WO2009153972A1 - miRNAを有効成分とする低酸素障害の予防または保護剤 - Google Patents

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WO2009153972A1
WO2009153972A1 PCT/JP2009/002730 JP2009002730W WO2009153972A1 WO 2009153972 A1 WO2009153972 A1 WO 2009153972A1 JP 2009002730 W JP2009002730 W JP 2009002730W WO 2009153972 A1 WO2009153972 A1 WO 2009153972A1
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WO
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mirna
hif
mir130a
protein
expression
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PCT/JP2009/002730
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松下正之
齋藤憲
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三菱化学株式会社
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    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/10—Production naturally occurring

Definitions

  • the present invention relates to a hypoxic injury protective agent or a prophylactic or therapeutic agent for hypoxic injury comprising miRNA as an active ingredient.
  • Micro RNA (hereinafter referred to as microRNA or miRNA) is a small non-coding RNA of about 22 nucleotides that is not translated into protein, and is a member of small RNA. Following recent advances in small RNA research, we found that miRNAs act as important regulators of development and differentiation. Knowledge about the function of miRNA originated from research on the developmental regulation of lin-4 and let-7, miRNAs found in C. elegans. These lin-4 miRNA and let-7 miRNA were identified by genetic analysis of mutant nematodes defective in development timing. In nematodes, let-7letmiRNA begins to be expressed during late developmental stages. And let-7 miRNA acts as a post-transcriptional repressor of target genes such as lin-41.
  • let-7 miRNA binds to a sequence complementary to let-7 miRNA on the 3 'untranslated region of mRNA transcribed from the target gene, allowing subsequent mRNA to protein translation. Inhibit.
  • lin-4 miRNA and let-7RNAmiRNA play an important role in the regulation of early development by binding to target mRNA and suppressing translation.
  • bantamRNA which was investigated in Drosophila melanogaster. It is expressed in a tissue-specific manner during development, stimulates cell proliferation by suppressing transcription of hid mRNA, and suppresses apoptosis. It is known that there is.
  • mouse miRNAs including miR181, have been reported to regulate hematopoiesis.
  • miRNAs are generated from genes that are transcribed into single or clustered miRNA precursors. That is, first, pri-miRNA, which is a primary transcription product, is transcribed from a gene. Then, in stepwise processing from pri-miRNA to mature miRNA, about 70 bases of pre-miRNA having a characteristic hairpin structure are generated from pri-miRNA. Furthermore, mature miRNA is generated from pre-miRNA by Dicer-mediated processing (Non-patent Document 1).
  • miRNAs Except for a small number of miRNAs, little is known about the physiological and pathological roles of miRNAs. However, in the complex containing miRNA, there are proteins involved in neuromuscular degenerative diseases such as spinal muscular atrophy and fragile X syndrome. Regarding the relationship between cancer and miRNA, it has been reported that miR15 and miR16 miRNAs are frequently expressed in lymphocytic leukemia.
  • HIF hyperoxia-inducible factor
  • HIF is a major transcription factor of heterodimer and is activated under hypoxia. HIF not only mediates homeostatic responses such as erythropoiesis, angiogenesis and glycolysis to hypoxia in mammals, but also promotes major angiogenesis and growth.
  • HIF is composed of two subunits, HIF-1 ⁇ and HIF-1 ⁇ , and HIF1- ⁇ is also known as ARNT (Aryl-Receptor-Nuclear-Transclocator). These two subunits belong to the bHLH (basic elixhelix-loop-helix) and PAS (Per, ARNT, Sim) families.
  • Non-patent Document 2 Hydroxylated proline promotes the interaction between HIF and the VHL (von Hippel-Lindau) ubiquitin ligase complex, and after rapid ubiquitination, the proteasome destroys the HIF1 ⁇ protein.
  • HIF-1 ⁇ is not recognized by pVHL but accumulates in cells. Thereafter, HIF-1 ⁇ moves to the nucleus and forms a dimer with the HIF-1 ⁇ subunit that is constantly present (Non-patent Document 5). Subsequently, the dimer binds to hypoxia responsive element in the target gene, and erythropoietin, VEGF (Non-patent Document 6), platelet-derived growth factor ⁇ (PDGF- ⁇ ), glucose transporter (GLUT1) And genes such as nitrous oxide synthase (Non-patent Document 7) are transactivated.
  • VEGF erythropoietin
  • PDGF- ⁇ platelet-derived growth factor ⁇
  • GLUT1 glucose transporter
  • genes such as nitrous oxide synthase
  • HIF-1 ⁇ levels increase HIF-1 ⁇ levels and increase the mutation frequency of certain oncogenes and tumor suppressor genes, such as VHL, resulting in increased levels of HIF-1 ⁇ (non- Patent Document 8). It is an interesting question whether hydroxylation or an alternative mechanism is involved in this hypoxia-independent HIF activation, and miRNAs that regulate HIF-1 ⁇ protein expression were not known.
  • An object of the present invention is to provide a novel means for protecting a hypoxic disorder and preventing or treating the hypoxic disorder.
  • the transcription factor HIF-1 ⁇ plays an important role in maintaining oxygen homeostasis in vivo, and such HIF-1 ⁇ It was found that it is regulated by RNA such as miR130a, miR130b, miR301. Furthermore, by introducing into the cell a small nucleic acid molecule capable of regulating the expression and / or activity of the transcription factor HIF-1 ⁇ protein activated by hypoxia, for example, miR130a, miR130b, miR301 molecule, the transcription factor HIF-1 ⁇ It was found that the activation of VEGF promotes the expression of vascular endothelial growth factor VEGF and the like. The present invention has been completed based on these findings.
  • a hypoxic injury protective agent or a prophylactic or therapeutic agent for hypoxic injury containing miRNA having an action of enhancing expression of HIF-1 ⁇ protein as an active ingredient.
  • the miRNA is an RNA chain consisting of 15 to 40 bases including at least AGUGCAA among the base sequences set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 3, and having an action of enhancing expression of HIF-1 ⁇ protein (1 ) Or a prophylactic or therapeutic agent for hypoxic injury.
  • the miRNA has 90% or more homology with an RNA chain consisting of 15 to 40 bases including at least AGUGCAA among the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 3, and the HIF-1 ⁇ protein
  • the hypoxic injury protective agent or the prophylactic or therapeutic agent for hypoxic injury according to (1) or (2) which is an RNA strand having an expression enhancing action.
  • a method for protecting hypoxic cells from hypoxic injury comprising introducing miRNA having an action of enhancing expression of HIF-1 ⁇ protein into cells in vitro.
  • a method for increasing the production of angiogenic factor (VEGF) under hypoxic conditions which comprises introducing miRNA having an action of enhancing expression of HIF-1 ⁇ protein into cells in vitro.
  • VEGF angiogenic factor
  • a novel hypoxic injury protective agent or a prophylactic or therapeutic agent for hypoxic injury is provided.
  • FIG. 1 shows the sequence of each microRNA.
  • the underline indicates a region considered to be important for binding to mRNA.
  • FIG. 2 shows the results of examining whether the expression level of mature miR130a varies with hypoxia. It was confirmed that the expression level of mature miR130a was increased by hypoxia.
  • FIG. 3 shows the results of examining whether the expression level of mature miR130b varies with hypoxia. It was confirmed that the expression level of mature miR130b was increased by hypoxia.
  • FIG. 4 shows the results of examining the expression of HIF-1 ⁇ after transfection of each microRNA (10 nM) into HEK293 cells, culturing for 2 days, and further culturing at each oxygen concentration. It was confirmed that the expression of HIF-1 ⁇ increased.
  • FIG. 1 shows the sequence of each microRNA. The underline indicates a region considered to be important for binding to mRNA.
  • FIG. 2 shows the results of examining whether the expression level of mature miR130a varies with hypoxia. It was confirmed
  • FIG. 5 shows that each concentration of microRNA (Pre-miR130a or Pre-miR130b) shown in the figure was transfected into HEK293 cells, cultured for 2 days, and further cultured at 21% or 0.1% oxygen concentration for 8 hours. And the results of examining the expression of HIF-1 ⁇ . It was confirmed that the maximum amount of protein was expressed.
  • FIG. 7 shows the amount of HIF-1 ⁇ expressed by correcting the band of HIF-1 ⁇ under 0.1% oxygen concentration (density value) in FIG.
  • FIG. 8 shows the results of measuring HRE-Luc reporter activity. HRE-Luc reporter activity increased with exposure to hypoxia, but the increase was significantly increased by the introduction of Pre-miR130a and Pre-miR130b.
  • FIG. 9 shows the results of measuring pNFkB-Luc reporter activity. The pNFkB-Luc reporter activity was not changed by the introduction of Pre-miR130a and Pre-miR130b.
  • FIG. 10 shows the results of examining changes in the expression of VEGF by introducing Pre-miR130a and Pre-miR130b into cells at normal oxygen concentrations. The expression of VEGF was found to increase significantly.
  • FIG. 11 shows the results of examining changes in the expression of VEGF by introducing Pre-miR130a and Pre-miR130b into cells at an oxygen concentration of 0.1%. Even at 0.1% oxygen concentration, it was confirmed that VEGF expression was significantly increased by intracellular introduction of Pre-miR130a and Pre-miR130b in hypoxic exposure.
  • FIG. 12 shows the results of examining the proliferation of cells by introducing Pre-miR130a and Pre-miR130b into cells at low oxygen concentrations.
  • FIG. 13 shows the result of introducing miR130a and Pre-miR130b into cells and examining the amount of DDX6. It was confirmed that DDX6 decreased.
  • FIG. 14 shows the results of examining the binding between DDX6 protein and HIF-1 ⁇ mRNA or HIF-1 ⁇ mRNA. It was revealed that DDX6 protein binds to HIF-1 ⁇ mRNA but not to HIF-1 ⁇ mRNA.
  • FIG. 15 shows the result of knocking down endogenous DDX6 using siRNA (100 nM) against the DDX6 gene and detecting the expression of HIF-1 ⁇ under hypoxia by Western blotting.
  • FIG. 16 shows the structure of Pre-miR130a and Pre-miR130b.
  • FIG. 17 shows siRNA for Pre-miR130a and Pre-miR130b.
  • FIG. 18 shows the results of examining the increase and decrease of the protein of HIF-1 ⁇ by introducing siRNA for Pre-miR130a and Pre-miR130b into cells. It was confirmed that the introduction of si130a and si130b decreased only the HIF-1 ⁇ protein.
  • FIG. 16 shows the structure of Pre-miR130a and Pre-miR130b.
  • FIG. 17 shows siRNA for Pre-miR130a and Pre-miR130b.
  • FIG. 18 shows the results of examining the increase and decrease of the protein of HIF-1 ⁇ by introducing siRNA for Pre-miR130a and Pre-miR130b into cells. It was confirmed that the introduction of si130a and si130b decreased only the HIF-1 ⁇ protein.
  • FIG. 18 shows the results of examining the increase and decrease of
  • FIG. 19 shows the result of examining the distribution of miR130a in each tissue of mouse fetus (E18.5) by in-situ hybridization.
  • the tissue distribution of Pri-miR130a was investigated using Antisense probe (A) and Sense probe ( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ B) as a control.
  • Antisense Locked probe (C, E, G, I, K) and Antisense two miss match Locked probe (D, F, H, J, L) were used as controls.
  • the hypoxic injury protective agent or the prophylactic or therapeutic agent for hypoxic injury according to the present invention contains miRNA having an action of enhancing the expression of HIF-1 ⁇ protein as an active ingredient.
  • the miRNA used in the present invention is a miRNA that regulates the expression of HIF-1 ⁇ protein by targeting a nucleic acid encoding HIF-1 ⁇ (hypoxia-inducible factor 1 ⁇ ).
  • a method for protecting cells from hypoxic injury including in vitro introduction of miRNA having an action of enhancing expression of HIF-1 ⁇ protein, and production of angiogenic factor (VEGF) under hypoxic conditions A method for increasing the value is also included in the present invention.
  • such miRNA preferably has 15 to 40 bases including at least AGUGCAA in the base sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 3, and has an action of enhancing expression of HIF-1 ⁇ protein.
  • RNA strands are used.
  • the chain length of the miRNA is preferably 15 to 40 bases, more preferably 15 to 30 bases, and most preferably 20 to 25 bases.
  • it has 90% or more, more preferably 95% or more homology with an RNA chain consisting of 15 to 40 bases containing at least AGUGCAA.
  • an RNA chain having an action of enhancing the expression of HIF-1 ⁇ protein is also used.
  • RNA strand consisting of 15 to 40 bases including at least AGUGCAA among the base sequences set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, one to several (preferably one or two) bases
  • RNA strand that is deleted, substituted, and / or added and has an action of enhancing expression of HIF-1 ⁇ protein may be used.
  • RNA strands as miRNA used in the present invention are those described in SEQ ID NOs: 4 to 6, respectively, miR130a (SEQ ID NO: 4), miR130b (SEQ ID NO: 5), and miR301 (SEQ ID NO: 6).
  • the miRNA may be referred to as “miRNA of the present invention”.
  • the miRNA of the present invention can be synthesized using a method known per se. It can also be obtained by inserting a DNA encoding Pre-miRNA, which is a precursor of miRNA of the present invention, into an appropriate expression vector and transcribe it in an appropriate cell.
  • DNA encoding Pre-miRNA serves as a template for Pri-miRNA from which Pre-miRNA is derived. Since the RNA strand synthesis method by the above-described recombination method is a known method per se, it can be appropriately selected and used depending on the miRNA to be used.
  • Pri-miRNA and Pre-miRNA are generated, which can be modified by known methods to obtain miRNA.
  • a modification method for example, an in vitro Drosophila cell lysis system (described in US Patent Publication No. 2002/0086356) or an E. coli RNAseIII system (described in US Patent Publication No. 2004/0014113) is used. be able to.
  • the amount of the mature miR130a, miR130b and miR301 can be increased more than twice by lowering the cells from normal oxygen concentration to hypoxia concentration, for example, from 21% to 0.1% for 48 hours. Quantitative real-time PCR revealed. The same fact can be confirmed by examining the expression level by Northern blot. These findings suggest that mature miR130a, 130b and miR301 are miRNAs that increase with hypoxia.
  • Pre-miR130a and Pre-miR130b are modified to become final miR130a and 130b. That is, mature miRNA is generated from pre-miRNA by processing mediated by Dicer. Therefore, in the present invention, Pre-miR130a, ⁇ ⁇ Pre-miR130b, or Pre-miR301 consisting of the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 3 are used. It can be used as an active ingredient. That is, the miRNA referred to in the present invention may be a mature miRNA or one derived in vivo from Pre-miRNA.
  • the miRNA of the present invention includes those in which DNA encoding Pre-miRNA is transcribed and induced in a living body administered with the drug of the present invention. Furthermore, in order to enhance the stability of the miRNA of the present invention, for example, a nucleic acid derivative and / or a nucleic acid having a modified internucleoside bond is used. These nucleic acid derivatives can be appropriately selected from known ones.
  • Pre-miR130a When pre-miR130a, Pre-miR130b, and Pre-miR301 were introduced into cells and then exposed to hypoxia, the protein of HIF-1 ⁇ was increased. Furthermore, when the amount of Pre-miR130 was changed, for example, it was changed by about 1000 times from 0.1 nM to 100 nM, it was revealed that the amount of HIF-1 ⁇ expressed increases in a Pre-miRNA concentration-dependent manner. .
  • a pre-miR130a, Pre-miR130b and Pre-miR301 can activate the HRE reporter using a reporter having Hypoxia response element (HRE) as a promoter that activates transcription by HIF-1 ⁇ .
  • HRE Hypoxia response element
  • PHRE-Luc containing 6 copies of the hypoxia response element from the promoter of transferrin and pNFkB-Luc were used.
  • HRE-Luc reporter activity increased with exposure to hypoxia, but the increase was significantly increased by the introduction of Pre-miR130a, Pre-miR130b and Pre-miR301.
  • miR130a, Pre-miR130b and Pre-miR301 have the function of increasing the amount of HIF-1 ⁇ protein, binding to the hypoxia-responsive transcription region of the genome, and increasing downstream gene expression. found.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • miR130a As a result of examining in situ hybridization which miR130a is expressed, it was found that miR130a is highly expressed in the brain and kidney. It is expressed in the cerebral cortex in the brain, granule cells in the cerebellum, and cells around the tubules in the kidney. From the above results, it is considered that miR130a has a function of maintaining homeostasis against fluctuations in oxygen concentration in the brain and kidney.
  • miR130a, miR130b, and Pre-miR301 increased in hypoxia, and by introducing miR130a and miR130b molecules into HEK293 cells, increased expression of HIF-1 ⁇ was observed depending on the concentration of miR130a and miR130b .
  • the expression of VEGF, an angiogenic factor was significantly increased by miR130a, miR130b and Pre-miR301 in hypoxia. From these results, it was found that miR130a, miR130b and Pre-miR301 are molecules involved in the expression and function of HIF-1 ⁇ . Furthermore, since miR130a is localized in many brains and kidneys, it is considered that miR130a is involved in maintaining oxygen homeostasis in these organs.
  • MiRNAs of the present invention such as miR130a, miR130b and Pre-miR301 are expected as new hypoxic injury protective agents by regulating the translation of target genes at low concentrations and enabling hypoxic adaptation.
  • hypoxic disorder refers to an ischemic disease caused by hypoxia, specifically cerebral infarction, myocardial infarction, renal failure, heart failure, diabetic vascular disorder, obstructive arteriosclerosis colitis, ulcer Spinal cord disorder, optic neuropathy, photoreceptor cell disorder, neuropathy and the like.
  • the miRNA of the present invention which is an active ingredient in the hypoxic disorder protective agent or hypoxic disorder preventive or therapeutic agent of the present invention (hereinafter also referred to as the drug of the present invention), is miRNA, Pre-miRNA or Pri from which these are derived.
  • -It is administered to a subject in combination with a delivery reagent as DNA that serves as a template for miRNA inserted into an appropriate expression vector.
  • the administration method may be oral administration or parenteral administration (for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, mucosal administration, rectal administration, intravaginal administration, topical administration to the affected area, skin administration) Etc.).
  • the delivery reagent used in the drug of the present invention is not particularly limited as long as it can deliver the miRNA of the present invention or the RNA or DNA capable of inducing it to a site where hypoxia is occurring, and is a known reagent. Or it can select and use a method suitably. Specific examples include MirusMiTransit TKO lipophilic reagent, lipofectin, cellfectin, polycation, and liposome. In the case of liposomes, it preferably contains a ligand molecule that binds to a receptor that is specifically expressed in the delivery target cell.
  • a pharmaceutically acceptable additive can be blended as necessary.
  • pharmaceutically acceptable additives include antioxidants, preservatives, colorants, flavors, and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, buffers, delivery vehicles. , Diluents, carriers, excipients and / or pharmaceutical adjuvants and the like.
  • the preparation form of the drug of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include liquids, injections, sustained-release agents and the like.
  • the solvent used for formulating the drug of the present invention as the above-mentioned preparation may be either aqueous or non-aqueous.
  • Injections can be prepared by methods well known in the art. For example, after dissolving in an appropriate solvent (physiological saline, buffer solution such as PBS, sterilized water, etc.), sterilized by filtration with a filter, and then filled into a sterile container (eg, ampoule) Can be prepared.
  • This injection may contain a conventional pharmaceutical carrier, if necessary.
  • Administration methods using non-invasive catheters can also be used.
  • the carrier that can be used in the present invention include neutral buffered physiological saline or physiological saline mixed with serum albumin.
  • miRNA having an action of enhancing the expression of HIF-1 ⁇ protein which is an active ingredient of the drug of the present invention, can be administered in the form of a non-viral vector or a viral vector.
  • Such dosage forms are known in the art.
  • a method for introducing nucleic acid molecules using liposomes liposome method, HVJ-liposome method, cationic liposome method, lipofection method, lipofectamine method, etc.
  • microinjection method gene gun (Gene Gun )
  • Gene Gun Gene Gun
  • a method of transferring a nucleic acid molecule into a cell together with a carrier (metal particle) can be used.
  • the miRNA of the present invention when the miRNA of the present invention is transcribed and induced in vivo, a method in which DNA encoding each Pre-miRNA is inserted into an expression vector and administered is also used.
  • the expression vector include pCAGGS, pBJ-CMV, pcDNA3.1, pZeoSV (available from Invitrogen or Stratagene), and the like.
  • lipofection for example, lipofectamine 2000, oligofectamine (silencer siRNA TransfectionKit, GeneSilencer siRNA Transfection Reagent) and the like can be used.
  • the Pre-miRNA that is a precursor of the miRNA of the present invention is not particularly limited as long as the miRNA of the present invention can be induced. Specifically, the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 is used. The thing which consists of is mentioned.
  • the DNA encoding Pre-miRNA which is a precursor of miRNA of the present invention, is transcribed when inserted into a living cell after being inserted into an appropriate expression vector, and the Pre-miRNA is induced.
  • Any Pri-miRNA can be produced as long as it is produced.
  • 57165247 to 57165335 DNA serving as a template for RNA of SEQ ID NO: 1
  • 20337593 to 20337674 DNA serving as a template for RNA of SEQ ID NO: 2
  • chromosome number of chromosome number 11 of the human genome The DNA represented by 1186926506 to 86926591 (DNA serving as the template of RNA of SEQ ID NO: 3) is used.
  • DNA encoding Pre-mRNA is not limited to those having the above-described sequences, and miRNA of the present invention via Pri-mRNA or Pre-miRNA of miRNA of the present invention present in the living body. However, any structure may be used as long as it can finally induce the miRNA of the present invention.
  • a viral vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus
  • Expression enhancement of HIF-1 ⁇ protein in DNA viruses or RNA viruses such as detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, pox virus, poliovirus, Sindbis virus, Sendai virus, SV40
  • the miRNA of the present invention can be introduced into a cell or tissue by introducing the above-mentioned DNA encoding the pre-miRNA of miRNA having the above, and infecting the cell or tissue with this recombinant virus.
  • miRNA having an action of enhancing the expression of HIF-1 ⁇ protein can be directly injected into an organ or tissue of a living body. At this time, it is also preferable to administer the delivery reagent at the same time.
  • the dosage of the drug of the present invention can be determined by those skilled in the art in consideration of the purpose of use, the severity of the disease, the age, weight, sex, medical history, type of active ingredient, etc. of the patient.
  • the dose of miRNA having an action of enhancing the expression of HIF-1 ⁇ protein, which is an active ingredient is not particularly limited. For example, about 0.1 ng / kg to about 100 mg / kg, preferably about 1 ng / kg to about per adult 10 mg / kg.
  • the frequency of administration of the drug of the present invention can be, for example, once a day to once every several months (for example, once a week to once a month).
  • Example 1 We investigated whether the expression level of mature miR130a and miR130b fluctuated by hypoxia.
  • HEK293 cells were seeded at a concentration of 2 ⁇ 10 5 cells in a 100 mm dish. The next day, the medium was replaced with fresh DMEM medium and then placed in hypoxia for 48 hours. Cells were harvested after culturing in normoxic and hypoxic conditions.
  • RNA was extracted using Trizol (Invitrogen) according to the instructions in the instruction manual. 1 ⁇ g of total RNA was subjected to reverse transcription reaction at 42 ° C. for 15 minutes, 95 ° C. for 2 minutes and 4 ° C.
  • Hybridization was performed at 25 ° C. for 24 hours.
  • the membrane was washed 3 times at 55 ° C for 5 minutes with a 2X concentrated SSC solution containing 0.1% SDS, and reacted with an anti-DIG-AP antibody (ROCHE) diluted 1000 times with blocking solution at room temperature for 1 hour. .
  • ROCHE anti-DIG-AP antibody
  • the signal was detected using GDP-star and exposed to X-ray film for visualization.
  • the following probes were used for detection: miR130a LNA-B, ATGcCCtAAcATTgCAcTG (SEQ ID NO: 7), miR130a 2 mismatch LNA-B, ATGaCCtTTtAAcATTgCAaTG (SEQ ID NO: 8).
  • Example 2 We investigated the effect of Pre-miR130a and Pre-miR130b on HIF-1 ⁇ , the central transcription factor of hypoxic response. The day before the experiment, 4 ⁇ 10 5 HEK293 cells were seeded on a 35 mm plastic dish. Using DharmaFECT1 reagent to these cells, Negative control, Pre-miR130a and Pre-miR130b were introduced according to a conventional method, and two days later, the cells were exposed to 0.1% hypoxia.
  • SDS sample buffer 250 mM Tris / HCL, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% ⁇ -ME, 0.01% bromophenol blue
  • 200 ⁇ l was added, destroyed, collected and subjected to ultrasonic waves.
  • proteins were separated by 10% SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane.
  • Nitrocellulose membranes were soaked in TBST (50 mM Tris / HCL, pH 7.2, 140 mM NaCl, 0,05% Tween-20) with 5% (w / v) skim milk for 1 hour to block nonspecific binding sites.
  • HIF-1 ⁇ and HIF-1 ⁇ antibodies (NOVUS) (diluted 1000 times with TBST containing 1% milk) and actin antibody (SIGMA) (diluted 10000 times with TBST containing 1% milk) were soaked at 4 ° C. overnight. Thereafter, the nitrocellulose membrane was washed with TBST three times for 10 minutes. Blots were soaked in HRP-labeled goat anti-mouse secondary antibody (BIORAD) (1000-fold diluted with TBST containing 1% milk) for 1 hour and washed 3 times with TBST for 10 minutes. Detection was performed with ECL. As a result, as shown in FIG. 4, HIF-1 ⁇ protein was increased in cells into which Pre-miR130a, Pre-miR130b, and Pre-miR301 were introduced (FIG. 4).
  • Example 3 We examined the concentration-dependent changes of Pre-miR130a and Pre-miR130b to HIF1 ⁇ .
  • the experimental technique is the same as in Example 1. It was confirmed that the amount of HIF1 ⁇ protein increased in a concentration-dependent manner by introducing Pre-miR130a and Pre-miR130b into cells (FIG. 5). This change was quantified with Pre-miR130a (FIG. 6) and Pre-miR130b (FIG. 7), respectively, and ECL luminescence was measured with VERSADOC (BIORAD). As a result, it was confirmed that both Pre-miR130a and Pre-miR130b expressed the maximum amount of HIF1 ⁇ protein at the introduction concentration (10 nM).
  • Example 4 Since Pre-miR130a and Pre-miR130b were found to increase the protein mass of HIF1 ⁇ as shown in Example 3, a reporter having a promoter as a promoter of Hypoxia response element (HRE) that activates transcription by HIF1 ⁇ .
  • HRE Hypoxia response element
  • pHRE-Luc containing 6 copies of hypoxia response element from transferrin promoter and pNFkB-Luc were used as a firefly luciferase reporter plasmid.
  • 10 ⁇ M pre-miRNA130a and 130b were introduced into the cells using Dharma FECT1 introduction reagent (Dharma).
  • Dharma FECT1 introduction reagent Dharma
  • 48 hours after introduction of Pre-miRNAs cells were exposed to 0.1% oxygen or treated with 20 ng / ml TNF- ⁇ for 12 hours.
  • Cell extract was prepared with Passive Lysis Buffer (Promega), and luciferase assay was performed with Dual-Luciferase assy kit (Promega) according to the instructions for use.
  • the numerical values of HRE luciferase and NFkB luciferase were assigned by the numerical value of Renilla luciferase to correct the variation due to the introduction efficiency.
  • HRE-Luc reporter activity increased with exposure to hypoxia, but the increase was found to increase significantly with the introduction of Pre-miR130a and Pre-miR130b (FIG. 8). However, pNFkB-Luc reporter activity was not changed by the introduction of Pre-miR130a and Pre-miR130b (FIG. 9). Based on the above results, miR130a and Pre-miR130b have the function of increasing the amount of HIF1 ⁇ protein, binding to the hypoxia-responsive transcription region of the genome, and increasing downstream gene expression.
  • Example 5 In order to examine whether endogenous genes are actually increased by hypoxia-responsive transcription, we investigated changes in the expression of VEGF, which has an angiogenic effect due to increased expression in hypoxia.
  • the method for recovering RNA is the same as in Example 2.
  • PCR was pre-denatured at 95 ° C. for 2 minutes, followed by 50-60 cycles of denaturation at 95 ° C. for 10 seconds, annealing at 55 ° C. for 20 seconds, and extension at 72 ° C. for 30 seconds.
  • a standard curve was calculated using ⁇ -actin mRNA, and the amount of VEGF mRNA was normalized using ⁇ -actin mRNA as an internal standard.
  • VEGF forward primer 5'-ACCATGGATGATGATATCGCC-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • reverse primer 5'-GCCTTGCACATGCCGG-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • VEGF forward primer 5'-CCCTGATGAGATCGAGTACAT-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • VEGF reverse primer 5'-CGGCTTGTCACATCTGCAAGT-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • Example 6 We investigated whether introduction of Pre-miR130a and Pre-miR130b into cells could protect cells from hypoxic cell damage and growth inhibition. The day before the experiment, HEK293 cells were seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / hole in a 24-well plate (Iwaki). The next day, miRNA or siRNA was introduced into the cells and cultured at 37 ° C. for 48 hours.
  • Example 7 Target genes of Pre-miR130a and Pre-miR130b were searched from databases such as TARGET SCAN and miRanda, and DDX6 was examined as the candidate gene.
  • the DDX6 protein has been found to be a protein that constitutes the P body that controls mRNA storage and degradation. For this reason, it was considered as the first candidate because of post-transcriptional regulation of HIF-1 ⁇ mRNA. The day before the experiment, 4 ⁇ 10 5 HEK293 cells were seeded in a 35 mm dish.
  • SDS sample buffer 250 mM Tris / HCL, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% ⁇ -ME, 0.01% bromophenol blue
  • the cells were disrupted by adding 200 ⁇ l, subjected to sonication and boiling for 2 minutes, separated by 8% SDS-PAGE, and transferred to a nitrocellulose membrane. Nitrocellulose membrane is soaked in TBST solution (50 mM Tris / HCL, pH7.2, 140 mM NaCl, 0,05% Tween-20) with 5% (w / v) skim milk for 1 hour to block nonspecific binding sites.
  • TBST solution 50 mM Tris / HCL, pH7.2, 140 mM NaCl, 0,05% Tween-20
  • nitrocellulose membrane was washed with TBST solution three times for 10 minutes.
  • the blots were soaked in HRP-labeled goat anti-mouse secondary antibody (BIORAD) (diluted 1000 times with TBST containing 5% milk) for 1 hour and washed 3 times with TBST solution for 10 minutes.
  • the signal was detected as chemiluminescence with Immun-Star HRP reagent (BIORAD) and visualized with VarsaDoc (BIORAD).
  • BIORAD Immun-Star HRP reagent
  • VarsaDoc VarsaDoc
  • HEK293 cells were seeded in a 100 mm dish. The cells are washed once with 5 ml of PBS on the next day, followed by Lysis buffer (10 mM HEPES pH 7.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCl, 0.5% NP-40, 1 mM DTT, 100 units / ml RNaseOUT (Invitrogen), Protease inhibitor cocktail (Roch) ) was added and crushed, 3 ⁇ g of anti-DDX6 antibody (BETHYL) was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. overnight.
  • Lysis buffer (10 mM HEPES pH 7.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCl, 0.5% NP-40, 1 mM DTT, 100 units / ml RNaseOUT (Invitrogen), Protease inhibitor cocktail (Roch)
  • Lysis buffer 10 mM HEPES pH 7.0, 100 mM KCl, 5 mM Mg
  • RNA was quantified by light absorption at 260 nm, and cDNA was synthesized using PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa) using 1 ⁇ g of total RNA.
  • PCR was performed using ExTaq DNA polymerase (TaKaRa) and HIF-1 ⁇ primer or HIF-1 ⁇ primer using 1 ⁇ l of cDNA as a template for a total volume of 25 ⁇ l. The primers used in PCR are shown below.
  • HIF-1 ⁇ forward primer 5'-CTTGCTCATCAGTTGCCACTT-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • HIF-1 ⁇ reverse primer 5'-GCCATTTCTGTGTGTAAGCAT-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • HIF-1 ⁇ forward primer 5'-ATTCAAGGTGGAGGAGCCATTGTC-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • HIF-1 ⁇ reverse primer 5'-ATAGGAGCCATCAGTGGATGTGTT-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • DDX6 protein binds to HIF-1 ⁇ mRNA, but not to HIF-1 ⁇ mRNA (FIG. 14). From the above results, it is considered that miR130a and miR130b act on DDX6 and decrease the protein level of DDX6, thereby promoting the release of HIF-1 ⁇ from the P-body and enhancing the translation activity.
  • DDX6 In order to prove that DDX6 is directly involved in the translational control of HIF-1 ⁇ , the DDX6 gene was knocked down with siRNA and the protein level of HIF-1 ⁇ was examined by Western blot.
  • the day before the experiment 4 ⁇ 10 5 HEK293 cells were seeded in a 35 mm dish.
  • DDX6 siRNA purchased from QIAGEN was introduced into HEK293 cells using DharmaFECT1 reagent (Dharmacon) to a final concentration of 100 nM. The introduction method was performed according to the DharmaFECT1 reagent instruction manual. Cells were exposed to hypoxia 48 hours after introduction of DDX6 siRNA.
  • siRNA against these microRNAs was designed for each loop region (FIG. 16) (FIG. 17). By introducing this siRNA into cells, the increase or decrease of HIF-1 ⁇ protein was verified. The same method is used for introduction of siRNA and detection by Western blot.
  • Example 9 We investigated in which organ miR130a was expressed by in situ hybridization.
  • DIG-labeled immobilized nucleic acid was prepared as an antisense probe for aged miR130a (22n.t.).
  • Paraffin-embedded blocks for in situ hybridization and mouse embryo (E18.5) sections were obtained from Genostaff. Hybridization was performed by preparing a DIG-labeled immobilized miR130a probe with Probe Diluent to a concentration of 100 ng / ml.
  • the sections were reacted with AP-labeled DIG antibody (ROCHE) for 2 hours.
  • the color reaction was performed overnight with NBT / BCIP. Sections were counterstained with Kernechtrot, dehydrated, and sampled with malinol.
  • ROCHE AP-labeled DIG antibody
  • miR130a is highly expressed in the brain and kidney (FIG. 19). It is expressed in the cerebral cortex (C-a, b) in the brain, granule cells (Da, b) in the small, and cells around the tubule in the kidney (Ea). Based on the above results, miR 130a is thought to have a function of maintaining homeostasis against oxygen concentration fluctuations in the brain and kidney.

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Abstract

　本発明の課題は、低酸素障害の保護、並びに低酸素障害の予防または治療のための新規な手段を提供することである。本発明によれば、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAを有効成分として含有する、低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤が提供される。

Description

miRNAを有効成分とする低酸素障害の予防または保護剤
　本発明はmiRNAを有効成分とする、低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤に関する。
　マイクロRNA（以下、microRNAあるいはmiRNAという）は、蛋白質に翻訳されない約22ヌクレオチドの小さなnon-coding RNAであり、small RNAの一員である。small RNA研究の最近の進歩に従い、miRNAが発生と分化に重要な調節因子として作用していることが分かった。miRNAの機能に関する知見は線虫（シーエレガンス：C.elegans）で発見されたmiRNAであるlin-4とlet-7の発生調節に関する研究から始まった。これらlin-4 miRNA及びlet-7 miRNAは、発生タイミングに欠陥がある突然変異体線虫の遺伝的分析により 同定された。線虫において、let-7 miRNAは後期発生段階の間に発現し始める。そして、let-7 miRNAは、lin-41などの標的遺伝子の転写後リプレッサーとして作用する。具体的には、標的遺伝子から転写されるmRNAの3’非翻訳領域上にあるlet-7 miRNAに相補的な配列にlet-7 miRNAが結合することで、その後のmRNAからタンパク質への翻訳を阻害する。すなわちlin-4 miRNAとlet-7 miRNAは標的mRNAに結合して翻訳を抑制することにより初期の発生時期の調節に重要な役目をする。更に、他の例としてはキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）で究明されたbantamRNAで、発生過程で一時的に組織特異的に発現し、hid mRNAの転写抑制により細胞増殖を刺激し、アポトーシスを抑制する作用があることが知られている。最近、miR181を含むいくつかのマウスmiRNAは血液生成(hematopoiesis)を調節するものと報告された。
　miRNAはヒトを含む生物に多数存在することが確認されており、系統的に十分に保存されている。これまで、ヒトを含む様々な生物に置いて約600種類のmiRNAが発見されている。miRNAは単一又はクラスター化されたmiRNA前駆体に転写される遺伝子から生成される。すなわち、先ず、遺伝子から一次転写産物であるpri-miRNAが転写される。次いで、 pri-miRNAから成熟型miRNAへの段階的なプロセシングにおいて、pri-miRNAから特徴的なヘアピン構造を有する約70塩基のpre-miRNAが生成される。さらにDicer介在のプロセシングによりpre-miRNAから成熟型miRNAが生成される（非特許文献１）。
　少数のmiRNAを除いては、miRNA の生理学的および病理学的役割はほとんど知られていない。しかしながら、miRNAを含む複合体に置いては、脊髄性筋萎縮症や脆弱X症候群などの神経筋変性疾患に関与する蛋白質が存在する。また、癌とmiRNAの関連については、リンパ性白血病において、miRNAであるmiR15およびmiR16が頻繁に発現が低下していることが報告されている。
　HIF(低酸素誘導性因子)はヘテロ二量体の主要転写因子であり、低酸素下で活性化する。HIFは、ほ乳類において低酸素状態に対する赤血球新生、血管新生および解糖などの恒常性反応を媒介するだけでなく、主要の血管新生および成長をも促進する。HIFは二つのサブユニット、HIF-1αおよびHIF-1βから構成されており、HIF1-βはARNT（Aryl Receptor Nuclear Transclocator）としても知られている。この二つのサブユニットはbHLH(basic helix-loop-helix)およびPAS(Per, ARNT, Sim)ファミリーに属している。これらの因子のbHLHドメインの2つのへリックスは二量体形成に、ベーシック領域はDNA結合に関与する。HIF-1αおよびHIF-2α内のこれら2つのドメインは、低酸素シグナル経路に応答する。前者は酸素依存性分解ドメインで、正常酸素圧下で酸素依存性プロリル水酸化酵素による翻訳後修飾を受ける(非特許文献２)。水酸化したプロリンは、HIFとVHL(von Hippel-Lindau)ユビキチンリガーゼ複合体との相互作用を促進し、素早いユビキチン化の後、プロテアソームによりHIF１αタンパク質が破壊される。HIF1αのCOOH末端トランス活性化ドメインのアスパラギンの水酸化は、p300/CBPコアクチベーターとの相互作用が抑制し、正常酸素圧下でHIF-1転写活性を抑制することが示されている(非特許文献３)。このように、アスパラギン水酸化酵素はプロリル水酸化酵素とともに、細胞内の酸素レベルで調節される低酸素スイッチとして作用する。最近の研究で、水酸化と同様に、ユビキチン化およびリン酸化、アセチル化がHIF-1の安定性の調節に重要な役割を持っていることが示された(非特許文献４)。低酸素状態では、活性化に酸素分子を要する水酸化酵素が非活性になり、HIF-1αは水酸化されず、従って、HIF-1αはpVHLに認識されず細胞内に蓄積する。その後、HIF-1αは核に移動し、恒常的に存在するHIF-1βサブユニットと二量体を形成する(非特許文献５)。その後、二量体は標的遺伝子内の低酸素応答要素(hypoxia responsive element)と結合し、エリスロポエチン、VEGF(非特許文献６)、血小板由来成長因β(PDGF-β)、グルコース輸送体(GLUT1)および亜酸化窒素合成酵素(非特許文献７)のような遺伝子がトランス活性化する。特定のホルモンおよび成長因子もまた、HIF-1α濃度を増加させ、そして、特定の発癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子、例えばVHLの突然変異頻度も上昇させるので、結果としてHIF-1αレベルが増加する(非特許文献８)。水酸化またはそれに代わる機構が、この低酸素非依存性HIF活性化に関与しているかどうかは興味深い問題であり、HIF-1αタンパク質の発現を制御するmiRNAは知られていなかった。
Hutvagner G, McLachlan J, Pasquinelli AE, Balint E, Tuschl T, Zmore PD, Science, 293：834-8, 2001 Jaakkola et al.,Science, 292:468-472, 2001 Lando et al.,Science, 295:858-861, 2002 Jeong et al.,Cell,111:709-720, 2002 Semenza, Genes & Development,14:1983-1991,1985 Forsythe et al., Mol. Cell. Biol., 16:4604-4613, 1996 Neckers, J. Natl. Cancer Ins.,91:106-107, 1999 Ivan and Kaelin, Current Opinion in Genetics & Development, 11:27-34, 2001
　本発明は、低酸素障害の保護、並びに低酸素障害の予防または治療のための新規な手段を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、転写因子HIF-1αは、生体内における酸素恒常性の維持に重要な役割を果たしており、このようなHIF-1αが、マイクロRNA、例えばmiR130a、miR130b、miR301によって制御されることを見出した。さらに、低酸素で活性化される転写因子HIF-1αタンパク質の発現および/または活性を調節可能な小核酸分子、例えばmiR130a、miR130b、miR301分子を細胞内に導入することにより、転写因子HIF-1αの活性化が促進し、血管内皮細胞増殖因子VEGFなどの発現が促進することを見いだした。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
　すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAを有効成分として含有する、低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
（２）　miRNAが、配列番号１～３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５～４０塩基からなり、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖である、（１）に記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
（３）　miRNAが、配列番号１～３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５～４０塩基からなるRNA鎖と９０％以上の相同性を有し、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖である、（１）又は（２）に記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
（４）　miRNAが、配列番号４～６の何れかに記載の塩基配列からなるRNA鎖である、（１）から（３）の何れかに記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
（５）　miRNAが、配列番号１～３の何れかに記載の塩基配列からなるPre-miRNAから誘導されたものである、（１）から（４）の何れかに記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
（６）　miRNAが、配列番号１～３の何れかに記載の塩基配列からなるPre-miRNAをコードするDNAから転写され誘導されたものである、（１）から（５）の何れかに記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
（７）　HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAをインビトロで細胞内に導入することを含む、低酸素状態の細胞を低酸素障害から保護する方法。
（８）　HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAをインビトロで細胞内に導入することを含む、低酸素条件下での血管新生因子（VEGF）の産生を増大させる方法。
（９）　HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAを患者に投与することを含む、低酸素障害を保護する方法、又は低酸素障害を予防若しくは治療する方法。
（１０）　低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤の製造のための、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAの使用。
　本発明によれば、新規な低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤が提供される。
図１は、各micro RNAの配列を示す。アンダーラインはｍRNAへの結合に重要と考えられる領域を示す。 図２は、成熟型のmiR130aの発現量が低酸素によって変動するかを調べた結果を示す。成熟型のmiR130aの発現量が低酸素によって増加することが確認された。 図３は、成熟型のmiR130bの発現量が低酸素によって変動するかを調べた結果を示す。成熟型のmiR130bの発現量が低酸素によって増加することが確認された。 図４は、各マイクロRNA ( 10 nM )をHEK２９３細胞にトランスフェクションし２日間培養後、 各酸素濃度でさらに８時間培養し、HIF-1αの発現を調べた結果を示す。HIF-1αの発現は増加することが確認された。 図５は、図に示す各濃度のマイクロRNA ( Pre-miR130a またはPre-miR130b )をHEK２９３細胞にトランスフェクションし２日間培養後、21%または0.1％酸素濃度でさらに８時間培養し、HIF-1αとHIF-1βの発現を調べた結果を示す。蛋白量を最大に発現することが確認された。 図６は、図２Ａにおける0.1%酸素濃度下のHIF-1αのバンド( density値 )をActinのバンドで補正した値をHIF-1αの発現量とし、Mock（トランスフェクションなし）のHIF-1αの発現量に対するPre-miR130a量ごとのHIF-1αの発現量の割合を算出した結果を示す( N=3, Error bar : S.E. )。 図７は、図２Ａにおける0.1%酸素濃度下のHIF-1αのバンド( density値 )をActinのバンドで補正した値をHIF-1αの発現量とし、Mock（トランスフェクションなし）のHIF-1αの発現量に対するPre-miR130b量ごとのHIF-1αの発現量の割合を算出した結果を示す( N=3, Error bar : S.E. )。 図８は、HRE-Lucレポーター活性を測定した結果を示す。HRE-Lucレポーター活性は低酸素暴露で上昇するが、その上昇がPre-miR130a, Pre-miR130bの導入により有意に上昇することが明らかとなった。 図９は、pNFkB-Lucレポーター活性を測定した結果を示す。pNFkB-Lucレポーター活性は、Pre-miR130a, Pre-miR130bの導入により変化がなかった。 図１０は、正常酸素濃度においてPre-miR130a, Pre-miR130bを細胞内に導入することによるVEGF の発現の変化を調べた結果を示す。VEGF の発現は、有意に増加することが明らかとなった。 図１１は、0.1％の酸素濃度においてPre-miR130a, Pre-miR130bを細胞内に導入することによるVEGF の発現の変化を調べた結果を示す。0.1％の酸素濃度においても低酸素暴露ではPre-miR130a, Pre-miR130bの細胞内導入により、有意にVEGF発現を増加させることが確認された。 図１２は、低酸素濃度においてPre-miR130a, Pre-miR130bを細胞内に導入し、細胞の増殖を調べた結果を示す。細胞の増殖は濃度依存的に増加することが明らかとなった。 図１３は、miR130a, Pre-miR130bを細胞内に導入し、DDX6量を調べた結果を示す。DDX6は減少することが確認された。 図１４は、DDX6 蛋白質とHIF-1αmRNA又はHIF-1βmRNAとの結合を調べた結果を示す。DDX6 蛋白質はHIF-1αのmRNAに結合するが、HIF-1βのmRNAには結合しないことが明らかとなった。 図１５は、DDX6遺伝子に対するsiRNA(100nM)を用いて、内在性DDX6をノックダウンし、低酸素下におけるHIF-1αの発現をウエスタンブロットにより検出した結果を示す。Negative control siRNAを導入したものに比べDDX6 siRNAを導入したものは、HIF-1αの蛋白質レベルが増加した。 図１６は、Pre-miR130a, Pre-miR130bの構造を示す。 図１７は、Pre-miR130a, Pre-miR130bに対するsiRNAを示す。 図１８は、Pre-miR130a, Pre-miR130bに対するsiRNAを細胞内に導入し、HIF-1αの蛋白質の増減を調べた結果を示す。si130a, si130bの導入により、HIF-1αの蛋白質のみ減少することが確認された。 図１９は、マウス胎児（E18.5） の各組織におけるmiR130aの分布をin situ hybridizationにより調べた結果を示す。Pri-miR130aの組織分布については、Antisense probe ( A )とコントロールとしてSense probe ( B )を用いてしらべた。Mature miR130a については、Antisense Locked probe(C, E, G, I, K),とコントロールとしてAntisense two miss match Locked probe(D, F, H, J, L)を用いた。大脳皮質(C,D)、小脳(E,F)、神経節(G-J)、腎臓(K,L)
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明による低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤は、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAを有効成分として含有する。本発明で用いるmiRNAは、HIF-1α（低酸素誘導性因子1α）をコードする核酸を標的として、HIF-1αタンパク質の発現を調節するmiRNAである。また、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAをインビトロで細胞内に導入することを含む、低酸素障害から細胞を保護する方法、並びに低酸素条件下での血管新生因子（VEGF）の産生を増大させる方法も本発明に含まれる。
　本発明において、このようなmiRNAとしては、好ましくは、配列番号１から３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５～４０塩基からなりHIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖が用いられる。上記miRNAの鎖長は、好ましくは１５～４０塩基、さらに好ましくは１５～３０塩基、最も好ましくは２０～２５塩基である。さらには、上記配列番号１～３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５～４０塩基からなるRNA鎖と、９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有し、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖も用いられる。あるいは、上記配列番号１～３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５～４０塩基からなるRNA鎖において、１個から数個（好ましくは１個又は２個）の塩基が欠失、置換、及び／又は付加されていて、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖を用いてもよい。
　本発明で用いられるmiRNAとして最も好ましいRNA鎖は配列番号４～６に記載されたものであり、それぞれmiR130a（配列番号４）、miR130b（配列番号５）、及びmiR301（配列番号６）である。
　以下、上記miRNAを「本発明のmiRNA」と称することがある。
　本発明のmiRNAは、それ自体公知の方法を用いて合成することができる。また、本発明のmiRNAの前駆体であるPre-miRNAをコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な細胞で転写させて得ることもできる。本明細書において、Pre-miRNAをコードするDNAとは、Pre-miRNAが誘導されるPri-miRNAの鋳型となるものである。上記の組み換え法によるRNA鎖の合成方法はそれ自体公知の方法であるので、用いるmiRNAに応じて適宜選択して用いることができる。また、上記の組み換え法では、Pri-miRNA及びPre-miRNAが生成するので、これを公知の方法で修飾してmiRNAとすることができる。このような修飾方法として、例えば、インビトロショウジョウバエ細胞溶解システム（米国特許公開番号2002/0086356号公開公報に記載）や、大腸菌RNAseIIIシステム（米国特許公開番号2004/0014113号公開公報に記載）などを用いることができる。
　本発明では、細胞を通常の酸素濃度から低酸素状態濃度、例えば21％から0.1％に下げて48時間置くことで、上記　成熟型miR130aとmiR130b及びmiR301の量は2倍以上に増加することが定量的リアルタイムPCRにより明らかになった。同様の事実はノーザンブロットによる発現量の検討に依っても確認できる。これらの所見は、成熟型miR130a, 130b及びmiR301が低酸素により増加するmiRNAであることを示唆する。
　マイクロRNAはmRNAより２段階の切断を受けて成熟型になり機能を発揮する。図１に示すように、Pre-miR130a, Pre-miR130bが修飾を受けて、最終的なmiR130a, 130bになる。即ち、Dicerが介在するプロセシングによりpre-miRNAから成熟型miRNAが生成されるので、本発明では、配列番号１から３に記載の塩基配列からなるPre-miR130a, Pre-miR130b、又はPre-miR301を有効成分として用いることができる。即ち、本発明で言うmiRNAとは、成熟型miRNAでもよいし、Pre-miRNAから生体内で誘導されたものでもよい。さらに、本発明のmiRNAは、Pre-miRNAをコードするDNAが、本発明の薬物を投与された生体内で転写され、誘導されたものも含む。さらに、本発明のmiRNAは、その安定性を高めるために例えば、核酸誘導体及び／または改変型ヌクレオシド間結合を有する核酸が用いられる。これらの核酸誘導体は、公知のものを適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、ホスホネートホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ポスホラミデートメトキシエチルホスホラミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン－スルフィド、ジメチレン－スルホキシド、ジメチレン－スルホン、２‘－Ｏ－アルキル、および２’－デオキシ－２’－フルオロホスホロチオエートのヌクレオシド間結合を含む核酸等が挙げられる（Uhlmannら、1990、Chem.Rev.90:543-584、Schneiderら、1990、Tetrahedron  Lett.31:335）。さらには、Locked Nucleic Acid等の誘導体も挙げられる。
　細胞にPre-miR130a、Pre-miR130b及びPre-miR301を導入し、その後、低酸素状態に暴露するとHIF-1αの蛋白質が増加していた。さらにPre-miR130の量を変化させて、例えば0.1nMから100nMまで1000倍程度変化させて、導入すると発現するHIF-1αの蛋白量がPre-miRNA濃度依存的に増加することが明らかとなった。
　さらに本発明では、HIF-1αが転写を活性化させるHypoxia response element (HRE)をプロモーターとして持つレポーターを使い、Pre-miR130a, Pre-miR130b及びPre-miR301がHREレポーターを活性化することができるかどうかを検討した。トランスフェリンのプロモーターからの低酸素症応答要素の6コピーを含むpHRE-Lucと、pNFkB-Luc（BD Clonetech）を使った。HRE-Lucレポーター活性は低酸素暴露で上昇するが、その上昇がPre-miR130a, Pre-miR130b及びPre-miR301の導入により有意に上昇することが明らかとなった。しかしながら、pNFkB-Lucレポーター活性は、Pre-miR130a, Pre-miR130b及びPre-miR301の導入により変化がなかった。以上の結果より、miR130a, Pre-miR130b及びPre-miR301はHIF-1αのタンパク量を増加させ、ゲノムの低酸素応答性の転写領域に結合し、下流の遺伝子発現を増加させる機能があることが判明した。
　低酸素応答性の転写によって内在性の遺伝子が実際に上昇するかを検討するために、低酸素で発現が上昇し血管新生作用のある血管内皮細胞増殖因子VEGFの発現変化を調べた。その結果、正常酸素濃度においてもmiR130a, Pre-miR130b及びPre-miR301を細胞内に導入することにより、VEGF の発現が有意に増加することが判明した。また、0.1％の酸素濃度でも低酸素暴露ではPre-miR130a, Pre-miR130b及びPre-miR301の細胞内導入により、有意にVEGF発現を増加させることが確認された。
　miR130aがどの臓器に発現しているかをインサイチューハイブリダイゼイションで検討した結果、miR130aは脳と腎臓に高発現していることが判明した。脳では、大脳皮質、小脳では顆粒細胞、腎臓では尿細管周辺の細胞に発現している。以上の結果より、miR130aに関しては、脳と腎臓で酸素濃度変動に対する恒常性維持の機能があると考えられる。
　miR130a, miR130b及びPre-miR301の転写は、低酸素状態において増加し、miR130aとmiR130b分子をHEK293細胞に導入することで、HIF-1αの発現亢進が、miR130aとmiR130bの濃度依存的に認められた。また、血管新生因子であるVEGFの発現は、低酸素において、miR130aとmiR130b及びPre-miR301によって有意に増加することが明らかになった。これらのことからmiR130aとmiR130b及びPre-miR301は、HIF-1αの発現・機能に関わる分子であることがわかった。さらにmiR130aは、脳や腎臓に多く局在することから、これらの臓器での酸素恒常性の維持にmiR130aが関与すると考えられる。
　miR130aとmiR130b及びPre-miR301などの本発明のmiRNAは、低濃度で標的遺伝子の翻訳を調節し、低酸素適応を可能にすることより、新たな低酸素障害保護剤として期待される。 本発明において、低酸素障害とは、低酸素に起因する虚血性疾患をいい、具体的には脳梗塞、心筋梗塞、腎不全、心不全、糖尿病性血管障害、閉塞性動脈硬化症大腸炎、潰瘍、脊髄障害、視神経障害、視細胞障害、神経障害などである。
　本発明の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤（以下、本発明の薬剤とも言う）における有効成分である本発明のmiRNAは、miRNA、Pre-miRNAあるいはこれらが誘導されるPri-miRNAの鋳型となるDNAを適当な発現ベクターに挿入したものとして、送達試薬と組み合わせて対象に投与される。投与方法は、経口投与でもよいし、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）でもよい。
　本発明の薬剤で用いられる送達試薬としては、低酸素障害が起きている箇所へ本発明のmiRNAあるいはそれを誘導し得るRNAやDNAを送達し得るものであれば特に制限はなく、公知の試薬あるいは方法を適宜選択して用いることができる。具体的には、たとえば、Mirus Transit TKO親油性試薬、リポフェクチン、セルフェクチン、ポリカチオン、リポソームなどが挙げられる。リポソームの場合には、送達対象細胞で特異的に発現している受容体に結合するリガンド分子を含むことが好ましい。
　本発明の薬剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。　薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤、徐放剤などが挙げられる。本発明の薬剤を上記製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のいずれでもよい。
　注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。本発明で用いることができるキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水などが挙げられる。
　さらに、本発明の薬剤の有効成分であるHIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。このような投与形態は、当該分野において公知である。
　非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ-リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Gene Gun）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。
　また、本発明のmiRNAを生体内で転写、誘導させる場合には、各Pre-miRNAをコードするDNAを発現ベクターに挿入して投与する方法も用いられる。ここで、発現ベクターとしては、例えば、pCAGGS、pBJ-CMV、pcDNA3.1、pZeoSV（Invitrogen社又はStratagene社から入手可能）などが挙げられる。リポフェクションを用いる場合、例えば、リポフェクトアミン2000、オリゴフェクトアミン（silencer siRNA TransfectionKit,GeneSilencer siRNA Transfection Reagent）などを用いることができる。本発明のmiRNAの前駆体であるPre-miRNAは、本発明のmiRNAが誘導され得るものであれば特に制限はないが、具体的には、配列番号１から３の何れかに記載の塩基配列からなるものが挙げられる。
　また、本発明のmiRNAの前駆体であるPre-miRNAをコードするDNAは、これを適当な発現ベクターに挿入して生体細胞内へ入れた場合に、転写が起こり、該Pre-miRNAが誘導されるPri-miRNAが産出されるものであれば何れのものでもよい。具体的には、ヒトゲノムの染色体番号11の57165247から57165335（配列番号１のRNAの鋳型となるDNA）、染色体番号22の20337593から20337674（配列番号２のRNAの鋳型となるDNA）、あるいは染色体番号11の86926506から86926591（配列番号３のRNAの鋳型となるDNA）で示されるDNAが用いられる。また、Pre-mRNAをコードするDNAは、上記配列を有するものに限定されるものではなく、生体内に存在する本発明のmiRNAのPri-mRNAやPre-miRNAを経由して、本発明のmiRNAが誘導されるものにも限定されず、最終的に本発明のmiRNAが誘導され得る構造であれば何れのものでもよい。
　HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、SV40などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAのPre-miRNAをコードする上記ＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に本発明のmiRNAを導入することができる。また、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAは、生体の器官や組織などに直接注入することもできる。この際、上記送達試薬を同時に投与することも好ましい。
　本発明の薬剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、又は有効成分の種類などを考慮して、当業者が決定することができる。有効成分であるHIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAの投与量は特に限定されないが、例えば、成人一人当たり、約０．１ｎｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｎｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇである。
　また本発明の薬剤の投与頻度としては、例えば、一日一回～数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回～１ヶ月に１回）の頻度で投与することができる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその内容が限定されるものではない。
（実施例１）
　成熟型のmiR130a, miR130bの発現量が低酸素によって変動するかを検討した。HEK293細胞は100mmディッシュに2×105細胞になるような濃度で蒔き込んだ。翌日に培地を新鮮なDMEM培地に交換して、その後48時間低酸素状態に置いた。細胞を正常酸素状態と低酸素状態で培養してから回収した。RNAはTrizol（Invitrogen）を用いて使用説明書の手順にしたがって抽出した。1μgの全RNA を5μgのランダム6オリゴマーとExScript RT reagent キット（Takara）の20μl反応液中で42℃15分間、95℃2分間、4℃で逆転写反応させた。RT-PCR産物は20倍に希釈し、SYBR Premix Ex Taq kit（Takara）を使って2μlを定量的リアルタイムPCRにかけた。定量的リアルタイムPCRとデータ解析はライトサイクラー1.5システム（Roche）によって成熟型miR130a, 130bの定量を行った。その結果miR130a（図２A）, miR130b(図３A)ともに低酸素によって発現量が増加することが確認された。
　また、発現量をノーザンブロットで検討した。RNAは上記のように回収し、260nmの光吸収で定量し、全RNAの40μgを15％TBE/尿素ゲル（Invitrogen）による電気泳動で分離した。電気泳動後、ゲルはセミドライ転写装置（Taitech）で200mAで90分かけてHybond N+膜(Amersham)に転写した。RNAはUVクロスリンカーで膜に固定し、5mlの　PerfectHyb ハイブリダイズ溶液で37℃、60分前処理した。DIG標識した固定化核酸プローブのmiR130a LNA-Bを5mlのPerfectHyb ハイブリダイズ溶液に加えた。ハイブリダイズは25℃で24時間行った。膜を0.1％SDS入りの2倍濃度SSC溶液で、55℃、5分間3回洗浄し、抗DIG-AP抗体（ROCHE）をブロッキング液で1000倍に希釈したものと室温で1時間反応させた。シグナルはGDP-starを使って検出し、X線フィルムに露光して可視化した。以下のプローブを検出に使用した：
　miR130a LNA-B、ATGcCCtAAcATTgCAcTG（配列番号７）、miR130a 2ミスマッチ LNA-B、ATGaCCtTTtAAcATTgCAaTG（配列番号８）。固定化核酸は小文字で、ミスマッチは下線付きで表示されている。その結果、低酸素によりmiR130a, 130bともに発現増加する結果を得た（２図B,　図３B）。以上より、成熟型miR130a, 130bは低酸素により増加するマイクロRNAであることが明らかとなった。
（実施例２）
　Pre-miR130a, Pre-miR130bの低酸素応答の中心的転写因子であるHIF-1αへの影響を検討した。実験の前日に、35mmプラスチックディッシュに4×105個のHEK293細胞を蒔いた。この細胞にDharmaFECT1試薬を用い、常法に従って、Negative control, Pre-miR130a, Pre-miR130bを導入し、その2日後に細胞を0.1％低酸素状態に暴露した。
　低酸素状態に8時間暴露してから、細胞を2倍濃度のSDSサンプルバッファー（250mM Tris/HCL, pH6.8, 4%SDS, 20%glycerol, 10% β-ME,0.01% bromophenol blue）200μlを加えて破壊し、回収して超音波をかけた。2分間煮沸してから、蛋白質を10％SDS-PAGEで分離してニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜を５％(w/v)スキムミルク入りTBST（50mM Tris/HCL, pH7.2, 140mM NaCl, 0,05% Tween-20）に1時間浸して非特異的結合部位をブロックした。HIF-1α、HIF-1βの抗体（NOVUS）（1％ミルク入りTBSTで1000倍希釈）、アクチン抗体（SIGMA）（1％ミルク入りTBSTで10000倍希釈）には４℃で一晩浸けた。その後、ニトロセルロース膜はTBSTで10分間3回洗った。ブロットはHRP標識したヤギの抗マウス二次抗体（BIORAD）（1％ミルク入りTBSTで1000倍希釈）に1時間浸して、TBSTで10分間3回洗った。検出はECLで行った。その結果、図４に示すようにPre-miR130a, Pre-miR130b,Pre-miR301を導入した細胞では、HIF-1αの蛋白質を増加させた（図４）。
（実施例３）
　Pre-miR130a, Pre-miR130bのHIF1αへの濃度依存的変化を検討した。実験手技は実施例１と同様である。Pre-miR130a, Pre-miR130bの細胞内への導入により、濃度依存的にHIF1αのタンパク量が増加することが確認された（図５）。この変化をPre-miR130a（図６）、Pre-miR130b（図７）それぞれで、ECLの発光をVERSADOC (BIORAD社)で定量を行なった。その結果、Pre-miR130a, Pre-miR130bともに導入濃度（10nM）でHIF1αのタンパク量を最大に発現することが確認された。
（実施例４）
　Pre-miR130a, Pre-miR130bが実施例３に示すように、HIF1αの蛋白質量を増加させることが明らかとなったので、HIF1αが転写を活性化させるHypoxia response element (HRE)をプロモーターとして持つレポーターを使い、Pre-miR130a, Pre-miR130bがHREレポーターを活性化することができるか検討した。 HEK293細胞は24穴プレート(Iwaki)に5×104個（/穴）を蒔いた。
　Lipofectamine LTX 導入試薬を使い(Invitrogen)、細胞に170 ngの蛍ルシフェラーゼレポータープラスミドと80 ngのウミシタケルシフェラーゼプラスミドpGL4.74を導入した。蛍フシフェラーゼレポータープラスミドとしては、トランスフェリンのプロモーターからの低酸素症応答要素の6コピーを含むpHRE-Lucと、pNFkB-Luc（BD Clonetech）を使った。
レポータープラスミド導入から5時間後にDharma FECT1導入試薬(Dharma) を使って10μMのpre-miRNA130a, 130bを細胞に導入した。Pre-miRNAsの導入から48時間後に細胞を0.1％酸素に暴露、あるいは20 ng/ml TNF-αで12時間処理した。細胞抽出液はPassive Lysis Buffer（Promega）で調製し、ルシフェラーゼアッセイはDual-Luciferase assy キット（Promega）で使用説明に従って行った。HREルシフェラーゼとNFkBルシフェラーゼの数値は導入効率によるばらつきを補正するためにウミシイタケルシフェラーゼの数値で割り付けた。
　HRE-Lucレポーター活性は低酸素暴露で上昇するが、その上昇がPre-miR130a, Pre-miR130bの導入により有意に上昇することが明らかとなった（図８）。しかしながら、pNFkB-Lucレポーター活性は、Pre-miR130a, Pre-miR130bの導入により変化がなかった（図９）。以上の結果より、miR130a, Pre-miR130bはHIF1αのタンパク量を増加させ、ゲノムの低酸素応答性の転写領域に結合し、下流の遺伝子発現を増加させる機能がある。
（実施例５）
　低酸素応答性の転写によって内在性の遺伝子が実際に上昇するかを検討するために、低酸素で発現が上昇し血管新生作用のある、VEGFの発現変化を調べた。RNAの回収法は、実施例２と同様である。PCRは95℃2分間で前変性させて、95℃10秒間の変性、55℃20秒間のアニーリング、72℃30秒間の伸張を50～60サイクル行った。全量ではβ-actin mRNA を使って標準曲線を計算し、VEGF mRNA量は内部標準にβ-actin mRNAを使って基準化した。
Actinの順方向プライマー：5'-ACCATGGATGATGATATCGCC-3' （配列番号９）
Actinの逆方向プライマー：5'-GCCTTGCACATGCCGG-3' （配列番号１０）
VEGFの順方向プライマー：5'-CCCTGATGAGATCGAGTACAT-3' （配列番号１１）
VEGFの逆方向プライマー：5'-CGGCTTGTCACATCTGCAAGT-3' （配列番号１２）
　その結果、正常酸素濃度においてもmiR130a, Pre-miR130bを細胞内に導入することにより、VEGF の発現が有意に増加することが明らかとなった（図１０）。また、0.1％の酸素濃度でも低酸素暴露ではPre-miR130a, Pre-miR130bの細胞内導入により、有意にVEGF発現を増加させることが確認された（図１１）。以上のことより、Pre-miR130a, Pre-miR130bはVEGFを増加させることによる血管新生作用もあることが示された。
（実施例６）
　Pre-miR130a, Pre-miR130bの細胞内への導入が低酸素性の細胞障害、増殖抑制から細胞を守ることができるかを検討した。実験前日にHEK293細胞を24穴プレート(Iwaki)に5 x 104個/穴で藩種した。翌日、miRNAまたはsiRNAを細胞に導入し、37℃で48時間培養を行った。その後、低酸素条件下で、8時間培養し、培地を新鮮な培地に交換し、CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay 試薬（Promega）を用いて使用説明書に従い、マイクロプレートリーダー680 (BIORAD)で、ホルマザン産物の吸光度490 nmを測定することで、細胞増殖および細胞死を検出した。その結果、低酸素濃度においてmiR130a,Pre-miR130bを細胞内に導入することにより、細胞の増殖 が濃度依存的に増加することが明らかとなった（図１２）。
（実施例７）
　Pre-miR130a, Pre-miR130bの標的遺伝子をTARGET SCAN, miRandaなどのデータベースより検索し、その候補遺伝子としてDDX6を調べた。DDX6蛋白質はmRNAの貯蔵、分解を制御するP bodyを構成する蛋白質であることが判明している。そのため、HIF-1αのmRNAの転写後制御をしていると考え第一候補とした。実験の前日に、35mmディッシュに4×105個のHEK293細胞を藩種した。
　各Pre-miR130a, pre-miR130bを導入したHEK293細胞を48時間後に、SDSサンプルバッファー（250mM Tris/HCL, pH6.8, 4%SDS, 20%glycerol, 10% β-ME,0.01% bromophenol blue）200μlを加えて細胞を破壊し、超音波処理および2分間の煮沸処理を行い、蛋白質を8％SDS-PAGEで分離してニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜は、５％(w/v)スキムミルク入りTBST溶液（50mM Tris/HCL, pH7.2, 140mM NaCl,0,05% Tween-20）に1時間浸して非特異的結合部位をブロックし、次にDDX6抗体 ( BETHYL )（5％ミルク入りTBSTで1000倍希釈）、アクチン抗体（SIGMA）（5％ミルク入りTBSTで10000倍希釈）を含む5％(w/v)スキムミルク入りTBST溶液に４℃で一晩浸けた。
　その後、ニトロセルロース膜はTBST溶液で10分間3回洗った。ブロットはHRP標識したヤギの抗マウス二次抗体（BIORAD）（5％ミルク入りTBSTで1000倍希釈）に1時間浸して、TBST溶液で10分間3回洗った。シグナルは、Immun-Star HRP 試薬( BIORAD)で化学発光として検出し、VarsaDoc (BIORAD)にて可視化した。その結果、miR130a, Pre-miR130bを細胞内に導入することにより、DDX6の蛋白質が減少することが確認された（図1３）。
　また、このDDX6蛋白質がHIF-1αのmRNAに結合してmRNAの安定性や翻訳制御をしているとすると、DDX6はHIF-1αのmRNAに結合すると考えられる。これを証明するため、以下の実験を行なった。
　実験の前日に、100mmディッシュに2 x 106個のHEK293細胞を藩種した。翌日に細胞を5mlのPBSで一度洗浄した後、Lysis buffer ( 10mM HEPES pH 7.0, 100mM KCl, 5mM MgCl, 0.5% NP-40, 1mM DTT, 100units/ml RNaseOUT (Invitrogen), Protease inhibitor cocktail (Roch) )を500 μl加え破砕し、抗DDX6抗体( BETHYL )を3 μg加え、4℃で一晩攪拌した。その後、50% surraly Protein G sepharose 4 FF (GE Healthcare)を100μl加え4℃で一時間攪拌し、遠心 (10000 rpm, 10秒)によりレジンを回収した。回収したレジンは、500 μl のNT2 buffer ( 50mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM MgCl, 0.05% NP-40)で５回洗浄し、20unitのDNase Iを含むNT2 buffer 100μlをレジンに加え、15分間30℃で加熱した。DNase処理を行ったレジンは、遠心により回収し、TRIzolを加えRNAを抽出した。RNAは、260nmの光吸収で定量し、全RNAの1μgを用いてPrimeScript RT reagent Kit ( TaKaRa )によりcDNAを合成した。PCRは、全量25 μl に対して、cDNA 1 μlを鋳型とし、ExTaq DNAポリメラーゼ ( TaKaRa)およびHIF-1αプライマーまたはHIF-1βプライマーを用いて行った。PCRで使用したプライマーを以下に示す。
HIF-1αの順方向プライマー : 5'-CTTGCTCATCAGTTGCCACTT-3' （配列番号１３）
HIF-1αの逆方向プライマー : 5'-GCCATTTCTGTGTGTAAGCAT-3' （配列番号１４）
HIF-1βの順方向プライマー : 5'-ATTCAAGGTGGAGGAGCCATTGTC-3' （配列番号１５）
HIF-1βの逆方向プライマー : 5'-ATAGGAGCCATCAGTGGATGTGTT-3' （配列番号１６）
　その結果、DDX6 蛋白質はHIF-1αのmRNAに結合するが、HIF-1βのmRNAには結合しないことが明らかとなった（図１４）。以上の結果より、miR130a, miR130bはDDX6に作用し、DDX6の蛋白レベルを減少することにより、HIF-1αのP-bodyよりの遊離を促し、翻訳活性を高めていると考えられる。
　HIF-1αの翻訳制御にDDX6が直接関与することを証明するために、DDX6遺伝子をsiRNAでknock downし、HIF-1αの蛋白レベルをウエスタンブロットで調べた。実験の前日に、35mmディッシュに4 x 105個のHEK293細胞を藩種した。翌日、QIAGENから購入したDDX6 siRNAを最終濃度100nMとなるようにDharmaFECT1試薬 ( Dharmacon ）を用いて、HEK293細胞に導入した。導入方法は、DharmaFECT1試薬取り扱い説明書に従って行った。細胞は、DDX6 siRNAの導入から48時間後に低酸素状態に暴露した。その後、細胞を回収し、ウエスタンブロットにより、HIF-1αの発現を確認した。その結果、DDX6遺伝子のknock downは、HIF-1αの蛋白レベルを増加させた（図１５）。このことは、miR130, miR130bによるDDX6の減少が、HIF-1αの蛋白レベルを増加させること証明する。
（実施例８）
　Pre-miR130a, Pre-miR130bのHIF-1αへの影響を、確証するために、これらのmicroRNAに対するsiRNAをそれぞれのループ領域（図１６）に対してデザインした（図１７）。このsiRNAを細胞内に導入することにより、HIF-1αの蛋白質の増減を検証した。siRNAの導入、ウエスタンブロットによる検出は同様の方法を用いている。
　その結果、si130a, si130bの導入により、HIF-1αの蛋白質のみ減少することが確認された（図１８）。図５および図１８の結果より、miR130a, miR130bがHIF-1αの蛋白質レベルを制御することは明らかである。
（実施例９）
　miR130aがどの臓器に発現しているかをインサイチューハイブリダイゼイションで検討した。熟成miR130a(22n.t.)のアンチセンスプローブはDIG標識の固定化核酸を用意した。インサイチューハイブリダイゼイション用のパラフィン包埋ブロックとマウス胎児(E18.5)の切片はGenostaff社から入手した。ハイブリダイズはDIG標識固定化miR130aプローブをProbe Diluentで濃度100ng/mlに調製して行った。切片はAP 標識のDIG抗体（ROCHE）と2時間反応させた。発色反応はNBT/BCIPで一晩行った。切片はKernechtrotでカウンター染色し、脱水して、malinol で標本にした。
　その結果、miR130aは脳と、腎臓に高発現していることが判明した（図1９）。脳では、大脳皮質（C- a, b）、小のでは顆粒細胞（D-a,b）、腎臓では尿細管周辺の細胞に発現している（E-a）。
　以上の結果より、miR 130aに関しては、脳と腎臓で酸素濃度変動に対する恒常性維持の機能があると考えられる。

Claims (8)

  1. HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAを有効成分として含有する、低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
  2. miRNAが、配列番号１～３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５～４０塩基からなり、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖である、請求項１に記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
  3. miRNAが、配列番号１～３の何れかに記載の塩基配列のうち、少なくともAGUGCAAを含む１５～４０塩基からなるRNA鎖と９０％以上の相同性を有し、HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するRNA鎖である、請求項１又は２に記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
  4. miRNAが、配列番号４～６の何れかに記載の塩基配列からなるRNA鎖である、請求項１から３の何れかに記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
  5. miRNAが、配列番号１～３の何れかに記載の塩基配列からなるPre-miRNAから誘導されたものである、請求項１から４の何れかに記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
  6. miRNAが、配列番号１～３の何れかに記載の塩基配列からなるPre-miRNAをコードするDNAから転写され誘導されたものである、請求項１から５の何れかに記載の低酸素障害保護剤又は低酸素障害の予防若しくは治療剤。
  7. HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAをインビトロで細胞内に導入することを含む、低酸素状態の細胞を低酸素障害から保護する方法。
  8. HIF-1αタンパク質の発現亢進作用を有するmiRNAをインビトロで細胞内に導入することを含む、低酸素条件下での血管新生因子（VEGF）の産生を増大させる方法。
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