WO2010094899A1 - ACIDES NUCLEIQUES SE LIANT SPECIFIQUEMENT AU FACTEUR VII/VIIa HUMAIN, ET UTILISATIONS - Google Patents

ACIDES NUCLEIQUES SE LIANT SPECIFIQUEMENT AU FACTEUR VII/VIIa HUMAIN, ET UTILISATIONS Download PDF

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Gérald PERRET
Frédéric DUCONGE
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Definitions

  • the present invention relates to the field of the identification of ligands specific for human factor VII / VIIa, these ligands being intended in particular for the purification and detection of this protein, as well as for their use in medical domain.
  • FVII PRIOR ART Factor VII
  • FVIIa is a vitamin K-dependent glycoprotein which, in its activated form (FVIIa), participates in the coagulation process by activating factor X and factor IX in the presence of calcium and tissue factor.
  • FVII is secreted as a unique peptide chain of 406 amino acid residues, which has a molecular weight of about 50 kDa.
  • FVIIa a vitamin K-dependent glycoprotein, therefore plays an important role in the mechanisms of coagulation, resulting in blood clot formation.
  • FVIIa has the advantage of being able to act locally in the presence of the tissue factor released after lesion of tissues causing haemorrhages, even in the absence of Factor VIII or IX. This is why FVIIa has been used for many years to correct some bleeding disorders.
  • FVII is used in the treatment of hemophilia patients with factor VIII (type A haemophilia) or factor IX (type B haemophilia) deficiency, as well as patients with other coagulation factor deficiencies. for example, a hereditary deficiency in FVII. FVII is also recommended for the treatment of stroke. It is therefore necessary to have injectable FVIIa concentrates.
  • the oldest method of obtaining FVIIa concentrates was the purification of FVIIa from plasma proteins from fractionation.
  • PPSB prothrombin or FII
  • P proconvertin or FVII
  • S Stuart factor or FX
  • B antihemophilic factor B or FIX
  • EP 0 547 932 describes a method of manufacturing a high purity FVIIa concentrate essentially free of vitamin K dependent factors and FVIII.
  • the FVII obtained by this method despite its purity, has residual thrombogenic activity.
  • DNA encoding human factor VII was isolated (Hagen et al (1986), Proc Natl Acad Sci USA, Apr 83 (8): 2412-6) and the corresponding protein. has been expressed in BHK (Baby Hamster Kidney) mammalian cells (EP 0 200
  • Vll / Vlla Factor compositions purified from biological fluids from transgenic mammals it is important to have a free, or virtually free, end product of Vll / Vlla factor otherwise produced naturally by these transgenic mammals, likely to be immunogenic in humans.
  • single-stranded nucleic acids having at least 15 nucleotides in length and binding specifically to human factor VIII / VIIa are provided.
  • the present invention also relates to various compounds specifically binding to human factor VIII / VIIa, which comprise in their structure at least one nucleic acid defined above.
  • This invention also relates to a support for the immobilization of the human factor VIII / VIIa, characterized in that it comprises a solid support material on which are grafted a plurality of nucleic acids or compounds as defined above.
  • the subject of the invention is also a process for the immobilization of human factor VII / VIIa on a support, comprising a step during which a sample comprising human factor VII / VIIa is brought into contact with a support as defined herein. -above.
  • the invention also relates to a method for purifying the human factor VII / VIIa comprising the steps of: a) contacting a sample comprising human factor VII / VIIa with a nucleic acid or with a support as defined hereinabove.
  • the invention also relates to a method for detecting the presence of human factor VII / VIIa in a sample comprising the following steps: a) contacting a nucleic acid or a support as defined above with said sample; and b) detecting the formation of complexes between (i) said nucleic acid or said carrier and (ii) Vll / Vlla Factor
  • the present invention also relates to preventive or curative medical uses of the nucleic acids as defined above.
  • Figure 1 illustrates the results of a calculation of the nucleic acid folding model of the invention (Mapt2).
  • the computer program mFold was used according to parameters identical to those used to obtain the structure represented in FIG. 1, namely the following conditions: (i) linear sequence DNA, (ii) refolding temperature: 25 0 C, (iii) ionic conditions: [Na + ]: 150 mM; [Mg ++ ]: 4 mM, (iv) type of correction: Oligomer, (v) number of the percentage of "suboptimality”: 2, (vi) upper limit of the number of folds calculated: 50, (vii) maximum distance between two base pairs: no limit, and (viii) use default values for other parameters.
  • Figure 2 illustrates the binding curves of a nucleic acid diversity of the invention (Mapt2, Mapt3 and Mapt7) to human plasma Factor VII immobilized on a support, in a test according to the surface plasmon resonance technique.
  • abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • Figure 3 illustrates the plasma human factor VII binding curves, used at various concentrations, on a carrier-immobilized nucleic acid of the invention (Mapt2) in a surface plasmon resonance test.
  • Mapt2 carrier-immobilized nucleic acid of the invention
  • curves represent, from the top to the bottom of the figure, curve 1 "[FVII]”: purified human plasma FVII at a concentration of 500 nM; curve 2 "[FVII]”: purified human plasma FVII at a concentration of 250 nM; curve 3 "[FVII]”: purified human plasma FVII at a concentration of 125 nM; curve 4 "[FVII]”: human FVII purified plasma at a concentration of 62.5 nM; lower curves: preparation of purified immunoglobulins at the respective concentrations of 62, 125, 250 and 500 nM
  • Figure 4 illustrates the binding curve (i) of recombinant human factor VII to a carrier-immobilized nucleic acid of the invention (Mapt2), and (ii) the binding curve of a human anti-human FVII monoclonal antibody to immobilized nucleic acid / FVII complex formed in (i), in a test according to the technique of surface plasmon resonance.
  • abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • Figure 5 illustrates a saturation curve of a support on which is immobilized a nucleic acid of the invention (Mapt2), with the human factor VII plasma injected continuously over time. Test according to the surface plasmon resonance technique. On the abscissa: the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units. Upper curve: signal obtained with purified human FVII at a concentration of 500 nM.
  • Figure 6 illustrates plasma kinase Factor VII binding kinetics curves on a carrier-immobilized nucleic acid of the invention (Mapt2) in a surface plasmon resonance test. On the abscissa: the time, expressed in seconds; in ordinates, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units FIG.
  • FIG. 7 illustrates the binding curves of F VII proteins of various origins on a nucleic acid of the invention (Mapt2) immobilized on a support, in a test according to FIG. surface plasmon resonance technique.
  • Mapt2 nucleic acid of the invention
  • Figure 8 illustrates the binding curves of human plasma factor VII and recombinant rabbit Factor VII on a carrier-immobilized nucleic acid of the invention (Mapt2) in a surface plasmon resonance test.
  • Mapt2 carrier-immobilized nucleic acid of the invention
  • FIG. 9 illustrates the structure of a human Vll / VIIa-specific binding compound comprising an aptamer according to the invention (Mapt2) coupled to a spacer chain of PEG, the spacer chain being itself coupled to a biotin molecule. .
  • Figure 10 illustrates an alignment of various aptamers specifically binding to the selected Human Vll / VIIa Factor at the end of a run cycle of a SELEX type process.
  • the sequences shown in Figure 10 are, from top to bottom of the figure, respectively the sequences SEQ ID N 0 87 to SEQ ID NO 0100.
  • FIG. 11 illustrates a chromatography profile obtained during the implementation of the method for purifying a recombinant human factor VII produced in rabbit milk with the affinity support in which human anti-FVII nucleic aptamers are immobilized.
  • the absorbance value (OD) On the abscissa; the weather ; on the ordinate: the absorbance value (OD) at 254 nanometers.
  • Figure 12 illustrates the binding curves of a series of 27 nucleic aptamers of the invention to human plasma Factor VII immobilized on a support, in a test according to the surface plasmon resonance technique.
  • abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • Figure 13 illustrates the individual values of stable binding signal of each of the 27 aptamers tested.
  • abscissa each of the 27 aptamers tested;
  • ordinate resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • Figure 14 shows the curve of measured values of absorbance at 280 nm versus time.
  • Figure 15 shows the image of an SDS PAGE electrophoresis gel in which lane no. 1 corresponds to the fraction of the starting material and lane no. 2 to the elution fraction.
  • Figure 16 shows the binding curves of the immobilized aptaptin Mapt2 to recombinant human factor VII produced in the milk of a transgenic rabbit.
  • the arrows correspond to the time of the different injections, respectively from left to right in FIG. 16: 1: injection of the recombinant factor VII; 2: injection of a 1M NaCl buffer; 3: injection of a 2M NaCl buffer, 4: injection of a 3M NaCl buffer; 5: injection of a 50 mM Tris buffer, 10 mM EDTA.
  • On the abscissa the time expressed in seconds; on the ordinate; the value of the response signal, expressed in arbitrary units (RU).
  • Figure 17 shows the binding curves of the immobilized aptaptin Mapt2 to recombinant human factor VII produced in the milk of a transgenic rabbit.
  • the arrows correspond to the time of the different injections, respectively from left to right in Figure 17: 1: 50% propylene glycol; 2: EDTA at 10 mM.
  • new means capable of binding specifically to the human factor VIII / VIIa, of reduced size, which are easy and inexpensive to synthesize, and which can be used in all fields of application in which such means are useful, including for the purification of human factor VII / VIIa, for the detection of human factor VII / VIIa and for the use as an active ingredient of medicaments for the prevention or treatment of coagulation disorders .
  • the Applicant has constructed a family of single-stranded nucleic acids capable of specifically binding to the human factor VIII / VIIa, which have in common numerous structural characteristics, which will be detailed later in the present description.
  • the family of nucleic acids of the invention which are able to bind specifically to human factor VII / VIIa, consist of single-stranded nucleic acids, preferably of the DNA type, which By virtue of certain structural features provided by their nucleotide sequence, they are able to adopt conformations in space which contribute to their conferring their aforementioned Factor VIII / VIIa binding properties.
  • the nucleic acids of the invention may also be called "aptamers" nucleotides, with reference to a term commonly used by those skilled in the art to designate this type of molecules.
  • the subject of the present invention is a nucleic acid having at least 15 nucleotides in length and binding specifically to human factor VIII / VIIa.
  • Human Factor VII / VIIa may also be referred to as "nucleic aptamer”, “aptamer”, “human factor Vll / Vlla binding aptamer” or “human anti-FVII / Vlla aptamer”.
  • human Vll / Vlla factor a naturally occurring human Vll / Vlla factor and a recombinant human Vll / Vlla factor are encompassed.
  • a human factor VII / VIIa is considered with reference to its amino acid sequence, that is to say regardless of whether the protein is glycosylated or non-glycosylated, and if the protein is glycosylated , regardless of the type of glycosylation.
  • certain embodiments of the human Vll / Vlla Factor specific binding nucleic acids of the invention have a variety of common structural features, including a sequence comprising from the 5 'to 5' end. 3 'end, successively (i) an invariable specific nucleotide sequence of about 20 nucleotides in length, followed by (ii) a variable nucleotide sequence of about 40 to 50 nucleotides in length, followed by (iii) a specific nucleotide sequence invariable about 20 nucleotides in length. It states that Variable nucleotide sequences (ii) can have a very strong nucleotide sequence identity between them.
  • the Applicant has therefore constructed a family of nucleic aptamers that specifically bind to the human factor VII / VIIa, the existence of which has been shown to exist between (i) the common structural characteristics and (ii) the common functional characteristic (s).
  • the family of nucleic acids, or nucleic aptamers, specifically binding to the human factor VII / VIIa of the invention comprises at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide having at least 40% identity.
  • SEQ ID N 0 X is a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acid sequences SEQ ID No. 3 to SEQ ID No. 85 and SEQ ID NO: 87 to SEQ ID N 0 I OO,
  • - "x" is an integer equal to 0 or 1
  • - "y" is an integer equal to 0 or 1.
  • the acid of sequence SEQ ID N 0 X has a length of 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, or 50 nucleotides.
  • the nucleic acid of sequence SEQ ID N 0 X has a length of 43, 44, 45, 46, 47, 48 or 49 nucleotides in length.
  • the nucleic acid of sequence SEQ ID N 0 X has a length of 43, 44 or 45 nucleotides in length.
  • the nucleic acid of formula (I) is at least 15 nucleotides in length.
  • the nucleic acid of formula (I) has at least 15, 16,
  • nucleotides in length which includes nucleic acids having exactly each of the specified lengths.
  • the successive cycles of selection carried out to construct the family of nucleic acids of interest that bind specifically to the human factor VII / VIIa have resulted in isolating and characterizing, at each successive step of selection, sets and subsets of nucleic aptamers comprising, at their ends, 5 'and 3', respectively the sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2, structurally framing a sequence variable SEQ ID N 0 X.
  • the set of variable sequences SEQ ID N 0 X have between them a nucleotide sequence identity of at least 40%. This means that, for the sequence SEQ ID No. X, the structure constraints, to maintain the binding property to the human factor Vll / Vlla, are much less than the structure constraints for the sequences located respectively at the 5 'and 3 ends. of these nucleic aptamers.
  • the nucleic aptamers of the invention include nucleic acids comprising at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide having at least 40% nucleotide identity with the nucleic acid of formula (1-1) following 5 '- [SEQ ID N 0 X] - [SEQ ID No.2] -3' (1-1),
  • the nucleic aptamers of the invention include nucleic acids comprising at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide having at least 40% nucleotide identity with the nucleic acid of the following formula (I-2) 5 '- [SEQ ID NO: 1] - [SEQ ID NO: X] -3' (I-2)
  • the nucleic aptamers of the invention include nucleic acids comprising at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide having at least 40% nucleotide identity with the nucleic acid of the following formula (I-3): 5 '- [SEQ ID NO: X] -3' (1-3)
  • nucleic aptamers thus include nucleic acids comprising at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide having at least 40% nucleotide identity with a nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acids of SEQ ID NO: 3 sequences. to SEQ ID NO: 85 and SEQ ID NO: 87 to SEQ ID NO: 0 IOO.
  • a first polynucleotide having at least 40% nucleotide identity with a second polynucleotide or nucleic acid has at least 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48% 49% 50% 51% 52% 53% 54% 55% 56% 57% 58% 59% 60% 61% 62% 63% 64% 65 % 66% 67% 68% 69% 70% 71% 72% 73% 74% 75% 76% 77% 78% 79% 80% 81% 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 100% nucleotide identity with said second polynucleotide or nucleic acid.
  • nucleic acid of the invention comprising the sequence SEQ ID N 0 X
  • said sequence SEQ ID N 0 X is selected from the group consisting of nucleic acids having at least 15 consecutive nucleotides of a sequence possessing at least 40% nucleotide identity with at least one of SEQ ID NO : 3 to SEQ ID NO: 85 and SEQ ID NO: 87 to SEQ ID NO: 100.
  • nucleic acid of the invention comprising the sequence SEQ ID N 0 X
  • said sequence SEQ ID N 0 X is chosen from the group consisting of nucleic acids having at least 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%,
  • the present invention encompasses a family of single-stranded nucleic acids having at least 15 consecutive nucleotides of the sequence of formula
  • the "percent identity" between two nucleic acid sequences in the sense of the present invention is determined by comparing the two optimally aligned sequences through a comparison window.
  • the part of the nucleotide sequence in the comparison window may thus comprise additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or deletions) so as to obtain a optimal alignment between the two sequences.
  • the percent identity is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleotide base is observed for the two compared sequences, and then dividing the number of positions at which there is identity between the two nucleobases by the total number of positions in the sequence. the comparison window, then multiplying the result by one hundred in order to obtain the percentage of nucleotide identity of the two sequences between them.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be performed in a computer manner using known algorithms.
  • TREE TYPE "cladogram”
  • TREE GRAP DISTANCES "hide”.
  • nucleic aptamer of formula (I) By way of illustration and for certain embodiments of a nucleic aptamer of the invention, one skilled in the art can readily, on the basis of the structural definition above nucleic aptamers of formula (I), generate automatically, for example using a digital computer whose memory is loaded with an appropriate set of instructions, the set of sequences SEQ ID N 0 X possible. Where appropriate, those skilled in the art can then automatically determine, using said digital computer, respectively (i) those sequences whose structure pattern in space is similar or identical to that of the nucleic aptamer. Figure 1, and (ii) those whose structure of the nucleic aptamer is distinct from that of the nucleic aptamer of Figure 1.
  • Nucleic aptamers having a similar spatial structure or identical to that of the nucleic aptamer of Figure 1 include those that comprise the loop and stem sequence that has been previously described for this nucleic aptamer.
  • nucleic acid of formula (I) In order to determine the spatial structure of a nucleic acid of formula (I), one skilled in the art may, on the basis of the description of its nucleotide sequence, generate a structural model using the computer program mFold ® described by Zuker (2003, Nucleic Acids Research, Vol 231 (13): 3406-3413), which can also be used at the following web address: http://mfold.bioinfo.rpi.edu/.
  • the computer program mFold is used, according to parameters identical to those used to obtain the structure represented in FIG. 1, namely the following conditions: (i) linear sequence DNA, (ii) refolding temperature: (iii) ionic conditions: [Na + ]: 150 mM; [Mg ++ ]: 4 mM, (iv) type of correction: Oligomer, (v) number of the percentage of "suboptimality": 2, (vi) upper limit of the number of folds calculated: 50, (vii) maximum distance between two base pairs: no limit, and (viii) use default values for other parameters.
  • nucleic aptamer of the invention comprises at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide having at least 80% nucleotide identity with the nucleic acid of formula (I), which encompasses aptamers comprising 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide having at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 100% nucleotide identity with said nucleic acid of formula (I).
  • the sequence SEQ ID N 0 X has at least 80% nucleotide identity with at least one of the sequences SEQ ID No. 3 to SEQ ID N 85 and SEQ ID NO: 87 to SEQ ID NO: 10 , which includes sequences having at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 100% nucleotide identity with at least one of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 85 and SEQ ID NO: 87 to SEQ ID NO 0 I OO.
  • sequence SEQ ID N 0 X is chosen from the group consisting of the sequences SEQ ID N 0 3 to SEQ ID No. 85 and SEQ ID No. 87 at SEQ ID N 0 I OO.
  • sequence SEQ ID N 0 X is selected from the group consisting of SEQ ID N 0 3, 5, 6, 10, 11, 14 , 15, 16, 17, 19, 20, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 and 40.
  • a human Vll / Vlla-binding nucleic acid is a single-stranded nucleic acid capable of forming a complex with the human Vll / VIIa Factor when contacted with the human factor.
  • the nucleic acids binding to the human factor VIII / VIIa therefore include those for which complexes with the human factor VII / VIIa can be detected after a prior step of contacting said respective nucleic and protein partners.
  • the detection of complexes formed between a nucleic acid binding to the human factor VIII / VIIa can be easily performed by those skilled in the art, for example by implementing a surface plasmon resonance detection technique, including the Biacore ® technique. as illustrated in the examples.
  • Those skilled in the art can also easily detect the formation of complexes between a nucleic acid of interest and human factor VII / VIIa by standard ELISA techniques, as is also illustrated in the examples.
  • a nucleic acid of formula (I) has a strong binding capacity to any type of human factor VII / VIIa.
  • a nucleic acid of formula (I) binds to both human and human Factor VII / VIIa and recombinant human factor VII / VIIa.
  • nucleic acid of formula (I) has a strong capacity to bind to human factors Vll / VIIa having distinct types of glycosylation.
  • the Applicant believes that a nucleic acid of formula (I) is capable of efficiently binding not only to the Vll / VIIa Factor from natural sources, including human plasma, but also to a Vll Factor.
  • Recombinant human / Vlla produced in a transgenic animal, preferably a transgenic mammal, of different species, including the rabbit, whose types of glycosylation may differ slightly even from the type of glycosylation of human factor VII / VIIa naturally occurring in blood plasma.
  • a nucleic acid binding "specifically" to human Factor VII / VIIa consists of a nucleic acid having an ability to bind human Factor VII / VIIa greater than its ability to bind to any other protein, including to the Factors
  • Vll / VIIa encoded by the genome of a non-human mammal, such as Rabbit Factor VIII / VIIa.
  • a first nucleic acid has the ability to bind human Factor VII / VIIa, greater than that of a second nucleic acid, when using any of the binding detection techniques set forth herein. above, and under the same test conditions, a statistically significant upper binding signal value is obtained with the first nucleic acid, relative to that obtained with the second nucleic acids.
  • the used link detection technique is the Biacore ® technique
  • a first nucleic acid has a capacity to bind to VII / VIIa Factor, greater than that of a second nucleic acid, when the resonance signal value for the first nucleic acid, regardless of the expressed resonance unit of measure, is statistically greater than the measured resonance signal value for the second nucleic acid.
  • Two distinct "statistically" measured values encompass two values which have a greater difference than the measurement error of the link detection technique used. As illustrated in the examples, the ability of the nucleic acids of the invention to bind specifically to human factor VII / VIIa was tested.
  • a nucleic acid of formula (I) has a dissociation constant value for human factor VII / VIIA of at most 500 nM, more preferably at most 200 nM.
  • the nucleic acids of formula (I) have been shown to have an ability to bind to
  • Vll / VIIa factor Human Vll / VIIa factor that is significantly greater than their binding capacity to any Vll / VIIa Factor from a non-human mammal.
  • a nucleic acid of formula (I) has a strong ability to bind to any type of human factor Vll / VIIa, including natural or recombinant, it has little or no ability to bind to a specific factor.
  • nucleic acid of formula (I) is illustrated in the examples in particular with the nucleic acid of sequence SEQ ID N 0 86, which consists of a nucleic acid of formula (I) wherein the sequence SEQ ID N 0 X consists of the sequence SEQ ID N 0 and 85, the structure after its coupling with PEG and biotin is shown in Figure 9.
  • nucleic acid of formula (I) sequence SEQ ID N 0 86, was determined using the Biacore ® technique, the value of binding ability VII / Factor VIIa, expressed as the dissociation constant Kd, is about 100 nM.
  • said nucleic acid of formula (I) has a binding capacity of the same order of magnitude both to human plasma Factor VII / VIIa and to a recombinant human factor VII / VIIa, for example produced in a transgenic rabbit.
  • the complexes between a nucleic acid of formula (I) and a human factor VII / VIIa are stoichiometric, that is to say that the ratio of the number of nucleic acid molecules of formula (I) the number of complexed human Vll / VIIa molecules is about 1: 1, and more preferably 1: 1.
  • the ability of a nucleic acid of formula (I) to bind "specifically" to human Factor VII / VIIa can also be expressed as the ratio of dissociation constants Kd, respectively for Factor Vll / Human Vlla and a non-human factor Vll / VIIa.
  • the capacity of said nucleic acid to bind specifically to human factor VIII / VIIa can also be expressed by the following condition (A):
  • Human Kd is the dissociation constant of a nucleic acid of formula (I) for human Factor VII / VIIa, expressed in molar units
  • non-human Kd is the dissociation constant of said nucleic acid of formula ( I) for a non-human factor VII / VIIa, expressed in the same molar units.
  • the non-human human Kd / Kd ratio is preferably less than 0.01, better still less than 0.001.
  • a nucleic acid of formula (I) can be advantageously used in a means for purifying a human factor VII / VIIa, including from a complex starting medium capable of containing a factor VIII. / VIIa from a non-human mammal.
  • a nucleic acid of formula (I) may be used in a recombinant Vll / VIIa Factor purification means in a biological fluid of a transgenic rabbit for human factor VII / VIIa, said biological fluid being capable of containing a factor Vll / Vlla naturally produces by the rabbit.
  • nucleic acid of formula (I) is its ability, in a complex with human Factor VII / VIIa, to releasing the human factor VIII / VIIa by incubating said complex with a metal cation chelating agent.
  • a metal cation chelating agent such as EDTA.
  • the binding of a nucleic acid of formula (I) according to the invention to human factor VIII / VIIa can be dissociated by contacting with a metal cation chelating agent, including by setting contact with EDTA.
  • nucleic acid of formula (I) is particularly advantageous for the use of said nucleic acid in a means for purifying the human factor VII / VIIa.
  • the human factor VII / VIIa immobilized in a complex with a nucleic acid of formula (I)
  • metal cations so without requiring the use of known substances to denature, at least partially, the human factor VIII / VIIa, such as acidic conditions or urea.
  • a nucleic acid of formula (I) according to the invention is preferentially immobilized on a solid support.
  • Said solid support includes solid particles, chromatography media, etc. Techniques for immobilizing nucleic acids of interest on a wide variety of types of solid supports are well known to those skilled in the art.
  • the solid support may be an affinity chromatography column composed of a gel derived from agarose, cellulose or a synthetic gel such as an acrylamide, methacrylate or polystyrene derivative, a chip such as a chip adapted to the surface plasmon resonance, a membrane such as a polyamide, polyacrylonitrile or polyester membrane or a magnetic or paramagnetic ball.
  • a nucleic acid of formula (I) is preferentially included in a chemical structure also comprising a spacer means and, if appropriate, a means of immobilization. on a solid support.
  • the present invention also relates to a compound that binds specifically to human factor VIII / VIIa, characterized in that it has the following formula (II):
  • [NUCL] means a nucleic acid specifically binding to human Factor VII / VIIa comprising at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide having at least 40% nucleotide identity with the nucleic acid of formula (I).
  • the above compound is a particular embodiment of a human factor VIII / VIIa purification means.
  • the "spacer chain" designated [SPAC] in the compound of formula (II) may be of any known type. Said spacer chain has the function of physically moving the nucleic acid [NUCL] away from the surface of the solid support on which said compound can be immobilized and to allow a relative mobility of the nucleic acid [NUCL], relative to the surface solid support on which it can be immobilized.
  • the spacer chain limits or avoids that steric hindrances, due to an excessive proximity of the solid support with the nucleic acid of formula (I), interfere with the binding events between said nucleic acid and human Vll / Vlla Factor molecules that are likely to occur. to be put in contact with it.
  • the spacer chain is preferably bonded to the 5 'end or the 3' end of [NUCL] nucleic acid.
  • the spacer chain is bonded to both an end of the aptamer and the solid support.
  • This spacer construction has the advantage of not directly immobilizing the aptamer on the solid support.
  • the spacer chain is a nonspecific oligonucleotide or polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • said spacer chain includes PEG-type polyethylene glycol (CI 8).
  • the [NUCL] nucleic acid can be chemically modified with different chemical groups such as groups that make it possible to immobilize said nucleic acid in a covalent manner, such as thiols, amines or any other group capable of reacting with chemical groups present on the solid support.
  • the spacer chain is itself capable of being immobilized on the solid support, where appropriate after modification of said spacer chain with one or more appropriate chemical groups.
  • the spacer chain is linked to a compound for immobilizing the compound of interest comprising the nucleic aptamer on the mobile support.
  • the present invention also relates to a compound that binds specifically to human factor VIII / VIIa, characterized in that it has the following formula (III):
  • FIX means an immobilization compound on a support
  • - [SPAC] means a spacer chain
  • - [NUCL] means a nucleic acid specifically binding to human Factor VII / VIIa comprising at least 15 consecutive nucleotides of a polynucleotide having at least 40% nucleotide identity with the nucleic acid of formula (I).
  • the compound of formula (III) above is an embodiment of a method for purifying human factor VIII / VIIa.
  • Said means for purifying human Factor VII / VIIa of formula (II) or of formula (III) is preferably in a form bound to a solid support.
  • the compound [FIX] consists of a compound chosen from
  • the first type of compound [FIX] includes the bifunctional coupling agents, such as glutaraldehyde, SIAB or SMCC.
  • the compound SIAB comprises two reactive groups, an iodoacetate group and a sulpho-NHS ester group respectively, these groups reacting respectively on amino and sulfhydryl groups.
  • the SMCC compound which is described by Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2 (1): 37-46), is the compound of formula (II) below:
  • the SMCC compound comprises two reactive groups, respectively a sulfo-NHS ester group and a maleimide group, which react respectively with an amino group and a sulfhydryl group.
  • the second type of compound [FIX] includes biotin, which is capable of specifically non-covalently binding to avidin or streptavidin molecules present on the solid support.
  • the aptamer when immobilized on the solid support via the spacer chain, is advantageously modified at its free end (end not bound to the spacer) by virtue of, and not limited to, a chemically nucleotide modified (such as 2'-O-methyl or 2'-fluoropyrimidine, 2'-ribopurine, phosphoramidite), an inverted nucleotide or a chemical group (PEG, polycations, cholesterol).
  • a chemically nucleotide modified such as 2'-O-methyl or 2'-fluoropyrimidine, 2'-ribopurine, phosphoramidite
  • an inverted nucleotide or a chemical group PEG, polycations, cholesterol
  • the solid support may be an affinity chromatography column composed of a gel derived from agarose, cellulose or a synthetic gel such as an acrylamide, methacrylate or polystyrene derivative, a chip such as a chip adapted to the surface plasmon resonance, a membrane such as a polyamide, polyacrylonitrile or polyester membrane, a magnetic or paramagnetic ball.
  • the present invention also relates to a complex between:
  • the subject of the present invention is also a support for the immobilization of the human factor VII / VIIa, characterized in that it comprises a solid support material to which a plurality of molecules, each consisting of or each comprising a nucleic aptamer, are grafted. , said molecules being chosen from (a) a nucleic acid of formula
  • the above support can be used in virtually any application for which human Vll / Vlla Factor is to be immobilized, which includes applications for Vll / Vlla Factor Purification and applications for the detection of Factor VIII / Vlla. Human factor VII / VIIa.
  • the present invention therefore also relates to a method for immobilizing human factor VII / VIIa on a carrier, comprising a step in which a sample comprising human factor VII / VIIa is contacted with a solid support on which previously immobilized a substance selected from a nucleic acid of formula (I), a compound of formula (II) and a compound of formula (III).
  • Said method may comprise, according to the technical objectives pursued, an additional step of recovering the molecules of Immobilized human factor VII / VIIa, complexed with the nucleic acid molecules of formula (I).
  • the additional Factor VIII / VIIa recovery step preferably consists of a step of contacting the Factor VII / VIIa complexes with the nucleic acids of formula (I) with a metal cation chelating agent, such as EDTA.
  • a metal cation chelating agent such as EDTA.
  • the subject of the present invention is also a process for the purification of the factor
  • Human / human Vlla comprising the following steps: a) contacting a sample comprising human Factor VII / VIIa with a nucleic acid of formula (I), a compound of formula (II), a compound of formula (III) or with a solid support as defined in the present description, to form a complex between (i) said nucleic acid or said support and (ii) human factor VII / VIIa, and b) release human factor VII / VIIa from the complex form in step a) and recover the purified human factor VIII / VIIa.
  • buffer reduced concentration MgCl 2 is meant according to the invention a buffer whose final concentration of MgCl 2 is less than 1 mM.
  • a buffer whose concentration of MgCl 2 is less than 1 mM includes buffers whose concentration of MgCl 2 is less than 0.5 mM, 0.1 mM, 0.05 mM and 0.01 mM, advantageously equal to 0 mM.
  • the method comprises a step a '), step a' following step a) and preceding step b), which consists of a step of washing the affinity support with a buffer washing.
  • the process comprises a step 1 ) of washing the affinity support during which the ionic strength is increased, that is to say that a washing buffer is used whose ionic strength is increased relative to the ionic strength of the buffer used in step a).
  • the ionic strength of the washing buffer used in step a ') is greater by 2 to 500 times with respect to the ionic strength of the buffer used in step a).
  • the ionic strength of the washing buffer is greater by 100 to 500 times, preferably 200 to 500 times, relative to the ionic strength of the buffer used in step a). It has been shown in the examples that the use, in washing step a '), of a washing buffer having a high ionic strength, in particular a buffer having a high concentration of NaCl, makes it possible to effectively eliminate substances non-specifically related to the affinity support without simultaneously affecting detectably the binding of Factor VII to the affinity support.
  • a washing buffer having a final NaCl concentration of at least 1M is preferably used.
  • a washing buffer having a final NaCl concentration of at least 1 M includes wash buffers having a final NaCl concentration of at least 1.5M, 2M, 2.5M or at least 3M.
  • a washing buffer used in step a ') of the process has a final NaCl concentration of at most 3.5 M.
  • a washing buffer used in step a') of the process has a concentration of final NaCl content of between 1.5 and 3.5, preferably between 2 and 3.5, preferably between 2.5 and 3.5, for example preferably between 3 and 3.5.
  • step a ') of a washing buffer having a high hydrophobicity, in particular a high concentration of propylene glycol makes it possible to effectively remove the non-ionically bound substances. specific to the affinity support without simultaneously sensibly affecting the binding of Factor VII to the affinity support.
  • step a ' a wash buffer with a final propylene glycol content of at least 20% (v / v) is preferably used.
  • a wash buffer having a final propylene glycol content of at least 20% includes wash buffers having a final propylene glycol content of at least 25% M, 30%, 35%, 40% , 45%, 50%, 55%, or at least 60% by volume, based on the total volume of the wash buffer.
  • a wash buffer used in step a ') of the process has a final propylene glycol content of at most 50%.
  • a washing buffer used in step a ') of the process has a final propylene glycol content of between 20% and 50%, preferably between 30% and 50%.
  • the washing buffer used in step a ') contains both NaCl and propylene glycol as described above.
  • step b) is performed by contacting the affinity support with an elution buffer containing a divalent ion chelating agent, preferably EDTA.
  • the elution buffer may contain a final concentration of EDTA of at least 1 mM and at most 30 mM.
  • the term "at least 1 mM” includes at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 mM.
  • the expression “not more than 30 mM” includes not more than 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20,
  • an affinity support comprising a nucleic aptamer of the invention and the realization of a method of purifying human Factor VII with said affinity support is illustrated in the examples.
  • the solid supports on which the aptamers of the invention can be immobilized include any type of support having the structure and composition commonly found for filter supports, silicon support for chips, membranes, etc.
  • Solid supports include resins, resins for affinity chromatography columns, polymer beads, magnetic beads, and the like.
  • Solid supports also include glass or metal-based materials such as steel, gold, silver, aluminum, copper, silicon, glass and ceramics.
  • Solid supports also include, in particular, polymeric materials, such as polyethylene, polypropylene, polyamide, polyvinylidene fluoride, and combinations thereof.
  • the solid support may be coated with a material facilitating attachment, fixation, complex formation, immobilization or interaction with aptamers.
  • the solid support is a glass slide whose surface is coated with a gold layer, a carboxymethylation-treated layer, a layer of dextran, collagen, avidin, streptavidin, etc.
  • the aptamers according to the invention can be immobilized on the solid support by means of an attachment coating, as for example described above, either by chemical reaction with creation of covalent bonds, or by association by non-covalent bonds such as hydrogen bonds, electrostatic forces, Van der Waals forces, etc.
  • affinity support generally means a support formed of a solid material on which nucleic aptamers as defined in the present description have been immobilized.
  • solid supports consisting of a glass slide coated with a layer of streptavidin molecules, and aptamers of the invention conjugated to a biotin molecule which are immobilized on the support by non-covalent association of biotin / streptavidin.
  • solid supports consisting of a polystyrene material coated with a layer of streptavidin molecules, and aptamers of the invention conjugated to a biotin molecule which are immobilized on the support by non-covalent association biotin / streptavidin.
  • the aptamers of the invention may be immobilized on a solid support suitable for affinity chromatography, electrochromatography and capillary electrophoresis, as described, for example, by Ravelet et al. al. (2006, J Chromatogr A, Vol.117 (1): 1-10), Connor et al. (2006, J Chromatogr A, Vol.111 (2): 115-119), Cho et al. (2004, Electrophoresis, Vol 25 (21-22): 3730-3739) or Zhao et al. (2008, Anal Chem, Vol 80 (10): 3915-3920).
  • An aptamer of formula (I) having at least 15 nucleotides in length and binding specifically to human Factor VII / VIIA, a compound of formula (II), or a compound of formula (III), can also be advantageously used as a capture of human FVII / VIIa, in detection or diagnostic methods and devices.
  • the present invention also relates to a method for detecting the presence of human factor VII / VIIa in a sample comprising the following steps: a) contacting (i) a nucleic acid of formula (I), a compound of formula (II) or a compound of formula (III) or a solid support on which are immobilized a plurality of molecules of said nucleic acid or said compound, with (ii) said sample; and b) detecting the formation of complexes between (i) said nucleic acid of formula (I), said compound of formula (II) or said compound of formula (III) or said support and (ii) the factor
  • the examples of the present patent application provide various embodiments of methods for detecting human FVII / VIIa with aptamers of the invention previously immobilized on a solid support.
  • the solid support used may be a solid support chosen from the solid supports described above in connection with the method for purifying the human factor VII / VIIa.
  • step b) of detecting complex formation between (i) said nucleic acid or said solid support and (ii) human factor VII / VIIa may be performed by measuring the plasmonic resonance signal of surface, as described in the examples.
  • the step b) of detecting the formation of complexes between (i) said nucleic acid or said solid support and (ii) the human factor VII / VIIa can be achieved by bringing said complexes into contact with each other. optionally formed with a human Factor VII / VIIa ligand, said ligand being detectable.
  • a human Factor VII / VIIa ligand optionally formed with a human Factor VII / VIIa ligand, said ligand being detectable.
  • those embodiments are described in which, as the detectable ligand of the human factor VII / VIIa, human anti-FVII / VIIa monoclonal or polyclonal antibodies, labeled with an enzyme, namely horseradish peroxidase, are used. as conventionally used in ELISA type tests.
  • the sample comprising or capable of comprising human factor VIII / VIIa consists of a liquid sample which contains the human factor VII / VIIa, including a liquid sample comprising the human factor VII / VIIa and which is capable of containing also Vll / VIIa molecules of a non-human mammal.
  • said sample consists of a biological solution, such as a body fluid, a cell, a cell crumb, a tissue, a tissue mill, an organ or an entire organism.
  • said sample consists of a liquid biological solution from an animal such as blood, a blood derivative (blood derivative), mammalian milk or a mammalian milk derivative.
  • Said sample may consist of plasma, plasma cryoprecipitate, clarified milk or their derivatives.
  • said sample is derived from a transgenic animal for human factor VIII / VIIa.
  • the solution is mammalian milk or a transgenic mammalian milk derivative for the human factor VII / VIIa.
  • the transgenic animals include (i) non-human mammals such as cows, goats, rabbits, pigs, monkeys, rats or mice, (ii) birds or (iii) ) insects such as mosquitoes, flies or silkworms.
  • the transgenic animal for human factor VIII / VIIa is a non-human transgenic mammal, most preferably a transgenic rabbit for human factor VIII / VIIa.
  • the transgenic mammal produces the recombinant Vll / VIIa factor in its mammary glands, because of the insertion into its genome of an expression cassette comprising nucleic acid encoding the human factor VII / VIIa which is placed under the control of a specific promoter allowing the expression of the transgene protein in the milk of said transgenic mammal.
  • a method for producing human Factor VII / VIIa in the milk of a transgenic animal may comprise the following steps: a DNA molecule comprising a gene encoding human factor VII / VIIa, said gene being under the control of a promoter of a naturally secreted protein in the milk (such as the casein, beta-casein, lactalbumin, beta-lactoglobulin promoter or the WAP promoter) is integrated into an embryo of a non-human mammal. The embryo is then placed in a female mammal of the same species. Once the mammal from the embryo has grown sufficiently, the lactation of the mammal is induced, then the milk collected. The milk then contains the human factor VII / VIIa.
  • a promoter of a naturally secreted protein in the milk such as the casein, beta-casein, lactalbumin, beta-lactoglobulin promoter or the WAP promoter
  • a plasmid containing the WAP (Whey Acidic Protein) promoter is manufactured by introducing a sequence comprising the promoter of the WAP gene, this plasmid being made in such a way as to be able to receive a foreign gene placed under the control of the WAP promoter.
  • the plasmid containing the promoter and the gene coding for the protein of the invention are used to obtain transgenic rabbits by microinjection into the male pronucleus of rabbit embryos. The embryos are then transferred into the oviduct of hormonally prepared females.
  • transgenic mammal The presence of the transgenes is revealed by the Southern technique from the DNA extracted from the transgenic rabbits obtained. Concentrations in animal milk are evaluated using specific radioimmunoassays. Other documents describe methods for preparing proteins in milk of a female mammal other than man. These include, but are not limited to, US 7,045,676 (transgenic mouse) and EP 1,739,170 (production of von Willebrand factor in a transgenic mammal).
  • a nucleic acid having at least 15 nucleotides in length and specifically binding to human Factor VII / VIIa can be used in vivo in physiological situations requiring inhibition of Factor X by Factor VIIa, for example by inhibiting the formation of a functional complex Factor VII / Tissue Factor ("Tissue Factor").
  • an aptamer nucleic acid as defined in the present description can also be used, as a preventive or curative, as anticoagulant active ingredient of a drug.
  • an aptamer nucleic acid as defined in the present description may be used as a preventive or curative anticoagulant active ingredient, in particular for the treatment of coagulation disorders including venous thromboses, arterial thromboses, post-surgical thromboses, coronary artery bypass (CABG) disorders, stroke, percutaneous transdermal coronary angioplasty (PTCA), tumor metastasis, non-severe or severe inflammatory reactions, septic shock, hypotension, acute respiratory distress syndrome (ARDS), pulmonary embolisms, disseminated intravascular coagulation (DIC), vascular restenosis, platelet deposition, myocardial infarction, angiogenesis, and any prohylactic treatment of men or women at risk of developing thrombosis.
  • coagulation disorders including venous thromboses, arterial thromboses, post-surgical thromboses, coronary artery bypass (CABG) disorders, stroke, percutaneous transdermal coronary angioplasty (PTCA), tumor metastasis, non
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid having at least 15 nucleotides in length specifically binding to the human factor VIII / VIIa as defined in the present description, in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the amount of human anti-FVII / FVIIa aptamer nucleic acid according to the invention, in a pharmaceutical composition, is adapted to allow the administration of an effective amount of this active ingredient to patients.
  • the dosage ranges of the human anti-FVII / VIIa aptamer of the invention may be readily determined by the physician or pharmacist.
  • the amount of active ingredient to be administered varies with the patient's age, medical condition, and sex, as well as with the degree of spread of the disease or degree of risk of developing the disease, and may be easily determined by those skilled in the art.
  • a pharmaceutical composition comprises an amount of a human anti-FVII / VIIa aptamer ranging from 1 nanogram to 100 milligrams per unit dose, more preferably from 100 nanograms to 10 milligrams per unit dose.
  • a pharmaceutical composition according to the invention comprises from 0.01% to 99.9% by weight of an anti-FVII / VIIa aptamer, or a combination of several anti-FVII / VIIa aptamers, and from 99% to 99.9% by weight of an anti-FVII / VIIa aptamer. , 9% to 0.01% by weight of an excipient, or a combination of excipients, relative to the total weight of said composition.
  • said pharmaceutical composition comprises 1, 2, 3, 4, 5 or 6 different anti-FVII / VIIa aptamers.
  • an anti-human FVII / VIIa aptamer according to the present invention is prepared in a form adapted to the chosen type of administration, for example in liquid form or in freeze-dried form.
  • the anti-human FVII / VIIa aptamer pharmaceutical compositions according to the present invention may contain an excipient and / or a pharmaceutically acceptable carrier, preferably an aqueous carrier.
  • compositions for example, water, buffered water, saline solution, glycine solution and their derivatives as well as agents necessary to reproduce physiological conditions such as buffering agents and pH adjusters, surfactants such as sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, this list not being limiting.
  • the pharmaceutical composition can be sterilized by sterilization techniques well known to those skilled in the art.
  • a pharmaceutical composition according to the invention, one skilled in the art can advantageously also refer to the latest edition of the European Pharmacopoeia, for example to the 5th edition of the European Pharmacopoeia published in January 2005, or again at the 6th edition of the European Pharmacopoeia, available to the public in June 2007.
  • the skilled person may also refer to the content of PCT Application No. WO 2007/058801, PCT Application No. WO 2005/084412 0 and demand PCT WO 2004/047742 n 0. or in the PCT application WO 2008/150495 n 0.
  • the anti-human FVII / Vlla aptamer active ingredient (s) may be used alone or in combination with one or more other pharmaceutically acceptable molecules.
  • active agents including one or more other anticoagulant active ingredients.
  • the invention also relates to a nucleic acid having at least 15 nucleotides in length specifically binding to human factor VIII / VIIa, as defined herein, for use as a medicament.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid having at least 15 nucleotides in length specifically binding to human factor VIII / VIIa, as defined in the present description, for the manufacture of a medicament for the treatment coagulation disorders.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid having at least 15 nucleotides in length specifically binding to human factor VIII / VIIa, as defined in the present description, for the treatment of coagulation disorders.
  • the invention also relates to a method for preventing or treating a coagulation disorder, comprising a step in which a patient requiring a preventive or curative treatment of a coagulation disorder is administered a anti-human FVII / Vlla aptamer pharmaceutical composition as defined herein.
  • a daily dose of an anti-human FVII / VIIa aptamer as defined in the present description is administered from 1 nanogram to 100 milligrams, more preferably from 100 nanograms to 10 milligrams, for a patient of 80 kgs.
  • a solid support was made on which were immobilized plasma purified human Vll / VIIa molecules of plasma origin.
  • Human Factor VII is immobilized on NHS-EDC-activated dextran carboxymethyl and binding to the free amines present on FVII / VIIa.
  • the human factor VII / VIIa is thus immobilized with a immobilization rate of 2743 RU (1 RU corresponds approximately to 1 ⁇ g of immobilized product per mm 2 ).
  • Nucleic aptamers of the invention purity: 99%
  • aptaptor Mapt 2 SEQ ID No. 86
  • aptamer Mapt 3 SEQ ID No. 41
  • aptamer Mapt 7 SEQ ID No. # 58
  • Each sample was injected sequentially on the same chip (solid support) containing the immobilized human FVII. Controls are obtained by injecting whites containing only the race buffer. All injections were performed with a flow rate of 30 ⁇ l / min for 60 sec. After the injection, the stroke buffer was injected onto the chip at the same rate for 120 sec. Elution buffer (EDTA, 5mM) was then injected for 60 sec with a flow rate of 30 ⁇ l / min to unhook the aptamer from immobilized human FVII.
  • the chip makes it possible to study in real time the formation and the rupture of the interactions between the immobilized human FVII and each of the aptaptors Mapt2, Mapt3 and Mapt7 tested, thanks to the surface plasmon resonance (RPS).
  • a linkage on the immobilized human FVII results in an increase in the signal in resonance unit (RU) recorded by the apparatus (FIG. 2).
  • RU signal in resonance unit
  • FIG. 2 A linkage on the immobilized human FVII results in an increase in the signal in resonance unit (RU) recorded by the apparatus (FIG. 2).
  • GE Biacore T100
  • the modeling of recorded interactions is done using the Biaevaluation (GE) Software.
  • Example 2 Capture of Human Factor VII / VIIa by an aptamer nucleic acid according to the invention, immobilized on a support.
  • a solid support was made on which were immobilized molecules of the nucleic aptamer of the invention of sequence SEQ ID NO : 86, also referred to herein as "Mapt2".
  • Mapt2 Prior to its attachment to the solid support, the 5 'end of the aptamer Mapt2 was chemically coupled to a spacer chain consisting of 4 molecules of PEG (IC 8). Then, the free end of the spacer chain, opposite to the aptamer coupled end, was coupled to a biotin molecule.
  • a solid support containing immobilized streptavidin molecules is available (S sensor chip SA series, GE)
  • the solid support was contacted with the above aptamer compounds above in order to immobilize the nucleic acids of sequence SEQ ID N 0 86, by noncovalent association between the streptavidin molecules of the substrate and molecules of biotin aptamer compounds.
  • the aptamer Mapt2 is thus immobilized with a immobilization rate of 983 RU (1 RU corresponds approximately to 1 ⁇ g of immobilized product per mm 2 ).
  • a preparation of immunoglobulins (Tegeline ®, marketed by LFB, France) was diluted in running buffer (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, CaCl 2 10 mM, MgCl 2 4 mM, pH 7.4 ) to obtain four polyvalent immunoglobulin concentration samples of 62, 125, 250 and 500 nM.
  • Each sample was injected sequentially on the same chip (solid support) containing the aptaptin Mapt2 immobilized by a biotin-streptavidin interaction. Controls are obtained by injecting whites containing only the race buffer. All injections were performed with a flow rate of 30 ⁇ l / min for 60 sec. After the injection, the stroke buffer was injected onto the chip at the same rate for 120 sec. Elution buffer (EDTA, 5mM) was then injected for 30 sec with a flow rate of 30 ⁇ l / min to pick up the FVII HP aptamer ..
  • the chip allows to study in real time the formation and rupture of interactions between FVII HP, or polyvalent immunoglobulins, and immobilized aptamer through surface plasmon resonance (SPR).
  • SPR surface plasmon resonance
  • a link on the immobilized aptamer results in an increase in the signal in resonance unit (RU) recorded by the apparatus ( Figure 3).
  • Mapt2 aptamer once immobilized specifically binds to FVII HP, with significant affinity. Mapt2 aptamer does not bind to polyvalent immunoglobulins.
  • Example 3 Capture of Human Factor VII / VIIa by an aptamer nucleic acid according to the invention, immobilized on a support.
  • a solid support was made on which were immobilized molecules of the nucleic aptamer of the invention of sequence SEQ ID NO : 86, also referred to herein as "Mapt2".
  • Mapt2 Prior to its attachment to the solid support, the 5 'end of the aptamer Mapt2 was chemically coupled to a spacer chain consisting of 4 molecules of PEG (IC 8). Then, the free end of the spacer chain, opposite to the aptamer coupled end, was coupled to a biotin molecule.
  • a solid support containing immobilized streptavidin molecules (S sensor Chip SA series, GE) was then added.
  • the above solid support was then contacted with the aptamer compounds above to immobilize the nucleic acids of the present invention.
  • sequence SEQ ID NO : 86 by non-covalent association between the streptavidin molecules of the support and the biotin molecules of the aptamer compounds.
  • the aptamer Mapt2 is thus immobilized with a immobilization rate of 424.9 RU (1 RU corresponds approximately to 1 ⁇ g of immobilized product per mm 2 ).
  • FVII HP Human FVII purified from plasma (FVII HP, purity: 99%) was diluted in running buffer (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, CaCl 2 10 mM, MgCl 2 4 mM, pH 7.4) of in order to obtain a sample of concentration of FVII HP 50O nM.
  • an injection sequence comprising (i) 50nm FVII HP and (ii) a 1 ⁇ M anti-FVII monoclonal antibody (Sigma, Ref. Clone No. MC1476 / EA8.1) was performed on the same chip. The conditions of injection and analysis are identical to those described above. If the aptamer actually retains FVII, the injection of anti-FVII monoclonal antibody should result in an increase in the signal in RU subsequent to the binding of the antibodies on the FVII itself linked to the aptamer. As controls, only antibodies are injected. The signal increase in RU shows that the aptamer recognizes the FVII ( Figure 4). The modeling of recorded interactions is done using the Software
  • the results of this example show that the aptamer, once immobilized, binds specifically to FVII HP with significant affinity and that the observed signal is due to the retention of FVII on the aptamer.
  • a solid support was made on which were immobilized molecules of the nucleic aptamer of the invention of sequence SEQ ID NO : 86, also referred to herein as "Mapt2".
  • Mapt2 Prior to its attachment to the solid support, the 5 'end of the aptamer Mapt2 was chemically coupled to a spacer chain consisting of 4 molecules of PEG (IC 8). Then, the free end of the spacer chain, opposite to the aptamer coupled end, was coupled to a biotin molecule.
  • a solid support containing immobilized streptavidin molecules is available (S sensor chip SA series, GE)
  • the solid support was contacted with the above aptamer compounds above in order to immobilize the nucleic acids of sequence SEQ ID N 0 86, by noncovalent association between the streptavidin molecules of the substrate and molecules of biotin aptamer compounds.
  • the aptamer Mapt2 is thus immobilized with a immobilization rate of 983 RU (1 RU corresponds approximately to 1 ⁇ g of immobilized product per mm 2 ).
  • FVII HP Human FVII purified from plasma (FVII HP, purity: 99%) was diluted in running buffer (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, CaCl 2 10 mM, MgCl 2 4 mM, pH 7.4) of to obtain a 1 ⁇ M FVII HP concentration sample.
  • Each sample was injected sequentially on the same chip (solid support) containing the aptaptin Mapt2 immobilized by a biotin-streptavidin interaction. Controls are obtained by injecting whites containing only the race buffer. All injections were performed with a flow rate of 30 ⁇ l / min for 700 sec. After the injection, the stroke buffer was injected onto the chip at an identical rate for 120 sec. Elution buffer (EDTA, 20 mM) was then injected for 30 sec with a flow rate of 30 ⁇ l / min to unhook the FVII HP from the aptamer.
  • EDTA 20 mM
  • the chip allows to study in real time the formation and the rupture of the interactions between the FVII HP, and the immobilized aptamer thanks to the surface plasmon resonance (RPS).
  • RPS surface plasmon resonance
  • a link on the immobilized aptamer results in an increase in the signal in resonance unit (RU) recorded by the apparatus ( Figure 5).
  • RU signal in resonance unit
  • MW Mapt2 means the molecular weight of Mapt2, equal to 27 kDa
  • Mapt2 / FVII stoichiometry which is equal to 1.
  • the expected maximum signal value was: 1820 RU.
  • Mapt2 aptamers bound to a human Factor VII molecule is then calculated according to the formula: Measured Signal / Waited Signal, with:
  • the percentage of Mapt2 aptamer molecules bound to a human FVII molecule at the end of the injection is 62%.
  • Example 5 Kinetics of binding of the aptamer in human plasma FVII Mapt2 was manufactured a solid support on which are immobilized nucleic molecules of the aptamer of the invention of sequence SEQ ID N 0 86, also referred to herein as " Mapt2 ". Prior to its attachment to the solid support, the 5 'end of the aptamer Mapt2 was chemically coupled to a spacer chain consisting of 4 molecules of PEG (IC 8). Then, the free end of the spacer chain, opposite to the aptamer coupled end, was coupled to a biotin molecule.
  • a solid support containing immobilized streptavidin molecules is available (S sensor chip SA series, GE)
  • the solid support was contacted with the above aptamer compounds above in order to immobilize the nucleic acids of sequence SEQ ID N 0 86, by noncovalent association between the streptavidin molecules of the substrate and molecules of biotin aptamer compounds.
  • the aptamer Mapt2 is thus immobilized with a immobilization rate of 425 RU (1 RU corresponds approximately to 1 ⁇ g of immobilized product per mm 2 ).
  • FVII HP Human FVII purified from plasma (FVII HP, purity: 99%) was diluted in running buffer (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, CaCl 2 10 mM, MgCl 2 4 mM, pH 7.4) of to obtain four samples of concentration of FVII HP of 125, 250 (in duplicate), 500 nM and 100O mM.
  • Each sample was injected sequentially on the same chip (solid support) containing the aptaptin Mapt2 immobilized by a biotin-streptavidin interaction. Controls are obtained by injecting whites containing only the race buffer. All injections were performed with a flow rate of 30 ⁇ l / min for 60 sec. After the injection, the stroke buffer was injected onto the chip at the same rate for 120 sec. Stamp elution (EDTA, 20 mM) was then injected for 75 sec with a flow rate of 30 ⁇ l / min to unhook the FVII HP from the aptamer.
  • EDTA 20 mM
  • a solid support was made on which were immobilized molecules of the nucleic aptamer of the invention of sequence SEQ ID NO : 86, also referred to herein as "Mapt2".
  • Mapt2 Prior to its attachment to the solid support, the 5 'end of the aptamer Mapt2 was chemically coupled to a spacer chain consisting of 4 molecules of PEG (IC 8). Then, the free end of the spacer chain, opposite to the aptamer coupled end, was coupled to a biotin molecule.
  • the above solid support was brought into contact with the above aptamer compounds in order to immobilize the nucleic acids of sequence SEQ ID NO : 86, by non-covalent association between the streptavidin molecules of the support and the biotin molecules of aptamer compounds.
  • a solid support was also constructed on which molecules of a biotinylated anti-FVII polyclonal antibody were immobilized.
  • Solid supports with the Mapt2 aptamer or with the human anti-FVII polyclonal antibody consist of 96-well plates for ELISA assay;
  • Example 7 Binding aptamers to different types of human factor VII
  • a solid support was made on which were immobilized molecules of the nucleic aptamer of the invention of sequence SEQ ID NO : 86, also referred to herein as "Mapt2".
  • Mapt2 Prior to its attachment to the solid support, the 5 'end of the aptamer Mapt2 was chemically coupled to a spacer chain consisting of 4 molecules of PEG (IC 8). Then, the free end of the spacer chain, opposite to the end coupled to the aptamer, has been coupled to a biotin molecule.
  • a solid support containing immobilized streptavidin molecules (S sensor Chip SA series, GE) was then added.
  • the above solid support was then contacted with the aptamer compounds above to immobilize the nucleic acids of the present invention.
  • sequence SEQ ID NO : 86 by non-covalent association between the streptavidin molecules of the support and the biotin molecules of the aptamer compounds.
  • the aptamer Mapt2 is thus immobilized with a immobilization rate of 4326 RU (1 RU corresponds approximately to 1 ⁇ g of immobilized product per mm 2 ).
  • the part of the solid support on which Mapt2 is immobilized is called the active cell.
  • any nucleic acid molecules we immobilized on any part of the solid support called the reference cell any nucleic acid molecules, with an immobilization rate of 4069 RU.
  • Each sample was injected sequentially onto the same active cell (solid support) containing the aptaptin Mapt2 immobilized by a biotin-streptavidin interaction. Controls are obtained by injecting whites containing only the race buffer. Signals corresponding to the background noise are obtained by injecting the same samples on the reference cell containing any immobilized nucleic acids, these signals are deducted from the signals obtained on the active cell. All injections were performed with a flow rate of 30 ⁇ l / min for 60 sec. After the injection, the stroke buffer was injected onto the chip at the same rate for 120 sec.
  • a solid support was made on which were immobilized molecules of the nucleic aptamer of the invention of sequence SEQ ID NO : 86, also referred to herein as "Mapt2".
  • Mapt2 Prior to its attachment to the solid support, the 5 'end of the aptamer Mapt2 was chemically coupled to a spacer chain consisting of 4 molecules of PEG (IC 8). Then, the free end of the spacer chain, opposite to the aptamer coupled end, was coupled to a biotin molecule.
  • a solid support containing immobilized streptavidin molecules is available (S sensor chip SA series, GE)
  • the solid support was contacted with the above aptamer compounds above in order to immobilize the nucleic acids of sequence SEQ ID N 0 86, by noncovalent association between the streptavidin molecules of the substrate and molecules of biotin aptamer compounds.
  • the aptamer Mapt2 is thus immobilized with a immobilization rate of 4326 RU (1 RU corresponds approximately to 1 ⁇ g of immobilized product per mm 2 ).
  • the part of the solid support on which Mapt2 is immobilized is called the active cell.
  • the reference cell any nucleic acid molecules, with an immobilization rate of 4069 RU.
  • Each sample was injected sequentially on the same chip (solid support) containing the aptaptin Mapt2 immobilized by a biotin-streptavidin interaction. Controls are obtained by injecting whites containing only the race buffer. Signals corresponding to the background noise are obtained by injecting the same samples on the reference cell containing any immobilized nucleic acids, these signals are deducted from the signals obtained on the active cell. All injections were performed with a flow rate of 30 ⁇ l / min for 60 sec, after the injection, the stroke buffer was injected on the chip at an identical rate for 120 sec.
  • Elution buffer (EDTA, 15mM) was then injected for 30 sec with a flow rate of 30 ⁇ l / min to unhook the human FVII or rabbit aptamer ..
  • the chip can study in real time training and breaking of interactions between FVII HP and the immobilized aptamer through surface plasmon resonance (SPR). A link on the immobilized aptamer results in an increase in the signal in resonance unit (RU) recorded by the apparatus ( Figure 8).
  • SPR surface plasmon resonance
  • the affinity support was made of a solid carrier material consisting of a matrix having grafted streptavidin (streptavidin-agarose - Novagen ®).
  • a volume of 1 ml of gel was placed in a container consisting of a column (i.d., 1 mm). The gel was washed with purified water to remove the storage solvent
  • the characteristics of the gel are: - Adsorption capacity of biotin: ⁇ 85 nanomole / ml of gel
  • biotinylated anti-human FVII nucleic aptamers of sequence SEQ ID No. 86 are solubilized in purified water at the final concentration of 0.5 mg / 0.187 ml, ie a final molar concentration of 0.1 mM.
  • the nucleic aptamer solution was activated at 95 ° C. according to the standard cycle, for the immobilization of the aptamers on the solid support material.
  • the nucleic aptamer solution was previously diluted with 4.8 ml of purified water and then 1.5 ml of Me ++ buffer (5x concentrate).
  • the absorbance detector is adjusted to 1 AUFS (Absorbance Unit FuII Scale) and the OD is recorded at 254 nm of this solution at 0.575 AU 254 .
  • the aptamer affinity carriers were tested from a purified FVII / FVIIa preparation prepared according to the technique described in PCT Application No. WO2008 / 099077.
  • the starting biological material is transgenic rabbit milk containing recombinant human FVII.
  • the expression cassette comprises the human FVII transgene placed under the control of the ⁇ -casein gene promoter.
  • the average amidolytic FVII titre (biologically activatable FVII) in the milk collected is 928 IU / ml.
  • the milks are stored at a temperature of -80 ° C.
  • the rabbit milks are thawed in a water bath at a temperature of 37 ° C. and are then diluted with a solution of sodium citrate for a final concentration. in citrate of 62 g / l at a pH of 7.5.
  • the treatment with sodium citrate makes it possible to destabilize the phosphocalcic micelles of caseins.
  • the lipid-rich protein solution of the milk is then clarified on a sequence of filters, respectively (i) filter depth of 15 to 0.5 ⁇ m porosity threshold and (i) 0.2 ⁇ m membrane filter.
  • a quantity of 17.5 mg of low purity FVII (-5%) obtained at the end of the above step is purified by ion exchange chromatography, using a Q-sepharose® XL gel ( GE Healthcare) with a volume of 20 ml.
  • the human FVII is eluted with a volume of 78 ml of buffer comprising 5 mM calcium chloride.
  • Residual protein from rabbit milk is difficult to separate from
  • FVII at this stage either because there are structure homologies such as GLA domain or EGF domain proteins, or physico-chemical homologies (ionic charge and / or near molecular size).
  • structure homologies such as GLA domain or EGF domain proteins, or physico-chemical homologies (ionic charge and / or near molecular size).
  • Conventional techniques allow up to 99.95% purity improvement by orthogonal techniques (combination of hydroxyapatite gel separation and size exclusion chromatography).
  • orthogonal techniques combination of hydroxyapatite gel separation and size exclusion chromatography
  • the exogenous protein load allowed for the genetic recombination proteins must not exceed 50 ppm, ie purity> 99.995%. Such purity only seems attainable after purification on an affinity matrix.
  • a volume of 6 ml of the purified human FVII solution (1.1 mg of FVII) obtained at the end of the previous step is used for the purification step at a high level of purity of the recombinant human FVII with the support affinity of the invention.
  • the FVII solution obtained in the preceding step is injected onto the Aptamer-agarose gel (affinity support) with a peristaltic pump at a flow rate of 0.1 ml / minute is a contact time with the 10-minute affinity support (I / O).
  • the gel is washed in 50mM tris buffer + 5mM NaCl + 4mM MgCl 2 + 10mM CaCl 2 at pH 7.5.
  • a volume of 10 ml of non-adsorbed solution is collected.
  • FVII is eluted with 50mM tris buffer + 10mM EDTA pH 7.5.
  • the collection of the elution peak is carried out according to the DO profile.
  • the amount of immobilized nucleic aptamers in the affinity support is 17 nanomoles, which corresponds, for a mole to mole interaction with the FVII molecules, to an absolute capacity of the affinity support of 0. , 9 mg of FVII.
  • Figure 11 illustrates a chromatographic profile of recombinant human FVII produced in rabbit milk, with continuous monitoring of absorbance (D.O.) values at 254 nanometers.
  • the inflection (2) of the absorption curve after the moment of the injection (1) illustrates the beginning of the saturation of the affinity support with the recombinant human FVII.
  • time (3) the injection of recombinant human FVII is stopped.
  • the duration between the injection start time (1) and the injection end time (2) is 10 minutes.
  • the affinity support continues to saturate with the coagulation protein of interest: complexes between (i) the anti-nucleic aptamers FVII of the affinity support and (ii) the recombinant human FVII molecules initially contained in the composition to be purified were formed.
  • a washing step (6) of the column is carried out with the washing buffer specified above. Then the elution step is carried out by injection at the time (4) of the buffer solution comprising a final concentration of 10 mM EDTA.
  • the absorption peak illustrates the release of recombinant human FVII from recombinant nucleic Aptamer / FVII complexes. It is noted that the recombinant human FVII molecules are released rapidly and therefore in a small volume. Therefore, thanks to the affinity support of the invention, a high concentration elution solution of recombinant human FVII protein is obtained.
  • a step of regeneration of the affinity support was carried out with a 50 mM Tris buffer.
  • the visible absorbance peak in (7) corresponds to the substances released from the affinity support due to the regeneration step
  • Dynamic absorption capacity of the affinity support Table 1 below presents the results of the test, which show a dynamic adsorption capacity of 0.45 to 0.49 mg / ml of the affinity matrices 50 55% bio-available ligands.
  • Dynamic elution yield (for "Dynamic Elution”); which represents the ratio between the recombinant FVII eluted and the recombinant FVII adsorbed, expressed as a percentage Specific separation capacity of the affinity support
  • the affinity supports were evaluated for specificity by a specific ELISA assay for rabbit milk proteins.
  • Example 10 illustrate the excellent characteristics of the Aptamer agarose gel affinity carriers with a dynamic adsorption capacity of at least 1 mg of FVII per mg of ligand with an elution efficiency of at least 75%. Specificity is also well established with a clear improvement in purity (-99.95%), elimination of 2 log 10 of residual rabbit milk protein RMPs. The final rate is about 500 ppm on these 2 non-optimized trials.
  • Example 11 Capturing Aptameric Nucleic Acids According to the Invention with Human Factor VII / VIIa Immobilized on a Support A solid support was made on which were immobilized plasma purified human Vll / VIIa molecules of plasma origin.
  • Human Factor VII is immobilized on NHS-EDC-activated dextran carboxymethyl and binding to the free amines present on FVII / VIIa.
  • the human factor VII / VIIa is thus immobilized with a immobilization rate of 2525.
  • a series of 27 nucleic aptamers of the invention (purity: 99%), ranging in length from 43 to 66 nucleotides depending on the aptamers, were diluted in running buffer
  • Each sample was injected sequentially on the same chip (solid support) containing the immobilized human FVII. Controls are obtained by injecting whites containing only the race buffer. All injections were performed with a flow rate of 30 ⁇ l / min for 60 sec. After the injection, the stroke buffer was injected onto the chip at the same rate for 120 sec. Elution buffer (EDTA, 5mM) was then injected for 60 sec with a flow rate of 30 ⁇ l / min to unhook the aptamer from immobilized human FVII.
  • the chip makes it possible to study in real time the formation and the rupture of the interactions between the immobilized human FVII and each of the aptamers tested, thanks to the surface plasmon resonance (RPS).
  • a link on the immobilized human FVII results in an increase in the signal in resonance unit (RU) recorded by the device ( Figure E1).
  • RU signal in resonance unit
  • Figure E1 These analyzes are performed with the RPS Biacore T100 (GE) device. The modeling of recorded interactions is done using the Biaevaluation (GE) Software.
  • Figure 12 illustrates the binding curves of a series of 27 nucleic aptamers of the invention to human plasma Factor VII immobilized on a support, in a test according to the surface plasmon resonance technique.
  • the abscissa the time, expressed in seconds; ordinate, resonance signal, expressed in arbitrary resonance units.
  • FIG. 13 illustrates the individual values of the stable attachment signal of each of the
  • Mapt2 Human VII. Mapt2 "core sequence" is in the weak affinity group. A representative of family 2 has a very superior affinity to others. This aptamer is named Mapt 2.2 and has the following "core sequence”: ⁇ 'CCGCACGCTACGCGCATGAACCCGCGCACACGACTTGAAGTAGCS '(SEQ ID NO: 33) The results obtained nevertheless show that all tested nucleic aptamers bind with a significant affinity to plasma human factor VII.
  • Example 12 Method for Purifying Human Plasma Factor VII A. Materials and Methods
  • the aptamer used is the aptamer of sequence SEQ ID NO : 20.
  • This starting material comprises impurities, truncated forms of Factor VII and degraded forms of Factor VII.
  • a degraded form of Factor VII may comprise a form of Factor VII, the gamma-carboxylation of which is impaired.
  • Figure 14 shows the curve of measured values of absorbance at 280 nm versus time.
  • peak # 1 is the fraction of the starting material that was not retained on the column.
  • Peak No. 2 corresponds to the elution fraction.
  • lane no. 1 corresponds to the fraction of the starting material and lane no. 2 to the elution fraction. Despite the high purity of the starting material, it is found that the eluted fraction no longer contains contaminant or degraded forms
  • the aptamer used is the sequence SEQ ID N aptamer 0 86
  • the fractions are analyzed for their amidolytic activity in chromogenic assay using a Stago kit according to the supplier's recommendations (Kit Factor VIIa StatClot).
  • the amidolytic activity is then converted into ⁇ g of FVII contained in said fraction.
  • a solid support was made on which were immobilized molecules of the nucleic aptamer of the invention of sequence SEQ ID NO : 86, also referred to herein as "Mapt2".
  • Mapt2 Prior to its attachment to the solid support, the 5 'end of the aptamer Mapt2 was chemically coupled to a spacer chain consisting of 4 molecules of PEG (IC 8). Then, the free end of the spacer chain, opposite to the aptamer coupled end, was coupled to a biotin molecule.
  • a solid support containing immobilized streptavidin molecules is available (S sensor chip SA series, GE)
  • the solid support was contacted with the above aptamer compounds above in order to immobilize the nucleic acids of sequence SEQ ID N 0 86, by noncovalent association between the streptavidin molecules of the substrate and molecules of biotin aptamer compounds.
  • the aptamer Mapt2 is thus immobilized with a immobilization rate of 3772 RU (1 RU corresponds to approximately 1 ⁇ g of immobilized product per mm 2 ).
  • Transgenic human FVII resulting purified from transgenic rabbit milk (FVII HPTG, purity: 98%) was diluted in running buffer (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, CaCl 2 10 mM, MgCl 2 4 mM, pH 7.4) so as to obtain a sample of concentration 20 mM FVII.
  • the sample was injected onto the chip (solid support) containing the aptaptin Mapt2 immobilized by a biotin-streptavidin interaction. Then, buffers of increasing concentration of NaCl were injected onto the solid support (3 injection series ranging from 1 M NaCl to 3 M NaCl). All injections were performed with a flow rate of 30 ⁇ l / min for 60 sec after the injection. After the 3 sets of injection with the 3 buffers containing NaCl, elution buffer (EDTA, 1 OmM) was then injected for 75 sec with a flow rate of 30 ⁇ l / min to unhook the FVII HPTG from the aptamer.
  • elution buffer EDTA, 1 OmM
  • mapping of the immobilized aptamer Mapt2 to transgenic human FVII were calculated with the dedicated module of the software Biacore® control Software, version 1.2.
  • Mapt2 aptamer binding results to human FVII determined that binding of Mapt2 aptamer to human FVII was not impaired by injection of NaCl-containing buffers.
  • EXAMPLE 15 Specific Embodiments of a Human Factor VII Interaction Protocol with an aptamer on Biacore (Propylene Glycol Resistance) A. Materials and Methods
  • a solid support was made on which were immobilized molecules of the nucleic aptamer of the invention of sequence SEQ ID NO : 86, also referred to herein as "Mapt2".
  • Mapt2 Prior to its attachment to the solid support, the 5 'end of the aptamer Mapt2 was chemically coupled to a spacer chain consisting of 4 molecules of PEG (IC 8). Then, the free end of the spacer chain, opposite to the aptamer coupled end, was coupled to a biotin molecule.
  • a solid support containing immobilized streptavidin molecules is available (S sensor chip SA series, GE)
  • the solid support was contacted with the above aptamer compounds above in order to immobilize the nucleic acids of sequence SEQ ID N 0 86, by noncovalent association between the streptavidin molecules of the substrate and molecules of biotin aptamer compounds.
  • the aptamer Mapt2 is thus immobilized with a immobilization rate of 5319 RU (1 RU corresponds to approximately 1 ⁇ g of immobilized product per mm 2 ).
  • Purified transgenic human FVII obtained from transgenic rabbit milk (FVII)
  • HPTG, purity: 98%) was diluted in running buffer (50mM Tris, 10mM CaCl 2 , 4mM MgCl 2 , pH 7.4) to obtain a 20mM FVII concentration sample.
  • the sample was injected onto the chip (solid support) containing the aptaptin Mapt2 immobilized by a biotin-streptavidin interaction. Then, a buffer containing 50% propylene glycol was injected onto the solid support. All injections were performed with a flow rate of 30 ⁇ l / min for 60 sec after the injection. After injection with the buffer containing 50% propylene glycol, elution buffer (EDTA, 10 mM) was then injected for 75 sec with a flow rate of 30 ⁇ l / min to unhook the FVII HPTG from the aptamer.
  • EDTA elution buffer
  • mapping of the immobilized aptamer Mapt2 to transgenic human FVII were calculated with the dedicated module of the software Biacore® control Software, version 1.2.
  • Mapt2 aptamer binding results to human FVII determined that binding of Mapt2 aptamer to human FVII was not impaired by injection of the propylene glycol-containing buffer.

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Abstract

L'invention concerne un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur se liant spécifiquement au facteur Vll/Vlla humain.

Description

TITRE DE L'INVENTION
Acides nucléiques se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain, et utilisations
DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de l'identification de ligands spécifiques du Facteur Vll/Vlla humain, ces ligands étant destinés notamment à la purification et à la détection de cette protéine, ainsi qu'à leur utilisation dans le domaine médical.
ART ANTERIEUR Le facteur VII (FVII) est une glycoprotéine vitamine K-dépendante qui, sous sa forme activée (FVIIa), participe au processus de coagulation en activant le facteur X et le facteur IX en présence de calcium et de facteur tissulaire. Le FVII est sécrété sous la forme d'une chaîne peptidique unique de 406 résidus d'acides aminés, dont la masse moléculaire est d'environ 50 kDa. Le FVIIa, une glycoprotéine dépendante de la vitamine K, joue donc un rôle important dans les mécanismes de la coagulation, aboutissant à la formation de caillot sanguin. Le FVIIa présente l'intérêt de pouvoir agir localement en présence du facteur tissulaire libéré après lésion de tissus engendrant des hémorragies, même en l'absence de Facteur VIII ou IX. C'est pourquoi le FVIIa est utilisé depuis de nombreuses années pour corriger certains troubles de la coagulation se manifestant par des saignements.
Le FVII est utilisé dans le traitement des patients atteints d'hémophilie, présentant un déficit en facteur VIII (hémophilie de type A) ou en facteur IX (hémophilie de type B) , ainsi que des patients présentant d'autres déficiences des facteurs de coagulation, par exemple un déficit héréditaire en FVII. Le FVII est également préconisé dans le traitement d'accidents vasculaires cérébraux. Il est donc nécessaire de disposer de concentrés de FVIIa injectables.
La méthode la plus ancienne d'obtention de concentrés de FVIIa a consisté en la purification du FVIIa à partir de protéines plasmatiques issues du fractionnement. Le document EP 0 346 241 décrit à cet effet la préparation d'une fraction enrichie en FVIIa, obtenue après adsorption puis élution d'un sous-produit du fractionnement de protéines plasmatiques contenant le FVII et le FVIIa et d'autres protéines telles les facteurs IX (FIX), X (FX) et II (FII), notamment le prééluat du PPSB (P = prothrombine ou FII, P = proconvertine ou FVII, S = facteur de Stuart ou FX et B = facteur antihémophilique B ou FIX). L'inconvénient de ce procédé est que le FVII obtenu contient encore quelques traces d'autres facteurs de coagulation.
De même, le document EP 0 547 932 décrit un procédé de fabrication d'un concentré de FVIIa de haute pureté essentiellement dépourvu des facteurs vitamine K dépendants et du FVIII. Le FVII obtenu par ce procédé, malgré sa pureté, présente une activité thrombogénique résiduelle. Dans les années 1980, l'ADN codant pour le facteur VII humain a été isolé (Hagen et al. (1986) ; Proc. Natl . Acad. Sci. USA ; Apr 83 (8) : 2412-6) et la protéine correspondante a été exprimée dans les cellules de mammifères BHK (Baby Hamster Kidney) (document EP 0 200
421 ) . La demande de brevet FR 06 04872 déposée par la Demanderesse décrit également la production de FVIIa dans un animal transgénique.
Ces méthodes de production permettent d'obtenir des protéines sécurisées en terme de contamination par des virus ou d'autres agents pathogènes. De plus, de tels procédés permettent d'obtenir des protéines dont la séquence primaire, c'est-à-dire un enchaînement identique entre les différents acides aminés, est identique à la séquence primaire humaine. Toutefois, quelle que soit la source initiale de Facteur Vll/Vlla, les procédés mis en œuvre génèrent des compositions enrichies en Facteur Vll/Vlla humain comprenant des substances contaminantes. Pour les procédés de purification du Facteur Vll/Vlla à partir de plasma humain, il serait très avantageux de disposer d'un produit final notamment exempt, ou quasi-exempt d'activité thrombogénique résiduelle. Pour les procédés d'obtention de Facteur Vll/Vlla humain recombinant purifié, il est essentiel de disposer d'un produit final notamment exempt, ou quasi-exempt, de protéines cellulaires indésirables. En particulier, pour les compositions de Facteur Vll/Vlla humain purifié à partir de fluides biologiques provenant de mammifères transgéniques, il est important de disposer d'un produit final exempt, ou quasi- exempt, de Facteur Vll/Vlla produit par ailleurs naturellement par ces mammifères transgéniques, susceptible d'être immunogène chez l'homme.
Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de disposer de moyens efficaces et spécifiques de purification du Facteur Vll/Vlla humain à partir d'un échantillon comprenant ledit Facteur Vll/Vlla, qui puissent être produits facilement et de manière reproductible.
RESUME DE L'INVENTION
II est fourni selon l'invention des acides nucléiques monobrin ayant au moins 15 nucléotides de longueur et se liant spécifiquement au facteur Vll/Vlla humain.
La présente invention concerne aussi divers composés se liant spécifiquement au facteur Vll/Vlla humain, qui comprennent dans leur structure au moins un acide nucléique défini ci-dessus.
Elle est également relative à des complexes entre un acide nucléique ou un composé tels que définis ci-dessus et (ii) un facteur Vll/Vlla humain.
Cette invention a également trait à un support pour l'immobilisation du Facteur Vll/Vlla humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffés une pluralité d'acides nucléiques ou de composés tels que définis ci-dessus.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour l'immobilisation du facteur Vll/Vlla humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur Vll/Vlla humain avec un support tel que défini ci-dessus. L'invention est aussi relative à un procédé pour la purification du Facteur Vll/Vlla humain comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur Vll/Vlla humain avec un acide nucléique ou avec un support tel que défini ci-dessus, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (ii) le Facteur Vll/Vlla humain, et b) libérer le Facteur Vll/Vlla humain à partir du complexe former à l'étape a) et récupérer le Facteur Vll/Vlla humain purifié
L'invention concerne aussi un procédé pour détecter la présence de Facteur Vll/Vlla humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un acide nucléique ou un support tel que défini ci-dessus avec ledit échantillon; et b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (ii) le Facteur Vll/Vlla
La présente invention a également trait à des utilisations médicales préventives ou curatives des acides nucléiques tels que définis ci-dessus.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre les résultats d'un calcul du modèle de repliement d'un acide nucléique de l'invention (Mapt2). On a utilisé le le programme d'odinateur mFold , selon des paramètres identiques à ceux utilisés pour obtenir la structure rreprésentée à la figure 1 , à savoir les conditions suivantes : (i) ADN à séquence linéaire, (ii) température de repliement : 250C, (iii) conditions ioniques : [Na+] : 150 mM; [Mg++] : 4 mM, (iv) type de correction : Oligomère, (v) nombre du pourcentage de « suboptimality » : 2, (vi) limite supérieure du nombre de repliements calculés : 50, (vii) distance maximale entre deux paires de bases : pas de limite, et (viii) utilisation des valeurs par défaut pour les autres paramètres.
La Figure 2 illustre les courbes de liaison d'une diversité d'acides nucléiques de l'invention (Mapt2, Mapt3 et Mapt7) au Facteur VII humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
La Figure 3 illustre les courbes de liaison du Facteur VII humain plasmatique, utilisé à diverses concentrations, sur un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Les courbes représentent, du haut vers le bas de la figure, courbe 1 « [FVII] » : FVII humain plasmatique purifié à la concentration de 500 nM ; courbe 2 « [FVII] » : FVII humain plasmatique purifié à la concentration de 250 nM ; courbe 3 « [FVII] » : FVII humain plasmatique purifié à la concentration de 125 nM ; courbe 4 « [FVII] » : FVII humain plasmatique purifié à la concentration de 62.5 nM ; courbes inférieures : préparation d'immunoglobulines purifiées aux concentrations respectives de 62, 125, 250 et 500 nM
La Figure 4 illustre la courbe de liaison (i) du facteur VII humain recombinant à un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, puis (ii) la courbe de liaison d'un anticorps monoclonal anti-FVII humain au complexe acide nucléique immobilisé/FVII formé en (i), dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
La Figure 5 illustre une courbe de saturation d'un support sur lequel est immobilisé une acide nucléique de l'invention (Mapt2), avec le Facteur VII humain plasmatique injecté de manière continue au cours du temps. Essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. Courbe supérieure : signal obtenu avec le FVII humain purifié à la concentration de 500 nM. La Figure 6 illustre des courbes de cinétique de liaison du Facteur VII humain plasmatique sur un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires La Figure 7 illustre les courbes de liaison de protéines Facteur VII d'origines diverses sur un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires
La Figure 8 illustre les courbes de liaison du facteur VII humain plasmatique et du Facteur VII recombinant de lapin sur un acide nucléique de l'invention (Mapt2) immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
La Figure 9 illustre la structure d'un composé de liaison spécifique au Facteur Vll/Vlla humain comprenant un aptamère selon l'invention (Mapt2) couplé à une chaîne espaceur de PEG, la chaîne espaceur étant elle-même couplée à une molécule de biotine.
La Figure 10 illustre un alignement de divers aptamères se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain sélectionnés à la fin d'un cycle de mise en œuvre d'un procédé de type SELEX. Les séquences représentées sur la figure 10 sont, du haut vers le bas de la figure, respectivement les séquences SEQ ID N087 à SEQ ID N0 100.
La figure 11 illustre un profil de chromatographie obtenu lors de la mise en œuvre du procédé de purification d'un Facteur VII humain recombinant produit dans le lait de lapine avec le support d'affinité dans lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques anti-FVII humain. En abscisse ; le temps ; en ordonnées : la valeur d'absorbance (D. O. ) à 254 nanomètres.
La figure 12 illustre les courbes de liaison d'une série de 27 aptamères nucléiques de l'invention au Facteur VII humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
La figure 13 illustre les valeurs individuelles de signal de fixation stable de chacun des 27 aptamères testés. En abscisse : chacun des 27 aptamères testés ; en ordonnées : signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. La Figure 14 représente la courbe des valeurs de mesure de l'absorbance à 280 nm en fonction du temps.
La Figure 15 représente le cliché d'un gel d'électrophorèse SDS PAGE dans lequel la piste n °1 correspond à la fraction du produit de départ et la piste n°2 à la fraction d'élution.
La Figure 16 représente les courbes de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au Facteur VII humain recombinant produit dans le lait d'une lapine transgénique. Les flèches correspondent au temps des différentes injections, respectivement de gauche à droite sur la figure 16 : 1 : injection du Facteur VII recombinant ; 2 : injection d'un tampon à 1 M NaCI ; 3 : injection d'un tampon à 2M NaCI, 4 : injection d'un tampon à 3 M NaCI ; 5 : injection d'un tampon Tris 50 mM, EDTA 10 mM. En abscisse : le temps exprimé en secondes ; en ordonnées ; la valeur du signal de réponse, exprimé en unités (RU) arbitraires.
La Figure 17 représente les courbes de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au Facteur VII humain recombinant produit dans le lait d'une lapine transgénique. Les flèches correspondent au temps des différentes injections, respectivement de gauche à droite sur la figure 17 : 1 : propylène glycol à 50% ; 2 : EDTA à 10 mM.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
II est fourni selon l'invention de nouveaux moyens aptes à se lier de manière spécifique au Facteur Vll/Vlla humain, de taille réduite, faciles et peu onéreux à synthétiser, et qui peuvent être employés dans tous les domaines d'application dans lesquels de tels moyens sont utiles, y compris pour la purification du Facteur Vll/Vlla humain, pour la détection du Facteur Vll/Vlla humain et pour l'utilisation en tant que principe actif de médicaments destinés à la prévention ou au traitement des troubles de la coagulation.
Plus précisément, la demanderesse a construit une famille d'acides nucléiques monobrin aptes à se lier de manière spécifique au Facteur Vll/Vlla humain, qui ont en commun de nombreuses caractéristiques structurelles, qui seront détaillées plus loin dans la présente description. Comme cela sera détaillé plus loin, la famille d'acides nucléiques de l'invention, qui sont aptes à se lier de manière spécifique au Facteur Vll/Vlla humain, consistent en des acides nucléiques simple brin, préférentiellement de type ADN, lesquels, du fait de certaines caractéristiques structurelles apportées par leur séquence nucléotidique, sont capables d'adopter des conformations dans l'espace qui contribuent à leur conférer leurs propriétés de liaison au Facteur Vll/Vlla précitées. De manière générique, les acides nucléiques de l'invention peuvent aussi être appelés « aptamères » nucléotidiques, en référence à un terme couramment utilisé par l'homme du métier pour désigner ce type de molécules.
On connaît déjà dans l'état de la technique des aptamères nucléiques capables de se lier à diverses protéines impliquées dans la voie de la coagulation sanguine, y compris des aptamères liant le Facteur de Willebrand (Demande PCT n 0 WO 2008/150495), des aptamères liant l'alpha-thrombine (demande de brevet euopéen n0 EP 1 972 693) ou la thrombine (Zhao et al., 2008, Anal Chem, Vol. 80(19) : 7586-7593), des aptamères liant le Facteur IX/IXa (Subash et al., 2006, Thromb Haemost, Vol. 95 : 767-771 ; Howard et al., 2007, Atherioscl Thromb Vase Biol, Vol. 27 : 722-727; Demande PCT n 0 WO 2002/096926; Brevet aux Etats-Unis n0 US
7,312,325), des aptamères liant le Facteur X/Xa ( Demande PCT n 0 WO 2002/096926; Brevet aux Etats-Unis n ° US 7,312,325).
Des aptamères nucléiques se liant au facteur Vll/Vlla humain ont aussi été décrits dans l'état de la technique (Rusconi et al., 2000, Thromb Haemost, Vol. 84(5) : 841 -848; Layzer et al., 2007, Spring, Vol. 17 : 1 -1 1
La présente invention a pour objet un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur et se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain.
Dans la présente description, un acide nucléique simple brin se liant spécifiquement au
Facteur Vll/Vlla humain peut aussi être désigné « aptamère nucléique », « aptamère », « aptamère se liant au Facteur Vll/Vlla humain » ou encore « aptamère anti-FVII/Vlla humain ».
Par Facteur Vll/Vlla humain, on englobe un Facteur Vll/Vlla humain d'origine naturelle et un Facteur Vll/Vlla humain recombinant. Au sens de la présente description, un Facteur Vll/Vlla humain est considéré en référence à sa séquence en acides aminés, c'est-à-dire indépendamment du fait que la protéine soit glycosylée ou non glycosylée, et, si la protéine est glycosylée, quel que soit le type de glycosylation.
Comme cela sera également illustré plus en détail ultérieurement, certains modes de réalisation des acides nucléiques se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain de l'invention possèdent diverses caractéristiques structurelles communes, y inclus une séquence comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', successivement (i) une séquence nucléotidique spécifique invariable d'environ 20 nucléotides de longueur, suivie de (ii) une séquence nucléotidique variable d'environ 40 à 50 nucléotides de longueur, suivie de (iii) une séquence nucléotidique spécifique invariable d'environ 20 nucléotides de longueur. On précise que les séquences nucléotidiques variables (ii) peuvent posséder entre elles une très forte identité de séquence en nucléotides.
La demanderesse a donc construit une famille d'aptamères nucléiques se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain dont elle a pu montrer l'existence de relations entre (i) les caractéristiques structurelles communes et (ii) la ou les caractéristiques fonctionnelles communes.
D'un point de vue structurel, la famille d'acides nucléiques, ou aptamères nucléiques, se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain de l'invention comprend au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) suivante :
5'-[SEQ ID N0I]X-[SEQ ID N 0 X]-[SEQ ID N °2]y-3' (I), dans laquelle :
- « SEQ ID N 0 X » consiste en un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N°3 à SEQ ID N°85 et SEQ ID N°87 à SEQ ID N 0I OO,
- « x » est un entier égal à 0 ou 1 , et
- « y » est un entier égal à 0 ou 1.
Dans certains modes de réalisation, l'acide de séquence SEQ ID N0X a une longueur de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 nucléotides.
Dans d'autres modes de réalisation, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N0X a une longueur de 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49 nucléotides de longueur.
Dans certains autres modes de réalisation préférés, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N0X a une longueur de 43, 44 ou 45 nucléotides de longueur. Comme déjà mentionné précédemment, l'acide nucléique de formule (I) a au moins 15 nucléotides de longueur.
Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique de formule (I) a au moins 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41 ,
42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 ou 81 nucléotides de longueur, ce qui englobe les acides nucléiques possédant exactement chacune des longueurs spécifiées.
Dans certains modes de réalisation, du procédé d'obtention des aptamères de formule (I), les cycles successifs de sélection réalisés pour construire la famille d'acides nucléiques d'intérêt se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain ont abouti à isoler et caractériser, à chaque étape successive de sélection, des ensembles et sous-ensembles d'aptamères nucléiques comprenant, à leurs extrémités, 5' et 3', respectivement les séquences SEQ ID N°1 et SEQ ID N °2, encadrant structurellement une séquence variable SEQ ID N 0X. Dans la famille principale d'aptamères nucléiques de l'invention, l'ensemble des séquences variables SEQ ID N0X ont, entre elles une identité de séquence en nucléotides d'au moins 40%. Cela signifie que, pour la séquence SEQ ID N° X, les contraintes de structure, pour conserver la propriété de liaison au Facteur Vll/Vlla humain, sont beaucoup moindres que les contraintes de structure pour les séquences localisées respectivement aux extrémités 5' et 3' de ces aptamères nucléiques.
Lorsque l'entier « x » est égal à 0 et l'entier « y » est égal à 1 , les aptamères nucléiques de l'invention, englobent les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (1-1 ) suivante 5' -[SEQ ID N0 X]-[SEQ ID N°2] -3' (1-1 ),
Lorsque l'entier « x » est égal à 1 et l'entier « y » est égal à 0, les aptamères nucléiques de l'invention, englobent les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I-2) suivante 5'-[SEQ ID N°1] -[SEQ ID N° X]-3' (I-2)
Lorsque l'entier « x » est égal à 0 et l'entier « y » est égal à 0, les aptamères nucléiques de l'invention, englobent les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I-3) suivante : 5'-[SEQ ID N°X]-3' (l-3)
Les aptamères nucléiques ci-dessus englobent donc les acides nucléiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N°3 à SEQ ID N°85 et SEQ ID N°87 à SEQ ID N0IOO. De manière générale, un premier polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec un second polynucléotide ou acide nucléique possède au moins 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec ledit second polynucléotide ou acide nucléique.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de l'invention comprenant la séquence SEQ ID N0 X, ladite séquence SEQ ID N0 X est choisie dans le groupe constitué des acides nucléiques ayant au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence possédant au moins 40% d'identité en nucléotides avec au moins l'une des séquences SEQ ID N03 à SEQ ID N° 85 et SEQ ID N°87 à SEQ ID N°100.
Dans certains modes de réalisation d'un acide nucléique de l'invention comprenant la séquence SEQ ID N0 X, ladite séquence SEQ ID N0 X est choisie dans le groupe constitué des acides nucléiques possédant au moins 41 %, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%,
50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%,
66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %,
82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec au moins l'une des séquences SEQ ID N0 3 à
SEQ ID N° 85 et SEQ ID N°87 à SEQ ID N0I OO.
Il résulte de ce qui précède que la présente invention englobe une famille d'acides nucléiques monobrin ayant au moins 15 nucléotides consécutifs de l'enchaînement de formule
(I) défini ci-dessus. Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides des deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1 .82) les paramètres étant fixés comme suit : (1 ) CPU MODE =
ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = « full » ; (3) OUTPUT FORMAT = « aln w/numbers » ; (4)
OUTPUT ORDER = « aligned » ; (5) COLOR ALIGNMENT = « no » ; (6) KTUP (word size) =
« default » ; (7) WINDOW LENGTH = « default » ; (8) SCORE TYPE = « percent » ; (9)
TOPDIAG = « default » ; (10) PAIRGAP = « default » ; (1 1 ) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = « none » ; (12) MATRIX = « default » ; (13) GAP OPEN = « default » ; (14) END
GAPS = « default » ; (15) GAP EXTENSION = « default » ; (16) GAP DISTANCES =
« default » ; (17) TREE TYPE = « cladogram » et (18) TREE GRAP DISTANCES = « hide ». Sur la base de la structure d'un acide nucléique de l'invention qui est représentée sur la figure 1 , l'homme du métier peut aisément déterminer les séquences spécifiques possibles pour la séquence SEQ ID N 0 X , au sein de l'ensemble du nombre fini des enchaînements de nucléotides possibles.
A titre illustratif et pour certains modes de réalisation d'un aptamère nucléique de l'invention, l'homme du métier peut aisément, sur la base de la définition structurelle ci-dessus des aptamères nucléiques de formule (I), générer de manière automatique, par exemple à l'aide d'un calculateur numérique dont la mémoire est chargée avec un ensemble d'instructions approprié, l'ensemble des séquences SEQ ID N0X possibles. Le cas échéant, l'homme du métier peut ensuite déterminer automatiquement, à l'aide dudit calculateur numérique, respectivement (i) celles des séquences dont le modèle de structure dans l'espace est similaire ou identique à celle de l'aptamère nucléique de la figure 1 , et (ii) celles dont la structure de l'aptamère nucléique est distincte de celle de l'aptamère nucléique de la figure 1 .
Les aptamères nucléiques ayant une structure dans l'espace similaire ou identique à celle de l'aptamère nucléique de la figure 1 englobent ceux qui comprennent l'enchaînement de boucles et de tiges qui a été décrit précédemment pour cet aptamère nucléique.
Pour déterminer la structure dans l'espace d'un acide nucléique de formule (I), l'homme du métier peut notamment, sur la base de la description de sa séquence en nucléotides, générer un modèle structurel en utilisant le programme d'ordinateur mFold® décrit par Zuker (2003, Nucleic Acids Research, Vol. 231 (13) : 3406-3413), et qui peut aussi être utilisé à l'adresse Web suivante : http://mfold.bioinfo.rpi.edu/.
Préférentiellement, on utilise le programme d'ordinateur mFold , selon des paramètres identiques à ceux utilisés pour obtenir la structure représentée à la figure 1 , à savoir les conditions suivantes : (i) ADN à séquence linéaire, (ii) température de repliement : 25^, (iii) conditions ioniques : [Na+] : 150 mM; [Mg ++] : 4 mM, (iv) type de correction : Oligomère, (v) nombre du pourcentage de « suboptimality » : 2, (vi) limite supérieure du nombre de repliements calculés : 50, (vii) distance maximale entre deux paires de bases : pas de limite, et (viii) utilisation des valeurs par défaut pour les autres paramètres.
Puis, l'homme du métier réalise une étape de comparaison entre (i) le modèle de structure de l'aptamère de la figure 1 et (ii) le modèle de structure de l'aptamère de formule (I) qui vient d'être généré, et il sélectionne positivement l'aptamère de formule (I) qui vient d'être généré si son modèle structurel est identique ou similaire à celui de l'aptamère représenté à la figure 1.
Dans tous les cas, afin de confirmer la sélection positive de l'aptamère de formule (I) nouvellement généré, l'homme du métier peut vérifier ses propriétés de liaison au Facteur Vll/Vlla humain, par exemple selon l'une des méthodes spécifiées dans la présente description, en particulier dans les exemples.
Dans certains modes de réalisation préférés d'un aptamère nucléique de l'invention, ledit aptamère nucléique comprend au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I), ce qui englobe les aptamères comprenant 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec ledit acide nucléique de formule (I). Dans des modes de réalisation préférés d'un acide nucléique de formule (I) la séquence SEQ ID N0X possède au moins 80% d'identité en nucléotides avec au moins l'une des séquences SEQ ID N° 3 à SEQ ID N° 85 et SEQ ID N°87 à SEQ ID N0I OO, ce qui englobe les séquences possédant au moins 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 100% d'identité en nucléotides avec au moins l'une des séquences SEQ ID N° 3 à SEQ ID N° 85 et SEQ ID N°87 à SEQ ID N0I OO.
Dans d'autres modes de réalisation préférés d'un acide nucléique de formule (I) la séquence SEQ ID N0X est choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N0 3 à SEQ ID N° 85 et SEQ ID N°87 à SEQ ID N0I OO. Dans encore d'autres modes de réalisation préférés d'un acide nucléique de formule (I), la séquence SEQ ID N0 X est choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N03, 5, 6, 10, 11 , 14, 15, 16, 17, 19, 20, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 and 40.
Selon l'invention, un acide nucléique se liant au Facteur Vll/Vlla humain consiste en un acide nucléique monobrin capable de former un complexe avec le Facteur Vll/Vlla humain, lorsqu'il est mis en contact avec ce dernier.
Les acides nucléiques se liant au Facteur Vll/Vlla humain englobent donc ceux pour lesquels on peut détecter des complexes avec le Facteur Vll/Vlla humain après une étape préalable de mise en contact desdits partenaires respectivement nucléique et protéique. La détection de complexes formés entre un acide nucléique se liant au Facteur Vll/Vlla humain peut être aisément réalisée par l'homme du métier, par exemple en mettant en œuvre une technique de détection par résonance plasmonique de surface, y compris la technique Biacore®, comme cela est illustré dans les exemples. L'homme du métier peut aussi aisément détecter la formation de complexes entre un acide nucléique d'intérêt et le Facteur Vll/Vlla humain par des techniques classiques du type ELISA, comme cela est également illustré dans les exemples.
Comme cela est illustré dans les exemples, un acide nucléique de formule (I) possède une forte capacité de liaison à tout type de Facteur Vll/Vlla humain. En particulier, un acide nucléique de formule (I) se lie à la fois au Facteur Vll/Vlla humain naturel et au Facteur Vll/Vlla humain recombinant.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que les résultats présentés dans les exemples montrent qu'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention possède une forte capacité à se lier à des facteurs Vll/Vlla humains ayant des types distincts de glycosylation. En d'autres termes, le demandeur pense qu'un acide nucléique de formule (I) est capable de se lier efficacement, non seulement au Facteur Vll/Vlla provenant de sources naturelles, y compris le plasma humain, mais également à un Facteur Vll/Vlla humain recombinant produit dans un animal transgénique, préférentiellement un mammifère transgénique, de différentes espèces, y compris le lapin, dont les types de glycosylation peuvent différer, même légèrement du type de glycosylation du Facteur Vll/Vlla humain produit naturellement dans le plasma sanguin.
Selon l'invention, un acide nucléique se liant « spécifiquement » au Facteur Vll/Vlla humain consiste en un acide nucléique possédant une capacité à se lier au Facteur Vll/Vlla humain supérieure à sa capacité à se lier à toute autre protéine, y compris aux Facteurs
Vll/Vlla codés par le génome d'un mammifère non humain, tels que le Facteur Vll/Vlla de lapin.
Au sens de la présente description, un premier acide nucléique possède une capacité à se lier au Facteur Vll/Vlla humain, supérieure à celle d'un second acide nucléique, lorsque, en utilisant l'une quelconque des techniques de détection de liaison ci-dessus, et dans les mêmes conditions d'essai, une valeur de signal de liaison supérieure statistiquement significative est obtenue avec le premier acide nucléique, par rapport à celle obtenue avec les seconds acides nucléiques. De manière illustrative, lorsque la technique de détection de liaison utilisée est la technique Biacore®, comme dans les exemples, un premier acide nucléique possède une capacité à se lier au Facteur Vll/Vlla humain, supérieure à celle d'un second acide nucléique, lorsque la valeur de signal de résonance pour le premier acide nucléique, quelle que soit l'unité de mesure de résonance exprimée, est statistiquement supérieure à la valeur de signal de résonance mesurée pour le second acide nucléique. Deux valeurs de mesure « statistiquement » distinctes englobent deux valeurs qui ont entre elles un écart supérieur à l'erreur de mesure de la technique de détection de liaison utilisée. Comme cela est illustré dans les exemples, on a testé la capacité des acides nucléiques de l'invention à se lier spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain.
De manière générale, un acide nucléique de formule (I) possède une valeur de constante de dissociation pour le facteur VII/VIIA humain d'au plus 500 nM, mieux d'au plus 200 nM. On a montré que les acides nucléiques de formule (I) ont une capacité à se lier au
Facteur Vll/Vlla humain qui est significativement supérieure à leur capacité de liaison à n'importe quel Facteur Vll/Vlla provenant d'un mammifère non humain. En particulier, alors qu'un acide nucléique de formule (I) possède une forte capacité à se lier à tout type de Facteur Vll/Vlla humain, y compris naturel ou recombinant, il a une capacité faible ou nulle à se lier à un Facteur Vll/Vlla codé par le génome d'un mammifère non humain, y compris un Facteur Vll/Vlla de lapin.
Cette caractéristique avantageuse d'un acide nucléique de formule (I) est illustrée dans les exemples notamment avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N086, qui consiste en un acide nucléique de formule (I) dans lequel la séquence SEQ ID N0X consiste en la séquence SEQ ID N0 85 et dont la structure, après son couplage avec du PEG et de la biotine, est représentée sur la figure 9.
Ainsi, pour l'acide nucléique de formule (I) de séquence SEQ ID N0 86, on a déterminé selon la technique Biacore®, que la valeur de capacité de liaison au Facteur Vll/Vlla humain, exprimée comme la constante de dissociation Kd, est d'environ 100 nM. De plus, ledit acide nucléique de formule (I) possède une capacité de liaison du même ordre de grandeur à la fois au Facteur Vll/Vlla humain plasmatique et à un Facteur Vll/Vlla humain recombinant, par exemple produit chez un lapin transgénique. On a aussi montré dans les exemples que les complexes entre un acide nucléique de formule (I) et un Facteur Vll/Vlla humain sont stcechiométriques, c'est à dire que le rapport du nombre de molécules d'acide nucléique de formule (I) au nombre de molécules de Facteur Vll/Vlla humain complexées est d'environ 1 ::1 , et peut être plus particulièrement de 1 ::1.
Ainsi, selon un autre aspect, la capacité d'un acide nucléique de formule (I) à de lier « spécifiquement » au Facteur Vll/Vlla humain peut aussi être exprimé comme le rapport des constantes de dissociation Kd, respectivement pour le Facteur Vll/Vlla humain et un Facteur Vll/Vlla non humain.
Selon encore une autre caractéristique d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention, la capacité dudit acide nucléique à se lier spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain peut aussi être exprimée par la condition (A) suivante :
Kd humain/Kd non-humain < 0,01 (A), dans laquelle :
« Kd humain » est la constante de dissociation d'un acide nucléique de formule (I) pour la Facteur Vll/Vlla humain, exprimée en unités molaires, et « Kd non-humain » est la constante de dissociation dudit acide nucléique de formule (I) pour un Facteur Vll/Vlla non humain, exprimée dans les mêmes unités molaires.
Ainsi, pour un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain selon l'invention, le rapport Kd humain/Kd non-humain est préférentiellement inférieur à 0,01 , mieux inférieur à 0,001. Ces caractéristiques de spécificité de la liaison d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention au Facteur Vll/Vlla humain illustrent que les acides nucléiques aptamères de l'invention peuvent être avantageusement utilisés pour discriminer entre un Facteur Vll/Vlla humain et un Facteur Vll/Vlla provenant d'un mammifère non humain, par exemple un Facteur Vll/Vlla de lapin. En particulier, un acide nucléique de formule (I) selon l'invention peut être avantageusement utilisé dans un moyen de purification d'un Facteur Vll/Vlla humain, y compris à partir d'un milieu de départ complexe susceptible de contenir un Facteur Vll/Vlla provenant d'un mammifère non humain. Notamment, un acide nucléique de formule (I) peut être utilisé dans un moyen de purification du Facteur Vll/Vlla recombinant dans un fluide biologique d'un lapin transgénique pour le Facteur Vll/Vlla humain, ledit fluide biologique étant susceptible de contenir un Facteur Vll/Vlla produit naturellement par le lapin.
Comme cela est illustré dans les exemples, une autre caractéristique d'un acide nucléique de formule (I) est son aptitude, dans un complexe avec le Facteur Vll/Vlla humain, à libérer le Facteur Vll/Vlla humain par incubation dudit complexe avec un agent chélateur de cations métalliques. On a notamment montré que les molécules de Facteur Vll/Vlla complexées avec un acide nucléique de formule (I) sont libérées desdits complexes par mise en contact avec un agent chélateur de cations métalliques tel que l'EDTA. Ainsi, selon encore un autre aspect, la liaison d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention au facteur Vll/Vlla humain peut être dissociée par mise en contact avec un agent chélateur des cations métalliques, y compris par mise en contact avec de l'EDTA.
Cette caractéristique additionnelle d'un acide nucléique de formule (I) selon l'invention est particulièrement avantageuse pour l'utilisation dudit acide nucléique dans un moyen de purification du Facteur Vll/Vlla humain. En effet, dans un telle application pour la purification, le Facteur Vll/Vlla humain, immobilisé dans un complexe avec un acide nucléique de formule (I), peut ensuite être récupéré sous forme purifiée par simple mise en contact ou incubation avec un agent chélateur des cations métalliques, donc sans nécessiter l'emploi de substances connues pour dénaturer, au moins partiellement, le Facteur Vll/Vlla humain, comme les conditions acides ou l'urée.
Pour son utilisation dans un moyen de purification du Facteur Vll/Vlla humain, un acide nucléique de formule (I) selon l'invention est préférentiellement immobilisé sur un support solide. Ledit support solide englobe des particules solides, des supports de chromatographie, etc. Les techniques d'immobilisation d'acides nucléiques d'intérêt sur des types très variés de supports solides sont bien connues par l'homme du métier.
Le support solide peut être une colonne de chromatographie d'affinité composée d'un gel dérivé de l'agarose, de la cellulose ou d'un gel synthétique tel qu'un dérivé acrylamide, méthacrylate ou polystyrène, une puce telle qu'une puce adaptée à la résonance plasmonique de surface, une membrane telle qu'une membrane polyamide, polyacrylonitrile ou polyester ou encore une bille magnétique ou paramagnétique.
Pour son utilisation dans un moyen de purification du Facteur Vll/Vlla humain, un acide nucléique de formule (I) selon l'invention est préférentiellement inclus dans une structure chimique comprenant également un moyen espaceur et, le cas échéant, un moyen d'immobilisation sur un support solide. Ainsi, la présente invention est également relative à un composé se liant spécifiquement au facteur Vll/Vlla humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (II) suivante :
[SPAC]- [NUCL] (II), dans laquelle :
- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et
- [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I).
Le composé ci-dessus constitue un mode de réalisation particulier d'un moyen de purification du Facteur Vll/Vlla humain. La « chaîne espaceur » désignée [SPAC] dans le composé de formule (II) peut être de tout type connu. Ladite chaîne espaceur a pour fonction d'éloigner physiquement l'acide nucléique [NUCL] de la surface du support solide sur lequel ledit composé peut être immobilisé et de permettre une mobilité relative de l'acide nucléique [NUCL], par rapport à la surface du support solide sur lequel il peut être immobilisé. La chaîne espaceur limite ou évite que des encombrements stériques, dus à une trop grande proximité du support solide avec l'acide nucléique de formule (I), gênent les événements de liaison entre ledit acide nucléique et des molécules de Facteur Vll/Vlla humain susceptibles d'être mises en contact avec celui-ci.
Dans le composé de formule (II), la chaîne espaceur est liée préférentiellement à l'extrémité 5' ou à l'extrémité 3' de l'acide nucléique [NUCL].
Avantageusement la chaîne espaceur est liée à la fois à une extrémité de l'aptamère et au support solide. Cette construction avec espaceur a pour avantage de ne pas immobiliser directement l'aptamère sur le support solide. De préférence la chaîne espaceur est un oligonucléotide non spécifique ou du Polyéthylène Glycol (PEG). Lorsque la chaîne espaceur consiste en un oligonucléotide non spécifique, ledit oligonucléotide comprend avantageusement au moins 5 nucléotides de longueur, de préférence entre 5 et 15 nucléotides de longueur.
Dans les modes de réalisation d'un composé de formule (II) dans lesquels la chaîne espaceur consiste en un Polyéthylène Glycol, ladite chaîne espaceur englobe un polyéthylène glycol de type PEG(CI 8). Pour immobiliser l'aptamère directement sur le support solide, ou sur la chaîne espaceur, l'acide nucléique [NUCL] peut être modifié chimiquement avec différents groupements chimiques tels que des groupements permettant d'immobiliser ledit acide nucléique de façon covalente, tels que des thiols, des aminés ou tout autre groupement capable de réagir avec des groupements chimiques présents sur le support solide. Dans certains modes de réalisation, la chaîne espaceur est-elle-même apte à être immobilisée sur le support solide, le cas échéant après modification de ladite chaîne espaceur avec un ou plusieurs groupements chimiques appropriés. Dans encore d'autres modes de réalisation, la chaîne espaceur est liée à un composé permettant l'immobilisation du composé d'intérêt comprenant l'aptamère nucléique sur le support mobile. Ainsi, la présente invention est également relative à un composé se liant spécifiquement au facteur Vll/Vlla humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (III) suivante :
[FIX]-[SPAC]- [NUCL] (III), dans laquelle :
- [FIX] signifie un composé d'immobilisation sur un support,
- [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et - [NUCL] signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I). Le composé de formule (III) ci-dessus constitue un mode de réalisation d'un moyen de purification du Facteur Vll/Vlla humain.
Ledit moyen de purification du Facteur Vll/Vlla humain de formule (II) ou de formule (III) se présente préférentiellement sous une forme liée à un support solide. Dans le composé de formule (III) le composé [FIX] consiste en un composé choisi parmi
(i) un composé capable de former une ou plusieurs liaisons covalente avec le matériau de surface d'un support solide et (ii) un composé capable de se lier spécifiquement sur le support solide par l'intermédiaire de liaison faibles non covalentes, y compris des liaisons hydrogènes, des forces électrostatiques ou des forces de Van der Waals. Le premier type de composé [FIX] englobe les agents de couplage bifonctionnels, comme le glutaraldéhyde, le SIAB ou encore le SMCC.
Le composé SIAB, décrit par Hermanson GT. (1996, Bioconjugate techniques, San Diego : Académie Press, pp 239-242), est le composé de formule (I) suivante :
Figure imgf000017_0001
(I)
Le composé SIAB comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe iodoacétate et un groupe ester Sulfo-NHS, ces groupes réagissant respectivement sur des groupes amino et sulfhydryl.
Le composé SMCC, qui est décrit par Samoszuk M. K. et al. (1989, Antibody, Immunoconjugates Radiopharm., 2(1 ) : 37-46), est le composé de formule (II) suivante :
Figure imgf000017_0002
(II)
Le composé SMCC comprend deux groupes réactifs, respectivement un groupe ester Sulfo-NHS et un groupe maléimide, qui réagissent respectivement avec un groupe amino et un groupe sulfhydryl. Le second type de composé [FIX] englobe la biotine, qui est capable de se lier de manière spécifique non covalente à des molécules d'avidine ou de streptavidine présentes sur le support solide.
Dans certains modes de réalisation, une fois immobilisé sur le support solide via la chaîne espaceur, l'aptamère est avantageusement modifié à son extrémité libre (extrémité non liée à l'espaceur) grâce à, et sans s'y limiter, un nucléotide chimiquement modifié (tel que 2'-O- methyl ou 2'-fluoropyrimidine, 2'-ribopurine, phosphoramidite), un nucléotide inversé ou un groupement chimique (PEG, polycations, cholestérol). Ces modifications permettent de protéger certains aptamères des dégradations enzymatiques. Le support solide peut être une colonne de chromatographie d'affinité composée d'un gel dérivé de l'agarose, de la cellulose ou d'un gel synthétique tel qu'un dérivé acrylamide, méthacrylate ou polystyrène, une puce telle qu'une puce adaptée à la résonance plasmonique de surface, une membrane telle qu'une membrane polyamide, polyacrylonitrile ou polyester, une bille magnétique ou paramagnétique. La présente invention est également relative à un complexe entre :
(i) une substance choisie parmi un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (II) et un composé de formule (III), et (ii) un Facteur Vll/Vlla humain.
La présente invention a aussi pour objet un support pour l'immobilisation du Facteur Vll/Vlla humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffées une pluralité de molécules consistant chacune en, ou comprenant chacune, un aptamère nucléique, lesdites molécules étant choisies parmi (a) un acide nucléique de formule
(I), (b) un composé de formule (II) et (c) un composé de formule (III).
Le support ci-dessus peut être utilisé pratiquement dans toutes les applications pour lesquelles on cherche à immobiliser le Facteur Vll/Vlla humain, ce qui englobe les applications à des fins de purification du Facteur Vll/Vlla et les applications à des fins de détection du Facteur Vll/Vlla humain.
La réalisation de supports sur lesquels sont immobilisés des aptamères nucléiques de l'invention se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain sont largement illustrés dans les exemples, dans lesquels les aptamères de l'invention sont utilisés notamment comme agents de capture du FVII/Vlla humain, utilisables pour la purification ou pour la détection du FVII/Vlla humain dans des échantillons.
La présente invention concerne donc aussi un procédé pour l'immobilisation du facteur Vll/Vlla humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur Vll/Vlla humain avec un support solide sur lequel a été préalablement immobilisée une substance choisie parmi un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (II) et un composé de formule (III). Ledit procédé peut comprendre, selon les objectifs techniques poursuivis, une étape additionnelle de récupération des molécules de Facteur Vll/Vlla humain immobilisées, complexées avec les molécules d'acides nucléiques de formule (I). L'étape additionnelle de récupération du Facteur Vll/Vlla consiste préférentiellement en une étape de mise en contact des complexes de Facteur Vll/Vlla avec les acides nucléiques de formule (I) avec un agent chélateur des cations métalliques, tel que l'EDTA. La présente invention a encore pour objet un procédé pour la purification du Facteur
Vll/Vlla humain comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur Vll/Vlla humain avec un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (II), un composé de formule (III) ou avec un support solide tel que défini dans la présente description, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support et (ii) le Facteur Vll/Vlla humain, et b) libérer le Facteur Vll/Vlla humain à partir du complexe former à l'étape a) et récupérer le Facteur Vll/Vlla humain purifié.
Pour la réalisation de procédés de purification de protéine par chromatographie d'affinité en utilisant des supports solides sur lesquels sont immobilisés les aptamères d'intérêt, l'homme du métier peut se référer aux travaux décrits par Romig et al. (1999, J Chomatogr B Biomed Sci ApI, Vol. 731 (2) : 275-284).
On a montré dans les exemples que les conditions de capture du Facteur VII sont améliorées lorsqu'on utilise à l'étape a) un tampon à concentration réduite en MgCI2 ou même un tampon exempt de MgCI2. Par tampon à concentration réduite en MgCI2, on entend selon l'invention un tampon dont la concentration finale en MgCI2 est inférieure à 1 mM.
Un tampon dont la concentration en MgCI2 est inférieure à 1 mM englobe les tampons dont la concentration en MgCI2 est inférieure à 0,5 mM, 0,1 mM, 0,05 mM et 0,01 mM, avantageusement égale à 0 mM. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape a'), l'étape a' suivant l'étape a) et précédant l'étape b), qui consiste en une étape de lavage du support d'affinité avec un tampon de lavage. Avantageusement, le procédé comprend une étape a1) de lavage du support d'affinité au cours de laquelle on augmente la force ionique, c'est à dire qu'on utilise un tampon de lavage dont la force ionique est augmentée par rapport à la force ionique du tampon utilisé à l'étape a). Avantageusement, la force ionique du tampon de lavage utilisé à l'étape a') est supérieure de 2 à 500 fois par rapport à la force ionique du tampon utilisé à l'étape a). Avantageusement, la force ionique du tampon de lavage est supérieure de 100 à 500 fois, de préférence de 200 à 500 fois, par rapport à la force ionique du tampon utilisé à l'étape a). On a montré dans les exemples que l'utilisation, à l'étape a') de lavage, d'un tampon de lavage ayant une force ionique élevée, en particulier un tampon ayant une concentration élevée en NaCI, permet d'éliminer efficacement les substances liées de manière non-spécifique au support d'affinité sans simultanément affecter de manière détectable la liaison du Facteur VII au support d'affinité.
A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une concentration finale en NaCI d'au moins 1 M. Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une concentration finale en NaCI d'au moins 1 M englobe les tampons de lavage ayant une concentration finale en NaCI d'au moins 1 ,5 M, 2 M, 2,5 M ou au moins 3 M.
De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une concentration finale en NaCI d'au plus 3,5 M. Avantageusement, un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une concentration finale en NaCI comprise entre 1 ,5 et 3,5, de préférence entre 2 et 3,5, y compris de préférence entre 2,5 et 3,5, par exemple de préférence entre 3 et 3,5.
On a également montré dans les exemples que l'utilisation à l'étape a') d'un tampon de lavage ayant une hydrophobicité élevée, en particulier une concentration élevée en propylène glycol, permet d'éliminer efficacement les substances liées de manière non-spécifique au support d'affinité sans simultanément affecter de manière détectable la liaison du Facteur VII au support d'affinité.
A l'étape a'), on utilise ainsi de préférence un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% (v/v).
Selon l'invention, un tampon de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 20% englobe les tampons de lavage ayant une teneur finale en propylène glycol d'au moins 25% M, 30%, 35%, 40% , 45%, 50%, 55%, ou au moins 60% en volume, par rapport au volume total du tampon de lavage.
De préférence un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol d'au plus 50%. Avantageusement, un tampon de lavage utilisé à l'étape a') du procédé a une teneur finale en propylène glycol comprise entre 20% et 50%, de préférence entre 30% et 50%.
Selon un mode de réalisation particulier, le tampon de lavage utilisé à l'étape a') contient à la fois du NaCI et du propylène glycol comme décrit ci-dessus.
De plus, dans certains modes de réalisation du procédé de purification ci-dessus, l'étape b) est réalisée par la mise en contact du support d'affinité avec un tampon d'élution contenant un agent chélateur des ions divalents, de préférence l'EDTA.
A titre illustratif, le tampon d'élution peut contenir une concentration finale d'EDTA d'au moins 1 mM et d'au plus 30 mM.
L'expression « au moins 1 mM » englobe au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mM. L'expression « au plus 30 mM » englobe au plus 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 , 20,
19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou 1 1 mM. De plus, la fabrication d'un support d'affinité comprenant un aptamère nucléique de l'invention et la réalisation d'un procédé de purification du Facteur VII humain avec ledit support d'affinité est illustré dans les exemples.
De manière générale, les supports solides sur lesquels peuvent être immobilisés les aptamères de l'invention englobe tout type de support ayant la structure et la composition retrouvée communément pour les supports de filtre, de support de silicium pour des puces, des membranes, etc. Les supports solides englobent notamment les résines, les résines pour colonne de chromatographie d'affinité, les billes de polymères, les billes magnétiques, etc. Les supports solides englobent aussi notamment les matériaux à base de verre ou de métal, tels que l'acier, l'or, l'argent, l'aluminium, le cuivre, le silicium, le verre, la céramique. Les supports solides englobent aussi notamment des matériaux polymères, tels qu'un polyéthylène, un polypropylène, un polyamide, un fluorure de polyvinylidène, et des combinaisons de ceux-ci.
Le support solide peut être revêtu avec un matériau facilitant l'attachement, la fixation, la formation de complexes, l'immobilisation ou l'interaction avec les aptamères. Dans certains modes de réalisation, le support solide est une lame de verre dont la surface est revêtue d'une couche d'or, d'une couche ayant subi un traitement par carboxyméthylation, d'une couche de dextran, de collagène, d'avidine, de streptavidine, etc.
De cette manière, les aptamères selon l'invention peuvent être immobilisés sur le support solide par l'intermédiaire d'un revêtement d'attachement, comme par exemple décrit ci- dessus, soit par réaction chimique avec création de liaisons covalentes, soit par association par des liaisons non covalentes telles que des liaisons hydrogène, des forces électrostatiques, des forces de Van der Waals, etc.
Selon l'invention, par « support d'affinité », on entend de manière générale un support formé d'un matériau solide sur lequel on a immobilisé des aptamères nucléiques tels que définis dans la présente description.
Les exemples décrivent des modes de réalisation de supports solides sur lesquels sont immobilisés, par des liaisons non covalentes, les aptamères de l'invention.
Dans les exemples, on décrit notamment des supports solides consistant en une lame de verre revêtue d'une couche de molécules de streptavidine, et des aptamères de l'invention conjugués à une molécule de biotine qui sont immobilisé sur le support par association non covalente biotine/streptavidine.
Dans les exemples, on décrit aussi des supports solides consistant en un matériau de polystyrène revêtu d'une couche de molécules de streptavidine, et des aptamères de l'invention conjugués à une molécule de biotine qui sont immobilisé sur le support par association non covalente biotine/streptavidine.
Dans certains modes de réalisation, les aptamères de l'invention peuvent être immobilisés sur un support solide adapté pour la chromatographie d'affinité, l'électrochromatographie et l'électrophorèse capillaire, comme décrit par exemple par Ravelet et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 1 17(1 ) : 1 -10), Connor et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 1 1 1 (2) : 1 15-1 19), Cho et al. (2004, Electrophoresis, Vol. 25 (21 -22) : 3730-3739) ou encore Zhao et al. (2008, Anal Chem, Vol. 80(10) : 3915-3920).
Un aptamère de formule (I) ayant au moins 15 nucléotides de longueur et se liant spécifiquement au Facteur VII/VIIA humain, un composé de formule (II), ou un composé de formule (III), peut être aussi avantageusement utilisé comme agent de capture du FVII/Vlla humain, dans des procédés et dispositifs de détection ou de diagnostic.
Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne aussi un procédé pour détecter la présence de Facteur Vll/Vlla humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact (i) un acide nucléique de formule (I), un composé de formule (II) ou un composé de formule (III) ou un support solide sur lequel sont immobilisés une pluralité de molécules dudit acide nucléique ou dudit composé, avec (ii) ledit échantillon; et b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique de formule (I), ledit composé de formule (II) ou ledit composé de formule (III) ou ledit support et (ii) le Facteur
Vll/Vl la.
Les exemples de la présente demande de brevet fournissent divers modes de réalisation de procédés de détection du FVII/Vlla humain avec des aptamères de l'invention préalablement immobilisés sur un support solide. Pour la réalisation d'un procédé de détection selon l'invention, le support solide utilisé peut être un support solide choisi parmi les supports solides décrits précédemment en relation avec le procédé de purification du Facteur Vll/Vlla humain.
Pour la réalisation d'un procédé ou d'un dispositif de détection du Facteur Vll/Vlla humain, l'homme du métier peut se référer notamment aux techniques décrites dans la demande de brevet européen n° EP 1 972 693, la demande PCT n 0 WO 2008/038696, la demande PCT n0 WO 2008/025830, ou encore la demande PCT n0 WO 2007/0322359.
Dans certains modes de réalisation, l'étape b) de détection de la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support solide et (ii) le Facteur Vll/Vlla humain peut être réalisé par mesure du signal de résonance plasmonique de surface, comme cela est décrit dans les exemples.
Dans certains autres modes de réalisation, l'étape b) de détection de la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique ou ledit support solide et (ii) le Facteur Vll/Vlla humain peut être réalisée par la mise en contact desdits complexes éventuellement formés avec un ligand du Facteur Vll/Vlla humain, ledit ligand étant détectable. Dans les exemples, on décrit ces modes de réalisation dans lesquels on utilise, comme ligand détectable du Facteur Vll/Vlla humain, des anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-FVII/Vlla humain, marqués avec une enzyme, en l'occurrence la peroxydase de raifort, comme cela est conventionnellement utilisé dans les tests de type ELISA. Avantageusement, l'échantillon comprenant, ou susceptible de comprendre, du Facteur Vll/Vlla humain consiste en un échantillon liquide qui contient le Facteur Vll/Vlla humain, y compris un échantillon liquide comprenant le Facteur Vll/Vlla humain et qui est susceptible de contenir aussi des molécules de Facteur Vll/Vlla d'un mammifère non humain. Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique, tels qu'un fluide corporel, une cellule, un broyât cellulaire, un tissu, un broyât tissulaire, un organe ou un organisme entier.
Dans certains modes de réalisation du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon consiste en une solution biologique liquide provenant d'un animal tel que du sang, un dérivé du sang (dérivé sanguin), du lait de mammifère ou un dérivé du lait de mammifère. Ledit échantillon peut consister en du plasma, du cryoprécipité du plasma, du lait clarifié ou leurs dérivés.
Dans des modes de réalisation particulièrement préférés du procédé de purification ou du procédé de détection ci-dessus, ledit échantillon provient d'un animal transgénique pour le Facteur Vll/Vlla humain. Avantageusement la solution est du lait de mammifère ou un dérivé du lait de mammifère transgénique pour le Facteur Vll/Vlla humain. Au sens de l'invention, les animaux transgéniques englobent (i) les mammifères non humains tels que les vaches, les chèvres, les lapins, les porcs, les singes, les rats ou les souris, (ii) les oiseaux ou encore (iii) les insectes tels que les moustiques, les mouches ou les vers à soie. Dans certains modes de réalisation préférés, l'animal transgénique pour le Facteur Vll/Vlla humain est un mammifère transgénique non humain, de manière tout à fait préférée une lapine transgénique pour le Facteur Vll/Vlla humain. Avantageusement, le mammifère transgénique produit le Facteur Vll/Vlla recombinant dans ses glandes mammaires, du fait de l'insertion dans son génome d'une cassette d'expression comprenant acide nucléique codant le Facteur Vll/Vlla humain qui est placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique permettant l'expression de la protéine transgénique dans le lait dudit mammifère transgénique.
Une méthode de production du Facteur Vll/Vlla humain dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN comprenant un gène codant le Facteur Vll/Vlla humain, ledit gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait (tels que le promoteur de la caséine, de la béta- caséine, de la lactalbumine, de la béta-lactoglobuline ou le promoteur WAP) est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors le Facteur Vll/Vlla humain.
Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine de l'invention. Un plasmide contenant le promoteur WAP (Whey Acidic Protein) est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine de l'invention sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques. D'autres documents décrivent des procédés de préparation de protéines dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'homme. On peut citer, sans s'y limiter les documents US 7,045,676 (souris transgénique) et EP 1 739 170. (production de facteur von Willebrand dans un mammifère transgénique).
Selon d'autres aspects de la présente invention, un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur et se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain peut être utilisé in vivo, dans des situations physiologiques nécessitant de provoquer une inhibition de l'activation du Facteur X par le Facteur VIIa, par exemple en inhibant la formation d'un complexe fonctionnel Facteur Vil/Facteur tissulaire (« Tissue Factor »).
En d'autres termes, un acide nucléique aptamère tel que défini dans la présente description peut aussi être utilisé, à titre préventif ou curatif, en tant que principe actif anticoagulant d'un médicament.
En particulier, un acide nucléique aptamère tel que défini dans la présente description peut être utilisé comme principe actif préventif ou curatif anticoagulant, notamment pour le traitement de troubles de la coagulation incluant les thromboses veineuses, les thromboses artérielles, les thromboses post-chirurgicales, les troubles associés aux pontages coronariens (CABG), les accidents vasculaires cérébraux, les angioplasties coronariennes percutanées transdermiques (PTCA), les métastases tumorales, les réactions inflammatoires non-sévères ou sévères, les chocs septiques, l'hypotension, le syndrome de détresse respiratoire aigu (ARDS), les embolismes pulmonaires, la coagulation intravasculaire disséminée (DIC), les resténoses vasculaires, le dépôt de plaquettes, l'infarctus du myocarde, l'angiogénèse, et tout traitement prohylactique d'hommes ou de femmes ayant un risque de développer une thrombose.
La présente invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur se liant spécifiquement au facteur Vll/Vlla humain tel que défini dans la présente description, en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. La quantité d'acide nucléique aptamère anti-FVII/FVIIa humain selon l'invention, dans une composition pharmaceutique, est adaptée pour permettre l'administration d'une quantité efficace de ce principe actif aux patients.
Les gammes de doses de l'aptamère anti-FVII/Vlla humain de l'invention peut être aisément déterminée par le médecin ou le pharmacien. En général, la quantité de principe actif à administrer varie avec l'âge, la condition médicale, et le sexe du patient, ainsi qu'avec le degré d'extension de la maladie ou du degré du risque de développer la maladie, et peut être aisément déterminée par l'homme du métier.
En général, une composition pharmaceutique comprend une quantité d'un aptamère anti-FVII/Vlla humain allant de 1 nanogramme à 100 milligrammes par dose unitaire, mieux allant de 100 nanogrammes à 10 milligrammes par dose unitaire.
En général, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend de 0,01% à 99,9% en poids d'un aptamère anti-FVII/Vlla, ou d'une combinaison de plusieurs aptamères anti-FVII/Vlla, et de 99,9% à 0,01% en poids d'un excipient, ou d'une combinaison d'excipients, par rapport au poids total de ladite composition.
Dans certains modes de réalisation, ladite composition pharmaceutique comprend 1 , 2, 3, 4, 5 ou 6 aptamères anti-FVII/Vlla distincts.
Pour réaliser une composition pharmaceutique selon l'invention, l'homme du métier peut avantageusement se référer à l'ouvrage de Remington. La composition pharmaceutique selon l'invention peut être utilisée pour une administration parentérale, topique ou locale et de manière prophylactique et/ou thérapeutique. Ainsi un aptamère anti-FVII/Vlla humain selon la présente invention est préparé sous une forme adaptée au type d'administration choisi, par exemple sous forme liquide ou sous forme lyophilisée. Les compositions pharmaceutiques d'aptamères anti-FVII/Vlla humain selon la présente invention peuvent contenir un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable, de préférence aqueux. De nombreux excipients et/ou véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent être utilisés, par exemple, l'eau, l'eau tamponnée, une solution saline, une solution de glycine et leurs dérivés ainsi que des agents nécessaires pour reproduire les conditions physiologiques comme par exemple des agents tampons et ajusteurs de pH, des surfactants comme l'acétate de sodium, le lactate de sodium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le chlorure de calcium, cette liste n'étant pas limitative. De plus, la composition pharmaceutique peut être stérilisée par des techniques de stérilisation bien connues de l'homme du métier. De manière générale, pour fabriquer une composition pharmaceutique conforme à l'invention, l'homme du métier peut avantageusement se référer également à la dernière édition de la Pharmacopée Européenne, par exemple à la 5è édition de la Pharmacopée Européenne publiée en janvier 2005, ou bien encore à la 6è édition de la Pharmacopée Européenne, disponible au public en juin 2007. Pour la fabrication d'une composition pharmaceutique comprenant un aptamère comme principe actif, l'homme du métier peut également se référer au contenu de la demande PCT n° WO 2007/058801 , de la demande PCT n0 WO 2005/084412 et la demande PCT n0 WO 2004/047742. ou encore dans la demande PCT n0 WO 2008/150495. Dans certains modes de réalisation d'une composition pharmaceutique selon l'invention, le ou les principes actifs aptamères anti-FVII/Vlla humain peut (peuvent) être utilisé(s) seul(s) ou en combinaison avec une ou plusieurs autres molécules pharmaceutiquement actives, y compris avec un ou plusieurs autres principes actifs anticoagulants.
L'invention est également relative à un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur se liant spécifiquement au facteur Vll/Vlla humain, tel que défini dans la présente description, pour son utilisation en tant que médicament.
L'invention a aussi trait à l'utilisation d'un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur se liant spécifiquement au facteur Vll/Vlla humain, tel que défini dans la présente description, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des troubles de la coagulation.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides de longueur se liant spécifiquement au facteur Vll/Vlla humain, tel que défini dans la présente description, pour le traitement des troubles de la coagulation.
L'invention a aussi pour objet une méthode de prévention ou de traitement d'un trouble de la coagulation, comprenant une étape au cours de laquelle on administre, à un patient nécessitant un traitement préventif ou curatif d'un trouble de la coagulation, une composition pharmaceutique aptamère anti-FVII/Vlla humain tel que défini dans la présente description.
En général, on administre une dose quotidienne d'un aptamère anti-FVII/Vlla humain tel que défini dans la présente description allant de 1 nanogramme à 100 milligrammes, mieux allant de 100 nanogrammes à 10 milligrammes, pour un patient de 80 kgs.
La présente invention est également illustrée ci-après, sans y être limitée, aux exemples suivants.
EXEMPLES Exemple 1 : Capture d'acides nucléiques aptamères selon l'invention par du Facteur Vll/Vlla humain immobilisé sur un support.
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de Facteur Vll/Vlla humain purifié d'origine plasmatique.
On réalise une immobilisation du Facteur VII humain sur dextran carboxymethyl activé par NHS-EDC et se liant aux aminés libres présentes sur le FVII/Vlla.
Le Facteur Vll/Vlla humain est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 2743 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2). Des aptamères nucléiques de l'invention (pureté : 99%), respectivement l'aptamère Mapt 2 (SEQ ID N° 86), l'aptamère Mapt 3 (SEQ ID N °41 ) et l'aptamère Mapt 7 (SEQ ID N° 58), ont été dilués dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCI2 10 mM, MgCI2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir trois échantillons d'aptamères. Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant le FVII humain immobilisé. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30μl/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 5mM) a ensuite été injecté pendant 60 sec avec un débit de 30μl/min pour décrocher l'aptamère du FVII humain immobilisé. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII humain immobilisé et chacun des aptamères Mapt2, Mapt3 et Mapt 7 testés, grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur le FVII humain immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 2). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuées à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les résultats obtenus montrent que tous les aptamères nucléiques testés se lient avec une affinité significative au Facteur VII humain plasmatique.
Exemple 2 : Capture du Facteur Vll/Vlla humain par un acide nucléique aptamère selon l'invention, immobilisé sur un support.
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N0 86, aussi désigné ici « Mapt2 ». Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(CI 8). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à l'aptamère, a été couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Série S sensor Chip SA, GE)
Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci- dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N0 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères. L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 983 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2) . Du FVII humain purifié à partir du plasma (FVII HP, pureté : 99%) a été dilué dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCI2 10 mM, MgCI2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir quatre échantillons de concentration en FVII HP de 62, 125, 250 et 500 nM.
Séparément, une préparation d'immunoglobulines polyvalentes (Tégéline®, commercialisée par le LFB, France) a été diluée dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCI2 10 mM, MgCI2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir quatre échantillons de concentration en immunoglobulines polyvalentes de 62, 125, 250 et 500 nM.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30μl/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 5mM) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30μl/min pour décrocher le FVII HP de l'aptamère..La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII HP, ou les immunoglobulines polyvalentes, et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 3). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Cet exemple montre que l'aptamère Mapt2, une fois immobilisé se lie spécifiquement au FVII HP, avec une affinité significative. L'aptamère Mapt2 ne se lie pas aux immunoglobulines polyvalentes.
Exemple 3 : Capture du Facteur Vll/Vlla humain par un acide nucléique aptamère selon l'invention, immobilisé sur un support.
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N0 86, aussi désigné ici « Mapt2 ». Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(CI 8). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à l'aptamère, a été couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Série S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci- dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N0 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères. L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 424,9 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
Du FVII humain purifié à partir du plasma (FVII HP, pureté : 99%) a été dilué dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCI2 10 mM, MgCI2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir un échantillon de concentration en FVII HP de 50O nM.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30μl/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 5mM) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30μl/min pour décrocher le FVII HP de l'aptamère. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII HP et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 4). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE).
Afin de vérifier que le produit qui se lie à l'aptamère immobilisé est bien le FVII, une séquence d'injection comprenant (i) le FVII HP à 50OnM et (ii) un anticorps monoclonal anti-FVII à 1 μM (Sigma, Ref Clone n° MC1476/E.A.8.1) a été réalisée sur la même puce. Les conditions d'injection et d'analyse sont identiques à celle décrites précédemment. Si l'aptamère retient effectivement du FVII, l'injection d'anticorps monoclonal anti-FVII doit se traduire par une augmentation du signal en RU consécutif à la liaison des anticorps sur le FVII lui même lié à l'aptamère. En témoins des anticorps seuls sont injectés. L'augmentation de signal en RU montre bien que l'aptamère reconnaît le FVII (Figure 4). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel
Biaevaluation (GE).
Les résultats de cet exemple montrent que l'aptamère, une fois immobilisé, se lie spécifiquement au FVII HP, avec une affinité significative et que le signal observé est bien du à la rétention du FVII sur l'aptamère.
Exemple 4 : Stoechiométrie aptamère Mapt2/FVII humain plasmatiαue
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N0 86, aussi désigné ici « Mapt2 ». Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(CI 8). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à l'aptamère, a été couplée à une molécule de biotine. On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Série S sensor Chip SA, GE)
Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci- dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N0 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 983 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
Du FVII humain purifié à partir du plasma (FVII HP, pureté : 99%) a été dilué dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCI2 10 mM, MgCI2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir un échantillon de concentration en FVII HP de 1 μM.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30μl/min pendant 700 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 2OmM) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30μl/min pour décrocher le FVII HP de l'aptamère. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII HP, et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 5). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE). Les résultats de cet exemple montrent que des quantités croissantes de FVII humain se lient à l'aptamère Mapt2 au cours du temps d'injection et que la saturation des sites aptamères par les molécules de FVII humain n'est pas encore atteinte à la fin de la durée d'injection (700 sec).
Les résultats montrent qu'une grande partie des molécules d'aptamère Mapt2 immobilisées à la surface du support solide sont capables de lier le FVII humain. Ces résultats signifient que la conformation dans laquelle l'aptamère est apte à lier sa cible est suffisamment stable pour que la grande majorité des aptamères soient sous cette forme et que cette conformation n'est pas significativement altérée ou gênée par l'immobilisation.
Ces résultats montrent aussi que la stœchiométrie de liaison Mapt2/FVII humain est d'environ 1/1.
Pour la liaison Mapt2/FVII humain, le signal maximum attendu était de : [MW FVII/MW Mapt2]*niveau immobilisation*stoechio, avec : - MW FVII signifie le poids moléculaire du FVII humain, égal à 50 kDa
- MW Mapt2 signifie le poids moléculaire de Mapt2, égal à 27 kDa,
- niveau d'immobilisation est dans cet exemple de 983,3, et
- steochio signifie la stœchiométrie Mapt2/FVII, qui est égale à 1. Avec la formule ci-dessus, la valeur du signal maximum attendu était de : 1820 RU.
On calcule ensuite le pourcentage d'aptamères Mapt2 ayant lié une molécule de Facteur VII humain, selon la formule : Signal Mesuré/Signal Attendu, avec :
- Signal Mesuré qui est égal à 1 124 RU, et - Signal Attendu qui est égal à 1820 RU
Selon la formule ci-dessus, le pourcentage de molécules de l'aptamère Mapt2 ayant lié une molécule de FVII humain à la fin de l'injection est de 62%.
Exemple 5 : Cinétique de la liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain plasmatique On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N0 86, aussi désigné ici « Mapt2 ». Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(CI 8). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à l'aptamère, a été couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Série S sensor Chip SA, GE)
Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci- dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N 0 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 425 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2) .
Du FVII humain purifié à partir du plasma (FVII HP, pureté : 99%) a été dilué dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCI2 10 mM, MgCI2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir quatre échantillons de concentration en FVII HP de 125, 250 (en duplicate), 500 nM et 100O mM.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30μl/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 2OmM) a ensuite été injecté pendant 75 sec avec un débit de 30μl/min pour décrocher le FVII HP de l'aptamère.
Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les courbes de la cinétique de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au FVII humain plasmatique ont été calculées avec le module dédié du logiciel Biacore® control Software, version 1.2.
Les courbes de la cinétique de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au FVII humain plasmatique sont représentées sur la Figure 6.
Les résultats du calcul de cinétique de liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain ont permis de déterminer que :
- la constante de dissociation Kd de Mapt2 est de 99,9 nM, et
- la constante d'association Ka (= 6,25.103 M 1S"1) de Mapt2 est de 6,25.104 s"1
Exemple 6 : Elution du FVII humain recombinant par l'EDTA
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N0 86, aussi désigné ici « Mapt2 ». Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(CI 8). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à l'aptamère, a été couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées
Puis, on a mis en contact le support solide ci dessus ci-dessus avec les composés aptamères ci-dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N0 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
On a aussi fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules d'un anticorps polyclonal anti-FVII biotinylé. Les supports solides avec l'aptamère Mapt2 ou avec l'anticorps polyclonal anti-FVII humain consistent en des plaques de 96 puits pour test ELISA;
Pour la révélation, on a utilisé un anticorps polyclonal anti-FVII humain marqué par la peroxydase de raifort.
Les conditions de l'essai sont détaillées ci-dessous.
- Plaque : Biobind Streptavidin coated (Thermo ref : 95029293) Tampons :
- Immobilisation : Tris 5OmM, NaCI 15OmM, Tween 20 0,1% / pH = 7,5 Lavage Ca2+/Mg2+: Tris 5OmM, NaCI 5OmM, CaCI2 1 OmM, MgCI2 4mM, Tween 20 0,1% /pH = 7,4
- Lavage EDTA : EDTA 1 OmM dans eau PPI + Tween 20 0,1%
- Liαand : Mapt 2 obtenue par synthèse chimique chez Eurogentec. Concentration pour l'immobilisation 20OnM, volume = 100μl, 1 h à température ambiante
- Liαands témoins : Anticorps polyclonnal anti-FVII purifié sur chromatographie d'affinité FVII (R&D System, ref :BAF 2338) Concentration pour l'immobilisation 20OnM, volume = 10Oμl, 1 h à température ambiante
- Echantillon : FVII humain transgénique produit chez le lapin stabilisé avec 1 % BSA, lot: 479186. Concentration = 10OnM, volume déposé = 100μl, 1 H15 à température ambiante
- Anticorps de révélation : issu du kit Asserachrom FVIhAg (diagnostica Stago) préparé selon les recommandations du fournisseur. Volume = 10Oμl, 45min à température ambiante
- Révélation : 10OuI par puits d'une solution d'OPD + H2O2
- Arrêt de la réaction : H2SO4 50μl par puits
- Lecture à 492 nm
Les résultats, exprimés en D. O. à 492 nm, sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
Figure imgf000033_0001
Résultats en caractères gras : aptamère Mapt2 (SEQ ID N °86) immobilisé Résultats en caractères normaux : anticorps polyclonal anti-FVII humain immobilisé
Les résultats de cet exemple montrent que seule une fixation du FVII humain avec l'aptamère Mapt 2 permet une élution avec de l'EDTA.
Exemple 7 : Liaison des aptamères à différents types de Facteur VII humain
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N0 86, aussi désigné ici « Mapt2 ». Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(CI 8). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à l'aptamère, a été couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Série S sensor Chip SA, GE) Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci- dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N0 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 4326 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2). La partie du support solide sur laquelle est immobilisée Mapt2 est appelée cellule active.
Selon la même technique, on a immobilisé sur une partie indépendante du support solide appelée cellule de référence des molécules d'acide nucléique quelconques, avec un taux d'immobilisation de 4069 RU.
On a utilisé différents types de Facteur VII humain, respectivement :
- du FVII humain plasmatique obtenu selon le procédé de purification Acset,
- du FVII humain recombinant produit chez le lapin,
- du FVII humain recombinant produit chez la chèvre, et - du FVII humain recombinant (Novoseven® commercialisé par Novo)
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur la même cellule active (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine- streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Des signaux correspondant au bruit de fond sont obtenus en injectant les mêmes échantillons sur la cellule de référence contenant les acides nucléiques quelconques immobilisés, ces signaux sont retranchés aux signaux obtenus sur la cellule active. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30μl/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 15mM) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30μl/min pour décrocher le FVII de l'aptamère.. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 7). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel
Biaevaluation (GE).
Les résultats sont représentés sur la Figure 7. Les résultats de cet exemple montrent que l'aptamère, une fois immobilisé, se lie spécifiquement à une grande variété de Facteur VII humain, y compris du Facteur VII humain plasmatique et des facteurs VII humains recombinants produits dans divers animaux transgéniques, incluant le lapin et la chèvre.
Exemple 8 : Liaison spécifique des aptamères au Facteur VII humain
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N0 86, aussi désigné ici « Mapt2 ». Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(CI 8). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à l'aptamère, a été couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Série S sensor Chip SA, GE)
Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci- dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N0 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères. L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 4326 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
La partie du support solide sur laquelle est immobilisée Mapt2 est appelée cellule active. Selon la même technique, on a immobilisé sur une partie indépendante du support solide appelée cellule de référence des molécules d'acide nucléique quelconques, avec un taux d'immobilisation de 4069 RU.
On a utilisé différents types de Facteur VII, respectivement :
- du FVII humain plasmatique obtenu selon le procédé de purification Acset,
- du FVII de lapin recombinant commercialisé par la société American Diagnostica (Ref 407RAB, Lot n ° 080818).
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Des signaux correspondant au bruit de fond sont obtenus en injectant les mêmes échantillons sur la cellule de référence contenant les acides nucléiques quelconques immobilisés, ces signaux sont retranchés aux signaux obtenus sur la cellule active. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30μl/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 15m M) a ensuite été injecté pendant 30 sec avec un débit de 30μl/min pour décrocher le FVII humain ou de lapin de l'aptamère.. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII HP et l'aptamère immobilisé grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur l'aptamère immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure 8). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE).
La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE). Les résultats de cet exemple montrent que l'aptamère, une fois immobilisé, est très spécifique du FVII/Vlla humain et ne se lie pas au FVII/Vlla de lapin.
Exemple 9 : préparation d'un support d'affinité
Le support d'affinité a été réalisé à partir d'un matériau de support solide consistant en une matrice sur laquelle on a greffé de la streptavidine (streptavidin-agarose - Novagen®).
On a introduit un volume de 1 ml de gel dans un conteneur consistant en une colonne (i.d. 1 1 mm). On a lavé le gel avec de l'eau purifiée, pour éliminer le solvant de stockage
Les caractéristique du gel sont : - Capacité d'adsoφtion de biotine : ≥ 85 nanomole / ml de gel
- Test fonctionnel : Capture >99% de thrombine biotinylée en 30 minutes à TA - Autres tests : Protease-free , endo/exonucléase-free, RNase-free.
- Conservateur : 100 mM sodium phosphate pH7,5 + NaN3 0,02
La sortie de la colonne conditionnée (« packée ») (Hauteur de lit de gel = 1cm) est connectée à un détecteur d'absorbance équipé d'un filtre UV à 254 nm et d'un enregistreur.
Les aptamères nucléiques anti-FVII humain biotinylés de séquence SEQ ID N° 86 sont solubilisés dans de l'eau purifiée à la concentration finale de 0,5 mg/0,187 ml, soit une concentration molaire finale de 0,1 mM. La solution d'aptamères nucléiques a été activée à 950C selon le cycle standard, pour l'immobilisation des aptamères sur le matériau support solide..
La solution d'aptamères nucléiques a été préalablement diluée par 4,8 ml d'eau purifiée puis 1 ,5 ml de tampon Me++ (5 x concentré). Le détecteur d'absorbance est ajusté à 1 AUFS (Absorbance Unit FuII Scale) et on enregistre la DO à 254 nm de cette solution à 0,575 UA254.
La solution d'aptamères nucléiques biotinylés est injectée sur le gel streptavidin-agarose pré-conditionnée (« prépackée ») et mise en recirculation avec une pompe péristaltique à un débit de 2,5 ml/minute, soit un temps de contact sur le gel de 24 secondes (entrée/sortie E/S). Dans ces conditions, la DO à 254 nm se stabilise rapidement à 0,05 UA254, soit une valeur de 91% de couplage théorique, c'est-à-dire 0,455 mg d'aptamères nucléiques par millilitre de gel.
Un lavage avec un tampon 10 mM CaCI2 + 4 mM MgCI2 puis en NaCI 2M est réalisé, afin d'éliminer les aptamères nucléiques qui ne sont pas fixées spécifiquement aux molécules de streptavidine greffées sur le matériau de support solide.
Example 10 : Procédé de purification du Facteur VII recombinant humain
Les supports d'affinité aptamères ont été testés à partir d'une préparation purifiée en FVII/FVIIa préparée selon la technique décrite dans la demande PCT n° WO2008/099077.
Préparation de l'échantillon à purifier
La matière biologique de départ est du lait de lapine transgénique contenant du FVII humain recombinant. La cassette d'expression comprend le transgène FVII humain placé sous le contrôle du promoteur du gène de la β-caseine.
Brièvement, 140 millilitres de lait ont été collectés sur 2 lapines en première lactation entre le Jour 4 et le Jour 12 après mise bas.
Le titre moyen en FVII amidolytique (FVII biologiquement activable) dans le lait collecté est de 928 Ul/ml. Les laits sont conservés à une température de -8O0C. Pour l'essai, les laits de lapine sont décongelés au bain-marie à la température de 370C, puis sont dilués par une solution de Citrate de Sodium pour une concentration finale en citrate de 62 g/l à un pH de 7,5.
Le traitement par le citrate de sodium permet la déstabilisation des micelles phosphocalciques de caséines. La solution protéique riche en lipides du lait est ensuite clarifiée sur une séquence de filtres, respectivement (i) filtre profondeur de 15 à 0,5 μm de seuil de porosité puis (i) filtre membrane à 0,2 μm.
Un volume de 360 ml de solution filtrée ayant un titre en FVII de 198 Ul/ml, soit 36 mg de FVII transgénique, est pré-purifié sur un gel de chromatographie MEP-HyperCel® (PaII BioSepra) d'un volume de 16 mL. Ce gel de capture permet d'éliminer 95% des protéines du lait, dont la plus grande partie des caséines, tout en conservant 60% de la quantité de FVII initiale.
Une quantité de 17,5 mg de FVII de faible pureté (-5%) obtenu à la fin de l'étape ci- dessus est purifiée par chromatographie d'échanges d'ions, en utilisant un gel de Q- sepharose® XL (GE Healthcare) d'un volume de 20 mL, Le FVII humain est élue avec un volume de 78 ml de tampon comprenant 5 mM de chlorure de calcium. La concentration en FVII amydolitique est de 337 Ul/ml, soit 0,17 mg de FVII/ml et la concentration en protéines totales est estimée à 0,18 mg/ml par mesure de DO à 280 nm et ε1% = 13, soit une pureté en FVII de 94%.
Les protéines résiduelles provenant du lait de lapine sont difficilement séparables du
FVII à ce stade, soit parce qu'il existe des homologies de structures telles que des protéines à GLA-domaines ou à domaine EGF, ou bien des homologies physico-chimiques (charge ionique et/ou taille moléculaire proche). Les techniques classiques permettent une amélioration de la pureté jusqu'à 99,95% par des techniques orthogonales (combinaison de séparation sur gel d'hydroxyapatite et par chromatographie d'exclusion de taille). Cependant, pour l'injection répétée à l'homme, la charge en protéines exogènes admises pour les protéines de recombinaison génétique ne doit pas dépasser 50 ppm soit une pureté > 99,995%. Une telle pureté ne semble atteignable qu'après purification sur matrice d'affinité.
Etape de purification du FVII recombinant humain sur le support d'affinité de l'invention
Un volume de 6 ml de la solution de FVII humain purifié (1 ,1 mg de FVII) obtenue à la fin de l'étape précédente est utilisé pour l'étape de purification à un haut niveau de pureté du FVII humain recombinant avec le support d'affinité de l'invention.
La solution de FVII obtenue à l'étape précédente, préalablement ajustée à 4 mM MgCI2 et 10 mM CaCI2 et pH 7,5, est injectée sur le gel Aptamère-agarose (support d'affinité) avec une pompe péristaltique à un débit de 0,1 ml/minute soit un temps de contact avec le support d'affinité de 10 minutes (E/S).
Après injection, le gel est lavé en tampon tris 50 mM + NaCI 5OmM + 4 mM MgCI2 + 10 mM CaCI2 à pH 7,5.
Un volume de 10 ml de solution non adsorbé est collecté.
Le FVII est élue par un tampon tris 5OmM + EDTA 10 mM à pH 7,5. La collecte du pic d'élution est réalisée suivant le profil de DO.
Selon les calculs molaires, la quantité d'aptamères nucléiques immobilisés dans le support d'affinité est de 17 nanomoles, ce qui correspond, pour une interaction mole à mole avec les molécules de FVII, à une capacité absolue du support d'affinité de 0,9 mg de FVII.
La figure 1 1 illustre un profil de chromatographie du FVII humain recombinant produit dans le lait de lapine, avec un suivi en continu des valeurs d'absorbance (D. O. ) à 254 nanomètres.
Sur la Figure 1 1 , l'inflexion (2) de la courbe d'absorption, après le moment de l'injection (1 ) illustre le début de la saturation du support d'affinité avec le FVII humain recombinant. Au temps (3) l'injection de FVII humain recombinant est stoppée. Pour illustrer l'échelle linéaire des temps sur la Figure 1 , on indique que la durée entre le temps de début d'injection (1 ) et le temps de fin d'injection (2) est de 10 minutes. Le support d'affinité continue de se saturer avec la protéine de la coagulation d'intérêt : des complexes entre (i) les aptamères nucléiques anti- FVII du support d'affinité et (ii) les molécules de FVII humain recombinant initialement contenues dans la composition à purifier ont été formés. Après passage de la composition à purifier, on procède à une étape de lavage (6) de la colonne avec le tampon de lavage spécifié précédemment. Puis on réalise l'étape d'élution, par injection au temps (4) de la solution tampon comprenant une concentration finale de 10 mM en EDTA. Le pic d'absorption illustre la libération du FVII humain recombinant à partir des complexes Aptamères nucléiques/FVII recombinant. On note que les molécules de FVII humain recombinant sont libérées rapidement et donc dans un faible volume. En conséquence, grâce au support d'affinité de l'invention, on obtient une solution d'élution de forte concentration en protéine FVII humain recombinant. Au temps (5), on a réalisé une étape de régénération du support d'affinité, avec un tampon Tris à 50 mM. Le pic d'absorbance visible en (7) correspond aux substances libérées du support d'affinité du fait de l'étape de régénération
Capacité dynamique d'absorption du support d'affinité Le tableau 1 ci-dessous présente les résultats de l'essai, qui montrent une capacité dynamique d'adsorption de 0,45 à 0,49 mg/ml des matrices d'affinité soit 50 à 55% de ligands bio-disponibles.
En EDTA, on calcule un rendement dynamique d'élution d'environ 75%.
Tableau 2 : bilan FVII recombinant humain et Protéines totales des essais de matrices Aptamères-aαarose:
Figure imgf000039_0001
Départ : échantillon de départ Final : composition des fractions
BDC / capacité dynamique d'absorption (pour « Dynamic Binding Capacity »)
DE : Rendement dynamique d'élution (pour « Dynamic Elution ») ; qui représente le rapport entre le FVII recombinant élue et le FVII recombinant adsorbé, exprimé en pourcentage Capacité de séparation spécifique du support d'affinité
Les supports d'affinité ont été évalués en spécificité par un dosage ELISA spécifique des protéines du lait de lapines.
Les résultats sont représentés dans le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 : bilan de la spécificité des supports d'affinité :
Figure imgf000040_0001
Les résultats du Tableau 3 ci-dessus montrent que l'on obtient une moyenne de 2 log10 d'élimination des Aptamères-agarose portant la pureté du FVII humain transgénique de 98,3% à 99,95%. Ceci montre une bonne spécificité des aptamères vis-à-vis du FVII humain et très peu d'interactions aux protéines résiduelles du lait de lapines.
Une amélioration est possible par des lavages intermédiaires avant élution par des solutions telles que NaCI 2M et/ou Propylène Glycol ou Ethylène Glycol à 50% si dans ces conditions le FVII ne s'élue pas.
Les résultats de l'exemple 10 illustrent les excellentes caractéristiques des supports d'affinité sur gel Aptamère-agarose avec une capacité dynamique d'adsorption d'au moins 1 mg de FVII par mg de ligand avec un rendement d'élution d'au moins 75%. La spécificité est également bien établie avec une nette amélioration de la pureté (-99,95%), une élimination de 2 logio des RMP « rabbit milk proteins » résiduelles. Le taux final s'établit à environ 500 ppm sur ces 2 essais non optimisés.
Exemple 11 : Capture d'acides nucléiques aptamères selon l'invention par du Facteur Vll/Vlla humain immobilisé sur un support On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de Facteur Vll/Vlla humain purifié d'origine plasmatique.
On réalise une immobilisation du Facteur VII humain sur dextran carboxymethyl activé par NHS-EDC et se liant aux aminés libres présentes sur le FVII/Vlla. Le Facteur Vll/Vlla humain est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 2525
RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2).
Une série de 27 aptamères nucléiques de l'invention (pureté : 99%), d'une longueur variant de 43 à 66 nucléotides selon les aptamères, ont été dilués dans du tampon de course
(Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCI2 10 mM, MgCI2 4 mM, pH 7,5) de manière à obtenir trois échantillons d'aptamères. Chaque aptamère testé a été injecté à la concentration finale de 1 μM dans le tampon de course.
Chaque échantillon a été injecté de façon séquentielle sur une même puce (support solide) contenant le FVII humain immobilisé. Des contrôles sont obtenus en injectant des blancs ne contenant que du tampon de course. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30μl/min pendant 60 sec, après l'injection, du tampon de course a été injecté sur la puce à un débit identique pendant 120 sec. Du tampon d'élution (EDTA, 5mM) a ensuite été injecté pendant 60 sec avec un débit de 30μl/min pour décrocher l'aptamère du FVII humain immobilisé. La puce permet d'étudier en temps réel la formation et la rupture des interactions entre le FVII humain immobilisé et chacun des aptamères testés, grâce à la résonance plasmonique de surface (RPS). Une liaison sur le FVII humain immobilisé se traduit par une augmentation du signal en unité de résonance (RU) enregistré par l'appareil (Figure E1). Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuées à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les résultats sont présentés dans les figures 12 et 13.
La figure 12 illustre les courbes de liaison d'une série de 27 aptamères nucléiques de l'invention au Facteur VII humain plasmatique immobilisé sur un support, dans un essai selon la technique de résonnance plasmonique de surface. En abscisse : le temps, exprimé en secondes; en ordonnées, signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires. La figure 13 illustre les valeurs individuelles de signal de fixation stable de chacun des
27 aptamères testés. En abscisse : chacun des 27 aptamères testés ; en ordonnées : signal de résonance, exprimé en Unités de résonance arbitraires.
On observe quatre groupes d'aptamères se distinguant par leur affinité pour le Facteur
VII humain. Mapt2 « core séquence » se trouve dans le groupe d'affinité faible. Un représentant de la famille 2 possède une affinité très supérieure aux autres. Cet aptamère est nommé Mapt 2.2 et possède la « core séquence » suivante : δ'CCGCACGCTACGCGCATGAACCCGCGCACACGACTTGAAGTAGCS' (SEQ ID N°33) Les résultats obtenus montrent néanmoins que tous les aptamères nucléiques testés se lient avec une affinité significative au Facteur VII humain plasmatique.
Exemple 12 : Procédé de purification du Facteur VII plasmatique humain A. Matériel et Méthodes
A.1. Le support de chromatoαraphie d'affinité
Matière Gel d'affinité sur lequel on a immobilisé l'aptamère « Mapt-2 core » couplé directement à la biotine, sans chaîne espaceur entre l'aptamère et la biotine. L'aptamère est immobilisé sur un gel streptavidine (Fournisseur Novagen) grâce à une biotine en 5' terminal avec une densité de ligand théorique 0,4 mg/ml : volume 1 ml packé dans une colonne XK16 (GE)
L'aptamère utilisé est l'aptamère de séquence SEQ ID N0 20. Ce produit de départ comprend des impuretés, des formes tronquées de Facteur VII et des formes dégradées de Facteur VII. Une forme dégradée de Facteur VII peut comprendre une forme de Facteur VII dont la gamma-carboxylation est altérée.
A.3. Le protocole de purification
Equilibration gel : Tris-HCI 0,050 M, CaCI2 0,010 M, MgCI2 0,05mM pH 7,5, Elution : Tris-HCI 0,020 M, EDTA 0,010 M, pH 7,5, 240μg de FVII VII plasmatique humain purifié à 98% est injecté avec un débit de 0,5ml/min en tampon d'équilibration
Après détection du pic de non retenu 2 volumes de colonne de tampon d'élution est injecté. On détecte les pics de protéines par mesure de la valeur d'absorbance à la longueur d'onde de 280 nanomètres.
B. Résultats
Les résultats sont illustrés sur les figures 14 et 15.
La Figure 14 représente la courbe des valeurs de mesure de l'absorbance à 280 nm en fonction du temps. Sur la Figure 14, le pic n°1 correspond à la fraction du produit de départ qui n'a pas été retenue sur la colonne. Le pic n°2 correspond à la fraction d'élution.
Le produit de départ ainsi que le produit élue a été analysé en SDS PAGE avec coloration au nitrate d'argent afin de visualiser l'élimination des impuretés. La Figure 15 représente ce gel : la piste n°1 correspond à la fraction du produit de départ et la piste n °2 à la fraction d'élution. Malgré la pureté importante du produit de départ on constate que la fraction éluée ne contient plus de contaminant ou de formes dégradées
Les résultats de des figures 14 et 15 montrent que l'aptamère de séquence SEQ ID N0 20 est capable de lier le FVII humain et de l'éluer spécifiquement en présence d'EDTA. Exemple 13 : Absence de liaison de l'aptamère au FVII de lapin A. Matériel et Méthodes
A.1. Le support de chromatoαraphie d'affinité
Gel d'affinité couplé à la streptavidine sur lequel on a immobilisé l'aptamère de séquence SEQ ID N 0 86 par l'intermédiaire d'une chaîne espaceur (Fournisseur Novagen) via une biotine en 5' terminal avec une densité de ligand théorique 0,35 mg/ml : volume 1 ml,
L'aptamère utilisé est l'aptamère de séquence SEQ ID N 086
A.2. Le produit de départ
Eluât d'hydroxyapatite enrichi en FVII de lapin obtenu par purification à partir de plasma de lapin, temps de contact 10 minutes, débit 0,5ml/min
A.3. Le protocole de purification
Equilibration gel Tris-HCI 0,050 M, CaCI2 0,010 M, MgSO3 0,05mM pH 7,5,
Elution Tris-HCI 0,050 M, EDTA 0,010 M, pH 7,5,
36μg injecté dans le gel avec temps de contact 10 minutes, l'élution est réalisée par injection de
2ml de tampon d'élution On détecte les pics de protéines par mesure de la valeur d'absorbance à la longueur d'onde de
280 nanomètres.
A.4. les protocoles d'analyse des fractions en protéines et en Facteur VII
Les fractions sont analysées pour leur activité amidolytique en dosage chromogénique grâce à un kit Stago selon les recommandations du fournisseur (Kit Facteur VIIa StatClot). L'activité amidolytique est ensuite convertie en μg de FVII contenu dans ladite fraction.
B. Résultats
Les résultats sont illustrés sur le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4
Figure imgf000043_0001
Les résultats du tableau 4 montrent que le Facteur VII de lapin n'est pas retenu sur le gel d'affinité sur lequel est immobilisé l'aptamère Mapt-2 de séquence SEQ ID N° 86.
Exemple 14 : Modes de réalisation spécifiques d'un protocole d'interaction du Facteur VII humain avec un a pt a mère sur Biacore (résistance au NaCI)
A. Matériel et Méthodes
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N0 86, aussi désigné ici « Mapt2 ». Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(CI 8). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à l'aptamère, a été couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Série S sensor Chip SA, GE)
Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci- dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N0 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères. L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 3772 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2) .
Du FVII humain transgénique purifié obtenu à partir de lait de lapine transgénique (FVII HPTG, pureté : 98%) a été dilué dans du tampon de course (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, CaCI2 10 mM, MgCI2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir un échantillon de concentration 20OmM en FVII.
L'échantillon a été injecté sur la puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Ensuite, des tampons de concentration croissante en NaCI ont été injectés sur le support solide (3 séries d'injection allant de 1 M de NaCI à 3 M de NaCI). Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30μl/min pendant 60 sec après l'injection. Après les 3 séries d'injection avec les 3 tampons contenant du NaCI, du tampon d'élution (EDTA, 1 OmM) a ensuite été injecté pendant 75 sec avec un débit de 30μl/min pour décrocher le FVII HPTG de l'aptamère.
Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les courbes de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au FVII humain transgénique ont été calculées avec le module dédié du logiciel Biacore® control Software, version 1.2. Les résultats liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain ont permis de déterminer que la liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain n'est pas altérée par l'injection des tampons contenant du NaCI.
B. Résultats
Les résultats sont illustrés dans la figure 16
Exemple 15 : Modes de réalisation spécifiques d'un protocole d'interaction du Facteur VII humain avec un aptamère sur Biacore (résistance au propylène qlycol) A. Matériel et Méthodes
On a fabriqué un support solide sur lequel ont été immobilisées des molécules de l'aptamère nucléique de l'invention de séquence SEQ ID N086, aussi désigné ici « Mapt2 ». Préalablement à sa fixation sur le support solide, l'extrémité 5' de l'aptamère Mapt2 a été chimiquement couplée à une chaîne espaceur constituée de 4 molécules de PEG(CI 8). Puis, l'extrémité libre de la chaîne espaceur, opposée à l'extrémité couplée à l'aptamère, a été couplée à une molécule de biotine.
On dispose d'un support solide contenant des molécules de streptavidine immobilisées (Série S sensor Chip SA, GE)
Puis, on a mis en contact le support solide ci-dessus avec les composés aptamères ci- dessus afin d'immobiliser les acides nucléiques de séquence SEQ ID N0 86, par association non covalente entre les molécules de streptavidine du support et les molécules de biotine des composés aptamères.
L'aptamère Mapt2 est ainsi immobilisé avec un taux d'immobilisation de 5319 RU (1 RU correspond approximativement à 1 pg de produit immobilisé par mm2) . Du FVII humain transgénique purifié obtenu à partir de lait de lapine transgénique (FVII
HPTG, pureté : 98%) a été dilué dans du tampon de course (Tris 50 m M, CaCI2 10 mM, MgCI2 4 mM, pH 7,4) de manière à obtenir un échantillon de concentration 20OmM en FVII.
L'échantillon a été injecté sur la puce (support solide) contenant l'aptamère Mapt2 immobilisé par une interaction biotine-streptavidine. Ensuite, un tampon contenant 50% de propylène glycol a été injecté sur le support solide. Toutes les injections ont été réalisées avec un débit 30μl/min pendant 60 sec après l'injection. Après l'injection avec le tampon contenant 50% de propylène glycol, du tampon d'élution (EDTA, 1OmM) a ensuite été injecté pendant 75 sec avec un débit de 30μl/min pour décrocher le FVII HPTG de l'aptamère.
Ces analyses sont effectuées avec l'appareil de RPS Biacore T100 (GE). La modélisation des interactions enregistrées sont effectuée à l'aide du Logiciel Biaevaluation (GE).
Les courbes de liaison de l'aptamère immobilisé Mapt2 au FVII humain transgénique ont été calculées avec le module dédié du logiciel Biacore® control Software, version 1.2. Les résultats liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain ont permis de déterminer que la liaison de l'aptamère Mapt2 au FVII humain n'est pas altérée par l'injection du tampon contenant du propylène glycol.
B. Résultats
Les résultats sont illustrés dans la figure 17

Claims

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain, ledit acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) suivante :
5'-[SEQ ID N°1]x-[SEQ ID N0 X]-[SEQ ID N°2]y-3' (I), dans laquelle :
- « SEQ ID N0 X » consiste en un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N°3 à SEQ ID N°85 et SEQ ID N°87 à SEQ ID N 0I OO,
- « x » est un entier égal à 0 ou 1 , et
- « y » est un entier égal à 0 ou 1.
2. Acide nucléique selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la séquence SEQ ID N0 X est choisie dans le groupe constitué des acides nucléiques possédant au moins 40% d'identité en nucléotides, mieux au moins 80% d'identité en nucléotides, avec au moins l'une des séquences SEQ ID N° 3 à SEQ ID N085 et SEQ ID N°87 à SEQ ID N°100.
3. Acide nucléique selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence SEQ ID N0X est choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N0 3 à SEQ ID N0 85 et SEQ ID N°87 à SEQ ID N°100.
4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N°3 à SEQ ID N°85 et SEQ ID N°87 à SEQ ID N0IOO
5. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence SEQ ID N°86.
6. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il possède une capacité à se lier spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain exprimée par la condition (A) suivante :
Kd humain/Kd non-humain < 0,01 (A), dans laquelle :
- « Kd humain » est la constante de dissociation d'un acide nucléique de formule (I) pour la Facteur Vll/Vlla humain, estimée en unités molaires, et - « Kd non-humain » est la constante de dissociation dudit acide nucléique de formule (I) pour un Facteur Vll/Vlla non humain, exprimée dans les mêmes unités molaires.
7. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il possède une valeur de constante de dissociation pour le facteur VII/VIIA humain d'au plus 500 nM, mieux d'au plus 200 nM.
8. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce sa liaison au facteur Vll/Vlla humain peut être dissociée par mise en contact avec un agent chélateur des cations métalliques.
9. Composé se liant spécifiquement au facteur Vll/Vlla humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (II) suivante :
[SPAC]- [NUCL] (II), dans laquelle : - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et
- NUCL signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) tel que défini dans la revendication 1.
10. Composé se liant spécifiquement au facteur Vll/Vlla humain, caractérisé en ce qu'il est de formule (III) suivante :
[FIX]-[SPAC]- [NUCL] (III), dans laquelle :
- [FIX] signifie un composé d'immobilisation sur un support, - [SPAC] signifie une chaîne espaceur, et
- NUCL signifie un acide nucléique se liant spécifiquement au Facteur Vll/Vlla humain comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide ayant au moins 40% d'identité en nucléotides avec l'acide nucléique de formule (I) tel que défini dans la revendication 1.
11. Complexe entre (i) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8 ou un composé selon l'une des revendications 9 et 10 et (ii) un facteur Vll/Vlla humain.
12. Support pour l'immobilisation du Facteur Vll/Vlla humain, caractérisé en ce qu'il comprend un matériau support solide sur lequel sont greffés une pluralité d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 8 ou de composés selon l'une des revendications 9 et 10.
13. Procédé pour l'immobilisation du facteur Vll/Vlla humain sur un support, comprenant une étape au cours de laquelle on met en contact un échantillon comprenant du Facteur Vll/Vlla humain avec un support selon la revendication 12.
14. Procédé pour la purification du Facteur Vll/Vlla humain comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon comprenant du Facteur Vll/Vlla humain avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8, ou avec un composé selon l'une des revendications 9 et 10, ou avec un support selon la revendication 12, afin de former un complexe entre (i) ledit acide nucléique, ou ledit composé, ou ledit support et (ii) le Facteur Vll/Vlla humain, et b) libérer le Facteur Vll/Vlla humain à partir du complexe formé à l'étape a) et récupérer le Facteur Vll/Vlla humain purifié.
15. Procédé selon la revendication 14, comprenant l'étape a') laver le support d'affinité avec un tampon de lavage.
16. Procédé pour détecter la présence de Facteur Vll/Vlla humain dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8 ou avec un composé selon l'une des revendications 9 et 10 ou avec un support selon la revendication
12 avec ledit échantillon; et b) détecter la formation de complexes entre (i) ledit acide nucléique, ou ledit composé, ou ledit support et (ii) le Facteur Vll/Vlla.
17. Composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, en combinaison avec un plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
18. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour son utilisation comme médicament.
19. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la fabrication d'un médicament pour le traitement des troubles de la coagulation.
20. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour le traitement des troubles
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