WO2010130862A1 - Peroxidasas de elevado potencial redox diseñadas por evolución dirigida - Google Patents

Peroxidasas de elevado potencial redox diseñadas por evolución dirigida Download PDF

Info

Publication number
WO2010130862A1
WO2010130862A1 PCT/ES2010/070316 ES2010070316W WO2010130862A1 WO 2010130862 A1 WO2010130862 A1 WO 2010130862A1 ES 2010070316 W ES2010070316 W ES 2010070316W WO 2010130862 A1 WO2010130862 A1 WO 2010130862A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
amino acid
sequence
activity
isolated polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2010/070316
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Eva GARCÍA RUIZ
María Jesús MARTÍNEZ HERNÁNDEZ
Francisco Javier RUIZ DUEÑAS
Ángel T. MARTÍNEZ FERRER
Miguel Alcalde Galeote
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Publication of WO2010130862A1 publication Critical patent/WO2010130862A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes

Definitions

  • the present invention is within the field of molecular biology, recombinant DNA technology and biotechnology. Specifically it refers to enzymes of the group of ligninolytic peroxidases, improved in their functional expression, catalytic activity and thermal stability, their uses and the procedure for obtaining them.
  • the functional expression as well as the improvement of activity and thermal stability of these peroxidases is carried out in eukaryotic Saccharomyces cerevisiae cells through a process of directed molecular evolution.
  • Said enzymes can be used as catalysts in industrial processes related to the transformation of lignocellulosic biomass to obtain cellulose products, biofuels, the food sector, the development of detergents, textile production and the chemical sector, as well as in the processing of the effluents originated in these processes.
  • Peroxidases (EC 1.11.1) are oxidoreductases that use H2O2 or other hydroperoxides as divalent oxidants of the enzyme. Once activated, the protein catalyzes successively two monovalent oxidations of different aromatic compounds, dyes, metal ions and other substrates. Said catalysis is carried out through the heme group, a protoporphyrin IX with an iron atom, which acts as a cofactor of most peroxidases and is located in a central cavity connected to the surface of the enzyme by one or more channels that allow substrates to access this catalytic center.
  • the peroxidases have been divided into two superfamilies based on their structural differences: the superfamily of animal peroxidases and Ia bacterial, fungal and plant peroxidases superfamily (Welinder. 1992. Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 388-393). Plant peroxidases have been the most studied, especially that of horseradish (Armoracia rusticana) known by its acronym in English (HRP), but it is the fungi that have the greatest biotechnological potential. This is because this class includes the peroxidases of ligninolytic basidiomycetes, characterized by their high redox potential (E 0 ' > +1000 mV) (Ruiz-Due ⁇ as et al., 2009.
  • LiP lignin peroxidases
  • MnP manganese peroxidases
  • VP versatile peroxidases
  • LiP EC 1.11.1.13
  • veratrilic alcohol is one of the most common substrates of the enzyme. It is an aromatic metabolite secreted by fungi that degrade lignin and that is also formed during its degradation (the substrate usually used to measure LiP activity) that can act as a short-distance redox mediator due to its low stability- during the depolymerization of lignin.
  • the VP (EC 1.11.1.16) described mainly in Pleurotus and Bjerkandera species (Mart ⁇ nez 2002. Enzyme Microb. Technol.
  • the VP presents in its structure a hypothetical manganese binding site, responsible for the oxidation of Mn 2+ to Mn 3+ , (as well as MnP) and a catalytic tryptophan, responsible for the oxidation of aromatic compounds of high redox potential (as well as LiP).
  • the VP itself is capable of oxidizing phenolic compounds (such as plant peroxidases), azo dyes and in general of high redox potential - such as Reactive Black 5- or polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) that LiP can only oxidize in the presence of veratrilic alcohol and the MnP cannot oxidize even in the presence of Mn 2+ .
  • PHAs Reactive Black 5- or polycyclic aromatic hydrocarbons
  • the optimum pH for the oxidation of these substrates varies from pH 5.0 for the oxidation of Mn 2+ to pH 3.0 for veratrilic alcohol, similar values to those optimal for the oxidation of these same substrates by MnP and LiP, respectively.
  • VP Pleurotus eryngii
  • thistle mushroom a model fungus for studies of selective degradation of lignin. Its characterization has included spectroscopic and crystallographic analyzes and the application of directed mutagenesis, which has made the VP a model both for the study of general mechanisms of peroxidases catalysis and for the establishment of the structural bases of its catalytic properties unique.
  • VP presents a site for the oxidation of compounds of low redox potential (0.6-0.8 V) such as phenols and ABTS (2,2'-azinobis- (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonate).
  • ligninolytic enzymes of high redox potential can be used in practically the entire production chain of paper products - from the production of paper pulp to the treatment of effluents - although it is in chlorine free bleaching of Pasta where it is more attractive.
  • ligninolytic enzymes find applications in the following sectors (Xu, 2005. Industrial Biotechnology 1: 38-50):
  • the food industry processing of beverages or bakery products.
  • the textile industry degradation (detoxification) of the effluent dyes or tissue bleaching (washing of the stone dejaans).
  • Nanobiotechnology a) as detectors of phenols, oxygen, azides, morphine, codeine, catecholamines or flavonoids in the preparation of biosensors for clinical and environmental analyzes; and b) production of fuel biopiles.
  • Bioremediation degradation of PAHs, AOX compounds, etc.
  • Chemical synthesis production of complex polymers, synthesis of pharmacological agents, preparation of antibiotic and cosmetic derivatives.
  • ligninolytic peroxidases at the industrial level requires robust expression systems that provide high levels of active enzyme.
  • heterologous expression systems enables the production of peroxidases of high redox potential from different sources in the same host, as well as new variants with improved properties with respect to the wild enzyme.
  • E. coli is the host organism most frequently used in the heterologous functional expression of the genes encoding the protein of interest.
  • the different use of codons and the impossibility of making the post-translational modifications necessary for the correct secretion of the mature protein can cause an inappropriate folding of the protein that is accumulated in bodies of inclusion, preventing its expression functional.
  • coli allows the construction of libraries in vivo through the homologous recombination of different genes (known as in vivo DNA shuffling or "shuffled"). Finally, the ligation of the mutated genes into expression vectors is, in many cases, a laborious step that requires a fine adjustment. In yeasts, the in vivo gap repair mechanism can replace in vitro ligation quickly and accurately (Bulter & Mayor, 2003. Directed evolution: library creation. Methods and protocols. Ed. Arnold, FH and Georgiou , G. Human Press, Totowa, New Jersey (USA), pp. 17-22.). However, the functional expression of ligninolytic peroxidases in S. cerevisiae has low yields probably due to the different molecular mechanisms and incompatibilities between the starting fungus (basidiomycete) and the heterologous host (ascomycete).
  • the directed molecular evolution of fungal oxidoreductases preferably requires the functional expression of the enzyme in S. cerevisiae as a vehicle for the production of the enzyme. It should be noted that first it is possible to make use of the directed molecular evolution to increase the level of Expression of the enzyme in S. cerevisiae and subsequently use the expression system designed to improve other properties of the enzyme (for example, thermostability). A clear example of this approach was detailed for the functional expression of fungal lacases in S. cerevisiae. Using this procedure, the production of the Myceliophthora thermophila ascomycete house in S. cerevisiae was increased up to 18 mg / L, as well as improving its thermal stability (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987-995).
  • Said enzymes can be used as catalysts in industrial processes related to the transformation of lignocellulosic biomass to obtain cellulose products, biofuels, the food sector, the development of detergents, textile production and the chemical sector, as well as in the processing of the effluents originated in these processes
  • the present invention relates to the expression of peroxidases enzymes of high redox potential, obtained from the VP of P. eryngii, and functionally produced in expression systems based on the eukaryotic organism S. cerevisiae.
  • the present invention relates to polypeptides or proteins generated by various methods of directed evolution of the polynucleotide sequences comprising the P. eryngii VP gene and the coding sequence of the native signal sequence of the factor ⁇ of S. cerevisiae, resulting in an improved functional expression in said host and / or an increased enzymatic activity towards one or more substrates as well as an improvement in the thermostability of the enzyme.
  • a first aspect of the invention refers to the isolated polynucleotides encoding the polypeptide with peroxidase activity, henceforth polynucleotides of the invention, characterized in that its amino acid sequence has an identity of at least 50% with the SEQ ID NO: 35, and because it has at least one of the mutations that is selected from the list comprising: to. the substitution of the amino acid glutamic acid (E) with the amino acid lysine (K), in the homologous position at position 128 of SEQ ID NO: 35, b. The replacement of the amino acid histidine (H) with the amino acid arginine (R), in the position homologous to position 130 of the SEQ
  • SEQ ID NO: 35 h.
  • Pleurotus and Bjerkandera can be considered related in terms of their evolution, It can be expected that the overall identity of the genomes at the amino acid level, and more specifically at the level of the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 35, is 50% or greater, and more preferably 60% or greater and more preferably 80, 90, 95 or 99% or greater.
  • the correspondence between the amino acid sequence of the putative fungal peroxidase (s) and the sequence of other peroxidases can be determined by methods known in the art. For example, those can be determined by a direct comparison of the amino acid sequence information from the putative peroxidase, and the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 35 of this specification.
  • homology refers to the similarity between structures due to a common evolutionary ancestry, and more specifically, to the similarity or identity between the nucleotides of two or more polynucleotides.
  • identity refers to the proportion of identical nucleotides between two polynucleotides that are compared. Sequence comparison methods are known in the state of the art, and include, but are not limited to, the BLASTP or BLASTN program, and FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 ( 1999) Since two proteins are considered homologous if they have the same evolutionary origin or if they have similar function and structure, in general, it is assumed that higher values of similarity or identity of 30% indicate homologous structures. Identity percentages of at least 80% will maintain the same properties of said peptide.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotides encoding the polypeptide whose amino acid sequence is selected from the list comprising: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO : 33.
  • isolated refers to nucleotides or peptides that: 1) are substantially free of components that normally accompany or interact with it in nature, or 2) if they are found in its natural environment, they have been synthetically (not naturally) altered by human intervention and / or introduced into a cell that does not possess them natively.
  • a natural nucleotide becomes “isolated” if it has been altered, or if it comes from a DNA that has been altered through human intervention (by means of, for example, but not limited to, directed mutagenesis, insertions, deletions , etc).
  • nucleotide becomes “isolated” if it is introduced by non-natural means into a genome not native to said nucleotide (transfection). Therefore, the term “isolated” in the latter case is equivalent to the term “heterologous.”
  • polynucleotides encoding the amino acid sequence polypeptides described correspond to variants of the native ⁇ -VP fusion protein constituted by the signal sequence of the factor ⁇ operatively linked to the sequence of the native VP of P. eryngii.
  • Said native ⁇ -VP fusion protein corresponds to the sequence of nucleotides, or polynucleotides, which constitute the coding sequence of the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 35.
  • polynucleotides encoding the amino acid sequence polypeptides SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 33 have been obtained through an evolution process aimed at from the native ⁇ -VP and may give rise to variants of the VP whose catalytic activity and / or functional expression and / or thermostability has been improved.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotides that are selected from the list comprising: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 , SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 36.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, hereinafter the first polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 1.
  • the first polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 1, a sequence that presents the mutant 11 H10 of the Examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the isolated polynucleotide, hereinafter the second polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 3.
  • the second polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO:
  • sequence presented by mutant 15G9 of the examples of the invention corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 4 or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, hereinafter the third polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 5.
  • the third polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 5, a sequence presented by mutant 4B5 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 6 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, henceforth the fourth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 7.
  • the fourth polynucleotide of the invention constitutes the sequence coding for a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is collected in SEQ ID NO: 7, sequence presented by mutant 4B1 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 8 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, hereinafter the fifth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 9.
  • the fifth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 9, a sequence presented by mutant 16E12 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 10 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, hereinafter the sixth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 11.
  • the sixth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 11, sequence that shows the mutant 19C2 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 12 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, henceforth the seventh polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 13.
  • the seventh polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 13, a sequence presented by the mutant 20D1 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 14 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneration of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, hereafter referred to as the eighth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 15.
  • the eighth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 15, a sequence presented by mutant 13G1 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 16 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, hereinafter ninth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 17.
  • the ninth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 17, sequence presented by mutants 10C3 and 6B1 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 18 or SEQ NO: 20 or its complementary chains, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneration of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the isolated polynucleotide, hereafter referred to as the tenth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 19.
  • the tenth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 19, sequence that shows the mutant 13E4 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 22 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the isolated polynucleotide, hereinafter eleventh polynucleotide of Ia invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 21.
  • the eleventh polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 21, sequence that shows the mutant 6E7 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 24 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, hereinafter twelfth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 23.
  • the twelfth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 23, sequence that shows the mutant 11 F3 of the Examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 26 or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under Soyringen conditions with a polynucleoid sequence of
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, hereinafter thirteenth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 25.
  • the thirteenth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 25, a sequence presented by the mutant R4 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 28 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the isolated polynucleotide, hereinafter fourteenth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 27.
  • the fourteenth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with improved activity and thermostability, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 27, a sequence presented by the mutant 24E10 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 30 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a) , or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, hereinafter fifteenth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 29.
  • the fifteenth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with improved activity and thermostability, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 29, a sequence presented by the mutant 3H9 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 32 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, hereinafter sixteenth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 31.
  • the sixteenth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with improved activity and thermostability, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 31, a sequence presented by the mutant 15B4 of the examples of the invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 34 or its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the isolated polynucleotide, hereinafter seventeenth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 33.
  • the seventeenth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the ⁇ -VP with improved activity and thermostability, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 33, a sequence presented by the mutant 2-1 B of the examples of The invention and corresponds to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 36 or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under Sovereign conditions with a polynucleoid sequence of (a), or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code. Therefore, polynucleotide sequences of mutants obtained by directed evolution that encode variants of ⁇ -VP with catalytic activity and / or functional expression and / or improved thermostability are reported.
  • the invention includes the method for producing said improved polynucleotides and enzymes by means of the directed molecular evolution methodology, also providing a solution for heterologously extracellular, functional and soluble VP production with improved activity towards one or more substrates and increased thermostability.
  • mutants are generated, through in vitro or in vivo diversity creation protocols, which contain mutations that may be beneficial for the property to be enhanced. Mutants created in this way can be produced simply in S. cerevisiae.
  • conventional tests are used to determine if the VP of interest synthesized by the expression system has improvements in its expression and its functional properties. For example, to determine if the polynucleotide undergoing directed evolution and expressed in a foreign host produces VP with improved activity, experiments can be designed to determine the functional activity of the protein. A large number of mutants can be analyzed accurately and simultaneously (high-throughput) by designing screening or screening methods, after which the best mutants can be isolated, purified and characterized. The best mutants of each evolutionary cycle are used as parental or starting points for the next evolutionary cycle, thus obtaining significant improvements over the parental / initial / is due to the accumulation of beneficial mutations from one cycle to another.
  • the detailed procedure for obtaining the improved polynucleotides and enzymes comprises three phases: 1) Introduction of the signal sequence of the ⁇ factor to favor the functional expression of the VP in S. cerevisiae.
  • the signal sequence of factor ⁇ is usually used to favor the secretion of heterologous proteins in S. cerevisiae (Shuster, JR Curr. Opin. Biotechnol. 2: 685-690. 1991).
  • Said signal sequence is cleaved during the maturation of the protein and its secretion to the extracellular medium, so that it is not part of the mature enzyme.
  • the new construction (the signal sequence of the ⁇ factor fused with the gene encoding the mature protein, referred to herein as ⁇ -VP) is subjected to the process of directed evolution in order to increase the functional expression and the total activity values VP. Therefore, the accumulation of beneficial mutations can take place both in the signal sequence of the factor ⁇ and in the sequence of the mature VP.
  • mutant libraries are constituted through in vivo cloning of the genes mutagenized with the expression vector as well as the recombination of the best variants and their transformation into S. cerevisiae cells.
  • This phase comprises i) the micro-fermentation of the clones containing the mutated and / or recombined genes for the functional expression of the best ⁇ -VP mutants in 96-well plates format; ii) the screening of the activities and / or thermostabilities of the secreted recombinant enzymes, by means of colorimetric methods based on the oxidation of non-phenolic substrates; and iii) additional re-screenings to guarantee the selection of genes that express greater protein and / or activity and / or thermostability through isolation, purification and transformation and expression of previously selected genes in S. cerevisiae.
  • the obtaining of the improved polynucleotides and enzymes described in the present invention could also be carried out by a method called "directed mutagenesis” based on the information of the mutations reported in the present patent. This is because in order to carry out this procedure it is necessary to know the exact position and the amino acid change that must be included in the new protein.
  • This process consists in the introduction of specific changes in the DNA sequence encoding said enzyme. These changes are introduced in the coding DNA (cDNA) complementary to the messenger RNA (mRNA) encoding the ⁇ -VP (and lacking the non-coding sequences, "introns" present in the eukaryotic genomic DNA), cloned into a vector expression.
  • the resulting vector is used as a template in PCR reactions, in which a high fidelity polymerase is used so that the changes in the DNA are limited to those desired.
  • a high fidelity polymerase is used so that the changes in the DNA are limited to those desired.
  • at least two oligonucleotides "primers" of the PCR reaction are designed, whose sequences incorporate the appropriate change and are complementary to opposite strands of the same region of DNA.
  • the verification that the DNA chains resulting from the PCR carry only the desired mutations can be achieved by sequencing.
  • Another aspect of the invention relates to a genetic construction of DNA or RNA, from now on genetic construction of the invention, which comprises one of the following types of sequences: a) an isolated polynucleotide of the invention, b) an isolated polynucleotide encoding the polypeptide whose amino acid sequence is selected from the list comprising SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17,
  • SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, Ia SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 35.
  • This genetic construction includes the cloning and expression vectors that comprise the isolated polynucleotides of the invention.
  • expression vectors include control sequences, such as, for example, control elements for translation (such as start and stop codes) and for transcription (for example, promoter-operator regions, binding sites).
  • control sequences such as, for example, control elements for translation (such as start and stop codes) and for transcription (for example, promoter-operator regions, binding sites).
  • the vectors according to the invention may include plasmids and viruses, and other vectors according to procedures well known and documented in Ia technique, and can be expressed in a variety of different expression systems, also well known and documented in the art.
  • a "vector” is a replicon to which another polynucleotide segment has been attached, to perform the replication and / or expression of the bound segment.
  • a “replicon” is any genetic element that behaves as an autonomous unit of polynucleotide replication within a cell; that is, able to replicate under its own control.
  • Control sequence refers to nucleotide sequences that are necessary to effect the expression of the coding sequences to which they are linked. The nature of such control sequences differs depending on the host organism. In prokaryotes, such control sequences generally include a promoter, a ribosomal binding site and termination signals. In eukaryotes, generally, such control sequences include promoters, termination signals, enhancers and, sometimes, silencers. It is intended that the term “control sequences” includes, at a minimum, all the components whose presence is necessary for expression and may also include additional components whose presence is advantageous.
  • Operaationally linked refers to a juxtaposition in which the components thus described have a relationship that allows them to function in the desired manner.
  • a control sequence "operatively linked" to a coding sequence is linked in such a way that the expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.
  • ORF "open reading frame” is a region of a nucleotide sequence that encodes a polypeptide; This region may represent a portion of a coding sequence or a complete coding sequence.
  • a "coding sequence” is a nucleotide sequence that is transcribed into mRNA and translated into a polypeptide when under control of appropriate regulatory sequences. The limits of the coding sequence are determined by a translation start codon at the 5 'end and a translation end codon at the 3' end.
  • a coding sequence may include, but is not limited to mRNA, cDNA and recombinant polynucleotide sequences.
  • the polynucleotide of (a), of the genetic construction of the invention encodes the polypeptide whose amino acid sequence consists of SEQ ID NO: 35.
  • the polynucleotide of (a), of the genetic construction of the invention is selected from the list comprising: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 38.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide of (a), of the genetic construction of the invention consists of SEQ ID NO: 38.
  • the present invention makes it possible to produce, in quantities not available up to now, VP which has a greater functional expression, a greater catalytic activity and an improved thermostability.
  • the isolated polynucleotides of the invention and / or the genetic construction of the invention can be introduced (or transfected) into a host cell.
  • Said host cell can be grown in a suitable culture medium, expressing the VP encoded by the polynucleotides or genetic constructs of the invention.
  • another aspect refers to a cell, from now on a cell of the invention, comprising an isolated polynucleotide of the invention, or the genetic construction of the invention.
  • cell refers to a prokaryotic or eukaryotic cell. In this invention, it preferably refers to a eukaryotic cell, and more preferably to a cell that can be classified within the genus Saccharomyces.
  • Another aspect refers to the use of the isolated polynucleotides of the invention, to the genetic construction of the invention, or to the cell of the invention, to produce versatile peroxidases (VP) with greater functional expression and / or greater catalytic and / or greater activity. Thermal stability.
  • VP versatile peroxidases
  • transfection refers to the introduction or transfer of an exogenous nucleic acid molecule into a eukaryotic cell, including, but not limited to, a ribonucleic or deoxyribonucleic acid molecule (by example, naked RNA or DNA).
  • Suitable culture media are known in the state of the art.
  • a “host” or “host cell” or “host cell” refers to an organism, cell or tissue that serves as a target or recipient of the polynucleotide encoding a recombinant protein of interest, where the cell Host is transformed with an expression vector containing the polynucleotide of interest.
  • the recombinant protein of interest is a VP of fungal origin, of high redox potential, which has a greater functional expression, a greater catalytic activity and a greater thermostability.
  • the host is S. cerevisiae.
  • the S. cerevisiae brewer's yeast is a unicellular fungus that belongs to the Eukaryota super-kingdom, (Metazoa / Fungi group), Fungi kingdom, Dikarya sub-kingdom, Ascomycota phylum, Saccharomycotina subphylum, Saccharomycetes class, Saccharomycetales order, Saccharomycetaceae family and genus Saccharomycetaceae and genus Saccharomycetaceae.
  • the present invention therefore comprises variants of genes and enzymes of the group of VPs that have a greater functional expression in S. cerevisiae, a greater catalytic activity and / or a greater thermostability.
  • a method for generating extracellular, functional and soluble VPs with improved activity towards one or more substrates and / or improved thermostability comprising: a) designing a genetic construct comprising the isolated polynucleotide that encodes the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 39 or any of its variants, b) generate diversity over the genetic construction of (a) and create the mutant libraries, and c) select the better expression, activity and / or thermostability mutants.
  • the isolated polynucleotide encoding the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 39, or any of its variants, of step (a) of the method of the invention is operatively linked to another nucleotide sequence. that directs Ia secretion and / or facilitate the correct processing of the enzyme.
  • the isolated polynucleotide encoding the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 39 or any of its variants, from step (a) of the method of the invention is operatively linked to the isolated polynucleotide encoding the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 39 or any of its variants.
  • variant refers to a protein substantially homologous to the protein whose amino acid sequence consists of SEQ ID NO: 39.
  • a variant includes additions, deletions or amino acid substitutions.
  • a protein is "substantially homologous" to the protein whose amino acid sequence consists of SEQ ID NO: 39 (or in SEQ ID NO: 37), when its amino acid sequence has a good alignment with said sequence of amino acids, that is, when their amino acid sequence has a degree of identity with respect to the amino acid sequence SEQ ID NO: 39 (or in SEQ ID NO: 37), of at least 50%, typically of, at least 70%, advantageously at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%, and even more preferably at least 99% .
  • the mature protein gene of the VP is fused with the signal sequence of the ⁇ factor to favor the functional expression of the mature VP in S. cerevisiae.
  • the signal sequence of the ⁇ factor corresponds to the amino acid sequence SEQ ID NO: 37 and the sequence of the mature protein gene of the VP corresponds to the amino acid sequence SEQ ID NO: 39.
  • the native signal sequence of factor ⁇ is defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes Ia coding sequence of the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO 37, which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 40, or in its complementary chain, b) molecules of nucleic acid whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), or c) nucleic acid molecules whose sequence differs from (a) and / or (b) due to the degeneracy of the genetic code, in which the polypeptide encoded by said nucleic acids has the activity and structural characteristics of the signal sequence native to the ⁇ factor.
  • the VP of P. eryngii is defined in the present invention by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO 39, which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules of The isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 41, or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), or c) molecules of nucleic acid whose sequence differs from (a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the VP. from P. eryngii.
  • the method of the invention also comprises the identification and mapping of the mutations introduced in the selected variants.
  • the genetic construction of step (a) of the method of the invention comprises the isolated polynucleotide whose nucleotide sequence consists of SEQ ID NO: 40, operatively linked to the isolated polynucleotide whose nucleotide sequence consists of SEQ ID NO: 41.
  • the method of the invention also comprises repeating steps (a) - (c), using in the genetic construction according to (a) the polynucleotides that code for the best expression, activity and / or thermostability mutants obtained in step (c), consecutively.
  • the cycles can be repeated as many times as desired, checking, for example, the characteristics of the different mutants obtained (characteristics of interest such as, but not limited to, functional expression, activity and / or thermostability), until the values of said characteristics in the mutants obtained in step (c) of the last cycle do not vary significantly from a statistical point of view of the mutants obtained in step or steps (c) of the previous cycles, or until we obtain a mutant with the characteristics That are of interest.
  • characteristics of interest such as, but not limited to, functional expression, activity and / or thermostability
  • the procedure is applied in a first cycle of directed evolution of the ⁇ -VP parental gene.
  • Phase 1 of the procedure is carried out using as a template the pGAPZ ⁇ vector of Invitrogen TM and the vpl2 cDNA of P. eryngii, whose nucleotide sequence is collected in SEQ ID NO: 41.
  • the amplified DNA fragment of ⁇ -VP is subcloned into the shuttle vector pJRoC30 (Novozymes) to facilitate functional expression in S. cerevisiae and plasmid overproduction in E. coli (Fig. 1).
  • Phase 2 of the procedure is carried out through the construction of a library of mutants with a low mutation rate (average point mutations randomly introduced into the parental gene ⁇ -VP) created by mutagenic PCR.
  • the directed evolution landscape of the built library is shown, with 13% of the clones explored with less than 10% of the parental activity.
  • the cloning of the mutant libraries with the expression vector is carried out in vivo using the eukaryotic cellular machinery of S. cerevisiae.
  • the library in question is co-transformed with the linearized expression plasmid.
  • the generated PCR products have overlapping extensions of not less than 50 base pairs that facilitate in vivo cloning and repair of the expression vector by a homologous recombination process.
  • the overlapping ends are generated thanks to the design of oligonucleotide primers of the mutagenic PCR reaction that confer said homology with the ends of the linearized vector.
  • stage 3 of the procedure screening is performed using activity tests in endpoint mode with the non-phenolic ABTS substrate.
  • Re-screening protocols (especially the second re-screening) are carried out from new transforming cells to promote cell synchronization and avoid the selection of false positives.
  • the details cited for this phase are also applicable in all the particular embodiments described below referring to evolutionary cycles.
  • 4 ⁇ -VP mutant genes called 11 H10, 15G9, 4B5 and 4B1 are selected with improvements ranging from 9 to 3.6 times better total activity than the ⁇ -VP parental expressed in S. cerevisiae (Table 2 and Fig. 3).
  • total activity is defined as that which is derived from the improvement in the level of expression and the catalytic activity of the enzyme.
  • the method is applied in a second cycle of directed evolution using as parental the mutant genes obtained in the first generation: 11 H10, 15G9, 4B5 and 4B1.
  • Phase 2 of the procedure is carried out by means of the construction of a mutagenic library through in vivo shuffling of previously mutagenized parental genes. This approach facilitates the evolutionary thrust towards improvements in the total activity by: i) the recombination of the best mutations of the parental genes, ii) the introduction of new beneficial point mutations.
  • the in vivo recombination of the best parents is carried out by co-transformation of the mutagenic PCR products of said genes with the linearized vector in S. cerevisiae.
  • the overlapping ends facilitate cloning in vivo while the high homologous recombination rate of S. cerevisiae favors the recombination of the accumulated mutations to generate chimera genes.
  • Phase 3 is carried out by activity test protocols in endpoint mode.
  • Fig. 4 the landscape of directed evolution of the constructed library is shown, with 35% of the clones explored with less than 10% of the activity of the parental type.
  • 4 mutant genes of ⁇ -VP called 16E12, 19C2, 20D1 and 13G1 are selected, with improvements ranging from 4.6 to 3.2 times the total activity of the best mutant gene of the previous generation, 11 H10 (Table 2 and Fig. 5).
  • the procedure is applied in a third cycle of directed evolution using as parental the mutant genes obtained in the second generation: 16E12, 19C2, 20D1 and 13G1.
  • Phase 2 of the procedure is carried out by means of the construction of a mutagenic library through in vivo shuffling of previously mutagenized parental genes, in the same way as described in the previous embodiment.
  • Phase 3 is carried out by means of activity test protocols in kinetic mode, due to the higher starting activity of the parental types.
  • Fig. 6 the landscape of directed evolution of the constructed library is shown, with 40% of the clones explored with less than 10% of the activity of the parental type.
  • 5 ⁇ -VP mutant genes called 10C3, 6B1, 13E4, 6E7 and 11 F3 are selected, with improvements ranging from 3.1 to 2.4 times the total activity of the best mutant gene of the previous generation, 16E12 (Table 2 and Fig. 7).
  • the procedure is applied in a fourth cycle of directed evolution using the mutant genes obtained in the third generation as parental: 10C3, 6B1, 13E4, 6E7 and 11 F3.
  • a new screening is introduced to improve thermal stability.
  • Phase 2 of the procedure is carried out by means of the construction of a mutagenic library through in vitro shuffling of the parental genes by means of a mutagenic StEP reaction combined with a subsequent in vivo shuffling of the genes in S. cerevisiae.
  • This diversity protocol is applied with the purpose of generating different cross-links to those obtained with the in vivo shuffling technique used in previous generations.
  • Phase 3 is carried out through activity test protocols in kinetic and endpoint mode.
  • a thermostability screening test is also designed to select mutants with improved stability against temperature. The test was based on the oxidation of ABTS and was expressed in relative values with respect to the initial activities shown by the mutants before and after their incubation at a given temperature (Fig. 8).
  • Fig. 9 the landscapes of directed evolution of the constructed library are shown, with 16% of the clones explored with less than 10% of the activity of the parental type.
  • 2 mutant genes of ⁇ -VP called R4 are selected (best and last selected mutant of activity; ratio of total activity improvement / stability improvement: 1, 84/1, 07 with respect to the best mutant of the previous generation, 10C3) and 24E10 (better muitability of esiability; relationship improvement of io ⁇ al activity / improvement of esiability: 1.07 / 1.23 with respect to the best muierie of the previous generation, 10C3) (Table 2 and Fig. 10).
  • the procedure is applied in a five-year cycle of evolution directed exclusively towards inertiability, using the muierie gene of the inermoability screening of the fourth generation, 24E10.
  • Phase 2 of the procedure is carried out by means of the consiruction of a muogenic library through the in vivo recombination of muenogenic libraries of the 24E10 parenchymal with mutational specimen differential (IvAM).
  • IvAM mutational specimen differential
  • This diversity prococcal is inroduced to generate a mutational specimen that differs from that obtained with the mucogenic assays with Taq / MnC ⁇ from previous generations.
  • Phase 3 is carried out by means of test probes of inertiability in kinetic mode and final puncture.
  • the iremoesiability screening is modified by increasing the incubation temperature to values that involve the loss of 2/3 of the activity of the parenchymal 24E10.
  • Fig. 11 the landscapes of directed evolution of the cons ⁇ ruida library are shown, with 37% of the clones explored with less than 10% of the activity of the parenchial ipod.
  • 2 muiah-like genes of ⁇ -VP called 3H9 and 15B4 are selected (improvement of io ⁇ al activity / improvement of esiability with respect to the best moierie of iremoesiability of the previous generation -24E10- of 0.79 / 1, 35 and 1 , 19/1, 21 respectively) (Table 2 and Fig. 12).
  • the procedure is applied in a sixth cycle of evolution directed towards thermostability using as parental the mutant genes of the thermostability screening of the fifth generation, 3H9 and 15B4.
  • Phase 2 of the procedure is carried out by means of the construction of a mutagenic library through an in vivo shuffling of previously mutagenized parental genes, in the same way as described for the second and third evolutionary cycles.
  • Phase 3 is carried out through activity test protocols in kinetic and endpoint mode.
  • the thermostability screening is modified by increasing the incubation temperature to values that involve the loss of 2/3 of the activity of the parents 3H9 and 15B4.
  • the selective pressure of the screening test (the set temperature) is increased from 6 ° C to 9 ° C.
  • Fig. 13 the landscapes of directed evolution of the constructed library are shown, with 43% of the clones explored with less than 10% of the activity of the parental type.
  • 1 mutant gene of ⁇ -VP called 2-1 B is selected (total activity improvement / stability improvement ratios with respect to the best mutant of the previous generation -3H9- of 0.8 / 1, 27) (Table 2 and Fig. 14).
  • the method of the invention would comprise the identification and mapping of the inroduced mutations in the selected varianids.
  • Identification of the inroduced mutations in the selected varianids was carried out by means of the sequencing of the DNA of the muanids of the ⁇ -VP gene obtained from six cycles of directed evolution (Table 2 and Figs. 3, 5, 7, 10, 12, 14 and 15).
  • the number determines the position of the muted residue in the original amino acid sequence of the mature VP, the first amino acid (to the left of the number) is the original one in The sequence of the mature VP and the second is that by which he moved.
  • G indicates Glycine
  • V indicates Valine
  • L indicates Leucine
  • I indicates Isoleucine
  • F indicates Phenyl Alanine
  • Y indicates Tyrosine
  • W indicates Tryptophan
  • S indicates Serine
  • T indicates Threonine
  • C indicates Cysteine
  • M indicates Methionine
  • N indicates Asparagine
  • Q indicates Glutamine
  • D indicates Aspartic Acid
  • E indicates Glutamic Acid
  • K indicates Lysine
  • R indicates Arginine
  • H indicates Histidine
  • P indicates Proline.
  • the location of the mutations identified in the global folding of the protein is based on the crystallographic structure of the VPL2 deposited in the structural database of PDB proteins (Berman et al., 2000. Nucleic Acids. Res. 28: 235-242) with reference 2BOQ (Pérez-Boada, 2005. Mol. Biol. 354: 385-402).
  • the changes caused as a result of the incorporation of the different point mutations eg contacts with adjacent amino acids, including hydrogen bonds, electrostatic interactions, etc. responsible for the improvements observed in each of the mutants can be predicted obtained in the different evolution cycles.
  • the signal sequence of the ⁇ -facid comprises 83 amino acids, of which 19 are the pre-peptide and 64 the pro-peptide.
  • He Pre-peptide is responsible for the insertion of the maturation polypeptide chain into the endoplasmic reticulum, after which it is cleaved by the action of an endo-peptidase between amino acids 19 and 20.
  • the pro-peptide intervenes in the folding of Ia polypeptide chain during its transition and stay from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus.
  • the pro-peptide is cleaved in the Golgi before the mature enzyme is secreted abroad by means of the action of three specific proteases (KEX1, KEX2 and STE13).
  • KEX1, KEX2 and STE13 three specific proteases
  • the evaluation of the improvement of the ⁇ -VP mutants is estimated by determining their total activity from the supernatants of the cell fermented microculture scale (96 well format) and more precisely per liter of fermented.
  • the total activity of the best mutants of the generations oriented to the improvement of total activity is evaluated (cycles 1 to 4; Table 3).
  • the best mutant of Total activity, R4 shows an activity of 2400 U / L, which is an improvement of approximately 700 times the total activity of the initial parental ⁇ -VP in S. cerevisiae.
  • amino acid framework mutations (E37K, V160A, T184M and Q202L) (Table 2 and Fig. 10) could be applicable in the heterologous expression of any other eukaryotic gene phylogenetically related to the VP susceptible or desirable to be expressed in species of the genus Saccharomyces or in other related yeasts (such as P. pastoris) for improvement by directed evolution, and more particularly in the heterologous expression and improvement of genes of other peroxidases of high redox potential, such as the MnP that is produced by the majority of ligninolytic basidiomycetes .
  • the Catalytic Activity Unit (U) is defined as the amount of enzyme necessary to oxidize 1 ⁇ mol of substrate per minute under the reaction conditions.
  • thermostability of the different mutants obtained was evaluated.
  • T50 defined as the temperature at which the enzyme loses half of its catalytic activity (residual activity / initial activity) after 10 min incubation is determined.
  • the degree of glycosylation of ⁇ -VP in S. cerevisiae was estimated below 10% (equivalent to that found for the wild VP of P. eryngii).
  • the low glycosylation percentages of the VP in S. cerevisiae and the differences found in the thermostabilities with respect to the VP expressed in E. coli suggest an ideal folding of the enzyme when it is expressed functionally in S. cerevisiae.
  • S. cerevisiae is known for hyperglycosilar heterologous enzymes which can increase the stability of the enzyme. This is not the case of the ⁇ -VP mutants, their thermostabilities are due to an appropriate folding and genetic improvement due to the evolutionary cycles of thermostability introduced.
  • the low degree of glycosylation indicates that the period of residence of the ⁇ -VP mutants in their transit from the endoplasmic reticulum to the Golgi and their subsequent exocytosis should be short, which is indicative of an optimized secretion for this expression system.
  • the variant R4 is purified (Fig. 19).
  • the activities ( ⁇ mol product ⁇ mol peroxidase -1 s -1 ) of the R4 mutant and of the VP expressed in E. coli are calculated.
  • the R4 mutant is active frenzy to a wide range of natural environment differentiates (Table 5).
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides and deoxyribonucleotides.
  • peptide refers to a polymeric form of amino acids of any length.
  • Fig. 1 Construction of pJRoC30- ⁇ -VP.
  • Fig. 2 Landscapes of the screening trial against ABTS of the first generation. The activities of the clones of the mutant libraries are represented in descending order. The dashed lines indicate the activity of the ⁇ -VP parental type.
  • Fig. 4 Landscape of the screening trial against ABTS of the second generation. The activities of the clones of the mutant library are represented in descending order. The dashed line indicates the activity of the parental type used as an internal standard in screening (mutant 11 H10). Fig. 5. Mutants obtained in the second cycle of directed evolution. Cross-linking events and the introduction of new mutations are indicated in different colors.
  • Fig. 6 Landscape of the screening trial against ABTS of the third generation. The activities of the clones of the mutant library are represented in descending order. The dashed line indicates the activity of the parental type used as an internal standard in screening (mutant 16E12).
  • Fig. 7 Mutants obtained in the third cycle of directed evolution. Cross-linking events and the introduction of new mutations are indicated in different colors.
  • Fig. 9. A) Landscape of thermostability selection using ABTS as a substrate in the fourth generation. The dashed line indicates the activity / thermostability of the parental 10C3. B) Landscape of the screening trial against ABTS of the fourth generation. The activities of the clones of the mutant library are represented in descending order. The dashed line indicates the activity of the parental type used as an internal standard in screening (mutant 10C3).
  • Fig. 10 Mutani obtained in the fourth cycle of directed evolution. The events of cross-breeding and the inroduction of new mutations are indicated with different colors.
  • Fig. 11 A) Landscape of selection of iremoesiability using ABTS as sus ⁇ ra ⁇ o in the fifth generation. The discontinuous line indicates the activity / impermeability of the 24E10 paren ⁇ al. B) Landscape of the screening trial restrains ABTS of the fifth generation. The activities of the clones from the library of mutants are represented in descending order. The dashed line indicates the activity of the parental type used as an internal standard in screening (mutant 24E10).
  • Fig. 13 A) Landscape of thermostability selection using ABTS as a substrate in the sixth generation. The dashed line indicates the activity / thermostability of the parental 3H9. B) Landscape of the screening trial against ABTS of the sixth generation. The activities of the clones of the mutant library are represented in descending order. The dashed line indicates the activity of the parental type used as an internal standard in screening (mutant 3H9).
  • Fig. 14 Mutani obtained in the sixth cycle of directed evolution. The events of cross-breeding and the inroduction of new mutations are indicated with different colors.
  • Fig. 15 General scheme of the artificial evolution process. The improvements are calculated with respect to the corresponding parental used as a reference during the screening of the evolutionary cycle.
  • Fig. 16 Molecular model of the VP (reference PDB 2BOQ) (A) and of the mutant R4 (B).
  • the mutated amino acids present in the R4 muierie and the correspondents in the native VP will be underlined in both models.
  • the hydrogen puen ⁇ es en ⁇ re esios waste and the adjacent amino acids appear in a discontinuous line. It also shows a potentially inestable de-destabilization between E37 and D30 in the naive enzyme (shaded in red) that disappears with the E37K removal in the R4 muierie.
  • Fig. 17. Molecular model of the VP (A) and the best thermostability mutant, 2-1 B (B).
  • the 7 mutated amino acids in the mutant 2-1 B are shown, and the corresponding prisoners in the native VP.
  • the underlined amino acids (R39, A213 and R330) are specific to the muieie 2- 1 B, while the quaiered quaie amino acids correspond to the "amino acid framework" common to all the mutants selected from the fourth generation.
  • thermostability study was carried out with the help of a gradient thermal cycler (Mycycler, Biorad USA).
  • FIG. 19 Biochemical characterization of the R4 mutant.
  • acivivities were measured with 2 mM ABTS in Bri ⁇ ón ónmpón and Robinson 100 mM (without CaCl2 and with 1 mM CaCl2) adjusted to the diferen ⁇ es pH of the measure, and 0.1 mM of H2O2.
  • VP activity was normalized with respect to its optimal value of activity. Each point comes from the average value of three independent experiments.
  • the fusion protein ( ⁇ -VP) used in the present invention is constituted by the signal sequence of the ⁇ factor fused with the gene coding for the mature VP protein.
  • the StratageneTM pGAPZ ⁇ vector, used for protein expression in P. pastoris, which contains the pre-pro signal peptide of the factor ⁇ was taken as a template.
  • pGAPZ ⁇ was linearized with the restriction enzymes EcoRI and Notl. The vpl2 cDNA of P.
  • eryngii, 996 bp (SEQ ID NO: 41) was amplified with the straight oligonucleotide primers N echo RI-di (SEQ ID NO: 42) and CtNotl-reverse (SEQ ID NO: 43) which they include restriction targets for EcoRI and Not ⁇ (GAATTC and GCGGCCGC respectively, underlined and in bold), generating the mature VP template that excludes the native signal sequence.
  • the conditions of the amplification reaction were the following: 400 nM of the oligonucleotide N eco RI -di straight, 400 nM oligonucleotide CNotl-reverse, 0.25 mM dNTPs, 0.05 U / ⁇ L Taq polymerase (Invitrogen), 0.5 ng / ⁇ L of vpl2 cDNA in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.4) and 4 mM MgCl 2 in a final volume of 50 ⁇ L.
  • the PCR program used was: 94 ° C for 5 min, 55 ° C for 5 min, 72 ° C for 5 min (1 cycle), 95 ° C for 0.35 min, 50 ° C for 2 min, 72 ° C for 4 min (25 cycles) and 72 ° C for 10 min (1 cycle).
  • the amplified product VP was digested with EcoRI and Not ⁇ and linked to the linearized vector pGAPZ ⁇ generating the construction pGAPZ ⁇ -VP.
  • Saying vector was transformed into competent E. coli DH5 ⁇ cells by thermal shock to over-produce and purify the plasmid.
  • ⁇ -VP was amplified from pGAPZ ⁇ -VP by PCR with the aid of the NtpJRBamHI-direct oligonucleotides (SEQ ID NO: 44) and CtNotl-reverse (SEQ ID NO: 43) which include restriction targets for BamHl and Notl ( GGATCC and GCGGCCGC 1 respectively, underlined and in bold).
  • the PCR reaction was carried out in 50 ⁇ l containing 400 nM of the NtpJRBamHI-direct oligonucleotide, 400 nM CtNotl-reverse oligonucleotide, 0.25 mM dNTPs, 0.05 U / ⁇ L Taq polymerase (Invitrogen), 0.4 ng / ⁇ L of pGAPZ ⁇ -VP in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.4) and 4 mM MgCl 2 .
  • the PCR program used was: 94 ° C for 5 min, 55 ° C for 5 min, 72 ° C for 5 min (1 cycle), 95 ° C for 0.35 min, 50 ° C for 2 min, 72 ° C for 4 min (25 cycles) and 72 ° C for 10 min (1 cycle).
  • ⁇ -VP was subcloned into the shuttle vector pJRoC30 (Novozymes, USA).
  • pJRoC30 is a bifunctional episomic vector of 10477 bp that contains the GAL1 promoter (galactose-inducible), the ampicillin resistance gene for selection in E. coli and the URA3 gene that complements uracil auxotrophy in ura3-S strains.
  • cerevisiae S. cerevisiae cells grown with this vector can be grown in selective medium, without uracil).
  • the digestion of pJRoC30 with the enzymes BamH ⁇ and Not ⁇ was carried out, as well as the digestion of ⁇ -VP with BamH ⁇ and Not ⁇ .
  • EXAMPLE 2 DIRECTED EVOLUTION OF ⁇ -VP 1. PREPARATION OF PROTOCOLS TO GENERATE DIVERSITY AND CREATION OF THE MUTANTS 'LIBRARIES
  • the generation of diversity by PCR-mutagenic was carried out in a gradient thermocycler (Thermocycler Mycycler, Biorad, USA) under the following reaction parameters: 95 ° C for 2 min (1 cycle); 94 ° C for 45 s, 53 ° C for 45 s, 74 ° C for 3 min (28 cycles); and 74 ° C for 10 min (1 cycle).
  • the oligonucleotides used for the mutagenic amplification were direct RMLN (SEQ ID NO: 45; with binding site to pJRoC30- ⁇ -VP in the position pb 5'-160-181-3 ') and reverse RMLC (SEQ ID NO: 46 ; with binding site to pJRoC30- ⁇ -VP in position pb 5'-1532-1551-3 ').
  • the PCR products were designed containing extensions with a homology of 40 bp and 66 bp for the ends digested with Bam ⁇ ⁇ ⁇ and Xho ⁇ of the linearized vector, respectively.
  • the corresponding PCR products were loaded on a semi-preparative low melting agarose gel and purified with the Zymoclean gel DNA recovery kit (ZymoResearch, USA).
  • the PCR products were subsequently cloned in vivo by transforming the S. cerevisiae cells, after the GAL1 promoter of the pJRoC30 vector previously linearized with Bam ⁇ ⁇ ⁇ and Xho ⁇ .
  • Mutazyme-ll libraries The mutation index was modulated by varying the amount of template DNA in the PCR reaction.
  • concentration of each of the reagents, in a final volume of 50 ⁇ L was the following: 370 nM of RMLN oligonucleotide, 370 nM of RMLC oligonucleotide, 0.8 mM dNTPs, 3% (v / v) DMSO, 0.05 U / ⁇ L of Mutazyme DNA polymerase (Genemorph Il Random Mutagenesis kit, Stratagene) and 52 ng / ⁇ L of pJRoC30- ⁇ -VP .
  • the mutation rate was controlled by varying the concentration of MnCI 2 Additionally, the effect of balanced / unbalanced concentrations of dNTPs and the concentration of template DNA in the mutagenic PCR reaction was also analyzed (Table 6).
  • a library of 1408 clones was designed and explored, using ⁇ -VP as parental. This was amplified by error-prone PCR with equilibrated dNTPs and a MnCI 2 concentration of 0.01 mM, as detailed in
  • the transformation mixture of the library contained a linearized vector ratio: 1: 4 PCR product (200 ng of vector and 800 ng of PCR product).
  • the endpoint screening was developed as described in section 2 of the present example.
  • the best variants of the first generation (mutants 11 H10, 15G9, 4B5 and 4B1) were taken as parental and were subjected to a new cycle of evolution by mutagenic PCR with Tag / MnCI 2 , to subsequently recombine these products by shuffling in vivo . 1740 clones were explored.
  • Each of the parents was amplified by error-prone PCR with balanced dNTPs and a concentration of 0.01 mM MnCI 2 as detailed in Table 6.
  • the products mutagenized by PCR were mixed in the same proportion (800 ng totals, 200 ng of each product) and were transformed together with the linearized vector (ratio vecto ⁇ PCR product 1: 4).
  • the endpoint screening was developed as described in section 2 of the present example.
  • mutants 16E12, 19C2, 20D1 and 13G1 were taken as parental and were subjected to a new cycle of evolution by mutagenic PCR with Tag / MnCI 2 , to subsequently recombine these products by shuffling in vivo. 1131 clones were explored.
  • Each of the parents was amplified by error-prone PCR with balanced dNTPs and a concentration of MnCI 2 of 0.01 mM, as detailed in Table 6.
  • the products mutagenized by PCR were mixed in the same proportion (400 ng total , 100 ng of each product) and were transformed together with the linearized vector (vector: PCR product 1: 4 ratio). Screening was developed as described in section 2 of this example. In this particular generation, screening could be carried out in kinetic mode due to the improvement of activity after three evolutionary cycles.
  • the best variants of the third generation were taken as parental and were subjected to a new cycle of evolution by mutagenic StEP.
  • the mutagenic conditions are determined by the low concentration of template DNA -0.1 ng / ⁇ L- in combination with the use of a low fidelity polymerase (Taq polymerase) and the amplification protocol in the thermocycler with short ringing and extension cycles .
  • the parameters of the amplification reaction were the following: 95 ° C for 5 min (1 cycle); 94 ° C for 30 s and 55 ° C for 20 s (90 cycles).
  • a shuffle was performed in vivo through the mixing of the PCR product (800 ng) and the linearized plasmid (200 ng); (Vecto ⁇ product PCR 1: 4 ratio).
  • the screening was developed as described in section 2 of the present example incorporating the thermostability exploration protocol, evaluating the stability at 6 ° C.
  • a library of 1392 clones was constructed from the in vivo assembly of two error-prone PCR experiments with different mutational predisposition (IvAM), using as the template DNA the best thermostability mutant of the previous generation (variant 24E10).
  • the Mutazima library was prepared according to section 1.1.A).
  • the Taq / MnCI 2 library was prepared with balanced dNTPs and a concentration of MnCI 2 of 0.01 mM as detailed in Table 6. Both libraries were mixed in the same proportion and recombined in vivo after transformation into S Cerevisiae and in vivo repair of the linearized pJRoC30 vector with the mutagenized fragments.
  • the screening was developed as described in section 2 of the present example incorporating the thermostability scanning protocol and increasing the incubation temperature to 8 ° C.
  • YPD media and minimum liquid medium, SC plates and expression medium were prepared as indicated in Zumárraga et al. 2008 (Proteins 71: 250-260) with the proviso that bovine hemoglobin (Sigma) was included in the expression medium in final concentrations of 100 mg / L to favor the incorporation of the heme group to the VP.
  • the libraries of each evolutionary cycle generated by different strategies were transformed into S. cerevisiae cells (Yeast transformation Kit, Sigma) for a functional expression of the corresponding clones. Isolated colonies of wild S.
  • cerevisiae cells were incubated in 20 mL of liquid YPD medium at 30 ° C and 210 rpm on a shaker (Edmund Bühler GmbH SM-30, Germany) overnight (DO600> 2). An adequate amount of the culture was inoculated in a total volume of 120 mL of YPD tempered to reach a D0 6 or 0.3. It was incubated again for 4-6 h, until two growth cycles were completed and a DO ⁇ oo of 1, 2 was reached. The cells were transformed with the corresponding libraries in the presence of the linearized plasmid, with the yeast transformation kit. Immediately before the thermal shock (42 ° C for 15 min), DMSO was added to the transformation mixture with a final concentration of 10% (v / v) to increase the transformation efficiency (approximately 20,000 clones per transformation reaction).
  • the S. cerevisiae cells transformed with the corresponding library and the linearized pJRoC30 vector were seeded on SC plates and incubated at 30 ° C. After 3-4 days, individual colonies were chopped and inoculated into 96-well microplates (Sero-well, United Kingdom) containing 50 ⁇ L of minimum medium per well. The complete column number 6 of each plate was inoculated with the parental type selected from the previous cycle (column of reference) and one of the wells (H1) was inoculated with untransformed S. cerevisiae cells (negative control). The plates were sealed with parafilm and incubated at 30 ° C, 210 rpm and 80% relative humidity in an incubator with Minitron-INFORS humidification system (Biogen, Spain).
  • Plate A was doubled by 50 and 20 ⁇ L extractions for plates B and C respectively.
  • Plate B special thermocycler plate (Multiply PCR P ⁇ ate without skirt, neutral, Sarstedt) - was sealed with heat-resistant film (PCR Adhesive Film, Deltalab) and incubated at the corresponding temperature in thermocycler (MyCycler, Biorad, USA) for 10 min (so that the activity was reduced by approx. 2/3 of the initial activity). After incubation, plate B was incubated on ice for 10 min and was frightened for another 5 min at room temperature. 20 ⁇ L of plate B was transferred to plate D (residual activity test plate). Plates C and D were used for the colorimetric screening assay as described in section 2.3. 2.3 Colorimetric tests
  • the ABTS activity screening was performed by adding 180 ⁇ l_ of 100 mM sodium tartrate buffer (pH 3.5) containing 2 mM ABTS and 0.1 mM H2O2 to the corresponding replica plate. The plates were shaken briefly and the absorbance in the plate reader was measured at 418 nm. The plates were incubated at room temperature until the green color of the cationic radical ABTS # + developed and absorbance was measured again ( ⁇ 4 and 8
  • thermostability 36000 M -1 cm -1 ).
  • Second re-screening 100 ⁇ L aliquots of the most active clones of the first re-screening were grown in 3 mL of YPD medium at 30 ° C and 210 rpm for 24 h. Plasmids were extracted from these cultures (Zymoprep yeast plasmid miniprep kit, Zymo Research). As the product of zymoprep no It was pure and the concentration of the extracted DNA was very low, the plasmids were transformed into XL2-blue supercompetent E. coli cells according to the corresponding protocol (Stratagene) and were selected in LB / amp plates.
  • Plasmids (NucleoSpin® Plasmid kit, Macherey-Nagel) were extracted. The S. cerevisiae cells were transformed with the plasmids of the best mutants as well as with the corresponding parental type and the screening was carried out in the same way, with the proviso that each activity value came from the average of 5 microcultures per clone
  • Example 3 production, purification and biochemical characterization of mutants
  • the S. cerevisiae clones containing the ⁇ -VP genes of both the native type and mutants were grown in 3 mL of minimum medium for 48 h, at 30 ° C and 250 rpm (Micromagmix shaker, Ovan). An aliquot of this preculture was inoculated to reach an optical density (DO ⁇ oo) of 0.25 in a total volume of 50 mL of minimum medium in a 500 mL flask with porous plug.
  • DO ⁇ oo optical density
  • the culture cells (section 3.1) were separated by centrifugation at 4 ° C for 15 min at 8000 g (Beckman Coulter centrifuge, Avanti J-E centrifuge). The supernatant was filtered twice with fiberglass and nitrocellulose membranes with a pore of 0.45 ⁇ m.
  • the crude extract was subjected to a fractional precipitation with 65% saturation ammonium sulfate (w / v) at 0 ° C. After balancing the sample for 15-30 min, it was centrifuged 20 min at 18514 g at 3 ° C (Eppendorf 5810R centrifuge, Germany).
  • the dialysate was filtered with a 0.45-0.22 ⁇ m pore diameter filter and loaded into a 5 mL HiTrapQFF (Amersham Bioscience) anion exchange column pre-equilibrated in buffer A.
  • the protein was eluted with a linear gradient from 0 to 1 M NaCl (flow 1 mL / min).
  • the purified proteins were deglycosylated with the peptide-N-glycosidase F (PNGase F) (Sigma), which hydrolyzes the oligosaccharides bound to the asparagine residues.
  • PNGase F peptide-N-glycosidase F
  • 8 ⁇ g of pure VP was denatured with 0.2% SDS (w / v) and 100 mM ⁇ -mercaptoethanol at 100 ° C for 10 min.
  • 2.5 units of PNGase F were added and the reaction mixture was incubated overnight at 37 ° C. The reaction was stopped at 100 ° C for 10 min.
  • the products were analyzed on an electrophoresis gel (SDS-PAGE) stained with Coomasie blue.
  • thermostability study was carried out with the help of the Mycycler thermal cycler equipped with a gradient former (Bio-Rad, USA), which allows temperature gradients to be created at different intervals. Dilutions of the proteins were prepared in 10 mM tartrate buffer (pH 5.1) so that 20 ⁇ L aliquots would give an adequate response to measure the activity in the microplate reader in kinetic mode. 50 ⁇ L of VP was incubated for each point of the gradient.
  • the temperature gradient studied comprised the range 30-80 ° C with intermediate temperatures of 30.0 ° C, 31.7 ° C, 34.8 ° C,
  • the pH profiles of the activity of the different purified VPs were performed in 100 mM ByR buffer at different pH values (2.0-9.0, adjusted with NaOH). Dilutions of the enzymes were prepared in 10 mM sodium tartrate buffer (pH 5.0) containing 1 mM CaC ⁇ so that 10 ⁇ L aliquots would give an adequate response in the measure of activity in the kinetic mode microplate reader.
  • the VP (10 ⁇ L) were added by rows and the buffer at different pH values (180 ⁇ L) by columns. Finally, 10 ⁇ L ABTS / H2O2 solution (concentration in the 2 mM and 0.1 mM test respectively) was added and the activities of each of the conditions were measured in triplicate.
  • the specific activities of the native enzyme and R4 were determined in a SPECTRAmax Plus 384 microplate reader (Molecular Devices, USA) with a bandwidth of 1 nm. Each experimental data was obtained from the average of three independent experiments. Dilutions of the enzymes were prepared in 10 mM sodium tartrate buffer (pH 5.0) containing 1 mM CaCl2 so that 10 ⁇ L aliquots gave an adequate response in the measure of activity in the kinetic mode microplate reader (in a final volume 200 ⁇ L test).

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Peroxidasas versátiles obtenidas mediante evolución molecular dirigida a partir de una peroxidasa versátil de Pleurotus eryngii, mejoradas en su expresión funcional, actividad catalítica y estabilidad térmica, y procedimiento de obtención.

Description

PEROXIDASAS DE ELEVADO POTENCIAL REDOX DISEÑADAS POR
EVOLUCIÓN DIRIGIDA.
La presente invención se encuentra dentro del campo de Ia biología molecular, Ia tecnología del ADN recombinante y Ia biotecnología. Específicamente se refiere a enzimas del grupo de las peroxidasas ligninolíticas, mejoradas en su expresión funcional, actividad catalítica y estabilidad térmica, sus usos y el procedimiento para su obtención. La expresión funcional así como Ia mejora de actividad y estabilidad térmica de estas peroxidasas se lleva a cabo en células eucariotas de Saccharomyces cerevisiae a través de un proceso de evolución molecular dirigida. Dichas enzimas pueden emplearse como catalizadores en procesos industriales relacionados con Ia transformación de Ia biomasa lignocelulósica para Ia obtención de productos de celulosa, biocombustibles, el sector alimentario, el desarrollo de detergentes, Ia producción textil y el sector químico, así como en el procesamiento de los efluentes originados en dichos procesos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Las peroxidasas (EC 1.11.1 ) son oxidorreductasas que utilizan H2O2 u otros hidroperóxidos como oxidantes divalentes de Ia enzima. La proteína una vez activada cataliza sucesivamente dos oxidaciones monovalentes de diferentes compuestos aromáticos, colorantes, iones metálicos y otros sustratos. Dicha catálisis se lleva a cabo a través del grupo hemo, una protoporfirina IX con un átomo de hierro, que actúa como cofactor de Ia mayoría de las peroxidasas y que está situado en una cavidad central conectada a Ia superficie de Ia enzima por uno o varios canales que permiten el acceso de los sustratos a este centro catalítico.
Las peroxidasas se han dividido en dos superfamilias en función de sus diferencias estructurales: Ia superfamilia de las peroxidasas animales y Ia superfamilia de las peroxidasas bacterianas, fúngicas y de plantas (Welinder. 1992. Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 388-393). Las peroxidasas de plantas han sido las más estudiadas, especialmente Ia del rábano picante (Armoracia rusticana) conocida por sus siglas en inglés (HRP), pero son las fúngicas las que presentan mayor potencial biotecnológico. Esto es debido a que esta clase incluye las peroxidasas de los basidiomicetos ligninolíticos, caracterizadas por su elevado potencial redox (E0' > +1000 mV) (Ruiz-Dueñas et al., 2009. Microbial Biotechnol. 2:164-177). Esta característica les permite oxidar el polímero de lignina, otros sustratos aromáticos y colorantes recalcitrantes que no pueden ser oxidados por otras peroxidasas o por las lacasas (enzimas de tipo fenoloxidasa producidas por hongos y otros organismos) -en ausencia de mediadores redox- (Martínez et al., 2005. Intern. Microbiol. 8: 195-204).
Las peroxidasas fúngicas de alto potencial redox incluyen tres familias: lignina peroxidasas (LiP), manganeso peroxidasas (MnP) y peroxidasas versátiles (VP, de sus siglas en inglés). Las LiP (EC 1.11.1.13) se caracterizan por su capacidad para oxidar dímeros de lignina de tipo no fenólico y otros compuestos aromáticos de alto potencial redox, siendo el alcohol veratrílico uno de los sustratos más comunes de Ia enzima. Se trata de un metabolito aromático secretado por los hongos que degradan Ia lignina y que también se forma durante Ia degradación de ésta (siendo el sustrato habitualmente utilizado para medir Ia actividad LiP) que puede actuar como mediador redox de corto recorrido -debido a su baja estabilidad- durante Ia despolimerización de Ia lignina. Las MnP (EC 1.11.1.14) oxidan específicamente el Mn2+ a Mn3+ y éste, al quelarse con ácidos orgánicos sintetizados por los hongos, actúa como un oxidante difusible (quelatos estables con E0'= 0,9-1 ,2 V). A través de este mecanismo mediado, Ia MnP es capaz de degradar los elementos fenólicos y ácidos carboxílicos en el proceso de degradación de Ia lignina de Ia pared vegetal, aunque no es capaz de oxidar directamente las unidades no fenólicas de Ia lignina. Las VP (EC 1.11.1.16) descritas principalmente en especies de Pleurotus y Bjerkandera (Martínez 2002. Enzyme Microb. Technol. 30: 425-444), y más recientemente en Cerrena unicolor (Rainio et al., 2008. Proceedings of the 8th International Peroxidase Symposium, Tampere), combinan las propiedades catalíticas de Ia LiP y Ia MnP y de ciertas peroxidasas de plantas (como Ia HRP), Io que les confiere una gran versatilidad y potencial biotecnológico (Martínez, 2007. En Polaina y MacCabe (Eds.) Industrial Enzymes: Structure, Function and Applications. Springer, Berlín, pags. 475-486). De esta forma, las VP pueden oxidar sustratos típicos de Ia LiP (como el alcohol veratrílico, los metoxibencenos, y compuestos modelo de lignina de tipo no fenólico), así como el Mn2+, característico de Ia MnP. En concreto, Ia VP presenta en su estructura un hipotético sitio de unión del manganeso, responsable de Ia oxidación del Mn2+ a Mn3+, (al igual que Ia MnP) y un triptófano catalítico, responsable de Ia oxidación de compuestos aromáticos de alto potencial redox (al igual que Ia LiP). Además, Ia VP por si misma es capaz de oxidar compuestos fenólicos (como las peroxidasas de plantas), colorantes tipo azo y en general de alto potencial redox -como el Reactive Black 5- o hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) que Ia LiP solamente puede oxidar en presencia de alcohol veratrílico y Ia MnP no puede oxidar ni siquiera en presencia de Mn2+. El pH óptimo para Ia oxidación de estos sustratos varía desde pH 5.0 para Ia oxidación del Mn2+ a pH 3.0 para el alcohol veratrílico, valores similares a los óptimos para Ia oxidación de estos mismos sustratos por Ia MnP y Ia LiP, respectivamente.
La VP mejor caracterizada es Ia de Pleurotus eryngii (conocida como "seta de cardo"), un hongo modelo para los estudios de degradación selectiva de Ia lignina. Su caracterización ha comprendido análisis espectroscópicos y cristalográficos y Ia aplicación de Ia mutagénesis dirigida, Io que ha convertido a Ia VP en un modelo tanto para el estudio de mecanismos generales de Ia catálisis por peroxidasas como para el establecimiento de las bases estructurales de sus propiedades catalíticas únicas. Recientemente se ha determinado Ia estructura cristalina de Ia VP recombinante procedente de un replegado in vitro tras expresión en Escheríchia coli (variante alélica VPL2) a una resolución de 1 ,33 A (referencia PDB 2BOQ). En ella se observa el grupo hemo en el centro de una estructura formada por 12 hélices predominantemente alfa. Presenta 4 puentes disulfuro, dos sitios de unión a calcio, tres residuos ácidos potencialmente implicados en Ia oxidación del Mn2+ y un triptófano superficial (Trp164) que es el inicio de una ruta de transporte electrónico de largo recorrido para Ia oxidación de compuestos de alto potencial redox (como el alcohol veratrílico o el Reactive Black 5) (Pérez-Boada et al. 2005. J. Mol. Biol. 354: 385-402). Además Ia VP presenta un sitio para Ia oxidación de compuestos de bajo potencial redox (0,6-0,8 V) como fenoles y ABTS (2,2'-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato).
La tecnología de las enzimas ligninolíticas de alto potencial redox puede ser empleada en prácticamente Ia totalidad de Ia cadena de producción de productos papeleros -desde Ia elaboración de Ia pasta de papel hasta el tratamiento de efluentes- aunque es en el blanqueo libre de cloro de las pastas donde resulta más atractiva. Además las enzimas ligninolíticas encuentran aplicaciones en los siguientes sectores (Xu, 2005. Industrial Biotechnology 1 :38-50):
i) La industria alimentaria: procesamiento de bebidas o de productos de panadería. ii) La industria textil: degradación (destoxificación) de los colorantes de los efluentes o blanqueo de tejidos (lavado a Ia piedra dejeans). iii) Nanobiotecnología: a) como detectores de fenoles, oxígeno, azidas, morfina, codeína, catecolaminas o flavonoides en Ia elaboración de biosensores para análisis clínicos y medioambientales; y b) elaboración de biopilas de combustible. iv) Biorremediación: degradación de PAHs, compuestos AOX, etc. v) Síntesis química: producción de polímeros complejos, síntesis de agentes farmacológicos, preparación de derivados antibióticos y cosméticos.
La aplicación de peroxidasas ligninolíticas a nivel industrial requiere de sistemas de expresión robustos que proporcionen altos niveles de enzima activa. El empleo de sistemas de expresión heterólogos posibilita Ia producción de las peroxidasas de alto potencial redox de diferentes procedencias en un mismo hospedador, así como de nuevas variantes con propiedades mejoradas con respecto a Ia enzima salvaje.
A pesar de las ventajas biotecnológicas que ofrecen las peroxidasas de alto potencial redox, éstas no se han podido aun aplicar a nivel industrial debido a que no se han conseguido expresar funcionalmente a niveles suficientemente elevados en huéspedes apropiados. Esto en parte puede ser debido a que están glicosiladas Io que, unido a su inherente complejidad estructural (contienen cuatro-cinco puentes disulfuro, dos Ca2+ estructurales y un grupo hemo) dificulta su correcto plegamiento y expresión funcional. La variante alélica VPL2 de Ia VP de P. eryngii se expresó inicialmente en Emericella nidulans, obteniéndose unos niveles en torno a 0,4 mg/L (Ruiz-Dueñas et al., Appl. Environ. Microbio!. 65:4705-4707) y posteriormente en Aspergillus niger sin conseguir mejoras sobre los valores obtenidos con E. nidulans (Eibes et al., 2009. Bioprocess Biosyst Eng. 32:129-134).
Considerando Ia eficiencia de transformación, Ia estabilidad del ADN plasmídico y Ia tasa de crecimiento, E. coli es el organismo hospedador más frecuentemente utilizado en Ia expresión funcional heteróloga de los genes que codifican Ia proteína de interés. Sin embargo, el diferente uso de codones y Ia imposibilidad de realizar las modificaciones post-traduccionales necesarias para Ia correcta secreción de Ia proteína madura (como el procesamiento proteolítico o las glicosilaciones) pueden causar un plegamiento inapropiado de Ia proteína que es acumulada en cuerpos de inclusión, impidiendo su expresión funcional. Se ha descrito Ia expresión de Ia VP de P. eryngii en E. coli y su posterior replegado in vitro a partir de cuerpos de inclusión con rendimientos próximos al 7% (~5 mg/L) que son los más elevados obtenidos para una peroxidasa de secreción (Pérez-Boada et al. 2002. Enzyme. Microb. Tech. 30: 518-524). Este hecho, probablemente refleje Ia dificultad inherente de E. coli como un huésped de expresión para proteínas eucariotas, debido a su imposibilidad de glicosilar y a su limitada capacidad para favorecer Ia formación de puentes disulfuro. Muy recientemente se ha reportado Ia expresión funcional de Ia VP de Bjerkandera adusta en E. coli, aunque Ia enzima obtenida mostraba unos valores de actividad específica extremadamente bajos (en el orden de mU/mg). Los autores del trabajo atribuyen este fenómeno a un plegamiento conformacional diferente al de Ia proteína salvaje (Mohorcic et al., 2009. Bioresource Technology 100:851-858).
Algunos de los problemas anteriores pueden evitarse si los genes se expresan en hospedadores eucarióticos cuya maquinaría celular sea más próxima a Ia nativa, como es el caso de las levaduras. En especial, el uso de Saccharomyces cerevisiae es de gran interés ya que posee Ia habilidad de glicosilar y secretar las proteínas al medio extracelular (Io cual evita pasos intermedios de lisis celular) y tiene una elevada eficiencia de transformación. Además, haciendo uso de un vector episómico adecuado no integra el plásmido dentro de su genoma, facilitando así su posterior manipulación. Otra ventaja muy interesante desde un punto de vista de generación de diversidad para experimentos de evolución dirigida es su elevada frecuencia de recombinación de ADN, Ia cual a diferencia de E. coli permite Ia construcción de genotecas in vivo a través de Ia recombinación homologa de diferentes genes (conocido como in vivo ADN shuffling o "barajado"). Por último, Ia ligación de los genes mutados en vectores de expresión es, en muchos casos, un paso laborioso que requiere un ajuste fino. En levaduras, el mecanismo reparador de huecos (in vivo gap repair) puede sustituir Ia ligación in vitro de una manera rápida y precisa (Bulter & Alcalde, 2003. Directed evolution: library creation. Methods and protocols. Ed. Arnold, F. H. y Georgiou, G. Humana Press, Totowa, New Jersey (EEUU), pp. 17-22.). Sin embargo, Ia expresión funcional de peroxidasas ligninolíticas en S. cerevisiae tiene bajos rendimientos debido probablemente a los diferentes mecanismos moleculares e incompatibilidades entre el hongo de partida (basidiomiceto) y el huésped heterólogo (ascomiceto).
Las dificultades descritas para Ia expresión funcional heteróloga de peroxidasas ligninolíticas pueden ser superadas mediante el empleo de técnicas de evolución molecular dirigida (Arnold, 2001. Nature 409:253-257). Esta metodología recrea en el laboratorio los procesos claves de Ia evolución natural (mutación, recombinación y selección) de manera que es posible diseñar enzimas de gran interés científico y tecnológico. Sometiendo los genes seleccionados a ciclos sucesivos de evolución molecular, las diferentes mutaciones puntuales beneficiosas se irán acumulando y combinando hasta adquirir Ia propiedad deseada, que se ve mejorada de manera notoria, generación tras generación.
En Ia evolución in vitro, mediante mutagénesis aleatoria inducida y/o recombinaciones en el material genético que codifica para una o varias proteínas, se crea una diversidad genética que posteriormente se expresa y explora bajo las condiciones en las que se quiere mejorar Ia enzima (altas temperaturas o medios no convencionales, pH extremo, etc.). La mayoría de las características enzimáticas -expresión heteróloga funcional, regioespecificidad, enantioespecificidad, termoestabilidad, estabilidad en disolventes orgánicos, incluso Ia búsqueda de actividades de novo en el caso de anticuerpos catalíticos- pueden ser sometidas a experimentos de evolución dirigida (Tao & Cornish, 2002. Curr. Opin. Chem. Biol. 6:858-864).
La evolución molecular dirigida de oxidorreductasas fúngicas requiere preferentemente Ia expresión funcional de Ia enzima en S. cerevisiae como vehículo para Ia producción de Ia enzima. Conviene indicar que primero se puede hacer uso de Ia evolución molecular dirigida para aumentar el nivel de expresión de Ia enzima en S. cerevisiae y posteriormente usar el sistema de expresión diseñado para mejorar otras propiedades de Ia enzima (por ejemplo, Ia termoestabilidad). Un ejemplo claro de esta aproximación se detalló para Ia expresión funcional de lacasas fúngicas en S. cerevisiae. Utilizando este procedimiento se consiguió incrementar hasta 18 mg/L Ia producción de lacasa del ascomiceto Myceliophthora thermophila en S. cerevisiae así como mejorar su estabilidad térmica (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987-995).
La expresión funcional de Ia VP en S. cerevisiae no se ha descrito con éxito hasta el momento. Únicamente se ha reportado Ia mejora por evolución dirigida o mutagénesis combinatorial de peroxidasas de bajo potencial redox o de otras peroxidasas ligninolíticas. En primer lugar se reportó Ia evolución dirigida de Ia peroxidasa de Coprínopsis cinérea (CiP) -de bajo potencial redox- para mejorar su estabilidad operacional frente a Ia temperatura, presencia de H2O2 y pH alcalino. Como huésped heterólogo en el protocolo evolutivo se empleó S. cerevisiae y se sobre-expresó en Aspergillus oryzae (Cherry et al., 1999. Nature Biotech. 17:379-384). Posteriormente, el grupo de Arnold describió Ia evolución dirigida de Ia HRP -de bajo potencial redox- para su expresión funcional en S. cerevisiae y sobre-expresión en Pichia pastoris (Morawski et al., 2000. Protein Engineeríng. 13:377-384). En un trabajo ulterior, emplearon el mismo sistema para mejorar Ia estabilidad térmica y resistencia al H2O2 de Ia HRP (Morawski et al., 2001. Biotechonology and Bioeenginering 76: 99-107). Con respecto a peroxidasas ligninolíticas, se ha descrito un experimento de mutagénesis saturada combinatorial en Ia MnP para mejorar su estabilidad frente al H2O2. Como sistema de expresión se hizo uso de un método de expresión in vitro de Ia proteína basado en el sistema de E. coli (Miyazaki- Imamura et al., 2003. Protein Engineering 16:423-428). Más recientemente, se evolucionó Ia LiP para conferirla mayor eficiencia catalítica y resistencia frente al H2O2. Como sistema de expresión se empleó S. cerevisiae a través de un "yeast surface display" o de Ia secreción directa (Ryu et al., 2008. Journal of Biotechnology 133: 110-115; Ryu et ai, 2008. Journal of Biotechnology 135:241-246). Es necesario, por tanto, desarrollar VP extracelulares, funcionales y solubles con actividad mejorada hacia uno o más sustratos y termoestabilidad incrementada, así como encontrar un método para producirlas heterólogamente a niveles suficientemente elevados en huéspedes apropiados, que las expresen funcionalmente, para poder aplicarlas a nivel industrial. Dichas enzimas pueden emplearse como catalizadores en procesos industriales relacionados con Ia transformación de Ia biomasa lignocelulósica para Ia obtención de productos de celulosa, biocombustibles, el sector alimentario, el desarrollo de detergentes, Ia producción textil y el sector químico, así como en el procesamiento de los efluentes originados en dichos procesos
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a Ia expresión de enzimas peroxidasas de elevado potencial redox, obtenidas a partir de Ia VP de P. eryngii, y producidas funcionalmente en sistemas de expresión basados en el organismo eucariótico S. cerevisiae. En mayor detalle, Ia presente invención se refiere a polipéptidos o proteínas generadas mediante varios métodos de evolución dirigida de las secuencias polinucleotídicas que comprenden el gen de Ia VP de P. eryngii y Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal nativa del factor α de S. cerevisiae, dando lugar a una expresión funcional mejorada en dicho hospedador y/o a una actividad enzimática aumentada hacia uno o más sustratos así como a una mejora en Ia termoestabilidad de Ia enzima.
Un resumen de los polinucleótidos y polipéptidos descritos en Ia presente invención se resumen en Ia Tabla 1.
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
Por tanto, un primer aspecto de Ia invención se refiere a los polinucleótidos aislados que codifican el polipéptido con actividad peroxidasa, de ahora en adelante polinucleótidos de Ia invención, caracterizado porque su secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 50% con Ia SEQ ID NO: 35, y porque presenta al menos una de las mutaciones que se selecciona de Ia lista que comprende: a. la sustitución del aminoácido ácido glutámico (E) por el aminoácido lisina (K), en Ia posición homologa a Ia posición 128 de Ia SEQ ID NO: 35, b. Ia sustitución del aminoácido histidina (H) por el aminoácido arginina (R), en Ia posición homologa a Ia posición 130 de Ia SEQ
ID NO: 35, c. Ia sustitución del aminoácido valina (V) por el aminoácido alanina (A), en Ia posición homologa a Ia posición 251 de Ia SEQ ID NO: 35, d. Ia sustitución del aminoácido treonina (T) por el aminoácido metionina (M), en Ia posición homologa a Ia posición 275 de Ia SEQ ID NO: 35, e. Ia sustitución del aminoácido glutamina (Q) por el aminoácido leucina (L), en Ia posición homologa a Ia posición 293 de Ia SEQ ID NO: 35, f. Ia sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) por el aminoácido alanina (A), en Ia posición homologa a Ia posición 304 de Ia SEQ ID NO: 35, g. Ia sustitución del aminoácido treonina (T) por el aminoácido isoleucina (I), en Ia posición homologa a Ia posición 375 de Ia
SEQ ID NO: 35, h. Ia sustitución del aminoácido alanina (A) por el aminoácido treonina (T), en Ia posición homologa a Ia posición 399 de Ia SEQ ID NO: 35, i. Ia sustitución del aminoácido ácido glutámico (G) por el aminoácido arginina (R), en Ia posición homologa a Ia posición 421 de Ia SEQ ID NO: 35,
Dado que las peroxidasas versátiles de hongos basidiomicetos ligninolíticos, y otras enzimas peroxidasas como las MnP producidas por Ia mayoría de los basidiomicetos ligninolíticos y otras VP producidas por especies de los géneros
Pleurotus y Bjerkandera, pueden considerarse afines en cuanto a su evolución, puede esperarse que Ia identidad global de los genomas al nivel de los aminoácidos, y más concretamente a nivel de Ia secuencia aminoacídica correspondiente a Ia SEQ ID NO: 35, sea de un 50% o mayor, y más preferiblemente de un 60% o mayor y más preferiblemente de un 80, un 90, un 95 o un 99% o mayor. La correspondencia entre Ia secuencia aminoacídica de la(s) peroxidasa(s) fúngicas putativa(s) y Ia secuencia de otras peroxidasas se puede determinar por métodos conocidos en Ia técnica. Por ejemplo, aquéllas se pueden determinar por una comparación directa de Ia información de secuencia aminoacídica procedente de Ia peroxidasa putativa, y Ia secuencia aminoacídica correspondiente a Ia SEQ ID NO: 35 de esta memoria.
El término "homología", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a Ia semejanza entre do estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más concretamente, a Ia semejanza o identidad entre los nucleótidos de dos o más polinucleótidos.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a Ia proporción de nucleótidos idénticos entre dos polinucleótidos que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de Ia técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa BLASTP o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1999). Puesto que dos proteínas se consideran homologas si tienen el mismo origen evolutivo o si tienen función y estructura similares, en general, se asume que valores superiores de similitud o identidad del 30% indican estructuras homologas. Podemos considerar, por tanto, que porcentajes de identidad de, al menos, un 80%, mantendrán las mismas propiedades de dicho péptido.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a los polinucleótidos aislados que codifican el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, Ia SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27, Ia SEQ ID NO: 29, Ia SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 33.
El término "aislado", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a nucleótidos o péptidos que: 1 ) se encuentran sustancialmente libres de componentes que normalmente acompañan o interaccionan con él en Ia naturaleza, o 2) si se encuentran en su medio natural, han sido sintéticamente (no naturalmente) alterados por Ia intervención humana y/o introducidos en una célula que no los posee de forma nativa. Por ejemplo, un nucleótido natural se convierte en "aislado" si se ha alterado, o si proviene de un ADN que ha sido alterado por medio de Ia intervención humana (por medio de, por ejemplo pero sin limitarnos, mutagénesis dirigida, inserciones, deleciones, etc). De Ia misma manera, un nucleótido natural se convierte en "aislado" si se introduce por medios no naturales en un genoma no nativo a dicho nucleótido (transfección). Por tanto, el término "aislado" en este último caso, es equivalente al término "heterólogo".
Los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de secuencias aminoacídicas descritos corresponden a variantes de Ia proteína de fusión α- VP nativa constituida por Ia secuencia señal del factor α operativamente enlazada a Ia secuencia de Ia VP nativa de P. eryngii. Dicha proteína de fusión α-VP nativa corresponde a Ia secuencia de nucleótidos, o polinucleótidos, que constituyen Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 35.
Por tanto, los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, Ia SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27, Ia SEQ ID NO: 29, Ia SEQ ID NO: 31 y Ia SEQ ID NO: 33 han sido obtenidos mediante un proceso de evolución dirigida a partir de Ia α-VP nativa y podrán dar lugar a variantes de Ia VP cuya actividad catalítica y/o expresión funcional y/o termoestabilidad ha sido mejorada.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a los polinucleótidos aislados que se seleccionan de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 2, Ia SEQ ID NO: 4, Ia SEQ ID NO: 6, Ia SEQ ID NO: 8, Ia SEQ ID NO: 10, Ia SEQ ID NO: 12, Ia SEQ ID NO: 14, Ia SEQ ID NO: 18, Ia SEQ ID NO: 20, Ia SEQ ID NO: 22, Ia SEQ ID NO: 24, Ia SEQ ID NO: 26, Ia SEQ ID NO: 28, Ia SEQ ID NO: 30, Ia SEQ ID NO: 32, Ia SEQ ID NO: 34 y Ia SEQ ID NO: 36.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante primer polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 1.
El primer polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 1 , secuencia que presenta el muíante 11 H10 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 2 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante segundo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 3. El segundo polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO:
3, secuencia que presenta el mutante 15G9 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 4 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante tercer polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 5.
El tercer polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 5, secuencia que presenta el mutante 4B5 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 6 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético. Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante cuarto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 7. El cuarto polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 7, secuencia que presenta el mutante 4B1 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 8 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante quinto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 9.
El quinto polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 9, secuencia que presenta el mutante 16E12 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 10 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de
(a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante sexto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 11.
El sexto polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 11 , secuencia que presenta el muíante 19C2 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 12 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de
(a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante séptimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 13.
El séptimo polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 13, secuencia que presenta el muíante 20D1 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consisíe en Ia SEQ ID NO: 14 o en su cadena complemeníaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante octavo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 15.
El octavo polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 15, secuencia que presenta el muíante 13G1 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 16 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de
(a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante noveno polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 17.
El noveno polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 17, secuencia que presentan los mutantes 10C3 y 6B1 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 18 o Ia SEQ NO: 20 o en sus cadenas complementarias, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante décimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 19.
El décimo polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 19, secuencia que presenta el muíante 13E4 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 22 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de
(a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante undécimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 21.
El undécimo polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 21 , secuencia que presenta el muíante 6E7 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 24 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante duodécimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 23.
El duodécimo polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 23, secuencia que presenta el muíante 11 F3 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consisíe en Ia SEQ ID NO: 26 o en su cadena complemeníaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complemeníaria es capaz de hibridar en condiciones asíringeníes con una secuencia polinucleoíídica de
(a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante decimotercer polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 25.
El decimotercer polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 25, secuencia que presenta el muíante R4 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 28 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante decimocuarto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 27.
El decimocuarto polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad y termoestabilidad mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 27, secuencia que presenta el muíante 24E10 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 30 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante decimoquinto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 29.
El decimoquinto polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad y termoestabilidad mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 29, secuencia que presenta el muíante 3H9 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 32 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante decimosexto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 31. El decimosexto polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad y termoestabilidad mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 31 , secuencia que presenta el muíante 15B4 de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 34 o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido aislado, de ahora en adelante decimoséptimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 33.
El decimoséptimo polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia α-VP con actividad y termoestabilidad mejorada, cuya secuencia polipeptídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 33, secuencia que presenta el muíante 2-1 B de los ejemplos de Ia invención y corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consisíe en Ia SEQ ID NO: 36 o en su cadena complemeníaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complemeníaria es capaz de hibridar en condiciones asíringeníes con una secuencia polinucleoíídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genéíico. Se reportan, por tanto, las secuencias polinucleotídicas de los mutantes obtenidos por evolución dirigida que codifican para variantes de α-VP con actividad catalítica y/o expresión funcional y/o termoestabilidad mejorada.
Hasta el momento no se ha descrito Ia expresión funcional de Ia VP en S. cerevisiae. La invención incluye el procedimiento para producir dichos polinucleótidos y enzimas mejoradas mediante Ia metodología de evolución molecular dirigida, proporcionando además una solución para producir heterólogamente VP extracelulares, funcionales y solubles con actividad mejorada hacia uno o más sustratos y termoestabilidad incrementada.
Para ello, se generan miles de mutantes, a través de protocolos de creación de diversidad in vitro o in vivo, que contienen mutaciones que pueden ser beneficiosas para Ia propiedad a potenciar. Los mutantes creados de esta manera pueden ser producidos de manera sencilla en S. cerevisiae. Para determinar si Ia VP de interés sintetizada por el sistema de expresión tiene mejoras en su expresión y en sus propiedades funcionales, se emplean test convencionales. Por ejemplo, para determinar si el polinucleótido sometido a evolución dirigida y expresado en un hospedador foráneo produce VP con actividad mejorada, se pueden diseñar experimentos para determinar Ia actividad funcional de Ia proteína. Se pueden analizar una gran cantidad de mutantes de manera precisa y simultánea (high-throughput) mediante el diseño de métodos de exploración o screening, tras los cuales los mejores mutantes pueden ser aislados, purificados y caracterizados. Los mejores mutantes de cada ciclo evolutivo se emplean como parentales o puntos de partida para el siguiente ciclo evolutivo obteniendo de esta manera mejoras significativas sobre el/los parental/es inicial/es debidas a Ia acumulación de mutaciones beneficiosas de un ciclo a otro.
El procedimiento detallado para Ia obtención de los polinucleótidos y enzimas mejoradas comprende tres fases: 1 ) Introducción de Ia secuencia señal del factor α para favorecer Ia expresión funcional de Ia VP en S. cerevisiae. La secuencia señal del factor α se emplea habitualmente para favorecer Ia secreción de proteínas heterólogas en S. cerevisiae (Shuster, J. R. Curr. Opin. Biotechnol. 2:685-690. 1991 ). Dicha secuencia señal se escinde durante Ia maduración de Ia proteína y su secreción al medio extracelular, por Io que no forma parte de Ia enzima madura. La nueva construcción (Ia secuencia señal del factor α fusionada con el gen que codifica Ia proteína madura, denominada en esta memoria como α- VP) se somete al proceso de evolución dirigida con el fin de aumentar Ia expresión funcional y los valores de actividad total VP. Por Io tanto, Ia acumulación de mutaciones beneficiosas puede tener lugar tanto en Ia secuencia señal del factor α como en Ia secuencia de Ia VP madura.
2) Desarrollo de protocolos de generación de diversidad y creación de las librerías de mutantes. La generación de diversidad se lleva a cabo empleando diferentes herramientas: i) introducción aleatoria de mutaciones puntuales en α-VP mediante amplificación del ADN en reacciones en cadena de ADN polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) sometida a error y denominada desde este momento PCR mutagénica; y ii) recombinación de ADN de diferentes genes mutados de α-VP para facilitar Ia acumulación de mutaciones beneficiosas y Ia eliminación de aquellas que se presentan como deletéreas o neutrales, a través de: a) el barajado in vivo del ADN mutagenizado; b) el ensamblaje in vivo de librerías mutantes con diferente espectro mutacional (IvAM "in vivo assembly of mutant libraries with different mutational spectra"); o c) Ia recombinación in vitro del ADN a través de una modificación del proceso conocido como Staggered Extensión Process (StEP), que desde este momento denominamos StEP mutagénico.
Las librerías de mutantes se constituyen a través del clonaje in vivo de los genes mutagenizados con el vector de expresión así como de Ia recombinación de las mejores variantes y su transformación en células de S. cerevisiae.
3) Exploración de alta capacidad o screening high-throughput para Ia selección de los mejores mutantes de expresión y actividad. Esta fase comprende i) Ia micro-fermentación de los clones que contienen los genes mutados y/o recombinados para Ia expresión funcional de los mejores mutantes de α-VP en formato placas de 96 pocilios; ii) el screening de las actividades y/o termoestabilidades de las enzimas recombinantes secretadas, mediante métodos colorimétricos basados en Ia oxidación de sustratos no fenólicos; y iii) re-screenings adicionales para garantizar Ia selección de los genes que expresan mayor proteína y/o actividad y/o termoestabilidad a través del aislamiento, purificación y nuevamente transformación y expresión de los genes previamente seleccionados en S. cerevisiae.
La obtención de los polinucleótidos y enzimas mejoradas descritas en Ia presente invención podría también llevarse a cabo mediante un método denominado "mutagénesis dirigida" basándose en Ia información de las mutaciones reportadas en Ia presente patente. Esto se debe a que para llevar a cabo este procedimiento es necesario conocer Ia posición exacta y el cambio aminoacídico que se debe incluir en Ia nueva proteína. Este proceso consiste en Ia introducción de cambios puntuales en Ia secuencia de ADN que codifica dicha enzima. Estos cambios se introducen en el ADN codificante (ADNc) complementario del ARN mensajero (ARNm) que codifica Ia α-VP (y que carece de las secuencias no codificantes, "intrones", presentes en el ADN genómico eucariota), clonado en un vector de expresión. El vector resultante se usa como molde en reacciones de PCR, en las que se emplea una polimerasa de alta fidelidad con objeto de que los cambios en el ADN se limiten a los deseados. Para cada mutación se diseñan al menos dos oligonucleótidos "cebadores" de Ia reacción de PCR, cuyas secuencias incorporan el cambio adecuado y son complementarias a hebras opuestas de Ia misma región de ADN. La comprobación de que las cadenas de ADN resultantes de Ia PCR portan únicamente las mutaciones deseadas puede lograrse mediante su secuenciación.
Por tanto, el método para Ia obtención de los polinucleótidos y enzimas mejoradas requiere el diseño de una nueva construcción genética, (Ia secuencia señal del factor α fusionada con el gen que codifica Ia proteína madura, denominada α-VP). Así pues, otro aspecto de Ia invención se refiere a una construcción genética de ADN o ARN, de ahora en adelante construcción genética de Ia invención, que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias: a) un polinucleótido aislado de Ia invención, b) un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17,
Ia SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27, Ia SEQ ID NO: 29, Ia SEQ ID NO: 31 , Ia SEQ ID NO: 33 y Ia SEQ ID NO: 35. c) una molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida en condiciones astringentes con Ia secuencia polinucleotídica de (a), ó d) una secuencia de nucleótidos de a), ó b), preferiblemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales {enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc..
Esta construcción genética incluye los vectores de clonación y expresión que comprenden los polinucleótidos aislados de Ia invención. Tales vectores de expresión incluyen secuencias de control, tales como, por ejemplo, elementos de control de Ia traducción (como códigos de iniciación y de parada) y de Ia transcripción (por ejemplo, regiones de promotor-operador, sitios de unión). Los vectores conforme a Ia invención pueden incluir plásmidos y virus, y otros vectores de acuerdo con procedimientos bien conocidos y documentados en Ia técnica, y pueden expresarse en una variedad de sistemas de expresión diferentes, asimismo bien conocidos y documentados en Ia técnica.
Se conoce, así mismo, una variedad de técnicas que pueden utilizarse para introducir tales vectores en células procarióticas o eucarióticas (células hospedantes) para su expresión. Técnicas adecuadas de transformación o transfección están bien descritas en Ia bibliografía.
Un "vector" es un replicón al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para realizar Ia replicación y/o expresión del segmento unido.
Un "replicón" es cualquier elemento genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleotídica dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control.
"Secuencia de control" se refiere a secuencias de nucleótidos que son necesarias para efectuar Ia expresión de las secuencias codificadoras a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. En procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal y señales de terminación. En eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores y, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para Ia expresión y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.
"Unidos de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición en Ia que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar de Ia manera deseada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que Ia expresión de Ia secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un "marco de lectura abierto" (ORF de su nombre en inglés) es una región de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora completa.
Una "secuencia codificadora" es una secuencia de nucleótidos que se transcribe a ARNm y se traduce a un polipéptido cuando está bajo control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de Ia secuencia codificadora se determinan mediante un codón de inicio de traducción en el extremo 5' y un codón de finalización de Ia traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no se limita a ARNm, ADNc y secuencias de polinucleótidos recombinantes.
En una realización preferida de este aspecto, el polinucleótido de (a), de Ia construcción genética de Ia invención, codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica consiste en Ia SEQ ID NO: 35.
En otra realización preferida de este aspecto, el polinucleótido de (a), de Ia construcción genética de Ia invención, se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 2, Ia SEQ ID NO: 4, Ia SEQ ID NO: 6, Ia SEQ ID NO: 8, Ia SEQ ID NO: 10, Ia SEQ ID NO: 12, Ia SEQ ID NO: 14, Ia SEQ ID NO: 18, Ia SEQ ID NO: 20, Ia SEQ ID NO: 22, Ia SEQ ID NO: 24, Ia SEQ ID NO: 26, Ia SEQ ID NO: 28, Ia SEQ ID NO: 30, Ia SEQ ID NO: 32, Ia SEQ ID NO: 34 y Ia SEQ ID NO: 38. En otra realización más preferida de este aspecto, Ia secuencia nucleotídica del polinucleótido de (a), de Ia construcción genética de Ia invención, consiste en Ia SEQ ID NO: 38. La presente invención permite producir, en cantidades hasta ahora no disponibles, VP que presenta una mayor expresión funcional, una mayor actividad catalítica y una termoestabilidad mejorada.
Los polinucleótidos aislados de Ia invención y/o Ia construcción genética de Ia invención pueden introducirse (o transfectarse) en una célula hospedadora. Dicha célula hospedadora puede crecerse en un medio de cultivo adecuado, expresándose Ia VP codificada por los polinucleótidos o construcciones genéticas de Ia invención.
Por tanto, otro aspecto se refiere a una célula, de ahora en adelante célula de Ia invención, que comprende un polinucleótido aislado de Ia invención, o Ia construcción genética de Ia invención.
El término "célula" tal como se entiende en Ia presente invención hace referencia a una célula procariótica o eucariótica. En esta invención, preferiblemente se refiere a una célula eucariótica, y más preferiblemente a una célula que puede clasificarse dentro del género Saccharomyces.
Otro aspecto se refiere al uso de los polinucleótidos aislados de Ia invención, a Ia construcción genética de Ia invención, o a Ia célula de Ia invención, para producir peroxidasas versátiles (VP) con mayor expresión funcional y/o mayor actividad catalítica y/o mayor estabilidad térmica.
Tal y como se usa en esta memoria, el término "transfección" se refiere a Ia introducción o transferencia de una molécula de ácido nucleico exógena en una célula eucariota, incluyendo, pero no limitándose a ella, una molécula de ácido ribonucleico o desoxirribonucleico (por ejemplo, ARN ó ADN desnudo).
Medios de cultivos adecuados son conocidos en el estado de Ia técnica. Un "hospedador" o "célula hospedadora" o "célula hospedante" se refiere a un organismo, célula o tejido que sirve como diana o recipiente del polinucleótido que codifica una proteína recombinante de interés, donde Ia célula hospedadora se transforma con un vector de expresión conteniendo el polinucleótido de interés. En esta memoria, Ia proteína recombinante de interés es una VP de origen fúngico, de alto potencial redox, que presenta una mayor expresión funcional, una mayor actividad catalítica y una mayor termoestabilidad.
Preferiblemente, el hospedador es S. cerevisiae. La levadura de cerveza S. cerevisiae es un hongo unicelular que pertenece al superreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), reino Fungi, subrreino Dikarya, phylum Ascomycota, subphylum Saccharomycotina, clase Saccharomycetes, orden Saccharomycetales, familia Saccharomycetaceae y género Saccharomyces.
La presente invención comprende, por tanto, variantes de genes y enzimas del grupo de las VP que presentan una mayor expresión funcional en S. cerevisiae, una mayor actividad catalítica y/o una mayor termoestabilidad.
Por tanto, en otro aspecto de Ia invención se proporciona un método para generar VP extracelulares, funcionales y solubles con actividad mejorada hacia uno o más sustratos y/o termoestabilidad mejorada, de ahora en adelante método de Ia invención, que comprende: a) diseñar una construcción genética que comprenda el polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 39 o cualquiera de sus variantes, b) generar diversidad sobre Ia construcción genética de (a) y crear las librerías de mutantes, y c) seleccionar los mejores mutantes de expresión, actividad y/o termoestabilidad.
En una realización preferida de este aspecto, el polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 39, o cualquiera de sus variantes, del paso (a) del método de Ia invención, se encuentra operativamente enlazado a otra secuencia nucleotídica que dirija Ia secreción y/o facilite el correcto procesamiento de Ia enzima. En una realización más preferida, el polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 39 o cualquiera de sus variantes, del paso (a) del método de Ia invención, se encuentra operativamente enlazado al polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 39 o cualquiera de sus variantes.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a una proteína sustancialmente homologa a Ia proteína cuya secuencia aminoacídica consiste en Ia SEQ ID NO: 39. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos.
Tal como aquí se utiliza, una proteína es "sustancialmente homologa" a Ia proteína cuya secuencia aminoacídica consiste en Ia SEQ ID NO: 39 (o en Ia SEQ ID NO: 37), cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con dicha secuencia de aminoácidos, es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a Ia secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39 (o en Ia SEQ ID NO: 37), de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 70%, ventajosamente de, al menos, un 80%, preferiblemente de, al menos un 90%, más preferiblemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferiblemente de, al menos, un 99%.
En Ia construcción genética del procedimiento de Ia invención se fusiona el gen de Ia proteína madura de Ia VP con Ia secuencia señal del factor α para favorecer Ia expresión funcional de Ia VP madura en S. cerevisiae. La secuencia señal del factor α se corresponde con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 37 y Ia secuencia del gen de Ia proteína madura de Ia VP se corresponde con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 39.
En el contexto de Ia presente invención, Ia secuencia señal nativa del factor α se define por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO 37, que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 40, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a Ia degeneración del código genético, en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee Ia actividad y las características estructurales de Ia secuencia señal nativa del factor α.
La VP de P. eryngii está definida en Ia presente invención por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO 39, que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 41 , o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), ó c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético, en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee Ia actividad y las características estructurales de Ia VP. de P. eryngii.
En otra realización preferida de este aspecto, el método de Ia invención además comprende Ia identificación y el mapeo de las mutaciones introducidas en las variantes seleccionadas. En otra realización más preferida, Ia construcción genética del paso (a) del método de Ia invención, comprenda el polinucleótido aislado cuya secuencia nucleotídica consiste en Ia SEQ ID NO: 40, operativamente enlazado con el polinucleótido aislado cuya secuencia nucleotídica consiste en Ia SEQ ID NO: 41.
En otra realización preferida, el método de Ia invención además comprende repetir los pasos (a)-(c), empleando en Ia construcción genética según (a) los polinucleótidos que codifican para los mejores mutantes de expresión, actividad y/o termoestabilidad obtenidos en el paso (c), de manera consecutiva.
En esta memoria "de manera consecutiva" significa que los pasos (a) - (c) del método de Ia invención se repiten en ciclos, uno después de otro, empleando en Ia construcción genética según (a) los polinucleótidos que codifican para los mejores mutantes de expresión, actividad y/o termoestabilidad obtenidos en el paso (c) del ciclo anterior. Los ciclos pueden repetirse tantas veces como se quiera, comprobando, por ejemplo, las características de los diferentes mutantes obtenidos (características de interés como por ejemplo, pero sin limitarnos, expresión funcional, actividad y/o termoestabilidad), hasta que los valores de dichas características en los mutantes obtenidos en el paso (c) del último ciclo no varíen significativamente desde un punto de vista estadístico de los mutantes obtenidos en el paso o los pasos (c) de los ciclos anteriores, o hasta que obtengamos un muíante con las características que sean de interés.
Así, en una realización particular de Ia presente invención el procedimiento se aplica en un primer ciclo de evolución dirigida del gen parental α-VP. La fase 1 del procedimiento se lleva a cabo empleando como molde el vector pGAPZα de Invitrogen™ y el ADNc vpl2 de P. eryngii, cuya secuencia nucleotídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 41.
El fragmento de ADN amplificado de α-VP es subclonado en el vector lanzadera pJRoC30 (Novozymes) para facilitar Ia expresión funcional en S. cerevisiae y Ia sobre-producción plasmídica en E. coli (Fig. 1). La fase 2 del procedimiento se lleva a cabo a través de Ia construcción de una librería de mutantes con una tasa mutacional baja (promedio de mutaciones puntuales introducidas al azar en el gen parental α-VP) creada mediante PCR mutagénica. En Ia Fig. 2 se muestra el paisaje de evolución dirigida de Ia librería construida, con un 13 % de los clones explorados con menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental. El clonaje de las librerías mutantes con el vector de expresión se lleva a cabo in vivo haciendo uso de Ia maquinaría celular eucariota de S. cerevisiae. Para ello, se co-transforma Ia librería en cuestión con el plásmido de expresión linearizado. Los productos de PCR generados poseen extensiones solapantes de no menos de 50 pares de bases que facilitan el clonaje in vivo y Ia reparación del vector de expresión mediante un proceso de recombinación homologa. Los extremos solapantes se generan gracias al diseño de oligonucleótidos cebadores de Ia reacción de PCR mutagénica que confieran dicha homología con los extremos del vector linearizado.
Para Ia fase 3 del procedimiento se realiza un screening empleando ensayos de actividad en modo de punto final con el sustrato no fenólico ABTS. Los protocolos de re-screening (en especial el segundo re-screening) se llevan a cabo a partir de células transformantes nuevas para promover Ia sincronización celular y evitar Ia selección de falsos positivos. Los detalles citados para esta fase son también aplicables en todas las realizaciones particulares que se describen a continuación referentes a ciclos evolutivos. De Ia presente realización se seleccionan 4 genes mutantes de α-VP denominados 11 H10, 15G9, 4B5 y 4B1 con mejoras que van desde 9 a 3,6 veces mejor actividad total que el parental α-VP expresado en S. cerevisiae (Tabla 2 y Fig. 3). En esta memoria se define como "actividad total" aquella que se deriva de Ia mejora en el nivel de expresión y Ia actividad catalítica de Ia enzima. En otra realización particular de Ia presente invención el procedimiento se aplica en un segundo ciclo de evolución dirigida utilizando como parentales los genes mutantes obtenidos en Ia primera generación: 11 H10, 15G9, 4B5 y 4B1. La fase 2 del procedimiento se lleva a cabo mediante Ia construcción de una librería mutagénica a través de un barajado in vivo de los genes parentales previamente mutagenizados. Este enfoque facilita el empuje evolutivo hacia mejoras en Ia actividad total mediante: i) Ia recombinación de las mejores mutaciones de los genes parentales, ii) Ia introducción de nuevas mutaciones puntuales beneficiosas. La recombinación in vivo de los mejores parentales se lleva a cabo mediante una co-transformación de los productos de PCR mutagénica de dichos genes con el vector linearizado en S. cerevisiae. Los extremos solapantes facilitan el clonaje in vivo al tiempo que Ia elevada tasa de recombinación homologa de S. cerevisiae favorece Ia recombinación de las mutaciones acumuladas para generar genes quimera.
La fase 3 se lleva a cabo mediante protocolos de ensayo de actividad en modo de punto final. En Ia Fig. 4 se muestra el paisaje de evolución dirigida de Ia librería construida, con un 35 % de los clones explorados con menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental. De esta realización se seleccionan 4 genes mutantes de α-VP denominados 16E12, 19C2, 20D1 y 13G1 , con mejoras que van desde 4.6 a 3.2 veces Ia actividad total del mejor gen muíante de Ia anterior generación, 11 H10 (Tabla 2 y Fig. 5).
En una realización particular de Ia presente invención el procedimiento se aplica en un tercer ciclo de evolución dirigida utilizando como parentales los genes mutantes obtenidos en Ia segunda generación: 16E12, 19C2, 20D1 y 13G1. La fase 2 del procedimiento se lleva a cabo mediante Ia construcción de una librería mutagénica a través de un barajado in vivo de los genes parentales previamente mutagenizados, de igual manera que se describe en Ia realización anterior. La fase 3 se realiza mediante protocolos de ensayo de actividad en modo cinético, debido a Ia mayor actividad de partida de los tipos parentales. En Ia Fig. 6 se muestra el paisaje de evolución dirigida de Ia librería construida, con un 40 % de los clones explorados con menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental. De esta realización se seleccionan 5 genes mutantes de α-VP denominados 10C3, 6B1 , 13E4, 6E7 y 11 F3, con mejoras que van desde 3,1 a 2,4 veces Ia actividad total del mejor gen muíante de Ia anterior generación, 16E12 (Tabla 2 y Fig. 7). En una realización particular de Ia presente invención el procedimiento se aplica en un cuarto ciclo de evolución dirigida utilizando como parentales los genes mutantes obtenidos en Ia tercera generación: 10C3, 6B1 , 13E4, 6E7 y 11 F3. En este cuarto ciclo además del screening hacia Ia mejora de actividades, se introduce un nuevo screening para Ia mejora de Ia estabilidad térmica. La fase 2 del procedimiento se lleva a cabo mediante Ia construcción de una librería mutagénica a través de un barajado in vitro de los genes parentales mediante una reacción de StEP mutagénico combinado con un posterior barajado in vivo de los genes en S. cerevisiae. Este protocolo de diversidad se aplica con Ia finalidad de generar entrecruzamientos diferentes a los obtenidos con Ia técnica de barajado in vivo empleada en las generaciones anteriores. La fase 3 se realiza mediante protocolos de ensayo de actividad en modo cinético y de punto final. Para este cuarto ciclo se diseña adicionalmente un ensayo de screening de termoestabilidad para seleccionar mutantes con estabilidad mejorada frente a Ia temperatura. El ensayo estuvo basado en Ia oxidación del ABTS y se expresó en valores relativos con respecto a las actividades iniciales mostradas por los mutantes antes y después de su incubación a una temperatura dada (Fig. 8).
Figure imgf000039_0001
En Ia Fig. 9 se muestran los paisajes de evolución dirigida de Ia librería construida, con un 16 % de los clones explorados con menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental. De esta realización se seleccionan 2 genes mutantes de α-VP denominados R4 (mejor y último muíante seleccionado de actividad; relación mejora de actividad total/mejora de estabilidad: 1 ,84/1 ,07 con respecto al mejor muíante de Ia generación anterior, 10C3) y 24E10 (mejor muíaníe de esíabilidad; relación mejora de acíividad íoíal/mejora de esíabilidad: 1.07/1.23 con respecío al mejor muíaníe de Ia generación aníerior, 10C3) (Tabla 2 y Fig. 10).
En una realización particular de Ia preseníe invención el procedimienío se aplica en un quinío ciclo de evolución dirigida exclusivameníe hacia íermoesíabilidad uíilizando como pareníal el gen muíaníe del screening de íermoesíabilidad de Ia cuarta generación, 24E10. La fase 2 del procedimienío se lleva a cabo medianíe Ia consírucción de una librería muíagénica a íravés de Ia recombinación in vivo de librerías muíagénicas del pareníal 24E10 con difereníe especíro muíacional (IvAM). Esíe proíocolo de diversidad se iníroduce para generar un especíro muíacional difereníe al obíenido con los ensayos muíagénicos con Taq/MnC^ de las generaciones aníeriores. La fase 3 se realiza medianíe proíocolos de ensayo de íermoesíabilidad en modo cinéíico y de punió final. El screening de íermoesíabilidad se modifica aumeníando Ia íemperaíura de incubación hasía valores que supongan Ia pérdida de las 2/3 partes de Ia acíividad del pareníal 24E10.
En Ia Fig. 11 se muesíra los paisajes de evolución dirigida de Ia librería consíruida, con un 37 % de los clones explorados con menos del 10 % de Ia acíividad del íipo pareníal. De esía realización se seleccionan 2 genes muíaníes de α-VP denominados 3H9 y 15B4 (relaciones mejora de acíividad íoíal/mejora de esíabilidad con respecío al mejor muíaníe de íermoesíabilidad de Ia generación aníerior -24E10- de 0,79/1 ,35 y 1 ,19/1 ,21 respecíivameníe) (Tabla 2 y Fig. 12). En una realización particular de Ia presente invención el procedimiento se aplica en un sexto ciclo de evolución dirigida hacia termoestabilidad utilizando como parental los genes mutantes del screening de termoestabilidad de Ia quinta generación, 3H9 y 15B4. La fase 2 del procedimiento se lleva a cabo mediante Ia construcción de una librería mutagénica a través de un barajado in vivo de los genes parentales previamente mutagenizados, de igual manera que se describe para los ciclos evolutivos segundo y tercero. La fase 3 se realiza mediante protocolos de ensayo de actividad en modo cinético y de punto final. El screening de termoestabilidad se modifica aumentando Ia temperatura de incubación hasta valores que supongan Ia pérdida de las 2/3 partes de Ia actividad de los parentales 3H9 y 15B4. Del cuarto al sexto ciclo de evolución Ia presión selectiva del ensayo de screening (Ia temperatura fijada) se incrementa de 6O°C a 9O°C.
En Ia Fig. 13 se muestra los paisajes de evolución dirigida de Ia librería construida, con un 43 % de los clones explorados con menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental. De esta realización se selecciona 1 gen muíante de α-VP denominado 2-1 B (relaciones mejora de actividad total/mejora de estabilidad con respecto al mejor muíante de Ia generación anterior -3H9- de 0,8/1 ,27) (Tabla 2 y Fig. 14).
En una realización particular, el méíodo de Ia invención comprendería Ia ideníificación y el mapeo de las muíaciones iníroducidas en las varianíes seleccionadas. La ideníificación de las muíaciones iníroducidas en las varianíes seleccionadas se llevo a cabo medianíe Ia secuenciación del ADN de los muíaníes del gen α-VP obíenidos iras seis ciclos de evolución dirigida (Tabla 2 y Figs. 3, 5, 7, 10, 12, 14 y 15). Para Ia iníerpreíación de las muíaciones obíenidas, y si no se indica de oíra manera, el número deíermina Ia posición del residuo muíado en Ia secuencia de aminoácidos original de Ia VP madura, el primer aminoácido (a Ia izquierda del número) es el original en Ia secuencia de Ia VP madura y el segundo es aquel por el que se muía. Para el caso de muíaciones en Ia secuencia señal del facíor α, el número va acompañado de Ia letra "α". G indica Glicina, V indica Valina, L indica Leucina, I indica Isoleucina, F indica Fenil Alanina, Y indica Tirosina, W indica Triptófano, S indica Serina, T indica Treonina, C indica Cisteína, M indica Metionina, N indica Asparragina, Q indica Glutamina, D indica Ácido Aspártico, E indica Ácido Glutámico, K indica Lisina, R indica Arginina, H indica Histidina y P indica Prolina.
La localización de las mutaciones identificadas en el plegamiento global de Ia proteína (Figs. 16 y 17) se realiza en base a Ia estructura cristalográfica de Ia VPL2 depositada en Ia base de datos estructurales de proteínas PDB (Berman et al., 2000. Nucleic Acids. Res. 28: 235-242) con Ia referencia 2BOQ (Pérez- Boada, 2005. Mol. Biol. 354: 385-402). En dicha estructura se pueden predecir los cambios ocasionados como consecuencia de Ia incorporación de las diferentes mutaciones puntuales (p. ej. contactos con aminoácidos adyacentes, incluyendo puentes de hidrógeno, interacciones electrostáticas, etc) responsables de las mejoras observadas en cada uno de los mutantes obtenidos en los diferentes ciclos de evolución.
Así pues, en Ia realización particular de Ia invención se han completado 6 ciclos evolutivos: los tres primeros orientados hacia Ia mejora de Ia actividad total de α-VP; los tres últimos hacia Ia termoestabilidad de α-VP. El cuarto ciclo evolutivo combinó Ia exploración de mutantes tanto para mejora de actividad total como para mejora de termoestabilidad (Fig.15).
El mejor muíante de Ia última generación de actividad total (cuarta generación), muíante R4, acumula 4 mutaciones iras 4 ciclos evolutivos y 6400 clones explorados (Tabla 2 y Figs. 10 y 15). El mejor muíante de termoesíabilidad de Ia úlíima generación (sexía generación), muíaníe 2-1 B, acumula 7 muíaciones iras 6 ciclos evoluíivos y 9000 clones explorados (Tabla 2 y Figs. 14 y 15).
Ninguna de esías muíaciones (ni en R4 ni en 2-1 B) se encueníra en Ia secuencia señal del facíor α. La secuencia señal del facíor α comprende 83 aminoácidos, de los cuales 19 consíiíuyen el pre-pépíido y 64 el pro-pépíido. El pre-péptido es el responsable de Ia inserción de Ia cadena polipéptidica en maduración en el retículo endoplasmático, tras Io cual es escindido por Ia acción de una endo-peptidasa entre los aminoácidos 19 y 20. El pro-péptido interviene en el plegamiento de Ia cadena polipéptidica durante su transición y estancia del retículo endoplasmático al aparato de Golgi. El pro-péptido es escindido en el Golgi antes de que Ia enzima madura sea secretada al exterior mediante Ia actuación de tres proteasas específicas (KEX1 , KEX2 y STE13). Aunque durante el protocolo evolutivo se llegan a introducir hasta 8 mutaciones (3 de ellas sinónimas) tanto en el pre- como en el propéptido, el que los mutantes finales de actividad total y estabilidad no conserven ninguna de estas mutaciones indica que no son indispensables para Ia secreción de Ia VP en S. cerevisiae y Ia secuencia señal del factor α nativa -sin modificaciones adicionales en su secuencia- funciona de manera adecuada para orientar y favorecer Ia secreción de los mutantes finales de VP. A partir de Ia cuarta generación, todos los mutantes seleccionados presentan un "armazón aminoacídico" común constituido por las mutaciones E37K, V160A, T184M y Q202L (Tabla 2 y Figs. 10 y 15). Tres de estas cuatro mutaciones (E37K, V160A, T184M) fueron introducidas de manera independiente en diferentes mutantes de Ia primera generación (11 H10, 15G9, 4B1 ) mientras que Ia mutación Q202L procede del mejor muíante de Ia segunda generación, 16E12. Los protocolos de recombinación de ADN escogidos han permitido entrecruzamientos idóneos por Io que tras cuatro ciclos estas mutaciones aparecen en los mejores genes seleccionados, produciendo un efecto sinérgico para aumentar Ia actividad total de los mutantes y conservándose en los ciclos ulteriores de evolución.
La evaluación de Ia mejora de los mutantes de α-VP se estima determinando su actividad total a partir de los sobrenadantes de los fermentados celulares a escala de microcultivo (formato 96 pocilios) y de manera más precisa por litro de fermentado. En una realización particular de Ia presente invención se evalúa Ia actividad total de los mejores mutantes de las generaciones orientadas a Ia mejora de actividad total (ciclos 1° al 4°; Tabla 3). El mejor muíante de actividad total, R4, muestra una actividad de 2400 U/L, Io que supone una mejora de aproximadamente 700 veces Ia actividad total del parental inicial α- VP en S. cerevisiae. Estos resultados significan de manera particular Ia primera VP expresada de forma funcional y soluble en S. cerevisiae y en términos generales constituyen los niveles de expresión más altos descritos para cualquier peroxidasa ligninolítica en S. cerevisiae hasta el momento, estimados en torno a 29 mg/L de cultivo (Tabla 4). Las mutaciones que constituyen el armazón aminoacídico (E37K, V160A, T184M y Q202L) en los mutantes de α- VP son las responsables de los niveles de expresión obtenidos.
Las mutaciones del armazón aminoacídico (E37K, V160A, T184M y Q202L) (Tabla 2 y Fig. 10) podrían ser aplicables en Ia expresión heteróloga de cualquier otro gen eucariótico relacionado filogenéticamente con Ia VP susceptible o deseable de ser expresado en especies del género Saccharomyces o en otras levaduras relacionadas (como P. pastoris) para su mejora mediante evolución dirigida, y más particularmente en Ia expresión heteróloga y mejora de genes de otras peroxidasas de alto potencial redox, como Ia MnP que es producida por Ia mayoría de los basidiomicetos ligninolíticos.
Figure imgf000044_0001
Tabla 3. Actividades por litro de fermentado para los mejores mutantes de cada generación. La Unidad de actividad catalítica (U) se define como Ia cantidad de enzima necesaria para oxidar 1 μmol de sustrato por minuto bajo las condiciones de reacción.
Figure imgf000045_0001
En una realización particular de Ia presente invención se evaluó Ia termoestabilidad de los diferentes mutantes obtenidos. Para ello, se determina Ia T50 definida como Ia temperatura a Ia que Ia enzima pierde Ia mitad de su actividad catalítica (actividad residual/actividad inicial) tras 10 min de incubación.
Como se puede apreciar en Ia Fig. 18, Ia T50 se desplaza aproximadamente 2°C por ciclo evolutivo de termoestabilidad con una mejora final de 5°C (de 60,5 hasta 65,3°C) con respecto al parental α-VP. Es notorio observar una mejora 29.5°C en Ia T50 si se compara el mejor mutante de termoestabilidad (2-1 B, T50=65.3°C) con Ia VP nativa expresada en E. coli (T50=37°C).
El grado de glicosilación de α-VP en S. cerevisiae se estimó inferior al 10 % (equivalente al encontrado para Ia VP salvaje de P. eryngii). Los bajos porcentajes de glicosilación de Ia VP en S. cerevisiae y las diferencias encontradas en las termoestabilidades con respecto a Ia VP expresada en E. coli sugieren un plegamiento idóneo de Ia enzima cuando se expresa funcionalmente en S. cerevisiae. S. cerevisiae es conocido por hiperglicosilar enzimas heterólogas Io que puede aumentar Ia estabilidad de Ia enzima. No es el caso de los mutantes de Ia α-VP, sus termoestabilidades se deben a un plegamiento apropiado y a Ia mejora genética debido a los ciclos evolutivos de termoestabilidad introducidos. Además, el bajo grado de glicosilación indica que el período de residencia de los mutantes de Ia α-VP en su tránsito del retículo endoplasmático al Golgi y su posterior exocitosis debe ser corto, Io que es indicativo de una secreción optimizada para este sistema de expresión heteróloga.
En una realización particular de Ia presente invención se purifica Ia variante R4 (Fig. 19). Se calculan las actividades (μmol producto μmol peroxidasa-1 s-1) del muíante R4 y de Ia VP expresada en E. coli. El muíante R4 es activo freníe a una amplia gama de susíraíos de difereníe naíuraleza (Tabla 5).
Figure imgf000046_0001
Tabla 5. Acíividades caíalííicas (μmol producío μmol peroxidasa-1 s-1) de Ia VP naíiva expresada en E. coli y el muíaníe R4 expresado en S. cerevisiae. *l_a VP naíiva expresada en E. coli procede de un replegado in vitro a partir de cuerpos de inclusión.
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos.
Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Construcción de pJRoC30-α-VP.
Fig. 2. Paisajes del ensayo de screening frente a ABTS de Ia primera generación. Las actividades de los clones de las bibliotecas de mutantes se representan en orden descendente. Las líneas discontinuas indican Ia actividad del tipo parental α-VP.
Fig. 3. Mutantes obtenidos en el primer ciclo de evolución dirigida.
Fig. 4. Paisaje del ensayo de screening frente a ABTS de Ia segunda generación. Las actividades de los clones de Ia biblioteca de mutantes se representan en orden descendente. La línea discontinua indica Ia actividad del tipo parental usado como estándar interno en el screening (muíante 11 H10). Fig. 5. Mutantes obtenidos en el segundo ciclo de evolución dirigida. Se indican con diferentes colores los eventos de entrecruzamiento y Ia introducción de nuevas mutaciones.
Fig. 6. Paisaje del ensayo de screening frente a ABTS de Ia tercera generación. Las actividades de los clones de Ia biblioteca de mutantes se representan en orden descendente. La línea discontinua indica Ia actividad del tipo parental usado como estándar interno en el screening (muíante 16E12).
Fig. 7. Mutantes obtenidos en el tercer ciclo de evolución dirigida. Se indican con diferentes colores los eventos de entrecruzamiento y Ia introducción de nuevas mutaciones.
Fig. 8. Protocolo de screening de termoestabilidad empleado de Ia 4a a Ia 6a generación.
Fig. 9. A) Paisaje de selección de termoestabilidad empleando ABTS como sustrato en Ia cuarta generación. La línea discontinua indica Ia actividad/termoestabilidad del parental 10C3. B) Paisaje del ensayo de screening frente a ABTS de Ia cuarta generación. Las actividades de los clones de Ia biblioteca de mutantes se representan en orden descendente. La línea discontinua indica Ia actividad del tipo parental usado como estándar interno en el screening (muíante 10C3).
Fig. 10. Mutaníes obíenidos en el cuarto ciclo de evolución dirigida. Se indican con difereníes colores los eveníos de enírecruzamienío y Ia iníroducción de nuevas muíaciones.
Fig. 11. A) Paisaje de selección de íermoesíabilidad empleando ABTS como susíraío en Ia quinía generación. La línea disconíinua indica Ia acíividad/íermoesíabilidad del pareníal 24E10. B) Paisaje del ensayo de screening freníe a ABTS de Ia quinía generación. Las acíividades de los clones de la biblioteca de mutantes se representan en orden descendente. La línea discontinua indica Ia actividad del tipo parental usado como estándar interno en el screening (muíante 24E10).
Fig. 12. Mutantes obtenidos en el quinto ciclo de evolución dirigida. Se indican con diferentes colores los eventos de entrecruzamiento y Ia introducción de nuevas mutaciones.
Fig. 13. A) Paisaje de selección de termoestabilidad empleando ABTS como sustrato en Ia sexta generación. La línea discontinua indica Ia actividad/termoestabilidad del parental 3H9. B) Paisaje del ensayo de screening frente a ABTS de Ia sexta generación. Las actividades de los clones de Ia biblioteca de mutantes se representan en orden descendente. La línea discontinua indica Ia actividad del tipo parental usado como estándar interno en el screening (muíante 3H9).
Fig. 14. Mutaníes obíenidos en el sexío ciclo de evolución dirigida. Se indican con difereníes colores los eveníos de enírecruzamienío y Ia iníroducción de nuevas muíaciones.
Fig. 15. Esquema general del proceso de evolución artificial. Las mejoras se calculan con respecto al correspondiente parental empleado como referencia durante el screening del ciclo evolutivo.
Fig. 16. Modelo molecular de Ia VP (referencia PDB 2BOQ) (A) y del muíante R4 (B). Los aminoácidos mutados preseníes en el muíaníe R4 y los correspondieníes en Ia VP naíiva se muesíran subrayados en ambos modelos. Los pueníes de hidrógeno eníre esíos residuos y los aminoácidos adyaceníes aparecen en línea disconíinua. También se muesíra una iníeracción poíencialmeníe desesíabilizadora eníre E37 y D30 en Ia enzima naíiva (sombreada en rojo) que desaparece con Ia susíiíución E37K en el muíaníe R4. Fig. 17. Modelo molecular de Ia VP (A) y del mejor muíante de termoestabilidad, 2-1 B (B). Se muestran los 7 aminoácidos mutados en el muíante 2-1 B, y los correspondientes preseníes en Ia VP naíiva. Los íres aminoácidos subrayados (R39, A213 y R330) son específicos del muíaníe 2- 1 B, mieníras que los resíaníes cuaíro aminoácidos muíados corresponden al "armazón aminoacídico" común a iodos los mutantes seleccionados a partir de Ia cuarta generación.
Fig. 18. Termoestabilidad de Ia VP. El estudio de termoestabilidad se realizó con ayuda de un termociclador de gradiente (Mycycler, Biorad EEUU). El ensayo de actividad se llevó a cabo en tampón tartrato sódico 100 mM (pH 3,5) con ABTS 2 mM siguiendo Ia formación de su radical catiónico (£413= 36000 M-
1cm-1) tras Ia adición de H2O2 0,1 mM. Los valores de actividad a diferentes temperaturas se normalizaron con Ia actividad inicial a temperatura ambiente antes de Ia incubación. Cada punto representa el valor medio de tres experimentos independientes.
Fig. 19. Caracterización bioquímica del muíante R4. A) Electroforesis (SDS- PAGE) de los disíiníos pasos de purificación de Ia varianíe R4. GeI de poliacrilamida al 12% íeñido con Azul de Coomasie. 1 ) Paírón de peso molecular; 2) VP naíiva expresada en E. coli y replegada in vitro; 3) Exíracío crudo de un fermeníado de S. cerevisiae que expresa R4; 4) Después de precipiíación con sulfaío amónico al 65%, resuspendido y dializado en íampón piperazina-CI- 20 mM (pH 5,5); 5) Después de cromaíografía de baja resolución en columna de iníercambio aniónico fuerte (HiTrap-Q FF de Amersham Bioscience); 6) Después de cromaíografía de alia resolución en columna de iníercambio aniónico fuerte (Mono-Q 5/5HR, Amersham Biosciences). B) Perfiles de acíividad a difereníes valores de pH de R4 expresada en S. cerevisiae y VP naíiva expresada en E. coli. Las acíividades se midieron con ABTS 2 mM en íampón Briííon y Robinson 100 mM (sin CaCl2 y con 1 mM de CaCl2) ajusíado a los difereníes pH de Ia medida, y 0,1 mM de H2O2. La acíividad VP se represenía normalizada con respecío a su valor ópíimo de actividad. Cada punto procede del valor medio de tres experimentos independientes.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, los cuales no pretenden ser limitativos del alcance de su protección.
EJEMPLO 1 : CONSTRUCCIÓN DE α-VP
La proteína de fusión (α-VP) empleada en Ia presente invención está constituida por Ia secuencia señal del factor α fusionada con el gen que codifica para Ia proteína VP madura. Para fusionar Ia secuencia señal del factor α, se tomó como molde el vector de StratageneTM pGAPZα, utilizado para expresión de proteínas en P. pastoris, que contiene el pre-pro péptido señal del factor α. En primer lugar, se linearizó pGAPZα con las enzimas de restricción EcoRI y Notl. El ADNc vpl2 de P. eryngii, 996 pb, (SEQ ID NO: 41 ), fue amplificado con los oligonucleótidos cebadores N eco R I -di recto (SEQ ID NO: 42) y CtNotl-reverse (SEQ ID NO: 43) que incluyen dianas de restricción para EcoRI y Not\ (GAATTC y GCGGCCGC respectivamente, subrayadas y en negrita), generando el molde de Ia VP madura que excluye Ia secuencia señal nativa. Las condiciones de Ia reacción de amplificación fueron las siguientes: 400 nM del oligonucleótido N eco R I -di recto, 400 nM oligonucleótido CNotl- reverse, 0,25 mM dNTPs, 0,05 U/μL Taq polimerasa (Invitrogen), 0,5 ng/μL de ADNc vpl2 en tampón Tris-HCl 20 mM (pH 8,4) y 4 mM de MgCI2 en un volumen final de 50 μL. El programa de PCR empleado fue: 94 °C durante 5 min, 55 °C durante 5 min, 72 °C durante 5 min (1 ciclo), 95 °C durante 0,35 min, 50 °C durante 2 min, 72 °C durante 4 min (25 ciclos) y 72 °C durante 10 min (1 ciclo). El producto amplificado VP fue digerido con EcoRI y Not\ y ligado al vector linearizado pGAPZα generando Ia construcción pGAPZα-VP. Dicho vector se transformó en células competentes de E. coli DH5α por choque térmico para sobre-producir y purificar el plásmido.
α-VP se amplificó a partir de pGAPZα-VP mediante PCR con ayuda de los oligonucleótidos NtpJRBamHI-directo (SEQ ID NO: 44) y CtNotl-reverse (SEQ ID NO: 43) los cuales incluyen dianas de restricción para BamHl y Notl (GGATCC y GCGGCCGC1 respectivamente, subrayadas y en negrita). La reacción de PCR se llevo a cabo en 50 μl conteniendo 400 nM del oligonucleótido NtpJRBamHI-directo, 400 nM oligonucleótido CtNotl-reverso, 0,25 mM dNTPs, 0,05 U/μL Taq polimerasa (Invitrogen), 0,4 ng/μL de pGAPZα- VP en tampón Tris-HCl 20 mM (pH 8,4) y 4 mM de MgCI2. El programa de PCR empleado fue: 94 °C durante 5 min, 55 °C durante 5 min, 72 °C durante 5 min (1 ciclo), 95 °C durante 0,35 min, 50 °C durante 2 min, 72 °C durante 4 min (25 ciclos) y 72 °C durante 10 min (1 ciclo).
α-VP fue subclonado en el vector lanzadera pJRoC30 (Novozymes, USA). pJRoC30 es un vector episómico bifuncional de 10477 pb que contiene el promotor GAL1 (inducible por galactosa), el gen de resistencia a ampicilina para Ia selección en E. coli y el gen URA3 que complementa Ia auxotrofía para uracilo en cepas ura3- de S. cerevisiae (las células de S. cerevisiae crecidas con este vector pueden cultivarse en medio selectivo, sin uracilo). Se llevo a cabo Ia digestión de pJRoC30 con las enzimas BamH\ y Not\, así como Ia digestión de α-VP con BamH\ y Not\. Se ligó α-VP digerido y el plásmido pJRoC30 linearizado dando lugar a Ia construcción pJRoC30-α-VP (Fig. 1 ). Debido a Ia estrategia de clonación utilizada, en el extremo amino terminal de Ia proteína aparecen dos aminoácidos extras (E-F) tras el procesamiento del péptido señal. Las mutaciones introducidas en Ia proteína madura durante el proceso evolutivo mantienen Ia numeración descrita para Ia VP madura de P. eryngii nativa.
EJEMPLO 2. EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE α-VP 1. ELABORACIÓN DE PROTOCOLOS PARA GENERAR DIVERSIDAD Y CREACIÓN DE LAS LIBRERÍAS DE MUTANTES
1.1 Ajuste de las condiciones de PCR mutagénica
La generación de diversidad mediante PCR-mutagénica se llevó a cabo en un termociclador de gradiente (Thermocycler Mycycler, Biorad, EEUU) bajo los siguientes parámetros de reacción: 95 °C durante 2 min (1 ciclo); 94 °C durante 45 s, 53 °C durante 45 s, 74 °C durante 3 min (28 ciclos); y 74 °C durante 10 min (1 ciclo). Los oligonucleótidos utilizados para Ia amplificación mutagénica fueron RMLN directo (SEQ ID NO: 45; con sitio de unión a pJRoC30-α-VP en Ia posición pb 5'-160-181-3') y RMLC reverso (SEQ ID NO: 46; con sitio de unión a pJRoC30-α-VP en Ia posición pb 5'-1532-1551-3'). Para promover Ia ligación in vivo, los productos de PCR se diseñaron conteniendo extensiones con una homología de 40 pb y 66 pb para los extremos digeridos con Bam\λ\ y Xho\ del vector linearizado, respectivamente.
En cada una de las generaciones, los correspondientes productos de PCR fueron cargados en un gel semipreparativo de agarosa de bajo punto de fusión y purificados con el kit Zymoclean gel DNA recovery (ZymoResearch, USA). Los productos de PCR fueron posteriormente clonados in vivo al transformar las células de S. cerevisiae, tras el promotor GAL1 del vector pJRoC30 previamente linearizado con Bam\λ\ y Xho\.
Para estimar el índice de mutación y evaluar los diferentes paisajes de evolución, se construyeron pequeñas genotecas de 174 clones (2 placas de 96 pocilios) empleando polimerasas con diferente espectro mutacional.
A) Genotecas Mutazima-ll: El índice de mutación se moduló variando Ia cantidad de ADN molde en Ia reacción de PCR. La concentración de cada uno de los reactivos, en un volumen final de 50 μL, fue Ia siguiente: 370 nM de oligonucleótido RMLN, 370 nM de oligonucleótido RMLC, 0,8 mM dNTPs, 3 % (v/v) DMSO, 0,05 U/μL de Mutazima ADN polimerasa (Genemorph Il Random Mutagenesis kit, Stratagene) y 52 ng/μL de pJRoC30-α-VP.
B) Genotecas Taa polimerasa/MnCI2:
En este caso, Ia tasa de mutación se controló variando Ia concentración de MnCI2 Adicionalmente también se analizó el efecto de concentraciones equilibradas/desequilibradas de dNTPs y de Ia concentración del ADN molde en Ia reacción de PCR mutagénica (Tabla 6).
1.2 Primera generación: PCR mutagénica con Taq polimerasa/MnCl2
Se diseñó y exploró una genoteca de 1408 clones, usando como parental α- VP. Éste fue amplificado mediante PCR propensa a error con dNTPs equillibrados y una concentración de MnCI2 de 0,01 mM, tal como se detalla en
Ia Tabla 6. La mezcla de transformación de Ia genoteca contenía una relación vector linearizado:producto de PCR 1 :4 (200 ng de vector y 800 ng de producto de PCR). El screening de punto final se desarrolló como se describe en el apartado 2 del presente ejemplo.
1.3 Segunda generación: barajado in vivo de ADN mutagenizado
Las mejores variantes de Ia primera generación (mutantes 11 H10, 15G9, 4B5 y 4B1 ) se tomaron como parentales y fueron sometidos a un nuevo ciclo de evolución mediante PCR mutagénica con Tag/MnCI2, para posteriormente recombinar estos productos mediante un barajado in vivo. Se exploraron 1740 clones. Cada uno de los parentales fue amplificado mediante PCR propensa a error con dNTPs equilibrados y una concentración de MnCI2 de 0,01 mM tal y como se detalla en Ia Tabla 6. Los productos mutagenizados por PCR se mezclaron en Ia misma proporción (800 ng totales, 200 ng de cada producto) y se transformaron conjuntamente con el vector linearizado (relación vectoπproducto PCR 1 :4). El screening de punto final se desarrolló como se describe en el apartado 2 del presente ejemplo.
1.4 Tercera generación: barajado in vivo de ADN mutagenizado
Las mejores variantes de Ia segunda generación (mutantes 16E12, 19C2, 20D1 y 13G1 ) se tomaron como parentales y fueron sometidos a un nuevo ciclo de evolución mediante PCR mutagénica con Tag/MnCI2, para posteriormente recombinar estos productos mediante un barajado in vivo. Se exploraron 1131 clones. Cada uno de los parentales fue amplificado mediante PCR propensa a error con dNTPs equilibrados y una concentración de MnCI2 de 0,01 mM, como se detalla en Ia Tabla 6. Los productos mutagenizados por PCR se mezclaron en Ia misma proporción (400 ng totales, 100 ng de cada producto) y se transformaron conjuntamente con el vector linearizado (relación vector: producto PCR 1 :4). El screening se desarrolló como se describe en el apartado 2 del presente ejemplo. En esta generación en particular, el screening pudo llevarse a cabo en modo cinético debido a Ia mejora de actividad tras tres ciclos evolutivos.
1.5 Cuarta generación: StEP mutagénico + barajado in vivo
Las mejores variantes de Ia tercera generación (mutantes 10C3, 6B1 , 13E4, 6E7 y 11 F3) se tomaron como parentales y fueron sometidos a un nuevo ciclo de evolución mediante StEP mutagénico. Las condiciones mutagénicas vienen determinadas por Ia baja concentración de DNA molde -0,1 ng/μL- en combinación con Ia utilización de una polimerasa de baja fidelidad (Taq polimerasa) y el protocolo de amplificación en el termociclador con ciclos cortos de anillamiento y extensión. La concentración de cada uno de los reactivos, en un volumen final de 50 μL, fue Ia siguiente: 90 nM de oligonucleótido RMLN, 90 nM de oligonucleótido RMLC, 0,3 mM dNTPs, 3 % (v/v) DMSO, 0,05 U/μL de Taq polimerasa -Sigma-, MgCI2 1 ,5 mM y 0,1 ng/μL de mezcla equimolar 10C3, 6B1 , 13E4, 6E7 y 11 F3. Los parámetros de Ia reacción de amplificación fueron los siguientes: 95 °C durante 5 min (1 ciclo); 94 °C durante 30 s y 55 °C durante 20 s (90 ciclos). Con los productos de PCR se realizó un barajado in vivo a través de Ia mezcla del producto de PCR (800 ng) y el plásmido linearizado (200 ng); (relación vectoπproducto PCR 1 :4). El screening se desarrolló como se describe en el apartado 2 del presente ejemplo incorporando el protocolo de exploración de termoestabilidad, evaluando Ia estabilidad a 6O°C.
1.6 Quinta generación: IvAM
Se construyó una genoteca de 1392 clones a partir del ensamblaje in vivo de dos experimentos de PCR propenso a error con diferente predisposición mutacional (IvAM), usando como DNA molde el mejor muíante de termoestabilidad de Ia generación anterior (variante 24E10). La genoteca de Mutazima se preparó según el apartado 1.1.A). La genoteca Taq/MnCI2 se preparó con dNTPs equilibrados y una concentración de MnCI2 de 0,01 mM tal y como se detalla en Ia Tabla 6. Ambas genotecas se mezclaron en Ia misma proporción y se recombinaron in vivo tras Ia transformación en S. cerevisiae y reparación in vivo del vector pJRoC30 linearizado con los fragmentos mutagenizados. Se empleó una relación vector linearizado:genoteca mixta a partir de 100 ng de vector de 1 :8. El screening se desarrolló como se describe en el apartado 2 del presente ejemplo incorporando el protocolo de exploración de termoestabilidad y aumentando Ia temperatura de incubación a 8O°C.
1.7 Sexta generación: barajado in vivo de ADN mutagenizado
Las mejores variantes de Ia quinta generación (mutantes 3H9 y 15B4) se tomaron como parentales y fueron sometidos a un nuevo ciclo de evolución mediante PCR mutagénica con Tag/MnCI2, para posteriormente recombinar estos productos mediante un barajado in vivo: Se exploraron 1219 clones. Cada uno de los parentales fue amplificado mediante PCR propensa a error con dNTPs equillibrados y una concentración de MnCI2 de 0,01 mM tal y como se detalla en Ia Tabla 6. Los productos mutagenizados por PCR se mezclaron en Ia misma proporción (800 ng totales, 200 ng de cada producto) y se transformaron conjuntamente con el vector linearizado (relación vector: producto PCR 1 :4). El screening se desarrolló como se describe en el apartado 2 del presente ejemplo incorporando el protocolo de exploración de termoestabilidad y aumentando Ia temperatura de incubación a 90 °C.
Figure imgf000057_0001
2. PROTOCOLO DE SCREENING DE ALTA CAPACIDAD
2.1 Transformación de células de S. cerevisiae
Los medios YPD y medio mínimo líquido, las placas SC y el medio de expresión se prepararon tal como se indica en Zumárraga et al. 2008 (Proteins 71 : 250-260) con Ia salvedad de que en el medio de expresión se incluyó hemoglobina bovina (Sigma) en concentraciones finales de 100 mg/L para favorecer Ia incorporación del grupo hemo a Ia VP. Las genotecas de cada ciclo evolutivo generadas mediante diferentes estrategias se transformaron en células de S. cerevisiae {Yeast transformation Kit, Sigma) para una expresión funcional de los correspondientes clones. Se incubaron colonias aisladas de células silvestres de S. cerevisiae en 20 mL de medio YPD líquido a 30 °C y 210 rpm en un agitador (Edmund Bühler GmbH SM-30, Alemania) durante toda Ia noche (DO600 > 2). Una cantidad adecuada del cultivo se inoculó en un volumen total de 120 mL de YPD atemperado para alcanzar una D06oo de 0,3. Se incubó de nuevo durante 4-6 h, hasta completar dos ciclos de crecimiento y alcanzar una DOβoo de 1 ,2. Las células se transformaron con las correspondientes genotecas en presencia del plásmido linearizado, con el kit de transformación de levadura. Inmediatamente antes del choque térmico (42 °C durante 15 min), se añadió DMSO a Ia mezcla de transformación con una concentración final de 10% (v/v) para aumentar Ia eficiencia de transformación (aproximadamente 20000 clones por reacción de transformación).
2.2 Preparación de las librerías para el screenlng de alta capacidad
Las células de S. cerevisiae transformadas con Ia correspondiente genoteca y el vector pJRoC30 linearizado se sembraron en placas SC e incubaron a 30 °C. Trascurridos 3-4 días se picaron colonias individuales y se inocularon en microplacas de 96 pocilios (Sero-well, Reino Unido) que contenían 50 μL de medio mínimo por pocilio. La columna completa número 6 de cada placa se inoculó con el tipo parental seleccionado del ciclo previo (columna de referencia) y uno de los pocilios (H1 ) se inoculó con células de S. cerevisiae sin transformar (control negativo). Las placas se sellaron con parafilm y se incubaron a 30 °C, 210 rpm y 80% de humedad relativa en un incubador con sistema de humidificación Minitron-INFORS (Biogen, España). Tras 48 h, se añadieron 160 μl_ de medio de expresión a cada pocilio y se volvieron a incubar a 30 °C y 210 rpm. Después de 24 h, se midió Ia DO600 para determinar Ia densidad celular de cada pocilio con un lector de microplacas SPECTRAmax Plus 384 (Molecular Devices, EEUU). Se centrifugaron las placas (placas maestras) durante 10 min a 3200 g y 4 °C en una centrífuga Eppendorf 5810R (Alemania). 20 μl_ del sobrenadante de cada pocilio fue transferido desde Ia placa maestra a una placa replica 1 mediante un robot manipulador de líquidos Quadra 96-320 (Tomtec, EEUU). En Ia placa réplica 1 se realizó el screening de actividad frente a ABTS. A partir de Ia tercera generación, y debido a Ia elevada actividad/nivel de secreción de Ia VP, a Ia placa réplica se Ia adicionaron 180 μl_ de tampón tartrato sódico 10 mM (pH 5,1 ). De esta placa réplica se hizo una extracción de 20 μl_ a una placa réplica 2 sobre Ia que se aplicó el método colorimétrico. La finalidad de esta dilución es que permitiera cuantificar en modo de punto final. De Ia 4a a Ia 6a generación se incluyó un protocolo de termoestabilidad (Fig. 8) consistente en los pasos descritos a continuación. De Ia placa maestra se extrajeron 20 μL de sobrenadante sobre los que se adicionaron 180 μL de tampón tartrato sódico 10 mM (pH 5,1 ) (placa A). La placa A se duplicó mediante sendas extracciones de 50 y 20 μL para las placas B y C respectivamente. La placa B -placa especial de termociclador (Multiply PCR Píate without skirt, neutral, Sarstedt)- se selló con film termorresistente (Film adhesivo PCR, Deltalab) y se incubó a Ia temperatura correspondiente en termociclador (MyCycler, Biorad, EEUU) durante 10 min (de manera que Ia actividad se redujera aprox. 2/3 de Ia actividad inicial). Tras Ia incubación, Ia placa B se incubó en hielo durante 10 min y se atemperó 5 min más a temperatura ambiente. Se transfirieron 20 μL de Ia placa B a Ia placa D (placa de ensayo de actividad residual). Las placas C y D se emplearon para el ensayo de screening colorimétrico como se describe en el apartado 2.3. 2.3 Ensayos colorimétricos
El screening de actividad frente a ABTS se realizó añadiendo a Ia correspondiente placa réplica 180 μl_ de tampón tartrato sódico 100 mM (pH 3,5) conteniendo ABTS 2 mM y H2O2 0,1 mM. Se agitaron las placas brevemente y se midió Ia absorbancia en el lector de placas a 418 nm. Las placas se incubaron a temperatura ambiente hasta que se desarrolló el color verde del radical catiónico ABTS#+ y se midió nuevamente Ia absorbancia (ε4i8
= 36000 M-1cm-1). Para las generaciones de estabilidad térmica, Ia medida de termoestabilidad vino dada por el cociente Actividad residual/Actividad inicial, relativos al correspondiente parental.
2.4 Re-screenings
Aquellos mutantes seleccionados que mostraron mayor actividad frente a ABTS fueron sometidos a dos re-screenings consecutivos:
Primer re-screening: alícuotas de 5 μl_ de los clones seleccionados se inocularon en placas multipocillo con 50 μl_ de medio mínimo. Las columnas y filas de los extremos de Ia placa (columnas 1 y 12, filas A y H) no se utilizaron. Tras 24 h de incubación a 30 °C y 210 rpm, se transfirieron 5 μL a los pocilios adyacentes, incubándose durante 24 h más. Finalmente se adicionaron 160 μL de medio de expresión y se incubaron durante 24 h. De esta manera cada clon fue crecido en 4 pocilios y el parental (estándar interno) se trató del mismo modo (fila D, pocilios 7-11 ). Las placas se sometieron al mismo protocolo de screening, con Ia salvedad de que cada valor de actividad procedió de Ia media de 4 microcultivos por clon.
Segundo re-screening: alícuotas de 100 μL de los clones más activos del primer re-screening se crecieron en 3 mL de medio YPD a 30 °C y 210 rpm durante 24 h. Se extrajeron los plásmidos de estos cultivos (Zymoprep yeast plasmid miniprep kit, Zymo Research). Como el producto de las zymoprep no era puro y Ia concentración del ADN extraído fue muy baja, se transformaron los plásmidos en células de E. coli supercompetentes XL2-blue según el protocolo correspondiente (Stratagene) y se seleccionaron en placas LB/amp. Colonias aisladas se inocularon en 5 ml_ de medio LB/amp y se crecieron durante toda Ia noche a 37 °C. Se extrajeron los plásmidos (NucleoSpin® Plasmid kit, Macherey-Nagel). Las células de S. cerevisiae se transformaron con los plásmidos de los mejores mutantes así como con el correspondiente tipo parental y el screening se llevó a cabo de Ia misma manera, con Ia salvedad de que cada valor de actividad procedió de Ia media de 5 microcultivos por clon.
Ejemplo 3: producción, purificación y caracterización bioquímica de los mutantes
3.1 Producción de VP en S. cerevisiae
Los clones de S. cerevisiae que contenían los genes de α-VP tanto del tipo nativo como de mutantes fueron cultivados en 3 mL de medio mínimo durante 48 h, a 30 °C y 250 rpm (Micromagmix shaker, Ovan). Una alícuota de este precultivo se inoculó para alcanzar una densidad óptica (DOβoo) de 0,25 en un volumen total de 50 mL de medio mínimo en un matraz de 500 mL con tapón poroso. Cuando se completaron dos ciclos de crecimiento (DOβoo = 1 ; 6-8 h de incubación), se añadieron 450 mL de medio de expresión conteniendo 100 mg/L de hemoglobina bovina y se incubó a 30 °C y 220 rpm en un matraz de 2 L de base ancha (20 cm 0 en Ia base). El cultivo se paró tras 48 horascuando tanto el crecimiento celular como Ia actividad VP se estacionaron (DO600 28-32; actividad VP 0,2-3000 U/L, dependiendo de Ia variante).
3.2 Purificación de los mutantes Las VP nativa y mutantes fueron purificadas con un equipo de cromatografía de proteínas FPLC (LC-500 Cl, Amersham Bioscience) siguiendo el procedimiento siguiente:
1.- Las células del cultivo (apartado 3.1 ) se separaron por centrifugación a 4°C durante 15 min a 8000 g (centrífuga Beckman Coulter, Avanti J-E centrifuge). El sobrenadante se filtró dos veces con membranas de fibra de vidrio y nitrocelulosa con un poro de 0,45 μm.
2.- El extracto crudo se sometió a una precipitación fraccionada con sulfato amónico al 65 % de saturación (p/v) a 0°C. Tras equilibrar Ia muestra durante 15-30 min, se centrifugó 20 min a 18514 g a 3°C (centrífuga Eppendorf 5810R, Alemania).
3.- Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el precipitado en 4 mL de tampón piperazina-CI- 20 mM (pH 5,5) conteniendo CaCl2 1 mM (Tampón A).
4.- La muestra se dializó frente a 1-3 L de tampón A durante toda Ia noche en tubos de diálisis (PlusOne Mini Diálisis, Amersham Pharmacia) con un corte molecular de 8 KDa.
5.- Se filtró el dializado con filtro de 0,45-0,22 μm de diámetro de poro y se cargó en una columna de intercambio aniónico HiTrapQFF (Amersham Bioscience) de 5 mL preequilibrada en tampón A. La proteína se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 1 M NaCl (flujo 1 mL/min).
6.- Se seleccionaron las fracciones con mayor relación grupo hemo:actividad peroxidasa sobre ABTS (410 nm:418 nm), se juntaron y dializaron en tampón A como se indica en el paso 4. 7.- La muestra dializada se filtró y se cargo en una columna de intercambio aniónico MonoQ 5/5 HR (Amersham Bioscience) preequilibrada en buffer A. La proteína se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 1 M NaCl, (flujo 0,4 mL/min).
8.- Se seleccionaron las fracciones con mayor relación grupo hemo:actividad peroxidasa sobre ABTS (410 nm:418 nm), se juntaron y dializaron en tampón A como se indica en el paso 4.
3.3 Caracterización bioquímica de los mutantes
A) Desglicosilación
Las proteínas purificadas se desglicosilaron con Ia péptido-N-glicosidasa F (PNGasa F) (Sigma), que hidroliza los oligosacáridos unidos a los residuos de asparragina. Concretamente, 8 μg de VP pura se desnaturalizaron con SDS 0,2% (p/v) y β-mercaptoetanol 100 mM a 100 °C durante 10 min. Posteriormente se añadieron 2.5 unidades de PNGasa F y Ia mezcla de reacción se incubó toda Ia noche a 37 °C. La reacción se paró a 100 °C durante 10 min. Los productos se analizaron en un gel de electroforesis (SDS- PAGE) teñido con azul de Coomasie.
B) Medida de Ia estabilidad térmica (T50)
El estudio de termoestabilidad se realizó con ayuda del termociclador Mycycler equipado con un formador de gradientes (Bio-Rad, EEUU), el cual permite crear gradientes de temperatura a diferentes intervalos. Se prepararon diluciones de las proteínas en tampón tartrato 10 mM (pH 5,1 ) de tal manera que alícuotas de 20 μL dieran una respuesta adecuada para medir Ia actividad en el lector de microplacas en modo cinético. Se incubaron 50 μL de VP por cada punto del gradiente. El gradiente de temperatura estudiado comprendió el intervalo 30-80 °C con temperaturas intermedias de 30,0 °C, 31 ,7 °C, 34,8 °C,
39,3 °C, 45,3 °C, 49,9 °C, 53,0 °C, 55,0 °C, 56,8 °C, 59,9 °C, 64,3 °C, 70,3 °C, 75,0 °C, 78,1 °C y 80,0 °C. Tras 10 min de incubación las muestras se enfriaron en hielo durante 10 min. A continuación se extrajeron alícuotas de 20 μl_ de VP y se incubaron a temperatura ambiente 5 min mas. Las muestras se mezclaron con 180 μl_ de ABTS 2 mM y H2O2 0,1 mM en tampón tartrato 100 mM. La actividad se valoró en continuo (oxidación del ABTS a 418 nm). La medida de termoestabilidad vino determinada por el cociente entre actividad residual de las muestras incubadas a diferentes temperaturas en el termociclador con respecto a Ia actividad de Ia VP a temperatura ambiente.
C) Ensayos de actividad a diferentes valores de pH
Los perfiles de pH de Ia actividad de las diferentes VP purificadas se realizaron en tampón ByR 100 mM a diferentes valores de pH (2,0-9,0, ajustado con NaOH). Se prepararon diluciones de las enzimas en tampón tartrato sódico 10 mM (pH 5,0) conteniendo 1 mM CaC^ para que alícuotas de 10 μL dieran una respuesta adecuada en Ia medida de actividad en el lector de microplacas en modo cinético. Las VP (10 μL) se añadieron por filas y el tampón a diferentes valores de pH (180 μL) por columnas. Finalmente, se añadieron 10 μL solución ABTS/H2O2 (concentración en el ensayo 2 mM y 0,1 mM respectivamente) y se midieron las actividades de cada una de las condiciones por triplicado.
D) Determinación las actividades específicas
Las actividades específicas de Ia enzima nativa y de R4 se determinaron en un lector de microplacas SPECTRAmax Plus 384 (Molecular Devices, EEUU) con ancho de banda de 1 nm. Cada dato experimental se obtuvo a partir de Ia media de tres experimentos independientes. Se prepararon diluciones de las enzimas en tampón tartrato sódico 10 mM (pH 5,0) conteniendo 1 mM CaCl2 para que alícuotas de 10 μL dieran una respuesta adecuada en Ia medida de actividad en el lector de microplacas en modo cinético (en un volumen final de ensayo de 200 μL). Se determinaron las actividades específicas de Ia enzima nativa y de R4 frente a los siguientes sustratos: 1 ) ABTS (Sigma) 2 mM en tampón tartrato sódico 100 mM (pH 3,5) (180 μl_) y 0,1 mM H2O2 (10 μL) (concentraciones en el ensayo) a 418 nm (£413= 36000 M- 1cm-1)
2) Reactive Black 5 (Sigma) 15μM en tampón tartrato sódico 100 mM (pH 3,5) (180 μL) y 0,1 mM H2O2 (10 μL) (concentraciones en el ensayo) a 598 nm (E598= 50000 M-W1)
3) 2,6-Dimetoxifenol (DMP) (Fluka) 0,1 mM en tampón tartrato sódico 100 mM (pH 3,5) (180 μL) y 0,1 mM H2O2 (10 μL) (concentraciones en el ensayo) a 469 nm (£469= 27500 M-1Cm-1)
4) Alcohol veratrílico (Sigma-Aldrich) 40 mM en tartrato sódico 100 mM (pH 3,0) (180 μL) y 0,1 mM H2O2 (10 μL) (concentraciones en el ensayo) a 310 nm (£310= 9300 M-1cm-1 )
5) MnSO4 (Sigma) 2 mM en tartrato sódico 100 mM (pH 5.0) (180 μL) y 0,1 mM H2O2 (10 μL) (concentraciones en el ensayo) a 238 nm
Figure imgf000065_0001
6500 M-1cm-1)

Claims

REIVINDICACIONES
1. Polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con actividad peroxidasa caracterizado porque su secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 50% con Ia SEQ ID NO: 35, y porque presenta al menos una de las mutaciones que se selecciona de Ia lista que comprende: a. Ia sustitución del aminoácido ácido glutámico (E) por el aminoácido lisina (K), en Ia posición homologa a Ia posición 128 de Ia SEQ ID NO: 35, b. Ia sustitución del aminoácido histidina (H) por el aminoácido arginina (R), en Ia posición homologa a Ia posición 130 de Ia SEQ ID NO: 35, c. Ia sustitución del aminoácido valina (V) por el aminoácido alanina
(A), en Ia posición homologa a Ia posición 251 de Ia SEQ ID NO: 35, d. Ia sustitución del aminoácido treonina (T) por el aminoácido metionina (M), en Ia posición homologa a Ia posición 275 de Ia SEQ ID NO: 35, e. Ia sustitución del aminoácido glutamina (Q) por el aminoácido leucina (L), en Ia posición homologa a Ia posición 293 de Ia SEQ ID NO: 35, f. Ia sustitución del aminoácido ácido aspártico (D) por el aminoácido alanina (A), en Ia posición homologa a Ia posición 304 de Ia SEQ ID NO: 35, g. Ia sustitución del aminoácido treonina (T) por el aminoácido isoleucina (I), en Ia posición homologa a Ia posición 375 de Ia SEQ ID NO: 35, h. Ia sustitución del aminoácido alanina (A) por el aminoácido treonina (T), en Ia posición homologa a Ia posición 399 de Ia SEQ ID NO: 35, i. la sustitución del aminoácido ácido glutámico (G) por el aminoácido arginina (R), en Ia posición homologa a Ia posición 421 de Ia SEQ ID NO: 35,
2. Polinucleótido aislado según Ia reivindicación 1 , que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, Ia SEQ ID NO: 21 , Ia
SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27, Ia SEQ ID NO: 29, Ia SEQ ID NO: 31 y Ia SEQ ID NO: 33.
3. Polinucleótido aislado según Ia reivindicación 1 que se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 2, Ia SEQ ID NO: 4, Ia SEQ ID NO:
6, Ia SEQ ID NO: 8, Ia SEQ ID NO: 10, Ia SEQ ID NO: 12, Ia SEQ ID NO: 14, Ia SEQ ID NO: 18, Ia SEQ ID NO: 20, Ia SEQ ID NO: 22, Ia SEQ ID NO: 24, Ia SEQ ID NO: 26, Ia SEQ ID NO: 28, Ia SEQ ID NO: 30, Ia SEQ ID NO: 32, Ia SEQ ID NO: 34 y Ia SEQ ID NO: 36.
4. Construcción genética de ADN o ARN, que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias: a. un polinucleótido según Ia reivindicación 1 , b. un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende
Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27, Ia SEQ ID NO: 29, Ia SEQ ID NO: 31 , Ia SEQ ID NO: 33 y Ia SEQ
ID NO: 35, c. una molécula de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida en condiciones astringentes con Ia secuencia polinucleotídica de (a) ó (b), ó d. una secuencia de nucleótidos de (a), (b), ó (c) correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés.
5. Construcción genética de ADN o ARN según Ia reivindicación anterior, donde el polinucleótido aislado de (a) se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 2, Ia SEQ ID NO: 4, Ia SEQ ID NO: 6, Ia SEQ ID NO: 8, Ia SEQ ID NO: 10, Ia SEQ ID NO: 12, Ia SEQ ID NO: 14, Ia SEQ ID NO: 18, Ia SEQ ID NO: 20, Ia SEQ ID NO: 22, Ia SEQ ID NO: 24, Ia SEQ ID NO: 26, Ia SEQ ID NO: 28, Ia SEQ ID NO: 30, Ia SEQ ID NO: 32, Ia SEQ ID NO: 34 y Ia SEQ ID NO: 38.
6. Construcción genética de ADN o ARN según Ia reivindicación 4, donde el polinucleótido aislado de (a) codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica consiste en Ia SEQ ID NO: 35.
7. Construcción genética de ADN o ARN según Ia reivindicación 5, donde Ia secuencia nucleotídica del polinucleótido de (a) consiste en Ia SEQ ID NO: 38.
8. Célula que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 4-7.
9. Célula según Ia reivindicación anterior que puede clasificarse taxonómicamente como perteneciente al género Saccharomyces.
10. Uso de los polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, de Ia construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, o de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, para producir peroxidasas versátiles.
11. Método para generar peroxidasas versátiles (VP) extracelulares, funcionales y solubles con actividad mejorada hacia uno o más sustratos y/o termoestabilidad mejorada, que comprende: a. diseñar una construcción genética que comprenda el polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 39 o cualquiera de sus variantes, b. generar diversidad sobre Ia construcción genética de (a) y crear las librerías de mutantes, y c. seleccionar los mejores mutantes de expresión, actividad y/o termoestabilidad.
12. Método según Ia reivindicación 11 , donde el polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 39, o cualquiera de sus variantes, del paso (a) se encuentra operativamente enlazado a otra secuencia nucleotídica que dirija Ia secreción y/o facilite el correcto procesamiento de Ia enzima peroxidada versátil.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, donde el polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 39 o cualquiera de sus variantes, del paso (a) se encuentra operativamente enlazado al polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 37 o cualquiera de sus variantes.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, que además comprende Ia identificación y el mapeo de las mutaciones introducidas en las variantes seleccionadas.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11-14, donde Ia construcción genética del paso (a) comprende el polinucleótido aislado cuya secuencia nucleotídica consiste en Ia SEQ ID NO: 40, operativamente enlazado con el polinucleótido aislado cuya secuencia nucleotídica consiste en Ia SEQ ID NO: 41.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11-15, que además comprende repetir los pasos (a)-(c), empleando en Ia construcción genética según (a) los polinucleótidos que codifican para los mejores mutantes de expresión, actividad y/o termoestabilidad obtenidos en el paso (c), de manera consecutiva.
PCT/ES2010/070316 2009-05-12 2010-05-11 Peroxidasas de elevado potencial redox diseñadas por evolución dirigida Ceased WO2010130862A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200930157 2009-05-12
ESP200930157 2009-05-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010130862A1 true WO2010130862A1 (es) 2010-11-18

Family

ID=43084654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2010/070316 Ceased WO2010130862A1 (es) 2009-05-12 2010-05-11 Peroxidasas de elevado potencial redox diseñadas por evolución dirigida

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2010130862A1 (es)

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUTLER T. ET AL.: "Functional expression of a fungal lacasse in Sacharomyces cerevisiae by directed evolution", APPLIED AND ENVIROMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 69, no. 2, 2003, pages 987 - 995 *
GARCIA-RUIZ ET AL. ET AL.: "Evolving thermostability in mutant libraries of ligninolytic oxidoreductases expressed in yeast", MICROBIAL CELL FACTORIES, vol. 9, no. ABS.17, 2010, pages 1 - 13 *
PEREZ BOADA M. ET AL.: "Expression of Pleurotus eryngii versatile peroxidase in Escherichia coli and optimisation of in vitro folding", ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, vol. 30, no. 4, 2002, pages 518 - 524 *
PEREZ BOADA M. ET AL.: "Versatile peroxidase oxidation of high redox potential aromatic compounds: site-directed mutagenesis, spectroscopic and crystallographic investigation of three long-range electron transfer pathways.", J. MOL. BIOL., vol. 354, 2005, pages 385 - 402 *
RUIZ-DUENAS F.J. ET AL.: "Manganese oxidation site in Pleurotus eryngii versatile peroxidase: A site-directed mutagenesis, kinetic, and crystallographic study", BIOCHEMISTRY, vol. 46, no. 1, 2007, pages 66 - 77 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Camarero et al. Engineering platforms for directed evolution of laccase from Pycnoporus cinnabarinus
Garcia-Ruiz et al. Directed evolution of a temperature-, peroxide-and alkaline pH-tolerant versatile peroxidase
Viña‐Gonzalez et al. Functional expression of aryl‐alcohol oxidase in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris by directed evolution
EP3375869B1 (en) Mutants of unspecific peroxygenase with high monooxygenase activity and uses thereof
RU2483107C2 (ru) Полипептид, имеющий nadh-зависимую hmf-редуктазную активность
Ilić Đurđić et al. Improved degradation of azo dyes by lignin peroxidase following mutagenesis at two sites near the catalytic pocket and the application of peroxidase-coated yeast cell walls
CN106459160A (zh) Asx特异性蛋白质连接酶
WO2008150376A1 (en) Use of an aspartic protease (nsp24) signal sequence for heterologous protein expression
US12415991B2 (en) Recombinant heme thiolate oxygenases
Gonzalez-Perez et al. Alkaline versatile peroxidase by directed evolution
US8609386B2 (en) Polypeptides having tyrosinase activity and polynucleotides encoding same
Viña-Gonzalez et al. Directed evolution method in Saccharomyces cerevisiae: mutant library creation and screening
WO2010058057A1 (es) Lacasas de alto potencial redox obtenidas por evolución dirigida
ES2370216B1 (es) Lacasa de alto potencial redox.
CN103282490B (zh) 在酵母中产生肠激酶的组合物和方法
JP6032652B2 (ja) 冷凍ストレス耐性を有する酵母
CN114317469A (zh) 一种黄素单加氧酶突变体及其制备和应用
KR100665316B1 (ko) 메타게놈 유래의 신규한 이중 활성 수산화효소, 이를코드하는 유전자 및 그 스크리닝 방법
Viña-González Biotechnological platforms for aryl-alcohol oxidases by directed evolution
US20080044878A1 (en) Novel Promoters
JP7113682B2 (ja) 酵母の亜硫酸生成能向上方法
Festa DEVELOPMENT OF OXIDATIVE BIOSYSTEMS FOR THE TREATMENT OF INDUSTRIAL EFFLUENTS
Mateljak Directed and computational evolution of fungal laccases: redox potential enhancement and development of a family of thermostable chimeras
Mierke Characterisation of two novel oleaginous yeast strains for efficient and sustainable production of acetyl-CoA derived products
Ryan Site directed mutagenesis studies of horseradish peroxidase

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10774587

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10774587

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1