JP4182196B2

JP4182196B2 - Telomerase inhibitor

Info

Publication number: JP4182196B2
Application number: JP2002015209A
Authority: JP
Inventors: 博幸上山; 繁織竹中; 誠高木
Original assignee: Kyushu University NUC
Current assignee: Kyushu University NUC
Priority date: 2002-01-24
Filing date: 2002-01-24
Publication date: 2008-11-19
Anticipated expiration: 2022-01-24
Also published as: JP2003212894A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターカレータ基置換α-アミノ酸残基を含むテロメラーゼ阻害活性を有するペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩、およびそれらを有効成分として含有するテロメラーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
テロメア(telomere)は真核細胞の染色体の両端に存在し、DNAと蛋白質からなる特殊な構造を持ち、ヒトテロメアはTTAGGGの塩基配列が2千から3千回反復された特異な構造を有しており、染色体末端の安定化に必要とされているものである。実際、テロメアを欠く染色体は融合や転座を受けることが知られている。体細胞においては、DNAポリメラーゼ複合体はラギング鎖の5'末端を複製できないため、in vitroもしくはin vivoにおいて、テロメア長が細胞分裂毎に短くなり、末端複製問題(end-replication problem)と言われている。このように細胞分裂を繰り返しDNAが複製されるたびに、テロメアDNAは短くなるため、テロメアは「命を刻む時計」とも言われている。
【０００３】
通常、体細胞などは細胞分裂を繰り返すたびにテロメアDNAの短縮化が起きるが、生殖細胞や不死化細胞はテロメアDNAの長さを保持している。これは、テロメアDNAを伸長させる酵素であるテロメラーゼ(telomerase)によってテロメアDNAが合成されているためである。この酵素の存在は、1984年にGreiderらによってテトラヒメナ(Tetrahymena)で初めて報告された。このテロメラーゼはテロメアの反復配列に相補的な配列を持つ鋳型RNAと2種類の蛋白質からなるRNA-蛋白質複合体で、一種の逆転写酵素である。ヒトのテロメラーゼRNAは単離され、その鋳型領域は11ヌクレオチド(5'-CUAACCCUAAC)であり、ヒトのテロメア配列(TTAGGG)nに相補的であることが分かっている。通常テロメアは3'末端が1本鎖として突出して存在しており、テロメラーゼはそのテロメアDNAの末端構造を認識して結合し、内在的鋳型RNAを用いて、テロメア1本鎖DNAの3'末端にテロメア反復配列を付加していく。
近年、正常のヒト体細胞では検出されないこのテロメラーゼ活性が、不死化した培養細胞やがん組織由来の細胞では高度(85〜95%)に活性化されていることが判明し、細胞の不死化、がん化あるいは老化といったことにテロメラーゼが重要な役割を担っていることが明らかになった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような事実から、テロメラーゼの活性を阻害・抑制する物質が、テロメラーゼ活性が亢進した過剰増殖細胞で見出される過剰増殖性疾患、例えば、がん、乾癬、マルファン症候群などの有効な治療剤になり得ると考えられるため、これまでに種々のテロメラーゼ阻害剤が提案されている。例えば、アンチセンスDNAやペプチド核酸をもとにしたもの(Norton et al., Nature Biotechnology 14:615-619)、ピリジン系化合物(特開平11-49676号公報、特開平11-49678号公報、特開平11-49679号公報、特開平11-49777号公報等)、緑茶由来のカテキン(Naasani et al., 249:391-396,1998)などの多くのテロメラーゼ阻害剤が提案されている。
【０００５】
他方、テロメアDNAは、グアニン(G)の多い繰り返し配列を持っているため、その3'末端側の張り出し領域はG配列が4つ集まって(G-tetrad)、4本鎖構造(Quadruplex)を形成することが明らかになっている(Stu Borman, October 5, 1998, C&EN, 42-46)。この4本鎖構造には、テロメラーゼは結合できずその活性を示さない。従って、この4本鎖構造を安定化させることができれば、テロメラーゼの活性を阻害することができ、がん細胞に有効に働くものと考えられる。このようにテロメアDNAの4本鎖構造を安定化させるものとして、カリウムイオン(Balagurumoorthy, P. et. al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 21858)、アントラセン誘導体(Sun,D.,et al.,1997. J.Med.Chem., 40, 2113; Perry,P.J.,et al., J.Med.Chem., 41,3253)、ペリレン誘導体(Fedoroff,O.Y.,et al., 1998. Biochemistry 37, 12367)などが提案されている。しかしながら、これらのテロメラーゼ阻害剤も、十分にテロメラーゼの活性を阻害できるとは言えず、未だテロメラーゼを標的とした医薬が開発されていないのが現状である。
従って、本発明の目的は、テロメラーゼの活性を十分に阻害できる新たな物質を提供することにある。
本発明の他の目的は、この新たな物質を有効成分として含有するテロメラーゼ阻害剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、テロメアDNAの3'末端側の張り出し領域に存在するG配列が4つ集まって形成する4本鎖構造を十分に安定化させる物質を得ることを目的として鋭意研究した結果、アクリジン骨格を有する基、アントラキノン骨格を有する基、アントラセン骨格を有する基などのインターカレータ基、即ちテロメアDNAの4本鎖構造中でグアニジン塩基が4つ集まって形成される平面構造に平行して挿入し得るインターカレータ基が置換されたα-アミノ酸残基を含むペプチドが、テロメアDNAの4本鎖構造に強力に結合し4本鎖構造を安定化させることができ、従って強力なテロメラーゼ阻害剤となり得ることを見出し本発明を完成させた。
従って、本発明は、インターカレータ基置換α-アミノ酸残基を含むペプチドであって下記式Iで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩である。
【化３】

（式中、Xはインターカレータ基を表し、Yはα-アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zはα-アミノ酸を構成する1価の基を表し、ｎは0、1、2、3、4または5を表す）
更に本発明は、上記ペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩を有効成分として含有するテロメアーゼ阻害剤である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
式Iにおいて、Xはインターカレータ基を表わす。インターカレータ基としては、テロメアDNAの3'末端側の張り出し領域に存在するグアニン配列が4つ集まって形成する4本鎖構造中でグアニジン塩基が4つ集まって形成される平面構造に平行して挿入し得るものであればいずれの基であってもよい。かかるインターカレータ基としては、例えば、置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基、置換基を有していてもよいアントラキノン骨格を有する基、置換基を有していてもよいアントラセン骨格を有する基、置換基を有していてもよいナフタレンイミド骨格を有する基、置換基を有していてもよいナフタレンジイミド骨格を有する基、置換基を有していてもよいピレン骨格を有する基などが挙げられる。ここで言う置換基としては、例えば、塩素、フッ素、臭素などのハロゲン原子；メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、トリフルオロメチルなどのハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数1から6のアルキル基; メトキシ、エトキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどの炭素原子数1から6のアルコキシ基；ホルミル、アセチル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルなどの炭素原子数1から7のアシル基；アセチルオキシ、ブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、ヘキサノイルオキシなどの炭素原子数2から7のアシルオキシ基；アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、メチルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチルなどの炭素原子数1から6のアルキル基が1つもしくは2つ置換されていてもよい炭素原子数1から6のアミノアルキル基などが挙げられる。これらの置換基は、アクリジン骨格、アントラキノン骨格、アントラセン骨格等のいずれの位置に置換されていてもよく、また2つ以上の複数の置換基がこれらの骨格に置換されていてもよい。また、アクリジン骨格、アントラキノン骨格、アントラセン骨格等には、式ＩのペプチドにおけるYと結合するための官能基を有していてもよく、このような官能基としては、例えば、メチレン、エチレンなどの炭素原子数1から6のアルキレン基、カルボニル基、炭素原子数1から6のアルキレンカルボニル基、スルホニル基、アミド基などが挙げられる。
【０００８】
上記した置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基、置換基を有していてもよいアントラキノン骨格を有する基、置換基を有していてもよいアントラセン骨格を有する基、置換基を有していてもよいナフタレンイミド骨格を有する基、置換基を有していてもよいナフタレンジイミド骨格を有する基、置換基を有していてもよいピレン骨格を有する基の具体的な例として以下のものが挙げられる。
置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基
【化４】

置換基を有していてもよいアントラキノン骨格を有する基
【化５】

置換基を有していてもよいアントラセン骨格を有する基
【化６】

置換基を有していてもよいナフタレンイミド骨格を有する基
【化７】

置換基を有していてもよいナフタレンジイミド骨格を有する基
【化８】

置換基を有していてもよいピレン骨格を有する基
【化９】

【０００９】
式Iのペプチドにおいて、Yはα-アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zはα-アミノ酸を構成する1価の基を表す。即ち、Yはα-アミノ酸から-CH(NH₂)COOHを除いた残りの該α-アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zは1価の基を表す。具体的には、Yは-A-W-で表される基であり、ここで、Aはメチレン、エチレン、プロピレン、メチルメチレンンなどの炭素原子数1から6の直鎖もしくは分岐アルキレン基を表し、Wは単結合、NH、CO、CONH、NHCO、O、SまたはHNC(NH)NHを表す。Zは-A-W-Hで表される基である。これらのYおよびZは、α-アミノ酸である、例えばアラニン、リシン、ノルリシン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、システインなどから-CH(NH₂)COOHを除いた残りの該α-アミノ酸を構成するそれぞれ2価の基あるいは1価の基を表す。式Ｉのペプチドにおいて、ｎは0、1、2、3、4または5を表す。
【００１０】
式Iのペプチドは、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩であってもよい。N末端が置換された誘導体としては、例えば、ホルミル、アセチル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルなどの炭素原子数1から7のアシル基；メトキシカルボニル、ブトキシカルボニル、t-ブトキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニルなどの炭素原子数2から7のアルコキシカルボニル基等がN末端のアミノ基に置換された誘導体などが挙げられる。C末端が置換された誘導体としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、トリフルオロメチルなどのハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数1から6のアルキル基; アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、メチルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチルなどの炭素原子数1から6のアミノアルキル基；アミノ基等がC末端のカルボニル基に置換された誘導体などが挙げられる。式Ｉのペプチドの塩あるいは該ペプチドのN末端もしくはC末端が置換された誘導体の塩としては、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸などの有機酸；塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸等との酸付加塩が挙げられる。また、式Ｉのペプチドのカルボキシル基とのナトリウム塩、カリウム塩なども挙げられる。
【００１１】
本発明の式Iのペプチドの特に好ましい例としては、以下の式IIで表されるペプチドが挙げられる。
【化１０】

【００１２】
本発明の式Iのペプチドは、下記式IIIのインターカレータ基置換α-アミノ酸のアミノ基もしくはカルボニル基保護誘導体と下記式IVのα-アミノ酸のアミノ基もしくはカルボニル基保護誘導体とを用いて、周知のペプチド合成反応を行うことによって合成することができる。
【化１１】

ペプチド合成は、両者の保護誘導体を順次ペプチド結合により連結して行うこともでき、また周知の固相法もしくは液相法により合成することもでき、ペプチド合成機により合成することもできる。上記式IIIのインターカレータ基置換α-アミノ酸および上記式IVのα-アミノ酸のアミノ基もしくはカルボニル基保護誘導体としては、上記した保護基で保護されたものが挙げられる。上記式IIIのインターカレータ基置換α-アミノ酸は、下記式Vで表されるα-アミノ酸と下記式VIで表されるインターカレーター誘導体(式VIにおいてDは、ハロゲン原子などの反応性基を表す)とを反応させることにより得ることができる。
【化１２】

式IVまたはVのα-アミノ酸としては、上記したアラニン、リシン、ノルリシン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、システインなどが挙げられる。
かくして式Iのペプチドを得ることができる。式IのペプチドのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩は、式Iのペプチドの合成の段階で得ることもでき、また式Iのペプチドからそれ自体周知の方法で得ることもできる。
【００１３】
本発明の式Iのペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩は、テロメアDNAの3'末端側の張り出し領域に存在するグアニン配列が4つ集まって形成する4本鎖構造に結合し十分に安定化させるため強力なテロメラーゼ阻害剤となり得る。従って、テロメラーゼ活性が亢進した過剰増殖細胞で見出される過剰増殖性疾患、例えば、がん、乾癬、マルファン症候群などの有効な治療剤として用いることができる。本発明のテロメラーゼ阻害剤はヒトを含む哺乳動物に適用することができる。かかるテロメラーゼ阻害剤は、通常の製剤化に用いられるラクトース、でんぷんなどの賦形剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、その他の添加剤などと混合して錠剤とすることができる。また錠剤以外にも、丸剤、散剤、液剤などのすることもでき、また注射剤、外用剤などにすることもできる。これらの製剤はそれ自体周知の方法によって調製することができる。本発明の式Iのペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩の用量は、投与する対象の性別、年齢、症状、体重などにより変動し得るが、通常一日当たり、０．００１〜１００mg/kgの範囲で、単回あるいは数回に分けて投与することができる。
本発明のテロメラーゼ阻害剤は、ヒトを含む哺乳動物以外に、線状染色体を持ち、その維持にテロメラーゼを必要とする線虫、酵母、真菌、原生動物などの増殖抑制剤として適用することができる。また、本発明のテロメラーゼ阻害剤は、研究用の試薬として使用することもできる。
【００１４】
【実施例】
以下に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００１５】
実施例１
テトラキス−アクリジニルペプチドの合成
図１に示す、メトキシ基と塩素原子が置換されたアクリジン骨格がインターカレータ基として置換されたリシン残基を含むペプチド(TAP)を固相合成法により合成した。
1. Fmoc-Lys(Acr)-OHの合成
【化１３】

a)方法
50mlのビーカーにフェノール30gを入れ80℃まで加熱溶解させた。これに6-クロロ-2-メトキシ-9-フェノキシアクリジン4.54g(13.5mmol)を加え完全に溶解させた。その後、55〜65℃で、Fmoc-Lys-OH 4.42g(12.0mmol)を加えて2時間攪拌した。それからしばらく放冷し、300mlのエーテルを攪拌しながら注いだ。得られた沈殿物を吸引濾過し、減圧乾燥させた。
b)結果
性状：黄色固体
収量：7.57g(収率：92%)
¹H-NMR、MALDI TOF MASS（質量分析）により同定した結果、目的化合物の分子量610.11に相当するピークが610.80に検出された。
【００１６】
2.Ac-Lys(Acr)-(Lys(Boc))₂-Lys(Acr)-(Lys(Boc))₂-Lys(Acr)-(Lys(Boc))₂-Lys (Acr)-Resinの合成（TAPの伸長反応）
a)方法
リアクションベッセルにFmoc-NH SAL 樹脂 200mgを入れ、カートリッジ1, 4,7,10にFmoc-Lys(Acr)-OH 0.33gを入れ、カートリッジ2, 3, 5, 6, 8, 9にFmoc-Lys(Boc)-OHを入れた。後は、PE Applied Biosystems社の431Aペプチドシンセサイザーにて合成を行った。Fmoc法でN末端はアセチル化した。
b)結果
性状：黄色固体
収量：0.5003g
【００１７】
3.Ac-Lys(Acr)-(Lys(Boc))₂-Lys(Acr)-(Lys(Boc))₂-Lys(Acr)-(Lys(Boc))₂- Lys(Acr)-樹脂のレジンからの切り出し及び側鎖の脱保護
a)方法
50mlのナス型フラスコに上記の2の実験操作で合成したレジン0.50gを入れ、これにm-クレゾール0.10ml、チオアニソール0.60ml、トリフルオロ酢酸4.3mlを加えて室温で1時間攪拌した。その後、TFAを減圧留去し、氷浴下でエーテル20mlを加えた。超音波照射後、しばらく放置し上澄み液を取り除いた。それから酢酸エチル20mlを加えて超音波照射後、しばらく放置した。吸引ろ過しエーテルで洗浄した。その後、減圧乾燥させた。
b)結果
性状：黄色固体
収量：0.3181g
【００１８】
4.HPLCによる純度チェック及び精製
TAPの純度チェックを以下の条件下で行った。
検出波長：210nmカラム：Inertsil ODS
試料注入溶媒：超純水流速：1ml/min
溶離液A:0.1%TFA水溶液
溶離液B:70%アセトニトリル/0.1%TFA溶液
グラジエント条件
【表１】

同定はTOF MASSにより行った。TOF MASSの結果、目的化合物の分子量2307.51に相当するピークが2309.03に検出された。
【００１９】
実施例２
CD による TAP の Tm 測定
CD（Circular dichroism：円偏光二色性）スペクトルは、その化合物の溶液中における構造、たとえばDNAであればA型、B型、Z型など、また蛋白質についてはα-へリックス、β-シートなどの構造における情報を得ることができる。従って、そのDNAの溶液中の構造が1本鎖構造や2本鎖構造あるいは4本鎖構造でスペクトルが大きく異なるので、CDスペクトルを測定することによって、DNAの溶液中の構造が分かる。
a)方法
CDによるTm測定は以下の測定条件で行った。
測定溶液：10mM MES, 1mM EDTA(pH6.25), 50mM KCl
[テロメア DNA]=2.2μM, DNA:dye=1:1
テロメア DNAとして、以下のヒトのテロメアDNA配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
5'-CATGGTGGTTTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTACCAC-3'
CD測定は、本発明のTAPとともに、対象化合物として図2に示した公知化合物を用いた。
上記の測定溶液に、テロメア DNAを2.2μMになるように添加し、さらにTAPあるいは各化合物も2.2μMずつ入れ、Tm曲線（4本鎖構造の安定性）がどのように変化するかを比較した。
【００２０】
b)結果
得られたTm曲線を図3に示した。図3は、TAPあるいは各公知化合物の存在下で、上記テロメアDNA配列が形成する4本鎖構造が1本鎖構造へ解離される状況を示している。図3ではCDスペクトルの[θ]値で4本鎖構造の安定性が示されている。図3においてNormalized[θ]がちょうど0.5となる温度がTm(融解温度)となる。このTm値が高温になればなるほど、その4本鎖構造は安定化されていることになる。
図3から明らかなように、本発明のTAPを用いた時が最も高いTm(融解温度)を示しており、本発明のTAPによりテロメアDNA配列が形成する4本鎖構造が高度に安定化されたことが判る。
図1に示したように、本発明のTAP分子中のインターカレータ基がテロメアDNA配列が形成する4本鎖構造の平面構造中に挿入されて4本鎖構造が高度に安定化されるものと考えられる。
【００２１】
【発明の効果】
本発明により提供される、アクリジン骨格を有する基、アントラキノン骨格を有する基、アントラセン骨格を有する基などのインターカレータ基が置換されたα-アミノ酸残基を含むペプチドは、テロメアDNAのグアニジン配列が形成する4本鎖構造に強力に結合し4本鎖構造を安定化させることができ、強力なテロメラーゼ阻害剤となり得る。従って、テロメラーゼ活性が亢進した過剰増殖細胞で見出される過剰増殖性疾患、例えば、がん、乾癬、マルファン症候群などの有効な治療剤として用いることができる。また研究用の試薬として用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図1は、本発明で得られる代表的なペプチドであるTAP(テトラキス-アクリジニルペプチド)の化学構造式、並びにTAPがテロメアDNAのグアニジン配列が形成する4本鎖構造に強力に結合し4本鎖構造を安定化させるメカニズムを示す。
【図２】図2は、本発明のペプチドの対象化合物として用いた公知のテロメラーゼ阻害作用を有する化合物を示す。
【図３】図3は、本発明で得られる代表的なペプチドであるTAPおよび公知のテロメラーゼ阻害作用を有する化合物の存在下でテロメアDNAの4本鎖構造が1本鎖構造へ変化する状況を示すTm曲線である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a peptide having an intercalator group-substituted α-amino acid residue and having a telomerase inhibitory activity, a derivative thereof substituted at the N-terminus or C-terminus thereof, or a salt thereof, and a telomerase inhibitor containing them as an active ingredient About.
[0002]
[Prior art]
Telomere is present at both ends of eukaryotic chromosomes and has a special structure consisting of DNA and protein. Human telomere has a unique structure in which the base sequence of TTAGGG is repeated 3,000 to 3,000 times. It is required for stabilization of chromosome ends. In fact, chromosomes lacking telomeres are known to undergo fusion and translocation. In somatic cells, the DNA polymerase complex is unable to replicate the 5 'end of the lagging strand, so in vitro or in vivo, the telomere length is shortened at every cell division and is called the end-replication problem. ing. Each time the DNA is replicated by repeating cell division, the telomere DNA becomes shorter, so it is said that the telomere is a “clock that dies”.
[0003]
Normally, somatic cells and other cells undergo telomere DNA shortening each time they repeat cell division, but germ cells and immortalized cells retain the length of telomeric DNA. This is because telomeric DNA is synthesized by telomerase, which is an enzyme that extends telomeric DNA. The presence of this enzyme was first reported in Tetrahymena in 1984 by Greider et al. This telomerase is a kind of reverse transcriptase, which is an RNA-protein complex consisting of a template RNA having a sequence complementary to a telomeric repetitive sequence and two types of proteins. Human telomerase RNA has been isolated and its template region is 11 nucleotides (5'-CUAACCCUAAC) and is known to be complementary to the human telomere sequence (TTAGGG) n. Normally, telomeres have a 3 'end protruding as a single strand, and telomerase recognizes and binds to the end structure of the telomeric DNA, and uses the endogenous template RNA to make the 3' end of the telomeric single strand DNA. The telomere repeat sequence is added to.
In recent years, it has been found that this telomerase activity, which is not detected in normal human somatic cells, is highly activated (85-95%) in immortalized cultured cells or cells derived from cancer tissue, and the cells are immortalized. It has become clear that telomerase plays an important role in canceration and aging.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Based on these facts, substances that inhibit / suppress telomerase activity are effective therapeutic agents for hyperproliferative diseases found in hyperproliferative cells with enhanced telomerase activity, such as cancer, psoriasis, and Marfan syndrome. Various telomerase inhibitors have been proposed so far because they are considered to be possible. For example, those based on antisense DNA and peptide nucleic acids (Norton et al., Nature Biotechnology 14: 615-619), pyridine-based compounds (JP-A-11-49676, JP-A-11-49678, Many telomerase inhibitors such as Kaihei 11-49679 and JP-A-11-49777) and catechins derived from green tea (Naasani et al., 249: 391-396, 1998) have been proposed.
[0005]
On the other hand, telomeric DNA has a repetitive sequence rich in guanine (G), so its overhanging region on the 3 'end side has four G sequences (G-tetrad), and a four-stranded structure (Quadruplex). It has been shown to form (Stu Borman, October 5, 1998, C & EN, 42-46). Telomerase cannot bind to this four-stranded structure and does not show its activity. Therefore, if this four-stranded structure can be stabilized, the activity of telomerase can be inhibited, and it is considered that it works effectively on cancer cells. As described above, potassium ions (Balagurumoorthy, P. et.al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 21858), anthracene derivatives (Sun, D. , et al., 1997. J. Med. Chem., 40, 2113; Perry, PJ, et al., J. Med. Chem., 41, 3253), perylene derivatives (Fedoroff, OY, et al., 1998) Biochemistry 37, 12367) and the like have been proposed. However, it cannot be said that these telomerase inhibitors can sufficiently inhibit the activity of telomerase, and the present situation is that a drug targeting telomerase has not been developed yet.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a new substance that can sufficiently inhibit the activity of telomerase.
Another object of the present invention is to provide a telomerase inhibitor containing this new substance as an active ingredient.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of earnest research for the purpose of obtaining a substance that sufficiently stabilizes the four-stranded structure formed by gathering four G sequences existing in the overhanging region on the 3 ′ end side of telomeric DNA, the present inventor Intercalator groups such as a group having a skeleton, a group having an anthraquinone skeleton, a group having an anthracene skeleton, that is, inserted in parallel to a planar structure formed by gathering four guanidine bases in the four-stranded structure of telomeric DNA. Peptides containing α-amino acid residues with substituted intercalator groups can strongly bind to and stabilize the four-stranded structure of telomeric DNA and can therefore be potent telomerase inhibitors As a result, the present invention has been completed.
Accordingly, the present invention is a peptide comprising an intercalator group-substituted α-amino acid residue, represented by the following formula I, a derivative thereof substituted at the N-terminus or C-terminus, or a salt thereof.
[Chemical 3]

(Wherein X represents an intercalator group, Y represents a divalent group constituting an α-amino acid, Z represents a monovalent group constituting an α-amino acid, and n represents 0, 1, 2,

Represents

3, 4 or 5)
Furthermore, the present invention is a telomerase inhibitor comprising as an active ingredient the above peptide, its N-terminal or C-terminal substituted derivative or a salt thereof.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In formula I, X represents an intercalator group. The intercalator group is parallel to the planar structure formed by four guanidine bases in a four-stranded structure formed by four guanine sequences existing in the overhanging region on the 3 'end side of telomeric DNA. Any group may be used as long as it can be inserted. Examples of such an intercalator group include a group having an acridine skeleton which may have a substituent, a group having an anthraquinone skeleton which may have a substituent, and an anthracene skeleton which may have a substituent. A group having a naphthalene imide skeleton which may have a substituent, a group having a naphthalenediimide skeleton which may have a substituent, a group having a pyrene skeleton which may have a substituent Etc. Examples of the substituent herein include halogen atoms such as chlorine, fluorine and bromine; and carbon atoms which may be substituted with halogen atoms such as methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl and trifluoromethyl. 1 to 6 alkyl groups; alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms such as methoxy, ethoxy, butoxy, pentoxy, hexoxy; acyl groups having 1 to 7 carbon atoms such as formyl, acetyl, butanoyl, pentanoyl, hexanoyl; acetyloxy Acyloxy groups having 2 to 7 carbon atoms such as butanoyloxy, pentanoyloxy, hexanoyloxy; aminomethyl, aminoethyl, aminopropyl, methylaminomethyl, dimethylaminomethyl, dimethylaminopropyl, dimethylaminobutyl, etc. Alkyl having 1 to 6 carbon atoms There the like one or two optionally substituted from a good carbon atoms 1 6 aminoalkyl group. These substituents may be substituted at any position of the acridine skeleton, anthraquinone skeleton, anthracene skeleton and the like, and two or more plural substituents may be substituted with these skeletons. The acridine skeleton, anthraquinone skeleton, anthracene skeleton and the like may have a functional group for bonding to Y in the peptide of formula I. Examples of such a functional group include methylene and ethylene. Examples thereof include an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, a carbonyl group, an alkylenecarbonyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfonyl group, and an amide group.
[0008]
A group having an acridine skeleton optionally having a substituent, a group having an anthraquinone skeleton optionally having a substituent, a group having an anthracene skeleton optionally having a substituent, and a substituent; Specific examples of the group having a naphthalene imide skeleton which may have, a group having a naphthalenediimide skeleton which may have a substituent, and a group having a pyrene skeleton which may have a substituent are as follows. Can be mentioned.
A group having an acridine skeleton which may have a substituent

A group having an anthraquinone skeleton which may have a substituent

A group having an anthracene skeleton which may have a substituent

A group having an optionally substituted naphthaleneimide skeleton

A group having a naphthalenediimide skeleton which may have a substituent

A group having an optionally substituted pyrene skeleton

[0009]
In the peptide of formula I, Y represents a divalent group constituting an α-amino acid, and Z represents a monovalent group constituting an α-amino acid. That is, Y represents a divalent group constituting the remaining α-amino acid obtained by removing —CH (NH ₂ ) COOH from an α-amino acid, and Z represents a monovalent group. Specifically, Y is a group represented by -AW-, wherein A represents a linear or branched alkylene group having 1 to 6 carbon atoms such as methylene, ethylene, propylene, methylmethylene, W represents a single bond, NH, CO, CONH, NHCO, O, S, or HNC (NH) NH. Z is a group represented by -AWH. These Y and Z are α-amino acids, for example, alanine, lysine, norlysine, aspartic acid, glutamine, serine, cysteine, etc., respectively, constituting the remaining α-amino acids from which -CH (NH ₂ ) COOH is removed. Represents a divalent group or a monovalent group. In the peptide of formula I, n represents 0, 1, 2, 3, 4 or 5.
[0010]
The peptide of formula I may be a derivative thereof substituted at its N-terminus or C-terminus, or a salt thereof. Examples of derivatives substituted at the N-terminus include acyl groups having 1 to 7 carbon atoms such as formyl, acetyl, butanoyl, pentanoyl, hexanoyl; methoxycarbonyl, butoxycarbonyl, t-butoxycarbonyl, pentyloxycarbonyl, hexyloxy Examples thereof include derivatives in which an alkoxycarbonyl group having 2 to 7 carbon atoms such as carbonyl is substituted with an N-terminal amino group. Derivatives substituted at the C-terminus include alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted with halogen atoms such as methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, trifluoromethyl; aminomethyl, amino Aminoalkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, such as ethyl, aminopropyl, methylaminomethyl, dimethylaminomethyl, dimethylaminopropyl, dimethylaminobutyl; derivatives in which the amino group or the like is substituted with a C-terminal carbonyl group It is done. Examples of the salt of the peptide of formula I or the derivative of the peptide in which the N-terminus or C-terminus of the peptide is substituted include organic acids such as acetic acid, trifluoroacetic acid, citric acid and malic acid; inorganics such as hydrochloric acid, sulfuric acid and phosphoric acid Examples include acid addition salts with acids and the like. Also included are sodium and potassium salts with the carboxyl group of the peptide of formula I.
[0011]
Particularly preferred examples of the peptide of formula I of the present invention include peptides represented by the following formula II.
Embedded image

[0012]
The peptide of formula I of the present invention is well known using an amino group or carbonyl group-protected derivative of an intercalator group-substituted α-amino acid of formula III below and an amino group or carbonyl group protected derivative of an α-amino acid of formula IV below. It can synthesize | combine by performing peptide synthesis reaction of these.
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Peptide synthesis can be performed by sequentially linking both protected derivatives by peptide bonds, and can also be synthesized by a well-known solid phase method or liquid phase method, or can be synthesized by a peptide synthesizer. Examples of the intercalator group-substituted α-amino acid of the above formula III and the amino group or carbonyl group-protected derivative of the α-amino acid of the above formula IV include those protected with the above-described protecting groups. The intercalator group-substituted α-amino acid of the above formula III is an α-amino acid represented by the following formula V and an intercalator derivative represented by the following formula VI (in formula VI, D represents a reactive group such as a halogen atom) ).
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Examples of α-amino acids of formula IV or V include alanine, lysine, norlysine, aspartic acid, glutamine, serine, cysteine and the like described above.
A peptide of formula I can thus be obtained. A derivative thereof or a salt thereof in which the N-terminal or C-terminal of the peptide of formula I is substituted can also be obtained at the stage of synthesis of the peptide of formula I, or from a peptide of formula I in a manner known per se. You can also.
[0013]
The peptide of formula I of the present invention, its derivative substituted at the N-terminus or C-terminus, or a salt thereof is formed by four guanine sequences formed in the overhanging region on the 3 ′ end side of telomeric DNA. It can be a potent telomerase inhibitor because it binds to the chain structure and stabilizes sufficiently. Therefore, it can be used as an effective therapeutic agent for hyperproliferative diseases found in hyperproliferative cells with enhanced telomerase activity, such as cancer, psoriasis, and Marfan syndrome. The telomerase inhibitor of the present invention can be applied to mammals including humans. Such telomerase inhibitors can be mixed with excipients such as lactose and starch, lubricants such as magnesium stearate and talc, and other additives that are used in normal formulation to form tablets. In addition to tablets, pills, powders, liquids and the like can be used, and injections and external preparations can also be used. These preparations can be prepared by a method known per se. The dose of the peptide of formula I of the present invention, its N-terminal or C-terminal substituted derivative or salt thereof may vary depending on the sex, age, symptom, body weight, etc. of the subject to be administered. The dose can be administered in a single dose or divided into several doses in the range of 0.001 to 100 mg / kg.
The telomerase inhibitor of the present invention can be applied as a growth inhibitor for nematodes, yeasts, fungi, protozoa, etc. having a linear chromosome and requiring telomerase for its maintenance in addition to mammals including humans. . The telomerase inhibitor of the present invention can also be used as a research reagent.
[0014]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0015]
Example 1
Synthesis of tetrakis-acridinyl peptide As shown in FIG. 1, a peptide (TAP) containing a lysine residue substituted with an acridine skeleton substituted with a methoxy group and a chlorine atom as an intercalator group is prepared by solid phase synthesis. Was synthesized.
1. Synthesis of Fmoc-Lys (Acr) -OH

a) Method
30 g of phenol was placed in a 50 ml beaker and dissolved by heating to 80 ° C. To this, 4.54 g (13.5 mmol) of 6-chloro-2-methoxy-9-phenoxyacridine was added and completely dissolved. Thereafter, at 55 to 65 ° C., 4.42 g (12.0 mmol) of Fmoc-Lys-OH was added and stirred for 2 hours. Then it was allowed to cool for a while and 300 ml of ether was poured with stirring. The resulting precipitate was filtered with suction and dried under reduced pressure.
b) Result properties: Yellow solid Yield: 7.57 g (Yield: 92%)
As a result of identification by ¹ H-NMR and MALDI TOF MASS (mass spectrometry), a peak corresponding to the molecular weight 610.11 of the target compound was detected at 610.80.
[0016]
2.Ac-Lys (Acr)-(Lys (Boc)) ₂ -Lys (Acr)-(Lys (Boc)) ₂ -Lys (Acr)-(Lys (Boc)) ₂ -Lys (Acr) -Resin Synthesis (TAP elongation reaction)
a) Method Place 200 mg of Fmoc-NH SAL resin in the reaction vessel, add 0.33 g of Fmoc-Lys (Acr) -OH into

cartridges

1, 4, 7, 10 and add them into

cartridges

2, 3, 5, 6, 8, 9. Fmoc-Lys (Boc) -OH was added. Thereafter, synthesis was performed using a 431A peptide synthesizer manufactured by PE Applied Biosystems. N-terminal was acetylated by Fmoc method.
b) Result properties: yellow solid Yield: 0.5003g
[0017]
3.Ac-Lys (Acr) - ( Lys (Boc)) 2 -Lys (Acr) - (Lys (Boc)) 2 -Lys (Acr) - (Lys (Boc)) 2 - Lys (Acr) - resin Resin excision and side chain deprotection
a) Method
To a 50 ml eggplant-shaped flask, 0.50 g of the resin synthesized in the above-described experimental operation 2 was added, and m-cresol 0.10 ml, thioanisole 0.60 ml, and trifluoroacetic acid 4.3 ml were added and stirred at room temperature for 1 hour. Thereafter, TFA was distilled off under reduced pressure, and 20 ml of ether was added in an ice bath. After the ultrasonic irradiation, the supernatant was removed by leaving for a while. Then, 20 ml of ethyl acetate was added and left for a while after ultrasonic irradiation. Suction filtered and washed with ether. Then, it was made to dry under reduced pressure.
b) Result properties: Yellow solid Yield: 0.3181g
[0018]
4. HPLC purity check and purification
The purity check of TAP was performed under the following conditions.
Detection wavelength: 210nm Column: Inertsil ODS
Sample injection solvent: Ultrapure water Flow rate: 1 ml / min
Eluent A: 0.1% TFA aqueous solution Eluent B: 70% acetonitrile / 0.1% TFA solution gradient conditions [Table 1]

Identification was performed by TOF MASS. As a result of TOF MASS, a peak corresponding to the molecular weight of 2307.51 of the target compound was detected at 2309.03.
[0019]
Example 2
Tm measurement of TAP by CD
CD (Circular dichroism) spectrum is the structure of the compound in solution, such as A, B, and Z for DNA, and α-helix and β-sheet for proteins. Information on the structure of can be obtained. Therefore, the structure of the DNA in solution is greatly different depending on whether the structure is a single-stranded structure, a double-stranded structure or a 4-stranded structure. By measuring the CD spectrum, the structure of the DNA in the solution can be determined.
a) Method
Tm measurement by CD was performed under the following measurement conditions.
Measurement solution: 10 mM MES, 1 mM EDTA (pH 6.25), 50 mM KCl
[Telomeric DNA] = 2.2μM, DNA: dye = 1: 1
As the telomeric DNA, the following oligonucleotide having the human telomeric DNA sequence was used.
5'-CATGGTGGTTTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTACCAC-3 '
In the CD measurement, a known compound shown in FIG. 2 was used as a target compound together with the TAP of the present invention.
Add telomeric DNA to the above measurement solution to 2.2μM, add TAP or each compound 2.2μM at a time, and compare how the Tm curve (the stability of the four-stranded structure) changes. .
[0020]
b) The resulting Tm curve is shown in FIG. FIG. 3 shows a situation where the four-stranded structure formed by the telomeric DNA sequence is dissociated into a single-stranded structure in the presence of TAP or each known compound. In FIG. 3, the stability of the four-stranded structure is shown by the [θ] value of the CD spectrum. In FIG. 3, the temperature at which Normalized [θ] is exactly 0.5 is Tm (melting temperature). The higher the Tm value, the more stable the four-stranded structure.
As is apparent from FIG. 3, the highest Tm (melting temperature) was obtained when the TAP of the present invention was used, and the four-stranded structure formed by the telomeric DNA sequence was highly stabilized by the TAP of the present invention. You can see that
As shown in FIG. 1, the intercalator group in the TAP molecule of the present invention is inserted into the planar structure of the four-stranded structure formed by the telomeric DNA sequence, and the four-stranded structure is highly stabilized. Conceivable.
[0021]
【The invention's effect】
Peptides containing α-amino acid residues substituted with intercalator groups such as groups having an acridine skeleton, groups having an anthraquinone skeleton, and groups having an anthracene skeleton provided by the present invention are formed by guanidine sequences of telomeric DNA. It can bind strongly to the four-stranded structure to stabilize the four-stranded structure, and can be a potent telomerase inhibitor. Therefore, it can be used as an effective therapeutic agent for hyperproliferative diseases found in hyperproliferative cells with enhanced telomerase activity, such as cancer, psoriasis, and Marfan syndrome. It can also be used as a research reagent.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the chemical structural formula of TAP (tetrakis-acridinyl peptide), which is a typical peptide obtained in the present invention, as well as the four-stranded structure formed by the guanidine sequence of telomeric DNA. The mechanism that binds to and stabilizes the four-stranded structure is shown.
FIG. 2 shows a known telomerase inhibitory compound used as a target compound of the peptide of the present invention.
FIG. 3 shows a situation in which the four-stranded structure of telomeric DNA is changed to a single-stranded structure in the presence of TAP, which is a typical peptide obtained in the present invention, and a compound having a known telomerase inhibitory activity. It is a Tm curve shown.

Claims

A halogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted with a halogen atom, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an acyl group having 1 to 7 carbon atoms, an acyloxy group having 2 to 7 carbon atoms An acridine skeleton optionally having a substituent selected from the group consisting of an aminoalkyl group having 1 to 6 carbon atoms which may be substituted with one or two alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms A peptide comprising an intercalator group-substituted α-amino acid residue which is a group having the following formula I, the N-terminus of which is an acyl group having 1 to 7 carbon atoms or having 2 to 7 carbon atoms alkoxycarbonyl group derivative substituted with, the C-terminal is an alkyl group having from good carbon atoms 1 be substituted with a halogen atom 6, amino of 1 to 6 carbon atoms Substituted derivatives alkyl group or amino group, or a telomerase inhibitor containing as an active ingredient a salt thereof.

(Wherein X represents an intercalator group, Y represents a divalent group constituting an α-amino acid, Z represents a monovalent group constituting an α-amino acid, and n represents 0, 1, 2, Represents 3, 4 or 5)

Y represents -A-W- (A represents a linear or branched alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, and W represents a single bond, NH, CO, CONH, NHCO, O, S, or HNC (NH) NH. The telomerase inhibitor according to claim 1.

The telomerase inhibitor according to claim 1 or 2, wherein Z is -A-W-H (A and W are as defined in claim 2).

The telomerase inhibitor according to any one of claims 1 to 3, wherein the active ingredient is a peptide represented by the following formula II, a derivative thereof substituted at its N-terminus or C-terminus, or a salt thereof.