WO2010058057A1 - Lacasas de alto potencial redox obtenidas por evolución dirigida - Google Patents

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WO2010058057A1
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PCT/ES2009/070516
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Susana CAMARERO FERNÁNDEZ
Ana Isabel CAÑAS PORTILLA
Ángel MARTÍNEZ FERRER
Francisco José PLOU GASCA
Antonio Ballesteros Olmo
María Jesús MARTÍNEZ HERNÁNDEZ
Éric RECORD
Marcel Asther
Miguel Alcalde Galeote
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12Y110/03002—Laccase (1.10.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0061—Laccase (1.10.3.2)

Definitions

  • the invention is within the field of molecular biology, recombinant DNA technology and biotechnology. Specifically it refers to lacasa-like oxidases enzymes improved in their functional expression and catalytic activity, their uses and the process for obtaining them. Functional expression and improvement of laccase activity is carried out in eukaryotic Saccharomyces cerevisiae cells through a process of directed molecular evolution. Said enzymes can be used as catalysts in industrial processes related to the transformation of lignocellulosic biomass to obtain biofuels or the production of wood and paper products with new properties, for the food sector, textile production and the chemical sector, as well as for the bioremediation of effluents and environmental pollutants.
  • Lacases (EC 1.10.3.2) are a group of oxidases widely distributed in higher plants and fungi, although they have also been described in some bacteria and even in insect cuticles (Mayor, 2007. In: Industrial enzymes. Structure, function and applications Ed. Polaina, J. and MacCabe, AP. Springer, Heidelberg (Germany), pp. 459-474). They belong to the family of blue multicore oxidases (together with ascorbate oxidase and ceruloplasmin), and are generally presented as extracellular monomeric glycoproteins.
  • Lacases individually, catalyze the oxidation of a broad spectrum of aromatic organic substances. Among them are ortho and para-diphenols, methoxy-substituted phenols, benzenethiols, hydroxyindoles, 1-naphthol and syringaldazine (Gianfreda et al., 1999. Bioremediation Journal 3: 1-25). The resulting free radicals suffer different reactions depending on their structure and reaction conditions. Free radical coupling generating dimeric or polymeric products and oxidative decarboxylations are the most frequent reactions. Also inorganic / organic metal compounds are lacquer substrates. Mn 2+ is oxidized to Mn 3+ and also Fe (EDTA) 2 " is accepted by the enzyme (Thurston, 1994. Microbiology-UK 140: 19-26).
  • the lacquers contain a type 1 copper (T1) where oxidation of the reducing substrate takes place, and a trinuclear center or cluster with three copper, a T2 and two T3, where the reduction of O2 takes place.
  • T1 type 1 copper
  • T2 trinuclear center or cluster with three copper, a T2 and two T3, where the reduction of O2 takes place.
  • the reaction mechanism must function as a battery, storing electrons from individual oxidation reactions to reduce molecular oxygen and produce water (Davies, 2002. Lacease. In: Handbook of Metallproteins. (Ed A. Messercschimdt et al), pp. 1359-1368 John Wiley and Sons, LTD, New York).
  • the formal redox potential (E 0 ' ) of the laccases has a direct relationship with the energy required to start an electron from the reducing substrate, constituting one of the fundamental characteristics of these enzymes.
  • the catalytic behavior of the lacquers on most of the reducing substrates depends on the E ° ' in the Cu T1 (electron acceptor).
  • lacquers with a higher E ° ' n are of special interest in biotechnology because they are capable of oxidizing substrates with higher E ° ' such as certain polycyclic aromatic hydrocarbons or various synthetic organic dyes.
  • High-redox potential lacquers - from white rot basidiomycete fungi - have enormous biotechnological potential due to their broad substrate specificity (they oxidize phenols, amines, thiols, anthracene, etc.), and their low application requirements (only require oxygen , which is transformed into water during the reaction). When they act on the lignin polymer (or phenolic type compounds) they can catalyze both degradation and polymerization activities. In addition, their range of substrates can be extended to non-phenolic compounds more difficult to degrade using redox mediators, of natural or synthetic origin, in the called lacasa-mediator systems (Camarero et al., 2005. Appl. Environ. Microb. 71: 1775-1784).
  • lacquers of high redox potential can be used in practically all of the paper products production chain: the production of paper pulp, chlorine-free bleaching of pastes, the elimination of pitch or the treatment of effluents
  • two more emerging research areas are a) the design of lignocellulosic materials with new resistance and stability properties by grafting phenolic compounds catalyzed by lacasa, in the so-called "functionalization of cellulose fibers"; and b) the use of lacquers for the improvement in the adhesion of wooden boards (by means of the enzymatic coupling in situ of the lignin), without the need to use toxic adhesives based on formaldehyde.
  • lacquers find applications in the following sectors (Xu, 2005. Industrial Biotechnology 1: 38-50): i) The food industry: processing of beverages or bakery products. ii) The textile industry: degradation (detoxification) of the effluent dyes or bleaching of fabrics (washing the jeans stone). iii) Nanobiotecology: a) as detectors of phenols, oxygen, azides, morphine, codeine, catecholamines or flavonoids in the preparation of biosensors for clinical and environmental analyzes; and b) elaboration of fuel biopiles that offer clean electric energy (without using fossil fuels) by means of immobilizing laccases in the cathode.
  • Bioremediation degradation of PAHs, AOX compounds, etc.
  • Chemical synthesis a) production of complex polymers (eg polytecol for chromatography resins); b) synthesis of pharmacological agents: antitumor agents (eg viblastin), new derivatives antibiotics (eg of cyclosporine A), or dyes (Suberasa® de Novozymes); c) cosmetics: hair dyes formulated with lacasa.
  • lacquers at the industrial level requires robust expression systems that provide high levels of active enzyme.
  • heterologous expression systems enables the production of lacases from different sources in the same host, as well as new variants with improved properties with respect to the wild enzyme.
  • cerevisiae can be significantly increased by means of directed molecular evolution techniques, which allows the design of new enzymatic functions that do not exist in natural environments or the improvement of certain properties of the enzyme (Arnold, 2001 Nature 409: 253-257).
  • This methodology recreates in the laboratory the key processes of natural evolution (mutation, recombination and selection) so that it is possible to design enzymes of great scientific and technological interest.
  • the selected genes to successive cycles of molecular evolution, the different beneficial point mutations will accumulate and combine until the desired property is acquired, which is exponentially improved, generation after generation.
  • the production of the Myceliophtora thermophila ascomycete house in S. cerevisiae was increased up to 18 mg / L (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987-995. 2003).
  • E. coli is the host organism most frequently used in the heterologous functional expression of the genes encoding the protein of interest, the different use of codons, and Ia Inability to make the post-translational modifications necessary for the correct secretion of the mature protein (such as proteolytic processing or glycosylations) can cause an inappropriate folding of the protein that is accumulated in inclusion bodies, preventing its functional expression. This is especially true for fungal laccases for which their functional expression in E. coli has not yet been achieved. Some of these problems can be avoided if these genes are expressed in eukaryotic hosts whose cellular machinery is closer to the native one, as is the case with yeasts.
  • Saccharomyces cerevisiae is of great interest since it has the ability to glycosylate and secrete the proteins to the extracellular environment (which in many cases prevents intermediate steps of cell lysis) and has a high transformation efficiency.
  • making use of a suitable episomic vector does not integrate the plasmid into its genome, thus facilitating its subsequent manipulation.
  • Another very interesting advantage from an evolutionary point of view is its high frequency of DNA recombination, which unlike E. coli allows the construction of libraries in vivo through the homologous recombination of different genes (known as in vivo shuffling DNA or "barajeo").
  • a polynucleotide encoding the polypeptide whose amino acid sequence is selected from the list comprising: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 29.
  • the polynucleotides encoding the amino acid sequence polypeptides SEQ ID NO: 1, the SEQ ID NO: 3, the SEQ ID NO: 5, the SEQ ID NO: 7, the SEQ ID NO: 9, the SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 correspond to variants of Ia the native Pycnoporus cinnabar ⁇ nus laccase (the native Pycnoporus cinnabar ⁇ nus laccase is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 33), obtained by means of a directed evolution process, the process of which Catalytic activity and / or functional expression has been improved by a process of directed molecular evolution.
  • polynucleotides encoding the amino acid sequence polypeptides SEQ ID NO: 21, the SEQ ID NO: 23, the SEQ ID NO: 25, the SEQ ID NO: 27 and the SEQ ID NO: 29 correspond to variants of the coding sequence of the native signal sequence of the factor ⁇ (nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 31) with mutations introduced by a process of directed evolution to improve the expression of polypeptides to which They are operatively linked.
  • the polynucleotides encoding the amino acid sequence polypeptides SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 may result in lacks whose catalytic activity and / or functional expression has been improved, while the polynucleotides encoding the amino acid sequence polypeptides SEQ ID NO: 21, the SEQ ID NO: 23, the SEQ ID NO: 25, the SEQ ID NO: 27 and the SEQ ID NO: 29, will improve the expression of the polypeptides to those that are operatively linked, particularly lacquers.
  • polynucleotide encoding the polypeptide whose amino acid sequence is selected from the list comprising: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the polynucleotide, hereinafter the first polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 1.
  • the first polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the Pycnoporus cinnabar ⁇ nus laccase with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 1, sequence presented by mutants 1 D12 and 3D3 of the examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 43, or in its complementary chains, b) molecules of nucleic acid whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of (a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the polynucleotide, hereinafter the second polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 3.
  • the second polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of Pycnoporus cinnabar ⁇ nus laccase with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 3, sequence that presents the mutant 3G10 of the Examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the polynucleotide sequence isolated consisting of SEQ ID NO: 4, or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs of a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the polynucleotide, hereinafter the third polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 5.
  • the third polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the Pycnoporus cinnabar ⁇ nus laccase with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 5, sequence that the mutants 20C7, 5D3 have and 9C3 of the examples of the invention and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45, or its complementary chains, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the code genetic.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the polynucleotide, henceforth the fourth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 7.
  • the fourth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the laccase of Pycnoporus cinnabar ⁇ nus with catalytic activity and / or improved functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 7, sequence presented by mutant 10A7 of the examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 8, or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a) , c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the polynucleotide, henceforth the fifth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 9.
  • the fifth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the laccase of Pycnoporus cinnabar ⁇ nus with improved catalytic activity and / or functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 9, a sequence that presents mutant 1 F10 of the examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 10, or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable to hybridize under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the polynucleotide, hereinafter the sixth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 11.
  • the sixth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the laccase of Pycnoporus cinnabarinus with improved catalytic activity and / or functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 11, a sequence presented by mutant 1C9 of the examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 12, or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridize under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the polynucleotide, henceforth the seventh polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 13.
  • the seventh polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the laccase of Pycnoporus cinnabarinus with improved catalytic activity and / or functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 13, a sequence presented by mutant 19C8 of the examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 14, or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridize under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the polynucleotide, hereinafter the eighth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 15.
  • the eighth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the laccase of Pycnoporus cinnabar ⁇ nus with improved catalytic activity and / or functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 15, a sequence presented by mutant 7A9 of the examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 16, or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridize under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the polynucleotide, hereafter ninth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 17.
  • the ninth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the laccase of Pycnoporus cinnabar ⁇ nus with improved catalytic activity and / or functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 17, sequence presented by mutants 5F7 and 2D8 of the examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 46, or in its complementary chains, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code .
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the polynucleotide, hereinafter tenth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 19.
  • the tenth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of a variant of the laccase of Pycnoporus cinnabar ⁇ nus with improved catalytic activity and / or functional expression, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 19, a sequence presented by mutant 17B7 of the examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 20, or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridize under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • the organism Pycnoporus cinnabar ⁇ nus belongs to Superuk Eukaryota, (Metazoa / Fungi group), Fungi Kingdom, Subreino Dikarya, Phylum Basidiomycota, Agar ⁇ comycetes Class, Polyporales Order, Family Polyporaceae and Genus Pycnoporus.
  • polynucleotide encoding the polypeptide whose amino acid sequence is selected from the list comprising: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO : 27 and SEQ ID NO: 29.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the polynucleotide, hereinafter eleventh polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 21.
  • the eleventh polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of the signal sequence of the ⁇ factor with mutations to improve the expression of operably linked polypeptides, whose polypeptide sequence is collected in SEQ ID NO: 21, sequence that the 3D3, 19C8 mutants have and 2D8 of the examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO 47 or SEQ ID NO: 48, or its complementary chains, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the code genetic.
  • twelfth polynucleotide of the invention which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 23.
  • the twelfth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of the signal sequence of the ⁇ factor with mutations to improve the expression of operably linked polypeptides, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 23, a sequence that presents the mutant 20C7 of the Examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 24, or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing in astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the polynucleotide, hereinafter thirteenth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 25.
  • the thirteenth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of the signal sequence of the ⁇ factor with mutations to improve the expression of operably linked polypeptides, whose polypeptide sequence is collected in SEQ ID NO: 25, sequence presented by mutants 5F7 and 3G10 of the examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 49, or in its complementary chain, b) molecules of nucleic acid whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the polynucleotide, hereinafter fourteenth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to
  • the fourteenth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of the signal sequence of the ⁇ factor with mutations to improve the expression of operably linked polypeptides, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 27, sequence that the mutants 1C9, 1 have.
  • F10 and 1 D12 of the examples of the invention and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 51, or in its complementary chains, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to degeneration of the genetic code.
  • Another preferred embodiment of this aspect of the invention relates to the polynucleotide, hereinafter fifteenth polynucleotide of the invention, which encodes the polypeptide whose amino acid sequence corresponds to SEQ ID NO: 29.
  • the fifteenth polynucleotide of the invention constitutes the coding sequence of the signal sequence of the ⁇ factor with mutations to improve the expression of operably linked polypeptides, whose polypeptide sequence is included in SEQ ID NO: 29, a sequence presented by mutants 7A9, 17B7 , 9C3, 5D3 and 10A7 of the examples of the invention, and corresponding to: a) nucleic acid molecules of the polynucleotide sequence isolated consisting of SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 or SEQ ID NO: 55, or in its complementary chains, b) acid molecules nucleic whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • Another aspect refers to a genetic construction of DNA or RNA, from now on genetic construction of the invention, which comprises one of the following types of sequences: a. a polynucleotide encoding the polypeptide whose amino acid sequence is selected from the list comprising: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, for in vitro or in vivo transcription, b. a nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with the polynucleotide sequence of a), or c.
  • This genetic construction includes the cloning and expression vectors that comprise the isolated polynucleotides of the invention.
  • Such expression vectors include control sequences, such as, for example, control elements for translation (such as start and stop codes) and for transcription (for example, promoter-operator regions, binding sites).
  • control sequences such as, for example, control elements for translation (such as start and stop codes) and for transcription (for example, promoter-operator regions, binding sites).
  • the vectors according to the invention can include plasmids and viruses, and other vectors according to procedures well known and documented in the art, and can be expressed in a variety of different expression systems, also well known and documented in the art.
  • a "vector” is a replicon to which another polynucleotide segment has been attached, to perform the replication and / or expression of the bound segment.
  • a “replicon” is any genetic element that behaves as an autonomous unit of polynucleotide replication within a cell; that is, able to replicate under its own control.
  • Control sequence refers to polynucleotide sequences that are necessary to effect the expression of the coding sequences to which they are linked. The nature of such control sequences differs depending on the host organism; in prokaryotes, said control sequences generally include a promoter, a ribosomal binding site, and termination signals; in eukaryotes, generally, said control sequences include promoters, termination signals, enhancers and, sometimes, silencers.
  • control sequences is intended to include, at a minimum, all components whose presence is necessary for expression, and may also include additional components whose presence is advantageous.
  • Operaationally linked refers to a juxtaposition in which the components thus described have a relationship that allows them to function in the intended way.
  • a control sequence "operatively linked" to a coding sequence is linked in such a way that the expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.
  • a “free reading frame” is a region of a polynucleotide sequence that encodes a polypeptide; This region may represent a portion of a coding sequence or a complete coding sequence.
  • a "coding sequence” is a polynucleotide sequence that is transcribed into mRNA and / or translated into a polypeptide when under control of appropriate regulatory sequences. The limits of the coding sequence are determined by a translation start codon at the 5 'end and a translation end codon at the 3' end.
  • a coding sequence may include, but is not limited to mRNA, cDNA, and recombinant polynucleotide sequences.
  • the genetic construction of the invention further comprises one of the following types of sequences; a) a polynucleotide encoding the polypeptide whose amino acid sequence is selected from the list comprising: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 29, or b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with the polynucleotide sequence of a), operatively linked to a polynucleotide encoding the polypeptide whose amino acid sequence is selected from the list comprising: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, for in vitro or in vivo transcription.
  • mutant 79A would exhibit a catalytic activity and / or functional expression superior to the rest of the mutants obtained.
  • the signal sequence of the ⁇ factor of the mutant 79A is collected in the amino acid sequence SEQ ID NO: 29, and the sequence of the laccase enzyme corresponding to the mu79ie 79A is collected in the amino acid sequence SEQ ID NO: 15.
  • the isolated polynucleotide encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 29 is operably linked to the isolated polynucleotide encoding the polypeptide of the amino acid sequence SEQ ID NO: 15 .
  • the presen ⁇ e permi ⁇ e invention to produce, in hasia can ⁇ ariaes now not available, fungal laccases po ⁇ encial alio redox presen ⁇ an greater functional expression and greater ca ⁇ al ⁇ ica ac ⁇ ividad.
  • aspec ⁇ o refers to the use of the isolated polynucleó ⁇ idos of the invention and / or the genetic cons ⁇ ruc descriptions of the invention to produce fungal lacases of redox poetic alio with greater functional expression and / or greater ca ⁇ al ⁇ ac ⁇ ividad
  • the isolated polynucleóides of the invention and / or the genetic consiruction of the invention can be inroduced (or transfected) in a host cell.
  • Said host cell can be grown in a suitable culture medium, expressing the laccase encoded by the polynucleóides or genetic consiructions of the invention.
  • transfection refers to the introduction or transfer of an exogenous nucleic acid molecule into a eukaryotic cell, including, but not limited to, a ribonucleic or deoxyribonucleic acid molecule (by example, naked RNA or DNA).
  • Suitable culture media are known in the state of the art.
  • the recombinant protein of interest is a laccase enzyme of fungal origin, of high redox potential, which has a greater functional expression and a greater catalytic activity.
  • the host is Saccharomyces cerevissiae.
  • yeast Saccharomyces cerevissiae is a unicellular fungus that belongs to Superuk Eukaryota, (Metazoa / Fungi group), Fungi Kingdom, Subreino Dikarya, Phylum Ascomycota, Subphylum Saccharomycotina, Class Saccharomycetes, Order Saccharomychatals, Saccharomycetaceae Family and Saccharomycetaceae Family.
  • the present invention therefore comprises variants of genes and enzymes of the group of fungal lacases of high redox potential that have a greater functional expression in Saccharomyces cerevisiae as well as a greater catalytic activity.
  • the invention includes the process for producing said polynucleotides and enzymes of high redox potential, extracellular, functional and soluble with improved activity towards one or more substrates, by means of the directed molecular evolution methodology.
  • mutants are generated through diversity creation protocols in vitro or in vivo that contain mutations that may be beneficial for the property to be enhanced. Mutants created in this way can be produced simply in S. cerevisiae.
  • laccase of interest synthesized by the expression system has improvements in its expression and its functional properties, conventional tests are used. For example, to determine if the polynucleotide undergoing directed evolution and expressed in a foreign host produces lacases with improved activity, experiments can be designed to determine the functional activity of the protein.
  • a large number of mutants can be analyzed accurately and simultaneously (high-throughput) by designing screening or screening methods, after which the best mutants can be isolated, purified and characterized.
  • the best mutants of each evolutionary cycle are used as parental or starting points for the next evolutionary cycle, thus obtaining exponential improvements over the initial parental due to the accumulation of beneficial mutations from one cycle to another.
  • a method for generating high redox, extracellular, functional and soluble lacases with improved activity towards one or more substrates comprises: a) designing A genetic construct comprising the isolated polynucleotide encoding the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 31 operatively linked to the isolated polynucleotide encoding the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 33. b) generating diversity over the genetic construction of (a), and create the mutant libraries, d) select the best expression and activity mutants.
  • the Ia is replaced signal sequence of the native laccase of Pycnoporus cinnabar ⁇ nus (from now on, n-PcL) by the signal sequence of the ⁇ factor to favor the functional expression of the mature laccase (PcL) in S. cerevisiae.
  • the signal sequence of the native laccase of Pycnoporus cinnabar ⁇ nus (n-PcL) corresponds to the amino acid sequence SEQ ID NO: 41, and the signal sequence of factor ⁇ with the amino acid sequence SEQ ID NO: 31.
  • the signal sequence of the native laccase of Pycnoporus cinnabar ⁇ nus is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 41 , and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 42, or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing in astringent conditions with a polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • the native signal sequence of the factor ⁇ is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 31, and which would comprise various variants from : a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 32, or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a ), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • the native laccase of Pycnoporus cinnabarinus is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID NO: 33, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules of the isolated polynucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 34, or in its complementary chain, b) nucleic acid molecules whose complementary chain is capable of hybridizing under astringent conditions with a polynucleotide sequence of a) , c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code.
  • the signal sequence of factor ⁇ is usually used to favor the secretion of heterologous proteins in S. cerevisiae. Said signal sequence is cleaved during the maturation of the protein and secretion to the extracellular medium, so it is not part of the mature enzyme.
  • the new construction (the signal sequence of the ⁇ factor fused with the gene encoding the mature protein, from this moment ⁇ -PcL) is subjected to the process of directed evolution in order to increase the functional expression and the total activity values of PcL . Therefore, the accumulation of beneficial mutations takes place both in the signal sequence of the factor ⁇ and in the sequence of the mature laccase (PcL).
  • the generation of diversity is carried out using two different tools i) random introduction of point mutations in ⁇ -PcL by means of the DNA amplification reaction (polymerase chain reaction, PCR) subjected to error and called from this moment mutagenic PCR; and ii) recombination of DNA from different mutated ⁇ -PcL genes to facilitate the accumulation of beneficial mutations and the elimination of those that are presented as deleterious or neutral, through: a) in vivo scanning of mutagenized DNA or b) Ia recombination in vivo by assembly in the yeast.
  • DNA amplification reaction polymerase chain reaction, PCR
  • recombination of DNA from different mutated ⁇ -PcL genes to facilitate the accumulation of beneficial mutations and the elimination of those that are presented as deleterious or neutral, through: a) in vivo scanning of mutagenized DNA or b) Ia recombination in vivo by assembly in the yeast.
  • mutant libraries are constituted through in vivo cloning of the genes mutagenized with the expression vector as well as the recombination of the best variants and their transformation into S. cerevisiae cells.
  • the high capacity or high-throughput scan for the selection of the best expression and activity mutants comprises i) the micro-fermentation of the clones containing the mutated and / or recombined genes for the functional expression of the best ⁇ - mutants PcL in 96-well plates format; ii) The screening of the activities of the secreted recombinant enzymes, using colorimetric methods based on the oxidation of phenolic and non-phenolic substrates; iii) additional re- screenings to guarantee the selection of genes that express greater protein and / or laccase activity through isolation, purification and again transformation and expression of previously selected genes in S. cerevisiae.
  • the method of the invention would comprise the identification and mapping of the mutations introduced in the selected variants.
  • the present invention could also be carried out by a method called "directed mutagenesis” based on the information of the mutations reported in the present patent. This is because in order to carry out this procedure it is necessary to know the exact position and the amino acid change that must be included in the new protein.
  • This process consists in the introduction of specific changes in the DNA sequence encoding said enzyme. These changes are introduced in the coding DNA (cDNA) complementary to the messenger RNA (mRNA) that encodes the ⁇ -PcL (and lacks the non-coding sequences, "introns" present in eukaryotic genomic DNA), cloned into a vector expression.
  • the resulting vector is used as a template in DNA polymerase chain reactions (PCR) in which a high fidelity polymerase is used so that the changes in the DNA are limited to those desired.
  • PCR DNA polymerase chain reactions
  • primers For each mutation, at least two oligonucleotides "primers" of the PCR reaction are designed, whose sequences incorporate the appropriate change and are complementary to opposite strands of the same region of DNA. The verification that the DNA chains resulting from the PCR carry only the desired mutations can be achieved by sequencing.
  • the genetic construction of step a) of the method of the invention comprises an isolated polynucleotide encoding the polypeptide whose amino acid sequence is selected from SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 31 operably linked with an isolated polynucleotide encoding the polypeptide whose amino acid sequence is selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 , SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 33.
  • the procedure is applied in a first cycle of directed evolution of the parental gene ⁇ -PcL.
  • Phase 1 of the procedure is carried out using the pGAPZ ⁇ vector of Invitrogen TM and the cDNA ladder of Pycnoporus cinnabar ⁇ nus as a template, whose sequence is deposited in the GenBank DNA sequence database (Gen Bank accession number: AF170093).
  • the amplified ⁇ -PcL fragment is subcloned into the shuttle vector pJRoC30 (Novozymes) to facilitate functional expression in S. cerevisiae and plasmid overproduction in Escherichia coli, (Fig. 1).
  • Phase 2 of the procedure is carried out through the construction of two libraries of mutants with different mutational rate (average of point mutations randomly introduced into the parental gene ⁇ -PcL) created by mutagenic PCR.
  • Fig. 2 the landscapes of directed evolution of both libraries are shown.
  • the first library was constructed so that 20% of the clones explored had less than 10% of the activity of the parental type (medium mutation index library, LMM).
  • the second library was constructed so that 6% of the clones explored had less than 10% of the parental activity (low mutation index library, LMB). Both LMM and LMB were appropriate libraries for the selection of mutants with improvements in expression and activity levels.
  • the cloning of the mutant libraries with the expression vector is carried out in vivo using the eukaryotic cellular machinery of S. cerevisiae.
  • the library in question is co-transformed with the linearized expression plasmid.
  • the generated PCR products have overlapping extensions of not less than 50 base pairs that facilitate in vivo cloning and repair of the expression vector by a homologous recombination process.
  • the overlapping ends are generated thanks to the design of oligonucleotide primers of the mutagenic PCR reaction that confer said homology with the ends of the linearized vector.
  • phase 3 of the procedure a double screening is performed using activity tests in endpoint mode with phenolic substrates and not phenolic in order to avoid dependence on the selected mutants towards the chosen substrate.
  • the protocols of re-screenings are carried out from new transforming cells to promote cell synchronization and avoid the selection of false positives.
  • the details cited for this phase are also applicable in all the particular embodiments described below referring to evolutionary cycles.
  • 4 genes of mutant lacases called: 1 D12, 5F7, 3D3 and 3G10 are selected with improvements ranging from 12.6 to 2.3 times better total activity than the ⁇ -PcL parent expressed in S. cerevisiae (Table 2, Fig. 3). From this moment on, the total activity is defined as the one derived from the improvement in the level of expression and the catalytic activity of the enzyme.
  • the method is applied in a second cycle of directed evolution using as parental the mutant genes obtained in the first generation: 1 D12, 5F7, 3D3 and 3G10.
  • Phase 2 of the procedure is carried out by means of the construction of a single mutagenic library through an in vivo screening of the previously mutagenized parental genes.
  • This approach facilitates the evolutionary push towards improvements in the total activity by: i) the recombination of the best mutations of the parental genes, ii) the introduction of new beneficial point mutations.
  • the in vivo recombination of the best parents is carried out by co-transformation of the mutagenic PCR products of said genes with the linearized vector in S. cerevisiae.
  • the overlapping ends facilitate cloning in vivo while the high homologous recombination rate of S. cerevisae favors the recombination of the accumulated mutations to generate chimera genes.
  • Phase 3 is carried out by activity test protocols in endpoint mode.
  • Fig. 4 the landscape of directed evolution of the constructed library is shown, with 62% of the clones explored with less than 10% of the activity of the parental type.
  • 6 genes of mutant lacases named: 10A7, 19C8, 20C7, 1 F10, 1C9, 2D8 are selected with improvements ranging from 17 to 8.7 times the total activity of the best parental gene of the previous generation, 1 D12 ( Table 2, Fig. 3).
  • the method is applied in a third cycle of directed evolution using the mutant genes obtained in the second generation as parental: 10A7, 19C8, 20C7, 1 F10, 1C9, 2D8.
  • Phase 2 of the procedure is carried out by means of the construction of a single mutagenic library through an in vivo screening of the previously mutagenized parental genes, in the same manner as described in the previous embodiment.
  • Phase 3 is done by activity test protocols in kinetic mode, due to the higher starting activity of the parental type 10A7.
  • Fig. 5 the landscape of directed evolution of the constructed library is shown, with 36% of the clones explored with less than 10% of the activity of the parental type.
  • mutant lacases named: 7A9, 5D3, 9C3, 17B7 are selected with improvements ranging from 3.7 to 1, 3 times the total activity of the best parental gene of the previous generation, 10A7 (Table 2, Fig. . 3).
  • the mutations introduced in the different variants generated during the three cycles of directed evolution are determined by sequencing the corresponding mutated genes (Table 2, Fig. 6, 7).
  • the number determines the position of the mutated residue in the original amino acid sequence of mature PcL, the first amino acid (to the left of the number) is the original one in the mature PcL sequence and the second is the one by which it is mutated.
  • the number is accompanied by the letter " ⁇ ".
  • G indicates Glycine
  • V indicates Valine
  • L indicates Leucine
  • I indicates Isoleucine
  • F indicates Phenyl Alanine
  • Y indicates Tyrosine
  • W indicates Tryptophan
  • S indicates Serine
  • T indicates Threonine
  • C indicates Cysteine
  • M indicates Methionine
  • N indicates Asparagine
  • Q indicates Glutamine
  • D indicates Aspartic Acid
  • E indicates Glutamic Acid
  • K indicates Lysine
  • R indicates Arginine
  • H indicates Histidine
  • P indicates Proline.
  • the best mutant of the last generation, 7A9 accumulates 8 mutations after 3 evolutionary cycles and 6000 clones explored (Table 2, Fig. 6, 7).
  • Four mutations are found in the signal sequence of the ⁇ factor, attributing to them the improvement in the secretion of the enzyme.
  • the signal sequence of the ⁇ factor comprises 83 amino acids, of which 19 constitute the pre-peptide and 64 the pro-peptide.
  • the pre-peptide is responsible for the insertion of the mature polypeptide chain into the endoplasmic reticulum, after which it is cleaved by the action of an endo-peptidase between amino acids 19 and 20.
  • the pro-peptide intervenes in the folding of the polypeptide chain during its transition and stay from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus.
  • the pro-peptide is cleaved in the Golgi before the mature enzyme is secreted to the outside by means of the action of three specific proteases (KEX ⁇ , KEX2 and STE13).
  • a ( ⁇ 9) D is located in the region of the pre-peptide and comes from the mutant 1 D12 of the first generation (with improvement of up to 12.6 times the total activity of ⁇ -PcL) being preserved during the following recombinations in the evolutionary process (Fig. 6, 7).
  • the S ( ⁇ 58) G mutation is located in the region of the pro-peptide and comes from the 3D3 mutant of the first cycle. It is preserved in several mutan ⁇ es selected from 2 or 4 cycle and mu ⁇ an ⁇ es selected Ia 3rd generation. Mutations F ( ⁇ 48) S and E ( ⁇ 86) G, located in the propeptide and in the processing zone of the propeptide, respectively, appear in the muierie 10A7 of the second generation as a consequence of the muogenic PCR, and iodos preserved in the mutant selccionados of Ia 3rd generation.
  • the mutations described for the signal sequence of the factor ⁇ (Table 2) can be applicable in the heterologous expression of any other eukaryotic gene susceptible or desirable to be expressed in S.
  • cerevisiae (as non-limiting examples can be applied to laccase genes, peroxidases , glucoses oxidases, P450 monooxygenases, galactose oxidases, glucosidases, amylases, amyloglucosidases, galactosidases, cellulases, invertases, glycosyltransferases, lipases, dehalogenaes).
  • the N208S mutation is a consequence of the third generation mutagenic PCR.
  • the D341 N mutation comes from the 19C8 mutant of the second generation, which shows an improvement of 11, 7 times of activity total (with respect to the parental) compared to 8.7 of the 2D8 mutant which differs only in the aforementioned mutation.
  • the P394H mutation is responsible for a 4.5-fold improvement of the total activity in the 5F7 mutant of the first generation. This mutation is conserved during the following recombinations throughout the evolutionary process.
  • the evaluation of the improvement of the mutant laccases is estimated by determining their total activity from the supernatants of the cell fermented microculture scale (96 well format) or per liter of fermented.
  • the total activity of the best mutant of the last generation, 7A9 is evaluated and an activity of 40 U / L of fermented is quantified, which is an improvement of approximately 3x10 6 times the total activity of the Initial parental ⁇ -PcL in S. cerevisiae.
  • the Catalytic Activity Unit (U) is defined as the amount of enzyme necessary to oxidize 1 ⁇ mol of substrate per minute under the reaction conditions.
  • homogeneity is purified and the 7A9 variant is biochemically characterized and compared with wild PcL (mature protein expressed in Pycnoporus cinnabar ⁇ nus and purified) (Fig. 9).
  • Activity profiles are determined against pH, thermostability, degree of glycosylation, and catalytic efficiency in the oxidation of various phenolic and non-phenolic substrates is evaluated.
  • the molecular mass of wild PcL is estimated around 65 kDa.
  • the molecular mass of 7A9 expressed in S. cerevisiae is approximately 120 kDa.
  • the N-deglycosylation of 7A9 reduces the molecular mass to ⁇ 60 kDa, (Fig. 9A). From these data it is deduced that 7A9 is hyperglycosylated: approximately 50% of the total molecular mass are carbohydrates covalently linked to asparagine residues of the polypeptide chain due to post-translational modifications in the host organism S. cerevisiae.
  • the activity profile against pH is displaced in 7A9, as a side effect of the evolutionary and functional expression process in S. cerevisiae (Fig. 9B).
  • the optimal pH of wild PcL activity is 3 while 7A9 is detected in 4.
  • 7A9 retains 74% of its activity at pH 5.0 (native PcL retains 52% at the same pH).
  • thermostability in aqueous medium of 7A9 varies considerably with respect to wild PcL as a consequence of the functional expression and the evolutionary process in S. cerevisiae ⁇ ex. 7A9 maintains 85% of its activity after 24 h incubation at 40 0 C compared to 57% retained by the wild - PCl, Fig. 9C). It has been suggested that hyperglycosylation can increase enzymatic stability (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987-995).
  • the catalytic efficiency is the relationship between the K ca t (catalytic constant or spare number, which indicates the speed with which a substrate becomes a product) and the K m (Michaelis constant, which indicates the affinity of the enzyme for a given substrate) and reveals the ability of an enzyme to catalyze the modification of a given substrate.
  • Mutant 7A9 is active against a wide range of substrates of different nature, with catalytic efficiencies in the range 100-1500 mM "1 sg " 1, which shows that the screening method used in phase 3 facilitates selection of functional variants against different compounds (Table 3).
  • Mutae 7A9 reaches functional expression levels in S. cerevisiae that are kinetic-deficient in 24 hours of induction in expression medium (0.72 U / L) in micro-plate 96-well plate microermentations (200 ⁇ L final volume). These values guarantee the possible exploitation of 7A9 as well as any of the mutants generated during the evolutionary process, or of their individual mutations, for future improvements by directed evolution. Having a fungal laccase of high redox potential of the basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus functionally expressed and evolved in S.
  • the evolved laccase and its variants object of the present patent constitute the first lacquers of high redox potential that have underwent evolution for its functional expression in S. cerevisiae being an ideal vehicle for future applications in various sectors (forest products industry - paper and wood -, bioremediation, textile industry, food industry, pharmaceutical industry, chemical industry), ii) The evolved laccase and its variants can be evolved in S.
  • cinnabarinus (and also the recombinant expressed in Aspergillus niger), has been used successfully in different biotechnological applications (bleaching and control of paper pulp pitch, degradation of aromatic contaminants, stabilization of beverages).
  • Patent ES2189683 Georis et al., 2003. Pycnoporus cinnabarinus laceases: an interesting tool for food or non-food applications. Proc.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides and deoxyribonucleotides.
  • peptide oligopeptide
  • polypeptide polypeptide
  • protein protein
  • Figure 1 (Fig. 1). Construction of pJRoC30- ⁇ -PcL.
  • FIG. 2 Landscapes of the screening test against 2.6 dimethoxyphenol (DMP) of the medium mutation index library (LMM) and the low mutation index library (LMB) in the first generation.
  • DMP dimethoxyphenol
  • LMM medium mutation index library
  • LMB low mutation index library
  • Figure 3 (Fig. 3). General scheme of the process of artificial evolution. The silent mutations introduced are not included in the diagram. The improvements are calculated with respect to the corresponding parental used as a reference during the screening of the evolutionary cycle.
  • the reference parent of the first generation is ⁇ -PcL
  • the second generation is 1 D12
  • the third generation 10A7 is calculated with respect to the corresponding parental used as a reference during the screening of the evolutionary cycle.
  • Figure 4 (Fig. 4). Landscape of the screening test against 2,2 ' azino-bis (3- ethyl-benzothiazolin-6-sulphonate (ABTS) of the second generation. The activities of the clones of the mutant library are represented in descending order. discontinuous indicates the activity of the parental type used as an internal standard in screening (mutant 1 D12).
  • Figure 5 (Fig. 5). Landscapes of the third generation screening trials with DMP and ABTS. The activities of the clones of the Mutant libraries are represented in descending order. The dashed lines indicate the activity of the parental type used as an internal standard in screening (mutant 10A7).
  • FIG. 7 Comparison between the best mutants of the three evolutionary cycles and the accumulation of mutations.
  • FIG. 8 Mutations introduced in the mature laccase during the evolutionary process.
  • the spheres represent the catalytic copper.
  • the ligands of the T1 copper and trinuclear cluster 12/13 are highlighted in blue.
  • 7A9 accumulates in addition to the three mutations indicated in this figure, four mutations in the signal peptide and a silent mutation.
  • Prof. Piontek is thanked for facilitating access to the PDB file of the crystallographic structure.
  • Figure 9 (Fig. 1). Biochemical characterization of the 7A9 mutant.
  • n-PcL The substitution of the signal sequence of the native laccase of Pycnoporus cinnabar ⁇ nus (n-PcL) by the signal sequence of the factor ⁇ generates a fusion protein, ⁇ -PcL, constituted by the signal sequence fused of the factor ⁇ with the gene that codes for The mature protein.
  • ⁇ -PcL the fusion protein
  • the Stratagene TM pGAPZ ⁇ vector used for protein expression in Pichia pastor ⁇ s, which contains the pre-pro signal peptide of the factor ⁇ was taken as a template.
  • pGAPZ ⁇ was linearized with the restriction enzymes EcoRI and Notl. The lad cDNA of P.
  • cinnabar ⁇ nus (n-PcL, 1494 bp, Gen Bank accession no .: AF170093), was amplified with the NecoRI-direct priming oligonucleotides (SEQ ID NO: 35) and CNotl-reverse (SEQ ID NO: 36 ) that include restriction targets for EcoRI and Notl (GAATTC and GCGGCCGC respectively, underlined and in bold), generating a mature laccase (PcL) template that excludes the native signal sequence.
  • SEQ ID NO: 35 NecoRI-direct priming oligonucleotides
  • SEQ ID NO: 36 CNotl-reverse
  • the conditions of the amplification reaction were the following: 400 nM of the oligonucleotide N echo RI -di straight, 400 nM oligonucleotide CNotl-reverse, 0.25 mM dNTPs, 0.05 U / ⁇ L Taq polymerase (Invitrogen), 0.5 ng / ⁇ L of n-PcL in 20 mM Tris-HCI buffer, pH 8.4 and 4 mM MgCl 2 in a final volume of 50 ⁇ L.
  • the PCR program used was: 94 0 C for 5 min, 55 0 C for 5 min, 72 0 C for 5 min (1 cycle), 95 0 C for 0.35 min, 50 0 C for 2 min, 72 0 C for 4 min (25 cycles), and 72 0 C for 10 min (1 cycle).
  • PcL was digested with EcoRI and Notl and ligated the linearized vector pGAPZ ⁇ generating the construction pGAPZ ⁇ -PcL. Said vector was transformed into competent E. coli DH5 ⁇ cells by thermal shock to over-produce and purify the plasmid.
  • ⁇ -PcL was amplified from pGAPZ ⁇ -PcL by PCR using the NtpJRBgll I-direct oligonucleotides (SEQ ID NO: 37) and CtpGAPZIac-reverse (SEQ ID NO: 38) which include restriction targets for BgIII - compatible with BamHI- and Notl (AGATCT and GCGGCCGC, respectively, underlined and in bold).
  • the PCR reaction was carried out in 50 ⁇ l containing 400 nM of the NtpJRBgll I-direct oligonucleotide, 400 nM CtpGAPZIac-reverse oligonucleotide, 0.25 mM dNTPs, 0.05 U / ⁇ L Taq polymerase (Invitrogen), 0.4 ng / ⁇ L of pGAPZ ⁇ -PcL in 20 mM Tris-HCI buffer, pH 8.4 and 4 mM MgCl2.
  • the PCR program used was: 94 0 C for 5 min, 55 0 C for 5 min, 72 0 C for 5 min (1 cycle ), 95 0 C for 0.35 min, 50 0 C for 2 min, 72 0 C for 4 min (25 cycles), and 72 0 C for 10 min (1 cycle).
  • ⁇ -PcL was subcloned into the shuttle vector pJRoC30 (Novozymes, USA).
  • pJRoC30 is a bifunctional episomic vector of 10477 bp that contains the GAL1 promoter (galactose inducible), the ampicillin resistance gene for selection in E. coli and the URA3 gene that confers auxotrophy for uracil (the S. cerevisiae cells grown with this vector they can be grown in selective medium -without uracil-).
  • the digestion of pJRoC30 with the enzymes BamHI and Notl was carried out, as well as the digestion of ⁇ -PcL with BgIII and Notl.
  • the generation of diversity by PCR-mutagenic was carried out in a gradient thermocycler (Thermocycler Mycycler, Biorad, USA) under the following reaction parameters: 95 0 C for 2 min (1 cycle); 94 0 C for 0.45 min, 53 0 C for 0.45 min, 74 0 C for 3 min (28 cycles); and 74 0 C for 10 min (1 cycle).
  • the oligonucleotides used for the mutagenic amplification were direct RMLN (SEQ ID NO: 39; with binding site to pJRoC30 in position pb 5'-160-181-3 ') and inverse RMLC (SEQ ID NO: 40; with site of union to pJRoC30 in position pb 5'-2139-2158-3 ').
  • RMLN SEQ ID NO: 39
  • inverse RMLC SEQ ID NO: 40
  • the PCR products were designed containing extensions with a homology of 40 bp and 66 bp for the ends digested with Bam ⁇ ⁇ ⁇ and Xhol of the linearized vector, respectively.
  • PCR products were concentrated (DNA clean concentrator TM-5 kit, Zymo Research, USA), loaded on a semipreparative low melting agarose gel and purified with the Zymoclean gel DNA recovery kit (ZymoResearch, USAJ.
  • the PCR products were subsequently cloned in vivo when transforming S. cerevisiae cells, after the GAL1 promoter of the previously linearized pJRoC30 vector with Bam ⁇ ⁇ ⁇ and Xhol.
  • the mutation index was modulated by varying the amount of template DNA in the PCR reaction.
  • concentration of each of the reagents, in a final volume of 50 ⁇ L was the following: 370 nM of RMLN oligonucleotide, 370 nM RMLC oligonucleotide, 0.8 mM dNTPs, 3% (v / v) DMSO, 0.05
  • the mutation rate was controlled by varying the concentration of MnCl2
  • the effect of balanced / unbalanced concentrations of dNTPs and the concentration of the template DNA in the mutagenic PCR reaction was analyzed (Table 4).
  • Second generation in vivo scanning of mutagenized DNA.
  • mutants 1 D12, 3D3, 5F7 and 3G10 were taken as parental and were subjected to a new cycle of evolution by mutagenic PCR with Tag / MnC ⁇ , to subsequently recombine these products by in vivo barajeo ; -2000 clones were explored.
  • Each of the parents was amplified by error-prone PCR with equilibrated dNTPs and a concentration of MnC ⁇ of 0.01 mM as detailed in Table 4.
  • the products mutagenized by PCR were mixed in the same proportion (400 ng total, 100 ng of each product) and were transformed together with the linearized vector (vecto ⁇ product ratio PCR 1: 4).
  • the endpoint screening was developed as described in section 2 of the present example, preparing independent plates to assess the activity in the presence of phenolic and non-phenolic substrates.
  • mutants 10A7, 19C8, 20C7, 1 F10, 1C9, and 2D8 were taken as parental and were subjected to a new cycle of evolution by mutagenic PCR with Tag / MnC ⁇ , to subsequently recombine these products by an in vivo garage; -2000 clones were explored.
  • Each of the parents was amplified by error-prone PCR with equilibrated dNTPs and a concentration of 0.01 mM MnC ⁇ as detailed in Table 4.
  • the products mutagenized by PCR were mixed in the same proportion (400 ng totals, 100 ng of each product) and were transformed together with the linearized vector (PCR product vector ratio 1: 4).
  • the screening was developed as described in section 2 of the present example, preparing independent plates to assess the activity in the presence of phenolic and non-phenolic substrates. In this particular generation, screening could be carried out in kinetic mode due to the improvement of activity after three evolutionary cycles.
  • the YPD media, minimum liquid medium, SC plates and expression medium were prepared as indicated in Zumarraga, M. et al. 2008 ⁇ Proteins 71: 250-260.) With the proviso that 25 g / L ethanol was included in the expression medium to favor the secretion of the laccase and CuSO 4 in final concentrations of 2 mM for fermentations in microplate and 4 mM for production scale.
  • the libraries of each evolutionary cycle generated by different strategies were transformed into S. cerevisiae cells (Yeast transformation Kit, Sigma) for a functional expression of the corresponding clones. Isolated colonies of wild S.
  • cerevisiae cells were incubated in 20 ml_ of liquid YPD medium at 30 0 C and 210 rpm on a shaker (Edmund Bühler GmbH SM-30, Germany) overnight (DO600> 2). An adequate amount of the culture was inoculated in a total volume of 120 ml_ of YPD tempered to reach an OD600 of 0.3. It was incubated again for 4-6 h, until two growth cycles were completed and an OD 6 or 1 of 2 was reached. The cells were transformed with the corresponding libraries in the presence of the linearized plasmid, with the yeast transformation kit. Immediately before the thermal shock (42 0 C for 15 min), DMSO was added to the transformation mixture with a final concentration of 10% (v / v) to increase the transformation efficiency (approximately 20,000 clones per transformation reaction).
  • the S. cerevisiae cells transformed with the corresponding library and the linearized pJRoC30 vector were seeded on SC plates and incubated at 30 0 C. After 3-4 days individual colonies were chopped and inoculated into 96-well microplates (Sero-well , United Kingdom) containing 50 ⁇ L of minimum medium per well. The complete column number 6 of each plate was inoculated with the parental type selected from the previous cycle (reference column) and one of the wells (H1) was not inoculated (control). The plates were sealed with parafilm and incubated at 30 0 C, 210 rpm and 80% relative humidity in an incubator with humidification system Minitron-INFORS (Biogen, Spain).
  • the activity screening against DMP was performed by adding 180 ⁇ l_ of 100 mM acetate buffer, pH 5.0 containing 3mM DMP to the second replica plate, the plates were shaken briefly and absorbance was measured in the plate reader at 469 nm.
  • the activities with respect to each substrate were calculated based on the difference in the final and initial absorbance.
  • the relative activities were normalized with the activity of the parental type of the corresponding plate.
  • each clone was grown in 4 wells and the parental (internal standard) was treated in the same way (row D, wells 7-11).
  • the plates were subjected to the same screening protocol, with the proviso that each activity value came from the average of 4 microcultures per clone.
  • Second re-screening 100 uL aliquots of the most active of the first re-screening clones were grown in 3 mL of YPD medium at 30 0 C and 210 rpm for 24 h. Plasmids were extracted from these cultures (Zymoprep yeast plasmid miniprep kit, Zymo Research). Since the product of the zymoprep was not pure and the concentration of the extracted DNA was very low, the plasmids were transformed into XL2-blue supercompetent E. coli cells according to the corresponding protocol (Stratagene) and were selected in LB / amp plates. Isolated colonies were inoculated in 5 mL of LB / amp medium and grown overnight at 37 0 C.
  • Plasmids (NucleoSpin® Plasmid kit, Macherey-Nagel) were removed.
  • the S. cerevisiae cells were transformed with the plasmids of the best mutants as well as with the corresponding parental type, and the screening was carried out in the same way, with the proviso that each activity value came from the average of 5 microcultures per clone.
  • the S. cerevisiae clones containing the laccase genes of both the native type and mutants were cultured in 3 mL of minimum medium for 48 h, at 30 0 C and 250 rpm (Micromagmix shaker, Ovan). An aliquot of this preculture was inoculated to reach an optical density (OD 6 oo) of 0.25 in a total volume of 50 ml_ of minimum medium in a 500 ml_ flask with porous plug.
  • the culture of the apparatus was centrifuged 3.1. at 13000 rpm for 15 minutes at 4 0 C.
  • the supernatant was concentrated by tangential ultrafiltration.
  • the sample was passed through a 5 KDa membrane of pore size (Minisette, Filtron) by a flow provided by a peristaltic pump (Masterflex easy-load, Cole-Palmer).
  • a second concentration step was performed by ultrafiltration under pressure (exerted with N 2 gas) with 10 KDa pore size membrane (Amicon YM3, Millipore).
  • the purified proteins were deglycosylated with the peptide-N-glycosidase F (PNGase F) (Sigma), which hydrolyzes the oligosaccharides bound to the asparagine residues.
  • PNGase F peptide-N-glycosidase F
  • 8 g of pure laccase were denatured with SDS 0.2% (w / v) ⁇ -mercaptoethanol and 100 mM to 100 0 C for 10 min.
  • PNGase F peptide-N-glycosidase F
  • the reaction was incubated stopped at 100 0 C for 10 min.
  • the products were analyzed on an electrophoresis gel (SDS-PAGE) stained with Coomasie blue.
  • thermostability study was carried out with the help of the Mycycler thermal cycler equipped with a gradient former (Bio-Rad, USA), which allows temperature gradients to be created at different intervals. Dilutions of the proteins were prepared in 100 mM sodium acetate buffer, pH 5 such that aliquots of 10 ⁇ L gave an adequate response to measure the activity in the microplate reader in kinetic mode. 60 ⁇ L of the house was incubated for each point of the gradient.
  • the temperature gradient studied included the range 30-80 0 C with intermediate temperatures of 30.0 0 C, 31.7 0 C, 34.8 0 C, 39.3 0 C, 45.3 0 C, 49.9 0 C, 53 0 C, 55 0 C, 56.8 0 C, 59.9 0 C, 64.3 0 C, 70.3 0 C, 75.0 0 C, 78.1 0 C and 80.0 0 C.
  • 10 ⁇ L aliquots of the house were removed and mixed with 190 ⁇ L of 3 mM ABTS in buffer 100 mM sodium acetate pH 5. Activity was assessed continuously (oxidation of ABTS at 418 nm). Time 0 was determined from the corresponding samples incubated at room temperature. Each value came from at least three independent measures.
  • the pH profiles of the activity of the different purified lacases were performed in 100 mM ByR buffer at different pHs (pH 2.0-9.0, adjusted with NaOH). Dilutions of the enzymes in 10OmM sodium acetate buffer pH 5 were prepared so that 10 ⁇ L aliquots would give an adequate response in the measure of activity in the microplate reader in kinetic mode. Lacases (10 ⁇ L) were added by rows and the buffer at different pHs (180 ⁇ L) by columns. Finally, 10 ⁇ L of 60 mM ABTS was added and the activities of each of the conditions were measured in triplicate.
  • polypeptide whose amino acid sequence is selected from the list comprising: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17th SEQ ID NO: 19.
  • Polynucleotide according to claim 1 encoding the polypeptide whose amino acid sequence is selected from the list comprising: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 29.
  • DNA or RNA comprising one of the following types of sequences: a. a polynucleotide according to claim 2, for transcription in vitro or in vivo, b. a nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of (a), or c. nucleotide sequence of a), or b), corresponding to a gene expression system or vector, operably linked with at least one promoter that directs the transcription of said nucleotide sequence of interest, and with other sequences necessary or appropriate for The transcription and its regulation in time and place.

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Abstract

Método para generar lacasas de alto potencial redox, extracelulares, funcionales y solubles con actividad mejorada hacia uno o más sustratos, secuencias que codifican dicas lacasas, y usos.

Description

LACASAS DE ALTO POTENCIAL REDOX OBTENIDAS POR EVOLUCIÓN
DIRIGIDA.
La invención se encuentra dentro del campo de Ia biología molecular, Ia tecnología del ADN recombinante y Ia biotecnología. Específicamente se refiere a enzimas oxidasas de tipo lacasa mejoradas en su expresión funcional y actividad catalítica, sus usos y el procedimiento para su obtención. La expresión funcional y mejora de actividad de las lacasas se lleva a cabo en células eucariotas de Saccharomyces cerevisiae a través de un proceso de evolución molecular dirigida. Dichas enzimas pueden emplearse como catalizadores en procesos industriales relacionados con Ia transformación de Ia biomasa lignocelulósica para Ia obtención de biocombustibles o Ia elaboración de productos de madera y papel con nuevas propiedades, para el sector alimentario, Ia producción textil y el sector químico, así como para Ia biorremediación de efluentes y contaminantes ambientales.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Las lacasas (EC 1.10.3.2) son un grupo de oxidasas ampliamente distribuido en plantas superiores y en hongos, aunque también se han descrito en algunas bacterias e incluso en cutículas de insectos (Alcalde, 2007. En: Industrial enzymes. Structure, function and applications. Ed. Polaina, J. y MacCabe, AP. Springer, Heidelberg (Alemania), pp. 459-474). Pertenecen a Ia familia de las oxidasas multicobre azul (junto con las ascorbato oxidasa y Ia ceruloplasmina), y se presentan generalmente como glicoproteínas monoméricas extracelulares.
Las lacasas, individualmente, catalizan Ia oxidación de un amplio espectro de sustancias orgánicas aromáticas. Entre ellas se encuentran los orto y para-difenoles, los fenoles metoxi-substituidos, los bencenotioles, los hidroxindoles, el 1-naftol y Ia siringaldazina (Gianfreda et al., 1999. Bioremediation Journal 3:1-25). Los radicales libres resultantes sufren diferentes reacciones dependiendo de su estructura y de las condiciones de reacción. El acoplamiento de radicales libres generando productos diméricos o poliméricos y las descarboxilaciones oxidativas son las reacciones más frecuentes. También son sustratos de lacasas los compuestos metálicos inorgánicos/orgánicos. El Mn2+ es oxidado a Mn3+ y también el Fe (EDTA)2" es aceptado por Ia enzima (Thurston, 1994. Microbiology-UK 140:19-26).
La oxidación de todos estos sustratos va acoplada a Ia reducción del oxígeno molecular a dos moléculas de agua. Esto significa que por cada molécula de oxígeno reducida, se oxidan 4 moléculas de sustrato sin producir peróxido de hidrógeno. Por estos motivos, las lacasas se consideran como los catalizadores "verdes" ideales ya que emplean O2 como co-sustrato generando únicamente H2O como subproducto.
Las lacasas contienen un cobre de tipo 1 (T1 ) donde tiene lugar Ia oxidación del sustrato reductor, y un centro o cluster trinuclear con tres cobres, un T2 y dos T3, donde tiene lugar Ia reducción del O2. El mecanismo de reacción debe funcionar como una batería, almacenando electrones de las reacciones de oxidación individuales para reducir el oxígeno molecular y producir agua (Davies, 2002. Lacease. En: Handbook of Metallproteins. (ed A. Messercschimdt et al), pp. 1359-1368. John Wiley and Sons, LTD, New York).
El potencial redox formal (E0 ') de las lacasas tiene una relación directa con Ia energía requerida para arrancar un electrón al sustrato reductor, constituyendo una de las características fundamentales de estas enzimas. De hecho, el comportamiento catalítico de las lacasas sobre Ia mayoría de los sustratos reductores depende del E°' en el Cu T1 (aceptor de electrones). De este modo, las lacasas con un mayor E°'n son de especial interés en biotecnología debido a que son capaces de oxidar sustratos con mayor E°' como ciertos hidrocarburos aromáticos policíclicos o diversos colorantes orgánicos sintéticos. El E°' de diferentes lacasas ha sido ampliamente estudiado mediante técnicas espectroelectroquímicas (principalmente voltamperometría cíclica y valoraciones redox) haciendo uso de diferentes tipos de electrodos y mediadores redox (Xu, F. et al., 1998. Biochem. J. 334:63-70; Shleev, S.V. et al. 2004. Biochimie 86:693-703).
El E°' del Cu T1 de algunas lacasas fúngicas es mayor (E°'τi cercano a +800 mV) que el de las lacasas de plantas o bacterianas (por ejemplo Ia lacasa de Rhus vernicifera tiene un E0Yi= +400 mV) y otras oxidasas multicobre azul (ascorbato oxidasa E0Y= +340 mV). Sin embargo, es importante señalar que también existen marcadas diferencias en los E°Y de las diferentes lacasas fúngicas, desde +465 mV de Ia lacasa del ascomiceto Myceliophtora thermophila hasta +790 mV de Ia lacasa del basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus. En este sentido, se ha realizado un enorme esfuerzo con Ia intención de dilucidar qué factores determinan estas diferencias en los E0Y, sobre todo si se tienen en cuenta las geometrías de coordinación de los sitios de Cu, prácticamente conservadas. La mayor parte de estos estudios físico-químicos se ha servido del conocimiento aportado por los modelos cristalográficos disponibles. En concreto se ha resuelto a fecha de hoy las estructuras en 3D de 5 lacasas de Coprínus cinereus, Melanocarpus albomyces, Bacillus subtillis, Trámeles versicolor y Pycnoporus cinnabarinus.
Las lacasas de alto potencial redox -procedentes de hongos basidiomicetos de podredumbre blanca- poseen un enorme potencial biotecnológico debido a su amplia especificidad de sustrato (oxidan fenoles, aminas, tioles, antraceno, etc), y sus bajos requerimientos de aplicación (sólo requieren oxígeno, que es transformado en agua durante Ia reacción). Cuando actúan sobre el polímero de lignina (o compuestos de tipo fenólico) pueden catalizar tanto actividades de degradación como de polimerización. Además, su rango de sustratos puede ser ampliado a compuestos no fenólicos más difíciles de degradar utilizando mediadores redox, de origen natural o sintético, en los denominados sistemas lacasa-mediador (Camarero et al., 2005. Appl. Environ. Microb. 71 :1775-1784).
La tecnología de las lacasas de alto potencial redox puede ser empleada en prácticamente Ia totalidad de Ia cadena de producción de productos papeleros: Ia elaboración de Ia pasta de papel, el blanqueo libre de cloro de las pastas, Ia eliminación del pitch o el tratamiento de efluentes. En Ia industria de productos forestales dos áreas más de investigación emergentes son a) el diseño de materiales lignocelulósicos con nuevas propiedades de resistencia y estabilidad mediante el injerto de compuestos fenólicos catalizado por lacasa, en Ia denominada "funcionalización de las fibras de celulosa"; y b) el uso de lacasas para Ia mejora en Ia adhesión de tableros de madera (mediante el acoplamiento enzimático in situ de Ia lignina), sin necesidad de utilizar adhesivos tóxicos a base de formaldehído.
Además las lacasas encuentran aplicaciones en los siguientes sectores (Xu, 2005. Industrial Biotechnology 1 :38-50): i) La industria alimentaria: procesamiento de bebidas o de productos de panadería. ii) La industria textil: degradación (detoxificación) de los colorantes de los efluentes o blanqueo de tejidos (lavado a Ia piedra de jeans). iii) Nanobiotecología: a) como detectores de fenoles, oxígeno, azidas, morfina, codeína, catecolaminas o flavonoides en Ia elaboración de biosensores para análisis clínicos y medioambientales; y b) elaboración de biopilas de combustible que ofrecen energía eléctrica limpia (sin utilizar combustibles fósiles) mediante Ia inmovilización de lacasas en el cátodo. iv) Biorremediación: degradación de PAHs, compuestos AOX, etc. v) Síntesis química: a) producción de polímeros complejos (ej. policatecol para resinas de cromatografía); b) síntesis de agentes farmacológicos: antitumorales (ej. viblastina), nuevos derivados antibióticos (ej de Ia ciclosporina A), o colorantes (Suberasa® de Novozymes); c) cosméticos: tintes de cabello formulados con lacasa.
La aplicación de las lacasas a nivel industrial requiere de sistemas de expresión robustos que proporcionen altos niveles de enzima activa. El empleo de sistemas de expresión heterólogos posibilita Ia producción de lacasas de diferentes procedencias en un mismo hospedador, así como de nuevas variantes con propiedades mejoradas con respecto a Ia enzima salvaje.
Por este motivo, se ha estudiado en profundidad Ia expresión heteróloga de lacasas fúngicas en hospedadores eucariotas (Kunameni et al. Microbial CeII Faetones. In press. 2008). Se ha realizado especial hincapié en sistemas de expresión basados en hongos filamentosos {Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus sojae y Tríchoderma reseei); y levaduras (Saccaharomyces cerevisiae, Pichia pastorís, Pichia methalonica, Yarrowia lipolytica y Kluyveromyces lactis). Gracias a los avances obtenidos en el diseño de biorreactores y a Ia optimización de las condiciones de expresión en levaduras, se han alcanzado niveles de expresión de unos 20 mg de lacasa activa por litro de cultivo en Yarrowia lipolytica o Pichia pastorís. Estos niveles son significativamente inferiores a los 135 mg/L obtenidos en Aspergillus oryzae o los 920 mg/L en Tríchoderma. Sin embargo, Ia elección de levaduras como S. cerevisiae como hospedador ofrece Ia valiosa ventaja de poder mejorar las propiedades catalíticas de las lacasas recombinantes o su estabilidad en las condiciones de operación, mediante técnicas de evolución molecular dirigida.
Se ha estudiado Ia expresión en S. cerevisiae de lacasas de los hongos Coriolus hirsutus, Trametes versicolor, Melanocarpus albomyees, Trametes sp. strain C30, Pleurotus ostreatus, Pycnoporus coccineus y Pleurotus eryngii, aunque los niveles de expresión funcional detectados han sido mínimos (Kunameni et al., 2008. Microbial CeII Faetones. In press). No obstante, Ia expresión funcional de lacasas fúngicas en S. cerevisiae puede ser incrementada significativamente mediante técnicas de evolución molecular dirigida, que permite el diseño de nuevas funciones enzimáticas no existentes en ambientes naturales o Ia mejora de ciertas propiedades de Ia enzima (Arnold, 2001. Nature 409:253-257). Esta metodología recrea en el laboratorio los procesos claves de Ia evolución natural (mutación, recombinación y selección) de manera que es posible diseñar enzimas de gran interés científico y tecnológico. De esta manera, sometiendo los genes seleccionados a ciclos sucesivos de evolución molecular, las diferentes mutaciones puntuales beneficiosas se irán acumulando y combinando hasta adquirir Ia propiedad deseada, que se ve mejorada de manera exponencial, generación tras generación. Utilizando este procedimiento se consiguió incrementar hasta 18 mg/L Ia producción de lacasa del ascomiceto Myceliophtora thermophila en S. cerevisiae (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987-995. 2003).
En Ia evolución in vitro, mediante mutagénesis aleatoria inducida y/o recombinaciones en el material genético que codifica para una o varias proteínas, se crea una diversidad genética que posteriormente se expresa y explora bajo las condiciones en las que se quiere mejorar Ia enzima (altas temperaturas o medios no convencionales, pHs extremos, etc.). La mayoría de las características enzimáticas -regioespecificidad, enantioespecificidad, termoestabilidad, estabilidad en disolventes orgánicos, expresión génica, incluso Ia búsqueda de actividades de novo en el caso de anticuerpos catalíticos- pueden ser sometidas a experimentos de evolución dirigida (Tao & Cornish, 2002. Curr. Opin. Chem. Biol. 6:858-864.).
Aunque considerando Ia eficiencia de transformación, Ia estabilidad del ADN plasmídico y Ia tasa de crecimiento, E. coli es el organismo hospedador más frecuentemente utilizado en Ia expresión funcional heteróloga de los genes que codifican Ia proteína de interés, el diferente uso de codones, y Ia imposibilidad de realizar las modificaciones post-traduccionales necesarias para Ia correcta secreción de Ia proteína madura (como el procesamiento proteolítico o las glicosilaciones) pueden causar un plegamiento inapropiado de Ia proteína que es acumulada en cuerpos de inclusión, impidiendo su expresión funcional. Esto es especialmente cierto para las lacasas fúngicas para las que no se ha logrado todavía su expresión funcional en E. coli. Algunos de estos problemas pueden evitarse si estos genes se expresan en hospedadores eucarióticos cuya maquinaría celular sea más próxima a Ia nativa, como es el caso de las levaduras. En especial, el uso de Saccharomyces cerevisiae es de gran interés ya que posee Ia habilidad de glicosilar y secretar las proteínas al medio extracelular (Io cual evita en muchos casos pasos intermedios de lisis celular) y tiene una elevada eficiencia de transformación. Además, haciendo uso de un vector episómico adecuado no integra el plásmido dentro de su genoma, facilitando así su posterior manipulación. Otra ventaja muy interesante desde un punto de vista evolutivo es su elevada frecuencia de recombinación de ADN, Ia cual a diferencia de E. coli permite Ia construcción de genotecas in vivo a través de Ia recombinación homologa de diferentes genes (conocido como in vivo ADN shuffling o "barajeo"). Por último, Ia ligación de los genes mutados en vectores de expresión es, en muchos casos, un paso laborioso que requiere un ajuste fino. En levaduras, el mecanismo reparador de huecos (in vivo gap repair) puede sustituir Ia ligación in vitro de una manera rápida y precisa (Bulter & Alcalde, 2003. Directed evolution: library creation. Methods and protocols. Ed. Arnold, F. H. y Georgiou, G. Humana Press, Totowa, New Jersey (EEUU), pp. 17-22.).
La evolución molecular dirigida de lacasas fúngicas presenta como requisito indispensable Ia expresión funcional de Ia enzima en Saccharomyces cerevisiae. La expresión funcional en S. cerevisiae de lacasas de alto potencial redox -procedentes de basidiomicetos- no se ha descrito con éxito hasta el momento. Únicamente se ha reportado Ia mejora por evolución dirigida de lacasas de bajo potencial de oxido-reducción por nuestro grupo y colaboradores. Dichos trabajos se han centrado en Ia lacasa de bajo potencial redox (E°' T1 = +475 mV) del ascomiceto Myceliophthora thermophila. En estos trabajos, los niveles de expresión funcional en S. cerevisiae se lograron beneficiándose de Ia similitud existente entre el microorganismo de partida (Myceliophthora thermophila) y S. cerevisiae, ambos ascomicetos. Con este sistema se ha conseguido mediante evolución dirigida: i) su expresión funcional en S. cerevisiae, (Bulter et al.., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987-995.); y ii) su estabilización en cosolventes orgánicos, (Zumarraga et al., 2007. Chem. Biol. 14: 1052-1064.; Zumarraga et al., 2008. Proteins 71 : 250-260.; Zumarraga et al., 2007 Biocatal. Biotrans. 25: 219-228; Alcalde et al., 2005. J. Biomol. Screen. 10: 624-631 ).
Dado que el rango de actuación de Ia lacasa evolucionada de Myceliophthora thermophila está limitado por su bajo potencial redox (E°'τi = +475 mV) que Ie impide catalizar eficientemente Ia oxidación de moléculas con potenciales redox superiores al suyo, las lacasas de alto potencial redox producidas por hongos basidiomicetos de podredumbre de Ia madera suponen un punto de partida más adecuado para Ia mejora de las propiedades de Ia lacasa por evolución dirigida debido a su mayor aplicabilidad biotecnológica.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a polipéptidos o proteínas generadas mediante varios métodos de evolución dirigida de las secuencias polinucleotídicas que comprenden el gen de Ia lacasa de alto potencial redox (E°' T1 = +790 mV) del hongo basidiomiceto Pycnoporus cinnabarínus, y Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal nativa del factor α, dando lugar a una expresión funcional mejorada en S. cerevisiae y/o a una actividad enzimática aumentada hacia uno o más sustratos.
Todos los polinucleótidos y polipéptidos descritos en Ia presente invención se resumen en Ia Tabla 1.
Figure imgf000010_0001
Tabla 1. Polinucleotidos y polipéptidos de Ia invención. Se indica con letra en superíndice aquellos mutantes que comparten idéntica secuencia aminoacídica, tanto para las secuencias nucleotídicas del factor alfa como para las secuencias nucleotídicas de las lacasas maduras.
Así, en un primer aspecto de esta invención se proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 y Ia SEQ ID NO: 29.
Los polinucleotidos que codifican para los polipéptidos de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19 corresponden a variantes de Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarínus (Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarínus se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 33), obtenidas mediante un proceso de evolución dirigida, cuya actividad catalítica y/o expresión funcional ha sido mejorada mediante un procedimiento de evolución molecular dirigida.
Los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 y Ia SEQ ID NO: 29 corresponden a variantes de Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal nativa del factor α (secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 31 ) con mutaciones introducidas mediante un proceso de evolución dirigida para mejorar Ia expresión de polipéptidos a los que se encuentran operativamente enlazados.
Por tanto, los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19 podrán dar lugar a lacasas cuya actividad catalítica y/o expresión funcional ha sido mejorada, mientras que los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 y Ia SEQ ID NO: 29, mejoraran Ia expresión de los polipéptidos a los que se encuentran operativamente enlazados, particularmente lacasas.
Así, en otro aspecto de esta invención se proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante primer polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 1.
El primer polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 1 , secuencia que presentan los mutantes 1 D12 y 3D3 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 2 ó Ia SEQ ID NO: 43, o en sus cadenas complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de (a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante segundo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 3.
El segundo polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 3, secuencia que presenta el muíante 3G10 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 4, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante tercer polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 5.
El tercer polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 5, secuencia que presentan los mutantes 20C7, 5D3 y 9C3 de los ejemplos de Ia invención y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 6, Ia SEQ ID NO: 44 o Ia SEQ ID NO: 45, o en sus cadenas complementarias, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante cuarto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 7.
El cuarto polinucleótido de Ia invención constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 7, secuencia que presenta el mutante 10A7 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 8, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante quinto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 9.
El quinto polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 9, secuencia que presenta el mutante 1 F10 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 10, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante sexto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 11.
El sexto polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarinus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 11 , secuencia que presenta el mutante 1C9 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 12, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante séptimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 13.
El séptimo polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarinus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 13, secuencia que presenta el mutante 19C8 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 14, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante octavo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 15.
El octavo polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 15, secuencia que presenta el mutante 7A9 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 16, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante noveno polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 17.
El noveno polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 17, secuencia que presentan los mutantes 5F7 y 2D8 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 18 o Ia SEQ ID NO: 46, o en sus cadenas complementarias, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante décimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 19.
El décimo polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de una variante de Ia lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad catalítica y/o expresión funcional mejorada, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 19, secuencia que presenta el muíante 17B7 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 20, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Se reportan, por tanto, las secuencias polinucleotídicas de los mutantes obtenidos por evolución dirigida que codifican para variantes de lacasa de Pycnoporus cinnabarínus con actividad mejorada.
El organismo Pycnoporus cinnabarínus pertenece al Superreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino Fungí, Subreino Dikarya, Phylum Basidiomycota, Clase Agarícomycetes, Orden Polyporales, Familia Polyporaceae y Género Pycnoporus.
En otro aspecto de Ia invención se proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 y Ia SEQ ID NO: 29.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante undécimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 21.
El undécimo polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal del factor α con mutaciones para mejorar Ia expresión de polipéptidos operativamente enlazados, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 21 , secuencia que presentan los mutantes 3D3, 19C8 y 2D8 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 22, Ia SEQ ID NO 47 o Ia SEQ ID NO: 48, o en sus cadenas complementarias, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante duodécimo polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 23. El duodécimo polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal del factor α con mutaciones para mejorar Ia expresión de polipéptidos operativamente enlazados, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 23, secuencia que presenta el muíante 20C7 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 24, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante decimotercer polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 25.
El decimotercer polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal del factor α con mutaciones para mejorar Ia expresión de polipéptidos operativamente enlazados, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 25, secuencia que presentan los mutantes 5F7 y 3G10 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 26 o Ia SEQ ID NO: 49, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético. Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante decimocuarto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 27.
El decimocuarto polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal del factor α con mutaciones para mejorar Ia expresión de polipéptidos operativamente enlazados, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 27, secuencia que presentan los mutantes 1C9, 1 F10 y 1 D12 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 28 Ia SEQ ID NO: 50 ó Ia SEQ ID NO: 51 , o en sus cadenas complementarias, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otra realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al polinucleótido, de ahora en adelante decimoquinto polinucleótido de Ia invención, que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica corresponde a Ia SEQ ID NO: 29.
El decimoquinto polinucleótido de Ia invención, constituye Ia secuencia codificante de Ia secuencia señal del factor α con mutaciones para mejorar Ia expresión de polipéptidos operativamente enlazados, cuya secuencia polipetídica se recoge en Ia SEQ ID NO: 29, secuencia que presentan los mutantes 7A9, 17B7, 9C3, 5D3 y 10A7 de los ejemplos de Ia invención, y que corresponde a: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 30, Ia SEQ ID NO: 52, Ia SEQ ID NO: 53, Ia SEQ ID NO: 54 ó Ia SEQ ID NO: 55, o en sus cadenas complementarias, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
Otro aspecto se refiere a una construcción genética de ADN o ARN, de ahora en adelante construcción genética de Ia invención, que comprende, uno de los siguientes tipos de secuencias: a. un polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, para su transcripción in vitro o in vivo, b. una moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con Ia secuencia polinucleotídica de a), ó c. secuencia de nucleótidos de a), ó b), preferiblemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales {enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc.. Esta construcción genética incluye los vectores de clonación y expresión que comprenden los polinucleótidos aislados de Ia invención. Tales vectores de expresión incluyen secuencias de control, tales como, por ejemplo, elementos de control de Ia traducción (como códigos de iniciación y de parada) y de Ia transcripción (por ejemplo, regiones de promotor-operador, sitios de unión). Los vectores conforme a Ia invención pueden incluir plásmidos y virus, y otros vectores de acuerdo con procedimientos bien conocidos y documentados en Ia técnica, y pueden expresarse en una variedad de sistemas de expresión diferentes, asimismo bien conocidos y documentados en Ia técnica.
Se conoce, así mismo, una variedad de técnicas que pueden utilizarse para introducir tales vectores en células procarióticas o eucarióticas (células hospedantes) para su expresión. Técnicas adecuadas de transformación o transfección están bien descritas en Ia bibliografía.
Un "vector" es un replicón al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para realizar Ia replicación y/o expresión del segmento unido.
Un "replicón" es cualquier elemento genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleótida dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control.
"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar Ia expresión de las secuencias codificadoras a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal, y señales de terminación; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores y, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.
"Unidos de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición en Ia que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en Ia manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que Ia expresión de Ia secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un "marco de lectura libre" (ORF) es una región de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora completa.
Una "secuencia codificadora" es una secuencia de polinucleótidos que se transcribe a ARNm y/o se traduce a un polipéptido cuando está bajo control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de Ia secuencia codificadora se determinan mediante un codón de inicio de traducción en el extremo 5' y un codón de finalización de Ia traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no se limita a ARNm, ADNc, y secuencias de polinucleótidos recombinantes.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia construcción genética de Ia invención comprende, además, uno de los siguientes tipos de secuencias; a) un polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 y Ia SEQ ID NO: 29, ó b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con Ia secuencia polinucleotídica de a), operativamente enlazado con un polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, para su transcripción in vitro o in vivo.
Según se muestra en los ejemplos, el muíante 79A presentaría una actividad catalítica y/o expresión funcional superior al resto de los mutantes obtenidos. La secuencia señal del factor α del muíante 79A se recoge en Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 29, y Ia secuencia de Ia enzima lacasa correspondiente al muíaníe 79A se recoge en Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15.
Por íanío, en una realización más preferida de esíe aspecío de Ia invención, el polinucleóíido aislado que codifica el polipépíido de Ia SEQ ID NO: 29 se encueníra operaíivameníe enlazado con el polinucleóíido aislado que codifica el polipépíido de Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15.
La preseníe invención permiíe producir, en caníidades hasía ahora no disponibles, lacasas fúngicas de alio poíencial redox que presenían una mayor expresión funcional así como una mayor acíividad caíalííica.
Así, oíro aspecío se refiere al uso de los polinucleóíidos aislados de Ia invención y/o de Ia consírucción genéíica de Ia invención para producir lacasas fúngicas de alio poíencial redox con mayor expresión funcional y/o mayor acíividad caíalííica
Los polinucleóíidos aislados de Ia invención y/o Ia consírucción genéíica de Ia invención pueden iníroducirse (o íransfecíarse) en una célula hospedadora. Dicha célula hospedadora puede crecerse en un medio de culíivo adecuado, expresándose Ia lacasa codificada por los polinucleóíidos o consírucciones genéíicas de Ia invención. Tal y como se usa en esta memoria, el término "transfección" se refiere a Ia introducción o transferencia de una molécula de ácido nucleico exógena en una célula eucariota, incluyendo, pero no limitándose a ella, una molécula de ácido ribonucleico o desoxiribonucleico (por ejemplo, ARN ó ADN desnudo).
Medios de cultivos adecuados son conocidos en el estado de Ia técnica. Un "hospedador" o "célula hospedadora" o "célula hospedante", como se emplea en esta memoria, se refiere a un organismo, célula o tejido que sirve como diana o recipiente del polinucleótido que codifica una proteína recombinante de interés, donde Ia célula hospedadora se transforma con un vector de expresión conteniendo el polinucleótido de interés. En esta memoria, Ia proteína recombinante de interés es una enzima lacasa de origen fúngico, de alto potencial redox, que presenta una mayor expresión funcional y una mayor actividad catalítica.
Preferiblemente, el hospedador es Saccharomyces cerevissiae. La levadura de cerveza Saccharomyces cerevissiae es un hongo unicelular que pertenece al Superreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino Fungí, Subreino Dikarya, Phylum Ascomycota, Subphylum Saccharomycotina, Clase Saccharomycetes, Orden Saccharomycetales, Familia Saccharomycetaceae y Género Saccharomyces.
La presente invención comprende, por tanto, variantes de genes y enzimas del grupo de las lacasas fúngicas de alto potencial redox que presentan una mayor expresión funcional en Saccharomyces cerevisiae así como una mayor actividad catalítica.
Asimismo, Ia invención incluye el procedimiento para producir dichos polinucleótidos y enzimas de alto potencial redox, extracelulares, funcionales y solubles con actividad mejorada hacia uno o más sustratos, mediante Ia metodología de evolución molecular dirigida. Para ello, se generan miles de mutantes a través de protocolos de creación de diversidad in vitro o in vivo que contienen mutaciones que pueden ser beneficiosas para Ia propiedad a potenciar. Los mutantes creados de esta manera pueden ser producidos de manera sencilla en S. cerevisiae. Para determinar si Ia lacasa de interés sintetizada por el sistema de expresión tiene mejoras en su expresión y en sus propiedades funcionales, se emplean test convencionales. Por ejemplo, para determinar si el polinucleótido sometido a evolución dirigida y expresado en un hospedador foráneo produce lacasas con actividad mejorada, se pueden diseñar experimentos para determinar Ia actividad funcional de Ia proteína. Se pueden analizar una gran cantidad de mutantes de manera precisa y simultánea (high-throughput) mediante el diseño de métodos de exploración o screening, tras los cuales los mejores mutantes pueden ser aislados, purificados y caracterizados. Los mejores mutantes de cada ciclo evolutivo se emplean como parentales o puntos de partida para el siguiente ciclo evolutivo obteniendo de esta manera mejoras exponenciales sobre el parental inicial debidas a Ia acumulación de mutaciones beneficiosas de un ciclo a otro.
Por tanto, en otro aspecto de Ia invención se proporciona un método para generar lacasas de alto potencial redox, extracelulares, funcionales y solubles con actividad mejorada hacia uno o más sustratos, de ahora en adelante método de Ia invención, que comprende: a) diseñar una construcción genética que comprenda el polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 31 operativamente enlazada con el polinucleótido aislado que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 33. b) generar diversidad sobre Ia construcción genética de (a), y crear las librerías de mutantes, d) seleccionar los mejores mutantes de expresión y actividad.
En Ia construcción genética del procedimiento de Ia invención se sustituye Ia secuencia señal de Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarínus (de ahora en adelante, n-PcL) por Ia secuencia señal del factor α para favorecer Ia expresión funcional de Ia lacasa madura (PcL) en S. cerevisiae. La secuencia señal de Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarínus (n-PcL) se corresponde con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 41 , y Ia secuencia señal del factor α con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 31.
En el contexto de Ia presente invención, Ia secuencia señal de Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarínus (n-PcL) se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 41 , y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 42, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
En el contexto de Ia presente invención, Ia secuencia señal nativa del factor α se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 31 , y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 32, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético. En el contexto de Ia presente invención, Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarinus se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 33, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico de Ia secuencia polinucleotídica aislada que consiste en Ia SEQ ID NO: 34, o en su cadena complementaria, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar en condiciones astringentes con una secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético.
La secuencia señal del factor α se emplea habitualmente para favorecer Ia secreción de proteínas heterólogas en S. cerevisiae. Dicha secuencia señal se escinde durante Ia maduración de Ia proteína y secreción al medio extracelular, por Io que no forma parte de Ia enzima madura. La nueva construcción (Ia secuencia señal del factor α fusionada con el gen que codifica Ia proteína madura, desde este momento α-PcL) se somete al proceso de evolución dirigida con el fin de aumentar Ia expresión funcional y los valores de actividad total de PcL. Por Io tanto, Ia acumulación de mutaciones beneficiosas tiene lugar tanto en Ia secuencia señal del factor α como en Ia secuencia de Ia lacasa madura (PcL).
La generación de diversidad se lleva a cabo empleando dos herramientas diferentes i) introducción aleatoria de mutaciones puntuales en α-PcL mediante Ia reacción de amplificación del ADN (polymerase chain reaction, PCR) sometida a error y denominada desde este momento PCR mutagénica; y ii) recombinación de ADN de diferentes genes mutados de α- PcL para facilitar Ia acumulación de mutaciones beneficiosas y Ia eliminación de aquellas que se presentan como deletéreas o neutrales, a través de: a) el barajeo in vivo de ADN mutagenizado o b) Ia recombinación in vivo por ensamblaje en Ia levadura.
Las librerías de mutantes se constituyen a través del clonaje in vivo de los genes mutagenizados con el vector de expresión así como de Ia recombinación de las mejores variantes y su transformación en células de S. cerevisiae.
La exploración de alta capacidad o high-throughput para Ia selección de los mejores mutantes de expresión y actividad comprende i) Ia micro- fermentación de los clones que contienen los genes mutados y/o recombinados para Ia expresión funcional de los mejores mutantes de α-PcL en formato placas de 96 pocilios; ii) El screening de las actividades de las enzimas recombinantes secretadas, mediante métodos colorimétricos basados en Ia oxidación de sustratos fenólicos y no fenólicos; iii) re- screenings adicionales para garantizar Ia selección de los genes que expresan mayor proteína y/o actividad lacasa a través del aislamiento, purificación y nuevamente transformación y expresión de los genes previamente seleccionados en S. cerevisiae.
En una realización preferida, el método de Ia invención comprendería Ia identificación y el mapeo de las mutaciones introducidas en las variantes seleccionadas.
La identificación y mapeo de las mutaciones introducidas en las variantes seleccionadas mediante Ia secuenciación del ADN de los mutantes del gen α-PcL obtenidos y localización de dichas mutaciones en el plegamiento global de Ia proteína en base a Ia estructura cristalográfica de Ia lacasa salvaje de Pycnoporus cinnabarínus (Antorini et al., 2002. Biochim Biophys Acta Protein Struct Mol Enzymol 1594: 109-11 A).
La obtención de los polinucleótidos y enzimas mejoradas descritas en Ia presente invención podría también llevarse a cabo mediante un método denominado "mutagénesis dirigida" basándose en Ia información de las mutaciones reportadas en Ia presente patente. Esto se debe a que para llevar a cabo este procedimiento es necesario conocer Ia posición exacta y el cambio aminoacídico que se debe incluir en Ia nueva proteína. Este proceso consiste en Ia introducción de cambios puntuales en Ia secuencia de ADN que codifica dicha enzima. Estos cambios se introducen en el ADN codificante (ADNc) complementario del ARN mensajero (ARNm) que codifica Ia α-PcL (y que carece de las secuencias no codificantes, "intrones", presentes en el ADN genómico eucariota), clonado en un vector de expresión. El vector resultante se usa como molde en reacciones en cadena de ADN polimerasa (PCR) en las que se emplea una polimerasa de alta fidelidad con objeto de que los cambios en el ADN se limiten a los deseados. Para cada mutación se diseñan al menos dos oligonucleótidos "cebadores" de Ia reacción de PCR, cuyas secuencias incorporan el cambio adecuado y son complementarias a hebras opuestas de Ia misma región de ADN. La comprobación de que las cadenas de ADN resultantes de Ia PCR portan únicamente las mutaciones deseadas puede lograrse mediante su secuenciación.
En otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia construcción genética del paso a) del método de Ia invención comprende un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de entre Ia SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 y Ia SEQ ID NO: 31 operativamente enlazado con un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de entre Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19 y Ia SEQ ID NO: 33.
En una realización particular de Ia presente invención el procedimiento se aplica en un primer ciclo de evolución dirigida del gen parental α-PcL. La fase 1 del procedimiento se lleva a cabo empleando como molde el vector pGAPZα de Invitrogen™ y el ADNc lad de Pycnoporus cinnabarínus, cuya secuencia se encuentra depositada en Ia base de datos de secuencias de ADN GenBank (Gen Bank accession number: AF170093). El fragmento amplificado de α-PcL es subclonado en el vector lanzadera pJRoC30 (Novozymes) para facilitar Ia expresión funcional en S. cerevisiae y Ia sobreproducción plasmídica en Escherichia coli, (Fig. 1 ). La fase 2 del procedimiento se lleva a cabo a través de Ia construcción de dos librerías de mutantes con diferente tasa mutacional (promedio de mutaciones puntuales introducidas al azar en el gen parental α-PcL) creadas mediante PCR mutagénica. En Ia Fig. 2 se muestran los paisajes de evolución dirigida de ambas librerías. La primera librería se construyó de forma que el 20 % de los clones explorados tuvieran menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental (librería de índice de mutación medio, LMM). La segunda librería se construyó de forma que el 6 % de los clones explorados tuvieran menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental (librería de índice de mutación bajo, LMB). Tanto LMM como LMB fueron librerías apropiadas para Ia selección de mutantes con mejoras en los niveles de expresión y actividad.
El clonaje de las librerías mutantes con el vector de expresión se lleva a cabo in vivo haciendo uso de Ia maquinaría celular eucariota de S. cerevisiae. Para ello, se co-transforma Ia librería en cuestión con el plásmido de expresión linearizado. Los productos de PCR generados poseen extensiones solapantes de no menos de 50 pares de bases que facilitan el clonaje in vivo y Ia reparación del vector de expresión mediante un proceso de recombinación homologa. Los extremos solapantes se generan gracias al diseño de oligonucleótidos cebadores de Ia reacción de PCR mutagénica que confieran dicha homología con los extremos del vector linearizado.
Para Ia fase 3 del procedimiento se realiza un screening doble empleando ensayos de actividad en modo de punto final con sustratos fenólicos y no fenólicos con Ia finalidad de eludir Ia dependencia de los mutantes seleccionados hacia el sustrato escogido. Los protocolos de re-screenings (en especial el segundo re-screening) se llevan a cabo a partir de células transformantes nuevas para promover Ia sincronización celular y evitar Ia selección de falsos positivos. Los detalles citados para esta fase son también aplicables en todas las realizaciones particulares que se describen a continuación referentes a ciclos evolutivos. De Ia presente realización se seleccionan 4 genes de lacasas mutantes denominados: 1 D12, 5F7, 3D3 y 3G10 con mejoras que van desde 12,6 a 2,3 veces mejor actividad total que el parental α-PcL expresado en S. cerevisiae (Tabla 2, Fig. 3). Desde este momento, se define como actividad total aquella que se deriva de Ia mejora en el nivel de expresión y Ia actividad catalítica de Ia enzima.
En otra realización particular de Ia presente invención el procedimiento se aplica en un segundo ciclo de evolución dirigida utilizando como parentales los genes mutantes obtenidos en Ia primera generación: 1 D12, 5F7, 3D3 y 3G10. La fase 2 del procedimiento se lleva a cabo mediante Ia construcción de una única librería mutagénica a través de un barajeo in vivo de los genes parentales previamente mutagenizados. Este enfoque facilita el empuje evolutivo hacia mejoras en Ia actividad total mediante: i) Ia recombinación de las mejores mutaciones de los genes parentales, ii) Ia introducción de nuevas mutaciones puntuales beneficiosas. La recombinación in vivo de los mejores parentales se lleva a cabo mediante una co-transformación de los productos de PCR mutagénica de dichos genes con el vector linearizado en S. cerevisiae. Los extremos solapantes facilitan el clonaje in vivo al tiempo que Ia elevada tasa de recombinación homologa de S. cerevisae favorece Ia recombinación de las mutaciones acumuladas para generar genes quimera.
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Tabla 2. Mutaciones del proceso de evolución dirigida. λ Mutación introducida i Mutación acumulada
X(αn)X Mutación en el péptido señal (pre-prolíder del factor α). Se subrayan las mutaciones silenciosas.
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Tabla 2 (continuación). Mutaciones del proceso de evolución dirigida.
La fase 3 se lleva a cabo mediante protocolos de ensayo de actividad en modo de punto final. En Ia Fig. 4 se muestra el paisaje de evolución dirigida de Ia librería construida, con un 62 % de los clones explorados con menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental. De esta realización se seleccionan 6 genes de lacasas mutantes denominados: 10A7, 19C8, 20C7, 1 F10, 1C9, 2D8 con mejoras que van desde 17 a 8,7 veces Ia actividad total del mejor gen parental de Ia anterior generación, 1 D12 (Tabla 2, Fig. 3).
En una realización particular de Ia presente invención el procedimiento se aplica en un tercer ciclo de evolución dirigida utilizando como parentales los genes mutantes obtenidos en Ia segunda generación: 10A7, 19C8, 20C7, 1 F10, 1C9, 2D8. La fase 2 del procedimiento se lleva a cabo mediante Ia construcción de una única librería mutagénica a través de un barajeo in vivo de los genes parentales previamente mutagenizados, de igual manera que se describe en Ia realización anterior. La fase 3 se realiza mediante protocolos de ensayo de actividad en modo cinético, debido a Ia mayor actividad de partida del tipo parental 10A7. En Ia Fig. 5 se muestra el paisaje de evolución dirigida de Ia librería construida, con un 36 % de los clones explorados con menos del 10 % de Ia actividad del tipo parental. De esta realización se seleccionan 4 genes de lacasas mutantes denominados: 7A9, 5D3, 9C3, 17B7 con mejoras que van desde 3,7 a 1 ,3 veces Ia actividad total del mejor gen parental de Ia anterior generación, 10A7 (Tabla 2, Fig. 3).
En una realización particular de Ia presente invención, se determinan las mutaciones introducidas en las distintas variantes generadas durante los tres ciclos de evolución dirigida mediante secuenciación de los genes mutados correspondientes (Tabla 2, Fig. 6, 7). Para Ia interpretación de las mutaciones obtenidas, y si no se indica de otra manera, el número determina Ia posición del residuo mutado en Ia secuencia de aminoácidos original de PcL madura, el primer aminoácido (a Ia izquierda del número) es el original en Ia secuencia de PcL madura y el segundo es aquel por el que se muta. Para el caso de mutaciones en Ia secuencia señal del factor α, el número va acompañado de Ia letra "α". G indica Glicina, V indica Valina, L indica Leucina, I indica Isoleucina, F indica Fenil Alanina, Y indica Tirosina, W indica Triptófano, S indica Serina, T indica Treonina, C indica Cisteína, M indica Metionina, N indica Asparagina, Q indica Glutamina, D indica Ácido Aspártico, E indica Ácido Glutámico, K indica Lisina, R indica Arginina, H indica Histidina y P indica Prolina.
El mejor muíante de Ia última generación, 7A9, acumula 8 mutaciones tras 3 ciclos evolutivos y 6000 clones explorados (Tabla 2, Fig. 6, 7). Cuatro mutaciones se encuentran en Ia secuencia señal del factor α, atribuyéndoles Ia mejora en Ia secreción de Ia enzima. La secuencia señal del factor α comprende 83 aminoácidos, de los cuales 19 constituyen el pre-péptido y 64 el pro-péptido. El pre-péptido es el responsable de Ia inserción de Ia cadena polipéptidica en maduración en el retículo endoplasmático, tras Io cual es escindido por Ia acción de una endo-peptidasa entre los aminoácidos 19 y 20. El pro-péptido interviene en el plegamiento de Ia cadena polipéptidica durante su transición y estancia del retículo endoplasmático al aparato de Golgi. El pro-péptido es escindido en el Golgi antes de que Ia enzima madura sea secretada al exterior mediante Ia actuación de tres proteasas específicas {KEXλ , KEX2 y STE13). De las mutaciones introducidas en Ia secuencia señal del factor α, A(α9)D se localiza en Ia región del pre-péptido y proviene del muíante 1 D12 de Ia primera generación (con mejora de hasta 12,6 veces Ia actividad total de α-PcL) conservándose durante las siguientes recombinaciones en el proceso evolutivo (Fig. 6, 7). La mutación S(α58)G se localiza en Ia región del pro-péptido y proviene del muíante 3D3 del primer ciclo. Se conserva en varios de los mutaníes seleccionados del 2o ciclo y en los 4 muíaníes seleccionados de Ia 3a generación. Las muíaciones F(α48)S y E(α86)G, localizadas en el pro-pépíido y en Ia zona de procesamienío del pro-pépíido, respecíivameníe, aparecen en el muíaníe 10A7 de Ia segunda generación como consecuencia de Ia PCR muíagénica, y se conservan en iodos los mutantes selccionados de Ia 3a generación. Las mutaciones descritas para Ia secuencia señal del factor α (Tabla 2) pueden ser aplicables en Ia expresión heteróloga de cualquier otro gen eucariótico susceptible o deseable de ser expresado en S. cerevisiae (como ejemplos no limitativos se pueden aplicar a genes de lacasas, peroxidasas, glucosas oxidasas, P450 monooxigenasas, galactosas oxidasas, glucosidasas, amilasas, amiloglucosidasas, galactosidasas, celulasas, invertasas, glicosiltransferasas, lipasas, dehalogenasas).
De las 4 mutaciones que aparecen en Ia proteína madura (Tabla 2, Fig. 6, 7), una de ellas es silenciosa (no supone ningún cambio aminoácidico, L457L). Las 3 restantes forman parte de Ia proteína madura apareciendo en zonas conservadas de Ia enzima, en los alrededores del cobre catalítico del sitio T1 y se les atribuye Ia mejora en Ia actividad catalítica de Ia enzima (Fig. 8). La mutación N208S es consecuencia de Ia PCR mutagénica de Ia tercera generación. La mutación D341 N proviene del muíante 19C8 de Ia segunda generación, que muestra una mejora de 11 ,7 veces de acíividad total (respecto al parental) frente a los 8,7 del mutante 2D8 del que sólo se diferencia en Ia mencionada mutación. La mutación P394H es responsable de una mejora de 4,5 veces de Ia actividad total en el mutante 5F7 de Ia primera generación. Esta mutación se conserva durante las siguientes recombinaciones en todo el proceso evolutivo.
La evaluación de Ia mejora de las lacasas mutantes se estima determinando su actividad total a partir de los sobrenadantes de los fermentados celulares a escala de microcultivo (formato 96 pocilios) o por litro de fermentado. En una realización particular de Ia presente invención se evalúa Ia actividad total del mejor mutante de Ia última generación, 7A9, y se cuantifica una actividad de 40 U/L de fermentado, Io que supone una mejora de aproximadamente 3x106 veces Ia actividad total del parental inicial α-PcL en S. cerevisiae. La Unidad de actividad catalítica (U) se define como Ia cantidad de enzima necesaria para oxidar 1 μmol de sustrato por minuto bajo las condiciones de reacción.
En una realización particular de Ia presente invención se purifica a homogeneidad y se caracteriza bioquímicamente Ia variante 7A9 y se compara con PcL salvaje (proteína madura expresada en Pycnoporus cinnabarínus y purificada) (Fig. 9). Se determinan los perfiles de actividad frente al pH, Ia termoestabilidad, el grado de glicosilación, y se evalúa Ia eficiencia catalítica en Ia oxidación de diversos sustratos fenólicos y no fenólicos.
La masa molecular de PcL salvaje se estima entorno a los 65 kDa. La masa molecular de 7A9 expresado en S. cerevisiae es aproximadamente 120 kDa. La N-desglicosilación de 7A9 reduce Ia masa molecular hasta ~ 60 kDa, (Fig. 9A). De estos datos se deduce que 7A9 se encuentra hiperglicosilada: aproximadamente el 50 % de Ia masa molecular total son carbohidratos covalentemente unidos a residuos de asparagina de Ia cadena polipeptídica debido a las modificaciones postraduccionales en el organismo hospedador S. cerevisiae. Empleando el servidor Expasy, www.Expasy.org, se calcula Ia masa molecular teórica en 54249,55 Da, un 9.5 % menos de Io observado experimentalmente para 7A9 N-desglicosilada. Esta diferencia en Ia masa molecular puede ser debida a las O-glicosilaciones durante el procesamiento de Ia enzima en el aparato de Golgi.
El perfil de actividad frente al pH se ve desplazado en 7A9, como efecto lateral del proceso de evolución y expresión funcional en S. cerevisiae (Fig. 9B). Así, el pH óptimo de actividad de PcL salvaje se sitúa en 3 mientras que en 7A9 se detecta en 4. Notoriamente, 7A9 retiene el 74 % de su actividad a pH 5.0 (PcL nativa retiene un 52 % al mismo pH).
La termoestabilidad en medio acuoso de 7A9 varia notablemente con respecto a PcL salvaje como consecuencia de Ia expresión funcional y del proceso evolutivo en S. cerevisiae {ej. 7A9 mantiene el 85 % de su actividad tras 24 h de incubación a 40 0C frente al 57 % retenido por Ia PcL salvaje, Fig. 9C). Se ha sugerido que Ia hiperglicosilación puede aumentar Ia estabilidad enzimática (Bulter et al., 2003. Appl. Environ. Microb. 69: 987- 995).
La eficiencia catalítica es Ia relación entre Ia Kcat (constante catalítica o número de recambio, que indica Ia velocidad con Ia que un sustrato se convierte en producto) y Ia Km (constante de Michaelis, que indica Ia afinidad de Ia enzima por un sustrato dado) y revela Ia capacidad de una enzima para catalizar Ia modificación de un sustrato dado. El muíante 7A9 es activo frente a una amplia gama de sustratos de diferente naturaleza, con eficiencias catalíticas en el intervalo 100-1500 mM"1 sg"1 Io que pone de manifiesto que el método de screening que se emplea en Ia fase 3 facilita Ia selección de variantes funcionales frente a diferentes compuestos (Tabla 3).
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Tabla 3. Constantes cinéticas para ABTS y DMP de PcL salvaje y el muíante 7A9 expresado en S. cerevisiae
El mutaníe 7A9 alcanza unos niveles de expresión funcional en S. cerevisiae deíecíables en modo cinéíico iras 24 h de inducción en medio de expresión (0.72 U/L) en microfermentaciones en formato placa de 96 pocilios (200 μL de volumen final). Estos valores garantizan Ia posible explotación de 7A9 así como de cualquiera de los mutantes generados durante el proceso evolutivo, o de sus mutaciones individuales, para futuras mejoras por evolución dirigida. El disponer de una lacasa fúngica de alto potencial redox del basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus expresada funcionalmente y evolucionada en S. cerevisiae confiere las siguientes ventajas: i) La lacasa evolucionada y sus variantes objeto de Ia presente patente constituyen las primeras lacasas de alto potencial redox que han sido sometidas a evolución para su expresión funcional en S. cerevisiae siendo un vehículo idóneo para futuras aplicaciones en diversos sectores (industria de productos forestales -papel y madera-, biorremediación, industria textil, industria alimentaria, industria farmacéutica, industria química), ii) La lacasa evolucionada y sus variantes pueden ser evolucionadas en S. cerevisiae para mejorar diferentes propiedades (termoestabilidad, actividad a pHs básicos, oxidación de sustratos no naturales, resistencia a haluros) para después ser sobre- expresadas en otros huéspedes fúngicos heterólogos (Aspergillus niger) u homólogos (Pycnoporus cinnabarínus) a escala de mg-g/L tal y como se ha descrito para Ia lacasa salvaje de P. cinnabarinus, Io que supone una garantía en Ia transferencia del producto en diversas aplicaciones (Alves et al., 2004. Appl. Environ. Microbiol. 70:6379-6384; Record E., 2002. Eur. J. Biochem. 269:602-609). iii) La lacasa salvaje de P. cinnabarinus (y también Ia recombinante expresada en Aspergillus niger), ha sido utilizada con éxito en diferentes aplicaciones biotecnológicas (blanqueo y control del pitch de pastas de papel, degradación de contaminantes aromáticos, estabilización de bebidas). La evolución de su actividad catalítica hacia ciertos sustratos o el aumento de Ia estabilidad de Ia proteína en condiciones industriales, aumentará su potencial utilidad biotecnológica. (Patente ES2189683; Georis et al., 2003. Pycnoporus cinnabarinus laceases: an interesting tool for food or non-food applications. Proc. FAB2003, Mededelingen Faculteit Landbouwkundige en Toegepaste Biologische Wetenschapen, 2003; Ibarra et al., 2006. J. Chem. Technol. Biotechnol. 81 :1159-1165; Sigoillot et al., 2005. J. Biotechnol. 115:333-343; Gutiérrez et al., 2006. Environ. Sci. Technol. 40: 3416-3422).
Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxiribonucleótidos.
Los términos "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 (Fig.1). Construcción de pJRoC30-α-PcL.
Figura 2 (Fig.2). Paisajes del ensayo de screening frente a 2,6 dimetoxifenol (DMP) de Ia librería de índice de mutación medio (LMM) y Ia librería de índice de mutación bajo (LMB) en Ia primera generación. Las actividades de los clones de las bibliotecas de mutantes se representan en orden descendente. Las líneas discontinuas indican Ia actividad del tipo parental α- PcL.
Figura 3 (Fig.3). Esquema general del proceso de evolución artificial. No se incluye en el diagrama las mutaciones silenciosas introducidas. Las mejoras se calculan con respecto al correspondiente parental empleado como referencia durante el screening del ciclo evolutivo. El parental referente de Ia primera generación es α-PcL, el de Ia segunda generación es 1 D12 y el de Ia tercera generación 10A7.
Figura 4 (Fig.4). Paisaje del ensayo de screening frente a 2,2'azino-bis(3- etil-benzotiazolin-6-sulfonato (ABTS) de Ia segunda generación. Las actividades de los clones de Ia biblioteca de mutantes se representan en orden descendente. La línea discontinua indica Ia actividad del tipo parental usado como estándar interno en el screening (muíante 1 D12). Figura 5 (Fig.5). Paisajes de los ensayos de screening de Ia tercera generación con DMP y ABTS. Las actividades de los clones de las bibliotecas de mutantes se representan en orden descendente. Las líneas discontinuas indican Ia actividad del tipo parental usado como estándar interno en el screening (muíante 10A7). Los mutaníes con mejor acíividad freníe a ambos susíraíos se eligieron para los siguieníes re-screenings (resallado en circulo Ia variante 7A9). Figura 6 (Fig.6). Recombinación de mutaciones durante el proceso de evolución. Se resaltan en diferentes colores las mutaciones introducidas para apreciar los eventos de entrecruzamiento.
Figura 7 (Fig.7). Comparación entre los mejores mutantes de los tres ciclos evolutivos y Ia acumulación de mutaciones.
Figura 8 (Fig.8). Mutaciones introducidas en Ia lacasa madura durante el proceso evolutivo. A) parental α-PcL; B) muíante 7A9. Las esferas representan los cobres catalíticos. En azul se resaltan los ligandos de los cobres T1 y del cluster trinuclear 12/13. 7A9, acumula además de las tres mutaciones indicadas en esta figura, cuatro mutaciones en el péptido señal y una mutación silenciosa. Se agradece al Prof. Piontek por haber facilitado el acceso al fichero PDB de Ia estructura cristalográfica. Figura 9 (Fig.1). Caracterización bioquímica del muíante 7A9. A) Electroforesis (SDS-PAGE) de los disíiníos pasos de purificación de Ia varianíe 7A9. GeI de poliacrilamida al 7,5 % íeñido con Azul de Coomasie 1 ) Paírón de peso molecular; 2) Concenírado después de ulírafilíración bajo presión con N2 (membrana de 10 KDa, Amicon YM3, Millipore); 3) Después de Cromaíografía de baja resolución en columna de iníercambio aniónico débil (HiTrap-Q de Amersham Bioscience); 4) Después de cromaíografía de alia resolución en columna de iníercambio aniónico fuerte (Resource Q, Amersham Biosciences); 5) Misma fracción que 4 iras desglicosilación con Ia N-desglicosilasa PNGasaF; 6) Lacasa salvaje de P. cinnabarínus (PcL). B) Termoesíabilidad del muíaníe 7A9 y PcL salvaje. Las acíividades se midieron con ABTS 3 mM en aceíaío sódico 100 mM, pH 5. Las acíividades se normalizaron con Ia acíividad inicial a íemperaíura ambieníe aníes de Ia incubación. Cada punió represenía el valor medio de íres experimeníos independieníes. C) Perfiles de acíividad a difereníes pHs de 7A9 y PcL salvaje. Las acíividades se midieron con ABTS 3 mM en íampón Briííon y Robinson 100 mM ajusíado a los difereníes pHs de Ia medida. La acíividad lacasa se represenía normalizada con respecío a su valor ópíimo de acíividad. Cada punió represenía el valor medio de tres experimentos independieníes. MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.
EJEMPLO 1 : CONSTRUCCIÓN DE α-PcL
La sustitución de Ia secuencia señal de Ia lacasa nativa de Pycnoporus cinnabarínus (n-PcL) por Ia secuencia señal del factor α genera una proteína de fusión, α-PcL, constituida por Ia secuencia señal fusionada del factor α con el gen que codifica para Ia proteína madura. Para reemplazar Ia secuencia señal de n-PcL por Ia del factor α, se tomó como molde el vector de Stratagene™ pGAPZα, utilizado para expresión de proteínas en Pichia pastorís, que contiene el pre-pro péptido señal del factor α. En primer lugar, se linearizó pGAPZα con las enzimas de restricción EcoRI y Notl. El cADN lad de P. cinnabarínus (n-PcL, 1494 pb, Gen Bank accession n°: AF170093), fue amplificado con los oligonucleótidos cebadores NecoRI- directo (SEQ ID NO: 35) y CNotl-reverse (SEQ ID NO: 36) que incluyen dianas de restricción para EcoRI y Notl (GAATTC y GCGGCCGC respectivamente, subrayadas y en negrita), generando un molde de Ia lacasa madura (PcL) que excluye Ia secuencia señal nativa. Las condiciones de Ia reacción de amplificación fueron las siguientes: 400 nM del oligonucleótido N eco R I -di recto, 400 nM oligonucleótido CNotl-reverse, 0.25 mM dNTPs, 0.05 U/μL Taq polimerasa (Invitrogen), 0,5 ng/μL de n-PcL en tampón Tris- HCI 20 mM, pH 8,4 y 4 mM de MgCI2 en un volumen final de 50 μL. El programa de PCR empleado fue: 94 0C durante 5 min, 55 0C durante 5 min, 72 0C durante 5 min (1 ciclo), 95 0C durante 0.35 min, 50 0C durante 2 min, 72 0C durante 4 min (25 ciclos), y 72 0C durante 10 min (1 ciclo).
PcL fue digerido con EcoRI y Notl y ligado el vector linearizado pGAPZα generando Ia construcción pGAPZα-PcL. Dicho vector se transformó en células competentes de E. coli DH5α por choque térmico para sobre-producir y purificar el plásmido.
α-PcL se amplificó a partir de pGAPZα-PcL mediante PCR con ayuda de los oligonucleótidos NtpJRBgll I-directo (SEQ ID NO: 37) y CtpGAPZIac-reverso (SEQ ID NO: 38) los cuales incluyen dianas de restricción para BgIII - compatible con BamHI- y Notl (AGATCT y GCGGCCGC, respectivamente, subrayadas y en negrita). La reacción de PCR se llevo a cabo en 50 μl conteniendo 400 nM del oligonucleótido NtpJRBgll I-directo, 400 nM oligonucleótido CtpGAPZIac-reverso, 0.25 mM dNTPs, 0.05 U/μL Taq polimerasa (Invitrogen), 0,4 ng/μL de pGAPZα-PcL en tampón Tris-HCI 20 mM, pH 8,4 y 4 mM de MgCl2.EI programa de PCR empleado fue: 94 0C durante 5 min, 55 0C durante 5 min, 72 0C durante 5 min (1 ciclo), 95 0C durante 0.35 min, 50 0C durante 2 min, 72 0C durante 4 min (25 ciclos), y 72 0C durante 10 min (1 ciclo).
α-PcL fue subclonado en el vector lanzadera pJRoC30 (Novozymes, USA). pJRoC30 es un vector episómico bifuncional de 10477 pb que contiene el promotor GAL1 (inducible por galactosa), el gen de resistencia a ampicilina para Ia selección en E. coli y el gen URA3 que confiere auxotrofía para uracilo (las células de S. cerevisiae crecidas con este vector pueden cultivarse en medio selectivo -sin uracilo-). Se llevo a cabo Ia digestión de pJRoC30 con las enzimas BamHI y Notl, así como Ia digestión de α-PcL con BgIII y Notl. Se ligó α-PcL digerido y el plásmido pJRoC30 linearizado dando lugar a Ia construcción pJRoC30-α-PcL, (Figura 1 ). Debido a Ia estrategia de clonación utilizada, en el extremo amino terminal de Ia proteína aparecen dos aminoácidos extras (E-F) tras el procesamiento del péptido señal. Las mutaciones introducidas en Ia proteína madura durante el proceso evolutivo mantienen Ia numeración descrita para Ia lacasa madura de Pycnoporus cinnabarinus nativa. EJEMPLO 2. EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE α-PcL
1. ELABORACIÓN DE PROTOCOLOS PARA GENERAR DIVERSIDAD Y
CREACIÓN DE LAS LIBRERÍAS DE MUTANTES.
1.1 Ajuste de las condiciones de PCR mutagénica.
La generación de diversidad mediante PCR-mutagénica se llevó a cabo en un termociclador de gradiente (Thermocycler Mycycler, Biorad, EEUU) bajo los siguientes parámetros de reacción: 95 0C durante 2 min (1 ciclo); 94 0C durante 0.45 min, 53 0C durante 0.45 min, 74 0C durante 3 min (28 ciclos); y 74 0C durante 10 min (1 ciclo). Los oligonucleótidos utilizados para Ia amplificación mutagénica fueron RMLN directo (SEQ ID NO: 39; con sitio de unión a pJRoC30 en Ia posición pb 5'-160-181-3') y RMLC inverso (SEQ ID NO: 40; con sitio de unión a pJRoC30 en Ia posición pb 5'-2139-2158-3'). Para promover Ia ligación in vivo, los productos de PCR se diseñaron conteniendo extensiones con una homología de 40 pb y 66 pb para los extremos digeridos con Bam\λ\ y Xhol del vector linearizado, respectivamente.
En cada una de las generaciones, los correspondientes productos de PCR fueron concentrados (DNA clean concentrador TM-5 kit, Zymo Research, EEUU), cargados en un gel semipreparativo de agarosa de bajo punto de fusión y purificados con el kit Zymoclean gel DNA recovery (ZymoResearch, USAJ. Los productos de PCR fueron posteriormente clonados in vivo al transformar las células de S. cerevisiae, tras el promotor GAL1 del vector pJRoC30 previamente linearizado com Bam\λ\ y Xhol.
Para estimar el índice de mutación y evaluar los diferentes paisajes de evolución, se construyeron pequeñas genotecas de 174 clones (2 placas de 96 pocilios) empleando polimerasas con diferente espectro mutacional. A) Genotecas Mutazima-ll:
El índice de mutación se moduló variando Ia cantidad de ADN molde en Ia reacción de PCR. La concentración de cada uno de los reactivos, en un volumen final de 50 μL, fue Ia siguiente: 370 nM de oligonucleótido RMLN, 370 nM de oligonucleótido RMLC, 0,8 mM dNTPs, 3 % (v/v) DMSO, 0,05
U/μL de Mutazima ADN polimerasa (Genemorph Il Random Mutagenesis kit,
Stratagene), 93 ng/μL de pJRoC30-α-PcL para las genotecas de bajo índice de mutación y 40 ng/μL de pJRoC30-α-PcL para las de medio índice de mutación.
B) Genotecas Tao polimerasa/MnCI?:
En este caso, Ia tasa de mutación se controló variando Ia concentración de MnCl2 Adicionalmente también se analizó el efecto de concentraciones equilibradas/desequilibradas de dNTPs y de Ia concentración del ADN molde en Ia reacción de PCR mutagénica (Tabla 4).
1.2 Primera generación: PCR mutagénica con Mutazima-ll.
Se diseñaron y exploraron dos genotecas independientes, cada una de -1000 clones, usando como parental α-PcL. Las condiciones elegidas para Ia construcción de las genotecas de bajo índice de mutación (0-4,5 mutaciones/1000 pb) y medio índice de mutación (4,5-9 mutaciones/1000 pb) se recogen en el apartado 1.1. A. Las mezclas de transformación de cada una de las genotecas contenían una relación vector linearizado:productos de PCR 1 :4 (100 ng de vector y 400 ng de productos de PCR). El screening de punto final se desarrolló como se describe en el apartado 2 del presente ejemplo, preparando placas independientes para valorar Ia actividad en presencia de sustratos fenólicos y no fenólicos.
1.3 Segunda generación: barajeo in vivo de ADN mutagenizado.
Las mejores variantes de Ia primera generación (mutantes 1 D12, 3D3, 5F7 y 3G10) se tomaron como parentales y fueron sometidos a un nuevo ciclo de evolución mediante PCR mutagénica con Tag/MnC^, para posteriormente recombinar estos productos mediante un barajeo in vivo; se exploraron -2000 clones. Cada uno de los parentales fue amplificado mediante PCR propensa a error con dNTPs equillibrados y una concentración de MnC^ de 0,01 mM tal y como se detalla en Ia Tabla 4. Los productos mutagenizados por PCR se mezclaron en Ia misma proporción (400 ng totales, 100 ng de cada producto) y se transformaron conjuntamente con el vector linearizado (relación vectoπproducto PCR 1 :4). El screening de punto final se desarrolló como se describe en el apartado 2 del presente ejemplo, preparando placas independientes para valorar Ia actividad en presencia de sustratos fenólicos y no fenólicos.
1.4 Tercera generación: barajeo in vivo de ADN mutagenizado.
Las mejores variantes de Ia segunda generación (mutantes 10A7, 19C8, 20C7, 1 F10, 1C9, y 2D8) se tomaron como parentales y fueron sometidos a un nuevo ciclo de evolución mediante PCR mutagénica con Tag/MnC^, para posteriormente recombinar estos productos mediante un barajeo in vivo; se exploraron -2000 clones. Cada uno de los parentales fue amplificado mediante PCR propensa a error con dNTPs equillibrados y una concentración de MnC^ de 0,01 mM tal y como se detalla en Ia Tabla 4. Los productos mutagenizados por PCR se mezclaron en Ia misma proporción (400 ng totales, 100 ng de cada producto) y se transformaron conjuntamente con el vector linearizado (relación vectorproducto PCR 1 :4). El screening se desarrolló como se describe en el apartado 2 del presente ejemplo, preparando placas independientes para valorar Ia actividad en presencia de sustratos fenólicos y no fenólicos. En esta generación en particular, el screening pudo llevarse a cabo en modo cinético debido a Ia mejora de actividad tras tres ciclos evolutivos. TIPOS DE GENOTECAS 7aq/MnCI2 dNTPs dNTPs desequilibrados equilibrados
Componente
Concentración de Concentración ADN alta de ADN baja
Oligonucleótidos
9OnM 9OnM 9OnM (RMLN y RMLC) pJRoC30- α-PcL 1,5 ng/μL 0,1 ng/μL 0,1 ng/μL
0,2 mM dATP; 0,2 0,04 mM dATP;
0.3 mM (0.075 mM dGTP 0,6 mM 0,04 dGTP 0,1 dNTPs mM de dCTP; 0,6 mM mM dCTP; 0,1 cada uno ) dTTP mM dTTP
DMSO 3% (v/v) 3% (v/v) 3% (v/v) MgCI2 0,75 mg/mL 1,5 mg/mL 1,5 mg/mL Taq polimerasa 0,05 U/μL 0,05 U/μL 0,05 U/μL
0/ 0,002 mM/
0 mM / 0,05 mM / OmM/ 0,05 mM/ 0,005mM
MnCI2 1 0,1 mM/ 0,.1 mM/ /0,01mM /0,02
0,2 mM 0,2 mM mM/0,05mM/
0,1 mM/0,2mM
Tabla 4. Ajuste de las condiciones de las genotecas Tag/MnCI2 con las diferentes variables.
2. PROTOCOLO DE SCREENING DE ALTA CAPACIDAD
2.1 Transformación de células de S. cerevisiae.
Los medios YPD, medio mínimo líquido, las placas SC y el medio de expresión se prepararon tal como se indica en Zumarraga, M. et al. 2008{Proteins 71: 250-260.) con Ia salvedad de que en el medio de expresión se incluyó etanol 25 g/L para favorecer Ia secreción de Ia lacasa y CuSO4 en concentraciones finales de 2 mM para fermentaciones en microplaca y 4 mM para escala de producción. Las genotecas de cada ciclo evolutivo generadas mediante diferentes estrategias se transformaron en células de S. cerevisiae {Yeast transformation Kit, Sigma) para una expresión funcional de los correspondientes clones. Se incubaron colonias aisladas de células silvestres de S. cerevisiae en 20 ml_ de medio YPD líquido a 30 0C y 210 rpm en un agitador (Edmund Bühler GmbH SM-30, Alemania) durante toda Ia noche (DO600 > 2). Una cantidad adecuada del cultivo se inoculó en un volumen total de 120 ml_ de YPD atemperado para alcanzar una DO600 de 0,3. Se incubó de nuevo durante 4-6 h, hasta completar dos ciclos de crecimiento y alcanzar una DO6oo de 1 ,2. Las células se transformaron con las correspondientes genotecas en presencia del plásmido linearizado, con el kit de transformación de levadura. Inmediatamente antes del choque térmico (42 0C durante 15 min), se añadió DMSO a Ia mezcla de transformación con una concentración final de 10% (v/v) para aumentar Ia eficiencia de transformación (aproximadamente 20000 clones por reacción de transformación).
2.2 Preparación de las librerías para el screening de alta capacidad.
Las células de S. cerevisiae transformadas con Ia correspondiente genoteca y el vector pJRoC30 linearizado se sembraron en placas SC y se incubaron a 30 0C. Trascurridos 3-4 días se picaron colonias individuales y se inocularon en microplacas de 96 pocilios (Sero-well, Reino Unido) que contenían 50 μL de medio mínimo por pocilio. La columna completa número 6 de cada placa se inoculó con el tipo parental seleccionado del ciclo previo (columna de referencia) y uno de los pocilios (H1 ) no se inoculó (control). Las placas se sellaron con parafilm y se incubaron a 30 0C, 210 rpm y 80% de humedad relativa en un incubador con sistema de humidificación Minitron-INFORS (Biogen, España). Tras 48 h, se añadieron 160 μL de medio de expresión a cada pocilio y se volvieron a incubar a 30 0C y 210 rpm. Después de 24 h, se midió Ia DO600 para determinar Ia densidad celular de cada pocilio con un lector de microplacas Versa Max (Molecular Devices, EEUU). Se centrifugaron las placas (placas maestras) durante 5 min a 3200 g y 4 0C en una centrífuga Eppendorf 5810R (Alemania). 40 μl_ del sobrenadante de cada pocilio fueron transferidos desde Ia placa maestra a dos placas réplica (20 μl_ del sobrenadante en cada una), mediante un robot manipulador de líquidos Quadra 96-320 (Tomtec, EEUU). Con estas dos placas réplica se llevaron a cabo los screenings de actividad frente al sustrato fenólico DMP (2,6 Dimetoxifenol) y el sustrato no fenólico ABTS (2,2'azino-bis(3-etil-benzotiazolin-6-sulfonato)).
2.3 Ensayos colorimétricos.
El screening de actividad frente a ABTS se realizó añadiendo a Ia primera placa réplica 180 μl_ de tampón acetato 100 mM, pH 5,0 conteniendo ABTS 3mM, se agitaron las placas brevemente y se midió Ia absorbancia en el lector de placas a 418 nm. Las placas se incubaron a temperatura ambiente hasta que se desarrolló el color verde del radical catiónico ABTS#+ y se midió nuevamente Ia absorbancia (£413 = 36000 M"1cm"1). El screening de actividad frente a DMP se realizó añadiendo a Ia segunda placa réplica 180 μl_ de tampón acetato 100 mM, pH 5,0 conteniendo DMP 3mM, se agitaron las placas brevemente y se midió Ia absorbancia en el lector de placas a 469 nm. Las placas se incubaron a temperatura ambiente hasta que se desarrolló el color amarillo del DMP oxidado y se midió nuevamente Ia absorbancia (ε469 = 27500 M"1cm"1). Las actividades con respecto a cada sustrato se calcularon a partir de Ia diferencia de Ia absorbancia final e inicial. Las actividades relativas se normalizaron con Ia actividad del tipo parental de Ia correspondiente placa.
2.4 Re-screenings
Aquellos mutantes seleccionados que mostraron mayor actividad tanto frente a ABTS como DMP fueron sometidos a dos re-screenings consecutivos: Primer re-screening: alícuotas de 5 μl_ de los clones seleccionados se inocularon en placas multipocillo con 50 μl_ de medio mínimo. Las columnas y filas de los extremos de Ia placa (columnas 1 y 12, filas A y H) no se utilizaron. Tras 24 h de incubación a 30 0C y 210 rpm, se transfirieron 5 μl_ a los pocilios adyacentes, incubándose durante 24 h más. Finalmente se adicionaron 160 μl_ de medio de expresión y se incubaron durante 24 h. De esta manera cada clon fue crecido en 4 pocilios y el parental (estándar interno) se trató del mismo modo (fila D, pocilios 7-11 ). Las placas se sometieron al mismo protocolo de screening, con Ia salvedad de que cada valor de actividad procedió de Ia media de 4 microcultivos por clon.
Segundo re-screening: alícuotas de 100 μL de los clones más activos del primer re-screening se crecieron en 3 mL de medio YPD a 30 0C y 210 rpm durante 24 h. Se extrajeron los plásmidos de estos cultivos (Zymoprep yeast plasmid miniprep kit, Zymo Research). Como el producto de las zymoprep no era puro y Ia concentración del ADN extraído fue muy baja, se transformaron los plásmidos en células de E. coli supercompetentes XL2- blue según el protocolo correspondiente (Stratagene) y se seleccionaron en placas LB/amp. Colonias aisladas se inocularon en 5 mL de medio LB/amp y se crecieron durante toda Ia noche a 37 0C. Se extrajeron los plásmidos (NucleoSpin® Plasmid kit, Macherey-Nagel). Las células de S. cerevisiae se transformaron con los plásmidos de los mejores mutantes así como con el correspondiente tipo parental, y el screening se llevó a cabo de Ia misma manera, con Ia salvedad de que cada valor de actividad procedió de Ia media de 5 microcultivos por clon.
EJEMPLO 3: PRODUCCIÓN, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LOS MUTANTES
3.1 Producción de las lacasas en S. cerevisiae
Los clones de S. cerevisiae que contenían los genes de lacasas tanto del tipo nativo como de mutantes fueron cultivados en 3 mL de medio mínimo durante 48 h, a 30 0C y 250 rpm (Micromagmix shaker, Ovan). Una alícuota de este precultivo se inoculó para alcanzar una densidad óptica (DO6oo) de 0.25 en un volumen total de 50 ml_ de medio mínimo en un matraz de 500 ml_ con tapón poroso. Cuando se completaron dos ciclos de crecimiento (DOβoo = 1 ; 6-8 h de incubación), se añadieron 450 ml_ de medio de expresión conteniendo CuSO4 4 mM, etanol 25 g/L y se incubó a 20 0C y 250 rpm en un matraz de 2 L de base ancha (20 cm 0 en Ia base). El cultivo se paró tras 5 días cuando tanto el crecimiento celular como Ia actividad lacasa se estacionaron (DO600 28-32; actividad lacasa 20-40 U/L).
3.2 Purificación de los mutantes
1. Se centrifugó el cultivo del aparatado 3.1. a 13000 rpm durante 15 minutos a 4 0C. El sobrenadante se concentró por ultrafiltración tangencial. La muestra se hizo pasar a través de una membrana de 5 KDa de tamaño de poro (Minisette, Filtron) mediante un flujo proporcionado por una bomba peristáltica (Masterflex easy-load, Cole-Palmer). Se realizó un segundo paso de concentración mediante ultrafiltración bajo presión (ejercida con gas N2) con membrana de 10 KDa de tamaño de poro (Amicon YM3, Millipore).
2. Cromatografía de intercambio aniónico de baja resolución. Se utilizó un cartucho HiTrap-Q (Amersham Biosciences) acoplado a un equipo EconoSystem (Bio-Rad). Tras equilibrar el cartucho con solución A (acetato 25 mM pH 5), se aplicó Ia muestra y se lavó Ia columna con Ia misma solución para eliminar toda Ia fracción no retenida, hasta que Ia absorbancia a 280 nm fuese constante. La fracción retenida se eluyó con un gradiente en dos fases de solución B (NaCI 1 M en tampón acetato sódico 25 mM, pH 5), de 0 a 20% en 45 min y de 20 a 100% en 10 min, a un flujo de 1 mL/min.
3. Cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución. Se utilizó una columna Resource Q (Amersham Biosciences) acoplada a un equipo AKTApurifier (Amersham Biosciences). Se equilibró la columna con solución A (acetato sódico 25 mM pH 5). La fracción retenida se eluyó con un gradiente en dos fases con solución B (NaCI 1 M en acetato sódico 25 mM pH 5), de 0 a 20 % en 20 min y de 20 a 100 % en 10 min, a un flujo de 2 mL/min.
3.3 Caracterización bioquímica de los mutantes
A) Desglicosilación
Las proteínas purificadas se desglicosilaron con Ia péptido-N-glicosidasa F (PNGasa F) (Sigma), que hidroliza los oligosacáridos unidos a los residuos asparragina. Concretamente, 8 μg de lacasa pura se desnaturalizaron con SDS 0.2% (p/v) y β-mercaptoetanol 100 mM a 100 0C durante 10 min. Posteriormente se añadieron 2.5 Unidades de PNGasa F y Ia mezcla de reacción se incubó toda Ia noche a 37 0C. La reacción se paró a 100 0C durante 10 min. Los productos se analizaron en un gel de electroforesis (SDS-PAGE) teñido con azul de Coomasie.
B) Medida de Ia estabilidad térmica
El estudio de termoestabilidad se realizó con ayuda del termociclador Mycycler equipado con un formador de gradientes (Bio-Rad, EEUU), el cual permite crear gradientes de temperatura a diferentes intervalos. Se prepararon diluciones de las proteínas en tampón acetato sódico 100 mM, pH 5 de tal manera que alícuotas de 10 μL dieran una respuesta adecuada para medir Ia actividad en el lector de microplacas en modo cinético. Se incubaron 60 μL de lacasa por cada punto del gradiente. El gradiente de temperatura estudiado comprendió el intervalo 30-80 0C con temperaturas intermedias de 30.0 0C, 31.7 0C, 34.8 0C, 39.3 0C, 45.3 0C, 49.9 0C, 53 0C, 55 0C, 56.8 0C, 59.9 0C, 64.3 0C, 70.3 0C, 75.0 0C, 78.1 0C y 80.0 0C. A diferentes tiempos de incubación (2 h, 4 h y 24 h) se extrajeron alícuotas de 10 μL de lacasa y se mezclaron con 190 μL de de ABTS 3 mM en tampón acetato sódico 100 mM pH 5. La actividad se valoró en continuo (oxidación del ABTS a 418 nm). El tiempo 0 se determinó a partir de las correspondientes muestras incubadas a temperatura ambiente. Cada valor procedió de al menos tres medidas independientes.
C) Ensayos de actividad a diferentes pHs.
Los perfiles de pH de Ia actividad de las diferentes lacasas purificadas se realizaron en tampón ByR 100 mM a diferentes pHs (pH 2,0-9,0, ajustados con NaOH). Se prepararon diluciones de las enzimas en tampón acetato sódico 10OmM pH 5 para que alícuotas de 10 μL dieran una respuesta adecuada en Ia medida de actividad en el lector de microplacas en modo cinético. Las lacasas (10 μL) se añadieron por filas y el tampón a diferentes pHs (180 μL) por columnas. Finalmente, se añadieron 10 μL de ABTS 60 mM y se midieron las actividades de cada una de las condiciones por triplicado.
D) Determinación de los parámetros cinéticos
Los parámetros cinéticos (Km, Vmax, /ccat y kcJKm) de las enzimas nativa y de las mutantes se determinaron en un lector de microplacas VersaMax (Molecular Devices, USA). Se valoraron tanto sustratos no fenólicos (ABTS, ε4i8 = 36000 M"1 cm"1) como fenólicos (2,6-dimetoxifenol, ε 46g = 27500 M"1 cm"1) en tampón acetato sódico 100 mM, pH 5 a 25 0C. Los parámetros cinéticos se obtuvieron mediante un ajuste no lineal por mínimos cuadrados del modelo de Michaelis-Menten utilizando el programa informático Sigma Plot 7.101. Cada dato experimental se obtuvo a partir de Ia media de tres experimentos independientes. REIVINDICACIONES
1. Polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 o Ia SEQ ID NO: 29.
2. Polinucleótido según Ia reivindicación 1 que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17o la SEQ ID NO: 19.
3. Polinucleótido según Ia reivindicación 1 que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 o Ia SEQ ID NO: 29.
4. Construcción genética de ADN o ARN que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias: a. un polinucleótido según Ia reivindicación 2, para su transcripción in vitro o in vivo, b. una moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de (a), ó c. secuencia de nucleótidos de a), ó b), correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación en tiempo y lugar.
5. Construcción genética según Ia reivindicación 4 que además comprende uno de los siguientes tipos de secuencias: a. un polinucleótido según Ia reivindicación 3,

Claims

54REIVINDICACIONES
1. Polinucleótido que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17, Ia SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 o Ia SEQ ID NO: 29.
2. Polinucleótido según Ia reivindicación 1 que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 1 , Ia SEQ ID NO: 3, Ia SEQ ID NO: 5, Ia SEQ ID NO: 7, Ia SEQ ID NO: 9, Ia SEQ ID NO: 11 , Ia SEQ ID NO: 13, Ia SEQ ID NO: 15, Ia SEQ ID NO: 17o la SEQ ID NO: 19.
3. Polinucleótido según Ia reivindicación 1 que codifica el polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de Ia lista que comprende: Ia SEQ ID NO: 21 , Ia SEQ ID NO: 23, Ia SEQ ID NO: 25, Ia SEQ ID NO: 27 o Ia SEQ ID NO: 29.
4. Construcción genética de ADN o ARN que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias: a. un polinucleótido según Ia reivindicación 2, para su transcripción in vitro o in vivo, b. una moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de (a), ó c. secuencia de nucleótidos de a), ó b), correspondiente a un sistema o vector de expresión génica, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación en tiempo y lugar.
5. Construcción genética según Ia reivindicación 4 que además comprende uno de los siguientes tipos de secuencias: a. un polinucleótido según Ia reivindicación 3, 55
b. una moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de (a), ó c. Ia secuencia polinucleotídica de (a) ó (b) operativamente enlazada con un polinucleótido aislado según Ia reivindicación 1 , para su transcripción in vitro o in vivo.
6. Construcción genética según Ia reivindicación 5, en Ia que el polinucleótido que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15 se encuentra operativamente enlazado con el polinucleótido que codifica el polipéptido con Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 29.
7. Uso de los polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o de las construcciones genéticas según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, para producir lacasas fúngicas de alto potencial redox.
8. Método para generar lacasas de alto potencial redox, extracelulares, funcionales y solubles con actividad mejorada hacia uno o más sustratos, que comprende: a. diseñar una construcción genética que comprenda Ia SEQ ID NO: 31 operativamente enlazada a Ia SEQ ID NO:33, b. generar diversidad sobre Ia construcción genética de (a), y crear las librerías de mutantes, c. seleccionar los mejores mutantes de expresión y actividad.
9. Método según Ia reivindicación anterior que además comprende Ia identificación y el mapeo de las mutaciones introducidas en las variantes seleccionadas.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, donde Ia construcción genética del paso a) es Ia construcción genética según Ia reivindicación 5.
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