblemente, el tejido o el órgano es de Ia lista que comprende: riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Más preferiblemente, el órgano es el riñon. El FRA asociado al daño causado por isquemia-reperfusión es una de las principales causas por las que se produce el retraso inicial en Ia función o el rechazo de un riñon transplantado.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia célula de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del rechazo de un riñon transplantado.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxinas en un tejido o un órgano. Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxinas en un órgano de Ia lista que comprende: riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Una realización más preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxinas en el riñon.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento de un fallo agudo de un órgano. Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento de un fallo agudo de un órgano de Ia lista que comprende: riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Una realización más preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento de un FRA.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado. Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado de Ia lista que comprende riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel. Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende Ia célula de Ia invención para Ia prevención o el tratamiento del rechazo de un riñon transplantado.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia composición farmacéutica según se ha descrito anteriormente en este documento, comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización más preferida de Ia presente invención, Ia composición farmacéutica comprende además otro principio activo. En una realización más preferida de Ia presente invención, Ia composición farmacéutica comprende junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, además, otro principio activo.
Como se emplea aquí, los términos "principio activo", "sustancia activa", sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" o "ingrediente farmacéuticamente activo" se refiere a cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad, o que afecte a Ia estructura o función del cuerpo del ser humano u otros animales. Las composiciones pueden formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de Ia técnica. Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal y, más preferiblemente, a un mamífero, incluyendo a un humano, por una variedad de vías, incluyendo, pero sin limitarse a parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraaricular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracapsular, intracardiaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular o tópica.
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como, por ejemplo, edad, peso, sexo o tolerancia del animal. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad de Ia composición farmacéuticamente efectiva que produzca el efecto deseado y, en general, vendrá determinada entre otras causas, por las características propias de dicha composición farmacéutica y del efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" o "vehículos" farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos en el estado de Ia técnica.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un método para obtener Ia célula de Ia invención que comprende:
a. obtener una célula del SFM aislada, y b. transfectar Ia célula del paso (a) con un ácido nucleico que comprende un polinucleótido, donde dicho polinucleótido presenta una identidad con Ia SEQ ID NO: 1 seleccionada de Ia lista consiste en:
i) al menos, un 50 %, ii) al menos, un 60 %, iii) al menos, un 70 %, iv) al menos, un 80 %, y v) al menos, un 90 %.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el polinucleótido comprendido en el ácido nucleico transfectado en el paso (b) del método de Ia invención es Ia SEQ ID NO: 1.
En otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, el polinucleótido comprendido en el ácido nucleico transfectado en el paso (b) del método de Ia invención es Ia SEQ ID NO: 2.
En una realización más preferida de este aspecto de Ia invención, el polinucleótido comprendido en el ácido nucleico transfectado en el paso (b) está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de Ia lista que comprende:
a. un promotor que dirija Ia transcripción de dicho polinucleótido, b. una señal de inicio de Ia transcripción, c. una señal de terminación de Ia transcripción, d. una señal de poliadenilación, o e. un activador transcripcional.
El término "transfectar", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a introducir un ácido nucleico exógeno al interior de una célula eucariota.
El ácido nucleico del paso (b) del método de Ia presente invención puede ser introducido al interior de Ia célula del SFM aislada obtenida en el paso (a), por ejemplo, pero sin limitarse, como ácido nucleico desnudo o mediante un vector.
Tal como se utiliza en Ia presente invención los términos "vector" o "vector de transferencia géncica", se refieren a sistemas utilizados en el proceso de transfección de un ácido nucleico exógeno al interior de una célula, permitiendo de este modo Ia vehiculación del ácido nucleico al interior de Ia célula.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia célula del SFM se pone en contacto con un vector de transferencia génica, el cual comprende el ácido nucleico que comprende el polinucleótido del paso (b), de tal manera que el ácido nucleico es introducido en Ia célula bajo las condiciones apropiadas para que dicho polinucleótido sea expresado en el interior de Ia célula. El vector puede ser viral o no viral. Existen numerosos vectores virales y no virales para introducir DNA exógeno dentro de las células madre que son bien conocidos para aquellos expertos en Ia materia. Vectores virales apropiados para poner en práctica esta realización de Ia invención incluyen, pero no están limitados a los siguientes: vectores adenovirales, vectores adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores alfavirales, vectores herpesvirales y vectores derivados de coronavirus. Vectores de tipo no viral apropiados para poner en práctica esta realización de Ia invención incluyen, pero no están limitados a los siguientes: gene gun, liposomas, poliaminas, péptidos, dendrímeros, glicopolímeros catiónicos, complejos liposoma-policatión, proteínas y sistemas de transferencia génica mediados por receptor.
En una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención, Ia transfección del ácido nucleico del paso (b) se realiza empleando un vector adenoviral.
Preferiblemente, Ia célula del SMF obtenida en el paso (a) es una célula de mamífero, y más, preferiblemente, de un humano. Aún más preferiblemente, Ia célula del SMF es un monocito o un macrófago.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra el efecto de Ia administración de los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre el daño renal. A. Efecto sobre Ia expresión del marcador de daño funcional del riñon BUN. B. Efecto sobre Ia expresión del marcador de daño funcional del riñon creatina. A y B. Datos representados como Ia media +/- SEM; p<0,05; n=5. C. Efecto sobre el daño histológico analizado en secciones de tejido teñidas con hematoxilina-eosina. Magnificación original x 400.
Figura 2. Muestra el efecto de Ia administración de los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre Ia proliferación y Ia regeneración renal. A. Efecto sobre Ia expresión del marcador de proliferación y regeneración renal Ki67. B. Efecto sobre Ia expresión del marcador de proliferación y regeneración renal creatina. A y B. Datos representados como Ia media +/- SEM; p<0,05; n=5. C. Efecto sobre Ia expresión de los marcadores regenerativos PCNA y Statmina analizada mediante inmunofluorescencia. El PCNA se caracteriza por una tinción nuclear de las células durante Ia fase G1 tardía y fase S. La Statmina sin embargo es una proteína citosólica que actúa en Ia transición de Ia fase G2 a M (ver flechas). Magnificación original x 400.
Figura 3. Muestra el efecto de Ia administración de los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre Ia inflamación. Efecto sobre Ia expresión de las citoquinas pro-inflamatorias TNF-α (A) e IL-1 (B). Efecto sobre Ia expresión de las citoquinas anti-inflamatorias IL-10 (C) e IL-4 (D). A-C. Datos representados como Ia media +/- SEM; p<0,05; n=5. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de aplicación de Ia misma.
EJEMPLO 1. Macrófagos modificados genéticamente para Ia sobreexpresión de NGAL para inducir Ia regeneración en un modelo animal de isquemia-reperfusión renal.
MATERIAL Y MÉTODOS EMPLEADOS
Modelo de isquemia-reperfusión renal
Se utilizaron ratas de Ia cepa Sprague Dawley, machos de un peso aproximadamente de 225-25Og (Charles River, Francia). Todas las intervenciones se realizaron bajo Ia supervisión del comité ético de nuestra institución y siguieron las pautas de Ia Unión Europea. Las condiciones ambientales se mantuvieron constantes, Ia temperatura fue de 21-22°C, Ia humedad relativa del 70% y los ciclos alternativos de luz/oscuridad de 12h. Los animales fueron alimentados con una dieta estándar de pienso AO4 (Panlab, Barcelona) y agua de Ia red de Barcelona ad libitum.
Los animales fueron anestesiados con Isoflurane, se colocaron en posición supina y se mantuvo Ia temperatura corporal entre 36 y 37°C. Después de realizar una laparotomía media para acceder al riñon apartando cuidadosamente el paquete intestinal, se indujo Ia isquemia bilateral mediante el clampaje de ambos pedículos arteriovenosos renales durante 45 minutos con un clamp microvascular no-traumático. Posteriormente se inició el período de reperfusión, con Ia retirada del clamp y se verificó visualmente con Ia observación del regreso del flujo sanguíneo al riñon. A continuación se suturó el animal y se administró Buprex subcutáneo (4,16μg/100g de peso). Animales sujetos a una operación sham fueron utilizados como controles. Durante todo el proceso de operación, los animales fueron bien hidratados y Ia temperatura corporal se mantuvo alrededor de 37°C. Durante el tiempo de reperfusión, los animales se estabularon bajo el control de un veterinario. Pasadas 24h de reperfusión, el animal se sacrificó para Ia extracción de los ríñones y de sangre. El tejido fue conservado inmediatamente en formol para las pruebas histológicas o congelado en nieve carbónica y posteriormente almacenado a - 800C.
Grupos de estudio.
I/R.- Animales sometidos a 45 minutos de isquemia y 24 horas de reperfusión.
I/R NGAL.- Animales sometidos a I/R pero con inyección de 10x106 macrófagos genéticamente modificados para expresar NGAL por animal, mediante punción directa de Ia vena cava inferior, 1 hora después del inicio del tiempo de reperfusión. I/R bgal.- Animales sometidos a I/R pero con inyección de 10x106 macrófagos con el virus control para expresar Ia β-Galactosidasa por animal, mediante punción directa de Ia vena cava inferior, 1 hora después del inicio del tiempo de reperfusión.
Sham NGAL.- Animales control, no sometidos a isquemia/reperfusión y con administración de 10x106 macrófagos modificados genéticamente para expresar NGAL por animal.
Sham bgal.- ídem que SHAM NGAL, pero con inyección de macrófagos con el virus control para expresar Ia β-Galactosidasa. Cultivo celular de macrófagos primarios derivados de Ia medula ósea, transfección viral y posterior infusión al animal.
Células derivadas de Ia medula ósea de ratas Sprague Dawley fueron recogidas mediante Ia aspiración de los fémures y se cultivaron en Dulbecco's
Modified Eagle Médium (DMEM):F-12 1 :1 (volumen/volumen) con concentración alta de glucosa, 15mM Hepes y glutamina estable, suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml estreptomicina, 10%
(volumen final) suero bovino fetal inactivado, y 10ng/ml del factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF) (Invitrogen, Barcelona).
Las células se mantuvieron en flascones de teflón, no adherentes, durante 7 días para Ia maduración a macrófagos.
Posteriormente, los macrófagos fueron separados mediante adherencia diferencial. Las células se mantuvieron en una atmósfera con 5% CO2 en aire, a 37°C.
Para Ia transfección viral, 10x106 células fueron transfectadas con un adenovirus para sobreexpresar el NGAL (Ad-NGAL; producido y purificado por Viraquest, USA). Como virus control utilizamos un vector similar para Ia expresión de β-Galactosidasa (Ad-bgal), que fue producido en células HEK 293 y purificado por gradiente de cloruro de cesio. El título de cada virus fue determinado mediante análisis en placa en células HeLa. La eficiencia de cada transfección fue medida mediante Ia determinación de proteína por ELISA en el sobrenadante del cultivo celular. La transfección viral se estableció con una multiplicidad de infección (MOI) de 50. A las 48 horas post-transfección, los macrófagos fueron recogidos en un tubo y se mantuvieron en PBS hasta su posterior infusión en el animal. Marcadores de daño funcional del riñon.
Nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina en plasma fueron analizados como marcadores de función renal utilizando un ADVIA 2400 (Siemens Medical Diagnostics) del Hospital Clínico de Barcelona.
Análisis histológico.
Las muestras fueron incluidas en parafina, cortadas en secciones de 4μm, y teñido con hematoxilina y eosina (H&E). Evaluación del daño histológico fue determinado mediante microscopía convencional.
Inmunofluorescencia de los marcadores regenerativos PCNA y Statmina.
Todas las muestras se fijaron en formaldehído al 4% y posteriormente se incluyeron en parafina. Se realizaron cortes de 4μm que fueron lavados en xilol, y deshidratados mediante alcoholes de graduación decreciente, con lavado en PBS y posterior bloqueo de uniones inespecíficas con suero de cabra durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se incubaron las muestras con PCNA (Santa Cruz Biotechnology) y Statmina (Calbiochem) para detectar Ia regeneración en el tejido renal. Las muestras se incubaron con anticuerpos fluorescentes secundarios para revelar Ia tinción con PCNA y Statmina en el tejido (rabbit anti-goat IgG conjugado con Alexa Fluor 488 para Statmina y goat anti-mouse IgG conjugado con Alexa Fluor 568 para PCNA; Molecular Probes) durante dos horas a temperatura ambiente en oscuridad. Los cortes fueron montados con mowiol (Calbiochem) y las imágenes se obtenían mediante un microscopio confocal láser Leica TCS NT (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) a una magnificación original de x400. RT-PCR a tiempo real.
El RNA de las muestras de riñon fue extraído mediante el reactivo TRIzol de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Barcelona). Se extrajo el RNA total de las células con el RNeasy mini Kit de Qiagen (Madrid) acorde a las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de RNA fueron calculadas por determinación de absorbancia a 260 nm. La integridad del RNA así obtenido se examinó mediante análisis de las bandas de RNA ribosomal 18S y
28S detectado y analizado en el Bioanalyzer del Hospital Clínico Barcelona (Agilent).
La expresión de los genes analizados se midió mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real normalizada con el gen constitutivo (o houskeeping, en inglés) de gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Las RT-PCRs a tiempo real se llevaron a cabo en un Termociclador Bio-Rad (iCycler iQ Real-Time PCR detection System, Bio-Rad, Barcelona) y las amplificaiones se hicieron en reacciones de 20 μl con el RT-PCR Kit con SYBR-Green en dos pasos (Bio- Rad) según las instrucciones del fabricante. Los primers fueron los siguientes: Ki-67: directo, SEQ ID NO: 5; inverso, SEQ ID NO: 6; PCNA: directo, SEQ ID NO: 7; inverso, SEQ ID NO: 8; NGAL: directo, SEQ ID NO: 9; inverso, SEQ ID NO: 10; TNF-a: directo, SEQ ID NO: 11 ; inverso, SEQ ID NO: 12; GAPDH: directo, SEQ ID NO: 13; inverso, SEQ ID NO: 14. Los datos de las demás citoquinas (IL-1, IL-10, ÍL-4) fueron obtenidas usando primers pre-validados de Qiagen (Barcelona, España) con los números de referencia QT00181657, QT00106169 y QT00160678, respectivamente.
ELISA de NGAL.
El sobrenadante de las células fue recogido, centrifugado y guardado a -80 0C hasta su uso. La placa de ELISA de 96 pocilios se preincubó con Anti-mouse
Lipocalin-2/NGAL (R&D Systems, Madrid), mediante Ia adición de 1 μl de Ia solución madre del anticuerpo, diluido en 99μl de tampón carbonato 1 :100 durante 18 horas a 40C. Tras lavado de Ia placa, se bloquearon las uniones inespecíficas durante 1 h a temperatura ambiente.
Se añadieron 50μl_ de cada muestra a Ia placa de ELISA y se mantuvieron 1 hora a temperatura ambiente., Tras otro lavado, se añadieron 100 μl de un anticuerpo de detección biotiniliado, Anti-Mouse Lipocalin-2/NGAL (R&D Systems, Madrid), obtenido tras dilución de 1 μl de Ia solución madre en 99 μl de tampón de dilución 1 :100. El anticuerpo biotinilado se incubó durante 1 h a temperatura ambiente.
Posteriormente se añadieron 100 μl de avidina HRP-conjugada (Zymed, Invitrogen, Barcelona), obtenida tras dilución de 1 μl de Ia solución madre en 1999 μl de tampón de dilución 1 :2000. Se incubó durante 1 h a temperatura ambiente, para reconocer Ia unión del anticuerpo biotiniliado.
Finalmente se aplicó el agente colorante (OPD tablets, Dako, Barcelona) para medir Ia absorbancia a 492 nm.
Análisis estadístico.
Los datos se muestran como media +/- el error estándar de Ia media (SEM), y los valores de p>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis de varianza (ANOVA), y en caso de significancia se aplicó Ia t-Student.
RESULTADOS OBTENIDOS.
Efecto de Ia administración de los macrófaqos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre el daño renal.
Como se observa en Ia figura 1A, el nitrógeno ureico en sangre (BUN), marcador de daño renal funcional, se incrementa significativamente en el grupo de isquemia-reperfusión. Sin embargo, al administrar macrófagos genéticamente modificados para sobreexpresar NGAL se observa un descenso significativo de este parámetro de daño. En ninguno de los grupos a los que se administró macrófagos transfectados con el virus control (Sham bgal; I/R bgal) se pudo detectar ningún efecto protector respecto a sus respectivos controles (Sham; I/R). Los datos se muestran como media +/- SEM, y los valores de p>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis ANOVA, y en caso de significancia se aplicó Ia t-Student.
Como se observa en Ia figura 1 B, Ia creatinina en sangre, marcador de daño renal funcional, se incrementa significativamente en el grupo de isquemia- reperfusión. Sin embargo, al administrar macrófagos genéticamente modificados para sobreexpresar NGAL se observa un descenso significativo de este parámetro de daño. En ninguno de los grupos a los que se les administró macrófagos transfectados con el virus control (Sham bgal; I/R bgal) se pudo detectar ningún efecto protector respecto a sus respectivos controles (Sham; I/R). Los datos se muestran como media +/- SEM, y los valores de p>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis ANOVA, y en caso de significancia se aplicó Ia t- Student.
El análisis histológico de cortes del tejido renal (figura 1C) revela que el área más afectada se encuentra en Ia médula del riñon. A las 24 horas de reperfusión se observa edema intersticial grave, infiltración de células, necrosis, y Ia deposición de material proteico en el lumen tubular. Sin embargo, el tratamiento con macrófagos previamente modificados para sobreexpresar el NGAL preserva Ia integridad del tejido renal. Los macrófagos tratados con el virus control no tienen este efecto protector y se observa un grado de daño parecido a las 24 horas de reperfusión. En Ia figura 1C se muestran fotos representativas de los tres grupos principales (Sham; I/R; I/R NGAL). Efecto de Ia administración de los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre Ia proliferación y Ia regeneración.
En Ia figura 2A se muestra Ia expresión de Ki-67, marcador de proliferación celular y regeneración que se expresa durante todas las fases del ciclo celular, excepto GO. Los resultados de Ia RT-PCR a tiempo real muestran que a las 24 horas de reperfusión no se expresa Ki-67 en las células epiteliales tubulares del riñon y por Io tanto no hay regeneración en este tiempo en que las células probablemente están muriendo por apoptosis inducida por Ia isquemia- reperfusión. Al contrario, al administrar macrófagos sobreexpresando el NGAL detectamos un aumento significativo de Ia proliferación celular en el tejido y por Io tanto una avanzada regeneración al tiempo de 24 horas de reperfusión. Los macrófagos tratados con el virus control no tuvieron Ia capacidad de inducir Ia proliferación en el tejido renal Io que nos indica que es el NGAL el responsable de promover Ia regeneración renal. Los datos se muestran como media +/- SEM, y los valores de p>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis ANOVA, y en caso de significancia se aplicó Ia t-Student.
En Ia figura 2B se muestra Ia expresión de PCNA (proliferating cell nuclear antigen), marcador de proliferación celular y regeneración que tiene un pico de expresión en Ia fase S del ciclo celular, y por Io tanto en células mitóticamente activas. Los resultados de Ia RT-PCR a tiempo real muestran que solo se encuentra sobreexpresado en el grupo de macrófagos sobreexpresando NGAL. Los datos se muestran como media +/- SEM, y los valores de p>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis ANOVA, y en caso de significancia se aplicó Ia t- Student.
La figura 2C muestra el perfil de regeneración mediante inmunofluorescencia de PCNA y Statmina. Recientemente, Ia Statmina se ha descubierto como nuevo marcador de proliferación en Ia reparación tras un insulto agudo por isquemia renal. Es una fosfoproteína citosólica y está asociada a Ia inducción de proliferación y Ia reentrada de células en el ciclo celular. El PCNA sin embargo interactúa con diversas moléculas, y afecta al metabolismo celular, a los mecanismos de reparación del DNA y a su síntesis. Detectamos mediante miscroscopía confocal que el tratamiento con macrófagos sobreexpresando Ia NGAL efectivamente inducen tanto las expresión de PCNA como de Statmina a un nivel muy alto. Estas observaciones confirman el papel clave de Ia NGAL en Ia inducción de Ia regeneración renal. Al contrario, cuando administramos macrófagos transfectados con el virus control, no se detecta ningún efecto sobre Ia proliferación celular y los niveles de expresión de PCNA y Statmina se parecen al grupo de 24 horas de reperfusión.
Efecto de Ia administración de los macrófagos modificados genéticamente para sobreexpresar NGAL sobre Ia inflamación.
La figura 3 muestra los resultados de RT-PCR que indican Ia expresión de citoquinas tanto pro- como antiinflamatorias tras el tratamiento con macrófagos genéticamente modificadas con Ad-NGAL. Los resultados muestran una disminución de citoquinas proinflamatorias, representadas por TNF-α e IL-1 , cuando administramos macrófagos tratados con el virus portador de NGAL (en los animales del grupo I/R NGAL) comparado con los niveles de inflamación a las 24 horas de reperfusión en los animales no tratados (I/R) o tratados con el virus control (I/R bgal). Al contrario, las citoquinas antiinflamatorias, representadas por IL-10 e IL-4, muestran un aumento tras el tratamiento con macrófagos que sobreexpresan NGAL. Por Io tanto podemos deducir un efecto protector y antiinflamatorio con el tratamiento de macrófagos genéticamente modificados y el papel clave de NGAL en estos procesos. Los datos se muestran como media +/- SEM, y los valores de p>0,05 se consideraron significativos. Las diferencias estadísticas entre grupos se analizaron con un análisis ANOVA, y en caso de significancia se aplicó Ia t-Student.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Célula del Sistema Mononuclear Fagocítico (SMF) aislada modificada genéticamente caracterizada porque comprende un polinucleótido exógeno que presenta una identidad con Ia SEQ ID NO: 1 seleccionada de Ia lista que consiste en:
a. al menos, un 50 %, b. al menos, un 60 %, c. al menos, un 70 %, d. al menos, un 80 %, y e. al menos, un 90 %,
2. Célula del SMF modificada genéticamente según Ia reivindicación 1 caracterizada porque comprende el polinucleótido exógeno con Ia SEQ ID NO:
1.
3. Célula del SMF modificada genéticamente según Ia reivindicación 1 caracterizada porque comprende el polinucleótido exógeno con Ia SEQ ID NO: 2.
4. Célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el polinucleótido exógeno está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de Ia lista que comprende:
a. un promotor que dirija Ia transcripción de dicho polinucleótido, b. una señal de inicio de Ia transcripción, c. una señal de terminación de Ia transcripción, d. una señal de poliadenilación, o e. un activador transcripcional.
5. Célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el polinucleótido exógeno codifica una secuencia aminoacídica que presenta una identidad con Ia SEQ ID NO: 3 seleccionada de Ia lista que consiste en:
a. al menos, un 50 %, b. al menos, un 60 %, c. al menos, un 70 %, d. al menos, un 80 %, y e. al menos, un 90 %,
6. Célula del SMF modificada genéticamente según Ia reivindicación 5 donde el polinucleótido exógeno codifica Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3.
7. Célula del SMF modificada genéticamente según Ia reivindicación 5 donde el polinucleótido exógeno codifica Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4.
8. Célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde dicha célula es un monocito o un macrófago.
9. Composición farmacéutica que comprende Ia célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 9 que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10 que además comprende otro principio activo.
12. Uso de Ia célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para Ia elaboración de un medicamento.
13. Uso de Ia célula del SMF modificada genéticamente según Ia reivindicación 12 para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del daño causado por isquemia, isquemia-reperfusión o toxinas en un tejido o un órgano.
14. Uso de Ia célula del SMF modificada genéticamente según Ia reivindicación 12 para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de un fallo agudo de un órgano.
15. Uso de Ia célula del SMF modificada genéticamente según Ia reivindicación 12 para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento del rechazo de un órgano transplantado.
16. Uso de Ia célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 donde el órgano es de Ia lista que comprende: riñon, hígado, cerebro, corazón, pulmón, estómago, intestino, colon, páncreas, vejiga, útero o piel.
17. Uso de Ia célula del SMF modificada genéticamente según Ia reivindicación 16 donde el órgano es el riñon.
18. Método de obtención de Ia célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende:
a. obtener una célula del SFM aislada, y b. transfectar Ia célula del paso (a) con un ácido nucleico que comprende un polinucleótido, donde dicho polinucleótido presenta una identidad con Ia SEQ ID NO: 1 seleccionada de Ia lista consiste en: i) al menos, un 50 %, ii) al menos, un 60 %, iii) al menos, un 70 %, iv) al menos, un 80 %, y v) al menos, un 90 %.
19. Método de obtención de Ia célula del SMF modificada genéticamente según Ia reivindicación 18 donde el polinucleótido del paso (b) es Ia SEQ ID NO: 1.
20. Método de obtención de Ia célula del SMF modificada genéticamente según Ia reivindicación 18 donde el polinucleótido del paso (b) es Ia SEQ ID NO: 2.
21. Método de obtención de Ia célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 donde el polinucleótido del paso (b) está unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de Ia lista que comprende:
a. un promotor que dirija Ia transcripción de dicho polinucleótido, b. una señal de inicio de Ia transcripción, c. una señal de terminación de Ia transcripción, d. una señal de poliadenilación, o e. un activador transcripcional.
22. Método de obtención de Ia célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 donde Ia transfección del ácido nucleico del paso (b) se realiza empleando un vector adenoviral.
23. Método de obtención de Ia célula del SMF modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 donde Ia célula del SFM aislada en el paso (a) es un monocito o un macrófago.
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