WO2010063865A1 - Uso de modulinas solubles en fenol para el desarrollo de vacunas - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a métodos para aumentar la inmunogenicidad de un péptido antigénico por medio de su acoplamiento covalente a un péptido derivado de modulina (PSM, phenol soluble modulin). En particular, la unión de los péptidos PSMα, PSlMγ y PSMδ a un antigeno (proveniente de un patógeno o de una proteina asociada a un tumor) aumenta la capacidad del antigeno para activar una respuesta inmunitaria in vivo. Asi, los péptidos PSMα, PSMY y PSMδ unidos a estos antigenos pueden utilizarse en el desarrollo de vacunas para la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas o del cáncer.

Description

USO DE MODULINAS SOLUBLES EN FENOL PARA EL DESARROLLO DE VACUNAS

DESCRIPCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere, en general, al campo de la inmunología y, en particular, a métodos para aumentar la inmunogeni cidad de un péptido antigénico por medio de su acoplamiento covalente a un péptido derivado de modulina (PSM, phenol soluble modulin) . En particular, la unión de los péptidos PSMα, PSMγ y PSMδ a un antígeno (proveniente de un patógeno o de una proteína asociada a un tumor) aumenta la capacidad del antígeno para activar una respuesta inmunitaria in vivo. Así, los péptidos PSMα, PSMγ y PSMδ unidos a estos antígenos pueden utilizarse en el desarrollo de vacunas para la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas o del cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los patógenos y el cáncer siguen siendo las principales causas de muerte en el mundo. El desarrollo de vacunas para prevenir enfermedades para las que no existe vacunación -tales como SIDA o paludismo- o para tratar enfermedades crónicas o cánceres, así como la mejora de la eficiencia y seguridad de las vacunas ya existentes, sigue siendo una prioridad. En la mayoría de los casos, el desarrollo de tales vacunas requiere estrategias capaces de estimular de modo específico a los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) .

Los CTL se activan mediante la presentación a receptores de células T (TCR) de péptidos pequeños asociados a moléculas MHC de clase I. Estos complejos péptido-MHC de clase I están presentes en la superficie de células presentadoras de antígeno (APC) , que son también capaces de proporcionar señales de estímulo para la activación óptima de los CTL.

Las células dendríticas (DC) son las APC más potentes y tienen una capacidad única para interaccionar con los linfocitos T no activados (naive T lymphocytes) e iniciar la respuesta inmunitaria primaria, activando a los linfocitos T cooperadores CD4+ (helper) y a los linfocitos T citotóxicos CD8+. En ausencia de inflamación y de respuesta inmunitaria, las células dendriticas patrullan a través de la sangre, tejidos periféricos, linfa y órganos linfoides secundarios. En los tejidos periféricos, las células dendriticas capturan antigenos propios y ajenos. Los antigenos capturados son procesados hasta péptidos proteoliticos y pasan a las moléculas MHC de clase I y II (para la activación de linfocitos T CD8+ o CD4+, respectivamente) . Este proceso de captura de antigeno, degradación y carga, se denomina presentación antigénica. Sin embargo, en ausencia de estimulación, las células dendriticas periféricas presentan los antigenos de modo ineficiente. La (s) señal (es) exógena(s) provenientes de los patógenos o la (s) señal (es) endógena (s) induce (n) a las células dendriticas para que inicien un proceso de desarrollo denominado maduración, que transforma a las células dendriticas en APC y en activadores de linfocitos T.

Los productos bacterianos y virales, asi como las citoquinas inflamatorias y otras moléculas propias, inducen la maduración de las células dendriticas mediante interacción directa con los receptores de superficie de las células dendriticas innatas. Los linfocitos T, a través de vias dependientes e independientes de CD40, y las células endoteliales, contribuyen a la maduración final de las células dendriticas mediante contacto directo célula a célula y mediante secreción de citoquinas. Poco tiempo después de que surja una señal de peligro, se modifican la eficiencia de la captura de antigenos, el transporte intracelular y la degradación, y el tráfico intracelular de moléculas MHC. Se incrementa la carga de péptidos, asi como la vida media y el traslado a la superficie celular de las moléculas MHC. También aumenta la expresión en superficie de las moléculas co-estimuladoras de células T. De este modo, las células dendriticas se convierten en las APC más potentes, y las únicas capaces de activar a los linfocitos T no activados e iniciar la respuesta inmunológi ca . Junto a la modificación de sus capacidades en la presentación de antigenos, la maduración induce también la migración masiva de células dendríticas fuera de los tejidos periféricos. Las modificaciones en la expresión de receptores de quimioquinas y moléculas de adhesión, asi como los importantes cambios en la organización del citoesqueleto , contribuyen a la migración de las células dendriticas a través de la linfa hasta los órganos linfáticos secundarios .

Las células dendriticas responden a dos tipos de señales: al reconocimiento directo de patógenos (mediante receptores con patrón de reconocimiento especifico) y al reconocimiento indirecto de la infección (mediante citoquinas inflamatorias, compuestos celulares internos y respuestas inmunitarias especificas) . En respuesta a estas señales, las células dendriticas se activan e inician su proceso de maduración, que las transforma en estimuladores eficientes de células T. Una de las señales más eficientes para la maduración de las DC está mediada por las interacciones de los receptores tipo peaje

("toll-like receptors") , TLR, (TLRl- 9) con sus respectivos ligandos. (revisado por Kaisho y Akira, Biochimica et Biophysica

Acta, 2002, 1589: 1-13) . Una primera aproximación para dirigir los péptidos antigénicos a las moléculas MHC de clase I y/o II, está basada en vacunas peptidicas sintéticas que contienen epitopos seleccionados capaces de unirse directamente a estas moléculas en la superficie de las APC. En algunos casos estos péptidos han logrado protección tumoral o eliminación de virus en modelos murinos, mientras que en otros han inducido tolerancia. Los estudios con diferentes tipos de péptidos en humanos han conseguido tímidas respuestas clínicas en pacientes con cáncer. Esta pobre capacidad inmunogénica puede deberse a que los péptidos generalmente no activan la maduración de las células dendriticas, de manera que la presentación antigénica se produce en un entorno no inmunogénico, favoreciéndose la no respuesta al antigeno (anergia) .

Alternativamente, se han descrito varias aproximaciones en las que se dirigen los péptidos a las APC mediante la utilización de composiciones en las que se proporcionan los péptidos antigénicos con un segundo compuesto que muestra afinidad hacia un receptor en la superficie de la APC. En este sentido, la utilización de los ligandos de TLR para dirigir un péptido inmunogénico a la APC se ha descrito en el pasado. Los TLR se expresan en los macrófagos y en las células dendríticas, y en otras células tales como los linfocitos B. También se han identificado ligandos para diversos TLR. La mayoría de estos ligandos proceden de patógenos pero no se encuentran en el huésped, lo que sugiere que los TLR son fundamentales para detectar a los microorganismos invasores. El reconocimiento de ligandos por los TLR da lugar a una rápida activación de la inmunidad innata al inducir la producción de citoquinas proinflamatorias y a la sobrerregulación de moléculas co-estimuladoras . La inmunidad innata activada da lugar a una inmunidad adaptativa eficiente.

Se han utilizado diferentes ligandos de TLR para aumentar la eficiencia de un antígeno, como incluir EDA (Lasarte et al. J Immunol, 2007, solicitud de patente española ES200501412 ) , flagelina (Cuadros C et al., Infect Immun. Mayo de 2004; 72:2810-6) o CpG (Tighe, H., et al. 2000. Eur J Immunol. 30:1939) .

El documento WO2005025614 describe composiciones adyuvantes que comprenden un ácido nucleico que codifica un agonista de TLR y un ácido nucleico que codifica GM-CSF, aunque no se hace mención en este documento que podría proporcionarse GM-CSF como proteína de fusión con el agonista de TLR.

El documento WO2004060319 describe composiciones adyuvantes que comprenden una combinación de un agonista de TLR y un agonista del receptor de TNF para aumentar la respuesta inmunitaria frente a un antígeno pero en las que ambos componentes no están unidos covalentemente .

El documento WO07042583 describe una composición inmunoestimuladora frente al virus de la hepatitis C que comprende un agonista de TLR3 (poli I: C) , un agonista de CD40 y un polipéptido de NS3. No muestra los complejos covalentes entre ninguno de los elementos de la composición. El documento WO06134190 describe compuestos inmunoestimuladores que comprenden un fragmento de fibronectina con afinidad hacia TLR4. Este documento menciona la posibilidad del acoplamiento covalente del fragmento de fibronectina y un antigeno. Sin embargo, este documento no menciona compuestos similares utilizando agonistas de TLR2 o PSM.

El documento WO2007103322 describe proteínas de fusión que comprenden un polipéptido inmunogénico y o bien un agonista de TLR5 (flagelina) o un agonista de TLR2/6 (el lipopéptido Pam₃Cys) y los usos de las mismas para inducir una respuesta de anticuerpos frente al péptido inmunogénico.

El documento WO2006083706 describe un método de identificación de ligandos de TLR2 y el aislamiento de una serie de nuevos ligandos de TLR2 asi como conjugados covalentes que comprenden estos ligandos y un antigeno que puede utilizarse para generar inmunización protectora.

Sin embargo, sigue habiendo una necesidad de composiciones inmunogénicas adicionales que puedan (i) transportar epitopos de linfocitos T derivados de antigeno hasta las APC (o DC) de modo que se carguen en las moléculas MHC de clase I y/o II, (ii) transmitir las señales adecuadas hasta las DC para inducir su activación ya que la llegada del antigeno a las DC sin la existencia de una señal de la maduración podría producir tolerancia en lugar de activación de linfocitos T cooperadores y citotóxicos y (iii) conducir a una inmunogenicidad eficiente independientemente de la inmunidad previa frente al propio vehículo .

RESUMEN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la invención se refiere a un conjugado que comprende

(i) una modulina soluble en fenol (PSM) o una variante funcionalmente equivalente de la misma y

(ii) uno o más péptidos antigénicos donde los componentes (i) y (ii) están acoplados covalentemente y donde el conjugado promueve una respuesta citotóxica hacia el péptido o péptidos antigénicos.

En aspectos adicionales, la invención se refiere a un polinucleótido o construcción génica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el conjugado de la invención, a un vector que comprende un polinucleótido o construcción génica de la invención y a una célula huésped que comprende un polinucleótido, una construcción génica o un vector de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende, en conjunto o por separado,

(a) un conjugado, un polinucleótido, una construcción génica, un vector o una célula huésped de la invención y

(b) un segundo componente seleccionado del grupo de

(i) uno o más agonistas de los receptores tipo peaje,

(ii) uno o más anticuerpos agonistas de una molécula co-estimuladora,

(iii) una o más citoquinas y

(iv) cualquier combinación de los compuestos mencionados en (i) a (iii) .

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para obtener una célula presentadora de antigeno sensibilizada con antigeno, que comprende las etapas de

(i) poner en contacto una célula presentadora de antigeno con un conjugado, un polinucleótido, una construcción génica, un vector, una célula huésped o una composición de la invención y

(ii) aislar la célula presentadora de antigeno sensibilizada con antigeno.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula presentadora de antigeno sensibilizada con antigeno obtenida mediante el método de la invención. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica o una vacuna que comprende un conjugado, un polinucleótido, una construcción génica, un vector, una célula huésped, una composición o una célula presentadora de antigeno sensibilizada con antigeno de la invención.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado, un polinucleótido, una construcción génica, un vector, una célula huésped, una composición, una composición farmacéutica, una vacuna o una célula presentadora de antigeno de la invención para su utilización en medicina.

Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado, un polinucleótido, una construcción génica, un vector, una célula huésped, una composición de la invención, una composición farmacéutica, una vacuna o una célula presentadora de antigeno de la invención para su utilización en un método de inducción de una respuesta citotóxica hacia una enfermedad infecciosa, una enfermedad alérgica o una enfermedad neoplásica.

Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado, un polinucleótido, una construcción génica, un vector, una célula huésped, una composición, una composición farmacéutica, una vacuna o una célula presentadora de antigeno de la invención para su utilización en un método in vitro para promover la presentación del péptido o péptidos antigénicos por las células presentadoras de antigeno o para promover la maduración de las células presentadoras de antigeno.

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado que comprende

(i) una modulina soluble en fenol (PSM) o una variante funcionalmente equivalente de la misma y (ii) un compuesto biológicamente activo en el que los componentes (i) y (ii) están acoplados covalentemente .

En aspectos adicionales, la invención se refiere a un polinucleótido o construcción génica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un conjugado no inmunogénico de la invención, un vector que comprende un polinucleótido o construcción génica de la invención, una célula huésped que comprende un polinucleótido o construcción génica de la invención .

En otro aspecto, la invención se refiere a una preparación farmacéutica que comprende un conjugado no inmunogénico, un polinucleótido, construcción génica, un vector o una célula huésped de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable .

Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado no inmunogénico, un polinucleótido, una construcción génica, un vector, una célula huésped o una composición farmacéutica de la invención para su utilización en medicina.

Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado, un polinucleótido, una construcción génica, un vector, una célula huésped o una composición farmacéutica de la invención para su utilización en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por una proliferación no deseada o una actividad no deseada de una célula seleccionada del grupo de células positivas CD4, CD8, CD19, CDlIc, F4/8 o CD117 o una combinación de las mismas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Los péptidos PSM se unen a los esplenocitos de ratón. Los esplenocitos de ratón (paneles A, B, D y E) o células dendríticas derivadas de médula ósea (paneles C y F) se fijaron con glutaraldehído y se incubaron después con el péptido CFSE αMod-SI INFEKL (paneles A, B y C) o con el péptido CFSE γMod- SIINFEKL (paneles D, E y F) , que contienen el péptido PSMα o PSMγ unido covalentemente al péptido SIINFEKL y marcado con CFSE en un extremo amino-terminal . Como controles, también se tiñeron células con el péptido control marcado CFSE-OVA (235-264 ) (A, C, D y F) . Para estudiar la especificidad de unión, se llevó a cabo la incubación de los péptidos marcados con CSFE en presencia o ausencia de los péptidos αMod-SIINFEKL (B) o γMod-SIINFEKL (D) no marcados con CFSE como competidores. Tras 30 min. a 4⁰C y dos lavados con PBS, las células se analizaron por citometria de flujo. (G) Doble tinción de los esplenocitos totales con el péptido CFSE γMod-S I INFEKL y con anticuerpos anti-CD4, CD8, CDlIc, CD19, F480 o GRl marcados con f icoeritrina . En los histogramas inferiores del panel G, se indica el porcentaje de células positivas para estos marcadores de superficie que se tiñen con el péptido CFSE γMod-SIINFEKL .

Figura 2. Los péptidos PSM inducen la maduración de células dendriticas derivadas de médula ósea y mejoran la presentación antigénica . Expresión de ARN mensaj ero que codifica las proteínas IL-I 2 (p40) (A) o TNF-α (B) . Las células dendriticas derivadas de médula ósea se cultivaron con los péptidos indicados a una concentración de 50 μM. Tras 14 horas de cultivo, se purificó el ARN de las células y se realizó su transcripción reversa. La expresión del ARNm para la IL12-p40 y el TNF-α se realizó por PCR a tiempo real . (C) Expresión de marcadores de maduración en la superficie celular de células dendriticas. Las células dendriticas derivadas de médula ósea se cultivaron tal como se describió en (A) en presencia de los péptidos indicados. Tras 48 horas de cultivo, se analizó la expresión de los marcadores indicados por citometria de flujo utilizando anticuerpos específicos. (URF: Unidad relativa de fluorescencia) . (D) Ensayo in vitro para la presentación antigénica. Se cultivaron células dendriticas derivadas de médula ósea en presencia o ausencia de 10 μM de los péptidos indicados. Cuarenta horas después, se lavaron las células y se distribuyeron en placas de 96 pocilios a diferentes concentraciones y se incubaron en presencia de 10⁵ células T/pocillo obtenidas de ratones transgénicos OT-I (que expresan un receptor T específico para el péptido SIINFEKL de la ovoalbúmina) . Setenta y dos horas después, se añadió timidina tritiada a los cultivos y seis horas después, se recogieron las células y se analizó la timidina incorporada en un contador de centelleo (Topcount Packard) .

Figura 3. Activación de una respuesta celular in vivo especifica para el péptido SIINFEKL. Se inmunizaron ratones C57BL/6 con 5 nmoles del péptido indicado más 50 μg de poli I: C. Siete días (A y B) o 60 días (C y D) después de la inmunización, se sacrificaron los ratones y se realizó un ensayo ELISPOT (A y C) para cuantificar el número de células productoras de IFN-γ en respuesta al péptido SIINFEKL o el correspondiente péptido de la modulina en cada uno de los grupos de ratones inmunizados. (B y D) Medición de la actividad citotóxica especifica frente al péptido SIINFEKL inducida siete días (B) o 60 días (D) tras la inmunización con los diferentes péptidos. Se realizó el ensayo de lisis in vivo (in vivo killing) inyectando a los ratones por vía intravenosa esplenocitos marcados con CFSE 0,25 μM o con CFSE 2,5 μM y el péptido SIINFEKL (10 μg/ml) . Tras 16 horas, se sacrificaron los ratones y los esplenocitos se analizaron por citometria de flujo para cuantificar la lisis de las células pulsadas con el péptido SIINFEKL.

Figura 4. Sinergia de las modulinas con diferentes ligandos de TLR en la activación in vivo de respuestas celulares. Se inmunizaron ratones C57BL/6 con 5 nmoles del péptido indicado y en combinación con 50 μg del ligando de TLR indicado: PGN

(peptidoglicano) , PIC (poli I:C), LPS (lipopolisacárido) , EDA

(extradominio A de fibronectina) o CpG. Siete días después, se midió la actividad citotóxica especifica frente al péptido

SIINFEKL inducida tras la inmunización con los diferentes péptidos. Se realizó un ensayo de lisis in vivo (in vivo killing) inyectando a los ratones por vía intravenosa esplenocitos marcados con CFSE 0,25 μM o con CFSE 2,5 μM y el péptido SIINFEKL (10 μg/ml) . Tras 16 horas se sacrificaron los ratones y los esplenocitos se analizaron por citometria de flujo para cuantificar la lisis de las células pulsadas con el péptido SIINFEKL.

Figura 5. Protección frente al desarrollo de tumores. (A) Se inmunizaron de manera subcutánea por vía intravenosa ratones C57BL/6 con 5 nmoles del péptido SIINFEKL, αMod más SIINFEKL (no unidos covalentemente) , αMod-SI INFEKL o SI INFEKL-αMod, todos ellos en combinación con 50 μg de poli I:C. Un grupo de ratones recibió poli I:C solo y a otro grupo se le inyectó PBS (como control de crecimiento del tumor) . (B) Se inmunizaron de manera subcutánea por vía intravenosa ratones C57BL/6 con 5 nmoles del péptido SIINFEKL o con el péptido γMod-SIINFEKL en combinación con poli I:C. Un grupo de ratones recibió poli I:C solo y a otro grupo se le inyectó PBS (como control de crecimiento del tumor) . Siete días después de la inmunización, se inyectaron 5xlO⁵ (A) o 7xlO⁵ (B) células tumorales EG7OVA por vía subcutánea. El seguimiento del crecimiento tumoral se monitorizó con un calibre. Se representa el gráfico de Kaplan-Meier de la supervivencia de los ratones para cada tratamiento. Efecto de αMod-SIINFEKL (A) y γMod-SIINFEKL (B) sobre la protección frente al desafio del tumor.

Figura 6A. Tratamiento de ratones que llevan tumores establecidos EG7OVA con el péptido αMod-SIINFEKL más poli I:C. Se inyectaron a los ratones C57BL/6 por vía s.c. 5xlO⁵ células tumorales EG7OVA. Cuando los tumores alcanzaron los 5 mm de diámetro, se trataron con PBS o con el péptido indicado más poli I: C. El seguimiento del crecimiento tumoral se monitorizó con un calibre. Se representa el gráfico de Kaplan-Meier de la supervivencia de los ratones para cada tratamiento.

Figura 6B. La inmunización con el péptido aMod-E7 (49-57)en combinación con poli I:C induce una respuesta citotóxica especifica frente al péptido E7 (49-57) y es capaz de curar a ratones que portan tumores subcutáneos TCl. (A) Inmunizamos ratones C57B/6 con 5 nanomoles del péptido indicado en combinación con 50 μg de poli I:C. Siete días después de la inmunización, se midió la respuesta inducida frente al péptido citotóxico E7 (49-57) mediante un ELISPOT para cuantificar el número de células productoras de IFN-γ. (B, C y D.) Grupos de ratones C57B/6 fueron inyectados subcutáneamente con 5 x 10⁵ células tumorales TC-I (que expresan la proteina E7 del virus HPV-I 6) . Después de 25 días, cuando el tumor alcanzó un diámetro de 8 mm, los ratones se trataron intravenosamente con PBS (B), con el péptido E7 (49-57) más 50 μg/ml poli I : C (C), o con el péptido αMod-E7 (49-57) más 50 μg/ml poli I : C (D) . Siete días después, los ratones recibieron una segunda inmunización de los mismos inmunógenos. El tamaño tumoral, presentado como el promedio de dos diámetros perpendiculares, fue medido a intervalos regulares. El número de ratones libres de tumor relativo al número total de animales por grupo es incluido para cada tratamiento.

Figura 7. Inducción ±n vivo de respuestas de células T frente al péptido de NS3 de la hepatitis C, plO73, utilizando péptidos de modulina derivados de α, γ o δ acoplados a plO73.

Se inmunizaron C57BL/6 con 5 nmoles del péptido indicado más 50 μg de poli I:C. Siete días después, se sacrificaron los ratones y se realizó un ensayo ELISPOT (A) para medir la presencia de células productoras de IFNγ especificas para el péptido plO73 (1073) procedente de la proteina NS3 de la hepatitis C. Se realizó un ensayo de in vivo killing (B) utilizando células del bazo marcadas con CFSE 0,25 μM o con CFSE 2,5 μM y péptido plO73 (10 μg/ml) .

Figura 8 . Activación de una respuesta celular inducida por los péptidos derivados de la modulina en ratones KO ( "knockout" , deficiente) en TLR2 . Se i nmuni zaron ratone s C57 BL / 6 wí l d type

( de tipo salvaj e ) o ratone s KO en TLR2 con 5 nmole s del péptido i ndi cado y e n comb i na ci ón co n 5 0 μg de pol i I : C . Siete días después de la inmunización, los animales se sacrificaron y se realizó un ELISPOT para cuantificar el número de células productoras de IFN-γ en respuesta al péptido SIINFEKL. (B) Medición de la actividad citotóxica especifica frente al péptido SIINFEKL inducida tras la inmunización con los diferentes péptidos. Se realizó un ensayo de lisis in vivo (in vivo killing) inyectando a los ratones por via intravenosa esplenocitos marcados con CFSE 0,25 μM o con CFSE 2,5 μM y el péptido SIINFEKL (10 μg/ml) . Tras 16 horas, se sacrificaron los ratones y los esplenocitos se analizaron por citometria de flujo para cuantificar la lisis de las células pulsadas con el péptido SIINFEKL.

Figura 9. Los péptidos PSM se unen a los esplenocitos de ratón de los ratones deficientes en TLR2. Los esplenocitos de ratón procedentes de ratones KO en TLR2 se fijaron con glutaraldehido y se incubaron después o bien con el péptido CFSE αMod-SIINFEKL o bien con el péptido CFSE γMod-S I INFEKL . Como controles, también se tiñeron células con el péptido control marcado CFSE- OVA(235-264) o se dejaron sin tratar (histograma gris) . Tras 30 minutos de incubación a 4°C y dos lavados con PBS, las células se analizaron por citometria de flujo.

DESCRIPCIÓN Los autores de la presente invención han mostrado que los péptidos PSM pueden llevar un antigeno hasta células presentadoras de antigeno, activar su maduración, mejorar la presentación antigénica y en consecuencia promover la activación de una respuesta inmunitaria celular frente al antigeno. Esta estrategia ha demostrado ser eficiente para inducir respuestas citotóxicas y para proteger ratones C57BL/6 frente al desarrollo de tumores. Sin embargo, se ha observado que el mecanismo de acción de los péptidos derivados de la modulina es independiente de TLR2. De hecho, la inmunización de ratones con los péptidos utilizados, que contienen modulinas alfa o gamma unidas a un antigeno, induce fuertes respuestas celulares incluso en ratones deficientes para el receptor TLR2.

I. LOS CONJUGADOS DE LA INVENCIÓN Los autores de la presente invención han mostrado que los conjugados covalentes que comprenden una modulina soluble en fenol y un péptido antigénico pueden promover la maduración de las células dendriticas y la presentación de péptidos por las células dendriticas de péptidos acoplados covalentemente a dichas PSM.

Tal como se muestra en el ejemplo 2 de la presente invención, las proteínas de fusión que comprenden una PSM y a péptido promueven la maduración de las células dendriticas y la presentación antigénica en un grado superior al observado con el péptido antigénico solo. Además, el ejemplo 3 de la invención muestra que la administración de los conjugados conduce a una respuesta citotóxica fuerte y de larga duración que no se observa tras la administración de una composición que comprende una mezcla no covalente de la PSM y el péptido antigénico. Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un conjugado que comprende

(i) una modulina soluble en fenol (PSM) o una variante funcionalmente equivalente de la misma y (ii) uno o más péptidos antigénicos en el que los componentes (i) y (ii) están acoplados covalentemente y en el que el conjugado promueve una respuesta citotóxica hacia el péptido o péptidos antigénicos.

A. La modulina soluble en fenol El primer componente de los conjugados de la invención corresponde a una modulina soluble en fenol o una variante f uncionalmente equivalente de la misma. Las expresiones "modulina soluble en fenol" y "PSM" se utilizan en el presente documento de manera indistinta y se refieren a cualquier miembro de la familia de los péptidos citotóxicos secretados por diferentes cepas de Staphylococcus, en particular Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis, y caracterizados por su capacidad para su reparto en la fase orgánica cuando se extraen con fenol caliente.

La PSM se identificó originalmente por Mehlin et al. (J. Exp. Med., 1999, 189: 907-917) como un complejo de polipéptido con actividad inflamatoria obtenido de la bacteria Staphylococcus epidermidis y se identificó posteriormente como que podía activar la ruta de señalización de TLR2. (Hajjar AM et al. , 2001, J Immunol, 166 : 15-19) . Aunque la bacteria Staphylococcus epidermidis es menos grave que otros estafilococos, la infección por esta bacteria también puede conducir a septicemia. La bacteria libera diferentes péptidos que, debido a su solubilidad en fenol, se conocen generalmente como modulina soluble en fenol (PSM) . La PSM tiene al menos cuatro componentes, PSMα, PSMβ, PSMδ y PSMγ, que son pequeñas proteínas con entre 22 y 54 aminoácidos. Se ha descrito que la PSM de S. epidermidis induce la producción de las citoquinas TNF-α, IL-lβ e IL-6 y activa al factor de transcripción NF-κβ en macrófagos (Liles WC et al., J. Leukoc. Biol . 70:96-102) . En la tabla 1 se muestran modulinas preferidas para su uso en los conjugados de la presente invención.

(T,

Tabla 1: Modulinas solubles en fenol

Lo más preferiblemente, la PSM utilizada en los conjugados de la invención incluyen las α-, γ- y δ-modulinas tal como se describe en SEQ ID NO: 1, 13 y 14, respectivamente.

La expresión "variante funcionalmente equivalente" de una PSM se refiere a compuestos que muestran sustancialmente la(s) misma (s) act i vi dad ( e s ) biológica (s) que PSM. Ensayos funcionalmente adecuados para determinar si un compuesto dado es una variante funcionalmente equivalente de la PSM son, por ejemplo el ensayo basado en la capacidad de PSM para activar LTR de VIH-I en células THP-I asi como la capacidad de PSM para promover la secreción de TNF-α por células THP-I, ambas descritas por Mehlin et al. (J. Exp . Med., 1999, 189:907-917), el ensayo basado en la capacidad de promover la activación de NF-kappaB en células que expresan TLR2 (ya sean células transíectadas transitoriamente con TLR2 o células que expresan TLR2 de manera constitutiva) tal como se describe por Hajjar et al. (Journal of Immunology, 2001, 166:15-19) .

Las moléculas relacionadas adecuadas como componente (i) de los conjugados de la presente invención también incluyen aquellas secuencias que son sustancialmente homologas a la PSM mencionada. La expresión "sustancialmente homólogo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente cuando su secuencia de nucleótidos tiene un grado de identidad con respecto a la secuencia de nucleótidos de la invención de al menos el 60%, ventajosamente de al menos el 70%, preferiblemente de al menos el 85% y más preferiblemente de al menos el 95%. Normalmente, puede aislarse una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos de la invención a partir de un microorganismo productor del polipéptido de la invención basándose en la información contenida en dicha secuencia de nucleótidos, o se construye basándose en la secuencia de ADN mostrada en SEQ ID NO: 1-14, por medio de la introducción de sustituciones conservativas o no conservativas, por ejemplo. Otros ejemplos de modificaciones posibles incluyen la inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la secuencia o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o dentro de la secuencia. El grado de identidad entre dos polinucleótido s se determina utilizando algoritmos informáticos y métodos que se conocen ampliamente por los expertos en la técnica. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente utilizando el algoritmo BLASTN [BLAST Manual, Altschul, S. , et al. , NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. , et al. , J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) ] .

En la tabla 2 se muestran péptidos adecuados que tienen una homología de secuencia sustancial correspondiente . Los homólogos de PSM preferidos utilizados en la presente invención incluyen las delta-lisinas y las delta-hemolisinas aisladas de Staphylococcus aureus.

En una realización preferida, el componente (i) de los conjugados de la invención es una PSM seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1 a 26.

K

Tabla II: Péptidos citotóxicos que muestran alto grado de similitud de secuencia con las PSM.

B . El/los péptido(s) antigénico (s)

El componente (ii) de los conjugados de la invención es uno o más péptidos antigénicos. La expresión "péptido antigénico", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende como un péptido que estimula el sistema inmunitario de un mamífero que tiene un tumor o enfermedades infecciosas para atacar el tumor e inhibe su crecimiento o destruye el patógeno que provoca la enfermedad. Por tanto, el antígeno utilizado en la invención corresponde a la enfermedad específica encontrada en el animal que está tratándose.

En general, el antígeno peptídico es heterólogo para la PSM; es decir, no es la propia proteína PSM ni un fragmento de la misma, aunque en ciertas circunstancias puede ser deseable utilizar una proteína de fusión que comprende dos copias de la misma PSM, por ejemplo con el fin de inducir una respuesta frente a la propia proteína PSM. El antígeno puede derivar del mismo organismo que la PSM. Cuando el antígeno procede de una especie que produce una PSM, puede ser deseable utilizar la PSM de esa especie, ya que cualquier respuesta inmunitaria que se genere frente a la propia PSM contribuirá a la protección proporcionada frente a ese organismo. Por ejemplo, cuando el antígeno es de S. aureus, la PSM (por ejemplo la alfa-modulina) también es preferiblemente de S. aureus.

Se apreciará que el antígeno o los antígenos puede (n) ser proteínas completas, dominios aislados de una proteína, fragmentos peptídicos de una proteína o proteínas de fusión poliepitópicas que comprenden múltiples epítopos (por ejemplo desde 5 hasta 100 epítopos diferentes) . El polipéptido puede incluir opcionalmente segmentos adicionales, por ejemplo, puede incluir al menos 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 90 o incluso 100 o más segmentos, siendo cada uno una parte de una proteína que se produce de manera natural de un agente patógeno y/o de un antígeno tumoral que se produce de manera natural que puede ser el mismo o diferente de la(s) proteína (s) de las que se deriva (n) los otros segmentos. Cada uno de estos segmentos puede tener al menos 8 aminoácidos de longitud, y cada uno contiene al menos un epítopo (preferiblemente dos o más) diferente de los epitopos de los otros segmentos. Al menos uno

(preferiblemente al menos dos o tres) de los segmentos en el polipéptido híbrido puede contener, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7 o incluso 10 o más epitopos, particularmente epitopos de unión a

MHC de clase I o de clase II. Dos, tres o más de los segmentos pueden ser contiguos en el polipéptido híbrido: es decir, están unidos extremo con extremo, sin espaciador entre ellos.

Alternativamente, dos segmentos adyacentes cualesquiera pueden estar unidos por un aminoácido espaciador o un péptido espaciador .

El antígeno puede ser, por ejemplo, pero no se limita a, un antígeno viral, un antígeno bacteriano, un antígeno fúngico, un antígeno de diferenciación, un antígeno tumoral, un antígeno embrionario, un antígeno de oncogenes y genes supresores de tumor mutados, un antígeno tumoral único que resulta de translocaciones cromosómicas y/o derivados de los mismos.

Antígenos virales Los antígenos virales que pueden provocar una respuesta inmunitaria frente al virus incluyen antígenos del VIH-I, (tales como tat, nef, gpl20 o gplβO, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev) , virus del herpes humanos, (tales como gH, gL gM gB gC gK gE o gD o derivados de los mismos) o proteína temprana inmediata tales como ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 de VHSl o VHS2, citomegalovirus, especialmente humano, (tales como gB o derivados de los mismos) , virus de Epstein Barr (tales como gp350 o derivados de los mismos) , virus de la varicela zóster (tales como gpl, II, 111 y IE63) , o de un virus de la hepatitis tales como virus de la hepatitis B (por ejemplo antígeno de superficie de la hepatitis B o antígeno de núcleo de la hepatitis) , virus de la hepatitis C (por ejemplo antígenos de núcleo, El, NS3 o NS5), de paramixovirus tales como virus respiratorio sincitial (tales como proteínas F y G o derivados de las mismas) , de virus parainfluenza, de virus de la rubéola (tales como proteínas El y E2), virus del sarampión, virus de las paperas, virus del papiloma humanos (por ejemplo HPV6, 11, 16, 18, eg LI, L2 , El, E2, E3, E4, E5, E6, E7) , flavivirus (por ejemplo virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis transmitido por garrapatas, virus de la encefalitis japonesa) o células infectadas con virus influenza, tales como proteínas HA, NP, NA o M, o combinaciones de las mismas) , antígenos de rotavirus (tales como VP7sc y otros componentes de rotavirus) , y similares (véase Fundamental Virology, segunda edición, eds . Fields, B. N. y Knipe, D. M. (Raven Press, Nueva York, 1991) para ejemplos adicionales de antígenos virales) .

En una forma preferida de realización, el péptido antigénico deriva del virus de la hepatitis C, en una forma de realización aún más preferida, el péptido deriva de la proteína NS3 del virus de la hepatitis C. En una forma de realización aún más preferida, el péptido antigénico corresponde a los aminoácidos 1073-1081 de NS3 limitado por HLA-A2 cuya secuencia es CVNGVCWTV (SEQ ID NO: 50) .

En una forma preferida de realización, el péptido antigénico deriva del virus del papilona humano, en una forma de realización aún más preferida, del virus del papiloma humano 16, en una forma de realización aún más preferida el péptido deriva de la proteína E7 del virus del papiloma humano y, en una forma de realización aún más preferida, dicho péptido tiene la secuencia RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 55) .

Antígenos bacterianos La invención contempla la utilización de antígenos bacterianos tales como antígenos de Neisseria spp, incluyendo N. gonorrhea y N. meningitidis (proteínas de unión a transíerrina, proteínas de unión a lactoferrina, PiIC y adhesinas) ; antígenos de S. pyogenes (tales como proteínas M o fragmentos de las mismas y proteasa C5A) ; antígenos de S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, incluyendo M catarrhalis , también conocido como Branhamella catarrhalis (tales como adhesinas e invasinas de alto y de bajo peso molecular) ; antígenos de Bordetella spp, incluyendo B. pertussis (por ejemplo Parapertussis y B. bronchi séptica (tal como pertactina, toxina de la tosferina o derivados de los mismos, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclasa, fimbrias) ; antigenos de Mycobacterium spp., incluyendo M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis , M. smegmatis; Legionella spp, incluyendo L. pneumophila; (por ejemplo ESAT6, antigeno 85A, -B o -C, MPT 44, MPT59, MPT45, HSPIO, HSP65, HSP70, HSP 75, HSP90, PPD de 19kDa [Rv3763], PPD de 38kDa [RvO934]) ; antigenos de Escherichia spp, incluyendo E. coli enterotóxica (por ejemplo factores de colonización, toxina termolábil o derivados de la misma, toxina termoestable o derivados de la misma) , antigenos de E. coli enterohemorrágica y E. coli enteropatógena (por ejemplo toxina similar a la toxina Shiga o derivados de la misma) ; antigenos de Vibrio spp, incluyendo V. cholera (por ejemplo toxina del cólera o derivados de la misma) ; antigenos de Shigel 1 a spp, incluyendo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii ; Yersinia spp, incluyendo Y. enterocolitica (por ejemplo una proteina Yop) ; antigenos de Y. pestis, Y. pseudotuberculosis ; Campylobacter spp, incluyendo C. jejuni (por ejemplo toxinas, adhesinas e invasinas) ; antigenos de Salmonella spp, incluyendo S. typhi , S. paratyphi , S. choleraesuis , S. enteritidis ; histeria spp., incluyendo L. monocytogenes ; Helicobacter spp, incluyendo H. pylori (por ejemplo ureasa, catalasa, toxina vacuolizante) ; antigenos de Pseudomonas spp, incluyendo P. aeruginosa ; Staphylococcus spp., incluyendo S. aureus, S. epidermidi s ; Enterococcus spp., incluyendo E. faecalis , E. faecium; Clostridium spp., incluyendo C. tetani

(por ejemplo toxina tetánica y derivado de la misma) ; antigenos de C. botulinum (por ejemplo toxina botulinica y derivado de la misma) , antigenos de C. difficile (por ejemplo toxinas del clostridium A o B y derivados de las mismas) ; antigenos de Bacillus spp., incluyendo B. anthracis (por ejemplo toxina del ántrax y derivados de la misma) ; Corynebacterium spp., incluyendo C. diphtheriae (por ejemplo toxina diftérica y derivados de la misma) ; antigenos de Borrelia spp . , incluyendo B. burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB) ; antigenos de B. garinii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB) , B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB) , antigenos de B. andersonfi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB) , antigenos de B. hermsii; Ehrlichia spp., incluyendo E. equi y el agente de la ehrlichiosis granulocitica humana; Rickettsia spp, incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluyendo C. trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina) ; antigenos de Chlamydia pneumoniae (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina) , antigenos de C. psittaci; Leptospira spp., incluyendo L. interrogans ; Treponema spp., incluyendo T. pallidum (por ejemplo las proteínas de la membrana exterior poco comunes) , antigenos de T. denticola , T. hyodysenteriae ; antigenos de Plasmodium spp., incluyendo P. falciparum; Toxoplasma spp. y T. gondii (por ejemplo SAG2 , SAGS, Tg34) ; antigenos de Entamoeba spp., incluyendo E. histolytica ; Babesia spp. , incluyendo B. microti ; Trypanosoma spp., incluyendo T. cruzi; Giardia spp., incluyendo G. lamblia; leishmania spp., incluyendo L. major; Pneumocystis spp. , incluyendo P. carinii; Trichomonas spp., incluyendo T. vaginalis; Schisostoma spp., incluyendo S. mansoni, o derivados de levaduras tales como Candida spp., incluyendo C. albicans ; Cryptococcus spp., incluyendo C. neoformans; antigenos de M. tuberculosis (tales como Rv2557, Rv2558, RPFs: RvO837c, Rvl884c, Rv2389c, Rv2450, Rvl009, aceA (RvO467) , PstSl, (RvO932) , SodA (Rv3846) , Rv2031c de 16 kDal, Tb Ral2, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 y hTCCl) ; antigenos de Chlamydia (tales como la proteina de alto peso molecular (HWMP) , ORF3 (documento EP 366 412) y posibles proteínas de membrana (Pmp) ; antigenos de Streptococcus spp, incluyendo S. pneumoniae (PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de unión a colina, el antigeno proteico neumolisina, y derivados detoxif icados mutantes de los mismos) ; antigenos derivados de Haemophilus spp. , incluyendo H. influenzae tipo B (por ejemplo PRP y conjugados del mismo) ; antigenos de H. influenzae no clasificable (tales como OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y peptidos derivados de fimbrina, o variantes de múltiples copias o las proteínas de fusión de las mismas); antígenos derivados de Plasmodium falciparum (tales como RTS. S, TRAP, MSPl, AMAl, MSP3, EBA, GLURP, RAPl, RAP2, secuestrina, PfEMPl, Pf332, LSAl, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfslβ, Pfs48/45, Pfs230 y sus análogos en Plasmodium spp.)

Antígenos fúngicos

Los antígenos fúngicos para su utilización con los conjugados y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, componentes de antígeno fúngico de Candida; antígenos fúngicos de Histoplasma tales como proteína de choque térmico 60 (HSP60) y otros componentes de antígeno fúngico de Histoplasma; antígenos fúngicos de criptococos tales como polisacáridos capsulares y otros componentes de antígeno fúngico de criptococos; antígenos fúngicos de coccidios tales como antígenos de esférula y otros componentes de antígeno fúngico de coccidios; y antígenos fúngicos de Tinea tales como tricofitina y otros componentes de antígeno fúngico de coccidios .

Antígenos de protozoos y otros parásitos Los antígenos de protozoos incluyen, pero no se limitan a, antígenos de Plasmodium falciparum tales como antígenos de superficie de merozoitos , antígenos de superficie de esporozoitos, antígenos de circumsporozoitos, antígenos de superficie de gametocitos/gametos, antígeno de estadio en sangre pf, 55/RESA y otros componentes de antígenos de plasmoides; antígenos de Toxoplasma tales como SAG-I, p30 y otros componentes de antígeno de Toxoplasma; antígenos de esquistosoma tales como glut at i ón-S-t r ans f er asa , paramiosina y otros componentes de antígeno de esquistosoma; el antígeno de Leishmannia y otros antígenos de Leishmania tales como gp63, lipofosf oglicano y su proteína asociada y otros componentes de antígeno de Leishmania; y antígenos de Trypanosoma cruzi tales como el antígeno de 75-77 kDa, el antígeno de 56 kDa y otros componentes de antígeno de Trypanosoma.

Alérgenos y antígenos medioambientales

El antígeno puede ser un alérgeno o antígeno medioambiental, tal como, pero sin limitarse a, un antígeno derivado de alérgenos que se producen de manera natural tales como alérgenos del polen (alérgenos del polen de árboles, hierba, maleza y césped) , alérgenos de insectos (alérgenos inhalables, de la saliva y del veneno) , alérgenos de la caspa y el pelo de animales, y alérgenos de la comida. Alérgenos del polen importantes de árboles, césped y hierbas se originan a partir de órdenes taxonómicos de Fágales , Oléales , Pinoles y Platanaceae incluyendo entre otros abedul (Betula) , aliso (Alnus) , avellano (Corylus) , carpe (Carpinus) y olivo (Olea), cedro (Cryptomeriaand Juniperus) , plátano (Platanus) , el orden de Poales incluyendo entre otros céspedes de los géneros Lolium, Phleum, Poa , Cynodon , Dactylis , Holcus, Phalaris , Sécale y Sorghum, los órdenes de Asterales y Urticales incluyendo entre otros hierbas de los géneros Ambrosia , Artemisia y Parietaria . Otros antígenos alergénicos que pueden utilizarse incluyen alérgenos de ácaros del polvo doméstico de los géneros Dermatophagoides y Euroglyphus, ácaros de almacenamiento por ejemplo Lepidoglyphys , Glycyphagus y Tyrophagus, los de cucarachas, mosquillas y pulgas por ejemplo Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, los de mamíferos tales como gato, perro y caballo, pájaros, alérgenos de veneno incluyendo los que se originan de picaduras o mordeduras de insectos tales como los del orden taxonómico de Hymenoptera incluyendo abejas (superfamilia Apidae) , avispas y hormigas (superfamilia Formicoidae) . Todavía otros antígenos alergénicos que pueden utilizarse incluyen alérgenos por inhalación de hongos tales como de los géneros Alternarla y Cladosporium.

Antígenos tumorales Los ejemplos de antígenos tumorales incluyen MAGE, MART- 1/Melan-A, gplOO, dipeptidil peptidasa IV (DPPIV) , proteína de unión a adenosina desaminasa (ADAbp) , ciclofilina b, antígeno asociado colorrectal ( C R C ) -0017-1 A / G A 733 , antígeno carcinoembrionario (CEA) y sus epítopos antigénicos CAP-I y CAP- 2, etvβ, amll, antígeno específico de la próstata (PSA) y sus epítopos antigénicos PSA-I, PSA-2, y PSA-3, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) , receptor de células T/cadena CD3-ς, familia MAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, MAGE- Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4 , MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7 , MAGE- A8, MAGE-A9, MAGE-AlO, MAGE-AIl, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3) , MAGE-Xp4 (MAGE-B4) , MAGE-Cl, MAGE-C2, MAGE- C3, MAGE-C4, MAGE-C5) , familia GAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, GAGE-I, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9) , BAGE, RAGE, LAGE-I, NAG, GnT-V, MUM-I, CDK4 , tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21ras, RCASl, α- fetoproteína, E-cadherina, α-catenina, 13-catenina, γ-catenina, pl2Octn, gpl00^Pmel117, PRAME, NY-ESO-I, cdc27, proteína de poliposis adenomatosa del colon (APC) , fodrina, Conexina 37, idiotipo Ig, pl5, gp75, gangliósidos GM2 y GD2, productos virales tales como proteínas del virus del papiloma humano, familia Smad de antígenos tumorales, lmp-1, PlA, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-I, glucógeno fosforilasa del cerebro, SSX-I, SSX-2 (HOM-MEL-40) , SSX-3, SSX-4, SSX-5, SCP-I y CT-7 , y c-erbB-2, leucemia linfoblástica aguda (etvβ, amll, ciclofilina b) , linfoma de células B (idiotipo Ig) , glioma (E- cadherina, a-catenina, 13-catenina, 7-catenina, pl20ctn) , cáncer de vejiga (p21ras) , cáncer biliar (p21ras) , cáncer de mama (familia MUC, HER2/neu, c-erbB-2), carcinoma de cuello uterino (p53, p21ras), carcinoma de colon (p21ras, HER2/neu, c-erbB-2, familia MUC) , cáncer colorrectal (antígeno asociado colorrectal (CRC) -0017-1A/GA733, APC) , cor io car ci noma (CEA) , cáncer de células epiteliales (ciclofilina b) , cáncer gástrico (HER2/neu, c-erbB-2, glucoproteína ga733), cáncer hepatocelular, linfoma de Hodgkins (lmp-1, EBNA-I), cáncer de pulmón (CEA, MAGE-3, NY-ESO- 1) , leucemia derivada de células linfoides (ciclofilina b) , melanoma (proteina pl5, gp75, antigeno oncofetal, gangliósidos

GM2 y GD2, Melan-A/MART-1 , cdc27, MAGE-3, p21ras, gpl00^Pmel117) , mieloma (familia MUC, p21ras) , carcinoma de pulmón de células no pequeñas (HER2/neu, c-erbB-2), cáncer nasofaringeo (lmp-1, EBNA-

1) , cáncer de ovarios (familia MUC, HER2/neu, c-erbB-2) , cáncer de próstata (antigeno especifico de la próstata (PSA) y sus epitopos antigénicos PSA-I, PSA-2 y PSA-3, PSMA, HER2/neu, c- erbB-2, glucoproteina ga733) , cáncer renal (HER2/neu, c-erbB-2), cánceres de células escamosas del cuello uterino y del esófago

(productos virales tales como proteínas del virus del papiloma humano) , cáncer de testículos (NY-ESO-I) y leucemia de células T

(epitopos del VLTH-I) .

El ligador que conecta los componentes (i) y (ii)

Los conjugados de la invención pueden comprender un ligador que conecta el primer y el segundo componente. Según la invención, dicha secuencia de aminoácidos intermedia no natural actúa como región de bisagra entre dominios, permitiéndolos moverse independientemente entre si al tiempo que conservan la forma tridimensional de los dominios individuales. En este sentido, una secuencia de aminoácidos intermedia no natural preferida según la invención será una región de bisagra caracterizada por una ductilidad estructural que permite este movimiento. Los ligadores a modo de ejemplo no limitativos que pueden utilizarse para conectar componentes (i) y (ii) de la invención incluyen un ligador flexible no natural. En una realización preferida, dicho ligador flexible es un péptido ligador flexible con una longitud de 20 aminoácidos o menos. En una realización más preferida, el péptido ligador comprende 2 aminoácidos o más seleccionados del grupo que consiste en glicina, serina, alanina y treonina. En una realización preferida de la invención, dicho ligador flexible es un ligador de poliglicina. Los ejemplos posibles de secuencias de ligador/espaciador incluyen SGGTSGSTSGTGST (SEQ ID NO: 27), AGSSTGSSTGPGSTT (SEQ ID NO: 28) o GGSGGAP (SEQ ID NO: 29) . Estas secuencias se han utilizado para unir hélices espirales diseñadas a otros dominios de proteina (Muller, K. M., Arndt, K. M. y Alber, T. , Meth . Enzymology, 2000, 328: 261-281) . Preferiblemente, dicho ligador comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos GGGVEGGG (SEQ ID NO: 30) .

El efecto de la región de ligador es proporcionar un espacio entre el componente (i) y el componente (ii) de manera que la estructura secundaria del componente (i) no se ve afectada por la presencia del componente (ii) y viceversa. El espaciador tiene preferiblemente una naturaleza peptidica. El péptido ligador comprende preferiblemente al menos dos aminoácidos, al menos tres aminoácidos, al menos cinco aminoácidos, al menos diez aminoácidos, al menos 15 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 30 aminoácidos, al menos 40 aminoácidos, al menos 50 aminoácidos, al menos 60 aminoácidos, al menos 70 aminoácidos, al menos 80 aminoácidos, al menos 90 aminoácidos o aproximadamente 100 aminoácidos.

El ligador puede estar unido a componentes que flanquean los dos componentes de los conjugados de la invención por medio de enlaces covalentes y preferiblemente el espaciador es esencialmente no inmunogénico y/o no comprende ningún residuo de cisteina. De una manera similar, la estructura tridimensional del espaciador es preferiblemente lineal o sustancialmente lineal . Los ejemplos preferidos de péptidos espaciadores o ligadores incluyen los que se han utilizado para unir proteínas sin deteriorar sustancialmente la función de las proteínas unidas o al menos sin deteriorar sustancialmente la función de una de las proteínas unidas . Más preferiblemente, los espaciadores o ligadores se han utilizado para unir proteínas que comprenden estructuras con hélices espirales.

El ligador puede incluir los residuos 53-56 de tetranectina, que forman una lámina β en tetranectina, y los residuos 57-59 que forman un giro en la tetranectina (Nielsen, B. B. et al., FEBS Lett. 412: 388-396, 1997) . La secuencia del segmento es GTKVHMK (SEQ ID NO: 31) . Este ligador tiene la ventaja de que cuando está presente en la tetranectina nativa, une el dominio de trimerización con el dominio de CRD, y por tanto es adecuado para conectar el dominio de trimerización con otro dominio en general . Además, no se espera que la construcción resultante sea más inmunógena que la construcción sin ligador.

Alternativamente, puede seleccionarse como ligador una subsecuencia de la hebra 3 de conexión de la fibronectina humana, correspondiente a los aminoácidos 1992-2102 (número de SWISSPROT, entrada P02751) . Preferiblemente se utiliza la subsecuencia PGTSGQQPSVGQQ (SEQ ID NO: 32) correspondiente a los aminoácidos números 2037-2049, y dentro de esa subsecuencia el fragmento GTSGQ (SEQ ID NO: 33) correspondiente a los aminoácidos 2038-2042 es más preferible. Esta construcción tiene la ventaja de que no es muy propensa a la corte proteolitica y no es muy inmunógena porque la fibronectina está presente en altas concentraciones en el plasma.

Alternativamente, un péptido ligador adecuado puede basarse en la secuencia de 10 residuos de aminoácido de la región de bisagra superior de la IgG3 murina. Este péptido (PKPSTPPGSS, SEQ ID NO: 34) se ha utilizado para producir anticuepos dimerizados por medio de una hélice espiral (Pack P. y Pluckthun, A., 1992, Biochemistry 31:1579-1584) y puede ser útil como péptido espaciador según la presente invención. Una secuencia correspondiente de la región de bisagra superior de la

IgG3 humana puede ser incluso más preferible. No se espera que las secuencias de IgG3 humana sean inmunógenas en seres humanos.

En una realización preferida, el péptido adaptador se selecciona del grupo del péptido de secuencia APAETKAEPMT (SEQ ID NO: 35) y del péptido de secuencia GAP.

Alternativamente, los dos componentes de los conjugados de la invención pueden conectarse mediante un péptido cuya secuencia contiene una diana de corte para una proteasa, permitiendo asi la separación del componente (i) del componente (ii) . Los sitios de corte por proteasa adecuados para su incorporación en los polipéptidos de la invención incluyen enteroquinasa (sitio de corte DDDDK, SEQ ID NO: 36) , factor Xa

(sitio de corte IEDGR, SEQ ID NO: 37) , trombina (sitio de corte

LVPRGS, SEQ ID NO: 38) , proteasa de VGT (sitio de corte ENLYFQG,

SEQ ID NO: 39) , proteasa PreScission (sitio de corte LEVLFQGP, SEQ ID NO: 40) , inteinas y similares. En una realización preferida, el sitio de corte es un sitio de corte por proteasa expresado en tejidos tumorales, en tejidos inflamados o en el hígado de modo que la separación de Apo A y del componente (ii) tiene lugar una vez que el conjugado ha alcanzado el hígado. En una realización preferida, el ligador contiene un sitio de reconocimiento de la metaloproteasa-9 de la matriz (sitio de corte LFPTS, SEQ ID NO: 41) .

La invención también contempla conjugados en los que el componente (ii) comprende más de un antígeno o epítopo. En este caso, el antígeno o los epítopos pueden ser iguales o diferentes. En el caso de que los péptidos antigénicos estén acoplados a la PSM, entonces pueden acoplarse diferentes péptidos en diferentes sitios de la PSM. Alternativamente, los péptidos antigénicos pueden estar formando una única cadena polipeptídica que puede acoplarse a un único sitio en la PSM.

En una realización preferida, los conjugados de la invención pueden por una única cadena polipeptídica en la que el extremo C-terminal del componente (ii) es un único péptido antigénico que forma una única cadena polipeptídica con el componente (i) . En una realización todavía más preferida, el conjugado según la invención es una única cadena polipeptídica en la que el extremo C-terminal del componente (ii) está acoplado al extremo N-terminal del componente (i) o en la que el extremo N-terminal del componente (ii) está acoplado al extremo C-terminal del componente (i) .

En una realización preferida, los conjugados de la invención no son un péptido seleccionado del grupo de: LMSCLILRIFILIKEGVISMAQDIISTIGDLVKWIIDTVNKFTKK (SEQ ID NO: 42) y MAQDIISTIGDLVKWIIDTVNKFTKKKKKKKKKKKK (SEQ ID NO: 43)

C . El efecto citotóxico de los conjugados de la invención Los conjugados de la invención pueden inducir una respuesta de células T citotóxicas (CTL) que tiene especificidad por células que expresan sobre su superficie antigenos peptidicos que se presentan en asociación con proteínas codificadas por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) . Los CTL inducen y promueven la destrucción intracelular de microbios intracelulares, o la lisis de células infectadas con tales microbios o que expresan antigenos tumorales sobre la superficie . Para determinar si se obtiene una respuesta de CTL en un animal que está tratándose según esta invención, se mide el nivel de células CD8+ (es decir, CTL) presentes en la sangre o en los órganos linfáticos tales como el bazo o los ganglios linfáticos. Esta determinación se realiza midiendo en primer lugar el nivel de células CD8+ antes de realizar el método de esta invención y midiendo el nivel durante el tratamiento, por ejemplo a los 7, 10, 20, 40 dias, etc. El nivel o la fuerza de la respuesta de CD8+ (CTL) pueden evaluarse in vivo o in vitro.

En seres humanos, hasta ahora sólo existe una prueba in vivo para medir respuestas de células T CD8+, que es una prueba cutánea. En esta prueba cutánea, se inyectan por via intradérmica péptidos de unión a HLA de clase I. Si está presente una respuesta de CTL, estas células reconocerán y atacarán a las células dérmicas pulsadas con el péptido, provocando una reacción inflamatoria local o bien mediante la liberación de citoquinas o bien mediante el mecanismo citotóxico. Esta reacción inflamatoria puede cuantificarse midiendo el diámetro del exantema cutáneo local y/o midiendo el diámetro del infiltrado (es decir, la reacción de hinchazón) . Como alternativa a la inyección de péptido libre soluble, también puede inyectarse por via intradérmica el péptido de unión a HLA de clase I en forma unida, por ejemplo, unido a células dendriticas derivadas de manera extracorpórea . En otros mamíferos, existen pruebas in vivo adicionales, aunque experimentales, para evaluar respuestas de células T CD8+. Por ejemplo, en un modelo de ratón, pueden medirse respuestas de células T CD8+ mediante infección por desafio con un virus vaccinia recombinante que expresa el péptido utilizado para la inmunización. Puede cuantificarse el nivel de inmunidad hasta la reinfección como el factor de reducción del titulo de virus vaccinia recuperado de los órganos del ratón tras la infección por exposición.

También puede cuantif icarse el nivel de respuestas de células T CD8+ in vitro, estimando el número de células T CD8+ especificas para el péptido antigénico en cuestión. En un mamífero no tratado previamente, la denominada "frecuencia", es decir, el número de células T CD8+ especificas dividido entre el número de glóbulos blancos no específicos, es inferior a 10^~6. Tras una inmunización satisfactoria, la frecuencia aumenta debido a la proliferación de células T especificas. Durante una infección viral aguda, por ejemplo, la frecuencia de células T CD8+ especificas puede elevarse hasta 10^~2. Entonces, tras la eliminación del virus, la frecuencia de células T CD8+ especificas desciende habitualmente hasta un nivel de "memoria" de aproximadamente 10^~4. Asi, puede cuantificarse la respuesta de células T CD8+ midiendo la frecuencia de células T CD8+ especificas. Cuanto mayor sea la frecuencia, más fuerte será la respuesta. Los ensayos clásicos utilizados para medir la frecuencia de células T CD8+ especificas se basan en técnicas de cultivo de células en dilución limitante, tal como se describe en detalle por Kundig, T. M. et al. (Proc .Nati .Acad. Sci . USA. , 1996, 93:9716-9723) . Un enfoque novedoso para estimar la frecuencia de células T CD8+ especificas es construir moléculas MHC de clase I (para su utilización en ratones) o HLA (para su utilización en seres humanos) solubles con un péptido unido en su hendidura, de modo que los receptores de células T específicos se unirán a estos complejos. Estos complejos pueden marcarse para su detección, por ejemplo, con una sustancia fluorescente, permitiendo la detección por citometria de flujo. Otro enfoque para cuantificar el nivel de actividad de CTL in vivo es el ensayo de in vivo killing, que se ha descrito en las figuras 3, 4 y 9 de la presente invención de patente. II. MÉTODOS PARA OBTENER LOS CONJUGADOS DE LA INVENCIÓN

Los conjugados de la invención pueden obtenerse utilizando cualquier método conocido por un experto en la materia. Asi, es posible obtener el polipéptido de PSM o la variante de dicha proteina mediante cualquier método convencional. Por ejemplo, la proteina PSM puede purificarse mediante extracción con fenol de sobrenadantes de S. ep idermidis estacionaria tal como se describe por Mehlin et al. (J.Exp.Med. , 1999, 189:907) . Alternativamente, la proteina PSM puede obtenerse a partir de ADNc por medio de su expresión en un microorganismo heterólogo tal como, por ejemplo, E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris, células de insecto utilizando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en Otto, M. et al (J Infect Dis. 2004, 190:748-55) .

Una vez que hay una cantidad suficiente de proteina PSM purificada, debe conjugarse con el compuesto antigénico de interés. La conjugación del componente terapéuticamente activo

(ii) con la PSM puede llevarse a cabo de diferentes formas. Una posibilidad es la conjugación directa de un grupo funcional con el componente terapéuticamente activo en una posición que no interfiera con la actividad de dicho componente. Tal como se entiende en la presente invención, los grupos funcionales se refieren a un grupo de átomos específicos en una molécula que son responsables de una reacción química característica de dicha molécula. Los ejemplos de grupos funcionales incluyen, pero no se limitan a grupos hidroxilo, aldehido, alquilo, alquenilo, alquinilo, amida, carboxamida, aminas primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias, aminoxilo, azida, azo (diimida) , bencilo, carbonato, éster, éter, glioxililo, haloalquilo, haloformilo, imina, imida, cetona, maleimida, isocianida, isocianato, carbonilo, nitrato, nitrito, nitro, nitroso, peróxido, fenilo, fosfina, fosfato, fosfono, piridilo, sulfuro, sulfonilo, sulfinilo, tioéster, tiol y 3, 4-dihidroxifenilalanina (DOPA) oxidada. Ejemplos de dichos grupos son grupos maleimida o glioxililo que reaccionan específicamente con grupos tiol en la molécula de PSM y grupos 3, 4-dihidroxifenilalanina (DOPA) oxidada que reaccionan con grupos amina primaria en la molécula de PSM.

Otra posibilidad es conj ugar el componente terapéuticamente activo (ii) con la molécula de PSM por medio de la utilización de grupos homo o heterobifuncionales . El grupo bifuncional puede conjugarse en primer lugar con el compuestos terapéuticamente activo y, entonces, conjugarse con el péptido de PSM o, alternativamente, es posible conjugar el grupo bifuncional con la proteina PSM y entonces conjugarlo con el componente (ii) . Los ejemplos ilustrativos de estos tipos de conjugados incluyen los conjugados conocidos como cetona-oxima (descritos en el documento US20050255042 ) en los que el primer componente del conjugado comprende un grupo aminoxilo que está unido a un grupo cetona presente en un grupo heterobifuncional que a su vez está unido a un grupo amino en el segundo componente del conjugado.

En otras realizaciones, el agente que se utiliza para conjugar los componentes (i) y (ii) de los conjugados de la invención puede tratarse fotolitica, química, térmica o enzimáticamente . Es particularmente interesante utilizar agentes de unión que pueden hidrolizarse mediante enzimas que están en la diana celular, de modo que el compuesto terapéuticamente activo sólo se libera dentro de la célula. Se han descrito ejemplos de estos tipos de agentes de unión que pueden tratarse intracelularmente en los documentos WO04054622, WO06107617, WO07046893 y WO07112193.

En una realización preferida, el componente (ii) del conjugado de la invención es un compuesto de naturaleza peptídica, incluyendo tanto oligopéptidos como péptidos. Un experto en la materia conoce ampliamente métodos para modificar químicamente una cadena polipeptídica e incluyen métodos basados en la conjugación a través de grupos tiol presentes en los residuos de cisteína, métodos basados en la conjugación a través de los grupos amino primario presentes en residuos de usina (documento US6809186) , métodos basados en la conjugación a través de los extremos N y C-terminales . Los reactivos adecuados para modificar polipéptidos para permitir su acoplamiento con otros compuestos incluyen: glutaral dehido (permite unir compuestos al extremo N-terminal de los polipéptidos) , carbodiimida (permite unir el compuesto al extremo C-terminal de un polipéptido) , esteres de succinimida (por ejemplo, MBS, SMCC) que permiten activar el extremo N-terminal y restos cisteina, bencidina (BDB) , que permite activar restos tirosina, peryodato, que permite activar restos carbohidrato en las proteínas que están glicosiladas .

En el caso particular en el que el componente PSM y el péptido antigénico formen una única cadena peptídica, es posible expresar el conjugado en una única etapa utilizando una construcción génica de la invención que codifica dicho conjugado, para lo que dicho construcción se introduce en un vector adecuado para su expresión en un organismo heterólogo junto con elementos de control de la transcripción y, opcionalmente, de la traducción. Los elementos de control de la transcripción y, opcionalmente, de la traducción presentes en el cásete de expresión de la invención incluyen promotores, que dirigen la transcripción de la secuencia de nucleótidos a la que están operativamente unidos y otras secuencias que son necesarias o adecuadas para la transcripción y su regulación adecuada en el tiempo y lugar, por ejemplo, señales de iniciación y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, potenciadores transcripcionales, silenciadores transcripcionales, etc. Dichos elementos, así como los vectores utilizados para construir los casetes de expresión y los vectores recombinantes según la invención se eligen generalmente según las células huésped que van a utilizarse.

III. POLINUCLEÓTIDOS , CONSTRUCCIONES GENICAS , VECTORES Y CÉLULAS HUÉSPED DE LA INVENCIÓN. E n o t ro aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención. Un experto en la materia entenderá que los polinucleótidos de la invención codificarán solamente los conjugados en los que el componente (ii) tiene una naturaleza peptidica y que forma una única cadena peptidica con el componente (i) , independientemente de la orientación relativa y del hecho de que ambos componentes estén conectados directamente o separados por una región espadadora.

En otro aspecto, la invención se refiere a una construcción génica que comprende un pol inucleótido de la invención. La construcción comprende preferiblemente el polinucleótido de la invención ubicado bajo el control operativo de secuencias que regulan la expresión del polinucleótido de la invención. Un experto en la materia entenderá que los polinucleótidos de la invención deben acceder al núcleo de un tejido diana y transcribirse y traducirse en el mismo para dar lugar a la proteina de fusión biológicamente activa.

En principio, puede utilizarse cualquier promotor para las construcciones génicas de la presente invención siempre que dicho promotor sea compatible con las células en las que ha de expresarse el polinucleótido. Por tanto, los promotores adecuados para la realización de la presente invención incluyen, sin limitarse necesariamente a, promotores constitutivos tales como los derivados de los genomas de virus eucariotas tales como poliomavirus , adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de la hepatitis B, el promotor del gen de la metalotioneina , el promotor del gen de timidina quinasa del virus herpes simple, regiones LTR de retrovirus, el promotor del gen de inmunoglobulinas , el promotor del gen de la actina, el promotor del gen de EF-lalfa asi como promotores inducibles en los que la expresión de la proteina depende de la adición de una molécula o una señal exógena, tal como el sistema de tetraciclina, el sistema NFκB/luz UV, el sistema Cre/Lox y el promotor de genes de choque térmico, los promotores regulables de la ARN polimerasa II descritos en el documento WO/2006/135436 asi como promotores específicos de tejido. En una realización preferida, las construcciones génicas de la invención contienen las regiones de potenciación de la expresión presentes en regiones de promotor de genes de expresión predominantemente hepática tales como genes de albúmina sérica humana, genes de protrombina, los genes de al f a-1-microglobulina o genes de aldolasa, o bien en una única copia en forma de varias copias de la misma y o bien en una forma aislada o en combinación con otros elementos de expresión específicos del hígado tales como promotores de citomegalovirus, alfa-1-antitripsina o albúmina. Preferiblemente, el promotor utilizado para expresar los polinucleótidos de la invención son promotores funcionales en células dendríticas tales como el promotor del gen de fascina tal como se describe por Bros et al. (J. Immunol . , 2003, 171:1825-1834) , los promotores de los genes de DC-CKl, DC-STAMP y DC-SIGN, el promotor de dectina-2 descrito en Morita et al., (Gene Ther., 2001, 8:1729-37) , el promotor del gen de CDlIc tal como se describe en (Masood, R., et al. 2001. Int J Mol Med 8:335-343 y Somia, N. V., et al. 1995. Proc Acad Sci USA 92:7570-7574) .

Otros ejemplos de promotores que son específicos de tejido incluyen el promotor del gen de la albúmina (Miyatake et al., 1997, J. Virol, 71:5124-32) , el promotor del núcleo del virus de la hepatitis (Sandig et al, 1996, Gene Ther., 3:1002-9); el promotor del gen de la alfa-fetoproteína (Arbuthnot et al., 1996, Hum. GeneTher . , 7:1503-14) , y el promotor de la proteína de unión a globulina que se une a tiroxina (Wang, L., et al., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:11563-11566) .

Los polinucleótidos de la invención o los construcciones génicas que los forman pueden formar parte de un vector. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende un polinucleótido o una construcción génica de la invención. Un experto en la materia entenderá que no existe ninguna limitación en relación con el tipo de vector que puede utilizarse debido a que dicho vector puede ser un vector de clonaje adecuado para la propagación y para obtener los polinucleótidos o construcciones génicas o vectores de expresión adecuados en diferentes organismos heterólogos adecuados para purificar los conjugados. Por tanto, los vectores adecuados según la presente invención incluyen vectores de expresión en procariotas tales como pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl , RP4, fagos y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28, vectores de expresión en levaduras tales como vectores del tipo de plásmidos de 2 mieras, plásmidos de integración, vectores YEP, plásmidos centroméricos y similares, vectores de expresión en células de insecto tales como los vectores de la serie pAC y la serie pVL, vectores de expresión en plantas tales como vectores de expresión en plantas tales como vectores de la serie pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y similares y vectores de expresión en células eucariotas superiores basados en vectores virales (adenovirus, virus asociados a adenovirus asi como retrovirus y lentivirus) asi como vectores no virales tales como pSilencer 4.1 -CMV (Ambion) , pcADN3, pcADN3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL y pKSV-10, pBPV-1, pML2d y pTDTl. El vector de la invención puede utilizarse para transformar, transfectar o infectar células que pueden transformarse, transfectarse o infectarse mediante dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. A modo de ejemplo, el vector en el que se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que se ha integrado. Dicho vector puede obtenerse mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica (Sambrok et al., 2001, mencionado anteriormente) .

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una célula que comprende un polinucleótido, una construcción génica o un vector de la invención, para el que dicha célula ha podido transformarse, transfectarse o infectarse con una construcción o vector proporcionados por esta invención. Las células transformadas, transfectadas o infectadas pueden obtenerse mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica (Sambrok et al., 2001, mencionado anteriormente) . En una realización particular, dicha célula huésped es una célula animal transfectada o infectada con un vector adecuado. Las células huésped adecuadas para la expresión de los conjugados de la invención incluyen, sin limitarse a, células de mamífero, vegetales, de insecto, fúngicas y bacterianas. Las células bacterianas incluyen, sin limitarse a, células bacterianas Gram-pos i t ivas tales como especies del género Bacillus , Streptomyces y Staphylococcus y células bacterianas Gram-negativas tales como células del género Escherichia y Pseudomonas . Las células fúngicas incluyen preferiblemente células de levaduras tales como Saccharomyces, Pichia pastoris y Hansenula polimorpha. Las células de insecto incluyen, sin limitarse a, células de Drosophila y células Sf9. Las células vegetales incluyen, entre otras, células de plantas de cultivo tales como cereales, plantas medicinales, ornamentales y bulbosas. Las células de mamífero adecuadas en la presente invención incluyen líneas celulares epiteliales (porcino, etc.) , líneas celulares de osteosarcoma (ser humano, etc.), líneas celulares de neuroblastoma (ser humano, etc. ) , carcinomas epiteliales (ser humano, etc.) , células guales (murino, etc.) , líneas celulares hepáticas (de mono, etc.) , células CHO (ovario de hámster chino) , células COS, células BHK, células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 o PER.C6, células ECC humanas NTERA-2, células D3 de la línea mESC, células madre embrionarias humanas tales como células HS293 y BGVOl, SHEFl, SHEF2 y HS181, células NIH3T3, 293T, REH y MCF-7 y células hMSC .

IV. PREPARACIONES FARMACÉUTICAS DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han observado que los conjugados de la invención pueden provocar una respuesta de CTL hacia el antígeno que forma parte del conjugado, permitiendo así la utilización de dichos conjugados para el tratamiento de enfermedades en las que se requiere una respuesta inmunitaria hacia el antígeno. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una preparación farmacéutica o una vacuna que comprende un conjugado de la invención, un polinucleótido o construcción génica de la invención, un vector de la invención, o una célula huésped de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo que no produce una reacción alérgica u otro efecto adverso en sujetos a los que se administra. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH y/o adyuvantes que potencian la eficiencia de la vacuna. Los ejemplos de adyuvantes que pueden ser eficientes incluyen pero no se limitan a: hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil- nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, MTP-PE y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno al 2%/Tween 80. Otros ej emplos de adyuvantes incluyen DDA (bromuro de dimetildioctadecilamonio) , adyuvantes completo e incompleto de Freund y QuilA. Además, pueden utilizarse sustancias inmunomoduladoras tales como linfoquinas (por ejemplo, IFN- GAMMA, IL-2 e IL- 12) o inductores de IFN-gamma sintéticos tales como poli I:C en combinación con adyuvantes descritos en el presente documento. Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de la invención, un polinucleótido o construcción génica de la invención, un vector de la invención, una célula huésped o una composición farmacéutica o una vacuna de la invención para su utilización en medicina. Los conjugados pueden utilizarse solos o pueden administrarse en combinación con otros antígenos o con otros compuestos tales como citoquinas que se conoce que potencian la inmunoestimulación de las respuestas de CTL, tales como, GM-CSF, IL-I 2, IL-2, TNF, IFN, IL-18, IL-3, IL-4, IL-8, IL-9, IL-13, IL- 10, IL-14, IL-15, G-SCF, IFN alfa, IFN beta, IFN gamma, TGFα, TGFβ y similares. Las citoquinas se conocen en el estado de la técnica y están fácilmente disponibles en la bibliografía o comercialmente .

En otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado de la invención, a un polinucleótido o construcción génica de la invención, a un vector de la invención, a una célula huésped de la invención o a una composición farmacéutica o una vacuna según la invención para su utilización en un método para provocar una respuesta citotóxica hacia el péptido antigénico. Además, la invención se refiere a un método para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto que necesita dicha respuesta que comprende la administración a dicho sujeto de un conjugado de la invención, a un polinucleótido o construcción génica de la invención, a un vector de la invención, a una célula huésped de la invención o a una composición farmacéutica o una vacuna según la invención.

Se apreciará que los conjugados, po 1 i nucí eó t i do s , construcciones génicas, vectores, células huésped y composiciones farmacéuticas de la invención pueden utilizarse para el tratamiento de cualquier enfermedad para la que se ha identificado un péptido antigénico que conduce a la generación de una respuesta de CTL. Por tanto, los compuestos de la presente invención son adecuados para el tratamiento de enfermedades virales tales como enfermedades que resultan de infección por un adenovirus, un herpesvirus (por ejemplo VHS-I, VHS-II, CMV o VZV) , un poxvirus (por ejemplo, un ortopoxvirus tal como viruela o vaccinia, o molluscum contagiosum) , un picornavirus (por ejemplo rinovirus o enterovirus) , un ortomixovirus (por ejemplo virus influenza) , a pramoixovirus

(por ejemplo virus parainf luenza, virus de las paperas, virus del sarampión y virus respiratorio sincitial), un coronavirus (por ejemplo SARS), un papovirus (por ejemplo papilomavirus tal como los que producen verrugas genitales, verrugas comunes o verrugas de la planta del pie) , un hepadnavirus (por ejemplo virus de la hepatitis B) , un flavivirus (por ejemplo virus de la hepatitis C o virus del dengue) , o un retrovirus (por ejemplo lentivirus tal como VIH-I) .

En una forma preferida de realización, los conjugados, polinucleótidos, construcciones génicas, vectores, células huésped o preparaciones farmacéuticas de la invención pueden ser usadas para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por el virus de la hepatitis C. Estas enfermedades incluyen, sin limitación, hepatitis C crónica y aguda,

Enfermedades bacterianas tales como enfermedades que resultan de infección por bacterias del género Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Shigella, Listeria, Aerobacter, Helicobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas , Streptococcus, Chlamydia, Mycoplasma, Pneumococcus, Neisseria, Clostridium, Bacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Campylobacter, Vibrio, Serratia, Providencia, Chromobacterium, Brucella, Yersinia, Heamophilus o Bordetella . Otras enfermedades infecciosas tales como enfermedades fúngicas que incluyen pero no se limitan a candidiasis, aspergi 1 o s i s , hi s toplasmo s i s , meningitis criptocócica o enfermedades parasitarias que incluyen pero no se limitan a infección por paludismo, Pneumocystis j iroveci, neumonía, leishmaniosis, criptosporidiosis, toxoplasmosis y tripanosoma.

Los conjugados de la invención también son adecuados para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tales como, sin limitación, neoplasias ubicadas en: colon, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenales, paratiroideas, hipófisis, testículos, ovarios, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico) , sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, tórax y aparato genitourinario.

De manera similar, otros trastornos hiperproliferativos que pueden tratarse o detectarse también mediante los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a leucemia linf oblástica aguda infantil, leucemia linf oblástica aguda, leucemia linfocitica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma corticosuprarrenal, cáncer hepatocelular en adultos (primario) , cáncer de hígado en adultos (primario) , leucemia linfocitica aguda en adultos, leucemia mieloide aguda en adultos, enfermedad de Hodgkin en adultos, linfoma de Hodgkin en adultos, leucemia linfocitica en adultos, linfoma no de Hodgkin en adultos, cáncer de hígado en adultos primario, sarcoma del tejido blando en adultos, linfoma relacionado con el SIDA, tumores malignos relacionados con el SIDA, cáncer de ano, astrocitoma, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, glioma del tallo cerebral, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de la pelvis renal y uréter, linfoma del sistema nervioso central (primario) , linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, cáncer de cuello uterino, cáncer hepatocelular infantil (primario) , cáncer de hígado infantil (primario) , leucemia linf oblástica aguda infantil, leucemia mieloide aguda infantil, glioma del tallo cerebral infantil, astrocitoma cerebeloso infantil, astrocitoma cerebral infantil, tumores de células germinales extracraneales infantiles, enfermedad de Hodgkin infantil, linfoma de Hodgkin infantil, glioma de la vía óptica y e hipotalámico infantil, leucemia linf oblástica infantil, meduloblastoma infantil, linfoma no de Hodgkin infantil, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineales infantiles, cáncer de hígado primario infantil, rabdomiosarcoma infantil, sarcoma del tejido blando infantil, glioma hipotalámico y de la vía óptica infantil, leucemia linfocitica crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer de colon, linfoma de células T cutáneo, carcinoma de células de los islotes del páncreas endocrino, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer epitelial, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing y tumores relacionados, cáncer de páncreas exocrino, tumor de células germinales extracraneales, tumor de células germinales extragodanales, cáncer de las vías biliares extrahepáticas, cáncer de ojo, cáncer de mama en la mujer, enfermedad de Gaucher, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumores gastrointestinales, tumores de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, enfermedad de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, hipergammaglobulinemia, cáncer hipofaringeo, cánceres intestinales, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes, cáncer pancreático de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, cáncer de laringe, cáncer de labio y cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, trastornos linfoproliferativos, macroglobulinemia, cáncer de mama en el hombre, mesotelioma maligno, timoma maligno, meduloblastoma, melanoma, mesotelioma, cáncer metastásico escamoso de cuello con primario oculto, cáncer metastásico escamoso de cuello primario, cáncer metastásico escamoso de cuello, mieloma múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, síndrome mié lodi splás i co , leucemia mielógena, leucemia mieloide, trastornos mieloproliferativos, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin durante el embarazo, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer metastásico escamoso de cuello con primario oculto, cáncer bucofaringeo, osteosarcoma-Z fibroso maligno, osteosarcoma-W histiocitoma fibroso maligno, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales de ovario, tumor de bajo potencial maligno de ovario, cáncer pancreático, paraproteinemias, púrpura, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, feo cromo ci toma , tumor hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, linfoma del sistema nervioso central primario, cáncer de hígado primario, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales, cáncer de pelvis renal y uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de las glándulas salivares, sarcoidosis, sarcomas, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma del tejido blando, cáncer de cuello escamoso, cáncer de estómago, tumores pineales y neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, linfoma de células T, cáncer testicular, timoma, cáncer tiroideo, cáncer de la pelvis renal y uréter de células de transición, cáncer de pelvis renal y uréter de transición, tumores trofoblásticos, cáncer de células de uréter y pelvis renal, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma de útero, cáncer de vagina, glioma hipotalámico y de la vía óptica, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasia, ubicada en un sistema de órgano enumerado anteriormente. Además, los conjugados de la invención pueden ser adecuados también para la prevención y/o el tratamiento de estados premalignos y para evitar la progresión hasta un estado de neoplasia o maligno, incluyendo pero sin limitarse a los trastornos descritos anteriormente. Tales utilizaciones están indicadas en estados que se conoce o se sospecha que preceden a la progresión hasta neoplasia o cáncer, en particular, en los que se ha producido un crecimiento celular no neoplásico que consiste en hiperplasia, metaplasia, o lo más particularmente, displasia . La hiperplasia es una forma de proliferación celular controlada, que implica un aumento en el número de células en un tejido u órgano, sin alteración significativa en la estructura o función. Los trastornos hiperplásicos que pueden prevenirse y/o tratarse con los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a, hiperplasia angiofolicular de los ganglios linfáticos del mediastino, hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, hiperplasia melanocitica atipica, hiperplasia de células básales, hiperplasia gigante de ganglios linfáticos benigna, hiperplasia del cemento, hiperplasia suprarrenal congénita, hiperplasia sebácea congénita, hiperplasia quistica, hiperplasia quistica de mama, hiperplasia por prótesis dental, hiperplasia ductal, hiperplasia del endometrio, hiperplasia fibromuscular , hiperplasia epitelial focal, hiperplasia gingival, hiperplasia fibrosa inflamatoria, hiperplasia papilar inflamatoria, hiperplasia endotelial papilar intravascular, hiperplasia nodular de próstata, hiperplasia regenerativa nodular, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, hiperplasia sebácea senil y hiperplasia verrucosa.

La metaplasia es una forma de crecimiento celular controlado en el que un tipo de célula adulta o completamente diferenciada se sustituye por otro tipo de célula adulta. Los trastornos metaplásicos que pueden prevenirse y/o tratarse con los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a, metaplasia mieloide agnogénica, metaplasia apocrina, metaplasia atípica, metaplasia autoparenquimatosa, metaplasia del tejido conjuntivo, metaplasia epitelial, metaplasia intestinal, anemia metaplásica, osificación metaplásica, pólipos metaplásicos, metaplasia mieloide, metaplasia mieloide primaria, metaplasia mieloide secundaria, metaplasia escamosa, metaplasia escamosa del amnios y metaplasia mieloide sintomática. La displasia es frecuentemente un precursor del cáncer, y se encuentra principalmente en los epitelios; es la forma más desordenada de crecimiento celular no neoplásico, implicando una pérdida en la uniformidad de células individuales y en la orientación arquitectónica de las células. Las células con displasia tienen con frecuencia núcleos profundamente teñidos, grandes de manera anómala, y muestran pleomorfismo . La displasia se produce de manera característica cuando existe irritación o inflamación crónica. Los trastornos displásicos que pueden prevenirse y/o tratarse con los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a, displasia ectodérmica anhidrótica, displasia facial anteropos terior , displasia torácica asfixiante, displasia at r iodi gi t al , displasia broncopulmonar, displasia cerebral, displasia cervical, displasia condroectodérmica, displasia cleidocraneal, displasia ectodérmica congénita, displasia craneodiafisaria, displasia craneocarpotarsal, displasia craneometafisaria, displasia dentinaria, displasia diafisaria, displasia ectodérmica, displasia del esmalte, displasia encefalooftálmica, displasia epifisaria hemimélica, displasia epifisaria múltiple, displasia epifisaria punctata, displasia epitelial, displasia faciodigitogenital , displasia fibrosa familiar de las mandíbulas, displasia familiar con pliegues blancos, displasia f ibromuscular , displasia fibrosa de hueso, displasia ósea florida, displasia retiniana-renal hereditaria, displasia ectodérmica hidrótica, displasia ectodérmica hipohidrótica, displasia tímica linfopénica, displasia mamaria, displasia mandibulofacial , displasia metafisaria, displasia de Mondini, displasia fibrosa monostótica, displasia mioepitelial, displasia epifisaria múltiple, displasia oculoauriculovertebral, displasia o cu 1 o de n t o di gi t a 1 , displasia oculovertebral , displasia odontogénica, displasia oftalmomandibulomélica, displasia cemental periapical, displasia fibrosa poliostótica, displasia espondiloepifisaria pseudoacondroplástica, displasia retiniana, displasia septoóptica, displasia espondiloepifisaria y displasia ventriculorradial . Trastornos preneoplásicos adicionales que pueden prevenirse y/o tratarse con los compuestos según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, trastornos no proliferativos benignos (por ejemplo, tumores benignos, estados f ibroquí sticos , hipertrofia tisular, pólipos intestinales, pólipos de colon y displasia esofágica) , leucoplasia, queratosis, enfermedad de Bowen, elastosis actínica, queilitis solar y queratosis solar.

En una forma preferida de realización, los conjugados, polinucleótidos , construcciones génicas, vectores, células huésped y preparaciones farmacéuticas de la invención se emplean para el tratamiento de trastornos causados por una proliferación celular indeseada causada por el virus del papiloma humano, incluyendo tanto las verrugas como los tumores. Tipos de verrugas que pueden ser tratados con las composiciones de la invención incluyen verrugas comunes, verrugas plantares, verrugas genitales, verrugas subunguales o periunguales y verrugas planas. Tumores que pueden ser tratados con las composiciones de la presente invención incluyen tumores de cuello uterino, de la vulva, de la vagina y del ano en la mujer y del pene y del ano en el hombre. V. COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han identificado que el efecto inmunógeno de los conjugados de la invención se aumenta de una manera sinérgica si los conjugados se administran junto con otros compuestos inmunoestimuladores . El ejemplo 3 de la presente solicitud describe la capacidad de combinaciones de un conjugado de PSM y o bien un ligando de TLR2 (PGN) , ligando de TLR3 (pIC) , un ligando de TLR4 (LPS o el dominio EDA de fibronectina) o bien un ligando de TLR9 (CpG) para promover una respuesta citotóxica frente al péptido acoplado a la PSM que es más fuerte que la respuesta obtenida cuando se administra el péptido como un conjugado con PSM en ausencia de ligando de TLR adicional .

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende, en conjunto o por separado,

(a) un conjugado según la invención, un polinucleótido o construcción génica según la invención, un vector según la invención, una célula huésped según la invención según la invención y (b) un segundo componente seleccionado del grupo de

(i) uno o más agonistas de los receptores tipo peaje, (ii) uno o más anticuerpos agonistas de una molécula co-estimuladora, (iü) una o más citoquinas y

(iv) uno o más compuestos tal como se definen en (i) a (iii)

La expresión "agonista de TLR", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un componente que puede producir una respuesta de señalización a través de una ruta de señalización de TLR, o bien como un ligando dirigido o bien indirectamente a través de la generación de ligando endógeno o exógeno (Sabroe et al, JI 2003 pl630-5) .

En una realización de la presente invención, el agonista de TLR puede producir una respuesta de señalización a través de

TLR-I. Los ejemplos no limitativos de agonistas de TLR-I incluyen lipopéptidos triacilados (LP) ; modulinas solubles en fenol; LP de Mycobacterium tuberculosis; LP de S- (2,3- bis (palmitoiloxi) - (2-RS) -propil) -N-palmitoil- (R) -Cys- (S) -Ser- (S) -Lys (4) -OH, triclorhidrato (Pam₃Cys) que imita el extremo amino terminal acetilado de una lipoproteina bacteriana y LP de OspA de Borrelia burgdorfei .

En una realización alternativa, el agonista de TLR puede producir una respuesta de señalización a través de TLR-2. Los ejemplos no limitativos de agonistas de TLR-2 incluyen, sin limitación, una modulina soluble en fenol (PSM) tal como se define en las tablas 1 y 2 y variantes de la misma, uno o más de un lipopéptido bacteriano de M. tuberculosis, B. burgdorferi, T. pallidum; peptidoglicanos de especies incluyendo Staphylococcus aureus; ácidos lipoteicoicos , ácidos manurónicos, Neisseria porins, fimbrias bacterianas, factores de virulencia de Yersina, viriones de CMV, hemaglutinina del sarampión y zimosano de levadura .

En una realización alternativa, el agonista de TLR puede producir una respuesta de señalización a través de TLR-3, tal como ARN bicatenario, o ácido poliinosinico-policitidilico (poli I: C) .

En una realización alternativa, el agonista de TLR puede producir una respuesta de señalización a través de TLR-4, tal como uno o más de los dominios EDA de f ibronectina , un lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram-negativas, o fragmentos del mismo; proteina de choque térmico (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 ó 90; proteina A tensioactiva, oligosacáridos de hialuronano, fragmentos de heparán sulfato, fragmentos de f ibronectina, péptidos del fibrinógeno y b-defensina-2. En una realización el agonista de TLR es HSP 60, 70 ó 90. En una realización alternativa, el agonista de TLR que puede producir una respuesta de señalización a través de TLR-4 es un derivado no tóxico de LPS tal como monofosforil lipido A (MPL) tal como se describe por Ribi et al (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ . Corp. , NY, págs . 407-419) y que tiene la estructura:

Una versión detoxificada adicional de MPL resulta de la eliminación de la cadena de acilo de la posición 3 de la estructura principal de disacárido, y se denomina monofosforil lipido A 3-0-desacilado (3D-MPL) .

Los derivados no tóxicos de LPS, o lipopolisacáridos bacterianos, que pueden utilizarse como agonistas de TLR en la presente invención pueden purificarse y procesarse a partir de fuentes bacterianas, o alternativamente pueden ser sintéticos. Por ejemplo, el monofosforil lipido A purificado se describe en Ribi et al 1986 (citado anteriormente) , y el monofosforil o difosforil lipido A 3-0-desacilado derivado de Salmonella sp. se describe en los documentos GB 2220211 y US 4912094. Se han descrito otros lipopolisacáridos purificados y sintéticos (documentos US 6005099 y EP 0729473-B1; Hilgers et al., 1986, IntArch.Allergy. Immunol. , 79 (4 ) : 392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60 (1) : 141-6; y el documento EP 0 549 074 Bl) . Los adyuvantes de lipopolisacárido bacteriano pueden ser 3D-MPL y los disacáridos de glucosamina f3 (l-6) descritos en los documentos US 6005099 y EP0729473-B1. Por consiguiente, otros derivados de LPS que pueden utilizarse como agonistas de TLR en la presente invención son aquellos inmunoestimulantes que tienen una estructura similar a la de LPS o MPL o 3D-MPL. En otro aspecto de la presente invención, los derivados de LPS pueden ser un monosacárido acilado, que es una subparte de la estructura anterior de MPL. Un agonista de disacárido puede ser un lipido A purificado o sintético de la siguiente fórmula:

en la que R² puede ser H o PO₃H₂; R³ puede ser una cadena de acilo o 8-hidroximiristoí lo o un resto 3-aciloxiacilo que tiene la fórmula:

i

C=O I

CH₂

I

CH-O-R⁴

I (CH₂)V

I

CH₃

O f! en la que R ₄ es -C-(CH-Λ^x-CH3 y X e Y tienen un valor de 0 hasta 20.

Todavía un derivado no tóxico adicional de LPS, que comparte poca homología estructural con LPS y es puramente sintético es el descrito en el documento WO 00/00462, cuyo contenido se incorpora completamente al presente documento como referencia.

En una realización alternativa, el agonista de TLR puede producir una respuesta de señalización a través de TLR-5, tal como flagelina bacteriana.

En una realización alternativa, el agonista de TLR puede producir una respuesta de señalización a través de TLR-6 tal como lipoproteína micobacteriana, LP di-acilado y modulina soluble en fenol. Agonistas de TLR6 adicionales se describen en el documento W02003043572.

En una realización alternativa, el agonista de TLR puede producir una respuesta de señalización a través de TLR-7 tal como loxoribina, un análogo de guanosina en las posiciones N7 y C8 o un compuesto de imidazoquinolina, o derivados de los mismos. En una realización, el agonista de TLR es imiquimod. Agonistas de TLR7 adicionales se describen en el documento W002085905.

En una realización alternativa, el agonista de TLR puede producir una respuesta de señalización a través de TLR-8 tal como una molécula de imidazoquinolina con actividad anti-viral, por ejemplo resiquimod (R848) ; resiquimod también puede ser reconocido por TLR-7. Otros agonistas de TLR-8 que pueden utilizarse incluyen los descritos en el documento W02004071459.

En una realización alternativa, el agonista de TLR puede producir una respuesta de señalización a través de TLR-9 tal como ADN que contienen nucleótidos de CpG no metilados, en contextos de secuencias particulares conocidos como motivos CpG. Los oligonucleótidos que contienen CpG inducen una respuesta predominantemente de ThI . Tales oligonucleótidos se conocen bien y están descritos, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y las patentes número US6008200 y US5856462. En una realización, los nucleótidos de CpG son oligonucleótidos de CpG.

En una realización alternativa, el componente (i) es un agonista de TLR que puede producir una respuesta de señalización a través de TLR-IO. Alternativamente, el agonista de TLR puede producir una respuesta de señalización a través de cualquier combinación de dos o más de los TLR anteriores.

La expresión "anticuerpos agonistas" de una "molécula co- estimuladora", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a compuestos que pueden unirse con alta afinidad a proteínas en la superficie de las células T y que tienen un efecto agonista, es decir pueden activar la señalización a través del receptor conduciendo a los mismos efectos que la unión del ligando. Moléculas co-estimuladoras preferidas que pueden seleccionarse como diana de los anticuerpos agonistas son moléculas que tienen actividad co-e st imuladora sobre la proliferación de células T e incluyen, sin limitación, CD4 y CD137. Por tanto, los anticuerpos agonistas preferidos adecuados para su utilización en las composiciones de la invención incluyen anticuerpos anti-CD4 y anti-CD137 específicos. Según la presente invención, el término "anticuerpo" comprende moléculas de anticuerpo completas así como fragmentos de las mismas que pueden unirse a CD137 o CD4, y ejercer así un efecto agonista sobre la función de CD137 o CD4. La activación de CD137 coestimula la proliferación de linfocitos T (Goodwin et al. , 1993; Pollock et al. , 1993; Schwarz et al. , 1996) , y el ligando de CD137 expresado en linfocitos B coestimula la proliferación de células T de manera sinérgica con B7 (DeBenedette et al. , 1995) .

Los anticuerpos para su utilización en la presente invención pueden dirigirse contra CD137 o CD4. El término "anticuerpo" comprende anticuerpos policlonales así como monoclonales , anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, que pueden estar presentes en forma unida o soluble. Además, un "anticuerpo" según la presente invención puede ser un fragmento o derivado de las especies mencionadas anteriormente. Tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden estar presentes también como moléculas recombinantes, por ejemplo, como las proteínas de fusión con otros componentes (proteináceos ) . Los fragmentos de anticuerpo se producen habitualmente a través de digestión enzimática, síntesis de proteínas o mediante tecnologías recombinantes conocidas por un experto en la materia. Por tanto, los anticuerpos para su utilización en la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales, monoclonales, humanos o humanizados o recombinantes o fragmentos de los mismos así como anticuerpos de cadena sencilla, por ejemplo construcciones de scFv, o anticuerpos sintéticos. Los anticuerpos policlonales son mezclas heterogéneas de moléculas de anticuerpo que se producen a partir de sueros de animales que se han inmunizado con el antigeno. Objeto de la presente invención son también anticuerpos monoespeci fieos policlonales que se obtienen mediante purificación de la mezcla de anticuerpos (por ejemplo mediante cromatografía sobre una columna con péptidos del epitopo especifico unidos) . Un anticuerpo monoclonal representa una población homogénea de anticuerpos específicos para un único epitopo del antigeno.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales según métodos descritos en la técnica anterior (por ejemplo Kohler y Milstein, Nature, 256,495-397, (1975) ; patente US4376110; Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, CoId Spring, Harbor Laboratory (1988) ; Ausubel et al., (eds) , 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley amp; Sons, Nueva York) .

Los anticuerpos modificados mediante ingeniería genética para su utilización en la presente invención pueden producirse según métodos tal como se describen en las referencias mencionadas anteriormente.

Los anticuerpos para su utilización en la presente invención pueden pertenecer a cualquiera de las siguientes clases de inmunoglobulinas : IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y, cuando pueda aplicarse, una subclase de las clases mencionadas anteriormente, por ejemplo las subclases de la clase IgG. Se prefieren IgG y sus subclases, tales como IgGl, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgGM. Se prefieren especialmente los subtipos de IgG IgGl/k o IgG2b/k . Un clon de hibridoma que produce anticuerpos monoclonales para su utilización en la presente invención puede cultivarse in vitro, in situ o in vivo. Altos títulos de anticuerpos monoclonales se producen preferiblemente in vivo o in situ. Los anticuerpos quiméricos son especies que contienen componentes de diferente origen (por ejemplo anticuerpos que contienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino, y una región constante derivada de una inmunoglobulina humana) . Los anticuerpos quiméricos se emplean con el fin de reducir la inmunogenicidad de las especies cuando se administran al paciente y para mejorar el rendimiento de producción. Por ejemplo, en comparación con las lineas celulares de hibridoma, los anticuerpos monoclonales murinos proporcionan mayores rendimientos. Sin embargo, conducen a una mayor inmunogenicidad en un paciente humano. Por tanto, se utilizan preferiblemente anticuerpos quiméricos humanos/murinos . Incluso se prefiere más un anticuerpo monoclonal en el que las regiones hipervariables que definen la complementariedad (CDR) de un anticuerpo monoclonal murino se combinan con las regiones de anticuerpo adicionales de un anticuerpo humano. Un anticuerpo de este tipo se denomina un anticuerpo humanizado. Anticuerpos quiméricos y métodos para su producción se describen en la técnica anterior (Cabilly et al., Proc. Nati. Sci . USA 81: 3273- 3277 (1984) ; Morrison et al. Proc. Nati. Acad. Sci USA 81: 6851- 6855 (1984) ; Boulianne et al. Nature 312 643-646 (1984); Cabilly et al., documento EP-A-125023; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., documento EP-A-171496; Morrión et al., documento EP-A-173494; Neuberger et al., documento WO 86/01533; Kudo et al., documento EP-A-184187; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986) ; Robinson et al., documento WO 87/02671; Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 84: 3439-3443 (1987) ; Sun et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 84: 214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) y Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, citado anteriormente) .

Los fragmentos de anticuerpo comprenden cualquier resto de anticuerpo delecionado o derivatizado que tiene uno o dos sitio (s) de unión para el antigeno, es decir, uno o más epitopos del ligando de CD137 o CD137.

Ejemplos específicos de tales fragmentos de anticuerpo son fragmentos Fv, Fab o F (ab')2 o fragmentos monocatenarios tales como scFv. Se prefieren fragmentos bicatenarios tales como Fv, Fab o F (ab')2. Los fragmentos Fab y F(ab')2 no tienen ningún fragmento Fc contenido en anticuerpos intactos . Como consecuencia beneficiosa, tales fragmentos se transportan más rápido en el sistema circulatorio y muestran menos unión no especifica a tejido en comparación con las especies de anticuerpo completas. Tales fragmentos pueden producirse a partir de anticuerpos intactos mediante digestión proteolitica utilizando proteasas tales como papaina (para la producción de fragmentos Fab) o pepsina (para la producción de fragmentos F(ab')2), u oxidación química. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpo o construcciones de anticuerpo se producen a través de manipulación genética de los correspondientes genes de anticuerpos. Las construcciones de anticuerpos recombinantes comprenden habitualmente moléculas de Fv monocatenarias (scFvs, 30 kDa de tamaño) , en las que los dominios VH y VL están encadenados entre sí mediante un ligador de polipéptido para mejorar la expresión y eficiencia de plegamiento. Con el fin de aumentar la afinidad funcional (avidez) y de aumentar el tamaño y reducir de ese modo las tasas de aclaramiento sanguíneo, los fragmentos scFv monoméricos pueden acomplejarse en dímeros, trímeros o agregados más grandes utilizando dominios de proteína adhesivos o péptidos adaptadores. Un ejemplo de una construcción de este tipo de un dímero de scFv bivalente es un diacuerpo de 60 kDa en el que un ligador corto, por ejemplo de cinco residuos, entre los dominios VH- y V de cada scFv evita el alineamiento de los dominios de V en un único módulo de Fv y en su lugar da como resultado la asociación de dos moléculas de scFv. Los diacuerpos tienen dos sitios de unión a antígeno funcionales. Los adaptadores pueden reducirse también hasta menos de tres residuos lo que evita la formación de un diacuerpo y en su lugar dirige tres moléculas de scFv a asociarse en un trímero (triacuerpo de 90 kDa) con tres sitios de unión funcionales a antígeno. También es posible la asociación de cuatro scFv en un tetracuerpo tetravalente. Construcciones de anticuerpo preferidos adicionales para su utilización en la presente invención son dímeros de las proteínas de fusión scFv- CH3 (80 kDa; denominadas "minicuerpos") . Los anticuerpos para su utilización en la presente invención se refieren preferiblemente a un péptido o una proteína que está codificado por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según el número de registro de GenBank L12964 8 (véase la figura 8A) o un ácido nucleico que tiene al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, de manera especialmente preferida al menos el 97% de homología con respecto a la secuencia de nucleótidos según el número de registro de GenBank L12964. La expresión "citoquina inmunoestimuladora", tal como se utiliza en el presente documento, se entiende como cualquier compuesto que promueve un aumento en la actividad de cualquier componente del sistema inmunitario incluyendo aquellos componentes que forman parte o que están implicados en la respuesta inmunitaria mediada por células, respuesta inmunitaria humoral y el sistema del complemento. Preferiblemente, la citoquina inmunoestimuladora se selecciona del grupo de IL-12, IL-2, IL-15, IL-18, IL-24, GM-CSF, TNFα, ligando de CD40, I FNa, IFNβ, IFNγ y variantes funcionalmente equivalentes de los mismos.

En una realización preferida, el componente (b) de las composiciones de la invención incluye un agonista de TLR. En una realización aún más preferida, el agonista se selecciona del grupo de un ligando de TLR3, un ligando de TLR4 y un ligando de TLR9. En una realización aún más preferida, el ligando de TLR3 es poliI:C, el ligando de TLR4 es LPS o el dominio EDA de fibronectina y/o el ligando de TLR9 es CpG.

VI. UTILIZACIONES MÉDICAS DE LAS COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓN Las composiciones de la invención son adecuadas para promover una respuesta inmunológica hacia el péptido antigénico que forma parte de los conjugados. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere una preparación farmacéutica o una vacuna que comprende una composición de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición de la invención o una preparación farmacéutica o vacuna que comprende las composiciones de la invención para su utilización en medicina.

Las composiciones de la invención pueden utilizarse para los mismos fines que los conjugados de la invención. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a la composición de la invención para su uso en medicina.

Las composiciones de la invención pueden utilizarse in vivo como vacuna para inducir una respuesta citotóxica hacia el péptido antigénico. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para inducir una respuesta citotóxica hacia un péptido antigénico que comprende administrar a un sujeto que necesita dicha respuesta las composiciones de la invención. En otro aspecto, la invención se refiere a las composiciones y composiciones farmacéuticas de la invención para su utilización en un método de inducción de una respuesta citotóxica hacia un péptido antigénico. En una forma particular de realización, la invención se relaciona con un método para inducir una respuesta citotóxica hacia una enfermedad infecciosa, alérgica o neoplásica.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a la composición de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa, una enfermedad alérgica o una enfermedad neoplásica. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad infecciosa, una enfermedad alérgica o una enfermedad neoplásica que comprende la administración a un paciente que necesita del mismo de las composiciones de la invención.

VII. USOS JN VITRO DE LOS CONJUGADOS Y COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓN

Tal como se muestra en el ejemplo 2 de la presente invención, los conjugados de la invención pueden promover la maduración de las células dendriticas y la presentación antigénica. Por tanto, los conjugados de la invención también pueden utilizarse in vitro para promover la maduración de las células dendriticas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de un conjugado como el de la invención, un polinucleótido o construcción génica de la invención, un vector de la invención, una célula huésped de la invención o una composición de la invención para promover la presentación del péptido o péptidos antigénicos por las células presentadoras de antigeno o para promover la maduración de las células presentadoras de antigeno. En una realización preferida, las células presentadoras de antigeno son células dendriticas.

Las diferentes realizaciones que se refieren a los métodos para promover la maduración de las células dendriticas y la presentación antigénica se resumen en detalle a continuación en el punto VIII .

VIII. MÉTODO PARA LA PREPARACIÓN DE CÉLULAS PRESENTADORAS DE

ANTÍGENO SENSIBILIZADAS CON ANTÍGENO Y CÉLULAS

PRESENTADORAS DE ANTÍGENO OBTENIDAS UTILIZANDO DICHO MÉTODO

Los autores de la presente invención también han observado que los conjugados de la invención pueden promover la maduración de las células dendriticas y la presentación antigénica por dichas células, conduciendo asi a células dendriticas sensibilizadas con antigeno. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para obtener células dendriticas sensibilizadas con antigeno que comprende las etapas de

(i) poner en contacto una célula presentadora de antigeno

(APC) con un conjugado, un pol inucleót ido , una construcción génica, un vector, una célula huésped, una composición o una preparación farmacéutica según la invención y

(ii) aislar la APC cargada con antigeno.

En la primera etapa, el método de obtención de APC sensibilizada con antigeno supone poner en contacto la APC con un conjugado según la invención.

La expresión "células presentadoras de antigeno (APC) ", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una clase de células que pueden presentar uno o más antigenos en forma de complejo péptido-MHC reconocible por células efectoras especificas del sistema inmunitario, e induciendo asi una respuesta inmunitaria celular eficiente frente al antigeno o antígenos que se están presentando. Las APC adecuadas para su utilización en la presente invención incluyen tanto APC profesionales tales como células dendriticas (DC) , macrófagos y células B asi como APC no profesionales tales como fibroblastos, células epiteliales timicas, células epiteliales tiroideas, células guales, células beta pancreáticas y células endoteliales vasculares. En una realización preferida, las APC son células dendriticas. Preferiblemente, las APC para su utilización en los métodos de la invención son células dendriticas, puesto que son las únicas APC que tienen la capacidad para presentar antigenos en una cantidad eficiente para activar células T vírgenes para respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) .

La expresión "células dendriticas (DC)" se refiere a una población diversa de tipos celulares morfológicamente similares que se encuentran en una variedad de tejidos linfoides y no linfoides, Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol . 9:271-296. Las células dendriticas constituyen las APC más potentes y preferidas en el organismo. Aunque las células dendriticas pueden diferenciarse a partir de los monocitos, tienen diferentes fenotipos. Por ejemplo, un marcador de diferenciación particular, el antigeno CD14, no se encuentra en las células dendriticas pero lo tienen los monocitos. Además, las células dendriticas maduras no son fagociticas, mientras que los monocitos son células fuertemente fagocitadoras . Se ha demostrado que las DC maduras pueden proporcionar todas las señales necesarias para la activación y proliferación de células T.

Las células dendriticas pueden aislarse o generarse a partir de la sangre o médula ósea, u órganos linfoides secundarios del sujeto, tales como pero sin limitarse a bazo, ganglios linfáticos, amígdalas, placas de Peyer del intestino y médula ósea, mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Preferiblemente, las DC utilizadas en los métodos de la invención son células dendriticas (o diferenciadas terminalmente) . La fuente de las células dendríticas es preferiblemente monocitos sanguíneos humanos.

Las células inmunitarias obtenidas de tales fuentes comprenden normalmente macrófagos y linfocitos en recirculación predominantemente en diversas fases de diferenciación y maduración. Pueden enriquecerse las preparaciones de células dendríticas mediante técnicas convencionales (véase por ejemplo, Current Protocols in Immunology, 7.32.1-7.32.16, John Wiley and Sons, Inc. , 1997), como mediante reducción de células T y células adherentes, seguido por centrifugación en gradiente de densidad. Las DC pueden purificarse opcionalmente mediante separación de las células marcadas con fluorescencia, o utilizando perlas magnéticas con AcM anti-CD83. Alternativamente, puede obtenerse un alto rendimiento de una población relativamente homogénea de DC tratando los progenitores de DC presentes en muestras de sangre o médula ósea con citoquinas, tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y la interleuquina 4 (IL-4) . En tales condiciones, los monocitos se diferencian en células dendríticas sin proliferación celular. El tratamiento adicional con agentes tales como TNF-alfa estimula la diferenciación terminal de las DC.

A modo de ejemplo pero sin limitación, las células dendríticas pueden obtenerse a partir de monocitos sanguíneos tal como sigue: se obtienen monocitos de sangre periférica mediante métodos convencionales (véase, por ejemplo, Sallusto et al. , 1994, J. Exp. Med. 179: 1109-1118) . Se recogen los leucocitos de donantes de sangre sanos mediante preparación de la capa leucocítica o paquete de leucaféresis utilizando centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Paque y adherencia a plástico. Si se desean DC maduras, puede utilizarse el siguiente protocolo para cultivar las DC. Se permite que se adhieran las células a placas de plástico durante 4 horas a 37 ⁰C. Se eliminan las células no adherentes y se cultivan los monocitos adherentes durante 7 días en medios de cultivo que contienen factor estimulante de colonias de granulocitos- macrófagos (GM-CSF) 0,1 μg/ml e interleucina-4 (IL-4) 0,05 μg/ml . Con el fin de preparar células dendríticas maduras, se añade factor de necrosis tumoral alfa en el día 5, y se recogen las células en el día 7. Se conocen en la técnica métodos para madurar células dendriticas inmaduras. Por ejemplo, pueden obtenerse DC completa e irreversiblemente maduras y estables cultivando células dendriticas inmaduras en un medio condicionado con monocitos autólogos o no autólogos, medio condicionado con PBMC o SAC tal como se describe en Romani et al. (Immunol. Methods, 1996, 196:137) y Bender et al. (J. Immunol. Methods, 1996, 196:121) . Jonuleit et al. (Eur. J. Immunol., 1997 12:3135-3142) dan a conocer la maduración de DC inmaduras mediante cultivo durante toda la noche en un medio que contiene GM-CSF e IL-4, más un "cóctel de citoquinas" que comprende TNF-α, IL-lβ, I L- 6 y PGE₂. Las concentraciones preferidas de citoquinas en el cóctel son TNF-α 10 ng/ml, IL- β 10 ng/ml, I L- 6 100 ng/ml y PGE₂ 1 μg/ml. La publicación de patente europea EP-A-O 922 758 da a conocer la producción de células dendriticas maduras a partir de células dendriticas inmaduras derivadas de monocitos mediante cultivo en un medio que contiene IFN-γ. La publicación de patente número US2004/0152191 da a conocer la maduración de células dendriticas mediante cultivo con RU41740. El "procedimiento de base de CD40L" y el "procedimiento de CD40L de electroporación tras la maduración (PME)" para la maduración de DC se describen en la solicitud internacional WO 2006/042177, cuyo contenido se incorpora como referencia. En el procedimiento de base de CD40L, se transfectan DC inmaduras con ARNm de CD40L y ARNm que codifica el antigeno, y luego se tratan con IFN-γ (1000 U/ml) o TNF- α(10 ng/ml) o una combinación de IFN-γ y PGE₂ (1 μg/ml) . Pueden aumentarse o disminuirse los niveles de citoquinas. En el "procedimiento de PME-CD40L", se maduran DC inmaduras derivadas de monocitos (normalmente tras 4-7 dias tras comenzar el cultivo de los monocitos con GM-CSF y IL-4) mediante cultivo durante toda la noche (12-30 horas, preferiblemente durante aproximadamente 18 h) con TNF-I± (10 ng/ml) , IFN-γ (1000 U/ml) y PGE2 (1 μg/ml) . Tras este cultivo durante la noche, se recogen las DC y se someten a electroporación con ARN que codifica el antigeno y ARNm de CD40L y se cultivan en medios X-VIVO 15 que contienen GM-CSF 800 U/ml e IL-4 500 U/ml durante 4 h o más horas antes de su retirada y toma de alícuotas para la pulsación con un lisado o extracto de células o viriones.

Alternativamente, las células presentadoras de antigeno (APC) , incluyendo pero sin limitarse a macrófagos, células dendriticas y células B, pueden obtenerse mediante la producción in vitro a partir de células madre y progenituras de sangre periférica humana o médula ósea tal como se describe por Inaba et al, (1992) J Exp Med 176 1693-1702.

Las células dendriticas obtenidas de esta manera expresan de manera característica el marcador de la superficie celular CD83. Además, tales células expresan de manera característica altos niveles de moléculas MHC de clase II, asi como los marcadores de la superficie celular CDl alfa, CD40, CD86, CD54 y CD80, pero pierden la expresión de CD14. Otros marcadores de la superficie celular incluyen de manera característica los marcadores de células T, CD2 y CD5, el marcador de células B, CD7 y los marcadores de células mieloides, CD13, CD32 (Fc gamma R II) , CD33, CD36, y CD63, asi como un gran número de antigenos asociados a leucocitos. Opcionalmente, pueden utilizarse técnicas convencionales, tales como observación morfológica y tinción inmunoquimica, para verificar la presencia de células dendriticas. Por ejemplo, puede evaluarse la pureza de células dendriticas mediante citometria de flujo utilizando anticuerpos marcados con fluorocromo dirigidos contra uno o más de los marcadores característicos de la superficie celular indicados anteriormente, por ejemplo, CD83, HLA-ABC, HLA-DR, CDl alfa, CD40 y/o CD54. Esta técnica también puede utilizarse para distinguir entre DC inmaduras y maduras, utilizando anticuerpos marcados con fluorocromo dirigidos contra CD 14, que está presente en las DC inmaduras, pero no en las maduras. Pueden obtenerse precursores de DC a partir de un sujeto sano o de un sujeto que se sabe que padece una enfermedad asociada con la expresión de un antigeno particular. Tales precursores de DC pueden ser alogénicos o autólogos. Una vez que se obtienen los precursores de DC, se cultivan en condiciones apropiadas y durante un tiempo suficiente para expandir la población celular y mantener las DC en un estado óptimo para la captura, el procesamiento y la presentación del antigeno. En una aproximación preferida para cultivar precursores de DC, se generan las DC a partir de tales precursores de DC mediante cultivo ex vivo en medio libre de suero o libre de proteínas durante 40 horas, en ausencia de citoquinas añadidas de manera exógena, tal como se detalla en el documento de titularidad conjunta USSN 60/158.618. Los aspectos preferidos del aislamiento y cultivo de DC incluyen la utilización de medio de cultivo que carece de citoquinas suministradas de manera exógena y el cultivo en condiciones libres de suero de manera eficiente para dar como resultado la generación de DC superactivadas cargadas con Ag, que son células que ya han procesado un Ag y tienen la capacidad para presentar el Ag a las células inmunitarias y generar rápidamente respuestas inmunitarias especificas de Ag, por ejemplo, respuestas de células T mediadas por CTL frente a antigenos tumorales. Las células dendriticas pueden conservarse mediante cr i ocons ervaci ón antes o después de la exposición a los conjugados de la invención.

En la etapa (i) del método de obtención de células dendriticas cargadas con antigeno de la invención, se pone en contacto la APC poniendo en contacto una célula dendritica con un conjugado, un polinucleótido, una construcción génica, un vector, una célula huésped o una composición farmacéutica según la invención. La etapa de poner en contacto se llevará a cabo de manera diferente dependiendo de si la DC se pone en contacto con los conjugados como tales o con un ácido nucleico que codifica dichos conjugados. En el caso de que la etapa de poner en contacto se lleve a cabo utilizando los conjugados de la invención, la etapa de poner en contacto comprende poner en contacto/incubar la DC con los conjugados durante tiempo suficiente. En una realización, puede aumentarse la sensibilización poniendo en contacto las APC con proteína (s) de choque térmico (hsp) unida (s) de manera no covalente al conjugado. Se ha demostrado que las hsp unidas de manera no covalente a moléculas antigénicas pueden aumentar la sensibilización de la APC. Alternativamente, puede transfectarse la APC con un vector que codifica los conjugados y utilizarse para terapia vacunal y/o i nmu no t e r ap i a adoptiva. Se han utilizado varias aproximaciones para introducir ácidos nucleicos en células in vivo, ex vivo e in vitro tales como transporte de genes mediante lípidos o liposomas y vectores retrovirales defectuosos en la replicación que albergan una secuencia de polinucleótido terapéutica como parte del genoma retroviral. Los vectores retrovirales ampliamente utilizados incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (VLMu) , virus de la leucemia del gibón (VLG) , virus de la inmunodeficiencia en simios (VIS) , virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , alfavirus y combinaciones de los mismos . Los vectores se someten opcionalmente a pseudotipado para extender la gama de huéspedes del vector a células que no están infectadas por el retrovirus correspondiente al vector. Por ejemplo, se ha utilizado la gli coproteí na de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular (VEV-G) para construir vectores de VIH pseudotipados con VEV-G que pueden infectar células madre hematopoyéticas . Los vectores basados en virus adenoasociados (VAA) también se utilizan para transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos y en procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo. Otros vectores virales adecuados incluyen herpesvirus, lentivirus y virus vaccinia. Además de los vectores virales, están disponibles varios métodos de transfección no virales. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a métodos de electroporación, transfección con fosfato de calcio, liposomas, complejos lipidicos catiónicos, emulsiones de agua en aceite, polietileniminas y dendrimeros. Cuando sea apropiado, pueden utilizarse juntos dos o más tipos de vectores. Por ejemplo, puede utilizarse un vector de plásmido junto con liposomas. En el caso de vectores no virales, puede incorporarse un ácido nucleico en los vectores no virales mediante cualquier medio adecuado conocido en el estado de la técnica. Para los plásmidos, ésto normalmente implica la ligación de la construcción en un sitio de restricción adecuado. Para vectores tales como liposomas, emulsiones de agua en aceite, pol iet i lenami ñas y dendrimeros, el vector y la construcción pueden asociarse mediante mezclado en condiciones adecuadas conocidas en el estado de la técnica. También es posible cargar APC con ARN. Esto se lleva a cabo normalmente utilizando técnicas tales como electroporación, captura pasiva, lipofección, mi cr oinyección , reactivos catiónicos, transducción viral, CaPO₄ y similares.

La activación de la DC puede detectarse poniendo en contacto la DC con clones de células T que expresan un receptor de células T especifico para el péptido antigénico presente en el conjugado y midiendo la proliferación de las células T, normalmente midiendo la incorporación de un análogo de nucleótido marcado. Una vez que se ha sensibilizado la APC con el antigeno, se aislan las células con el fin de obtener la APC sensibilizada con antigeno. Pueden utilizarse marcadores de la superficie celular para aislar las células necesarias para poner en práctica los métodos de esta invención. Por ejemplo, las DC expresan moléculas MHC y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, B7-1 y B7-2) . La expresión de marcadores de superficie facilita la identificación y la purificación de estas células . Estos métodos de identificación y aislamiento incluyen FACS, cromatografía en columna y similares. Para una revisión de procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo en general, véase Stites y Terr (eds. ) 1991 Basic and Clinical Immunology (7^a ed. ) y Paul citado anteriormente. Para una discusión de cómo preparar anticuerpos contra antigenos seleccionados véase Harlow y Lañe (1989) citado anteriormente. Pueden realizarse el aislamiento de las células o los inmunoensayos para la detección de células durante la purificación celular en cualquiera de varias configuraciones, por ejemplo, las revisadas en Maggio (ed.) (1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Ratón, FIa.; Tijan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam; Harlow y Lañe, citado anteriormente; Chan (ed. ) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FIa.; Price y Newman (eds.) (1991) Principies and Practice of Immunoassays, Stockton Press, NY; y Ngo (ed. ) (1988) Non-isotopic Immunoassays, Plenum Press, NY. Pueden aislarse las células y caracterizarse mediante métodos de citometria de flujo y análisis FACS. Se conoce una amplia variedad de métodos de citometria de flujo. Para una revisión general de la citometria de flujo activada por fluorescencia, véase, por ejemplo, Abbas et al. (1991) Cellular and Molecular immunology W. B. Saunders Company, particularmente el capitulo 3, y Kuby (1992) Immunology W. H. Freeman and Company, particularmente el capitulo 6.

Los agentes de marcado que pueden utilizarse para marcar un antigeno celular incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , proteínas u otros polímeros tales como matrices de afinidad, hidratos de carbono o lipidos. Se procede a la detección mediante cualquier método conocido, tal como i nmun o t r a n s f e r e n c i a , análisis de inmunotransferencia de tipo Western, seguimiento de marcadores radiactivos o bioluminiscentes, electroforesis capilar u otros métodos que seguirán la pista de una molécula basándose en el tamaño, la carga o la afinidad.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una APC que puede obtenerse mediante el método mencionado previamente. La APC cargada con antígeno obtenida utilizando el método de la presente invención puede utilizarse para activar células T CD8+ y/o células T CD4+ in vitro o puede introducirse directamente en un sujeto para activar las células T in vivo. Por tanto, en aspectos adicionales, la invención se refiere a una APC que puede obtenerse mediante el método de la invención para su utilización en medicina asi como a una vacuna que comprende la APC que puede obtenerse mediante el método de la invención. Se entenderá que, para los fines de utilizaciones médicas, las células pueden provenir del mismo individuo que va a tratarse (trasplante autólogo) o de un individuo diferente (trasplante alogénico) . En el trasplante alogénico, el donante y el receptor se hacen coincidir basándose en la similitud de los antigenos HLA con el fin de minimizar la respuesta inmunitaria de las células tanto del donante como del receptor frente al otro .

Pueden introducirse células T CD8⁺ educadas in vitro en un mamífero en el que son citotóxicas frente a células diana que llevan péptidos antigénicos correspondientes a aquellos para los que las células T se activan para reconocer en moléculas MHC de clase I. Estas células diana son normalmente células cancerosas o células infectadas por patógenos que expresan péptidos antigénicos únicos en sus superficies de MHC de clase I.

De manera similar, también pueden estimularse células T cooperadoras CD4⁺, que reconocen péptidos antigénicos en el contexto de MHC de clase II, mediante las APC de la invención, que comprenden péptidos antigénicos tanto en el contexto de MHC de clase I como de clase II. Las células T cooperadoras también estimulan una respuesta inmunitaria frente a una célula diana. Como con las células T citotóxicas, las células T cooperadoras se estimulan con las APC cargadas con antígeno in vitro o in vivo .

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula presentadora de antígeno de acuerdo a la invención para su utilización en un método de inducción de una respuesta citotóxica hacia el péptido antigénico. En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula presentadora de antigeno de la invención para su utilización en un método de inducción de una respuesta citotóxica hacia una enfermedad infecciosa, una enfermedad alérgica o una enfermedad neoplásica. Puede determinarse la inmunogenicidad de las células presentadoras de antigeno o células T educadas producidas mediante los métodos de la invención mediante metodologías bien conocidas que incluyen, pero sin limitarse a, las siguientes: ensayo de lisis de liberación de ⁵¹Cr para determinar la función de los CTL. Las células T citotóxicas pueden destruir células que presentan el complejo de MHC de clase I :péptido particular que reconocen específicamente. La función de los CTL se determina normalmente midiendo la liberación de un isótopo radiactivo por una célula diana (por ejemplo, una APC cargada con antigeno, célula tumoral, célula patógena, etc. ) .

Ensayo de liberación de citoquinas . El análisis de los tipos y las cantidades de citoquinas secretadas por células T al poner en contacto APC modificadas puede ser una medida de la actividad funcional. Pueden medirse las citoquinas mediante ensayos ELISA o ELISpot para determinar la velocidad y cantidad total de producción de citoquinas (Fujihashi et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:181; Tanquay y Killion (1 994) Lymphokine Cytokine Res. 13:259) .

Educación de células T in vitro. Pueden someterse a ensayo las composiciones de la invención para determinar la capacidad para producir poblaciones de células T reactivas a partir de PBMC de un paciente o donante normal. En este sistema, las células T producidas pueden someterse a prueba para determinar la actividad litica, liberación de citoquinas, policlonalidad y reactividad cruzada con el epitopo antigénico (Parkhurst et al. , 1996, J. Immunol. 1996, 157:2539) .

Modelos de animales transgénicos . Puede evaluarse la inmunogenicidad in vivo mediante la vacunación de animales transgénicos HLA con las composiciones de la invención y la determinación de la naturaleza y magnitud de la respuesta inmunitaria inducida. Alternativamente, el modelo de ratón hu- PBL-SCID permite la reconstitución de un sistema inmunitario humano en un ratón mediante la transferencia adoptiva de PBL humano. Estos animales pueden vacunarse con las composiciones y analizarse para determinar la respuesta inmunitaria tal como se mencionó previamente en Shirai et al. (1995) J. Immunol. 154:2733; Mosier et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90:2443.

Ensayos de proliferación. Las células T proliferarán en respuesta a composiciones reactivas. Puede monitorizarse cuantitativamente la proliferación midiendo, por ejemplo, la captura de [³H] -timidina . En un método preferido, se mide la proliferación de células T utilizando éster succinimidilico de diacetato de carboxi-flouresceina (CFSE) . El CFSE consiste en una molécula de fluoresceina que contiene un grupo funcional de éster succinimidilico y dos restos acetato. En primer lugar, se incuban los linfocitos con CFSE no fluorescente, permeable a la membrana que difunde pasivamente dentro las células y las esterasas intracelulares rompen los grupos acetato, convirtiéndolos en un colorante impermeante para la membrana, fluorescente. Se elimina por lavado el colorante en exceso y se inducen las células quiescentes para que proliferen mediante estimulación antigénica o mitogénica in vitro. Se mantienen las células en cultivo durante seis días. Durante cada ronda de división celular, se divide por la mitad la fluorescencia de CFSE, permitiendo la identificación de sucesivas generaciones celulares. Se detecta CFSE utilizando filtros de fluoresceina convencionales (excitación = 492 nm, emisión = 517 nm) . La tinción con anticuerpos marcados con fluorescencia para las moléculas de la superficie celular, tales como CD4 y CD8, y marcadores intracelulares permite el examen de la proliferación de subconjuntos de linfocitos específicos así como la caracterización de las propiedades fenotípicas y funcionales de las células en proliferación utilizando la citometría de flujo. La utilización concomitante de yoduro de propidio (PI) facilita la evaluación de la viabilidad celular. Están disponibles kits de flujo de CFSE a través de Renovar, Inc. (Madison, WI) y otras fuentes .

Modelos de primate. Puede utilizarse un sistema de modelo de primate no humano (chimpancé) para monitorizar inmunogenicidades in vivo de ligandos restringidos para HLA. Se ha demostrado que los chimpancés comparten especificidades de MHC-ligando solapantes con moléculas MHC humanas, permitiendo asi que se sometan a prueba ligandos restringidos para HLA para determinar la inmunogenicidad relativa in vivo (Bertoni et al., 1998, Immunol. 161 :4447) .

Monitorización de acontecimientos de transducción de señales de TCR. Varios acontecimientos de transducción de señales intracelulares (por ejemplo, fosforilación) están asociados con el acoplamiento a TCR satisfactorio por los complejos MHC-ligando. Loa análisis cualitativos y cuantitativos de estos acontecimientos se han correlacionado con las capacidades relativas de las composiciones para activar células efectoras a través del acoplamiento a TCR (Salazar et al. (2000) Tnt. J. Cáncer 85829; lsakov et al. (1995) J. Exp . Med. 181 :375) .

Las células APC pueden utilizarse para el tratamiento de diferentes enfermedades dependiendo del tipo de antigeno que forma parte de los conjugados utilizados para la sensibilización de las células presentadoras de antigeno. Se han descrito previamente antigenos adecuados para la sensibilización y por tanto, las células son adecuadas para el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades alérgicas o enfermedades neoplásicas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a las células presentadoras de antigeno de la invención para su utilización en el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades alérgicas o enfermedades neoplásicas. Aún en otro aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades alérgicas o enfermedades neoplásicas que comprende la administración a un paciente de las células presentadoras de antigeno de la invención. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la célula presentadora de antígenos de acuerdo a la invención para su utilización en un método de inducción de una respuesta citotóxica hacia el péptido antigénico o para su utilización en un método de inducción de una respuesta citotóxica hacia una enfermedad infecciosa, una enfermedad alérgica o una enfermedad neoplásica .

Preferiblemente, los métodos de tratamiento de la presente invención comprendían la denominada inmunoterapia adoptiva. La expresión "inmunoterapia adoptiva" se refiere a una aproximación terapéutica para tratar el cáncer o enfermedades infecciosas en la que se administran células inmunitarias a un huésped con el objetivo de que las células medien o bien directa o bien indirectamente la inmunidad específica para (es decir, monten una respuesta inmunitaria dirigida contra) las células no deseadas. En realizaciones preferidas, la respuesta inmunitaria da como resultado la inhibición de la proliferación y/o el crecimiento de células tumorales y/o metastásicas y lo más preferiblemente da como resultado la resorción y/o muerte de las células neoplásicas. Las células inmunitarias pueden derivarse de un o r gani smo / hué sped diferente (células inmunitarias exógenas) o pueden ser células obtenidas del organismo del sujeto (células inmunitarias autólogas) Las células inmunitarias normalmente se activan in vitro mediante un antígeno particular (en este caso, el péptido antigénico utilizado en los conjugados de la invención) utilizando cualquiera de las técnicas mencionadas anteriormente para la activación de APC in vitro. Los expertos en la técnica conocen bien métodos para llevar a cabo la inmunoterapia adoptiva (véanse, por ejemplo, las patentes números US5081029, US5985270, US5830464, US5776451, US5229115, US690915 y similares) . La invención contempla numerosas modalidades de inmunoterapia adoptiva. En una realización, las DC (por ejemplo, aisladas del paciente o células dendríticas autólogas) se pulsan con los conjugados de la invención y luego se inyectan de nuevo al sujeto en el que están presentes y activan las células inmunitarias in vivo. Además, o alternativamente, las DC pueden trans f ectar se con ácidos nucleicos que codifican para los conjugados de la invención y luego volverse a introducir en un paciente. Aún en otra realización, las DC se pulsan con los conjugados de la invención o se transfectan con ácidos nucleicos que codifican para los conjugados de la invención, y luego se utilizan para estimular linfocitos de sangre periférica o TIL en cultivo y activar CTL dirigidos contra el péptido antigénico que luego se infunden en el paciente. De manera similar, se transfectan fibroblastos, y otras APC, o células tumorales con un ácido nucleico que codifica los conjugados para la invención y se utilizan para activar células tumorales o PBL ex vivo para producir CTL dirigidos contra el péptido antigénico que luego pueden infundirse en un paciente.

Utilizando las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, pueden desarrollarse fácilmente otras modalidades terapéuticas que utilizan los conjugados de la invención o los ácidos nucleicos que codifican para dichos conjugados. Tal como se indicó anteriormente, en una realización las células inmunitarias se derivan de linfocitos de sangre periférica o TIL (por ejemplo derivados de tumores/suspensión tumoral) Los linfocitos utilizados para la activación in vitro incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T, diversas células presentadoras de antigeno (por ejemplo, monocitos, células dendriticas, células B, etc. ) y similares. La activación puede suponer poner en contacto una célula presentadora de antigeno con los conjugados de esta invención que luego presentan el antigeno (o fragmento del mismo) , por ejemplo en moléculas HLA de clase I y/o en moléculas HLA de clase II, y/o puede suponer poner en contacto una célula (por ejemplo linfocito T) directamente con la molécula quimérica. La activación de células inmunitarias puede adoptar varias formas incluyendo, pero sin limitarse a, la adición directa del conjugado a linfocitos de sangre periférica (PBL) o linfocitos de infiltración tumoral (TIL) en cultivo, carga de las células presentadoras de antigeno (por ejemplo, monocitos, células dendriticas, etc.) con la molécula quimérica en cultivo, transfección de las células presentadoras de antigeno, o PBL, con un ácido nucleico que codifica el conjugado y similares . La inoculación de las células activadas es preferiblemente a través de administración sistémica. Las células pueden administrarse por via intravenosa a través de un catéter venoso central o en una vena periférica grande. Otros métodos de administración (por ejemplo, infusión directa en una arteria) están dentro del alcance de la invención.

Las células dendriticas de la invención pueden proporcionarse en una formulación que es adecuada para la administración a un paciente, por ejemplo, por via intravenosa. Las DC de la invención que son adecuadas para la administración a un paciente se denominan en el presente documento como una "vacuna" o una "vacuna de DC." Una vacuna o vacuna de DC puede comprender además componentes adicionales para ayudar a modular la respuesta inmunitaria, o puede procesarse adicionalmente con el fin de ser adecuada para la administración a un paciente. Se conocen en el estado de la técnica métodos de administración intravenosa de las células dendriticas, y un experto en la materia podrá variar los parámetros de la administración intravenosa con el fin de maximizar el efecto terapéutico de las DC administradas. Por tanto, las DC se administran a un sujeto de cualquier manera adecuada, a menudo con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. La idoneidad de un vehículo farmacéuticamente aceptable está determinada en parte por la composición particular que se esté administrando, asi como por el método particular utilizado para administrar la composición. De la manera más habitual, se realizan pruebas de control de calidad (por ejemplo, ensayos mi cr obi o lógi co s , ensayos clonogénicos, pruebas de viabilidad) y se vuelven a infundir de nuevo las células en el sujeto, en algunos casos precedido por la administración de difenhidramina e hidrocortisona. Véase, por ejemplo, Korbling et al. (1986) Blood 67: 529-532 y Haas et al. (1990) Exp. Hematol. 18: 94-98.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, tal como, por ejemplo, mediante administración intravenosa, incluyen disoluciones acuosas para inyección estériles, isotónicas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacterio s tato s y solutos que convierten a la formulación en isotónica con la sangre del receptor pretendido, asi como suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. En general, pueden administrarse las DC de la invención a un sujeto a una velocidad determinada por la dosis eficiente, la toxicidad del tipo celular (por ejemplo, la DL-50) , y los efectos secundarios del tipo celular a diversas concentraciones, según sea apropiado para la masa y la salud general del sujeto, tal como determinará un experto en la materia. Puede realizarse la administración a través de dosis únicas o divididas. Las DC de la invención pueden complementar otros tratamientos para una enfermedad o trastorno, incluyendo, por ejemplo, radioterapia convencional, agentes citotóxicos, análogos de nucleótidos y modificadores de la respuesta biológica.

La dosis de las células dendriticas administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención debe ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente con el tiempo, o para inhibir el crecimiento de células cancerosas o para inhibir la infección. Por tanto, se administran células a un paciente en una cantidad suficiente para producir una respuesta de CTL eficiente frente al antigeno viral o tumoral y/o para aliviar, reducir, curar o al menos detener parcialmente los síntomas y/o las complicaciones de la enfermedad o infección. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente eficiente". La dosis estará determinada por la actividad de la célula dendrítica producida y el estado del paciente, así como el peso corporal o área superficial del paciente que va a tratarse. El tamaño de la dosis también estará determinado por la existencia, la naturaleza y el grado de cualquier efecto secundario adverso que acompañe a la administración de una célula particular en un paciente particular. Al determinar la cantidad eficiente de la célula que va a administrarse en el tratamiento o la profilaxis de enfermedades tales como cáncer (por ejemplo, melanoma metastásico, cáncer de próstata, etc.), el médico necesita evaluar los niveles circulantes en plasma, la toxicidad de CTL, la evolución de la enfermedad y la inducción de una respuesta inmunitaria frente a cualquier tipo celular introducido.

Antes de la infusión, se obtienen muestras de sangre y se conservan para su análisis. En general, se infunden al menos aproximadamente de 10⁴ a 10⁶ y normalmente, entre 10⁸ y 10¹⁰ células por vía intravenosa o por vía intraperitoneal a un paciente de 70 kg durante aproximadamente 60-120 minutos. Preferiblemente, se utilizan cifras de células de al menos 10⁷ para cada punto de vacunación. Las inyecciones pueden ser, por ejemplo, 4 veces repetidas en intervalos de 2 semanas y deben administrarse preferiblemente cerca de los ganglios linfáticos mediante inyecciones int radérmicas o subcutáneas. Pueden realizarse inyecciones de refuerzo tras una pausa de 4 semanas. Se monitorizan estrechamente los signos vitales y la saturación de oxigeno mediante oximetria de pulso. Se obtienen muestras de sangre 5 minutos y 1 hora tras la infusión y se conservan para su análisis. Se repite una nueva infusión de células aproximadamente cada mes durante un total de 10-12 tratamientos en un periodo de un año. Tras el primer tratamiento, pueden realizarse infusiones de manera ambulatoria según criterio del médico . Si se administra la nueva infusión de manera ambulatoria, se monitoriza al participante durante al menos 4 horas tras la terapia. Para la administración, pueden administrarse células de la presente invención a una velocidad determinada por la DL-50 (u otra medida de toxicidad) del tipo celular y los efectos secundarios del tipo celular a diversas concentraciones, tal como se aplica a la masa y salud general del paciente. La administración puede realizarse a través de dosis únicas o divididas. En algunos regímenes, los pacientes pueden recibir además opcionalmente una dosificación adecuada de un modificador de la respuesta biológica, incluyendo pero sin limitarse a las citoquinas I FNa, IFNγ, IL-2, IL-4, IL-6, TNF u otro factor de crecimiento de citoquinas, TGFβ antisentido, IL- 10 antisentido y similares.

En el caso de que se utilicen las células activadas para tratar tumores, las células pueden utilizarse solas o junto con otros regímenes terapéuticos, incluyendo, pero sin limitarse a, la administración de IL-2, otros compuestos quimioterápicos (por ejemplo doxi rubi ci na , vinblastina, vincristina, etc. ) , radioterapia, cirugía y similares. Tal como se indicó anteriormente, las células pueden, opcionalmente, expandirse en cultivo. Esta expansión puede lograrse mediante la estimulación repetida de las células T con los conjugados de la invención con o sin IL-2 o mediante crecimiento en medio que contiene IL-2 sola. Otros métodos de cultivo de células T (por ejemplo, con otras linfoquinas, factores de crecimiento u otras moléculas bioactivas) también están dentro del alcance de la invención.

IX. MÉTODOS PARA LA ADMINISTRACIÓN DE COMPUESTOS ACTIVOS TERAPÉUTICOS A CÉLULAS QUE EXPRESAN LOS MARCADORES CD4 , CD8 , CD19, CDIlC, F4/8 Y/O CD117

Los autores de la presente invención también han observado que los conjugados de PSM de la invención pueden unirse eficientemente a la superficie de un gran número de linfocitos B, macrófagos, células dendríticas CDlIc, linfocitos T CD4 y CD8 o de granulocitos y, en particular, pueden unirse a células que expresan los marcadores CD4, CD8, CD19, CDlIc, F4/8 o CD117. Este hallazgo abre la puerta a nuevas aplicaciones terapéuticas adicionales en las que puede administrarse un compuesto de interés a células que expresan uno o más de los marcadores anteriores. Los compuestos de interés incluyen compuestos terapéuticamente activos que van a dirigirse a células específicas así como compuestos citotóxicos que se requieren, en las que existe un número de células elevado de anómalo o las células muestran una actividad no deseada.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado (a continuación en el presente documento "conjugado no inmunogénico" ) que comprende

(i) una modulina soluble en fenol o una variante funcionalmente equivalente de la misma y

(ii) un compuesto biológicamente activo.

Se han descrito en detalle PSM adecuadas para su utilización en los conjugados no inmunogénicos de la invención en relación con los conjugados inmunogénicos.

La expresión "compuesto biológicamente activo" se define como un compuesto que puede prevenir o eliminar los síntomas de una enfermedad. La invención contempla inicialmente la utilización de cualquier compuesto terapéutico que es susceptible de modificación covalente sin perder sustancialmente su actividad biológica, de tal manera que puede conjugarse a PSM o a la variante funcionalmente equivalente de la misma. Por tanto, la invención contempla la utilización de pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, proteínas, polipéptidos , glicoproteínas, oligosacáridos, ácidos nucleicos y similares como componente terapéuticamente eficiente .

En una realización preferida, el compuesto biológicamente activo es un compuesto peptídico. En una realización todavía más preferida, el compuesto peptídico biológicamente activo forma una única cadena polipeptídica con la PSM. La invención también se refiere a un polinucleótido o construcciones génicas que comprenden una secuencia que codifica el conjugado no inmunogénico, a un vector que comprende dicho polinucleótido o construcción génica y a una célula huésped que comprende el polinucleótido, construcción génica o vector. Los vectores y las células huésped adecuados para expresar los conjugados no inmunogénicos son esencialmente los mismos que los utilizados para los conjugados inmunogénicos y por tanto, no es necesario explicarlos adicionalmente . En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado no inmunogénico de la invención asi como un polinucleótido que codifica dicho conjugado, un vector o una construcción génica que comprende dicho polinucleótido o una célula huésped que comprende dicho polinucleótido, vector o construcción génica junto con un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, para la administración a un paciente . La frase "vehículo farmacéuticamente aceptable" tal como se utiliza en el presente documento significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un relleno sólido o liquido, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, implicado en llevar o transportar los agentes objeto desde un órgano, o parte del cuerpo, hasta otro órgano, o parte del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maiz y almidón de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximet i 1 ce luí o s a sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) goma tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maiz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol, solutol y polietilenglicol ; (12) esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido alginico; (16) agua sin pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) disoluciones de tampón fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas tales como DMSO (dimetilsulf óxido) y sus derivados .

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por cualquier vía de administración adecuada, por ejemplo una vía oral, tópica, rectal o parenteral (incluyendo la vía subcutánea, intraperitoneal , intradérmica, intramuscular e intravenosa) .

Las formas farmacéuticas adecuadas para la administración oral incluyen cualquier composición sólida (comprimidos, pastillas, cápsulas, granulos, etc. ) o composición liquida (disoluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, etc. ) y pueden contener excipientes convencionales conocidos en el estado de la técnica, tales como agentes de unión, por ejemplo almíbar, goma arábiga, gelatina, sorbitol, goma tragacanto o polivinilpirrolidona; rellenos, por ejemplo lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina; lubricantes para la preparación de comprimidos, por ejemplo estearato de magnesio, disgregantes, por ejemplo almidón, polivinilpirrolidona, glicolato sódico de almidón o celulosa microcri s talina ; o agentes humectantes farmacéuticamente aceptables tales como laurilsulf ato de sodio.

Pueden prepararse composiciones orales sólidas por medio de métodos convencionales para el mezclado , llenado o preparación de comprimidos. Pueden utilizarse operaciones de mezclado repetidas para distribuir el principio activo a través de la totalidad de las composiciones utilizando grandes cantidades de agentes de relleno. Tales operaciones son convencionales en la técnica. Los comprimidos pueden prepararse, por ejemplo por medio de granulación en seco o en húmedo y opcionalmente pueden recubrirse según métodos bien conocidos en la práctica farmacéutica normal, particularmente con un recubrimiento entérico.

Las composiciones farmacéuticas también pueden adaptarse para la administración parenteral tal como disoluciones, suspensiones o productos liofilizados estériles en una forma farmacéutica unitaria adecuada. Pueden utilizarse excipientes adecuados tales como agentes de relleno, agentes tamponantes o tensioactivos . Las formulaciones mencionadas se prepararán utilizando métodos habituales tales como los descritos o a los que se hace referencia en la Farmacopea Española o la Farmacopea de los Estados Unidos y en textos de referencia similares. La administración de los compuestos o las composiciones utilizados en la presente invención puede obtenerse mediante cualquier método adecuado, tal como infusión intravenosa, preparaciones orales y administración intraperitoneal e intravenosa. No obstante, la vía de administración preferida dependerá del estado del paciente. Se prefiere la administración oral debido a la comodidad para el paciente y la naturaleza crónica de las enfermedades que van a tratarse.

Para su aplicación en terapia, las composiciones de la invención se encontrarán preferiblemente en forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir las composiciones de la invención tienen un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los excipientes farmacéuticamente aceptables y no incluyendo el material considerado que es tóxico a los niveles de dosificación normales .

Las cantidades terapéuticamente eficientes de los conjugados no inmunogénico s de la invención dependerán en general, entre otros factores, del individuo que va a tratarse, de la gravedad de la enfermedad que padece dicho individuo, de la forma de administración elegida, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben considerarse como guias para el experto en la materia y este último debe ajustar las dosis según las variables mencionadas anteriormente. No obstante, los conjugados pueden administrarse una o más veces al día, por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4 veces al día en una cantidad diaria total típica comprendida entre 1 y 200 mg/kg de masa corporal/día, preferiblemente 1-10 mg/kg de masa corporal/día. De la misma manera, puede administrarse un inhibidor de colina quinasa una o más veces al día, por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4 veces al día en una cantidad diaria total típica comprendida entre 1 y 200 mg/kg de masa corporal/día, preferiblemente 1-10 mg/kg de masa corporal/día.

Los conjugados no inmunogénicos pueden utilizarse en medicina y por tanto, la invención también se refiere a los conjugados no inmunogénicos, los polinucleótidos que codifican para dichos conjugados, el vector que comprende dicho polinucleótido o construcción génica, la célula huésped que comprende el polinucleótido, construcción génica o vector o las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos conjugados para su utilización en medicina.

Los conjugados no inmunogénicos de la invención son particularmente adecuados para la administración de compuestos biológicamente activos a aquellos tipos celulares para los que los conjugados muestran afinidad. Tal como se ha mostrado en el ejemplo 1, los conjugados pueden unirse a células que expresan CD4, CD8, CDlIc, CD19, F480 o CD117. En aquellos casos en los que el compuesto es citotóxico o puede inhibir genes supresores del crecimiento, los compuestos pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades en las que se produce una proliferación no deseada de uno o más tipos de las células mencionadas anteriormente. Sin embargo, los compuestos también pueden utilizarse para la administración de compuestos adecuados para restaurar una propiedad de cualquiera de los tipos celulares mencionados anteriormente. Los compuestos pueden o bien suministrar una actividad que falta a la célula o bien pueden inhibir un gen responsable de la desaparición de una propiedad dada de la célula.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por una proliferación no deseada o una actividad no deseada de una célula seleccionada del grupo de una célula positiva para CD4, CD8, CDlIc, CD19, F480 o CD117 o una combinación de las mismas, que comprende administrar a un paciente los polinucleótidos que codifican dichos conjugados, el vector que comprende dicho polinucleótido o construcción génica, la célula huésped que comprende el polinucleótido, construcción génica o vector o las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos conjugados. En una realización preferida, los conjugados no inmunogénicos comprenden un compuesto citotóxico y pueden utilizarse para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por una proliferación no deseada de células que expresan o CD4, CD8, CD19, CDlIc, F4/8 o CD117.

Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para (por ejemplo, destruye) células. Para una descripción de estas clases de fármacos que se conocen bien en la técnica, y sus mecanismos de acción, véase Goodman et al., Goodman y Gilman' s The Pha rma co 1 o gi ca 1 Basis Of Therapeutics, 8^a Ed., Macmillan Publishing Co., 1990. Se proporcionan técnicas adicionales relevantes para la preparación de inmunotoxinas de anticuerpo, por ejemplo, en Vitetta, Immunol. Today 14, 252 (1993) y el documento US 5194594. Los agentes terapéuticos adecuados para formar inmunocon j ugados útiles para la presente invención incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, actinomicina D, 1-deshidro-testosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol y puromicina, antimetabolitos (tales como metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5- fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina) , agentes alquilantes (tales como mecloretamina , tioepa, clorambucilo , melfalán, carmustina

(BSNU) , lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTlC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados del platino, tales como carboplatino ) , antibióticos (tales como dactinomicina (anteriormente, actinomicina) , bleomicina, daunorubicina (anteriormente, daunomicina) , doxorubicina, idarubicina, mitramicina, cal i cheami c i na , mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC) ) , toxina diftérica y moléculas relacionadas (tales como cadena de la difteria A y fragmentos activos de la misma y moléculas híbridas) , toxina ricina (tal como ricina A o una toxina de cadena de ricina A desglucosilada) , toxina del cólera, una toxina tipo Shiga (SLT- I, SLT-II, SLT-IIV) , toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina de la tosferina, toxina tetánica, inhibidor de la proteasa Bowman-Birk de soja, exotoxina de pseudomonas, alorina, saporina, modeccina, gelanina, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantinas, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, toxinas gelonina, mitogellina, restrictocina, fenomicina y enomicina. Agentes terapéuticos, que pueden administrarse en combinación con un anticuerpo tal como se describe en otra parte del presente documento, también pueden ser candidatos para restos terapéuticos útiles para la conjugación a un anticuerpo utilizado en la presente invención. Además, si el compuesto citotóxico es un polipéptido, éste incluye, sin limitación, una toxina enzimáticamente activa, o fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica; una proteína tal como factor de necrosis tumoral o interferón-gamma , o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleuquina-1 (IL-I) , interleuquina-2 (IL-2) , interleuquina-6 (IL-6 ) , factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) , factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) u otros factores de crecimiento y proteínas inductoras de apoptosis aisladas de mitocondrias .

Enfermedades en las que se desea destruir células positivas para CD4 son, por ejemplo, infección por VIH-I en la que y para promover la inhibición del crecimiento de células que expresan CD4 en aquellas situaciones en las que existe una actividad aumentada de las células CD4 frente a dianas u órganos propios tal como sucede en enfermedades autoinmunitarias tales como lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, artrosis, artritis crónica juvenil, una espondiloartropatía, esclerosis sistémica, una miopatía inflamatoria idiopática, síndrome de Sjógren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmunitaria, trombocitopenia autoinmunitaria, tiroiditis, diabetes mellitus, enfermedad renal mediada por el sistema inmunitario, una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central o periférico, po 1 i neu r opat i a de smi e 1 i n i z ant e s idiopática, síndrome de Guillain-Barre, una polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, una enfermedad h ep a t ob i 1 i a r , hepatitis activa crónica infecciosa o autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, colangitis esclerosante, enfermedad inflamatoria del intestino, celiaquía, enfermedad de Whipple, una enfermedad de la piel mediada por el sistema inmunitario o autoinmunitaria, una enfermedad de la piel vesicular, eritema multiforme, dermatitis de contacto, psoriasis, una enfermedad alérgica, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a alimentos, urticaria, una enfermedad inmunológica del pulmón, neumonías eosinófilas, fibrosis pulmonar idiomática, neumonitis por hipersensibilidad, una enfermedad asociada a trasplante, rechazo de injerto o enfermedad de injerto contra huésped.

Las enfermedades caracterizadas por una proliferación no deseada o una actividad no deseada de una célula positiva para CD8 incluyen enfermedades mediadas por el sistema inmunitario que resultan de respuestas inmunitarias frente a auto-antígenos o de respuestas inapropiadas frente a antígenos extraños inocuos (es decir infección con virus no citopáticos o con virus que imitan a auto-antígenos) .

La expresión "enfermedad autoinmunitaria", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un estado en un sujeto caracterizado por lesión celular, de tejidos y/o de órganos producida por una reacción inmunológica del sujeto a sus propias células, tejidos y/u órganos. Los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de enfermedades autoinmunitarias que pueden tratarse con la población de células de la invención incluyen alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolipídico, enfermedad de Addison autoinmunitaria, enfermedades autoinmunitarias de la glándula suprarrenal, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, ovaritis y orquitis autoinmunitarias, trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatia, celiaquia-dermatitis , síndrome de disfunción inmunitaria y fatiga crónica (CFIDS) , po 1 i neur opat ía de smiel ini zante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, enfermedad por crioaglutinina, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia- fibromiositis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, Guillain-Barre , tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) , neuropatía IgA, artritis juvenil, liquen plano, enfermedad de Méniére, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo 1 o mediada por el sistema inmunitario, miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, panarteritis nudosa, policondritis , síndromes poliglandulares , polimialgia reumática, polimiositis y de rmatomi o s i t i s , agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, sarcoidosis, esclerodermia, esclerosis sistémica progresiva, síndrome de Sjogren, síndrome de Goodpasture, síndrome del hombre rígido, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis tales como vasculitis con dermatitis he rpe t i f o rme , vitíligo, granulomatosis de Wegener, etc.) .

Las enfermedades que resultan de respuestas inapropiadas frente a antígenos extraños inocuos (es decir infección con virus no citopáticos o con virus que imitan a auto-antígenos) incluyen enfermedad neurológica inducida por VIH-I, esclerosis múltiple mediada por el virus de la encefalomielitis murina de Theiler (VEMT) , miastenia grave inducida por VHS, autoinmunidad frente a los islotes pancreáticos inducida por rotavirus y similares. Enfermedades caracterizadas por una proliferación no deseada o una actividad no deseada de una célula positiva para CDlIc incluyen cualquier tumor maligno de linaje B tales como neoplasias linfoides, linfoma no de Hogdkin, linfoma folicular, linfoma difuso de células B grandes, linfoma linfocitico crónico, tricoleucemia, leucemia prolinfocitica T, linfoma de células del manto, leucemia tipo Burkitt, mieloma múltiple, leucemia linfática aguda y similares.

La invención se describe a modo de los siguientes ejemplos que han de interpretarse como meramente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Los péptidos de la modulina pueden unirse a la superficie celular de los esplenocitos . Análisis de las subpoblaciones capaces de unirse a péptidos derivados de la modulina .

Material y métodos: Los péptidos utilizados en los presentes ensayos se muestran en la tabla 3.

Se llevaron a cabo ensayos de unión utilizando o bien esplenocitos (figura 1, paneles A B, D, E y G) o bien células dendriticas derivadas de médula ósea (figura 1, paneles C y F) . Se fijaron las células mediante una incubación con una disolución de glutaraldehido al 0,4% durante 15 minutos a 4°C. Se incubaron 5 x 10⁵ células fijadas en presencia de CFSE αMod- SIINFEKL 20 μM (figura 1, paneles A, B y C) o CFSE γMod-SIINFEKL (figura 1, paneles D, E, F y G) . En algunos ensayos, y para estudiar la especificidad de unión al péptido marcado con CFSE, estas incubaciones se llevaron a cabo en presencia o ausencia de los péptidos sin marcar αMod-SIINFEKL, αMod-SIINFEKL o SIINFEKL (100 μM) (paneles B y E) . Además, se llevaron a cabo ensayos de unión utilizando el péptido marcado con CFSE, CFSE-OVA (235-264 ), como control negativo (figura 1, paneles A, C, D y F) . Tras 30 minutos de incubación a 4⁰C se realizaron dos lavados con PBS y se realizó al análisis por citometria de flujo del mareaje realizado. En algunos experimentos (figura IG) se realizaron dobles tinciones utilizando anticuerpos anti-CD4, CD8, CDlIc, CD19, F480 o GR1 (CD117) marcados con ficoeritrina (Pharmingen) junto con el péptido CFSE-γMod-SI INFEKL . En estos casos, el mareaje con los anticuerpos específicos se realizó antes de la fijación de las células con glutaraldehído . Tal como se mencionó anteriormente, en algunos casos los experimentos de mareaje con el péptido CFSE γMod-SIINFEKL o CFSE αMod-SI INFEKL o con el péptido control CFSE-OVA (235-264 ) se llevaron a cabo en células dendríticas de médula ósea obtenidas tal como se indica a continuación (figura IC y IF) .

Resultados y discusión

Una de las características que puede favorecer la actividad de un inmunógeno para inducir una respuesta inmunitaria eficiente es su capacidad de ser capturado eficientemente por las células presentadoras de antígeno. Los péptidos de la modulina podrían tener esa capacidad ya que se ha descrito que pueden activar la vía de señalización TLR2 y las células presentadoras de antígeno expresan esta molécula en su superficie. Sin embargo, no existe ninguna evidencia experimental de que los péptidos de la modulina se unan a la superficie de las células presentadoras de antígeno. Por este motivo, se sintetizó el péptido CFSE γMod-SIINFEKL, que contiene la secuencia de la modulina gamma unida al determinante T citotóxico SIINFEKL de la ovoalbúmina y se le unió el colorante fluorescente CFSE (Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) , éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína) al extremo amino-terminal del péptido con el fin de analizar por citometria de flujo su capacidad de unirse a la superficie de las células. Por tanto, tal como se muestra en la figura 1, se encontró que el péptido CFSE-αMod-SIINFEKL se une a esplenocitos . De hecho, los esplenocitos incubados con CFSE-αMod-SIINFEKL mostraron una mayor intensidad de fluorescencia que la encontrada en esplenocitos incubados con el péptido irrelevante marcado con CFSE, CFSE-OVA (235-264 ) (figura IA) . Esta señal positiva se inhibió significativamente mediante la adición del péptido no marcado αMod-SIINFEKL pero no por el péptido SIINFEKL

(figura IB), lo que sugiere que la señal obtenida con CFSE αMod- SIINFEKL es especifica y está relacionada con la presencia de α- modulina. También se observó claramente esta capacidad de unión de CFSE αMod-SIINFEKL cuando se utilizaron células dendriticas derivadas de médula ósea (figura IC) . Se encontraron resultados similares cuando se utilizó el péptido CFSE-γMod-SIINFEKL (figuras IC, D y E) . En este caso, se encontraron dos picos de fluorescencia (uno con fluorescencia baja (baja) y otro con fluorescencia alta (brillante) (figura ID) . La fluorescencia obtenida con el péptido irrelevante marcado con CFSE, CFSE-OVA (235-264), fue similar al pico fluorescente bajo observado con CFSE γMod-SIINFEKL (figura ID) lo que sugiere que este segundo pico se debía a una unión no específica. La incubación con el péptido γMod-S I INFEKL que no contiene CFSE y que por tanto compite con el péptido CFSE γMod-SIINFEKL por la unión a su receptor, redujo la fluorescencia brillante (véase la línea de puntos en la figura IE) . Sin embargo, la incubación con el péptido SIINFEKL no afectó a esta señal, lo que indica que la unión del péptido a la superficie de la célula se debía a la acción de la secuencia de γ-modulina.

Como en el caso del péptido CFSE αMod-SIINFEKL, el péptido CFSE γMod-SIINFEKL también pudo teñir células dendriticas derivadas de médula ósea (figura IF) . Cuando se realizaron dobles tinciones utilizando anticuerpos anti-CD4, CD8, CDlIc, CD19, F480 o GR1(CD117) marcados con ficoeritrina (Pharmingen) junto con el péptido CFSE-γMod-SI INFEKL (figura IG) , se encontró que aproximadamente el 24, 4% de células CD4 + , el 17, 8% de células CD8+, el 62, 1% de células CDlIc, el 52, 8% de células CD19, el 66, 2% de células F418 y el 27, 3% de células GRl+ se tiñeron con el péptido CFSE γMod-SIINFEKL, indicando que la γ- modulina se une a estas células.

Estos datos indican que la α-modulina y la γ-modulina se unen específicamente a algunos subtipos celulares y en particular a células presentadoras de antígeno, una propiedad que puede ser muy útil en la vehiculización de antígenos a estas células a la hora de activar una respuesta celular específica frente al antígeno.

Ejemplo 2. Los péptidos de α-modulina y γ-modulina activan la maduración de las células dendríticas y la presentación antigénica .

Material y métodos

Generación de las células dendríticas a partir de médula ósea.

Se hicieron crecer células dendríticas de células de médula ósea. Tras lisar los eritrocitos con tampón de lisis ACK, se lavaron las células y se retiraron linfocitos y granulocitos mediante incubación con una mezcla de anticuerpos frente a CD4

(GKl; ATCC, Manassas, VA) , CD8 (53.6.72; ATCC) , Ly-6G/Grl (BD-

Pharmingen; San Diego CA) y CD45R/B220 (BD-Pharmingen) , seguido de complemento de conejo. Las células restantes se hicieron crecer en 12 placas de cultivo en medio completo con 10⁶ células/ml complementado con 20 ng/ml de mGM-CSF y 20 ng/ml de mIL-4 (ambos de Peprotech; Londres , GB) . Cada 2 días se sustituía el medio con medio fresco que contenía citoquinas. Se recogieron células dendríticas no adherentes el día 7, y se cultivaron en presencia o ausencia de 50 μM de los péptidos de la modulina o de 1 μg/ml de LPS (Sigma) y se incubaron durante 48 horas a 37°C y un 5% de CO₂. Después de este periodo, se aislaron las células y se incubaron con los anticuerpos anti- IAb, CD54 y CD86 (Pharmingen) . En experimentos paralelos, se incubaron las células dendríticas con los estímulos indicados durante 16 horas tras las cuales se analizó la expresión del ARN mensajero para las moléculas p40 de la IL-12 y del TNF-α.

Análisis de la expresión de ARN mensajero para p40 de IL-12 y TNFa.

Se extrajo el ARN total de las células dendríticas incubadas durante 16 horas con los diferentes estímulos indicados anteriormente, utilizando la solución de lisis Nucleic Acid Purification Lysis Solution (Applied BioSystems, Foster City, CA) y el sistema semiautomático ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied BioSystems) . El tratamiento con ADNasas, la transcripción inversa y la PCR cuantitativa a tiempo real para la subunidad p40 de la IL-12 y el TNF-alfa se realizaron tal como se describió previamente y utilizando cebadores específicos para estas citoquinas (Zabala, M., et al 2007. J Hepatol 47:807-815.) Los valores de ARN mensajero se calcularon utilizando la fórmula: 2^Δct, donde ΔCt indica la diferencia en el ciclo de umbral entre el gen de control (β actina) y los genes en estudio.

Regulación por incremento de marcadores de maduración .

Se midió la expresión de marcadores de maduración de DC mediante citometría de flujo. Se recogieron DC y se preincubaron con un AcM de rata anti-CD16/32 (clon 2.4G2, BD Pharmingen) durante 15 min., para bloquear la unión no específica de anticuerpos primarios. Tras esta incubación inicial, se tiñeron las células con los anticuerpos primarios a 4°C durante 15 min., se lavaron y se adquirieron en un citómetro FACSscan (BD Biosciences, San Diego, CA) y se analizaron utilizando el software CeIl Quest (BD Biosciences) . Los anticuerpos utilizados fueron: anti-H-2K^b (clon AF6-88.5) , anti-CD54 (clon 3E2) , anti- CD86 (clon GLl) y anti-CDllc (clon HL-3), todos de BD Pharmingen . Ensayos de presentación antigénica.

Se cultivaron las células dendríticas derivadas de médula ósea en presencia o ausencia de 10 μM de los péptidos indicados (figura 3) . Cuarenta horas más tarde, se lavaron las células y se distribuyeron en placas de 96 pocilios a diferentes concentraciones y se incubaron en presencia de 10⁵ células T/pocillo obtenidas de ratones transgénicos OT-I (que expresan un receptor T especifico para el péptido SIINFEKL de la ovoalbúmina) . Setenta y dos horas más tarde, se añadió timidina tritiada a los cultivos y seis horas más tarde se recogieron las células y se analizó la timidina incorporada en un contador de centelleo (Topcount Packard) .

Resultados y discusión. La maduración de células dendriticas (DC) es un requisito para la estimulación óptima de una respuesta de linfocitos T. Cuando se produce la maduración, las APC aumentan la expresión de moléculas de superficie como las MHC de clase I (H2Kb en este modelo) y clase II (IAb en este modelo) , y las moléculas CD40, CD80 y CD86. Por tanto, se analizó si los péptidos derivados de la α-modulina o la γ-modulina EDA-SIINFEKL podrían inducir la maduración de células dendríticas derivadas de médula ósea. Para ello, se cultivaron las células dendríticas tal como se indicó en materiales y métodos y se analizaron por citometría de flujo para observar la expresión de estos marcadores de maduración. Puede observarse en la figura 2C que la adición de α-modulina o γ-modulinas induce la sobreexpres ion de algunos de estos marcadores. Específicamente, la α-modulina activa la expresión de CD54, CD86 y la molécula IAb, mientras que la γ-modulina promueve la expresión de CD54 y la molécula IAb. Estos datos sugieren que las modulinas podrían tener un efecto potenciador en la activación de una respuesta inmunitaria frente a un antígeno, mediante la estimulación de la maduración de las células dendríticas. Cuando se analizó la expresión de ARN mensajero para las citoquinas IL-12 y TNF-alfa (figura 2A y 2B respectivamente) , se encontró que en cierta medida, las modulinas α y γ podían aumentar la expresión de estos ARNm (p<0,05 en ambos casos, en comparación con la expresión de ARNm de DC cultivadas con modulinas α o γ o con medio de cultivo solo) , sugiriendo que pueden promover la secreción de estas citoquinas pro- inflamatorias que podrían favorecer la activación de una respuesta inmunitaria frente a un antígeno. Una vez analizada la capacidad de los péptidos de la modulina para unirse a la superficie de la célula dendrítica y activar su maduración, se estudió si podía favorecer la presentación antigénica del péptido SIINFEKL al que estaban unidos covalentemente . Así, cuando se incubaron las células dendríticas con 10 μM de los péptidos αMod-SIINFEKL, γMod- SIINFEKL, OVA(235-364) , αMod, γMod o SIINFEKL solo y se utilizaron estas células como células presentadoras para activar la proliferación de linfocitos T de ratones OT-I (y por tanto con un receptor de la célula T específico para el péptido SIINFEKL), se encontró que los linfocitos T proliferan mejor cuando se han incubado las células dendríticas con SIINFEKL solo, lo que no requiere tratar el antígeno ya que se une directamente a moléculas MHC de clase I en la superficie de las células dendríticas. Sin embargo, cuando se comparan estos péptidos que requieren tratamiento del antígeno (péptidos más largos) , se encontró que las células dendríticas incubadas con αMod-SIINFEKL o con γMod- S I INFEKL estimulaban la proliferación de células T OT-I de manera significativamente mejor que el péptido OVA(235-264) (p<0, 05) . Por tanto, tal como puede observarse en la figura 2D, la presencia de α-modulina o γ- modulina favorece el procesamiento y presentación de SIINFEKL por las células dendríticas a linfocitos T específicos de SIINFEKL, mejorando su proliferación. Ejemplo 3A. La inmunización con los péptidos derivados de las modulinas unidos al antigeno citotóxico SIINFEKL y en combinación con algunos ligandos de TLR induce la activación de una respuesta citotóxica frente al antigeno. Esta respuesta citotóxica es de larga duración y protege a los ratones frente a la inyección subcutánea de las células tumorales EG.70VA.

Material y métodos.

Medición de la inducción in vivo de linfocitos T citotóxicos (CTL) (In vivo killing) y de células productoras de IFN-γ después de la inmunización (ELISPOT) .

Se inmunizaron por via intravenosa ratones C57BL6 con 5 nmoles de los péptidos indicados en combinación con 50 μg del ligando de TLR3 poli I:C. En algunos casos, se inmunizaron los péptidos en presencia de ligandos de TLR2 (peptidoglicano) , TLR4

(LPS o la proteina EDA) o TLR9 (CpG) . Siete dias después de la inmunización, se inyectó por via intravenosa a los ratones una mezcla de 5 x 10⁶ esplenocitos de los cuales la mitad se hablan marcado previamente con una dosis de C 0,25 μM y la otra mitad con CFSE 2,5 μM y el péptido SIINFEKL (10 μg/ml) . Al dia siguiente, se sacrificaron los ratones y se analizaron los esplenocitos por citometria de flujo para cuantificar el número de células con alto mareaje de CFSE con respecto a las células con bajo mareaje de CFSE. De esta manera puede calcularse el porcentaje de lisis celular de las células incubadas con el péptido citotóxico SIINFEKL en un experimento denominado "in vivo killing".

Para el análisis de las células productoras de IFN-γ en presencia de SIINFEKL e inducidas in vivo por las inmunizaciones, se realizaron experimentos de ELISPOT utilizando un kit de BD-pharmingen (San Diego, CA) y de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las placas (Multiscreen HTS, Millipore, Bedford, MA) incubadas durante la noche con el anticuerpo anti-IFN-γ, se bloquearon durante 2 horas con medio HL-I (Biowhittaker, Verviers, Bélgica) que contenia un 10% de suero de caballo. Así, se incubaron 5 x 10 esplenocitos por triplicado en ausencia o en presencia de los antígenos a 37°C y un 5% de CO₂. Al día siguiente, se lavaron las placas con PBS y se incubaron con anticuerpo biotinilado anti-IFN-γ (2 mg/ml) . Tras dos horas, se lavaron las placas y se incubaron con una dilución 1/100 de estreptavidina-peroxidasa . Una hora más tarde, se lavaron los pocilios y se revelaron utilizando el conjunto de sustrato AEC (BD-Pharmingen) . Se paró la reacción colorimétrica con agua destilada y se cuantificó el número de puntos utilizando un lector automático de ELISPOT (CTL, Aalen, Alemania) .

Protección frente al desafío con células tumorales EGl que expresan la proteína OVA Se inmunizaron por vía subcutánea ratones C57BL6 con 5 nmol de los péptidos indicados en combinación con poli I:C. Siete días tras la inmunización, se inyectaron por vía subcutánea a los ratones 5 x 1 O⁵ o 5 x 10⁷ células EG7OVA. En algunos experimentos, se expusieron en primer lugar los ratones por vía subcutánea a 5 x 10⁵ células y cuando los tumores alcanzaron 5 mm de diámetro, se trataron con el péptido indicado. El crecimiento del tumor se controló con un calibre. Se sacrificaron los ratones cuando el tumor alcanzó un volumen superior a 4 cm³. Se representa el diagrama de Kaplan-Meier de la supervivencia de los ratones para cada inmunógeno.

Resultados y discusión.

Tal como se muestra en la figura 3, la inmunización de los ratones C57BL/6 con los péptidos α-modulina-SIINFEKL o γ- modulina-SIINFEKL puede inducir unas potentes respuestas citotóxicas (figura 3B) y la producción de IFN-γ (figura 3A) en respuesta a la estimulación con el péptido SIINFEKL. Sin embargo, el péptido SIINFEKL libre no puede activar estas respuestas, como tampoco puede la combinación de los péptidos α- modulina o γ-modulina con SIINFEKL cuando este último no está unido a ellos covalentemente . También se estudió la capacidad de estos inmunógenos para activar una respuesta de larga duración. Cuando se analizó la respuesta inducida 60 días después de la inmunización, se encontró que los péptidos derivados de la modulina α o γ unidos a SIINFEKL podían inducir una respuesta celular específica (figura 3C, células productoras de IFN-γ medidas por ELISPOT y figura 3D, células con capacidad lítica medidas por in vivo killing) que no puede inducir el péptido SIINFEKL en combinación con el adyuvante poli I:C. Estos resultados indican que la unión covalente de un determinante citotóxico a los péptidos de la modulina α o γ le confiere una propiedad especial crucial para la inducción de una respuesta celular citotóxica de larga duración frente al antígeno citotóxico. Esta propiedad, y según los resultados observados en las figuras anteriores, podría medirse por la capacidad de los péptidos de las modulinas de vehiculizar el antígeno hacia las células presentadoras. La unión del antígeno a las células presentadoras podría además favorecer su maduración y la presentación del determinante citotóxico de una forma más eficiente y ésto, junto con la ayuda de un adyuvante como el poli I:C, ligando de TLR3, podría potenciar enormemente la activación de la respuesta celular.

También se estudió el efecto de otros ligandos de TLR en combinación con péptidos derivados de la modulina sobre su capacidad de potenciar la activación de una respuesta citotóxica frente al péptido SIINFEKL. Tal como se muestra en la figura 4, la combinación de los péptidos de la modulina (αMod-SIINFEKL y γMod-S I INFEKL) con ligandos de TLR3 y TLR9, y en menor medida con ligandos de TLR4, tiene un efecto sinérgico sobre la activación de la respuesta inmunitaria. Estos datos sugieren que los péptidos de la modulina pueden combinarse con estos ligandos para el diseño de potenciales vacunas.

Una vez demostrada la capacidad de los péptidos derivados de las modulinas para activar una respuesta citotóxica frente al antígeno SIINFEKL, se evaluó la capacidad de estos inmunógenos para proteger a los ratones de la inyección de células tumorales EG70VA. Asi, se inmunizaron ratones por via subcutánea con 5 nmol de los péptidos indicados en la figura 5A y 5B en combinación con el adyuvante poli I: C. Siete dias tras la inmunización, se inyectaron por via subcutánea 5 x 10⁵ (en A) o 7 x 10⁵ (en B) células EG7OVA. Se observó que la inmunización con los péptidos αMod-SI INFEKL (figura 5A) o γMod-SI INFEKL (figura 5B) protegía a los ratones del crecimiento tumoral . Todos los ratones inmunizados con SIINFEKL o con solución salina desarrollaron tumores. También se sometió a prueba la capacidad de péptidos derivados de la modulina para tratar ratones que llevaban tumores subcutáneos. En este caso, se trataron ratones que llevaban tumores de EG7OVA con αMod-SIINFEKL más poli I: C, γMod + SIINFEKL (no unidos covalentemente) más poli I : C, SIINFEKL más poli I:C, más poli I:C solo o con solución salina y se evaluó el crecimiento del tumor. Se encontró que el tratamiento de ratones con αMod-SIINFEKL podia rechazar el tumor en aproximadamente el 38% de los ratones en comparación con el 0% para el resto de los tratamientos (figura 6, p<0, 05) . Estos datos sugieren que los péptidos de la modulina alfa o gamma pueden utilizarse como vehículos y adyuvantes en el desarrollo de estrategias de vacunación frente a patógenos o frente al cáncer .

A continuación, se sometió a prueba la capacidad inmunoestimulante de péptidos derivados de la modulina con otro antigeno diferente de SIINFEKL con el fin de comprobar si los resultados también podían reproducirse . Se acoplaron los péptidos derivados de la modulina a un determinante de célula T citotóxica bien caracterizado de la proteina no estructural NS3 del virus de la hepatitis C (el péptido 1073-1081 de NS3 limitado por HLA- A2 , secuencia CVNGVCWTV (SEQ ID NO:50) ) . Asi, se sintetizaron los péptidos αMod-1073, γMod-1073 y δMod-1073 asi como el péptido plO73 solo . Se inmunizaron ratones transgénicos (que expresaban la molécula HLA_A2 humana) con 5 nmoles del péptido correspondiente en presencia de poli I: C. Siete días tras la inmunización, se llevaron a cabo ensayos ELISPOT e in vivo killing tal como se describió anteriormente utilizando células diana pulsadas con péptido 1073. Tal como se muestra en la figura 7A y 7B, la presencia de α-Mod, γ-Mod así como de δ-Mod acoplados al péptido 1073 permitió la inducción de potentes respuestas inmunitarias de células T específicas para el péptido que no se encuentran cuando se inyecta a los ratones el péptido 1073 más poli I: C. De hecho, esos ratones inmunizados con δMod-1073, γMod-1073 y δMod-1073 tenían altos números de células productoras de IFNα específicos para el péptido 1073 (figura 7A) y altos niveles de actividad de CTL (figura 7B) .

En resumen, estos datos muestran que la unión de los péptidos de α-modulina, γ-modulina o δ-modulina a un antígeno favorece la vehiculi zación del antígeno hacia las células presentadoras de antígeno, promoviendo su maduración y la presentación antigénica. Esta propiedad permite que estos inmunógenos, en combinación con los ligandos de TLR3, 4 ó 9, induzcan in vivo potentes respuestas celulares citotóxicas frente al antígeno que pueden proteger a los ratones frente al crecimiento de células tumorales que expresen dicho antígeno o frente a células que expresan un antígeno viral.

Por tanto, los péptidos derivados de la modulina pueden constituir un vector muy adecuado para la inducción de respuestas celulares frente a un antígeno de interés. La construcción de proteínas de fusión basadas en estos péptidos supone una estrategia apropiada en los protocolos de vacunación frente a enfermedades tumorales o enfermedades causadas por agentes infecciosos.

Ejemplo 3b. La inmunización con el péptido αMod-E7 (49-57) en combinación con poli I :C induce una respuesta citotóxica específica frente al péptido E7 (49-57) y es capaz de curar a ratones que portan tumores subcutáneos TCl.

Material y métodos. En este apartado se utilizaron los péptidos:

Medición de la inducción in vivo de células productoras de IFN- γ después de la inmunización (ELISPOT) . Se inmunizaron por vía intravenosa ratones C57BL6 con 5 nmoles de los péptidos indicados en combinación con 50 μg del ligando de TLR3 poli I:C. Para el análisis de las células productoras de IFN-γ en presencia del péptido E7 (49-57) e inducidas in vivo por las inmunizaciones, los animales fueron sacrificados 7 días después de la inmunización y se realizaron experimentos de ELISPOT utilizando un kit de BD-pharmingen (San Diego, CA) como se indica más arriba y utilizando el péptido E7 (49-57) como antigeno .

Protección frente al desafio con células tumorales TCl que expresan la proteína El del virus HPVl 6 (papilomavirus humano 16)

Los ratones C57B/6 fueron inyectados subcutáneamente con 5 x 10⁵ células tumorales TC-I (que expresan la proteina E7 del virus HPV-I 6. Después de 25 días, cuando el tumor alcanza un diámetro de 8 mm, los ratones son tratados intravenosamente con PBS (B) , con el péptido E7 (49-57) más 50 μg/ml poli I:C (C) , o con el péptido αMod-E7 (49-57) más 50 μg/ml poli I : C (D) . Siete días después, los ratones recibieron una segunda inmunización de los mismos inmunógenos . El tamaño tumoral, presentado como el promedio de dos diámetros perpendiculares, fue medido a intervalos regulares utilizando un calibre. El número de ratones libres de tumor relativo al número total de animales por grupo es incluido para cada tratamiento.

Resultados y discusión. En los experimentos anteriores habíamos demostrado que los péptidos derivados de la modulina eran capaces de unirse a la superficie de los esplenocitos, activar la maduración de las células presentadoras de antígeno y actuar como vehículo para transportar antígenos, de manera que la inmunización con péptidos de fusión entre estos péptidos derivados de la modulina y un determinante T citotóxico como SIINFEKL en combinación con un ligando de TLR era capaz de inducir fuertes respuestas T citotóxicas in vivo y de proteger a los ratones tras el desafió de una célula tumoral EG7OVA que expresa el antígeno. Quisimos ver si este efecto terapéutico observado en el modelo tumoral EG7OVA era extrapolable a otros modelos tumorales. El carcinoma del cuello uterino es uno de los cánceres más comunes en mujeres en todo el mundo, y el quinto cáncer más frecuente en general, con una prevalencia estimada de 1,4 millones de casos. Hay evidencias consistentes de que la infección crónica del tracto genital por diversos tipos de papilomavirus humanos (HPV) mucosatrópicos causa cáncer del cuello uterino. Así, se ha postulado que HPV actúa como un iniciador de la carcinogénesis cervical y que la transformación maligna depende de la interacción con otros factores.

La vacuna contra el cáncer uterino del laboratorio estadounidense Merck, denominada Gardasil y usada en la actualidad, está indicada para la prevención de la infección por las cepas de virus HPV-16 y HPV-17 que están en el origen de aproximadamente el 70 por ciento de todos los casos de cáncer uterino. Esta vacuna se ha mostrado eficaz en la prevención de esta enfermedad cuando se administra a niñas en edades muy tempranas (11-12 años) . Sin embargo, esta vacuna no está indicada para el tratamiento del cáncer uterino, una vez que éste se ha manifestado.

La expresión de las proteínas oncogénicas de HPV E6 y E7 es necesaria para el inicio y el mantenimiento de la transformación maligna y la inmunidad celular a E7 que se han asociado a la resolución clínica y citológica de lesiones inducidas por HPV. Por este motivo hemos utilizado el modelo tumoral TCl, que expresa el antígeno E7 del HPV16 como antígeno tumoral . Una vez que los tumores han sido establecidos, llegando a un diámetro de 8 mm tras la inyección subcutánea de las células tumorales, los animales han sido vacunados con las diferentes alternativas. Hemos encontrado que aquellos animales que han recibido la inmunización con el péptido aMod-E7 (49-57 ) y poli I:C han eliminado por completo el tumor. Asi, 11 de 11 ratones tratados con este inmunógeno se curan, mientras que cuando los ratones son tratados con el péptido E7 (49-57) , solamente 4 de 11 ratones consiguen eliminar el tumor. Estos datos sugieren que el péptido de fusión αMod-E7 (49-57 ) , o péptidos similares basados en la fusión entre los péptidos derivados de la modulina y un antigeno de HPV pueden ser considerados para el desarrollo de una terapia alternativa contra el carcinoma de cuello de útero humano.

Ejemplo 4. La capacidad de los péptidos derivados de la modulina para inducir una respuesta celular frente al antigeno es independiente de la activación de la vía TLR2.

Material y métodos.

Medición de la inducción in vivo de linfocitos T citotóxicos (CTL) (in vivo killing) y de células productoras de IFNγ tras la inmunización (ELISPOT) en ratones KO en TLR2. Se inmunizaron ratones C57BL6 de tipo silvestre y ratones deficientes en TLR2 con el objetivo de estudiar la dependencia de TLR2 en la capacidad inmunoestimuladora de los péptidos derivados de la modulina. Asi, se inyectaron a los distintos ratones 5 nmoles de los péptidos indicados o PBS en combinación con 50 μg del ligando de TLR3 poli I:C. Siete días tras la inmunización, se inyectó a los ratones por vía intravenosa una mezcla de 5 x 10⁶ esplenocitos de los cuales la mitad se había marcado previamente con una dosis de C 0,25 μM y la otra mitad con CFSE 2,5 μM y el péptido SIINFEKL (10 μg/ml) . Al día siguiente, se sacrificaron los ratones y se analizaron los esplenocitos por citometría de flujo para cuantificar el número de células con alto mareaje de CFSE con respecto a las células con bajo mareaje de CFSE del mismo modo que en el ejemplo 3.

Para el análisis de las células productoras de IFN-γ en presencia de SIINFEKL e inducidas in vivo por las inmunizaciones, se realizaron experimentos de ELISPOT utilizando un kit de BD-pharmingen (San Diego, CA) y de acuerdo con las instrucciones del fabricante, del mismo modo que en el ejemplo 3.

Ensayos de unión

Se purificaron esplenocitos de ratón a partir de ratones C57BL/6 KO en TLR2 tras homogeneizar el bazo. Se fijaron las células por medio de una incubación con una disolución de glutaraldehido al 0,4% durante 15 minutos a 4°C. Se incubaron 5 x 10⁵ esplenocitos fijados en presencia de CFSE γMod-SI INFEKL, CFSE αMod-SIINFEKL o péptido control CFSE-OVA (235-264) 20 μM para mostrar la especificidad de unión. Tras 30 minutos de incubación a 4°C, se llevaron a cabo dos lavados con PBS y se analizó el mareaje realizado mediante citometria de flujo.

Resultados y discusión.

Como era de esperar, la inmunización con los péptidos αMod-SIINFEKL o con γMod-S I INFEKL puede inducir respuestas T citotóxicas frente a células diana incubadas con el péptido SIINFEKL cuando se inmunizan ratones C57BL/6 de tipo silvestre. Del mismo modo, se induce la activación de células productoras de IFN-γ especificas para el péptido SIINFEKL (figura 8B y 8A respectivamente) . Sin embargo, esta respuesta también se observa, sorprendentemente, cuando se inmunizan ratones que carecen de la molécula TLR2. De hecho, el nivel de respuestas encontrado es similar en ambos casos de ratones, sugiriendo que la molécula TLR2 no es responsable de la capacidad de los péptidos derivados de la modulina utilizados para favorecer la inducción de respuestas celulares frente al determinante T de SIINFEKL (figura 8) .

En consecuencia, cuando se llevan a cabo los ensayos de unión utilizando péptido marcado con CFSE, se encontró que los péptidos tanto CFSE αMod-SI INFEKL como CFSE αMod-SIINFEKL todavía conservaban la capacidad de unirse a la superficie de esplenocitos (figura 9) , sugiriendo que esta unión no está relacionada con la molécula TLR2.

Puede concluirse con estos experimentos que, aunque no se ha descrito en la bibliografía, los péptidos de la modulina activan la vía TLR2 , esta propiedad, si es cierta, no es necesaria para su capacidad inmunopotenciadora . Queda por descubrir el mecanismo de acción de estos péptidos para favorecer la inducción de respuestas celulares frente al antígeno al que van unidos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Conjugado que comprende

(i) una modulina soluble en fenol (PSM) o una variante funcionalmente equivalente de la misma y

(ii) uno o más péptidos antigénicos en el que los componentes (i) e (ii) están acoplados covalentemente y en el que el conjugado promueve una respuesta citotóxica hacia el péptido o péptidos antigénicos.

2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que la PSM se selecciona del grupo de SEQ ID NO: 1 a 10 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas.

3. Conjugado según la reivindicación 1 ó 2, en el que el componente (ii) forma una única cadena polipeptidica con el componente (i) .

4. Polinucleótido o construcción génica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un conjugado según la reivindicación 3.

5. Vector que comprende un polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 4.

6. Célula huésped que comprende un polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 4 o un vector según la reivindicación 5.

7. Composición que comprende, en conjunto o por separado,

(a) un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 4 , un vector según la reivindicación 5, una célula huésped según la reivindicación 6 y

(b) un segundo componente seleccionado del grupo de

(i) uno o más agonistas de los receptores tipo peaje,

(ii) uno o más anticuerpos agonistas de una molécula co-estimuladora

(iii) una o más citoquinas y (iv) cualquier combinación de los compuestos mencionados en (i) a (iii) .

8. Composición según la reivindicación 7, en la que el segundo agonista de los receptores tipo peaje se selecciona del grupo de un ligando de TLR3, un ligando de

TLR4 y un ligando de TLR9.

9. Composición según la reivindicación 8, en la que el ligando de TLR3 es poli I: C, el ligando de TLR4 es LPS o la proteina EDA y/o el ligando de TLR9 es CpG.

10. Método para obtener una célula presentadora de antigeno sensibilizada con antigeno, que comprende las etapas de

(i) poner en contacto una célula presentadora de antigeno con un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, un polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 4, un vector según la reivindicación 5, una célula huésped según la reivindicación 6 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 y

(ii) aislar la célula pre sentadora de antigeno sensibilizada con antigeno.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la célula presentadora de antigeno es una célula dendritica.

12. Célula presentadora de antigeno obtenida mediante los métodos según las reivindicaciones 10 u 11.

13. Preparación farmacéutica o vacuna que comprende un conjugado según las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido o construcción gé ni ca s egún l a reivindicación 4, un vector según la reivindicación 5, una célula huésped según la reivindicación 6, una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 o una célula presentadora de antigeno según la reivindicación 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 3, polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 4, vector según la reivindicación 5, célula huésped según la reivindicación 6, composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, composición farmacéutica o vacuna según la reivindicación 10 o célula presentadora de antigeno según la reivindicación 12 para su utilización en medicina .

15. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 3, polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 4, vector según la reivindicación 5, célula huésped según la reivindicación 6, composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, composición farmacéutica según la reivindicación 10 o célula presentadora de antigeno según la reivindicación 12 para su utilización en un método de inducción de una respuesta citotóxica hacia el péptido antigénico .

16. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 3, polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 4, vector según la reivindicación 5, célula huésped según la reivindicación 6, composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, composición farmacéutica según la reivindicación 10 o célula presentadora de antigeno según la reivindicación 12 para su utilización en un método de inducción de una respuesta citotóxica hacia una enfermedad infecciosa, una enfermedad alérgica o una enfermedad neoplásica .

17. Utilización de un conjugado según las reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 4, un vector según la reivindicación 5, una célula huésped según la reivindicación 6, una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en un método in vitro para promover la presentación del péptido o péptidos antigénicos por las células presentadoras de antigeno o para promover la maduración de las células presentadoras de antigeno.

18. Conjugado que comprende

(i) una modulina soluble en fenol (PSM) o una variante funcionalmente equivalente de la misma y (ii) un compuesto biológicamente activo en el que los componentes (i) y (ii) están acoplados covalentemente .

19. Conjugado según la reivindicación 18, en el que la PSM se selecciona del grupo de SEQ ID NO: 1 a 10 o una variante funcionalmente equivalente de las mismas.

20. Conjugado según las reivindicaciones 18 ó 19, en el que el componente (ii) es un compuesto peptidico que forma una única cadena polipeptidica con el componente (i) .

21. Polinucleótido o construcción génica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un conjugado según la reivindicación 20.

22. Vector que comprende un polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 21.

23. Célula huésped que comprende un polinucleótido o construcción génica según 22.

24. Preparación farmacéutica que comprende un conjugado según la reivindicación 18 a 20, un polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 21, un vector según la reivindicación 22 o una célula huésped según la reivindicación 23 y un vehículo farmacéuticamente aceptable .

25. Conjugado según la reivindicación 18 a 20, polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 21, vector según la reivindicación 22 o célula huésped según la reivindicación 23 o preparación farmacéutica según la reivindicación 24 para su utilización en medicina.

26. Conjugado según la reivindicación 18 a 20, polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 21, vector según la reivindicación 22 o célula huésped según la reivindicación 23 o preparación farmacéutica según la reivindicación 24 para su utilización en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por una proliferación no deseada o una actividad no deseada de una célula seleccionada del grupo de una célula positiva para CD4, CD8, CD19, CDlIc, F4/8 o CD117 o una combinación de las mismas .

27. Conjugado según la reivindicación 18 a 20, polinucleótido o construcción génica según la reivindicación 21, vector según la reivindicación 22 o célula huésped según la reivindicación 23 o preparación farmacéutica según la reivindicación 24 en los que la enfermedad caracterizada por una proliferación no deseada o actividad no deseada de una célula seleccionada del grupo de una célula positiva para CD4, CD8, CD19, CDlIc, F4/8 o CD117 es una enfermedad autoinmunitaria, una infección retroviral de una célula positiva para CD4, una enfermedad que resulta de una respuesta inmunitaria frente a un autoantigeno inducido por un agente foráneo inocuo y un cáncer del linaje B.