WO2010026277A1 - Modelo animal para el estudio de la angiogénesis y linfoangiogénesis in vivo - Google Patents

Modelo animal para el estudio de la angiogénesis y linfoangiogénesis in vivo Download PDF

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Sagrario Ortega Jimenez
Ines Martinez Corral
Daniel Olmeda Casadome
Rodrigo Dieguez Hurtado
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Fundación Centro Nacional De Investigaciones Oncológicas Carlos Iii
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Definitions

  • the present invention is within the field of molecular biology and biotechnology, and refers to a genetically modified non-human mammal whose cells integrate the IRES-EGFP-Luciferase construct in the 3 ' UTR region of the Flt4 gene, and which is capable to report the expression of the Flt4 gene with a pattern identical to that of the VEGFR-3 receptor expression.
  • Said non-human mammal is useful in the study and evaluation of the progression of diseases that occur with lymphoangiogenesis, angiogenesis and / or inflammation, as well as for the trial of drugs aimed at modulating these processes, and therefore, for the development of therapies. antiangiogenic, antitumor and antimetastatic.
  • the Flt4 gene codes for the VEGFR-3 receptor, a membrane receptor with tyrosine kinase activity that belongs to the family of vascular endothelial growth factor receptors (VEGF A-D).
  • VEGF A-D vascular endothelial growth factor receptors
  • This family of receptors (VEGFR 1-3) has a relatively specific expression pattern of endothelial cells of blood and lymphatic vessels and they are very important regulators of the angiogenesis and neovascularization processes, since they participate in the control of proliferation, migration and differentiation of endothelial cells.
  • VEGFR-3 receptor begins to express itself in the mouse during embryonic development approximately on day 8 of gestation in the primary blood vessels, but its expression is restricted to the lymphatic vessels at the time they develop. In fact, on day 12 of embryonic development the expression of VEGFR-3 is already detected mainly in the lymphatic vessels (our own results). In the adult animal, it has been described that under physiological conditions VEGFR-3 is expressed mostly in endothelial cells of the lymphatic vessels, and is considered a good marker of this cell type since unlike VEGFR-1 and -2 receptors, VEGFR-3 is not expressed in the endothelium of adult blood vessels, under physiological conditions.
  • VEGFR-3 Although specific for lymphatic endothelial cells, the expression of VEGFR-3 in adults is low in baseline conditions. The mouse shows a dramatic drop in expression levels between young animals (1-5 weeks) and adult animals (more than 6 weeks).
  • VEGF receptors In general, there is a correlation both spatially and temporally between the expression of VEGF receptors and angiogenesis processes. Thus, in adults the expression of these receptors is increased associated with tissue scarring, inflammation, tumor growth and metastasis formation, all of them, processes that depend on the formation and growth of new vessels from existing ones.
  • Tie1 receptors Two transgenic lines have been developed by different laboratories in which the EGFP (enhanced green fluorescent protein) gene is expressed under the control of the promoter or promoter / enhancer of the Tie1 receptors (lljin et al., 2002. Faseb J, 16 , 1764-1774) and Tie2 (Motoike et al., 2000; Genesis, 28, 75-81) respectively.
  • Tiely Tie2 are expressed during embryonic development in the mouse, in angioblasts and in endothelial cells. In the adult organism, the endogenous expression of these receptors in the endothelium is maintained at lower levels, and is induced in neovascularization sites such as the ovary during the formation of the corpus luteum and in healing processes.
  • reporter genes under the control of regulatory sequences of these genes in the corresponding genetically modified models, such as the Tie1-EGFP line is not induced in the endothelium during tumor neovascularization. This induction has been observed, however, by replacing part of the sequence of the endogenous Tie1 gene with the lacZ gene, as was done for the generation of the Tie1 knockout (Puri et al., 1995).
  • the inventors have constructed an animal model, a genetically modified mouse by means of gene-targeting (knock-in) in which a tracer or reporter protein will be expressed under the control of the VEGF-3 receptor expression signals.
  • the expression of this report can be monitored in vivo by non-invasive techniques, which implies that angiogenesis associated with different processes, both physiological and pathological in real time, could be measured and quantified directly in the mouse.
  • a first aspect of the invention refers to a genetically modified non-human mammal, hereinafter mammal of the invention, whose cells express the construction IRES-EGFP-Luciferase in the 3 ' UTR region of the Flt4 gene with a pattern identical to the expression of the VEGFR-3 receptor, both in space and time.
  • the expression of the IRES-EGFP-Luciferase construct comprises the introduction of a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 1 in the animal or one of its ancestors.
  • the sequence SEQ ID NO: 1 comprises the IRES sequences of the encephalomyocarditis virus, the sequence of the EGFP and the luciferase.
  • the IRES sequences are nucleotide sequences that allow the initiation of protein synthesis in the middle of the translation of the open reading frame of a messenger RNA (mRNA or mRNA). Unlike the best known mechanism of protein translation in eukaryotic organisms that requires a previous modification at the 5 'end of the messenger mRNA for the assembly of the translation machinery, the IRES sequences are recognized by the 43S pre-initiation complex, so that they can start the translation of the messenger RNA despite lacking Cap modification at its 5 'end. These sequences have been found in members of the viral families picornavirus, retrovirus and herpesvirus.
  • IRES sequences have recently been found in mRNA of eukaryotic organisms, especially in proteins involved in the regulation of the cell cycle, as well as apoptotic mechanisms.
  • IRES sequences are used, but not limited to, the IRES sequence of the encephalomyocarditis virus.
  • the EGFP according to its acronym in English (enhanced green fluorescent protein) is a mutation of a protein (GFP) produced by the jellyfish Aequorea sp. (To victory, A. aequorea, A. forskalea) that emits bioluminescence in the green zone of the visible spectrum.
  • This mutation increases fluorescence, photostability and has excitation and emission peaks compatible with fluorescein isothiocyanate filters (FITC), so that the gene encoding this protein is isolated and is commonly used in molecular biology as marker.
  • luciferase refers to a generic term that groups a group of enzymes capable of producing bioluminescence in nature. The best known is Ia firefly luciferase, from Photinus pyralis. In the luminescence reactions, light is produced by the oxidation of luciferin (a pigment), and the reaction requires ATP (adenosine triphosphate).
  • luciferase and luciferin do not refer to specific molecules, but rather generic terms for a substrate and its associated enzyme.
  • the gene "Flt4", "FMS-like tyrosine kinase 4", "VEGFR3", “VEGFR-3”, “Chy” and / or “AI323512” is defined as a sequence of nucleotides or polynucleotide, which constitutes the coding sequence of the Flt4 polypeptide, and which would comprise various variants from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, b) nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the sequence amino acid with an identity of at least one
  • the genetic modification of the Flt4 gene that is carried out in the invention leads to the expression of a bicistronic messenger, which is expressed using the endogenous regulation signals of the Flt4 gene.
  • the translation of this messenger simultaneously results in the synthesis of two proteins: the intact VEGFR-3 receptor and the EGFP-luciferase fusion protein. Therefore, after the genetic modification, the EGFPIuc reporter is expressed by recapitulating exactly the same endogenous expression pattern of the Flt4 gene, with identical control both spatially and temporally.
  • EGFP-luciferase fusion as a reporter molecule, allows the expression of VEGFR3 to be monitored by means of optical imaging techniques both by fluorescence emitted by the EGFP and by luminescence emitted by the luciferase in the presence of its specific sutrate, the luciferin.
  • the photonic emission that is emitted when the luciferase reacts with the suitable luciferin can be detected by a light sensitive apparatus which is called a luminometer, or by modified optical microscopes, or allowing the observation of biological processes, even in vivo, in the whole animal previously anesthetized.
  • non-human mammal refers to a non-human mammalian animal of any genetic background, preferably laboratory animals such as rodents, more preferably rats and mice, or non-human primates.
  • Said non-human animal can have practically any known genetic background, that is, it can be a wild-type or wt animal or it can be combined with other genetic alterations in the same mouse, for example, a transgenic animal , mutant or deficient (knock-out or KO), with spontaneous or experimentally induced mutations, likewise in any genetic background.
  • transgenic applied to a non-human mammal, as used in the present invention, refers to mammals that contain a transgene and includes, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, conventional transgenic animals , or obtained by homologous recombination: KOs, KIs, conditional models etc.) in any genetic background.
  • the authors of the present invention have introduced the Flt4 knock-in modified allele, Flt4-IRES-EGFPLuc, into an immunosuppressed mouse (nu / nu).
  • This genetic background provides the advantage of allowing xenograft assays with tumor lines of different origins, both murine and human, and quantifying angiogenesis / lymphangiogenesis in relation to the size of tumors by combining different imaging techniques in vivo.
  • the angiogenesis associated with the establishment of metastases in this model could be quantified.
  • the non-human mammal is an immunosuppressed mouse (nu / nu).
  • the reporter molecule (the EGFP-luciferase fusion) is expressed under the control of the endogenous expression signals of the Flt4 gene and therefore has an expression pattern identical to that of the receptor both in space and time. This does not happen in conventional transgenic models.
  • the insertion of the reporter cassette is done in the 3 ' untranslated region of the gene (3 ' UTR, from the English unstranlated region or untranslated trailer), outside the coding sequence, so that the coding sequence of the Flt4 gene is not found altered
  • the marker does recapitulate the pattern of endogenous expression of the corresponding gene but simultaneously in these models a copy of the gene is inactivated which in many cases can lead to associated phenotype that can manifest even in heterozygosis with the second copy of the gene intact (haploinsufficiency).
  • a “cassette” or “cassette” is a coding region of a gene from a prokaryotic or eukaryotic organism flanked by the regulatory elements necessary for its expression in vivo or in vitro.
  • the expression cassettes can have very varied configurations, they must contain at least one promoter (promoter), a coding region (eukaryotic cDNA or prokaryotic gene) and a transcription terminator (terminator) or a polyadenylation site, as appropriate of a gene derived from a prokaryotic organism or from a cDNA from a eukaryotic organism.
  • a sequence with regulatory function for the natural expression of the gene in the chosen system eg: an operator, an enhancer, the Shine and Dalgarno sequence for binding to the rRNA of E. coli, or the sequences of a signal peptide (if the protein is exported).
  • the mammal of the invention has the nucleotide IRES-EGFP-Luciferase 149 construction introduced below the TGA stop codon within the 3 ' UTR region of the Flt4 gene.
  • the reporter gene when introduced into the 3 ' UTR region of the Flt4 gene, between the stop codon and the polyadenylation sequence, does not affect the normal expression of this gene, so that the animal model can be used in both heterozygosis and in homozygosis.
  • This provides the advantage of being able to control the baseline fluorescence / luminescence signal according to the requirements of the assay, without this having any consequence on the phenotype of the model to be studied.
  • the mammal of the invention is a mouse (Mus musculus).
  • the IRES-EGFP-Luciferase gene construct is included within a vector, such as, for example, an expression vector or a transfer vector.
  • a vector such as, for example, an expression vector or a transfer vector.
  • vector refers to systems used in the process of transferring an exogenous gene or an exogenous gene construct into a cell, thus allowing stable vehicle transport of genes and exogenous gene constructs.
  • vectors may be non-viral vectors or viral vectors.
  • a gene targeting vector from now on vector of the invention, which comprises the construction containing the cDNA that encodes the EGFP-luciferase fusion protein, preceded by a sequence of internal ribosome entry (IRES), the genomic sequences of the Flt4 locus that flank the integration point of the IRES-EGFP-luciferase construction in the 3 ' UTR region of the Flt4 gene, and a positive selection cassette comprising a phosphoglycerate promoter kinase (PGK in Fig. 1), a neomycin resistance gene (NEO in Fig. 1) and a polyA signal of the SV40 virus, flanked by frt sequences.
  • PGK in Fig. 1 phosphoglycerate promoter kinase
  • NEO neomycin resistance gene
  • the vector of the invention is also accompanied by a negative selection cassette comprising the promoter of the mouse phosphoglycerate kinase gene, the coding sequence of the herpes simplex virus thymidine kinase gene (TK in Ia Fig. 1), and a polyA signal of the SV40 virus.
  • a negative selection cassette comprising the promoter of the mouse phosphoglycerate kinase gene, the coding sequence of the herpes simplex virus thymidine kinase gene (TK in Ia Fig. 1), and a polyA signal of the SV40 virus.
  • Another aspect of the invention relates to a method for obtaining the mammal of the invention, hereinafter method of the invention, which comprises: a) constructing a vector of the invention as described above, b) transfecting said construction in a population of embryonic stem cells, and selecting embryonic stem cells that have stably integrated the vector of the invention into their genome by homologous recombination.
  • step c) incorporate the clones of embryonic stem cells recombined from step b) into host embryos, so that the recombined cells contribute to all cell lineages of the embryo, d) allow the development of the embryo to obtain a chimeric non-human mammal with the allele which expresses the IRES-EGFP-Luciferase construction in the 3 ' UTR region of the Flt4 gene. e) crossing the non-human chimeric mammal of step d) to produce heterozygous mammals for the expression of the construction
  • IRES-EGFP-Luciferase in the 3 ' UTR region of the Flt4 gene f) cross heterozygous individuals according to section e) with transgenic animals that express the recombinase FIp ubiquitously in all cells including the germ line (Tg-pCAG FIp ) to eliminate the pGK-neo cassette flanked by the Frt sites, and optionally, g) cross the heterozygous individuals according to section f) to each other to produce a homozygous genetically modified non-human mammal for the expression of the IRES-EGFP-Luciferase construction in the 3 ' UTR region of the Flt4 gene.
  • the embryonic stem cells are F1 hybrid background V6.4 (C57BL / 6 x 129).
  • transfect refers to any technique or procedure that allows the integration into a series of cells of a living organism of an exogenous gene, or "transgene”, and that confers on said cells and to the organism that carries them a new biological property.
  • the method of transfection is electroporation.
  • Said transgene or exogenous gene refers to a DNA normally not resident, nor present in the cell that is intended transform.
  • the DNA encodes for the EGFP and for a luciferase.
  • the process of transgenesis to obtain the model animal of the invention can be applied both to fully developed animals and to embryos thereof, provided that it allows the integration of the IRES-EGFP-Luciferase construction in the 3 ' UTR region of the gene Flt4.
  • the transgenesis process is applied to embryos.
  • Another aspect of the invention relates to a cell, from now on a cell of the invention, isolated from the mammal of the invention or that has integrated the vector of the invention by homologous recombination.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the cell line derived from the cell or cells of the invention.
  • the mammal of the invention is useful in the non-invasive monitoring of angiogenesis in tumors and other pathologies and its application to the development of antiangiogenic therapies. It also has a universal utility for the study of any process associated with the functioning and development of the endothelium, such as inflammatory processes, vascular pathologies and particularly, tumor growth, extravasation of tumor cells and establishment of metastases.
  • the use of the model as a lymphangiogenesis / angiogenesis / inflammation report also implies its use for the trial of drugs aimed at modulating these processes and therefore for the development of antiangiogenic, antitumor and antimetastatic therapies.
  • another aspect of the invention relates to a method of detecting agents potentially useful in the treatment or prevention of inflammatory processes comprising: a) inducing an inflammatory and / or angiogenic process in the mammal of The invention, b) recombinantly expressing the agent, or administering the agent to the mammal of the invention of a), b) comparing the level of emission of and / or luminescence in the mammal of the invention of a) with: i. the level of emission of fluorescence and / or luminescence in the same mammal of the invention before the administration of the compound, ii.
  • the induction of the inflammatory and / or angiogenic process in the mammal of the invention can be carried out by various means, including, but not limited to, inflicting a wound, administering an angiogenic agent, inducing a tumor process, xenografts in a model nude (nu / nu).
  • agent is understood as any chemical compound of natural or synthetic origin, with a genetic therapeutic activity or a pharmacological therapeutic activity.
  • the concepts of gene therapy as well as pharmacological therapy are well known to an expert in the field.
  • the mammal of the invention is a mouse.
  • the introduction of the IRES-EGFP-Luciferase cassette is carried out 149 nucleotides below the TGA stop codon within the 3 ' UTR region of the Flt4 gene.
  • the mammal of the invention is homozygous for the introduction of the IRES-EGFP-Luciferase cassette in the 3 ' UTR region of the Flt4 gene.
  • Another aspect of the invention relates to a method of detecting agents potentially useful in the treatment or prevention of tumor processes comprising: a) inducing a tumor process in the mammal of the invention, b) recombinantly expressing the agent, or administering the agent to the mammal of the invention, b) comparing the level of fluorescence and / or luminescence emission in the mammal of the invention of a) with: i. the level of emission of fluorescence and / or luminescence in the same mammal of the invention before the administration of the compound, ii. the level of emission of fluorescence and / or luminescence in another mammal of the invention, to which the compound has not been administered; or iii.
  • the mammal of the invention is a mouse.
  • the introduction of the IRES-EGFP-Luciferase cassette is carried out 149 nucleotides below the TGA stop codon within the 3 ' UTR region of the Flt4 gene.
  • the mammal of the invention is homozygous for the introduction of the IRES-EGFP-Luciferase cassette in the 3 ' UTR region of the Flt4 gene.
  • Another aspect of the invention relates to a method of detection and isolation of endothelial cells of lymphatic vessels at different stages of the development of a non-human mammal, comprising: a) disintegrating the tissues of said non-human mammal, b) detecting and isolate cells expressing EGFP by flow cytometry.
  • Fig. 1 Generation of the VEGFR3-IRESEGFPIuc Kl model: gene targeting strategy.
  • Fig. 2 Analysis of the expression of VEGFR3 and EGFP in the reporter model.
  • VEGFR3 VEGFR3 in embryos of 13.5 days of development by Western Blot. 100 ⁇ g of protein extract was analyzed for each of the genotypes indicated in 10% SDS-PAGE. In the figure the immunoblots for VEGFR3 and EGFP are shown. The ⁇ -Tubulin immunoblot is included as a load control. It is observed that the expression levels of VEGFR3 remain constant in the different genotypes.
  • VEGFR3-EGFPIuc Analysis of the expression of VEGFR3-EGFPIuc in KI / KI embryos at different stages of development by confocal microscopy.
  • a specific expression of EGFP is observed in the lymphatic vessels of the embryos (green) while no expression is detected in the vessels blood, which are recognized by the erythrocyte autofluorescence (red).
  • Fig. 3 Monitoring of the expression of VEGR3 during postnatal development in the reporter model.
  • Luciferase activity in vivo in females VEGFR3-IRESEGFPIuc (n 8) at the ages of 2, 3, 4, 5, 8, 10 and 15 weeks was monitored in an IVIS Spectrum.
  • Luciferase activity is expressed in photons per second per cm 2 to correct for the difference in size of animals at different ages. The data is shown as mean + SD.
  • Fig. 4 Analysis of the expression of VEGFR3 in the reporter model in skin healing trials.
  • a maximum luciferase emission is shown on day 8 of the test around the ends of the wound, which correlates with a healing of 30%. Luciferase expression is not detected after day 23 when the wound is completely healed.
  • Dexamethasone treatment induces a significant decrease in luciferase emission on days 8-10 of healing, however, the signal is the same in animals treated from day 15, when the wound is healed approximately 40%.
  • Dexamethasone treatment causes a decrease in recruitment of macrophages to the area of healing altering the kinetics of the process. Taking this into account, and that macrophages express VEGFR3, the emission peak observed around day 10 in untreated animals may reflect the process of macrophage recruitment to the area of the wound. The decrease in macrophage recruitment can also explain the delay in the healing process as shown in Fig. B2.
  • FIG. 5 VEGFR3 expression associated with the inflammation induced by the contact hypersensitivity test (CHS).
  • This strategy allows to generate a bicistronic messenger that gives rise to the simultaneous expression of two genes with the same transcriptional regulation and therefore, in this case, to direct the expression of the EGFPIuc fusion specifically to the endothelial cells in which the flt4 gene is transcribed. without altering the endogenous expression thereof.
  • a "universal" targeting vector was designed first that allows this same strategy to be applied to any gene in the murine genome.
  • the structure of this vector is the one represented in the figure below and is prepared to clone the homology arms of the gene of interest in the single positions Notl and SaII.
  • Notl and SaII are unique sites in the vector that recognize these restriction enzymes and where homology arms of any gene can be inserted.
  • PGK-neo and PGK-hsvTK are the positive and negative selection markers respectively.
  • This vector contains a marker that expresses a bacterial neomycin resistance gene under the control of the promoter of the gene encoding the mouse phosphoglycerate kinase (PGK-neo).
  • the PGK-neo cassette allows the selection of clones in which the vector has been integrated, either randomly or by homologous recombination. This marker is flanked by frt sites for subsequent elimination mediated by FIp recombinase.
  • the vector includes a marker for negative selection that is lost if the vector is integrated by homologous recombination but not if it is randomly integrated.
  • hsvTK herpes virus thymidine kinase gene
  • the vector also contains unique restriction sites for SaII and Notl enzymes that are rare in the mouse genome, and that can be used to clone the 5 ' and 3 ' homology arms respectively.
  • the reporter gene that has been used is an EGFP-luciferase fusion protein.
  • the EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • the fusion between the green fluorescent protein and the luciferase has the advantage that it allows the monitoring of its expression both by fluorescence and bioluminescence uptake.
  • the homology arms used for the construction have been obtained from C57BL / 6 genomic DNA, and have been amplified by PCR from a BAC (RP23-445K3) that contains this gene.
  • the size of each of the arms is 3.3Kb and 3.7Kb on 3 ' and 5 ' respectively.
  • the primers used for the amplification of the 5 ' homology arm are: Flt45F SEQ ID NO: 3 Flt45R SEQ ID NO: 4 and for the 3 ' arm are: Flt43F SEQ ID NO: 5 Flt43R SEQ ID NO: 6.
  • the amplification was done using the TAQ LA polymerase TAQ LA from Takara by 2 pre-PCR cycles (98 0 C 1Os, 54 0 C 1 m, 68 0 C 5m) and 30 PCR cycles (98 0 C 1Os and 68 0 C 5m).
  • the vector was amplified and after linearizing it by digestion with Notl, it was electroporporated into embryonic stem cells (ES) V6.4 of hybrid genetic background F1 [C57BL / 6 129SvJ]. Typically 17 million cells are electroporated with 20 micrograms of linearized DNA in 0.8 ml of PBS, at 250 volts and 500 microFaradios, in a 0.4 cm wide cuvette. The evaluation of the homologous recombination frequency and the selection of homologous recombinant clones was performed by Southern Blot analysis. For this, genomic DNA was extracted from 60 clones.
  • the DNA was digested with Seal and analyzed by Southern blot using a 262 bp fragment that hybridizes in an area outside the 5 ' homology arm. Recombination in the 3 ' arm was similarly analyzed, digesting genomic DNA with Seal and using a 324pb fragment as a probe for Southern Blot. Of the 60 clones analyzed, 18 were positive for both homology arms.
  • ESIM4.31 and ESIM4.52 were incorporated into developing embryos by means of the aggregation technique.
  • morulas were extracted from mice of the strain CD1, at day 2.5 of gestation. These embryos, once the zona pellucida was removed by digestion with Tyrode solution, were added with clusters of about 6-8 cells per embryo. Aggregated embryos (approximately 70) were incubated place overnight in KSOM at 37 0 C, 5% CO2 and the following day were transferred to pseudopregnant female oviduct of the strain CD1 to day 0.5 of pseudopregnancy. The delivery took place at 19 days after the transfer of the embryos.
  • the GAPDH probe corresponds to a 400 bp fragment of the coding sequence of the rat GAPDH gene.
  • FIG. 2 Monitoring of the expression of EGFP in embryos (FIG. 2)
  • Embryos on different days of pregnancy were removed from the uterus in PBS and observed in a Leica TCS-SP ⁇ confocal microscope (AOBS) equipped with LAS AF acquisition software.
  • AOBS Leica TCS-SP ⁇ confocal microscope
  • a 488nm argon laser was used.
  • Luciferase activity in extracts of different organs and tissues was measured using a commercial Promega kit (E-1501) following the manufacturer's recommendations.
  • the diameter of the wound is measured, in vertical (V) and horizontal (H) orientation with a caliber.
  • V vertical
  • H horizontal
  • healing is represented at each point as the percentage size of the wound with respect to the size of the wound at day 0.

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Abstract

La presente invención se encuentra dentro del campo de Ia biología molecular y Ia biotecnología, y se refiere a un mamífero no humano modificado genéticamente cuyas células integran Ia construcción IRES- EGFP-Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4, y que es capaz de reportar Ia expresión del gen Flt4 con un patrón idéntico al de Ia expresión del receptor VEGFR-3. Dicho mamífero no humano es útil en el estudio y evaluación de Ia progresión de las enfermedades que cursan con linfoangiogénesis, angiogénesis y/o inflamación, así como para el ensayo de fármacos dirigidos a modular estos procesos, y por tanto, para el desarrollo de terapias antiangiogénicas, antitumorales y antimetastásicas.

Description

MODELO ANIMAL PARA EL ESTUDIO DE LA ANGIOGENESIS Y LINFOANGIOGÉNESIS IN VIVO.
La presente invención se encuentra dentro del campo de Ia biología molecular y Ia biotecnología, y se refiere a un mamífero no humano modificado genéticamente cuyas células integran Ia construcción IRES- EGFP-Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4, y que es capaz de reportar Ia expresión del gen Flt4 con un patrón idéntico al de Ia expresión del receptor VEGFR-3. Dicho mamífero no humano es útil en el estudio y evaluación de Ia progresión de las enfermedades que cursan con linfoangiogénesis, angiogénesis y/o inflamación, así como para el ensayo de fármacos dirigidos a modular estos procesos, y por tanto, para el desarrollo de terapias antiangiogénicas, antitumorales y antimetastásicas.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El gen Flt4 codifica para el receptor VEGFR-3, un receptor de membrana con actividad tirosina-quinasa que pertenece a Ia familia de receptores de factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF A-D). Esta familia de receptores (VEGFR 1-3) tiene un patrón de expresión relativamente específico de células endoteliales de vasos sanguíneos y linfáticos y son reguladores muy importantes de los procesos de angiogénesis y neovascularización, ya que participan en el control de Ia proliferación, migración y diferenciación de las células endoteliales.
El receptor VEGFR-3 comienza a expresarse en el ratón durante el desarrollo embrionario aproximadamente en el día 8 de gestación en los vasos sanguíneos primordiales, pero su expresión se restringe a los vasos linfáticos en el momento en que estos se desarrollan. De hecho, a día 12 del desarrollo embrionario Ia expresión de VEGFR-3 ya se detecta fundamentalmente en los vasos linfáticos (nuestros propios resultados). En el animal adulto, se ha descrito que en condiciones fisiológicas VEGFR-3 se expresa mayoritariamente en células endoteliales de los vasos linfáticos, y se considera un buen marcador de este tipo celular ya que al contrario que los receptores VEGFR-1 y -2, VEGFR-3 no se encuentra expresado en el endotelio de los vasos sanguíneos adultos, en condiciones fisiológicas.
Aunque específico de células endoteliales linfáticas, Ia expresión de VEGFR-3 en adulto es baja en condiciones básales. En el ratón se observa una caída dramática de los niveles de expresión entre animales jóvenes (1-5 semanas) y animales adultos (más de 6 semanas).
En general, existe una correlación tanto a nivel espacial como temporal entre Ia expresión de receptores de VEGF y procesos de angiogénesis. Así, en adultos Ia expresión de estos receptores se encuentra incrementada asociada a cicatrización tisular, inflamación, crecimiento tumoral y formación de metástasis, todos ellos, procesos que dependen de Ia formación y crecimiento de nuevos vasos a partir de los ya existentes.
Actualmente existe un modelo desarrollado por Xenogen Corporation basado en las señales de expresión del receptor VEGFR-2 (Flk1/KDR) (Zhang et al., 2004. Blood, 103, 617-626. US 6,867,348). Se trata de un ratón genéticamente modificado en el cual dos fragmentos del gen FIkI del ratón conteniendo las secuencias del promotor y enhancer respectivamente se han clonado en un plásmido que contiene Ia secuencia que codifica Ia enzima luciferasa. Esta construcción ha sido introducida en el genoma del ratón al azar mediante microinyección en pronúcleos de embriones de una célula. Además se han desarrollado otros modelos repórter basados en las señales de expresión de otros genes cuya expresión es específica de células endoteliales. Dos líneas transgénicas han sido desarrolladas por diferentes laboratorios en las que el gen de Ia EGFP (enhanced green fluorescent protein) se expresa bajo el control del promotor o promotor/enhancer de los receptores Tie1 (lljin et al., 2002. Faseb J, 16, 1764-1774) y Tie2 (Motoike et al., 2000; Génesis, 28, 75-81 ) respectivamente. Tiely Tie2 se expresan durante el desarrollo embrionario en el ratón, en angioblastos y en células endoteliales. En el organismo adulto Ia expresión endógena de estos receptores en el endotelio se mantiene a niveles más bajos, y se induce en sitios de neovascularización como el ovario durante Ia formación del cuerpo lúteo y en procesos de cicatrización. Sin embargo, Ia expresión de genes repórter bajo el control de secuencias reguladoras de estos genes en los correspondientes modelos genéticamente modificados, como Ia línea Tie1- EGFP no se induce en el endotelio durante Ia neovascularización tumoral. Esta inducción sí se ha observado, sin embargo, al reemplazar parte de Ia secuencia del gen Tie1 endógena por el gen lacZ, tal y como se hizo para Ia generación del knockout de Tie1 (Puri et al., 1995). La discrepancia entre el comportamiento de Ia línea knockout/knockin y Ia línea transgénica de Tie1 en cuanto a Ia activación de Ia expresión de Tie1 durante Ia angiogénesis tumoral refleja Ia limitación de las líneas transgénicas convencionales para reproducir fielmente Ia regulación de Ia expresión de los genes endógenos. Lo mismo se observa en una línea transgénica que expresa lacZ bajo el control del promotor de VEGFR-3, en Ia que no se reproduce por completo Ia expresión endógena del receptor (lljin et al., 2001 ). DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han construido un modelo animal, un ratón modificado genéticamente mediante gene-targeting (knock-in) en el cual una proteína trazadora o repórter se expresara bajo el control de las señales de expresión del receptor VEGF-3. La expresión de este repórter puede ser monitorizada in vivo por técnicas no invasivas, Io que implica que se podría medir y cuantificar directamente en el ratón Ia angiogénesis asociada a diferentes procesos, tanto fisiológicos como patológicos a tiempo real.
Por tanto, un primer aspecto de Ia invención se refiere a un mamífero no humano genéticamente modificado, de ahora en adelante mamífero de Ia invención, cuyas células expresan Ia construcción IRES-EGFP-Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4 con un patrón idéntico a Ia expresión del receptor VEGFR-3, tanto en el espacio como en el tiempo.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención Ia expresión de Ia construcción IRES-EGFP-Luciferasa comprende Ia introducción de una secuencia de ácidos nucleicos que comprende Ia SEQ ID NO: 1 en el animal o uno de sus ancestros.
La secuencia SEQ ID NO: 1 comprende las secuencias de IRES del virus de Ia encefalomiocarditis, Ia secuencia de Ia EGFP y de Ia luciferasa.
Las secuencias IRES (del inglés "internal ribosome entry site") son secuencias nucleotídicas que permite Ia iniciación de Ia síntesis proteica en el medio de Ia traducción del marco abierto de lectura de un RNA mensajero (mRNA o ARNm). A diferencia del mecanismo más conocido de traducción proteica en organismos eucariontes que requiere una modificación previa en el extremo 5' del mRNA mensajero para el ensamblaje de Ia maquinaria de traducción, las secuencias IRES son reconocidas por el complejo de pre-iniciación 43S, de manera que pueden comenzar Ia traducción del RNA mensajero a pesar de carecer de modificación Cap en su extremo 5'. Estas secuencias han sido encontradas en miembros de las familias virales picornavirus, retrovirus y herpesvirus. Además, recientemente se han encontrado secuencias IRES en mRNA de organismos eucariontes, especialmente en proteínas implicadas en Ia regulación del ciclo celular, así como mecanismos apoptóticos. En el contexto de Ia presente invención se emplea como secuencias IRES, pero sin limitarnos, Ia secuencia IRES del virus de Ia encefalomiocarditis.
La EGFP según sus siglas en inglés (enhanced green fluorescent protein) es una mutación de una proteína (GFP) producida por Ia medusa Aequorea sp. (A victoria, A. aequorea, A. forskalea) que emite bioluminiscencia en Ia zona verde del espectro visible. Esta mutación (S65T) incrementa Ia fluorescencia, fotoestabilidad y posee unos picos de excitación y de emisión compatibles con los filtros de isotiocianato de fluoresceína (FITC), por Io que el gen que codifica esta proteína está aislado y se utiliza habitualmente en biología molecular como marcador.
En esta memoria "luciferasa" se refiere a un término genérico que agrupa un grupo de enzimas capaces de producir bioluminiscencia en Ia naturaleza. La más conocida es Ia firefly luciferase, de Photinus pyralis. En las reacciones de luminiscencia Ia luz es producida por Ia oxidación de Ia luciferina (un pigmento), y Ia reacción requiere ATP (adenosina trifosfato). En esta memoria, por tanto "luciferasa" y "luciferina" no se refieren a moléculas específicas, sino términos genéricos para un substrato y su enzima asociada.
En esta memoria se define como gen "Flt4", "FMS-like tyrosine kinase 4", "VEGFR3", "VEGFR-3", "Chy" y/o "AI323512" una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye Ia secuencia codificante del polipéptido Flt4, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende Ia secuencia aminoacídica de Ia SEQ ID NO: 2, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a Ia degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipétptido que comprende Ia secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un
80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con Ia SEQ ID NO: 2. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee Ia actividad y las características estructurales de Ia proteína Flt4.
La modificación genética del gen Flt4 que se realiza en Ia invención conduce a Ia expresión de un mensajero bicistrónico, que se expresa utilizando las señales de regulación endógenas del gen Flt4. La traducción de este mensajero da lugar simultáneamente a Ia síntesis de dos proteínas: el receptor VEGFR-3 intacto y Ia proteína de fusión EGFP- luciferasa. Por tanto, después de Ia modificación genética, el repórter EGFPIuc se expresa recapitulando exactamente el mismo patrón de expresión endógeno del gen Flt4, con idéntico control tanto a nivel espacial como temporal.
El utilizar Ia fusión EGFP-luciferasa como molécula repórter, permite monitorizar Ia expresión de VEGFR3 mediante técnicas de imagen óptica tanto por fluorescencia emitida por Ia EGFP como por luminiscencia emitida por Ia luciferasa en presencia de su sutrato específico, Ia luciferina.
La emisión fotónica que es emitida cuando Ia luciferasa reacciona con Ia luciferina adecuada puede ser detectada por un aparato sensible a Ia luz que se denomina luminometro, o por microscopios ópticos modificados, o permitiendo Ia observación de procesos biológicos, incluso in vivo, en el animal completo previamente anestesiado.
Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "mamífero no humano" se refiere a un animal mamífero no humano de cualquier fondo genético, preferentemente animales de laboratorio como roedores, más preferentemente ratas y ratones, o primates no humanos. Dicho animal no humano puede tener, prácticamente, cualquier fondo genético conocido, es decir, puede tratarse de un animal tipo salvaje (wild-type ó wt) o se puede combinar con otras alteraciones genéticas en el mismo ratón, por ejemplo, un animal transgénico, muíante o deficiente (knock-out ó KO), con mutaciones espontáneas o inducidas experimentalmente, así mismo en cualquier fondo genético.
El término "transgénico", aplicado a mamífero no humano, tal como se utiliza en Ia presente invención, se refiere a mamíferos que contienen un transgén e incluye, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, a animales transgénicos convencionales, u obtenidos por recombinación homologa: KOs, KIs, modelos condicionales etc.) en cualquier fondo genético.
Los autores de Ia presente invención han introducido el alelo modificado knock-in de Flt4, Flt4-IRES-EGFPLuc, en un ratón inmunosuprimido (nu/nu). Este fondo genético aporta Ia ventaja de que permite hacer ensayos de xenografts con líneas tumorales de diferentes orígenes, tanto murinas como humanas y cuantificar Ia angiogénesis/linfoangiogénesis en relación al tamaño de los tumores mediante Ia combinación de diferentes técnicas de imagen in vivo. Así mismo, utilizando líneas metastásicas se podría cuantificar Ia angiogénesis asociada al establecimiento de metástasis en este modelo. La ventaja añadida de utilizar un fondo nude (nu/nu) es que en ratones desnudos no se produce el enmascaramiento de Ia señal emitida por Ia luciferasa como consecuencia de Ia interferencia del pelo del animal, con Io cual Ia señal es más intensa y permite una mejor detección y cuantificación de cambios débiles de expresión. Por tanto, en una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención, el mamífero no humano es un ratón inmunodeprimido (nu/nu).
La molécula repórter (Ia fusión EGFP-luciferasa) se expresa bajo el control de las señales de expresión endógenas del gen Flt4 y por Io tanto tiene un patrón de expresión idéntico a Ia del receptor tanto en el espacio como en el tiempo. Esto no ocurre en los modelos transgénicos convencionales.
La inserción del cassette repórter se hace en Ia región 3' no traducida del gen (3'UTR, del inglés unstranlated región o bien de untranslated trailer), fuera de Ia secuencia codificante, por Io que Ia secuencia codificante del gen Flt4 no se encuentra alterada. En los modelos en los que Ia secuencia codificante del gen se sustituye por un marcador, el marcador sí recapitula el patrón de expresión endógeno del gen correspondiente pero simultáneamente en estos modelos se inactiva una copia del gen Io cual en muchos casos puede dar lugar a un fenotipo asociado que puede manifestarse incluso en heterocigosis estando Ia segunda copia del gen intacta (haploinsuficiencia).
En esta memoria, un "cassette" o "cásete" es una región codificante de un gen procedente de un organismo procariota o eucariota flanqueada por los elementos reguladores necesarios para su expresión in vivo o in vitro. Aunque los casetes de expresión pueden tener configuraciones muy variadas, deben contener por Io menos un promotor (promoter), una región codificante (ADNc eucariota o gen procariota) y un terminador de Ia transcripción (terminator) o un sitio de poliadenilación, según se trate de un gen derivado de un organismo procariota o de un ADNc procedente de un organismo eucariota. A esta configuración básica se Ie añade, si fuera necesario, una secuencia con función reguladora para Ia expresión natural del gen en el sistema elegido, p.ej.: un operador, un potenciador, Ia secuencia de Shine y Dalgarno para Ia unión al ARNr de E. coli, o las secuencias de un péptido señal (si Ia proteína se exporta).
En otro aspecto de Ia invención, el mamífero de Ia invención tiene introducida Ia construcción IRES-EGFP-Luciferasa 149 nucleótidos abajo del codón de parada TGA dentro de Ia región 3'UTR del gen Flt4.
El gen repórter, al introducirse en Ia región 3'UTR del gen Flt4, entre el codón de parada y Ia secuencia de poliadenilación, no afecta a Ia expresión normal de este gen, por Io que el modelo animal puede ser utilizado tanto en heterozigosis como en homocigosis. Esto aporta Ia ventaja de poder controlar Ia señal basal de fluorescencia/luminiscencia según los requisitos del ensayo, sin que esto tenga ninguna consecuencia en el fenotipo del modelo a estudiar.
Los seres humanos y los ratones de laboratorio (ambos mamíferos euterios) tienen más genes en común que los que se podrían encontrar entre los humanos y animales no-euterios. El parecido genético entre las dos especies permite comparar los genes casi directamente, y permite a los científicos encontrar los mismos genes en humanos para decodificar las rutas y mecanismos de las enfermedades humanas, porque los ratones también pueden desarrollarlas. Por tanto, en otra realización preferida, el mamífero de Ia invención es un ratón (Mus musculus).
Ventajosamente, Ia construcción génica IRES-EGFP-Luciferasa está incluida dentro de un vector, tal como, por ejemplo, un vector de expresión o un vector de transferencia. Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "vector" se refiere a sistemas utilizados en el proceso de transferencia de un gen exógeno o de una construcción génica exógena al interior de una célula, permitiendo de este modo Ia vehiculación estable de genes y construcciones génicas exógenas. Dichos vectores pueden ser vectores no virales o vectores virales.
Así, en otro aspecto de Ia invención se proporciona un vector de gene- targeting, de ahora en adelante vector de Ia invención, que comprende Ia construcción que contiene el cDNA que codifica para Ia proteína de fusión EGFP-luciferasa, precedida de una secuencia de entrada interna de ribosomas (IRES), las secuencias genómicas del locus Flt4 que flanquean el punto de integración de Ia construcción IRES-EGFP-luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4, y un cassette de selección positiva que comprende un promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK en Ia Fig. 1 ), un gen de resistencia a Ia neomicina (NEO en Ia Fig. 1 ) y una señal poliA del virus SV40, flanqueado por secuencias frt.
En una realización preferida, el vector de Ia invención se encuentra acompañado además por un cassette de selección negativa que comprende el promotor del gen de Ia fosfoglicerato quinasa de ratón, Ia secuencia codificante del gen de Ia timidina quinasa del virus herpes simple (TK en Ia Fig. 1 ), y una señal poliA del virus SV40.
Otro aspecto de Ia invención se relaciona con un procedimiento para Ia obtención del mamífero de Ia invención, en adelante método de Ia invención, que comprende: a) construir un vector de Ia invención según se ha descrito más arriba, b) transfectar dicha construcción en una población de células madre embrionarias, y seleccionar las células madre embrionarias que han integrado de forma estable el vector de Ia invención en su genoma por recombinación homologa. c) incorporar los clones de células madre embrionarias recombinadas del paso b) a embriones huésped, de manera que las células recombinadas contribuyan a todos los linajes celulares del embrión, d) permitir el desarrollo del embrión para obtener un mamífero no humano quimérico con el alelo que expresa Ia construcción IRES-EGFP- Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4. e) cruzar el mamífero no humano quimérico del paso d) para producir mamíferos heterocigóticos para Ia expresión de Ia construcción
IRES-EGFP-Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4, f) cruzar los individuos heterocigóticos según el apartado e) con animales transgenicos que expresan Ia recombinasa FIp de forma ubicua en todas las células incluida Ia línea germinal (Tg-pCAG FIp) para eliminar el cassette pGK-neo flanqueado por los sitios Frt, y opcionalmente, g) cruzar los individuos heterocigóticos según el apartado f) entre sí para producir un mamífero no humano genéticamente modificado homocigótico para Ia expresión de Ia construcción IRES-EGFP-Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4.
En una realización preferida del método de Ia invención las células madre embrionarias son V6.4 de fondo genético híbrido F1 (C57BL/6 x 129).
Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "transfectar" se refiere a cualquier técnica o procedimiento que permita Ia integración en una serie de células de un organismo vivo de un gen exógeno, o "transgén", y que confiere a dichas células y al organismo que las porta una nueva propiedad biológica. Preferiblemente el método de transfección es Ia electroporación. Dicho transgén o gen exógeno se refiere a un ADN normalmente no residente, ni presente en Ia célula que se pretende transformar. En el caso particular de Ia presente invención el ADN codifica para Ia EGFP y para una luciferasa. Por otro lado, el proceso de transgénesis para obtener el animal modelo de Ia invención puede ser aplicado tanto a animales completamente desarrollados como a embriones del mismo siempre que permita Ia integración de Ia construcción IRES- EGFP-Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4. Preferiblemente, el proceso de transgénesis es aplicado a embriones.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una célula, de ahora en adelante célula de Ia invención, aislada del mamífero de Ia invención o que ha integrado el vector de Ia invención por recombinación homologa. Una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere a Ia línea celular derivada de Ia o las células de Ia invención.
El mamífero de Ia invención es útil en el seguimiento no invasivo de Ia angiogénesis en tumores y en otras patologías y su aplicación al desarrollo de terapias antiangiogénicas. Además tiene una utilidad universal para el estudio de cualquier proceso asociado al funcionamiento y desarrollo del endotelio, como procesos inflamatorios, patologías vasculares y particularmente, crecimiento tumoral, extravasación de células tumorales y establecimiento de metástasis.
La utilización del modelo como repórter de linfoangiogénesis/angiogénesis /inflamación implica también su utilización para el ensayo de fármacos dirigidos a modular estos procesos y por tanto para el desarrollo de terapias antiangiogénicas, antitumorales y antimetastásicas.
Así pues, otro aspecto de Ia invención se refiere a un método de detección de agentes potencialmente útiles en el tratamiento o prevención de procesos inflamatorios que comprende: a) inducir un proceso inflamatorio y/o angiogénico en el mamífero de Ia invención, b) expresar de forma recombinante el agente, o administrar el agente al mamífero de Ia invención de a), b) comparar el nivel de emisión de y/o luminiscencia en el mamífero de Ia invención de a) con: i. el nivel de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia en el mismo mamífero de Ia invención antes de Ia administración del compuesto, ii. el nivel de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia en otro mamífero de Ia invención, al que no se Ie ha administrado el compuesto; o iii. un nivel estándar de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia para los mamíferos según i o ii; donde un cambio favorable con el nivel del indicador (disminución de Ia fluorescencia y/o luminiscencia) en relación con el cambio de referencia usando animales normales no afligidos por procesos inflamatorios en condiciones comparables, indica que el compuesto es activo para tratar dicho proceso inflamatorio.
La inducción del proceso inflamatorio y/o angiogénico en el mamífero de Ia invención se puede realizar por diversos medios, entre los que se incluyen, pero sin limitarnos, infligir una herida, administrar un agente angiogénico, inducir un proceso tumoral, xenografts en un modelo nude (nu/nu).
En Ia presente invención, se entiende por "agente" cualquier compuesto químico de origen natural o sintético, con una actividad terapéutica génica o una actividad terapéutica farmacológica. Los conceptos de terapia génica así como el de terapia farmacológica son bien conocidos para un experto en Ia materia.
En una realización preferida de este aspecto, el mamífero de Ia invención es un ratón. En una realización aún más preferida es un ratón nude (nu/nu). En una realización aún más preferida, Ia introducción del cassette IRES-EGFP-Luciferasa se realiza 149 nucleótidos abajo del codón de parada TGA dentro de Ia región 3'UTR del gen Flt4. Y en otra realización aún más preferida el mamífero de Ia invención es homozigótico para Ia introducción del cassette IRES-EGFP-Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a un método de detección de agentes potencialmente útiles en el tratamiento o prevención de procesos tumorales que comprende: a) inducir un proceso tumoral en el mamífero de Ia invención, b) expresar de forma recombinante el agente, o administrar el agente al mamífero de Ia invención, b) comparar el nivel de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia en el mamífero de Ia invención de a) con: i. el nivel de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia en el mismo mamífero de Ia invención antes de Ia administración del compuesto, ii. el nivel de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia en otro mamífero de Ia invención, al que no se Ie ha administrado el compuesto; o iii. un nivel estándar de emisión de fluorescencia y/o luminiscencia para los mamíferos según i o ii; donde un cambio favorable con el nivel del indicador (fluorescencia y/o luminiscencia) en relación con el cambio de referencia usando animales normales no aflijidos por el tumor inducido en condiciones comparables, indica que el compuesto es activo para tratar dicha enfermedad.
En una realización preferida de este aspecto, el mamífero de Ia invención es un ratón. En una realización aún más preferida es un ratón nude (nu/nu). En una realización aún más preferida, Ia introducción del cassette IRES-EGFP-Luciferasa se realiza 149 nucleótidos abajo del codón de parada TGA dentro de Ia región 3'UTR del gen Flt4. Y en otra realización aún más preferida el mamífero de Ia invención es homozigótico para Ia introducción del cassette IRES-EGFP-Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a un método de detección y aislamiento de células endoteliales de los vasos linfáticos en distintos estadios del desarrollo de un mamífero no humano, que comprende: a) disgregar los tejidos de dicho mamífero no humano, b) detectar y aislar las células que expresan EGFP mediante citometría de flujo.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Generación del modelo VEGFR3-IRESEGFPIuc Kl: estrategia de gene targeting.
A) Esquema de Ia estructura del gen Flt4, el vector de gene targeting utilizado y el alelo obtenido por recombinación homologa en células ES. Se muestra además Ia posición de los sitios de restricción Seal utilizados en el análisis por Southern blot de los clones recombinantes así como Ia posición de los fragmentos de DNA empleados como sondas en dicho análisis. Finalmente se muestra Ia estructura del alelo recombinado una vez eliminado el cásete de selección positiva (PGK-neo) mediante Ia actividad de Ia recombinasa FIp. B) Análisis de clones recombinantes mediante Southern Blot. Se muestra el tamaño de las bandas correspondientes a los alelos WT (Flt4+) y recombinante (Flt4-neo-IRESEGFPIuc)
C) La escisión del cásete PGKneo por Ia recombinasa FIp fue analizado mediante PCR con los primers indicados en Ia figura A para diferenciar Flt4-neo-IRESEGFPIuc (flechas rojas) and Flt4IRESEGFPIuc (flechas azules).
Fig. 2. Análisis de Ia expresión de VEGFR3 y EGFP en el modelo repórter. A) Análisis de Ia expresión de VEGFR3 en embriones de 13.5 días de desarrollo mediante Northern blot. Se analizaron 15 μg de RNA total de los genotipos indicados utilizando una sonda de 500bp específica para el RNA mensajero de VEGFR3. El tamaño del RNA mensajero es el indicado tanto para el genotipo silvestre cómo para el knockin. Los niveles de GAPDH se muestran como control de carga.
B) Análisis de Ia expresión de VEGFR3 en embriones de 13.5 días de desarrollo mediante Western Blot. Se analizaron 100 μg de extracto de proteína para cada uno de los genotipos indicados en 10% de SDS-PAGE. En Ia figura se muestran los inmunoblots para VEGFR3 y EGFP. Se incluye como control de carga el inmunoblot de α-Tubulin. Se observa que los niveles de expresión de VEGFR3 permanecen constantes en los diferentes genotipos.
C) Análisis de Ia expresión de VEGFR3-EGFPIuc en embriones KI/KI a diferentes estadios de desarrollo mediante microscopía confocal. Se observa una expresión específica de EGFP en los vasos linfáticos de los embriones (verde) mientras que no se detecta expresión en los vasos sanguíneos, que se reconocen por Ia autofluorescencia de los eritrocitos (rojo).
Fig. 3. Monitorización de Ia expresión de VEGR3 durante el desarrollo postnatal en el modelo repórter.
La actividad de luciferasa in vivo en hembras VEGFR3-IRESEGFPIuc (n=8) a las edades de 2, 3, 4, 5, 8, 10 y 15 semanas se monitorizó en un IVIS Spectrum.
A) Imágenes representativas de Ia actividad de luciferasa monitorizadas en las zonas dorsal y ventral de cada animal.
B) Cuantificación de Ia actividad de luciferasa mostrada en las imágenes en A. La actividad de luciferasa está expresada en fotones por segundo por cm2 para corregir por Ia diferencia de tamaño de los animales a diferentes edades. Los datos se muestran como media + SD.
Fig. 4. Análisis de Ia expresión de VEGFR3 en el modelo repórter en ensayos de cicatrización cutánea.
A) Imágenes representativas de Ia emisión de luciferasa durante un ensayo de cicatrización cutánea con o sin administración de dexametasona (DEX).
B) Cuantificación de Ia emisión de luciferasa (B.1 ) y de Ia cicatrización (B.2) durante el ensayo. Los datos se muestran como media + SD.
En los paneles A y B se muestra un máximo de emisión de luciferasa en el día 8 del ensayo alrededor de los extremos de Ia herida, que se correlaciona con una cicatrización del 30%. No se detecta expresión de luciferasa después del día 23 cuando Ia herida está completamente cicatrizada. El tratamiento con dexametasona induce una disminución significativa de Ia emisión de luciferasa en los días 8-10 de cicatrización, sin embargo Ia señal es Ia misma en los animales tratados a partir del día 15, cuando Ia herida está cicatrizada aproximadamente un 40%. El tratamiento con dexametasona causa una disminución en el reclutamiento de macrófagos a Ia zona de cicatrización alterando Ia cinética del proceso. Teniendo ésto en cuenta, y que los macrófagos expresan VEGFR3, el pico de emisión que se observa alrededor del día 10 en animales no tratados puede reflejar el proceso de reclutamiento de macrófagos a Ia zona de Ia herida. La disminución en el reclutamiento de macrófagos puede explicar asimismo el retraso en el proceso de cicatrización como se muestra en Ia Fig. B2.
Fig. 5. Expresión de VEGFR3 asociada a Ia inflamación inducida mediante el ensayo de hipersensibilidad por contacto (CHS).
Ratones VEGFR3-IRES-EGFPIuc KI/KI (n=5) se pre-sensibilizaron mediante tratamiento tópico con oxazolona en el abdomen. Seis días después Ia inflamación se indujo en Ia oreja izquierda de los animales mediante administración tópica de 1% de oxazolone. Otro grupo de animales a los que se indujo CHS (n=7) se trató además con dexametasona, administrada intraperitonealmente a una dosis diaria de 5 mg/Kg de peso.
A) Emisión de luciferasa medida diariamente in vivo durante el tratamiento
B) Cuantificación de Ia emisión que se muestra en A. Los datos se muestran como media + SD. (OXA) Oxazolona; (DEX) Dexametasona.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto Ia especificidad y efectividad de en Ia monitorización de los procesos de linfoangiogénesis/angiogénesis /inflamación.
Estrategia para Ia construcción del modelo Knockin (FIG. 1) Se ha introducido en Ia región 3' no traducida (UTR) del gen que codifica para el receptor VEGFR3 (flt4), cuya expresión es específica de células endoteliales, Ia secuencia codificante de Ia proteína de fusión EGFPIuc precedida por una secuencia IRES (Internal Ribosome Entry Site). La fusión IRES-EGFPIuc se introduce entre el codón de terminación del gen flt4 y Ia secuencia de poliadenilación. Esta estrategia permite generar un mensajero bicistrónico que da lugar a Ia expresión simultánea de dos genes con Ia misma regulación transcripcional y por tanto, en este caso, dirigir Ia expresión de Ia fusión EGFPIuc específicamente a las células endoteliales en las que se transcriba el gen flt4 sin alterar Ia expresión endógena del mismo.
Para Ia obtención del alelo knockin Flt4-IRES-EGFPIuc se diseñó en primer lugar un vector de targeting "universal" que permite aplicar esta misma estrategia a cualquier gen del genoma murino. La estructura de éste vector es Ia que se representa en Ia figura a continuación y está preparado para clonar en los sition únicos Notl y SaII los brazos de homología del gen de interés.
Notl y SaII son sitios únicos en el vector que reconocen estas enzimas de restricción y donde se pueden insertar los brazos de homología de cualquier gen. PGK-neo y PGK-hsvTK son los marcadores de selección positiva y negativa respectivamente.
Este vector contiene un marcador que expresa un gen de resistencia a neomicina bacteriano bajo el control del promotor del gen que codifica Ia fosfoglicerato quinasa de ratón (PGK-neo). El cásete PGK-neo permite Ia selección de los clones en los que el vector se ha integrado, bien al azar o bien por recombinación homologa. Este marcador está flanqueado por sitios frt para su posterior eliminación mediada por Ia recombinasa FIp. El vector incluye un marcador para selección negativa que se pierde si el vector se integra por recombinación homologa pero no si se integra al azar. Este último es el cásete que expresa el gen de Ia timidina quinasa del virus herpes (hsvTK) también bajo el control del promotor PGK. La pérdida de este cásete se selecciona en presencia de ganciclovir. Estos dos elementos permiten seleccionar las células que hayan incorporado el vector mediante recombinación homologa. La inclusión del marcador de selección negativa proporciona un aumento de 5-10 veces en Ia frecuencia de clones recombinantes homólogos.
El vector además contiene sitios de restricción únicos para las enzimas SaII y Notl que son poco frecuentes en el genoma del ratón, y que pueden ser utilizados para clonar los brazos de homología 5' y 3' respectivamente.
El gen repórter que se ha utilizado es una proteína de fusión EGFP- luciferasa. La EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) es una variante de Ia proteina GFP, más brillante y con mejores niveles de expresión en células de mamífero. La fusión entre Ia proteína verde fluorescente y Ia luciferasa tiene como ventaja que permite Ia monitorización de su expresión tanto por captación de fluorescencia como de bioluminiscencia.
Finalmente, los brazos de homología utilizados para Ia construcción se han obtenido a partir de DNA genómico de C57BL/6, y se han amplificado por PCR a partir de un BAC (RP23-445K3) que contiene este gen. El tamaño de cada uno de los brazos es de 3.3Kb y 3.7Kb el 3' y 5' respectivamente. Los primers utilizados para Ia amplificación del brazo de homología 5' son: Flt45F SEQ ID NO: 3 Flt45R SEQ ID NO: 4 y para el brazo 3' son: Flt43F SEQ ID NO: 5 Flt43R SEQ ID NO: 6. La amplificación se hizo utilizando Ia TAQ polimerasa TAQ LA de Takara mediante 2 ciclos de pre-PCR (980C 1Os, 540C 1 m, 680C 5m) y 30 ciclos de PCR (980C 1Os y 680C 5m).
Una vez construido el vector, éste se amplificó y después de linearizarlo mediante digestión con Notl se electroporó en células madre embrionarias (ES) V6.4 de fondo genético híbrido F1 [C57BL/6 129SvJ]. Típicamente 17 millones de células se electroporan con 20 microgramos de DNA linearizado en 0,8 mi de PBS, a 250 voltios y 500 microFaradios, en una cubeta de 0,4 cm de ancho. La evaluación de Ia frecuencia de recombinación homologa y Ia selección de clones recombinantes homólogos se realizó mediante análisis por Southern Blot. Para ello se extrajo DNA genómico de 60 clones. Para comprobar Ia recombinación homologa en el brazo 5', el DNA se digirió con Seal y se analizó por Southern blot utilizando como sonda un fragmento de 262pb que híbrida en una zona externa al brazo de homología 5'. La recombinación en el brazo 3' se analizó de forma semejante, digiriendo el DNA genómico con Seal y utilizando como sonda para Southern Blot un fragmento de 324pb. De los 60 clones analizados, 18 de fueron positivos para ambos brazos de homología.
Finalmente dos de los clones recombinantes (ESIM4.31 y ESIM4.52) se incorporaron a embriones en desarrollo mediante Ia técnica de agregación. Para ello, se extrajeron mórulas de ratones de Ia cepa CD1 , a día 2,5 de gestación. Estos embriones, una vez eliminada Ia zona pelúcida mediante digestión con solución de Tyrode, se agregaron con cúmulos de unas 6-8 células por embrión. Los embriones agregados (aproximadamente 70) se incubaron toda Ia noche en medio KSOM a 370C, 5% CO2 y al día siguiente se transfirieron al oviducto de hembras pseudogestantes de Ia cepa CD1 a día 0,5 de pseudogestación. El parto tuvo lugar a los 19 días después de Ia transferencia de los embriones. Entre las crías nacidas las quimeras se distinguieron por Ia presencia de pigmentación en Ia piel y en el pelo, que indica Ia contribución de las células ES, ya que el embrión huésped proviene de una cepa albina. Se obtuvieron 10 quimeras (ESIM4.31 , 5 machos (1 )100%, 1 (70%), 2(50%), 1 (30%) y para el clon ESIM4.52, 5 machos 100%)
Las mejores quimeras machos, se cruzaron con hembras CD1 para analizar Ia contribución de las células ES a Ia línea germinal (aparición de crías pigmentadas). 7 quimeras (de 7 testadas) transmitieron Ia pigmentación a su descendencia. De 71 crías analizadas por PCR, 20 contenían el alelo recombinante. Estos animales, heterocigotos para el alelo Flt4-IRES-EGFPIuciferasa, se cruzaron entre sí para generar animales homocigotos. La frecuencia de animales homocigotos nacidos de estos cruces fue del 25%, indicando que Ia mutación en homocigosis no resulta en letalidad embrionaria o perinatal.
Análisis de expresión mediante Northern y Western blot (FIG. 2)
Para los ensayos de Northern, se extrajo RNA total a partir de embriones a día de desarrollo E13,5 de los genotipos indicados, mediante extracción con Trizol. Se analizaron 15 microgramos de RNA total de cada genotipo.
Como sonda se utilizó un fragmento de 500 pb correspodiente a Ia zona
3'UTR del gen flt4 externo al sitio de integración del repórter IRES-
EGFPIuciferasa. La sonda para GAPDH corresponde a un fragmento de 400pb de Ia secuencia codificante del gen de Ia GAPDH de rata.
Para analizar los niveles de proteína por Western blot, 100 microgramos de extracto de proteína total obtenido a partir de embriones a día E13,5 de cada genotipo, se resolvieron en un gel SDS-PAGE al 10%. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se hibridaron con anticuerpos anti-VEGFR3 (AFL4 de Becton Dickinson) y anti-EGFP (AB3080 Chemicon International) a las diluciones 1 :60 y 1 :400 respectivamente.
Monitorización de Ia expresión de EGFP en embriones (FIG. 2)
Embriones en diferentes días de gestación se extrajeron de útero en PBS y se observaron en un microscopio confocal Leica TCS-SPδ(AOBS) equipado con el software de adquisición LAS AF. Para excitar Ia EGFP se utilizó un láser de argón de 488nm.
Determinación de Ia actividad de luciferasa en extractos La actividad de luciferasa en extractos de diferentes órganos y tejidos se midió utilizando un kit comercial de Promega (E-1501 ) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Determinación de Ia expresión de luciferasa in vivo. (FIG. 3, 4 y 5)
Animales a diferentes edades y de diferentes genotipos son anestesiados por inhalación de isofluorano. A continuación se les administra D-luciferina (Xenogen XR-1001 ) a una concentración de 15 mg/ml en PBS mediante una única inyección intraperitoneal. La dosis de luciferina es de 150mg/Kg de peso. Los animales inyectados se observan en un IVIS Spectrum (Xenogen Corp.) adquiriendo imágenes durante 30 segundos de forma continuada hasta que se alcanza el máximo de emisión (aproximadamente a los 20 minutos de Ia administración de Ia luciferina).
Ensayos de cicatrización cutánea. (FIG. 4)
En este ensayo se emplean hembras de 11-14 semanas de edad y heterocigotas para el alelo VEGFR3-EGFPIuciferasa Kl. Los animales son anestesiados por inhalación de isofluorano. Se les afeita Ia zona dorsal y se realiza una herida circular en Ia piel, aproximadamente a una altura media de Ia zona dorsal, con un punzón de biopsia de 8 mm de diámetro, escindiendo Ia piel y el panículo carnoso. A diferentes días se mide Ia emisión de luciferasa en un IVIS Spectrum como se describe anteriormente. En este caso el ROI (región of interest), donde se mide Ia señal, corresponde al área inicial de Ia herida para cada ratón en cada punto. En paralelo se mide el diámetro de Ia herida, en orientación vertical (V) y horizontal (H) con un calibre. Para calcular el área en cada punto se multiplican las medias V x H . La cicatrización se representa en cada punto como el tamaño porcentual de Ia herida respecto al tamaño de Ia herida a día 0.
Para estudiar Ia contribución de Ia inflamación al proceso de cicatrización, en el mismo ensayo algunos animales fueron tratados con dexametasona (Sigma D1756) a una concentración de 1 mg/ml en Etanol y a una dosis de 5 mg /Kg de peso administrada mediante inyección intraperioteneal diaria. Los animales control fueron tratados de Ia misma forma sólo con vehículo.
Ensayo de hipersensibilidad por contacto (FIG. 5)
Hembras homocigotas para el alelo VEGFR3-EGFPIuciferasa Kl de aproximadamente 11 semanas de edad fueron pre-sensibilizadas por administración tópica de 50 microlitros de oxazolona al 2% en acetona/aceite. 4:1 v/v en el abdomen afeitado previamente. Seis días después (día 0) se indujo Ia inflamación por administración tópica de 10 microlitros de oxazolona al 1 % en el mismo vehículo en Ia oreja izquierda del animal. La oreja derecha fue tratada sólo con vehículo como control interno. En paralelo, otro grupo de animales de Ia misma edad y genotipo fueron tratados con dexametasona como se describe anteriormente. La emisión de luciferasa se midió diariamente a día 0 y durante los seis días siguientes al comienzo del tratamiento utilizando el IVIS Spectrum como se describe en los apartados anteriores. En este caso el ROI es sólo Ia oreja tratada o Ia oreja control de cada animal.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Mamífero no humano genéticamente modificado cuyas células expresan Ia construcción IRES-EGFP-Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4 con el mismo patrón de Ia expresión del receptor VEGFR-
3, tanto en el espacio como en el tiempo.
2. Mamífero no humano genéticamente modificado de acuerdo con Ia reivindicación anterior, donde Ia expresión de Ia construcción IRES- EGFP-Luciferasa comprende Ia introducción de una secuencia de ácidos nucleicos que comprende Ia SEQ ID NO: 1 en el animal o uno de sus ancestros.
3. Mamífero no humano genéticamente modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el mamífero está inmunodeprimido.
4. Mamífero no humano genéticamente modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde Ia introducción del cassette IRES- EGFP-Luciferasa se realiza 149 nucleótidos abajo del codón de parada TGA dentro de Ia región 3'UTR del gen Flt4.
5. Mamífero no humano genéticamente modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que es homocigótico para Ia introducción del cassette IRES-EGFP-Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4.
6. Mamífero no humano genéticamente modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el mamífero es un ratón.
7. Vector de gene-targeting que comprende Ia construcción que contiene el cDNA que codifica para Ia proteína de fusión EGFP-luciferasa, precedida de una secuencia de entrada interna de ribosomas (IRES), las secuencias genómicas del locus Flt4 que flanquean el punto de integración de Ia construcción IRES-EGFP-luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4, y un cassette de selección positiva que comprende el promotor del gen de Ia fosfoglicerato quinasa de ratón, un gen de resistencia a Ia neomicina y una señal poliA del virus SV40, flanqueado por secuencias frt.
8. Vector según Ia reivindicación anterior, acompañado además por un cassette de selección negativa que comprende, el promotor del gen de Ia fosfoglicerato quinasa de ratón, Ia secuencia codificante del gen de
Ia timidina quinasa del virus herpes simple, y una señal poliA del virus SV40.
9. Método de modificación genética para construir un mamífero no humano genéticamente modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende: a. construir un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7-8. b. transfectar dicha construcción en una población de células madre embrionarias, y seleccionar las células madre embrionarias que han integrado de forma estable el vector de a) en su genoma por recombinación homologa. c. incorporar los clones de células madre embrionarias recombinadas del paso b) a embriones huésped de manera que las células recombinadas contribuyan a todos los linajes celulares del embrión. d. permitir el desarrollo de éstos embriones para obtener un mamífero no humano quimérico con el alelo que expresa Ia construcción IRES-EGFP-Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4. e. cruzar el mamífero no humano quimérico del paso d) para producir mamíferos no humanos heterocigóticos para Ia modificación introducida, y opcionalmente, f. cruzar los individuos heterocigóticos según e) entre sí para producir un mamífero no humano genéticamente modificado homocigótico para Ia expresión de Ia construcción IRES- EGFP-Luciferasa en Ia región 3'UTR del gen Flt4.
10. Método según Ia reivindicación anterior, donde las células madre embrionarias son V6.4 de fondo genético híbrido F1 (C57BL/6 x 129).
11.CeIuIa aislada de un mamífero según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o que ha integrado por recombinación homologa un vector según cualquiera de las reivindicaciones 7-8.
12. Línea celular derivada de una célula aislada según Ia reivindicación 11.
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