WO2010023928A1 - トランスジェニック鳥類及びその作製法、並びにタンパク質の生産法 - Google Patents

トランスジェニック鳥類及びその作製法、並びにタンパク質の生産法 Download PDF

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birds
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飯島信司
西島謙一
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    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus

Definitions

  • the present invention relates to transgenic birds. Specifically, the present invention relates to a transgenic bird useful for producing a glycosylated protein, a method for producing the transgenic bird, and a method for producing a protein using the transgenic bird.
  • Non-patent Documents 3 to 7 a method of injecting a foreign gene into a blastoderm-stage embryo after egg release using a retrovirus vector
  • Non-patent Documents 8 and 9 a method of directly injecting DNA or the like into the nucleus of a fertilized egg at the 1-cell stage
  • Non-Patent Documents 10 and 11 a method using a lentiviral vector
  • Non-Patent Document 12 a method using ES cells
  • Non-patent Document 14 Human erythropoietin produced in egg white by the chimeric chicken showed activity in vitro equivalent to human erythropoietin produced by recombinant CHO cells.
  • Non-Patent Document 12 and Non-Patent Document 14 are combined, when a specific protein is produced in the egg white of transgenic birds, glycosylation is unlikely to occur, and it is expected that incomplete glycosylation occurs. The Such incomplete sugar chain modification causes a loss of the original function of the protein. Then, this invention makes it a subject to provide the production method of the useful protein using the transgenic birds which produce the foreign protein in which sugar chain structure was improved in egg white, its production method, and the said transgenic birds.
  • target protein is an antibody.
  • transgenic bird according to [6] wherein the gene is introduced by injection of a replication-defective retrovirus vector containing the gene.
  • retroviral vector is a lentiviral vector.
  • a step of preparing two male and female homologous birds in which a gene encoding the target protein is introduced into one or both germ cells, and fertilization obtained by mating the two male and female homologous birds A method for producing a transgenic bird, comprising: incubating an egg; and introducing a gene encoding ⁇ 1,4-galactose transferase into the formed early embryo to cause insertion of the gene into a chromosome. .
  • a method for producing a transgenic bird characterized by performing the following cross (1) or (2): (1) A cross between a male transgenic bird obtained by the production method according to [10] and a female transgenic bird obtained by the production method according to [10], (2) A cross between a transgenic bird obtained by the production method according to [10] and a wild-type bird of the same species.
  • a method for producing a protein comprising recovering a target protein from the egg white of the transgenic bird according to any one of [1] to [9].
  • GalT1 The protein content of GalT1 in chicken liver and oviduct enormous area was analyzed by Western blot of microsomal fraction. ⁇ ⁇ ⁇ GalT1 band is indicated by an arrow. It was confirmed that the amount of GalT1 protein in the large part of the oviduct was lower than that of the liver.
  • (A) shows the structure of a retroviral vector into which a gene has been introduced. In this vector construct, it is possible to express galactose transferase (GalT1) systemically by the actin promoter.
  • LTR Long terminal repeat
  • eGFP enhanced GFP
  • P ⁇ act chicken ⁇ -actin promoter
  • ckGalT1 chicken ⁇ 1,4-Galactosyltransferase 1.
  • the copy number of the introduced viral vector gene in the blood of the G0 generation galactose transferase-introduced chimeric chicken (female) was assayed by real-time PCR. Primers that recognize sequences specific to the viral vector shown in FIG. 3A were designed and analyzed.
  • WT non-introduced individual. Protein level expression analysis of GalT1 gene in galactose transferase-introduced chickens. GalT1 expression in the oviduct enormous area was analyzed by Western blot of the microsomal fraction. Non-transduced (wild type) and transgenic (# 77, # 78) chickens were compared. The GalT1 band is indicated by an arrow.
  • the number of copies of the transgene in the oviduct enormous part measured by real-time PCR is shown below. Gene expression was confirmed at the protein level in individuals (# 77) with a high introduced copy number in the enormous part of the oviduct. Analysis of galactose transferase-introduced chickens.
  • A Gene expression analysis in the oviduct enormous part by real-time RT-PCR. Expression was shown relative to the expression in non-introduced (wild type) individuals. In the transgenic individuals (# 77, # 78), compared to non-transfected (wild type) individuals, strong expression of the introduced GalT1 gene was confirmed at the mRNA level. On the other hand, no significant change was observed in the endogenous gene expression (ST6Gal1).
  • Galactose is not present in the egg white protein of non-transfected sputum (no antibody gene and wild type) sputum, but galactose is bound to the egg white protein of GalT1 transgenic individuals (# 68, # 72, # 77, # 79, # 82) It has been shown. The presence of an equal amount of protein was confirmed by CBB staining (bottom). An egg yolk sample was used as a positive control. In addition, egg white protein derived from a chicken (no antibody gene) in which neither an antibody gene nor a galactose transferase gene was introduced was also analyzed. (B) Analysis of galactose bound to a model antibody purified from egg white (RCA120 lectin blot, top).
  • Transferrin which is a protein containing a large amount of sialic acid-containing sugar chains, was also compared. Analysis by isoelectric focusing of a model antibody produced by a galactose transferase-introduced chicken (terminal sialic acid analysis 2). The purified antibody was analyzed by isoelectric focusing. When sialic acid is bonded, a shift toward the acidic (anode) side is observed. The band (arrow) that disappears upon treatment with sialidase (NF) is considered to be the band of the sialic acid-added antibody. Production of transgenic chicken producing human erythropoietin with strong expression of galactose transferase.
  • (A) shows the structure of a retroviral vector into which a gene has been introduced.
  • human erythropoietin can be expressed systemically by the actin promoter.
  • galactose transferase (GalT1) is simultaneously produced from the same mRNA by the effect of IRES.
  • LTR Long terminal repeat
  • P ⁇ act chicken ⁇ -actin promoter
  • hEPO human erythropoietin
  • IRES Internal Ribosome Entry Site
  • ckGalT1 chicken ⁇ 1,4-Galactosyltransferaseyl1
  • WPRE Woodchuck posttranscriptional element.
  • a chicken fertilized egg was incubated for 2.5 days, and a viral vector was injected into the heart of an embryo that had developed (55-hour embryo). A total of 40 embryos were introduced in two introduction experiments, and 8 (20%) transgenic chimeric chickens were obtained.
  • A Analysis by Western blotting using anti-human erythropoietin antibody.
  • B Analysis of galactose bound to human erythropoietin purified from egg white (RCA120 lectin blot).
  • Non-patent Document 14 The erythropoietin derived from the egg white of an individual introduced with erythropoietin alone (Non-patent Document 14; GalT1-) does not bind to RCA120 at all, whereas the erythropoie derived from the egg white of an individual simultaneously introduced with the GalT1 gene (GalT1 +) Ethin bound strongly to RCA120.
  • NF neuraminidase
  • ⁇ Gal ⁇ -galactosidase.
  • the first aspect of the present invention relates to a transgenic bird that produces a target protein in egg white.
  • two foreign genes ie, a gene encoding a target protein and a gene encoding ⁇ 1,4-galactose transferase are introduced.
  • the two genes are introduced into the same individual by crossing a transgenic bird introduced with a gene encoding the target protein and a transgenic bird introduced with a gene encoding ⁇ 1,4-galactosyltransferase. Including cases.
  • gene encoding target protein is referred to as “target protein gene”, and “gene encoding ⁇ 1,4-galactosyltransferase” is referred to as “ ⁇ 1,4-GalT gene”. Also called.
  • the “target protein” is a protein intended to be produced by the transgenic bird of the present invention.
  • a preferred target protein is a glycosylated protein in its natural form.
  • the transgenic bird of the present invention can produce a protein having a sugar chain structure that is the same as or close to the natural type.
  • the target protein is not limited to the above protein. If the target protein is a protein that does not originally have a sugar chain, it is possible to produce a modified protein with a sugar chain added.
  • the transgenic birds of the present invention are also useful as a means for protein modification.
  • proteins whose glycoforms are glycosylated include antibodies, erythropoietin, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone, luteinizing hormone, human chorionic gonadotropin, and cytokine.
  • the preferred form of the antibody here is a double-chain antibody, scFv and scFv-Fc which are widely present in nature.
  • the variable region of immunoglobulin IgG has a domain consisting of heterodimers of VH and VL called Fv (Fragment of variable region). Although this Fv domain has a molecular weight of about one-fifth that of IgG, it has sufficient antigen-binding ability by itself.
  • a low molecular weight antibody called scFv is obtained by artificially connecting the VH and VL domains with a peptide linker.
  • the scFv-Fc is obtained by connecting the Fc region to this scFv.
  • the Fc region is preferably derived from a human IgG class. Powers et al. (Powers, DB et al. (2000) J Immunol Method 251,123) found that fC region derived from human IgG1 was fused to scFv to increase stability in blood. This scFv-Fc antibody is promising for medical use.
  • the origin of the antibody (animal species) is not particularly limited. However, human antibodies, human antibodies or human chimeric antibodies are preferred.
  • the antigen recognized by the antibody is not particularly limited.
  • antigens are CD2, CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD20, CD21, CD34, CD40, CD40L, CD80, HLA class II antigen, CD56 (NK cells), CD86, CD161, TCR ⁇ , TCR ⁇ , iNKT, prion Can be mentioned.
  • the transgenic bird of the present invention can be used for transgenes in somatic cells throughout the body even if the individual has a transgene in a somatic cell (ie, a target protein gene and a ⁇ 1,4-GalT gene). An individual who holds Moreover, a chimera may be sufficient only about one transgene.
  • G0 transgenic chimeric bird birds obtained by gene transfer into fertilized eggs grow as chimeric individuals.
  • This first generation transgenic bird is called G0 transgenic chimeric bird.
  • G0 transgenic chimeric birds whose germ cells carry the transgene are parents, and offspring that carry the transgene in somatic cells throughout the body are called G1 transgenic birds.
  • the descendants of the G1 transgenic birds that inherit the transgene are called G2 transgenic birds, G3 transgenic birds, G4 transgenic birds ...
  • Gn transgenic birds (n is an integer) in order of generation.
  • G0 transgenic chimeric birds and their progeny are collectively referred to as transgenic birds.
  • Species of birds are not particularly limited.
  • the birds of the present invention include chickens, quails, turkeys, ducks and ostriches. Of these, chicken and quail are particularly preferable because they are easily available and are plentiful as egg-laying species.
  • the transgene ⁇ 1,4-GalT gene is expressed in the large portion of the oviduct which is the secretory organ of egg white protein. This feature makes it possible to efficiently secrete a target protein having an improved sugar chain structure into egg white.
  • ⁇ 1,4-GalT gene As long as it encodes a protein exhibiting ⁇ 1,4-galactose transfer activity in the body of a transgenic bird, the type, sequence, etc. of the ⁇ 1,4-GalT gene are not particularly limited.
  • Examples of ⁇ 1,4-GalT gene are ⁇ 1,4-galactosyltransferase 1 (GalT1) gene, ⁇ 1,4-galactosyltransferase 2 (GalT2) gene, ⁇ 1,4-galactosetransferase 3 (GalT3) gene.
  • base sequences of these genes are shown in the attached sequence listing (chicken GalT1 gene (SEQ ID NO: 1), chicken GalT2 gene (SEQ ID NO: 2), chicken GalT3 gene (SEQ ID NO: 3)). These base sequences are merely examples, and even base sequences that are partially different from the base sequences are used as ⁇ 1,4-GalT genes as long as they encode proteins having ⁇ 1,4-galactose transfer activity. be able to. Moreover, you may decide to use genes of species other than a chicken.
  • genes of species other than chicken are human or mouse ⁇ 1,4-galactosyltransferase 1 (GalT1) gene, ⁇ 1,4-galactosetransferase 2 (GalT2) gene, ⁇ 1,4-galactosetransferase 3 (GalT3). ), ⁇ 1,4-galactose transferase 5 (GalT5).
  • the expression levels of the GalT1 gene and the GalT2 gene are low in the oviduct enormous portion.
  • the expression level of GalT1 was significantly lower than that of other tissues.
  • the GalT1 gene or the GalT2 gene more preferably the GalT1 gene is used as the ⁇ 1,4-GalT gene. Two or more kinds of ⁇ 1,4-GalT genes may be used in combination.
  • the transgenic bird of the present invention is a transgenic bird obtained by any of the following methods (1) to (4) or a progeny thereof.
  • a step in which at least one side prepares two male and female homologous birds having a gene encoding a target protein in a germ cell, and incubating a fertilized egg obtained by mating the two male and female homologous birds
  • encoding a target protein Preparing a bird having a gene in a germ cell and a homozygous bird having a gene encoding ⁇ 1,4-galactose transferase in a germ cell; and a fertilized egg obtained by mating the two birds
  • the method (1) first, two male and female homologous birds, each having at least one target protein gene in a germ cell, are prepared.
  • the “bird” here is not particularly limited as long as the target protein gene is retained in the germ cell. Although it may be a chimeric individual with respect to the target protein gene, it is preferably a transgenic individual from the G1 generation onwards in order to efficiently obtain the target transgenic bird. The following two combinations (a) to (c) are shown when the transgenic individuals of the G1 generation and later are used.
  • wild type refers to a transgene (in the above example) It represents that the target protein gene) is a wild type, that is, an individual into which a transgene has not been introduced.
  • incubation is started.
  • the incubation conditions may be in accordance with conventional methods, for example, incubating under conditions of 37.8 ° C to 39.0 ° C and humidity of 50 to 70%.
  • the ⁇ 1,4-GalT gene is introduced into the formed early embryo to cause insertion of the gene into the chromosome.
  • eggs that have been fertilized in the oviduct first begin to break approximately 1.5 hours after fertilization.
  • Eggs that start dividing with the cytoplasm connected are divided while being released outside the body over a day, and become embryos called blastoderm consisting of about 60,000 cells (blastoderm stage).
  • This blastoderm is observed as a white ring with a diameter of 3-4 mm in the middle of the yolk.
  • the embryo divides into upper and lower layers to form a split space. Ovulation occurs when the lower blastoderm layer is formed, and the striatum is formed.
  • the blastoderm has a triple structure of upper, middle, and lower, and three germ layers are formed. Then, after embryo formation and growth, it hatches on the 22nd day after ovulation.
  • the blastoderm stage is also called stage X, and germ cells are produced from some of the cells at this time. So far, fertilized eggs at this time are used as targets for gene transfer.
  • fertilized eggs at the blastoderm stage are hatched immediately after egg release (eg, 37.8 ° C to 39.0 ° C for chickens, and about 50 to 70% humidity)
  • the incubation time was set at 0 hours (at the start of incubation)
  • the formation of vasculature was observed on the yolk from about 36 hours after the start of incubation in the quail and about 43 hours after the start of incubation in the chicken.
  • the pulsation of organs that differentiate into the heart can be observed.
  • gene transfer is performed after this stage, the transgene is expressed at a high level.
  • Gene transfer can be performed by methods known in the art. That is, a method of injecting a foreign gene into a blastoderm-stage embryo after egg release using a retrovirus vector (Non-patent Documents 3 to 7), a method of directly injecting DNA or the like into the nucleus of a fertilized egg at the 1-cell stage (Non-Patent Documents 8 and 9), methods using a lentiviral vector (Non-Patent Documents 10 and 11), etc. may be used for gene introduction.
  • a typical method that is, a gene transfer method using a recombinant retrovirus will be described in detail.
  • Moloney murine leukemia virus (MoMLV), Moloney murine sarcoma virus (MoMSV), avian leukemia virus (ALV), mouse stem cell virus (MSCV), mouse embryonic stem cell virus (MESV), lentivirus human immunodeficiency virus (A retroviral vector is constructed using HIV).
  • a retrovirus vector derived from MSCV.
  • a replication-defective retrovirus vector In order to delete the replication ability, one or more (preferably two or all) of the three genes gag, pol, and env necessary for the replication of the virus particle are deleted.
  • the coat protein for efficient infection of avian cells, it is preferable to artificially use the coat protein as a VSV-G envelope protein derived from bovine vesicular stomatitis virus (VSV-G pseudotype).
  • the gene encoded by the retroviral vector is not particularly limited, such as a promoter, enhancer, regulatory factor, etc. in addition to the transgene.
  • Promoter is a functional sequence that determines the transcription start position of a gene and regulates the transcription level.
  • the promoter is not limited as long as it functions effectively in birds.
  • EF1 ⁇ promoter thymidine kinase promoter, simian virus 40 (SV40) promoter, murine phosphoglycerokinase (PGK) promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, rous sarcoma virus (RSV) promoter, chicken ⁇ -actin promoter, etc.
  • Virus promoters and cellular promoters can be used.
  • An inducible promoter typified by a tetracycline inducible promoter can also be used.
  • a tissue-specific promoter such as an ovalbumin promoter can be used.
  • Enhancer is a functional sequence that promotes transcription.
  • enhancers include SV40, CMV, thymidine kinase enhancer, steroid response element and lysozyme enhancer.
  • a regulatory factor is a functional sequence that contributes to transcriptional regulation and stabilization of RNA after transcription.
  • Examples of regulatory factors include woodchuck hepatitis virus-derived regulatory elements (woodchuck post-transcriptional regulatory element: WPRE, US Pat. No. 6,136,597).
  • a retroviral vector typically includes at least a part of a long repetitive sequence (long terminal repeat, LTR) at the 5 'end and 3' end. Since LTR has a transcription promoter gene and polyA addition signal, it can be used as a promoter or terminator. Transgenes and other sequences (promoters, enhancers, regulatory elements, etc.) are included between the 5'LTR and the 3'LTR on the vector construct.
  • LTR long terminal repeat
  • a recombinant retrovirus can be produced by introducing a plasmid encoding a retrovirus vector (specifically, a plasmid containing the above-described repetitive sequence) into a packaging cell.
  • a plasmid encoding a retrovirus vector specifically, a plasmid containing the above-described repetitive sequence
  • lipofection method, calcium phosphate method, electroporation method and the like may be used.
  • the packaging cell a cell expressing a gene (gag, pol or gag, pol, env) necessary for the formation of virus particles is used.
  • the above plasmid is introduced together with a plasmid containing the env gene into GP293 cells that constitutively express gag and pol.
  • the above plasmid may be transiently introduced into a 293FT cell together with a plasmid for expressing gag, pol, and env.
  • the above plasmid may be introduced into a GP293 cell that constitutively expresses gag and pol together with a plasmid containing the VSV-G gene.
  • a GP293 cell line stably holding the plasmid may be prepared and used as a packaging cell. The virus solution (the culture supernatant of the packaging cell) is concentrated as necessary.
  • the ⁇ 1,4-GalT gene is introduced into the early embryo using the recombinant retrovirus prepared by the above method.
  • the gene transfer is preferably performed by the microinjection method (Bosselman, RA et al. (1989) Science 243, 533), but is not limited thereto, and the gene transfer is performed by a lipofection method, an electroporation method, or the like. May be.
  • Hatching can be performed in a conventional manner.
  • One of the preferred methods is a method using an artificial eggshell (Kamihira, M et al. (1998) Development Growth Differ 40, 449).
  • G0 transgenic chimera birds having ⁇ 1,4-GalT gene in mosaic form in their somatic cells can be obtained.
  • Transgenes target protein gene and ⁇ 1,4-GalT gene
  • the mating type for creating the G1 transgenic includes the G0 transgenic chimera male and the same wild type female, the G0 transgenic chimera female and the same wild type male, and the G0 transgenic chimera. There are three types: male and female of G0 transgenic chimera. If one female of the G0 transgenic chimera is crossed with a plurality of females (wild-type wild type or G0 transgenic chimera), a G1 transgenic can be produced efficiently.
  • Descendants after G2 can be produced by crossing or backcrossing the transgenics obtained so far (including G0 transgenic chimeras) and wild type.
  • PCR was performed using DNA extracted from the blood or cells of the obtained offspring as a sample.
  • a transgene may be detected to detect the transgene.
  • the copy number of the transgene in G0 transgenic chimeric birds or offspring after the G1 generation can also be confirmed using PCR or hybridization.
  • RT-PCR or Northern blotting can be used for confirmation of the expression level of the transgene.
  • a bird having a target protein gene in a germ cell and a homozygous bird having a ⁇ 1,4-GalT gene in a germ cell are prepared. These two birds are not particularly limited as long as they have a transgene (target protein gene, ⁇ 1,4-GalT gene) in a germ cell. That is, it may be a chimeric individual, but is preferably a transgenic individual from the G1 generation onwards in order to efficiently obtain the desired transgenic birds.
  • transgenic individual G1 in which somatic cells throughout the body have the target protein gene and the ⁇ 1,4-GalT gene.
  • the transgenic individual can be used to produce its offspring (G2 generation and later).
  • the target protein gene and the ⁇ 1,4-GalT gene are introduced into the formed early embryo to cause insertion of the two genes into the chromosome.
  • the target protein gene and ⁇ 1,4-GalT gene can be introduced by co-introduction of a vector carrying the target protein gene (first expression vector) and a vector carrying the ⁇ 1,4-GalT gene (second expression vector), or the purpose This can be done by introducing a vector (co-expression vector) carrying a protein gene and ⁇ 1,4-GalT gene.
  • the first expression vector holds the target protein gene so that it can be expressed.
  • the second expression vector holds the ⁇ 1,4-GalT gene so that it can be expressed.
  • an Internal® Ribosome® Entry Site (IRES) sequence may be used for the construction of a co-expression vector.
  • the method (4) uses a transgenic bird in which the ⁇ 1,4-GalT gene is introduced instead of the target protein gene, and accordingly, the target protein gene is introduced into the fertilized egg instead of the ⁇ 1,4-GalT gene.
  • the method is the same as the method (1) except that Therefore, for the details, the above explanation regarding the method (1) is incorporated and omitted.
  • a further aspect of the present invention relates to a method for producing a protein using the transgenic bird of the present invention.
  • the target protein is recovered from the egg white of the transgenic bird of the present invention.
  • egg white is diluted with a buffer solution or distilled water, and then subjected to centrifugation, salting out (such as ammonium sulfate fractionation), and various chromatography. These methods may be used alone or in any combination.
  • a protein having a sugar chain is obtained. Therefore, a separation / purification method utilizing the binding property to a sugar chain, such as affinity chromatography using a lectin, is effective. You may decide to isolate
  • Glycosyltransferase gene expression analysis in chicken tissues ⁇ 1,4-Galactosyltransferase 1 is “GalT1”
  • ⁇ 1,4-Galactosyltransferase 2 is “GalT2”
  • ⁇ 1,4-Galactosyltransferase 3 is “GalT3”
  • ⁇ -galactoside ⁇ 2 , 6-sialyltransferase 1 is abbreviated as “ST6Gal1
  • ⁇ -galactoside ⁇ 2,3-sialyltransferase 4 is abbreviated as “ST3Gal4”
  • ⁇ -galactoside ⁇ 2,3-sialyltransferase 6 is abbreviated as “ST3Gal6”.
  • RNAiso To analyze the expression of galactose transferase and sialyltransferase genes, extract total RNA from each tissue of chicken laying eggs using Quick prep TM Total RNA extraction kit (GE Healthcare) or RNAiso (Takara Bio) did. About 50-150 mg of wet tissue was used. The operation followed the protocol attached to the kit. When RNAiso was used, DNase I (Takara Bio) treatment (20 U / sample) was further performed at 37 ° C. for 1 hour, and the total RNA was purified again using RNAiso. The amount of RNA was measured by absorption at a wavelength of 260 nm.
  • oligo dT primer By adding 5 p mole oligo dT primer to 800 ng (for sialyltransferase gene) and 3 ⁇ g (for galactosetransferase) total RNA, treating at 70 ° C for 10 minutes, and cooling on ice, annealing reaction Went.
  • a buffer attached to RevaTra Ace (trade name, Toyobo) and 2 mM dNTP were added, and the mixture was incubated at 42 ° C., and 100 U of RevaTra Ace was added to carry out reverse transcription to synthesize cDNA.
  • the amplified product was subjected to 2% agarose electrophoresis to confirm that non-specific amplification and primer dimer formation did not occur.
  • GalT1 was confirmed to be highly expressed in the liver and kidney, and in the oviduct enormous part, it was confirmed to be expressed at the same level as the brain.
  • GalT3 was confirmed to have high expression in the oviduct enormous area (FIG. 1A).
  • ST3Gal6 expression that produces ⁇ 2,3 bond in the oviduct enormous area is higher than that in the brain, and ST6Gal1 expression that produces ⁇ 2,6 bond is also compared in the brain (Fig. 1B).
  • microsomal fraction was suspended in 20 mM MES buffer (pH 6.5) and 2% Triton X-100 solution, and solubilized by sonication (30 seconds (1 second pulse), 2 times). The amount of protein contained in this solution was quantified by the Bradford method.
  • the antiserum prepared in (1) was used as a 1000-fold dilution, and the secondary antibody used was a goat anti-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology) 200 ⁇ g / 0.5 ml diluted 2,000-fold with a blocking solution.
  • the PVDF membrane was washed and washed with Tris buffered saline containing 0.05% Tween 20 (registered trademark) for 5 minutes ⁇ 3 times.
  • the PVDF membrane was reacted with Western Lightning TM Ceniluminescence Reagent Plus (Perkin Elmer), and the resulting luminescence was measured with a lumino image analyzer (Fuji Film, LAS-3000).
  • a lumino image analyzer Fluji Film, LAS-3000
  • PCR was performed using KOD-Plus-DNA Polymerase (Toyobo) under the following conditions and primers. ⁇ Conditions> After 94 ° C / 2 minutes, 30 cycles of 94 ° C, 15 seconds, 54 ° C, 30 seconds and 68 ° C, 1 minute 30 seconds ⁇ Primer> (1) Amino terminal forward: 5′-AAAGTCGACCATGAAGGAGCCGGCGCTGCCCGGCACC-3 ′ (SEQ ID NO: 27) reverse: 5'-CAGGTTCACAGGCTGGGAGAATTCCACGCG-3 '(SEQ ID NO: 28) (2) Carboxy terminal forward: 5'-GTGGAATTCTCCCAGCCTGTGAACCTGGA-3 '(SEQ ID NO: 29) reverse: 5'-AAAATCGATTAGCTGCCGGGCGCTCCGATA-3 '(SEQ ID NO: 30)
  • the obtained PCR product was excised after electrophoresis and purified by Mag Extractor -PCR & Gel clean up- (Toyobo).
  • the obtained PCR products were cleaved with SalI and EcoRI and EcoRI and ClaI, respectively, and then ligated with pBluescriptIIKS ( ⁇ ) (Stratagene) previously cleaved with SalI and ClaI to obtain pBlue / ⁇ 4Gal-T1.
  • the sequence was confirmed using a THERMO Sequenase TM II dye terminator cycle sequencing kit (GE Healthcare).
  • Plasmid pQMSCV / eG ⁇ AGalT1 encoding a GalT1-expressing retroviral vector by an actin promoter was prepared as follows.
  • the plasmid pQMSCV / eG ⁇ AGalT1 is a plasmid vector derived from the Q vector, has an MSCV LTR, expresses eGFP by the LTR, and GalT1 is deleted by a deletion type actin promoter (intron part deleted). To express. First, 5.
  • the vector pBlue / ⁇ 4Gal-T1 cloned from the chicken GalT1 prepared in step 1 was cleaved with Sal I and Cla I, 1.1 kb was excised, inserted into pQMSCV / eG ⁇ A LIG7H (TNF) cleaved with Sal I and Cla I, and the chicken GalT1
  • pQMSCV / eG ⁇ A LIG7H (TNF) cleaved with Sal I and Cla I
  • a plasmid pQMSCV / eG ⁇ AGalT1 encoding a replication-defective retrovirus vector that expresses the gene with a chicken triactin promoter was prepared (see Hotta, A. et al. (2006) J Biosci Bioeng 101, 361). This plasmid map is shown in FIG. 3A with the viral vector inserted into the chromosome.
  • the EcoRI and SalI sites of pMSCVneo (Clontech) contain EcoRI containing the eGFP gene, DNA containing XhoI ends, and XhoI and Sal containing the chicken triactin promoter (described in Non-Patent Document 13).
  • PMSCV / eG ⁇ A was constructed by binding DNA with I-terminus.
  • the anti-human TNF ⁇ antibody H chain variable region (US Pat. No. 5,698,195) is chemically synthesized downstream of the mouse IgG H chain signal sequence (NCBI M59921) and bound to the IgG1 constant region C ⁇ 1 A TNF ⁇ heavy chain gene was obtained.
  • Anti-human TNF ⁇ antibody L chain variable region (US Pat. No.
  • mice IgG L chain signal sequence downstream of mouse IgG L chain signal sequence (NCBI AF201961) is chemically synthesized and bound to the constant region C ⁇ of ⁇ chain
  • the TNF ⁇ light chain gene was obtained.
  • Synthetic L chain gene, synthetic IRES sequence forward: 5'-TCGAC- (TTCTGACATCCGGCGGGT) 7 -GACTCACAACCCCAGAAACAGACATCGC-3 '(SEQ ID NO: 31) and reverse: 5'-GGCCGCGATGTCTGTTTCTGGGGTTGTGAGTC- (ACCCGCCGGATGTCAGAA) 7 -G (SEQ ID NO: 32)
  • the synthesized H chain sequence was inserted downstream of the promoter of pMSCV / eG ⁇ A to prepare pMSCV / eG ⁇ ALIG7H (TNF).
  • pMSCV / eG ⁇ ALIG7H was cleaved with KpnI and inserted into a pQMSCV vector cleaved with KpnI to prepare pQMSCV / eG ⁇ A LIG7H (TNF).
  • GalT1-expressing viral vector with actin promoter In order to prepare a retrovirus from the vector construct pQMSCV / eG ⁇ AGalT1 prepared in step 1, GP293 cells (Clontech) were cultured using a DMEM medium in a culture dish having a diameter of 100 mm. GP293 cells were transfected with 11 ⁇ g of plasmid pQMSCV / eG ⁇ AGalT1 and 11 ⁇ g of plasmid pVSV-G (Clontech) by the lipofection method until 90% confluence.
  • the supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m cellulose acetate filter (Advantech), and then centrifuged at 25,000 rpm at 4 ° C. for 1.5 hours. The supernatant was discarded and the precipitate was dissolved in TNE (50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 130 mM NaCl, 1 mM EDTA) to obtain a virus solution.
  • TNE 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 130 mM NaCl, 1 mM EDTA
  • the virus titer was measured as follows. 1.5 ⁇ 10 4 cells were planted culture to the day before in NIH3T3 cells (American Type Culture obtained from the collection) the 24 well dishes of measurement. Replace 1 ml of virus solution diluted with DMEM containing 10 ⁇ g / ml polybrene 10 2 to 10 6 times with the cell culture medium, and after 48 hours, measure the percentage of cells expressing eGFP with a fluorescence microscope. The titer was determined by the calculation formula.
  • Virus titer (cfu / ml) cell number ⁇ dilution rate ⁇ expression ratio
  • the titer of the high titer virus solution obtained in 7 was measured in this way, and it was 4 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 9 cfu / ml. It was.
  • Retrovirus Injection into Chicken Embryo and Embryo Culture A fertilized egg obtained by mating a transgenic chicken (Non-patent Document 13) expressing a single-chain antibody systemically with an actin promoter was used. Chicken fertilized eggs sterilized with 70% ethanol in an incubator (Showa Franchi P-008) equipped with an automatic turning device for approximately 55 hours at 38 ° C and 65% humidity at 15 ° angle once every 15 minutes Embryos were generated by incubating while turning. The sharp end was cut into a 3.5 cm diameter circle with a diamond cutter to expose the embryo. 6.
  • the glass tube (Narishige GD-1) with a micropipette maker (Narishige PC-10) and fold the tip so that the outer shape is about 20 ⁇ m. While observing the embryo with a stereomicroscope, the embryo was stabbed in the direction along the bloodstream, and about 2 ⁇ l was injected using a microinjector (Eppendorf, Transjector 5246). This egg was filled with egg white up to the cut end of the eggshell, and then covered with a PTFE membrane (Millipore, Milliwrap) and polyvinylidene chloride wrap (Asahi Kasei, Saran Wrap) using the egg white as glue.
  • a PTFE membrane Micropore, Milliwrap
  • polyvinylidene chloride wrap Asahi Kasei, Saran Wrap
  • Fertilized eggs injected with the virus were incubated with an incubator until the end of the injection of all the eggs. Then, the egg white and yolk of the fertilized egg into which the virus was injected were transferred to a shell in which the chicken LL egg was disinfected with 70% ethanol and the blunt end was cut into a circle with a diameter of 4.5 cm with a diamond cutter and the contents were removed. After adding 0.5 ml of a turbid calcium lactate solution (50 mg / ml), the egg white was glued and covered with polyvinylidene chloride wrap (Saran Wrap, Asahi Kasei). Embryos transferred to chicken LL eggs were incubated while being turned at an angle of 30 degrees every 15 minutes in an incubator with an automatic turning device.
  • a turbid calcium lactate solution 50 mg / ml
  • Genomic DNA was obtained from chicks, allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then kept at 4 ° C. overnight. Genomic DNA was obtained from the clot from which serum was removed by centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes using MagExtactor-Genome- (Toyobo). The operation followed the protocol attached to the kit. DNA concentration was measured by absorbance at 280 nm.
  • Non-patent Document 13 Assay of blood copy number of transgenic avian embryos
  • the pMSCVG ⁇ AscFvFc vector (Non-patent Document 13), which was originally introduced, is not present.
  • the eGFP gene present in the introduced pQMSCV / eG ⁇ AGalT1 is quantified by real-time PCR and copied. The number was determined.
  • the primers used were Forward: 5′-CGGCAACTACAAGACCCGC-3 ′ (SEQ ID NO: 33) and Reverse: 5′-GAAGTTCACCTTGATGCCGTTC-3 (SEQ ID NO: 34).
  • PCR was performed in 45 cycles of 50 ° C, 2 minutes, 95 ° C, 2 minutes, 94 ° C, 5 seconds, 58 ° C, 10 seconds, 72 ° C, 10 seconds.
  • 20 ng of genomic DNA obtained from clots of autoclaved and UV-sterilized Milli Q (registered trademark) water and non-introduced chicken was used as a negative control.
  • a standard curve was prepared using a transgenic chicken genome with a known copy number. The operation followed the protocol. As a result of the test, the number of transgene copies in blood of the born chimeric chicken was 0.2 to 2.2 (FIG. 4).
  • Egg white sample was prepared as follows. Egg white was diluted 10 times with PBS and sonicated (30 seconds) to reduce the viscosity of the sample. SDS-PAGE sample buffer was added to this solution and heat denatured, and subjected to lectin blot analysis (described later). Purification of the recombinant antibody from egg white was performed as follows. The egg white was loosened with a stirrer for 15 minutes, 5 volumes of Milli Q (registered trademark) water was added, and the mixture was stirred at room temperature.
  • Milli Q registered trademark
  • the pH was adjusted to 5.0 with 1 M HCl, and the mixture was further stirred for 15 minutes. Centrifugation (7,300 rpm, 4 ° C., 20 minutes) was performed to collect the supernatant. The collected supernatant was passed through a 0.45 ⁇ m filter and applied to 1 ml of a protein G column (GE Healthcare) using FPLC. The operation was performed as follows. About 80 ml of the above sample was allowed to flow on a column equilibrated with binding buffer (10 mM phosphate buffer (pH 7.4)) at a flow rate of 2 ml / min, followed by elution buffer (100 mM Glycine-HCl).
  • binding buffer (10 mM phosphate buffer (pH 7.4)
  • RCA120 was diluted to 1 ⁇ g / ml with Tris buffered saline containing 0.05% Tween 20 (registered trademark) containing 1% BSA, and reacted with the membrane at 4 ° C. overnight. Subsequently, mouse anti-RCA120 antiserum obtained by immunizing BALB / c mice was diluted 1,000 times with Tris buffered saline containing 0.05% Tween 20 (registered trademark) containing 1% BSA, and the membrane and room temperature, 2 Reacted for hours.
  • the membrane is immersed in an antibody removal buffer (250 mM Glycine-HCl (pH 2.5), 1% SDS) to remove the lectin and the antibody, and Tris containing 0.05% Tween 20 (registered trademark) containing 1% skim milk. Blocking was performed overnight in buffered saline at 4 ° C., and Western blotting was performed with an anti-human Fc antibody in the same manner as above to confirm the amount of antibody protein migrated. As a result of the analysis, in the GalT1 gene non-introduced individual, galactose is not added to the egg white endogenous protein (FIG.
  • SSA Sudbucus sieboldiana lectin (Seikagaku Corporation, 300177) was diluted to 1 ⁇ g / ml with Tris-buffered saline containing 0.05% Tween 20 (registered trademark) containing 1% BSA, and the membrane and room temperature. The reaction was performed for 2 hours. Subsequently, the mouse anti-SSA antiserum obtained by immunizing BALB / c mice was diluted 1,000 times with Tris buffered saline containing 0.05% Tween 20 (registered trademark) containing 1% BSA, and the membrane and room temperature, 2 Reacted for hours.
  • SSA Sudbucus sieboldiana
  • a point electrophoresis apparatus NA-1410 type (Nippon Aido) was used. Electrophoresis was performed at 10 ° C.
  • a small amount (about 500 ⁇ l) of low-viscosity silicone oil (Shin-Etsu Chemical, KF-96L-5CS) is hung on the tray, and the gel cut into 11 cm x 8 cm is placed on the film with the film facing down.
  • Electrode filter paper soaked with each electrode buffer solution was set at a position about 5 mm from the top.
  • 1 M H 3 PO 4 was used for the anode buffer and 1 M NaOH for the cathode buffer. Place the platinum electrode on top of the filter paper so that it is in close contact with the gel, and keep the gel at 10 ° C, perform pre-electrophoresis at 200-400 V, 8 mA, 60 minutes (the voltage gradually increased), and sample application piece ( GE Healthcare) was placed on the gel and each sample was applied at 1.25 ⁇ g. IEF marker 3-10 (Selva) was used as a marker. After the application, electrophoresis was performed at 500-600 V, 2 mA, 90 minutes (the voltage was gradually increased. Sample application pieces were removed 30 minutes after the start of the electrophoresis).
  • the gel was separated using Film Remover (GE Healthcare). Since the gel is very fragile, it was covered with PVDF membrane on Film Remover. Thereafter, using a WB transfer device, the membrane was transferred to the membrane at 80 mA / membrane for 1 hour. After transfer, carefully separate the membrane from the gel, block with Tris buffered saline containing 0.05% Tween 20 (registered trademark) containing 1% skim milk, and 19. In the same manner as described above, the anti-human Fc antibody was detected. As a result of analysis, an acidic (anode) side band disappeared by sialidase was observed. The amount was small, and the same band was observed in the antibody purified from the egg white of the Gal T1-non-introduced chicken (FIG. 9).
  • Tween 20 registered trademark
  • pETBlue2 / EMCV-IRES pETBlue 2 cleaved by Sma I and Eco RV from EMCV-derived internal ribosome entry site (IRES) sequence from pMSCV / eGCMV H-IRES-L (TNF). Ligated with the vector to prepare pETBlue2 / EMCV-IRES.
  • PMSCV / eGCMV H-IRES-L (TNF) was prepared as follows.
  • Retroviral Vector pMSCV / G ⁇ AhEPO-IRES-GalT-W that Simultaneously Expresses Human Erythropoietin and GalT1 by Actin Promoter
  • the GalT1 gene was excised from pETBlue2 / GalT1 with Sse 8387I and MluI.
  • the IRES sequence was cut out from pETBlue2 / EMCV-IRES with Sse8387 I and Mlu I.
  • PMSCV / G ⁇ AhEPO-IRES-GalT-W (FIG.
  • Hatching rate of transgenic avian embryos 40 embryos were introduced into chicken embryos twice, and embryos introduced with a replication-defective retrovirus vector were hatched. Eight birds hatched and the hatching rate averaged 20% (FIG. 10B).
  • Rabbit anti-human erythropoietin antibody (R & D Systems, AB-286-NA) 1 mg / ml diluted 1000 times as primary antibody, goat anti-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology) 400 ⁇ g / ml as secondary antibody The ml diluted 2000 times was used. Since the elution buffer contained a high concentration of salt, it was desalted with a PD-10 column (GE Healthcare). The operation was in accordance with the protocol attached to the column. In addition, human erythropoietin (Non-patent Document 14) produced in the egg white of a GalT1 non-expressing transgenic chicken was used as a comparison target.
  • a useful protein having a sugar chain that is the same as or close to the natural type can be produced.
  • the useful protein can be expected to dramatically extend the half-life in the body.
  • this invention brings about the improvement of the medicinal effect of the protein utilized as a pharmaceutical, and the dosage reduction accompanying it.
  • the present invention it is possible to add a sugar chain structure or modify a sugar chain that does not exist in a natural protein. That is, the present invention is useful as a means for producing a protein having an artificial sugar chain structure.

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Abstract

　糖鎖構造が改善された外来タンパク質を卵白中へ産生するトランスジェニック鳥類を提供する。目的タンパク質をコードする遺伝子と、β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を導入し、β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子が輸卵管膨大部で発現するトランスジェニック鳥類を得る。

Description

トランスジェニック鳥類及びその作製法、並びにタンパク質の生産法
　本発明はトランスジェニック鳥類に関する。詳しくは、糖鎖付加型タンパク質の生産に有用なトランスジェニック鳥類、該トランスジェニック鳥類の作製法、及び該トランスジェニック鳥類を用いたタンパク質の生産法に関する。
　トランスジェニック動物を用いて医薬品等の有用タンパク質を生産する技術（いわゆる動物工場）の実用化が進められている。ヤギやヒツジなどの大型哺乳動物に比べ、鳥類（特にニワトリやウズラに代表される家禽類）は、性成熟の期間が短いこと、小型で管理が容易なこと、高いタンパク質含量の卵を高頻度で産むことなど、数多くの有利な特徴を有し、次世代の動物工場の主力として期待されている。ニワトリについては、タンパク質へのシアル酸付加パターンがヒトのものに類似するという利点も併せもつ（非特許文献１）。
　トランスジェニック鳥類の作製に関して様々な試みが行われている（非特許文献２）。例えば、レトロウイルスベクターを用いて放卵後の胚盤葉期の胚に外来遺伝子を注入する方法（非特許文献３～７）、１細胞期の受精卵の核にDNA等を直接注入する方法（非特許文献８、９）、レンチウイルスベクターを利用した方法（非特許文献１０、１１）、ES細胞を利用した方法（非特許文献１２）等が報告されている。また、トランスジェニック鳥類を用いて医薬用タンパク質の生産に成功したとの報告もある。一方、タンパク質の効率的な生産に向けた技術開発も精力的に行われている（特許文献１、非特許文献１３）。また、本発明者らの研究グループは、ヒトエリスロポエチンを高生産するキメラニワトリの作製に成功したことを報告した（非特許文献１４）。当該キメラニワトリが卵白中に生産するヒトエリスロポエチンは、in vitroにおいて、組換えCHO細胞が生産するヒトエリスロポエチンと同等の活性を示した。
国際公開第２００４／０１６０８１号パンフレット
Raju, T. S et al. Glycobiology 10 (2000) 477-486. Sang, H. Mech. Dev. 121 (2004) 1179-1186. Bosselman, R. A. et al. Science 243 (1989) 533-535. Harvey, A. J.et al. Nat. Biotechnol. 20 (2002) 396-399. Mizuarai, S. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 286 (2001) 456-463. Rapp, J. C. et al. Transgenic Res. 12 (2003) 569-575. Thoraval, P. et al. Transgenic Res. 4 (1995) 369-377. Love, J. et al. Biotechnology 12 (1994) 60-63. Sherman, A. et al. Nat. Biotechnol. 16 (1998) 1050-1053. Chapman, S. C. et al. Development 132 (2005) 935-940. McGrew, M. J. et al. EMBO Rep. 5 (2004) 728-733. Zhu, L. et al. Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1159-1169. Kamihira, M. et al. J. Virol. 79 (2005) 10864-10874. Kodama, D. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367(2008)834-839. Kawabe, Y. et al. J. Biosci. Bioeng 102 (2006) 297-303. Williams, J. Biochem. J. 108 (1968) 57-67.
　医薬品などに用いるタンパク質の多くはO-グリコシル化又はN-グリコシル化などの糖鎖修飾を受けている。これら糖鎖修飾は当該タンパク質の血中半減期や薬効に重要であると考えられている。過去の報告（非特許文献１２、非特許文献１４）を総合すると、トランスジェニック鳥類の卵白へ特定のタンパク質を生産した場合、グリコシル化が起きにくく、不完全な糖鎖修飾となることが予想される。このような不完全な糖鎖修飾は、タンパク質本来の機能を損なう原因となる。
　そこで本発明は、糖鎖構造が改善された外来タンパク質を卵白中に生産するトランスジェニック鳥類及びその作製法、並びに当該トランスジェニック鳥類を利用した有用タンパク質の生産法を提供することを課題とする。
　上記課題に鑑み、種々の実験を行った。まず、モデル抗体（scFv-Fc）を生産するトランスジェニックニワトリ及びトランスジェニックウズラを作製し（非特許文献１３、非特許文献１５）、卵白中に生産された抗体の糖鎖修飾について解析した。その結果、末端シアル酸とその内側のガラクトースを有する糖鎖がほとんどないことが判明した（図７Ｂ、図８）。内在性の卵白タンパク質も同様に不完全な糖鎖しか持たないことからすると（図７Ａ、非特許文献１６）、このような現象の原因は、卵白タンパク質を生産する組織である輸卵管の特徴にあると考えられた。そこで、輸卵管膨大部における糖鎖付加機構を解析した。その結果、輸卵管膨大部ではガラクトース転移酵素の発現が極めて弱いことが明らかとなった。以上の知見に基づき、望ましい糖鎖修飾を実現することを目的として、輸卵管膨大部でガラクトース転移酵素遺伝子を強制発現させるという戦略を立てた。この戦略の有効性及び実効性を確認すべく、ガラクトース転移酵素遺伝子を導入したトランスジェニックニワトリを作製し、卵白中に生産させた抗体の糖鎖修飾を解析した。解析結果は、ガラクトースが付加されたことを示すものであった。即ち、上記戦略の有効性及び実効性が実験的に確認された。
　本発明は、以上の成果及び知見に基づくものであり、次の通りである。
　［１］目的タンパク質を卵白中に生産するトランスジェニック鳥類であって、目的タンパク質をコードする遺伝子と、β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子とが導入されていることを特徴とするトランスジェニック鳥類。
　［２］β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子が輸卵管膨大部で発現している、［１］に記載のトランスジェニック鳥類。
　［３］β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子がニワトリβ1,4-ガラクトース転移酵素１遺伝子である、［１］又は［２］に記載のトランスジェニック鳥類。
　［４］目的タンパク質の天然型が糖鎖付加型タンパク質である、［１］～［３］のいずれか一項に記載のトランスジェニック鳥類。
　［５］目的タンパク質が抗体である、［１］～［４］のいずれか一項に記載のトランスジェニック鳥類。
　［６］（１）～（４）からなる群より選択される方法によって得られるトランスジェニック鳥類又はその子孫である、［１］～［５］のいずれか一項に記載のトランスジェニック鳥類、
（１）少なくとも片方が、目的タンパク質をコードする遺伝子を生殖細胞に保有する雌雄二羽の同種鳥類を用意するステップと、該雌雄二羽の同種鳥類を交配して得られた受精卵を孵卵するステップと、形成された初期胚に対してβ1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を導入し、染色体への該遺伝子の挿入を生じさせるステップと、を含む方法、
（２）目的タンパク質をコードする遺伝子を生殖細胞に保有する鳥類と、β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を生殖細胞に保有する同種異性鳥類を用意するステップと、該二羽の鳥類を交配して得られた受精卵を孵卵するステップと、を含む方法、
（３）鳥類受精卵を孵卵するステップと、形成された初期胚に対して目的タンパク質をコードする遺伝子とβ1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を導入し、染色体への該二つの遺伝子の挿入を生じさせるステップと、を含む方法、
（４）少なくとも片方が、β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を生殖細胞に保有する雌雄二羽の同種鳥類を用意するステップと、該雌雄二羽の同種鳥類を交配して得られた受精卵を孵卵するステップと、形成された初期胚に対して目的タンパク質をコードする遺伝子を導入し、染色体への該遺伝子の挿入を生じさせるステップと、を含む方法。
　［７］遺伝子の導入が、該遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターのインジェクションによって行われる、［６］に記載のトランスジェニック鳥類。
　［８］レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、［７］に記載のトランスジェニック鳥類。
　［９］鳥類がニワトリである、［１］～［８］のいずれか一項に記載のトランスジェニック鳥類。
　［１０］その片方又は両方の生殖細胞に、目的タンパク質をコードする遺伝子が導入されている雌雄二羽の同種鳥類を用意するステップと、該雌雄二羽の同種鳥類を交配して得られた受精卵を孵卵するステップと、形成された初期胚にβ1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を導入し、染色体への該遺伝子の挿入を生じさせるステップと、を含む、トランスジェニック鳥類の作製法。
　［１１］以下の（１）又は（２）の交配を行うことを特徴とする、トランスジェニック鳥類の作製法、
（１）［１０］に記載の作製法によって得られた雄トランスジェニック鳥類と、［１０］に記載の作製法によって得られた雌トランスジェニック鳥類との交配、
（２）［１０］に記載の作製法によって得られたトランスジェニック鳥類と、同種異性の野生型鳥類との交配。
　［１２］［１］～［９］のいずれか一項に記載のトランスジェニック鳥類の卵白から目的タンパク質を回収することを特徴とする、タンパク質の生産法。
ニワトリ糖転移酵素の遺伝子発現解析。ニワトリ各臓器におけるガラクトース転移酵素（Ａ）及びシアル酸転移酵素（Ｂ）の発現をリアルタイムRT-PCRにより解析した。発現は、脳での発現を基準として相対的に示した。卵白成分を生産する輸卵管膨大部においてはガラクトース転移酵素GalT1の発現が低いことが示された。輸卵管膨大部ではシアル酸転移酵素のうちST3Gal6の発現が高いことが示された。 ニワトリガラクトース転移酵素１（GalT1）のタンパク質発現解析。ニワトリ肝臓及び輸卵管膨大部におけるGalT1のタンパク量をミクロソーム画分のウエスタンブロットにより解析した。 GalT1のバンドを矢印で示した。肝臓に比べ輸卵管膨大部でのGalT1タンパク量が低いことが確認された。 ガラクトース転移酵素強発現トランスジェニックニワトリの作製。（Ａ）遺伝子導入したレトロウイルスベクターの構造を示す。本ベクターコンストラクトでは、アクチンプロモーターにより全身でガラクトース転移酵素（GalT1）を発現することが可能である。LTR：Long terminal repeat、eGFP：enhanced GFP、Pβact：ニワトリβ-actin プロモーター、ckGalT1：ニワトリβ1,4-Galactosyltransferase 1。（Ｂ）トランスジェニックニワトリ作製実験の概要。一本鎖抗体生産トランスジェニックニワトリの卵を2.5日間孵卵し、発生を進めた胚（55時間胚）の心臓にウイルスベクターを注入した。5回の導入実験で計164胚に導入し、41羽(25%)のGalT1遺伝子導入キメラニワトリが得られた。 ガラクトース転移酵素導入ニワトリにおける血中のトランスジーンコピー数の算出。G0世代のガラクトース転移酵素導入キメラニワトリ（メス）の血中における導入ウイルスベクター遺伝子のコピー数を、リアルタイムPCRにて検定した。図３Ａに示すウイルスベクターに特異的な配列を認識するプライマーを設計し、解析を行った。WT：非導入個体。 ガラクトース転移酵素導入ニワトリにおけるGalT1遺伝子のタンパクレベルでの発現解析。輸卵管膨大部でのGalT1の発現をミクロソーム画分のウエスタンブロットにより解析した。非導入（野生型）、遺伝子導入（♯77、♯78）ニワトリを比較した。GalT1のバンドを矢印で示した。リアルタイムPCRにより測定した導入遺伝子の輸卵管膨大部におけるコピー数を下に示した。輸卵管膨大部での導入コピー数の高い個体（♯77）において遺伝子発現がタンパク質レベルで確認できた。 ガラクトース転移酵素導入ニワトリの解析。（Ａ）リアルタイムRT-PCRによる輸卵管膨大部での遺伝子発現解析。発現は、非導入（野生型）個体での発現を基準として相対的に示した。非導入（野生型）個体に比べ遺伝子導入個体（♯77、♯78）では、導入したGalT1遺伝子の強発現がmRNAレベルで確認された。一方で、内在性の遺伝子発現（ST6Gal1）には有意な変動は観察されなかった。（Ｂ）組織抽出液のミクロソーム画分におけるガラクトース転移活性の測定。酵素反応の結果生成したN-アセチルラクトサミン（Gal-GlcNAC）のバンドを矢印で示した。非導入個体（野生型）の輸卵管膨大部においてはガラクトース転移酵素活性が検出されないのに対し、遺伝子導入個体（♯77、♯78）においては活性が認められた。 ニワトリにより生産された内在性卵白タンパク質、及びモデル抗体の糖鎖解析（ガラクトース付加の解析）。ガラクトース特異的レクチン（RCA120）への結合性によって、ガラクトース付加を確認した。（Ａ）内在性タンパク質に結合したガラクトースの解析（RCA120レクチンブロット、上段）。非導入 (抗体遺伝子なし及び野生型) 個体の卵白タンパク質にはガラクトースが存在しないが、GalT1遺伝子導入個体（♯68、♯72、♯77、♯79、♯82）の卵白タンパク質にはガラクトースの結合が示された。等量のタンパク質が存在することをCBB染色により確認した（下段）。陽性対照として卵黄サンプルを用いた。また、抗体遺伝子、ガラクトース転移酵素遺伝子ともに導入していないニワトリ（抗体遺伝子なし）由来の卵白タンパク質も解析した。（Ｂ）卵白より精製したモデル抗体に結合したガラクトースの解析（RCA120レクチンブロット、上段）。非導入（野生型）個体の卵白由来の抗体はRCA120と全く結合しないのに対し、遺伝子導入個体（♯72、♯82）の卵白由来の抗体はRCA120と強く結合した。β－ガラクトシダーゼによりガラクトースを除去したサンプルについても解析した。等量のタンパク質が存在することを抗Fc抗体を用いたウエスタンブロットにより確認した（下段）。対照として、CHO細胞で生産させたモデル抗体を同様にして解析した。抗体のバンドを矢印で示した。NF:ノイラミニダーゼ、βGal：β－ガラクトシダーゼ。 ガラクトース転移酵素導入ニワトリにより生産されたモデル抗体の糖鎖解析（末端シアル酸の解析１）。α2,6結合のシアル酸付加の有無を特異的レクチン（SSA）により確認した（上段）。GalT1遺伝子導入の有無にかかわらず、α2,6結合のシアル酸付加を示すバンドは認められなかった。等量のタンパク質が存在することを抗Fc抗体を用いたウエスタンブロットにより確認した（下段）。卵黄由来の抗体はシアル酸が結合していることが知られることから、比較対照として用いた。（分子量の低下は部分分解による。）また、多量のシアル酸含有糖鎖を含むタンパク質であるトランスフェリンも比較対象とした。 ガラクトース転移酵素導入ニワトリにより生産されたモデル抗体の等電点電気泳動による解析（末端シアル酸の解析２）。精製した抗体を等電点電気泳動により解析した。シアル酸が結合すると酸性(陽極)側へのシフトが見られる。シアリダーゼ（NF）処理により消失するバンド（矢印）がシアル酸付加抗体のバンドと考えられる。 ガラクトース転移酵素強発現ヒトエリスロポイエチン生産トランスジェニックニワトリの作製。（Ａ）遺伝子導入したレトロウイルスベクターの構造を示す。本ベクターコンストラクトでは、アクチンプロモーターにより全身でヒトエリスロポイエチンを発現することが可能である。また、IRESの効果により同一のmRNAから同時にガラクトース転移酵素（GalT1）を生産する。LTR：Long terminal repeat、Pβact：ニワトリβ-actin プロモーター、hEPO：ヒトエリスロポイエチン、IRES：Internal Ribosome Entry Site、 ckGalT1：ニワトリβ1,4-Galactosyltransferase 1、WPRE：Woodchuck posttranscriptional element。（Ｂ）トランスジェニックニワトリ作製実験の概要。ニワトリ受精卵を2.5日間孵卵し、発生を進めた胚（55時間胚）の心臓にウイルスベクターを注入した。2回の導入実験で計40胚に導入し、8羽(20%)の遺伝子導入キメラニワトリが得られた。 作製したガラクトース転移酵素強発現ヒトエリスロポイエチン生産トランスジェニックニワトリの卵白中に生産されたヒトエリスロポイエチンの解析。（Ａ）抗ヒトエリスロポイエチン抗体を用いたウエスタンブロット法による解析。（Ｂ）卵白より精製したヒトエリスロポイエチンに結合したガラクトースの解析（RCA120レクチンブロット）。エリスロポイエチン単独で導入した個体（非特許文献１４; GalT1-）の卵白由来のエリスロポイエチンはRCA120と全く結合しないのに対し、GalT1遺伝子を同時に導入した個体（GalT1+）の卵白由来のエリスロポイエチンはRCA120と強く結合した。NF:ノイラミニダーゼ、βGal：β－ガラクトシダーゼ。
（トランスジェニック鳥類）
　本発明の第１の局面は目的タンパク質を卵白中に生産するトランスジェニック鳥類に関する。本発明のトランスジェニック鳥類には二つの外来遺伝子、即ち目的タンパク質をコードする遺伝子と、β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子が導入されている。尚、目的タンパク質をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック鳥類と、β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を導入したトランスジェニック鳥類との交配によって、同一個体に当該二つの遺伝子が導入されている場合も含む。本明細書では、説明の便宜上、「目的タンパク質をコードする遺伝子」のことを「目的タンパク質遺伝子」、「β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子」のことを「β1,4-GalT遺伝子」とも呼ぶ。
　「目的タンパク質」とは、本発明のトランスジェニック鳥類によって生産することが意図されたタンパク質である。好ましい目的タンパク質は、その天然型が糖鎖付加型のタンパク質である。このようなタンパク質を目的タンパク質とした場合、本発明のトランスジェニック鳥類によれば、天然型と同一又は天然型に近似した糖鎖構造を有するタンパク質を生産することができる。
　一方、目的タンパク質は上記の如きタンパク質に限定されるものではない。本来は糖鎖を有しないタンパク質を目的タンパク質とすれば、糖鎖が付加された改変型タンパク質を生産することが可能である。このように、タンパク質改変の手段としても本発明のトランスジェニック鳥類は有用である。
　その天然型が糖鎖付加型のタンパク質の例を挙げると、抗体、エリスロポエチン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、サイトカインである。ここでの抗体の好ましい形態は天然に広く存在する二本鎖抗体やscFv及びscFv-Fcである。免疫グロブリンIgGの可変領域にはFv（Fragment of variable region）と呼ばれる、VH及びVLのヘテロ二量体からなるドメインがある。このFvドメインはIgGの約5分の1の分子量でありながら、単独で充分な抗原結合能を持つ。VH、VLドメイン間を人工的にペプチドリンカーで結合したものがscFvと呼ばれる低分子抗体である。このscFvにFc領域を連結したものがscFv-Fcである。Fc領域として好ましくはヒトIgGクラス由来のものを使用する。
　Powersら（Powers,D.B.ら（2000）J Immunol Method 251,123）は、scFvにヒトIgG1に由来するFc部を融合させることで、血中での安定性が増すことを見出した。このscFv-Fc抗体は医療用として有望視されている。
　抗体の由来（動物種）は特に限定されない。但し、好ましくはヒト型抗体、ヒト抗体又はヒトキメラ抗体である。抗体が認識する抗原も特に限定されない。抗原の例としてCD2、CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD20、CD21、CD34、CD40、CD40L、CD80、HLAクラスII抗原、CD56（NK細胞）、CD86、CD161、TCRαβ、TCRγδ、iNKT、プリオンを挙げることができる。
　本発明のトランスジェニック鳥類は、体細胞にモザイク状に導入遺伝子（即ち、目的タンパク質遺伝子及びβ1,4-GalT遺伝子）を保有する個体（即ちキメラ）であっても、全身の体細胞に導入遺伝子を保有する個体であってもよい。また、片方の導入遺伝子に関してのみキメラであってもよい。
　ここで、受精卵に遺伝子導入して得られる鳥類はキメラ個体として成長する。この一世代目の遺伝子導入鳥類をG0トランスジェニックキメラ鳥類と呼ぶ。生殖細胞が導入遺伝子を保有するG0トランスジェニックキメラ鳥類を親とし、全身の体細胞に導入遺伝子を保有する子孫はG1トランスジェニック鳥類と呼ばれる。また、導入遺伝子を受け継ぐ、G1トランスジェニック鳥類の子孫は世代順にG2トランスジェニック鳥類、G3トランスジェニック鳥類、G4トランスジェニック鳥類・・・Gnトランスジェニック鳥類（nは整数）と呼ばれる。
　本明細書では、G0トランスジェニックキメラ鳥類及びその子孫（G1トランスジェニック鳥類など）を総称してトランスジェニック鳥類と呼ぶ。
　鳥類の種は特に限定されない。本発明の鳥類として、ニワトリ、ウズラ、七面鳥、カモ、ダチョウを例示できる。中でもニワトリやウズラは、入手が容易である点、産卵種としても多産である点などから特に好ましい。
　好ましい一態様では、導入遺伝子であるβ1,4-GalT遺伝子が、卵白タンパク質の分泌器官である輸卵管膨大部で発現している。この特徴により、糖鎖構造が改善された目的タンパク質を効率的に卵白中へ分泌させることが可能となる。
　トランスジェニック鳥類の体内においてβ1,4-ガラクトース転移活性を示すタンパク質をコードする限り、β1,4-GalT遺伝子の種類、配列等は特に限定されない。β1,4-GalT遺伝子の例はβ1,4-ガラクトース転移酵素１（GalT1）遺伝子、β1,4-ガラクトース転移酵素２（GalT2）遺伝子、β1,4-ガラクトース転移酵素３（GalT3）遺伝子である。これらの遺伝子の塩基配列の例を、添付の配列表に示す（ニワトリGalT1遺伝子（配列番号１）、ニワトリGalT2遺伝子（配列番号２）、ニワトリGalT3遺伝子（配列番号３））。尚、これらの塩基配列は一例であり、当該塩基配列と部分的に相違する塩基配列であっても、β1,4-ガラクトース転移活性を有するタンパク質をコードする限りにおいてβ1,4-GalT遺伝子として用いることができる。また、ニワトリ以外の種の遺伝子を用いることにしてもよい。
ニワトリ以外の種の遺伝子の例は、ヒト又はマウスのβ1,4-ガラクトース転移酵素１（GalT1）遺伝子、β1,4-ガラクトース転移酵素２（GalT2）遺伝子、β1,4-ガラクトース転移酵素３（GalT3）、β1,4-ガラクトース転移酵素５（GalT5）である。これらの遺伝子の塩基配列の例を、添付の配列表に示す（ヒトβ1,4-ガラクトース転移酵素１（配列番号４）、ヒトβ1,4-ガラクトース転移酵素２（配列番号５）、ヒトβ1,4-ガラクトース転移酵素３（配列番号６）、ヒトβ1,4-ガラクトース転移酵素５（配列番号７）、マウスβ1,4-ガラクトース転移酵素１（配列番号８）、マウスβ1,4-ガラクトース転移酵素２（配列番号９）、マウスβ1,4-ガラクトース転移酵素３（配列番号１０）、マウスβ1,4-ガラクトース転移酵素５（配列番号１１））。
　既述の通り、本発明者らの検討の結果、輸卵管膨大部ではGalT1遺伝子及びGalT2遺伝子の発現量が低いことが明らかとなった。また、GalT1については他の組織に比べて発現量が顕著に低いことが明らかとなった。この知見に鑑み、β1,4-GalT遺伝子として、好ましくはGalT1遺伝子又はGalT2遺伝子、更に好ましくはGalT1遺伝子を用いる。尚、二種類以上のβ1,4-GalT遺伝子を併用することにしてもよい。
　典型的には、本発明のトランスジェニック鳥類は、以下の（１）～（４）のいずれかの方法によって得られるトランスジェニック鳥類又はその子孫である。
　（１）少なくとも片方が、目的タンパク質をコードする遺伝子を生殖細胞に保有する雌雄二羽の同種鳥類を用意するステップと、該雌雄二羽の同種鳥類を交配して得られた受精卵を孵卵するステップと、形成された初期胚に対してβ1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を導入し、染色体への該遺伝子の挿入を生じさせるステップと、を含む方法
　（２）目的タンパク質をコードする遺伝子を生殖細胞に保有する鳥類と、β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を生殖細胞に保有する同種異性鳥類を用意するステップと、該二羽の鳥類を交配して得られた受精卵を孵卵するステップと、を含む方法
　（３）鳥類受精卵を孵卵するステップと、形成された初期胚に対して目的タンパク質をコードする遺伝子とβ1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を導入し、染色体への該二つの遺伝子の挿入を生じさせるステップと、を含む方法
　（４）少なくとも片方が、β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を生殖細胞に保有する雌雄二羽の同種鳥類を用意するステップと、該雌雄二羽の同種鳥類を交配して得られた受精卵を孵卵するステップと、形成された初期胚に対して目的タンパク質をコードする遺伝子を導入し、染色体への該遺伝子の挿入を生じさせるステップと、を含む方法
　（１）の方法ではまず、少なくとも片方が目的タンパク質遺伝子を生殖細胞に保有する雌雄二羽の同種鳥類を用意する。ここでの「鳥類」は、目的タンパク質遺伝子を生殖細胞に保有する限り、特に限定されない。目的タンパク質遺伝子に関してキメラ個体であってもよいが、効率的に目的のトランスジェニック鳥類を得るため、G1世代以降のトランスジェニック個体であることが好ましい。G1世代以降のトランスジェニック個体を用いる場合の二羽の組合せを以下の（ａ）～（ｃ）に示す。
　（ａ）目的タンパク質遺伝子に関してG1世代以降のトランスジェニックのオスと、同種野生型のメスの組合せ
　（ｂ）目的タンパク質遺伝子に関してG1世代以降のトランスジェニックのオスと、目的タンパク質遺伝子に関してG1世代以降の同種トランスジェニックのメスの組合せ
　（ｃ）目的タンパク質遺伝子に関してG1世代以降のトランスジェニックのメスと、同種野生型のオスの組合せ
　尚、本明細書において「野生型」とは、導入遺伝子（上の例では目的タンパク質遺伝子）に関して野生型であること、即ち導入遺伝子が導入されていない個体であることを表す。
　次に、用意した二羽の同種鳥類を交配して受精卵を得た後、孵卵を開始する。孵卵の条件は常法に従えばよく、例えば37.8 ℃～39.0 ℃、湿度50～70%の条件下、インキュべートする。続いて、形成された初期胚に対してβ1,4-GalT遺伝子を導入し、染色体への該遺伝子の挿入を生じさせる。放卵後の受精卵の初期発生についてニワトリを例にとると、まず輸卵管内で受精した卵は、受精後約1.5時間で卵割を開始する。細胞質がつながったまま盤割が始まった卵は、1日かけて体外に放出される間に分裂し、約6万個の細胞からなる胚盤葉と呼ばれる胚になる（胚盤葉期）。この胚盤葉は、卵黄中央部の直径3～4mmの白いリングとして観察される。この胚は、上層と下層に分裂し、割腔を形成する。放卵は胚盤葉下層が形成される頃に起こり、原条が形成され、胚盤葉は上、中、下の三重構造を取り、三胚葉が形成される。その後、胚の形成、成長を経て、排卵から22日目に孵化する。胚盤葉期はステージXとも呼ばれ、この時期の細胞の一部から生殖細胞が生じることから、従来は遺伝子導入の対象としてこの時期の受精卵を使用している。
　過去の報告（例えば国際公開第2004/016081号公報）にあるように、放卵直後、胚盤葉期の受精卵を孵化条件（例えばニワトリならば37.8 ℃～39.0 ℃、湿度50～70%程度の孵化に適した環境条件）においた時間を0時間（孵卵開始時）とした場合、ウズラでは孵卵開始から36時間後、ニワトリでは孵卵開始後43時間頃から卵黄上に血管系の形成が観察され、心臓に分化する器官の脈動が観察できる。そして、この段階以降に遺伝子導入を実施すると、導入遺伝子が高レベルで発現する。そこで、ウズラの場合、好ましくは孵卵開始から36時間以上経過した後（具体的には孵卵開始から36時間後～50時間後の間）、ニワトリの場合、好ましくは孵卵開始から43時間以上経過した後（具体的には孵卵開始から43時間後～60時間後の間）に遺伝子導入を実施するとよい。
　遺伝子導入は、当該分野で公知の方法によって行うことができる。即ち、レトロウイルスベクターを用いて放卵後の胚盤葉期の胚に外来遺伝子を注入する方法（非特許文献３～７）、１細胞期の受精卵の核にDNA等を直接注入する方法（非特許文献８、９）、レンチウイルスベクターを利用した方法（非特許文献１０、１１）等によって遺伝子導入すればよい。以下、代表的な方法である、組換えレトロウイルスを用いた遺伝子導入法について詳細に説明する。
　まず、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、モロニーマウス肉腫ウイルス（MoMSV）、トリ白血病ウイルス（ALV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、レンチウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（HIV）等を利用してレトロウイルスベクターを構築する。中でもMSCVに由来するレトロウイルスベクターを用いることが好ましい。また、安全性の観点から、複製能欠失型レトロウイルスベクターを用いることが好ましい。複製能を欠失させるためには、ウイルス粒子の複製に必要な3種の遺伝子gag、pol、envの一つ以上（好ましくは二つ又は全部）を欠損させる。鳥類細胞への効率的な感染のためには、外皮タンパク質を人為的にウシ水疱性口内炎ウイルス由来のVSV-Gエンベロープタンパク質とすることが好ましい（VSV-Gシュードタイプ）。
　レトロウイルスベクターにコードされる遺伝子は、導入遺伝子の他、プロモーター、エンハンサー、調節因子等、特に限定されない。
　プロモーターとは遺伝子の転写開始位置を決定し、また転写レベルを調節する機能配列である。プロモーターは、鳥類で有効に機能するものであれば限定されない。例えば、EF1αプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、シミアンウイルス40（SV40）プロモーター、ミューリン・フォスフォグリセロキナーゼ（PGK）プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、ラウスザルコーマウイルス（RSV）プロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター等、ウイルスプロモーターや細胞性プロモーターを用いることができる。また、テトラサイクリン誘導型プロモーターに代表される誘導型プロモーターを用いることもできる。さらには、オボアルブミンプロモーターのような組織特異的プロモーターを用いることもできる。
　エンハンサーとは転写を促進する機能配列である。エンハンサーの例としてSV40、CMV、チミジンキナーゼエンハンサー、ステロイド応答エレメントやリゾチームエンハンサーが挙げられる。
　調節因子とは転写調節や転写後のRNAの安定化に寄与する機能配列である。調節因子の例としてウッドチャック肝炎ウイルス由来調節エレメント（woodchuck post－transcriptional regulatory element：WPRE、米国特許6136597号明細書）等が挙げられる。
　レトロウイルスベクターは、典型的には、5’末端、3’末端に長い反復配列（long terminal repeat，LTR）の少なくとも一部を含む。LTRは転写プロモーター遺伝子やpolyA付加シグナルを持つことから、プロモーターやターミネーターとして利用し得る。導入遺伝子及びその他の配列（プロモーター、エンハンサー、調節因子等）はベクターコンストラクト上で5’LTRと3’LTRの間に含まれる。
　レトロウイルスベクターをコードするプラスミド（具体的には上記の反復配列等を含むプラスミド）をパッケージング細胞へ導入することによって、組換えレトロウイルスを産生させることができる。パッケージング細胞への上記プラスミドの導入にはリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法などを利用すればよい。パッケージング細胞にはウイルス粒子の形成に必要な遺伝子（gag、pol又はgag、pol、env）を発現する細胞が用いられる。例えば、gag及びpolを構成的に発現するGP293細胞に、env遺伝子を含むプラスミドとともに上記プラスミドを導入する。あるいは293FT細胞にgag、pol、envを発現するためのプラスミドとともに上記プラスミドを一過性に遺伝子導入しても良い。VSV-Gシュードタイプの組換えウイルスを産生させるためには、例えば、gag、polを構成的に発現するGP293細胞に、VSV-G遺伝子を含むプラスミドとともに上記プラスミドを導入すればよい。高濃度のウイルス液を得るために、上記プラスミドを安定に保持するGP293細胞株を作製しパッケージング細胞として用いても良い。ウイルス液（パッケージング細胞の培養上清）は必要に応じて濃縮される。
　以上の方法で調製した組換えレトロウイルス等を利用してβ1,4-GalT遺伝子を初期胚へ導入する。遺伝子導入効率の観点から好ましくはマイクロインジェクション法（Bosselman,R.Aら（1989）Science 243、533）により遺伝子導入するが、これに限られるものではなく、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等により遺伝子導入してもよい。
　遺伝子導入後、引き続きインキュベートし、孵化させる。孵化は常法で行うことができる。好ましい方法の一つとして人工卵殻による方法（Kamihira，Mら（1998） Develop Growth Differ 40，449）を挙げることができる。
　以上の方法によれば、その体細胞にモザイク状にβ1,4-GalT遺伝子を持ったG0トランスジェニックキメラ鳥類が得られる。このようにして得たG0トランスジェニックキメラ鳥類を同種野生型の鳥類と交配することにより、又はG0トランスジェニックキメラ鳥類同士を交配することにより、導入遺伝子（目的タンパク質遺伝子及びβ1,4-GalT遺伝子）を子孫に伝播させることができるとともに、全身の体細胞に導入遺伝子をもつ完全なトランスジェニック鳥類を作製できる。このように安定的に導入遺伝子を伝播するトランスジェニック鳥類の系統を確立することで、タンパク生産システムとしての品質の安定化が可能である。更に、完全なトランスジェニック鳥類を用いれば、導入遺伝子をもつ体細胞の割合が多いことから、G0トランスジェニックキメラ鳥類に比べ、導入遺伝子に由来する、糖鎖構造が改善された組換えタンパク質の生産量の増大が望める。
　尚、「交配」として、自然交配の他、人工交配を用いてもよい。
　同種鳥類を用いる場合、G1トランスジェニックを作製するための交配型には、G0トランスジェニックキメラのオスと同種野生型のメス、G0トランスジェニックキメラのメスと同種野生型のオス、G0トランスジェニックキメラのオスとG0トランスジェニックキメラのメス、の３種類がある。G0トランスジェニックキメラのオス１羽に対して複数羽のメス（同種野生型又はG0トランスジェニックキメラ）を交配させることにすれば、効率的にG1トランスジェニックを作製することができる。
　G2以降の子孫は、それまでに得られたトランスジェニック（G0トランスジェニックキメラを含む）と野生型との交配や戻し交配などによって作製することができる。
　G0トランスジェニックキメラ鳥類が作製されたことを確認するため、或いは導入遺伝子が次世代へ伝搬したことを確認するためには、得られた子孫の血液又は細胞などから抽出したDNAを試料としてPCR法又はハイブリダイゼーション法などを実施し、導入遺伝子を検出すればよい。
　また、G0トランスジェニックキメラ鳥類又はG1世代以降の子孫における導入遺伝子のコピー数についても、PCR法やハイブリダイゼーション法を利用して確認することができる。導入遺伝子の発現量の確認には、RT-PCR法又はノーザンブロット法などを利用できる。
　以下、トランスジェニック鳥類を作製するための方法（２）～（４）を説明する。（２）の方法ではまず、目的タンパク質遺伝子を生殖細胞に保有する鳥類と、β1,4-GalT遺伝子を生殖細胞に保有する同種異性鳥類を用意する。これらの二羽の鳥類は、導入遺伝子（目的タンパク質遺伝子、β1,4-GalT遺伝子）を生殖細胞に保有する限り特に限定されない。即ちキメラ個体であってもよいが、効率的に目的のトランスジェニック鳥類を得るため、G1世代以降のトランスジェニック個体であることが好ましい。
　次に、用意した二羽の鳥類を交配して受精卵を得た後、孵卵する。孵卵及び孵化の方法、条件などは（１）の場合と同様である。（２）の方法によれば、全身の体細胞が目的タンパク質遺伝子及びβ1,4-GalT遺伝子を持つトランスジェニック個体（G1）を得ることができる。（１）の場合と同様、当該トランスジェニック個体を利用してその子孫（G2世代以降）を作製することもできる。
　（３）の方法ではまず、鳥類受精卵を用意し、孵卵を開始する。続いて、形成された初期胚に対して目的タンパク質遺伝子とβ1,4-GalT遺伝子を導入し、染色体への該二つの遺伝子の挿入を生じさせる。目的タンパク質遺伝子とβ1,4-GalT遺伝子の導入は、目的タンパク質遺伝子を搭載したベクター（第１発現ベクター）とβ1,4-GalT遺伝子を搭載したベクター（第２発現ベクター）の共導入、又は目的タンパク質遺伝子とβ1,4-GalT遺伝子を搭載したベクター（共発現ベクター）の導入によって行うことができる。第１発現ベクターは目的タンパク質遺伝子を発現可能に保持する。第２発現ベクターはβ1,4-GalT遺伝子を発現可能に保持する。一方、共発現ベクターの構築には例えばInternal Ribosome Entry Site(IRES)配列を利用すればよい。
　（４）の方法は、目的タンパク質遺伝子ではなくβ1,4-GalT遺伝子の方を導入したトランスジェニック鳥類を用いることと、これに伴いβ1,4-GalT遺伝子ではなく目的タンパク質遺伝子を受精卵へ導入することを除いて、（１）の方法と同じである。従って、その詳細については、（１）の方法に関する上記説明を援用し、省略することにする。
（タンパク質の生産法）
　本発明の更なる局面は、本発明のトランスジェニック鳥類を用いたタンパク質の生産法に関する。本発明の生産法では、本発明のトランスジェニック鳥類の卵白から目的タンパク質を回収する。例えば、卵白を緩衝液や蒸留水等で希釈した後、遠心処理、塩析（硫安分画など）、各種クロマトグラフィーなどに供する。これらの方法は単独で或いは任意に組み合わされて用いられる。本発明の生産法によれば、糖鎖を有するタンパク質が得られる。従って、レクチンを用いたアフィニティークロマトグラフィーなど、糖鎖との結合性を利用した分離・精製法が有効である。タンパク質部分の特徴を利用して目的タンパク質を分離・精製することにしてもよい。例えば目的タンパク質が抗体分子であれば、対応する抗原を固相化したカラムによるアフィニティークロマトグラフィーなどが有効である。
１．ニワトリ各組織における糖転移酵素の遺伝子発現解析
　以下、β1,4-Galactosyltransferase 1を「GalT1」、β1,4-Galactosyltransferase 2を「GalT2」、β1,4-Galactosyltransferase 3を「GalT3」、β-galactoside α2,6-sialyltransferase 1を「ST6Gal1」、β-galactoside α2,3-sialyltransferase 4を「ST3Gal4」、β-galactoside α2,3-sialyltransferase 6を「ST3Gal6」と略記する。
　ガラクトース転移酵素及びシアル酸転移酵素遺伝子の発現を解析するため、ニワトリ産卵個体の各組織からQuick prepTM Total RNA extraction kit (GE ヘルスケア)、或はRNAiso (タカラバイオ)を用い、全RNAを抽出した。組織は湿重量で約50-150 mgを用いた。操作はキットに付属のプロトコールに準じた。RNAisoを用いた場合には、さらに37℃、1時間のDNase I(タカラバイオ)処理（20 U/サンプル）を行い、再度RNAisoによる全RNAの精製を行った。RNA量は260 nm波長の吸収により測定した。800 ng（シアル酸転移酵素遺伝子の場合）、3μg（ガラクトース転移酵素の場合）の全RNAに5 p mole オリゴdTプライマーを加え、70℃、１０分処理し、氷上で冷却することで、アニール反応を行った。RevaTra Ace(商品名、東洋紡)付属の緩衝液、及び2 mM dNTPを加え、42℃で保温した後、100 UのRevaTra Aceを加え逆転写反応を行いcDNAを合成した。適宜希釈した反応液2μlを鋳型cDNAとして、LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I (ロシェダイアグノスティックス)を用いてリアルタイムPCRを行なった。各糖転移酵素の発現量をLightCycler Software version 3.5 (ロシェダイアグノスティックス)により定量した。ニワトリグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の発現量を同様に測定し、これにより鋳型量を補正した。条件は以下の通りで行なった。
　95 ℃、10分を1サイクル
　変性 95 ℃、10秒、アニール 55 ℃、15 秒、伸長72 ℃、10 秒を40サイクル
尚、各ステップでの温度変化は20 ℃/秒と設定した。 
使用したプライマーは以下の通りである。
＜ガラクトース転移酵素＞
　GalT1用forward：5’-GGAGTATGACTATGACTGCTTTGTGT-3’（配列番号１２）
　GalT1用reverse：5’-TGTTCTTTGCTCAAGGCAGAC-3’（配列番号１３）
　GalT2用forward：5’-CAGAAGGTGGCTTATGGCATC-3’（配列番号１４）
　GalT2用reverse：5’-GAGGTCCACATCGCTGAAA-3’（配列番号１５）
　GalT3用forward：5’-TAATGTTGGTGTCCGAGAAGC-3’（配列番号１６）
　GalT3用reverse：5’-TGTTTGGGATAGTATTCATCACAG-3’（配列番号１７）
＜シアル酸転移酵素＞
　ST3Gal4用forward：5’-AAGAAAACAAGACCGTATGTCCC-3’（配列番号１８）
　ST3Gal4用reverse：5’-CGTCCTCACCCAGAAGTAATC-3’（配列番号１９）
　ST3Gal6用forward：5’-GGAGAGAAGGAACGAAATAA-3’（配列番号２０）
　ST3Gal6用reverse：5’-ACTGGCACACAGGAACGG-3’（配列番号２１）
　ST6Gal1用forward：5’-TGGGTCGCTGTGCTGTT-3’（配列番号２２）
　ST6Gal1用reverse：5’-TGGGAGTTGACAAGACGAATC-3’（配列番号２３）
＜コントロール＞
　ニワトリGAPDH用forward：5’-GGGCACGCCATCACTATC-3’（配列番号２４）
　ニワトリGAPDH用reverse：5’-GTGAAGACACCAGTGGACTCC-3’（配列番号２５）
　PCR反応後、増幅産物を2 %アガロース電気泳動に供し、非特異的増幅及びプライマーダイマーの形成が起こっていないことを確認した。
　リアルタイムRT-PCRの結果、脳での発現量を基準とすると、GalT1は肝臓、腎臓では高発現を、輸卵管膨大部では脳と同レベルの発現を確認した。GalT3は輸卵管膨大部での発現が高いことを確認した（図１Ａ）。また、シアル酸転移酵素については、輸卵管膨大部でのα2,3結合を生成するST3Gal6の発現は、脳におけるそれと比較して高く、また、α2,6結合を生成するST6Gal1の発現も脳に比較して高いことが確認された（図１Ｂ）。
２．抗GalT1抗体の取得
　ニワトリGalT1の部分ペプチドを化学合成(東洋紡)し、キャリアーとしてKLH（カサ貝のヘモシアニン）に結合させた。このペプチドをウサギに繰り返し免疫し(一度の免疫につき0.5 mgのペプチドを使用)、抗GalT1抗体を抗血清の形で得た。用いたペプチド配列は以下の通りである。ただし、最初のシステインはキャリアータンパク質と結合させるために付加したアミノ酸である。
　CRMIRHSRDRKNEPNPER（配列番号２６）
３．ニワトリ肝臓、輸卵管組織からのミクロソーム画分の調製
　-80℃にて凍結保存しておいたニワトリ組織を液体窒素中ですり潰し、１ g当り９ mlのホモジナイズ緩衝液（10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1 mM EDTA、0.25 M Sucrose）に懸濁し、ポッター型ホモジナイザー（10ストローク）により破砕した。未破砕の組織はガーゼ濾過によって取り除いた。その後、7,700 g、30分、4 ℃の遠心分離に供し、得られた上清を更に100,000 g、60分、4 ℃で遠心分離した。この遠心分離で得られる沈殿をミクロソーム画分とした。ミクロソーム画分は、20 mM MES緩衝液 (pH 6.5)、2 % Triton X-100溶液に懸濁し、超音波処理（30秒（１秒パルス）、2回）を行い可溶化した。この溶液中に含まれるタンパク質量をブラッドフォード法によって定量した。
４．GalT1のウエスタンブロットによる発現解析
　３.で調製した各サンプル10μgを、ミニプロテアンII(バイオラッド)を用いた10%ポリアクリルアミドゲルによるSDS-PAGEに供し、泳動終了後、転写装置AE-6675(アトー 340491)によりPVDFメンブレン(GE ヘルスケア)に転写した。ブロッキング液（3%となるようにスキムミルクをトリス緩衝生理食塩水に溶解したもの）に一晩4℃で浸しブロッキングした。PVDFメンブレンを0.05% Tween 20(登録商標)を含むトリス緩衝生理食塩水で数回洗い、1次抗体反応、2次抗体反応を行った。1次抗体には２．で作製した抗血清を1000倍希釈として用い、2次抗体にはヤギ抗ウサギIgG-HRP (サンタクルーズバイオテクノロジー) 200 μg/0.5 mlをブロッキング液で2,000倍希釈したものを用いた。尚、抗体反応が終わるたびにPVDFメンブレンを0.05% Tween 20(登録商標)を含むトリス緩衝生理食塩水で5分×3回洗洗浄した。2次抗体反応後の洗浄終了後にPVDFメンブレンを、Western LightningTM Ceniluminescence Reagent Plus(パーキンエルマー)と反応させ、生じる発光をルミノイメージアナライザー（フジフィルム、LAS-3000）にて測定した。
　その結果、輸卵管膨大部におけるGalT1の発現は肝臓に比べ、極めて弱いことが判明した（図２）。
５．ニワトリGalT1遺伝子のクローニング
　8週齢のニワトリオス(LINE M)の腎臓よりEASYPrep RNA (タカラバイオ)を用いて全RNAを回収した。この全RNAを鋳型にReverTra Ace（東洋紡）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを取得した。この際、プライマーにはオリゴdTを用いた。
　得られたcDNAを鋳型としてPCRを行い、二つの部分に分けて別々に増幅しベクターと連結することでGalT1遺伝子をクローニングした。この際、連結部にEco RIサイトを導入するためにアミノ酸配列を変えない変異を導入した。PCRはKOD-Plus-DNA Polｙmerase（東洋紡）を用い、以下の条件及びプライマーにより行った。
＜条件＞
　94℃/2分の後、94℃、15秒、54℃、30秒及び68℃、1分30秒を30サイクル
＜プライマー＞
（１）アミノ末端
　forward：5’-AAAGTCGACCATGAAGGAGCCGGCGCTGCCCGGCACC-3’（配列番号２７）
　reverse: 5’-CAGGTTCACAGGCTGGGAGAATTCCACGCG-3’（配列番号２８）
（２）カルボキシ末端
　forward: 5’-GTGGAATTCTCCCAGCCTGTGAACCTGGA-3’（配列番号２９）
　reverse: 5’-AAAATCGATTAGCTGCCGGGCGCTCCGATA-3’（配列番号３０）
　得られたPCR産物を電気泳動後切り出し、Mag Extractor -PCR & Gel clean up-（東洋紡）で精製した。得られたPCR産物をそれぞれSalIとEco RI及びEco RIとClaIにて切断後、あらかじめSalIとClaIで切断したpBluescriptIIKS (-) (ストラタジーン)と連結し、pBlue/β4Gal-T1を得た。
　なお、配列はTHERMO SequenaseTM II dye terminator cycle sequencing kit (GE ヘルスケア)を用いて確認した。
６．アクチンプロモーターによるGalT1発現レトロウイルスベクターの構築
　アクチンプロモーターによるGalT1発現レトロウイルスベクターをコードするプラスミドpQMSCV/eGΔAGalT1は以下のようにして作製した。尚、プラスミドpQMSCV/eGΔAGalT1はQベクター由来のプラスミドベクターであり、MSCVのLTRを有し、当該LTRによってeGFPを発現するとともに、欠失型アクチンプロモーター（イントロン部分を欠失させたもの）によりGalT1を発現する。
　まず、５．で作製したニワトリGalT1をクローニングしたベクターpBlue/β4Gal-T1をSal I及びCla Iで切断し、1.1kbを切り出し、Sal I及びCla Iで切断したpQMSCV/eGΔA LIG7H (TNF)に挿入し、ニワトリGalT1をニワトリアクチンプロモーターで発現させる複製能欠失型レトロウイルスベクターをコードするプラスミドpQMSCV/eGΔAGalT1を作製した（Hotta, A.ら （2006）J Biosci Bioeng 101, 361が参考になる）。このプラスミド地図をウイルスベクターが染色体内に挿入された形で図３Ａに示した。尚、pQMSCV/eGΔA LIG7H (TNF)は以下により作製した。
　まず、pMSCVneo (クローンテック)のEcoR IとSal Iのサイトに、eGFP遺伝子を含むEco RI、Xho I末端を持つDNA及びニワトリアクチンプロモーター（非特許文献１３に記述がある）を含むXho I、Sal I末端を持つDNAを結合し、pMSCV/eGΔAを作製した。マウスIgGのH鎖のシグナル配列（NCBI M59921）の下流に抗ヒトTNFα抗体H鎖の可変領域（米国特許 5698195号明細書）を配したDNAを化学合成し、IgG1の定常領域Cγ1と結合させ抗TNFαH鎖遺伝子を得た。マウスIgGのL鎖のシグナル配列（NCBI AF201961）の下流に抗ヒトTNFα抗体L鎖の可変領域（米国特許 5698195号明細書）を配したDNAを化学合成、κ鎖の定常領域Cκと結合させ抗TNFαL鎖遺伝子を得た。合成したL鎖遺伝子、合成IRES配列（forward: 5’-TCGAC-(TTCTGACATCCGGCGGGT)7-GACTCACAACCCCAGAAACAGACATCGC-3’（配列番号３１）及びreverse: 5’-GGCCGCGATGTCTGTTTCTGGGGTTGTGAGTC-(ACCCGCCGGATGTCAGAA)7-G）（配列番号３２）、合成したH鎖配列をpMSCV/eGΔAのプロモーター下流に挿入し、pMSCV/eGΔALIG7H(TNF)を作製した。pMSCV/eGΔALIG7H(TNF)をKpn Iで切断し、Kpn Iで切断したpQMSCVベクターに挿入しpQMSCV/eGΔA LIG7H (TNF)を作製した。
７．アクチンプロモーターによるGalT1発現ウイルスベクターの調製
　６．で作製したベクターコンストラクトpQMSCV/eGΔAGalT1よりレトロウイルスを調製するため、GP293細胞（クローンテック）を直径100 mmの培養ディッシュにてDMEM培地を用いて培養した。90%コンフルエントになるように前日にまき直しリポフェクション法によりプラスミドpQMSCV/eGΔAGalT1を11μg及びプラスミドpVSV-G（クローンテック）11 μgをGP293細胞にトランスフェクトした。48時間後、上清を0.45 μm酢酸セルロースフィルター（アドバンテック）を通して夾雑物を除いた後、25,000 rpm、4 ℃で1.5時間超遠心分離した。上清を捨て沈殿をTNE（50 mM Tris-HCl （pH 7.8）、130 mM NaCl、1 mM EDTA）に溶解しウイルス液とした。
８．ウイルスタイターの測定
　ウイルスタイターの測定は、以下のように行った。測定の前日にNIH3T3細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を24 wellディッシュに1.5×104細胞植え培養した。102～106倍に10 μg／mlポリブレン入りDMEMで希釈したウイルス溶液1 mlを細胞の培地と交換し、48時間後に蛍光顕微鏡によりeGFPを発現している細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
　ウイルスタイター（cfu／ml）＝細胞数×希釈率×発現割合
　７で得られた高タイターウイルス溶液のタイターをこのようにして測定したところ、4×108～1×109 cfu／mlであった。
９．ニワトリ胚へのレトロウイルスのインジェクション及び胚培養
　アクチンプロモーターで一本鎖抗体を全身に発現するトランスジェニックニワトリ（非特許文献１３）を交配させて得た受精卵を使用した。70%エタノールで殺菌したニワトリ受精卵を自動転卵装置が内蔵された孵卵器（昭和フランキP-008型）で約55時間、38 ℃、湿度65%で、15分に1回角度90度で転卵しながら孵卵することで胚発生させた。鋭端部を直径3.5 cmの円形にダイヤモンドカッターで切り取り、胚を露出させた。ガラス管（ナリシゲ GD-1）をマイクロピペット製作機（ナリシゲ PC-10）で加工し、外形約20 μmとなるように先端を折って作製した針に７．で調製したウイルス溶液を入れ、胚を実体顕微鏡で観察しながら、胚の心臓部に血流に沿った方向に刺し、マイクロインジェクター（エッペンドルフ、Transjector 5246）を用いて約2 μlを注入した。この卵に卵殻の切り口まで卵白を満たした後、卵白を糊としてPTFE膜（ミリポア、ミリラップ）とポリ塩化ビニリデンラップ（旭化成、サランラップ）で蓋をした。ウイルスをインジェクションした受精卵は全ての卵のインジェクション終了時まで孵卵器で孵卵を行った。その後、ニワトリのLL卵を70%エタノールで消毒し鈍端部を直径4.5 cmの円形にダイヤモンドカッターで切り取り中身を取り除いた殻に、ウイルスをインジェクションした受精卵の卵白と卵黄を移し、卵白に懸濁した乳酸カルシウム溶液(50 mg／ml)を0.5 ml添加後、卵白を糊としてポリ塩化ビニリデンラップ（サランラップ、旭化成）で蓋をした。ニワトリLL卵に移した胚を自動転卵装置が内蔵された孵卵器で15分ごとに角度30度転卵しながら孵卵を行った。
１０．遺伝子導入鳥類胚の孵化率
　ニワトリ胚へのウイルス導入操作を5回にわけ計164胚行い、複製能欠失型レトロウイルスベクターにより遺伝子導入した胚を９．で示した方法により孵化させた。平均25.0%の孵化率で遺伝子導入鳥類胚を孵化させることができた（図３Ｂ）。
１１．血液ゲノムDNAの取得
　ヒヨコから採血し、室温で1時間静置した後、4 ℃で一晩保持した。10,000 rpm、10分の遠心により血清を除去した血餅から、MagExtactor-Genome-(東洋紡)を用いてゲノムDNAを取得した。操作はキットに付属のプロトコールに従った。DNA濃度は280 nmの吸光度により測定した。
１２．遺伝子導入鳥類胚の血中コピー数の検定
　もともと導入してあったpMSCVGΔAscFvFcベクター（非特許文献１３）には存在せず、導入したpQMSCV/eGΔAGalT1に存在するeGFP遺伝子をリアルタイムPCR法により定量し、コピー数を決定した。使用したプライマーはForward：5’-CGGCAACTACAAGACCCGC-3’（配列番号３３）及びReverse：5’-GAAGTTCACCTTGATGCCGTTC-3（配列番号３４）である。50 ℃、2分、95 ℃、2分の後、94 ℃、5秒、58 ℃、10秒、 72 ℃、10秒を45サイクルにてPCRを行った。
　この際、陰性対照としてオートクレーブ及びUV滅菌したMilli Q（登録商標）水と非導入ニワトリの血餅から得られたゲノムDNA 20 ngを用いた。また、コピー数既知の遺伝子導入ニワトリゲノムを用いて検量線を作製した。操作はプロトコールに準じた。
　検定の結果、生まれたキメラニワトリの血中導入遺伝子コピー数は0.2～2.2であった（図４）。
１３．GalT1導入ニワトリのウエスタンブロットによる発現解析
　遺伝子導入ニワトリを解剖し、輸卵管膨大部における導入遺伝子のコピー数を血中ゲノムと同様にリアルタイムPCRにより測定した。その結果、＃７７が1.81コピー、＃７８が0.53コピーであることが示された。次に、得られた輸卵管組織のミクロソーム画分におけるGalT1の発現を４．と同様にタンパクレベルで解析した。GalT1導入コピー数の高い＃７７の輸卵管において、GalT1の発現が認められた（図５）。
１４．GalT1導入ニワトリのRT-PCR法による発現解析
　遺伝子導入ニワトリを解剖し、得られた輸卵管におけるGalT1の発現を１．と同様に解析した。導入したGalT1のmRNAが導入個体でのみ強く発現していることが確認された（図６Ａ）。同時に内在性のシアル酸転移酵素ST6Gal1の発現量には有意な変化がないことを確認した（図６Ａ）。
１５．輸卵管組織におけるガラクトース転移酵素の活性測定
　ミクロソーム画分として得られた組織抽出液のガラクトース転移酵素活性を測定した。１３．で得られたタンパク質20 μgを50 μlの反応液（25 mM N-Acethylglucosamine、100 mM Tris-maleate (pH 6.8)、20 mM MnCl2、0.1% Triton X-100、4 mM ATP、20 mM γ-Galactono-1,4-lactone、0.5 mg/ml BSA、トリチウム標識UDP-ガラクトース 0.025 nmol）中で37℃、15分反応させた。次に、シリカゲルプレート上に、各反応液を５μlずつスポットし、展開溶媒（1- Butanol 50 ml、Ethanol 30 ml、蒸留水 20 ml）を用いて80分の展開を二回繰り返した。次に、プレートをフィルムに感光させた。尚、反応の詳細な条件などは、Shaperらの報文（Shaperら（1997） J Biol Chem 272, 31389）を参考にした。
　測定の結果、非導入個体の輸卵管においてはガラクトース転移酵素活性がほとんど検出されないのに対し、導入個体においては強い活性が認められた（図６Ｂ）。
１６．卵白サンプルの調製、及び組換え抗体の卵白からの精製
　内在性卵白タンパク質へのガラクトース付加を検証する為に、卵白サンプルの調製を以下のように行った。
　卵白をPBSで10倍に希釈し、超音波処理（30秒）を行い、サンプルの粘性を低下させた。この溶液にSDS-PAGEサンプル緩衝液を加え、熱変性させたものをレクチンブロット解析（後述）に供した。
　卵白からの組換え抗体の精製は以下のように行った。卵白をスターラーで15分間ほぐし、その5倍容のMilli Q（登録商標）水を加え室温で攪拌した。1 M HClでpH 5.0に調整し、さらに15分間攪拌した。遠心分離(7,300 rpm、4 ℃、20分)し上清を回収した。回収した上清を0.45 μmフィルターに通しFPLCを用いてprotein G カラム(GE ヘルスケア) 1 mlにかけた。操作は以下のように行った。流速2 ml/分で結合緩衝液(10 mM リン酸緩衝液(pH 7.4))にて平衡化したカラムに上述のサンプルを約80 ml流し吸着させた後、溶出緩衝液（100 mM Glycine-HCl (pH 2.7)）1 ml/分にて溶出した。その際に溶出液を1 mlずつ分画すると同時に150 μｌの1 M Tris-HCl (pH 8.0)で中和した。280 nmの吸光度を測定し、タンパク質のピークを認めたフラクション4、5では、抗Fc抗体を用いたELISA法により組換え抗体の存在が確認された。
１７．組換え抗体に存在する糖鎖のノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）による部分分解
　精製抗体1.25 μgを8 mM リン酸緩衝液(pH 6.6)、1.5 mUノイラミニダーゼF(マルキンバイオ、24229-74)、全量25 μlで37 ℃、6時間反応させ、末端シアル酸を除いた。
１８．組換え抗体に存在する糖鎖のβ-ガラクトシダーゼによる部分分解
　精製抗体2.7 μgを50 mM リン酸緩衝液(pH 5.5)、1 mU ノイラミニダーゼ F、全量24 μlで37 ℃、4時間反応させ、末端シアル酸を除き、続いて、β-ガラクトシダーゼ(Streptococcus 6646K由来) (生化学工業、100573) 0.5 mU を加え(全量50 μl)、37 ℃、20時間反応させ、末端ガラクトースを切断した。サンプルを酵素なしで同様にインキュベートしたものを対照サンプルとした。
１９．内在性タンパク質及び組換え抗体に存在する糖鎖のレクチンブロットによる解析
　各サンプル(卵白サンプルまたは非処理、シアリダーゼ処理、β-ガラクトシダーゼ処理精製組換え抗体)をSDS-PAGEにより電気泳動し、PVDFメンブレンに転写後、1% BSA (シグマ-アルドリッチ)含有0.05% Tween 20(登録商標)を含むトリス緩衝生理食塩水中で、一晩4 ℃でブロッキングした。RCA120 (Ricinus communis) (ヒママメ) レクチン(生化学工業、300162)を用いて、末端のガラクトースの有無を解析した。RCA120を1% BSA含有0.05% Tween 20(登録商標)を含むトリス緩衝生理食塩水で1 μg/mlに希釈し、メンブレンと4 ℃、一晩反応させた。続いて、BALB/cマウスに免疫することで得たマウス抗RCA120抗血清を1% BSA含有0.05% Tween 20(登録商標)を含むトリス緩衝生理食塩水で1,000倍希釈し、メンブレンと室温、2時間反応させた。続いて、ヤギ抗マウスIgG-HRP(サンタクルーズバイオテクノロジー、sc-2005)を1% BSA含有0.05% Tween 20(登録商標)を含むトリス緩衝生理食塩水で0.2 μg/mlに希釈しメンブレンと室温、1時間反応させた。その後メンブレンをWestern LightningTM Ceniluminescence Reagent Plus(パーキンエルマー)のEnhanced Luminal Reagent及びOxidizing Reagentを等量混ぜたものとを約1分間インキュベートし発色させ、CCDカメラにより撮影した。
　レクチン反応後、メンブレンを抗体除去緩衝液（250 mM Glycine-HCl (pH 2.5)、1 % SDS）に浸し、レクチン、抗体を除去し、1% スキムミルク含有0.05% Tween 20(登録商標)を含むトリス緩衝生理食塩水中で、4 ℃、一晩ブロッキングし、先と同様に抗ヒトFc抗体でウエスタンブロットを行い、泳動した抗体タンパク量の確認を行った。
　解析の結果、GalT1遺伝子非導入個体では、卵白内在性タンパク質にガラクトースが付加されていないこと（図７Ａ）及びトランスジェニック鳥類に生産させた卵白由来組換え抗体にガラクトースが付加されていないこと（図７Ｂ）が確認された。一方Gal T1遺伝子導入により、卵白内在性タンパク質には有意にガラクトースが付加されていることが確認された（図７Ａ）。また、Gal T1導入ニワトリから精製した抗体では、検出されたバンドがβ-ガラクトシダーゼ処理により消失し、ガラクトースの付加が確認できた（図７Ｂ）。
　次に、α2,6結合で結合しているシアル酸をSSAレクチンを用いて以下により解析した。SSA (Sambucus sieboldiana) (ニホンニワトコ)レクチン(生化学工業、300177)を1% BSA含有0.05% Tween 20(登録商標)を含むトリス緩衝生理食塩水で1 μg/mlに希釈し、メンブレンと室温、2時間反応させた。続いて、BALB/cマウスに免疫することで得たマウス抗SSA抗血清を1% BSA含有0.05% Tween 20(登録商標)を含むトリス緩衝生理食塩水で1,000倍希釈し、メンブレンと室温、2時間反応させた。続いてヤギ抗マウスIgG-HRP (サンタクルーズバイオテクノロジー、sc-2005)を1% BSA含有0.05% Tween 20(登録商標)を含むトリス緩衝生理食塩水で0.2 μg/mlに希釈し、メンブレンと室温、1時間反応させた。その後、メンブレンをRCA120の場合と同様に発色させ、CCDカメラにより撮影した。SSAレクチンにおいて、陽性対照として、ヒトトランスフェリン(α2,6結合シアル酸をもつ糖タンパク質)及び、卵黄に生産させた組換え抗体を用いた。
　解析の結果、卵白より精製した抗体には、GalT1の導入の有無にかかわらず、α2,6結合で結合しているシアル酸の存在を示すバンドは認められなかった（図８）。
２０．等電点電気泳動によるシアル酸付加の解析
　等電点電気泳動はAmpholine PAG plate (pH 3.5-9.5、T = 5%、C = 3%)(GE ヘルスケア) を用い、泳動装置には等電点電気泳動装置NA-1410型(日本エイドー)を使用した。泳動は10℃で行なった。少量(500 μl程度)の低粘度シリコンオイル(信越化学、KF-96L-5CS)をトレイの上に垂らし、その上に11 cm × 8 cmに切断したゲルをフィルムを下にして置き、ゲル両端から5 mm 程度の位置に各電極緩衝液を染み込ませた電極ろ紙をセットした。陽極緩衝液には1 M H3PO4を、陰極緩衝液には1 M NaOHを用いた。白金電極を密着するようにろ紙の上に乗せ、ゲルを常に10℃に保ちながら、200-400 V、8 mA、60分の予備泳動を行い(電圧は徐々に上げた)、sample application piece (GE ヘルスケア)をゲル上に置き、各サンプルを1.25 μgアプライした。マーカーとしてIEF marker 3-10 (セルバ) を用いた。アプライ後、500-600 V、2 mA、90分の泳動を行なった(電圧は徐々に上げた。また、泳動開始30分後にsample application pieceを除いた)。泳動終了後、Film Remover (GE ヘルスケア)を用いてゲルを切り離した。ゲルが非常に壊れやすいためFilm Remover上でPVDFメンブレンを被せた。その後WB転写装置を用いて、メンブレンに80 mA/メンブレンで1時間転写した。転写後、慎重にメンブレンとゲルを切り離し、1 %スキムミルク含有0.05% Tween 20(登録商標)を含むトリス緩衝生理食塩水にてブロッキング後、１９．と同様に抗ヒトFc抗体で検出した。
　解析の結果、シアリダーゼによって消失する酸性（陽極）側のバンドが認められた。その量は少なく、また、Gal T1非導入ニワトリの卵白より精製した抗体においても同様のバンドが認められた（図９）。
２１．pETBlue2/GalT1の構築
　pQMSCV/eGΔAGalT1（６．を参照）から、GalT1遺伝子をSal IとCla Iにより切り出し、Sal IとCla Iにより切断したpETBlue 2ベクター（ノバジェン）と連結し、pETBlue2/GalT1を作製した。
２２．pETBlue2/EMCV-IRESの構築
　pMSCV/eGCMV H-IRES-L (TNF)からEMCV由来内部リボソーム結合配列（internal ribosome entry site, IRES）配列をSma IとEco RVにより切り出し、Hinc IIにより切断したpETBlue 2ベクターと連結し、pETBlue2/EMCV-IRESを作製した。なお、pMSCV/eGCMV H-IRES-L (TNF)は以下のように作製した。pMSCV/eGΔALIH(EMCV IRES, TNFα)（特開2007-295846）からSalI/ EcoRI断片（H鎖）及びEcoRI/ Cla I断片（IRES-L鎖）を切り出し、Sal I/ Cla Iで切断したベクターpMSCV/eGPcmvLIH(GtxIRES, TNFα; n=7) （特開2007-295846）と結合させ、pMSCV/eGCMV H-IRES-L (TNF)を作製した。
２３．アクチンプロモーターによりヒトエリスロポイエチンとGalT1を同時に発現するレトロウイルスベクターpMSCV/GΔAhEPO-IRES-GalT-Wの構築
　pETBlue2/GalT1から、GalT1遺伝子をSse 8387IとMlu Iにより切り出した。また、pETBlue2/EMCV-IRESからIRES配列をSse8387 IとMlu Iにより切り出した。Mlu Iにより切断したpMSCV/GΔAhEpo(c)Wベクター（非特許文献１４）とGalT1遺伝子、IRES配列遺伝子を連結し、pMSCV/GΔAhEPO-IRES-GalT-W（図１０（Ａ））を作製した。作製したベクターはアクチンプロモーターによりヒトエリスロポイエチンを発現する。脳心筋炎ウイルス（encephalomyocarditis virus, EMCV）のIRESの働きにより、ヒトエリスロポイエチンと同一のmRNAの3’下流よりGalT1を同時に発現する。さらに下流のWoodchuck posttranscriptional element (WPRE)によりタンパク質発現量の増大が期待できる。
２４．遺伝子導入鳥類の作製
　アクチンプロモーターによりヒトエリスロポイエチン及びGalT1発現ウイルスベクターの調製、ウイルスタイターの測定及びニワトリ胚へのレトロウイルスのインジェクション及び胚培養は既述（７．～９．を参照）の方法に準じた。
２５．遺伝子導入鳥類胚の孵化率
　ニワトリ胚へのウイルス導入操作を2回にわけ計40胚行い、複製能欠失型レトロウイルスベクターにより遺伝子導入した胚を孵化させた。8羽が孵化し孵化率は平均20%であった（図１０（Ｂ））。
２６．卵白からのヒトエリスロポイエチンの部分精製
２６－１．卵白の前処理
　卵白を、茶漉しを通すことで、濃厚卵白と水様性卵白に分離した。水様性卵白をスターラーで15分ほぐし、その5倍容の超純水を加え室温で攪拌した。1N塩酸でpH 5.0に調整し、さらに15分攪拌した。遠心分離(5,000 rpm, 4 ℃,10 分)し上清を回収し、1 M 水酸化ナトリウム水溶液でpH 7.1に調整後、-80℃で保存した。
２６－２．ブルーセファロースによるヒトエリスロポイエチンの精製
　結合緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH 7.5)）で置換したブルーセファロース(Blue Sepharose 6 fast Flow)(GEヘルスケア)1 mlと、3.5 mlの前処理済み卵白、6.5 mlの結合緩衝液）を混ぜ、一晩4℃で、ローテーターで回転させ吸着させた。同様に、結合緩衝液で置換したブルーセファロース1 mｌと5 mlの血清、5 mlの結合緩衝液を混ぜ、一晩4℃で、ローテーターで回転させ吸着させた。その後、溶液をカラム(スクリーニングカラム、フィッシャーヘルスケア)に通し、5 mlの結合緩衝液で洗浄した。再び5 mlの結合緩衝液で洗浄後、8 mlの溶出緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、1M NaCl）で溶出した。吸光度計にて波長280 nmを測定し、タンパクを含む画分を確認した。各フラクション中のヒトエリスロポイエチン量はウエスタンブロット法により測定した。ウエスタンブロット法は既述（４．を参照）の方法に準じた。一次抗体としてウサギ抗ヒトエリスロポイエチン抗体(R&Dシステムズ, AB-286-NA) 1 mg/mlを1000倍希釈したもの、二次抗体としてヤギ抗ウサギIgG-HRP(サンタクルーズバイオテクノロジー) 400 μg/mlを2000倍希釈したものを用いた。溶出緩衝液には高濃度の塩が含まれるため、PD-10カラム(GEヘルスケア)により脱塩した。操作はカラムに添付されたプロトコールに準じた。なお、GalT1非発現トランスジェニックニワトリの卵白中に生産させたヒトエリスロポイエチン（非特許文献１４）を比較対象として用いた。
２７．ヒトエリスロポイエチンに存在する糖鎖の解析
　結合する糖鎖のノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）、β-ガラクトシダーゼによる部分分解、及びレクチンブロットは既述（１７．～１９．を参照）の方法により行った。まずウエスタンブロット法により産生したエリスロポイエチンの分子量を測定した。GalT1を強発現することにより卵白中のヒトエリスロポイエチンの分子量は、GalT1非発現ニワトリの卵白中のものに比べ明らかに大きいことが示された(図１１（Ａ）)。β-ガラクトシダーゼ処理によりガラクトースを除去すると同一の分子量になることから、この差がガラクトース付加によるものであると考えられた。さらに、N-グルコシル化糖鎖の構造を明らかにするために、糖鎖末端からシアル酸、ガラクトースを酵素的に順次遊離したタンパク質についてガラクトース特異的なRCA120レクチンを用いたレクチンブロットにより解析した(図１１（Ｂ）)。その結果、GalT1を強発現するニワトリの卵白中のヒトエリスロポイエチンにのみバンドが認められ、このバンドはβ-ガラクトシダーゼ処理により消失した。これらのことから、GalT1を強発現することによりガラクトースが付加されたヒトエリスロポイエチンをトランスジェニックニワトリ卵白中に生産できることが示された。
　医薬品に利用されるタンパク質の多くは糖鎖を有する。本発明のトランスジェニック鳥類によれば、天然型と同一又は天然型に近似した糖鎖を有する有用タンパク質を生産することができる。当該有用タンパク質には例えば体内での半減期の飛躍的延長が期待できる。このように本発明は、医薬品として利用されるタンパク質の薬効の向上及びそれに伴う投与量の低減などをもたらす。
　本発明を利用すれば、天然型タンパク質には存在しない糖鎖構造の付加や糖鎖の改変も可能である。即ち、人工的な糖鎖構造を有するタンパク質を生産する手段としても本発明は有用である。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
　本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (12)

  1. 　目的タンパク質を卵白中に生産するトランスジェニック鳥類であって、目的タンパク質をコードする遺伝子と、β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子とが導入されていることを特徴とするトランスジェニック鳥類。
  2. 　β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子が輸卵管膨大部で発現している、請求項１に記載のトランスジェニック鳥類。
  3. 　β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子がニワトリβ1,4-ガラクトース転移酵素１遺伝子である、請求項１又は２に記載のトランスジェニック鳥類。
  4. 　目的タンパク質の天然型が糖鎖付加型タンパク質である、請求項１～３のいずれか一項に記載のトランスジェニック鳥類。
  5. 　目的タンパク質が抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載のトランスジェニック鳥類。
  6. 　（１）～（４）からなる群より選択される方法によって得られるトランスジェニック鳥類又はその子孫である、請求項１～５のいずれか一項に記載のトランスジェニック鳥類、
    （１）少なくとも片方が、目的タンパク質をコードする遺伝子を生殖細胞に保有する雌雄二羽の同種鳥類を用意するステップと、該雌雄二羽の同種鳥類を交配して得られた受精卵を孵卵するステップと、形成された初期胚に対してβ1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を導入し、染色体への該遺伝子の挿入を生じさせるステップと、を含む方法、
    （２）目的タンパク質をコードする遺伝子を生殖細胞に保有する鳥類と、β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を生殖細胞に保有する同種異性鳥類を用意するステップと、該二羽の鳥類を交配して得られた受精卵を孵卵するステップと、を含む方法、
    （３）鳥類受精卵を孵卵するステップと、形成された初期胚に対して目的タンパク質をコードする遺伝子とβ1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を導入し、染色体への該二つの遺伝子の挿入を生じさせるステップと、を含む方法、
    （４）少なくとも片方が、β1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を生殖細胞に保有する雌雄二羽の同種鳥類を用意するステップと、該雌雄二羽の同種鳥類を交配して得られた受精卵を孵卵するステップと、形成された初期胚に対して目的タンパク質をコードする遺伝子を導入し、染色体への該遺伝子の挿入を生じさせるステップと、を含む方法。
  7. 　遺伝子の導入が、該遺伝子を含む複製能欠失型レトロウイルスベクターのインジェクションによって行われる、請求項６に記載のトランスジェニック鳥類。
  8. 　レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項７に記載のトランスジェニック鳥類。
  9. 　鳥類がニワトリである、請求項１～８のいずれか一項に記載のトランスジェニック鳥類。
  10. 　その片方又は両方の生殖細胞に、目的タンパク質をコードする遺伝子が導入されている雌雄二羽の同種鳥類を用意するステップと、該雌雄二羽の同種鳥類を交配して得られた受精卵を孵卵するステップと、形成された初期胚にβ1,4-ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子を導入し、染色体への該遺伝子の挿入を生じさせるステップと、を含む、トランスジェニック鳥類の作製法。
  11. 　以下の（１）又は（２）の交配を行うことを特徴とする、トランスジェニック鳥類の作製法、
    （１）請求項１０に記載の作製法によって得られた雄トランスジェニック鳥類と、請求項１０に記載の作製法によって得られた雌トランスジェニック鳥類との交配、
    （２）請求項１０に記載の作製法によって得られたトランスジェニック鳥類と、同種異性の野生型鳥類との交配。
  12. 　請求項１～９のいずれか一項に記載のトランスジェニック鳥類の卵白から目的タンパク質を回収することを特徴とする、タンパク質の生産法。
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