WO2010036141A1 - Имплантируемая нейроэндопротезная система, способ её получения и способ проведения реконструктивной нейрохирургической операции - Google Patents

Имплантируемая нейроэндопротезная система, способ её получения и способ проведения реконструктивной нейрохирургической операции Download PDF

Info

Publication number
WO2010036141A1
WO2010036141A1 PCT/RU2009/000067 RU2009000067W WO2010036141A1 WO 2010036141 A1 WO2010036141 A1 WO 2010036141A1 RU 2009000067 W RU2009000067 W RU 2009000067W WO 2010036141 A1 WO2010036141 A1 WO 2010036141A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
patient
implantable
spinal cord
Prior art date
Application number
PCT/RU2009/000067
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ
Виктор Иванович СЕВАСТЬЯНОВ
Original Assignee
Bryukhovetskiy Andrey Stepanov
Sevastianov Viktor Ivanovich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bryukhovetskiy Andrey Stepanov, Sevastianov Viktor Ivanovich filed Critical Bryukhovetskiy Andrey Stepanov
Priority to US13/121,069 priority Critical patent/US20110177170A1/en
Priority to EP09816502A priority patent/EP2347763A4/en
Publication of WO2010036141A1 publication Critical patent/WO2010036141A1/ru
Priority to US14/748,183 priority patent/US9750848B2/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/44—Vessels; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Endothelial progenitor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3878—Nerve tissue, brain, spinal cord, nerves, dura mater
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/32—Materials or treatment for tissue regeneration for nerve reconstruction

Definitions

  • the invention relates to the field of neurosurgery and tissue engineering of organs and can be used to replace defects in the nervous tissue of the brain and spinal cord during reconstructive treatment of the effects of traumatic injuries, ischemic lesions and surgical interventions on the central nervous system (CNS) and the autonomic nervous system (BHC) a mammal, for example, a human.
  • CNS central nervous system
  • BHC autonomic nervous system
  • HSCs hematopoietic stem cells
  • peripheral blood enriched with cells containing the CD34 antigen in a final concentration of (40 ⁇ 100) -10 6 cells / ml.
  • the therapeutic treatment of traumatic disease of GM and CM is carried out by intrathecal or intraventricular administration of this drug to a patient (RU 2283119 Cl, A61K35 / 14, 2006).
  • the use of the drug from HSC alone proved to be insufficiently effective in the treatment of GM and CM nervous tissue defects.
  • NeuroGel TM for filling defects in neural tissue
  • the use of the NeuroGel TM biopolymer prosthesis is also not effective in the treatment of GM and CM nerve tissue defects.
  • the NeuroGel TM biopolymer contains ingredients prohibited for human use.
  • a universal heterogeneous collagen matrix for implantation is also known, which is an elastically elastic mass obtained from two sources of collagen, one source being the tissue of a vertebrate animal of one class and the second one of an animal of another class, and consisting of two phases: solid - in the form of collagen microspheres mammalian tissue, and liquid - from denatured collagen of bird tissue.
  • This heterogeneous collagen-containing matrix was proposed to repair damage to soft tissues and organs by implantation (RU 2249462 Cl, A61K38 / 39, 2005). This matrix is adopted as a prototype of the proposed implantable neuroendoprosthetic system.
  • An object of the present invention is to develop a tissue-replaced artificial cell-biopolymer neuroendoprosthetic system (ICBP NEPS) for surgical repair of nerve tissue defects GM and CM, which allows stimulation of the regeneration and growth of damaged axons of nerve cells, as well as the development of a method for producing this system and a method for reconstructive neurosurgical operations to replace defects in GM and / or CM and / or the autonomic nervous system of a mammal using the indicated si systems, which will be referred to as the implantable neuroendoprosthetic system or, in short, ICBP NEPS.
  • ICBP NEPS tissue-replaced artificial cell-biopolymer neuroendoprosthetic system
  • the present invention provides an implantable neuroendoprosthetic system for replacing defects in the brain and spinal cord and the autonomic nervous system of a mammal during reconstructive neurosurgical operations, which is an elastically elastic cell-biopolymer biologically active mass obtained from a heterogeneous collagen-containing matrix of biocomposites for preparations from various types of autologous cells of the patient.
  • this biocomposition contains NaCl solution-containing neural stem cells (HCK), neuroglial lining cells (NGOK), endothelial cells with a CD34 + marker (EC) and purified mononuclear cells (MH) in the following ratio of components (in parts by cell number): HCK - 0.8-1.2; NGOK - 1.6-2.4; EC - 4-6; MH - 4000-6000. A predominantly 0.5-1.3% NaCl solution was used. As a heterogeneous collagen-containing matrix, the composition of the heterogeneous implantable gel "SpheroFGEY" was used.
  • the specified biocomposition may additionally contain stimulators of cellular regeneration and growth factors of nerves and blood vessels.
  • the most optimal, effective and safe is the composition of IKBP NEPS, when it contains the following number of cells in 0.5-1 ml of 0.9% NaCl solution per 1 ml of heterogeneous collagen-containing matrix : HCK - 10 6 ; NGOK - 2 10 6 ; EC - 5 10 6 ; MH - 5 10 9 , as well as 0.1-0.2 ml of a standard solution of a cell regeneration stimulant (methyluracil, leucogen, ATP, pentoxyl, etc.).
  • a cell regeneration stimulant methyluracil, leucogen, ATP, pentoxyl, etc.
  • Perfusion is carried out mainly by centrifugation. Centrifugation is carried out mainly for 1, 5-2.5 minutes at a speed 1500-2500 rpm.
  • the specified biocomposition is prepared from cryopreserved cell preparations, which are immediately thawed in a water bath at a temperature of 37-40 0 C immediately before receiving the implantable neuroendoprosthetic system and then washed at least twice with physiological saline NaCl. More specifically, said biocomposition contains NaCl solution-containing neural stem cells (HCK), neuroglial parietal cells (NGOK), endothelial cells with a CD34 + marker (EC) and purified mononuclear cells (MH).
  • HNK neural stem cells
  • NGOK neuroglial parietal cells
  • EC endothelial cells with a CD34 + marker
  • MH purified mononuclear cells
  • the source of HCK and OGC is the patient’s olfactory nose lining
  • the source of EC and MH is the patient’s bone marrow or the patient’s mobilized autologous stem cell leukoconcentrate obtained by separation of peripheral blood after stimulation of the patient with a granulocyte colony stimulating factor.
  • Tissue regeneration stimulants and growth factors of nerves and blood vessels can be added to this biocomposition.
  • the proposed method for producing ICBP NEPS is carried out under sterile conditions or directly in the operating room (ex tert) or in a culture laboratory (implantation period of up to 6 hours).
  • the proposed method of reconstructive neurosurgical surgery to replace defects in the brain and / or spinal cord and / or the autonomic nervous system of a mammal including implantation of a neuroendoprosthetic system in the form of an elastic cell-biopolymer biologically active mass into a defect in a nervous tissue, obtained from a heterogeneous collagen-containing matrix for implantation and biocomposition of cell preparations from various types of autologous cells patient .
  • said biocomposition contains NaCl solution-containing neural stem cells (HCK), neuroglial parietal cells (NGOK), endothelial cells with a CD34 + marker (EC) and purified mononuclear cells (MH).
  • the "SpheroFGEYA" heterogeneous implantable gel composition is used predominantly.
  • the neuroendoprosthetic system is implanted by placing it in a defect according to the type of “filling” with filling the entire volume of the cyst or damage to the brain and / or spinal cord. After placing the neuroendoprosthetic system in the defect, it is closed with autologous muscle fascia or artificial dura mater and / or biodegradable synthetic polymer membrane for restrictions on the contact of the neuroendoprosthetic system with the cerebrospinal fluid of the patient.
  • a biodegradable synthetic polymer shell a predominantly implantable biopolymer membrane "Elastopob" ® is used.
  • the neuroendoprosthetic system is implanted by forming a conduit from an artificial prosthesis of the artery and the neuroendoprosthetic system, which at least partially fill this prosthesis, placing the conduit in the diastasis zone between the ends of the damaged spinal cord and subsequent suturing of the soft membrane of the distal and proximal ends of the damaged spinal cord brain to the walls of the conduit.
  • the length of the artificial prosthesis of the artery is chosen equal to the length of the diastasis, and the width of this prosthesis is chosen to the diameter of the spinal cord at the site of damage.
  • the implantable biopolymer membrane "Elastopob” ® is manufactured by Biomir-servis CJSC (Moscow) in accordance with TU 9398-002-54969743-2006, reg. beats M> FS 01032006 / 5581-06 dated 12.28.2006 f.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the effectiveness of the treatment of patients with traumatic disease of GM and CM using the method of the present invention and the traditional method; in FIG. 2 - patient urograms before (A) and after (B) implantation of ICP NEP according to the present invention.
  • the consistency and biostructure of the proposed ICPB NEPS provide adequate modeling of the neuroimplant in damaged areas of the brain and local stimulation of regeneration processes in the pathological zones of GM and CM.
  • the use of drugs from autologous cells for biocomposition in ECBP NEP only avoids the problems of histocompatibility and immune conflict, as well as the need for the use of immunosuppressants.
  • the risk of infection of the patient with infectious and viral diseases is excluded. Also excluded the risk of infection prions, possible when using xenogenic donor cell preparations.
  • the specific amount of NEPS used is determined by the volume, nature and location of brain damage.
  • the basic element in the creation of the proposed NEBP NEPS was the development and production of a polymer matrix that would meet the specific requirements of the “bridge” between the damaged areas of GM or CM, perform support and nutritional functions for cell preparations and a guide vector for axons of affected autoneurons and neuroglial cells, and stimulate regeneration of damaged axons and ensured their germination through the zone of nerve tissue defect, inhibiting the processes of “matching” (twisting).
  • the proposed matrix must meet safety criteria and biodegrade in a predetermined time interval (8-12 months) for safe components, being replaced by restored nervous tissue.
  • Preferred for use in the proposed ICBP NEPS is a matrix in the form of a heterogeneous implantable gel composition having the trade name "Cepo®GEL", protected by the RF certificate for trademark N ° 26977 '4 and manufactured by Biomir Service (Moscow) according to TU 9398-001- 54969743-2006 dated 26.12.2006, reg. beats N ° FS 01032006 / 5580-06 dated 12.28.2006
  • the SphereFGER matrix consists of microparticles of type VII cross-linked collagen obtained from farm animals distributed in an elastic homogeneous gel and represents a unique complex of peptides (30-50 mg / g), uronic acids (0.8-1.2 mg / g) and hexosamines (2.0-3.0 mg / g). In amino acid composition, it is identical to collagen, but surpasses it in the content of hexosamines by 2 times, and uronic acids by more than 15 times. Matrix Sphero® GEL is stable during long-term storage and is not prone to the phenomena of syneresis (release of the liquid phase). In this state, it does not mix with water and hydrophobic liquids.
  • this gel turns into a liquid that mixes in all proportions with water and cross-linked collagen microparticles.
  • the size of the microparticles in the gel can be changed from 30 to 300 microns.
  • the average bioresorption time in the body is from several weeks to 9 months, depending on the implantation site and the size of the microparticles.
  • the high biocompatible and biostimulating properties of the Cfepo® GEL biopolymer implant have been experimentally proven and clinically confirmed, which contribute to restoration processes in places tissue damage.
  • bioactive artificial synovial fluid in the therapeutic treatment of deforming arthrosis of the knee joints
  • Endothelial cells with a marker CD34 + (EC) and neural stem cells (HCK) have directed migration to the damaged areas.
  • Transplanted cells form clusters of progenitor cells in brain tissue. This phenomenon has become key in addressing the issue of regeneration of damaged brain.
  • EC CD34 +
  • HCK neural stem cells
  • ICBP NEPS is an artificial analogue of nerve tissue containing its main cellular elements (neurons, neuroglial cells, endotheliocytes, etc.) and a polymer matrix with specified biodegradation parameters (from 8 to 12 months). Consistency and bioplasticity of IKPB NEPS allow adequate modeling of a neuroimplant in damaged anatomical structures of the brain, as well as provide local stimulation of regeneration processes in the damage zone. ICPB NEPS is able to perform supporting functions of the “bridge” and “nutrient medium” for the germination of damaged axons of nerve cells through pathologically altered areas of brain tissue.
  • HCKs which are in the biocomposite of the proposed ICPB NEPS, are able to reconstruct damaged nerve tissue and, first of all, ensure restoration of the gray matter of the spinal cord, and NGOK can stimulate the differentiation of blood precursor cells into astrocytes and oligodendrocytes, which can recreate white matter and be a source of cells capable of realizing remyelination of damaged axons.
  • NGOK can stimulate the differentiation of blood precursor cells into astrocytes and oligodendrocytes, which can recreate white matter and be a source of cells capable of realizing remyelination of damaged axons.
  • CD34 + CD45- hematopoietic stem cells
  • non-hematopoietic stem cells in the mononuclear fraction (MH) of peripheral blood in a cell biocomposition after stimulation with colony-stimulating factors allows the production of a large number of growth factors, which are the most effective means of axon regeneration.
  • the suspension of cultured NGOK and HCK is prepared according to standard methods.
  • the source of these cells is a fragment of the olfactory lining of the patient’s nose, taken by otolaryngological endoscopic surgical manipulation.
  • the preparation of hematopoietic stem cells, which are the source of EC, as well as non-hematopoietic stem cells located in the mononuclear fraction (MH), is carried out in accordance with the technology described in RU N ° 2283119 and in the registration certificate of the Federal Service for Supervision in Healthcare and Social Development M> ⁇ -2006- / 151 dated 01.07.2006.
  • the proposed method for obtaining ICBP NEPS and the method for conducting neurosurgical surgery can be carried out only in the conditions of the neurosurgical operating department of the surgical department and the department of anesthesiology and intensive care of a multidisciplinary medical institution licensed for high-tech medical activity in neurology, neurosurgery, collection of hematopoietic cells and the use of cellular technologies neurosurgeon specialists and resuscitation anesthetists trained the use of cellular technology.
  • the medical institution must be equipped with modern diagnostic tools (MPT, spiral computed tomography, angiographic technique, cytofluorimeter, blood separator) or have agreements with institutions that have these tools.
  • a laboratory that certifies and certifies autologous peripheral blood hematopoietic stem cells (AHSCC), HCK, NEGC and EC should be licensed as a laboratory that has the right to use cell technology, meet the requirements of the GLP standard (Good Laboratory Practice - Good Laboratory Practice) and be able to conduct a complete analysis of the cellular preparation in the volume recommended by the European registry of bone marrow stem cell transplantation.
  • the laboratory should be able to conduct tests for the sterility of the biological product, toxicity, cultural work with this biomaterial, i.e. have a sterile box with a laminar cabinet, a CO 2 incubator, a bifocal microscope and a set of reagents for cultural work. Specialists should have an additional specialization in transfusiology.
  • the technology of using the proposed ICBP NEPS consists of a series of successive stages: I - a specialized examination of the patient;
  • a mandatory clinical and paraclinical examination of the patient is carried out according to the standard protocol.
  • An analysis of the diagnostic parameters of the pathological focus is carried out, a strategy for conducting tissue engineering of GM or CM is being developed, indications and contraindications for implanting ICDB NEPS are established, the timing of each stage, taking into account the data from the examination.
  • mathematical modeling of cell transplantation and planning of the volume of the cell preparation for the preparation of ICPS NEPS according to MPT are carried out.
  • This stage should not be in the nature of a formal analysis and examination. It is at this stage that absolute and relative contraindications are determined, the medical and social prognosis of the operation for tissue engineering of GM and CM for the patient is clearly defined.
  • the heterogeneous matrix “Sphero® ⁇ h” is an elastically elastic mass that is stable during long-term storage and not prone to synergism (liquid phase separation).
  • the biopolymer matrix decreases sharply, while the physical state of the globular (solid) component does not change.
  • the resulting matrix has a fairly low immunogenicity.
  • antibiotics can be introduced into the matrix.
  • Antibiotics can be penicillins (e.g. benzylpenicillin, cloxacillin, ampicillin), cephalosporins (e.g. cephaloridin, cefuroxime, cefotetan, ceftazidine), carbopenems (e.g. merapenem), monobactams (e.g. aztrelicinamides, e.g. ), tetracyclines (e.g.
  • tetracycline, minocycline macrolides (e.g., erythromycin, azithromycin), lincosamides (e.g., lincomycin), peptide group antibiotics (e.g., polymyxin B, polymyxin M, ristomycin, bacitracin).
  • macrolides e.g., erythromycin, azithromycin
  • lincosamides e.g., lincomycin
  • peptide group antibiotics e.g., polymyxin B, polymyxin M, ristomycin, bacitracin.
  • stimulators of cell regeneration for example, methyluracil leucogen, adenine triphosphoric acid (ATP), pentoxyl, potassium orotate, riboxin, etaden can be used.
  • Antibacterial and antiviral components, as well as antiplatelet agents, can also be added to the Cfepo®GER composition.
  • Stimulators of cell regeneration are perfused in Cfero® Tel directly in the operating room in a volume of not more than 0.2 ⁇ l per 1 ml of matrix.
  • the matrix “C ⁇ j6ep ⁇ ®GEL” introduced directly into the defect zone is replaced over time with the original tissue without the formation of scar tissue.
  • biodegradation time from a few weeks to several months (the final products of biodegradation are carbon dioxide and water);
  • the procedure is conditionally divided into two parts - the mobilization of stem cells in peripheral blood and the collection of stem cells.
  • Stem Cell Mobilization in Peripheral Blood is conditionally divided into two parts - the mobilization of stem cells in peripheral blood and the collection of stem cells.
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • the donor receives 8 injections of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), subcutaneously with an interval of 10-12 hours for 4 days.
  • G-CSF is a medical product obtained by genetic engineering, and is an absolute analogue of the human factor.
  • the dose of the drug is 2.5 mcg / kg, on the last day the dose doubles.
  • a general blood test is performed daily and on the 4-5th day an abdominal ultrasound is done.
  • the duration of the procedure is 3-4 hours, depending on the speed of the procedure, the weight of the patient and the parameters of the blood test.
  • the procedure is performed by taking blood from one vein, treating the blood inside the separator, taking a certain volume of stem cells and returning the remaining blood components to the donor through another vein.
  • Venous access is carried out by puncture of 2 peripheral veins or through a double-lumen central catheter installed in the subclavian vein for the duration of the session.
  • the average volume of collected material is 300-400 ml.
  • the collected material is evaluated by two parameters: by the total number of nuclear cells (UC) in the separat and by the number of CD34 + cells per kilogram of patient weight. UC in the separatum is determined by counting in the Goryaev’s chamber before any manipulations.
  • the percentage of CD34 + cells in the cell suspension obtained during cytapheresis is determined by flow cytometry.
  • the subpopulation composition of CD34 + cells is determined cytofluorimetrically using the triple label method (simultaneous staining of cells with antibodies to 3 different antigens loaded with various fluorochrome dyes).
  • the determination of the number of progenitor cells is carried out cytofluorimetrically, in a direct immunofluorescence reaction (RIF).
  • a double-label method is used with simultaneous staining of the cell substrate with monoclonal antibodies (MKA) to the CD34 antigen, the main marker of stem pool cells of hematopoietic cells and to the CD45 molecule, the general leukocyte antigen that determines all hematopoietic cells.
  • MKA monoclonal antibodies
  • IgGl isotype immunoglobulins
  • the cells of the peripheral blood and the cytapheresis product are freed from red blood cell impurities by a standard lysis procedure and subsequent washing in buffered saline with the addition of bovine serum albumin (PBS-BSA) by centrifugation at 1000 g for 5 minutes.
  • PBS-BSA bovine serum albumin
  • PBS-BSA can be replaced by Hanks or 199.
  • Erythrocyte lysis technique 1. Add 2 ml of the lysing solution to 0.2-0.5 ml of the cell pellet, mix, incubate until the solution becomes clear (lacquered).
  • a direct RIF is performed in a 96-well plate, and a panel of 3 holes is used to determine the amount of AHSCC in any material:
  • At least 500,000 cells per well are introduced into the wells.
  • the cells are washed twice from unbound antibodies by centrifugation for 5-7 minutes at 1000 g.
  • Cells are transferred to special plastic tubes for counting on a flow cytometer.
  • the volume of the cell suspension in each tube was adjusted to 200-500 ⁇ l by adding PBS-BSA to the cells. The account should be carried out immediately after setting the reaction.
  • CD34 + cells in peripheral blood represent a small cell population. Even in conditions of preliminary stimulation of hematopoiesis, the maximum percentage of these cells is 1.0-3.0%. Therefore, when counting these cells, at least 20,000 cell events should be accumulated in each analyzed sample.
  • CD45 + cells which includes all hematopoietic cells.
  • a gate implies an event accumulation region limited by certain parameters.
  • SSC / FL-1 CD45 FITC
  • FL-I abscissa
  • FL-I abscissa
  • cellular events will be arranged according to their granularity (cytometric, and not a morphological term).
  • the absolute number of CD34 + cells in 1 ⁇ l of blood and cytoconcentrate was calculated based on the number of leukocytes in the hemogram on the day of the study.
  • the device has a menu for recording Acquisitiop cell samples.
  • JVbI IgGlPE + IgGl FITC
  • JV ° 2 IgGl PE + CD45 FITC
  • the gate which includes only CD45 + events in the JVb 2 sample and contains the minimum number of cellular events in the JVb 1 sample.
  • the device is switched to the recording mode of samples (pormal) and the JVb 1 sample is collected and recorded on 20,000 cell events without a gate (the entire cell population). Recording this sample in the gate does not make sense, since it lacks MKA for CD45 antigen. As indicated above, this test is necessary for the correct choice of a gate containing only CD45 + events.
  • a control marker is set in such a way that there are practically no cellular events in the lower right quadrant. AT on average, for the vertical bar of the marker, the values will be about 130 (to the right of 10 2 ), and for the horizontal bar of the marker the average values will be 60, which corresponds to the concept of SS ⁇ -low, i.e. cells with a minimum number of cell inclusions. Thus, non-specific binding levels will be equal to or close to zero. 3. Automatically go to the Na sample 3. All instrument readings taken for the second sample are saved.
  • the cytogram is opened in the SSC / FL-2 parameters, the gate selected earlier during the collection by CD45 + cell events is saved, and the values of the control marker established by sample N ° 2 are saved. Only non-specific levels of the cytogram will be reflected on the abscissa axis binding, as in the second test, and specific CD34 + events. The percentage of CD34 + cells is automatically displayed by the device.
  • the separated cells are concentrated by centrifugation at a speed of 2000 rpm for 10 min at + 18 ° C.
  • plasma is removed from the container as much as possible, the cells remain in a volume of 40-60 ml.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • polyglucin allowed to reduce the amount of DMSO by half, to 5-6% of the final concentration, since polyglucin is able to disaggregate cells and thereby improve the penetration of cryophylactics into cells, and in addition, polyglucin (6% dextran) is itself a cryophylactic.
  • nucleus-containing cells as well as CD 34 + cells to be frozen, are counted.
  • the ratio of the volume of the plastic container to the volume of the material frozen in it and the concentration of frozen cells are important. It was found the optimal concentration of frozen cells is from 40 to 6 to 100 to 6 cells in 1 ml.
  • the number of polymer ampoules (15-20) for deep freezing is selected.
  • the cell suspension is transferred into a container for cryopreservation.
  • the cooling rate of the material at temperatures from 0 ° C to -40 ° C is 1.1 degrees per minute.
  • the crystallization plateau is smoothed, which is usually clearly expressed during software freezing in an electronic device, and the composition of the frozen material remains unchanged during storage.
  • the container can already be transferred to a storage facility for long-term storage, where it will be in liquid nitrogen or its vapor until transplantation. Preparation of the drug AGSCPC for use. Defrosting hematopoietic stem cells
  • Thawing is carried out immediately before transplantation in a water bath at a temperature of 37-40 0 C until the frozen material passes into the liquid phase. Subsequently, by centrifugation at 1500 rpm, mobilized hematopoietic stem cells are deposited on the bottom of the centrifuge tube, the supernatant is aspirated, and 1 ml of 0.9% physiological NaCl solution is added. The procedure is repeated twice. A thawed autologous stem cell preparation can be used up to 6 hours after preparation. If the drug is not used during this time, then it must be disposed of.
  • Tissue olfactory epithelium was obtained from the upper third of the upper nasal passage of adult patients.
  • the resulting tissue was washed in a Hanks solution containing antibiotics (streptomycin, penicillin) and antimycotic (amphotericin).
  • the tissue was ground and incubated in a solution of trypsin (0.05%) and EDTA (0.02%) (40 min, 36.5 0 C).
  • the tissue was dissociated by repeated pipetting, centrifuged and the pelleted cells were washed with Hanks solution with 5% serum.
  • the total number of cells in suspension and the percentage of viable cells were determined in the Goryaev chamber using trypan blue staining.
  • Cells (final concentration of 100,000 cells / ml) were cultured in 12-well plates on a polylysine-laminin substrate for 10-15 days (5% CO 2 , 36.5 ° C) in an environment of the following composition: DMEM / F12 (Gibco), 10% fetal bovine serum (Gibco), glutamine 2 mM (Gibco), glucose 0.8%, a mixture of insulin, transferrin and sodium selenite (Gibco, 1: 100), HEPES buffer (IO mM), Numap neugegulin-1 ⁇ - 1 / heregulin 1- ⁇ -l EGF dosage 2 pg / ml (R&D Systems).
  • Control samples showed that at least 90% of the cells retain their viability after thawing.
  • cytochemical identification of glial cells of the olfactory epithelium part of the suspension of each passage was cultured on coverslips (22x22 mm) in Petri dishes for 1 week.
  • the tissue of the olfactory lining including the olfactory epithelium and the layer of connective tissue (lamipa rorgia), is obtained from patients with spinal cord injury and treated according to the standard cultural protocol.
  • the resulting tissue was delivered to the laboratory in a chilled Hanks solution without Ca 2+ and Mg 2+ (HBSS) containing antibiotics and antimycotics (1: 100; Gibco). Delivery time does not exceed 2 hours.
  • HBSS Ca 2+ and Mg 2+
  • blood vessels are removed from the mucous membrane, after which the tissue is ground and incubated for 40 min at 36.5 ° C in a trypsin / EDTA 0.25% solution prepared at 0 01 M phosphate buffer (PBS, pH 7.4).
  • DMEM medium Gibco
  • HBSS Hanks balanced salt solution
  • fetal calf serum Vetal bovipe serum.
  • FBS.Gibso.Ivitgohep glucose 0.8%, glutamine 2 mM (Gibso), additives B27 (Sigma), HEPES 20 mM, growth factors (only for primary cultures) - fibroblast growth factor (FGF2, lpg / ml Sigma), neuro growth factor (NGF 2 pg / ml, Sigma).
  • FGF2, lpg / ml Sigma fibroblast growth factor
  • NGF 2 pg / ml, Sigma neuro growth factor
  • the resulting cell suspension is centrifuged (3 min at 1200 rpm), the pellet is resuspended in a nutrient medium of the same composition.
  • the number and viability of the dissociate cells are determined in the Goryaev chamber after staining with a 0.1% trypan blue solution. For subsequent cultivation, cell suspensions with only 85-95% viable are used. cells.
  • Dissociated cells (5-10 5 cells / ml) were cultured in 12-well plates on a polylysine-laminin substrate for 14 days (36.5 ° C, 5% CO 2 ). A partial change of 1/3 of the nutrient medium is performed twice a week. The primary culture after the formation of the confluent monolayer is removed using a trypsin / EDTA solution. After washing in HBSS and centrifugation, the cells are resuspended in culture medium. The cell suspension (10000-12000 cells / cm 2 ) is transferred to 12-well tablets or vials (area 25 cm 2 ). In this way, cultures are passaged 4 times until a drainage monolayer is formed.
  • the free-floating neurospheres formed in the cell monolayer attached to the substrate are selected using the Pasteur pipettes and dissociated by the enzymatic treatment described above. Isolation of the neurospheres allows you to separate them from the lining glial cells, fibroblasts and stromal (supporting) cells attached to the substrate.
  • the cell suspension of neurosphere cells after washing and centrifugation, is resuspended in a nutrient medium and cultured in 12-well plates (10000-12000 cells / cm 2 ) and on coverslips (18x18 mm) in Petri dishes until a drainage monolayer is formed. The resulting cultures are used for itological and immunocytochemical studies. Part of the cells of the last passages are frozen in a cryopreservation medium (90% serum, 10% dimethyl sulfoxide) and stored in liquid nitrogen. Immuno-cytochemical studies
  • the cell monolayer is fixed in a 4% paraformaldehyde solution prepared in 0.01 M phosphate buffer (pH 7.4) for 30 minutes. After washing in PBS (3x10 min.), The cells are incubated for 24 hours at 4 ° C with primary antibodies to ⁇ -tubulin (1: 300; Chemisop), nestin (1: 100, Chemisop) and neuronal specific enolase (1: 100, antibodies received in our laboratory). After washing in PBS, cells are sequentially treated with biotinylated antibodies with an avidin-biotin complex (ABC, Test Laborotories, Ips), a solution of diaminobenzidine prepared on phosphate buffer (DBA 0.5 mg / ml, hydrogen peroxide 0.03%). The preparations are dehydrated and placed under coverslips in a synthetic resin (Epellap, Megk).
  • the cell culture medium consists of Iskov medium in the Dubelko modification with the addition of 0.5 g / l of serum albumin, 0.39 ⁇ g / ml of human insulin and 60 ⁇ g / ml transferrin.
  • 100 ng / ml stem cell growth factor (SCF), 20 ng / ml Flt ⁇ (Flt ⁇ L) and 20 ng / ml thrombopoietin TPO are added to the culture medium.
  • the cultivation mode is as follows. Cells were cultured at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . Fresh medium and cytokines are added every third day. The cultivation time is 5-7 days.
  • the preparation of purified mononuclear cells is prepared from a cryopreserved and thawed cell preparation of mobilized autologous stem cells (MACK) by “washing” from it a 10% DMSO solution by 3-fold centrifugation at 2000 rpm with physiological solution of a 0.9% NaCl solution.
  • MACK mobilized autologous stem cells
  • Stage III Reconstructive neurosurgery on CM or GM, intraoperative preparation of ICBP NEPS, implantation of IPBK NEPS Intraoperative preparation of ICBP NEPS
  • ICPS NEPS IC-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic factor-derived neurotrophic acid.
  • ICBP NEPS Preparation of ICBP NEPS is as follows. Cell preparations in accordance with the above proportions are mixed in the required volume in a sterile tube and evenly mixed by 2-3 sampling of the cell mixture into the syringe and returning it to the tube.
  • the preparation "Sphero®GEYA” is removed from the refrigerator and heated to a temperature of 37.5-38 ° C. Take a single syringe with a volume corresponding to the required estimated volume of the ICBP NEPS. The piston is removed from the syringe and the cannula for the syringe needle is closed with a rubber or plastic stopper (the syringe is used as a test tube). At the bottom of the syringe the tubes are placed in 1 ml of the Cepo® GEYA matrix and up to 1 ml of the cellular biocomposite is added to it. It is centrifuged for 2 minutes in a mini-centrifuge at a speed of 2000 rpm.
  • the liquid part of the biocomposite with the cells is perfused into the matrix "Cepo® GEJlh".
  • the above procedure is carried out in layers, placing the Sphero® GEYA matrix and the cell biocomposite according to the “multi-layer pie” type and also centrifuging for 2-3 minutes.
  • a piston is inserted into the syringe and air is removed.
  • a plastic sterile armor (venous catheter) is worn on the syringe cannula, which will be used for implantation.
  • the NEPS in the syringe is left under sterile conditions at room temperature (20-22 ° C) to cool and give it a toothpaste consistency. Then ICBP NEPS can be used for implantation.
  • CM or GM and implantation of ICBP NEP Plastic surgery of CM defects using ICBP NEP is performed during the standard neurosurgical operation of decompression laminectomy at the level of trauma by opening the dura mater (TMO) and performing radiculomyelolysis of the lesion area.
  • ICBP NEPS laid on the surface of the defect CM and simulated along the entire length of the damage.
  • intramedullary or intracerebral implantation ICBP NEPS is isolated from the direct impact of cerebrospinal fluid. So, in the presence of an intramedullary cyst (cyst) CM, they open, the cysts are drained, and ICPB NEPS is implanted inside the CM cyst.
  • a conduit - tube-like conductor (TOP) is microsurgically modeled, the walls of which are formed either from the patient's internal TMO leaf, or from the fascia of the patient's thigh muscles or from an artificial prosthesis of the artery (aorta) stitched to the patient's TMO.
  • An ICBP NEPS is implanted inside the TOP. The proximal and distal ends of the damaged CM are sutured (tunneled and sutured to TMO) to the formed conduit.
  • the TMO is closed and sutured with the inner sheet of its own TMO or artificial TMO, followed by coating the TMO plastic zone with standard biopolymer glue (such as “Tikkol” glue).
  • standard biopolymer glue such as “Tikkol” glue.
  • Postoperative management of the patient is carried out around the clock for 10 days after implantation of ICBP NEPS.
  • An anesthetist-resuscitator together with the attending physician, must monitor the patient's condition to assess the degree of risk of possible complications.
  • continuous monitoring by a neurosurgeon and a neurologist is shown, which should work in close cooperation with hematologists, transplantologists, immunologists and laboratory doctors.
  • the main criteria for the effectiveness of the intervention is the improvement of neurological symptoms (motor, sensory and function of the pelvic organs).
  • the term of the expected result is extremely individual for each patient and depends on the amount of damage to the GM and CM, the duration of the injury, the degree of compensation of impaired functions.
  • the effectiveness of therapy varies from 7 days to 48 months after surgery for tissue engineering, and is evaluated by the ASIA clinical scales (Américap Scipul Ipjuru Accosiati Scale - Scale of the American Association of Spinal Damage), FIM (Scale Functional Independence - Scale of Functional Independence) and neurophysiological research methods (cerebral EEG mapping, transcranial magnetic stimulation, somatosensory evoked potentials and electroneuromyography, as well as a comprehensive urodynamic study).
  • ASIA clinical scales Américap Scipul Ipjuru Accosiati Scale - Scale of the American Association of Spinal Damage
  • FIM Scale Functional Independence
  • neurophysiological research methods cerebral EEG mapping, transcranial magnetic stimulation, somatosensory evoked potentials and electroneuromyography, as well as a comprehensive urodynamic study.
  • the effectiveness of the present invention was evaluated in patients with the consequences of injuries of GM and CM in comparison with traditional surgical treatment.
  • specialized scales ASIA and FIM were used, as well as data from MPT, electroneuromyography, cerebral EEG mapping, complex urodynamic studies, immunochemical studies of blood and cerebrospinal fluid.
  • the study was conducted in 50 patients. Tissue engineering operations with by implanting ICDB, NEPS were performed in 30 patients with severe traumatic CM disease. All patients included in the study were divided into 3 groups.
  • Group 1 (main, 30 patients) - patients operated on with the implantation of ICBP NEPS, group 2 (control, 20 patients) - patients who received traditional surgical treatment (decompression laminectomy, microsurgical radiculomyelolysis, drainage of intramedullary cysts, TMO plastic) .
  • traditional surgical treatment decompression laminectomy, microsurgical radiculomyelolysis, drainage of intramedullary cysts, TMO plastic
  • FIG. 1 A comparison of the effectiveness of tissue engineering CM with the implantation of ICDB NEPS in traumatic GM disease and CM with traditional surgical methods of treatment is presented in the diagram of FIG. 1.
  • group 1 patients who received surgical treatment with implantation of ICP NEP according to the present invention
  • Group 2 patients in the control group who received traditional surgical therapy.
  • Reliably p ⁇ 0.05
  • Reliability (p ⁇ 0.05) was calculated using the ⁇ 2 method.
  • FIG. Figure 2 shows the dynamics of uro dynamic parameters in patient B. before and after implantation of ICDB NEP according to the present invention (A - urogram before treatment, B - urogram after implantation of ICBP NEP).
  • table 2 The data obtained are also presented in tables 2 and 3 and are illustrated by clinical examples 1 and 2.
  • table 2 The data obtained are also presented in tables 2 and 3 and are illustrated by clinical examples 1 and 2.
  • JNb 1 "Sphero®GEJl"
  • JNb 2 "Sphero® GEL", MH and EC;
  • JNb 3 "Sphero® GEL", NGOK and HCK; JNb 4: "Sphero®GEJl”, HCK, HCOK, MH and EC
  • tissue engineering methods with the implantation of ECB NEP according to the present invention for the treatment of the most severe contingent of patients with traumatic disease of GM and CM can be considered as a method of choice, the effectiveness of which in patients reaches 45 % in those cases when all traditional methods and approaches of treatment are practically ineffective.
  • Using the traditional surgical approach to treating the severe consequences of traumatic injuries of GM and CM does not lead to a significant improvement in neurological symptoms.
  • the application of the proposed medical technology significantly improves the quality of life of patients with severe injuries of GM and CM and significantly expands the possibilities of functional and social independence of patients (tables 2, 3).
  • the proposed method for neurosurgical surgery today is the only effective way to treat patients with the consequences of severe traumatic injuries of GM and CM, including with a complete anatomical interval of CM (with diastasis up to 5 cm) and can lead to a real improvement not only in their condition and quality life, but also social adaptation in society.
  • the possible return of patients after injuries of the brain and spinal cord to normal social and social activities carries with it great economic feasibility, both taking into account the resumption of work, and taking into account the reduction of costs for long and ineffective treatment.
  • the postoperative period was uneventful, the wound healed by primary intention.
  • HELL 110/70 mm Hg Heart sounds are clear, rhythmic.
  • the tongue is pink, wet.
  • the abdomen is soft, painless.
  • the liver is not enlarged, the spleen is not palpable.
  • the kidneys in the patient’s sitting position are not palpable.
  • Stool 1 time in 2-3 days using laxative suppositories. Consciousness is clear. Correctly oriented in space, time, self.
  • the face is symmetrical.
  • the soft palate is mobile, symmetrical. Phonation and swallowing are not disturbed. Atrophy, paresis, myofasculation of the trapezius and sternocleidomast muscles were not detected. Tongue in the midline, without atrophy and fasciculations. Coordination tests are satisfactory. Muscle tone in the proximal and distal muscle groups of the hands is not changed. Hypotrophy of the muscles of the hands there. Tendon and periosteal reflexes of the hands are moderate, with no distinct side difference. Arm muscle strength - 5 points. Abdominal reflexes are not triggered. Muscle tone in the proximal and distal muscle groups of the lower extremities is increased in spastic type, according to the Ashworth scale of 3 points.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Prostheses (AREA)

Abstract

Изобретение используется в нейрохирургии и тканевой инженерии органов для замещения дефектов нервной ткани головного (ГМ) и спинного (CM) мозга млекопитающего при реконструктивных нейрохирургических операциях. Задача изобретения - разработка тканезамещаемой искусственной клеточно-биополимерной нейроэндопротезной системы (ИКБП НЭПС) для хирургической пластики дефектов нервной ткани ГМ и CM, позволяющей обеспечить стимуляцию регенерации и роста поврежденных аксонов нервных клеток, а также разработка способа получения ИКБП НЭПС и способа проведения реконструктивной нейрохирургической операции с использованием ИКБП НЭПС. ИКБП НЭПС представляет собой упругоэластичную клеточно-биополимерную биологически активную массу, полученную из гетерогенного коллагенсодержащего матрикса для имплантации и биокомпозиции клеточных препаратов из различных типов аутологичных клеток пациента. Биокомпозиция содержит находящиеся в растворе NaCl нейральные стволовые клетки (HCK), нейроглиальные обкладочные клетки (НГОК), эндотелиальные клетки с маркером CD34+ (ЭК) и очищенные мононуклеары (MH) при следующем соотношении компонентов (в частях по количеству клеток): HCK - 0,8-1,2; НГОК - 1,6-2,4; ЭК - 4-6; MH - 4000-6000. Способ получения ИКБП НЭПС включает в себя перфузирование биокомпозиции клеточных препаратов из различных типов аутологичных клеток пациента в гетерогенный коллагенсодержащий матрикс для имплантации с получением упругоэластичной клеточно-биополимерной биологически активной массы. Способ проведения реконструктивной нейрохирургической операции для замещения дефектов ГМ и/или CM и/или вегетативной нервной системы млекопитающего включает в себя имплантацию ИКБП НЭПС в дефект нервной ткани.

Description

ИМПЛАНТИРУЕМАЯ НЕЙРОЭНДОПРОТЕЗНАЯ СИСТЕМА,
СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ РЕКОНСТРУКТИВНОЙ
НЕЙРОХИРУРГИЧЕСКОЙ ОПЕРАЦИИ
Область техники
Изобретение относится к области нейрохирургии и тканевой инженерии органов и может быть использовано для замещения дефектов нервной ткани головного и спинного мозга при реконструктивно-восстановительном лечении последствий травматических повреждений, ишемических поражений и оперативных вмешательств на центральной нервной системе (ЦНС) и вегетативной нервной системе (BHC) млекопитающего, например, человека. Предшествующий уровень техники
До конца XX века проблема протезирования дефектов нервной ткани считалась нереальной и практически нерешаемой задачей. Это было связано с канонизированными представлениями исследователей мозга, неврологов и нейрохирургов об ограниченных возможностях нервной ткани к регенерации и саногенезу, а также установленными в 1801 г. Рамоном Кохалем догматическими представлениями о принципиальной неспособности нервных клеток к восстановлению после повреждения. Однако в последнем десятилетии XX века эти представления существенно изменились в связи с накоплением новых научных фактов о регенераторном потенциале ЦНС, открытием репаративных возможностей нейральных стволовых клеток (HCK) и получением неопровержимых доказательств о возможности восстановления аксонов поврежденных нейронов.
Известен препарат гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), представляющий собой аутологичные ГСК, полученные из периферической крови пациента, обогащенной клетками, содержащими антиген CD34, в конечной концентрации (40÷100)-106 клеток/мл. Терапевтическое лечение травматической болезни ГМ и CM проводят путем интратекального или интравентрикулярного введения этого препарата пациенту (RU 2283119 Cl, A61K35/14, 2006). Однако, использование препарата из одних лишь ГСК оказалось недостаточно эффективным при лечении дефектов нервной ткани ГМ и CM. Известен биополимерный протез «NeuroGel»™ для заполнения дефектов нервной ткани (S.Wоеrlу, V.D.Dоап, F.Еvапs-Маrtiп, С.G.Рагаmоrе, J.D.Реduzzi, "Sрiпаl соrd rесопstruсtiоп usiпg NеurоGеl™ imрlапts апd fuпсtiопаl гесоvегу аftеr сhrопiс iпjurу", J. оf Nеurоsсiепsсе Rеs. 2001. VoI.66, Р.l 187-1197). Исследования показали, что через биополимерную композицию возможно прорастание в CM млекопитающих поврежденных аксонов нервной ткани и восстановление утраченных функций мозга, а стволовые клетки способствуют созданию благоприятных условий для регенерации аксонов. Однако, использование биополимерного протеза «NeuroGel»™ также недостаточно эффективно при лечении дефектов нервной ткани ГМ и CM. Кроме того, биополимер «NeuroGel»™ имеет в своем составе запрещенные к применению для человека ингредиенты.
Известен также универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации, представляющий собой упругоэластичную массу, полученную из двух источников коллагена, причем один источник является тканью позвоночного животного одного класса, а второй - животного другого класса, и состоящий из двух фаз: твердой - в виде микрогранул из коллагена ткани млекопитающих, и жидкой - из денатурированного коллагена ткани птиц. Этот гетерогенный коллагенсодержащий матрикс был предложен для восстановления повреждений мягких тканей и органов путем имплантации (RU 2249462 Cl, A61K38/39, 2005). Этот матрикс принят в качестве прототипа предложенной имплантируемой нейроэндопротезной системы. Имплантация в дефект нервной ткани данного коллагенсодержащего матрикса не позволила добиться полной активации регенераторного потенциала искусственного импланта из-за большого размера микрогранул (300-400 мкм) и их жесткости, что приводило к механической травме и гибели трансплантируемых стволовых клеток. Раскрытие изобретения
Технической задачей настоящего изобретения является разработка тканезамещаемой искусственной клеточно-биополимерной нейроэндопротезной системы (ИКБП НЭПС) для хирургической пластики дефектов нервной ткани ГМ и CM, позволяющей обеспечить стимуляцию регенерации и роста поврежденных аксонов нервных клеток, а также разработка способа получения этой системы и способа проведения реконструктивной нейрохирургической операции для замещения дефектов ГМ и/или CM и/или вегетативной нервной системы млекопитающего с использованием указанной системы, которая далее будет наименоваться имплантируемой нейроэндопротезной системой или сокращенно ИКБП НЭПС. Указанная задача решается тем, что согласно настоящему изобретению предложена имплантируемая нейроэндопротезная система для замещения дефектов головного и спинного мозга и вегетативной нервной системы млекопитающего при реконструктивных нейрохирургических операциях, представляющая собой упругоэластичную клеточно-биополимерную биологически активную массу, полученную из гетерогенного коллагенсодержащего матрикса для имплантации и биокомпозиции клеточных препаратов из различных типов аутолоrичных клеток пациента.
Более конкретно, указанная биокомпозиция содержит находящиеся в растворе NaCl нейральные стволовые клетки (HCK), нейроглиальные обкладочные клетки (НГОК), эндотелиальные клетки с маркером CD34+ (ЭК) и очищенные мононуклеары (MH) при следующем соотношении компонентов (в частях по количеству клеток): HCK - 0,8-1,2; НГОК - 1,6-2,4; ЭК - 4-6; MH - 4000-6000. Использован преимущественно 0,5-1,3%- ный раствор NaCl. В качестве гетерогенного коллагенсодержащего матрикса использована преимущественно композиция гетерогенного имплантируемого геля "СфероФГЕЯЪ".
Указанная биокомпозиция может дополнительно содержать стимуляторы клеточной регенерации и факторы роста нервов и сосудов. Наиболее оптимальным, эффективным и безопасным (с учетом коэффициента набухания матрикса "СфероФГЕЛЪ") является состав ИКБП НЭПС, когда она содержит следующее количество клеток в 0,5-1 мл 0,9%-нoгo раствора NaCl из расчета на 1 мл гетерогенного коллагенсодежащего матрикса: HCK - 106; НГОК - 2 106; ЭК - 5 106; MH - 5 109, а также 0,1-0,2 мл стандартного раствора стимулятора клеточной регенерации (метилурацил, лейкоген, АТФ, пентоксил и т.д.). Указанная задача решается также тем, что предложен способ получения имплантируемой нейроэндопротезной системы для замещения дефектов головного и спинного мозга и вегетативной нервной системы млекопитающего при реконструктивных нейрохирургических операциях, включающий в себя перфузирование биокомпозиции клеточных препаратов из различных типов аутолоrичных клеток пациента в гетерогенный коллагенсо держащий матрикс для имплантации с получением упругоэластичной клеточно-биополимерной биологически активной массы.
Перфузирование проводят преимущественно путем центрифугирования. Центрифугирование проводят преимущественно в течение 1 ,5-2,5 минут при скорости 1500-2500 об/мин. Указанную биокомпозицию готовят из криоконсервированных клеточных препаратов, которые непосредственно перед получением имплантируемой нейроэндопротезной системы размораживают на водяной бане при температуре 37- 400C и затем не менее двух раз промывают в физиологическом растворе NaCl. Более конкретно, указанная биокомпозиция содержит находящиеся в растворе NaCl нейральные стволовые клетки (HCK), нейроглиальные обкладочные клетки (НГОК), эндотелиальные клетки с маркером CD34+ (ЭК) и очищенные мононуклеары (MH). Источником HCK и НГОК является преимущественно обонятельная выстилка носа пациента, а источником ЭК и MH - костный мозг пациента или лейкоконцентрат мобилизованных аутологичных стволовых клеток пациента, полученный при сепарации периферической крови после стимуляции пациента гранулоцитарным колониестимулирующим фактором. В указанную биокомпозицию могут быть добавлены стимуляторы регенерации тканей и факторы роста нервов и сосудов. Предложенный способ получения ИКБП НЭПС проводят в стерильных условиях или непосредственно в операционной (ех tеmрого) или в культуральной лаборатории (срок имплантации до 6 часов).
Указанная задача решается также тем, что предложен способ проведения реконструктивной нейрохирургической операции для замещения дефектов головного и/или спинного мозга и/или вегетативной нервной системы млекопитающего, включающий в себя имплантацию в дефект нервной ткани нейроэндопротезной системы в виде упругоэластичной клеточно-биополимерной биологически активной массы, полученной из гетерогенного коллагенсодержащего матрикса для имплантации и биокомпозиции клеточных препаратов из различных типов аутологичных клеток пациента. Более конкретно, указанная биокомпозиция содержит находящиеся в растворе NaCl нейральные стволовые клетки (HCK), нейроглиальные обкладочные клетки (НГОК), эндотелиальные клетки с маркером CD34+ (ЭК) и очищенные мононуклеары (MH). В качестве гетерогенного коллагенсодержащего матрикса используют преимущественно композицию гетерогенного имплантируемого геля "СфероФГЕЯЪ" . Нейроэндопротезную систему имплантируют путем ее помещения в дефект по типу «плoмбиpoвaния» с заполнением ею всего объема кисты или повреждения головного и/или спинного мозга. После помещения нейроэндопротезной системы в дефект ее закрывают аутологичной мышечной фасцией или искусственной твердой мозговой оболочкой и/или биодеградируемой синтетической полимерной оболочкой для ограничения контакта нейроэндопротезной системы с ликвором пациента. В качестве биодеградируемой синтетической полимерной оболочки используют преимущественно имплантируемую биополимерную мембрану "ЭластоПОБ"®. При полном анатомическом перерыве спинного мозга нейроэндопротезную систему имплантируют путем формирования кондуита из искусственного протеза артерии и нейроэндопротезной системы, которой по меньшей мере частично заполняют этот протез, помещения кондуита в зону диастаза между концами поврежденного спинного мозга и последующего подшивания мягкой оболочки дистального и проксимального концов поврежденного спинного мозга к стенкам кондуита. Длину искусственного протеза артерии выбирают равной длине диастаза, а ширину этого протеза - диаметру спинного мозга в месте повреждения. При интрамедуллярной или интрацеребральной имплантации нейроэндопротезную систему изолируют от прямого ударного воздействия спинномозговой жидкости.
Имплантируемая биополимерная мембрана "ЭластоПОБ"® изготавливается ЗАО «Биoмиp-cepвиc» (Москва) согласно ТУ 9398-002-54969743-2006, рег. уд. M> ФС 01032006/5581-06 от 28.12.2006 f.
Краткое описание чертежей
Эффективность использования ИКПБ НЭПС по настоящему изобретению поясняется диаграммами: на фиг. 1 изображена диаграмма, иллюстрирующая эффективность лечения больных с травматической болезнью ГМ и CM способом по настоящему изобретению и традиционным способом; на фиг. 2 - урограммы больного до (А) и после (Б) имплантации ИКБП НЭП по настоящему изобретению. Варианты осуществления изобретения
Консистенция и биоструктура предложенной ИКПБ НЭПС обеспечивают адекватное моделирование нейроимпланта в поврежденных участках мозга и локальную стимуляцию процессов регенерации в патологических зонах ГМ и CM. Применение для биокомпозиции в ИКБП НЭП препаратов только из аутологичных клеток позволяет избежать проблем гистосовместимости и иммунного конфликта, а также необходимости применения иммуносупрессоров. При этом отсутствуют этические, юридические и моральные ограничения, т.к. для лечения используются только собственные клетки пациента. Исключен риск заражения пациента инфекционными и вирусными заболеваниями. Также исключен риск заражения прионами, возможный при использовании ксеногенных донорских клеточных препаратов. Конкретное количество используемой ИКБП НЭПС определяется в зависимости от объема, характера и места повреждения мозга.
Базовым элементом создания предложенной ИКБП НЭПС явилась разработка и производство полимерного матрикса, который соответствовал бы специфичным требованиям "моста" между поврежденными участками ГМ или CM, выполнял бы опорные и питательные функции для клеточных препаратов и направляющего вектора для аксонов пострадавших аутонейронов и нейроглиальных клеток, способствовал стимуляции регенерации поврежденных аксонов и обеспечивал их прорастание через зону дефекта нервной ткани, препятствуя процессам «cпpayтингa» (скручивания). Предлагаемый матрикс должен соответствовать критериям безопасности и биодеградировать в заданный интервал времени (8-12 месяцев) на безопасные компоненты, замещаясь восстановленной нервной тканью.
Предпочтительной для использования в предложенной ИКБП НЭПС является матрикс в виде композиции гетерогенного имплантируемого геля, имеющей торговое наименование "Cфepo®ГEЛЪ", защищенное свидетельством РФ на товарный знак N° 26977 '4 и изготавливаемой ЗАО «Биoмиp cepвиc» (г. Москва) согласно ТУ 9398-001- 54969743-2006 от 26. 12. 2006 г., рег. уд. N° ФС 01032006/5580-06 от 28.12.2006 г.
Матрикс "СфероФГЕRЬ" состоит из микрочастиц полученного от сельскохозяйственных животных сшитого коллагена VII типа, распределенных в упругом однородном геле и представляет собой уникальный комплекс пептидов (30-50 мг/г), уроновых кислот (0,8-1,2 мг/г) и гексозаминов (2,0-3,0 мг/г). По аминокислотному составу он идентичен коллагену, но превосходит его по содержанию гексозаминов в 2 раза, а уроновых кислот более чем в 15 раз. Матрикс Сферо® ГЕЛЬ устойчив при длительном хранении и не склонен к явлениям синерезиса (выделение жидкой фазы). В таком состоянии он не смешивается с водой и гидрофобными жидкостями. При температуре 370C этот гель превращается в жидкость, смешивающуюся во всех соотношениях с водой и микрочастицами сшитого коллагена. Размер микрочастиц в геле можно менять от 30 до 300 мкм. Набухаемость матрикса "Cфepo®YEJlh" не менее 87%, рН = 4,8-7,2. Среднее время биорезорбции в организме - от нескольких недель до 9 месяцев в зависимости от места имплантации и размера микрочастиц. Экспериментально доказаны и клинически подтверждены высокие биосовместимые и биостимулирующие свойства биополимерного имплантата "Cфepo®ГEЛЬ", способствующие восстановительным процессам в местах повреждения тканей. Доклинические и клинические исследования проводили ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов, ЗАО Клиника «HeйpoBитa», Больница РАН (г. Троицк), ГКБ Гражданской авиации, ГКБ им. Боткина СП.
Клинические исследования доказали высокие функциональные свойства матрикса "Cфepo®ГEЛЬ " в качестве:
• биоактивной искусственной синовиальной жидкости при терапевтическом лечении деформирующих артрозов коленных суставов;
• имплантатов при хирургическом лечении нарушений проводимости периферических нервов; • имплантируемых носителей для трансплантации и локализации стволовых клеток при лечении травм спинного мозга.
Именно матрикс "Cфepo®ГEЯЪ" после трехлетних испытаний на животных в ЗАО Клиника «HeйpoBитa» на экспериментальной модели травмы спинного мозга стал основой предложенной нейроэндопротезной системы. В последующем, при экспериментальной и клинической апробации матрикса "Cςbepø®ГEЛЬ" в него было предложено перфузировать определенный состав клеточных элементов, формируя клеточную композицию со стимуляторами тканевой регенерации. Главной проблемой создания ИКБП НЭПС была необходимость нахождения основных ингредиентов клеточной биокомпозиции и определения их количества в 1 мл биодеградируемого матрикса "Cфepo®ГERЪ".
Эндотелиальные клетки с маркером CD34+ (ЭК) и нейральные стволовые клетки (HCK) обладают направленной миграцией к зонам повреждения. Трансплантированные клетки формируют кластеры прогенираторных клеток в ткани мозга. Этот феномен стал ключевым в решении вопроса регенерации поврежденного мозга. Однако только после длительного экспериментального этапа на животных и проведения 32 операций на человеке удалось найти необходимое сочетание биополимера с клеточным составом и стимуляторами регенерации, которое позволило добиться максимального клинического и нейрофизиологического эффекта от проведения операций по тканевой инженерии мозга, что и позволило говорить о создании открытых ИКБП НЭПС. ИКБП НЭПС является искусственным аналогом нервной ткани, содержащим ее основные клеточные элементы (нейроны, нейроглиальные клетки, эндотелиоциты и т.д.) и полимерную матрицу с заданными параметрами биодеградации (от 8 до 12 месяцев). Консистенция и биопластичность ИКПБ НЭПС позволяют осуществить адекватное моделирование нейроимпланта в поврежденных анатомических структурах мозга, а также обеспечить локальную стимуляцию процессов регенерации в зоне повреждения. ИКПБ НЭПС способна выполнять опорные функции «мocтa» и «питaтeльнoй cpeды» для прорастания поврежденных аксонов нервных клеток через патологически измененные участки ткани мозга.
HCK, находящиеся в биокомпозиции предложенной ИКПБ НЭПС, способны реконструировать поврежденную нервную ткань и в первую очередь обеспечить восстановление серого вещества спинного мозга, а НГОК могут стимулировать дифференцировку клеток предшественников крови в астроциты и олигодендроциты, которые могут воссоздавать белое вещество и быть источником клеток, способных осуществить ремиелинизацию поврежденных аксонов. Добавление в биокомпозицию гемопоэтических стволовых клеток (CD34+CD45-), получивших вектор дифференцировки в эндотелиоциты, т.е. являющихся источником ЭК, способствует образованию новых сосудов, позволяет быстро сформировать в эндопротезе микрокапиллярную сосудистую сеть, улучшить локальный кровоток. Применение в клеточной биокомпозиции стволовых негемопоэтических клеток, находящихся в мононуклеарной фракции (MH) периферической крови после стимуляции колониестимулирующими факторами, позволяет добиться продуцирования большого количества факторов роста, которые являются самым эффективным средством регенерации аксонов.
Практическое применение в клинической практике различных клеточных препаратов в матриксе "Cфepo®ГEЛЬ" показало, что наилучшие клинические и нейрофизиологические результаты получаются не при изолированном применении матрикса и интрацеребральной или интрамедуллярной трансплантации отдельных клеточных культур, а при определенном количественном соотношении этих клеточных препаратов в матриксе "Cфepo®ГEЯh", что позволило создать специфичное искусственное микроокружение поврежденным аксонам, близкое по клеточной структуре" к естественной ткани развивающегося мозга.
Приготовление суспензии культивированных НГОК и HCK осуществляется по стандартной методике. Источником этих клеток является фрагмент обонятельной выстилки носа пациента, взятый путем отоларингологической эндоскопической хирургической манипуляции. Получение препарата гемопоэтических стволовых клеток, являющихся источником ЭК, а также негемопоэтических стволовых клеток, находящихся в мононуклеарной фракции (MH), осуществляется в соответствии с технологией, описанной в RU N° 2283119 и в регистрационном удостоверении Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития M>ФC-2006-/151 от 01.07.2006.
Предложенные способ получения ИКБП НЭПС и способ проведения нейрохирургической операции могут осуществляться только в условиях нейрохирургической операционной хирургического отделения и отделения анестезиологии и реанимации многопрофильного лечебно-профилактического учреждения, имеющего лицензию на медицинскую деятельность по высоким технологиям в неврологии, нейрохирургии, забору гемопоэтических клеток и применению клеточных технологий специалистами-нейрохирургами и анестезиологами-реаниматологами, прошедшими подготовку по применению клеточных технологий. Лечебно-профилактическое учреждение должно быть оснащено современными средствами диагностики (MPT, спиральная компьютерная томография, ангиографическая техника, цитофлуориметр, сепаратор крови) или иметь договора с учреждениями, имеющими эти средства. Лаборатория, в которой осуществляется сертификация и паспортизация аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови (АГСКПК), HCK, НГОК и ЭК должна быть лицензирована как лаборатория, имеющая право на применение клеточных технологий, соответствовать требованиям GLР-стандарта (Gооd Lаbоrаtогу Рrасtiсе - надлежащая лабораторная практика) и иметь возможность для проведения полного анализа клеточного препарата в объеме, рекомендуемым европейским регистром трансплантации стволовых клеток костного мозга. Лаборатория должна иметь возможность проводить тесты на стерильность биопрепарата, токсичность, культуральные работы с данным биоматериалом, т.е. иметь в оснащении стерильный бокс с ламинарным шкафом, CO2-инкyбaтop, бифокальный микроскоп и набор реактивов для культуральных работ. Специалисты должны иметь дополнительную специализацию по трансфузиологии.
Технология использования предложенной ИКБП НЭПС складывается из выполнения ряда последовательных стадий: I - специализированное обследование пациента;
II - забор и подготовка биоматериала (включает в себя предложенный способ получения ИКБП НЭПС) и
III - реконструктивная нейрохирургическая операция на CM или ГМ с интраоперационной подготовкой ИКБП НЭПС и ее имплантацией. Стадия I. Специализированное обследование пациента
На этой стадии проводится обязательное клиническое и параклиническое обследование пациента по стандартному протоколу. Проводится анализ диагностических параметров патологического очага, разрабатывается стратегия проведения тканевой инженерии ГМ или CM, устанавливаются показания и противопоказания для проведения имплантации ИКБП НЭПС, сроки проведения каждого этапа с учетом данных проведенного обследования. При необходимости осуществляется математическое моделирование клеточной трансплантации и планирование объема клеточного препарата для подготовки ИКБП НЭПС по данным MPT. Данная стадия не должна носить характера формального проведения анализов и обследований. Именно на этой стадии определяются абсолютные и относительные противопоказания, четко определяется медицинский и социальный прогноз операции по тканевой инженерии ГМ и CM для больного. Поскольку планируется интрамедуллярное и (или) интрацеребральное погружение клеточных препаратов HCK и НГОК, основное внимание должно быть уделено иммунохимическому состоянию крови и ликвора пациента. Дополнительное внесение нейроспецифических белков при трасплантации нейронов и нейроглиисодержащих клеток во время операции и исходное высокое наличие нейроспецифических антигенов в крови и ликворе пациента может способствовать усилению собственного деструктивного процесса мозга. В то же время привнесение нейроспецифических белков при трасплантации нейрональных и нейроглиисодержащих клеток во время операции и исходное наличие антител к нейроспецифическим антигенам в крови и ликворе пациента может способствовать запуску или усилению аутоиммунного процесса, а в ряде случае и аутоиммунному лизису поврежденной ткани. Нецелесообразно рассматривать в качестве кандидатов на подобные операции пациентов с наличием антител к нейроспецифическим белкам и иммунологическим дефицитом.
Стадия II. Забор и подготовка биоматериала Композиция гетерогенного имплантируемого геля Cфepo®ГEЛЬ Композиция "Cфe/?o®ГEЛЬ" изготавливается по способу, описанному в указанном патенте РФ (RU 2249462). Выпускается в инъекционной форме в шприцах по 1, 2 и 5 мл.
При комнатной температуре гетерогенный матрикс "Cфepo®ГEЯh" представляет собой упругоэластичную массу, устойчивую при длительном хранении и не склонную к явлениям синерезиса (выделение жидкой фазы). При температуре 37°C вязкость биополимерного матрикса за счет слабо сшитого жидкого компонента резко уменьшается, при этом физическое состояние глобулярного (твердого) компонента не меняется. Полученный матрикс имеет достаточно низкую иммуногенность.
В качестве дополнительных компонентов, непосредственно перед операцией в матрикс можно вводить антибиотики, антисептики, стимуляторы регенерации и антисвертывающие препараты. Антибиотиками могут быть пенициллины (например, бензилпенициллин, клоксациллин, ампициллин), цефалоспорины (например, цефалоридин, цефуроксим, цефотетан, цефтазидин), карбопенемы (например, мерапенем), монобактамы (например, азтреонам), аминогликозиды (например, стрептомицин, гентамицин, амикацин), тетрациклины (например, тетрациклин, миноциклин), макролиды (например, эритромицин, азитромицин), линкозамиды (например, линкомицин), антибиотики пептидной группы (например, полимиксин В, полимиксин M, ристомицин, бацитрацин). В качестве стимуляторов клеточной регенерации можно использовать, например, метилурацил лейкоген, аденинтрифосфорную кислоту (АТФ), пентоксил, калия оротат, рибоксин, этаден.
В композицию "Cфepo®ГERЪ" можно дополнительно внести также антибактериальные и антивирусные компоненты, а также антиагрегационные препараты. Стимуляторы клеточной регенерации перфузируются в "Cфepo®TEЛЬ" непосредственно в операционной в объеме не более 0,2 мкл на 1 мл матрикса. Введенный непосредственно в зону дефекта матрикс "C<j6epø®ГEЛЬ" со временем заменяется исходной тканью без образования рубцовой ткани.
Преимуществами матрикса "Cфepo®ГEЛЬ", используемого для имплантации в поврежденный головной и спинной мозг являются:
- многофункциональность (опорная и трофическая функция для клеточных культур, стимулирует регенерацию аксонов и неоваскуляризацию);
- высокая биосовместимость на белковом и клеточном уровне как готового изделия, так и продуктов био деградации;
- способность стимулировать пролиферацию и дифференциацию нервных клеток;
- регулируемое время биодеградации от нескольких недель до нескольких месяцев (конечными продуктами био деградации являются углекислый газ и вода);
- способность к порообразованию непосредственно при контакте с биологическими средами, обеспечивающая процессы неоваскуляризации);
- возможность стерилизации без изменения медико-технических свойств. Подготовка и получение биокомпозиции клеточных препаратов Получение стволовых клеток
Процедуру условно разделяют на две части - мобилизацию стволовых клеток в периферическую кровь и сбор стволовых клеток. Мобилизация стволовых клеток в периферическую кровь
С целью увеличения количества стволовых клеток в периферической крови донор получает 8 инъекций гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), подкожно с интервалом в 10-12 часов в течение 4 дней. Г-КСФ представляет собой медицинский препарат, полученный путем генной инженерии, и является абсолютным аналогом человеческого фактора. В первые три дня доза препарата составляет 2,5 мкг/кг, в последний день доза удваивается. Ежедневно производят общий анализ крови и на 4-5-й день делается УЗИ брюшной полости.
Сбор стволовых клеток
Осуществляется на 5-й день от начала стимуляции Г-КСФ на сепараторе крови типа СОВЕ-спектра с использованием одноразовой системы для сепарации и стандартных растворов. Длительность процедуры 3-4 часа в зависимости от скорости процедуры, веса пациента и параметров анализа крови. Процедура проводится путем забора крови из одной вены, обработки крови внутри сепаратора, забора определенного объема стволовых клеток и возврата остальных компонентов крови донору через другую вену. Венозный доступ осуществляется путем пункции 2-х периферических вен или через двухпросветный центральный катетер, установленный в подключичную вену на время проведения сеанса. Средний объем собранного материала 300-400 мл. Собранный материал оценивают по двум параметрам: по общему количеству ядерных клеток (ЯК) в сепарате и по количеству CД34+ клеток на килограмм веса больного. ЯК в сепарате определяют путем подсчета в камере Горяева до проведения каких-либо манипуляций.
Процент CД34+ клеток в клеточной суспензии, полученной в ходе цитафереза, определяют методом проточной цитофлуориметрии.
Определение периферических стволовых клеток
Установление субпопуляционного состава CD34+ клеток проводится цитофлуориметрически с применением метода тройной метки (одновременная окраска клеток антителами к 3-м разным антигенам, нагруженными различными флуорохромными красителями).
Стандартизация препарата
Определение количества клеток-предшественниц проводится цитофлуориметрически, в прямой реакции иммунофлуоресценции (РИФ).
Используется метод двойной метки с одновременным окрашиванием клеточного субстрата моноклональными антителами (MKA) к антигену CD34 - основному маркеру клеток пула стволовых гемопоэтических клеток и к молекуле CD45 - общелейкоцитарному антигену, определяющему все гемопоэтические клетки. Подобная методика позволяет сразу рассчитать соотношение количества CD34+ клеток и всех гемопоэтических (CD45+) клеток в материале.
Для оценки уровней неспецифического связывания часть клеток окрашивают изотипическими контролями. В качестве изотипических контролей стандартно применяются мышиные иммуноглобулины IgGl изотипа (IgGl), меченные красителями, аналогичными метке используемых моноклональных антител (PE, FITC,
РегСР).
Подготовка клеточных проб
Перед постановкой реакции клетки периферической крови и цитаферезного продукта освобождают от примеси эритроцитов путем стандартной процедуры лизиса и последующей отмывки в забуференном физиологическом растворе с добавлением бычьего сывороточного альбумина (ЗФР-БСА) центрифугированием при 1000 г в течение 5 минут. ЗФР-БСА может быть заменен средой Хенкса или 199.
Методика лизиса эритроцитов: 1. Добавить 2 мл лизирующего раствора к 0,2-0,5 мл клеточного осадка, перемешать, инкубировать до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (лаковым).
2. Отмыть клетки 2 раза средой 199 центрифугированием (1000 г, 5-7 мин).
С выделенными клетками проводят прямую РИФ в 96-лyнoчнoм планшете, при этом для определения количества АГСКПК в любом материале используется панель из 3-х лунок:
• неокрашенные клетки;
• клетки, окрашенные изотипическими контролями с меткой, соответствующей метке использованных MKA;
• клетки, окрашенные одновременно MKA к антигенам CD34 и CD45. Следует обратить особое внимание на то, что MKA к CD34+ предпочтительнее использовать с фикоэритриновой (PE) или перидининхлорофиловой (РегСР) метками. Данные флуорохромы имеют более высокий уровень специфического сигнала по сравнению с флуоресцеинизотиоционатом (FITC). Для определения количества CD34+ клеток оптимальными являются антитела к антигену CD34 клона HPC A-2 (8Gl 2), изотипа IgGl. Таким образом, стандартная панель имеет вид: 1. контроль IgGl PE+ контроль IgGl FITC; 2. контроль IgGl PE+ MKA к CD45 FITC;
3. MKA к CD34 PE (HPCA-2) + MKA к CD45 FITC. Постановка РИФ
1. В лунки вносятся клетки в количестве не менее 500000 на лунку.
2. Далее в каждую лунку вносят коктейль антител в соответствии с панелью и аккуратно ресуспендируют пипеткой. Каждое MKA берут в количестве 10 мкл на лунку, суммарный объем MKA в лунке - 20 мкл.
3. Клетки инкубируют с антителами в течение 30 минут при 4°C (нижняя полка обычного холодильника).
4. По окончании времени инкубации клетки дважды отмывают от несвязавшихся антител путем центрифугирования в течение 5-7 минут при 1000 г.
5. Клетки переносят в специальные пластиковые пробирки для счета на проточном цитометре.
6. Объем клеточной суспензии в каждой пробирке доводят до 200-500 мкл путем добавления к клеткам ЗФР-БСА. Счет должен быть осуществлен сразу после постановки реакции.
Счет и запись на проточном цитофлуориметре
Оценку реакции проводят на проточном 5-пapaмeтpoвoм цитометре. Данная схема применима для проточного цитофлуориметра любой конфигурации.
CD34+ клетки в периферической крови представляют собой малую клеточную популяцию. Даже в условиях предварительной стимуляции кроветворения максимальный процент данных клеток составляет 1,0-3,0%. Поэтому при подсчете данных клеток в каждой анализируемой пробе следует накапливать не менее 20000 клеточных событий.
Сбор и анализ клеток осуществляется в гейте CD45+ клеток, который включает все гемопоэтические клетки. В данном контексте гейт подразумевает область накопления событий, ограниченную определенными параметрами. В данном случае SSC/FL-1 (CD45 FITC). То есть, по оси абсцисс (FL-I) на точечной цитограмме будут видны все CD45+ события. По оси ординат (параметр SSC - боковое светорассеяние) клеточные события будут расположены в соответствии с их гранулярностью (цитометрический, а не морфологический термин).
Подсчет абсолютного числа CD34+клeтoк в 1 мкл крови и цитоконцентрата проводили на основании числа лейкоцитов в гемограмме на день исследования.
Принцип определения CD34+ клеток в гемопоэтической ткани. Запись проб 1. Выбор области анализа - гейта.
В приборе открыто меню записи клеточных образцов Асquisitiоп. На первом этапе в режиме sеtuр (режим просмотра клеточного образца без записи) просматриваются пробы JVbI (IgGlPE+ IgGl FITC) и JV°2 (IgGl PE +CD45 FITC) и выявляются CD45+ события. Данные события расположены правее значений 101 (среднее пороговое значение уровня специфического сигнала для флуоресцеина FITC) по оси абсцисс - FL- 1 (CD45+клeтки) и достаточно четко визуализируются по сравнению с контрольной пробой JVb 1.
По пробе JVb 1 ограничивается вся область, расположенная правее основной клеточной плотности - гейт, включающий только CD45+ события в пробе JVb 2 и содержащий минимальное количество клеточных событий в пробе JVb 1.
2. Прибор переводится в режим записи образцов (поrmаl) и проба JVb 1 собирается и записывается на 20000 клеточных событий без гейта (вся клеточная популяция). Запись данной пробы в гейте не имеет смысла, так как в ней отсутствуют MKA к CD45 антигену. Как указано выше, данная проба необходима для правильного выбора гейта, содержащего только CD45+ события.
3. Пробы JVbJVb 2, 3 собираются и записываются в гейте CD45+. Данный гейт идентичен и для 2-й и для 3-й пробы, т.е. в процессе сбора изменения параметров гейта не происходит. Минимальное количество клеточных событий - 20000 для каждой пробы. Анализ записанных проб
1. Переходим в меню анализа записанных образцов Апаlуsis. Открываем цитограмму (dоt-рlоt) пробы JVb 2 в параметрах SSC/FL-2, в гейте Rl - CD45+ (гейт выбран нами ранее в момент записи сбора и автоматически перенесен в режим анализа). При этом по оси ординат будет отражен параметр SSC - гранулярность событий, попавших в анализируемый гейт, а по оси абсцисс FL-2 - детектор, отражающий уровни неспецифического связывания для фикоэритринового красителя, выявляемые антителами к иммуноглобулинам мыши IgGlPE.
2. По данной цитограмме устанавливается контрольный маркер таким образом, чтобы в правом нижнем квадранте практически не оказалось клеточных событий. В среднем, для вертикальной планки маркера, значения будут около 130 (правее 102), а для горизонтальной планки маркера средние значения составят 60, что соответствует понятию SSС-lоw, т.е. клетки с минимальным количеством клеточных включений. Таким образом, уровни неспецифического связывания будут равны или близки к нулю. 3. Автоматически переходим к пробе Na 3. Все показания прибора, принятые для второй пробы, сохраняются. То есть, цитограмма открыта в параметрах SSC/FL-2, сохранен гейт, выбранный ранее при сборе по CD45+ клеточным событиям, и сохранены значения контрольного маркера, установленного по пробе N° 2. Только на данной цитограмме по оси абсцисс будут отражены не уровни неспецифического связывания, как во второй пробе, а специфичные CD34+ события. Процент CD34+ клеток выводится прибором автоматически.
Криоконсервирование АГСКПК
Выделение фракции АГСКПК
Сепарированные клетки концентрируются путем центрифугирования на скорости 2000 об/мин в течение 10 мин при +18°C. С помощью ручного плазмоэкстрактора из контейнера максимально удаляется плазма, клетки остаются в объеме 40-60 мл.
Добавление криопротектора
В качестве криопротектора кроветворных клеток используется высокоочищенный диметилсульфоксид (ДМСО). К полученным клеткам добавляют при постоянном перемешивании равный объем полиглюкина с ДМСО. Смешивание ДМСО с полиглюкином происходит по типу экзотермической реакции с выделением умеренного количества тепла. Концентрация ДМСО в полиглюкине - 10-12%. Таким образом, его конечная концентрация в замораживаемом материале составит 5-6%.
Применение полиглюкина позволило снизить количество ДМСО вдвое, до 5-6% конечной концентрации, так как полиглюкин способен дезагрегировать клетки и тем самым улучшать проникновение криофилактика в клетки, а кроме того, полиглюкин (6% декстран) сам по себе является криофилактиком.
Подсчет количества криоконсервируемых клеток
На следующем этапе обязательно производят подсчет ядросодержащих клеток, а также CD 34+клeтoк, подлежащих заморозке.
Выбор оптимального объема замораживаемого материала
При криоконсервировании для создания наилучших условий важное значение имеют отношение объема пластикового контейнера к объему замораживаемого в нем материала и концентрация замораживаемых клеток. Как было установлено, оптимальная концентрация замораживаемых клеток составляет от 40-Ю6 до 100-Ю6 клеток в 1 мл.
Замораживание стволовых клеток
В зависимости от конечного объема замораживаемого материала выбирается количество полимерных ампул (15-20) для глубокого замораживания. Далее клеточную взвесь переводят в контейнер для криоконсервирования.
Для замораживания ампул с клеточной взвесью их помещают в программный замороживатель или в контейнер, выполненный из многослойной фанеры (общая толщина 10 мм) с плотно закрывающейся крышкой и соответствующий размеру ампул. Затем контейнер с замораживаемым материалом переносят в пары жидкого азота при температуре минус 165-170°C.
Скорость охлаждения материала при температуре от 0°C до -40°C составляет 1,1 градус в минуту. При этом методе криоконсервирования сглаживается плато кристаллизации, которое обычно четко выражено при программном замораживании в электронном устройстве, и состав замораживаемого материала остается неизменным в процессе хранения.
Через 1-2 часа от начала замораживания контейнер уже можно переносить в хранилище для длительного хранения, где он будет находиться в жидком азоте или его парах до трансплантации. Подготовка препарата АГСКПК к применению. Размораживание стволовых гемопоэтических клеток
Размораживание производится непосредственно перед трансплантацией в водяной бане при температуре 37-400C до момента перехода замороженного материала в жидкую фазу. В дальнейшем, путем центрифугирования при 1500 об/мин на дно центрифужной пробирки осаждают мобилизованные гемопоэтические стволовые клетки, отсасывают надосадочную жидкость и заливают 1 мл 0,9% физиологического раствора NaCl. Процедуру повторяют дважды. Препарат аутологичных стволовых клеток в размороженном состоянии может применяться в течение 6 часов после приготовления. Если препарат за это время не использован, то он подлежит утилизации.
Получение HCK и НГОК
С согласия пациента необходимо провести эндоскопический забор слизистой оболочки носа. Проводится анемизация полости носа 0,1% раствором Галазолина. Под местной анестезией 10% раствора Лидокаина аппликационно и 1% раствора Новокаина иссекают эндоскопически фрагмент размером около 3x4 мм слизистой оболочки верхних отделов перегородки носа. Кровотечение останавливают ватными тампонами с раствором Галазолина и перекиси водорода. Тампон удаляют через сутки после операции при отсутствии признаков носового кровотечения. При наличии даже незначительного кровотечения проводится повторная тампонада носовых ходов сроком на сутки.
Методика получения и культивирования НГОК обонятельного эпителия (ЕNSНЕАТШNG CELLS) Ткань обонятельного эпителия получали из верхней трети верхнего носового хода взрослых пациентов. Полученную ткань промывали в растворе Хенкса, содержащего антибиотики (стрептомицин, пенициллин) и антимикотик (амфотерицин). Ткань измельчали и инкубировали в растворе трипсина (0,05%) и EDTA (0,02%) (40 мин, 36,50C). Ткань диссоциировали многократным пипетированием, центрифугировали и осажденные клетки промывали раствором Хенкса с 5% сыворотки. Общее количество клеток в суспензии и процент жизнеспособных клеток определяли в камере Горяева с помощью окраски трипановым синим. Клетки (конечная концентрация 100000 кл/мл) культивировали в 12-лyнoчныx планшетах на полилизин-ламининовом субстрате в течение 10-15 суток (5% CO2, 36,5°C) в среде следующего состава: DMEM/F12 (Gibсо), эмбриональная телячья сыворотка 10% (Gibсо), глутамин 2 мМ (Gibсо), глюкоза 0,8%, смесь инсулина, трансферрина и селенита натрия (Gibсо, 1 :100), буфер HEPES(IO мМ), Нumап neuгegulin-1 β-1/heregulin 1-β-l EGF dоmаiп 2 пg/ml (R&D Sуstеms). Смену среды производили каждые 3-4 дня. После формирования плотного монослоя клетки для последующих пассажей снимали с субстрата раствором трипсина/ЕDТА, промывали раствором Хенкса и пересевали во флаконы с полилизин- л амининовым субстратом (25 см2, 10000-12000 кл/см2). После 3-4 пассажей клетки снимали с субстрата раствором трипсина/ЕDТА, промывали раствором Хенкса и полученную суспензию либо использовали для трансплантации, либо замораживали с использованием криопротектора (10% сыворотки, 90% ЭДТА) и хранили в жидком азоте при -7O0C. Для трансплантации криоконсервированные клетки размораживали и определяли их жизнеспособность с помощью окраски трипановым синим. Контрольные пробы показали, что не менее 90% клеток после размораживания сохраняют свою жизнеспособность Для цитохимической идентификации глиальных клеток обонятельного эпителия часть суспензии каждого пассажа культивировали на покровных стеклах (22x22 мм) в чашках Петри в течение 1 недели. Для иммуноцитохимического анализа использовал ии первичные антитела к кислому глиофибриллярному белку (GFAP, 1 :6; моноклональные антитела, полученные в лаборатории иммунохимии ГНЦ ССП им. В. П. Сербского), нестину (Сhеmiсоп Iпtеmаtiопаl, CA 10 μg/ml) и низкоаффинным рецепторам фактора роста нервов (p75, Сhеmiсоп Iпtегпаtiопаl, CA, 10 μg/ml). Полученные препараты исследовали и фотографировали во флуоресцентном микроскопе Lеiса DLMB.
Методика получения и культивирования HCK из обонятельной выстилки носа пациента
Ткань обонятельной выстилки, включающую обонятельные эпителий и слой соединительной ткани (lаmiпа рrоргiа) получают от пациентов с травмой спинного мозга и обрабатывают по стандартному культуральному протоколу.
В исследование принимаются взятые под местной анестезией фрагменты слизистой оболочки размером 10x5 мм, которые иссекают из верхнего отдела верхней носовой раковины. Полученную ткань доставляют в лабораторию в охлаждённом растворе Хенкса без Ca2+ и Mg2+ (HBSS), содержащем антибиотики и антимикотики (1 :100; Gibсо). Время доставки не превышет 2 ч. После повторной промывки в том же растворе из слизистой оболочки удаляют кровеносные сосуды, после чего ткань измельчают и инкубируют в течение 40 мин при 36,5°C в растворе трипсина/ЭДТА 0,25%, приготовленном на 0,01 M фосфатном буфере (PBS, рН 7,4). Действие ферментов блокируют средой DMEM (Gibсо), содержащей 3% сыворотки, ткань промывают в трёх сменах сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS; Напks' bаlапсеd sаlt sоlutiоп. Sigmа) и диссоциируют повторным пипетированием в питательной среде. Состав среды: минимальная среда Игла (MEM, Sigmа) 90%, эмбриональная сыворотка телят (Fеtаl bоviпе sеrum. FВS.Gibсо.Ivitгоgеп), глюкоза 0,8%, глутамин 2 мМ (Gibсо), добавок B27 (Sigmа), HEPES 20 мМ, ростовые факторы (только для первичных культур) - фактор роста фибробластов (FGF2, lпg/ml Sigmа), нейроростовой фактор (NGF 2 пg/ml, Sigmа). Полученную суспензию клеток центрифугируют (3 мин при 1200 об/мин), осадок ресуспендируют в питательной среде того же состава.
Количество и жизнеспособность диссоциируют клеток определяют в камере Горяева после окраски 0,1% раствором трипанового синего. Для последующего культивирования используют клеточные суспензии только с 85-95% жизнеспособных клеток.
Диссоциированные клетки (5-105 кл/мл) культивируют в 12-лyнoчныx планшетах на полилизин-ламининовом субстрате в течение 14 суток (36,50C, 5% CO2). Частичную смену 1/3 питательной среды производят два раза в неделю. Первичную культуру после формирования сливного монослоя снимают с помощью раствора трипсина/ЭДТА. После промывки в HBSS и центрифугирования клетки ресуспезируют в питательной среде. Клеточную суспензию (10000-12000 кл/см2) переносят в 12-лyнoчныe планшеты или флаконы (площадь 25 см2). Таким способом культуры пассируют 4 раза до формирования сливного монослоя. Формирующиеся в клеточном монослое прикреплённые к субстрату и свободноплавающие нейросферы отбирают с помощью Пастеровских пипеток и диссоциируют описанным выше методом ферментной обработки. Выделение нейросфер позволяет отделить их от прикреплённых к субстрату обкладочных глиальных клеток, фибробластов и стромальных (опорных) клеток. Клеточную суспензию клеток нейросфер после промывки и центрифугирования ресуспендируют в питательной среде и культивируют в 12-лyнoчныx планшетах (10000-12000 кл/см2) и на покровных стеклах (18x18 мм) в чашках Петри до формирования сливного монослоя. Полученные культуры используют для итологических и иммуноцитохимических исследований. Часть клеток последних пассажей замораживают в среде для криоконсервирования (90% сыворотки, 10% диметилсульфоксида) и хранят в жидком азоте. Имму но цитохимические исследования
Клеточный монослой фиксируют в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,01 M фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 30 мин. После промывки в PBS (3x10 мин.) клетки инкубируют 24 ч при 4°C с первичными антителами к β-тубулину (1 :300; Сhеmiсоп), нестину (1 :100, Сhеmiсоп) и нейрональной специфической енолазе (1:100, антитела получены в нашей лаборатории). После промывки в PBS клетки последовательно обрабатывают биотинилированными антителами с авидин-биотиновым комплексом (ABC, Vесtог Lаbоrаtоriеs, Iпс), раствором диаминобензидина, приготовленным на фосфатном буфере (DBA 0,5 мг/мл, перекись водорода 0,03%). Препараты обезвоживают и заключают под покровные стекла в синтетическую смолу (Епtеllап, Мегk).
Методика получения эндотелиальных клеток CD 34+ из препарата мобилизованных стволовых клеток
Для получения клеточного препарата эндотелиальных клеток (ЭК) положена стандартная методология выделения стволовых гемопоэтических клеток CD34+ CD 133+ из лейкоконцентрата мобилизованной периферической крови и сепарации на магнитных шариках (CD34+) с последующим краткосрочным культивированием клеток по стандартной методике. Среда культивирования клеток состоит из среды Искова в модификации Дубелько с добавлением 0,5 г/л сывороточного альбумина, 0,39 мкг/мл человеческого инсулина и 60 мкг/мл трансферрина. В культуральную среду добавляют 100 нг/мл фактора роста стволовых клеток (SCF), 20 нг/мл FltЗ (FltЗL) и 20 нг/мл тромбопоэтина TPO. Режим культивирования следующий. Клетки культивируют при 37°C в атмосфере 5% CO2. Свежую среду и цитокины добавляют каждый третий день. Время культивирования составляет 5-7 дней.
Для исключения попадания в клеточный препарат аутологичных мононуклеаров, эритроцитов, тромбоцитов и других форменных элементов крови проводится очистка лейкоконцентрата от них. Препарат очищенных мононуклеаров готовится из криоконсервированного и размороженного клеточного препарата мобилизованных аутологичных стволовых клеток (MACK), путем «oтмывки» от него 10% раствора ДМСО 3-х кратным центрифугированием на 2000 об/мин с физиологическим раствором 0,9% раствора NaCl.
Стадия III. Реконструктивная нейрохирургическая операция на CM или ГМ, интраоперационная подготовка ИКБП НЭПС, имплантация ИПБК НЭПС Интраоперационная подготовка ИКБП НЭПС
Клеточную биокомпозицию готовят в стерильных условиях либо непосредственно в операционной (ех tеmрого) или заранее в культуральной лаборатории (срок имплантации клеточных препаратов до 6 часов). Количество ИКБП НЭПС для имплантации определяется в зависимости от объема, характера и места повреждения мозга. Предварительный расчет потребности ИКБП НЭПС осуществляется на основании оценки зоны повреждения по данным MPT или КТ-исследований ГМ или CM. Приготовление ИКБП НЭПС выполняют следующим образом. Клеточные препараты в соответствии с вышеописанными пропорциями смешиваются в стерильной пробирке в нужных объемах и равномерно перемешиваются путем 2-3 заборов клеточной смеси в шприц и возвращения ее в пробирку. Препарат "Cфepo®ГEЯЪ" вынимают из холодильника и нагревают до температуры 37,5-38°C. Берут разовый шприц объемом, соответствующим необходимому расчетному объему ИКБП НЭПС. Из шприца удаляется поршень и резиновой или пластмассовой пробкой закрывается канюля для иглы шприца (шприц используется как пробирка). На дно шприцевой пробирки помещают 1 мл матрикса "Cфepo®ГEЯЪ" и к нему добавляют до 1 мл клеточного биокомпозита. Центрифугируют в течение 2-х минут в миницентрифуге со скоростью 2000 об/мин. При центрифугировании жидкая часть биокомпозита с клетками перфузируется в матрикс "Cфepo®ГEJlh" . При приготовлении большего объема ИКБП НЭПС в шприцевой пробирке проводят вышеописанную процедуру послойно, помещая матрикс "Cфepo®ГEЯЪ" и клеточный биокомпозит по типу «мнoгocлoйнoгo пиpoгa» и также центрифугируют в течении 2-3 минут. В шприц вставляется поршень и удаляется воздух. На канюлю шприца одевается пластмассовая стерильная бронюля (венозный катетер), которая будет использована для имплантации. В течении 30-40 минут после изготовления ИКБП НЭПС в шприце оставляют в стерильных условиях при комнатной температуре (20-220C) для охлаждения и придания ему консистенции зубной пасты. После чего ИКБП НЭПС может использоваться для имплантации.
Реконструктивная операция на CM или ГМ и имплантация ИКБП НЭПС Пластика дефектов CM с использованием ИКБП НЭП осуществляется во время стандартной нейрохирургической операции декомпрессионной ламинэктомии на уровне травмы путем вскрытия твердой мозговой оболочки (TMO) и проведенния радикуломиелолиза зоны повреждения. ИКБП НЭПС укладывают на поверхности дефекта CM и моделируют по всей длине повреждения. При интрамедуллярной или интрацеребральной имплантации ИКБП НЭПС изолируют от прямого ударного воздействия спинномозговой жидкости. Так при наличии интрамедуллярной кисты (кист) CM они вскрываются, кисты дренируются и ИКПБ НЭПС имплантируется внутрь кисты CM. При полных анатомических перерывах CM в зоне диастаза CM микрохирургически моделируется кондуит - трубкообразный проводник (ТОП), стенки которого формируются либо из внутреннего листка TMO пациента, либо из фасций мышц бедра пациента или из искусственного протеза артерии (аорты), подшитого к TMO пациента. Внутрь ТОП имплантируется ИКБП НЭПС. К сформированному кондуиту пришиваются (туннелируются и фиксируются швами к TMO) проксимальные и дистальные концы поврежденного CM. После завершения пластики CM проводят закрытие и ушивание TMO внутренним листком собственной TMO или искусственной TMO с последующим покрытием зоны пластики TMO стандарным биополимерным клеем (типа клея «Tиccyкoл»). Имплантация ИКБП НЭПС в дефекты ГМ проводится после эвакуации содержимого (ликвора, детрита и т.д.) из кистозных полостей ГМ, как во время открытых нейрохирургических операций, так и при функциональных нейрохирургических вмешательствах (стереотаксис, эндоскопические манипуляции и т.д.) или при имплантации ИКБП НЭПС в вегетативные ганглии. Пoкaзaнo,чтo в течении 12-24 месяцев ИКБП НЭПС деградирует, и зона протезирования замещается полностью или частично волокнами собственной нервной ткани пациента. Последующая нейровизуализация зоны пластики ГМ или CM с применением магнитно-резонансной томографии (MPT) через 8-12 месяцев позволяет верифицировать и оценить морфологию реконструированных тканевых структур ГМ и CM.
Послеоперационное ведение пациента осуществляется круглосуточно в течение 10 дней после имплантации ИКБП НЭПС. Анестезиолог-реаниматолог вместе с лечащим врачом должны осуществлять контроль состояния пациента для оценки степени риска развития возможных осложнений. Кроме того, показано постоянное наблюдение нейрохирурга и невролога, которые должны работать в тесной кооперации с гематологами, трансплантологами, иммунологами и врачами-лаборантами. Основными критериями эффективности проведенного вмешательства является улучшение неврологической симптоматики (двигательной, чувствительной и функции тазовых органов). Срок ожидаемого результата крайне индивидуален для каждого пациента и зависят от объема повреждения ГМ и CM, давности травмы, степени компенсации нарушенных функций. Эффективность терапии варьируется от 7 дней до 48 месяцев после операции по тканевой инженерии, и оценивается клиническими шкалами ASIA (Аmеriсап Sрiпаl Iпjurу Аssосiаtiоп Sсаlе - Шкала американской ассоциации спинальных повреждений), FIM (Sсаlе Functional Independens - Шкала функциональной независимости) и нейрофизиологическими методами исследования (церебральным картированием ЭЭГ, транскраниальной магнитной стимуляцией, соматосенсорными вызванными потенциалами и электонейромиографией, а так же комплексным уро динамическим исследованием).
Промышленная применимость
Эффективность настоящего изобретения оценивалась у пациентов с последствиями травм ГМ и CM в сравнении с традиционным хирургическим лечением. С целью объективизации полученных клинических результатов использовали специализированные шкалы ASIA и FIM, а также данные MPT, электронейромиографии, церебрального картирования ЭЭГ, комплексного уродинамического исследования, иммунохимического исследования крови и ликвора. Исследование проведено у 50 пациентов. Операции тканевой инженерии с имплантацией ИКБП НЭПС выполнены у 30 пациентов с тяжелой травматической болезнью CM. Все пациенты, включенные в исследование, были разбиты на 3 группы. 1-я группа (основная, 30 пациентов) - пациенты, оперированные с имплантацией ИКБП НЭПС, 2-я группа (контрольная, 20 пациентов) - пациенты, получавшие традиционное хирургическое лечение (декомпрессионная ламинэктомия, микрохирургический радикуломиелолиз, дренирование интрамедуллярных кист, пластика TMO). Распределение больных по полу и возрасту представлено в таблице 1.
Таблица 1 Распределение больных по полу и возрасту
Figure imgf000026_0001
Сравнение эффективности тканевой инженерии CM с имплантацией ИКБП НЭПС при травматической болезни ГМ и CM с традиционными хирургического методами лечения представлено на диаграмме фиг. 1. На этой диаграмме 1 группа - пациенты, получавшие хирургическое лечение с имплантацией ИКБП НЭП по настоящему изобретению; 2 группа - пациенты контрольной группы, получавшие традиционную хирургическую терапию. Достоверно (p<0,05) доказана высокая эффективность тканевой инженерии CM с имплантацией ИКБП НЭП при травматической болезни CM в отличие от контрольной группы. Достоверность (р <0,05) подсчитывалась с помощью метода χ2.
На фиг. 2 представлена динамика уро динамических показателей у больного В. до и после имплантации ИКБП НЭП по настоящему изобретению (А - урограмма до лечения, Б - урограмма после имплантации ИКБП НЭП).
Полученные данные представлены также в таблицах 2 и 3 и проиллюстрированы клиническими примерами 1 и 2. Таблица 2
Результаты лечения пациентов с травмой CM после операций по тканевой инженерии CM с имплантацией ИКБП НЭП
ω > m
δ
E
о
Zl
> го iз О
К) σ>
Figure imgf000027_0001
ω > m х δ
о
> ГО
О
К) σ>
Figure imgf000028_0001
с
* Состав ИКБП НЭП:
JNb 1 : "Cфepo®ГEJlЬ"; JNb 2: "Cфepo®ГEЛЬ", MH и ЭК;
JNb 3: "Cфepo®ГEЛЬ", НГОК и HCK; JNb 4: "Cфepo®ГEJlЪ", HCK,HГOK,MH и ЭК
Таблица 3
Результаты динамики неврологических нарушений у некоторых пациентов после операции по тканевой инженерии CM с имплантацией ИБПК НЭП
Figure imgf000029_0001
Таким образом, применение для лечения наиболее тяжелого контингента пациентов с травматической болезнью ГМ и CM (в том числе и при полном анатомическом перерыве CM) методов тканевой инженерии с имплантацией ИКБП НЭП по настоящему изобретению может рассматриваться как метод выбора, эффективность применения которого у пациентов достигает 45% в тех случаях, когда все традиционные методы и подходы лечения практически неэффективны. Использование традиционного хирургического подхода к лечению тяжелых последствий травматического повреждения ГМ и CM не приводит к значительному улучшению неврологической симптоматики. В то же время применение предложенной медицинской технологии существенно улучшает качество жизни пациентов с тяжелыми повреждениями ГМ и CM и значительно расширяет возможности функциональной и социальной независимости пациентов (таблицы 2, 3).
Предложенный способ проведения нейрохирургической операции на сегодня является единственным эффективным способом лечения больных с последствиями тяжелых травматических повреждений ГМ и CM, в том числе и с полным анатомическим перерывом CM (с диастазом до 5 см) и может привести к реальному улучшению не только их состояния и качества жизни, но и социальной адаптации в обществе. Возможное возвращение пациентов после повреждений головного и спинного мозга к нормальной общественно-социальной деятельности несет в себе большую экономическую целесообразность как с учетом возобновления трудовой деятельности, так и с учетом уменьшения затрат на длительное и малоэффективное лечение.
Клинический пример JVs 1
Пациентка Ш-га Я., 50 лет, поступила в клинику с жалобами на постоянные мучительные боли опоясывающего характера на уровне реберной дуги слева, отсутствие произвольных движений в ногах, отсутствие всех видов чувствительности с уровня паховой складки, склонность к задержке дефекации и невозможность управляемого мочеиспускания (самостоятельно катетеризирует мочевой пузырь в течении 14 лет). Из анамнеза известно, что в 1991 году в результате дорожно-транспортного происшествия пациентка получила травму грудного отдела позвоночника: осложненный компрессионный перелом тел ThIII и ThIV позвонков. В раннем периоде отмечалась нижняя параплегия, нижняя параанестезия с уровня Th5 сегмента. Оперативное вмешательство на грудном отделе позвоночника не проводилось. Неоднократно проходила курсы восстановительного лечения в центрах реабилитации без существенного эффекта.
02.10.2006 пациентка поступила в клинику для решения вопроса о возможности ее включения в программу исследований «Hoвыe клеточные технологии - мeдицинe». На момент поступления состояние пациентки компенсированное. Кожа и видимые слизистые обычной окраски, влажные. Регионарные лимфоузлы не пальпируются. Грудная клетка правильной формы. Дыхание самостоятельное адекватное, свободное, проводится во все отделы. ЧДД 16 в мин. Пульс ритмичный, удовлетворительного качества с частотой 88/мин. АД 120/60 мм.рт.ст. Тоны сердца ясные, ритмичные. Язык розовый, влажный. Живот мягкий, безболезненный. Печень не увеличена, селезенка не пальпируется. Почки в положении больной сидя не пальпируются. Органы чувств и железы внутренней секреции без видимой грубой патологии. Мочеиспускание с помощью катетера Фолея. Стул регулярный через день с использованием слабительных суппозиториев. Сознание ясное. Правильно ориентирована в пространстве, времени, собственной личности. Зрачки округлой формы, D=S, фотореакция живая, симметричная. Движения глазных яблок в полном объеме, нистагма нет. Нарушений чувствительности на лице нет. Лицо симметричное. Мягкое нёбо подвижное, симметричное. Фонация и глотание не нарушены. Атрофии, парезов, миофасцикуляций трапециевидной и кивательных мышц не выявлено. Язык по средней линии, без атрофии и фасцикуляций. Координаторные пробы выполняет удовлетворительно. Мышечный тонус в проксимальных и дистальных группах мышц рук не изменен. Гипотрофии мышц рук нет. Сухожильные и периостальные рефлексы рук умеренные, без отчетливой разницы сторон. Сила мышц рук - 5 баллов. Брюшные рефлексы не вызываются. Мышечный тонус в проксимальных и дистальных группах мышц нижних конечностей повышен по спастическому типу, по шкале Аshwоrth 3 балла. Имеет место выраженная гипотрофия мышц голеней. Сухожильные и периостальные рефлексы ног высокие, D=S. Выявляются патологические рефлексы стоп, клонусы стоп, надколенников. Сохранены движения мышц сгибателей бедра (1 балл), разгибателей колена (2 балла). Болевая и температурная параанестезия с уровня ThXII, тактильная параанестезия с уровня Th4. Нарушения функции тазовых органов в виде недержания мочи и склонности к запорам. Менингеального синдрома нет. Функциональная оценка по шкале ASIA: 56*42*46, степень поражения спинного мозга - А (полная). Функциональная оценка по шкале FIM 36%.
По результатам комплексного обследования пациентка включена в программу исследований «Hoвыe клеточные технологии - медициною В рамах этой программы проведен курс цитотрансфузий MACK в субарахноидальное пространство. На фоне проведенного лечения наметилась положительная динамика в виде появления ощущения наполнения мочевого пузыря. 26.09.2005 в клинике «HeйpoBитa» произведено оперативное вмешательство:
Ламинэктомия ThII-ThIII-ThIV, менинrомиелорадикулолиз, тканевая инженерия спинного мозга с использованием коллагенсодержащего гетерогенного матрикса "СфероФТЕЛЪ" с имплантированными аутологичными обкладочными глиообонятельными клетками (2,8- 106), шунтирование позвоночного канала армированным сосудистым протезом «Goгe Tex». Послеоперационный период протекал гладко, рана зажила первичным натяжением.
При контрольном осмотре через 2 года после операции состояние пациентки компенсированное. Кожа и видимые слизистые обычной окраски, влажные. Регионарные лимфоузлы не пальпируются. Грудная клетка правильной формы. Дыхание самостоятельное адекватное, свободное, проводится во все отделы. ЧДД 14 в мин. Пульс ритмичный, удовлетворительного качества с частотой 86/мин. АД 110/70 мм.рт.ст. Тоны сердца ясные, ритмичные. Язык розовый, влажный. Живот мягкий, безболезненный. Печень не увеличена, селезенка не пальпируется. Почки в положении больной сидя не пальпируются. Органы чувств и железы внутренней секреции без видимой грубой патологии. Мочеиспускание с помощью интермиттирующих катетеризации. Стул регулярный через день с использованием слабительных суппозиториев. Сознание ясное. Правильно ориентирована в пространстве, времени, собственной личности. Зрачки округлой формы, D=S, фотореакция живая, симметричная. Движения глазных яблок в полном объеме, нистагма нет. Нарушений чувствительности на лице нет. Лицо симметричное. Мягкое небо подвижное, симметричное. Фонация и глотание не нарушены. Атрофии, парезов, миофасцикуляций трапециевидной и кивательных мышц не выявлено. Язык по средней линии, без атрофии и фасцикуляций. Координаторные пробы выполняет удовлетворительно. Мышечный тонус в проксимальных и дистальных группах мышц рук не изменен. Гипотрофии мышц рук нет. Сухожильные и периостальные рефлексы рук умеренные, без отчетливой разницы сторон. Сила мышц рук - 5 баллов. Брюшные рефлексы низкие, D=S. Мышечный тонус в проксимальных и дистальных группах мышц нижних конечностей повышен по спастическому типу, по шкале Аshwоrth 2 балла. Имеет место умеренная гипотрофия мышц голеней. Сухожильные и периостальные рефлексы ног умеренные, D=S. Патологических рефлексов, клонусов не выявлено. Движения мышц сгибателей бедра (3 балла), разгибателей колена (3 балла), тыльные сгибатели стопы (2 балла), разгибатели I пальца (2 балла), подошвенные сгибатели пальцев (2 балла). Фиксирует колени при вертикализации. Болевая и температурная параанестезия с уровня L2, тактильная парагипестезия с уровня LЗ. Появились ощущение наполнения мочевого пузыря и произвольный контроль за мочеиспусканием. Не использует катетеризацию и памперсы. Менингеального синдрома нет. Функциональная оценка по шкале ASIA: 74*98*76, степень поражения спинного мозга - С (неполная). Функциональная оценка по шкале FIM 27%. По данным нейрофизиологического исследования появились низкоамплитудные, нечетко структурированные церебральные соматосенсорные вызванные потенциалы при стимуляции обеих нижних конечностей. Увеличилась амплитуда М-ответа с мышц нижних конечностей. Клинический пример JVs 2 Пациентка Р-ска Д., 37 лет, поступила в клинику с жалобами на отсутствие произвольных движений в ногах, отсутствие всех видов чувствительности с уровня паховой складки, задержку мочеиспускания и дефекации.
Из анамнеза известно, что в 2005 году в результате дорожно-транспортного происшествия пациентка получила травму грудного отдела позвоночника: осложненный компрессионный перелом тел ThXI и ThXII позвонков. В раннем периоде отмечалась нижняя параплегия, нижняя параанестезия с уровня ThI 1 сегмента. Перенесла 3 оперативных вмешательства: 1. Декомпрессивная ламинэктомия, транспедикулярная стабилизация на уровне ThX-LII (ноябрь 2005г., клиника Редегера, г. Краков, Польша); 2. Межтеловой спондилодез из передне-бокового доступа с использованием mеsh и фиксацией пластиной на уровне ThXI-ThXII (январь 2006, госпиталь Св. Томаша, г. Тарное, Польша); 3. Демонтаж транспедикулярной системы и установка ригидной транспедикулярной стабилизации на уровне ThX-LI-LII (февраль 2006, госпиталь Св. Томаша, г. Тарное, Польша). Пациентка неоднократно проходила курсы восстановительного лечения в центрах реабилитации Польши и Германии без существенного эффекта. 02.10.2006 пациентка поступила в клинику для решения вопроса о возможности ее включения в программу исследований «Hoвыe клеточные технологии - мeдицинe». На момент поступления состояние пациентки компенсированное. Кожа и видимые слизистые обычной окраски, влажные. Регионарные лимфоузлы не пальпируются. Грудная клетка правильной формы. Дыхание самостоятельное адекватное, свободное, проводится во все отделы. ЧДЦ 18 в мин. Пульс ритмичный, удовлетворительного качества с частотой 82/мин. АД 110/70 мм.рт.ст. Тоны сердца ясные, ритмичные. Язык розовый, влажный. Живот мягкий, безболезненный. Печень не увеличена, селезенка не пальпируется. Почки в положении больной сидя не пальпируются. Органы чувств и железы внутренней секреции без видимой грубой патологии. Мочеиспускание с помощью катетера Фолея. Стул 1 раз в 2-3 дня с использованием слабительных суппозиториев. Сознание ясное. Правильно ориентирована в пространстве, времени, собственной личности. Зрачки округлой формы, D=S, фотореакция живая, симметричная. Движения глазных яблок в полном объеме, нистагма нет. Нарушений чувствительности на лице нет. Лицо симметричное. Мягкое небо подвижное, симметричное. Фонация и глотание не нарушены. Атрофии, парезов, миофасцикуляций трапециевидной и кивательных мышц не выявлено. Язык по средней линии, без атрофии и фасцикуляций. Координаторные пробы выполняет удовлетворительно. Мышечный тонус в проксимальных и дистальных группах мышц рук не изменен. Гипотрофии мышц рук нет. Сухожильные и периостальные рефлексы рук умеренные, без отчетливой разницы сторон. Сила мышц рук - 5 баллов. Брюшные рефлексы не вызываются. Мышечный тонус в проксимальных и дистальных группах мышц нижних конечностей повышен по спастическому типу, по шкале Аshwоrth 3 балла. Имеет место выраженная гипотрофия мышц голеней. Сухожильные и периостальные рефлексы ног высокие, с расширением рефлексогенных зон, D=S. Выявляются патологические рефлексы стоп, клонусы стоп, надколенников. Нижняя спастическая параплегия. Болевая и температурная параанестезия с уровня LI, тактильная параанестезия с уровня LI. Нарушения функции тазовых органов в виде задержки мочеиспускания и дефекации. Менингеального синдрома нет. Функциональная оценка по шкале ASIA: 50*74*74, степень поражения спинного мозга - А (полная). Функциональная оценка по шкале FIM 31%.
По результатам комплексного обследования пациентка включена в программу исследований «Hoвыe клеточные технологии - медицине)). В рамах этой программы проведен курс цитотрансфузий MACK в субарахноидальное пространство. На фоне проведенного лечения наметилась положительная динамика в виде появления ощущения наполнения мочевого пузыря и появления позыва на мочеиспускание.
07.03.2007 в клинике «HeйpoBитa» произведено оперативное вмешательство: Демонтаж транспедикулярной стабилизирующей системы на уровне ThX-LI-LII. Ламинэктомия LI. Менингомиелорадикулолиз. Тканевая инженерия спинного мозга с использованием коллагенсодержащего гетерогенного матрикса "Cфepo®ГEЛЪ" с имплантированными аутологичными обкладочными глиообонятельными клетками (3,5-106) и мобилизированными аутологичными стволовыми клетками (ЭК и MH). Моделирование арахноидальной оболочки. Пластика TMO. Восстановление стабилизирующей системы на уровне ThX-LI-LII. Послеоперационный период протекал гладко, рана зажила первичным натяжением.
Проведены реабилитационные мероприятия по индивидуально разработанной программе.
При контрольном осмотре через год состояние пациентки компенсированное. Кожа и видимые слизистые обычной окраски, влажные. Регионарные лимфоузлы не пальпируются. Грудная клетка правильной формы. Дыхание самостоятельное адекватное, свободное, проводится во все отделы. ЧДД 16 в мин. Пульс ритмичный, удовлетворительного качества с частотой 86/мин. АД 120/80 мм.рт.ст. Тоны сердца ясные, ритмичные. Язык розовый, влажный. Живот мягкий, безболезненный. Печень не увеличена, селезенка не пальпируется. Почки в положении больной сидя не пальпируются. Органы чувств и железы внутренней секреции без видимой грубой патологии. Мочеиспускание с интермиттирующих катетеризации. Стул через день с использованием слабительных суппозиториев. Сознание ясное. Правильно ориентирована в пространстве, времени, собственной личности. Зрачки округлой формы, D=S, фотореакция живая, симметричная. Движения глазных яблок в полном объеме, нистагма нет. Нарушений чувствительности на лице нет. Лицо симметричное. Мягкое небо подвижное, симметричное. Фонация и глотание не нарушены. Атрофии, парезов, миофасцикуляций трапециевидной и кивательных мышц не выявлено. Язык по средней линии, без атрофии и фасцикуляций. Координаторные пробы выполняет удовлетворительно. Мышечный тонус в проксимальных и дистальных группах мышц рук не изменен. Гипотрофии мышц рук нет. Сухожильные и периостальные рефлексы рук умеренные, без отчетливой разницы сторон. Сила мышц рук - 5 баллов. Брюшные рефлексы не вызываются. Мышечный тонус в проксимальных и дистальных группах мышц нижних конечностей повышен по спастическому типу, по шкале Аshwоrth 1 балл. Сохраняется умеренная гипотрофия мышц голеней. Сухожильные и периостальные рефлексы ног умеренные, D=S. Патологических рефлексов, клонусов не выявлено. Появились движения мышц сгибателей бедра (3 балла), разгибателей колена (3 балла), тыльные сгибатели стопы (3 балла), разгибатели I пальца (3 балла), подошвенные сгибатели пальцев (2 балла). Может самостоятельно поднять правую ногу на высоту 50-60 см и описать ей полукруг вокруг оси конечности. Болевая и температурная параанестезия с уровня L2, тактильная парагипестезия с уровня L2. Появились ощущение наполнения мочевого пузыря. Менингеального синдрома нет. Функциональная оценка по шкале ASIA: 78*94*78, степень поражения спинного мозга - С (неполная). Функциональная оценка по шкале FIM 77%. По данным нейрофизиологического исследования увеличилась амплитуда потенциала действия сенсорных волокон нижних конечностей, увеличилась скорость распространения возбуждения по сенсорным волокнам с двух сторон, увеличилась габитуация H- рефлекса при стимуляции с обеих сторон.

Claims

Формула изобретения
1. Имплантируемая нейроэндопротезная система для замещения дефектов головного и спинного мозга и вегетативной нервной системы млекопитающего при реконструктивных нейрохирургических операциях, представляющая собой упругоэластичную клеточно-биополимерную биологически активную массу, полученную из гетерогенного коллагенсодержащего матрикса для имплантации и биокомпозиции клеточных препаратов из различных типов аутологичных клеток пациента.
2. Имплантируемая система по п. 1, отличающаяся тем, что биокомпозиция содержит находящиеся в растворе NaCl нейральные стволовые клетки (HCK), нейроглиальные обкладочные клетки (НГОК), эндотелиальные клетки с маркером CD34+ (ЭК) и очищенные мононуклеары (MH) при следующем соотношении компонентов (в частях по количеству клеток): HCK - 0,8-1,2; НГОК - 1,6-2,4; ЭК - 4-6; MH - 4000-6000.
3. Имплантируемая система по п. 2, отличающаяся тем, что использован 0,5-1,3%- ный раствор NaCl.
4. Имплантируемая система по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве гетерогенного коллагенсодержащего матрикса использована композиция гетерогенного имплантируемого геля "Cфepo®ГEЛЬ".
5. Имплантируемая система по любому из п.п. 1-4, отличающаяся тем она содержит следующее количество клеток в 0,5-1 мл 0,9%-нoгo раствора NaCl из расчета на 1 мл гетерогенного коллагенсодежащего матрикса: HCK - 106; НГОК - 2 106; ЭК - 5-Ю6; MH - 5-Ю9.
6. Имплантируемая система по п. 1, отличающаяся тем, что биокомпозиция дополнительно содержит стимуляторы клеточной регенерации и факторы роста нервов и сосудов.
7. Способ получения имплантируемой нейроэндопротезной системы для замещения дефектов головного и спинного мозга и вегетативной нервной системы млекопитающего при реконструктивных нейрохирургических операциях, включающий в себя перфузирование биокомпозиции клеточных препаратов из различных типов аутологичных клеток пациента в гетерогенный коллагенсодержащий матрикс для имплантации с получением упругоэластичной клеточно-биополимерной биологически активной массы.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что перфузирование проводят путем центрифугирования.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что центрифугирование проводят в течение
1,5-2,5 минут при скорости 1500-2500 об/мин.
10. Способ по п. 7, отличающийся тем, что биокомпозицию готовят из криоконсервированных клеточных препаратов, которые непосредственно перед получением имплантируемой нейроэндопротезной системы размораживают на водяной бане при температуре 37-4O0C и затем не менее двух раз промывают в физиологическом растворе NaCl.
11. Способ по любому из п.п. 7-10, отличающийся тем, что биокомпозиция содержит находящиеся в растворе NaCl нейральные стволовые клетки (HCK), нейроглиальные обкладочные клетки (НГОК), эндотелиальные клетки с маркером CD34+ (ЭК) и очищенные мононуклеары (MH).
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что источником HCK и НГОК является обонятельная выстилка носа пациента, а источником ЭК и MH - костный мозг пациента или лейкоконцентрат мобилизованных аутологичных стволовых клеток пациента, полученный при сепарации периферической крови после стимуляции пациента гранулоцитарным колониестимулирующим фактором.
13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в биокомпозицию добавляют стимуляторы регенерации тканей и факторы роста нервов и сосудов.
14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что его проводят в стерильных условиях или непосредственно в операционной (ех tеmроrо) или в культуральной лаборатории.
15. Способ проведения реконструктивной нейрохирургической операции для замещения дефектов головного и/или спинного мозга и/или вегетативной нервной системы млекопитающего, включающий в себя имплантацию в дефект нервной ткани нейроэндопротезной системы в виде упругоэластичной клеточно-биополимерной биологически активной массы, полученной из гетерогенного коллагенсодержащего матрикса для имплантации и биокомпозиции клеточных препаратов из различных типов аутологичных клеток пациента.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что биокомпозиция содержит находящиеся в растворе NaCl нейральные стволовые клетки (HCK), нейроглиальные обкладочные клетки (НГОК), эндотелиальные клетки с маркером CD34+ (ЭК) и очищенные мононуклеары (MH).
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что в качестве гетерогенного коллагенсодержащего матрикса используют композицию гетерогенного имплантируемого геля "СфероФГЕЛЪ".
18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нейроэндопротезную систему имплантируют путем ее помещения в дефект по типу «плoмбиpoвaния» с заполнением ею всего объема кисты или повреждения головного и/или спинного мозга.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что после помещения нейроэндопротезной системы в дефект ее закрывают аутологичной мышечной фасцией или искусственной твердой мозговой оболочкой и/или биодеградируемой синтетической полимерной оболочкой для ограничения контакта нейроэндопротезной системы с ликвором пациента.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что в качестве биодеградируемой синтетической полимерной оболочки используют имплантируемую биополимерную мембрану "ЭластоПОБ"®.
21. Способ по п. 15, отличающийся тем, что при полном анатомическом перерыве спинного мозга нейроэндопротезную систему имплантируют путем формирования кондуита из искусственного протеза артерии и нейроэндопротезной системы, которой по меньшей мере частично заполняют этот протез, помещения кондуита в зону диастаза между концами поврежденного спинного мозга и последующего подшивания мягкой оболочки дистального и проксимального концов поврежденного спинного мозга к стенкам кондуита.
22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что длину искусственного протеза артерии выбирают равной длине диастаза, а ширину этого протеза - диаметру спинного мозга в месте повреждения.
23. Способ по любому из пунктов 15-22, отличающийся тем, что при интрамедуллярной или интрацеребральной имплантации нейроэндопротезную систему изолируют от прямого ударного воздействия спинномозговой жидкости.
PCT/RU2009/000067 2008-09-25 2009-02-13 Имплантируемая нейроэндопротезная система, способ её получения и способ проведения реконструктивной нейрохирургической операции WO2010036141A1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/121,069 US20110177170A1 (en) 2008-09-25 2009-02-13 implantable neuroendoprosthetic system, a method of production thereof and a method of reconstructive neurosurgical operation
EP09816502A EP2347763A4 (en) 2008-09-25 2009-02-13 IMPLANTABLE NEURO-ENDOPROSTHESIS SYSTEM, METHOD FOR PRODUCING THE SAME, AND METHOD FOR EXECUTING RECONSTRUCTIVE NEUROSURGERY OPERATION
US14/748,183 US9750848B2 (en) 2008-09-25 2015-06-23 Method of preparing an implantable neuroendoprosthetic system

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008138161/14A RU2394593C2 (ru) 2008-09-25 2008-09-25 Имплантируемая нейроэндопротезная система, способ ее получения и способ проведения реконструктивной нейрохирургической операции
RU2008138161 2008-09-25

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/121,069 A-371-Of-International US20110177170A1 (en) 2008-09-25 2009-02-13 implantable neuroendoprosthetic system, a method of production thereof and a method of reconstructive neurosurgical operation
US14/748,183 Continuation-In-Part US9750848B2 (en) 2008-09-25 2015-06-23 Method of preparing an implantable neuroendoprosthetic system

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010036141A1 true WO2010036141A1 (ru) 2010-04-01

Family

ID=42059926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2009/000067 WO2010036141A1 (ru) 2008-09-25 2009-02-13 Имплантируемая нейроэндопротезная система, способ её получения и способ проведения реконструктивной нейрохирургической операции

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20110177170A1 (ru)
EP (1) EP2347763A4 (ru)
RU (1) RU2394593C2 (ru)
WO (1) WO2010036141A1 (ru)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2464020C2 (ru) * 2011-07-29 2012-10-20 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Способ стимулирования регенерации нерва
RU2478398C1 (ru) * 2011-12-23 2013-04-10 Закрытое акционерное общество "Институт прикладной нанотехнологии" Биополимерный матрикс для пролиферации клеток и регенерации нервных тканей
RU2517117C2 (ru) * 2012-11-26 2014-05-27 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России) Способ стимулирования регенерации нерва с помощью наноструктурированного матрикса и генетических конструкций
US10335435B2 (en) 2015-05-22 2019-07-02 Marco Merida Method for endoscopically delivering stem cells to the brain using an intranasal, injectable approach
CN109125922A (zh) * 2018-08-14 2019-01-04 上海白衣缘生物工程有限公司 一种生物套在神经刺激器植入方面的应用
RU2716013C2 (ru) * 2019-05-27 2020-03-05 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ изготовления средства для клеточно-опосредованной генной терапии и средство для клеточно-опосредованной генной терапии
US11446084B2 (en) 2019-07-12 2022-09-20 Neuralink Corp. Laser drilling of pia mater
FR3108260B1 (fr) 2020-03-17 2024-01-05 Neurobiomat Hydrogel hétérogène hybride, procédé de fabrication et utilisation comme implant de comblement non-dégradable in-situ
RU2744966C1 (ru) * 2020-07-26 2021-03-17 Светлана Алексеевна Зорькина Способ коррекции дефектов кожи

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002086106A1 (en) * 2001-04-23 2002-10-31 Nsgene A/S Method and culture medium for producing neural cells expressing tyrosine hydroxylase
RU2249462C1 (ru) 2003-08-21 2005-04-10 Севастьянов Виктор Иванович Универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации и способ его получения
RU2283119C1 (ru) 2005-03-29 2006-09-10 Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ Препарат аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, способ его получения, криоконсервации и использования для лечения травматической болезни центральной нервной системы
WO2008102460A1 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Sanbio Inc. Transplantation of bone marrow stromal cell-induced neural stem cells for promoting fuctional recovery after spinal cord injury

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6171610B1 (en) * 1998-04-24 2001-01-09 University Of Massachusetts Guided development and support of hydrogel-cell compositions
WO2001003609A1 (fr) * 1999-07-07 2001-01-18 Tapic International Co., Ltd. Tube neural artificiel
US20040136968A1 (en) * 2002-09-27 2004-07-15 Verigen Ag Autologous cells on a support matrix for tissue repair
CN101437528A (zh) * 2004-10-28 2009-05-20 梅迪沃什有限公司 生物活性创伤敷料和可植入装置及使用方法
DE102005042455A1 (de) * 2005-09-06 2007-04-12 Medizinische Hochschule Hannover Nervenimplantat

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002086106A1 (en) * 2001-04-23 2002-10-31 Nsgene A/S Method and culture medium for producing neural cells expressing tyrosine hydroxylase
RU2249462C1 (ru) 2003-08-21 2005-04-10 Севастьянов Виктор Иванович Универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации и способ его получения
RU2283119C1 (ru) 2005-03-29 2006-09-10 Андрей Степанович БРЮХОВЕЦКИЙ Препарат аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, способ его получения, криоконсервации и использования для лечения травматической болезни центральной нервной системы
WO2008102460A1 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 Sanbio Inc. Transplantation of bone marrow stromal cell-induced neural stem cells for promoting fuctional recovery after spinal cord injury

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S.WOERLY, V.D.DOAN, F.EVANS-MARTIN, C.G.PARAMORE, J.D.PEDUZZI: "Spinal cord reconstruction using NeuroGelTM implants and functional recovery after chronic injury", J. OF NEUROSCIENSCE RES., vol. 66, 2001, pages 1187 - 1197
See also references of EP2347763A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2394593C2 (ru) 2010-07-20
US20110177170A1 (en) 2011-07-21
EP2347763A1 (en) 2011-07-27
RU2008138161A (ru) 2010-03-27
EP2347763A4 (en) 2013-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2394593C2 (ru) Имплантируемая нейроэндопротезная система, способ ее получения и способ проведения реконструктивной нейрохирургической операции
Chernykh et al. Application of autologous bone marrow stem cells in the therapy of spinal cord injury patients
CN104212760B (zh) 肌肉干细胞体外培养方法及其应用
JP2008534529A (ja) 自家造血幹細胞の調製物、その製造方法、低温保存方法、および中枢神経系の外傷性疾患の治療のための使用
de Souza Lucena et al. Experimental considerations concerning the use of stem cells and tissue engineering for facial nerve regeneration: a systematic review
US20210244770A1 (en) Method for xeno-free generation of a population of hmpc
KR100959995B1 (ko) 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는,신경전구세포 또는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화 및증식 유도용 조성물
William et al. Functional recovery of spinal cord injury following application of intralesional bone marrow mononuclear cells embedded in polymer scaffold-two year follow-up in a canine
US20230201423A1 (en) Cell sheet construct for neurovascular reconstruction and manufacture thereof
US20100021436A1 (en) Multipotent adult stem cell derived from canine umbilical cord blood, placenta and canine fetus heart, method for preparing the same and cellular therapeutics containing the same
US20220154142A1 (en) Production of schwann cells
Cheng et al. Ten years of clinical observation of olfactory ensheathing cell transplantation in patients with spinal cord injury
CN106421756A (zh) 一种脂肪间充质干细胞组合物及其应用
KR101653197B1 (ko) 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화 유도방법
WO2004045666A1 (ja) 臓器の再生方法
Temeltas et al. Bladder function recovery in rats with traumatic spinal cord injury after transplantation of neuronal-glial restricted precursors or bone marrow stromal cells
US9750848B2 (en) Method of preparing an implantable neuroendoprosthetic system
CN104582729B (zh) 新细胞组合物及其制备方法和用途
RU2798554C2 (ru) Биомедицинский клеточный продукт для лечения онкологических, нейродегенеративных, аутоимунных заболеваний и травм головного и спинного мозга
CN108392624A (zh) 活性促进肽以及间充质干细胞在治疗类风湿性关节炎中的应用
RU2286160C1 (ru) Способ лечения травматических повреждений спинного мозга
RU2720002C1 (ru) Биомедицинский клеточный продукт для лечения нервных болезней и психических расстройств, способ его получения и его применение
CN109641016A (zh) 表达甲状旁腺激素1受体的细胞及其用途
Gu et al. Combined use of chitosan-PGLA nerve grafts and bone marrow mononuclear cells to repair a 50-mm-long median nerve defect combined with an 80-mm-long ulnar nerve defect in the human upper arm
CN101721430A (zh) 羊膜上皮细胞在制药中的用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09816502

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13121069

Country of ref document: US

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2009816502

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009816502

Country of ref document: EP