WO2010000592A2 - Cyclopeptides used as mmp-type protease enzyme inhibitors - Google Patents

Cyclopeptides used as mmp-type protease enzyme inhibitors Download PDF

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WO2010000592A2
WO2010000592A2 PCT/EP2009/057202 EP2009057202W WO2010000592A2 WO 2010000592 A2 WO2010000592 A2 WO 2010000592A2 EP 2009057202 W EP2009057202 W EP 2009057202W WO 2010000592 A2 WO2010000592 A2 WO 2010000592A2
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Thomas Berthelot
Gérard DELERIS
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Commissariat A L'energie Atomique
Universite Victor Segalen - Bordeaux 2
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8146—Metalloprotease (E.C. 3.4.24) inhibitors, e.g. tissue inhibitor of metallo proteinase, TIMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to novel cyclopeptides that can be used as inhibitors of MMP-type protease enzymes (abbreviation corresponding to extracellular matrix metalloproteases).
  • MMPs are a family of endopeptidases, numbering 28, containing a zinc atom at their active site. They can be classified into two subfamilies, depending on whether they are secreted or associated with a membrane. Secreted MMPs include collagenases (such as MMP-I, 8, 13 and 18), gelatinases (such as MMP-2 and 9), matrilysines
  • stromelysins such as MMP-7 and 26
  • Membrane-associated MMPs include transmembrane MMPs such as MMP-14, MMP-15, MMP-I6, MMP-17, MMP-23, MMP-24 and MMP-25.
  • MMPs are capable of cleaving all elements of the extracellular matrix as well as certain growth factors, or adhesion molecules. MMPs are regulated by natural inhibitors, such as TIMPs (abbreviation for tissue inhibitors of metalloproteases), and play an important role in physiological processes (such as embryonic growth, angiogenesis, tissue remodeling). bony) . When the MMP / TIMP balance is out of order, pathological processes appear such as tumor growth, metastases, rheumatoid arthritis, heart disease. The role of MMPs in tumor progression is multiple, particularly because of the ability of MMPs to degrade the extracellular matrix, thus promoting tumor invasion. MMPs have been shown to also have proteolytic activity against non-matrix proteins, giving them a complex role in several other stages of tumor progression, loss of adhesion, invasion, proliferation, angiogenesis , Intravasion, extravasion and metastatic growth.
  • TIMPs abbreviation for tissue inhibitors of metalloproteases
  • the endothelial cell has a remarkable genetic stability and will therefore be little prone to mutations causing resistance to treatment.
  • Tumor angiogenesis is therefore clearly one of the most promising and active areas of cancer research.
  • Several products currently used for the treatment of certain tumors have anti-angiogenic effects.
  • the remodeling of the extracellular matrix in particular its degradation, is necessary in several stages of tumor progression. This degradation is ensured largely by the MMPs.
  • MMPs The expression of MMPs varies according to the stages of tumor progression. For example, gelatinases (MMP-2 and 9) are the most in tumor angiogenesis. Most of these MMPs, namely MMP-I, 2, 3, 7 and 8, 9, 10 and 133, and MT1-MMP have become important therapeutic targets for the treatment of cancerous tumors.
  • MMPs are involved in the degradation of many extracellular and non-matrix proteins.
  • inhibitors of the catalytic activity of these MMPs have been listed or developed for therapeutic purposes, such as inhibitors of the following formulas:
  • the object of the present invention is to provide novel inhibitors of MMP enzymes with good selectivity. More specifically, unlike current broad-spectrum molecules, it is necessary to develop narrow spectrum inhibitors, targeting few MMPs and in the best case only one.
  • Si is a target peptide sequence of an MMP enzyme, that is to say a peptide sequence capable of being recognized and cleaved by an MMP enzyme;
  • - Mi and M2 represent, independently, a single bond, a hydrocarbon group or an amino acid residue, optionally carrying an aromatic pendant group;
  • X and Y represent, independently, a single bond, a hydrocarbon group, linear or branched, which may comprise in its chain, one or more heteroatoms, or a residue of amino acid.
  • target peptide sequence conventionally means, within the meaning of the invention, a peptide sequence capable of being recognized and cleaved by an MMP protease enzyme.
  • hydrocarbon group is generally meant a group comprising in its chain carbon and hydrogen atoms, in which may be intercalated one or more heteroatoms such as O, N and / or S.
  • aliphatic hydrocarbon groups such as alkylene groups having a number of carbon atoms of less than or equal to 10, preferably 5, in which may be intercalated one or more heteroatoms such as O, in which case it will be referred to as polyether groups.
  • amino acid residue is meant, conventionally, the amino acid residue resulting from the reaction of a function -NH 2 of an amino acid or -CO 2 H and the like with a function of another compound, so as to form a covalent bond.
  • aromatic pendant group is meant an aromatic side group covalently bound to the hydrocarbon group as defined above or to the amino acid residue as defined above, this aromatic group may comprise one or more heteroatoms such as , N and / or S.
  • the target peptide sequences of the invention may be targeted at an MMP-I, MMP-2, MMP-3, MMP-5, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11 enzyme. , MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-I 6, MMP-17, MMP-I 9, MMP-23, MMP-25 and MMP-26.
  • the peptide sequence Si may be derived from natural peptide sequences found in the natural substrates of MMPs or may be derived from synthetic sequences recognized as being synthetic substrates for MMPs.
  • the synthetic sequences may include, for example, the following amino acids or groups:
  • Nva Nor-valine
  • Cha 3-cyclohexylalanine
  • Dpa N-3 (2,4-dinitrophenyl) -L-2,3-diaminopropionyl
  • Abu ⁇ -aminobutyric acid
  • Cys (Me) corresponding to S-methylcysteine which means that the -SH group is replaced by the group - S-CH 3 .
  • GIy glycine; Pro: proline; Leu: leucine; AIa: alanine; GIn: glutamine; Ile: isoleucine; Arg: arginine; Val: valine; Tyr: tyrosine; Glu: glutamate; Met: methionine; Phe: phenylalanine; Asn: Asparagine; Thr: threonine;
  • the peptide sequence Si does not conventionally comprise a sequence -His-Trp-Gly-Phe-.
  • the peptide sequence Si When the peptide sequence Si is intended to target the MMP-I enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • the peptide sequence Si When the peptide sequence Si is intended to target the MMP-3 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences: -Arg-Val-GIy-Phe-Tyr-Glu-Ser-Asp-
  • the peptide sequence Si When the peptide sequence Si is intended to target the MMP-9 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences: Gly-Pro-Pro-Gly-Val-Val-Gly-Pro
  • the peptide sequence Si is intended to target the MMP-14 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • X and / or Y represent a hydrocarbon group, it may be in particular an alkylene group containing from 1 to 4 carbon atoms, in which may be intercalated one or more heteroatoms.
  • X and / or Y represent an amino acid residue, besides the fact that it may be a natural or non-natural amino acid residue, it may be an amino acid having a group during aromatic period, of an amino acid comprising a group during carrier of a heteroatom, such as OH, SH.
  • X and / or Y may be a cysteine residue.
  • X and Y are both cysteine residues, they are advantageously linked together by a disulfide bridge, thus conferring a certain stability on the resulting cyclopeptide, said residues thus being able to meet the following formulas:
  • the braces corresponding to the places where the remains of cysteine are linked, namely the accolade at the level of the group -CO- being the place by which this group -CO- is linked to Mi, the accolade at the level of the group - NH- being the place by which this group -NH- is linked to M 2 .
  • M 1 and / or M 2 may be hydrocarbon groups carrying an aromatic group or alternatively amino acid residues carrying a pendant aromatic group.
  • M 1 and M 2 are both carriers of an aromatic group, this may allow the formation of a complex of hydrophobic nature or of the ⁇ -stacking type, which contributes to the stability of the cyclopeptides of the invention.
  • M 1 and M 2 carry aromatic groups comprising an identical nucleus.
  • Aromatic groups that may be suitable may be benzene, anthracene or coumarin groups.
  • Mi and M 2 are hydrocarbon groups or amino acid residues carrying a coumarin group, said coumarin group being able to meet the following formulas:
  • Mi and M 2 may correspond to an amino acid residue, such as lysine, carrying a coumarin group, such residues that can respond to one of the following formulas:
  • Lys MC
  • Lys DAC
  • cyclopeptides according to the invention may be cyclopeptides of general formula as defined above, in which:
  • - Mi and M 2 are amino acid residues carrying an aromatic pendant group
  • X and Y are amino acid residues.
  • Specific cyclopeptides according to the invention may especially be peptides of the following formula:
  • a particular cyclopeptide according to the invention may be a cyclopeptide of the following formula:
  • the group -AIa- can be replaced for the group -GIy-, without loss of activity.
  • the peptides of the invention may be used as a vector in imaging applications or drug delivery systems in vitro and in vivo in order to locate and / or deliver drugs at the place of overexpression, the MMP targeting the peptide sequence Si.
  • the peptides of the invention can then be coupled with a radionuclide for use in radionuclear imaging, for example by radiolabelling with 18 F, 15 O, 11 C or 64 Cu for positron emission tomography, with fluorochromes, for example with a quantum dot, for use in optical imaging, a contrast agent for magnetic resonance imaging such as for example gadolinium chelates or metal oxide nanoparticles, to nonaparticles, such as nanoparticles of polymers, assemblies supramolecular ages or to liposomes for delivery systems for biologically active molecules or drugs.
  • a radionuclide for use in radionuclear imaging, for example by radiolabelling with 18 F, 15 O, 11 C or 64 Cu for positron emission tomography, with fluorochromes, for example with a quantum dot, for use in optical imaging, a contrast agent for magnetic resonance imaging such as for example gadolinium chelates or metal oxide nanoparticles, to nonaparticles, such as nano
  • the cyclopeptides of the invention can be prepared by methods involving a step of automatic synthesis on a solid phase by a conventional method, followed by coupling of the ends of the linear peptide to form the bridge connecting the ends, so as to obtain the cyclopeptide of the invention, the cyclization can take place either after releasing the peptide from the solid phase, or by releasing it from the solid phase.
  • the solid phase is conventionally a resin carrying groups capable of reacting with a -NH 2 or -COOH function so as to form a covalent bond, this bond being intended to be cleaved later, so as to release the peptide once synthesized.
  • Such resins may be functionalized Wang resins, such as the Fmoc-Cys (Acm) -Wang resin, the Fmoc-Cys (Acm) group corresponding to the following formula:
  • Fmoc means 9-fluorenylmethyloxycarbonyl and the brace represents the place where the Fmoc-Cys (Acm) group is bound to Wang's resin.
  • the method of the invention comprises: a) a step of preparation of a linear peptide by chemical synthesis on a solid phase; b) a step of releasing the linear peptide from the solid phase; and c) a cyclization step by coupling the groups present at the ends of the linear peptide, so as to obtain the cyclopeptide of the invention.
  • the method of the invention comprises: a) a step of preparation of the linear peptide by chemical synthesis on a solid phase; b) a cyclization step by coupling the groups present at the ends of the peptide linear, so as to obtain the cyclopeptide of the invention; and c) a step of releasing the cyclopeptide from the solid phase, the steps b) and c) being able to be carried out concomitantly.
  • the linear peptide before cyclization will correspond to a linear peptide comprising the following sequence: HS-CyS-M 1 -Si-M 2 -CyS-SH, the groups
  • the cyclopeptides of the invention are excellent inhibitors of MMP-like protease enzymes.
  • cyclopeptides of the invention can be envisaged in several ways:
  • they can be used in the field of cancer therapy, or more broadly for all diseases involving a deregulation of metalloprotease activity; they can be used on a support to purify a solution comprising different MMPs.
  • an affinity chromatography may be performed on a solution comprising the MMP to be purified, which solution is brought into contact with a grafted support of a cyclopeptide according to the invention comprising a target sequence of said MMP to be purified.
  • the desired MMP clings to the immobilized cyclopeptides on the support, while the other MMPs possibly present are eluted.
  • the medium is recovered and the desired MMP is unhooked; they can be used as a vector in the field of medical imaging or in the therapeutic field.
  • the single figure is a graph representing the variation of fluorescence intensity IF ⁇ Dat had r (in arbitrary units) of a substrate of MMP-I (peptide 1 having the following formula: DNP-Pro-Leu -Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-OH, DNP meaning 2,4-dinitrophenyl) in the presence or absence of the Cyclo-SS-MMP-1 inhibitor (no inhibitor for curve (a), inhibitor to a concentration of 0.5 ⁇ M for curve (b) and an inhibitor at a concentration of 1 ⁇ M for curve (c)), as a function of time t (in min), the substrate being placed in the presence of a solution of MMP-I (InM).
  • MMP-I peptide 1 having the following formula: DNP-Pro-Leu -Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-OH, DNP meaning 2,4-dinitrophenyl
  • This example illustrates the preparation of a MMP-I selective inhibitory cyclopeptide, this inhibitor comprising a peptide sequence Si corresponding to a target sequence of an MMP-I enzyme, this sequence being the following: -Gly-Pro-Gln- Gly-Leu-Leu-Gly-Ala- This inhibitor is called Cyclo-SS-MMP-1.
  • the preparation of this cyclopeptide comprises the following sequences: a) the grafting of a starting amino acid: Fmoc-Lys (MC) on a Fmoc-Cys (Acm) -Wang resin; b) synthesis of the sequence -Gly-Pro-Gln (Trt) -Gly-Leu-Leu-Ala-; c) the modification of the peptide obtained by successive grafting of Lys (MAC) and Cys (Acm); d) cyclization of the linear peptide.
  • Fmoc-Lys (TM) reagent having the following formula:
  • This resin is reacted with Fmoc-Lys (330 mg, 0.578 mmol) in the presence of PyBOP (260 mg, 0.58 mmol), HOBt (82 mg, 0.6 mmol) and DIEA (200 ⁇ L, 1.6 mmol) in DMF (5 mL) for 5 hours at room temperature.
  • Fmoc-Lys (DAC) (190 mg, 0.3 mmol) is coupled to the peptide on resin in the presence of PyBOP (153 mg, 0.3 mmol), HOBt (40.53 mg, 0.3 mmol) and DIEA (99.1 ⁇ L, 0.6 mmol) in DMF (5 mL) for 5 minutes. hours at room temperature. Subsequently, the resin is filtered and washed as before. 235 mg are recovered. The degree of substitution is evaluated at 0.28 mmol / g. The unreacted amines are acetylated by the same procedure as described above.
  • Fmoc-Cys (mAb) (207.24 mg, 0.5 mmol) is coupled to the peptide on the resin in the presence of PyBOP (255 mg, 0.49 mmol) , HOBt (67.67 mg, 0.5 mmol) and DIEA (165 ⁇ L, 1 mmol) in NMP (5 mL) at room temperature for 12 hours.
  • the resin is filtered and washed to give 253 mg peptide on resin.
  • the resin After treatment with 20% piperidine in DMF, the resin is suspended in a solution of DMF / anisole (19/1). The mixture is cooled to 0 ° C. and Ti (CF 3 CO 2 ) 3 (65.2 mg, 0.12 mmol) is added. After 1.5 h stirring, the resin is filtered and washed with DMF (50 mL) and DCM (50 mL).
  • the tests were performed with active and activated MMP-I by pAPMA (Sigma Aldrich). Before their use, the presence of active MMP-I was checked by electrophoresis.
  • Solution A the peptide was dissolved in the buffer solution, to obtain a final concentration of 90 ⁇ M;

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Abstract

The invention relates to a cyclopeptide of the following formula: wherein: - S1 is a target peptide sequence of an MMP enzyme, that is a peptide sequence that can be identified and cleaved by an MMP enzyme; - M1 and M2 are independently a single bond, a hydrocarbonated group or an amino acid residue, optionally carrier of an aromatic side group; - X and Y are independently a single bond, and a linear or branched hydrocarbonated group that can have, in its chain, at least one heteroatom or an amino acid residue. Said cyclopeptides can be used as MMP protease enzyme inhibitors.

Description

CYCLOPEPTIDES UTILISABLES EN TANT QU' INHIBITEURS D'ENZYMES PROTEASES DU TYPE MMP CYCLOPEPTIDES USEFUL AS INHIBITORS OF MMP PROTEASE ENZYMES
DESCRIPTIONDESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUETECHNICAL AREA
La présente invention a pour objet de nouveaux cyclopeptides utilisables en tant qu'inhibiteurs d'enzymes protéases du type MMP (abréviation correspondant aux métalloprotéases de matrice extracellulaire) .The present invention relates to novel cyclopeptides that can be used as inhibitors of MMP-type protease enzymes (abbreviation corresponding to extracellular matrix metalloproteases).
Les MMP sont une famille d' endopeptidases, au nombre de 28, contenant un atome de zinc au niveau de leur site actif. Elles peuvent être classées en deux sous-familles, selon qu'elles sont sécrétées ou associées à une membrane. Les MMP sécrétées comprennent les collagénases (telles que MMP-I, 8, 13 et 18), les gélatinases (telles que MMP-2 et 9) , les matrilysinesMMPs are a family of endopeptidases, numbering 28, containing a zinc atom at their active site. They can be classified into two subfamilies, depending on whether they are secreted or associated with a membrane. Secreted MMPs include collagenases (such as MMP-I, 8, 13 and 18), gelatinases (such as MMP-2 and 9), matrilysines
(telles que MMP-7 et 26), les stromélysines (telles que(such as MMP-7 and 26), stromelysins (such as
MMP-3, 10 et 11), l'épilysine (MMP-28), l' énamélysine (MMP-20) . Les MMP associées à une membrane comprennent les MMP transmembranaires telles que MMP-14, MMP-15, MMP-I 6, MMP-17, MMP-23, MMP-24 et MMP-25.MMP-3, 10 and 11), epilysine (MMP-28), eneamelysine (MMP-20). Membrane-associated MMPs include transmembrane MMPs such as MMP-14, MMP-15, MMP-I6, MMP-17, MMP-23, MMP-24 and MMP-25.
Les MMP sont capables de cliver tous les éléments de la matrice extracellulaire ainsi que certains facteurs de croissance, ou encore des molécules d'adhésion. Les MMP sont régulées par des inhibiteurs naturels, tels que les TIMP (abréviation correspondant aux inhibiteurs tissulaires de métalloprotéases), et jouent un rôle important dans les processus physiologiques (tels que la croissance embryonnaire, l' angiogénèse, le remodelage du tissu osseux) . Lorsque la balance MMP/TIMP est déréglée, des processus pathologiques apparaissent tels que la croissance tumorale, les métastases, les arthrites rhumatoïdes, les maladies cardiaques. Le rôle des MMP dans la progression tumorale est multiple, notamment du fait de la capacité des MMP à dégrader la matrice extracellulaire, favorisant ainsi l'invasion tumorale. Il a été démontré que les MMP ont également une activité protéolytique contre des protéines non matricielles, ce qui leur confère un rôle complexe dans plusieurs autres étapes de la progression tumorale, la perte d'adhérence, l'invasion, la prolifération, l' angiogénèse, 1' intravasion, l' extravasion et la croissance métastatique .MMPs are capable of cleaving all elements of the extracellular matrix as well as certain growth factors, or adhesion molecules. MMPs are regulated by natural inhibitors, such as TIMPs (abbreviation for tissue inhibitors of metalloproteases), and play an important role in physiological processes (such as embryonic growth, angiogenesis, tissue remodeling). bony) . When the MMP / TIMP balance is out of order, pathological processes appear such as tumor growth, metastases, rheumatoid arthritis, heart disease. The role of MMPs in tumor progression is multiple, particularly because of the ability of MMPs to degrade the extracellular matrix, thus promoting tumor invasion. MMPs have been shown to also have proteolytic activity against non-matrix proteins, giving them a complex role in several other stages of tumor progression, loss of adhesion, invasion, proliferation, angiogenesis , Intravasion, extravasion and metastatic growth.
La cellule endothéliale présente une remarquable stabilité génétique et sera donc peu sujette à des mutations provoquant une résistance aux traitements. L' angiogénèse tumorale est donc clairement l'un des domaines les plus prometteurs et les plus actifs de la recherche contre le cancer. Plusieurs produits actuellement utilisés pour le traitement de certaines tumeurs ont des effets anti-angiogéniques .The endothelial cell has a remarkable genetic stability and will therefore be little prone to mutations causing resistance to treatment. Tumor angiogenesis is therefore clearly one of the most promising and active areas of cancer research. Several products currently used for the treatment of certain tumors have anti-angiogenic effects.
Le remodelage de la matrice extracellulaire, en particulier sa dégradation, est nécessaire dans plusieurs étapes de la progression tumorale. Cette dégradation est assurée en grande partie par les MMP.The remodeling of the extracellular matrix, in particular its degradation, is necessary in several stages of tumor progression. This degradation is ensured largely by the MMPs.
L'expression des MMP varie selon les étapes de la progression tumorale. Par exemple, ce sont les gélatinases (MMP-2 et 9) , qui sont les plus exprimées dans l' angiogénèse tumorale. La plupart de ces MMP, en l'occurrence MMP-I, 2, 3, 7 et 8, 9, 10 et 133 et la MTl-MMP sont devenues des cibles thérapeutiques importantes pour le traitement de tumeurs cancéreuses.The expression of MMPs varies according to the stages of tumor progression. For example, gelatinases (MMP-2 and 9) are the most in tumor angiogenesis. Most of these MMPs, namely MMP-I, 2, 3, 7 and 8, 9, 10 and 133, and MT1-MMP have become important therapeutic targets for the treatment of cancerous tumors.
Les MMP sont impliquées dans la dégradation de nombreuses protéines de la matrice extracellulaire mais aussi non matricielles.MMPs are involved in the degradation of many extracellular and non-matrix proteins.
Durant ces dernières années, nombre d'inhibiteurs de l'activité catalytique de ces MMP ont été répertoriés ou développés à des fins thérapeutiques, tels que des inhibiteurs de formules suivantes :In recent years, many inhibitors of the catalytic activity of these MMPs have been listed or developed for therapeutic purposes, such as inhibitors of the following formulas:
Figure imgf000004_0001
Le but de la présente invention est de proposer de nouveaux inhibiteurs des enzymes MMP présentant une bonne sélectivité. Plus particulièrement, et contrairement aux molécules actuelles à spectre large, il s'agit de développer des inhibiteurs à spectre étroit, ciblant peu de MMP et dans le meilleur des cas, une seule.
Figure imgf000004_0001
The object of the present invention is to provide novel inhibitors of MMP enzymes with good selectivity. More specifically, unlike current broad-spectrum molecules, it is necessary to develop narrow spectrum inhibitors, targeting few MMPs and in the best case only one.
EXPOSÉ DE L' INVENTION Ainsi, l'invention a trait à de nouveaux cyclopeptides répondant à la formule suivante :SUMMARY OF THE INVENTION Thus, the invention relates to novel cyclopeptides having the following formula:
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0001
dans laquelle :in which :
- Si est une séquence peptidique cible d'une enzyme MMP, c'est-à-dire une séquence peptidique apte à être reconnue et clivée par une enzyme MMP ;Si is a target peptide sequence of an MMP enzyme, that is to say a peptide sequence capable of being recognized and cleaved by an MMP enzyme;
- Mi et M2 représentent, indépendamment, une liaison simple, un groupe hydrocarboné ou un reste d'acide aminé, éventuellement porteur d'un groupe pendant aromatique ;- Mi and M2 represent, independently, a single bond, a hydrocarbon group or an amino acid residue, optionally carrying an aromatic pendant group;
- X et Y représentent, indépendamment, une liaison simple, un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié, pouvant comporter dans sa chaîne, un ou plusieurs hétéroatomes, ou un reste d'acide aminé.X and Y represent, independently, a single bond, a hydrocarbon group, linear or branched, which may comprise in its chain, one or more heteroatoms, or a residue of amino acid.
Avant d'entrer plus en détail dans la description, nous proposons les définitions suivantes. Par séquence peptidique cible, on entend classiquement, au sens de l'invention, une séquence peptidique apte à être reconnue et clivée par une enzyme protéase MMP. Par groupe hydrocarboné, on entend, généralement, un groupe comprenant dans sa chaîne des atomes de carbone et d'hydrogène, dans laquelle peuvent venir s'intercaler un ou plusieurs hétéroatomes tels que O, N et/ou S. A titre d'exemple, on peut citer les groupes hydrocarbonés aliphatiques, tels que les groupes alkylènes comportant un nombre d'atomes de carbone inférieur ou égal à 10, préférentiellement 5, dans lesquels peuvent s'intercaler un ou plusieurs hétéroatomes tels que O, auquel cas on parlera de groupes polyéthers.Before going into more detail in the description, we propose the following definitions. The term "target peptide sequence" conventionally means, within the meaning of the invention, a peptide sequence capable of being recognized and cleaved by an MMP protease enzyme. By hydrocarbon group is generally meant a group comprising in its chain carbon and hydrogen atoms, in which may be intercalated one or more heteroatoms such as O, N and / or S. As an example there may be mentioned aliphatic hydrocarbon groups, such as alkylene groups having a number of carbon atoms of less than or equal to 10, preferably 5, in which may be intercalated one or more heteroatoms such as O, in which case it will be referred to as polyether groups.
Par reste d'acide aminé, on entend, classiquement, le reste d'acide aminé résultant de la réaction d'une fonction -NH2 d'un acide aminé ou -CO2H et analogues avec une fonction d'un autre composé, de sorte à former une liaison covalente.By amino acid residue is meant, conventionally, the amino acid residue resulting from the reaction of a function -NH 2 of an amino acid or -CO 2 H and the like with a function of another compound, so as to form a covalent bond.
Par groupe pendant aromatique, on entend un groupe latéral aromatique lié de façon covalente au groupe hydrocarboné tel que défini ci-dessus ou au reste d'acide aminé tel que défini ci-dessus, ce groupe aromatique pouvant comprendre un ou plusieurs hétéroatomes tels que O, N et/ou S.By aromatic pendant group is meant an aromatic side group covalently bound to the hydrocarbon group as defined above or to the amino acid residue as defined above, this aromatic group may comprise one or more heteroatoms such as , N and / or S.
Les séquences peptidiques cibles de l'invention peuvent être cibles d'une enzyme MMP-I, MMP-2, MMP-3, MMP-5, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-IO, MMP- 11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-I 6, MMP-17, MMP-I 9, MMP-23, MMP-25 et MMP-26. La séquence peptidique Si peut être issue de séquences peptidiques naturelles rencontrées dans les substrats naturels des MMP ou bien être issues de séquences synthétiques reconnues comme étant des substrats synthétiques des MMP.The target peptide sequences of the invention may be targeted at an MMP-I, MMP-2, MMP-3, MMP-5, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11 enzyme. , MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-I 6, MMP-17, MMP-I 9, MMP-23, MMP-25 and MMP-26. The peptide sequence Si may be derived from natural peptide sequences found in the natural substrates of MMPs or may be derived from synthetic sequences recognized as being synthetic substrates for MMPs.
Les séquences synthétiques peuvent comprendre, par exemple les acides aminés ou groupes suivants :The synthetic sequences may include, for example, the following amino acids or groups:
Nva (Nor-valine) ; Cha (3- cyclohexylalanine) ; Dpa (N-3 (2, 4-dinitrophényl) -L-2, 3- diaminopropionyle) ; Abu : acide α-aminobutyrique ; Cys (Me) correspondant à la S-méthylcystéine, ce qui signifie que le groupe -SH est remplacé par le groupe - S-CH3. Dans la suite de cet exposé, on précise que les abréviations listées ci-dessous ont les significations suivantes :Nva (Nor-valine); Cha (3-cyclohexylalanine); Dpa (N-3 (2,4-dinitrophenyl) -L-2,3-diaminopropionyl); Abu: α-aminobutyric acid; Cys (Me) corresponding to S-methylcysteine, which means that the -SH group is replaced by the group - S-CH 3 . In the remainder of this presentation, it is specified that the abbreviations listed below have the following meanings:
GIy : glycine ; Pro : proline ; Leu : leucine ; AIa : alanine ; GIn : glutamine ; Ile : isoleucine ; Arg : arginine ; Val : valine ; Tyr : tyrosine ; Glu : glutamate ; Met : méthionine ; Phe : phénylalanine ; Asn : Asparagine ; Thr : thréonine ;GIy: glycine; Pro: proline; Leu: leucine; AIa: alanine; GIn: glutamine; Ile: isoleucine; Arg: arginine; Val: valine; Tyr: tyrosine; Glu: glutamate; Met: methionine; Phe: phenylalanine; Asn: Asparagine; Thr: threonine;
Ser : serine ; His : histidine, ces abréviations correspondant à la nomenclature officielle à 3 lettres des acides aminés.Ser: serine; His: histidine, these abbreviations corresponding to the official 3-letter amino acid nomenclature.
La séquence peptidique Si ne comprend pas, classiquement, de séquence -His-Trp-Gly-Phe- .The peptide sequence Si does not conventionally comprise a sequence -His-Trp-Gly-Phe-.
Lorsque la séquence peptidique Si est destinée à être cible de l'enzyme MMP-I, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :When the peptide sequence Si is intended to target the MMP-I enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala- SEQ. 1 -Ala-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala SEQ. 1 -Ala-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-
SEQ. 2SEQ. 2
-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln- SEQ.3-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln- SEQ.3
-Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-AIa-Gly-IIe-Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-IIe-
SEQ.4 -Gly-Pro-GIu-Gly-Leu-Arg-Val-GIy-SEQ.4 -Gly-Pro-GIu-Gly-Leu-Arg-Val-GIy-
SEQ.5 -Tyr-Glu-Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-SEQ.5 -Tyr-Glu-Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-
SEQ.6 -Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-Glu-Arg-SEQ.6 -Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-Glu-Arg-
SEQ.7SEQ.7
-Ala-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Ser-Thr- SEQ.8-Ala-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Ser-Thr- SEQ.8.8
-Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile--Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-
SEQ.9 -Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-SEQ.9 -Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-
SEQ.10 -Thr-Glu-Gly-Glu-Ala-Arg-Gly-Ser-SEQ.10-Thr-Glu-Gly-Glu-Ala-Arg-Gly-Ser-
SEQ.11SEQ.11
-Pro-Cha-Abu-Cys (Me) -His-Ala- SEQ.12-Pro-Cha-Abu-Cys (Me) -His-Ala-SEQ.12
McGeehan, G. M., et al. 1994. J. Biol . Chem. 269, 32814McGeehan, G.M., et al. 1994. J. Biol. Chem. 269, 32814
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 13-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-SEQ. 13
Bickett, D. M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58 Lorsque la séquence peptidique Si est destinée à être cible de l'enzyme MMP-2, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :Bickett, DM, et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58 When the peptide sequence Si is intended to target the MMP-2 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
-Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala--Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala-
SEQ.14SEQ.14
-Pro-GIn-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys--Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys-
SEQ.15SEQ.15
Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221Beckman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221
-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg- SEQ.16-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-SEQ.16
Murphy, G., et al. 1994. J. Biol . Chem. 269, 6632Murphy, G., et al. 1994. J. Biol. Chem. 269, 6632
Lorsque la séquence peptidique Si est destinée à être cible de l'enzyme MMP-3, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Arg-Val-GIy-Phe-Tyr-Glu-Ser-Asp-When the peptide sequence Si is intended to target the MMP-3 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences: -Arg-Val-GIy-Phe-Tyr-Glu-Ser-Asp-
SEQ.17SEQ.17
-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr--Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr-
SEQ.18 -Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-SEQ.18 -Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-
SEQ.19SEQ.19
-Ile-Ala-Gly-Arg-Ser-Leu-Asn-Pro--Ile-Ala-Gly-Arg-Ser-Leu-Asn-Pro-
SEQ.20SEQ.20
-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu
SEQ.21 -Asp-Val-Ala-Gln-Phe-Val-Leu-Thr-SEQ.21 -Asp-Val-Ala-Gln-Phe-Val-Leu-Thr-
SEQ.22SEQ.22
-Asp-Thr-Leu-Glu-Val-Met-Arg-Lys-Asp-Glu-Leu-Thr-Val-Met-Arg-Lys
SEQ.23 -Asp-Val-GIy-His-Phe-Arg-Thr-Phe-SEQ.23 -Asp-Val-GIy-His-Phe-Arg-Thr-Phe-
SEQ.24SEQ.24
-Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-Met-Leu-Thr-Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-Met-Leu-Thr
SEQ.25 -Arg-Val-Ala-Glu-Met-Arg-Gly-Glu-SEQ.25 -Arg-Val-Ala-Glu-Met-Arg-Gly-Glu
SEQ.26SEQ.26
-Asp-Leu-Gly-Arg-Phe-Gln-Thr-Phe--Asp-Leu-Gly-Arg-Phe-Gln-Thr-Phe-
SEQ.27 -Pro-Phe-Ser-Pro-Leu-Val-Ala-Thr-SEQ.27-Pro-Phe-Ser-Pro-Leu-Val-Ala-Thr-
SEQ.28SEQ.28
-Ala-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Ser--Ala-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Ser
SEQ.29SEQ.29
-Phe-Ser-Ser-Glu-Ser-Lys-Arg-Glu-Phe-Ser-Ser-Glu-Ser-Lys-Arg-Glu
SEQ.30SEQ.30
-Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Phe-Gln--Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Phe-Gln
SEQ.31SEQ.31
Lorsque la séquence peptidique Si est destinée à être cible de l'enzyme MMP-9, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Gly-Pro-Pro-Gly-Val-Val-Gly-Pro-When the peptide sequence Si is intended to target the MMP-9 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences: Gly-Pro-Pro-Gly-Val-Val-Gly-Pro
SEQ.32SEQ.32
-Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Gly-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Gly-Glu
SEQ.33 -GIy-Pro-Gly-Gly-Val-Val-GIy-Pro-SEQ.33 -GIy-Pro-Gly-Gly-Val-Val-GIy-Pro-
SEQ.34SEQ.34
-Ile-Pro-Gln-Asn-Phe-Phe-Gly-Val--Ile-Pro-Gln-Asn-Phe-Phe-Gly-Val
SEQ.35SEQ.35
-Pro-Pro-Gly-AIa-Tyr-His-Gly-AIa- SEQ.36-Pro-Pro-Gly-AIa-Tyr-His-Gly-AIa- SEQ.36
Lorsque la séquence peptidique Si est destinée à être cible de l'enzyme MMP-14, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :When the peptide sequence Si is intended to target the MMP-14 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
-Pro-Leu-Ala-Cys (p-OMeBz) -Trp-Ala-Arg--Pro-Leu-Ala-Cys (p-OMeBz) -Trp-Ala-Arg-
SEQ. 37 Mucha, A., et al. 1998. J. Biol . Chem. 273, 2763 Holtz, B., et al. 1999. Biochemistry 38, 12174SEQ. Mucha, A., et al. 1998. J. Biol. Chem. 273, 2763 Holtz, B., et al. 1999. Biochemistry 38, 12174
Lorsque X et/ou Y représentent un groupe hydrocarboné, il peut s'agir notamment d'un groupe alkylène comportant de 1 à 4 atomes de carbone, dans lequel peut s'intercaler un ou plusieurs hétéroatomes .When X and / or Y represent a hydrocarbon group, it may be in particular an alkylene group containing from 1 to 4 carbon atoms, in which may be intercalated one or more heteroatoms.
Lorsque X et/ou Y représentent un reste d'acide aminé, outre le fait qu'il peut s'agir d'un reste d'acide aminé naturel ou non naturel, il peut s'agir d'un acide aminé comportant un groupe pendant aromatique, d'un acide aminé comportant un groupe pendant porteur d'un hétéroatome, tel que OH, SH. En particulier, X et/ou Y peuvent être un reste de cystéine .When X and / or Y represent an amino acid residue, besides the fact that it may be a natural or non-natural amino acid residue, it may be an amino acid having a group during aromatic period, of an amino acid comprising a group during carrier of a heteroatom, such as OH, SH. In particular, X and / or Y may be a cysteine residue.
En particulier, lorsque X et Y sont tous deux des restes de cystéine, ils sont avantageusement liés entre eux par un pont disulfure, conférant ainsi une certaine stabilité au cyclopeptide résultant, lesdits restes pouvant ainsi répondre aux formules suivantes :In particular, when X and Y are both cysteine residues, they are advantageously linked together by a disulfide bridge, thus conferring a certain stability on the resulting cyclopeptide, said residues thus being able to meet the following formulas:
Figure imgf000012_0001
les accolades correspondant aux endroits par lesquels sont liés les restes de cystéine, à savoir l'accolade au niveau du groupe -CO- étant l'endroit par lequel est lié ce groupe -CO- à Mi, l'accolade au niveau du groupe -NH- étant l'endroit par lequel est lié ce groupe -NH- à M2.
Figure imgf000012_0001
the braces corresponding to the places where the remains of cysteine are linked, namely the accolade at the level of the group -CO- being the place by which this group -CO- is linked to Mi, the accolade at the level of the group - NH- being the place by which this group -NH- is linked to M 2 .
M1 et/ou M2 peuvent être des groupes hydrocarbonés porteurs d'un groupe aromatique ou encore des restes d'acide aminé porteurs d'un groupe pendant aromatique. Lorsque M1 et M2 sont tous deux porteurs d'un groupe aromatique, cela peut permettre la formation d'un complexe de nature hydrophobe ou du type π-stacking, qui participe à la stabilité des cyclopeptides de l'invention. De préférence, M1 et M2 sont porteurs de groupes aromatiques comprenant un noyau identique. Des groupes aromatiques susceptibles de convenir peuvent être des groupes benzéniques, anthracéniques ou coumarines.M 1 and / or M 2 may be hydrocarbon groups carrying an aromatic group or alternatively amino acid residues carrying a pendant aromatic group. When M 1 and M 2 are both carriers of an aromatic group, this may allow the formation of a complex of hydrophobic nature or of the π-stacking type, which contributes to the stability of the cyclopeptides of the invention. Preferably, M 1 and M 2 carry aromatic groups comprising an identical nucleus. Aromatic groups that may be suitable may be benzene, anthracene or coumarin groups.
De préférence, Mi et M2 sont des groupes hydrocarbonés ou des restes d'acide aminé porteurs d'un groupe coumarine, ledit groupe coumarine pouvant répondre aux formules suivantes :Preferably, Mi and M 2 are hydrocarbon groups or amino acid residues carrying a coumarin group, said coumarin group being able to meet the following formulas:
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
MCMC
Ainsi, Mi et M2 peuvent correspondre à un reste d'acide aminé, tel que la lysine, porteur d'un groupe coumarine, de tels restes pouvant répondre à l'une des formules suivantes :
Figure imgf000014_0001
Thus, Mi and M 2 may correspond to an amino acid residue, such as lysine, carrying a coumarin group, such residues that can respond to one of the following formulas:
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000014_0002
ces restes étant dénommés par les abréviations respectives Lys (MC) et Lys (DAC) .these residues being denominated by the respective abbreviations Lys (MC) and Lys (DAC).
Des cyclopeptides particuliers conformes à l'invention peuvent être des cyclopeptides de formule générale telle que définie ci-dessus, dans laquelle :Specific cyclopeptides according to the invention may be cyclopeptides of general formula as defined above, in which:
- Mi et M2 sont des restes d' acide aminé porteurs d'un groupe pendant aromatique ;- Mi and M 2 are amino acid residues carrying an aromatic pendant group;
- X et Y sont des restes d'acides aminés. Des cyclopeptides particuliers conformes à l'invention peuvent être notamment des peptides de formule suivante :X and Y are amino acid residues. Specific cyclopeptides according to the invention may especially be peptides of the following formula:
Cys M1 S1 M2 CysCys M 1 S 1 M 2 Cys
Si, Mi et M2 étant tels que définis ci-dessus, les restes Cys liés à Mi et M2 répondant respectivement aux formules suivantes :If, Mi and M 2 being as defined above, the Cys residues linked to Mi and M 2 respectively corresponding to the following formulas:
Figure imgf000015_0001
les accolades correspondant aux endroits par lesquels sont liés les restes de cystéine.
Figure imgf000015_0001
the braces corresponding to the places by which the remains of cysteine are bound.
Si peut correspondre à une séquence cible d'une MMP-I telle que définie ci-dessus, en particulier à la séquence suivante :If can correspond to a target sequence of an MMP-I as defined above, in particular to the following sequence:
-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala
Un cyclopeptide particulier conforme à l'invention peut être un cyclopeptide de formule suivante :A particular cyclopeptide according to the invention may be a cyclopeptide of the following formula:
CyS-LyS(DAC)-GIy-PrO-GIn-GIy-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS(MC)-CySCys-Lys (DAC) -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys (TM) -Cys
les groupes -Lys (DAC) - et -Lys (MC) - répondant aux formules respectives suivantes : the groups -Lys (DAC) - and -Lys (MC) - corresponding to the following respective formulas:
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0002
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000016_0002
le groupe Cys lié au groupe Lys (DAC) répondant à la formule suivante :the Cys group linked to the Lys group (DAC) corresponding to the following formula:
Figure imgf000016_0003
tandis que le groupe Cys lié au groupe Lys (MC) répond à la formule suivante :
Figure imgf000016_0003
while the Cys group linked to the Lys (TM) group has the following formula:
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0001
le groupe -AIa- pouvant être remplacé pour le groupe -GIy-, sans qu'il y ait perte d'activité.the group -AIa- can be replaced for the group -GIy-, without loss of activity.
Dans certains cas de figure, les peptides de l'invention, outre le fait d'assurer un rôle d' inhibiteur, pourront être utilisés comme vecteur dans des applications d'imagerie ou de systèmes de délivrances de médicaments en milieu in vitro et in vivo afin de localiser et/ou de délivrer des médicament à l'endroit de surexpression, la MMP ciblant la séquence peptidique Si. A titre d'exemples et non limitatif, les peptides de l'invention peuvent être alors couplés avec un radionucléide pour une utilisation en imagerie radionucléaire comme par exemple par radiomarquage au 18F, 15O, 11C ou au 64Cu pour la tomographie d'émission de positons, à des fluorochromes, comme par exemple à un quantum dot, pour une utilisation en imagerie optique, à un agent de contraste pour l'imagerie par résonance magnétique comme par exemple à des chélates de gadolinium ou à des nanoparticules d'oxyde métallique, à des nonaparticules, comme les nanoparticules de polymères, des assemblages supramoléculaires ou encore à des liposomes pour des systèmes de délivrance de molécules biologiquement actives ou de médicaments.In certain cases, the peptides of the invention, besides acting as an inhibitor, may be used as a vector in imaging applications or drug delivery systems in vitro and in vivo in order to locate and / or deliver drugs at the place of overexpression, the MMP targeting the peptide sequence Si. As non-limiting examples, the peptides of the invention can then be coupled with a radionuclide for use in radionuclear imaging, for example by radiolabelling with 18 F, 15 O, 11 C or 64 Cu for positron emission tomography, with fluorochromes, for example with a quantum dot, for use in optical imaging, a contrast agent for magnetic resonance imaging such as for example gadolinium chelates or metal oxide nanoparticles, to nonaparticles, such as nanoparticles of polymers, assemblies supramolecular ages or to liposomes for delivery systems for biologically active molecules or drugs.
Les cyclopeptides de l'invention peuvent être préparés par des procédés mettant en jeu une étape de synthèse automatique sur une phase solide par un procédé classique, suivie d'un couplage des extrémités du peptide linéaire pout former le pont reliant les extrémités, de sorte à obtenir le cyclopeptide de l'invention, la cyclisation pouvant avoir lieu soit après avoir libéré le peptide de la phase solide, soit en le libérant ensuite de la phase solide.The cyclopeptides of the invention can be prepared by methods involving a step of automatic synthesis on a solid phase by a conventional method, followed by coupling of the ends of the linear peptide to form the bridge connecting the ends, so as to obtain the cyclopeptide of the invention, the cyclization can take place either after releasing the peptide from the solid phase, or by releasing it from the solid phase.
La phase solide est classiquement une résine porteuse de groupes aptes à réagir avec une fonction -NH2 ou -COOH de façon à former une liaison covalente, cette liaison étant destinée à être clivée ultérieurement, de façon à libérer le peptide une fois synthétisé .The solid phase is conventionally a resin carrying groups capable of reacting with a -NH 2 or -COOH function so as to form a covalent bond, this bond being intended to be cleaved later, so as to release the peptide once synthesized.
De telles résines peuvent être des résines dite de Wang fonctionnalisées, telles que la résine Fmoc-Cys (Acm) -Wang, le groupe Fmoc-Cys (Acm) correspondant à la formule suivante : Such resins may be functionalized Wang resins, such as the Fmoc-Cys (Acm) -Wang resin, the Fmoc-Cys (Acm) group corresponding to the following formula:
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0001
Fmoc signifiant 9- fluorénylméthyloxycarbonyl et l'accolade représentant l'endroit par lequel le groupe Fmoc-Cys (Acm) est lié à la résine de Wang.Fmoc means 9-fluorenylmethyloxycarbonyl and the brace represents the place where the Fmoc-Cys (Acm) group is bound to Wang's resin.
Selon un premier mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend : a) une étape de préparation d'un peptide linéaire par synthèse chimique sur une phase solide ; b) une étape de libération du peptide linéaire de la phase solide ; et c) une étape de cyclisation par couplage des groupes présents aux extrémités du peptide linéaire, de sorte à obtenir le cyclopeptide de 1' invention .According to a first embodiment, the method of the invention comprises: a) a step of preparation of a linear peptide by chemical synthesis on a solid phase; b) a step of releasing the linear peptide from the solid phase; and c) a cyclization step by coupling the groups present at the ends of the linear peptide, so as to obtain the cyclopeptide of the invention.
Selon un second mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend : a) une étape de préparation du peptide linéaire par synthèse chimique sur une phase solide ; b) une étape de cyclisation par couplage des groupes présents aux extrémités du peptide linéaire, de sorte à obtenir le cyclopeptide de l'invention; et c) une étape de libération du cyclopeptide de la phase solide, les étapes b) et c) pouvant être réalisées de façon concomitante.According to a second embodiment, the method of the invention comprises: a) a step of preparation of the linear peptide by chemical synthesis on a solid phase; b) a cyclization step by coupling the groups present at the ends of the peptide linear, so as to obtain the cyclopeptide of the invention; and c) a step of releasing the cyclopeptide from the solid phase, the steps b) and c) being able to be carried out concomitantly.
Que ce soit pour le premier ou le second mode de réalisation, l'homme du métier utilisera, pour synthétiser le peptide linéaire, les groupes protecteurs appropriés. Dans le cas où X et Y sont des restes de cystéine, le peptide linéaire avant cyclisation correspondra à un peptide linéaire comportant la séquence suivante : HS-CyS-M1-Si-M2-CyS-SH, les groupesWhether for the first or the second embodiment, those skilled in the art will use the appropriate protecting groups to synthesize the linear peptide. In the case where X and Y are cysteine residues, the linear peptide before cyclization will correspond to a linear peptide comprising the following sequence: HS-CyS-M 1 -Si-M 2 -CyS-SH, the groups
-SH appartement aux restes de cystéine. Les cyclopeptides de l'invention constituent d'excellents inhibiteurs d'enzymes protéases du type MMP.-SH apartment with the remains of cysteine. The cyclopeptides of the invention are excellent inhibitors of MMP-like protease enzymes.
Plus précisément, l'utilisation des cyclopeptides de l'invention peuvent être envisagées de plusieurs façons :More specifically, the use of the cyclopeptides of the invention can be envisaged in several ways:
- ils peuvent être utilisés dans le domaine de la thérapie cancéreuse, ou plus largement pour toutes maladies faisant intervenir une dérégulation de l'activité métalloprotéasique ; - ils peuvent être utilisés sur support pour purifier une solution comprenant différentes MMP.they can be used in the field of cancer therapy, or more broadly for all diseases involving a deregulation of metalloprotease activity; they can be used on a support to purify a solution comprising different MMPs.
Par exemple, une chromatographie d'affinité peut être effectuée sur une solution comportant la MMP à purifier, laquelle solution est amenée au contact d'un support greffé d'un cyclopeptide conforme à l'invention comportant une séquence cible de ladite MMP à purifier. Dans ces conditions, la MMP désirée s'accroche sur les cyclopeptides immobilisés sur le support, tandis que les autres MMP éventuellement présentes sont éluées. Le support est récupérée et la MMP désirée est décrochée ; - ils peuvent être utilisés comme vecteur dans le domaine de l'imagerie médicale ou dans le domaine thérapeutique.For example, an affinity chromatography may be performed on a solution comprising the MMP to be purified, which solution is brought into contact with a grafted support of a cyclopeptide according to the invention comprising a target sequence of said MMP to be purified. Under these conditions, the desired MMP clings to the immobilized cyclopeptides on the support, while the other MMPs possibly present are eluted. The medium is recovered and the desired MMP is unhooked; they can be used as a vector in the field of medical imaging or in the therapeutic field.
L' invention va maintenant être décrite par rapport aux exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif.The invention will now be described with reference to the following examples given for illustrative and not limiting.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
La figure unique est un graphique représentant la variation d' intensité de fluorescence ΔIF donneur (en unités arbitraires a.u) d'un substrat de la MMP-I (le peptide 1 répondant à la formule suivante : DNP-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-OH, DNP signifiant 2, 4-dinitrophényle) en présence ou non de l'inhibiteur Cyclo-SS-MMP-1 (pas d'inhibiteur pour la courbe (a), inhibiteur à une concentration de 0,5 μM pour la courbe (b) et inhibiteur à une concentration de 1 μM pour la courbe (c) ) , en fonction du temps t (en min), le substrat étant mis en présence d'une solution de MMP-I (InM) .The single figure is a graph representing the variation of fluorescence intensity IF Δ Dat had r (in arbitrary units) of a substrate of MMP-I (peptide 1 having the following formula: DNP-Pro-Leu -Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-OH, DNP meaning 2,4-dinitrophenyl) in the presence or absence of the Cyclo-SS-MMP-1 inhibitor (no inhibitor for curve (a), inhibitor to a concentration of 0.5 μM for curve (b) and an inhibitor at a concentration of 1 μM for curve (c)), as a function of time t (in min), the substrate being placed in the presence of a solution of MMP-I (InM).
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERSDETAILED PRESENTATION OF PARTICULAR EMBODIMENTS
Cet exemple illustre la préparation d'un cyclopeptide inhibiteur sélectif de la MMP-I, cet inhibiteur comportant une séquence peptidique Si correspondant à une séquence cible d'une enzyme MMP-I, cette séquence étant la suivante : -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala- Cet inhibiteur est dénommé Cyclo-SS-MMP-1. La préparation de ce cyclopeptide comprend les séquences suivantes : a) le greffage d'un acide aminé de départ : le Fmoc-Lys (MC) sur une résine Fmoc-Cys (Acm) -Wang ; b) la synthèse de la séquence -Gly-Pro-Gln (Trt) -Gly-Leu-Leu-Ala- ; c) la modification du peptide obtenu par greffages successifs de Lys (MAC) et Cys (Acm) ; d) la cyclisation du peptide linéaire.This example illustrates the preparation of a MMP-I selective inhibitory cyclopeptide, this inhibitor comprising a peptide sequence Si corresponding to a target sequence of an MMP-I enzyme, this sequence being the following: -Gly-Pro-Gln- Gly-Leu-Leu-Gly-Ala- This inhibitor is called Cyclo-SS-MMP-1. The preparation of this cyclopeptide comprises the following sequences: a) the grafting of a starting amino acid: Fmoc-Lys (MC) on a Fmoc-Cys (Acm) -Wang resin; b) synthesis of the sequence -Gly-Pro-Gln (Trt) -Gly-Leu-Leu-Ala-; c) the modification of the peptide obtained by successive grafting of Lys (MAC) and Cys (Acm); d) cyclization of the linear peptide.
Dans les protocoles exposés ci-dessus, les abréviations suivantes ont été utilisées :In the protocols outlined above, the following abbreviations have been used:
Acm : S-acétamidométhyl ; ACN : acétonitrile ; DAC : acide 7-diéthylaminocoumarin-3- carboxylique ; DCM : dichlorométhane ; DIEA : N, N'- diisopropyldiéthylamine ; DMF : diméthylformamide; Fmoc : 9-fluorénylméthyloxycarbonyle ; GABA : acide γ- aminobutyrique ; HBTU : O-benzotriazole-N, N, N' , N' - tétraméthyluroniumhexafluorophosphate ; HOBt : N- hydroxybenzotriazole ; MC : acide 7-méthoxycoumarin-3- carboxylique ; NMP : N-méthylpyrrolidone ; pAMPA : acétate 4-aminophénylmercurique ; Tis : triisopropylsilane PyBOP : benzotriazole-1-yloxy-tris- pyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate ; TA : température ambiante ; TFA : acide trifluoroacétique ; TRIS : tris (hydroxyméthyl) aminométhane ; Trt : trityl.Acm: S-acetamidomethyl; ACN: acetonitrile; DAC: 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid; DCM: dichloromethane; DIEA: N, N'-diisopropyldiethylamine; DMF: dimethylformamide; Fmoc: 9-fluorenylmethyloxycarbonyl; GABA: γ-aminobutyric acid; HBTU: O-benzotriazole-N, N, N ', N' -tetramethyluroniumhexafluorophosphate; HOBt: N-hydroxybenzotriazole; MC: 7-methoxycoumarin-3-carboxylic acid; NMP: N-methylpyrrolidone; pAMPA: 4-aminophenylmercuric acetate; Tis: triisopropylsilane PyBOP: benzotriazol-1-yloxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate; TA: room temperature; TFA: trifluoroacetic acid; TRIS: tris (hydroxymethyl) aminomethane; Trt: trityl.
Tous les produits chimiques et les solvants sont de qualité analytique et ont été achetés chez Sigma. La résine Fmoc-Cys (ACM) -Wang, le PyBOP et tous les acides aminés (protégés en Na par Fmoc) ont été achetés chez Advanced Chemtech. Toutes les réactions chimiques ont été réalisées sous N2 avec des solvants anhydres. Le DMF a été desséché sur CaH2 au reflux pendant une nuit et distillé. Le DCM a été distillé avant utilisation. Les spectres UV/Visible ont été enregistrés sur un spectrophotomètre Hitachi modèle U-2010. Les spectres de fluorescence ont été réalisés sur un spectrofluorimètre PTI et un Jobin-Yvonb JY3 avec une cuve thermostatée à 370C. La synthèse peptidique en phase solide a été effectuée sur un synthétiseurAll chemicals and solvents are analytical grade and have been purchased from Sigma. The Fmoc-Cys (ACM) -Wang resin, the PyBOP and all the amino acids (protected in Na by Fmoc) were purchased from Advanced Chemtech. All chemical reactions were carried out under N 2 with anhydrous solvents. The DMF was dried over CaH 2 at reflux overnight and distilled. DCM was distilled before use. UV / Visible spectra were recorded on a Hitachi Model U-2010 spectrophotometer. The fluorescence spectra were carried out on a PTI spectrofluorometer and a Jobin-Yvonb JY3 with a tank thermostated at 37 ° C. Solid phase peptide synthesis was performed on a synthesizer
Applied Biosystem 433A. Les purifications ont été réalisées sur une HPLC Shimadzu en phase inverseApplied Biosystem 433A. Purifications were performed on a reversed-phase Shimadzu HPLC
(Longueurs d'onde 214, 267 et 254 nm) et colonne C18(Wavelengths 214, 267 and 254 nm) and column C18
SATISFACTION RP18AB 5 μm, 250*4,6 mm. Le système de solvants utilisé pour l'élution est : (A) solution aqueuse de TFA à 0,1% et (B) solution aqueuse d'ACN à 70%. La spectrométrie de masse MALDI-TOF a été réalisée sur un Bruker Reflex III.SATISFACTION RP18AB 5 μm, 250 * 4.6 mm. The solvent system used for elution is: (A) 0.1% aqueous TFA solution and (B) 70% aqueous ACN solution. MALDI-TOF mass spectrometry was performed on a Bruker Reflex III.
a) Greffage du Fmoc-Lys (MC) sur une résinea) Grafting Fmoc-Lys (TM) onto a resin
Fmoc-Lys (Acm) -WangFmoc-Lys (Acm) -Wang
Le schéma réactionnel est le suivant :The reaction scheme is as follows:
Figure imgf000023_0001
le réactif Fmoc-Lys (MC) répondant à la formule suivante :
Figure imgf000023_0001
Fmoc-Lys (TM) reagent having the following formula:
Figure imgf000024_0001
les groupes Fmoc et Acm correspondant respectivement aux formules suivantes :
Figure imgf000024_0001
the Fmoc and Acm groups respectively corresponding to the following formulas:
Figure imgf000024_0002
Figure imgf000024_0002
la résine obtenue étant symbolisée par Fmoc-Lys (MC) -Cys (Acm) -Wang. Dans un premier temps, la résine Fmoc-the resin obtained being symbolized by Fmoc-Lys (MC) -Cys (Acm) -Wang. At first, the Fmoc-resin
Cys (Acm) -Wang (330 mg, 0,8 mmol/g) a été déprotégée (c'est-à-dire débarrassée du groupe Fmoc) par mise en contact avec un mélange comprenant 20% de pipéridine dans du DMF à température ambiante (T. A) pendant 3 heures. La présence d'aminé primaire libre a été vérifiée par le test de Kaiser.Cys (Acm) -Wang (330 mg, 0.8 mmol / g) was deprotected (that is to say freed from the Fmoc group) by contact with a mixture comprising 20% piperidine in DMF at room temperature. room temperature (T. A) for 3 hours. The presence of free primary amine was verified by the Kaiser test.
Cette résine est mise à réagir avec de la Fmoc-Lys (MC) (330 mg, 0,578 mmol) en présence de PyBOP (260 mg, 0,58 mmol), de HOBt (82 mg, 0,6 mmol) et de DIEA (200 μL, 1,6 mmol) dans le DMF (5 mL) pendant 5 heures à température ambiante.This resin is reacted with Fmoc-Lys (330 mg, 0.578 mmol) in the presence of PyBOP (260 mg, 0.58 mmol), HOBt (82 mg, 0.6 mmol) and DIEA (200 μL, 1.6 mmol) in DMF (5 mL) for 5 hours at room temperature.
La résine est, par la suite, filtrée et lavée avec du DMF, DCM et du méthanol. 464 mg de Fmoc- Lys (MC) -Cys (Acm) -Wang sont récupérés. Le taux de substitution de cette nouvelle résine a été déterminé àThe resin is subsequently filtered and washed with DMF, DCM and methanol. 464 mg of Fmoc-Lys (MC) -Cys (Acm) -Wang are recovered. The substitution rate of this new resin was determined at
0,53 mmol/g par mesure UV du complexe dibenzofulvène après traitement à la pipéridine. Les fonctions aminés, qui n'ont pas réagi ont été acétylées en présence d'anhydride acétique (16 mg, 0,16 mmol), de pipéridine0.53 mmol / g by UV measurement of the dibenzofulvene complex after treatment with piperidine. The unreacted amino functions were acetylated in the presence of acetic anhydride (16 mg, 0.16 mmol), piperidine
(12 mg, 0,16 mmol) dans du DMF (5 mL) pendant 40 minutes à température ambiante.(12 mg, 0.16 mmol) in DMF (5 mL) for 40 minutes at room temperature.
b) Synthèse peptidique automatisée de la séquence Gly-Pro-Gln (Trt) -Gly-Leu-Leu-Alab) Automated Peptide Synthesis of the Gly-Pro-Gln (Trt) -Gly-Leu-Leu-Ala Sequence
Le schéma réactionnel est le suivant :The reaction scheme is as follows:
Fmoc-Lys(MC)-Cys(Acm) WangFmoc-Lys (TM) -Cys (Acm) Wang
H2N-GIy-PrO-GIn(Tn)-GIy-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS(MC)-CyS(ACm) WangH 2 N-GIy-PrO-GIn (Tn) -GIy-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS (MC) -CyS (ACm) Wang
La résine Fmoc-Lys (MC) -Cys (Acm) -WangFmoc-Lys (TM) -Cys (Acm) -Wang Resin
(188 mg, 0,1 mmol) est introduite dans le réacteur du synthétiseur. Les acides aminés (GIy, Pro, GIn (Trt) , Leu et AIa) protégés en Na (Fmoc) sont introduits en excès (10 fois) . Les étapes de couplage sont réalisées en présence de HBTU, HOBt et DIEA. Après 15 heures, 227 mg de peptide lié à la résine sont récupérés. c) Modification du peptide(188 mg, 0.1 mmol) is introduced into the synthesizer reactor. The amino acids (GIy, Pro, GIn (Trt), Leu and Ala) protected in Na (Fmoc) are introduced in excess (10 times). The coupling steps are carried out in the presence of HBTU, HOBt and DIEA. After 15 hours, 227 mg of peptide bound to the resin are recovered. c) Modification of the peptide
Le schéma réactionnel est le suivantThe reaction scheme is as follows
H2N-GIy-PrO-GIn(TrO-GIy-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS(MC)-CyS(ACm) WangH 2 N-GIy-PrO-GIn (TrO-GIy-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS ™ -CyS (ACm) Wang
1) Fmoc-Lys(DAC), PyBOP, HOBt, DIEA, DMF, TA, 5h1) Fmoc-Lys (DAC), PyBOP, HOBt, DIEA, DMF, TA, 5h
2) Fmoc-Cys(Acm), PyBOP, HOBt, DIEA, NMP, TA, 12h2) Fmoc-Cys (Acm), PyBOP, HOBt, DIEA, NMP, TA, 12h
Fmoc-Cys(Acm)-Lys(DAC)-Gly-fro-Gm(Trt)-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys(MC)-Cys(Acm} Wang Fmoc-Cys (Acm) -Lys (DAC) -Gly-fro-Gm (Trt) -Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys (TM) -Cys (Acm) Wang
le Fmoc-Lys (DAC) et le Fmoc-Cys (Acm) répondant respectivement aux formules suivantes :Fmoc-Lys (DAC) and Fmoc-Cys (Acm) corresponding respectively to the following formulas:
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0001
La Fmoc-Lys (DAC) (190 mg, 0,3 mmol) est couplée au peptide sur résine en présence de PyBOP (153 mg, 0,3 mmol), de HOBt (40,53 mg, 0,3 mmol) et de DIEA (99,1 μL, 0,6 mmol) dans du DMF (5 mL) pendant 5 heures à température ambiante. Par la suite, la résine est filtrée et lavée comme précédemment. 235 mg sont récupérés. Le taux de substitution est évalué à 0,28 mmol/g. Les aminés n'ayant pas réagi sont acétylées par la même procédure que celle décrite plus haut .Fmoc-Lys (DAC) (190 mg, 0.3 mmol) is coupled to the peptide on resin in the presence of PyBOP (153 mg, 0.3 mmol), HOBt (40.53 mg, 0.3 mmol) and DIEA (99.1 μL, 0.6 mmol) in DMF (5 mL) for 5 minutes. hours at room temperature. Subsequently, the resin is filtered and washed as before. 235 mg are recovered. The degree of substitution is evaluated at 0.28 mmol / g. The unreacted amines are acetylated by the same procedure as described above.
Après un traitement avec 20% de pipéridine dans le DMF, la Fmoc-Cys (Acm) (207,24 mg, 0,5 mmol) est couplée au peptide sur la résine en présence de PyBOP (255 mg, 0,49 mmol), de HOBt (67,67 mg, 0,5 mmol) et de DIEA (165 μL, 1 mmol) dans la NMP (5 mL) à température ambiante pendant 12 heures. La résine est filtrée et lavée pour donner 253 mg de peptide sur résine.After treatment with 20% piperidine in DMF, Fmoc-Cys (mAb) (207.24 mg, 0.5 mmol) is coupled to the peptide on the resin in the presence of PyBOP (255 mg, 0.49 mmol) , HOBt (67.67 mg, 0.5 mmol) and DIEA (165 μL, 1 mmol) in NMP (5 mL) at room temperature for 12 hours. The resin is filtered and washed to give 253 mg peptide on resin.
d) Cyclisation du peptided) Cyclization of the peptide
Ensuite, la cyclisation du peptide linéaire obtenu est opérée selon le schéma réactionnel suivant : Then, the cyclization of the linear peptide obtained is carried out according to the following reaction scheme:
FmOC-CyS(ACm)-LyS(DAC)-GIy-PrO-GIn(Tn)-GIy-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS(MC)-CyS(ACm) WangFmOC-CyS (ACm) -LyS (DAC) -Gly-PrO-GIn (Tn) -Gly-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS (MC) -CyS (ACm) Wang
Ti(CF3Cθ2)3, DMF/Anisole (19: 1) 00C, 1 ,5 hTi (CF 3 CO 2) 3 , DMF / Anisole (19: 1) 0 0 C, 1.5 h
FmOC-CyS-LyS(DAC)-GIy-PrO-GIn(Tn)-GIy-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS(MC)-Cy 'S3 W V angFmOC-CyS-LyS (DAC) -Gly-PrO-GIn (Tn) -Gly-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS (MC) -Cy 'S3 W V ang
20% Pipéπdine/DMF, TA, 30 min20% Piperidine / DMF, TA, 30 min
H2N-CyS-LyS(DAC)-GIy-PrO-GIn(Tn)-GIy-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS(MC)-CyS WangH 2 N-CyS-LyS (DAC) -Gly-PrO-GIn (Tn) -Gly-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS ™ -CyS Wang
S SS S
TFA/TIS/H2O (95:2,5:2,5), TA, 3hTFA / TIS / H 2 O (95: 2.5: 2.5), TA, 3h
H2N-CvS-LyS(DAC)-GIy-PrO-GIn(Tn)-GIy-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS(MC)-CyS-OH S SH 2 N-CvS-LyS (DAC) -Gly-PrO-GIn (Tn) -Gly-LeU-LeU-GIy-Ala-LyS (MC) -CyS-OH SS
Après un traitement avec 20% de pipéridine dans du DMF, la résine est mise en suspension dans une solution de DMF/anisole (19/1). L'ensemble est refroidi à 00C et du Ti(CF3CO2)3 (65,2 mg, 0,12 mmol) est ajouté. Après 1,5 h d'agitation, la résine est filtrée et lavée avec du DMF (50 mL) et du DCM (50 mL) .After treatment with 20% piperidine in DMF, the resin is suspended in a solution of DMF / anisole (19/1). The mixture is cooled to 0 ° C. and Ti (CF 3 CO 2 ) 3 (65.2 mg, 0.12 mmol) is added. After 1.5 h stirring, the resin is filtered and washed with DMF (50 mL) and DCM (50 mL).
Après déprotection de l'extrémité N- terminale (20% pipéridine/DMF) , 112 mg de la résine est mise en suspension dans une solution de TFA/H2O/TISAfter deprotection of the N-terminus (20% piperidine / DMF), 112 mg of the resin is suspended in a solution of TFA / H 2 O / TIS
(95/2,5/2,5). Après 3 heures à température ambiante, la résine est filtrée, lavée avec du TFA (2*1 mL) et du DCM (10 mL) . Le filtrat est évaporé partiellement sous pression réduite puis noyé dans l'éther froid.(95 / 2.5 / 2.5). After 3 hours at room temperature, the resin is filtered, washed with TFA (2 * 1 mL) and DCM (10 mL). The filtrate is partially evaporated under reduced pressure and then immersed in cold ether.
Après 12 heures à -200C, le précipité est filtré et lavé pour obtenir 38 mg de produit brut. Après purification par HPLC semi-préparative, 16 mg de Cyclo-SS-MMP-1 sont obtenus. La structure du peptide a été vérifiée par ESMS.After 12 hours at -20 ° C., the precipitate is filtered and washed to obtain 38 mg of crude product. After purification by semi-preparative HPLC, 16 mg of Cyclo-SS-MMP-1 are obtained. The structure of the peptide has been verified by ESMS.
La formule du produit obtenu est la suivante :The formula of the product obtained is as follows:
CyS-LyS(DAC)-GIy-PrO-GIn-GIy-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS(MC)-CySCys-Lys (DAC) -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys (TM) -Cys
le groupe Cys lié au groupe Lys (DAC) répondant à la formule suivante :the Cys group linked to the Lys group (DAC) corresponding to the following formula:
Figure imgf000029_0001
tandis que le groupe Cys lié au groupe Lys (MC) répond à la formule suivante :
Figure imgf000029_0001
while the Cys group linked to the Lys (TM) group has the following formula:
Figure imgf000029_0002
Figure imgf000029_0002
ce cyclopeptide étant dénommé par l'abréviation Cyclo-SS-MMP-1. e) Mesure de l'activité inhibitrice du Cyclo-SS-MMP-1this cyclopeptide being named by the abbreviation Cyclo-SS-MMP-1. e) Measurement of the inhibitory activity of Cyclo-SS-MMP-1
Les tests en présence de MMP-I ont été réalisés dans un tampon TRIS 0,1 N (pH=7,46) en présence de 0,1 M de NaCl et de 10 mM de CaCl2. Les tests ont été réalisés avec de la MMP-I active et activée par du pAPMA (Sigma Aldrich) . Avant leur utilisation, la présence de MMP-I active a été contrôlée par électrophorèse .The tests in the presence of MMP-I were carried out in a 0.1 N TRIS buffer (pH = 7.46) in the presence of 0.1 M NaCl and 10 mM CaCl 2 . The tests were performed with active and activated MMP-I by pAPMA (Sigma Aldrich). Before their use, the presence of active MMP-I was checked by electrophoresis.
Différentes solutions mères ont été préparées pour effectuer les mesures de cinétiques :Different stock solutions have been prepared to perform kinetic measurements:
Solution A : le peptide a été dissous dans la solution tampon, pour obtenir une concentration finale de 90 μM ;Solution A: the peptide was dissolved in the buffer solution, to obtain a final concentration of 90 μM;
- Solution B : le peptide Cyclo-SS-MMP-1 a été dissous dans la solution tampon pour obtenir une concentration finale de 54,8 μM.Solution B: Cyclo-SS-MMP-1 peptide was dissolved in the buffer solution to obtain a final concentration of 54.8 μM.
Ces concentrations ont été vérifiées par mesure de l'absorbance à 431 nm (λmax du fluorophore DAC, ε=42000 M"1. cm"1). Tous les essais ont été réalisés dans un volume final de 2 mL avec une concentration finale de MMP-I de 1 nM en faisant varier la concentration du peptide 1 (2,5 ; 5 et 10 μM) et du Cyclo-SS-MMP-1 (0,25 ; 0,5 et 1 μM) . En présence du Cyclo-SS-MMP-1, on a pu constater une diminution de l'hydrolyse du peptide 1 au cours du temps (comme l'atteste la figure 1) .These concentrations were verified by measuring the absorbance at 431 nm (λ max of the fluorophore DAC, ε = 42000 M -1 cm -1 ). All assays were performed in a final volume of 2 mL with a final concentration of MMP-I of 1 nM by varying the concentration of peptide 1 (2.5, 5 and 10 μM) and Cyclo-SS-MMP- 1 (0.25, 0.5 and 1 μM). In the presence of Cyclo-SS-MMP-1, it has been possible to observe a decrease in the hydrolysis of peptide 1 over time (as shown in FIG. 1).
Afin de tester l'activité du Cyclo-SS-MMP-1 sur d'autres MMP, des essais en présence du peptide 2 (Dabcyl-GABA-PrO-GIn-GIy-LeU-GIu-EDANS-AIa-LyS-NH2) , Dabcyl et EDANS signifiant respectivement acide 4- (4'- diméthylaminophénylaza) benzoïque et acide 5- (2'- aminométhyl) naphtalènesulfonique, et de MMP-9 ont été réalisées. Les essais en présence ou non de Cyclo-SS- MMP-I n'ont pas montré de variation de l'hydrolyse du peptide 2 au cours du temps.In order to test the activity of Cyclo-SS-MMP-1 on other MMPs, tests in the presence of peptide 2 (Dabcyl-GABA-PrO-GIn-GIy-LeU-GIu-EDANS-Ala-LyS-NH 2 ), Dabcyl and EDANS respectively mean 4- (4'-dimethylaminophenylaza) benzoic acid and 5- (2'-aminomethyl) naphthalenesulfonic acid, and MMP-9 were made. Trials with or without Cyclo-SS-MMP-I showed no change in the hydrolysis of peptide 2 over time.
f_) Détermination de la constante d' inhibition Après addition de l'enzyme, l'hydrolyse du peptide 1 est suivie par l'augmentation de l'émission de fluorescence à 403 nm (MC) après excitation à 340 nm. Les différents graphes de variation de fluorescence de MC en fonction du temps sont obtenus en faisant varier les concentrations du peptide 1 et du cyclopeptide Cyclo-SS-MMPl . Les vitesses initiales sont alors extrapolées puis utilisées pour déterminer la constante d'inhibition K du Cyclo-SS-MMPl par la représentation de Dixon. Elle est évaluée à 187 nM. Determination of the inhibition constant After addition of the enzyme, the hydrolysis of the peptide 1 is followed by the increase of the fluorescence emission at 403 nm (MC) after excitation at 340 nm. The different fluorescence variation plots of MC as a function of time are obtained by varying the concentrations of the peptide 1 and cyclopeptide Cyclo-SS-MMP1. The initial velocities are then extrapolated and then used to determine the inhibition constant K of the Cyclo-SS-MMP1 by the Dixon representation. It is evaluated at 187 nM.

Claims

REVENDICATIONS
1. Cyclopeptide répondant à la formule suivante :Cyclopeptide corresponding to the following formula:
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000032_0001
dans laquelle :in which :
- Si est une séquence peptidique cible d'une enzyme MMP, c'est-à-dire une séquence peptidique apte à être reconnue et clivée par une enzyme MMP ;Si is a target peptide sequence of an MMP enzyme, that is to say a peptide sequence capable of being recognized and cleaved by an MMP enzyme;
-M1 et M2 représentent, indépendamment, une liaison simple, un groupe hydrocarboné ou un reste d'acide aminé, éventuellement porteur d'un groupe pendant aromatique ;-M 1 and M 2 represent, independently, a single bond, a hydrocarbon group or an amino acid residue, optionally carrying a pendant aromatic group;
-X et Y représentent, indépendamment, une liaison simple, un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié, pouvant comporter dans sa chaîne, un ou plusieurs hétéroatomes, ou un reste d'acide aminé.-X and Y represent, independently, a single bond, a hydrocarbon group, linear or branched, may include in its chain, one or more heteroatoms, or a residue of amino acid.
2. Cyclopeptide selon la revendication 1, dans lequel l'enzyme MMP est choisie parmi la MMP-I, MMP-2, MMP-3, MMP-5, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-IO, MMP- 11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-I 6, MMP-17, MMP-I 9, MMP-23, MMP-25 et MMP-26.The cyclopeptide according to claim 1, wherein the MMP enzyme is selected from MMP-I, MMP-2, MMP-3, MMP-5, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-I 6, MMP-17, MMP-I 9, MMP-23, MMP-25 and MMP-26.
3. Cyclopeptide selon la revendication 2, dans lequel : - la séquence peptidique Si, lorsqu'elle est cible de l'enzyme MMP-I, répond à l'une des formules suivantes :Cyclopeptide according to claim 2, wherein: the peptide sequence Si, when it is targeted at the MMP-I enzyme, corresponds to one of the following formulas:
-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala
SEQ. 1 -Ala-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-SEQ. 1 -Ala-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-
SEQ. 2SEQ. 2
-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln- SEQ.3-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln- SEQ.3
-Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-AIa-Gly-IIe-Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-IIe-
SEQ.4 -Gly-Pro-GIu-Gly-Leu-Arg-Val-GIy-SEQ.4 -Gly-Pro-GIu-Gly-Leu-Arg-Val-GIy-
SEQ.5 -Tyr-Glu-Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-SEQ.5 -Tyr-Glu-Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-
SEQ.6 -Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-Glu-Arg-SEQ.6 -Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-Glu-Arg-
SEQ.7SEQ.7
-Ala-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Ser-Thr- SEQ.8-Ala-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Ser-Thr- SEQ.8.8
-Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile--Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-
SEQ.9 -Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-SEQ.9 -Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-
SEQ.10 -Thr-Glu-Gly-Glu-AIa-Arg-Gly-Ser-SEQ.10-Thr-Glu-Gly-Glu-Ala-Arg-Gly-Ser-
SEQ.11SEQ.11
-Pro-Cha-Abu-Cys (Me) -His-Ala- SEQ.12-Pro-Cha-Abu-Cys (Me) -His-Ala-SEQ.12
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala--Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala
SEQ. 13 ou - la séquence peptidique Si, lorsqu'elle est cible de l'enzyme MMP-2, répond à l'une des formules suivantes :SEQ. 13 or the peptide sequence Si, when it is targeted at the MMP-2 enzyme, corresponds to one of the following formulas:
-Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala--Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala-
SEQ.14SEQ.14
-Pro-GIn-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys- SEQ.15-Pro-GIn-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys- SEQ.15
-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg--Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg
SEQ.16 ou - la séquence peptidique Si, lorsqu'elle est cible de l'enzyme MMP-3, répond à l'une des formules suivantes :SEQ.16 or - the peptide sequence Si, when it is targeted at the MMP-3 enzyme, corresponds to one of the following formulas:
-Arg-Val-GIy-Phe-Tyr-Glu-Ser-Asp-Arg-Gly-Val-Phe-Tyr-Glu-Asp-Ser
SEQ.17SEQ.17
-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr- SEQ.18-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr- SEQ.18
-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro
SEQ.19SEQ.19
-Ile-Ala-Gly-Arg-Ser-Leu-Asn-Pro--Ile-Ala-Gly-Arg-Ser-Leu-Asn-Pro-
SEQ.20SEQ.20
-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu
SEQ.21SEQ.21
-Asp-Val-Ala-Gln-Phe-Val-Leu-Thr- SEQ.22-Asp-Val-Ala-Gln-Phe-Val-Leu-Thr- SEQ.22
-Asp-Thr-Leu-Glu-Val-Met-Arg-Lys-Asp-Glu-Leu-Thr-Val-Met-Arg-Lys
SEQ.23SEQ.23
-Asp-Val-GIy-His-Phe-Arg-Thr-Phe- SEQ.24-Asp-Val-GIy-His-Phe-Arg-Thr-Phe- SEQ.24
-Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-Met-Leu-Thr-Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-Met-Leu-Thr
SEQ.25 -Arg-Val-Ala-Glu-Met-Arg-Gly-Glu-SEQ.25 -Arg-Val-Ala-Glu-Met-Arg-Gly-Glu
SEQ.26SEQ.26
-Asp-Leu-Gly-Arg-Phe-Gln-Thr-Phe--Asp-Leu-Gly-Arg-Phe-Gln-Thr-Phe-
SEQ.27SEQ.27
-Pro-Phe-Ser-Pro-Leu-Val-Ala-Thr- SEQ.28-Pro-Phe-Ser-Pro-Leu-Val-Ala-Thr- SEQ.28
-Ala-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Ser- SEQ.29-Ala-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Ser- SEQ.29
-Phe-Ser-Ser-Glu-Ser-Lys-Arg-Glu-Phe-Ser-Ser-Glu-Ser-Lys-Arg-Glu
SEQ.30SEQ.30
-Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Phe-Gln- SEQ.31 ou-Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Phe-Gln-SEQ.31 or
- la séquence peptidique Si, lorsqu'elle est cible de l'enzyme MMP-9, répond à l'une des formules suivantes : -Gly-Pro-Pro-Gly-Val-Val-Gly-Pro-the peptide sequence Si, when it is targeted at the MMP-9 enzyme, corresponds to one of the following formulas: Gly-Pro-Pro-Gly-Val-Val-Gly-Pro
SEQ.32SEQ.32
-Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Gly-Glu-Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Gly-Glu
SEQ.33 -GIy-Pro-Gly-Gly-Val-Val-GIy-Pro-SEQ.33 -GIy-Pro-Gly-Gly-Val-Val-GIy-Pro-
SEQ.34SEQ.34
-Ile-Pro-Gln-Asn-Phe-Phe-Gly-Val--Ile-Pro-Gln-Asn-Phe-Phe-Gly-Val
SEQ.35SEQ.35
-Pro-Pro-Gly-AIa-Tyr-His-Gly-AIa- SEQ.36-Pro-Pro-Gly-AIa-Tyr-His-Gly-AIa- SEQ.36
ou - la séquence peptidique Si, lorsqu'elle est cible de l'enzyme MMP-14, répond à l'une des formules suivantes :or the peptide sequence Si, when it is targeted at the MMP-14 enzyme, corresponds to one of the following formulas:
-Pro-Leu-Ala-Cys (p-OMeBz) -Trp-Ala-Arg- SEQ. 37-Pro-Leu-Ala-Cys (p-OMeBz) -Trp-Ala-Arg-SEQ. 37
4. Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le groupe X et le groupe Y représentent un reste d' acide aminé comportant un groupe pendant aromatique ou un reste d' acide aminé comportant un groupe pendant porteur d'un hétéroatome, tel que OH, SH.A cyclopeptide according to any one of the preceding claims, wherein the group X and the group Y represent an amino acid residue having an aromatic pendant group or an amino acid residue having a pendant heteroatom group, such as OH, SH.
5. Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le groupe X et le groupe Y répondent respectivement aux formules suivantes :Cyclopeptide according to any one of the preceding claims, wherein the group X and group Y respectively correspond to the following formulas:
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000037_0001
6. Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel Mi et M2 sont des groupes hydrocarbonés ou des restes d' acide aminé porteurs d'un groupe pendant aromatique.Cyclopeptide according to any one of the preceding claims, wherein Mi and M 2 are hydrocarbon groups or amino acid residues carrying an aromatic pendant group.
7. Cyclopeptide selon la revendication 6, dans lequel le groupe pendant aromatique est un groupe benzénique, anthracénique ou coumarine.Cyclopeptide according to claim 6, wherein the aromatic pendant group is a benzene, anthracene or coumarin group.
8. Cyclopeptide selon la revendication 7, dans lequel le groupe coumarine répond à l'une des formules suivantes : Cyclopeptide according to Claim 7, in which the coumarin group corresponds to one of the following formulas:
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000038_0001
MC
Figure imgf000038_0002
MC
Figure imgf000038_0002
9. Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel :Cyclopeptide according to any one of the preceding claims, wherein:
- Mi et M2 sont des restes d' acide aminé porteurs d'un groupe pendant aromatique ; et- Mi and M 2 are amino acid residues carrying an aromatic pendant group; and
- X et Y sont des restes d'acide aminé.X and Y are amino acid residues.
10. Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel Mi et M2 répondent respectivement aux formules suivantes :
Figure imgf000039_0001
10. Cyclopeptide according to any one of the preceding claims, wherein Mi and M 2 respectively satisfy the following formulas:
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000039_0002
Figure imgf000039_0002
11. Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, répondant à la formule suivante :11. Cyclopeptide according to any one of the preceding claims, corresponding to the following formula:
Cys M1 S1 M2 CysCys M 1 S 1 M 2 Cys
Si, Mi et M2 étant tels que définis dans les revendications précédentes et les restes Cys liés à Mi et M2 répondant respectivement aux formules suivantes :
Figure imgf000040_0001
Si, Mi and M 2 being as defined in the preceding claims and the residues Cys bound to Mi and M 2 respectively corresponding to the following formulas:
Figure imgf000040_0001
12. Cyclopeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la séquence peptidique Si répond à la formule suivante :Cyclopeptide according to any one of the preceding claims, wherein the peptide sequence Si has the following formula:
-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala
13. Cyclopeptide selon la revendication 12, répondant à la formule suivante:Cyclopeptide according to claim 12, having the following formula:
CyS-LyS(DAC)-GIy-PrO-GIn-GIy-LeU-LeU-GIy-AIa-LyS(MC)-CySCys-Lys (DAC) -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-Lys (TM) -Cys
les groupes -Lys (DAC) - et -Lys (MC) répondant aux formules respectives suivantes :the -Lys (DAC) - and -Lys (MC) groups corresponding to the following respective formulas:
Figure imgf000040_0002
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000040_0002
Figure imgf000041_0001
le groupe Cys lié au groupe Lys (DAC) répondant à la formule suivante :the Cys group linked to the Lys group (DAC) corresponding to the following formula:
Figure imgf000041_0002
tandis que le groupe Cys lié au groupe Lys (MC) répond à la formule suivante :
Figure imgf000041_0002
while the Cys group linked to the Lys (TM) group has the following formula:
Figure imgf000041_0003
Figure imgf000041_0003
14. Utilisation d'un cyclopeptide tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 en tant qu'inhibiteurs d'une enzyme protéase MMP. 14. Use of a cyclopeptide as defined in any one of claims 1 to 13 as inhibitors of an MMP protease enzyme.
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