附图简介
图1显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,(i)在多种组合物中存在的因子IX与(ii)特异性针对固定在支持物上的GLA结构域蛋白的适配体之间的结合曲线。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。1号曲线:由惠氏公司(Wyeth)以名称
出售的重组FIX;2号曲线:由转基因猪生产的重组因子IX的半纯化制备物(FIXtg)。该FIX是低γ羧基化的(在存在的12个中,羧基化量度<7个γ羧基化);3号曲线:阴性对照(仅缓冲液)。
图2是人血浆因子IX的纯化级分中,或因子IX的转基因猪的乳汁中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶的图像,所述蛋白质已经过预处理,所述预处理是通过澄清、然后在MEP
支持物上层析,然后在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右:第1道:起始组合物:来自人因子IX的转基因猪的乳汁,其经过了通过澄清然后在MEP
支持物上层析的预处理;第2道:未滞留在亲和支持物上的级分中含有的蛋白质;第3道:洗脱级分中含有的蛋白质;第4道:来自亲和支持物的输出物中、再生缓冲液中含有的蛋白质;第5道:人血浆因子IX的纯化级分;6道:已知分子量的参照蛋白质。标出了参照蛋白质的某些蛋白质条带的表观分子量。
图3是人血浆因子IX的纯化级分中,或人因子IX的转基因猪的乳汁中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶的图像,所述蛋白质已经过预处理,所述预处理通过澄清、然后在MEP
支持物上层析、然后在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上纯化。用硝酸银处理SDS-PAGE凝胶。图4A代表了染色后整个SDS-PAGE凝胶。图3B是图3A的凝胶的细节部分。“St”和“S”道:已知分子量的参照蛋白质;第1、2和4道:在不同测定后,在MEP
支持物上层析,然后在其上移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上纯化后洗脱级分中含有的蛋白质;第3道:人血浆因子IX的纯化级分(在SDS-PAGE凝胶上样的25ng因子IX);第3’道:人血浆因子IX的纯化级分(在SDS-PAGE凝胶上样的550ng因子IX)。图3A和图3B中标出了某些蛋白质条带的表观分子量。
图4显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,(i)在多种组合物中存在的因子IX与(ii)特异性针对固定在支持物上的GLA结构域蛋白的适配体之间的结合曲线。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。1号曲线:人血浆因子IX的制备物;2号曲线:由转基因猪生产的重组因子IX的制备物,通过在MEP
支持物然后在包含抗GLA适配体的亲和支持物上的层析来纯化;3号曲线:由转基因猪生产的重组因子IX的制备物,在通过包含抗GLA适配体的亲和支持物之前(在MEP
之后);4号曲线:阴性对照制备物(仅缓冲液)。
图5显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,(i)在多种组合物中存在的因子VII、因子IX或因子X,分别与(ii)特异性针对固定在支持物上的GLA结构域蛋白的适配体之间的结合曲线。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。1号曲线:人重组因子IX的制备物2号曲线:人血浆因子VII的制备物;3号曲线:人血浆因子X的制备物;4号曲线:阴性对照制备物。
图6显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,本发明的多种核酸与固定在支持物上的重组人因子IX的结合曲线。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。曲线“1”:低亲和力核酸;曲线“2”:中等亲和力核酸;曲线“3”:高亲和力核酸;曲线“4”:非常高亲和力核酸。
图7显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,核酸适配体“Mapt-1.2.-CS”和“Mapt-1.2.-CSO”与固定在支持物上的重组人因子IX的结合曲线。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。1号曲线是用Mapt-1.2.-CS适配体获得的结合曲线;2号曲线是用Mapt-1.2.-CSO适配体获得的结合曲线。
图8显示了当进行纯化人血浆因子IX的方法时获得的层析谱,所述人血浆因子IX是用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持物生产的。沿x轴:时间;沿y轴:在254纳米处的吸光度值(O.D.)。(1):注射人血浆FIX浓缩物的时刻;(2):非滞留级分的消除峰;(3):纯化的FIX的洗脱峰;(4):在层析支持物再生步骤的过程中生成的峰。
图9是人血浆因子IX的纯化级分含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶的图像,其具有4%至12%双丙烯酰胺梯度(无还原剂),所述人血浆因子IX经过在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右:第1道(“SM”):起始组合物、人血浆因子IX浓缩物;第2道(“NR”):未滞留在亲和支持物上的级分含有的蛋白质;第3道(“E1”):洗脱级分E1含有的蛋白质;第4道(“E2”):在来自亲和支持物的输出物、再生缓冲液中含有的蛋白质;第5道(“E3”):在来自亲和支持物的输出物、再生缓冲液中含有的蛋白质;第6道(“T FIX”):人血浆因子IX的纯化级分。
图10显示了当进行纯化人血浆因子IX的方法时获得的层析谱,所述人血浆因子IX是用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持物生产的。沿x轴:时间;沿y轴:在254纳米处的吸光度值(O.D.)。(1):非滞留级分;(2):纯化的人FIX的洗脱峰;(3):层析支持物的再生峰。
图11是人血浆因子IX的纯化级分中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶的图像,其具有4%至12%双丙烯酰胺梯度,不含还原剂,所述人血浆因子IX经过在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右:第1道(“起始物”):起始组合物、人血浆因子IX浓缩物;第2道(“未滞留的”):未滞留在亲和支持物上的级分含有的蛋白质;第3道(“洗脱物”):洗脱级分含有的蛋白质。
图12显示了当进行纯化转基因人因子IX的方法时获得的层析谱,所述人因子IX是在转基因母猪的乳汁中用其上固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持物生产的。沿x轴:时间;沿y轴:在254纳米处的吸光度值(O.D.)。(1):注射转基因FIX的时刻;(2):非滞留级分;(3):洗脱级分。
图13是在转基因母猪的乳汁中生产的重组人因子IX的预纯化级分中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶图像,所述重组人因子IX经过在其上移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右:第1道(“E5”、”起始物”):起始组合物,在MEP上预纯化的转基因人因子IX;第2道(“E6”、”未滞留的”):未滞留在亲和支持物上的级分中含有的蛋白质;第3道(“E7”、”洗脱物”):洗脱级分含有的蛋白质;第4道(“E8”、”再生”):再生级分中含有的蛋白质;第5道(“T FIX”、”纯FIX对照”):纯化的FIX对照。箭头:FIX迁移的位置。
图14显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,本发明的多种核酸与固定在支持物上的重组人因子IX的结合曲线。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。曲线“1”:低亲和力核酸;曲线“2”:中等亲和力核酸;曲线“3”:高亲和力核酸;曲线“4”:非常高亲和力核酸。
图15显示了当进行纯化转基因人因子VII的方法时获得的层析谱,所述人因子VII是用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持物生产的。沿x轴:时间;沿y轴:在254纳米处的吸光度值(O.D.)。(1):注射的时刻;(2):非滞留级分;(3):注射洗脱缓冲液的时刻;(4):洗脱级分。
图16是人血浆因子VII的预纯化级分中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶图像,所述人血浆因子VII经过在其上移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右:(1):第1道(”起始物”):起始组合物、人血浆因子VII;(2):第2道(”洗脱物”):洗脱级分中含有的蛋白质;(3):Des-Gla FVII:FVII的低糖基化形式;(4):FVII的其他难鉴别的形式。
图17显示了当进行纯化转基因人因子VII的方法时获得的层析谱,所述人因子VII是用其上固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持物生产的。沿x轴:时间;沿y轴:254纳米的吸光度值(O.D.)。(1):非滞留级分;(2):洗脱级分;(3):再生级分。
图18是人血浆因子VII的预纯化级分中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶图像,所述人血浆因子VII经过在其上移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右:(1):第1道(”起始物”):起始组合物,人血浆因子VII;(2):第2道(“NR”):非滞留蛋白质的级分;(3):第3道(”洗脱物”):洗脱级分中含有的蛋白质;(4):Des-Gla FVII:FVII的低糖基化形式。
图19显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线分别对应于血浆FVII在使用多种运行缓冲液的过程中的结合动力学,图16从下至上:T3:缓冲液3;T2:缓冲液2;T1:缓冲液1;T4:缓冲液4和T5:缓冲液5。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。图从下至上:曲线说明增加的亲和力的相互作用。
图20显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线使得能够确定在使用缓冲液1(50mM Tris、50mM NaCl、10mM CaCl2、4mM MgCl2,pH 7.5)的过程中血浆FVII的结合动力学参数。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。
图21显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线对应于在使用缓冲液5(50mM Tris、10mM CaCl2,pH 7.5)的过程中血浆FVII的结合动力学。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。
图22显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线对应于在使用多种洗涤缓冲液的过程中血浆FVII与Mapt-2的结合抗性:(1):注射FVII;(2):含有1M NaCl、10mM CaCl2、4mM MgCl2的50mM Tris缓冲液,pH 7.5;(3):含有2M NaCl、10mM CaCl2、4mM MgCl2的50mMTris缓冲液,pH 7.5,(4):50mM含3M NaCl、10mM CaCl2、4mM MgCl2的Tris缓冲液,pH 7.5;和(5):含10mM EDTA的50mM Tris缓冲液。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。
图23显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线对应于在使用多种洗涤缓冲液时血浆FVII与Mapt-2的结合抗性:(1):注射FVII;(2):含有10mM CaCl2、4mM MgCl2的50mM Tris缓冲液,pH 7.5;(3):含有10mM CaCl2、4mM MgCl2、1M NaCl的50mM Tris缓冲液,pH 7.5,(4):含有10mM CaCl2、4mM MgCl2、2M NaCl的50mM Tris缓冲液,pH 7.5;和(5):含有10mM CaCl2、4mM MgCl2、3M NaCl的50mM Tris缓冲液,pH 7.5;和(6):含10mM EDTA的50mM Tris缓冲液。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。
图24显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线对应于使用多种洗涤缓冲液时血浆FVII与Mapt-2的结合抗性:(1):注射FVII;(2):10%乙醇缓冲液;(3):含有10mM CaCl2、4mM MgCl2、1M NaCl的50mM Tris缓冲液,pH 7.5;(4):含有10mM CaCl2、4mM MgCl2、2M NaCl的50mM Tris缓冲液,pH 7.5;(5):含有10mM CaCl2、4mMMgCl2、3M NaCl的50mM Tris缓冲液,pH 7.5;和(6):含有10mMEDTA的50mM Tris缓冲液。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。
图25显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-1适配体与重组人因子VII的结合曲线。曲线对应于当使用多种洗涤缓冲液时重组FIX与Mapt-1的结合抗性:(1):注射重组FVII;(2):含有10mM CaCl2、4mM MgCl2、1M NaCl的50mM Tris缓冲液,pH 7.5;(3):含有10mM CaCl2、4mM MgCl2、2M NaCl的50mMTris缓冲液,pH 7.5;(4):含有10mM CaCl2、4mM MgCl2、3M NaCl的50mM Tris缓冲液,pH 7.5;和(5):含有10mM EDTA的50mM Tris缓冲液。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。
图26显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与重组人因子IX的结合曲线。曲线对应于当使用下列洗涤缓冲液时重组FIX与Mapt-1的结合抗性:50mM Tris、10mM CaCl2、50%丙二醇,pH 7.5。沿x轴:时间,按秒表示;沿y轴:共振信号,按任意共振单位表示。(1)在缓冲液5中注射50%丙二醇。
发明详述
申请人努力设计用于纯化活性GLA结构域凝固蛋白的新方法,即,适用于从包含GLA结构域凝固蛋白或多种GLA结构域凝固蛋白的起始样品中获得纯化且活性的GLA结构域凝固蛋白的新方法。换言之,申请人寻求开发出(i)对给定的活性GLA结构域凝固蛋白,或(ii)对多种活性GLA结构域凝固蛋白选择性的富集或纯化的方法。
为了开发这些纯化方法,申请人已经分离并表征了新的配体,所述配体具有特异性结合活性GLA结构域蛋白或多种活性GLA结构域凝固蛋白的能力。
这些新的配体不与无活性的GLA结构域凝固蛋白可检测地结合。
此外,能够把这些新配体固定在固体支持物的表面,从而制备用于亲和纯化GLA结构域凝固蛋白的支持物,所述亲和纯化支持物具有配体释放的降低风险,或甚至零风险,因而纯化的终产物被所述配体,或被所述配体降解导致的片段或产物污染的降低风险或零风险。
本说明书下文中将详述其特征的这些新配体由核酸组成,也称为“核酸适配体”,其与活性GLA结构域凝固蛋白结合。在某些实施方案中,所述适配体对预定的活性GLA结构域凝固蛋白是特异性的。在其他实施方案中,所述适配体对特定的活性GLA结构域凝固蛋白不是特异性的并能够结合多种活性GLA结构域凝固蛋白。
本发明提供了纯化活性GLA结构域凝固蛋白的方法,其中优势是利用这些核酸类型的新配体的结合特性。
申请人还努力开发获得特异性结合活性GLA结构域蛋白的核酸适配体的方法,目标是使用方法中的所述核酸适配体纯化所述活性蛋白。
根据本发明,已获得特异性结合活性GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体。更具体而言,申请人已获得并表征了与仅一种或多种活性GLA结构域凝固蛋白专有地结合(即,与具有GLA结构域的蛋白质结合,所述GLA结构域的GLA结构域特征性谷氨酰胺残基已经至少部分被γ羧基化并且所述GLA结构域的GLA结构域部分羧基化足以使所述GLA结构域凝固蛋白为活性的)的核酸适配体。
在某些实施方案中,本发明的对预定GLA结构域凝固蛋白特异性的核酸适配体能够选择性地与所述GLA结构域凝固蛋白的活性形式结合,而不与所述GLA结构域蛋白的无活性形式结合。
在其他实施方案中,对活性GLA结构域蛋白特异性的本发明的核酸适配体能够无差别地与具有保守的共同特征的多种蛋白质结合,所述共同特征是GLA结构域,其γ羧基化的水平使这些蛋白质能够是活性的,且不结合所述GLA结构域凝固蛋白的无活性形式。
实施例中特别显示,对GLA结构域凝固蛋白特异性的适配体能够结合多种活性蛋白,例如因子IX、因子VII和因子X。
实施例中展示的结果显示,本发明的抗GLA适配体(例如序列SEQ IDNO.37的Mapt-2-CS适配体,或序列SEQ ID NO.38的Mapt-2.2.-CS适配体)专有地结合GLA结构域凝固蛋白的活性形式,特别是专有地结合人因子VII的活性形式。例如,这些抗GLA适配体不结合人因子VII的Des-Gla形式,该形式由包含修饰或缺少GLA结构域的无功能形式组成。
特异且单独识别GLA结构域蛋白(例如因子II、因子VII、因子IX或因子X)的核酸适配体是现有技术已知的,包括结合凝血酶的适配体(Zhao等人,2008,Anal Chem,80卷(19):7586-7593)、结合因子IX/IXa的适配体(Subash等人,2006,Thromb Haemost,第95卷:767-771;Howard等人,2007,Atherioscl Thromb Vasc Biol,第27卷:722-727;PCT申请号WO 2002/096926;美国专利号US 7312325)、结合因子X/Xa的适配体(PCT申请号WO 2002/096926;美国专利号US 7312325)或者其它结合人因子VII/VIIa的适配体(Rusconi等人,2000,Thromb Haemost,84卷(5):841-848;Layzer等人,2007,Spring,第17卷:1-11)。
应说明的是上述适配体无一描述了用于纯化其结合的靶蛋白的用途。此外,上述适配体专有地结合单一GLA结构域蛋白,不与另一GLA结构域蛋白交叉结合,从而使得能够想象已知的适配体不结合GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域,因此不能选择性地结合活性GLA结构域蛋白的GLA结构域。
对给定的GLA结构域蛋白是特异性的,并且不具有结合另一蛋白质(包括另一GLA结构域蛋白)的能力的此类适配体,由例如Layzer等人(2007,Oligonucleotides,第17卷:1-11)所描述。
然而,就申请人已知,现有技术中尚未描述过这样的核酸适配体,所述核酸适配体的结合特异性是蛋白质的GLA结构域,且具有选择性地结合一种或多种活性GLA结构域凝固蛋白的能力。
此外,就申请人已知,现有技术中也尚未描述过这样的核酸适配体,所述核酸适配体的结合特异性是蛋白质的GLA结构域,且具有结合多种不同活性GLA结构域凝固蛋白的能力。
可获得特异性结合活性GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体使得能够开发纯化这些蛋白质的方法,特别是以获得可用作药物活性成分的纯化终产物为目标。依据所使用的核酸适配体的特异性类型,所述纯化方法允许(i)预定的活性GLA结构域凝固蛋白的选择性的纯化,(ii)或者多种GLA结构域凝固蛋白的活性形式的选择性的纯化。
本发明涉及纯化至少一种生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的方法,包括下列步骤:
a)使含有一种或多种GLA结构域凝固蛋白的样品与其上固定了特异性结合生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体的亲和支持物接触,从而在(i)所述核酸适配体和(ii)所述活性GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物,
b)从步骤a)形成的复合物中释放生物学活性的GLA结构域凝固蛋白,和
c)以纯化的形式回收所述生物学活性的GLA结构域凝固蛋白。
本发明还涉及纯化生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的方法,包括下列步骤:
a)使含有一种或多种GLA结构域凝固蛋白的样品与其上固定了特异性结合多种生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体的亲和支持物接触,从而在(i)所述核酸适配体和(ii)所述GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物,
b)从步骤a)形成的复合物中释放生物学活性的GLA结构域凝固蛋白,和
c)以纯化的形式回收所述生物学活性的GLA结构域凝固蛋白。
术语“GLA结构域凝固蛋白”涵盖了包含名为GLA结构域的区域的任何凝固蛋白,所述区域包含多种在蛋白质合成过程中γ羧基化的谷氨酰胺残基。GLA结构域凝固蛋白涵盖了在N末端具有GLA结构域的凝固蛋白,所述GLA结构域一般位于前肽的下游,即C端一侧,所述前肽在合成过程中被天然的水解。GLA结构域凝固蛋白涵盖了这样的凝固蛋白,所述凝固蛋白中的GLA结构域由包含9至12个谷氨酰胺残基的约45个氨基酸的区域组成,至少部分所述9至12个谷氨酰胺残基在细胞的蛋白质合成过程中被正常的羧基化以产生GLA残基。由维生素K依赖性的蛋白质组成的GLA结构域凝固因子涵盖了凝血酶原(因子II)、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。GLA结构域凝固蛋白涵盖了从天然源(例如血浆)产生的非重组蛋白,以及在体外通过用编码所述凝固蛋白的DNA转染或转化细胞能够生产的重组蛋白,或者在体内通过已导入编码所述凝固蛋白的转基因的动物能够生产的重组蛋白。在本说明书中由转基因动物生产的GLA结构域凝固蛋白也被称为“转基因蛋白”。
本说明书的下文中详细描述了测定GLA结构域凝固蛋白的活性的方法。
“活性的”或“生物学活性的”GLA结构域凝固蛋白涵盖了具有对相应的参照蛋白质测定的抗凝血或酰胺分解(amidolytic)活性的至少一半水平的GLA结构域凝固蛋白,分别判断所述参照蛋白质的抗凝血或酰胺分解活性是最佳的。活性GLA结构域凝固蛋白涵盖了这样的GLA结构域凝固蛋白,其具有对相应参照蛋白质所测定的抗凝血或酰胺分解活性的至少0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1倍水平,分别判断所述参照蛋白质的抗凝血或酰胺分解活性是最佳的。活性GLA结构域蛋白还涵盖了这样的GLA结构域蛋白,其也可被称为“超活的”GLA蛋白,其具有高于参照蛋白或组合物的抗凝血或酰胺分解活性水平,即具有大于1的抗凝血或酰胺分解活性水平。
活性因子II(凝血酶原)涵盖了具有对相应的参照因子II测定的抗凝血或酰胺分解活性的至少一半水平的因子II,分别判断所述参照因子II的抗凝血活性或酰胺分解活性是最佳的。
活性因子VII涵盖了具有对相应的参照因子VII测定的抗凝血或酰胺分解活性的至少一半水平的因子VII,分别判断所述参照因子VII的抗凝血活性或酰胺分解活性是最佳的。
活性因子IX涵盖了具有对相应的参照因子IX测定的抗凝血或酰胺分解活性的至少一半水平的因子IX,分别判断所述参照因子IX的抗凝血活性或酰胺分解活性是最佳的。
活性因子X涵盖了具有对相应的参照因子X测定的抗凝血或酰胺分解活性的至少一半水平的因子X,分别判断所述参照因子X的抗凝血活性或酰胺分解活性是最佳的。
活性蛋白C涵盖了具有对相应的参照蛋白C测定的抗凝血或酰胺分解活性的至少一半水平的蛋白C,分别判断所述参照蛋白C的抗凝血活性或酰胺分解活性是最佳的。
活性蛋白S涵盖了具有对相应的参照蛋白S测定的抗凝血或酰胺分解活性的至少一半水平的蛋白S,分别判断所述参照蛋白S的抗凝血活性或酰胺分解活性是最佳的。
根据上述内容,本领域技术人员将理解,“活性的”或“生物学活性的”GLA结构域凝固蛋白不应与“活化的”GLA结构域凝固蛋白混淆。“活化的”GLA结构域凝固蛋白是切割肽的蛋白水解反应的结果,所获得的蛋白质之后行使它自身的生物学活性。“活化的”凝固因子一般用额外的“a”标注。作为示例,因子VII/“活化的”因子VII对可被标注为FVII/FVIIa对。然而,出于本发明的目的,存在“活化的”凝固因子的“生物学活性的”形式和“生物学无活性的”形式,因为存在“生物学无活性的”(例如由于其GLA结构域的不正确的γ羧基化)“活化的”GLA结构域凝固因子的形式。
因而,出于本发明的目的,“生物学活性的”GLA结构域凝固蛋白涵盖了(i)所述GLA结构域凝固蛋白的“活化的”形式,该形式直接行使其自身的生物学活性,和(ii)所述蛋白质的非活化形式,所述蛋白质的非活化形式在活化后导致行使其自身生物学活性的所述蛋白质的形式。
术语“相应的蛋白质”或“相应的因子”意在优选地表示相同哺乳动物(例如人)的蛋白质或因子。
活性GLA结构域凝固蛋白,也称为生物学活性的GLA结构域凝固蛋白,涵盖了这样的蛋白质类型,其中GLA结构域的所有谷氨酰胺残基被γ羧基化。
在某些情况下,活性GLA结构域凝固蛋白涵盖了这样的蛋白质类型,其中GLA结构域的至少一个谷氨酰胺残基没有被γ羧基化,但出于本发明的目的,所述蛋白质类型仍然是生物学活性的。
根据本发明,术语“核酸适配体”意在表示特异性结合一种或多种活性GLA结构域凝固蛋白的单链核酸,在本说明书中也可被称为“抗GLA适配体”。因而本发明的适配体涵盖了这样的适配体,对其而言,在使各个核酸和蛋白质伙伴(partner)接触的在先步骤之后能够检测具有单个活性GLA结构域凝固蛋白的复合物或具有多个给定的活性GLA结构域凝固蛋白的复合物。优选地,根据本发明的“核酸适配体”具有结合多个活性GLA结构域蛋白的能力。
本领域技术人员可以容易地进行检测根据本发明的抗GLA适配体和活性GLA结构域凝固蛋白之间形成的复合物,例如,通过执行表面等离振子共振检测技术,包括
技术,如实施例中示例的。本领域的技术人员通过ELISA类型的常规技术也能够容易地检测根据本发明的抗GLA适配体和活性GLA结构域凝固蛋白之间复合物的形成,如本领域技术人员已知的。
实施例中已显示,根据本发明的抗GLA适配体能够选择性地结合GLA结构域凝固蛋白的活性形式,例如因子IX。根据本发明还显示,抗GLA适配体能够分别结合多种不同的活性GLA结构域凝固蛋白,特别是结合多种活性的人GLA结构域凝固蛋白。已特别显示,根据本发明的给定的抗GLA适配体能够分别与活性因子VII、活性因子IX和活性因子X结合。
在某些实施方案中,上述纯化方法的特征是所述GLA结构域凝固蛋白是维生素K依赖性的凝固因子。
在某些实施方案中,上述纯化方法的特征是所述GLA结构域凝固蛋白选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。
在某些实施方案中,上述纯化方法适合选择性纯化选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的单个活性GLA结构域凝固蛋白。
在某些实施方案中,上述纯化方法适合同时纯化至少两种选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的活性GLA结构域凝固蛋白。
在某些实施方案中,上述纯化方法适合同时纯化至少三种选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的活性GLA结构域蛋白。
在某些实施方案中,上述纯化方法适合同时纯化活性因子II、活性因子VII、活性因子IX和活性因子X。
在某些实施方案中,上述纯化方法适合纯化活性因子IX。
因而在实施例中已显示,根据本发明的抗GLA适配体能够区分活性GLA结构域凝固蛋白和无活性的GLA结构域凝固蛋白。特别是在实施例中已显示,根据本发明的抗GLA适配体能够区分GLA结构域被正确地γ羧基化的GLA结构域凝固蛋白和其GLA结构域被不正确地γ羧基化的GLA结构域凝固蛋白。
出于本发明的目的,根据本发明,正确γ羧基化的GLA结构域涵盖了其所有的特征性谷氨酰胺残基都被γ羧基化的GLA结构域,以及这样的GLA结构域,所述GLA结构域仅部分特征性谷氨酰胺残基被γ羧基化,而它的部分γ羧基化不导致所考虑的GLA结构域凝固蛋白不是生物学活性的。
作为示例,对于GLA结构域凝固蛋白如因子IX,当它的GLA结构域的所有特征性谷氨酰胺残基都被γ羧基化之时,以及当在它的GLA结构域中含有的12个特征性谷氨酰胺残基中,GLA结构域的至少7个谷氨酰胺残基被γ羧基化之时,所述蛋白质是生物学活性的。因而,对于因子IX,活性蛋白质涵盖了这样的因子IX,其中GLA结构域的7、8、9、10、11和12个谷氨酰胺残基已被γ羧基化。
对于因子IX,根据本发明的抗GLA核酸适配体涵盖了这样的适配体,所述适配体结合其中的GLA结构域的7、8、9、10、11和12个谷氨酰胺残基已被γ羧基化的因子IX,而不结合其中的GLA结构域的少于7个谷氨酰胺残基已被γ羧基化的因子IX。作为此类适配体的实例,可提及序列SEQ ID NO.4的适配体。
本发明的抗GLA适配体的区分活性GLA结构域凝固蛋白和无活性的GLA结构域凝固蛋白的这些特性,可用于纯化活性GLA结构域凝固蛋白的方法中,从而获得极大富集了目标GLA结构域凝固蛋白的活性形式的终产物。实施例中说明了用于纯化活性GLA结构域凝固蛋白的活性形式,特别是因子IX的活性形式的执行方法的实例。本发明的抗GLA适配体的这些有利的区分特性使其能够例如从人因子IX转基因的哺乳动物乳汁中,获得活性的重组人因子IX的纯化制备物,当所述乳汁包含重组人因子IX的活性形式和无活性形式时,特别是其GLA结构域被正确γ羧基化的重组人因子IX形式和其GLA结构域被不正确γ羧基化的重组人因子IX形式。
本发明还涉及纯化生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的方法,包括下列步骤:
a)使含有一种或多种GLA结构域凝固蛋白,并可能含有GLA结构域凝固蛋白的生物学无活性分子的样品与其上固定了与生物学活性的GLA结构域凝固蛋白或多种生物学活性的GLA结构域凝固蛋白特异性结合的核酸适配体的亲和支持物接触,从而在(i)所述核酸适配体和(ii)所述活性GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物,
b)从步骤a)形成的复合物中释放活性GLA结构域凝固蛋白,和
c)以纯化的形式回收所述生物学活性的GLA结构域凝固蛋白。
在以上方法的某些实施方案中,所述核酸适配体由脱氧核糖核酸适配体组成。
在某些实施方案中,上述纯化方法的特征是所述GLA结构域凝固蛋白是维生素K依赖性的凝固因子。
在某些实施方案中,上述纯化方法的特征是所述GLA结构域凝固蛋白选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。
在某些实施方案中,上述纯化方法适合选择性纯化选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的单个活性GLA结构域凝固蛋白。
在某些实施方案中,上述纯化方法适合同时纯化至少两种选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的活性GLA结构域凝固蛋白。
在某些实施方案中,上述纯化方法适合同时纯化至少三种选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的活性GLA结构域凝固蛋白。
在某些实施方案中,上述纯化方法适合同时纯化活性因子II、活性因子VII、活性因子IX和活性因子X。
在某些实施方案中,上述纯化方法适合纯化活性因子IX。
如前文已经提及的,GLA结构域凝固蛋白的“活性”形式由GLA结构域被正确γ羧基化的形式(即,由根据本发明的抗GLA适配体识别的GLA结构域凝固蛋白形式)组成。
能够通过出于本发明需要而特别开发的方法获得抗GLA适配体,所述方法详述在本说明书的下文中。
多于一种的GLA结构域凝固蛋白的同时纯化特别取决于用于执行纯化方法的起始样品的类型。特别地,在方法结束时,以纯化形式获得的GLA结构域凝固蛋白的数量和身份,逻辑上受初始存在于起始样品中的GLA结构域凝固蛋白的数量和身份的限制。
出于本发明的目的,活性GLA结构域凝固蛋白的“纯化”意指富集所述GLA结构域凝固蛋白的活性形式,即,获得这样的“纯化的”组合物,所述组合物具有的活性GLA结构域蛋白的浓度可检测地大于受纯化步骤的起始样品中的所述活性GLA结构域凝固蛋白的初始浓度。“纯化形式的”活性GLA结构域凝固蛋白涵盖了这样的组合物,所述组合物包含其浓度可检测地大于在进行纯化步骤前的起始组合物中其浓度的活性GLA结构域凝固蛋白。因而,本发明的活性GLA结构域凝固蛋白涵盖了这样的组合物,所述组合物中所述活性GLA结构域凝固蛋白被纯化为均质,但不以任何方式被限制为这一特定的纯化形式。特别地,当纯化前的样品包含多于一种的GLA结构域凝固蛋白时,纯化的活性蛋白质不能被定义为纯化为均质,单纯是由于纯化后的组合物中并存至少两种活性GLA结构域凝固蛋白。
一般而言,抗GLA适配体能够由DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)分子组成,并具有结合活性GLA结构域蛋白的能力,该能力大于结合无活性的GLA结构域凝固蛋白的能力。
能够通过出于本发明的需要而开发的方法获得抗GLA适配体,所述方法详细描述于本说明书的下文中。
在某些实施方案中,根据本发明的抗GLA适配体具有多个共同的结构特征,包括这样的序列,所述序列从5’端至3’端顺序包含(i)长度约20个核苷酸(例如,18个核苷酸长)的不变的特定核苷酸序列,接着(ii)长度约40至50个核苷酸(例如,44个核苷酸长)的可变核苷酸序列,接着(iii)长度约20个核苷酸(例如,18个核苷酸长)的不变的特定核苷酸序列。应说明,可变核苷酸序列(ii)彼此可具有非常强的核苷酸序列同一性。
在本说明书中说明的一些选择抗GLA适配体的方法是这样的类型,其使得能够获得抗GLA适配体的家族,所述抗GLA适配体能够选择性识别预定的活性GLA结构域凝固蛋白,特别是预定的人活性GLA结构域凝固蛋白。
在本说明书中说明的一些其他选择抗GLA适配体的方法是这样的类型,其使得能够获得抗GLA适配体的家族,所述抗GLA适配体能够选择性识别多种活性GLA结构域凝固蛋白,特别是多种人活性GLA结构域凝固蛋白。
从结构的观点出发,特异性结合本发明的活性GLA结构域凝固蛋白的核酸或核酸适配体的家族包含多核苷酸的至少15个连续核苷酸,所述多核苷酸与下列通式(I)的核酸具有至少40%核苷酸同一性:
5’-[SEQ ID NO.1]×-[SEQ ID NO.X]-[SEQ ID NO.2]y-3’(I),
其中:
-“SEQ ID NO.X”由序列SEQ ID NO:3的核酸组成,
-“X”是等于0或1的整数,和
-“Y”是等于0或1的整数。
在某些实施方案中,序列SEQ ID NO.X的酸长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
在其他实施方案中,序列SEQ ID NO.X的核酸长度为43、44、45、46、47、48或49个核苷酸。
在某些其他优选的实施方案中,序列SEQ ID NO.X的核酸长度为43、44或45个核苷酸。
如前文已经提及的,通式(I)的核酸长度至少是15个核苷酸。
在某些实施方案中,通式(I)的核酸长度至少是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80或81个核苷酸,从而涵盖了具有所述每个确切长度的核酸。
当整数“x”等于0,而整数“y”等于1时,本发明的核酸适配体涵盖了这样的核酸,所述核酸包含与下列通式(I-1)的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸:
5’-[SEQ ID NO.X]-[SEQ ID NO.2]-3’(I-1)
当整数“x”等于1,而整数“y”等于0时,本发明的核酸适配体涵盖了这样的核酸,所述核酸包含与下列通式(I-2)的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸:
5’-[SEQ ID NO.1]-[SEQ ID NO.X]-3’(I-2)
当整数“x”等于0,而整数“y”等于0时,本发明的核酸适配体涵盖了这样的核酸,所述核酸包含与下列通式(I-3)的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸:
5’-[SEQ ID NO.X]-3’(I-3)
因而,上述核酸适配体涵盖了包含与序列SEQ ID NO.3的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸。
一般而言,与第二多核苷酸或核酸具有至少40%核苷酸同一性的第一多核苷酸与所述第二多核苷酸或核酸具有至少41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或100%的核苷酸同一性。
在包含序列SEQ ID NO.X的本发明核酸的某些实施方案中,所述序列SEQ ID NO.X选自这样的核酸,所述核酸具有与选自序列SEQ ID NO.3、6至35、37和38的序列具有至少40%核苷酸同一性的序列的至少15个连续的核苷酸。
在包含序列SEQ ID NO.X的本发明核酸的某些实施方案中,所述序列SEQ ID NO.X选自这样的核酸,所述核酸与选自序列SEQ ID NO.3、6至35、37和38的序列具有至少41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或100%的核苷酸同一性。
在本发明的核酸适配体的某些实施方案中,所述适配体选自这样的核酸,所述核酸包含与选自序列SEQ ID NO.3、4和6至39的序列具有至少40%核苷酸同一性的序列的至少15个连续核苷酸的序列。
在本发明的核酸适配体的某些实施方案中,所述适配体选自这样的核酸,所述核酸包含选自序列SEQ ID NO.3、4和6至39的序列的至少15个连续核苷酸的序列。
在本发明的核酸适配体的某些实施方案中,所述适配体选自这样的核酸,所述核酸包含与选自序列SEQ ID NO.3、4和6至39的序列具有至少40%核苷酸同一性的序列。
在本发明的核酸适配体的某些实施方案中,所述适配体选自这样的核酸,所述核酸包含选自序列SEQ ID NO.3、4和6至39的序列。
在本发明的核酸适配体的某些实施方案中,所述适配体选自这样的核酸,所述核酸由选自序列SEQ ID NO.3、4和6至39的序列组成。
由上述可得出,本发明涵盖了具有上文定义的系列通式(I)的至少15个连续核苷酸的单链核酸家族。
出于本发明的目的,两条核酸序列之间的“百分比同一性”是通过比较窗口由比较两条最佳比对的序列来确定的。
因而比较窗口中的核苷酸序列部分能够包含相比参照序列(所述参照序列不包含这些添加或这些缺失)的添加或缺失(例如空位),从而获得两条序列间的最佳比对。
通过确定在比较的两条序列中观察到相同核酸碱基的位置的数量来计算百分比同一性,之后用两个核酸碱基之间相同的位置的数目除以比较窗口中的位置总数,再将结果乘以一百,从而获得两条序列相对于彼此的百分比核苷酸同一性。
可以通过使用已知算法的计算机就比较执行序列的最佳比对。
完全优选的,使用CLUSTAL W软件(1.82版)确定百分比序列同一性,参数固定如下:(1)CPU MODE=ClustalW mp;(2)ALIGNMENT=“全面”;(3)OUTPUT FORMAT=“aln w/numbers”;(4)OUTPUTORDER=“比对的”;(5)COLOR ALIGNMENT=“否”;(6)KTUP(字节)=“默认”;(7)WINDOW LENGTH=“默认”;(8)SCORE TYPE=“百分比”;(9)TOPDIAG=“默认”;(10)PAIRGAP=“默认”;(11)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE=“无”;(12)MATRIX=“默认”;(13)GAP OPEN=“默认”;(14)END GAPS=“默认”;(15)GAPEXTENSION=“默认”;(16)GAP DISTANCES=“默认”;(17)TREETYPE=“进化树”和(18)TREE GRAPH DISTANCES=“隐藏”。
在本发明的抗GLA核酸适配体的某些优选的实施方案中,所述核酸适配体包含与通式(I)的核酸具有至少80%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸,从而涵盖了包含与通式(I)的所述核酸具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或100%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸的适配体。
根据本发明的核酸适配体涵盖了序列SEQ ID NO.4的核酸适配体。回忆序列SEQ ID NO.4的适配体由通式(I)的适配体组成,其中序列SEQID NO.X由序列SEQ ID NO.3组成。还回忆序列SEQ ID NO.3的适配体由通式(I-3)的适配体组成,其中缺少序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
申请人已经显示了序列SEQ ID NO.3的适配体具有选择性结合活性GLA结构域凝固蛋白的能力,这与序列SEQ ID NO.4的适配体的能力基本相同。这些结果显示在序列SEQ ID NO.4的适配体的特定结合特性中存在序列SEQ ID NO.3的核酸的关键属性。一般而言,这些结果显示序列SEQ ID NO.X的核酸在通式(I)的适配体中的关键属性,序列SEQ ID NO.X的核酸赋予通式(I)的适配体选择性结合活性GLA结构域凝固蛋白的能力。
本发明的核酸适配体因而也涵盖了序列SEQ ID NO.3的适配体。
实施例中还显示多种适配体,包括序列SEQ ID NO.6至35的适配体,具有选择性结合活性GLA结构域凝固蛋白的能力,根据需要具有不同亲和力水平。作为示例,在序列SEQ ID NO.6至35的适配体中,具有与人因子IX最大结合能力的适配体是序列SEQ ID NO.35的适配体,也可被标注为“Mapt-1.2.-CS”。
实施例中也鉴定了具有甚至大于上述Mapt-1.2.-CS适配体的结合活性GLA结构域凝固蛋白的能力的适配体。此类适配体的实例是序列SEQ IDNO.36的适配体,也可被标注为“Mapt-1.2.-CSO”。
序列SEQ ID NO.36的Mapt-1.2.-CSO适配体是包含这样的多核苷酸的至少15个连续核苷酸的适配体,所述多核苷酸与下列通式(I)的长度为62个核苷酸的核酸具有至少40%的核苷酸同一性:
5’-[SEQ ID NO.1]-[SEQ ID NO.35]-3’,并且
由所述通式(I)的核酸中从第10位的核苷酸至第49位的核苷酸的核酸组成。
实施例中还显示,序列SEQ ID NOS.37至39的每种核酸都具有结合活性GLA结构域凝固蛋白的能力。序列SEQ ID NOS.39的适配体还可表示为“Mapt-2”。序列SEQ ID NO.37的适配体还可表示为“Mapt-2-CS”。序列SEQ ID NO.38的适配体还可表示为“Mapt-2.2-CS”。应说明的是Mapt-2-CS适配体的序列包括在Mapt-2适配体的序列内:它是Mapt-2适配体的“核心序列”SEQ ID NO.X。
实施例中显示,本发明的抗GLA适配体可成功用于生产亲和层析支持物,所述支持物用于分离活性GLA结构域凝固蛋白和无活性的GLA结构域凝固蛋白。
特别是为了制备亲和层析支持物,本发明的抗GLA核酸适配体优选包括在化学结构中,在本说明书中也被称为“化合物”,所述化学结构具体包括间隔区工具,以及恰当时包括用于固定在固相支持物上的工具。
在某些实施方案中,核酸适配体包括在下列通式(II)的化合物的结构中:
[IMM]x-[SPAC]y-[APT](II),其中:
-[IMM]表示用于固定在支持物上的化合物,
-[SPAC]表示间隔区链,
-[APT]表示本说明书中定义的抗GLA适配体,
-x是等于0或1的整数,和
-y是等于0或1的整数。
在通式(II)的化合物的某些实施方案中,[APT]由其序列是选自序列SEQ ID NO:3、4和6至39的脱氧核糖核酸组成。
在通式(II)的化合物中表示为[SPAC]的“间隔区链”可以是任何已知的类型。所述间隔区链的功能是物理上分隔核酸与固相支持物的表面(所述表面上可以固定所述化合物),并允许核酸相对于其可固定的固相支持物的表面的相对移动。间隔区链限制或防止了位阻损害在所述核酸和可与其产生接触的凝固蛋白分子之间的结合事件,其中所述位阻是由于在固相支持物和核酸之间太接近导致的。
在通式(II)的化合物中,间隔区链优选与核酸适配体的5’端或3’端连接。
有利的,间隔区链同时与适配体的一端和固相支持物连接。具有间隔区的构造具有不将适配体直接移动在固相支持物上的优势。优选的,间隔区链是非特异性的寡核苷酸或聚乙二醇(PEG),或另一种亲水性的基于烃的链。当间隔区链由非特异性的寡核苷酸组成时,所述寡核苷酸有利的包括至少5个核苷酸的长度,优选长度在5至15个核苷酸之间。
在间隔区链由聚乙二醇组成的通式(II)的化合物的实施方案中,所述间隔区链涵盖了由例如Sigma Aldrich公司出售的PEG(C18)类型的聚乙二醇。
如实施例所示,用包含间隔区链[SPAC]的通式(II)的化合物,和不具有间隔区链[SPAC]的通式(II)的化合物都可进行活性GLA结构域凝固蛋白的纯化。
为了将适配体固定在间隔区链上,可以用多种化学基团化学修饰核酸,例如使得能够共价固定所述核酸的基团,例如巯基、胺或任何其他能够与固相支持物上存在的化学基团反应的基团。
在通式(II)的化合物中,化合物[IMM]由这样的化合物组成,所述化合物选自(i)能够与固相支持物材料形成一个或多个共价键的化合物,和(ii)能够通过弱的非共价键(包括氢键、静电力或范德华氏力)特异性结合在固相支持物上的化合物。
在某些情况下,化合物[IMM]由于是由通过共价键彼此连接的原子链组成,因而可以具有间隔区链的行为。然而,根据定义,化合物[IMM]绝不可以表示在根据本发明的通式(II)的化合物中的[SPAC]链。换言之,在通式(II)的化合物中,当存在[SPAC]链时,其不可以通过共价键或弱的非共价键与层析支持物直接连接。
第一种类型的化合物[IMM]涵盖了双功能偶联剂,例如戊二醛、SIAB或SMCC。
SIAB化合物,如G.T.Hermanson(1996,Bioconj ugate techniques,SanDiego:Academic Press,第239-242页)所述,是下列通式(A)的化合物:
SIAB化合物包含两个反应基,分别是碘乙酸基和磺基-NHS酯基,这些基团分别与氨基和巯基反应。
SMCC化合物,如M.K.Samoszuk等人(1989,Antibody,Immunoconjugates Radiopharm.,2(1):37-46)所述,是下列通式(B)的化合物:
SMCC化合物包含两个反应基,分别是磺基-NHS酯基和马来酰亚胺基,这些基团分别与氨基和巯基反应。
第二种类型的化合物[IMM]涵盖了生物素,能够以特异性的非共价方式与存在于固相支持物上的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白分子结合。
一旦通过间隔区固定在固相支持物上,就有利的在其游离端(未与间隔区连接的末端),通过但不限于化学修饰的核苷酸(例如2’-O-甲基-或2’-氟嘧啶、2’-核嘌呤(2’-ribopurine)、亚磷酰胺)、反向核苷酸或化学基团(PEG、聚阳离子、胆固醇)修饰抗GLA适配体。这些修饰使得能够保护抗GLA适配体免于酶促降解。
固相支持物可以是亲和层析柱,包括源自琼脂或纤维素的凝胶,或合成的凝胶例如丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯的衍生物,芯片例如适合表面等离振子共振的芯片,膜例如聚酰胺、聚丙烯腈或聚酯膜,或磁珠或顺磁珠。
本发明还涉及在
(i)选自通式(I)的核酸和通式(II)的化合物的核酸适配体,和
(ii)活性GLA结构域凝固蛋白,包括GLA结构域被正确的γ羧基化的凝固蛋白,
之间的复合物。
本发明的主题还是用于固定活性GLA结构域凝固蛋白,包括具有正确γ羧基化的GLA结构域的凝固蛋白的支持物,其特征是包括这样的固相支持物材料,所述材料上移植了多种分子,每个所述分子都包括核酸适配体或由核酸适配体组成,所述分子选自(a)通式(I)的核酸,和(b)通式(II)的化合物。
上述支持物实践上可用于所有寻求固定活性GLA结构域凝固蛋白,包括人活性GLA结构域凝固蛋白的应用,涵盖了出于纯化所述活性GLA结构域凝固蛋白的目的的应用,和出于检测所述活性GLA结构域凝固蛋白的目的的应用。
实施例中广泛的示例了固定了本发明的核酸适配体的支持物的制备,其中所述核酸适配体特异性的结合活性GLA结构域凝固蛋白,其中本发明的适配体特别用作捕获剂,可用于纯化或检测样品中的活性GLA结构域凝固蛋白,包括人活性GLA结构域凝固蛋白。
因而,本发明还涉及将活性GLA结构域凝固蛋白固定到支持物上的方法,包括使含有至少一种GLA结构域蛋白的样品与固相支持物接触的步骤,其中固相支持物上预先固定了选自通式(I)的核酸和通式(II)的化合物的物质。根据所追求的技术目标,所述方法可包括回收与通式(I)的核酸分子复合的固定化的活性GLA结构域凝固蛋白分子的额外步骤。回收活性GLA结构域凝固蛋白或活性GLA结构域凝固蛋白的额外步骤优选由使活性GLA结构域凝固蛋白与通式(I)的核酸的复合物与金属阳离子螯合剂例如EDTA接触的步骤组成。
为了使用固定了目标适配体的固相支持物进行亲和层析蛋白质纯化的方法,本领域技术人员可参考Romig等人(1999,J Chromatogr B BiomedSci Apl,731卷(2):275-284)描述的工作。
此外,实施例中示例了包含本发明的核酸适配体的亲和支持物的生产,和用所述亲和支持物进行纯化活性人因子IX的方法。
一般而言,可以固定本发明的适配体的固相支持物涵盖了任何类型的支持物,所述支持物具有常见于过滤器支持物、芯片的硅支持物、膜等的结构和组成。固相支持物特别涵盖树脂、用于亲和层析柱的树脂、聚合物珠、磁珠等。固相支持物还特别涵盖基于玻璃的或基于金属的材料,例如钢、金、银、铝、铜、硅、玻璃或陶瓷。固相支持物还特别涵盖聚合物材料,例如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏氟乙烯,及其组合。
可以用有利于附着、结合、复合物形成、固定化或与适配体相互作用的材料包被固相支持物。
在某些实施方案中,固相支持物是表面包被了金层、经过了羧甲基化处理的层、葡聚糖层、胶原层、抗生物素蛋白层、链霉抗生物素蛋白层等的玻璃载玻片。
以该方式,根据本发明的适配体可以通过例如上述的附着包被的方式,或通过产生共价键的化学反应,或通过非共价键结合,例如氢键、静电作用力、范德华氏力等固定在固相支持物上。
实施例描述了其上通过非共价键固定本发明的适配体的固相支持物的实施方案。
在实施例中,特别描述了由包被了链霉抗生物素蛋白分子层的玻璃载玻片组成的固相支持物,和缀合生物素分子的本发明的适配体,其通过非共价的生物素/链霉抗生物素蛋白结合固定在支持物上。
在实施例中,还描述了由包被了链霉抗生物素蛋白分子层的聚苯乙烯材料组成的固相支持物,和缀合生物素分子的本发明的适配体,其通过非共价的生物素/链霉抗生物素蛋白结合固定在支持物上。
在某些实施方案中,本发明的适配体可以固定在适合亲和层析、电层析和毛细管电泳的固相支持物上,例如Ravelet等人(2006,J ChromatogrA,卷117(1):1-10)、Connor等人(2006,J Chromatogr A,卷111(2):115-119)、Cho等人(2004,Electrophoresis,卷25(21-22):3730-3739)或Zhao等人(2008,Anal Chem,卷80(10):3915-3920)所述。
长度至少15个核苷酸且特异性结合GLA结构域蛋白的通式(I)的适配体,或通式(II)的化合物,也可有利的用作在检测或诊断方法和装置中捕获活性GLA结构域蛋白的活性剂。
根据另一个方面,本发明还涉及检测样品中一种或多种活性GLA结构域凝固蛋白的存在的方法,包括下列步骤:
a)使(i)通式(I)的核酸,或通式(II)的化合物,或固定了所述核酸或所述化合物的多个分子的固相支持物与(ii)所述样品接触;和
b)检测在(i)所述通式(I)的核酸,或所述通式(II)的化合物,或所述支持物,与(ii)活性GLA结构域凝固蛋白之间复合物的形成。
本专利申请的实例提供了用预先固定在固相支持物上的本发明的适配体检测活性人FIX/FIXa的方法的多种实施方案。
为了进行根据本发明的检测方法,使用的固相支持物可以是选自之前涉及纯化活性GLA结构域凝固蛋白的方法时描述的固相支持物的固相支持物。
为了执行用于检测活性GLA结构域凝固蛋白的方法,或制备用于检测活性GLA结构域凝固蛋白的装置,本领域技术人员特别可参考欧洲专利申请号EP 1972693、PCT申请号WO 2008/038696、PCT申请号WO 2008/025830或PCT申请号WO 2007/0322359中描述的技术。
在某些实施方案中,可以如实施例所述,通过测量表面等离振子共振信号,来进行检测在(i)所述核酸或所述固相支持物与(ii)活性GLA结构域凝固蛋白之间复合物的形成的步骤b)。
在某些其他实施方案中,可以通过使所述任选形成的复合物与特异性针对GLA结构域凝固蛋白的配体接触(所述配体是可检测的),来执行步骤b),即检测在(i)所述核酸或所述固相支持物与(ii)活性GLA结构域凝固蛋白之间复合物的形成。实施例描述了这些实施方案,其中使用酶标记的抗GLA结构域凝固蛋白单克隆或多克隆抗体,作为GLA结构域凝固蛋白的可检测的配体,所述酶在此情况下是适用的辣根过氧化物酶,如ELISA类型的测试中常规使用的。作为特异性针对GLA结构域凝固蛋白的抗体,根据所追求的目标,可以使用(i)特异性针对预定GLA结构域凝固蛋白的抗体,例如抗人FII、抗人FVII、抗人FIX、抗人FX、抗人蛋白C或抗人蛋白S的抗体,(ii)或针对GLA结构域的抗体,其能够识别多种GLA结构域蛋白,例如美国专利号US 7439025所述。
令人惊奇的是,根据本发明显示,可以使用这样的DNA适配体作为抗GLA核酸适配体,来生产如本说明书定义的亲和支持物,所述DNA适配体在现有技术中被视为难以使用的核酸配体,且其对靶蛋白的特异性少于相应序列的RNA分子的特异性。特别的是,现有技术承认DNA配体比相应的RNA具有较低的灵活性,因此相比RNA配体更不能够进行构象改变。应记得,当核酸适配体结合靶蛋白时,发生构象改变。还描述了核酸适配体的构象改变越快,则所述核酸适配体对靶蛋白的亲和性越高(Michaud等人,2003,Anal Chem,第76卷:1015-1020;Brumbt等人,2005,Anal Chem,第77卷:1993-1998)。
因而,在根据本发明的亲和支持物的某些实施方案中,抗GLA适配体由DNA适配体组成。
因此,在根据本发明的亲和支持物的某些实施方案中,所述固定化的核酸适配体适当合适时包括在通式(I)的化合物的结构中时,由脱氧核糖核酸组成。
在根据本发明的亲和支持物的某些其他实施方案中,所述核酸的第一部分由脱氧核糖核酸组成,剩余部分由核糖核酸组成。
核酸适配体的另一个优势涉及相比合成RNA适配体的难度的生产它们的容易性,以及其成本价格显著低于RNA适配体的成本价格。
实施例中示例了这些具体的实施方案。
本发明的主题还是用于纯化活性GLA结构域凝固蛋白或用于纯化多种活性GLA结构域凝固蛋白的亲和层析装置,包括放置了合适量的本说明书中定义的亲和支持物的容器。
用于层析支持物的各种类型的容器是本领域已知的,并被上述术语“容器”的含义所涵盖。此类容器的重要特征涵盖了存在用起始样品补料亲和层析装置的手段,和在使液体与亲和支持物接触后离开的手段。
本发明的主题还是用于在支持物上固定活性GLA-结构域凝固蛋白的方法,包括使含有所述凝固蛋白的样品与上文定义的亲和支持物接触的步骤。
用根据本发明的亲和支持物从中纯化一种或多种活性GLA结构域凝固蛋白的起始样品涵盖了任何类型的液体溶液,其中所述活性GLA结构域凝固蛋白是处于悬浮中的或是溶解的。此类样品的具体实施方案,特别是涉及后文描述的纯化方法时,将如本说明书之后所定义的。
在某些优选实施方案中,所述样品含有人活性GLA结构域凝固蛋白。有利的,在这些实施方案中,含有目的活性GLA结构域凝固蛋白的样品由含有所述目标蛋白的液体样品组成,包括这样的液体样品,其包含所述活性GLA结构域凝固蛋白以及还能够含有(i)所述GLA结构域凝固蛋白的无活性分子,和/或(ii)非人哺乳动物的同源GLA结构域凝固蛋白的分子。在上述纯化方法的某些实施方案中,所述样品由生物学溶液组成,例如体液、细胞、研磨的细胞材料、组织、研磨的组织材料、器官或完整的生物。
实施例中已显示,因为这样的事实,根据本发明的抗GLA适配体使得能够纯化在所述人因子IX转基因的猪的乳汁中生产的重组人因子IX,所述事实是所述抗GLA适配体选择性结合活性人因子IX和(i)不结合无活性的人因子IX和(ii)不结合猪因子IX,不论所述猪因子IX是活性的或无论所述猪因子IX是无活性的。
在上述纯化方法的某些实施方案中,所述样品由源自动物的液体生物学溶液组成,例如血液、血液衍生物、哺乳动物乳汁或哺乳动物乳汁衍生物。所述样品可由血浆、血浆冷沉淀物、澄清的乳汁或其衍生物组成。
在上述纯化方法的特别优选的实施方案中,所述样品源自对目标人GLA结构域凝固蛋白转基因的动物。有利的,溶液是来自哺乳动物的乳汁,或来自对所述人目标蛋白转基因的哺乳动物的乳汁的衍生物。出于本发明的目的,转基因动物涵盖了(i)非人哺乳动物,例如牛、羊、兔、猪、猴、大鼠或小鼠,(ii)鸟类,或(iii)昆虫,例如蚊子、苍蝇或蚕。在某些优选的实施方案中,对目标人蛋白转基因的动物是非人转基因哺乳动物,完全优选对所述目标人蛋白转基因的母兔。有利的,转基因哺乳动物在它的乳腺中生产所述目标重组人蛋白,原因是在它的基因组中插入了包含编码所述目标蛋白的核酸的表达盒,所述核酸处于允许该转基因蛋白在所述转基因哺乳动物的乳汁中表达的特定启动子的控制下。
在转基因哺乳动物的乳汁中生产所述人GLA结构域蛋白的方法可包括下列步骤:将包含编码目标蛋白的基因的DNA分子整合到非人哺乳动物的胚胎中,所述基因处于在乳汁中天然分泌的蛋白质的启动子(例如酪蛋白启动子、β酪蛋白启动子、乳清蛋白启动子、β乳球蛋白启动子或WAP启动子)的控制下。然后,将胚胎置于相同物种的雌性哺乳动物中。一旦从胚胎获得的哺乳动物充分发育,则在哺乳动物中诱导泌乳,然后收集乳汁。所述乳汁则含有重组的目标人蛋白。
文件EP 0 527 063中给出了在人以外的雌性哺乳动物的乳汁中制备蛋白质的方法的实例,可以重复它的教导内容用于生产本发明的蛋白质。通过导入包含WAP基因的启动子的序列,产生含有WAP(乳清酸性蛋白)启动子的质粒,产生该质粒的方式使得能够接受处于WAP启动子的控制下的外源基因。含有启动子和编码本发明蛋白的基因的质粒用于获得转基因母兔,通过显微注射到母兔胚胎的雄原核中。然后,将胚胎转移到激素准备好的雌性的输卵管中。使用从所获得的年轻转基因兔中提取的DNA,通过Southern技术揭示转基因的存在。通过特定的放射性免疫测试,评估动物乳汁中的浓度。
其他文件描述了用于在人以外的哺乳动物雌性的乳汁中制备蛋白质的方法。可提及但不限于文件US 7 045 676(转基因小鼠)和EP 1 739 170(在转基因哺乳动物中生产von Willebrand因子)。
本发明的纯化方法还完美的适用于获得从人血浆、或从人血浆级分中纯化的活性GLA结构域凝固蛋白,例如人血浆的冷沉淀的级分。
在上述纯化方法的某些实施方案中,靶活性GLA结构域凝固蛋白是人的。
在上述纯化方法的某些实施方案中,样品包括至少一种非人的活性GLA结构域凝固蛋白。
在上述纯化方法的某些实施方案中,所述人的活性GLA结构域凝固蛋白是与所述非人的GLA结构域蛋白同源的。
在上述纯化方法的某些实施方案中,所述人的活性GLA结构域凝固蛋白是所述非人的GLA结构域蛋白的同源物。
在上述纯化方法的某些实施方案中,起始样品可由原料组成,所述原料是人血浆的样品或其级分,或者是对目标GLA结构域蛋白转基因的非人哺乳动物的体液,且含有所述待纯化的目标GLA结构域蛋白。转基因的非人哺乳动物的体液涵盖了乳汁或乳汁的级分,例如乳汁的脱脂级分,或缺少酪蛋白微团的级分。
然而,上述实施方案并非本发明的纯化方法的优选实施方案,特别是由于粗制起始样品中存在的大量蛋白质造成亲和支持物堵塞的风险。
在优选的实施方案中,上述起始样品由在所述溶液中以悬浮含有目标活性GLA结构域凝固蛋白的液体溶液组成,所述液体溶液由活性GLA结构域凝固蛋白的多步纯化方法过程中产生的中间产物组成。
作为示例,对于从对所述蛋白质转基因的非人哺乳动物的体液中纯化活性GLA结构域凝固蛋白的方法,起始样品可由疏水性相互作用层析步骤的洗脱物组成,例如使用了MEP
型层析支持物的层析步骤。实施例中示例了该根据本发明的纯化方法的特定实施方案。
以相同的方式,对于从人血浆中纯化目标活性GLA结构域凝固蛋白的方法,起始样品可由对人血浆样品的冷沉淀级分上进行的深层过滤步骤中的滤出物组成。
一般而言,为了执行本发明的纯化方法,使用亲和支持物的条件与使用常规层析支持物的常规条件非常相似,例如固定了配体抗体的免疫亲和支持物类型。本领域技术人员可参考例如Bailon等人(Pascal Bailon,George K.Ehrlich,Wen-Jian Fung and Wolfgang Berthold,An Overviewof Affinity Chromatography,Humana Press,2000)的手册。
然而,如下文说明书中详细说明的,本发明方法的洗脱步骤c)的条件非常有利于纯化活性GLA结构域凝固蛋白。
在步骤a)中,使恰当体积的待纯化样品与亲和支持物接触。在(i)固定在所述亲和支持物上的抗GLA适配体和(ii)待纯化样品中含有的目标活性GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物。
实施例中已显示,钙(例如以氯化钙形式)的存在促进用于抗GLA适配体结合活性GLA结构域凝固蛋白的条件。
因而,在步骤a)的某些实施方案中,使用包含CaCl2终浓度为至少1mM的缓冲液,涵盖了至少2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM和15mM。在步骤a)中,有利的使用包含CaCl2终浓度为至多50mM的缓冲液。
实施例中还已显示,缺少氯化镁促进用于抗GLA适配体结合活性GLA结构域凝固蛋白的条件。
因而,在步骤a)的某些实施方案中,使用不包含氯化镁的缓冲液。
作为示例,实施例中已显示,对于固定了根据本发明的抗GLA适配体的层析支持物,当步骤a)中使用缺乏氯化镁的缓冲液时,所述支持物对GLA结构域凝固蛋白的亲和力几乎增加了10倍,在此情况下缓冲液是pH 7.5的50mM Tris-HCl和CaCl2,所述增加是相比其余相同但包含氯化镁的缓冲液。
在方法的优选实施方案中,在下文详述的步骤a)结束时和步骤b)之前,可以进行一个或多个洗涤亲和支持物的步骤,从而去除非特异性滞留的物质,例如单纯吸附于所述支持物上的物质。可以使用本领域技术人员普遍已知的常规洗涤缓冲液。
然而,在洗涤步骤的某些实施方案中,可以使用包含NaCl,和/或乙二醇,和/或丙二醇,和/或乙醇的洗涤缓冲液。
实施例中已显示,使用包含NaCl的洗涤溶液不导致对GLA结构域凝固蛋白与固定化抗GLA适配体的特异性结合的任何改变。特别显示了3M的NaCl终浓度不破坏所述特异性结合。
因而,在步骤b)之前的洗涤步骤的某些实施方案中,使用具有至少0.5M的NaCl终浓度的洗涤溶液,包括至少1M、1.5M、2M、2.5M和3M。NaCl终浓度有利的是最多4M。
因而,实施例的结果显示,当固定化适配体和GLA结构域蛋白之间形成的复合物经历高离子强度环境时,本发明的抗GLA适配体结合GLA结构域凝固蛋白的能力未被改变,这是完全预料不到的结果。这实际上使人想起通常借助高离子强度的缓冲液作为洗脱之前与亲和支持物(包括包含固定化适配体的亲和支持物)的固定化配体复合的物质的缓冲液。
因而,实施例的结果显示,在高离子强度对它们结合活性GLA结构域凝固蛋白的能力缺少影响这一方面,根据本发明的抗GLA适配体具有特定的和预料不到的特征。
不希望受任何理论约束,申请人认为本发明的抗GLA适配体的这些预料不到的特性是所述抗GLA适配体特异性结合GLA结构域的能力的结果,所述GLA结构域是活性GLA结构域凝固蛋白普遍的。特别的是,申请人认为本发明的抗GLA适配体通过二价非共价桥键的方式结合靶蛋白,所述桥键仅可在GLA结构域的水平产生,所述二价桥键的产生阻止了源自NaCl的离子与GLA结构域的后续结合。
实施例中还显示,使用包含乙二醇的洗涤溶液不导致对活性GLA结构域凝固蛋白与固定化抗GLA适配体的特异性结合的任何改变。特别显示了1.5M的乙二醇终浓度不破坏所述特异性结合。
因而,在步骤b)之前的洗涤步骤的某些实施方案中,使用具有至少0.5M(包括至少1M和1.5M)的乙二醇终浓度的洗涤溶液。
实施例中还显示,使用包含丙二醇的洗涤溶液不导致对GLA结构域凝固蛋白与固定化抗GLA适配体的特异性结合的任何修饰。特别显示了50%(v/v)的丙二醇终浓度不破坏所述特异性结合。
因而,在步骤b)之前的洗涤步骤的某些实施方案中,使用具有至少10%(v/v)的丙二醇终浓度的洗涤溶液,包括至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%和50%的终浓度。
实施例中还显示,使用包含乙醇的洗涤溶液不导致对活性GLA结构域凝固蛋白与固定化抗GLA适配体的特异性结合的任何修饰。特别显示了10%(v/v)的乙醇终浓度不破坏所述特异性结合。
因而,在步骤b)之前的洗涤步骤的某些实施方案中,使用具有至少1%(v/v),包括至少1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、9.0%、9.5%和10.0%的乙醇终浓度的洗涤溶液。
已显示,此类洗涤缓冲液导致剧烈的条件,用于去除非特异性滞留在适配体上的物质,同时保留活性GLA结构域凝固蛋白分子与固定在亲和支持物上的适配体的特异性结合。令人想起用固定了抗体的亲和支持物难以轻易地实现专门或几乎专门去除与固定在亲和支持物上的配体非特异性结合的物质相关的技术优势。
步骤b)由洗脱在步骤a)过程中与抗GLA核酸适配体形成复合物的目标活性GLA结构域凝固蛋白分子的步骤组成。
如实施例中示例,上述纯化方法的特定优势是可能通过使在(i)固定在所述亲和支持物上的抗GLA核酸适配体和(ii)所述活性GLA结构域凝固蛋白之间形成的复合物与二价离子螯合剂(例如EDTA)接触,来进行洗脱步骤。
该技术优势(由本发明的亲和支持物的特征使之成为可能),使得能够在不需要依赖使用剧烈洗脱条件下洗脱活性GLA结构域凝固蛋白,所述剧烈条件可以变性(至少部分变性)目标活性GLA结构域凝固蛋白。所述被避免的剧烈条件涵盖为洗脱步骤使用酸性pH的剧烈条件,所述酸性pH是纯化已知的亲和支持物上的蛋白质的方法通常进行的,特别是在包含固定化抗体的亲和支持物上。
因而,在上述纯化方法的某些实施方案中,通过使亲和支持物与含有二价离子螯合剂(优选EDTA)的洗脱缓冲液接触,来执行步骤b)
作为示例,洗脱缓冲液可含有至少1mM和至多100mM的EDTA终浓度。
表述“至少1mM”涵盖了至少2、3、4、5、6、7、8、9或10mM。
表述“至多100mM”涵盖了至多29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12或11mM。
在步骤c)中,通过收集步骤b)结束时获得的洗脱液体,纯化目标活性GLA结构域蛋白。
在步骤c)结束时,获得目标凝固蛋白的纯化的液体组合物。然后,可以恰当的处理所述纯化的液体组合物,根据任何已知用于调节和储存蛋白质的技术,包括直接装瓶或在用合适的溶液稀释后装瓶,或者冻干,优选在无菌和无致热源的条件下,然后储藏在恰当的条件下,室温、-4℃或低温下,这取决于选定的调节类型。
如本说明书之前已提及的,本发明的亲和支持物可以在连续循环使用用于纯化目标活性GLA结构域凝固蛋白中,经历其吸收容量的降低,例如由于这样的事实,即洗脱步骤c)不能系统性的释放所有的凝固蛋白分子,从而降低了用于后续纯化循环的游离适配体位点数。
因此,所有已知的层析支持物都必需在恰当的时候进行再生亲和支持物的步骤,以便从所述支持物上释放出所有的活性GLA结构域凝固蛋白分子,并去除任何可能与亲和支持物的固体材料结合(一般是通过非特异性结合)的物质。
因而,在某些实施方案中,本发明的纯化方法包括使所述亲和支持物与再生溶液接触再生亲和支持物的额外步骤d)。
用于再生层析支持物,特别是亲和层析支持物的各种缓冲液,是本领域技术人员普遍已知的,并可用于方法的步骤d)中。本领域技术人员可参考例如Mohr等人(Affinity Chromatography:Practical and TheoreticalAspects,Peter Mohr,Klaus Pommerening,Edition:illustrated,CRC Press,1985)的手册。
作为示例,再生亲和支持物的步骤d)可通过使所述支持物与例如pH 7.5的20mM Tris、5%聚乙二醇和1M NaCl的缓冲液接触来执行,如实施例中示例的。
上述纯化方法使得能够获得非常高纯度的活性GLA结构域凝固蛋白,任选相对于纯化终产物中含有的蛋白质总重量,按重量计大于99.95%的纯度。
上述纯化方法的另一个优势(特别是在这样的实施方案中,其中起始样品由包含重组形式的目标人活性GLA结构域凝固蛋白的样品作为与由非人转基因哺乳动物天然生产的蛋白质的混合物组成)是包含高纯度的目标重组人蛋白的最终组合物基本不含源自所述转基因哺乳动物的蛋白质,特别是基本不含所述哺乳动物的与所述重组人活性GLA结构域凝固蛋白同源的蛋白质。
本发明还涉及特异性结合生物学活性的GLA结构域蛋白的核酸适配体,它结合靶GLA结构域蛋白的能力不受高离子强度环境的改变。
本发明特别涉及特异性结合生物学活性的GLA结构域蛋白的核酸适配体,它结合靶生物学活性的GLA结构域蛋白的能力不受具有至少0.5M的最终NaCl浓度的高离子强度环境的改变。
生物学活性的GLA结构域蛋白涵盖了生物学活性的GLA结构域凝固蛋白。
所述高离子强度的“环境”涵盖了高离子强度的缓冲液。
高离子强度的环境包括具有至少1M、1.5M、2M、2.5M和3M的NaCl终浓度的环境。NaCl终浓度有利的是至多4M。
表述“不被改变的”意指靶GLA结构域蛋白和特异性结合生物学活性的GLA结构域蛋白的核酸适配体之间的结合抵抗高离子强度的环境。例如,在高离子强度,优选85%、90%、95%、96%、97%、98%的环境中,至少80%的靶生物学活性的GLA结构域蛋白仍然结合在特异性结合生物学活性的GLA结构域蛋白的核酸适配体上。特别的是,这意指高离子强度的环境中的洗涤步骤不导致洗脱超过20%的与特异性结合生物学活性的GLA结构域蛋白的核酸适配体结合的生物学活性的GLA结构域蛋白,优选不超过10%、5%、4%、3%、2%、1%。
在一个具体实施方案中,根据本发明的核酸适配体还具有不受疏水环境(例如10%乙醇或50%丙二醇溶液)改变的结合靶生物学活性的GLA结构域蛋白的能力。
这些特性可有利的用于非常有效的洗涤固定了本发明的核酸适配体的亲和支持物,从而使得能够获得对非特异性结合在柱子上的污染物的更好的去除。洗涤效率的改善使得能够增加需要纯化的生物学活性的GLA结构域蛋白的纯度。
如本说明书之前所述以及实施例中示例的,可以通过使所述复合物与包含二价离子螯合剂(例如EDTA)的溶液接触,来解离在本发明的核酸适配体和靶生物学活性的GLA结构域蛋白之间形成的复合物。因而,根据其另一个特征,本发明的核酸适配体由允许与靶GLA结构域蛋白形成复合物的核酸适配体组成,通过使所述复合物与包含二价离子螯合剂(例如EDTA)的介质接触,所述复合物能够被解离,释放出靶生物学活性的GLA结构域蛋白。
如前具体所述,可以通过使所述复合物与介质接触,来解离在本发明的核酸适配体和靶生物学活性的GLA结构域蛋白之间复合物,所述介质包括缓冲液,其包含至少1mM和最多100mM的EDTA终浓度。
如实施例中示例的,优势在于某些实施方案的本发明的抗GLA适配体结合多种活性GLA结构域凝固蛋白的能力,例如结合多种人活性GLA结构域凝固蛋白的能力,用于利用单个亲和层析支持物同时纯化可能包含在起始样品中的多种活性GLA结构域凝固蛋白。例如可用于纯化上述GLA结构域蛋白的方法,用于同时纯化包含在起始样品中的若干GLA结构域凝固因子,例如同时纯化包含在人血浆的冷沉淀级分中的因子VII、IX和X。
本发明的主题还是重组人活性GLA结构域凝固蛋白的纯化组合物,其包含按重量计至少99.9%的所述重组人活性GLA结构域蛋白且基本不含非人蛋白质。
本发明还涉及重组人活性GLA结构域凝固蛋白的纯化组合物,其包含按重量计至少99.9%的所述重组人GLA结构域蛋白,和按重量计最多0.1%的非人蛋白质,按重量计的百分比相对于所述纯化组合物的总蛋白质重量表示。
在上述纯化的组合物中,“至少99.9%”涵盖了至少99.91%、99.92%、99.93%、99.94%、99.95%、99.96%、99.97%、99.98%和99.99%。
在上述纯化组合物中,“最多0.1%”涵盖了最多0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%和0.01%。
本发明还涉及如上定义的可用作药物的纯化组合物。
本发明还涉及药物组合物,其包含如上定义的重组人活性GLA结构域凝固蛋白的纯化组合物,与一种或多种可药用赋形剂。
本发明还涉及如上定义的纯化组合物,用于治疗凝血功能降碍。
本发明还涉及如上定义的纯化组合物的用途,用于生产治疗凝血功能障碍的药物。
获得抗GLA适配体的方法
一般而言,可以根据基于已知为SELEX(通过指数富集的配体系统进化)的一般技术原则的方法,获得根据本发明的抗GLA适配体,所述技术最初具体描述在PCT申请号WO 1991/019813中。用于选择适配体的SELEX方法在于:使蛋白质与核酸、DNA或RNA(一般1015种分子)的组合文库接触;去除不结合靶的核酸,通过PCR分离和扩增结合靶的核酸。重复所述方法直到溶液充分富集了对目标蛋白具有良好亲和力的核酸(Tuerk和Gold,“Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment:RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase”(1990)Science,249(4968):505-10和Ellington和Szostak,“In vitro selection ofRNA molecules that bind specific ligands”,(1990)Nature Aug 30;346(6287):818-22)。文件EP 0 786 469、EP 668 931、EP 1 695 978和EP 1 493 825中给出了其他SELEX方法的实例,其教导可以在实施选择用于本发明的核酸适配体的方法中重复。SELEX方法的某些变型包括反向选择之前通过结合靶目标蛋白选定的适配体的步骤。反向选择步骤可以由以下步骤组成,其中使之前用靶目标蛋白选择的适配体集合与非靶分子接触,从而从起始的适配体集合中去除与非靶分子结合的适配体。在获得核酸适配体的方法中执行此类反向选择步骤,能够增加在方法结束时选定的适配体的特异性或亲和力。
获得抗GLA适配体的第一种方法可以由包括下列步骤的方法组成:
a)提供核酸的混合物,也称为具有不同序列的核酸的“集合”,
b)在允许如下混合物的核酸和如下第一靶活性GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物的条件下,使步骤a)中提供的核酸混合物,或当重复步骤b)时在步骤d)结束时获得的核酸混合物与第一靶活性GLA结构域凝固蛋白接触,
c)进行(i)与所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白形成复合物的核酸与(ii)未与所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白形成复合物的核酸之间的分离,
d)扩增与所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白形成复合物的核酸,从而获得结合所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的核酸的混合物或集合,
e)重复步骤b)至d)足够的次数,以获得具有结合所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的理想的能力的核酸的集合,
f)使步骤e)中提供的核酸混合物,或当重复步骤f)时使步骤h)结束时获得的核酸混合物,与第二靶活性GLA结构域凝固蛋白在允许所述混合物的核酸和所述第二靶活性GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物的条件下接触,
g)进行(i)与所述第二靶活性GLA结构域凝固蛋白形成复合物的核酸与(ii)未与所述第二靶活性GLA结构域凝固蛋白形成复合物的核酸之间的分离,
h)扩增与所述第二靶活性GLA结构域凝固蛋白形成复合物的核酸,从而获得结合所述第二靶活性GLA结构域凝固蛋白的核酸的混合物或集合,
i)重复步骤f)至h)足够的次数,以获得具有结合所述第二靶活性GLA结构域凝固蛋白的理想的能力的核酸的集合,所述核酸具有结合所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白和结合第二靶活性GLA结构域凝固蛋白的能力,
j)任选的,用一个或多个其他不同的靶活性GLA结构域凝固蛋白重复步骤f)至i),从而在方法结束时,获得名为“抗GLA适配体”的具有结合活性GLA结构域凝固蛋白的能力的核酸混合物或集合。
在上述方法的步骤j)结束时获得的核酸适配体能够选择性的结合活性GLA结构域凝固蛋白,而不结合其他蛋白质,特别是不结合无活性的GLA结构域凝固蛋白。
一般而言,本领域技术人员可以在涉及SELEX技术的多种出版物中发现执行上述方法的步骤的详细方案,包括本说明书之前引用的参考文献。
在获得上述抗GLA适配体的方法的某些实施方案中,连续使用2-6个靶活性GLA结构域凝固蛋白选择抗GLA适配体,即,对活性GLA结构域凝固蛋白特异性,但对给定的活性GLA结构域凝固蛋白非特异性的核酸适配体。实践中,已显示在上述方法中连续使用2种不同的靶活性GLA结构域凝固蛋白使得能够获得抗GLA适配体。
为了执行上述获得抗GLA适配体的方法,靶活性GLA结构域凝固蛋白可选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。使用靶蛋白的顺序不是上述方法的必需特征。
根据备选方案,可以根据第二种方法获得抗GLA核酸适配体,该方法包括下列步骤:
a)提供核酸的混合物,也称为具有不同序列的核酸的“集合”,
b)在允许下述混合物的核酸和下述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域之间形成复合物的条件下,使步骤a)提供的核酸混合物,或当重复步骤b)时在步骤d)结束时获得的核酸混合物,与第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域接触,
c)进行(i)与所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域形成复合物的核酸与(ii)未与所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域形成复合物的核酸之间的分离,
d)扩增与所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域形成复合物的核酸,从而获得结合所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域的核酸的混合物或集合,
e)重复步骤b)至d)足够的次数,以获得具有结合所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域的理想的能力的核酸的集合,
f)使步骤e)中提供的核酸混合物,或当重复步骤f)时使步骤h)结束时获得的核酸混合物,与第二靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域在允许所述混合物的核酸和所述第二靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域之间形成复合物的条件下接触,
g)进行(i)与所述第二靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域形成复合物的核酸与(ii)未与所述第二靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域形成复合物的核酸之间的分离,
h)扩增与所述第二靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域形成复合物的核酸,从而获得结合所述第二靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域的核酸的混合物或集合,
i)重复步骤f)至h)足够的次数,以获得具有结合所述第二靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域的理想的能力的核酸的集合,所述核酸具有结合所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域和结合第二靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域的能力,
j)任选的,用一个或多个其他不同的靶GLA结构域蛋白的GLA结构域重复步骤f)至i),从而在方法结束时,获得名为“抗GLA适配体”的、具有结合活性GLA结构域蛋白的能力的核酸混合物或集合。
在上述方法的步骤j)结束时获得的核酸适配体能够选择性的结合活性GLA结构域凝固蛋白,而不结合其他蛋白质,特别是不结合无活性的GLA结构域凝固蛋白。
在用于获得上述抗GLA适配体的第二种方法的某些实施方案中,源自2至6种靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域连续用于选择抗GLA适配体。
为了执行上述获得抗GLA适配体的第二种方法,使用的GLA结构域所来源的靶活性GLA结构域凝固蛋白可选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。使用靶GLA结构域的顺序不是上述方法的必需特征。
上述获得抗GLA适配体的第二种方法和前述获得抗GLA适配体的第一种方法之间关键的区别在于靶,在第一种方法中,所述靶由一系列靶活性GLA结构域凝固蛋白组成,而在第二种方法中,所述靶由一系列活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域组成。
根据本发明,可以根据第三种方法获得结合多种活性GLA结构域凝固蛋白的抗GLA适配体,所述方法的原理与上述第一和第二种方法相同,但其中靶物质交替的是活性GLA结构域凝固蛋白和活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域。本领域技术人员可以方便的确定其中使用的活性GLA结构域凝固蛋白和活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域的顺序,特别是根据所述领域技术人员已获得的靶物质。
本领域技术人员可以方便的获得在上述第二和第三种方法中使用的靶GLA结构域,特别是在已知亲代GLA结构域凝固蛋白的氨基酸序列,因而也已知所考虑的GLA结构域的氨基酸序列的情况下。
根据某些实施方案,使用一种或多种具有已知切割特异性的合适的蛋白水解酶,GLA结构域是通过亲本GLA结构域凝固蛋白的蛋白水解从所述GLA结构域蛋白中获得的。
根据其他实施方案,GLA结构域是基于其已知的氨基酸序列,通过本身已知的肽合成技术获得的,然后使用羧化酶,根据本领域技术人员普遍已知的技术,γ羧基化GLA结构域的谷氨酰胺残基。作为示例,可以用
9050Plus型(Perkin Elmer,Stockholm,Sweden)肽合成仪装置,使用例如PerSeptive
公司(Framingham,Massachusets,United States)出售的DPfp Fmoc氨基酸,合成包含GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域的肽。关于新合成的GLA结构域的酶促γ羧基化步骤,可根据Wu等人(1990,J Biol Chem,265卷(22):13124-13129)所述的技术,使用例如Soute等人(1987,Thromb Haemostasis,第57卷:77-81)所述的半纯化羧化酶。
还可以根据下文描述的其他方法,获得其他选择性结合单个活性GLA结构域凝固蛋白的本发明的抗GLA适配体,所述方法也由这样的工艺组成,所述工艺的原则基于用于SELEX技术的规程的执行。
根据本发明,开发了用于获得选择性结合单个活性GLA结构域凝固蛋白的的抗GLA适配体的第四种方法,所述方法包括(i)一个或多个选择结合活性GLA结构域凝固蛋白的步骤,和(ii)一个或多个逆向选择的步骤,从而去除(ii-a)结合所述GLA结构域凝固蛋白的无活性形式的核酸,和/或(ii-b)结合其他GLA结构域凝固蛋白的核酸。应说明的是下面第四种方法包括一个或多个反向选择核酸的步骤,所述核酸之前已经就结合目标活性GLA结构域凝固蛋白而被选择。然而,可以在下列方法的步骤a)之前,提供反向选择步骤或一个或多个额外的反向选择步骤。
因而,第四种用于获得抗GLA适配体的方法由以下方法组成,所述方法包括下列步骤:
a)提供核酸的混合物,也称为具有不同序列的核酸的“集合”,所述核酸的集合任选的是在一个或多个如上所述的反向选择步骤结束时获得的,
b)在允许下述混合物的核酸和下述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域之间形成复合物的条件下,使步骤a)提供的核酸混合物,或当重复步骤b)时在步骤d)结束时获得的核酸混合物,与第一靶活性GLA结构域凝固蛋白接触,
c)进行(i)与所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白形成复合物的核酸与(ii)未与所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白形成复合物的核酸之间的分离,
d)扩增与所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白形成复合物的核酸,从而获得结合所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的核酸的混合物或集合,
e)重复步骤b)至d)足够的次数,以获得具有理想的结合所述第一靶活性GLA结构域凝固蛋白的能力的核酸的集合,
f)使步骤d)结束时获得的核酸混合物,或当重复步骤b)至d)时使步骤e)结束时获得的核酸混合物,与所述第一靶GLA结构域凝固蛋白的无活性形式在允许所述混合物的核酸和所述第一靶无活性的GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物的条件下接触
g)进行(i)与所述靶GLA结构域凝固蛋白的所述无活性形式形成复合物的核酸与(ii)未与所述靶GLA结构域凝固蛋白的所述无活性形式形成复合物的核酸之间的分离,
h)扩增未与所述靶GLA结构域凝固蛋白的所述无活性形式形成复合物的核酸,从而获得结合所述第一GLA结构域凝固蛋白的所述活性形式且不结合所述GLA结构域凝固蛋白的所述无活性形式的核酸的混合物或集合,
i)重复步骤f)至h)足够的次数,从而获得具有理想的结合所述靶活性GLA结构域凝固蛋白的能力的核酸的集合。
在上述第四种用于获得抗GLA适配体的方法中,步骤b)至e)由选择结合目标活性GLA结构域凝固蛋白的核酸的步骤组成。在所述第四种方法中,步骤f)至i)由反向选择步骤组成,在所述选择过程中,从核酸集合中去除了那些也结合目标GLA结构域凝固蛋白的无活性形式的核酸,所述核酸集合是在步骤b)至e)中根据它们结合目标活性GLA结构域凝固蛋白的能力挑选的。
为了执行包括一个或多个针对非靶蛋白的反向选择步骤的SELEX类型的方法,本领域技术人员可特别参考常规教导,也可参考专利US 5 580 737中描述的技术规程。
在上述第四种用于获得抗GLA适配体的方法的某些实施方案中,可以用单个目标GLA结构域凝固蛋白的多种无活性形式进行反向选择步骤f)至i),所述蛋白例如包括这样的GLA结构域的蛋白质,所述GLA结构域中连续的一个GLA残基和一个以上的GLA残基是没有γ羧基化的,因此作为谷氨酰胺残基存在于GLA结构域中。作为示例,为了执行连续的反向选择步骤,可以连续使用包括GLA结构域的目标蛋白的类型,其中连续的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个GLA残基是作为谷氨酰胺残基存在的,作为GLU存在的GLA的数量当然受到考虑完全γ羧基化时GLA结构域中存在的GLA残基最大数量的限制。
为了执行上述获得抗GLA适配体的第四种方法,GLA结构域凝固蛋白可选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。
本领域技术人员可以方便的开发其他用于选择特异性结合活性GLA结构域凝固蛋白的适配体的备选方法,包括选择方法,所述选择方法包括一个或多个使用无活性GLA结构域凝固蛋白的初步反向选择步骤,后接一个或多个使用活性的GLA结构域凝固蛋白的选择步骤。
根据其他实施方案,用于获得抗GLA适配体的方法可以是任一种上述方法的类型,其中可添加选择结合靶蛋白的能力不被高离子强度环境改变的那些适配体的步骤,高离子强度为例如包括终浓度为至少0.5M,包括至少1M、1.5M、2M、2.5M和3M的NaCl的缓冲液。
根据其他实施方案,用于获得抗GLA适配体的方法可以是任一种上述方法的类型,其中可添加允许与靶GLA结构域蛋白形成复合物的那些适配体的步骤,通过使所述复合物与包含二价离子螯合剂(例如EDTA)的介质接触,可以使所述复合物解离,释放靶GLA结构域蛋白。选择这些适配体的步骤可以用介质进行,包括缓冲液,其包含至少1mM和最多100mM的EDTA终浓度。
根据其他实施方案,用于获得抗GLA适配体的方法可以是任一种上述方法的类型,其中可添加选择结合靶蛋白的能力不被存在烷撑二醇(alkylene glycol)或聚烷撑二醇(polyalkylene glycol)而改变的那些适配体的步骤。
根据其他实施方案,用于获得抗GLA适配体的方法可以是任一种上述方法的类型,其中可添加选择结合靶蛋白的能力不被存在乙二醇而改变的那些适配体的步骤。选择这些适配体的步骤可以用介质进行,包括缓冲液,其包含至少0.5M,包括至少1M和1.5M的乙二醇终浓度。
根据其他实施方案,用于获得抗GLA适配体的方法可以是任一种上述方法的类型,其中可添加选择结合靶蛋白的能力不被存在丙二醇而改变的那些适配体的步骤。选择这些适配体的步骤可以用介质进行,包括缓冲液,其包含至少10%(v/v),包括至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%和50%的丙二醇终浓度。
根据其他实施方案,用于获得抗GLA适配体的方法可以是任一种上述方法的类型,其中可添加选择结合靶蛋白的能力不被存在乙醇而改变的那些适配体的步骤。选择这些适配体的步骤可以用介质进行,包括缓冲液,其包含至少1%(v/v),包括至少1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、9.0%、9.5%和10.0%的乙醇终浓度。
确定GLA结构域凝固蛋白的生物学活性的方法
一般而言,通常以本领域技术人员已知的方式,根据两类测试的任一种来确定GLA结构域凝固蛋白的生物学活性,所述测试分别是(i)利用测量所考虑的凝固蛋白重建初始耗尽了所述凝固蛋白的血浆的凝血活性的特性的优势,来确定抗凝血活性的测试;和(ii)通过测量生色底物的转化,确定所考虑的凝固蛋白的实际酶活性的测试。这两类确定GLA结构域凝固蛋白的生物学活性的一般原则描述如下,作为其生物学确定目标GLA结构域凝固蛋白的特定应用。
应说明的是,不论使用何种测试,只要结果表示为(i)测试蛋白质的生物学活性和(ii)活性参照蛋白的生物学活性的比例,则确定GLA结构域凝固蛋白的生物学活性的测量结果与给定的测试蛋白就是可比较的。
根据本发明,参照组合物可由血浆浓缩物组成,优选人血浆浓缩物,或者由包括重组GLA结构域凝固蛋白的组合物组成。
通过测量凝血活性,确定GLA结构域凝固蛋白的生物学活性
该第一种方法在于,将测试的凝固因子导入初始耗尽了该因子的血浆中,然后测量抗凝血活性相对于正常血浆的百分比重建。具体耗尽各种凝固因子的血浆是可商购的,例如通过诸如Stago、American Diagnostica或Hyphen Biomed的公司。
血浆的活性是用凝血时间表征的,即,通过形成彼此聚合并使血浆固化的纤维蛋白分子所必需的时间。可以利用血凝度计装置简单的测量血浆的这一机制特性的改变。血凝度计装置具有小的磁力条,磁力条的运动在凝血时停止。
如果测试的凝固因子是前凝血因子(procoagulant factor),则向初始耗尽了该因子的血浆中添加该因子将导致凝血时间减少,所述凝血时间将与正常血浆接近。这类方法使得能够验证凝固因子的大部分功能,例如:酶活性、靶和辅因子识别,但不能验证与血细胞和血管壁内皮细胞相互作用的能力。该类方法给出了待测试的GLA结构域凝固因子活性的整体和平均图。
一般而言,用于确定GLA结构域凝固蛋白的生物学活性的第一种方法由包括下列步骤的方法组成:
a)提供
(i)包含GLA结构域凝固蛋白的测试组合物,
(ii)从包含已知量的所述生物学活性的GLA结构域蛋白的参照组合物制备多种样品,每个样品包括已知量的所述生物学活性的GLA结构域蛋白,与其他样品中每一个所含的所述蛋白质的量都不同,
(iii)耗尽了所述GLA结构域蛋白的血浆组合物或不含所述GLA结构域蛋白的血浆组合物,以及需要时
(iv)所述GLA结构域蛋白的一个或多个纯化的辅因子,
b)通过进行下列步骤b1)和b2),开始测定:
b1)使(i)包含GLA结构域凝固蛋白的测试组合物,与(ii)耗尽了所述GLA结构域蛋白的血浆组合物或不含所述GLA结构域蛋白的血浆组合物,以及需要时,还与(iii)所述GLA结构域蛋白的一个或多个纯化的辅因子接触,
b2)使(i)包含已知量的所述生物学活性的GLA结构域蛋白的参照组合物的每个样品,与(ii)耗尽了所述GLA结构域蛋白的血浆组合物或不含所述GLA结构域蛋白的血浆组合物,以及需要时,还与(iii)所述GLA结构域蛋白的一个或多个纯化的辅因子接触,
c)确定:
c1)对于测试组合物,在开始步骤b1)时和步骤b1)中制备的与测试组合物的混合物凝血时刻之间流逝的时间,和
c2)对于每个参照组合物的样品,在开始步骤b2)时和步骤b2)中制备的与参照组合物的混合物凝血的时刻之间流逝的时间,
d)制备校准曲线,也称为参考曲线,使用在步骤c2)中确定的时间测量值作为每个样品中所述GLA结构域凝固蛋白的已知量的函数,
e)确定测试组合物中含有的所述GLA结构域凝固蛋白的量,通过步骤d)中制备的校准曲线和基于步骤c1)中确定的时间,确定测试组合物中所述GLA结构域凝固蛋白的推定量。
确定因子II(凝血酶原)的生物学活性
在步骤a)-(i)中,提供了包含因子II的测试组合物。
在步骤a)-(ii)中,提供了参照因子II组合物的多种样品,例如以基础参照组合物的连续稀释样品的形式。可以例如使用参照组合物的第一样品(100%),然后连续稀释至50%、25%、12.5%和6.2%的参照组合物。
在步骤a)-(iii)中,提供了耗尽因子II的血浆组合物,例如由AmericanDiagnostica Inc.公司(Stanford,USA)以参照编号202出售的组合物。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考由Hyphen Biomed公司以参考编号DP010K出售的测试,或由Hyphen Biomed公司以参考编号DP010A出售的测试。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考下列文章:Soulier等人(1952,Sang,卷23:549-559)、Favre-Gilly等人(1967,Cah Med Lyonnais,卷43(28):2611-2668)、Gjonaess等人(Acta Obste Gynecol Scand,卷54:363-367)或Andrew等人(1987,Blood,卷70:165-172)。
确定因子VII的生物学活性
在步骤a)-(i)中,提供了包含因子VII的测试组合物。
在步骤a)-(ii)中,提供了参照因子VII组合物的多种样品,例如以基础参照组合物的连续稀释样品的形式。可以例如使用参照组合物的第一样品(100%),然后连续稀释至50%、25%、12.5%和6.2%的参照组合物。由National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC-United Kingdom)以参考编号97/592出售的血浆浓缩物可用作参照组合物。
在步骤a)-(iii)中,提供了耗尽因子VII的血浆组合物,例如由American Diagnostica Inc.公司(Stanford,USA)以参照编号267出售的组合物。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考由Hyphen Biomed公司以参考编号DP030K出售的测试,或由Hyphen Biomed公司以参考编号DP030A出售的测试。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考下列文章:Soulier等人(1952,Sang,卷23:549-559)或Gjonaess等人(Acta Obste Gynecol Scand,卷54:363-367)。
确定因子IX的生物学活性
在步骤a)-(i)中,提供了包含因子IX的测试组合物。
在步骤a)-(ii)中,提供了参照因子IX组合物的多种样品,例如以基础参照组合物的连续稀释样品的形式。可以例如使用参照组合物的第一样品(100%),然后连续稀释至50%、25%、12.5%和6.2%的参照组合物。由National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC-United Kingdom)以参考编号07/182出售的血浆浓缩物可用作参照组合物。
在步骤a)-(iii)中,提供了耗尽因子IX的血浆组合物,例如由AmericanDiagnostica Inc.公司(Stanford,USA)以参照编号269出售的组合物。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考由Hyphen Biomed公司以参考编号DP050K出售的测试,或由Hyphen Biomed公司以参考编号DP050A出售的测试。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考下列文章:Van Hylckama等人(2000,Blood,卷95(12):3678-3682)、Taran等人(1997,Biochemistry(Mosc.),卷62(7):685-693)、Orstavik等人(1979,Br J Haematol,卷42(2):293-301),以及参考在下列网络地址可获得的文件:“www.ncbi.nlm.nih.gov”(OMIM,Haemophilia B,FIX deficiency,+306900,+134540,+134510,+134520)。
确定因子X的生物学活性
在步骤a)-(i)中,提供了包含因子X的测试组合物。
在步骤a)-(ii)中,提供了参照因子X组合物的多种样品,例如以基础参照组合物的连续稀释样品的形式。可以例如使用参照组合物的第一样品(100%),然后连续稀释至50%、25%、12.5%和6.2%的参照组合物。在Hyphen Biomed参考编号DP060K和DP060A中描述的血浆浓缩物可用作参照组合物。
在步骤a)-(iii)中,提供了耗尽因子X的血浆组合物,例如由AmericanDiagnostica Inc.公司(Stanford,USA)出售的组合物。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考由Hyphen Biomed公司以参考编号DP060K出售的测试,或由Hyphen Biomed公司以参考编号DP060A出售的测试。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考下列文章:Favre-Gilly等人(1967,Cah Med Lyonnais,卷43(28):2611-2668)或Gjonaess等人(ActaObste Gynecol Scand,卷54:363-367)。
确定蛋白C和蛋白S的生物学活性
相同的方法用于确定蛋白C和蛋白S的生物学活性。
通过使用可测量的底物测量酶活性,确定GLA结构域凝固蛋白的生
物学活性,所述底物例如生色底物或荧光底物
这一第二种方法的基本原则对所有的GLA结构域凝固因子都是相同的。该第二种方法在于,使待表征的因子与生色的或荧光的底物肽接触,所述底物肽模拟被考虑的所述因子天然识别并由所述因子裂解其天然靶蛋白的肽序列。
使用合适的分光光度计测量生色团或荧光团的释放。该方法可能需要添加辅因子,且必要时,需要执行激活测试因子的步骤。该第二种方法使得能够测量所测试的GLA结构域凝固蛋白与辅因子的酶促功能。相比之前描述的测量凝血活性的方法,这是较不全面的方法。然而,该第二种方法对测量目标GLA结构域凝固蛋白的酶活性具有优势。因为可能与其他具有胰蛋白酶样活性的酶交叉反应,所以该第二种方法主要用于测量预纯化的、浓缩的或存在于不含显著量的其他酶的基质中的因子的生物学活性,其中所述其他酶的量是相比目标凝固因子的量而言的。
在步骤a)-(iii)中,提供了耗尽蛋白C的血浆组合物,例如由AmericanDiagnostica Inc.公司(Stanford,USA)以编号249出售的组合物。
在步骤a)-(iii)中,提供了耗尽蛋白C的血浆组合物,例如由AmericanDiagnostica Inc.公司(Stanford,USA)以编号253出售的组合物。
一般而言,用于确定GLA结构域凝固蛋白的生物学活性的第二种方法由包括下列步骤的方法组成:
a)提供
(i)包含GLA结构域凝固蛋白的测试组合物,
(ii)从包含已知量的所述生物学活性的GLA结构域蛋白的参照组合物制备多种样品,每个样品包括已知量的所述生物学活性的GLA结构域蛋白,与其他样品中每一个所含的所述蛋白质的量都不同,以及
(iii)所述GLA结构域蛋白的可检测的底物,或由所述GLA结构域蛋白直接或间接激活的凝固蛋白的可检测的底物,
b)通过进行下列步骤b1)和b2),开始测定:
b1)使(i)包含GLA结构域凝固蛋白的测试组合物,与(ii)所述GLA结构域蛋白的可检测的底物,或与(iii)由所述GLA结构域蛋白直接或间接激活的凝固蛋白的可检测的底物接触,在此情况下还添加了组合物,所述组合物包括一种或多种由所述GLA结构域蛋白直接或间接激活的凝固蛋白,并且其中最后被激活的凝固蛋白由能够转化所述可检测底物的凝固蛋白组成,
b2)使(i)包含已知量的所述生物学活性的GLA结构域蛋白的参照组合物的每个样品,与(ii)所述GLA结构域蛋白的可检测的底物,或与(iii)由所述GLA结构域蛋白直接或间接激活的凝固蛋白的可检测的底物接触,在此情况下还添加了组合物,所述组合物包括一种或多种由所述GLA结构域蛋白直接或间接激活的凝固蛋白,并且其中最后被激活的凝固蛋白由能够转化所述可检测底物的凝固蛋白组成,
c)允许所述可检测底物的酶促转化发生预定的时间,所述时间分别始于步骤b1)开始时和步骤b2)开始时,然后在所述预定的时间结束时停止酶促反应,
d)测量已被酶促转化的所述可检测底物的量:
d1)对于参照组合物的每个样品,和
d2)对于测试组合物,
e)制备校准曲线,也称为参照曲线,使用在步骤d1)中确定的已被酶促转化的所述可检测底物的量的测量值作为参照组合物的每个样品中所述GLA结构域凝固蛋白的已知量的函数,
f)确定测试组合物中含有的所述GLA结构域凝固蛋白的量,通过步骤e)中制备的校准曲线和基于步骤d2)中确定的酶促转化的所述可检测底物的量,确定测试组合物中所述GLA结构域凝固蛋白的推定量。
术语“可检测的”底物意在表示由于所考虑的酶促反应,转化为可检测的转化产物的底物。一般而言,使用生色的或荧光的底物。
确定因子II(凝血酶原)的生物学活性
为了执行所述方法,本领域技术人员可使用Hyphen Biomed公司以参考编号221605出售的比色测试。
使用未稀释的参照组合物(200%凝血酶原)和参照组合物的一系列稀释样品,例如分别稀释为160%、100%和10%凝血酶原的样品,以及无凝血酶原的样品,制备标准曲线。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考下列文章:Gomez等人(2002,Clin Neurol Neurosurg,104卷(4):285-288)、Delahousse等人(2002,Blood Coagulation&Fibinolysis,13卷(5):465-470)、Neville等人(2001,Haemostasis,31卷:211-217)、Lane等人(1996,Thromb Haemost,76卷(5):651-662)、Poort等人(Blood,卷88:3698-3703)、Rosen等人(1999,ISTH,Abstract 269)或Stocker等人(1996,Toxicon,卷24(1):81-89)或参考在下列网络地址可获得的文件:www.ncbi.nlm.nih.gov(OMIM,凝固因子II,+176930)。
确定因子VII的生物学活性
为了执行所述方法,本领域技术人员可使用Hyphen Biomed公司以参考编号221304出售的比色测试。
使用未稀释的参照组合物(200%因子VII)和参照组合物的一系列稀释样品,例如分别稀释为100%、10%和1%因子VII的样品,制备标准曲线。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考下列文章:Seligsohn等人(1978,Blood,卷52(5):978-988)、Avvisati等人(1980,Br J Haematol,卷45(2):343-352)、Poller等人(1981,Br J Haematol,卷49(1):69-75)、Van Diejien等人(1982,Haemostasis,卷12(3):241-255)、Clarke等人(1992,FEBS Lett,卷298(2-3):206-210)、Ledwozyw等人(1993,ArchVet Pol,卷33(1-2):123-127)、Van Wersch等人(1993,Iht J Clin Lab Res,卷23(4):221-224)、Devies等人(1997,卷76(5):405-408)、Topper等人(1998,Am J Vet Res,卷59(5):538-541)或Chang等人(1999,Biochemistry,卷28(34):10940-10948)。
确定因子IX的生物学活性
为了执行所述方法,本领域技术人员可使用Hyphen Biomed公司以参考编号221812出售的比色测试。
可以使用参照组合物的一系列稀释样品,例如分别包含因子IXa终浓度为1.4、3.4、6.8和13.5mU/mi因子IXa的样品,制备标准曲线。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考下列文章:Taran等人(1997,Biochemistry(Mosc.),卷62(7):685-693)、Wagenwoord等人(1990,Haemostasis,卷20(5):276-288),或在下列网络地址可获得的文件:www.ncbi.nlm.nih.gov(OMIM,Haemophilia B,FIX缺陷,+306900、+134540、+134510、+134520)。
为了执行所述方法,本领域技术人员可使用Hyphen Biomed公司以参考编号221802、221605出售的比色测试。
可以使用未稀释的参照组合物(200%因子IXa),和参照组合物的一系列稀释样品,例如分别稀释至100%、50%和20%因子IXa的样品,制备标准曲线。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考下列文章:Van Hylckama等人(2000,Blood,卷95(12):3678-3682)、Taran等人(1997,Biochemistry(Mosc.),卷62(7):685-693)、Wagenwoord等人(1990,Haemostasis,卷20(5):276-288)、Parekh等人(1978,Br J Haematol,卷40(4):643-655)、Orstavik等人(1979,Br J Haematol,卷42(2):293-301),或在下列网络地址可获得的文件:“www.ncbi.nlm.nih.gov”(OMIM,Haemophilia B,FIX缺陷,+306900、+134540、+134510、+134520)。
确定因子X的生物学活性
为了执行所述方法,本领域技术人员可使用名为
FX的,American Diagnostica Inc.以参考编号880出售的测试。
可以使用未稀释的参照组合物(100%因子Xa),和参照组合物的一系列稀释样品,例如分别稀释至75%、50%、25%、10%和5%因子IXa的样品,以及不含因子X的样品,来制备标准曲线。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考下列文章:Kisiel等人(1976,Biochemistry,卷15:4901-4906)、Aurell等人(1977,Thrombosis Research,卷11:595-605)、Lindhout等人(1978,Biochem Biophys Acta,卷533:327-341)或Bergstrom等人(1978,Thrombosis Research,卷12:531-547)。
确定蛋白C的生物学活性
为了执行所述方法,本领域技术人员可使用名为
ProteinC的,American Diagnostica Inc.以参考编号836出售的测试。
可以使用未稀释的参照组合物(100%蛋白C),和参照组合物的一系列稀释样品,例如分别稀释至75%、50%、25%、10%和5%蛋白C的样品,以及不含蛋白C的样品,来制备标准曲线。
为了执行所述方法,本领域技术人员可参考下列文章:Francis等人,(1987,American journal of Clinical Pathology,卷85(5):619-625)。
序列表格
本发明还通过下列实施例进行示例。
实施例
实施例1:制备亲和支持物
亲和支持物是从固相支持物材料制备的,所述支持物材料由移植了链霉抗生物素蛋白(链霉抗生物素蛋白-琼脂糖——
)的基质组成。
将体积为1ml的凝胶导入由柱子(i.d.11mm)组成的容器中。用纯化水洗涤凝胶,从而去除储藏溶剂。
凝胶的特征是:
-生物素吸附容量:≥85纳摩尔/ml凝胶
-功能测试:在AT下,30分钟内捕获>99%生物素化的凝血酶
-其他测试:不含蛋白酶、不含内切/外切核酸酶、不含RNA酶
-保藏:100mM磷酸钠,pH 7.5,+NaN30.02
将装添的柱子(凝胶床高度=1cm)的出口与254nm下UV吸光值的检测仪和记录装置相连接。
将序列SEQ ID NO:4的生物素化抗GLA核酸适配体(在本说明书中也称为“Mapt-1”适配体)溶解在纯化水中,终浓度为0.5mg/0.187ml,即最终的摩尔浓度为0.1mM。根据标准循环,在95℃活化核酸适配体的溶液,用于将适配体固定到固相支持物材料上。
预先用4.8ml纯化水,然后用1.5ml浓缩缓冲液稀释核酸适配体溶液,从而获得下列制剂:50mM Tris,50mM NaCl,4mM MgCl2,10mMCaCl2,pH 7.5。
将吸光值检测仪调节至1AUFS(吸光值单位满刻度),该溶液在254nm下的OD记录为0.575AU254。
将生物素化核酸适配体的溶液注射到预装的链霉抗生物素蛋白-琼脂糖凝胶中,并用蠕动泵以2.5ml/分的流速重复循环,即在凝胶上24秒的接触时间(输入/输出,I/O)。在这些条件下,254nm的OD快速稳定为0.05AU254,这是91%的理论偶联,即,每毫升凝胶0.455mg核酸适配体。
用2M NaCl缓冲液进行洗涤,从而去除未与移植到固相支持物材料上的链霉抗生物素蛋白分子特异性结合的核酸适配体。
实施例2:重组GLA结构域蛋白(转基因人因子IX)的纯化
使用实施例1所述类型的亲和支持物来纯化在人因子IX转基因的猪的乳汁中生产的重组人因子IX。
A.通过亲和层析纯化的方案
用于在亲和支持物上执行起始样品的亲和层析步骤的特征描述在下表中,所述亲和支持物上固定了Mapt-1抗GLA适配体。
步骤1:澄清
用柠檬酸澄清,获得pH 7.5的澄清乳汁,柠檬酸缓冲液的终浓度为0.25M。
步骤2:MEP hypercel
SM:澄清的乳汁(IBF 25-10ml凝胶)
FIX上样:243IU/ml凝胶
平衡缓冲液:0.25M柠檬酸,pH 7.5
洗脱缓冲液:水
步骤3:透析
SM:MEP洗脱液
透析缓冲液:50mM Tris-50mM NaCl,pH 7.5
步骤4:MAPT-1(3轮)
SM:透析过的MEP洗脱液(IBF 1.1-1ml凝胶)
FIX上样:230IU/ml凝胶
平衡缓冲液:50mM Tris-50mM NaCl-4mM MgCl2-10mMCaCl2,pH 7.5
洗脱缓冲液:20mM Tris-10mM EDTA,pH 7.5
再生缓冲液:20mM Tris-1mM NaCl-5%PG,pH 7.5
B.原材料(RM)的特征
使用的原材料由来自人因子IX转基因的猪的未处理的乳汁组成。
C.方法的监测
C.1.步骤1:澄清
C.1.1.-澄清的监测
-E0在37℃解冻
-具有非常乳白色外观的混合物:45g(2/3)猪乳汁+25g(1/3)浓缩至0.75M的柠檬酸缓冲液
-在室温下温和搅拌30min
-15℃,5000g,离心30min
_沉淀:含有猪毛和杂质的小的、白色沉淀
_上清液:两相,上层固相油腻、白色,由脂肪物质构成,以及代表澄清乳汁(E1)的浅黄色相。
-用泵回收澄清的乳汁
-用Cuno BioCap 25滤纸深层过滤澄清的乳汁
-将澄清的过滤乳汁(E2)深度冷冻于-80℃。
C.1.2-总蛋白质的结果,按FIX:C、FIX:Ag和FIX:Am
结果显示在下表1和2中。
C.2.步骤2:MEP hypercel
C.2.1.-层析支持物的特征
-柱子:IBF 25,2.5cm高
-凝胶:MEP 10ml凝胶,批次200920/G206-04
-使用次数:第2次使用
-使用前凝胶的再生:1CV 1M NaOH;2CV 2M NaCl;4CV水
C.2.2.-制备起始材料(SM)
-E2在37℃解冻
-参照:1IU的FIX=4μg/ml
-注射体积(g):63.81
-按每ml凝胶IU计,FIX上样(IU/ml凝胶):243IU/ml凝胶
-按每ml凝胶μg计,FIX上样(μg/ml凝胶):972μg/ml凝胶
C.2.3-层析缓冲液的特征
-平衡缓冲液:0.25M柠檬酸,pH 7.5,612mOsmol/kg,31.9mS/cm
MEP洗脱缓冲液:水
C.2.4-监测层析步骤
C.4.:用抗GLA适配体(Mapt-1)在亲和支持物上层析
对如上所述的预先纯化的转基因人因子IX进行三次独立的纯化测试。每个测试的操作条件和结果说明如下。
C.4.1-层析持物的特征
-柱子:IBF 1.1,0.9cm高
-凝胶:MAPT-1,1ml凝胶
-使用次数:第2次使用
C.4.2.-制备起始材料(SM)
-调节pH,并向E5中添加终浓度为4mM MgCl2和10mM的CaCl2
-等分E5(48.17g),等分为3×16g,两份储藏在-80℃用于下列测试
-参照:1IU的FIX=4μg/ml
-注射体积(g):16.14
-按每ml凝胶IU计,FIX上样(IU/ml凝胶):234IU/ml凝胶
-按每ml凝胶μg计,FIX上样(μg/ml凝胶):936μg/ml凝胶
C.4.3-层析缓冲液的特征
-平衡缓冲液:50mM Tris,50mM NaCl,10mM CaCl2,4mMMgCl2,pH 7.51,218mOsmol/kg,10.77mS/cm
-洗脱缓冲液1:20mM Tris,10mM EDTA,pH 7.53,56mOsmol/kg,2.64mS/cm
-洗脱缓冲液2(再生缓冲液):20mM Tris,1M NaCl,50%丙二醇,pH 7.52,18.27mS/cm。
C.4.4-监测层析步骤
测试1
-在pH 7.34和211mOsm/kg平衡柱子
-FIX上样:234IU/ml凝胶。
实施例3:纯化具有正确的γ羧基化的GLA结构域的GLA结构域蛋
白
在实施例3中,特别进行从包含同一GLA结构域蛋白的不同形式的混合物的起始样品中纯化具有正确的γ羧基化的GLA结构域的GLA蛋白的测试,所述不同形式分别是GLA结构域被正确γ羧基化的形式和GLA结构域没有被正确γ羧基化的形式。
更具体的是,进行纯化人因子IX转基因的猪乳汁中产生的重组因子IX的测试。转基因猪的乳汁包括(i)具有正确的γ羧基化的GLA结构域的活性转基因重组人因子IX,和(ii)具有不正确的γ羧基化的GLA结构域的无活性转基因重组人因子IX的混合物。
这些测试的结果如下。
4.1.Mapt-1与具有正确的γ羧基化的GLA结构域的GLA蛋白的选择
性结合
4.1.1.实验条件:
a)结合测量:Biacore T100装置
-芯片:将生物素化的Mapt-1适配体以4326RU固定在激活的流动池3(FC3)的链霉抗生物素蛋白表面(芯片SA,GE)上。对照核酸适配体按4069RU固定在流动池1(FC1)中。注射的样品经过FC3和FC1,从而完全摘出了由于非特异性相互作用造成的背景噪声。
-样品的运行缓冲液(Run buffer)和稀释缓冲液:50mM Tris/50mMNaCl/10mM CaCl2/4mM MgCl2/pH=7.4。
-流速:30μl/min,注射60s,解离120s。
-信号:针对流动池1的信号校正的FC3信号。
-再生:含10mM EDTA的水用于注射。
更具体而言,生产这样的第一固体支持物(FC3),所述支持物上固定了具有序列SEQ ID No.4的本发明的核酸适配体分子(在本文中也称为“Mapt-1”)。在与固体支持物结合前,Mapt-1适配体的5’端与由一分子的PEG(C18)组成的间隔区链化学偶联。然后,与偶联适配体相反的一端——间隔区链的游离端与生物素分子偶联。
还生产第二种固体支持物(FC1),所述支持物上固定了具有序列SEQID No.5的适配体分子,所述适配体分子与Mapt-1不相关,不结合GLA结构域蛋白。
含有固定化的链霉抗生物素蛋白分子的固体支持物是可获得的(S系列传感芯片SA,GE)。
然后,使上述固体支持物与上述适配体化合物接触,从而通过支持物的链霉抗生物素蛋白分子与适配体化合物的生物素分子之间的非共价关联,固定具有序列SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的核酸。
因而,以4326RU的固定率(1RU对应于固定约1pg产物/mm2)固定Mapt-1适配体。
在运行缓冲液(50mM Tris,50mM NaCl,10mM CaCl2,4mMMgCl2,pH 7.4)中稀释转基因重组人FIX,所述转基因重组人FIX是由猪生产,并通过MEP支持物上的层析预先纯化的。
将样品顺序注射到(i)含有通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用固定的不相关的适配体的FC1芯片,和(ii)含有通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用固定的Mapt-1适配体的FC3芯片(固体支持物)。通过注射只含运行缓冲液的空白获得对照。所有注射都用30μl/min的流速进行60sec。在注射后,以初始流速将运行缓冲液注射到芯片上120sec。然后,用30μl/min的流速注射洗脱缓冲液(含10mM EDTA的水用于注射)30sec,从而将结合适配体的底物解偶联。芯片使得能够通过表面等离振子共振(SPR)实时的研究FIXtg和固定化适配体之间相互作用的形成和破坏。与固定化适配体的结合产生了装置记录的信号的增加,所述信号按共振单位(RU)表示(图3)。这些分析是用Biacore T100SPR装置(GE)进行的。所记录的相互作用的建模是通过Biaevaluation软件(GE)进行的。
从FC3芯片获得的信号中减去FC1芯片获得的信号,从而消除了由于非特异性相互作用造成的背景噪音。
b)测量比活:酰胺水解活性相对于抗原水平的比例
-根据供应商的说明,使用Biophen FIX试剂盒测量酰胺水解活性。
-根据供应商的说明,使用Stago
VII:Ag试剂盒测量抗原水平。
c)样品:
-根据生产商的数据含12个γ羧基化的
重组FIX(Nonacogalpha,Wyeth)。
-通过多个层析步骤(测定315138),从转基因猪的乳汁(milk K97,由GTC提供)中纯化FIX-TG,从而获得大于95%的纯度。在激活和用PNGase F消化后,通过LC-MS分析轻链的γ羧基化。MS光谱显示了轻链上不同程度的γ羧基化,范围从1至7。正常的γ羧基化水平是12。
4.1.2结果
结果显示在图1中。
Biacore结合测量值显示,Mapt-1适配体不结合特征是不完全的γ羧基化程度且0.2的比活的纯化FIX-Tg样品。这些结果提示,Mapt-1对正确的γ羧基化形式的选择性。
4.2根据本发明的亲和支持物选择性保留GLA结构域被正确的γ羧
基化的人因子IX的能力
使来自人因子IX的转基因猪的乳汁进行与实施例2所述相似的方法,包括下列步骤:
a)用柠檬酸澄清,
c)洗脱保留的级分,针对pH 7.5的50mM Tris,50mM NaCl缓冲液透析洗脱液,然后用10mM CaCl2和4mM MgCl2调节,
d)步骤c)结束时获得的洗脱液在固定了抗GLA适配体的亲和支持物上走样,在此情况下所述抗GLA适配体是Mapt-1适配体。
作为对照测试,血浆因子IX独立的在固定了抗GLA适配体的亲和支持物上走样,在此情况下所述抗GLA适配体是Mapt-1适配体。
4.2.1.实验条件
4.2.1.1.层析条件
a)步骤1:澄清
用柠檬酸澄清,获得pH 7.5的澄清乳汁,柠檬酸缓冲液的终浓度为0.25M
b)步骤2:在MEP上走样
-SM:澄清的乳汁(IBF 25-10ml凝胶)
-FIX上样:243IU/ml凝胶
-平衡缓冲液:0.25M柠檬酸,pH 7.5
-洗脱缓冲液:水。
c)步骤3:透析
-SM:MEP洗脱液
-透析缓冲液:50mM Tris-50mM NaCl,pH 7.5。
d)步骤4:MAPT-1(3个循环)
-SM:透析过的MEP洗脱液(IBF 1.1-1ml凝胶),针对MgCl2和CaCl2调节,从而获得相应的浓度:10mM和4mM
-FIX上样:230IU/ml凝胶
-平衡缓冲液:50mM Tris-50mM NaCl-4mM MgCl2-10mMCaCl2,pH 7.5
-洗脱缓冲液:20mM Tris-10mM EDTA,pH 7.5
-再生缓冲液:20mM Tris-1M NaCl-5%PG,pH 7.5。
4.2.1.2.测量比活:酰胺水解活性相对于抗原水平,或凝血活性相对于抗原水平的比例
-根据供应商的说明,使用Biophen FIX试剂盒测量酰胺水解活性。
-通过计时法测量凝血活性,所述计时法在于测量体系在存在脑磷脂和高岭土的条件下的凝血时间,所述体系中除因子IX以外,所有因子过量存在(因子IX缺陷型血浆,Stago)。通过稀释标准或样品来提供FIX。在自动分析仪:BCT型上进行分析,通过“hemostasis”软件处理数据,计算活性和置信区间。
-根据供应商的说明,使用Stago
VII:Ag试剂盒测量抗原水平。
4.2.1.3.结合测量:Biacore T100装置
-芯片:将Mapt-1按5073RU固定在激活的流动池2(FC2)的链霉抗生物素蛋白表面(芯片SA,GE)上。不相关的适配体按4959固定在流动池1(FC1)中。注射的样品走样经过FC2和FC1,从而完全减去了由于非特异性相互作用造成的背景噪声。
-样品的运行和稀释缓冲液:50mM Tris/10mM CaCl2/pH=7.4。
-流速:30μl/min,注射100s,解离200s。
-信号:根据流动池1的信号校正的FC2信号。
-再生:含10mM EDTA的PBS缓冲液,pH 7.4。
4.2.2.结果
4.2.2.1层析
产生层析图,并且还用考马斯蓝染色进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果显示在图2中。
分析Mapt-1步骤的层析图显示,首先,大部分的注射样品未滞留,第二,可能对应于少数的FIX-TG类型的非常弱的洗脱峰。
如图3中的图像所示,洗脱液的SDS-PAGE凝胶分析不能使可能纯化的FIX可视化,这与观察到的峰高度相关的数量一致。
另一方面,当制备SDS-PAGE电泳凝胶,然后用硝酸银染色时,在洗脱液滞留于Mapt-1亲和支持物上的级分中,纯化的转基因重组人FIX的蛋白质条带是清晰可见的(参见图3A和3B中显示的SDS-PAGE凝胶图像),所述条带表现出具有非常高的生物学活性。
4.2.2.2.在各种级分中发现的因子IX的比活
下表19展示了在起始产物中和在Mapt-1亲和支持物上亲和层析的过程中获得的各种级分中的因子IX的生物学活性的结果。
结果显示在图4的图表中。
图5展示的结合测量结果显示,在弱洗脱峰获得的FIX-TG的特征实际上是对Mapt-1的显著亲和力,与纯化过程获得的样品中呈现的大部分其他形式的FIX-TG相反。
在实施例3中显示,Mapt-1亲和支持物具有对最高生物学活性的GLA结构域蛋白类型的结合选择性,在此情况下合适的是转基因重组人因子IX的活性最高的类型。
因而,除了能够选择性的富集起始样品中的因子IX以外,Mapt-1亲和支持物还能够增加生物学活性/因子IX数量的比例。
实施例4:用固定了抗GLA适配体的亲和支持物纯化各种GLA结构
域蛋白
在实施例4中显示,固定了抗GLA适配体的亲和支持物成功的用于纯化多种GLA结构域蛋白。
更具体的是,实施例4中显示,固定了Mapt-1抗GLA适配体的亲和支持物选择性的保留了因子VII、因子IX和因子X。
5.1.1.实验条件
结合测量:Biacore T100装置
-芯片:将Mapt-1以3596RU固定在激活的流动池2(FC2)上的链霉抗生物素蛋白表面(芯片SA,GE)上。用于允许和稀释样品的缓冲液:50mM Tris/50mM NaCl/10mM CaCl2/4mM MgCl2/pH=7.4
-流速:30μl/min,注射60s,解离120s
-信号:根据空白的流动池1的信号校正FC2信号
-再生:含10mM EDTA的50mM Tris,pH=7.4。
5.1.2.结果
图5给出了结果。
图6显示,Mapt-1亲和支持物选择性的滞留多种GLA结构域蛋白,在此情况下恰当的是多种人GLA结构域凝固蛋白,如因子VII、因子IX和因子X。
实施例5:通过固定在支持物上的人因子IX捕获根据本发明的核酸适
配体
产生了固定了纯化的重组人因子IX分子的固相支持物。使用Wyeth公司以名称
出售的重组人因子IX的纯化制品。
人因子IX固定在用NHS-EDC激活的羧甲基葡聚糖上,NHS-EDC结合FIX上存在的游离胺。
因而,将人重组因子IX按3153RU(1RU对应于每mm2固定约1pg产物)的固定率固定。
将本发明的核酸适配体(纯度:99.9%)在运行缓冲液(50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,pH 7.5)中稀释,从而获得与待测试的不同适配体一样多的适配体样品,所述本发明的核酸适配体是分别具有序列SEQ ID No.3和6至35的适配体。
将每个样品顺序注射到含有固定化人重组FIX的同一芯片(固相支持物)上。通过注射仅含运行缓冲液的空白获得对照。所有的注射都用30μl/min的流速进行60sec;在注射后,以同样的流速将运行缓冲液注射到芯片上120sec。
然后注射洗脱缓冲液(10mM EDTA)60sec,流速为30μl/min,将适配体从固定化的人FIX上解偶联。
芯片使得能够通过表面等离振子共振(SPR)观察在固定化的人重组FIX和测试的每种适配体之间的相互作用的实时形成和破坏,所述适配体具有序列SEQ ID No.3和6至35。与固定化的重组人FIX结合产生了装置记录的信号的增加,所述信号以共振单位(RU)表示的(图6)。用Biacore T100 SPR装置(GE)进行这些分析。所记录的相互作用的建模是通过Biaevaluation软件(GE)进行的。
获得的结果显示,所测试的所有核酸适配体以显著的亲和力结合重组人血浆因子IX。
图6的结果也显示,根据与人因子IX的亲和力水平,所测试的30种适配体可分为四大组。
如图6所示,可尤其注意到被分在组4的适配体对人因子IX的极高亲和力。在所测试的30种适配体中,与人因子IX具有最高亲和力的适配体命名为Mapt-1.2,由具有序列SEQ ID No.35的适配体组成
[Mapt-1.2-CS]。
实施例6:通过固定在支持物上的人因子IX捕获根据本发明的核酸适
配体
产生了固定了纯化的重组人因子IX分子的固相支持物。使用Wyeth公司以名称出售的重组人因子IX的纯化制品。
人因子IX固定在用NHS-EDC激活的羧甲基葡聚糖上,NHS-EDC结合FIX上存在的游离胺。
因而,将重组人因子IX按3153RU(1RU对应每mm2固定约1pg产物)的固定率固定。
将本发明的核酸适配体(纯度:99%)在运行缓冲液(50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,pH 7.5)中稀释,从而获得与待测试的不同适配体一样多的适配体样品,本发明的所述核酸适配体是分别具有序列SEQ ID No.35(Mapt-1.2-CS)和36(Mapt-1.2-CSO)的适配体。
具有序列SEQ ID No.36的Mapt-1.2.-CSO适配体来自具有以下结构的核酸:5’-SEQ ID No.1-SEQ ID No.35-SEQ ID No.2,其长度为80个核苷酸。更具体的是,具有序列SEQ ID No.36的Mapt-1.2.-CSO适配体由这样的核酸组成,所述核酸的范围是从具有结构:5’-SEQ ID No.1-SEQ IDNo.35-SEQ ID No.2的核酸的第10位核苷酸开始至第49位的核酸结束。
将每个样品顺序注射到含有固定化重组人FIX的同一芯片(固相支持物)上。通过注射仅含运行缓冲液的空白获得对照。所有的注射都用30μl/min的流速进行60sec;在注射后,以同样的流速将运行缓冲液注射到芯片上120sec。
然后注射洗脱缓冲液(10mM EDTA)60sec,流速为30μl/min,将适配体从固定化的人FIX上解偶联。
芯片使得能够通过表面等离振子共振(SPR)研究在固定化的人重组FIX和测试的每种适配体之间的相互作用的实时形成和破坏,所述适配体具有序列SEQ ID No.35(Mapt-1.2-CS)和SEQ ID No.36(Mapt-1.2-CSO)。与固定化的人重组FIX结合产生了装置记录的信号的增加,所述信号是按共振单位(RU)表示的(图7)。用Biacore T100SPR装置(GE)进行这些分析。所记录的相互作用的建模是通过Biaevaluation软件(GE)进行的。
获得的结果显示,所测试的两种核酸适配体以显著的亲和力结合重组人血浆因子IX。
图7的结果也显示,在测试的两种适配体中,Mapt-1.2.-CSO(SEQ IDNo.36)表现出对人因子IX的亲和力水平显著高于Mapt-1.2.-CS适配体(SEQ ID No.35)的亲和力水平。
图7的结果还显示了Mapt-1.2.-CSO适配体(SEQ ID No.36)与因子IX的优秀的结合稳定性。
令人想起Mapt-1.2.-CS适配体(SEQ ID No.35)是实施例5中测试的30种适配体中表现出最高亲和力水平的适配体。
实施例7:制备亲和支持物
亲和支持物是由固相支持物材料制备的,所述材料由移植了链霉抗生物素蛋白(链霉抗生物素蛋白-琼脂糖,
)的基质组成。
将体积为1ml的凝胶导入由柱子(i.d.11mm)组成的容器中。用纯化水洗涤凝胶,从而去除储藏的溶剂。
凝胶的特征是:
-生物素吸附容量:≥85纳摩尔/ml凝胶
-功能测试:在AT下,30分钟内捕获>99%生物素化的凝血酶
-其他测试:不含蛋白酶、不含内切/外切核酸酶、不含RNA酶
-保藏:100mM磷酸钠,pH 7.5,+NaN30.02
将装好的柱子(凝胶床高度=1cm)的出口与安装254nm下UV滤光片的吸光度检测仪和记录装置相连接。
将包含具有序列SEQ ID NO:4的核酸的生物素化抗人FIX核酸适配体溶解在纯化水中,终浓度为0.5mg/0.187ml,即最终的摩尔浓度为0.1mM。根据标准循环,在95℃活化核酸适配体的溶液,用于将适配体固定到固相支持物材料上。
预先用4.8ml纯化水,然后用1.5ml Mg++缓冲液(浓缩5x),稀释核酸适配体溶液。
将吸光度检测仪调节至1AUFS(吸光值单位满刻度),该溶液在254nm下的OD记录为0.575AU254。
将生物素化核酸适配体的溶液注射到预先装好的链霉抗生物素蛋白-琼脂糖凝胶中,并用蠕动泵以2.5ml/分的流速再循环,即在凝胶上24秒的接触时间(输入/输出,I/O)。在这些条件下,254nm的OD快速稳定为0.05AU254,这是91%的理论偶联,即,每毫升凝胶0.455mg核酸适配体。
用10mM CaCl2+4mM MgCl2,然后用2M NaCl缓冲液进行洗涤,从而去除未与移植到固相支持物材料上的链霉抗生物素蛋白分子特异性结合的核酸适配体。
实施例8:用于纯化重组人因子IX的方法
A.包含固定化Mapt-1WS适配体的亲和支持物的用途
用人血浆FIX的纯化制品测试适配体亲和支持物。应说明的是,人血浆FIX的纯化制品由60%纯度的FIX浓缩液组成,由Laboratoire
du Fractionnement et des Biotechnologies(French Laboratory ofFractionation and Biotechnologies)(LFB)以名称
出售。
根据实施例7描述的方案制备亲和支持物。适配体由生物素化的抗GLA适配体组成,所述适配体不包括间隔区链,并被称为Mapt-1,包括具有序列SEQ ID No.4的核酸。
用于进行实施例8的亲和支持物具有0.46mg/ml的理论配体密度。使用的凝胶体积为1ml。
用pH 7.5的0.05M Tris-HCl、0.01M CaCl2缓冲液平衡亲和支持物。
按每毫升亲和支持物(凝胶)200IU(即800μg)的量,将纯化的人血浆FIX上样用于人FIX纯化步骤。
将之前调节为pH 7.5的50mM Tris+50mM NaCl+4mM MgCl2+10mM CaCl2的纯化人血浆FIX溶液,用蠕动泵注射到适配体-琼脂糖凝胶(亲和支持物)上,流速为0.1ml/分钟,即,与亲和支持物的接触时间为10分钟(I/O)。
在注射后,用pH 7.5的50mM Tris+50mM NaCl+4mM MgCl2+10mM CaCl2缓冲液洗涤凝胶。
回收体积为10ml的未吸附的溶液。
用pH 7.5的20mM Tris-HCl+10mM EDTA缓冲液洗脱FIX。根据OD谱收集洗脱峰。
为了再生亲和支持物,使用pH 7.5的20mM Tris-HCl,1M NaCl,50%丙二醇缓冲液。
图8显示了人血浆FIX的层析谱,连续监控254纳米的吸光值(OD)。
在图8中,在注射(1)人血浆FIX浓缩液后快速出现未滞留在亲和支持物上的级分的消除峰(2)。亲和支持物持续饱和目标凝固蛋白:发现在(i)亲和支持物的抗GLA核酸适配体和(ii)初始包含在待纯化的组合物中的人血浆FIX分子之间形成复合物。在待纯化的组合物走样后,实施用之前说明的洗涤缓冲液洗涤柱子的步骤。然后,通过注射包含终浓度为10mM EDTA的洗脱缓冲液,来实施洗脱步骤。
图8中的吸收峰(3)显示在洗脱步骤中,从核酸适配体/重组的FIX复合物中释放人血浆FIX。
应该注意到,人血浆FIX分子是快速释放的,因而是小的体积。因此,借助本发明的亲和支持物,获得具有高浓度的人血浆FIX蛋白的洗脱溶液。
在洗脱后,用pH 7.5的20mM Tris-HCl,1M NaCl,50%丙二醇缓冲液进行亲和支持物再生步骤。
产生层析图,并用不含还原剂的4-12%双丙烯酰胺梯度进行SDS-PAGE凝胶电泳,使用考马斯蓝染色。结果显示在图9中。
分析图9中的层析图显示洗脱液表现出良好的层析图纯度,且生物学活性分析的特征是保留了因子IX的功能性。
这些分析还显示,洗脱液级分中发现的“FIX活性”/“因子IX的量”比例的值与起始产物中发现的“FIX活性”/“因子IX的量”比例的值几乎相同,后一值为1.2。这些结果显示FIX在亲和层析纯化方法的过程中未被修饰。
实施例8-A的结果显示了在缺少间隔区链的条件下固定在亲和支持物上的Mapt-1WS适配体,例如在缺少聚乙二醇间隔区链的条件下,从含有多种血浆来源杂质的复杂起始介质中纯化人因子IX的能力。
B.包含固定化Mapt-1.2-CSO适配体的亲和支持物的用途
使用固定了包含PEG(C18)间隔区链的生物素化Mapt-1.2.-CSO适配体分子的亲和支持物。
Mapt-1.2.-CSO适配体包含具有序列SEQ ID No.36的核酸。
使用该亲和支持物,纯化人血浆因子IX。
根据实施例7描述的方案制备亲和支持物。
用于进行实施例X4的亲和支持物具有0.25mg/ml的理论配体密度。使用的凝胶体积为1ml。
用pH 7.5的0.05M Tris-HCl,0.01M CaCl2缓冲液平衡亲和支持物。
按每毫升亲和支持物(凝胶)207μg的量,将50%纯度的人血浆FIX上样用于人FIX纯化步骤。
将之前调节为10mM CaCl2且pH 7.5的纯化人血浆FIX溶液,用蠕动泵注射到适配体-琼脂糖凝胶(亲和支持物)上,流速为0.05ml/分钟,即,与亲和支持物的接触时间为20分钟(I/O)。
在注射后,用pH 7.5的50mM Tris+50mM NaCl+4mM MgCl2+10mM CaCl2缓冲液洗涤凝胶。
回收体积为10ml的未吸附的溶液。
用pH 7.5的50mM Tris-HCl+10mM EDTA缓冲液洗脱FIX。根据OD谱收集洗脱峰。
为了再生亲和支持物,使用pH 7.5的1M NaCl,50%丙二醇再生缓冲液。
图10显示了层析谱。在图10中,在注射人血浆FIX浓缩液后接着是未滞留在亲和支持物上的级分的消除峰(1)。亲和支持物持续饱和目标凝固蛋白:在(i)亲和支持物的抗GLA核酸适配体和(ii)初始包含在待纯化的组合物中的人血浆FIX分子之间形成复合物。在待纯化的组合物走样后,实施用之前说明的洗涤缓冲液洗涤柱子的步骤。然后,通过注射包含终浓度为10mM EDTA的洗脱缓冲液,来实施洗脱步骤。
应说明的是,未滞留的级分含有按重量计57%的包含在起始样品中的蛋白质,洗脱液级分代表按重量计40%的包含在起始样品中的蛋白质,再生级分代表按重量计3%的包含在起始样品中的蛋白质。
图10中的吸收峰(3)显示在洗脱步骤的过程中,从核酸适配体/重组的FIX复合物中释放人血浆FIX。
此外,图11显示了固定了Mapt-1.2.-CSO适配体分子的亲和支持物纯化人因子IX的优秀能力。
图11的结果显示,洗脱液级分表现出良好的电泳级纯度。
实施例8-B的结果显示,固定在亲和支持物上的Mapt-1.2.-CSO适配体从含有多种血浆来源杂质的复杂起始介质中纯化人因子IX的能力。
这些结果是特别出人意料的,因为Mapt-1.2.-CSO适配体仅包含Mapt-1.2.-CS适配体的一部分“核心序列”以及包括5’区,所述5’区由意在被共有引物识别的区域的3’部分组成。更具体而言,Mapt-1.2.-CSO适配体包括具有长度为80个核苷酸的序列5’-SEQ ID No.1-SEQ ID No.3-SEQID No.2-3’的核酸的nt10-nt49的40个核苷酸的区域。
实施例9:纯化重组人因子VII的方法
进行纯化在人因子IX转基因的猪的乳汁中产生的重组因子IX的纯化试验。转基因猪的乳汁包括(i)具有正确的γ羧基化的GLA结构域的活性转基因重组人因子IX,和(ii)具有不正确的γ羧基化的GLA结构域的失活转基因重组人因子IX的混合物。
对用于平衡层析支持物的缓冲液透析猪中产生并通过在MEP
支持物上层析而预纯化的转基因重组人FIX,从而去除柠檬酸钠。在MEP HyperCel上预纯化步骤获得含有纯度1.8%的人因子IX的组合物。
根据实施例7描述的方案制备亲和支持物。
用于进行实施例9的不含间隔区链的Mapt-1WS亲和支持物具有0.46mg/ml的理论配体密度。使用的凝胶体积为1ml。Mapt-1WS适配体包括具有序列SEQ ID No.4的核酸。
用pH 7.5的0.05M Tris-HCl,0.01M CaCl2缓冲液平衡亲和支持物。
每毫升亲和支持物(凝胶)302IU(即,1200μg)负荷的来自转基因母猪奶的预先纯化的重组人FIX用于人FIX纯化步骤。
将之前调节为10mM CaCl2且pH 7.5的纯化的人血浆FIX溶液,用蠕动泵注射到适配体-琼脂糖凝胶(亲和支持物)上,流速为0.1ml/分钟,即,与亲和支持物的接触时间为10分钟(I/O)。
当添加氯化钙时,起始产物没有明显的修饰。
在注射后,用pH 7.5的50mM Tris+50mM NaCl+4mM MgCl2+10mM CaCl2缓冲液洗涤凝胶。
回收体积为10ml的未吸附的溶液。
用pH 7.5的2mM Tris-HCl+10mM EDTA缓冲液洗脱FIX。根据OD谱收集洗脱峰。
为了再生亲和支持物,使用pH 7.5的20mM Tris-HCl,1M NaCl,50%丙二醇再生缓冲液。
图12显示了人血浆FIX的层析谱,连续监测254纳米下的吸光值(OD)。
在图12中,在注射人血浆FIX浓缩液(1)后快速出现未滞留在亲和支持物上的级分的消除峰(2)。亲和支持物持续饱和目标凝固蛋白:在(i)亲和支持物的抗GLA核酸适配体和(ii)初始包含在待纯化的组合物中的转基因人FIX分子之间形成复合物。在待纯化的组合物走样后,实施用之前说明的洗涤缓冲液洗涤柱子的步骤。然后,通过注射包含终浓度为10mM EDTA的洗脱缓冲液,来实施洗脱步骤。
图12中的吸收峰(3)显示,在洗脱步骤的过程中,人转基因FIX从核酸适配体/重组FIX复合物中释放。
应注意到,转基因人FIX分子是快速释放的,因而以小体积释放。因此,凭借本发明的亲和支持物,获得了具有高浓度的转基因人FIX蛋白的洗脱溶液。
洗脱后,用pH 7.5的20mM Tris-HCl,10mM EDTA缓冲液进行再生亲和支持物的步骤。
产生层析图,并使用考马斯蓝染色进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果显示在图12中。
分析图12中的层析图显示,洗脱液表现出良好的层析纯度,特征是这样的事实,即用选择完整因而活性的GLA结构域蛋白保留了因子IX的功能。
实施例9的结果显示,在缺少间隔区链,例如缺少聚乙二醇间隔区链的条件下,固定在亲和支持物上的不含间隔区链的Mapt-1WS适配体从含有多种血浆来源杂质的复杂起始介质中纯化人因子IX的能力。
下表T1也显示了通过层析纯化步骤的结果。
表T1
表T1中给出的结果显示,实施例9制备的亲和支持物表现出优秀的纯化人因子IX的能力,更具体而言,纯化在人因子IX转基因的母猪乳汁中产生的重组人因子IX的能力。特别的是,表T1的结果显示,获得了至少26倍的纯度增加。
实施例10:通过固定在支持物上的人因子VII捕获根据本发明的核酸
适配体
产生了固定了纯化的重组人因子VII分子的固相支持物。使用Laboratoires
du Fractionnement et des Biotechnologies公司(LFB)(French Laboratory of Fractionation and Biotechologies)以名称
出售的重组人因子VII的纯化制品。
人因子VII固定在用NHS-EDC激活的羧甲基葡聚糖上,NHS-EDC结合FIX上存在的游离胺。
因而,将人重组因子VII按2525RU(1RU对应每mm2固定约1pg产物)的固定率固定。
将本发明的核酸适配体(纯度:99%)在运行缓冲液(50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,pH 7.5)中稀释,从而获得与待测试的不同适配体一样多的适配体样品。
将每个样品顺序注射到含有固定化重组人FVII的同一芯片(固相支持物)上。通过注射仅含运行缓冲液的空白获得对照。所有的注射都用30μl/min的流速进行60sec;在注射后,以同样的流速将运行缓冲液注射到芯片上120sec。
然后注射洗脱缓冲液(5mM EDTA)60sec,流速为30μl/min,将适配体从固定化的人FVII上回收。
芯片使得能够通过表面等离振子共振(SPR)研究在固定化的重组人FVII和测试的每种适配体之间相互作用的实时形成和破坏。与固定化的重组人FVII结合产生了装置记录的信号的增加,所述信号是按共振单位(RU)表示的(图14)。用Biacore T100SPR装置(GE)进行这些分析。所记录的相互作用的建模是通过Biaevaluation软件(GE)进行的。
获得的结果显示,测试的所有核酸适配体以显著的亲和力结合重组人血浆因子VII。
图14的结果也显示,根据与人因子VII的亲和力水平,所测试的27种适配体可分为四大组。
如图14所示,应该注意被分为组4的适配体对人因子VII的极高亲和力。在所测试的27种适配体中,与人因子VII具有最高亲和力的适配体命名为Mapt-2.2,由具有序列SEQ ID No.38的适配体组成(Mapt-2.2-CS)。
实施例11:纯化人血浆因子VII的方法
A.包含固定化Mapt-2-CS适配体的亲和支持物的用途
用人血浆FVII的纯化制品测试适配体亲和支持物。应说明的是,人血浆FVII的纯化制品由98%纯度的FVII浓缩液组成,由Laboratoire
du Fractionnement et des Biotechnologies(French Laboratory ofFractionation and Biotechnologies)(LFB)以名称
出售。
根据实施例7描述的方案制备亲和支持物。实施例11-A的亲和支持物包括固定了的Mapt-2-CS适配体,所述适配体包括具有序列SEQ ID No.37的核酸。
用于进行实施例11-A的亲和支持物具有0.40mg/ml的理论配体密度。使用的凝胶体积为1ml。
用pH 7.5的0.05M Tris-HCl、0.01M CaCl2,0.05mM MgCl2缓冲液平衡亲和支持物。
将纯化的人血浆FVII负荷用于人FVII纯化步骤。
将之前调节为4mM MgCl2和10mM CaCl2和pH 7.5的纯化人血浆FVII溶液,用蠕动泵注射到适配体-琼脂糖凝胶(亲和支持物)上,流速为0.1ml/分钟,即,与亲和支持物的接触时间为10分钟(I/O)。
在注射后,用pH 7.5的50mM Tris+50mM NaCl+4mM MgCl2+10mM CaCl2缓冲液洗涤凝胶。
回收体积为10ml的未吸附的溶液。
用pH 7.5的2mM Tris-HCl+10mM EDTA缓冲液洗脱FVII。根据OD谱收集洗脱峰。
为了再生亲和支持物,使用pH 7.5的20mM Tris-HCl,1M NaCl,50%丙二醇缓冲液。
图15显示了人血浆FVII的层析谱,连续监测254纳米下的吸光值(OD)。
在图15中,在注射人血浆FVII浓缩液(1)后快速出现未滞留在亲和支持物上的级分的消除峰(2)。亲和支持物持续饱和目标凝固蛋白:在(i)亲和支持物的抗GLA核酸适配体和(ii)初始包含在待纯化的组合物中的人血浆FVII分子之间形成复合物。在待纯化的组合物走样后,实施用之前说明的洗涤缓冲液洗涤柱子的步骤。然后,通过注射包含终浓度为10mM EDTA的洗脱缓冲液,来实施洗脱步骤。
图15中的吸收峰(3)显示,在洗脱步骤的过程中,人血浆FIX从核酸适配体/重组FIX复合物中释放。
应注意到,人血浆FIX分子是快速释放的,因而以小体积释放。因此,凭借本发明的亲和支持物,获得了具有高浓度的人血浆FIX蛋白的洗脱溶液。
在洗脱后,用20mM Tris缓冲液进行亲和支持物再生步骤。
产生层析图,用考马斯蓝染色进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果显示在图16中。
分析图16中的层析图显示洗脱液表现出良好的层析纯度,且特征是实际上保留了因子VII的功能。
分析图16中的层析图显示,亲和支持物上仅滞留了起始纯化的人血浆FVII的活性形式。起始的纯化组合物中存在的失活形式,包括FVII的糖基化低下的形式和FVII的Des-Gla形式,未滞留在亲和支持物上。
实施例11-A的结果显示了在缺少间隔区链,例如在缺少聚乙二醇间隔区链的条件下,固定在亲和支持物上的Mapt-2-CS适配体从含有多种血浆来源杂质的复杂起始基质中纯化人因子VII的能力。
B.包含固定化Mapt-2.2-CS适配体的亲和支持物的用途
使用固定了包含PEG(C18)间隔区链的生物素化Mapt-2.2.-CS适配体分子的亲和支持物。
使用该亲和支持物,人血浆因子VII纯化至98%纯度
根据实施例7描述的方案制备亲和支持物。实施例11-B的亲和支持物包括固定化的Mapt-2.2.-CS适配体,所述适配体包含具有序列SEQ ID No.37的核酸。
用于进行实施例11-B的亲和支持物具有0.50mg/ml的理论配体密度。使用的凝胶体积为1ml。
用pH 7.5的0.05M Tris-HCl,0.05M NaCl,0.01M CaCl2,0.004MMgCl2缓冲液平衡亲和支持物。
按每毫升亲和支持物(凝胶)115μg的量,将纯化至98%的人血浆FVII负荷用于人FVII纯化步骤。
将之前调节为4mM MgCl2和10mM CaCl2和pH 7.5的纯化的人血浆FVII溶液,用蠕动泵注射到适配体-琼脂糖凝胶(亲和支持物)上,流速为0.05ml/分钟,即,与亲和支持物的接触时间为20分钟(I/O)。
在注射后,用pH 7.5的50mM Tris+50mM NaCl+4mM MgCl2+10mM CaCl2缓冲液洗涤凝胶。
回收体积为10ml的未吸附的溶液。
用pH 7.5的50mM Tris-HCl+10mM EDTA缓冲液洗脱FVII。根据OD谱收集洗脱峰。
为了再生亲和支持物,使用pH 7.5的1M NaCl,50%丙二醇缓冲液。
图17显示了层析谱。在图14中,在注射人血浆FVII浓缩液后接着是未滞留在亲和支持物上的级分的消除峰(1)。亲和支持物持续饱和目标凝固蛋白:在(i)亲和支持物的抗GLA核酸适配体和(ii)初始包含在待纯化的组合物中的人血浆FIX分子之间形成复合物。在待纯化的组合物走样后,实施用之前说明的洗涤缓冲液洗涤柱子的步骤。然后,通过注射包含终浓度为10mM EDTA的洗脱缓冲液,来实施洗脱步骤。
图17中的吸收峰(2)显示,在洗脱步骤的过程中,从核酸适配体/重组的FVII复合物中释放人血浆FVII。
应说明的是,未滞留的级分代表按重量计9%的包含在起始样品中的蛋白质,洗脱液级分含有按重量计78%的包含在起始样品中的蛋白质,而再生级分代表按重量计13%的包含在起始样品中的蛋白质。
此外,图18显示了固定了Mapt-2.2.-CS适配体分子的亲和支持物纯化人因子VII的优秀能力。
图18的结果显示,洗脱液级分表现出良好的电泳纯度。
分析图18的层析图显示,亲和支持物上仅滞留了起始的纯化人血浆FVII的活性形式。起始的纯化组合物中存在的失活形式,包括FVII的糖基化低下的形式和FVII的Des-Gla形式,未滞留在亲和支持物上。
实施例11-B的结果显示了固定在亲和支持物上的Mapt-2.2.-CS适配体从含有多种血浆来源杂质的复杂起始介质中纯化人因子VII的能力。
实施例12:优化用于在亲和支持物上捕获适配体的条件
生产固定了本发明的核酸适配体分子的固相支持物,所述核酸适配体具有80个核苷酸的序列SEQ ID No.39,也被称为“Mapt2”。在结合到固相支持物上之前,Mapt2适配体的5’端与5分子PEG(C18)的间隔区链化学偶联。然后,与偶联到适配体的一端相反的间隔区链的游离端,与生物素分子偶联。
含有固定化的链霉抗生物素蛋白分子的固相支持物是可获得的(S系列传感芯片SA,GE)。
然后,使上述固相支持物与上述适配体化合物接触,从而通过支持物的链霉抗生物素蛋白分子和适配体化合物的生物素分子之间的非共价结合,固定具有序列SEQ ID No.39的核酸。
因而,以4900RU的固定率(1RU对应于固定约1pg产物/mm2)固定Mapt2适配体。
在各种运行缓冲液中分别稀释从血浆中纯化的人FVII(FVII HP,纯度:99%):
-缓冲液1:50mM Tris,50mM NaCl,10mM CaCl2,4mM MgCl2,pH 7.5
-缓冲液2:50mM Tris,50mM NaCl,10mM CaCl2,10mM MgCl2,pH 7.5
-缓冲液3:50mM Tris,50mM NaCl,20mM MgCl2,pH 7.5;
-缓冲液4:50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,pH 7.5;和
-缓冲液5:50mM Tris,10mM CaCl2,pH 7.5。
将每种样品顺序注射到含有通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用固定的Mapt-1适配体的同一芯片(固相支持物)上。通过注射只含运行缓冲液的空白获得对照。所有注射都用30μl/min的流速进行60sec。在注射后,以相同流速将运行缓冲液注射到芯片上120sec。
然后,用30μl/min的流速注射洗脱缓冲液(5mM EDTA)30sec,从而将FVII HP与适配体解偶联。
芯片使得能够通过表面等离振子共振(SPR)实时的研究FVII HP和固定化适配体之间相互作用的形成和破坏。与固定化适配体的结合产生了装置记录的信号的增加,按共振单位(RU)表示。这些分析是用BiacoreT100SPR装置(GE)进行的。所记录的相互作用的建模是通过Biaevaluation软件(GE)进行的。
结果显示在图19中。
图19的结果显示,最佳捕获条件是用缓冲液5获得的,其既不包含NaCl也不包含MgCl2。
图19的结果显示,MgCl2的存在对固定化适配体分子最佳捕获FVII而言不是必需的。结果显示MgCl2的存在甚至不利于FVII的最佳结合。
此外,图19的结果显示,运行缓冲液中NaCl的存在对FVII与固定在亲和支持物上的适配体分子的最佳结合是不利的。
图20和21显示了人血浆FVII结合固定在亲和支持物上的Mapt-2适配体的动力学分析,分别使用缓冲液1(图20)和缓冲液5(图21)。
图20的结果显示,使用缓冲液1,适配体表现出与人FVII的亲和力为148nM(Kd值),ka值为3.3×103M-1s-1,而kd值为4.8×10-4s-1。
图21的结果显示,使用缓冲液5,适配体表现出与人FVII的亲和力为13nM(Kd值),ka值为4.7×104M-1s-1,而kd值为6×10-4s-1。
实施例13:优化用于洗涤亲和支持物上的适配体的条件
使用上述实施例X8描述的亲和支持物。
图22显示了与各种洗涤条件对于亲和支持物上固定的Mapt-2适配体上人FVII的滞留的可能效应相关的结果。测试了下列洗涤缓冲液:(1)50mM Tris,1mM NaCl,10mM CaCl2,4mM MgCl2缓冲液,pH 7.5;(2)50mM Tris,2M NaCl,10mM CaCl2,4mM MgCl2缓冲液,pH 7.5;(3)50mM Tris,3M NaCl,10mM CaCl2,4mM MgCl2缓冲液,pH 7.5;和(4)50mM Tris,10mM EDTA缓冲液。
结果显示,使用增加浓度的NaCl不导致人FVII与Mapt-2适配体结合的任何修饰。
图22的结果显示,即使洗涤亲和支持物的步骤用高离子强度的缓冲液进行,FVII仍然结合Mapt-2适配体。
图22的结果还显示,FVII是用EDTA洗脱的。
图23显示了与各种洗涤条件对于亲和支持物上固定的Mapt-2适配体上人FVII滞留的潜在效应相关的结果。测试了下列洗涤缓冲液:(1)50mMTris,10mM CaCl2,4mM MgCl2缓冲液,pH 7.5;(2)50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,1M NaCl缓冲液,pH 7.5;(3)50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,2M NaCl缓冲液,pH 7.5;(4)50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,3M NaCl缓冲液,pH 7.5;和(5)50mMTris,10mM EDTA缓冲液。
结果显示,使用增加浓度的NaCl不导致人FVII与Mapt-2适配体结合的任何修饰。
图23的结果显示,即使洗涤亲和支持物的步骤用高离子强度的缓冲液进行,FVII仍然结合Mapt-2适配体。
图23的结果还显示,FVII是用EDTA洗脱的。
图24显示了与各种洗涤条件对于亲和支持物上固定的Mapt-2适配体上人FVII的滞留的潜在效应相关的结果。测试了下列洗涤缓冲液:(1)10%乙醇缓冲液,(2)50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,1M NaCl缓冲液,pH 7.5;(3)50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,2M NaCl缓冲液,pH 7.5;(4)50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,3M NaCl缓冲液,pH 7.5;和(5)50mM Tris,10mM EDTA缓冲液。
图24的结果显示,在洗涤步骤中使用乙醇不导致人FVII与Mapt-2适配体结合的任何修饰。
结果显示,在洗涤步骤中使用增加浓度的NaCl不导致人FVII与Mapt-2适配体结合的任何修饰。
图24的结果显示,即使洗涤亲和支持物的步骤用高离子强度的缓冲液进行,FVII仍然结合Mapt-2适配体。
图24的结果还显示,FVII是用EDTA洗脱的。
实施例14:优化用于洗涤亲和支持物上的适配体的条件
产生了固定了本发明的Mapt-1核酸适配体分子的固相支持物,所述Mapt-1核酸适配体具有序列SEQ ID No.4,也被称为“Mapt1”。在结合到固相支持物上之前,Mapt2适配体的5’端与由5分子PEG(C18)组成的间隔区链化学偶联。然后,与偶联适配体的一端的间隔区链的游离端与生物素分子偶联。
含有固定化的链霉抗生物素蛋白分子的固相支持物是可获得的(S系列传感器芯片SA,GE)。
然后,使上述固相支持物与上述适配体化合物接触,从而通过支持物的链霉抗生物素蛋白分子和适配体化合物的生物素分子之间的非共价结合,固定具有序列SEQ ID No.4的核酸。
因而,以4900RU的固定率(1RU对应于固定约1pg产物/mm2)固定Mapt1适配体。
将每种样品顺序注射到含有通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用固定的Mapt1适配体的同一芯片(固相支持物)上。通过注射只含运行缓冲液的空白获得对照。所有注射都用30μl/min的流速进行60sec。在注射后,以相同流速将运行缓冲液注射到芯片上120sec。
然后,用30μl/min的流速注射洗脱缓冲液(5mM EDTA)30sec,从而将FVII HP与适配体解偶联。
芯片使得能够通过表面等离振子共振(SPR)实时的研究FIX和固定化适配体之间相互作用的形成和破坏。与固定化适配体的结合产生了装置记录的信号的增加,以共振单位(RU)表示。这些分析是用Biacore T100SPR装置(GE)进行的。所记录的相互作用的建模是通过Biaevaluation软件(GE)进行的。
图25显示了与各种洗涤条件对于亲和支持物上固定的Mapt-1适配体上人FIX的滞留的潜在效应相关的结果。测试了下列洗涤缓冲液:(1)50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,1M NaCl缓冲液,pH 7.5;(2)50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,2M NaCl缓冲液,pH 7.5;(3)50mM Tris,10mM CaCl2,4mM MgCl2,3M NaCl缓冲液,pH 7.5;和(4)50mM Tris,10mM EDTA缓冲液。
结果显示,在洗涤步骤中使用增加浓度的NaCl不导致人FIX与Mapt-1适配体结合的任何修饰。
图25的结果显示,即使洗涤亲和支持物的步骤用高离子强度的缓冲液进行,FIX仍然结合Mapt-1适配体。
图25的结果还显示,FIX是用EDTA洗脱的。
图26显示了与丙二醇(50%)对于亲和支持物上固定的Mapt-1适配体上人FIX的滞留的潜在效应相关的结果。测试了50mM Tris,10mMCaCl2,50%丙二醇缓冲液,pH 7.5。
图26的结果显示,在洗涤步骤中使用丙二醇不导致人FIX与Mapt-1适配体结合的修饰。