WO2010003369A1 - 细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂黄芩黄酮有机胺衍生物及其制法和用途 - Google Patents

细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂黄芩黄酮有机胺衍生物及其制法和用途 Download PDF

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张世轩
包永明
孙玉明
李康健
邹亮
马继刚
孙晓丹
尚海燕
李静
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    • C07D311/30—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3 with aromatic rings attached in position 2 only not hydrogenated in the hetero ring, e.g. flavones

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of xanthine flavonoid nitrogen-containing derivatives and methods for their synthesis, and also to the potential use of medical treatment for tumor treatment. Background technique
  • Cell cycle regulation is a very complex and delicate regulatory process that is closely related to cell differentiation, growth, proliferation, and death.
  • the discovery of signaling pathways that regulate cell cycle progression has been an important milestone for the past decade.
  • the molecular feature of human malignant tumors is the uncontrolled release of cell cycle, leading to a lack of cell differentiation and uncontrolled cell growth, leading to infinite proliferation of cells.
  • Many diseases, such as cancer, diabetes, and viral infection are associated with a disorder of a cellular signaling substance, a protein kinase. Cyclin-dependent protein kinase
  • Cdks Cyclin Dependent Kinases
  • ATP adenosine triphosphate
  • Cdks inhibitors can effectively induce cancer cell apoptosis, improve the sensitivity of tumor and AIDS chemotherapy drugs, and inhibit Cdks into a new target for anti-tumor and anti-AIDS drugs.
  • Natural flavonoids are widely found in natural plants and have a variety of biological activities and are natural Cdks inhibitors. However, due to poor water solubility of natural flavonoids, bioavailability is low and biological activity is relatively weak. It has important practical value by modifying the natural flavonoid structure and enhancing its biological activity.
  • NCI National Institutes of Health Cancer Research Institute isolated a large-scale natural anticancer drug screening from the stem and bark of Dysoxylum binectariferum to obtain a nitrogen-containing flavonoid Rohitukine, which showed certain anticancer activity. .
  • Flavopiridol [US-A-5849733] was synthesized as a highly efficient and low toxicity. Flavopiridol is a flavonoid amino derivative. It was first thought to be a tyrosine protein kinase inhibitor, but it was later found to be more potent in inhibiting Cdks and weaker in other kinases. It is also an inhibitor of mRNA transcription. Therefore, Flavopiridol has become the first oral anticancer drug in the United States to enter the clinical trial of the cell cycle, and has entered Phase II clinical trials.
  • Flavopiridol can block the proliferation of HIV-1 in the cell, significantly improve the sensitivity of chemotherapy drugs, and show good anti-cancer and AIDS application prospects. Due to the high inhibitory effect of Flavopiridol on the P-TEFb enzyme, a very small dose can cause a strong killing effect on the HIV-1 virus.
  • Cancer Biology Therapy, 2003, 4, S84, 77, 146; Curr. Pharm. Des., 2006, 12, 1949 An interesting finding is that the apoptosis inhibitor survivin is phosphorylated by Cdkl/Cyclin B, which can be eliminated. Anti-apoptotic activity, while survivin is only expressed in malignant tumors and not in mature tissues.
  • Flavopiridol reduces the concentration of survivin in cells by inhibiting Cdkl/Cyclin B. NCI's Louis Staudt et al. used DNA chip technology to reveal that Flavopiridol induces apoptosis in cancer cells and inhibits the proliferation of HIV to shut down most gene transcriptional mRNAs. However, it does not kill various types of cells, but selectively targets cancer cell. This is because RNA molecules that make cancer cells grow unregulated are very short-lived and completely dependent on the continuous synthesis of mRNA. Once Flavopiridol enters the cell, the mRNA with short duration of mRNA does not degrade rapidly, and this mRNA is rapidly degraded. However, the longevity of normal cellular mRNA molecules still exists.
  • Flavopiridol is an ATP-selective Cdks inhibitor that, unlike cytotoxic anticancer drugs, does not directly kill cells, but induces apoptosis in cancer cells by potently inhibiting cyclin-dependent protein kinase activity, which means that although The subject is a biological process prevalent in all human cells, but because it requires a small dose of pharmaceuticals, it has little damage to normal human cells. [Genome Biology, 2001, 2 (10), 0041.1] Flavopiridol is used interchangeably with cytotoxic drugs to improve the sensitivity of chemotherapeutic drugs, with synergistic synergy and inhibition of multidrug resistance. It can also be used for advanced cancer treatment, which can significantly improve the quality of life of patients and delay life.
  • Flavopiridol has a chiral structure, complex synthetic process, low yield, high cost, high price, large distribution coefficient of lipid water, low blood drug concentration, and serious adverse reactions such as diarrhea. Nevertheless, the discovery of Flavopiridol, an ATP-selective Cdks inhibitor, has brought new ideas and hopes for the treatment of cancer and AIDS.
  • Astragalus membranaceus is a plant of the genus ScMte/ton z baicalensis Geoygi, which is the largest medicinal plant in China.
  • the main active ingredient of Astragalus membranaceus is Astragalus flavonoids, which is as high as 10-20%. It has anti-cancer, anti-bacterial, anti-inflammatory, anti-allergic, anti-oxidation, hypolipidemic, anti-thrombosis and other effects.
  • the hydrolysate of astragalus flavonoid glycosides, baicalein aglycone and baicalein is more active, can induce apoptosis, inhibit cell proliferation, inhibit HIV replication and reverse transcriptase, in anti-tumor and Anti-AIDS and other aspects have shown a unique role and have received widespread attention.
  • the flavonoids of Astragalus membranaceus are insoluble in water, easily oxidized, have a low blood concentration, and the activity intensity does not meet clinical needs. Accordingly, the present invention contemplates the discovery of new high-efficiency, low-toxic ATP-selective Cdks inhibitors by structural modification of xanthine flavone.
  • the flavonoid derivative US-A-5,849,733 discloses the use of thio and oxo derivatives of Flavopiridol as a Cdks inhibitor for the treatment of proliferative diseases.
  • CN16686131A (W02004/004632) discloses flavonoid derivatives as Cdks inhibitors.
  • US-A-5,116,954 discloses flavonoids having antitumor and immunomodulatory activities.
  • CN1990481 discloses a baicalein derivative, a preparation method and use thereof.
  • CN1427003A discloses a baicalin 8-substituted methylamine derivative having inhibitory protein kinase C activity and a process for the preparation thereof.
  • the above patent does not mention the xanthine flavonoid organic amine derivative of the present invention and its use as a Cdks inhibitor. Summary of the invention
  • the present invention hopes to find novel high-efficiency and low-toxic selective Cdks inhibitors by modifying the structure of xanthine flavonoids.
  • the object of the present invention is to provide a preparation method for the synthesis of xanthine flavone organic amine derivatives by using xanthine flavone as a lead compound, baicalein and baicalein, and formaldehyde and an organic secondary amine compound; the anthraquinone flavonoid organic amine derivative forms an acid with an acid, and Formulated with pharmaceutically acceptable excipients for oral or injection applications; it is an effective drug for inhibiting Cdks activity, inhibiting tumor growth and inducing tumor cell apoptosis, and preventing and treating cancer and AIDS.
  • the target compound of the present invention is:
  • R 6 is OH
  • R 8 is piperazine methylene, methyl piperazine methylene, piperazine ethanol methylene, piperazine ethanethiol methylene, piperidinyl methylene, piperidine a ketomethylene group, a hydroxymethylpyrrole methylene group, a pyrrolidinium methylene group or a diethanolamine methylene group
  • R 8 is OC3 ⁇ 4
  • R 6 is a piperazinyl group, a methyl piperazinium group, Piperazine Ethylene Methylene, Piperazine Ethyl Mercaptan Methylene, Piperidinol Methylene, Piperidone Methylene, Hydroxymethylpyrrole Methylene, Pyrrolidin Methylene, Diethanolamine Methylene Base, dimethylamine methylene, pyrrolidinium methylene, piperidinylene, morpholinylmethylene or
  • the compound having the following structure has a better effect: when it is 0H, it is a piperidinol methylene group, a piperazine ethanol methylene group, a piperazine ethanethiol methylene group, a methyl group.
  • piperazine methylene, pyrrolidinium methylene, diethanolamine methylene is a better effect: when it is 0H, it is a piperidinol methylene group, a piperazine ethanol methylene group, a piperazine ethanethiol methylene group, a methyl group.
  • the technical scheme adopted by the invention to solve the technical problems thereof is as follows:
  • the preparation principle of the flavonoid organic amine derivative The traditional Chinese medicine Astragalus membranaceus mainly contains baicalin and baicalin, and the flavonoids of baicalein such as baicalein and wogonin, after enzymatic hydrolysis Separation and purification can obtain baicalein and wogonin.
  • the high-purity xanthine flavonoid organic amine series derivatives can be synthesized by the use of baicalein in the C 8 or Hanaxanthin C 6 position with formaldehyde and organic amines to form Mannich reaction:
  • the process steps are as follows: mixing baicalein or wogonin with formaldehyde solution and organic amine compound in a reaction container, adding methanol of 10-40 times the mass of baicalein or wogonin, at 50-70 ° Stir and condense for l-6h under C; filter, wash the precipitate with 1-20 times of methanol of baicalein or wogonin, wash the precipitate with methanol, and dry to obtain a total of not less than 98% by weight of xanthine flavonoids.
  • the organic amine compound is selected from the group consisting of piperazine, methylpiperazine, piperazine ethanol, piperazine ethanethiol, piperidinol, piperidone, hydroxymethylpyrrole, Pyrrolidone, diethanolamine;
  • the organic amine compound is selected from the group consisting of Pyrazine, methyl piperazine, piperazine ethanol, piperazine ethanethiol, piperidone, hydroxymethylpyrrole, pyrrolidin, diethanolamine, dimethylamine, pyrrolidine, piperidine, morpholine, thiomorpholine .
  • This screening biochemical analysis technique is based on a fluorescence resonance energy transfer (FRET) technique based on the sensitivity of enzymes to phosphorylation of phosphorylated and non-phosphorylated substrates.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the protein kinase transfers the ⁇ -phosphate group of ATP to a residual hydroxyl group of serine or threonine, whereas when a protein kinase inhibitor is present, phosphorylation is blocked.
  • a site-cutting enzyme is added to quench the protein kinase reaction, which allows for site-specific recognition and cleavage of unphosphorylated substrates.
  • Substrate without phosphorylation The FRET system was cleaved and the phosphorylated substrate remained FRET.
  • the disconnected and unbroken substrates are excited at a wavelength of 400 nm, with emission wavelengths at 445 nm and 520 nm, respectively, and the emission ratio is calculated. If the substrate is phosphorylated, the emission ratio will be low indicating little or no inhibition of protein kinase. The effect, high emission ratio, indicates that the substrate is not phosphorylated to have protein kinase inhibition.
  • the flavonoid organic amine derivative to be tested is dissolved in dimethyl sulfoxide to prepare a solution containing 1 mg per 1 ml, and then diluted with 4% dimethyl sulfoxide and protein kinase buffer into 8 different concentrations, Cdkl/ Cyclin B inhibitory activity was determined by the Invitragen Protein Kinase Assay Kit method of operation.
  • the concentration of the final reaction solution of the flavonoid organic amine derivative was controlled to be between 0.01 and 25 ⁇ , and the ⁇ was ⁇ .
  • the activity of Cdkl/Cyclin ⁇ enzyme was controlled between 20-50% of the blank phosphorylation rate, and the screening effect of Cdkl/Cyclin B was inhibited. See Table 1.
  • baicalin showed mild inhibition of Cdkl/Cyclin B activity.
  • the activity is about 9 times higher than that of baicalin.
  • the activity of baicalein monoamine methylene derivative is about 2 times higher than that of baicalein.
  • the activity of the flavonoid organic amine derivative containing more than two new hetero atom types is about 5-7 times higher than that of baicalein, and about 50 times higher than baicalin.
  • the mechanism of action and intensity of action are similar to those of Flavopiridol (IC 5 . 0.30 ⁇ ), a selective ATP binding site Cdks inhibitor, and distinct from the non-selective Cdks poison staurosporin.
  • Sex plays a vital role, and as the number of heteroatoms increases and the lipid-water partition coefficient decreases, activity increases. This is due to the fact that the N atom occupies the amino position in the ATP binding pocket of Cdkl/Cyclin B.
  • the 2 -position it is necessary for the 2 -position to be a hydrophobic substituent group, and a hydrophobic group such as a halogen is introduced to increase the activity, and the introduction of a hydrophilic group such as a hydroxyl group can cause the activity to disappear.
  • This fat-soluble group is not found in ATP, and it may fuse with the hydrophobic pocket of Cdkl/Cyclin B, resulting in a significant change in its configuration.
  • Astragalus flavonoids organic amine derivatives are mainly composed of lipid-water partition coefficient, PBS (pH 7.4) solubility, protein binding rate, elimination phase half-life in rabbits, average steady-state plasma concentration Wait.
  • PBS pH 7.4 solubility
  • the results are shown in Table 1. Only for the current test results, baicalein, baicalepine and piperazine and hydroxypiperazine show good drug-forming properties, wherein the average steady-state plasma concentration is higher than the lead compound baicalein. It is increased by about 1000-3000 times, which is about 100-300 times higher than the reference drug Flavopiridol.
  • baicale pyrrolidone and wogonin diethanolamine have certain application prospects, and the screening of the drug-forming properties of the xanthine organic amine derivatives is underway.
  • Baicalepiperidinol 0. 30 10. 21 40. 05 91 377 28. 7 4. 23 baicalein piperazine 0. 28 13. 1 42. 10 96 607 31. 6 3. 75 baicale pyrrolidin 0. 29
  • Flavopiridol 0. 30 0. 048 35. 90 0. 271 3. 60
  • baicalin for human cervical cancer Hela, human breast cancer MCF-7, human gastric cancer BGC823 cell line at 24, 48, 72 h MTT assay for half inhibition Concentration IC 5 . , as well as in IC 5 .
  • concentration 48 hours after treatment with cancer cells, the proportion of early apoptotic cells and the proportion of late apoptotic cells and necrotic cells were analyzed by flow cytometry using ArmexinV-PI double staining. The results are shown in Table 2.
  • baicalin has strong inhibitory effect on cancer cell growth and apoptosis, and the proportion of apoptosis in early cancer cells is much greater than that in advanced stage.
  • Cdks inhibition is a key mechanism for inducing apoptosis and can be used in medical treatment. Preparation of anticancer drugs.
  • baicalein, baicalepine and piperacitol have a growth inhibition rate of 50.0%, 46.2%, 40.6% for 58 human tumor cells, respectively;
  • ( ⁇ ) The growth rate of WI-38 and HLF in two normal human embryonic lung fibroblasts was consistent with the blank control group, and there was no significant difference.
  • baicalin, baicalepine, and baicalepipetane have obvious anticancer activity, and have almost no effect on normal tissue cells. Metabolite 6-methoxyxanthine of baicalein. The activity of mepazine is weakened.
  • Lymphoid progenitor cells ⁇ 0 3 monoclonal antibodies captured at inducing differentiation growth factors IL-3 and IL-5 Î ⁇ as the results of the measurements for 48h growth inhibition 55.0% and 46.2%, respectively.
  • astragalus flavonoid organic amine series derivative can be formed into salt with pharmaceutically acceptable organic acid or inorganic acid to prepare injectable xanthine flavonoid organic amine salt, which is used for oral preparation or injection.
  • injectable xanthine flavonoid organic amine salt which is used for oral preparation or injection.
  • cancer and AIDS such as injection of xanthine flavonoid organic amine methanesulfonate or injection of xanthine flavone organic amine phosphate.
  • the present invention provides a cyclin-dependent protein kinase inhibitor, anthraquinone flavonoid organic amine derivative, and a preparation method thereof, which is extracted and isolated from the traditional Chinese medicine Astragalus membranaceus
  • the flavonoids of Astragalus membranaceus are obtained by condensing a lead compound with formaldehyde and an organic secondary amine compound.
  • the saponin-dependent protein kinase inhibitor of the present invention is similar to Flavopiridol and P276-00, and is about 50-fold more potent than baicalin, and can selectively induce tumor cell apoptosis in proliferative phase.
  • CD 3 positive T lymphocytes induced apoptosis, while almost no effect on normal tissue, cell cycle inhibitors belonging to the new class of anticancer drugs.
  • the invention has abundant raw materials, simple process, high purity, low cost, clear metabolic mechanism, high efficiency and low toxicity, and can be made into oral preparation or injection by salt formation with acid, and is expected to be a novel high-efficiency and low-toxic cyclin-dependent protein kinase inhibitor.
  • Figure 1 Ascorbate piperazine (8-N-methylpiperazine methylene baicalein) inhibition curve for Cdkl/Cyclin B activity, abscissa is 8-N-methyl piperazine methylene baicalein concentration (nM), the ordinate is the inhibition rate (%) of Cdkl/Cyclin B activity.
  • Baicalepiperidinol [8-hydroxypiperidine methylene baicalein; 5,6,7-trihydroxy-8-(4-hydroxypiperidine) methylene-flavonoid; 5,6,7-trihydroxy-8 Preparation of ((4-hydroxypiperidin- 1 -yl)methyl)-2-phenyl-4H -chromen-4-one] and its mesylate salt:
  • baicalein mesylate salt 13.40 g, mp: 243 °C.
  • Baicale pyrrolidol [8-hydroxypyrrolidium methylene baicalein; 5,6,7-trihydroxy-8-(3-hydroxypyrrole) methylene-flavonoid; 5,6,7-trihydroxy-8- Preparation of ((3-hydroxypyrrolidin-l-yl)methyl)-2-phenyl-4H-chromen-4-on]: 27 g of baicalein, adding 350 ml of methanol, 8.8 g of 3-pyrrolidone, 8.04 ml of a 37% formaldehyde solution, and stirring at 5 (TC for 4 h, the precipitate was filtered off, washed with a small amount of methanol, and dried under reduced pressure at 65 C.
  • Hanxanthin Hydroxypiperazine [6-N-Hydroxyethylpiperazine Methylene Hanaxanthin; 5,7-Dihydroxy-8-methoxy-6-N-hydroxyethylpiperazine Methylene-flavonoid 6- ( (4- (2-hydroxyethyl ) piperazin-l-yl ) methyl ) -5,
  • Trehalin diethanolamine [6-diethanolamine methylene hemoside; 5,7-dihydroxy-8-methoxy-6-diethanolamine methylene-flavonoid; 6-((bis(2-hydroxyethyl)) Preparation of amino)methyl)-5,7-dihydroxy-8-methoxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one]:

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Description

细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂黄芩黄酮有机胺衍生物及其制法和用途 技术领域
本发明涉及黄芩黄酮含氮衍生物及其合成方法的技术领域， 同时也涉及对 肿瘤治疗的医疗的潜在用途。 背景技术
细胞周期调控是一个非常复杂和精细的调节过程， 它与细胞的分化、 生长、 增殖和死亡有着紧密的关系。 在过去的十几年里， 调控细胞周期进程的信号传 导途径的发现是一个重要的里程碑。 人恶性肿瘤的分子特征是细胞周期调节的 失控， 引起细胞分化的缺乏和细胞生长的失控， 导致细胞无限增殖。 其中癌症， 糖尿病， 病毒感染等许多疾病都与一种细胞信号传导物质一蛋白激酶的混乱有 关。 人类基因编码的 600多种蛋白激酶已被发现， 其中细胞周期素依赖蛋白激酶
(Cyclin Dependent Kinases, Cdks) 是控制细胞循环与增殖过程的重要调节者。 Cdks是一种丝氨酸 /苏氨酸的蛋白磷酸激酶， 与所对应的周期蛋白 （Cyclin) 形 成的蛋白复合物通过控制细胞循环的关键部分来实现细胞周期高效有序的运 转。 Cdks可以激发三磷酸腺苷 （ATP ) 磷酸化宿主细胞蛋白的丝氨酸或苏氨酸 残基而发挥作用， 而磷酸化蛋白具有调节各种细胞蛋白的活性。 有丝分裂是由 Cdkl/Cyclin B激活驱动的理论已被广泛认可。已发现 90%的肿瘤形成是由于 Cdks 被高度激活导致肿瘤抑制蛋白 Rb被磷酸化， 使 Rb程路径失活。 Cdks抑制剂可有 效地诱导癌细胞凋亡， 提高肿瘤和艾滋病化疗药物的敏感性， 对 Cdks的抑制成 为抗肿瘤和抗艾滋病药物研究的新靶点。 [Science,2004,303,1800 ; The AAPS Journal,2006,8,E204; Cancer Biology Therapy, 2003, 4, S84]
天然黄酮类化合物广泛存在于天然植物中， 具有多种生物活性， 是天然的 Cdks抑制剂。 但是， 由于天然黄酮类化合物的水溶性差， 生物利用度低， 生物 活性相对较弱。 通过对天然黄酮结构修饰， 增强其生物活性， 具有重要的实用 价值。 1994 年美国国家卫生研究院癌症研究所 （NCI) 在全球大规模天然抗癌 药物筛选中， 从 Dysoxylum binectariferum的茎和树皮中分离得到一种含氮的黄 酮 Rohitukine, 显示具有一定的抗癌活性。 以此为先导化合物， Aventis公司研制 合成了第一个作为高效低毒的 Cdks抑制剂 Flavopiridol[US-A-5849733]。 Flavopiridol是一种黄酮胺基衍生物。 最早被认为是酪氨酸蛋白激酶抑制剂， 但 后来发现其抑制 Cdks活性更强， 而对其它激酶作用较弱， 它也是 mRNA转录抑 制剂。 因此， Flavopiridol成为美国第一个针对细胞周期进入临床试验的可口服 抗癌药物， 已经进入 II期临床试验。 美国 Iowa州立大学的研究人员同时还发现 Flavopiridol可阻碍艾滋病病毒 HIV— 1在细胞内的增殖， 能显著提高化疗药物的 敏感性， 显示了良好的抗癌和艾滋病应用前景。 由于 Flavopiridol对 P-TEFb酶具 有高度的抑制力， 很小剂量即能对 HIV-1 病毒产生极强的杀伤力。 [Cancer Biology Therapy, 2003, 4, S84， 77, 146； Curr. Pharm. Des., 2006, 12, 1949] 一个有 趣的发现是细胞凋亡抑制剂 survivin被 Cdkl/Cyclin B磷酸化， 可取消其抗凋亡活 性， 而 survivin只在恶性肿瘤中表达， 不在成熟的组织中表达。 Flavopiridol通过 抑制 Cdkl/Cyclin B 而降低 survivin在细胞中的浓度。 NCI的 Louis Staudt 等用 DNA芯片技术揭示了 Flavopiridol诱导癌细胞凋亡及其抑制 HIV增殖机理为能够 关闭大多数基因转录 mRNA, 然而它并没有杀死各种类型的细胞，只是有选择性 的针对癌细胞。 这是由于使癌细胞无节制生长的 RNA分子是非常短命的， 完全 依赖 mRNA的持续合成， 一旦 Flavopiridol进入细胞， mRNA持续时间短的基因产 生 mRNA的速度没有降解的快， 这种 mRNA迅速被降解， 而正常细胞 mRNA分子 寿命长的却仍旧存在。 Flavopiridol为 ATP选择性 Cdks抑制剂与细胞毒类抗癌药物 不同， 并不是直接杀伤细胞， 而是通过强效抑制细胞周期素依赖蛋白激酶活性 来诱导癌细胞凋亡， 这就意味着虽然作用的对象是一种所有人体细胞中普遍存 在的生物过程， 但由于其所需的药用剂量很小， 因此对人体正常细胞几乎没有 伤害。 [Genome Biology, 2001， 2 ( 10) ,0041.1] Flavopiridol与细胞毒类治疗药 物交替使用， 能有效提高化疗药物的敏感性， 具有明显的减毒增效协同以及抑 制"多药耐药性"作用， 也可用于癌症晚期治疗， 能明显改善患者生存质量， 延缓 生命。 但是 Flavopiridol具有手性结构， 合成工艺复杂， 产率较低， 成本较高， 价格昂贵， 脂水分配系数较大， 血药浓度较低， 同时还存在着严重腹泻等不良 反应。尽管如此，作为 ATP选择性 Cdks抑制剂 Flavopiridol的发现还是给癌症和艾 滋病的治疗带来了新的理念与希望。
2008年 Kalpan S. Joshi等在全合成了一种新的黄酮有机胺类 Cdks抑制剂 P276-00 [CN1668613 1A (W02004/004632 ) ]， 对 12种人肿瘤细胞具有明显的抑 制活性，而对 2株正常组织细胞人胚胎肺纤维细胞几乎无影响， 无严重腹泻等不 良反应， 毒性较 Flavopiridol低， 已完成 II期临床， 但是似乎也存在脂水分配系 数较大， 血药浓度较低等问题。 [Molecular Cancer Therapeutics, 2007, 6， 918]。
黄苳为唇形科植物 ScMte/ton z baicalensis Geoygi , 是中国人工种植量最大的 药材品种。 黄芩的主要有效成分为黄芩黄酮， 含量高达 10-20%。 具有抗癌， 抑 菌， 抗炎， 抗变态反应， 抗氧化， 降血脂， 抗血栓等作用。 作为天然的 CDKs抑 制剂， 黄芩黄酮苷的水解产物黄芩黄酮苷元黄芩素和汉黄芩素等活性更强， 能 诱导细胞凋亡， 抑制细胞增殖， 抑制 HIV复制与逆转录酶， 在抗肿瘤和抗艾滋病 等方面显示出有独特的作用， 受到了广泛关注。 [Cancer Treatment Reviews , 2009， 35， 57] 但是黄芩黄酮不溶于水， 容易被氧化， 血药浓度较低， 活性强 度达不到临床需要。 因此， 本发明希望通过对黄芩黄酮进行结构修饰来寻找新 型高效低毒的 ATP选择性 Cdks抑制剂。
有关黄酮衍生物 US-A-5849733 公开了 Flavopiridol的硫代和氧代衍生物作 为 Cdks抑制剂用于治疗增生疾病 CN16686131A (W02004/004632 )公开了作为 Cdks 抑制剂的黄酮衍生物。 US-A-5116954 公开了具有抗肿瘤和免疫调节活性 的黄酮类化合物。 CN1990481 公开了一种黄芩素衍生物及其制法与用途。
CN1427003A公开了具有抑制蛋白激酶 C活性的黄芩素 8-位取代的甲胺类衍生 物及其制备方法。 上述专利并未提到本发明所涉及的黄芩黄酮有机胺衍生物， 以及作为 Cdks抑制剂的用途。 发明内容
本发明希望通过对黄芩黄酮结构修饰来寻找新型高效低毒的选择性 Cdks 抑制剂。 本发明的目的是： 提供用黄芩黄酮为先导化合物黄芩素和黄芩素与甲 醛和有机仲胺类化合物缩合成黄芩黄酮有机胺衍生物的制备方法； 黄芩黄酮有 机胺衍生物与酸成盐， 并与药学上可以接受的辅料配合制成口服或注射等有利 应用的剂型； 使其成为抑制 Cdks 活性， 抑制肿瘤生长并诱导肿瘤细胞凋亡， 以 及在预防和治疗癌症和艾滋病方面等有效药物。
本发明的目标化合物黄芩黄酮有机胺衍生物为：
Figure imgf000006_0001
其中： R6 为 OH时， R8为 哌嗪亚甲基， 甲基哌嗪亚甲基， 哌嗪乙醇亚甲基， 哌 嗪乙硫醇亚甲基， 哌啶醇亚甲基， 哌啶酮亚甲基， 羟甲基吡咯垸亚甲基， 吡咯 垸醇亚甲基或二乙醇胺亚甲基； R8为 OC¾时， R6为哌嗪亚甲基， 甲基哌嗪亚甲 基， 哌嗪乙醇亚甲基， 哌嗪乙硫醇亚甲基， 哌啶醇亚甲基， 哌啶酮亚甲基， 羟甲 基吡咯垸亚甲基， 吡咯垸醇亚甲基， 二乙醇胺亚甲基， 二甲胺亚甲基， 吡咯垸亚 甲基， 哌啶亚甲基， 吗啉亚甲基或硫吗啉亚甲基。
以上所述黄芩黄酮有机胺衍生物中，以如下结构的化合物效果较好：以 为 0H时， 为哌啶醇亚甲基， 哌嗪乙醇亚甲基， 哌嗪乙硫醇亚甲基， 甲基哌嗪亚甲 基， 吡咯垸醇亚甲基、 二乙醇胺亚甲基中的一种； 或 /和 为 0CH3时， R6为哌嗪乙 醇亚甲基， 哌啶醇亚甲基，甲基哌嗪亚甲基， 吡咯垸醇亚甲基， 二乙醇胺亚甲基 中的一种。 特别是在 为 0H时， 为哌啶醇亚甲基， 吡咯醇亚甲基或哌嗪乙醇亚 甲基； 为 0CH3时， R6为哌嗪乙醇亚甲基， 哌啶醇亚甲基， 吡咯垸醇亚甲基或二 乙醇胺亚甲基时效果更好。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 黄芩黄酮有机胺衍生物的制 备原理： 中药黄芩中主要含有黄芩苷和汉黄芩苷， 以及黄芩素和汉黄芩素等黄 芩黄酮， 经酶水解后， 分离提纯可得到黄芩素和汉黄芩素。 利用黄芩素在 C8或汉 黄芩素 C6位与甲醛和有机胺发生 Manni ch反应， 可合成出高纯度黄芩黄酮有机胺 系列衍生物：
黄芩药材
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黄芩素 Mnnich碱衍生物 汉黄芩素 Mnnich碱衍生物
黄芩黄酮有机胺衍生物的制备方法， 以黄芩黄酮先导化合物黄芩素或汉黄 芩素与甲醛溶液和有机胺类化合物反应而成； 其原料摩尔配比为： 黄芩素或汉 黄芩素： 甲醛溶液： 有机胺类化合物 = 1 : 1-1.2： 1-1.2；
工艺步骤为： 将黄芩素或汉黄芩素， 与甲醛溶液和有机胺类化合物按比例 在反应容器中混合均匀， 加入为黄芩素或汉黄芩素质量 10-40倍的甲醇， 在 50-70 °C下搅拌缩合 l-6h; 过滤， 用黄芩素或汉黄芩素质量 1-20倍的甲醇洗涤沉 淀， 甲醇洗涤沉淀， 干燥， 得含量不少于 98 % (重量） 的黄芩黄酮有机胺衍生 当黄芩黄酮先导化合物选自黄芩素时， 所述有机胺类化合物选自哌嗪， 甲基 哌嗪， 哌嗪乙醇， 哌嗪乙硫醇， 哌啶醇， 哌啶酮， 羟甲基吡咯垸， 吡咯垸醇， 二乙醇胺； 当黄芩黄酮导化合物选自汉黄芩素时， 所述有机胺类化合物选自哌 嗪， 甲基哌嗪， 哌嗪乙醇， 哌嗪乙硫醇， 哌啶酮， 羟甲基吡咯垸， 吡咯垸醇， 二乙醇胺， 二甲胺， 吡咯垸， 哌啶， 吗啉， 硫吗啉。
黄芩素衍生物对 Cdkl/Cyclin B抑制作用筛选： 该筛选生化分析技术是基于酶 对磷酸化和非磷酸化底物水解的灵敏性不同的一种荧光共振能量转移技术 (Fluorescence resonance energy transfer FRET) 测定米用——禾中合成的缩氛酸底物， 这种底物是由带有荧光供体香豆素和受体荧光素共同组成的 FRET。 在初级反应 中， 蛋白激酶将 ATP的 γ磷酸基转移到一个丝氨酸或者苏氨酸残余羟基上， 然而 当蛋白激酶抑制剂存在时， 磷酸化受阻。 在接下来的反应中， 加入一种定点切 断酶， 淬灭了蛋白激酶反应， 这种定点切断酶能定点识别和切断未被磷酸化的 底物。没有磷酸化的底物 FRET系统被断开， 而磷酸化底物依然维持 FRET。断开 的和没有断开的底物在 400nm波长激发，分别在 445nm和 520nm波长有发射波长， 计算发射比， 如果底物被磷酸化后发射比会比较低表明很少或者没有蛋白激酶 的抑制作用， 发射比高则表明底物没有被磷酸化从而具有蛋白激酶的抑制作用。
将待测黄芩黄酮有机胺衍生物用二甲基亚砜溶解，制成每 lml含 lmg的溶液， 再依次用 4%二甲基亚砜和蛋白激酶缓冲液稀释成 8个不同浓度， Cdkl/Cyclin B 抑制活性按 Invitragen公司蛋白激酶分析试剂盒操作方法测定。 黄芩黄酮有机胺 衍生物最终反应液浓度控制在 0.01-25μΜ之间， ΑΤΡ为 ΙΟμΜ, Cdkl/Cyclin Β酶活 力控制在空白磷酸化率 20-50%之间， 对 Cdkl/Cyclin B抑制作用筛选结果见表 1。 结果显示： 黄芩苷对 Cdkl/Cyclin B活性显示有轻度抑制作用。 当被水解为黄芩 素时， 活性比黄芩苷提高约 9倍。 黄芩素 单胺亚甲基衍生物活性比黄芩素提高 约 2倍。 含有 2个以上杂原子新结构类型化合物黄酮有机胺衍生物活性比黄芩素 提高了约 5-7倍， 比黄芩苷提高了约 50多倍， 作用机理和作用强度与 Flavopiridol 相近 (IC5。为 0.30μΜ)，为选择性 ATP结合位点 Cdks抑制剂，而有别于非选择性 Cdks 毒剂星孢菌素。其中， 8-N-甲基哌嗪亚甲基黄芩素对 Cdkl/Cyclin B活性抑制作用 测定结果曲线见图 1。 研究果显示部分黄芩黄酮有机胺衍生物具有较强的抑制 Cdkl/Cyclin B活性作用， 在预防和治疗癌症和艾滋病方面具有良好应用前景。
构效关系推论：
( 1 ) 位含氮取代基的存在与位置对 Cdkl/Cyclin B的抑制活
性起到了至关重要的作用， 且随着杂原子数目增多以及脂水分配系数降低， 活 性增强。 这是由于 N原子占据了 Cdkl/Cyclin B的 ATP结合口袋中氨基位的原因。
(2 ) C4=0， C5 = -OH， C7 = -OH是必需基团， 酚羟基的缺失以及甲基化都 会影响到抑制活性， 增加 C6 = -OH， 活性增强， 这是由于该组酸性基团占据了 Cdkl/Cyclin B的 ATP结合口袋中磷酸位的缘故。
(3 ) 2位为疏水取代基团是必须的， 再引入卤素等疏水性基团， 活性增加， 而羟基等亲水基团的引入， 可使活性消失。 这种脂溶性基团是 ATP所不具有的， 它可能与 Cdkl/Cyclin B的疏水性口袋融合， 导致其构型发生明显的改变。
黄芩黄酮有机胺衍生物成药性筛选： 黄芩黄酮有机胺衍生物成药性主要包 括脂水分配系数， PBS (pH7.4)溶解度， 蛋白结合率， 家兔体内消除相半衰期， 平均稳态血桨浓度等。 结果见表 1， 仅就目前检测结果而言黄芩素哌啶醇、 黄芩 素羟哌嗪和汉黄芩素羟哌嗪和表现出良好的成药性， 其中平均稳态血桨浓度比 先导化合物黄芩素提高了约 1000-3000倍,比对照药 Flavopiridol提高了约 100-300 倍。 此外， 黄芩素吡咯醇和汉黄芩素二乙醇胺也有一定的应用前景， 其黄芩黄 酮有机胺衍生物成药性的筛选正在进行之中。
表 1. 黄芩黄酮有机胺衍生物成药性筛选
黄芩黄酮及其有 Cycl in MCT-7 MCF-7 蛋白 PBS 禾、太/ 消除
ρΗ7. 4
机碱衍生物 B/Cdkl GI50 LC50 中 溶 血浆 相半
IC50 ( μ Μ) ( μ Μ) 解 度 浓度 衰期
( μ Μ)
( μ Μ) (%) ( μ Μ) (h) 黄芩素苷 18. 15
黄芩素 2. 08 0. 026 5. 26 黄芩素二甲胺 1. 05 12. 33 37. 07
黄芩素吡咯烷 1. 22 10. 33 34. 53
黄芩素哌啶 1. 28 10. 50 37. 17
黄芩素吗啉 0. 30 10. 13 48. 90
黄芩素硫吗啉 0. 38 14. 17 84. 33
黄芩素哌嗪 0. 28 13. 80 53. 10 166
黄芩素甲哌嗪 0. 29 10. 90 37. 23 98 6. 02
黄芩素哌啶醇 0. 30 10. 21 40. 05 91 377 28. 7 4. 23 黄芩素羟哌嗪 0. 28 13. 1 42. 10 96 607 31. 6 3. 75 黄芩素吡咯醇 0. 29
6-甲氧基黄芩素 0. 88 26. 10 〉100 甲哌嗪
汉黄芩素 3. 50
汉黄芩素二甲胺 7. 63
汉黄芩素吡咯烷 17. 21
汉黄芩素哌啶 10. 50
汉黄芩素吗啉 〉25
汉黄芩素硫吗啉 3. 17
汉黄芩素哌嗪 6. 62
汉黄芩素甲哌嗪 〉25
汉黄芩素哌啶醇 6. 91
汉黄芩素羟哌嗪 0. 32 11. 1 43. 10 9390 94. 0 4. 00 汉黄芩素二乙醇 0. 31
胺
Flavopiridol 0. 30 0. 048 35. 90 0. 271 3. 60
P276-00 0. 79
(注： 空格为尚未检测）
黄芩素甲哌嗪抑制人癌细胞生长并诱导凋亡作用： 黄芩素甲哌嗪对人宫颈 癌 Hela、 人乳腺癌 MCF-7、 人胃癌 BGC823细胞株在 24、 48、 72h MTT法测定半 数抑制浓度 IC5。， 以及在 IC5。浓度下， 作用于癌细胞 48h后， 用 ArmexinV- PI双染 检测流式细胞仪分析早期凋亡细胞的比例， 晚期凋亡细胞和坏死细胞比例， 测 定结果见表 2。 结果表明： 黄芩素甲哌嗪具有较强的抑制癌细胞生长和诱导凋亡 作用， 其中诱导早期癌细胞凋亡比例远大于晚期， 其中 Cdks抑制是诱导凋亡的 关键机制， 在医疗上可用于制备抗癌药物。
表 2. 黄芩素甲哌嗪对人癌细胞生长抑制与诱导凋亡
IC6„ ( μ Μ) HeLa MCF-7 BGC823
24 h 12. 8 ±0· 20 13. 7 ±0· 21 9. 6 ±0· 21
48 h 8. 2 ±0· 15 10. 6 ±0· 17 7. 2 ±0· 23
72 h 6. 7 ±0· 24 7. 4±0· 25 6. 5 ±0· 19
早期凋亡细胞 （％) 67. 3 72. 3 69. 2 晚期凋亡和坏死细胞 （％) 27. 1 23. 1 22. 2 黄芩黄酮有机胺衍生物体外抗癌活性筛选： 黄芩素甲哌嗪、 黄芩素羟哌嗪、 黄芩素哌啶醇、 以及黄芩素甲哌嗪的代谢物 6-甲氧基黄芩素甲哌嗪对人前列腺 PC3、人乳腺癌 MCF-7、人胃癌 BGC823细胞株在 48h体外抗癌活性测定结果见表 3。 与 NCI合作研究结果： ΙΟμΜ黄芩素甲哌嗪、 黄芩素羟哌嗪和黄芩素哌啶醇对 人 58种人肿瘤细胞体夕卜 48h生长抑制率分别为 50.0%, 46.2%, 40.6%;但是（ ΙΟΟμΜ) 对 2种正常人胚胎肺纤维细胞 WI-38以及 HLF体外 48h生长率与空白对照组基本 一致,无明显差异。 结果表明： 黄芩素甲哌嗪、 黄芩素羟哌嗪和黄芩素哌啶醇具 有明显的抗癌活性，对正常组织细胞几乎无影响，黄芩素甲哌嗪的代谢物 6-甲氧 基黄芩素甲哌嗪活性减弱。
表 3.黄芩黄酮有机胺衍生物体外抗癌活性
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黄芩黄酮有机胺衍生物对 T淋巴祖细胞分化的影响： ΙΟμΜ汉黄芩素羟哌嗪 和黄芩素哌啶醇对。03单克隆抗体捕获的淋巴 Τ祖细胞体外在生长因子 IL-3 和 IL-5等诱导下分化为 Τ细胞 48h生长抑制率测定结果分别为 55.0%和 46.2%。 结 果表明： 汉黄芩素羟哌嗪和黄芩素哌啶醇可诱导 CD3阳性 T淋巴细胞凋亡， 预测 也可诱导 HIV病毒感染的 CD3阳性 T淋巴细胞凋亡， 其中 Cdks抑制是这种诱导凋 亡的关键机制， 显示出对艾滋病的良好应用前景，在医疗上可用于制备抗艾滋病
黄芩素甲哌嗪家兔体内主要代谢过程： 高效液相-质谱-紫外光谱（LC-MSn) 检测结果表明： 黄芩素甲哌嗪进入家兔体内后， 迅速分布到各组织， 蛋白结合 率为 98%, 呈现浓度非依赖性。 主要代谢途： （1 )首先 6位羟基被葡萄糖醛酸化 为 8-N-甲基哌嗪亚甲基异黄芩苷； （2 ) 进入组织的药物 6位羟基被甲基化为 6-甲 氧基 -8-N-甲基哌嗪亚甲基黄芩素， 然后进入肝脏后 7羟基再被葡萄糖醛酸化为 6- 甲氧基 -8-N-甲基哌嗪亚甲基黄芩苷； （3 ) 进入组织的药物经历了水解， 重排为 4\ 5， 6， 7-四羟基 -8-氨甲基查耳酮， 在分子内 schiff化重排为代谢物 m/z=179。 代谢产物主要由尿液排除体外。代谢物 6-甲氧基 -8-N-甲基哌嗪亚甲基黄芩素（即 6-甲氧黄芩素甲哌嗪）抑制 Cdkl/Cyclin B活性和抗肿瘤活性均降低（结果见表 1 )。
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6-甲氧基 -8-N-甲基哌嗪亚甲基黄芩素 6-甲氧基 -8-N-甲基哌嗪亚甲基黄芩苷 高纯度黄芩黄酮有机胺系列衍生物， 黄芩黄酮有机胺系列衍生物可与药学上 可接受的有机酸或无机酸成盐， 制成注射用黄芩黄酮有机胺酸盐， 制成口服制 剂或注射剂用于癌症和艾滋病的治疗， 如注射用黄芩黄酮有机胺甲磺酸盐或注 射用黄芩黄酮有机胺磷酸盐等。
与现有技术相比， 本发明突出的优点在于： 本发明提供了一种细胞周期素 依赖蛋白激酶抑制剂黄芩黄酮有机胺衍生物及其制法， 该衍生物是从中药黄芩 中提取分离得到的黄芩黄酮为先导化合物与甲醛和有机仲胺类化合物缩合制得 的。 成药性初步研究表明本发明的黄芩黄酮有机胺衍生物对细胞周期素依赖蛋 白激酶抑制强度与 Flavopiridol和 P276-00类似， 比黄芩苷提高约 50多倍， 能选择 性诱导增殖期肿瘤细胞凋亡， 诱导 CD3阳性 T淋巴细胞凋亡,而对正常组织几乎无 影响， 属于新型细胞周期抑制剂类抗肿瘤药物。 本发明原料来源丰富， 工艺简 捷， 纯度高， 成本低， 代谢机理明确， 高效低毒， 与酸成盐可制成口服制剂或 注射剂， 有望成为新型高效低毒的周期素依赖蛋白激酶抑制剂类抗癌和艾滋病 附图说明
图 1 : 黄芩素甲哌嗪 （8-N-甲基哌嗪亚甲基黄芩素） 对 Cdkl/Cyclin B活性抑 制测定曲线， 横坐标为 8-N-甲基哌嗪亚甲基黄芩素浓度 （nM)， 纵坐标为对 Cdkl/Cyclin B活性抑制率 （％ )。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例 1
黄芩素甲哌嗪 [8-N-甲基哌嗪亚甲基黄芩素； 5,6,7-三羟基 -8-N-甲基哌嗪亚甲 基 - 黄 酮 ； 5,6,7-trihydroxy-8-((4-methylpiperazin-l-yl)methyl)-2-phenyl-4H -chromen-4-one] 的制备：
取黄芩素 100g, 加入甲醇 2L， 甲基哌嗪 45g， 37%甲醛溶液 36.5ml， 在 55°C 下搅拌 4h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 干燥， 得到浅黄色固体 113g， 含量为99.9%。111 .：280〜282 °( ; 1；¥: 11^ （乙醇） 278， 330 nm; MS: (API-ES ) m/z 383.1 [M+H]+, 405.1 [M+Na]+； IR: 3400， 3050， 2925 , 2861， 1637， 1570, 1509 cm" 1 ; lR NMR (DMSO- 6/CF3COOD, 400 MHz) ： (5 2.14 (s, 3H, CH3), 2.62 (s, 8H, N-CH2)， 3.96(s, 2H, 8-CH2), 6.87 (s, 1H， 3-H)， 7.46-7.54 (m, 3H, Ar-H), 8.01-8.02(m, 2H, Ar-H), 8.1 l(s, 6-OH), 12.64 (s, 1H， 5-OH)。 实施例 2
黄芩素羟哌嗪 [8-N-羟乙哌嗪亚甲基黄芩素； 5,6,7-三羟基 -8-N-羟乙基哌嗪亚 甲 基 - 黄 酮 ； 5,6,7-trihydroxy-8-((4-(2-hydroxyethyl)piperazin-l-yl)methyl)-2 -phenyl-4H-chromen-4-one]的制备：
称取黄芩素 27g，加入甲醇 350ml，羟乙基哌嗪 13.1g， 37%的甲醛溶液 8.04ml， 51 °C加热搅拌 4h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 抽干， 55°C减压干燥， 得黄色粉末 40.3g, 含量为 98.5%,m.p.:192°C。 MS: (API-ES) m/z 413.3 [M+H]+, 825.5 [2M+H]+ ,847.5 [2M+Na]+； ¾ NMR (DMSO- 6/CF3COOD, 400 MHz) ： δ 8.18-8.19(m, 2H, Ar-2 ',6 '-Η), 7.61-7.67(m, 3H, Ar-3 ',4 ',5 '-Η), 7.09(s, IH, 3-H), 4.73(s, 2H, CH2), 3.76(t, 2H, -CH2-OH), 3.59-3.69(m, 8H, CH2), 3.33(t, 2H,
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实施例 3
黄芩素哌啶醇 [8-羟基哌啶亚甲基黄芩素； 5,6,7-三羟基 -8- (4-羟基哌啶） 亚 甲基-黄酮； 5 ,6,7-trihydroxy-8-((4-hydroxypiperidin- 1 -yl)methyl)-2-phenyl-4H -chromen-4-one] 及其甲磺酸盐的制备：
称取黄芩素 27g，加入甲醇 350ml，哌啶醇（4) 10.2g, 37%的甲醛溶液 8.04ml， 51 °C加热搅拌 4h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 抽干， 55°C减压干燥， 得黄色粉末 37.02g, 含量为 99.2%, m.p.:221 °C 。 MS: (API-ES ) m/z 384.2 [M+H]+， 767.5 [2M+H]+ ,789.5 [2M+Na]+ ； ¾ NMR (DMSO- 6, 400 MHz) ： δ 8.05-8.07(m: 2H, Ar-2 ',6 '-Η), 7.58-7.59(m, 3H, Ar-3 ',4 ',5 '-Η), 6.87(s, IH, 3-H), 4.17(s, 2H, CH2), 3.67(m, IH, CH), 2.68,3.03(m, 2H, CH2), 2.71,3.05(m, 2H, CH2), 1.52,1.82(m, 2H, CH2), 1.53,1.84(m, 2H, CH2)。
称取黄芩素哌啶醇 ll.OOg, 加入无水乙醇 100ml, 室温搅拌均匀， 加入甲磺酸 3.07g， 搅拌， 将析出的沉淀滤出， 用少量无水乙醇洗涤， 65°C减压干燥， 即得 黄芩素哌啶醇甲磺酸盐浅黄色粉末 13.40g, m.p.:243 °C。 实施例 4
黄芩素吡咯醇 [8-羟基吡咯垸亚甲基黄芩素； 5,6,7-三羟基 -8- (3-羟基吡咯垸） 亚 甲 基 - 黄 酮 ； 5,6,7-trihydroxy-8-((3-hydroxypyrrolidin-l-yl)methyl)-2- phenyl-4H-chromen-4-on] 的制备： 黄芩素 27g， 加入甲醇 350ml， 3-吡咯垸醇 8.8g， 37%的甲醛溶液 8.04ml， 在 5(T C下搅拌 4h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 65 C减压干燥， 得到 浅黄色固体 36.0g, 含量为 99.0%。 MS: (API-ES ) /z 370.1 [M+H]+, 739.2 [2M+H]+ , 761.2 [2M+Na]+ ； ¾ NMR (DMSO- 6, 400 MHz) ： δ 8.05-8.07(m, 2H, Ar-2 ',6 '-Η), 7.58-7.59(m, 3H, Ar-3 ',4 ',5 '-Η), 6.87(s, IH, 3-H), 4.17(s, 2H, CH2), 3.32(m, IH, CH), 2.28, 2.53 (m, 2H, CH2), 2.20,2.30(m, 2H, CH2), 1.81 , 1.62(m, 2H, CH2)。 实施例 5
汉黄芩素甲哌嗪 [6-N-甲基哌嗪亚甲基汉黄芩素； 5,7-二羟基 -8-甲氧基 -6-N- 甲基哌嗪亚甲基-黄酮； 6- ( ( 4-methylpiperazin- l-yl ) methyl ) -5， 7- dihydroxy-8-methoxy~2-phenyl-4H-chromen-4-one] 的制备：
取汉黄芩素 28.4g, 加入甲醇 350ml， 甲基哌嗪 10.1g， 37%甲醛溶液 8.04ml， 在 51 C下搅拌 4h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 干燥， 得到橙红色固 体 38.6g， 含量为 99·7%， m.p.: 179 °C。 MS: (API-ES ) m/z 397.5 [M+H]+ , 419.5 [M+Na]+ ； ¾ NMR (DMSO- 6/CF3COOD, 400 MHz) ： i58.12-8.14(m, 2H, Ar-2 ',6 '-Η), 7.64-7.66(m, 3H, Ar-3 ',4 ',5 '-Η), 7.15(s, IH, 3-H), 4.44(s, 2H, CH2), 3.96(s, 3H, 8-OCH3), 3.43-3.74(m, 8H, CH2), 2.93(s, 3H, N-CH3)。 实施例 6
汉黄芩素羟哌嗪 [6-N-羟乙基哌嗪亚甲基汉黄芩素； 5,7-二羟基 -8-甲氧基 -6-N- 羟乙基哌嗪亚甲基-黄酮； 6- ( (4- (2-hydroxyethyl ) piperazin-l-yl ) methyl ) -5，
7- dihydroxy-8-methoxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one] 的制备：
汉黄芩素 28.4g， 加入甲醇 350ml， 羟乙基哌嗪 13.1 g， 37%甲醛溶液 100ml , 在 5(T C下搅拌 4h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 65 C减压干燥， 得到 浅黄色固体 41.7g，含量为 99·5%。 MS: (API-ES ) /z 427·5 [M+H]+， 449.5 [M+Na]+; ¾ NMR (DMSO- 6/CF3COOD, 400 MHz) ： δ 8.11 -8.13(m, 2H, Ar-2 ',6 '-Η), 7.62-7.67(m, 3H, Ar-3 ',4 ',5 '-Η), 7.11 (s, IH, 3-H), 4.45(s, 2H, CH2), 3.98(s, 3H,
8- OCH3), 3.78(t, 2H, -CH2-OH), 3.49-3.69(m, 8H, CH2), 3.36(t, 2H, N-CH2)。 实施例 7 汉黄芩素哌啶醇 [6-羟基哌啶亚甲基汉黄芩素； 5,7-二羟基 -8-甲氧基 -6- (4-羟 基哌啶） 亚甲基-黄酮； 5,7-dihydroxy-6- ((4-hydroxypiperidin- 1 -yl)methyl)-8- methoxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one] 的制备：
取汉黄芩素 28.4g，加入甲醇 350ml，哌啶醇（4) 10.2g， 37%的甲醛溶液 8.04ml， 在 5(T C下搅拌 4h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 65°C减压干燥， 得到 橙红色固体 38.5g, 含量为 99·4%。 MS: (API-ES ) /z 398·5 [M+H]+, 420.5 [M+Na]+ ； ¾ NMR (DMSO- 6, 400 MHz) ： (5 8.05-8.06(m, 2H, Ar-2 ',6 '-Η), 7.60-7.61(m, 3H, Ar-3 ',4 ',5 '-Η), 6.90(s, 1H, 3-H), 3.94(s, 2H, CH2), 3.83(s, 3H, 8-OCH3), 3.65-3.67(m, 1H, CH), 2.62,2.98(m, 4H, CH2), 1.51,1.83(m, 4H, CH2)。 实施例 8
汉黄芩素二乙醇胺 [6-二乙醇胺亚甲基汉黄芩素； 5,7-二羟基 -8-甲氧基 -6-二乙 醇胺亚 甲基 -黄酮； 6-((bis(2-hydroxyethyl)amino)methyl)-5,7-dihydroxy-8- methoxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one]的制备：
汉黄芩素 28.4g， 加入甲醇 350ml， 二乙醇胺 10.5g， 37%的甲醛溶液 8.04ml， 在 55 C下搅拌 4h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 65 C减压干燥， 得到 浅黄色固体 39.3g, 含量为 99.2%。 MS: (API-ES ) m/z 402.4 [M+H]+， 424.4 [M+Na]+； ¾ NMR (DMSO- 6, 400 MHz) ： δ 8.05-8.06(m, 2H, Ar-2 ',6 '-Η), 7.60-7.61(m, 3H, Ar-3 ',4 ',5 '-Η), 6.90(s, 1H, 3-H), 3.94(s, 2H, CH2), 3.83(s, 3H, 8-OCH3), 3.63(m, 4H, 0-CH2), 2.55(m, 4H, N-CH2)。 实施例 9
汉黄芩素二甲胺 [6-二甲胺亚甲基汉黄芩素； 5,7-二羟基 -8-甲氧基 -6-二甲胺 亚甲基-黄酮； 6-((dimethylamino)methyl)-5,7-dihydroxy-8-methoxy-2-phenyl- 4H-chromen-4-one]的制备：
取汉黄芩素 28.4g， 加入甲醇 350mL， 33%的二甲胺溶液 13.6g， 37%的甲醛 溶液 8.1g, 在 55°C下搅拌 4h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 65 °C减压干 燥， 得到浅黄色固体 32.7g, 含量为 99.3%。 MS: API-ES ) m/z 342.5 [M+H]+; ¾ NMR(DMSO-d6,400MHz)i5:8.03-8.04(m,2H,Ar-2 ',6 '-H),7.59-7.60(m,3H,
Ar-3 ',4 ',5 '- H ),6.81(s, 1H, 3-H), 3.97(s, 2H, CH2), 3.82(s, 3H, 8-OCH3), 2.56(s, 6H, CH3)。 实施例 10
汉黄芩素吡咯垸 [6-吡咯垸亚甲基汉黄芩素; 5,7-二羟基 -8-甲氧基 -6-吡咯垸亚 甲 基 - 黄 酮 ;5,7-dihydroxy-8-methoxy-2-phenyl-6-(pyrrolidin- l-ylmethyl)-4H- chromen -4-one]的制备：
取汉黄芩素 28.4g， 加入甲醇 350mL， 吡咯垸 7.1g， 37%的甲醛溶液 8.1g, 在 55 °C下搅拌 4.5h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 65 °C减压干燥， 得到橙 红色固体 35.4g, 含量为 99.1%。 MS: (API-ES ) m/z 368.5[M+H]+ ,390.5[M+Na]+; ¾ NMR(DMSO-d6, 400MHz) δ: 8.03-8.04(m, 2H, Ar-2 ',6 '-Η), 7.59-7.60(m, 3H, Ar-3 ',4 ',5 '-Η), 6.79(s, 1H, 3-H), 4.09(s, 2H, CH2), 3.81 (s, 3H,8-OCH3), 3.03(s, 4H, CH2), 1.90(s, 4H, CH2). 实施例 11
汉黄芩素哌嗪 [6-哌嗪亚甲基汉黄芩素； 5,7-二羟基 -8-甲氧基 -6-哌嗪亚甲基- 黄酮； 5,7-dihydroxy-8-methoxy-2-phenyl -6-(piperazin- 1 -ylmethyl)-4H-chromen-4- one]的制备：
取汉黄芩素 28.4g，加入甲醇 350mL，哌嗪 8.6g， 37%的甲醛溶液 8.1g, 在 55 °C 下搅拌 4h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 65 °C减压干燥， 得到浅黄色 固 体 36· lg, 含量为 99.1% 。 MS: ( API-ES ) m/z 383.5[M+H]+ ； ¾ NMR(DMSO-d6,400MHz) δ: 8.13-8.14 (m, 2H, Ar-2 ',6 '-Η), 7.64-7.66(m, 3H, Ar-3 ',4 ',5 '-Η), 7.14(s, 1H, 3-H), 4.43(s, 2H, CH2), 3.98(s, 3H, 8-OCH3), 3.36(s, 4H, CH2), 3.56(s, 4H, CH2), 1.25(s, 1H,丽)。 实施例 12
汉黄芩素吗啉 [6-吗啉亚甲基汉黄芩素； 5,7-二羟基 -8-甲氧基 -6-吗啉亚甲基 黄酮； 5,7-dihydroxy-8-methoxy-6- (morpholinomethyl)-2-phenyl-4H-chromen-4-one] 的制备：
取汉黄芩素 28.4g，加入甲醇 350mL，吗啉 8.7g， 37%的甲醛溶液 8.1g, 在 55 °C 下搅拌 4h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 65 °C减压干燥， 得到浅黄色 固体 36.3g, 含量为 99· 1%。 MS: API-ES ) m/z 384.5[M+H]+, 406.5 [M+Na]+ ; ¾ NMR(DMSO-d6,400MHz) S: 8.07-8.08(m, 2H, Ar-2 ',6 '-Η), 7.61-7.63(m, 3H, Ar-3 ',4 ',5 '-Η), 7.00(s, 1H, 3-H), 3.87(s, 3H, 8-OCH3), 3.82(s, 2H, CH2), 3.65(s, 4H, CH2), 2.60(s, 4H, CH2)。 实施例 13
汉黄芩素硫吗啉 [6-硫吗啉亚甲基汉黄芩素； 5,7-二羟基 -8-甲氧基 -6-硫代吗 啉亚甲基-黄酮； 5,7-dihydroxy-8-methoxy -2-phenyl-6-(thiomorpholinomethyl)-4H -chromen-4-one]的制备：
取汉黄芩素 28.4g， 加入甲醇 350mL， 硫吗啉 10.3g， 37%的甲醛溶液 8.1g, 在 55 °C下搅拌 4.5h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 65 °C减压干燥， 得到浅 黄色固体37.6^ 含量为99.2%。
Figure imgf000018_0001
： (API-ES ) m/z 400.5 [M+H]+, 422.5[M+Na]+; ¾ NMR(DMSO-d6,400MHz 5: 8.06-8.08(m, 2H, Ar-2 ',6 '-Η), 7.61-7.63 (m, 3H, Ar-3 ',4 ',5 '-Η), 6.99(s, 1H, 3-H), 3.87(s, 3H, 8-OCH3), 3.84(s, 2H, CH2), 2.86(s, 4H, CH2), 2.71 (s, 4H, CH2)。 实例 14
汉黄芩素哌啶 [6-哌啶亚甲基汉黄芩素； 5,7-二羟基 -8-甲氧基 -6-哌啶亚甲基- 黄酮； 5,7-dihydroxy-8-methoxy -2-phenyl -6-(piperidin- 1 -ylmethyl) -4H-chromen-4 -one]的制备：
取汉黄芩素 28.4g，加入甲醇 350mL，哌啶 8.5g， 37%的甲醛溶液 8.1g, 在 55 °C 下搅拌 4.5h， 将析出的沉淀滤出， 用少量甲醇洗涤， 65 °C减压干燥， 得到浅黄色 固体 35.3g, 含量为 99.2%。 MS: API-ES ) m/z 382.5[M+H]+, 404.5 [M+Na]+; ¾ NMR(DMSO-d6,400MHz 5: 8.05-8.06(m, 2H, Ar-2 ',6 '-Η), 7.60-7.61 (m, 3H, Ar-3 ',4 ',5 '-Η), 6.89(s, 1H, 3-H), 3.95(s, 2H, CH2), 3.83(s, 3H, 8-OCH3), 2.79(s, 4H, CH2), 1.64(m, 4H, CH2), 1.50(m, 2H, CH2)。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂黄芩黄酮有机胺衍生物， 其特征在 于具有下述结构通式：
Figure imgf000019_0001
其中： R6 为 OH时， R8为哌嗪亚甲基， 甲基哌嗪亚甲基， 哌嗪乙醇亚甲基， 哌嗪 乙硫醇亚甲基， 哌啶醇亚甲基， 哌啶酮亚甲基， 羟甲基吡咯垸亚甲基， 吡咯垸 醇亚甲基或二乙醇胺亚甲基； 为 0CH3时， R6为哌嗪亚甲基， 甲基哌嗪亚甲基， 哌 嗪乙醇亚甲基， 哌嗪乙硫醇亚甲基， 哌啶醇亚甲基， 哌啶酮亚甲基， 羟甲基吡 咯垸亚甲基， 吡咯垸醇亚甲基， 二乙醇胺亚甲基， 二甲胺亚甲基， 吡咯垸亚甲 基， 哌啶亚甲基， 吗啉亚甲基或硫吗啉亚甲基。
2、 根据权利要求 1 所述细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂黄芩黄酮有机胺衍 生物， 其特征在于在 为 OH时， R8为哌啶醇亚甲基， 哌嗪乙醇亚甲基， 哌嗪乙 硫醇亚甲基， 甲基哌嗪亚甲基， 吡咯垸醇亚甲基， 二乙醇胺亚甲基中的一种。
3、 根据权利要求 1 所述细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂黄芩黄酮有机胺衍 生物， 其特征在于 为 0CH3时， R6为哌嗪乙醇亚甲基， 哌啶醇亚甲基，甲基哌嗪亚 甲基， 吡咯垸醇亚甲基， 二乙醇胺亚甲基中的一种。
4、 根据权利要求 1 、 2或 3所述细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂黄芩黄酮有 机胺衍生物， 其特征在于在 为 OH时， R8为哌啶醇亚甲基， 吡咯垸醇亚甲基， 哌嗪乙醇亚甲基中的一种； R8为 0CH3时， R6为哌嗪乙醇亚甲基， 哌啶醇亚甲基， 吡咯垸醇亚甲基， 二乙醇胺亚甲基中的一种。
5、 如权利要求 1 所述细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂黄芩黄酮有机胺衍生 物的制备方法， 其特征在于以黄芩黄酮先导化合物黄芩素或汉黄芩素， 甲醛溶 液和有机胺类化合物反应而成； 其原料摩尔配比为： 黄芩素或汉黄芩素： 甲醛 溶液： 有机胺类化合物 = 1 : 1-1.2： 1-1.2；
工艺步骤为： 将黄芩素或汉黄芩素， 甲醛溶液和有机胺类化合物按比
例在反应容器中混合均匀， 加入为黄芩素或汉黄芩素质量 10-40倍的甲醇， 在 50-70 °C下搅拌缩合 l-6h; 过滤， 用黄芩素或汉黄芩素质量 1-20倍的甲醇洗涤沉 淀， 干燥， 得含量不少于 97 % (重量） 的黄芩黄酮有机胺衍生物。
6. 根据权利要求 5所述细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂黄芩黄酮有机胺衍 生物的制备方法， 其特征在于当黄芩黄酮先导化合物选自黄芩素时， 所述有机 胺类化合物选自哌嗪， 甲基哌嗪， 哌嗪乙醇， 哌嗪乙硫醇， 哌啶醇， 哌啶酮， 羟甲基吡咯垸， 吡咯垸醇， 二乙醇胺中的一种； 当黄芩黄酮导化合物选自汉黄 芩素时， 所述有机胺类化合物选自哌嗪， 甲基哌嗪， 哌嗪乙醇， 哌嗪乙硫醇， 哌啶酮， 羟甲基吡咯垸， 吡咯垸醇， 二乙醇胺， 二甲胺， 吡咯垸， 哌啶， 吗啉， 硫吗啉中的一种。
7、 如权利要求 1细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂黄芩黄酮有机胺衍生物， 在预防和治疗癌症和艾滋病的应用。
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