WO2010034956A1 - Nouvelle methode de mesure non-radioactive de la synthese proteique et marquage des proteines dans les cellules vivantes - Google Patents

Nouvelle methode de mesure non-radioactive de la synthese proteique et marquage des proteines dans les cellules vivantes Download PDF

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WO2010034956A1
WO2010034956A1 PCT/FR2009/051833 FR2009051833W WO2010034956A1 WO 2010034956 A1 WO2010034956 A1 WO 2010034956A1 FR 2009051833 W FR2009051833 W FR 2009051833W WO 2010034956 A1 WO2010034956 A1 WO 2010034956A1
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puromycin
cells
derivative
antibiotic
aminonucleoside
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Application number
PCT/FR2009/051833
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Inventor
Philippe Pierre
Enrico Schmidt
Giovanna Clavarino
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S)
Universite De La Mediterranee Aix-Marseille Ii
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S), Universite De La Mediterranee Aix-Marseille Ii filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S)
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins

Definitions

  • the present invention relates to a non-radioactive measurement method of the level of protein synthesis in a living cell.
  • mRNA messenger RNA
  • mRNA messenger RNA
  • Protein synthesis is controlled by multiple surface receptors and signal transduction cascades that coordinate proliferation and cell survival (Sabatini (2006) Nat Rev. Cancer 6: 729). Translation control has therefore become an important focus in biological research and new strategies for monitoring protein synthesis have been developed in recent years.
  • radioactive amino acid incorporation techniques are the basis of current knowledge on translation (Borsook et al (1949) Fed Proc 8: 589, Borsook et al (1949) J. Biol. Chem 179: 689). Nevertheless, these techniques have a number of significant disadvantages, particularly related to radiation protection problems. This is why other techniques that could replace the use of radioelements have been sought. It has thus been proposed to transform cells with fluorescent reporters or to enzymatically load unnatural amino acids onto tRNA (Noren et al (1989) Science 244: 182). However, these methods have never proved as effective as radiolabeling techniques.
  • Puromycin is a naturally occurring amnionucleoside antibiotic produced by Streptomyces alboniger. It is a structural analogue of aminoacylated tRNAs, which is attached to the growing peptide chain during translation, thus preventing further elongation (Nathans (1964) Fed Proc., 23: 984). The normal ester linkage of tRNA is replaced in puromycin by amide bond, which makes the compound more resistant to hydrolysis, thereby promoting ribosome stalling and premature release of the growing protein chain (Nathans (1964) Proc Natl Acad Sci USA 51: 585). Interestingly, if puromycin is used in small amounts, its incorporation into neo-synthesized proteins directly reflects the rate of translation of 1 mRNA into living cells.
  • the present invention thus relates to a method for measuring the level or detection of protein synthesis in a cell comprising the steps of: a) contacting the cell with an aminonucleoside antibiotic or a derivative thereof, b1) detecting or measuring the amount of aminonucleoside antibiotic or its derivative incorporated into protein fragments of the cell, wherein the level of the aminonucleoside antibiotic or its derivative in the protein fragments is indicative of the level or presence of protein synthesis in the cell.
  • protein synthesis or “protein synthesis” is meant here the process by which a cell assembles a protein chain by amino acid linkage, the sequence of the protein chain being a function of the DNA sequence of the gene encoding said amino acid. protein.
  • the protein synthesis comprises at least two steps: on the one hand the transcription of the DNA into mRNA and on the other hand the translation of the mRNA into protein.
  • the detection of the protein synthesis according to the invention corresponds more particularly to the detection of the translation step.
  • protein fragment is meant herein an amino acid chain resulting from the complete or partial translation of an mRNA.
  • the protein synthesis detected in a cell reflects the metabolism of this cell. In particular, the detection of protein synthesis in a cell means that said cell is alive. Therefore, the method of detecting the protein synthesis as defined above makes it possible to detect the presence of a living cell in a given medium.
  • the cells according to the invention may be prokaryotic cells, in particular Gram-positive or Gram-negative bacteria, or eukaryotic cells.
  • eukaryotic cells according to the invention include unicellular fungi, yeasts, protozoa, cells derived from metazoans and plants.
  • the cells according to the invention may be cells cultured in vitro or cells present in a tissue, an organ or an organism.
  • medium is meant here a support, preferably a fluid, in which cells can live.
  • the medium according to the invention may be a biological medium such as for example blood, urine, lymph, a synthetic or natural culture medium allowing the survival of living organisms. Examples of environment also include city water, mineral or spring water, wastewater.
  • aminonucleoside antibiotic is meant herein an antibiotic affecting protein synthesis and which acts by competing with aminoacyl-tRNAs when they bind to site A of the large ribosomal subunit.
  • suitable aminonucléosidiques include puromycin and its synthetic analogues, such as 6-DMAP, puromycin N 6 - bis-demethylated, and puromycin North methanocarba.
  • the aminonucleoside antibiotic used according to the invention is puromycin.
  • aminonucleoside antibiotic derivative is intended to mean an aminonucleoside antibiotic as defined above modified chemically or enzymatically, optionally comprising marker groups, but which retains the properties of the natural aminonucleoside antibiotic on protein synthesis.
  • the aminonucleoside antibiotic derivative used according to the invention is not an aminonucleoside antibiotic conjugated to a fluorophore.
  • cell contact with an aminonucleoside antibiotic is meant here, incubating the cell in a suitable medium with an aminonucleoside antibiotic as defined above at sufficient concentration and for a period of time sufficient for the aminonucleoside antibody to be incorporated into the protein fragments being synthesized in the cell.
  • the aminonucleoside antibiotic is used at a concentration of between about 0.1 ⁇ g / ml and about 50 ⁇ g / ml, more preferably at a concentration of between about 0.5 ⁇ g / ml and about 25 ⁇ g / ml, even better at a concentration between about 1 ⁇ g / ml and about 15 ⁇ g / ml, most preferably at a concentration of about 10 ⁇ g / ml.
  • the cell is brought into contact with the aminonucleoside antibiotic for a suitable period for obtaining a signal whose level is significantly higher than that of the background noise.
  • the cell is contacted with the aminonucleoside antibiotic for a period of between 15 seconds and 3 hours, more preferably for a period of between 1 minute and 1 hour, more preferably for a period of time between 5 minutes and 30 min, most preferably for a period of about 10 min.
  • the step b1) of detecting the level of the aminonucleoside antibiotic, or of its derivative, of the process defined above is carried out using a compound having a specific affinity for the aminonucleoside antibiotic or its derivative.
  • Suitable compounds having a specific affinity for the aminonucleoside antibiotic or its derivative include, in particular, antibodies and aptamers.
  • “Aptamers” are oligonucleotide or peptide sequences having the ability to recognize virtually any class of target molecules with high affinity and specificity. The modes of obtaining, modifications, applications and advantages of these molecules are described for example in Jayasena (1999) Clin. Chem. 45: 1628-1650.
  • the compound having a specific affinity for the aminonucleoside antibiotic, or its derivative, used according to the invention is an antibody.
  • antibodies refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, i.e., molecules that contain an antigen binding site which specifically binds to an antigen.
  • the term “antibody” therefore includes not only whole antibody molecules but also antibody fragments as well as variants (including derivatives) of antibodies and antibody fragments.
  • An antibody according to the invention may be a mammalian antibody, in particular an antibody of mouse, rat, rabbit or camelide.
  • An antibody according to the invention may be a polyclonal or monoclonal antibody.
  • Antibody fragments comprise a portion of an intact antibody, preferably the variable or antigen binding region of the intact antibody.
  • the antibody according to the invention is a monoclonal antibody.
  • the antibody according to the invention may be a modified antibody.
  • the antibody according to the invention may be conjugated to a marker group.
  • the marker group can be for example a non-radioactive marker substance such as a fluorophore, an enzyme such as alkaline phosphatase, horseradish peroxidase or luciferase, a coenzyme such as biotin, proteins, peptides, sugars, lipids, dyes, polyethylene glycol, and the like.
  • a non-radioactive marker substance such as a fluorophore
  • an enzyme such as alkaline phosphatase, horseradish peroxidase or luciferase
  • a coenzyme such as biotin, proteins, peptides, sugars, lipids, dyes, polyethylene glycol, and the like.
  • the antibody used in the present invention is an antibody conjugated to a fluorophore.
  • the term "specific”, when referring to recognition or binding of a ligand to a target, means that the ligand interacts with the target without substantial interaction with another target lacking structural resemblance to the target.
  • the antibody specific for the aminonucleoside antibiotic, or its derivative is specific for the aminonucleoside antibiotic, or its derivative, incorporated in the protein fragments with respect to the aminonucleoside antibiotic, or its derivative, free unincorporated in protein fragments. Techniques for identifying an antibody specific for the aminonucleoside antibiotic, specific for the aminonucleoside antibiotic incorporated in the protein fragments relative to the free aminonucleoside antibiotic not incorporated in the protein fragments, are known to those skilled in the art.
  • the antibody is firstly contacted with cells treated with the aminonucleoside antibiotic, and secondly brought into contact with the free aminonucleoside antibiotic.
  • the binding of the antibody with the aminonucleoside antibiotic incorporated into the protein fragments in the treated cells on the one hand, and with the free aminonucleoside antibiotic on the other hand, is then detected either directly or indirectly with the aid of a secondary antibody.
  • An antibody for which binding is detected with the aminonucleoside antibiotic incorporated into the protein fragments in the treated cells, but not with the free aminonucleoside antibiotic corresponds to an antibody specific for the aminonucleoside antibiotic incorporated into the protein fragments with respect to the free aminonucleoside antibiotic not incorporated in the protein fragments.
  • the detection step b1) of the method defined above can be carried out by any appropriate immunodetection technique making it possible to reveal the binding of an antibody.
  • detection techniques are well known to those skilled in the art including immunofluorescence, chemiluminescence, colorimetric, radiolabeling, immunochemistry, immunopurification and immunoprecipitation techniques.
  • the detection step b1) of the method defined above may in particular be carried out on living cells, cell lysates or a medium conditioned by the cells studied (for example, a culture supernatant).
  • the method defined above further comprises a step a2) of lysis of the cells after the contacting step a1) and before the detection step b1).
  • This cell lysis step a2) typically comprises contacting the cells under study with lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, protease inhibitors) for 10 min. min on ice.
  • the cells can also be taken directly in Laemmli buffer (65 mM Tris-HCl pH 6.8, 3% SDS, 10% glycerol, 100 mM DTT, 0.004% bromophenol blue).
  • the detection step b1) of the method defined above is then implemented by immunoblotting.
  • the methods of immunoblotting or Western blotting are well known to those skilled in the art and typically include the steps of migrating the cell extracts on a denaturing polyacrylamide gel, transfer the proteins thus separated on a nitrocellulose or PVDF membrane, saturate the membrane with a solution of TBS 0.1% Tween 20 containing skimmed milk powder, incubate the membrane with a primary antibody and then with a secondary antibody, reveal the membrane with a suitable revealing system depending on the type of secondary antibody used, such as chemiluminescence or colorimetry.
  • the detection step b1) of the method defined above is carried out on a living cell.
  • the detection step b1) of the process defined above is then carried out by flow cytometry or by microscopy, in particular by microscopy. confocal fluorescence. More preferably, the detection step b1) of the method defined above consists in detecting, by flow cytometry, the aminonucleoside antibiotic or the aminonucleoside antibiotic derivative on the surface of the cells. The inventors have in fact surprisingly demonstrated that the detection on the surface of the cells of the aminonucleoside antibody, in particular of puromycin, incorporated into the membrane proteins, was directly proportional to the overall incorporation of the aminonucleoside antibody. . This technique is called here SUnSET technique. Typically, the SUnSET technique is implemented as follows.
  • the aminonucleoside antibiotic or the aminonucleoside antibiotic derivative is contacted at an appropriate concentration, preferably at a concentration of 10 ⁇ g / ml, for a suitable period, preferably about 10 min, with the living cells or tissues. After washing and an appropriate flush period, preferably 50 minutes, the treated cells are incubated with an antibody specific for the aminonucleoside antibiotic or aminonucleoside antibiotic derivative, labeled directly or not with a suitable fluorophore. Detection of this antibody is then performed on the cells, living or fixed, by flow cytometry according to standard protocols well known to those skilled in the art. Most preferably, the method according to the invention defined above is not radioactive.
  • the present invention also relates to a method for screening new pharmacological compounds capable of affecting the metabolism or of killing cells comprising the steps of: a) contacting the cells with the pharmacological compound to be tested, b) contacting the cells, previously treated or not with the pharmacological compound to be tested, with an aminonucleoside antibiotic, or a derivative thereof, as defined above, c) detecting the level of the aminonucleoside antibiotic, or its derivative, in protein fragments in the cells treated or not with the pharmacological compound to be tested, using an antibody specifically directed against the aminonucleoside antibiotic, or derivative thereof; d) comparing the level of the aminonucleoside antibiotic, or derivative thereof, in the cells treated with the test drug compound and the untreated cells; wherein a higher level of the aminonucleoside antibiotic, or derivative thereof, in the protein fragments in cells not treated with the test drug compound relative to cells treated with the test drug compound, indicates that the testing is likely to affect metabolism or kill cells.
  • the present invention also relates to a kit for measuring the level or to detect the presence of protein synthesis in cells, the kit comprising: an aminonucleoside antibiotic or a derivative thereof as defined above,
  • electrophoresis system is meant here any system for separating and characterizing proteins and / or nucleic acids according to their size and / or their isoelectric point. Suitable electrophoresis systems are well known to those skilled in the art and include in particular isoelectric focusing electrophoreses (electrophoresis in a pH gradient), polyacrylamide gel electrophoresis, agarose gel electrophoresis, bi-electrophoresis. -dimensional, pulsed field electrophoresis, electrophoresis under denaturing conditions.
  • a suitable electrophoresis system comprises an SDS-PAGE or Tris-Tricine polyacrylamide gel, optionally accompanied by an electrophoresis tank, a migration buffer, a generator.
  • the present invention also relates to a kit for measuring or detecting by FACS the level or presence of protein synthesis in cells, the kit comprising: an aminonucleoside antibiotic or a derivative thereof as defined above, and
  • an antibody specific for the aminonucleoside antibiotic, or its derivative, as defined above the antibody preferably being an antibody conjugated to a marker group as defined above.
  • the present invention also relates to the use, preferably in vitro, of a compound having a specific affinity for an aminonucleoside antibiotic, or a derivative thereof, as defined above for detecting the presence of protein fragments. labeled with the aminonucleoside antibiotic, or its derivative, as defined above, on the surface of a cell having been placed in contact with the aminonucleoside antibiotic, or its derivative, as defined above.
  • the present invention thus describes an antibody specific for an aminonucleoside antibiotic or a derivative thereof for its use in the detection of the presence of protein fragments labeled with the aminonucleoside antibiotic or its derivative on the surface of a cell. having been contacted with the aminonucleoside antibiotic or its derivative.
  • protein fragments on the surface of a cell is meant here protein fragments or proteins of the cell as defined above which are embedded in the plasma membrane of the cell or bound to the plasma membrane of the cell. As is well known to those skilled in the art, these protein fragments and proteins are produced in the cell and are then transported to the plasma membrane of the cell by the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus.
  • FIG. 1 represents the result of an anti-puromycin blot (puro, panel on the left) and autoradiography ( 35 S, right panel) made on untreated B3Z cells (without puro / 35 S), treated during 1 h with 10 ⁇ g / ml of puromycin (puro), treated for 10 min with 25 ⁇ M cycloheximide and then treated for 1 h with 10 ⁇ g / ml puromycin (puro + CHX), treated for 10 min with 35 S promix ( 35 S) or treated for 10 min with 25 ⁇ M cycloheximide and then treated for 10 min with 35 S ( 35 S + CHX) promix.
  • An anti-actin detection showing the equality of the quantities charged in the wells is also presented (actin).
  • FIG. 2 represents the result of an anti-puromycin blot (puro, left panel) and autoradiography ( 35 S, right panel) made on primary OT-1 CD8 ⁇ + splenocytes stimulated or not with dendritic cells.
  • Mature cells loaded with SIINFEKL peptide (SEQ ID NO: 1) (mDC-SL8) and incubated for 1 hour with puromycin (puro) or with 35 S ( 35 S) promix.
  • An anti-actin detection showing the equality of the quantities charged in the wells is also presented (actin).
  • the graph above the blot represents the marking intensity determined for each of the wells.
  • FIG. 3 represents images taken by fluorescence confocal microscopy of NIH3T3 cells treated for 10 min with 10 ⁇ g / ml of puromycin and labeled with an anti-puromycin (puro, left panel) and an antiphospho-elF2 ⁇ (P-type). elF2 ⁇ , middle panel). The panel on the right represents the overlapping of the two markings. The scale bar corresponds to 10 ⁇ m. The graph shows the fluorescence intensities measured with anti-puromycin (puro) and anti-phospho-elF2 ⁇ (P-elF2 ⁇ ) at the section shown in the right image.
  • FIG. 4 represents images taken by confocal fluorescence microscopy of NIH3T3 cells treated for 5 min with 25 ⁇ M of cycloheximide (CHX) then for 10 min with 10 ⁇ g / ml of puromycin and labeled with an anti-puromycin (puro, panel of left) and an anti-phospho-elF2 ⁇ (P-elF2 ⁇ , middle panel).
  • the panel on the right represents the overlapping of the two markings.
  • the scale bar corresponds to 10 ⁇ m.
  • the graph represents the fluorescence intensities measured with anti-puromycin (puro) and anti-phospho-elF2 ⁇ (P-elF2 ⁇ ) at the section shown in the right image.
  • FIG. 5 represents images taken by fluorescence confocal microscopy of NIH3T3 cells treated for 10 min with 10 ⁇ g / ml of puromycin and labeled with an anti-phospho-elF2 ⁇ (P-elF2 ⁇ , panel at the top left), an anti- puromycin (puro, middle panel at the top) and an oligo dT-Alexa 555 (oligo dT, panel bottom left).
  • the panel at the top right represents the superposition of anti-puromycin and anti-phospho-elF2 ⁇ markings.
  • the bottom panel in the middle represents the superposition of the three markings.
  • the scale bar corresponds to 10 ⁇ m.
  • the graph represents the fluorescence intensities measured with anti-puromycin (puro) and anti-phospho-elF2 ⁇ (P-elF2 ⁇ ) at the section shown in the image at the top right.
  • FIG. 6 represents images taken by confocal fluorescence microscopy of NIH3T3 cells treated for 30 min with 500 ⁇ M of arsenite (AS) then treated for 10 min with 10 ⁇ g / ml of puromycin and labeled with an anti-phospho-elF2 ⁇ ( P-elF2 ⁇ , panel at the top left), an anti-puromycin (puro, middle panel at the top) and an oligo dT-Alexa 555 (oligo dT, panel bottom left).
  • the panel at the top right represents the superposition of anti-puromycin and anti-phospho-elF2 ⁇ markings.
  • the bottom panel in the middle represents the superposition of the three markings.
  • the arrows indicate stress granules.
  • the scale bar corresponds to 10 ⁇ m.
  • the graph represents the fluorescence intensities measured with anti-puromycin (puro) and anti-phospho-elF2 ⁇ (P-elF2 ⁇ ) at the section shown in the
  • FIG. 7 represents the result of a surface FACS analysis on untreated cells (without puro) or treated for 1 h with 10 ⁇ g / ml of puromycin (1 hr puro), representing the fluorescence intensity of the labeling with 12D10 anti-puromycin antibody conjugated to Alexa 647 on the abscissa and the number of cells on the ordinate.
  • Figure 8 shows a graph showing the median fluorescence intensity of the labeling with 12D10 anti-puromycin antibody conjugated to Alexa 647 (puro-A647) measured by surface FACS on B3Z cells treated for 1 h at puromycin indicated on the abscissa.
  • the Western Blot represented above the graph corresponds to a labeling with the 12D10 anti-puromycin antibody carried out on the corresponding cells.
  • FIG. 9 shows a graph representing the median fluorescence intensity of the labeling with 12D10 anti-puromycin antibody conjugated to Alexa 647 (puro-A647) measured by surface FACS on B3Z cells pulsed with 10 ⁇ g / ml of puromycin for 30 min (black curve) or 10 min (gray curve) and chased for the times indicated on the abscissa (hunting).
  • Figure 10 shows histograms representing the median fluorescence intensity of labeling with 12D10 anti-puromycin antibody conjugated to Alexa 647 (puro-A647) measured by surface FACS on B3Z cells pulsed with 10 ⁇ g / ml of puromycin for 10 min and hunted during the times indicated on the abscissa (hunting).
  • Figure 11 shows histograms showing the median fluorescence intensity of labeling with Alexa 647 conjugated anti-puromycin 12D10 antibody (puro-A647) measured by surface FACS on pre-treated B3Z cells for 10 min with cycloheximide at the concentrations indicated on the abscissa (CHX) before being pulsed with 10 ⁇ g / ml of puromycin for 10 min and chased for 1 h.
  • FIG. 12 shows histograms representing the median fluorescence intensity of labeling with 12D10 anti-puromycin antibody conjugated to Alexa 647 (puro-A647) measured by surface FACS on B3Z cells pulsed with 10 ⁇ g / ml of puromycin for 10 min and chased for 1 h and then trypsinated for 0, 5 or 10 min before analysis.
  • FIG. 12 shows histograms representing the median fluorescence intensity of labeling with 12D10 anti-puromycin antibody conjugated to Alexa 647 (puro-A647) measured by surface FACS on B3Z cells pulsed with 10 ⁇ g / ml of puromycin for 10 min and chased for 1 h and then trypsinated for 0, 5 or 10 min before analysis.
  • 13 represents the result of a surface FACS analysis on untreated cells (without puro), pulsed for 10 min with 10 ⁇ g / ml of puromycin and then removed for 1 hour (10 ⁇ g / ml puro +1 h), or treated with 5 ⁇ g / ml brefeldin A before being labeled with puromycin (puro + 5 ⁇ g / ml BFA) representing the fluorescence intensity of the labeling with 12D10 anti-puromycin antibody conjugated to the Alexa 647 on the abscissa and the number of cells on the y-axis.
  • puromycin puro + 5 ⁇ g / ml BFA
  • Figure 14 represents the result of an anti-puromycin (WB: puro) blot performed on total lysates (left panel) or on immunoprecipitated biotinylated surface proteins (PD: surface biotin, right panel) of B3Z cells. untreated (without puro), treated with puromycin (puro) or treated with brefeldin A before being treated with puromycin (puro + BFA).
  • WB puro
  • PD surface biotin, right panel
  • Figure 15 shows the result of a SUnSET analysis of a heterogeneous cell population.
  • the panel on the left represents the FACS distribution of the cells according to the intensity of the CD45.1 labeling (ordinate) and the size (FCS, abscissa).
  • the cells in the upper left area correspond to the CD45.1 / CD8 ⁇ + splenocytes
  • the cells in the lower left area correspond to OT-1 CD45.2 / CD8 ⁇ + splenocytes
  • the cells located in the bottom right correspond to B3Z hybridoma T cells.
  • the panel on the right represents the FACS distribution for each of the cell categories identified in the left panel (first row: CD45.1 / CD8 ⁇ + splenocytes, second row: B3Z hybridoma T cells, third row: OT splenocytes).
  • CD45.2 / CD8 ⁇ + cells incubated with mature dendritic cells loaded with peptide SL8 but not treated with puromycin (first column), cells incubated with mature dendritic cells loaded with peptide SL8 and treated with puromycin (second column) or cells incubated with mature dendritic cells and treated with puromycin (third column) according to the intensity of anti-puromycin labeling (ordinate) and size (abscissa).
  • cold PBS comprising 0.1% bovine serum albumin
  • the cells were washed twice with 150 ⁇ l of PBS / BSA, fixed by resuspension in 40 ⁇ l of 2% paraformaldehyde solution (PFA) (diluted in PBS / BSA) and stored at 4 ° C. until analysis. by FACS.
  • PFA paraformaldehyde solution
  • Cells were labeled with antibodies specific for CD8 ⁇ cell surface markers (RM2201, Caltag), CD69 (H1.2F3, BD Pharmingen), CD45.2 (104, BD Pharmingen), CD45.1 (A20, eBioscience), CD11c (N418, eBioscience) or puromycin (12D10) for 30 min at 4 ° C. The cells were then washed and fixed in PBS 2% PFA. Events were counted on a FACSCalibur device and data acquired using CelIQuest software (BD Biosciences) and analyzed with FlowJo software.
  • RM2201 Caltag
  • CD69 H1.2F3, BD Pharmingen
  • CD45.2 104, BD Pharmingen
  • CD45.1 A20, eBioscience
  • CD11c N418, eBioscience
  • puromycin (12D10) puromycin
  • the inventors first determined how the incorporation of puromycin allowed to follow the translation with respect to the incorporation of methionine / radioactive cysteine.
  • B3Z T cell hybridomas (Shastri and Gonzalez (1993) J. Immunol. 150: 2724) were labeled for 1 hour with 10 ⁇ g / ml puromycin or for 10 min with 35 S methionine / cysteine (promix) ( Figure 1).
  • the incorporation of puromycin was detected effectively by Western blot using mouse monoclonal antibody 12D10 anti puromycin with a sensitivity comparable to that of the incorporation of 35 S promix revealed by autoradiography.
  • OT-1 cells were stimulated with activated professional antigen presenting cells (mature dendritic cells, mDC) loaded with the SL8 peptide.
  • mDC professional antigen presenting cells
  • TCR T cell receptor activated by MHC-peptide complexes induces several signal transduction pathways leading to activation and proliferation of T cells. This activation is probably accompanied by a coordinated increase in translation as suggested by previously obtained results in human T cells stimulated with anti-CD3 antibodies (Mao et al (1992) J Biol Chem 267: 20444).
  • the inventors investigated whether the versatility of the 12D10 monoclonal antibody could be used to quantify translation into an individual cell.
  • the intensity of translation could be directly visualized and quantified in each of the cells present in the optical field.
  • the cells treated with CHX showed a strongly reduced fluorescence intensity, which could be detected and directly compared with the control fibroblasts (FIGS. 3 and 4).
  • the inventors have therefore used the 12D10 antibody conjugated to Alexa 647 to put surface marking and FACS on B3Z cells labeled with puromycin. They clearly detected a significant shift in surface labeling intensity indicating that the neo-synthesized puromycin labeled proteins could reach the cell surface efficiently (Figure 7). They demonstrated that the surface detection of puromycin was directly proportional to the overall incorporation of the compound as detected by immunoblotting and that a concentration of 10 ⁇ g / ml of puromycin was optimal (FIG. 8). Concentrations above 50 ⁇ g / ml tending to have an inhibitory effect on translation have not been evaluated in more detail.
  • the inventors then sought to define the population diversity of puromycin labeled proteins reaching the surface.
  • the cells were puromycin labeled in the presence or absence of BFA and the incorporation of puromycin was visualized by immunoblotting ( Figure 14, left panel).
  • the labeled cells were also biotinylated on the surface and the biotinylated proteins were immunoprecipitated before Western Blot with the 12D10 antibody ( Figure 14, right panel).
  • BFA shows that only a limited fraction of biotinylated proteins was labeled with puromycin, whereas in control cells the immunoprecipitated proteins contained a varied and abundant set of newly synthesized proteins bearing puromycin, all of which clearly required transport. from the endoplasmic reticulum to the Golgi to reach the cell surface.
  • the SUnSET technique therefore makes it possible to follow non-invasively the translation in individual cells or in different cell populations exposed to varying physiological conditions.
  • the inventors evaluated the activation of translation in a set comprising 3 different types of CD8 ⁇ + T cells. They mixed primary CD45.2 + / CD8 ⁇ + OT-1 cells (SL8-specific T cells), CD45.1 + / CD8 ⁇ + T cells (variable specificity) from C57 / BL6 mice, and B3Z (specific hybridomas). of SL8). These three populations were incubated with dendritic cells loaded with SL8 and SunSET was implemented (Figure 15). The different T cell populations were identified on the basis of their positivity for CD45 and their size (FCS).
  • the SUnSET makes it possible to discriminate cells on the basis of their metabolic activity.
  • This example describes the use of puromycin-specific puromycin antibody incorporated in the protein fragments as compared to unincorporated free puromycin.
  • B3Z cells were treated with puromycin as shown in Example 1 above. They were then incubated with both antibody clones and analyzed by flow cytometry to detect the incorporation of puromycin. In parallel, the two antibody clones were incubated with free puromycin. Antibody binding to free puromycin was detected by dot blot and ELISA.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection de la synthèse protéique dans une cellule d'une population de cellules dans un milieu donné, ainsi qu'un kit destiné à mesurer le niveau de synthèse protéique dans des cellules.

Description

Nouvelle méthode de mesure non-radioactive de la synthèse protéique et marquage des protéines dans les cellules vivantes
La présente invention concerne un procédé de mesure non radioactif du niveau de synthèse protéique dans une cellule vivante.
La plupart des activités biologiques sont effectuées par les protéines, dont la synthèse est donc un élément clé des fonctions cellulaires. De plus, l'activité de traduction de l'ARN messager (ARNm) en protéines est directement liée à l'état physiopathologique des cellules et des tissus (Sonenberg et Hinnebusch (2007) Mol. CeII. 28:721 ). La synthèse protéique est contrôlée par de multiples récepteurs de surface et cascades de transduction du signal qui permettent de coordonner la prolifération et la survie cellulaire (Sabatini (2006) Nat. Rev. Cancer 6:729). Le contrôle de la traduction est donc devenu un axe important dans la recherche biologique et de nouvelles stratégies de suivi de la synthèse protéique ont été développées au cours des dernières années.
En particulier, les techniques d'incorporation d'acides aminés radioactifs sont à la base des connaissances actuelles sur la traduction (Borsook et al. (1949) Fed. Proc. 8:589; Borsook et al. (1949) J. Biol. Chem 179:689). Néanmoins, ces techniques présentent un certain nombre d'inconvénients importants, liés notamment aux problèmes de radioprotection. C'est pourquoi d'autres techniques qui pourraient se substituer à l'utilisation de radioéléments ont été recherchées. Il a ainsi été proposé de transformer les cellules avec des rapporteurs fluorescents ou de charger enzymatiquement des acides aminés non naturels sur l'ARNt (Noren et al. (1989) Science 244:182). Cependant, ces méthodes ne se sont jamais révélées aussi efficaces que les techniques de radiomarquage.
En conséquence, il existe toujours une demande importante de nouvelles méthodes de mesure du niveau de synthèse protéique qui ne font pas intervenir la radioactivité.
La puromycine est un antibiotique amnionucléosidique naturel produit par Streptomyces alboniger. Il s'agit d'un analogue structural des ARNt aminoacylés, qui est attaché à la chaîne peptidique en croissance pendant la traduction, empêchant ainsi la poursuite de l'élongation (Nathans (1964) Fed Proc. 23:984). La liaison ester normale de l'ARNt est remplacée dans la puromycine par une liaison amide, qui rend le composé plus résistant à l'hydrolyse, favorisant ainsi le décrochage du ribosome et une libération prématurée de la chaîne protéique en croissance (Nathans (1964) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51 :585). De manière intéressante, si la puromycine est utilisée dans de faibles quantités, son incorporation dans les protéines néo synthétisées reflète directement le taux de traduction de I1ARNm dans les cellules vivantes.
L'incorporation et la détection de puromycine ont été utilisées initialement pour suivre les cinétiques de repliement des chaînes peptidiques en croissance in vitro (Hansen et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:26610). Il a également été démontré que différents dérivés de la puromycine de la forme X-dC-puromycine étaient fonctionnels dans des expériences de traduction in vitro (Starck et Roberts (2002) RNA 8:890; Doi et al. (2002) Génome Res. 12:487; Kawahashi et al. (2003) Proteomics 3: 1236). Ainsi plusieurs essais de fabrication d'une version de puromycine conjugué à un fluorophore ont permis de marquer des protéines synthétisées in vitro (Nemoto et al. (1999) FEBS Lett. 462:43; Starck et al. (2004) Chem. Biol. 11 :999). Néanmoins, aucune de ces études n'a démontré que ces techniques pouvaient être appliquées in vivo et ainsi être utilisées pour suivre la synthèse protéique d'une cellule.
Ainsi, il a été proposé dans la demande de brevet américain US 2006/0057069 d'utiliser des conjugués de puromycine marquée pour détecter la synthèse protéique in vivo. Cependant, l'utilisation de tels composés de puromycine modifiée est généralement associée à des problèmes de perméabilité membranaire qui affectent l'efficacité de ces techniques dans le suivi de la synthèse protéique dans les cellules vivantes (Starck et al. (2004) Chem. Biol. 11 :999).
Description de l'invention
Les inventeurs ont maintenant démontré que des anticorps monoclonaux dirigés contre la puromycine pouvaient faciliter sa détection et permettaient de suivre directement l'incorporation de la puromycine dans les protéines nouvellement synthétisées sans aucune modification chimique de la puromycine. Ainsi, la puromycine non modifiée franchit efficacement la membrane cellulaire et des stratégies de puise-chasse, qui tirent partie de la clairance rapide de la puromycine libre résiduelle peuvent être mises en œuvre pour marquer des protéines nouvellement synthétisées.
La présente invention concerne donc un procédé de mesure du niveau ou de détection de la synthèse protéique dans une cellule comprenant les étapes consistant à : ai ) mettre en contact la cellule avec un antibiotique aminonucléosidique ou un dérivé de celui-ci, b1 ) détecter ou mesurer la quantité d'antibiotique aminonucléosidique ou de son dérivé incorporé dans des fragments protéiques de la cellule, dans lequel le niveau de l'antibiotique aminonucléosidique ou de son dérivé dans les fragments protéiques est indicatif du niveau ou de la présence de synthèse protéique dans la cellule. Par "synthèse protéique" ou "synthèse de protéines", on entend ici le processus par lequel une cellule assemble une chaîne protéique par liaison d'acides aminés, la séquence de la chaîne protéique étant fonction de la séquence d'ADN du gène codant ladite protéine. Comme il est bien connu de l'homme du métier, la synthèse protéique comprend au moins deux étapes : d'une part la transcription de l'ADN en ARNm et d'autre part la traduction de l'ARNm en protéine. De manière préférée, la détection de la synthèse protéique selon l'invention correspond plus particulièrement à la détection de l'étape de traduction. Par "fragment protéique", on entend ici une chaîne d'acides aminés issue de la traduction complète ou partielle d'un ARNm. Comme il est bien connu de l'homme du métier, la synthèse protéique détectée dans une cellule reflète le métabolisme de cette cellule. En particulier, la détection de synthèse protéique dans une cellule signifie que ladite cellule est vivante. Par conséquent, le procédé de détection de la synthèse protéique tel que défini ci-dessus permet de détecter la présence d'une cellule vivante dans un milieu donné.
Les cellules selon l'invention peuvent être des cellules procaryotes, en particulier des bactéries Gram positives ou Gram négatives, ou des cellules eucaryotes. Des exemples de cellules eucaryotes selon l'invention comprennent les champignons unicellulaires, les levures, les protozoaires, les cellules issues de métazoaires et de plantes. Les cellules selon l'invention peuvent être des cellules cultivées in vitro ou des cellules présentes dans un tissu, un organe ou un organisme. Par "milieu", on entend ici un support, de préférence un fluide, dans lequel des cellules peuvent vivre. Le milieu selon l'invention peut être un milieu biologique tel que par exemple le sang, l'urine, la lymphe, un milieu de culture synthétique ou naturel permettant la survie d'organismes vivants. Des exemples de milieu comprennent également l'eau de ville, l'eau minérale ou de source, les eaux usées.
Par "antibiotique aminonucléosidique", on entend ici un antibiotique affectant la synthèse protéique et qui agit en entrant en compétition avec les aminoacyl-ARNt lors de leur liaison au site A de la grande sous-unité ribosomique. Des exemples d'antibiotiques aminonucléosidiques appropriés comprennent la puromycine et ses analogues synthétiques, tels que le 6-DMAP, la puromycine N6- bis-déméthylée, et la puromycine Nord methanocarba. De manière préférée, l'antibiotique aminonucléosidique utilisé selon l'invention est la puromycine.
Par "dérivé d'antibiotique aminonucléosidique", on entend un antibiotique aminonucléosidique tel que défini ci-dessus modifié par voie chimique ou enzymatique, comprenant éventuellement des groupements marqueurs, mais qui conserve les propriétés de l'antibiotique aminonucléosidique naturel sur la synthèse protéique. De manière préférée, le dérivé d'antibiotique aminonucléosidique utilisé selon l'invention n'est pas un antibiotique aminonucléosidique conjugué à un fluorophore. Comme il est bien connu de l'homme du métier, on entend ici par "mettre en contact la cellule avec un antibiotique aminonucléosidique", le fait d'incuber la cellule dans un milieu approprié avec un antibiotique aminonucléosidique tel que défini ci-dessus à une concentration suffisante et pendant une période suffisante pour que l'anticorps aminonucléosidique puisse être incorporé dans les fragments protéiques en cours de synthèse dans la cellule. De manière préférée, l'antibiotique aminonucléosidique est utilisé à une concentration comprise entre environ 0,1 μg/ml et environ 50 μg/ml, mieux encore à une concentration comprise entre environ 0,5 μg/ml et environ 25 μg/ml, mieux encore à une concentration comprise entre environ 1 μg/ml et environ 15 μg/ml, de manière préférée entre toutes à une concentration d'environ 10 μg/ml. De manière préférée, la cellule est mise en contact avec l'antibiotique aminonucléosidique pendant une période adaptée permettant l'obtention d'un signal dont le niveau est significativement plus élevé que celui du bruit de fond. De manière particulièrement préférée, la cellule est mise en contact avec l'antibiotique aminonucléosidique pendant une période comprise entre 15 secondes et 3 h, mieux encore pendant une période comprise entre 1 min et 1 h, mieux encore pendant une période comprise entre 5 min et 30 min, de manière préférée entre toutes pendant une période d'environ 10 min. Dans un mode de réalisation préféré, l'étape b1 ) de détection du niveau de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, du procédé défini ci-dessus est réalisée à l'aide d'un composé ayant une affinité spécifique pour l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé. Des composés appropriés ayant une affinité spécifique pour l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé incluent en particulier les anticorps et les aptamères. Les "aptamères" sont des séquences d'oligonucléotides ou peptidiques ayant la capacité de reconnaître virtuellement n'importe quelle classe de molécules cibles avec une haute affinité et spécificité. Les modes d'obtention, modifications, applications et avantages de ces molécules sont décrits par exemple dans Jayasena (1999) Clin. Chem. 45:1628-1650. Préférablement, le composé ayant une affinité spécifique pour l'antibiotique aminonucléosidique, ou son dérivé, utilisé selon l'invention est un anticorps.
Comme on l'entend ici le terme "anticorps" se réfère à des molécules d'immunoglobuline et des portions immunologiquement actives des molécules d'immunoglobuline, c'est-à-dire des molécules qui contiennent un site de liaison de l'antigène qui se lie spécifiquement à un antigène. Le terme "anticorps" ne comprend donc pas seulement les molécules d'anticorps entières mais aussi les fragments d'anticorps ainsi que les variants (y compris les dérivés) d'anticorps et de fragments d'anticorps. Un anticorps selon l'invention peut être un anticorps de mammifère, en particulier un anticorps de souris, de rat, de lapin ou de camélidé. Un anticorps selon l'invention peut être un anticorps polyclonal ou monoclonal. Les "fragments d'anticorps" comprennent une portion d'un anticorps intact, de préférence la région variable ou de liaison à l'antigène de l'anticorps intact. Des exemples de fragment d'anticorps approprié comprennent les fragments Fv, Fab, Fab', (Fab')2, Fd, dAb, scFV, dsFV, Sc(Fv)2, et les diabodies. De manière préférée, l'anticorps selon l'invention est un anticorps monoclonal. L'anticorps selon l'invention peut être un anticorps modifié. En particulier, l'anticorps selon l'invention peut être conjugué à un groupement marqueur. Le groupement marqueur peut être par exemple une substance marqueur non radioactive telle qu'un fluorophore, une enzyme telle que la phosphatase alcaline, la peroxidase de raifort ou la luciferase, une coenzyme telle que la biotine, des protéines, des peptides, des sucres, des lipides, des colorants, du polyethylène glycol, et analogues. De manière préférée, l'anticorps utilisé dans la présente invention est un anticorps conjugué à un fluorophore.
Le terme "spécifique", quand il se réfère à une reconnaissance ou une liaison d'un ligand à une cible, signifie que le ligand interagit avec la cible sans interaction substantielle avec une autre cible ne présentant pas de ressemblance structurale avec la cible. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, est spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, incorporé dans les fragments protéiques par rapport à l'antibiotique aminonucléosidique, ou son dérivé, libre non incorporé dans les fragments protéiques. Des techniques permettant d'identifier un anticorps spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique, spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique incorporé dans les fragments protéiques par rapport à l'antibiotique aminonucléosidique libre non incorporé dans les fragments protéiques, sont connues de l'homme du métier. Typiquement, l'anticorps est d'une part mis en contact avec des cellules traitées avec l'antibiotique aminonucléosidique, et d'autre part mis en contact avec l'antibiotique aminonucléosidique libre. La liaison de l'anticorps avec l'antibiotique aminonucléosidique incorporé dans les fragments protéiques dans les cellules traitées d'une part, et avec l'antibiotique aminonucléosidique libre d'autre part, est ensuite détectée soit directement, soit indirectement à l'aide d'un anticorps secondaire. Un anticorps pour lequel une liaison est détectée avec l'antibiotique aminonucléosidique incorporé dans les fragments protéiques dans les cellules traitées, mais pas avec l'antibiotique aminonucléosidique libre, correspond à un anticorps spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique incorporé dans les fragments protéiques par rapport à l'antibiotique aminonucléosidique libre non incorporé dans les fragments protéiques.
L'étape de détection b1 ) du procédé défini ci-dessus peut être mise en œuvre par toute technique appropriée d'immunodétection permettant de révéler la liaison d'un anticorps. Ces techniques de détection sont bien connues de l'homme du métier incluant les techniques d'immunofluorescence, de chimioluminescence, colorimétriques, de radiomarquage, d'immunochimie, d'immunopurification et d'immunoprécipitation.
L'étape de détection b1 ) du procédé défini ci-dessus peut être en particulier mise en œuvre sur des cellules vivantes, des lysats cellulaires ou un milieu conditionné par les cellules étudiées (par exemple, un surnageant de culture).
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé défini ci-dessus comprend en outre une étape a2) de lyse des cellules après l'étape ai ) de mise en contact et avant l'étape de détection b1 ). Cette étape a2) de lyse des cellules comprend typiquement la mise en contact des cellules étudiées avec du tampon de lyse (50 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCI, 1 % Triton X-100, inhibiteurs de protéases) pendant 10 min sur glace. Les cellules peuvent également être reprises directement en tampon Laemmli (65 mM Tris-HCI pH 6,8, 3% SDS, 10% glycérol, 100 mM DTT, 0,004% bleu de bromophénol). De manière préférée, l'étape de détection b1 ) du procédé défini ci-dessus est alors mise en œuvre par immunoempreinte. Les procédés d'immunoempreinte ou Western Blot sont bien connus de l'homme du métier et comprennent typiquement les étapes consistant à faire migrer les extraits cellulaires sur un gel de polyacrylamide dénaturant, transférer les protéines ainsi séparées sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF, saturer la membrane avec une solution de TBS 0,1 % Tween 20 contenant du lait en poudre écrémé, incuber la membrane avec un anticorps primaire puis avec un anticorps secondaire, révéler la membrane avec un système de révélation approprié dépendant du type d'anticorps secondaire utilisé, tel que la chimioluminescence ou la colorimétrie. Selon un autre mode de réalisation préféré, l'étape de détection b1 ) du procédé défini ci-dessus est effectuée sur une cellule vivante. De manière préférée, l'étape de détection b1 ) du procédé défini ci-dessus est alors mise en œuvre par cytométrie de flux ou par microscopie, en particulier par microscopie confocale à fluorescence. De manière encore préférée, l'étape de détection b1 ) du procédé défini ci-dessus consiste à détecter, par cytométrie en flux, l'antibiotique aminonucléosidique ou le dérivé d'antibiotique aminonucléosidique à la surface des cellules. Les inventeurs ont en effet ici démontré de manière surprenante que la détection à la surface des cellules de l'anticorps aminonucléosidique, en particulier de la puromycine, incorporé dans les protéines membranaires, était d irectement proportionnelle à l'incorporation globale de l'anticorps aminonucléosidique. Cette technique est appelée ici technique SUnSET. Typiquement, la technique SUnSET est mise en œuvre de la manière suivante. L'antibiotique aminonucléosidique ou le dérivé d'antibiotique aminonucléosidique est mis en contact à une concentration appropriée, de préférence à une concentration de 10 μg/ml, pendant une période appropriée, de préférence environ 10 min, avec les cellules ou tissus vivants. Après un lavage et une période de chasse appropriée, de préférence de 50 min, les cellules traitées sont incubées avec un anticorps spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique ou du dérivé d'antibiotique aminonucléosidique, marqué directement ou non avec un fluorophore idoine. La détection de cet anticorps est ensuite effectuée sur les cellules, vivantes ou fixées, par cytométrie en flux selon des protocoles standards bien connus de l'homme du métier. De manière préférée entre toutes, le procédé selon l'invention défini ci- dessus n'est pas radioactif.
La présente invention concerne également un procédé de criblage de nouveaux composés pharmacologiques susceptibles d'affecter le métabolisme ou de tuer des cellules comprenant les étapes consistant à: a) mettre en contact les cellules avec le composé pharmacologique à tester, b) mettre en contact les cellules, préalablement traitées ou non avec le composé pharmacologique à tester, avec un antibiotique aminonucléosidique, ou un dérivé de celui-ci, tel que défini ci-dessus, c) détecter le niveau de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, dans des fragments protéiques dans les cellules traitées ou non avec le composé pharmacologique à tester, à l'aide d'un anticorps spécifiquement dirigé contre l'antibiotique aminonucléosidique, ou son dérivé, d) comparer le niveau de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, dans les cellules traitées avec le composé pharmacologique à tester et les cellules non traitées; dans lequel un niveau plus élevé de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, dans les fragments protéiques dans les cellules non traitées avec le composé pharmacologique à tester par rapport aux cellules traitées avec le composé pharmacologique à tester, indique que le composé pharmacologique à tester est susceptible d'affecter le métabolisme ou de tuer des cellules.
La présente invention concerne également un kit destiné à mesurer le niveau ou à détecter la présence de synthèse protéique dans des cellules, le kit comprenant : - un antibiotique aminonucléosidique ou un dérivé de celui-ci tel que défini ci-dessus,
- un anticorps spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, tel que défini ci-dessus, et
- un système d'électrophorèse. Par "système d'électrophorèse", on entend ici tout système permettant de séparer et caractériser des protéines et/ou des acides nucléiques en fonction de leur taille et/ou de leur point isoélectrique. Les systèmes d'électrophorèse appropriés sont bien connus de l'homme du métier et comprennent notamment les électrophorèses de focalisation isoélectrique (électrophorèse dans un gradient de pH), les électrophorèses sur gel de polyacrylamide, les électrophorèses en gel d'agarose, les électrophorèses bi-dimensionnelles, les électrophorèses en champ puisé, les électrophorèses en conditions dénaturantes. De manière préférée, un système d'électrophorèse approprié comprend un gel de polyacrylamide SDS- PAGE ou Tris-Tricine, éventuellement accompagné d'une cuve d'électrophorèse, un tampon de migration, un générateur.
La présente invention concerne également un kit destiné à mesurer ou détecter par FACS le niveau ou la présence de synthèse protéique dans des cellules, le kit comprenant : - un antibiotique aminonucléosidique ou un dérivé de celui-ci tel que défini ci-dessus, et
- un anticorps spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, tel que défini ci-dessus, l'anticorps étant de préférence un anticorps conjugué à un groupement marqueur tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également l'utilisation, de préférence in vitro, d'un composé ayant une affinité spécifique pour un antibiotique aminonucléosidique, ou d'un dérivé de celui-ci, tel que défini ci-dessus pour détecter la présence de fragments protéiques marqués par l'antibiotique aminonucléosidique, ou son dérivé, tels que définis ci-dessus, à la surface d'une cellule ayant été mise en contact avec l'antibiotique aminonucléosidique, ou son dérivé, tel que défini ci-dessus.
La présente invention décrit ainsi un anticorps spécifique d'un antibiotique aminonucléosidique ou d'un dérivé de celui-ci pour son utilisation dans la détection de la présence de fragments protéiques marqués par l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé à la surface d'une cellule ayant été mise en contact avec l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé.
Par "fragments protéiques à la surface d'une cellule", on entend ici les fragments protéiques ou protéines de la cellule tels que définis ci-dessus qui sont enchâssés dans la membrane plasmique de la cellule ou liés à la membrane plasmique de la cellule. Comme il est bien connu de l'homme du métier, ces fragments protéiques et protéines sont produits dans la cellule et sont ensuite transportés au niveau de la membrane plasmique de la cellule par le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi.
Différents aspects de la présente invention ressortiront encore plus nettement au vu des exemples illustratifs ci-après.
Description des figures
La Figure 1 représente le résultat d'un blot anti-puromycine (puro, panel de gauche) et d'une autoradiographie (35S, panel de droite) réalisés sur des cellules B3Z non traitées (sans puro/35S), traitées pendant 1 h avec 10 μg/ml de puromycine (puro), traitées pendant 10 min avec 25 μM de cycloheximide puis traitées pendant 1 h avec 10 μg/ml de puromycine (puro + CHX), traitées pendant 10 min avec du promix 35S (35S) ou traitées pendant 10 min avec 25 μM de cycloheximide puis traitées pendant 10 min avec du promix 35S (35S + CHX). Une détection anti-actine mettant en évidence l'égalité des quantités chargées dans les puits est également présentée (actine).
La Figure 2 représente le résultat d'un blot anti-puromycine (puro, panel de gauche) et d'une autoradiographie (35S, panel de droite) réalisés sur des splénocytes primaires OT-1 CD8α+ stimulés ou non avec des cellules dendritiques matures chargées avec le peptide SIINFEKL (SEQ ID NO:1 ) (mDC-SL8) et incubées pendant 1 h avec de la puromycine (puro) ou avec du promix 35S (35S). Une détection anti-actine mettant en évidence l'égalité des quantités chargées dans les puits est également présentée (actine). Le graphique au-dessus du blot représente l'intensité de marquage déterminée pour chacun des puits.
La Figure 3 représente des images prises en microscopie confocale à fluorescence de cellules NIH3T3 traitées pendant 10 min avec 10 μg/ml de puromycine et marquées avec un anti-puromycine (puro, panel de gauche) et un anti-phospho-elF2α (P-elF2α, panel du millieu). Le panel de droite représente la superposition des deux marquages. La barre d'échelle correspond à 10 μm. Le graphique représente les intensités de fluorescence mesurées avec l'anti- puromycine (puro) et l'anti-phospho-elF2α (P-elF2α) au niveau de la section représentée sur l'image de droite.
La Figure 4 représente des images prises en microscopie confocale à fluorescence de cellules NIH3T3 traitées pendant 5 min avec 25 μM de cycloheximide (CHX) puis pendant 10 min avec 10 μg/ml de puromycine et marquées avec un anti-puromycine (puro, panel de gauche) et un anti-phospho- elF2α (P-elF2α, panel du millieu). Le panel de droite représente la superposition des deux marquages. La barre d'échelle correspond à 10 μm. Le graphique représente les intensités de fluorescence mesurées avec l'anti-puromycine (puro) et l'anti-phospho-elF2α (P-elF2α) au niveau de la section représentée sur l'image de droite.
La Figure 5 représente des images prises en microscopie confocale à fluorescence de cellules NIH3T3 traitées pendant 10 min avec 10 μg/ml de puromycine et marquées avec un anti-phospho-elF2α (P-elF2α, panel en haut à gauche), un anti-puromycine (puro, panel du milieu en haut) et un oligo dT-Alexa 555 (oligo dT, panel en bas à gauche). Le panel en haut à droite représente la superposition des marquages anti-puromycine et anti-phospho-elF2α. Le panel en bas au milieu représente la superposition des trois marquages. La barre d'échelle correspond à 10 μm. Le graphique représente les intensités de fluorescence mesurées avec l'anti-puromycine (puro) et l'anti-phospho-elF2α (P-elF2α) au niveau de la section représentée sur l'image en haut à droite.
La Figure 6 représente des images prises en microscopie confocale à fluorescence de cellules NIH3T3 traitées pendant 30 min avec 500 μM d'arsénite (AS) puis traitées pendant 10 min avec 10 μg/ml de puromycine et marquées avec un anti-phospho-elF2α (P-elF2α, panel en haut à gauche), un anti-puromycine (puro, panel du milieu en haut) et un oligo dT-Alexa 555 (oligo dT, panel en bas à gauche). Le panel en haut à droite représente la superposition des marquages anti-puromycine et anti-phospho-elF2α. Le panel en bas au milieu représente la superposition des trois marquages. Les flèches indiquent des granules de stress. La barre d'échelle correspond à 10 μm. Le graphique représente les intensités de fluorescence mesurées avec l'anti-puromycine (puro) et l'anti-phospho-elF2α (P- elF2α) au niveau de la section représentée sur l'image en haut à droite.
La Figure 7 représente le résultat d'une analyse en FACS de surface sur des cellules non traitées (sans puro) ou traitées pendant 1 h avec 10 μg/ml de puromycine (1 h puro), représentant l'intensité de fluorescence du marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine conjugué à l'Alexa 647 en abscisse et le nombre de cellules en ordonnée. La Figure 8 montre un graphique représentant l'intensité de fluorescence médiane du marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine conjugué à l'Alexa 647 (puro-A647) mesurée par FACS de surface sur des cellules B3Z traitées pendant 1 h aux concentrations de puromycine indiquées en abscisse. Le Western Blot représenté au dessus du graphique correspond à un marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine réalisé sur les cellules correspondantes.
La Figure 9 montre un graphique représentant l'intensité de fluorescence médiane du marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine conjugué à l'Alexa 647 (puro-A647) mesurée par FACS de surface sur des cellules B3Z puisées avec 10 μg/ml de puromycine pendant 30 min (courbe noire) ou 10 min (courbe grise) et chassées pendant les temps indiqués en abscisse (chasse).
La Figure 10 montre des histogrammes représentant l'intensité de fluorescence médiane du marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine conjugué à l'Alexa 647 (puro-A647) mesurée par FACS de surface sur des cellules B3Z puisées avec 10 μg/ml de puromycine pendant 10 min et chassées pendant les temps indiqués en abscisse (chasse).
La Figure 11 montre des histogrammes représentant l'intensité de fluorescence médiane du marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine conjugué à l'Alexa 647 (puro-A647) mesurée par FACS de surface sur des cellules B3Z pré-traitées pendant 10 min avec de la cycloheximide aux concentrations indiquées en abscisse (CHX) avant d'être puisées avec 10 μg/ml de puromycine pendant 10 min et chassées pendant 1 h.
La Figure 12 montre des histogrammes représentant l'intensité de fluorescence médiane du marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine conjugué à l'Alexa 647 (puro-A647) mesurée par FACS de surface sur des cellules B3Z puisées avec 10 μg/ml de puromycine pendant 10 min et chassées pendant 1 h puis trypsinées pendant 0, 5 ou 10 min avant l'analyse. La Figure 13 représente le résultat d'une analyse en FACS de surface sur des cellules non traitées (sans puro), puisées pendant 10 min avec 10 μg/ml de puromycine puis chassées pendant 1 h (10' 10 μg/ml puro +1 h), ou traitées avec 5 μg/ml de brefeldine A avant d'être marquées à la puromycine (puro + 5 μg/ml BFA) représentant l'intensité de fluorescence du marquage avec l'anticorps 12D10 anti- puromycine conjugué à l'Alexa 647 en abscisse et le nombre de cellules en ordonnée.
La Figure 14 représente le résultat d'un blot anti-puromycine (WB:puro) réalisé sur des lysats totaux (panel de gauche) ou sur des protéines de surface biotinylées immunoprécipitées (PD:biotine de surface, panel de droite) de cellules B3Z non traitées (sans puro), traitées à la puromycine (puro) ou traitées à la brefeldine A avant d'être traitées à la puromycine (puro +BFA).
La Figure 15 représente le résultat d'une analyse par SUnSET d'une population de cellules hétérogène. Le panel de gauche représente la répartition par FACS des cellules selon l'intensité du marquage CD45.1 (ordonnée) et la taille (FCS, abscisse). Les cellules comprises dans la zone en haut à gauche correspondent aux splénocytes CD45.1/CD8α+, les cellules situées dans la zone en bas à gauche correspondent aux splénocytes OT-1 CD45.2/CD8α+ et les cellules situées dans la zone en bas à droite correspondent aux lymphocytes T d'hybridome B3Z. Le panel de droite représente la répartition par FACS, pour chacune des catégories de cellules identifiées dans le panel de gauche (première rangée : splénocytes CD45.1 /CD8α+, deuxième rangée : lymphocytes T d'hybridome B3Z, troisième rangée : splénocytes OT-1 CD45.2/CD8α+), de cellules incubées avec des cellules dendritiques matures chargées avec le peptide SL8 mais non traitées à la puromycine (première colonne), de cellules incubées avec des cellules dendritiques matures chargées avec le peptide SL8 et traitées à la puromycine (deuxième colonne) ou de cellules incubées avec des cellules dendritiques matures et traitées à la puromycine (troisième colonne) selon l'intensité du marquage anti-puromycine (ordonnée) et la taille (abscisse). Exemple 1
Matériels et méthodes SUnSET
Les expériences ont été réalisées dans des plaques 96 puits à fond rond (Greiner Bio-One) avec un nombre maximal de cellules de 200 000 cellules / 150 μl de milieu RPMI complet (RC) comprenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF, HyClone Perbio) et 100 unités/mL de pénicilline/streptomycine (Gibco). Toutes les centrifugations ont été faites pendant 3 min à 340 g. 15 μl d'une solution de puromycine à 10 μg/ml (Sigma, min. 98% TLC, testé en culture cellulaire, P8833, dilué en PBS) ont été ajoutés et les cellules ont été incubées pendant 10 min à 37°C et 5% CO2 (=pulse). Les cellules ont été centrifugées à température ambiante, lavées deux fois avec 150 μl de milieu RC préchauffé et incubées pendant 1 h à 37°C et 5% CO2 (=chasse). Les cellules ont été récupérées par centrifugation à 4°C et lavées deux fois dans du PBS froid comprenant 0,1 % de sérum albumine bovine (PBS/BSA). Les cellules ont été resuspendues dans 30 μl de PBS/BSA froid comprenant 1 μg d'anticorps monoclonal anti-puromycine 12D10 lgG2a de souris marqué avec l'Alexa 647 et incubées 30 min sur glace. Les cellules ont été lavées deux fois avec 150 μl de PBS/BSA, fixées par resuspension dans 40 μl de solution de paraformaldéhyde (PFA) à 2% (diluée en PBS/BSA) et conservées à 4°C jusqu'à l'analyse par FACS.
Immunoempreinte et marquage radioactif 50 μg de matériel soluble en Triton X-100 ou 200 000 cellules, lysées directement en tampon Laemmli, ont été chargés en SDS-PAGE (gel d'électrophorèse à gradient de 2 à 12% d'acrylamide ou sans gradient à 10% d'acrylamide) avant immunoempreinte et détection par chimioluminescence (Pierce, USA). L'anticorps monoclonal de souris anti-actine (clone AC-15) a été obtenu chez Sigma et l'anticorps polyclonal de lapin anti-phospho-S6 (Ser235/236) a été obtenu chez CeII Signaling Technologies. 2x107 cellules ont été marquées par puise avec 10 mCi/ml de [35S]-methionine Pro-mix (APB, UK) pendant 10 min à 37°C en milieu RPMI contenant 10% SVF avant séparation par
SDS-PAGE et quantification avec un phosphoimager FUJI.
Analyse par cytométrie en flux Les cellules ont été marquées avec des anticorps spécifiques des marqueurs de la surface cellulaire CD8α (RM2201 , Caltag), CD69 (H1.2F3, BD Pharmingen), CD45.2 (104, BD Pharmingen), CD45.1 (A20, eBioscience), CD11 c (N418, eBioscience) ou la puromycine (12D10) pendant 30 min à 4°C. Les cellules ont ensuite été lavées et fixées en PBS 2% PFA. Les événements ont été comptés sur un appareil FACSCalibur et les données acquises en utilisant le logiciel CelIQuest (BD Biosciences) et analysées avec le logiciel FlowJo.
Activation des cellules T
5 μg/ml de peptide SL8 (SIINFEKL (SEQ ID NO:1 ); Schafer-N, Danemark) ont été ajoutés aux cellules dendritiques pendant 4 h. Après récupération, les cellules dendritiques ont été fixées en PBS 0,25% PFA pendant 5 min à température ambiante. Après lavage, le PFA a été désactivé avec 10 mM de glycine pendant 5 min à température ambiante. 20 000 cellules dendritiques ont été mélangées avec 200 000 cellules T et incubées en milieu de cellules T complet à 37°C et 5% CO2.
Immunofluorescence
Les cellules incubées avec la puromycine ont été fixées en PBS 3% PFA avant perméabilisation à la saponine (0,05%) ou au Triton X-100 (0,5%). Un double marquage a été effectué avec l'anticorps monoclonal de souris anti- puromycine 12D10 et un anticorps secondaire anti-anticorps de souris fluorescent.
L'observation finale est faite sur un microscope confocal ZEISS LSM 510.
Résultats 1 -Suivi de la traduction par incorporation de puromycine
Les inventeurs ont d'abord déterminé la manière dont l'incorporation de puromycine permettait de suivre la traduction par rapport à l'incorporation de méthionine/cystéine radioactive. Des hybridomes de cellules T B3Z (Shastri et Gonzalez (1993) J. Immunol. 150:2724) ont été marqués pendant 1 h avec 10 μg/ml de puromycine ou pendant 10 min avec de la méthionine/cystéine 35S (promix) (Figure 1). L'incorporation de puromycine a été détectée de manière efficace par Western Blot en utilisant l'anticorps monoclonal de souris anti- puromycine 12D10 avec une sensibilité comparable à celle de l'incorporation du promix 35S révélée par autoradiographie. Un pré-traitement avec la cycloheximide (CHX), un inhibiteur de la traduction, a complètement bloqué l'incorporation, ind iquant que la puromycine marque excl usivement les protéines néo- synthétisées. De manière intéressante, la détection de puromycine a seulement nécessité 20 à 30 s d'exposition du film, tandis que la détection du 35S a nécessité au moins 12 h d'exposition. Comme attendu, les protéines marquées avec la puromycine présentaient un poids moléculaire relativement plus faible que celles marquées au 35S du fait de l'arrêt de l'élongation induite par la puromycine.
La traduction a également été suivie dans des cellules T primaires OT-1 CD8α+ spécifiques du MHC I Kb lié au peptide SIINEFKL (SEQ ID NO:1 ) (SL8), un peptide de l'ovalbumine majeur. Les cellules OT-1 ont été stimulées par des cellules présentatrices de l'antigène professionnelles activées (cellules dendritiques matures, mDC) chargées avec le peptide SL8. Le récepteur des cellules T (TCR) activé par les complexes MHC-peptide induit plusieurs voies de transduction du signal menant à l'activation et la prolifération des cellules T. Cette activation est probablement accompagnée d'une augmentation coordonnée de la traduction comme suggéré par les résultats précédemment obtenus dans des cellules T humaines stimulées avec des anticorps anti-CD3 (Mao et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20444). Les inventeurs ont observé une intensité de la traduction des protéines relativement modeste dans les cellules OT-1 non-stimulées que ce soit en utilisant le marquage à la puromycine ou le promix 35S (Figure 2). Cependant, les deux techniques ont révélé une augmentation de la traduction dans les cellules T stimulées par les cellules dendritiques matures chargées avec le peptide (mDC-SL8). Dans les deux conditions expérimentales, les mêmes profils protéiques ont pu être détectés avec une sensibilité égale, démontrant que l'incorporation de puromycine et la détection par immunoempreinte étaient une bonne alternative au marquage métabolique au 35S. 2-Suivi de la traduction dans des cellules individuelles
Les inventeurs ont ensuite recherché si la versatilité de l'anticorps monoclonal 12D10 pouvait être utilisée pour quantifier la traduction dans une cellule individuelle. Des cellules NIH3T3, traitées ou non avec différents réactifs pharmacologiques influençant la traduction de I1ARNm, ont été incubées pendant une période courte avec de la puromycine avant visualisation en microscopie confocale à immunofluorescence (Figures 3 à 6). L'intensité de traduction a pu être directement visualisée et quantifiée dans chacune des cellules présentes dans le champ optique. Comme attendu, les cellules traitées avec CHX ont présenté une intensité de fluorescence fortement réduite, qui a pu être relevée et directement comparée aux fibroblastes contrôles (Figures 3 et 4). En plus du CHX, les cellules ont été exposées à de l'arsénite de sodium (AS), qui arrête la traduction par phosphorylation de elF2α et induit la formation de granules de stress (SG) (Anderson et Kedersha (2002) J. CeII. Sci. 115:3227) (Figures 5 et 6). Dans ce cas, la phosphorylation de elF2α et la formation de SG (marquage oligo- dT) ont été utilisées comme indicateurs pour évaluer l'efficacité du traitement des cellules, qui présentaient toutes une intensité d'incorporation de puromycine particulièrement faible (Figure 6). Ainsi, l'anticorps 12D10 et l'incorporation de puromycine peuvent être utilisés pour visualiser et quantifier l'intensité de traduction par microscopie dans des cellules individuelles exposées à différents traitements et conditions de croissance.
3-Détection de la puromycine à la surface de la cellule
Le repliement des protéines dans le réticulum endoplasmique a lieu de manière concomitante avec la synthèse des polypeptides par le ribosome (Fedorov et Baldwin (1997) J. Biol. Chem. 272:32715). Les inventeurs ont recherché si les protéines marquées avec la puromycine pouvaient être détectées à la surface de la cellule. La puromycine à faible concentration peut en effet être insérée dans les protéines membranaires de type II presque complètement traduites et repliées et la taille relativement petite du composé ne devrait pas interférer avec la translocation de la protéine (Hurtley et Helenius (1989) Annual Review of CeII Biology 5:277; Skach (2007) J. CeII. Biol. 179:1333). Les inventeurs ont donc utilisé l'anticorps 12D10 conjugué à l'Alexa 647 pour mettre en oeuvre un marquage à la surface et un FACS sur des cellules B3Z marquées à la puromycine. Ils ont clairement détecté un déplacement important de l'intensité de marquage de surface indiquant que les protéines marquées à la puromycine néo synthétisées pouvaient atteindre la surface de la cellule de manière efficace (Figure 7). Ils ont démontré que la détection de surface de la puromycine était directement proportionnelle à l'incorporation globale du composé telle que détectée par immunoempreinte et qu'une concentration de 1 0 μg/ml de puromycine était optimale (Figure 8). Les concentrations supérieures à 50 μg/ml tendant à avoir un effet inhibiteur sur la traduction n'ont pas été évaluées plus en détail.
Afin de minimiser le risque d'interférence de la puromycine avec les fonctions cellulaires, les inventeurs ont cherché à diminuer le temps d'exposition des cellules à la drogue et ont réduit les effets indésirables en réalisant un puise de marquage court suivi par une chasse. Ils ont démontré qu'un temps de puise de 10 min suivi d'une chasse de 50 min était optimal pour permettre aux protéines marquées à la puromycine d'atteindre la surface de la cellule (Figure 9). Ils ont ensuite évalué la stabilité de ces protéines, qui ont continué à être détectées à leurs niveaux maximaux jusqu'à 3 h après le puise (Figure 10). Après cette période, une perte de marquage, reflétant probablement le turnover endocytique, a été observée.
Pour démontrer que la détection de la puromycine à la surface ne reflétait pas simplement une liaison non spécifique, les cellules ont été pré-traitées avec différentes concentrations de CHX avant l'incorporation de puromycine (Figure 11). Aucun marquage au-dessus du bruit de fond n'a pu être détecté aux hautes concentrations de CHX, ce qui indique qu'une traduction active est nécessaire pour observer l'apparition de puromycine à la surface de la cellule. L'intensité de marquage était directement proportionnelle à la concentration de CHX, indiquant que le SUnSET reflète avec précision les variations d'activité traductionnelle ayant lieu dans les cellules. La trypsination des cellules marquées à la puromycine a également abattu efficacement la détection de surface démontrant encore que la puromycine de surface est liée aux protéines néo-synthétisées (Figure 12).
Le traitement des cellules avec le métabolite fongique brefeldine A (BFA), un bloqueur puissant du transport du réticulum endoplasmique vers le Golgi, a inhibé l'apparition à la surface des protéines marquées à la puromycine indiquant que ces molécules étaient exportées via la voie de sécrétion habituelle (Figure 13).
Les inventeurs ont ensuite cherché à définir la diversité de la population de protéines marquées à la puromycine atteignant la surface. Les cellules ont été soumises à un marquage à la puromycine en présence ou absence de BFA et l'incorporation de puromycine a été visualisée par immunoempreinte (Figure 14, panel de gauche). Les cellules marquées ont également été biotinylées à la surface et les protéines biotinylées ont été immunoprécipitées avant Western Blot avec l'anticorps 12D10 (Figure 14, panel de droite). En présence de BFA, seule une fraction limitée de protéines biotinylées était marquée avec la puromycine, tandis que dans les cellules contrôle, les protéines immunoprécipitées contenaient un ensemble varié et abondant de protéines nouvellement synthétisées portant de la puromycine, qui avaient clairement toutes besoin du transport du réticulum endoplasmique vers le Golgi pour atteindre la surface cellulaire.
La technique SUnSET permet donc de suivre de manière non-invasive la traduction dans des cellules individuelles ou dans différentes populations cellulaires exposées à des conditions physiologiques variables.
4-Utilisation du SUnSET avec des populations hétérogènes de cellules vivantes
Pour démontrer le potentiel de la technique SunSET pour suivre la traduction dans des populations cellulaires hétérogènes, les inventeurs ont évalué l'activation de la traduction dans un ensemble comprenant 3 types différents de cellules T CD8α+. Ils ont mélangé des cellules OT-1 CD45.2+/CD8α+ primaires (cellules T spécifiques de SL8), des cellules T CD45.1 +/CD8α+ (spécificité variable) provenant de souris C57/BL6 et des hybridomes B3Z (spécifiques de SL8). Ces trois populations ont été incubées avec des cellules dendritiques chargées avec SL8 et le SunSET a été mis en œuvre (Figure 15). Les différentes populations de cellules T ont été identifiées sur la base de leur positivité pour CD45 et leur taille (FCS). Après l'absorption de puromycine, les splénocytes T primaires présentaient une activité traductionnelle limitée par rapport aux hybridomes B3Z plus grands, qui avaient une plus forte activité traductionnelle basale sans doute due à leur état transformé. Après stimulation avec les cellules dendritiques chargées avec SL8, aucun changement dans l'intensité de traduction n'a pu être observé dans les cellules CD45.1 et dans les B3Z. En revanche, les cellules OT-1 CD45.2+ ont réagi à la présence de cellules dendritiques chargées avec SL8 et les inventeurs ont observé une augmentation considérable du marquage de surface de la puromycine dans ces cellules par rapport à la population exposée aux cellules dendritiques sans peptide.
Ainsi, le SUnSET permet de discriminer des cellules sur la base de leur activité métabolique.
Exemple 2
Cet exemple décrit l'utilisation d'un anticorps anti-puromycine spécifique de la puromycine incorporée dans les fragments protéiques par rapport à la puromycine libre non incorporée.
Deux clones d'anticorps monoclonaux de rat anti-puromycine ont été utilisés. Des cellules B3Z ont été traitées à la puromycine comme indiqué dans l'exemple 1 ci-dessus. Elles ont ensuite été incubées avec les deux clones d'anticorps, puis analysées par cytométrie en flux, afin de détecter l'incorporation de puromycine. En parallèle, les deux clones d'anticorps ont été incubés avec de la puromycine libre. La liaison des anticorps à la puromycine libre a été détectée par dot blot et ELISA.
L'analyse par cytométrie en flux a montré que les deux clones d'anticorps permettaient de détecter efficacement l'incorporation de puromycine dans les fragments protéiques dans les cellules traitées. En revanche, les inventeurs ont montré que lorsque ces anticorps étaient incubés avec de la puromycine libre, ils n'étaient pas capables de s'y lier. En effet, les tests ELISA réalisés sur des plaques ELISA recouvertes de puromycine ont montré une absorbance moyenne de 0,068 et 0,070 à 405 nm, indiquant que les anticorps anti-puromycine ne s'étaient pas liés à la puromycine libre. De même, en dot blot avec la puromycine libre, aucune bande n'a été observée pour ces deux clones d'anticorps. En revanche, les inventeurs ont montré que certains autres clones monoclonaux d'anticorps anti-puromycine de rat et des anticorps anti-puromycine de souris permettaient de détecter à la fois la puromycine incorporée dans les fragments protéiques dans les cellules traitées, et la puromycine libre, suggérant ainsi que cette spécificité envers la puromycine incorporée dans les fragments protéiques n'est pas inhérente à tous les anticorps anti-puromycine.

Claims

REVENDICATIONS
1.- Procédé de mesure du niveau ou de détection de la synthèse protéique dans une cellule comprenant les étapes consistant à : ai ) mettre en contact la cellule avec un antibiotique aminonucléosidique ou un dérivé de celui-ci, b1 ) détecter la présence ou mesurer la quantité d'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, incorporé dans des fragments protéiques de la cellule, dans lequel le niveau de l'antibiotique aminonucléosidique ou de son dérivé dans les fragments protéiques est indicatif du niveau ou de la présence de synthèse protéique dans la cellule.
2. -Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l'étape b1 ) de détection du niveau de l'antibiotique aminonucléosidique ou de son dérivé est réalisée à l'aide d'un anticorps spécifiquement dirigé contre l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé.
3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'antibiotique aminonucléosidique est la puromycine.
4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 3, dans lequel l'anticorps est spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, incorporé dans les fragments protéiques par rapport à l'antibiotique aminonucléosidique libre ou son dérivé.
5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'étape de détection b1 ) est effectuée sur une cellule vivante.
6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant en outre une étape a2) de lyse des cellules après l'étape de mise en contact ai ) et avant l'étape de détection b1 ).
7.- Procédé selon la revendication 6, dans lequel l'étape de détection b1 ) est mise en œuvre par immunoempreinte.
8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel l'anticorps est fluorescent.
9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 8, dans lequel l'étape de détection b1 ) est mise en œuvre par cytométrie de flux.
10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 8, dans lequel l'étape de détection b1 ) est mise en œuvre par microscopie à fluorescence.
11.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 8 à 9, dans lequel l'étape de détection b1 ) consiste à détecter l'antibiotique aminonucléosidique à la surface des cellules.
12.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , le procédé étant non radioactif.
13.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel le dérivé d'antibiotique aminonucléosidique n'est pas un antibiotique aminonucléosidique conjugué à un fluorophore.
14.- Kit destiné à mesurer le niveau ou à détecter la présence de synthèse protéique dans des cellules, le kit comprenant :
- un antibiotique aminonucléosidique ou un dérivé de celui-ci,
- un anticorps spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique ou de son dérivé, et
- un système d'électrophorèse.
15.- Kit selon la revendication 14, dans lequel l'antibiotique aminonucléosidique est la puromycine.
16.- Utilisation d'un anticorps spécifique d'un antibiotique aminonucléosidique ou d'un dérivé de celui-ci pour détecter la présence de fragments protéiques marqués par l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé à la surface d'une cellule ayant été mise en contact avec l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé.
17.- Utilisation selon la revendication 16, dans laquelle l'antibiotique aminonucléosidique est la puromycine.
18.- Anticorps spécifique d'un antibiotique aminonucléosidique ou d'un dérivé de celui-ci pour son utilisation dans la détection de la présence de fragments protéiques marqués par l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé à la surface d'une cellule ayant été mise en contact avec l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé.
19.- Anticorps selon la revendication 18, dans lequel l'antibiotique aminonucléosidique est la puromycine.
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