WO2010130525A1 - Biosensor for detecting toxins by means of a nucleic acid-coupled enzyme - Google Patents

Biosensor for detecting toxins by means of a nucleic acid-coupled enzyme Download PDF

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WO2010130525A1
WO2010130525A1 PCT/EP2010/055021 EP2010055021W WO2010130525A1 WO 2010130525 A1 WO2010130525 A1 WO 2010130525A1 EP 2010055021 W EP2010055021 W EP 2010055021W WO 2010130525 A1 WO2010130525 A1 WO 2010130525A1
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WO
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enzyme
nucleic acid
biosensor
sample
strand
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Application number
PCT/EP2010/055021
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Heike Barlag
Joachim Kaiser
Mathias Sprinzl
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Siemens Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/10—Oligonucleotides as tagging agents for labelling antibodies

Definitions

  • the invention relates to a biosensor for detecting toxins in a sample, to a method for detecting toxins in a sample and to the use of a biosensor according to the invention.
  • the test methods use living organisms such as fish, clams and microorganisms.
  • the test methods are based on the observation that the behavior of the whole organism changes with the addition of pollutants to the water (Brack et al., 1999).
  • Bacteria and algae also react to pollutants that inhibit their bioluminescence or photosynthetic activity.
  • Biological tests with living organisms are very laborious and difficult to standardize due to physiological fluctuations in the organism. In addition, the results of such tests are not clearly applicable to humans.
  • living organisms can be used to detect low levels of pollutants, e.g. are often not used in the control of drinking water limit, because they do not respond sufficiently sensitive.
  • Chemical-analytical methods such as chromatographic techniques for the detection of toxic substances, are an alternative to tests with living organisms (Engst & Noske, 2006). However, they have proven to be very time-consuming and costly due to the large number of detectable substances. In addition, only known substances can be detected by these methods. In addition, the proof of Substances whose character and characteristics are only suspected, problematic.
  • Enzyme inhibitors are a class or group of toxic substances for humans. Their action on isolated enzymes makes them very well detectable in low concentrations.
  • the enzyme cyanidase is used, which moves cyanide into formic acid and ammonia. The degradation leads to a change in the pH, which can then be measured as an electrical potential difference (Keusken et al., 2001).
  • An enzyme-based detection system also referred to as an enzyme inhibition assay, is independent of the substance, i. regardless of the chemical nature of the toxin. Thus, even unknown and unexpected toxins can be detected in a single detection method quickly, easily and with high sensitivity if they have an inhibitory effect on the enzyme used. Through the development of continuous flow systems, the detection of toxic substances by means of enzyme inhibition can be automated and extremely efficient (Sole et al., 2003).
  • a decrease in enzyme activity indicates the presence of inhibitors.
  • acetylcholinesterase inhibitors so that the influence of the sample on acetylcholinesterase or other esterases is frequently measured.
  • the esterase or acetylcholinesterase cleaves a special substrate, and the cleavage product can then be electrochemically measured because an electron is released by the oxidation.
  • This system is exploited in the detection of toxins using biosensors.
  • acetylcholinesterase is that it is not storage stable. In particular, the lack of thermal stability makes their use in the field problematic.
  • acetylcholinesterase for example acetylthiocholine or para-ammonia phenylacetate. It is, however the use of other enzymes or mutants of enzymes to increase specificity to certain substances described in the literature (Zhang et al., 2005; Prieto-Simén et al., 2006).
  • the active enzyme for example acetylcholinesterase
  • the enzyme can no longer cleave the existing substrate because the toxin reversibly or irreversibly damages or blocks the active center of the enzyme.
  • a drop in the electrochemical voltage can be measured in the sensor.
  • the enzymes used are firmly bound to the biosensor surface or membranes lying above, so that after an irreversibly inhibiting sample of the biosensor must be changed.
  • the object of the present invention is therefore to provide a low-maintenance biosensor, which can automatically perform several measurements in succession.
  • the object of the invention is further to provide a method for detecting toxins in a sample, which can be carried out automatically for several consecutive measurements.
  • a biosensor for detecting toxins in a sample having at least one enzyme which is brought into contact with a sample to be examined for the presence of at least one acting as an enzyme inhibitor toxin, wherein the at least one enzyme is a bond to a first nucleic acid strand, whereby an enzyme-nucleic acid complex is formed, at least a first measuring spot for measuring the activity of the enzyme, wherein the enzyme is inhibited by an interaction with the at least one enzyme inhibitor and at the first measuring spot on the biosensor arranged to the first nucleic acid Strand complementary nucleic acid strands for reversible coupling of the enzyme-nucleic acid complex.
  • the object is further achieved by a method for detecting toxins in a sample in which at least one enzyme is brought into contact with a sample to be examined for the presence of at least one acting as an enzyme inhibitor toxin, wherein the at least one enzyme with a first nucleic acid -Strang forms an enzyme-nucleic acid complex, at least a first measurement spot, the activity of the enzyme is measured, wherein the enzyme is inhibited by an interaction with the at least one enzyme inhibitor and the enzyme-nucleic acid complex arranged reversibly at the first measurement spot on the biosensor is coupled to the first nucleic acid strand complementary nucleic acid strands.
  • the object is further achieved by the use of a biosensor according to the invention for testing a sample for poisons.
  • the invention is based on the finding that the costs for maintenance of a biosensor in the field must be as low as possible. Since the inhibition of the enzyme of a biosensor is usually irreversibly damaged, after detecting contamination of the sample to be tested with the biosensor, the enzyme used must be replaced by new enzyme. For this, the entire biosensor usually has to be replaced if the enzyme is bound irreversibly to the sensor or a membrane on the measuring spot of the sensor.
  • the enzyme is fixed to the biosensor so that used enzyme can be removed automatically and replaced by new enzyme, the replacement of the enzyme can be automated and the maintenance costs are significantly reduced.
  • An exchange of the enzyme is possible in the biosensor according to the invention in that the enzyme is converted via a reversible nucleic acid. acid-nucleic acid coupling is bound to the sensor.
  • the enzyme is bound to a first nucleic acid strand in the biosensor according to the invention.
  • this binding takes place via a targeted coupling of amino-modified nucleic acid to a thiol group of the enzyme.
  • the enzyme-nucleic acid complex is then reversibly bound to the biosensor via a second nucleic acid strand.
  • nucleic acid strand of complementary nucleic acid strand bound to the enzyme is immobilized on the biosensor.
  • the two nucleic acid strands attached to the biosensor and that of the enzyme-nucleic acid complex then undergo nucleic acid-nucleic acid binding.
  • the nucleic acid can be designed as DNA, LNA, PNA or as another possible derivative.
  • the nucleic acid-nucleic acid binding is reversible.
  • suitable parameters such as temperature and ionic strength
  • the nucleic acid-nucleic acid binding can be opened.
  • the spent enzyme with the nucleic acid strand can be detached from the biosensor, wherein the complementary nucleic acid strands coupled to the biosensor remain on the biosensor.
  • new enzyme can bind to the nucleic acid strands on the biosensor and the entire sensor can be used again.
  • the corresponding sensor and method thus allow replacement of the spent enzyme and thereby allow use of the sensor in the field without replacement of the actual biosensor. Only a replacement of the spent enzyme and a refilling of the measurement enzyme are necessary. This can be done via appropriate controls from different reservoirs for the corresponding substances that are connected to the biosensor. Thus, new enzyme can be re-coupled without the biosensor itself has to be changed. This results in a biosensor with regenerable enzyme coating. Here, the regeneration is done only by the adjustment of temperature and the change of solutions via the biosensor be rinsed or pumped. Such a method is particularly easy to automate.
  • a further advantageous embodiment of the invention is characterized in that the first nucleic acid strand is amino-modified and that the at least one enzyme has a thiol group for binding to an amino group of the first nucleic acid strand.
  • This makes it possible to form the nucleic acid-enzyme complex by standard methods. For example, the bond may be over
  • thermostable esterase in particular as esterase 2 of the thermophilic eubacterium Alicyclobacillus acidocalderius, the thermostable esterase 2 having on its surface at least one cysteine
  • Binding to the first nucleic acid strand has.
  • the advantage of using a thermostable esterase is that also here the maintenance costs decrease.
  • the entire toxin detection monitoring system will become more robust if a long-term stable and thermostable enzyme can be used.
  • the use of the biosensor in the field is less prone to temperature.
  • the enzyme of Alicyclobacillus acidocaldarius, Esterase 2 is characterized by a particularly high thermostability.
  • the esterase 2 is stable up to 90 ° C. and shows a good activity in the range from 20 ° C. to 65 ° C. It is also characterized by a particularly high general stability which allows storage at 50 ° C. over several months.
  • the esterase 2 is advantageously inhibited by the same substances which also inhibit acetylcholinesterase. This makes it especially suitable for detecting Acetylcholinesteraseinhibitoren, as provided in the biosensor according to the invention suitable.
  • a further advantageous embodiment of the invention is characterized in that the mutation of esterase 2 used at position 118 has a cysteine instead of a glutamate.
  • a cysteine which has a thiol group for binding to the nucleic acid strand and thus to the formation of the nucleic acid-enzyme complex has been introduced.
  • the binding of the nucleic acid is made possible at exactly this point. This ensures a directed coupling of the nucleic acid to the surface of the enzyme.
  • a further advantageous embodiment is that the esterase 2 at position 97 has a serine instead of a cysteine.
  • a cysteine at position 97 is replaced with serine.
  • the enzyme is deprived of a thiol group, which now allows a particularly directed coupling to the nucleic acid, because only one cysteine is still present in the enzyme at position 118.
  • a further advantageous embodiment of the invention is characterized in that the biosensor has at least one control enzyme, in particular an alkaline phosphatase, which is likewise intactly contacted with a sample to be examined for the presence of at least one toxin acting as enzyme inhibitor and which contains a second nuclease - lineinic acid strand forms a control enzyme-nucleic acid complex.
  • control enzyme in particular an alkaline phosphatase
  • This enzyme is used as a control in the biosensor. This increases the false alarm security of the system.
  • the control enzyme should not react to the toxic substances to be detected.
  • control enzyme As a result, the activity of the control enzyme is only impaired if there is a defect in the entire measuring system or, in general, if there are generally enzyme-damaging substances or the like Conditions exist, such as a very high or low pH or the presence of surfactants.
  • a further advantageous embodiment of the invention is characterized in that the control enzyme is coupled to streptavidin and that the second nucleic acid strand to form the control enzyme-nucleic acid complex is formed as a biotinized nucleic acid, wherein the biotin with the streptavidin a very stable non-covalent bond.
  • the advantage here is that a streptavidin-coupled commercially available alkaline phosphatase can be used as a control enzyme. If a control enzyme-streptavidin complex is given simultaneously with a biotinylated nucleic acid via the biosensor, the streptavidin binds to the biotin and a stable control enzyme-nucleic acid complex can be formed.
  • a further advantageous embodiment of the invention is characterized in that the biosensor has a second measuring spot for measuring an enzyme activity of the control enzyme, wherein at the second measuring spot on the biosensor to the second nucleic acid strand complementary nucleic acid strands for reversible coupling of the control enzyme -Nucleic acid complex are arranged.
  • the control enzyme for example the alkaline phosphatase, which is coupled to the nucleic acid via the streptavidin-biotin bond, binds to the immobilized nucleic acid which is complementary to the biotinylated nucleic acid strand.
  • Control enzymes are measured.
  • both measurement spots ie the first measurement spot at which the enzyme which reacts to the toxins by being inhibited, and the second measurement spot with the control enzyme have an activity which is constant for the respective measurement spot
  • the sample examined is free of toxins. If the first measurement spot has less activity with the inhibited enzyme than with control measurements, and the second measurement spot has a normal activity. the biosensor has detected a toxin. If both measuring spots have a lower activity than in the case of comparative measurements, then there is a fault in the system or a contamination of the water sample with substances that generally damage the protein.
  • Another object of the present invention is the use of a biosensor according to the invention for testing a sample for poisons.
  • the biosensor according to the invention is suitable for monitoring various liquids, in particular for determining poisons in water, preferably drinking water, sewage water, surface water, well water, baiast water from ships and / or cooling water.
  • biosensor can be used to monitor extracts dissolved from solids, especially pesticides, biological and / or chemical warfare agents, and / or heavy metals.
  • the sample may also be a gas, preferably air, e.g. in air conditioners or respiratory masks.
  • the biosensor according to the invention is especially a low-maintenance, robust monitoring system for the detection of toxins in drinking water, air or other liquids.
  • the enzyme that is used is long-term stable and can be reversibly coupled to the biosensor. In this case, the coupling is addressable, so that an optimal alignment of the enzymes can be achieved with their activity center to the substrate.
  • the cleavage product is detectable electrochemically and thus the enzyme activity on the biosensor is easily detectable.
  • the enzyme coating can, if necessary, be inhibited by toxins and thus decomposed by poisons. were disrupted, fully automatically regenerated. If several enzymes are used, which are immobilized, for example, on different measuring spots of the biosensor, again with the aid of nucleic acid-nucleic acid bonds, then the influence of the sample on several enzymes can be measured simultaneously.
  • FIG. 1 a schematic representation of the biosensor according to the invention for the detection of toxins in a sample
  • FIG. 2 an illustration of a biosensor with two measurement spots
  • FIG. 3 a schematic representation of the use of the biosensor and its regeneration.
  • FIG. 1 shows the schematic structure of the biosensor 1 according to the invention.
  • a number of nucleic acid strands 3 ' are immobilized or fixed on a first measurement spot A.
  • An enzyme-nucleic acid complex 23 binds to these nucleic acid strands 3 'via a nucleic acid-nucleic acid bond.
  • the binding takes place via the nucleic acid strand 3' complementary to the nucleic acid strand 3 'immobilized on the biosensor the complementary nucleic acid strand 3, an enzyme 2 is coupled in each case.
  • the nucleic acid may be a DNA, LNA, PNA or another nucleic acid derivative.
  • the enzyme 2 is the esterase 2 of the thermophilic eubacterium Alicyclobacillus acidocaldarius.
  • the binding of the enzyme 2 to the nucleic acid strand 3 is carried out in this case, ie at a certain point of the enzyme, a thiol group (SH group) is provided for binding to an amino group of the nucleic acid. This ensures that the active site of the enzyme is free for the absorption of substances.
  • the esterase 2 now splits a substrate 44, which is passed over the biosensor. The cleavage releases an electron, which can be measured electrochemically on the measurement spot A.
  • the enzyme 2 remains active and continues to cleave substrate if no toxins that inhibit enzyme activity are present in the water sample.
  • a toxin 4 is contained in the water sample, this toxin reversibly or irreversibly binds to the enzyme or destroys the activity of the enzyme, whereby no further substrate can be cleaved. In this case, no formation of electrons occurs and no voltage is measured on the biosensor.
  • a particular advantage of the system according to the invention is that the nucleic acid-nucleic acid bond between the two nucleic acid strands 3, 3 'is reversible. That is, for an inactive enzyme that has been inhibited by the presence of toxin in a sample, the enzyme-nucleic acid complex 23 can be melted off, for example, by adjusting parameters such as temperature and ionic strength. After melting, new enzyme-nucleic acid complex can be bound to the remaining immobilized nucleic acid 3 'and the biosensor is ready for use again.
  • FIG. 1 Another embodiment of the invention is shown in FIG.
  • the biosensor in this embodiment has a second measurement spot B, on which nucleic acid strands 6 'enzyme-nucleic acid complexes 56 are bound, wherein the enzyme is a control enzyme here.
  • the control enzyme 5 is not inhibited by toxins contained in a sample which is passed over the sensor. This means that even in the presence of toxins 4, the activity of the control enzyme does not diminish.
  • the control enzyme 5 processes the substrate 7, wherein the control enzyme 5 is advantageously a commercially available alkaline phosphatase bound to streptadivin.
  • the control enzyme 5 is advantageously a commercially available alkaline phosphatase bound to streptadivin.
  • the nucleic acid strand 3 'on the measurement spot A is complementary to the nucleic acid strand 3, which is coupled to the measurement enzyme 2 and thus forms the enzyme-nucleic acid complex 23.
  • the nucleic acid strand 6 is complementary to the nucleic acid strand 6 ', wherein the nucleic acid strand 6 is coupled to the control enzyme 5.
  • the latter binding is formed via a streptadivin-biotin complex.
  • the control enzyme-nucleic acid complex 56 thus binds exclusively to measuring spot B. Therefore, a specific measurement of the enzyme activities of the measuring enzyme 2 and of the control enzyme 5 is possible.
  • the measurement enzyme 2 binds selectively to the measurement spots A and the control enzyme 5 binds selectively to the measurement spots B.
  • FIG. 3 shows the use of the biosensor 1 according to the invention and its regeneration.
  • the biosensor 1 with the two measuring spots A and B is ready for use, if at both measuring spots En- zyme are coupled.
  • the measurement enzyme 2 is bound to the measurement spot A via the measurement enzyme-nucleic acid complex 23
  • the control enzyme 5 is bound to the measurement spot B via the control enzyme-nucleic acid complex 56.
  • substances or substrates 44, 7 are given via the sensor, which are processed by the measuring enzyme 2 and the control enzyme 5 in the active state, ie split.
  • the respective cleavage product is produced at both measuring spots A, B, and by applying a voltage to a spatially close electrode, the cleavage product is oxidized, whereby a measurable current is generated.
  • Particularly advantageous is the use of enzyme substrates which release the redox-active molecule para-aminophenol during the cleavage. Using suitable methods, such as redox cycling, the local concentration of para-aminophenol can be measured particularly accurately.
  • a suitable substrate for the alkaline phosphatase is para-amino phenyl phosphate
  • a suitable substrate for the esterase is para-amino phenyl butyrate.
  • the increase in current over time is individual for each spot and can be described by a slope ml, m2. If a sample is passed over the biosensor, for example water, represented by H 2 O in the figure, then both measurement spots remain active and, after the measurement has begun, the corresponding currents at the two measurement spots increase.
  • the biosensor can be regenerated in a simple manner.
  • nucleic acid-nucleic acid binding is reversible.
  • suitable parameters such as temperature and ionic strength, the bond can be opened. Thereafter, new enzyme can be coupled again, so that a total of a biosensor with regenerable enzyme coating is formed. Since the regeneration of the biosensor itself does not have to be changed and the regeneration is done only by adjusting the temperature and changing the solutions via the biosensor, this is particularly easy to automate.
  • esterase 2 of Alicyclobacillus acidocaldarius is advantageous.
  • This esterase with only one or a few cysteines makes it possible to produce a long-term stable esterase-nucleic acid complex.
  • the enzyme can be bound to the nucleic acid strands in a directed manner, so that it is ensured that the active center of the enzyme is freely accessible.
  • nucleic acid-nucleic acid bond in this case allows a directed binding of the enzymes at exactly the positions where they would like to have them on the biosensor. For this purpose, only different strands of nucleic acid strands complementary to the enzyme-nucleic acid complexes have to be immobilized at different positions on the biosensor.

Abstract

The invention relates to a biosensor (1) for detecting toxins in a sample, comprising at least one enzyme (2) which is contacted with a sample that is to be tested for the presence of at least one toxin acting as enzyme inhibitor, wherein the at least one enzyme (2) is bonded to a first nucleic acid strand (3), forming an enzyme-nucleic acid complex (23), at least one first measuring point (A) for measuring the activity of the enzyme (2), wherein the enzyme (2) is inhibited by an interaction with the at least one enzyme inhibitor (4), and nucleic acid strands (3') that are arranged on the first measuring point (A) on the biosensor and are complementary to the first nucleic acid strand (3) for a reversible coupling of the enzyme-nucleic acid complex (23).

Description

Beschreibungdescription
Biosensor zum Detektieren von Toxinen mittels eines Nuklein- säure-gekoppelten EnzymsBiosensor for detecting toxins by means of a nucleic acid-coupled enzyme
Die Erfindung betrifft einen Biosensor zum Detektieren von Toxinen in einer Probe, ein Verfahren zum Detektieren von Toxinen in einer Probe sowie die Verwendung eines erfindungsgemäßen Biosensors.The invention relates to a biosensor for detecting toxins in a sample, to a method for detecting toxins in a sample and to the use of a biosensor according to the invention.
Giftige bzw. toxische Substanzen stellen im Trinkwasser, in Lebensmitteln und in der Luft eine akute Gefahr für Mensch und Tier dar. Durch biologische Tests mit lebenden Organismen können Gift und deren toxische Wirkungen gemessen werden. In den Testverfahren werden lebende Organismen, wie Fische, Muscheln und Mikroorganismen verwendet. Die Testverfahren beruhen auf der Beobachtung, dass sich das Verhalten des ganzen Organismus bei Zugabe von Schadstoffen zum Wasser ändert (Brack et al . , 1999). Bakterien und Algen reagieren ebenfalls auf Schadstoffe, in dem ihre Bioluminiszenz bzw. photosynthetische Aktivität gehemmt wird.Toxic or toxic substances pose an acute danger to humans and animals in drinking water, in food and in the air. By means of biological tests with living organisms poison and its toxic effects can be measured. The test methods use living organisms such as fish, clams and microorganisms. The test methods are based on the observation that the behavior of the whole organism changes with the addition of pollutants to the water (Brack et al., 1999). Bacteria and algae also react to pollutants that inhibit their bioluminescence or photosynthetic activity.
Biologische Tests mit lebenden Organismen sind jedoch sehr aufwändig und aufgrund physiologischer Schwankungen im Orga- nismus schwer zu standardisieren. Außerdem sind die Ergebnisse solcher Tests nicht eindeutig auf den Menschen übertragbar. Zudem können lebende Organismen zum Nachweis von niedrigen Schadstoffkonzentrationen, z.B. bei der Kontrolle des Trinkwassergrenzwertes häufig nicht eingesetzt werden, weil sie nicht ausreichend empfindlich reagieren.Biological tests with living organisms, however, are very laborious and difficult to standardize due to physiological fluctuations in the organism. In addition, the results of such tests are not clearly applicable to humans. In addition, living organisms can be used to detect low levels of pollutants, e.g. are often not used in the control of drinking water limit, because they do not respond sufficiently sensitive.
Chemisch-analytische Verfahren, wie chromatographische Techniken zum Nachweis toxischer Substanzen stellen eine alternative zu Tests mit lebenden Organismen dar (Engst & Noske, 2006) . Sie haben sich jedoch aufgrund der großen Zahl nachzuweisender Stoffe als sehr zeitaufwändig und kostenintensiv erwiesen. Zudem können durch diese Verfahren nur bekannte Substanzen nachgewiesen werden. Außerdem ist der Nachweis von Substanzen, deren Charakter und Merkmale lediglich vermutet werden, problematisch.Chemical-analytical methods, such as chromatographic techniques for the detection of toxic substances, are an alternative to tests with living organisms (Engst & Noske, 2006). However, they have proven to be very time-consuming and costly due to the large number of detectable substances. In addition, only known substances can be detected by these methods. In addition, the proof of Substances whose character and characteristics are only suspected, problematic.
Enzyminhibitoren stellen für den Menschen eine Klasse bzw. Gruppe giftiger Substanzen dar. Durch ihre Wirkung auf isolierte Enzyme können sie sehr gut in niedrigen Konzentrationen nachgewiesen werden. Für den Nachweis von Zyanid wird das Enzym Cyanidase verwendet, das Zyanid in Ameisensäure und Ammoniak verlegt. Der Abbau führt zu einer Änderung des pH- Wertes, die anschließend als elektrische Potentialdifferenz gemessen werden kann (Keusken et al . , 2001).Enzyme inhibitors are a class or group of toxic substances for humans. Their action on isolated enzymes makes them very well detectable in low concentrations. For the detection of cyanide, the enzyme cyanidase is used, which moves cyanide into formic acid and ammonia. The degradation leads to a change in the pH, which can then be measured as an electrical potential difference (Keusken et al., 2001).
Ein auf Enzymen basierendes Nachweissystem, das auch als Enzymhemmtest bezeichnet wird, ist unabhängig von der Substanz, d.h. unabhängig von der chemischen Natur des Toxins. So können auch unbekannte und unvermutete Toxine in einem einzigen Nachweisverfahren schnell, einfach und mit hoher Empfindlichkeit erkannt werden, wenn sie in Bezug auf das eingesetzte Enzym eine inhibitorische Wirkung haben. Durch die Entwick- lung von kontinuierlichen Durchflusssystemen ist der Nachweis von toxischen Substanzen mittels Enzyminhibition automatisierbar und äußerst effizient (Sole et al . , 2003).An enzyme-based detection system, also referred to as an enzyme inhibition assay, is independent of the substance, i. regardless of the chemical nature of the toxin. Thus, even unknown and unexpected toxins can be detected in a single detection method quickly, easily and with high sensitivity if they have an inhibitory effect on the enzyme used. Through the development of continuous flow systems, the detection of toxic substances by means of enzyme inhibition can be automated and extremely efficient (Sole et al., 2003).
Hierbei zeigt ein Absinken der Enzymaktivität die Anwesenheit von Inhibitoren an. Von besonderem Interesse sind dabei Ace- tylcholinesterase-Inhibitoren, so dass häufig der Einfluss der Probe auf Acetylcholinesterase oder andere Esterasen gemessen wird. In einem derartigen System spaltet die Esterase bzw. Acetylcholinesterase ein spezielles Substrat, wobei das Spaltprodukt dann elektrochemisch gemessen werden kann, weil durch die Oxidation ein Elektron frei wird. Dieses System macht man sich bei der Detektion von Toxinen mittels Biosensoren zunutze. Ein Problem bei der Verwendung von Acetylcholinesterase ist jedoch, dass sie nicht lagerstabil ist. Spe- ziell die mangelnde Thermostabilität macht ihren Einsatz im Feld problematisch. Als Substrat kann bei der Verwendung der Acetylcholinesterase, beispielsweise Acetylthiocholin oder Paraamoniophenylacetat verwendet werden. Es ist jedoch auch die Verwendung von anderen Enzymen bzw. Mutanten von Enzymen zur Erhöhung der Spezifität auf bestimmte Substanzen in der Literatur beschrieben (Zhang et al . , 2005; Prieto-Simόn et al., 2006) .Here, a decrease in enzyme activity indicates the presence of inhibitors. Of particular interest are acetylcholinesterase inhibitors, so that the influence of the sample on acetylcholinesterase or other esterases is frequently measured. In such a system, the esterase or acetylcholinesterase cleaves a special substrate, and the cleavage product can then be electrochemically measured because an electron is released by the oxidation. This system is exploited in the detection of toxins using biosensors. However, a problem with the use of acetylcholinesterase is that it is not storage stable. In particular, the lack of thermal stability makes their use in the field problematic. As a substrate can be used in the use of acetylcholinesterase, for example acetylthiocholine or para-ammonia phenylacetate. It is, however the use of other enzymes or mutants of enzymes to increase specificity to certain substances described in the literature (Zhang et al., 2005; Prieto-Simén et al., 2006).
Wird das aktive Enzym, beispielsweise die Acetylcholin- esterase durch ein Toxin inhibiert, so kann das Enzym das vorhandene Substrat nicht mehr spalten, weil das Toxin das aktive Zentrum des Enzyms reversibel oder irreversibel ge- schädigt bzw. blockiert. Hierdurch wird im Sensor ein Abfall der elektrochemischen Spannung messbar.If the active enzyme, for example acetylcholinesterase, is inhibited by a toxin, the enzyme can no longer cleave the existing substrate because the toxin reversibly or irreversibly damages or blocks the active center of the enzyme. As a result, a drop in the electrochemical voltage can be measured in the sensor.
Bei den bisher bekannten Verfahren bzw. Biosensoren werden die verwendeten Enzyme fest an die Biosensoroberfläche oder an darüber liegende Membranen gebunden, so dass nach einer irreversibel inhibierenden Probe der Biosensor gewechselt werden muss.In the previously known methods or biosensors, the enzymes used are firmly bound to the biosensor surface or membranes lying above, so that after an irreversibly inhibiting sample of the biosensor must be changed.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, einen wartungsarmen Biosensor, welcher automatisiert mehrere Messungen nacheinander durchführen kann, anzugeben. Die Aufgabe der Erfindung liegt weiterhin darin, ein Verfahren zum Detektieren von Toxinen in einer Probe anzugeben, welches automatisiert für mehrere nacheinander folgende Messungen durchgeführt werden kann.The object of the present invention is therefore to provide a low-maintenance biosensor, which can automatically perform several measurements in succession. The object of the invention is further to provide a method for detecting toxins in a sample, which can be carried out automatically for several consecutive measurements.
Die Aufgabe wird gelöst durch einen Biosensor zum Detektieren von Toxinen in einer Probe mit mindestens einem Enzym, welches mit einer auf die Anwesenheit mindestens eines als Enzy- minhibitors wirkenden Toxins zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht wird, wobei das mindestens eine Enzym eine Bindung zu einem ersten Nukleinsäure-Strang aufweist, wodurch ein Enzym-Nukleinsäure-Komplex gebildet wird, mindestens einem ersten Messspot zum Messen der Aktivität des Enzyms, wo- bei das Enzym durch eine Wechselwirkung mit dem mindestens einen Enzyminhibitor inhibiert wird und an dem ersten Messspot auf dem Biosensor angeordneten zum ersten Nukleinsäure- Strang komplementären Nukleinsäure-Strängen zur reversiblen Ankopplung des Enzym-Nukleinsäure-Komplexes .The object is achieved by a biosensor for detecting toxins in a sample having at least one enzyme which is brought into contact with a sample to be examined for the presence of at least one acting as an enzyme inhibitor toxin, wherein the at least one enzyme is a bond to a first nucleic acid strand, whereby an enzyme-nucleic acid complex is formed, at least a first measuring spot for measuring the activity of the enzyme, wherein the enzyme is inhibited by an interaction with the at least one enzyme inhibitor and at the first measuring spot on the biosensor arranged to the first nucleic acid Strand complementary nucleic acid strands for reversible coupling of the enzyme-nucleic acid complex.
Die Aufgabe wird weiterhin gelöst, durch ein Verfahren zum Detektieren von Toxinen in einer Probe, bei dem mindestens ein Enzym mit einer auf die Anwesenheit mindestens eines als Enzyminhibitors wirkenden Toxins zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht wird, wobei das mindestens eine Enzym mit einem ersten Nukleinsäure-Strang einen Enzym-Nukleinsäure- Komplex bildet, an mindestens einem ersten Messspot die Aktivität des Enzyms gemessen wird, wobei das Enzym durch eine Wechselwirkung mit dem mindestens einen Enzyminhibitor inhibiert wird und der Enzym-Nukleinsäure-Komplex reversibel am ersten Messspot auf dem Biosensor angeordneten zum ersten Nukleinsäure-Strang komplementären Nukleinsäure-Strängen angekoppelt wird.The object is further achieved by a method for detecting toxins in a sample in which at least one enzyme is brought into contact with a sample to be examined for the presence of at least one acting as an enzyme inhibitor toxin, wherein the at least one enzyme with a first nucleic acid -Strang forms an enzyme-nucleic acid complex, at least a first measurement spot, the activity of the enzyme is measured, wherein the enzyme is inhibited by an interaction with the at least one enzyme inhibitor and the enzyme-nucleic acid complex arranged reversibly at the first measurement spot on the biosensor is coupled to the first nucleic acid strand complementary nucleic acid strands.
Die Aufgabe wird weiterhin gelöst, durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Biosensors zum Untersuchen einer Probe auf Gifte.The object is further achieved by the use of a biosensor according to the invention for testing a sample for poisons.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass für den Einsatz eines Biosensors im Feld die Aufwände bei der Wartung möglichst niedrig sein müssen. Da durch die Inhibition das Enzym eines Biosensors in der Regel irreversibel geschädigt wird, muss nach Feststellen einer Verschmutzung der zu testenden Probe mit dem Biosensor das verwendete Enzym durch neues Enzym ersetzt werden. Hierzu muss in der Regel der gesamte Biosensor ausgetauscht werden, wenn das Enzym irrever- sibel an den Sensor oder eine Membran auf dem Messspot des Sensors gebunden ist.The invention is based on the finding that the costs for maintenance of a biosensor in the field must be as low as possible. Since the inhibition of the enzyme of a biosensor is usually irreversibly damaged, after detecting contamination of the sample to be tested with the biosensor, the enzyme used must be replaced by new enzyme. For this, the entire biosensor usually has to be replaced if the enzyme is bound irreversibly to the sensor or a membrane on the measuring spot of the sensor.
Wird nun das Enzym derart am Biosensor fixiert, dass verbrauchtes Enzym automatisch entfernt und durch neues Enzym ersetzt werden kann, so kann der Austausch des Enzyms automatisiert werden und der Wartungsaufwand sinkt erheblich. Ein Austausch des Enzyms ist bei dem erfindungsgemäßen Biosensor dadurch möglich, dass das Enzym über eine reversible Nuklein- säure-Nukleinsäure-Kopplung an den Sensor gebunden ist. Hierbei wird im erfindungsgemäßen Biosensor das Enzym an einen ersten Nukleinsäure-Strang gebunden. Diese Bindung erfolgt in der Regel über eine gezielte Ankopplung von aminiomodifizier- ter Nukleinsäure an eine Thiolgruppe des Enzyms. Der Enzym- Nukleinsäure-Komplex wird dann über einen zweiten Nukleinsäure-Strang reversibel an den Biosensor gebunden. Diese Bindung erfolgt dadurch, dass ein zum an das Enzym gebundenen Nukleinsäure-Strang komplementärer Nukleinsäure-Strang am Bio- sensor immobilisiert ist. Die beiden Nukleinsäure-Stränge, der am Biosensor befestigte und der vom Enzym-Nukleinsäure- Komplex, gehen dann eine Nukleinsäure-Nukleinsäure-Bindung ein. Die Nukleinsäure kann dabei als DNA, LNA, PNA oder als weiteres mögliches Derivat ausgebildet sein.Now, if the enzyme is fixed to the biosensor so that used enzyme can be removed automatically and replaced by new enzyme, the replacement of the enzyme can be automated and the maintenance costs are significantly reduced. An exchange of the enzyme is possible in the biosensor according to the invention in that the enzyme is converted via a reversible nucleic acid. acid-nucleic acid coupling is bound to the sensor. In this case, the enzyme is bound to a first nucleic acid strand in the biosensor according to the invention. As a rule, this binding takes place via a targeted coupling of amino-modified nucleic acid to a thiol group of the enzyme. The enzyme-nucleic acid complex is then reversibly bound to the biosensor via a second nucleic acid strand. This binding takes place in that a nucleic acid strand of complementary nucleic acid strand bound to the enzyme is immobilized on the biosensor. The two nucleic acid strands attached to the biosensor and that of the enzyme-nucleic acid complex then undergo nucleic acid-nucleic acid binding. The nucleic acid can be designed as DNA, LNA, PNA or as another possible derivative.
Die Nukleinsäure-Nukleinsäure-Bindung ist reversibel. So kann beispielsweise durch Auswahl geeigneter Parameter wie Temperatur und Ionenstärke die Nukleinsäure-Nukleinsäure-Bindung geöffnet werden. Hierdurch kann das verbrauchte Enzym mit dem Nukleinsäure-Strang vom Biosensor gelöst werden, wobei die an den Biosensor gekoppelten komplementären Nukleinsäure-Stränge auf den Biosensor verbleiben. Anschließend kann neues Enzym an den Nukleinsäure-Strängen auf dem Biosensor wieder binden und der gesamte Sensor ist wieder einsetzbar.The nucleic acid-nucleic acid binding is reversible. Thus, for example, by selecting suitable parameters such as temperature and ionic strength, the nucleic acid-nucleic acid binding can be opened. In this way, the spent enzyme with the nucleic acid strand can be detached from the biosensor, wherein the complementary nucleic acid strands coupled to the biosensor remain on the biosensor. Subsequently, new enzyme can bind to the nucleic acid strands on the biosensor and the entire sensor can be used again.
Der entsprechende Sensor und das Verfahren ermöglichen somit einen Austausch des verbrauchten Enzyms und ermöglichen hierdurch eine Verwendung des Sensors im Feld ohne Austausch des eigentlichen Biosensors. Lediglich eine Ablösung des ver- brauchten Enzyms und ein Wiederauffüllen des Messenzyms sind notwendig. Dies kann über geeignete Steuerungen aus verschiedenen Vorratsbehältern für die entsprechenden Substanzen, die an den Biosensor angeschlossen werden, erfolgen. Somit kann neues Enzym wieder angekoppelt werden, ohne dass der Biosen- sor selbst gewechselt werden muss. Es entsteht somit ein Biosensor mit regenerierbarer Enzymbeschichtung. Hierbei erfolgt die Regenerierung lediglich durch die Einstellung von Temperatur und den Wechsel der Lösungen, die über den Biosensor gespült bzw. gepumpt werden. Ein derartiges Verfahren ist besonders einfach zu automatisieren.The corresponding sensor and method thus allow replacement of the spent enzyme and thereby allow use of the sensor in the field without replacement of the actual biosensor. Only a replacement of the spent enzyme and a refilling of the measurement enzyme are necessary. This can be done via appropriate controls from different reservoirs for the corresponding substances that are connected to the biosensor. Thus, new enzyme can be re-coupled without the biosensor itself has to be changed. This results in a biosensor with regenerable enzyme coating. Here, the regeneration is done only by the adjustment of temperature and the change of solutions via the biosensor be rinsed or pumped. Such a method is particularly easy to automate.
Eine weitere vorteilhafte Ausbildung der Erfindung ist da- durch gekennzeichnet, dass der erste Nukleinsäure-Strang ami- niomodifiziert ist und dass das mindestens eine Enzym über eine Thiolgruppe zur Bindung an eine Aminogruppe des ersten Nukleinsäure-Strangs verfügt. Hierdurch wird eine Bildung des Nukleinsäure-Enzym-Komplexes mit Standardverfahren ermög- licht. Beispielsweise kann die Bindung überA further advantageous embodiment of the invention is characterized in that the first nucleic acid strand is amino-modified and that the at least one enzyme has a thiol group for binding to an amino group of the first nucleic acid strand. This makes it possible to form the nucleic acid-enzyme complex by standard methods. For example, the bond may be over
4- (N-Maleimidomethyl) cyclohexane-1-carbosylic acid 3-sulfo-N- hydroxysuccinimide ester sodium salt erfolgen. Es können jedoch auch andere Standardverfahren zur Bildung des Enzym- Nukleinsäure-Komplexes verwendet werden.4- (N-Maleimidomethyl) cyclohexane-1-carbosylic acid 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester sodium salt done. However, other standard methods of forming the enzyme-nucleic acid complex may also be used.
Eine weitere vorteilhafte Ausbildung der Erfindung besteht darin, dass das Enzym als thermostabile Esterase ausgebildet ist, insbesondere als Esterase 2 des thermophilen Eubakteri- ums Alicyclobazillus acidocalderius, wobei die thermostabile Esterase 2 an ihrer Oberfläche mindestens ein Cystein zurA further advantageous embodiment of the invention is that the enzyme is in the form of a thermostable esterase, in particular as esterase 2 of the thermophilic eubacterium Alicyclobacillus acidocalderius, the thermostable esterase 2 having on its surface at least one cysteine
Bindung an den ersten Nukleinsäure-Strang verfügt. Der Vorteil der Verwendung einer thermostabilen Esterase liegt darin, dass auch hier der Wartungsaufwand sinkt. Das gesamte Monitoringsystem für die Detektion von Toxinen wird robuster, wenn ein langzeitstabiles und thermostabiles Enzym verwendet werden kann. Der Einsatz des Biosensors im Feld ist hierdurch weniger temperaturanfällig.Binding to the first nucleic acid strand has. The advantage of using a thermostable esterase is that also here the maintenance costs decrease. The entire toxin detection monitoring system will become more robust if a long-term stable and thermostable enzyme can be used. The use of the biosensor in the field is less prone to temperature.
Das Enzym des Alicyclobazillus acidocaldarius, die Esterase 2, zeichnet sich hierbei durch eine besonders hohe Thermosta- bilität aus. Die Esterase 2 ist bis 90 0C stabil und zeigt eine gute Aktivität im Bereich von 20 0C bis zu 65 0C. Zudem ist sie durch eine besonders hohe allgemeine Stabilität gekennzeichnet, die eine Lagerung bei 5 0C über mehrere Monate ermöglicht. Die Esterase 2 wird vorteilhafterweise durch die gleichen Substanzen inhibitiert, die auch Acetylcholinestera- se hemmen. Hierdurch ist sie speziell zum Detektieren von Acetylcholinesteraseinhibitoren, wie dies beim erfindungsgemäßen Biosensor vorgesehen ist, geeignet.The enzyme of Alicyclobacillus acidocaldarius, Esterase 2, is characterized by a particularly high thermostability. The esterase 2 is stable up to 90 ° C. and shows a good activity in the range from 20 ° C. to 65 ° C. It is also characterized by a particularly high general stability which allows storage at 50 ° C. over several months. The esterase 2 is advantageously inhibited by the same substances which also inhibit acetylcholinesterase. This makes it especially suitable for detecting Acetylcholinesteraseinhibitoren, as provided in the biosensor according to the invention suitable.
Eine weitere vorteilhafte Ausbildung der Erfindung ist da- durch gekennzeichnet, dass die verwendete Mutation der Esterase 2 an Position 118 ein Cystein statt eines Glutamats aufweist. Hierdurch wird speziell an der Oberfläche des Enzyms ein Cystein, welches eine Thiolgruppe zur Bindung an den Nuk- leinsäure-Strang und damit zur Bildung des Nukleinsäure- Enzym-Komplexes aufweist, eingeführt. Somit wird die Bindung der Nukleinsäure an genau dieser Stelle ermöglicht. Hierdurch ist eine gerichtete Ankopplung der Nukleinsäure an der Oberfläche des Enzyms gewährleistet.A further advantageous embodiment of the invention is characterized in that the mutation of esterase 2 used at position 118 has a cysteine instead of a glutamate. In this way, especially at the surface of the enzyme, a cysteine which has a thiol group for binding to the nucleic acid strand and thus to the formation of the nucleic acid-enzyme complex has been introduced. Thus, the binding of the nucleic acid is made possible at exactly this point. This ensures a directed coupling of the nucleic acid to the surface of the enzyme.
Eine weitere vorteilhafte Ausbildung besteht darin, dass die Esterase 2 an Position 97 ein Serin statt eines Cysteins aufweist. Zusätzlich zum Austausch an Position 118 wird somit ein Cystein an Position 97 gegen Serin ausgetauscht. Hiermit wird dem Enzym eine Thiolgruppe entzogen, was nunmehr eine besonders gerichtete Ankopplung an die Nukleinsäure ermöglicht, weil nur noch ein Cystein im Enzym an Position 118 vorhanden ist.A further advantageous embodiment is that the esterase 2 at position 97 has a serine instead of a cysteine. Thus, in addition to replacing at position 118, a cysteine at position 97 is replaced with serine. Hereby, the enzyme is deprived of a thiol group, which now allows a particularly directed coupling to the nucleic acid, because only one cysteine is still present in the enzyme at position 118.
Eine weitere vorteilhafte Ausbildung der Erfindung kennzeich- net sich dadurch, dass der Biosensor mindestens ein Kontrollenzym aufweist, insbesondere eine alkalische Phosphatase, welches ebenfalls mit einer auf die Anwesenheit mindestens eines als Enzyminhibitors wirkenden Toxins zu untersuchenden Probe intakt gebracht wird und welches mit einem zweiten Nuk- leinsäure-Strang einen Kontrollenzym-Nukleinsäure-Komplex bildet. Der Vorteil durch die Verwendung eines weiteren Enzyms liegt darin, dass dieses Enzym als Kontrolle im Biosensor verwendet wird. Dies erhöht die Fehlalarmsicherheit des Systems. Hierbei soll das Kontrollenzym nicht auf die zu de- tektierenden toxischen Substanzen reagieren. Dadurch wird das Kontrollenzym in seiner Aktivität nur beeinträchtigt, wenn ein Fehler des gesamten Messsystems vorliegt oder generell wenn allgemein enzymschädigende Substanzen oder entsprechende Bedingungen vorliegen, wie z.B. ein sehr hoher oder niedriger pH-Wert oder auch die Gegenwart von Tensiden.A further advantageous embodiment of the invention is characterized in that the biosensor has at least one control enzyme, in particular an alkaline phosphatase, which is likewise intactly contacted with a sample to be examined for the presence of at least one toxin acting as enzyme inhibitor and which contains a second nuclease - lineinic acid strand forms a control enzyme-nucleic acid complex. The advantage of using another enzyme is that this enzyme is used as a control in the biosensor. This increases the false alarm security of the system. The control enzyme should not react to the toxic substances to be detected. As a result, the activity of the control enzyme is only impaired if there is a defect in the entire measuring system or, in general, if there are generally enzyme-damaging substances or the like Conditions exist, such as a very high or low pH or the presence of surfactants.
Eine weitere vorteilhafte Ausbildung der Erfindung ist da- durch gekennzeichnet, dass das Kontrollenzym an Streptavidin gekoppelt ist und dass der zweite Nukleinsäure-Strang zur Bildung des Kontrollenzym-Nukleinsäure-Komplexes als biotini- lierte Nukleinsäure ausgebildet ist, wobei das Biotin mit dem Streptavidin eine sehr stabile nicht kovalente Bindung ein- geht. Der Vorteil ist hierbei, dass eine an Streptavidin gekoppelte kommerziell verfügbare alkalische Phosphatase als Kontrollenzym eingesetzt werden kann. Wird ein Kontrollenzym- Streptavidin-Komplex gleichzeitig mit einer biotinilierten Nukleinsäure über den Biosensor gegeben, so bindet das Strep- tavidin an das Biotin und ein stabiler Kontrollenzym- Nukleinsäure-Komplex kann gebildet werden.A further advantageous embodiment of the invention is characterized in that the control enzyme is coupled to streptavidin and that the second nucleic acid strand to form the control enzyme-nucleic acid complex is formed as a biotinized nucleic acid, wherein the biotin with the streptavidin a very stable non-covalent bond. The advantage here is that a streptavidin-coupled commercially available alkaline phosphatase can be used as a control enzyme. If a control enzyme-streptavidin complex is given simultaneously with a biotinylated nucleic acid via the biosensor, the streptavidin binds to the biotin and a stable control enzyme-nucleic acid complex can be formed.
Eine weitere vorteilhafte Ausbildung der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass der Biosensor einen zweiten Mess- spot zum Messen einer Enzym-Aktivität des Kontrollenzyms aufweist, wobei an dem zweiten Messspot auf dem Biosensor zum zweiten Nukleinsäure-Strang komplementäre Nukleinsäure- Stränge zur reversiblen Ankopplung des Kontrollenzym-Nuklein- säure-Komplexes angeordnet sind. An dem zweiten Messspot bin- det somit an der immobilisierten Nukleinsäure, welche komplementär zum biotinilierten Nukleinsäure-Strang ist, lediglich das Kontrollenzym, beispielsweise die alkalische Phosphatase, welche über die Streptavidin-Biotin-Bindung an die Nukleinsäure gekoppelt ist. Somit kann auf einem zweiten Messspot unabhängig vom ersten Messspot lediglich die Aktivität desA further advantageous embodiment of the invention is characterized in that the biosensor has a second measuring spot for measuring an enzyme activity of the control enzyme, wherein at the second measuring spot on the biosensor to the second nucleic acid strand complementary nucleic acid strands for reversible coupling of the control enzyme -Nucleic acid complex are arranged. At the second measuring spot, therefore, only the control enzyme, for example the alkaline phosphatase, which is coupled to the nucleic acid via the streptavidin-biotin bond, binds to the immobilized nucleic acid which is complementary to the biotinylated nucleic acid strand. Thus, on a second measuring spot, independent of the first measuring spot, only the activity of the
Kontrollenzyms gemessen werden. Weisen somit beide Messspots, also der erste Messspot, an dem das Enzym, welches auf die Toxine reagiert, indem es inhibitiert wird, und der zweite Messspot mit dem Kontrollenzym eine für den jeweiligen Mess- spot konstante Aktivität auf, so ist die untersuchte Probe frei von Toxinen. Weist der erste Messspot mit dem inhibi- tierten Enzym eine geringere Aktivität auf als bei Kontrollmessungen und der zweite Messspot weist eine normale Aktivi- tät auf, so hat der Biosensor ein Toxin detektiert. Weisen beide Messspots eine geringere Aktivität als bei Vergleichsmessungen auf, so liegt ein Fehler im System oder eine Kontamination der Wasserprobe mit allgemein proteinschädigenden Substanzen vor.Control enzymes are measured. Thus, if both measurement spots, ie the first measurement spot at which the enzyme which reacts to the toxins by being inhibited, and the second measurement spot with the control enzyme have an activity which is constant for the respective measurement spot, the sample examined is free of toxins. If the first measurement spot has less activity with the inhibited enzyme than with control measurements, and the second measurement spot has a normal activity. the biosensor has detected a toxin. If both measuring spots have a lower activity than in the case of comparative measurements, then there is a fault in the system or a contamination of the water sample with substances that generally damage the protein.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Biosensors zum Untersuchen einer Probe auf Gifte. Insbesondere eignet sich der erfin- dungsgemäße Biosensor zum Überwachen von verschiedenen Flüssigkeiten, insbesondere zum Bestimmen von Giften in Wasser, vorzugsweise Trinkwasser, Klärwasser, Oberflächenwasser, Brunnenwasser, Baiastwasser von Schiffen und/oder Kühlwasser.Another object of the present invention is the use of a biosensor according to the invention for testing a sample for poisons. In particular, the biosensor according to the invention is suitable for monitoring various liquids, in particular for determining poisons in water, preferably drinking water, sewage water, surface water, well water, baiast water from ships and / or cooling water.
Es können ebenfalls Nahrungsmittel, insbesondere Getränke wie Milch, Saft, Bier und Wein überwacht werden. Darüber hinaus kann der Biosensor zum Überwachen von aus Feststoffen gelösten Extrakten, insbesondere Pestiziden, biologischen und/oder chemischen Kampfstoffen und/oder Schwermetallen verwendet werden.It is also possible to monitor foodstuffs, in particular beverages such as milk, juice, beer and wine. In addition, the biosensor can be used to monitor extracts dissolved from solids, especially pesticides, biological and / or chemical warfare agents, and / or heavy metals.
Ferner kann die Probe ebenso ein Gas sein, vorzugsweise Luft, z.B. in Klimaanlagen oder Atemmasken.Further, the sample may also be a gas, preferably air, e.g. in air conditioners or respiratory masks.
Durch den erfindungsgemäßen Biosensor liegt speziell ein wartungsarmes, robustes Monitoringsystem für die Detektion von Toxinen in Trinkwasser, Luft oder auch anderen Flüssigkeiten vor. Das Enzym, welches verwendet wird, ist langzeitstabil und reversibel an den Biosensor ankoppelbar. Hierbei ist die Ankopplung adressierbar, so dass eine optimale Ausrichtung der Enzyme mit ihrem Aktivitätszentrum zum Substrat hin erreicht werden kann. Das Spaltprodukt ist elektrochemisch de- tektierbar und somit ist die Enzymaktivität auf dem Biosensor leicht nachweisbar.The biosensor according to the invention is especially a low-maintenance, robust monitoring system for the detection of toxins in drinking water, air or other liquids. The enzyme that is used is long-term stable and can be reversibly coupled to the biosensor. In this case, the coupling is addressable, so that an optimal alignment of the enzymes can be achieved with their activity center to the substrate. The cleavage product is detectable electrochemically and thus the enzyme activity on the biosensor is easily detectable.
Durch die reversible Ankopplung der Enzym-Nukleinsäure- Komplexe an den Biosensor kann die Enzym-Beschichtung bei Bedarf, wenn die Enzyme durch Gifte inhibiert und damit zer- stört wurden, vollautomatisch regeneriert werden. Werden mehrere Enzyme eingesetzt, die beispielweise auf verschiedenen Messspots des Biosensors immobilisiert werden, wiederum mit Hilfe von Nukleinsäure-Nukleinsäure-Bindungen, so kann man den Einfluss der Probe auf mehrere Enzyme gleichzeitig messen .As a result of the reversible coupling of the enzyme-nucleic acid complexes to the biosensor, the enzyme coating can, if necessary, be inhibited by toxins and thus decomposed by poisons. were disrupted, fully automatically regenerated. If several enzymes are used, which are immobilized, for example, on different measuring spots of the biosensor, again with the aid of nucleic acid-nucleic acid bonds, then the influence of the sample on several enzymes can be measured simultaneously.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand der Figuren näher beschrieben und erläutert.The invention will be described and explained in more detail below with reference to the figures.
Es zeigen:Show it:
FIG 1 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Biosensors zur Detektion von Toxinen in einer Probe, FIG 2 eine Abbildung eines Biosensors mit zwei Messspots, FIG 3 eine schematische Darstellung des Einsatzes des Biosensors und dessen Regeneration.1 a schematic representation of the biosensor according to the invention for the detection of toxins in a sample, FIG. 2 an illustration of a biosensor with two measurement spots, FIG. 3 a schematic representation of the use of the biosensor and its regeneration.
FIG 1 zeigt den schematischen Aufbau des erfindungsgemäßen Biosensors 1. Hierbei ist an einem ersten Messspot A eine Anzahl von Nukleinsäure-Strängen 3' immobilisiert bzw fixiert. An diese Nukleinsäure-Stränge 3' bindet über eine Nukleinsäu- re-Nukleinsäure-Bindung ein Enzym-Nukleinsäure-Komplex 23. Hierbei erfolgt die Bindung über den zum auf dem Biosensor immobilisierten Nukleinsäure-Strang 3' komplementären Nuk- leinsäure-Strang 3. An dem komplementären Nukleinsäure-Strang 3 ist jeweils ein Enzym 2 angekoppelt. Bei der Nukleinsäure kann es sich um eine DNA, LNA, PNA oder ein anderes Nuklein- säurederivat handeln.FIG. 1 shows the schematic structure of the biosensor 1 according to the invention. In this case, a number of nucleic acid strands 3 'are immobilized or fixed on a first measurement spot A. An enzyme-nucleic acid complex 23 binds to these nucleic acid strands 3 'via a nucleic acid-nucleic acid bond. Here, the binding takes place via the nucleic acid strand 3' complementary to the nucleic acid strand 3 'immobilized on the biosensor the complementary nucleic acid strand 3, an enzyme 2 is coupled in each case. The nucleic acid may be a DNA, LNA, PNA or another nucleic acid derivative.
In dem Ausführungsbeispiel handelt es bei dem Enzym 2 um die Esterase 2 des thermophilen Eubakteriums Alicyclobacillus acidocaldarius . Die Bindung des Enzyms 2 an den Nukleinsäure- Strang 3 erfolgt hierbei gerichtet, d.h. an einer bestimmten Stelle des Enzyms wird eine Thiolgruppe (SH-Gruppe) für die Bindung an eine Aminogruppe der Nukleinsäure bereitgestellt. So wird sichergestellt, dass das aktive Zentrum des Enzyms frei für die Aufnahme von Substanzen ist. Die Esterase 2 spaltet nun ein Substrat 44, welches über den Biosensor gegeben wird. Durch die Spaltung wird ein Elektron frei, welches sich elektrochemisch auf dem Messspot A messen lässt.In the exemplary embodiment, the enzyme 2 is the esterase 2 of the thermophilic eubacterium Alicyclobacillus acidocaldarius. The binding of the enzyme 2 to the nucleic acid strand 3 is carried out in this case, ie at a certain point of the enzyme, a thiol group (SH group) is provided for binding to an amino group of the nucleic acid. This ensures that the active site of the enzyme is free for the absorption of substances. The esterase 2 now splits a substrate 44, which is passed over the biosensor. The cleavage releases an electron, which can be measured electrochemically on the measurement spot A.
Wird eine Wasserprobe über den Messspot geleitet, so bleibt das Enzym 2 aktiv und spaltet weiterhin Substrat, wenn in der Wasserprobe keine Toxine, die die Enzymaktivität inhibieren, enthalten sind. Ist jedoch in der Wasserprobe ein Toxin 4 enthalten, so bindet dieses Toxin reversibel oder irreversi- bei an das Enzym bzw. zerstört die Aktivität des Enzyms, wodurch kein weiteres Substrat gespalten werden kann. In diesem Fall kommt es auch nicht zu einer Bildung von Elektronen und auf dem Biosensor wird keine Spannung mehr gemessen.If a water sample is passed over the measurement spot, the enzyme 2 remains active and continues to cleave substrate if no toxins that inhibit enzyme activity are present in the water sample. However, if a toxin 4 is contained in the water sample, this toxin reversibly or irreversibly binds to the enzyme or destroys the activity of the enzyme, whereby no further substrate can be cleaved. In this case, no formation of electrons occurs and no voltage is measured on the biosensor.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Systems liegt darin, dass die Nukleinsäure-Nukleinsäure-Bindung zwischen den beiden Nukleinsäure-Strängen 3, 3' reversibel ist. Das heißt, bei einem inaktiven Enzym, welches durch die Gegenwart von Toxin in einer Probe inhibiert wurde, kann der Enzym- Nukleinsäure-Komplex 23 abgeschmolzen werden, beispielsweise durch Einstellung von Parametern wie Temperatur und Ionenstärke. Nach Abschmelzung kann an die noch vorhandene immobilisierte Nukleinsäure 3' wieder neuer Enzym-Nukleinsäure- Komplex gebunden werden und der Biosensor ist wieder einsatz- fähig.A particular advantage of the system according to the invention is that the nucleic acid-nucleic acid bond between the two nucleic acid strands 3, 3 'is reversible. That is, for an inactive enzyme that has been inhibited by the presence of toxin in a sample, the enzyme-nucleic acid complex 23 can be melted off, for example, by adjusting parameters such as temperature and ionic strength. After melting, new enzyme-nucleic acid complex can be bound to the remaining immobilized nucleic acid 3 'and the biosensor is ready for use again.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in FIG 2 dargestellt. Zusätzlich zu dem bereits beschriebenen Messspot A mit dem Enzym 2, welches durch das Toxin 4 inhibiert wird, verfügt der Biosensor in diesem Ausführungsbeispiel über einen zweiten Messspot B, an dem über Nukleinsäure-Stränge 6' Enzym-Nukleinsäure-Komplexe 56 gebunden sind, wobei das Enzym hier ein Kontrollenzym ist. Das Kontrollenzym 5 wird durch Toxine, die in einer Probe enthalten sind, welche über den Sensor geführt wird, nicht inhibiert. Das heißt, dass auch bei Gegenwart von Toxinen 4 die Aktivität des Kontrollenzyms nicht nachlässt. Das Kontrollenzym 5 verarbeitet das Substrat 7, wobei es sich bei dem Kontrollenzym 5 vorteilhafterweise um eine kommerziell verfügbare alkalische Phosphatase handelt, die an Streptadivin gebunden ist. Auf den beiden Messspot A und B sind jeweils nur Nukleinsäure-Stränge 3', 6' mit derselbenAnother embodiment of the invention is shown in FIG. In addition to the previously described measurement spot A with the enzyme 2, which is inhibited by the toxin 4, the biosensor in this embodiment has a second measurement spot B, on which nucleic acid strands 6 'enzyme-nucleic acid complexes 56 are bound, wherein the enzyme is a control enzyme here. The control enzyme 5 is not inhibited by toxins contained in a sample which is passed over the sensor. This means that even in the presence of toxins 4, the activity of the control enzyme does not diminish. The control enzyme 5 processes the substrate 7, wherein the control enzyme 5 is advantageously a commercially available alkaline phosphatase bound to streptadivin. On the two measurement spot A and B, only nucleic acid strands 3 ', 6' are in each case with the same
Sequenz immobilisiert. Hierbei ist der Nukleinsäure-Strang 3' auf dem Messspot A komplementär zum Nukleinsäure-Strang 3, der an das Messenzym 2 gekoppelt ist und somit den Enzym- Nukleinsäure-Komplex 23 bildet. Der Nukleinsäure-Strang 6 ist komplementär zum Nukleinsäure-Strang 6', wobei der Nukleinsäure-Strang 6 an das Kontrollenzym 5 gekoppelt ist. Letztere Bindung wird über einen Streptadivin-Biotin-Komplex gebildet. Der Kontrollenzym-Nukleinsäure-Komplex 56 bindet somit ausschließlich an Messspot B. Daher ist eine spezifische Messung der Enzymaktivitäten des Messenzyms 2 sowie des Kontrollenzyms 5 möglich. Wird nun ein Gemisch aus Messenzym- Nukleinsäure-Komplex, biotinmarkierter Nukleinsäure und Kon- trollenzym-Streptadivin-Komplex über den Biosensor gegeben, so bindet das Messenzym 2 selektiv an die Messspots A und das Kontrollenzym 5 bindet selektiv an die Messspots B.Sequence immobilized. Here, the nucleic acid strand 3 'on the measurement spot A is complementary to the nucleic acid strand 3, which is coupled to the measurement enzyme 2 and thus forms the enzyme-nucleic acid complex 23. The nucleic acid strand 6 is complementary to the nucleic acid strand 6 ', wherein the nucleic acid strand 6 is coupled to the control enzyme 5. The latter binding is formed via a streptadivin-biotin complex. The control enzyme-nucleic acid complex 56 thus binds exclusively to measuring spot B. Therefore, a specific measurement of the enzyme activities of the measuring enzyme 2 and of the control enzyme 5 is possible. If a mixture of measurement enzyme-nucleic acid complex, biotin-labeled nucleic acid and control enzyme-streptadivin complex is added via the biosensor, the measurement enzyme 2 binds selectively to the measurement spots A and the control enzyme 5 binds selectively to the measurement spots B.
Der Vorteil hierbei ist, dass der gesamte Biosensor somit fehlersicher gemacht wird, d.h. wenn das Kontrollenzym auch in seiner Aktivität nachlässt, liegt dies nicht an der Gegen- wart von Toxinen in der Probe, sondern an einem allgemeinenThe advantage here is that the entire biosensor is thus made fail-safe, i. If the control enzyme also decreases in its activity, this is not due to the presence of toxins in the sample but to a general one
Fehler im System, der generell zu einer Inaktivität von Enzymen führt, wie beispielsweise ein extremer pH-Wert oder andere Faktoren, die eine Enzym-Aktivität verhindern. Durch dieses Kontrollsystem, kann jederzeit festgestellt werden, ob der Biosensor fehlerfrei arbeitet. Der Ausfall des Messenzyms bzw. eine inhibitierte Aktivität des Messenzyms und damit ein entsprechend nicht vorhandener Stromfluss am Messspot A weist eindeutig auf die Gegenwart eines Toxins hin, wenn an Messspot B weiterhin ein Strom gemessen werden kann.Failure in the system that generally results in inactivity of enzymes, such as extreme pH or other factors preventing enzyme activity. Through this control system, it can be determined at any time whether the biosensor is working properly. The failure of the measurement enzyme or an inhibited activity of the measurement enzyme and thus a correspondingly non-existent current flow at the measurement spot A clearly indicates the presence of a toxin if a current can still be measured at measurement spot B.
FIG 3 zeigt den Einsatz des erfindungsgemäßen Biosensors 1 und dessen Regeneration. Der Biosensor 1 mit den beiden Messspots A und B ist einsatzbereit, wenn an beiden Messspots En- zyme gekoppelt sind. Hierbei ist das Messenzym 2 über den Messenzym-Nukleinsäure-Komplex 23 an den Messpot A gebunden und das Kontrollenzym 5 ist über den Kontrollenzym-Nuklein- säure-Komplex 56 an den Messspot B gebunden. Zur Kalibrierung des Systems bzw. des Sensors wird nun Substrat über den Biosensor gegeben. Hierbei werden Substanzen bzw. Substrate 44, 7 über den Sensor gegeben, welche von dem Messenzym 2 und dem Kontrollenzym 5 im aktiven Zustand bearbeitet, d.h. gespalten werden. Dabei fällt an beiden Messspots A, B das jeweilige Spaltprodukt an, und durch das Anlegen einer Spannung an eine räumlich nahe Elektrode wird das Spaltprodukt oxidiert, wobei ein messbarer Strom erzeugt wird. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Enzymsubstraten, die bei der Spaltung das redoxaktive Molekül Paraaminophenol freisetzen. Mit geeigne- ten Verfahren wie Redoxcycling kann die lokale Konzentration an Paraaminophenol besonders genau gemessen werden.3 shows the use of the biosensor 1 according to the invention and its regeneration. The biosensor 1 with the two measuring spots A and B is ready for use, if at both measuring spots En- zyme are coupled. In this case, the measurement enzyme 2 is bound to the measurement spot A via the measurement enzyme-nucleic acid complex 23, and the control enzyme 5 is bound to the measurement spot B via the control enzyme-nucleic acid complex 56. For calibrating the system or the sensor substrate is now given via the biosensor. Here, substances or substrates 44, 7 are given via the sensor, which are processed by the measuring enzyme 2 and the control enzyme 5 in the active state, ie split. In this case, the respective cleavage product is produced at both measuring spots A, B, and by applying a voltage to a spatially close electrode, the cleavage product is oxidized, whereby a measurable current is generated. Particularly advantageous is the use of enzyme substrates which release the redox-active molecule para-aminophenol during the cleavage. Using suitable methods, such as redox cycling, the local concentration of para-aminophenol can be measured particularly accurately.
Zur Bestimmung der Enzymaktivität wird die Bewegung der Flüssigkeit über dem Biosensor gestoppt. Dadurch steigt, verur- sacht durch die Enzymaktivitäten, lokal die Konzentration an Paraaminophenol an und das Stromsignal steigt ebenfalls. Der Anstieg des Stromsignals ist dabei korreliert mit der Enyzm- aktivität. Ein geeignetes Substrat für die alkalische Phosphatase ist Paraaminophenylphosphat, ein geeignetes Sub- strat für die Esterase ist Paraaminophenylbutyrat .To determine the enzyme activity, the movement of the liquid above the biosensor is stopped. As a result of this, the concentration of para-amino phenol increases locally as a result of the enzyme activities and the current signal also increases. The increase in the current signal is correlated with the enzyme activity. A suitable substrate for the alkaline phosphatase is para-amino phenyl phosphate, a suitable substrate for the esterase is para-amino phenyl butyrate.
Der Anstieg des Stroms über die Zeit ist für jeden Messspot individuell und kann durch eine Steigung ml, m2 beschrieben werden. Wird eine Probe über den Biosensor gegeben, bei- spielsweise Wasser, in der Figur durch H2O dargestellt, so bleiben beide Messspots weiterhin aktiv und es erfolgt nach Beginn der Messung ein Anstieg der entsprechenden Ströme an den beiden Messspots.The increase in current over time is individual for each spot and can be described by a slope ml, m2. If a sample is passed over the biosensor, for example water, represented by H 2 O in the figure, then both measurement spots remain active and, after the measurement has begun, the corresponding currents at the two measurement spots increase.
Wird nun eine Probe über den Biosensor gegeben, die ein Toxin 4 enthält, so wird das Enzym 2 am Messspot A inhibiert und es kann kein Stromanstieg an Messspot A mehr gemessen werden. Hingegen wird weiterhin ein Stromanstieg an Messspot B gemes- sen, da das Kontrollenzym 5 durch das Toxin 4 nicht geschädigt ist und somit weiterhin aktiv bleibt. Nachdem eine derartige Verschmutzung durch ein Toxin 4 von dem System festgestellt wurde, ist das Enzym 2 häufig nicht mehr einsetzbar. Jetzt werden andere Substanzen über den Biosensor gegeben, beispielsweise eine Substanz mit einem gewissen pH-Wert oder eine Salzlösung, welche zum Abschmelzen der Enzym-Nuklein- säure-Komplexe 23 und 56 führt. Anschließend sind an den beiden Messspots A und B lediglich die zu den Nukleinsäure- Strängen der Enzym-Nukleinsäure-Komplexe komplementären Nuk- leinsäure-Stränge 3' und 6' vorhanden. Durch neue Hinzugabe von Enzym-Nukleinsäure-Komplexen, welche wieder an die vorhandenen komplementären Nukleinsäure-Stränge 3' und 6' binden, kann der Biosensor auf einfache Weise regeneriert wer- den.If a sample is now passed over the biosensor containing a toxin 4, the enzyme 2 is inhibited at the measuring spot A and no increase in current at the measuring spot A can be measured. On the other hand, a current increase at measurement spot B is still measured. because the control enzyme 5 is not damaged by the toxin 4 and therefore remains active. After such contamination by a toxin 4 has been detected by the system, the enzyme 2 is often no longer usable. Now other substances are given over the biosensor, for example a substance with a certain pH or a saline solution, which leads to the melting of the enzyme-nucleic acid complexes 23 and 56. Subsequently, only the nucleic acid strands of the enzyme-nucleic acid complexes complementary nucleic acid strands 3 'and 6' are present at the two measurement spots A and B. By adding new enzyme-nucleic acid complexes, which again bind to the existing complementary nucleic acid strands 3 'and 6', the biosensor can be regenerated in a simple manner.
Insbesondere vorteilhaft bei der Erfindung ist die Tatsache, dass die Nukleinsäure-Nukleinsäure-Bindung reversibel ist. Durch die Auswahl geeigneter Parameter wie Temperatur und Io- nenstärke kann die Bindung geöffnet werden. Danach kann neues Enzym wieder angekoppelt werden, so dass insgesamt ein Biosensor mit regenerierbarer Enzym-Beschichtung entsteht. Da für die Regenerierung der Biosensor selbst nicht gewechselt werden muss und die Regenerierung nur durch die Einstellung von Temperatur und Wechsel der Lösungen über den Biosensor erfolgt, ist diese besonders einfach zu automatisieren.Particularly advantageous in the invention is the fact that the nucleic acid-nucleic acid binding is reversible. By selecting suitable parameters such as temperature and ionic strength, the bond can be opened. Thereafter, new enzyme can be coupled again, so that a total of a biosensor with regenerable enzyme coating is formed. Since the regeneration of the biosensor itself does not have to be changed and the regeneration is done only by adjusting the temperature and changing the solutions via the biosensor, this is particularly easy to automate.
Weiter ist die Verwendung der besonders stabilen Esterase 2 des Alicyclobacillus acidocaldarius vorteilhaft. Diese Este- rase mit nur einem oder wenigen Cysteinen ermöglicht die Herstellung eines Langzeit-stabilen Esterase-Nukleinsäure- Komplexes. Durch die wenigen Cysteine kann das Enzym gerichtet an die Nukleinsäure-Stränge gebunden werden, so dass sichergestellt ist, dass das aktive Zentrum des Enzyms frei zu- gänglich ist.Furthermore, the use of the particularly stable esterase 2 of Alicyclobacillus acidocaldarius is advantageous. This esterase with only one or a few cysteines makes it possible to produce a long-term stable esterase-nucleic acid complex. As a result of the few cysteines, the enzyme can be bound to the nucleic acid strands in a directed manner, so that it is ensured that the active center of the enzyme is freely accessible.
Möchte man mehrere Enzyme auf verschiedenen Messspots einsetzen, so benötigt man lediglich auf jedem Messspot einen Nuk- leinsäure-Strang mit spezifischer Sequenz und die Enzyme müssen lediglich an die entsprechende komplementäre Nukleinsäure gebunden werden. Durch Einsatz mehrerer Enzyme auf dem Biosensor kann eine Vielzahl von Substanzen auf ihre inhibitori- sehe Wirkung hin getestet werden. Die Nukleinsäure-Nuklein- säure-Bindung ermöglicht hierbei eine gerichtete Anbindung der Enzyme an genau den Positionen, an den man sie auf dem Biosensor haben möchte. Dazu müssen an verschiedenen Positionen auf dem Biosensor lediglich verschiedene Stränge von zu den Enzym-Nukleinsäure-Komplexen komplementären Nukleinsäure- Strängen immobilisiert werden.If you want to use several enzymes on different measurement spots, you only need a nuclide on each measurement spot. single-stranded acid strand with specific sequence and the enzymes need only be bound to the corresponding complementary nucleic acid. By using several enzymes on the biosensor, a variety of substances can be tested for their inhibitory effect. The nucleic acid-nucleic acid bond in this case allows a directed binding of the enzymes at exactly the positions where they would like to have them on the biosensor. For this purpose, only different strands of nucleic acid strands complementary to the enzyme-nucleic acid complexes have to be immobilized at different positions on the biosensor.
In Kombination mit der besonderen Stabilität des Enzyms wird so die Ausführung eines wartungsarmen Monitorsystems für En- zyminhibitoren ermöglicht. Durch die Verwendung eines zusätzlichen Kontrollenzyms kann außerdem die Fehleralarmsicherheit des Systems signifikant erhöht werden. In combination with the special stability of the enzyme, the execution of a low-maintenance monitor system for enzyme inhibitors is made possible. In addition, the use of an additional control enzyme can significantly increase the system's false alarm safety.

Claims

Patentansprüche claims
1. Biosensor (1) zum Detektieren von Toxinen in einer Probe mit • mindestens einem Enzym (2), welches mit einer auf die Anwesenheit mindestens eines als Enzyminhibitors wirkenden Toxins zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht wird, wobei das mindestens eine Enzym (2) eine Bindung zu einem ersten Nukleinsäure-Strang (3) aufweist, wodurch ein En- zym-Nukleinsäure-Komplex (23) gebildet wird,1. Biosensor (1) for detecting toxins in a sample with • at least one enzyme (2) which is brought into contact with a sample to be examined for the presence of at least one enzyme inhibitor acting as a toxin, wherein the at least one enzyme (2) has a bond to a first nucleic acid strand (3), whereby an enzyme-nucleic acid complex (23) is formed,
• mindestens einem ersten Messspot (A) zum Messen der Aktivität des Enzyms (2), wobei das Enzym (2) durch eine Wechselwirkung mit dem mindestens einen Enzyminhibitor (4) inhibiert wird und • an dem ersten Messspot (A) auf dem Biosensor angeordneten zum ersten Nukleinsäure-Strang (3) komplementären Nuk- leinsäure-Strängen (3' ) zur reversiblen Ankopplung des Enzym-Nukleinsäure-Komplexes (23) .At least one first measuring spot (A) for measuring the activity of the enzyme (2), wherein the enzyme (2) is inhibited by an interaction with the at least one enzyme inhibitor (4) and arranged on the first measuring spot (A) on the biosensor to the first nucleic acid strand (3) complementary nucleic acid strands (3 ') for reversible coupling of the enzyme-nucleic acid complex (23).
2. Biosensor nach Anspruch 1, bei dem der erste Nukleinsäure-Strang (3) aminomodifiziert ist und bei dem das mindestens eine Enzym (2) über eine Thiolgruppe zur Bindung an eine Ami- nogruppe des ersten Nukleinsäure-Strangs (3) verfügt.2. Biosensor according to claim 1, wherein the first nucleic acid strand (3) is amino-modified and in which the at least one enzyme (2) via a thiol group for binding to an amino group of the first nucleic acid strand (3) has.
3. Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Enzym (2) als thermostabile Esterase ausgebildet ist, insbesondere als Esterase 2 des thermophilen Eubakteriums Alicyclobacillus Acidocaldarius, wobei die thermostabile Esterase an ihrer Oberfläche mindestens ein Cystein zur Bindung an den ersten Nukleinsäure-Strang verfügt.3. Biosensor according to claim 1 or 2, wherein the enzyme (2) is formed as a thermostable esterase, in particular as esterase 2 of the thermophilic eubacterium Alicyclobacillus Acidocaldarius, wherein the thermostable esterase on its surface at least one cysteine for binding to the first nucleic acid strand features.
4. Biosensor nach Anspruch 3, bei dem die Esterase 2 an Position 118 ein Cystein statt eines Glutamats aufweist.A biosensor according to claim 3, wherein the esterase 2 at position 118 comprises a cysteine instead of a glutamate.
5. Biosensor nach Anspruch 4, bei dem die Esterase 2 an Position 97 ein Serin statt eines Cysteins aufweist. The biosensor of claim 4 wherein the esterase 2 at position 97 has a serine instead of a cysteine.
6. Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit mindestens einem Kontrollenzym (5), insbesondere einer alkalischen Phosphatase, welches ebenfalls mit einer auf die Anwesenheit mindestens eines als Enzyminhibitors wirkenden To- xins zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht wird und welches mit einem zweiten Nukleinsäure-Strang (6) einen Kon- trollenzym-Nukleinsäure-Komplex (56) bildet.6. Biosensor according to one of the preceding claims, with at least one control enzyme (5), in particular an alkaline phosphatase, which is also brought into contact with a test for the presence of at least one acting as enzyme inhibitor to xinsin sample and which with a second nucleic acid Strand (6) forms a control enzyme-nucleic acid complex (56).
7. Biosensor nach Anspruch 7, bei dem das Kontrollenzym (5) an Streptavidin gekoppelt ist und bei dem der zweite Nukleinsäure-Strang (6) zur Bildung des Kontrollenzym-Nukleinsäure- Komplexes (56) als biotinilierte Nukleinsäure (6) ausgebildet ist, wobei das Biotin mit dem Streptavidin eine nichtkovalen- te Bindung eingeht.7. Biosensor according to claim 7, wherein the control enzyme (5) is coupled to streptavidin and in which the second nucleic acid strand (6) for forming the control enzyme-nucleic acid complex (56) as biotinilated nucleic acid (6), wherein biotin enters into a non-covalent bond with streptavidin.
8. Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit mindestens einem zweiten Messspot (B) zum Messen einer Enzymaktivität des Kontrollenzyms (5), wobei an dem zweiten Messspot (B) auf dem Biosensor zum zweiten Nukleinsäure-Strang (6) komplementäre Nukleinsäure-Stränge (6') zur reversiblen Ankopplung des Kontrollenzym-Nukleinsäure-Komplexes (56) angeordnet sind.8. Biosensor according to one of the preceding claims with at least a second measuring spot (B) for measuring an enzyme activity of the control enzyme (5), wherein at the second measuring spot (B) on the biosensor to the second nucleic acid strand (6) complementary nucleic acid strands ( 6 ') for the reversible coupling of the control enzyme-nucleic acid complex (56) are arranged.
9. Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit mehreren Enzymen zur Messung unterschiedlicher Toxine, wobei jedes Enzym zur Bildung eines enzymspezifischen Enzym- Nukleinsäure-Komplexes mit einer spezifischen Nukleinsäure- Sequenz vorgesehen ist und wobei jeder enzymspezifische En- zym-Nukleinsäure-Komplex zur reversiblen Ankopplung an einen Messspot mittels einer zur spezifischen Nukleinsäure-Sequenz komplementären Nukleinsäure-Sequenz vorgesehen ist.9. Biosensor according to one of the preceding claims, comprising a plurality of enzymes for measuring different toxins, wherein each enzyme is provided for forming an enzyme-specific enzyme-nucleic acid complex with a specific nucleic acid sequence and wherein each enzyme-specific enzyme-nucleic acid complex to the reversible Coupling to a measuring spot by means of a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence is provided.
10. Verfahren zum Detektieren von Toxinen in einer Probe, bei dem • mindestens ein Enzym (2) mit einer auf die Anwesenheit mindestens eines als Enzyminhibitors wirkenden Toxins zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht wird, wobei das mindestens eine Enzym (2) mit einem ersten Nukleinsäure- Strang (3) einen Enzym-Nukleinsäure-Komplex (23) bildet,10. A method for detecting toxins in a sample, in which • at least one enzyme (2) is brought into contact with a sample to be examined for the presence of at least one enzyme inhibitor acting as a toxin, wherein the at least one enzyme (2) with a first nucleic acid strand (3) forms an enzyme-nucleic acid complex (23),
• an mindestens einem ersten Messspot (A) die Aktivität des Enzyms gemessen wird, wobei das Enzym (2) durch eine Wechselwirkung mit dem mindestens einen Enzyminhibitor (4) inhibiert wird undThe activity of the enzyme is measured at at least one first measuring spot (A), whereby the enzyme (2) is inhibited by an interaction with the at least one enzyme inhibitor (4) and
• der Enzym-Nukleinsäure-Komplex (23) reversibel an am ersten Messspot (A) auf dem Biosensor angeordneten zum ersten Nukleinsäure-Strang (3) komplementären Nukleinsäure- Strängen (3' ) angekoppelt wird.• the enzyme-nucleic acid complex (23) is reversibly coupled to nucleic acid strands (3 ') complementary to the first nucleic acid strand (3) arranged on the first measuring spot (A) on the biosensor.
11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der erste Nukleinsäure-Strang (3) aminomodifiziert ist und bei dem das mindestens eine Enzym (2) über eine Thiolgruppe an eine Aminogruppe des ersten Nukleinsäure-Strangs (3) bindet.11. The method of claim 10, wherein the first nucleic acid strand (3) is amino-modified and in which the at least one enzyme (2) via a thiol group to an amino group of the first nucleic acid strand (3) binds.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, bei dem das Enzym (2) eine thermostabile Esterase ist, insbesondere eine Esterase 2 des thermophilen Eubakteriums Alicyclobacillus acidocaldari- us, wobei die thermostabile Esterase mittels eines Cystein an den ersten Nukleinsäure-Strang bindet.12. The method of claim 10 or 11, wherein the enzyme (2) is a thermostable esterase, in particular an esterase 2 of the thermophilic eubacterium Alicyclobacillus acidocaldari- us, wherein the thermostable esterase binds by means of a cysteine to the first strand of nucleic acid.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, bei dem ein Kontrollenzym (5), insbesondere eine alkalische Phosphatase, ebenfalls mit einer auf die Anwesenheit mindestens eines als Enzyminhibitors wirkenden Toxins zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht wird und bei dem das Kontrollenzym (5) mit einem zweiten Nukleinsäure-Strang (6) einen Kontrollenzym- Nukleinsäure-Komplex (56) bildet.13. The method according to any one of claims 10 to 12, wherein a control enzyme (5), in particular an alkaline phosphatase, is also brought into contact with a test for the presence of at least one acting as an enzyme inhibitor toxin sample and in which the control enzyme (5 ) forms a control nucleic acid complex (56) with a second nucleic acid strand (6).
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, bei dem an einem zweiten Messspot (B) eine Enzymaktivität des Kontrollenzyms (5) gemessen wird, wobei an dem zweiten Messspot (B) auf dem Biosensor zum zweiten Nukleinsäure-Strang (6) komple- mentäre Nukleinsäure-Stränge (6') zur reversiblen Ankopplung des Kontrollenzym-Nukleinsäure-Komplexes (56) angeordnet sind. 14. The method according to any one of claims 10 to 13, wherein at a second measuring spot (B) an enzyme activity of the control enzyme (5) is measured, wherein at the second measuring spot (B) on the biosensor to the second nucleic acid strand (6) komple - Nucleic acid nucleic strands (6 ') for the reversible coupling of the control enzyme-nucleic acid complex (56) are arranged.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, mit mehreren Enzymen zur Messung unterschiedlicher Toxine (4), wobei jedes Enzym einen enzymspezifischen Enzym-Nukleinsäure- Komplexes mit einer spezifischen Nukleinsäure-Sequenz bildet und wobei jeder enzymspezifische Enzym-Nukleinsäure-Komplex reversibel an einen Messspot mittels einer zur spezifischen Nukleinsäure-Sequenz komplementären Nukleinsäure-Sequenz ankoppelt .15. The method according to any one of claims 10 to 14, comprising a plurality of enzymes for measuring different toxins (4), wherein each enzyme forms an enzyme-specific enzyme-nucleic acid complex with a specific nucleic acid sequence and wherein each enzyme-specific enzyme-nucleic acid complex is reversible couples a measuring spot by means of a nucleic acid sequence complementary to the specific nucleic acid sequence.
16. Verwendung eines Biosensors nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Untersuchen einer Probe auf Gift/e.16. Use of a biosensor according to one of claims 1 to 9 for examining a sample for poison / e.
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Wasser ist, vorzugsweise Trinkwasser, Klärwasser, Oberflächenwasser, Brunnenwasser, Ballastwasser von Schiffen und/oder Kühlwasser.17. Use according to claim 16, characterized in that the sample is water, preferably drinking water, sewage water, surface water, well water, ballast water of ships and / or cooling water.
18. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ein Nahrungsmittel ist.18. Use according to claim 16, characterized in that the sample is a foodstuff.
19. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ein Gas ist, vorzugsweise Luft.19. Use according to claim 16, characterized in that the sample is a gas, preferably air.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das/die Gift/e aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, bestehend aus Pestiziden, biologischen Kampfstoffen, chemischen Kampfstoffen und Schwermetallen. Use according to any one of claims 16 to 19, characterized in that the poison (s) is / are selected from the group consisting of pesticides, biological agents, chemical warfare agents and heavy metals.
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