WO2010118547A1

WO2010118547A1 - Proteína de inmunocastración de mamíferos

Info

Publication number: WO2010118547A1
Application number: PCT/CL2010/000014
Authority: WO
Inventors: Leonardo Enrique Saenz Iturriaga
Original assignee: Universidad De Chile
Priority date: 2009-04-15
Filing date: 2010-04-14
Publication date: 2010-10-21
Also published as: PL2431052T3; ES2467702T3; BRPI1005349A2; DK2431052T3; AR075953A1; DK2431052T5; EP2431052A1; CL2009000900A1; EP2431052B1; US20120093846A1; BRPI1005349B1; US8940693B2

Abstract

Proteína de fusión que incorpora la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH) para la immunocastración de mamíferos, secuencias de ADN que codifican dicha proteína de fusión, vacuna que comprende dicha proteína de fusión, y procedimiento para preparar la proteína de fusión. La proteína de fusión incorpora la secuencia aminoacídica de la GnRH fusionada a una secuencia de acuerdo a la SEQ ID No. 14, no derivada de patógeno, con capacidad inmunogénica y que contiene sitios de O-glicosilación.

Description

PROTEINA DE INMUNOCASTRACION DE MAMÍFEROS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con el campo de la Ingeniería Genética y la Biotecnología, y en particular con el uso de un polipéptido que incorpora la secuencia aminoacidica de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I) para la inmunocastración de mamiferos .

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

El polipéptido del presente invento es un polipéptido quimérico o glicopéptido, formado por la fusión de la secuencia aminoacidica de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I) o sus variantes, y una secuencia teórica no derivada de patógeno que mejora la inmunogenicidad de GnRH. La presente proteina de fusión, su versión glicosilada, asi como sus repeticiones en tándem, pueden ser utilizadas, en conjunto con distintos tipos de adyuvantes para la inmunoneutralización de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I) generando un bloqueo de la esteroidogénesis, ovogénesis y espermatogénesis en distintas especies animales.

COMENTARIOS DEL ARTE PREVIO

Las capacidades reproductivas de ambos sexos en la mayoría de las especies animales, sufren fluctuaciones cíclicas temporales gracias a los efectos que generan las hormonas sexuales sobre gónadas y sistema reproductor en general. La hormona liberadora de gonadotrofinas o GnRH juega un rol central en este proceso.

La hormona GnRH-I es un decapéptido que posee una secuencia de aminoácidos evolutivamente muy conservada y común para la mayoría de los mamíferos. GnRH-I es liberada desde la porción mesiobasal del hipotálamo e ingresa al torrente sanguíneo, donde en la hipófisis induce la liberación de LH y FSH desde células gonadotrofas . Por varios años se ha tratado de generar inmunoneutralización de la hormona GnRH como control de la esteroidogénesis, ovogénesis y espermatogénesis. El bloqueo de GnRH y la concomitante disminución en los niveles de gonadotrofinas tiene variadas aplicaciones, es asi que en medicina humana la disminución en la producción de andrógenos de pacientes con carcinoma prostático ha sido blanco de tratamiento por varios años. Por otro lado, en medicina veterinaria el bloqueo de la capacidad reproductiva con mínimos efectos secundarios de animales de compañía o especies silvestres que puedan significar plagas, ha sido un amplio tema de investigación y desarrollo. En el ámbito de la producción animal, la castración quirúrgica de machos es un procedimiento rutinario para evitar un comportamiento sexual agresivo o evitar que la carne adquiera características organolépticas indeseables por el efecto de feromonas. En todos estos escenarios, la utilización de una vacuna capaz de bloquear la función de la hormona GnRH-I constituye una importante herramienta.

El efecto de diferentes vacunas contra la hormona GnRH ha sido evaluado en un gran número de especies animales, utilizando un variado tipo de moléculas asociadas a GnRH en conjunto con distintos tipos de adyuvantes. La mayoria de éstos enfoques se basan en la síntesis química de haptenos uniendo GnRH a una molécula altamente inmunogénica como albúmina bovina (BSA) , ovalbumina (OVA) , toxoide tetánico (TT) o hemocianina (KLH) (Sad, Chauhan et al. 1993; Beekman, Schaaper et al. 1999; Dunshea, Colantoni et al. 2001; Miller, Gionfriddo et al. 2008) . Sin embargo, un fenómeno de dominancia antigénica ha sido descrito, en la cual estas proteínas "carrier" suprimen la respuesta hacia epitopes de la molécula de interés luego de sucesivas inmunizaciones, en un mecanismo de tolerancia al antigeno GnRH(Sad, Gupta et al. 1991; Sad, Gupta et al. 1991; Sad, Talwar et al. 1991) . La supresión de epitopes puede ser resultado de un defecto en la presentación del hapteno por linfocitos B específicos desarrollando una respuesta inmune de tipo "helper" 2 (Th2) (Renjifo, WoIf et al. 1998) . La exclusión de epitopes con alta antigenicidad, como ha sido planteado en el presente invento, reduce el riesgo de supresión antigénica y favorece una respuesta inmune a favor del antigeno GnRH, lo que permite su utilización en repetidas inmunizaciones eficientemente. Otros impedimentos al utilizar el modelo de proteínas "carrier", es el alto costo en síntesis y conjugación de los antigenos.

La tecnología de ADN recombinante ha sido usada para crear moléculas de GnRH repetidas en tándem, unidas a diferentes secuencias proteicas como inmunógenos para linfocitos T helper (Hannesdottir, Han et al. 2004; Jinshu, Jingjing et al. 2004; Khan, Ferro et al. 2007; Zhang, Xu et al. 2007; Khan, Ogita et al. 2008) . Proteínas recombinantes con múltiples insertos de GnRH han demostrado que la inmunogenicidad se ve incrementada con el numero de secuencias GnRH insertadas [15], y puede utilizar esta ventaja al incorporar un mayor número de repeticiones del péptido de fusión en la formulación. Múltiples epitopes de células B o T como lipopéptidos (Pam3Cys) o diferentes secuencias peptidicas de patógenos como Plasmodium falsiparum, Mycobacterium, virus respiratorio sinsicial o virus influenza, flanqueando secuencias de GnRH han sido utilizados en variados modelos "vaccinales" y han demostrado efectividad (Khan, Ferro et al. 2007) . En relación a esto, el presente antigeno no incorpora secuencias de patógenos que puedan interferir en el desencadenamiento de una respuesta inmune contra la secuencia de GnRH, ya que la secuencia intergénica utilizada entre las repeticiones de GnRH se ha diseñado para mejorar la antigenicidad de la secuencia de GnRH.

En este sentido, el documento US 2005/0239701 Al está dirigido al uso como vacuna de multimeros de GnRH unidos a proteínas "carrier" o fragmentos de ellas como toxinas bacterianas, y al uso de vectores recombinantes que incorporan secuencias genéticas que codifican para multimeros de GnRH, solos o en combinación con secuencias genéticas que codifican proteínas "carrier" tales como el fragmento de toxina tetánica C. Dichos vectores recombinantes están dirigidos a modificar la conducta sexual, la fertilidad o ambos, en vertebrados por medio de la inducción de una respuesta inmune que altera la función sexual fisiológica normal. El presente invento no incorpora secuencias génicas o peptidicas de proteínas "carrier", ni tampoco corresponde a multimeros de GnRH solos, ya que incorpora una secuencia intergénica no asociada a patógenos o proteínas "carrier" que funciona mejorando la inmunogenicidad de GnRH como antigeno, además esta secuencia posee la potencialidad de ser glicosilada cuando la proteina recombinante se expresa en sistemas eucariontes capaces de realizar modificaciones post- traduccionales a las proteínas.

La publicación internacional WO 01/85763 divulga péptidos quiméricos con eficacia inmunogénica que comprenden la secuencia de la hormona GnRH y mezclas de epitopes para células T "helper" obtenidos desde diferentes patógenos o péptidos con inmunogenicidad conocida como la toxina tetánica, Plasmodium falciparum, o la proteina F del virus del Sarampión, para la producción de títulos de anticuerpos anti-GnRH.

En general, la mayoría de las publicaciones en que se divulga la utilización de proteínas de fusión, el método se enfoca a la utilización de secuencias de patógenos que funcionan como epitopes de linfocito T-Helper, unidos a distinto número de repeticiones de GnRH o como en el caso de una síntesis química las repeticiones de GnRH unidas a una molécula inmunogénica per se. Ejemplo de esto es el documento "Use of recombinant gonadotropina-releasing hormone antigens for immunosterilizacion of beef heifers", Journal of Animal Science, 2006; 84(2): 343- 50, Geary TW, Grings EE, MacNeil MD, de Avila DM, Reeves JJ.

Un gran número de estudios se han realizado en cerdos y ganado para investigar el uso de la inmunización contra GnRH como método para mejorar la tasa de crecimiento y el producto cárneo obtenido de los animales. Ver por ejemplo, Adams and Adams, J. Animal Sci. (1992) 70:1691-1698; Caray and Bonneau, CR. Acad. Sc. Paris (1986) 303:673-676; Chaffaux et al, Recueil de Medicine Veterinaire (1985) 161:133-145; Finnerty et al., J. Repro. Fértil. (1994) 101:133-343. La castración elimina la fuente de esteroides anabólicos endógenos y la conversión alimenticia se torna menos eficiente, los animales necesitan comer más para generar canales del mismo peso y producen mayor cobertura grasa. En este sentido, se ha demostrado que el crecimiento de un animal entero es más eficiente que el de un animal castrado. La presencia de esteroides sexuales en el animal actúan como anabólicos naturales, permitiendo que este animal tenga un mejor desempeño en crecimiento y desarrollo muscular, gracias a una mejora sustancial en la eficiencia de conversión alimenticia. La mejor eficacia en la conversión alimenticia, tiene además implicaciones ambientales positivas a nivel mundial ya que se traduce en un menor consumo de alimento con menos presión para las tierras agrícolas y reducción en la producción de desechos, promueve una industria más sustentable usando menos alimento y generando menos desechos por cada kilogramo de carne producido. El objetivo de muchos de estos estudios ha sido el permitir a los animales crecer como machos en forma intacta aproximándose al final de la etapa de engorda, para luego someterlos a una castración inmunológica. El uso de vacunas anti-GnRH ha sido propuesto como una alternativa viable para mantener en producción machos sin castrar, los cuales son vacunados al final de la etapa productiva, permitiendo la metabolización de las hormonas sexuales y su olor asociado. Varias patentes se encuentran adjudicadas, las cuales abordan esta problemática (US Pat. No 4.975.420 1990; US Pat . No. 6.045.799 2000; US Pat. No. 6.761.890 Bl 2004; entre otras) sin embargo, en ellas las moléculas utilizadas como antigenos son conjugaciones químicas de la secuencia aminoacidica de la hormona GnRH a una molécula "carrier". En este sentido, la solicitud de patente US 2005/0239701 Al protege el uso de un esquema de vacunación a dos dosis 4 a 8 semanas antes del sacrificio del animal para asegurar la efectividad de la vacuna, por un corto periodo de tiempo, esto limita la aplicación de vacunas contra GnRH en las cuales su efectividad sea escasa y que necesiten revacunaciones para lograr los títulos de anticuerpos neutralizantes para bloquear el efecto hormonal.

De esta misma forma, los siguientes artículos científicos también se relacionan con la conjugación de la secuencia GnRH y una molécula "carrier" :

Beekman, N. J-, W. M. Schaaper, et al. (1999). "Highly immunogenic and fully synthetic peptide-carrier constructs targeting GnRH." Vaccine 17 (15-16): 2043-50. Indica que para usar péptidos como vacunas sintéticas tienen que ser acopladas a una proteina "carrier" para hacerlas más inmunogénicas . Sin embargo, la eficiencia del acoplamiento entre la proteina "carrier" y una proteina es dificil de controlar con respecto a la densidad de carga del péptido. Esto hace que estas proteinas "carrier" sean poco adecuadas en la práctica. Se han reportado intentos por encontrar moléculas "carrier" o sistemas de entrega que permiten un acoplamiento fácil o la incorporación de péptidos, densidad de carga reproducible y productos bien definidos . Los autores han comparado varias construcciones prometedoras o sistemas de entrega por inmunización de cerdos macho utilizando un péptido GnRH en tándem como construcción polilisina ramificada, un lipo-tioéster, una lipo-amida o un conjugado KLH en CFA, y el péptido lipoamida en un complejo inmunosimulador (ISCOM) . Los autores encontraron que las construcciones de lipo-tioéster y de polilisina ramificada constituian las moléculas "carrier" más efectivas para la inducción de anticuerpos contra GnRH e inmunocastración en cerdos .

Khan, M. A., K. Ogita, et al. (2008). "Immunisation with a plasmid DNA vaccine encoding gonadotrophin releasing hormone (GnRH-I) and T-helper epitopes in saline suppresses rodent fertility." Vaccine 26 (10): 1365-74. Plantea que la investigación en inmunización activa contra la hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH-I) ha ganado aceptación como medio para controlar la reproducción y comportamiento en animales de corral, compañía o salvajes. Muchos estudios describen el uso de múltiples copias del mismo péptido en alineación y conjugación con una proteina "carrier" mayor para aumentar la respuesta inmune del péptido. Sin embargo, los problemas que resultan de la supresión del epitope de la proteina "carrier" han disminuido el interés en el uso de materiales genéticos que inicien una óptima repuesta inmune. En el estudio realizado por los autores, una vacuna de 533 bases de pares de ADN fue construida en pcDNAV5-HisB codificando para 18,871 kDa GnRH-I-T-helper-V5 epitopes de proteínas de fusión. Se encontraron células transfectadas COSÍ con la construcción de vacuna que liberan proteina de fusión en el sobrenadante de cultivo. La construcción de vacuna (100 μg/ratón) en solución salina administrada en el músculo cuádriceps anterior de ratas ICR machos y hembras estimuló la respuesta al anticuerpo IgG antigeno especifico. Los niveles de testosterona en los machos vacunados se redujeron significativamente (p = 0,021) . Se notó una reducción significativa en los implantes uterinos después del apareamiento entre machos inmunizados y hembras control (p = 0,028) como también en hembras inmunizadas y machos control (p = 0,004). El examen histológico de las gónadas tanto de los machos como de las hembras en estudio en la semana 13 mostró atrofia del epitelio seminifero y supresión de foliculogénesis .

Miller, L. A-, J. P. Gionfriddo, et al. (2008) . "The single- shot GnRH immunocontraceptive vaccine (GonaCon) in White-tailed deer: comparison of several GnRH preparations. " Am J Reprod Immunol 60 (3): 214-23. Indica que el problema es la necesidad de una inyección de un agente GnRH contraceptivo que sea única, efectiva, multi-anual para controlar la reproducción en la población sobre abundante de venado de cola blanca. El método de estudio en esta investigación se relaciona con dos conjugados GnRH, GonaCon (GnRH-KLH) v GonaCon-B (proteina GnRH-Blue®) , que fueron preparados en emulsión como formulaciones de vacuna inmunocontraceptivas de una inyección y dos inyecciones. Además, el conjugado de proteina GnRH-KLH fue liofilizado y suspendido en adyuvante AdjuVac para producir una formulación de quinta vacuna. Cada formulación fue administrada a un grupo de cinco venados de cola blanca hembra adulto cautivas. El desempeño reproductivo de las hembras tratadas fue monitoreado por 5 años para determinar la eficacia comparativa de los distintos tratamientos. El resultado obtenido del estudio indica que la longevidad de la respuesta contraceptiva (2 a 5 años) fue influenciada fuertemente por el diseño del antigeno conjugado, el adyuvante utilizado, y la forma de entrega de la vacuna. Los autores concluyeron que las formulaciones de una y dos inyecciones de GonaCon y GonaCon-B produce contracepción multi- anual en venado de cola blanca hembra adulto. GonaCon-B produce un efecto contraceptivo más duradero.

Sad, S., V. S. Chauhan, et al. (1993). "Synthetic gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) vaccines incorporating GnRH and synthetic T-helper epitopes." Vaccine 11 (11): 1145-50. Se refiere al desarrollo de una vacuna contra la hormona que libera la gonadotrofina (GnRH) como método inmunológico para el tratamiento de hipertrofia prostética, basándose en la observación de que la inmunización activa contra GnRH lleva a la producción de anticuerpos anti-GnRH que resultan en la disminución de la glándula prostética . Los autores han investigado la regulación de las respuestas anticuerpo anti-GnRH por las moléculas "carrier". En estudios previos, los autores han demostrado que el uso de moléculas de grandes proteínas como "carriers" limita el uso de tales vacunas debido a los problemas potenciales de la supresión anti-haptenica inducida por el carrier. En este estudio, los autores demuestran que los epitopes T-helper sintéticos pueden ser utilizados como "carriers" para la generación de respuesta de anticuerpos anti- GnRH.

Sin embargo, de acuerdo al presente invento, el uso de adyuvantes inmunopotenciadores ha permitido lograr efectos "vaccinales" de largo plazo utilizando una sola dosis de vacuna, por lo tanto, utilizando el antigeno del presente invento en distintas formulaciones permite modificar el esquema de vacunación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Muestra la respuesta inmune contra la proteina recombinante denominada GnRXG/Q, del presente invento, medida mediante la técnica de ELISA, como un alza de inmunoglobulinas IgG, en los animales vacunados versus el control, observadas como densidad óptica especificas contra el péptido recombinante GnRXG/Q en animales inmunizados, utilizando un adyuvante acuoso en la formulación. La dilución de suero utilizada fue de 1:250 y el tamaño de la muestra de 10 individuos por grupo. Los animales fueron inmunizados al dia 0 y 15. En la Figura 1 -M- corresponde a Control PBS y -A- corresponde a GNRXG/Q + Adyuvante .

Figura 2. Muestra la disminución en la concentración sérica de testosterona, medida mediante la técnica de ELISA, en animales inmunizados con la proteina recombinante denominada GnRXG/Q, del presente invento, versus control a los dias 0 y 15 en un número de 10 individuos por grupo. En la Figura 2 -M- corresponde a Control PBS y -A- corresponde a GNRXG/Q + Adyuvante .

Figura 3. Muestra la respuesta inmune contra la proteina recombinante denominada GnRXG/Q, del presente invento, como un alza de inmunoglobulinas especificas, medida mediante la técnica de ELISA, utilizando diferentes adyuvantes en la formulación, en un ensayo de 15 semanas. Los animales (n=5) fueron inmunizados al dia 0 y 30 y el alza en inmunoglobulinas se evaluó hasta el dia 110. En la Figura 3 -M- corresponde a control PBS, -A- corresponde a GNRXG/Q + Chi-H MW, -Δ- corresponde a GNRXG/Q + Chi-L MW, y -•- corresponde a GNRXG/Q + CFA.

Figura 4. Muestra la atrofia testicular provocada por la inmunización con la proteina recombinante denominada GnRXG/Q, del presente invento y un adyuvante en su formulación. En A se observan testiculos de un ratón control (1) y de un ratón inmunizado con el péptido GnRX G/Q (2) en la parte inferior de la fotografia se observa una escala en centímetros; en B se observan cortes histológicos de los testiculos bajo dos nivel de amplificación .

Figura 5. Muestra la disminución en la concentración de testosterona sérica, medida mediante la técnica de ELISA, en caninos inmunizados con el péptido recombinante denominada GnRXG/Q, del presente invento, en asociación con un adyuvante. Los animales (n=7) fueron inmunizados al dia 0 y 30 y se evaluó el efecto de la vacuna durante 3 meses .

Figura 6. GeI de poliacrilamida SDS al 10% donde se muestra la proteina recombinante denominada GnRX G/Q, del presente invento, repetida en tándem, purificada desde un extracto total de proteínas bacterianas, con un peso aproximado de 29 kiloDalton

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El presente invento comprende el diseño, la expresión y la purificación de la siguiente proteina recombinante (Secuencia SEQ ID No.1 y Secuencia SEQ ID No.2, ver listado de secuencias) con una estructura primaria que incorpora la secuencia aminoacidica de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I) fusionada a una secuencia teórica glicosilable y con actividad inmunogénica, que no incluye secuencias de patógenos o de proteinas "carrier" en su estructura.

En las secuencias SEQ ID No.1 y SEQ ID No.2, se observa en negrita la secuencia peptidica de la hormona GnRH-I de 10 aminoácidos, fusionada a la secuencia teórica glicosilable de 14 aminoácidos, este péptido quimérico de 24 aminoácidos ha sido denominado GnRX G/Q.

Otro aspecto de la invención comprende la vacuna que comprende el péptido denominado GnRX G/Q, para ser utilizado solo o en una repetición en tándem, el procedimiento para producir la vacuna, su uso y método para la inmunocastración de mamiferos .

La secuencia "teórica" puede estar flanqueando la secuencia de GnRH-I en cualquier orden (extremo amino o carboxilo del péptido, Secuencia SEQ ID No. I y SEQ ID No.2) .

Otro aspecto de la invención comprende el constructo, ver secuencia SEQ ID No.3 y SEQ ID No.4 del listado de secuencias, formado por el péptido quimérico GnRX G/Q repetido en tándem 10 veces y que se observa como proteina recombinante migrando electroforáticamente en un gel de SDSPAGE al 10 % en la figura 6.

Otro aspecto de la invención comprende secuencias nucleotidicas y los correspondientes vectores. Las secuencias nucleotidicas fueron diseñadas por genética inversa para ser utilizadas como templados en la expresión recombinante del péptido GnRX G/Q, las que fueron insertadas en vectores de expresión procariontes y eucariontes (secuencias SEQ ID No.5 y SEQ ID No.6, ver listado de secuencias), resultando la proteina de la secuencia SEQ ID No.7 (ver listado de secuencias) que se indica en el listado se secuencias .

La presente proteina ha sido concebida como una proteina de fusión recombinante o quimérica, en la cual se puede encontrar la secuencia aminoacidica de GnRH como un porcentaje de la molécula total (40%), el porcentaje restante (60%) corresponde a una secuencia diseñada a partir del análisis bioinformático de distintos péptidos, diseñándose una secuencia única que permite mejorar la inmunogenicidad del segmento correspondiente a la secuencia de GnRH, evitando la incorporación de segmentos inmunodominantes como inmunogenos derivados de patógenos, toxinas o proteinas "carriers", lo que la diferencia de otras moléculas patentadas en el arte previo.

La secuencia diseñada posee una notable hidrofobicidad e incorpora una secuencia consenso que puede ser O-glicosilada en sistemas de expresión proteica eucarionte como levaduras o células de insecto. Esta modificación está orientada a mejorar la antigenicidad del péptido para aumentar la capacidad de ser reconocida por el sistema inmune. Además, la incorporación de este segmento glicosilable diferencia la presente proteina de otras proteinas de fusión, que incorporan GnRH, al tratarse el presente glicopeptido de un proteoglicano. En consecuencia, el sistema inmune reconocerá integramente la molécula como un hapteno y no solamente a un segmento inmunogénico de ésta. Otro aspecto de la invención comprende el procedimiento para preparar la proteina de fusión, donde la secuencia nucleotidica que codifica para la proteina recombinante (secuencia SEQ ID Nos. 5 y 6) ha sido insertada en un vector de expresión con promotor inducible para bacterias E. coli B121 (pQE 801, Qiagen) o un vector con promotor inducible para levaduras S. serveciae (pYES, invitrogen) . La proteina ha sido purificada mediante cromatografia de afinidad en columnas de Ni sefarosa, lo que permite eliminar posibles contaminantes del sistema de expresión, principalmente pirógenos, tales como (Lipopolisacarido (LPS) .

Esta secuencia "teórica" ha sido diseñada utilizando los siguientes 10 algoritmos bioinformaticos que evalúan las propiedades de hidrofobicidad, hidrofilicidad y antigenicidad de una secuencia peptidica: 1) Algoritmo de Hidrofobicidad Fauchere-Pliska, el cual genera un perfil de propiedades utilizando una escala de hidrofobicidad basada en particiones experimentales octanol/agua de amidas de N-acetil aminoácidos de cada residuo a pH neutro; 2) Algoritmo de hidrofilicidad de Goldman/Engelman/Steitz, el cual genera un perfil de propiedades calculando los residuos no polares en α-helices; 3) algoritmo de hidrofobicidad de Janin, el que genera un perfil de propiedades de hidrofobicidad basado en la fracción molar de ocurrencias de residuos ocultos o expuestos en proteinas conocidas; 4) algoritmo de hidrofobicidad de Kyte Doolittle, el que genera un perfil de propiedades de hidrofobicidad e hidrofilicidad basado en valores de kyte doolittle para residuos individuales en regiones internas o externas de una proteina globular; 5) Algoritmo de hidrofobicidad de Manavalan, el que genera un perfil de propiedades basado en la hidrofobicidad de un residuo individual modificado por la presencia de otros residuos en un radio de 8 angstom; 6) Algoritmo de hidrofilicidad de von Heijne, el que genera un perfil de propiedades usando una escala que refleja la energía libre de transferencia estimada cuando una α-helice se mueve de una fase acuosa a una no polar; 7) algoritmo de antigenicidad de Hopp and Woods, la escala de Hopp- Woods fue diseñada para predecir la localización de determinantes antigénicos en una proteina, asumiendo que estos están expuestos en la superficie de una proteina y se localizan donde existen regiones hidrofilicas; 8) algoritmo de antigenicidad de Parker, esta herramienta predice la presencia de determinantes antigénicos por la presencia de áreas de gran hidrofobicidad local usando una escala basada en los tiempos de retención en HPLC de péptidos modelos; 9) Algoritmo de antigenicidad de Protrusion Index, esta herramienta genera un perfil de propiedades utilizando un Índice de protrusión que es una escala de antigenicidad basada en el estudio de proteínas con estructura 3D conocida; y 10) algoritmo de antigenicidad de Welling, esta herramienta calcula un valor de antigenicidad como el log del cociente entre el porcentaje de una muestra con conocidas regiones antigénicas y el porcentaje de proteínas promedio .

Diferentes secuencias aminoacidicas fueron evaluadas en su potencial capacidad de mejorar la antigenicidad e hidrofilicidad de la secuencia para GnRH-I cuando se encuentran fusionadas en el extremo amino o carboxilo terminal de GnRH, asi como en repeticiones en tándem, comparándola con una secuencia de GnRH-I repetida en tándem sin la presencia de secuencias intergénicas . Utilizando los parámetros antes mencionados, se diseño la secuencia aminoacidica NH₂-GPPFSGGGGPPFSA-COOH, la cual presenta un score de hidrofobicidad en la mayoría de los algoritmos, superior a 0 y mayor que el de la secuencia GnRH-I. Del mismo modo por su condición hidrofóbica, presenta una escasa antigenicidad permitiendo, al analizar la molécula global, que la antigenicidad de la secuencia GnRH-I mejore considerablemente comparada con una secuencia de GnRH-I repetida en tándem sin secuencias intergénicas. En su diseño se incorporó la secuencia señal consenso SGGG, que corresponde a un sitio de O- glicosilación, el cual es susceptible de recibir esta modificación postraduccional cuando la proteina es expresada en levaduras u otras células eucariontes . Este tetrapeptido que posee la secuencia general Ser-Gly-Xaa-Gly (donde Xaa puede ser cualquier aminoácido) corresponde a un sitio de reconocimiento para la incorporación de un glicosaminoglicano (Burdon M. , et al., 1987) . Por último en el diseño de esta secuencia se consideró la exclusión de similitudes con secuencias de patógenos o proteínas "carrier" . Para esto, se realizó un análisis de búsqueda y alineamiento de esta secuencia con bases de datos presentes en GenBank utilizando la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search ToIl. En ninguna de ellas se encontró la secuencia la y Ib de la presente invención.

Para la fabricación y expresión de la proteina recombinante, la secuencia nucleotidica de doble hebra fue ligada para lograr repeticiones en tándem, y posteriormente, insertada en vectores de expresión procarionte y eucarionte inducibles por IPTG o glucosa. La proteina recombinante obtenida posee un tag de 6 repeticiones de histidina, lo que permite su purificación desde otras proteínas endógenas del hospedero por medio de cromatografía de afinidad con niquel o cobalto .

Otro aspecto de la invención comprende las secuencias nucleotidicas en las cuales se varia el codón a utilizar en la traducción, los cuales pueden generar el mismo péptido quimérico, como se observan en las secuencias SEQ ID Nos.8-13 del listado de secuencias.

Antecedentes Técnicos de la Invención

Para probar la efectividad de la proteina del presente invento, específicamente aquella de la Secuencia SEQ ID No.7 en su capacidad de bloquear la esteroidogénesis, ovogénesis y espermatogénesis en animales de laboratorio, a través de la inmunoneutralización de GnRH, la proteina generada y purificada antes mencionada ha sido inoculada en animales de laboratorio en cantidades de 50 a 500 μg en un adyuvante oleoso, particularmente el Adyuvante completo o incompleto de Freund o un adyuvante experimental, específicamente quitosano, analizándose distintos parámetros como son la capacidad de los animales de formar anticuerpos contra la proteina, su actividad reproductiva, espermatogénesis, ovogénesis y niveles de andrógenos . Experimento 1

La molécula como vacuna fue probada en un tamaño muestral de 18 animales de laboratorio obteniéndose con diferencias significativas (p<0,01) en cuanto a efecto fisiológico esperado y respuesta inmune adaptativa con el grupo control, utilizando distintos adyuvantes. (Ver Figura 1 a 4) .

Diez ratones macho de 8 semanas de edad fueron inmunizados con 100 μg de la proteina recombinante GnRX G/Q (secuencia SEQ ID No.7) en 100 μl de un adyuvante comercial, particularmente Adyuvante completo de Freund, a los dias 0 y 15 por via subcutánea. Se extrajo sangre de los animales cada 15 dias para evaluar la efectividad de la vacuna y su capacidad para elevar títulos de inmunoglobulinas contra la hormona GnRH-I. En la Figura 1 se observa el alza en los niveles de inmunoglobulinas específicos contra la hormona GnRH-I, medida mediante la técnica de ELISA, de los animales inmunizados, en relación al control. En la Figura 2 se observa la caida en los niveles de testosterona sérica, medida mediante la técnica de ELISA, de los animales inmunizados con la proteína recombinante GnRX G/Q antes mencionada comparados con un grupo control. Al finalizar el ensayo los animales fueron sacrificados y ambos testículos fueron comparados macroscópica y microscópicamente con un grupo de animales control (Fig 4.) .

Experimento 2

Quince ratas macho de 8 semanas de edad, fueron inmunizadas con 100 μg de la proteína recombinante GnRX G/Q en 200 ul de un adyuvante comercial, específicamente Adyuvante completo de Freund, y 2 adyuvantes experimentales, particularmente Quitosano de alto y bajo peso molecular, al 0,5% v/v, a los dias 0 y 30 de experimentación. Se extrajo sangre de los animales cada 15 dias, evaluando el efecto de la vacuna en el alza de inmunoglobulinas especificas contra la hormona GnRH-I en el tiempo medida mediante la técnica de ELISA (Fig 3) .

Experimento 3

Siete caninos machos adultos mestizos, fueron inmunizados con 200 μg de la proteina recombinante GnRX G/Q (secuencia SEQ ID No.7) en 1 mi de un adyuvante comercial, particularmente Adyuvante incompleto de Freund, a los dias 0 y 30. Se extrajo sangre de los animales cada 30 dias para evaluar el efecto de la vacuna en los niveles plasmáticos de testosterona. En la figura 5 se observa la caida en los niveles de testosterona en el tiempo a valores cercanos a la castración quirúrgica (0,1 ng/ml) , medida mediante la técnica de ELISA.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Proteina de fusión para inmunocastración, en donde la secuencia aminoacidica primaria de la hormona liberadora de gonadotrofinas fusionada a una secuencia teórica no derivada de patógeno, con capacidad inmunogénica que contiene sitios de O- glicosilación de acuerdo a las secuencias SEQ ID Nos.l y 2.

2.- Una proteina de fusión acuerdo a la reivindicación 1, que está formada por una o más repeticiones de la proteina de fusión de la reivindicación 1 y comprende la siguiente secuencia SEQ NO.7.

3.- Una proteina de fusión de acuerdo a la reivindicación 2, que es una glicoproteina.

4. - Una proteina de fusión de acuerdo a la reivindicación 1, que comprende la secuencia teórica SEQ ID No.14.

5. - Una proteina de fusión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende la secuencia señal SGGG, correspondiente a un sitio de O-glicosilación, capaz de recibir la modificación postraduccional cuando la proteina es expresada en levadura u otras células eucariontes .

6. - Una proteina de fusión de acuerdo a cualquiera de las

HOJA DE REEMPLAZO (Regia 26)

6. - Una proteina de fusión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que es una proteina de fusión recombinante o quimérica, en la cual la secuencia aminoacidica de GnRH corresponde al 40% de la molécula total y la secuencia teórica corresponde al 60% de la molécula total.

7. - Una proteina de fusión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que no comprende segmentos inmunodominantes como inmunógenos derivados de patógenos, toxinas o proteinas "carriers" .

8. - Secuencias de ADN que codifican la proteína de acuerdo a la reivindicación 1, así como sus variantes genéticas que contengan codones optimizados que den origen a dichas secuencias SEQ ID Nos.8-13.

9. - Vacuna que comprende la proteína de fusión acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y uno o más adyuvantes veterinariamente o farmacéuticamente aceptables.

10.- Vacuna que comprende las secuencias nucleotídicas que codifican las proteínas de fusión de acuerdo a cualquiera de las proteínas de las reivindicaciones 1 a 7 y uno o más adyuvantes veterinariamente o farmacéuticamente aceptables.

11.- La vacuna de acuerdo a las reivindicaciones 9 y 10, que comprende entre 50-500 μg de la proteína recombinante GnRX G/Q.

12.- La vacuna de acuerdo a la reivindicación 11, que comprende entre 100-200 μg de la proteina recombinante GnRX G/Q.

13.- La vacuna de acuerdo a la reivindicación 12, que comprende 100 μg de la proteina recombinante GnRX G/Q.

14.- La vacuna de acuerdo a la reivindicación 12, que comprende 200 μg de la proteina recombinante GnRX G/Q.

15.- La vacuna de la reivindicación 13, que además comprende 100 μl de un adyuvante comercial.

16.- La vacuna de la reivindicación 13, que además comprende 200 μl de un adyuvante comercial.

17.- La vacuna de la reivindicación 14, que además comprende 1 mi de un adyuvante comercial.

18.- La vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9, 10, 13 y 15, que comprende 100 μg de la proteina recombinante GnRX G/Q en 100 μl de un adyuvante comercial.

19.- La vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9, 10, 13 y 16, que comprende 100 μg de la proteina recombinante GnRX G/Q en 200 μl de un adyuvante comercial.

20.- La vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9, 10, 14 y 17, que comprende 200 μg de la proteina recombinante GnRX G/Q en 1 mi de un adyuvante comercial.

21.- La vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 ó 15-20, en donde dicho adyuvante es el adyuvante completo o incompleto de Freund.

22.- Uso de la vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9-21, que sirve para la inmunocastración de mamíferos.

23.- Uso de la vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9-21, que sirve para preparar composiciones para la inmunocastración de mamíferos .

24.- Procedimiento para producir una vacuna de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9-21, que comprende mezclar la proteina de la reivindicación 1 con uno o más adyuvantes veterinariamente o farmacéuticamente aceptables .

25.- Procedimiento para preparar una proteina de fusión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende fusionar la secuencia aminoacidica de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I) con una secuencia teórica glicosilable y con actividad inmunogénica, que no incluye secuencias de patógenos o de proteínas "carrier" en su estructura.

26.- Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 25, que comprende diseñar la secuencia teórica a partir de análisis bioinformático usando los siguientes 10 algoritmos que evalúan las propiedades de hidrofobicidad, hidrofilicidad y antigenicidad de una secuencia peptídica: 1) algoritmo de Hidrofobicidad Fauchere-Pliska; 2) algoritmo de hidrofilicidad de Goldman/Engelman/Steitz, el cual genera un perfil de propiedades calculando los residuos no polares en α-helices; 3) algoritmo de hidrofobicidad de Janin; 4) algoritmo de hidrofobicidad de Kyte Doolittle; 5) algoritmo de hidrofobicidad de Manavalan; 6) algoritmo de hidrofilicidad de von Heijne; 7) algoritmo de antigenicidad de Hopp and Woods; 8) algoritmo de antigenicidad de Parker; 9) algoritmo de antigenicidad de Protrusion Index; y 10) algoritmo de antigenicidad de Welling.

27.- Método para inmunocastración de mamíferos, que comprende administrar a un mamífero, una proteína de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

28.- Proteína de fusión de una secuencia de la hormona liberadora de gonadotrofinas y una secuencia teórica no derivada de patógenos con capacidad inmunogénica que contiene sitios de O-glicosilación, que sirve para inmunocastración de mamíferos.