WO2009145243A1 - 光線力学的治療に利用可能な脂質膜およびその利用 - Google Patents

光線力学的治療に利用可能な脂質膜およびその利用 Download PDF

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lipid
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池田　篤志
元英 秋山
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国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学
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Definitions

  • the present invention relates to a lipid membrane that can be used for photodynamic therapy and its use, and more specifically, a lipid membrane containing a photosensitizer and a photoactivator having absorption maxima in different wavelength ranges, and the same It is about use.
  • PDT photodynamic therapy
  • PDT is a treatment method used for the treatment of cancer and the like, and is a treatment method for killing cancer cells and the like by using active oxygen generated by irradiating light to a photosensitive substance. More specifically, in PDT, active oxygen (singlet oxygen, hydroxy radical, etc.) generated by the photochemical reaction of water and / or oxygen is irradiated by irradiating light to an affected area to which a substance activated by light is administered. Generated at the affected area. The generated active oxygen destroys and kills cancer cells by inhibiting the activity and / or proliferation of the cancer cells in the affected area.
  • Fullerenes having a closed shell structure consisting only of carbon atoms efficiently generate active oxygen such as singlet oxygen by light irradiation based on the following unique properties: (1) Specific ⁇ electron cloud Are delocalized, (2) high electron affinity, (3) relatively low ionization energy, (4) high electron accepting ability, (5) photoexcited with visible light.
  • fullerenes are insoluble in polar solvents
  • methods for solubilizing the fullerene by coating the fullerene polymer chain, C 60 - by moving the C 60 cyclodextrin complex within liposomes (exchange reaction) such as the methods of obtaining the C 60-containing liposomes, and the fullerenes technique for dissolving in an aqueous solvent is previously disclosed (e.g., see Patent documents 1 and 2).
  • the technique of treating cancer tissue by light irradiation using the liposome containing a photosensitizing compound is also disclosed (for example, refer patent document 3 and 4).
  • the light beam used for PDT has a long wavelength.
  • light exceeding a wavelength of 700 nm is easily absorbed by water. Therefore, it is more preferable that the light beam used for PDT has a wavelength range of 600 to 700 nm.
  • a similar wavelength range is also used in the techniques described in Patent Documents 3 and 4.
  • C 60 fullerene has an absorption maximum outside the range of 500 to 800 nm, and cannot generate active oxygen based on light irradiation with a wavelength range of 600 to 700 nm.
  • a laser beam with a wavelength of 500 to 800 nm is used as a light source that has already been applied to PDT, a new facility is required to perform PDT using C 60 fullerene.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and its object is to provide a new material for making a substance that could not be used for PDT in the wavelength range of 500 to 800 nm available in the same wavelength range. To provide technology.
  • Bimolecules that can successfully perform electron transfer / energy transfer are used for photoelectric conversion and the like.
  • the present inventors have found that even light in the wavelength range that can not activate the C 60 fullerene, to jointly appropriate donor molecule against C 60 fullerene as acceptor molecule, activates C 60 fullerene I expected to be able to.
  • cytotoxicity was observed using liposomes containing carotene (astaxanthin), which has little adverse effect on the living body, together with C 60 fullerene.
  • carotene did not lead to activation of C 60 fullerene.
  • liposomes cannot provide a suitable environment for causing electron / energy transfer from donor molecules to acceptor molecules (these two molecules can be close enough to cause electron / energy transfer in the liposomes). It was suggested).
  • Patent Document 5 describes an organic solar cell with high energy conversion efficiency using self-organization of porphyrin and fullerene.
  • the present inventors have also developed a material for a photoelectric conversion element utilizing this (see Patent Documents 6 and 7).
  • Patent Document 8 describes a near-infrared light emitting material composed of a bimolecular solid film in which porphyrin and fullerene form a charge transfer state. Accordingly, the present inventors, the porphyrin using liposomes which contains together with C 60 fullerene was observed cytotoxicity. However, as in the case of carotene, C 60 fullerene was not activated even when porphyrin was present in the liposome. Further, by coexisting with C 60 fullerene, porphyrin had reduced to cytotoxicity has originally.
  • the present inventors have found ingenuity based on personal Viewpoints, if a compound having a specific structure, the cells of C 60 fullerene with light irradiation under the wavelength range that can not activate the C 60 fullerene It has been found that toxicity can be induced, and the present invention has been completed.
  • the lipid membrane according to the present invention can generate active oxygen upon irradiation with light in the wavelength range of 500 to 800 nm, can absorb light in the range of 500 to 800 nm, and can be in the range of 500 to 800 nm.
  • the photosensitizer is characterized in that it contains two hydrocarbon groups having 8 to 20 carbon atoms.
  • the lipid membrane according to the present invention contains the photosensitizer having the above structure together with the photoactivatable substance, so that the photosensitizer can be changed from the photosensitizer to the photoactivatable substance even in the light irradiation in the wavelength range of 500 to 800 nm.
  • the photoactivator can be successfully activated based on electron / energy transfer to produce active oxygen that is cytotoxic.
  • the carbon number of the long chain hydrocarbon group in the present invention is more preferably 12-18, and still more preferably 12-16.
  • the hydrocarbon group is preferably linear, but may have one or several branches or may have one or several double bonds.
  • the photoactivator is preferably selected from the group consisting of fullerene, porphyrin, oligothiophene, carotenoid and pyrene.
  • the photosensitizer is
  • n 1 to 3
  • the lipid membrane according to the present invention is preferably an artificial lipid membrane, more preferably a lipid bilayer from the viewpoint of the stability of the membrane structure, and further preferably a liposome form or a micelle form.
  • the cell growth inhibitor according to the present invention is characterized by containing the above lipid membrane.
  • the photodynamic therapeutic agent according to the present invention is characterized by containing the lipid membrane.
  • the present invention can generate active oxygen by light irradiation and inhibit cell activity and / or proliferation. And based on such a property, this invention can be utilized for PDT.
  • the photodynamic therapeutic agent uses toxic active oxygen.
  • a known photosensitizing compound When a known photosensitizing compound is used for PDT, it takes time until the compound is decomposed / metabolized even though its toxicity is controlled by light irradiation. Thus, the subject needs to remain in the dark for about a week after treatment. Since the present invention is composed of two compounds that are not toxic under the visible light region, the proximity state of both is solved with the degradation of the liposome. This can greatly reduce the likelihood of toxicity remaining in the body and reduce photosensitivity.
  • the present invention provides a lipid membrane containing a photoactivator and a photosensitizer.
  • the photosensitizer is a donor molecule that supplies light energy to the photoactivator
  • the photoactivator is an acceptor molecule that accepts light energy from the donor molecule.
  • donating / accepting light energy intends the transfer of energy and / or electrons generated directly or indirectly due to the acceptance of light.
  • light energy is intended to mean not only at least one of energy and electrons generated due to acceptance of light, but also at least one of additional energy and electrons generated due to donation / acceptance of light energy. Is done.
  • the lipid membrane according to the present invention is preferably an artificial lipid membrane, and more preferably a lipid bilayer from the viewpoint of the stability of the membrane structure.
  • the lipid bilayer is a membranous structure (lipid bilayer) in which polar lipids (particularly phospholipids) are bilayered.
  • the lipid bilayer structure stabilizes as a two-dimensional structure in a spherical shape, but can be a planar structure if the end is isolated from water molecules.
  • the spherical one is called a liposome
  • the planar one is called a lipid flat membrane.
  • micelles composed of lipid monolayers are generally unstable. However, as described in Patent Document 9, the micelles formed by block copolymer molecules (block copolymers) have good stability. The contractor is fully aware. Such micelles are being studied as one of the means of drug delivery (DDS).
  • Liposomes are lipid artificial membranes, also called vesicles, and can be produced by dispersing a suspension of lipids (for example, phospholipids) followed by sonication. Studies using liposomes are widely performed, and are used as cell membrane models or as one of the means for drug delivery (DDS).
  • the liposome composition according to the present invention may contain a photoactivatable substance and a photosensitizer, but it is preferable that both the photoactivator and the photosensitizer are embedded in the lipid membrane. .
  • an “implanted” state is intended to mean that some or all of the subject substance is present in the lipid moiety and is “incorporated (in the lipid moiety)”. It is used interchangeably with a state, a “stuck (in lipid part)” state, or a “stable (in lipid part)” state.
  • the lipid planar membrane is used when measuring the activity of a membrane protein (for example, a channel protein) in vitro, and its production method is well known in the art.
  • a membrane protein for example, a channel protein
  • membrane which concerns on this invention should just have both the photoactivation substance and the photosensitive substance embedded in the lipid film.
  • the lipid membrane according to the present invention contains a photosensitive substance that can absorb light in the range of 500 to 800 nm and a photoactivatable substance that cannot absorb light in the range of 500 to 800 nm.
  • the photosensitive material is excited by light irradiation to generate first light energy, the first light energy is received by the photoactivatable material, and the photoactivatable material is excited to generate second light energy. .
  • active oxygen is produced
  • the photosensitive material contains two long-chain hydrocarbon groups. Based on such a configuration, the present invention can activate a photoactivatable substance even with light irradiation in a wavelength range (500 to 800 nm) where the photoactivatable substance cannot be activated. Can generate active oxygen.
  • active oxygen is not particularly limited, but for example, singlet oxygen and hydroxy radicals are intended.
  • “can absorb light” in a particular wavelength range is used interchangeably with “has photoactivity for light” and “can be activated by light” in that wavelength range .
  • “cannot absorb light” in a specific wavelength range is used interchangeably with “does not have photoactivity for light” and “cannot be activated by light” in that wavelength range.
  • photoactivity is intended to be an activity that is excited by irradiation light to generate light energy different from irradiation light, and is preferably another substance by light irradiation. Activities that can donate light energy to (eg acceptor molecules) are contemplated.
  • light energy can be provided to the photoactivatable material based on light irradiation (ie, the photoactivatable material can be excited). It is contemplated that light energy can be donated to oxygen based on that (ie, active oxygen can be generated).
  • a “photoactivator” cannot absorb light in the range of 500-800 nm, but accepts light energy from an excited “photosensitizer” Any compound that can donate light energy to oxygen (that is, a compound having photoactivity with respect to light energy from an excited “photosensitive substance”) may be used.
  • the photoactivator is preferably selected from the group consisting of fullerene, porphyrin, oligothiophene, carotenoid and pyrene, more preferably fullerene and porphyrin, C 60 fullerene, C 70 fullerene. Is particularly preferred.
  • the lipid membrane according to the present invention is a lipid membrane containing C 60 fullerene (hereinafter also referred to as “C 60 ”) as a photoactivator. In this embodiment, C 60 without the surface is modified, it is present in the lipid membrane.
  • C 60 is known to generate active oxygen upon irradiation with light.
  • it is preferably present singly molecules without C 60 interact with each other, be present in a state in which a plurality of molecules are associated, C Only some of the 60 molecules may be present in an associated state.
  • a fullerene / ⁇ -cyclodextrin complex is prepared according to the procedure described in Patent Document 2, mixed with the liposome, heated (for example, at 80 ° C.
  • the “photosensitive substance” may be any compound that can absorb light in the range of 500 to 800 nm and can be stably incorporated into the lipid moiety.
  • a compound containing two long-chain hydrocarbon groups is preferable in order that the “photosensitive substance” can be “stablely incorporated into the lipid moiety” to the extent that a desired action is produced.
  • the “photosensitive substance” is a compound having an absorption maximum in the range of preferably 400 to 800 nm, more preferably 500 to 800 nm, and still more preferably 550 to 750 nm.
  • the photosensitive substance may have a further absorption maximum outside the wavelength range described above as long as it has photoactivity with respect to light in the range of 500 to 800 nm.
  • the number of carbon atoms of the long-chain hydrocarbon group of the photosensitive material is preferably 8 to 20, more preferably 12 to 18, and still more preferably 12 to 16.
  • the long-chain hydrocarbon group of the photosensitive substance may be linear, may have one or several branches, and may further have one or several double bonds.
  • a person skilled in the art can synthesize such a long-chain hydrocarbon group as appropriate, and therefore can easily synthesize a photosensitive substance obtained by adding two long-chain hydrocarbon groups to a commercially available fluorescent dye.
  • the photosensitive substance used in the present invention can be easily synthesized by reacting an ester of a dye and succinimide with an amine having two long-chain hydrocarbon groups.
  • rhodamine DHPE (Invitrogen), which is a rhodamine derivative having the same structure as the above target product
  • the photosensitive material used in the present invention is as follows:
  • n is 1-3 and R is a C 12-18 alkyl group, (CH 2 ) 8 CH ⁇ CH (CH 2 ) 7 CH 3 , or (CH 2 ) 8 CH ⁇ CHCH 2 ⁇ CH (CH 2 ) 4 CH 3 ), carbocyanine dyes or rhodamine derivatives are more preferred,
  • BODIPY FL DHPE (official name: N- (4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionyl) -1 2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt, Invitrogen).
  • the specific composition of the lipid constituting the lipid membrane according to the present invention is not particularly limited, and may be any one or any combination of a cationic lipid, an anionic lipid, and a bipolar lipid.
  • a lipid film containing C 60 preferably contains a cationic lipid, more preferably contains a cationic cholesterol.
  • disassembled by active oxygen can be formed.
  • the lipid membrane excellent in cell permeability can be provided by containing cationic lipid.
  • a lipid membrane that generates active oxygen and has excellent cell permeability can be suitably used for PDT.
  • Examples of the cationic lipid constituting the lipid membrane according to the present invention include 1,2-dioleoyloxy-3- (trimethylammonium) propane (DOTAP), N, N-dioctadecylamide glycylspermine (DOGS), Dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB), 3 ⁇ [N- (N7, N′-dimethylamino-ethane) -carbamoyl] cholesterol, stearylamine, N- ( ⁇ -trimethylammonioacetyl) dodecyl-D-glutamate chloride, N -[1- (2,3-oleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA), 2,3-dioleoyloxy-N- [2- (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneammonium triflate Or
  • cationic phospholipids such as esters of phosphatidic acid and amino alcohol, such as esters of dipalmitoyl phosphatidic acid (DPPA) or distearoyl phosphatidic acid (DSPA) and hydroxyethylenediamine can also be used.
  • DPPA dipalmitoyl phosphatidic acid
  • DSPA distearoyl phosphatidic acid
  • cationic lipid can be suitably used as the cationic lipid. If such a cationic lipid is used, liposomes having an average particle diameter of 50 nm to 200 nm can be prepared as the lipid membrane according to the present invention. Liposomes having such an average particle size can be selectively targeted to cancer cells by the EPR (Enhanced permeability and retention) effect.
  • the content is preferably 90 mol% or less, more preferably 50 mol% or less, and more preferably 20 mol% or less with respect to the total lipid amount. More preferably.
  • anionic lipid constituting the lipid membrane according to the present invention examples include phosphatidylglycerol derived from natural substances such as dimyristoylphosphatidylglycerol, dipalmitoylphosphatidylglycerol, egg yolk, or soybean, fully hydrogenated phosphatidylglycerol, distearoyl.
  • the present invention includes the following formula (2)
  • the lipid membrane according to the present invention is in the form of liposome, among the lipids exemplified above, the lipid membrane may contain a single lipid or a combination of a plurality of lipids. Further, when a plurality of charged lipids (anionic lipids or cationic lipids) are contained in combination, it is preferable to contain negatively charged lipids or positively charged lipids in combination. Thereby, it can reduce that a liposome couple
  • the bipolar lipid and the charged lipid are contained in combination, the bipolar lipid: charged lipid (molar ratio) is preferably 200: 1 to 1: 9, and preferably 100: 1 to 1: 1. It is more preferable that the ratio is 40: 1 to 5: 1.
  • bipolar lipid constituting the lipid membrane according to the present invention examples include 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • Phosphatidic acid dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dimyristolphosphatidylcholine (DMPC), dioleylphosphatidylcholine (DOPC), dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), distearoylphosphatidylserine (DSPS), Stearoyl phosphatidylglycerol (DSPG), dipalmitoyl phosphatidyl inosito (DPPI), distearoyl phosphatidylinositol (DSPI), dipalmitoyl phosphatidic acid (DPPA), distearoyl phosphatidic acid (DSPA), cardiolipin, sphingomyelin, egg yolk lecithin, soybean lecithin, lysolecithin, and hydrogenated in a conventional manner
  • phospholipids such as hydroxide (eg hydrogenated soybean lec
  • Cationic lipids are known to have cell permeability. Therefore, when the lipid membrane according to the present invention is used for cell growth inhibition or photodynamic therapy, it is preferable that the lipid constituting the lipid membrane contains a cationic lipid. However, it is generally known that cationic lipids have toxicity. Therefore, the content of the cationic lipid is determined in consideration of cell permeability and side effects due to toxicity. At this time, the content of the cationic lipid is preferably prepared by using a combination of a bipolar lipid and a cationic lipid.
  • bipolar lipids and cationic lipids are used in combination, and by appropriately changing the content of the cationic lipid within the above-mentioned range, it has good cell permeability and reduces side effects due to toxicity. Lipid membranes can be produced.
  • the lipid membrane according to the present invention may contain a glycolipid.
  • the glycolipid include glycerolipids such as digalactosyl diglyceride and galactosyl diglyceride sulfate, galactosylceramide, galactosylceramide sulfate, lactosylceramide, sphingoglycolipids such as ganglioside G7, ganglioside G6, and ganglioside G4. Can do.
  • the lipid membrane according to the present invention may contain components other than the photosensitizer, photoactivator and lipid.
  • sterols acting as a film stabilizer may be contained.
  • the sterols include cholesterol, dihydrocholesterol, cholesterol ester, phytosterol, sitosterol, stigmasterol, campesterol, cholestanol, and lanosterol.
  • the stabilizer may contain a sterol derivative such as 1-O-sterol glucoside, 1-O-sterol maltoside or 1-O-sterol galactoside.
  • the content thereof is preferably 0.05 to 70 mol%, more preferably 0.1 to 60 mol%, based on all lipid molecules. Preferably, it is 0.5 to 40 mol%. If it is in the said range, the lipid membrane of a liposome form can be stabilized, without inhibiting formation of a liposome.
  • a lipid membrane contains cholesterol
  • cholesterol can also become an anchor for polyalkylene oxide introduction
  • Various functional substances can be immobilized at the end of the polyoxyalkylene chain by covalent bonds.
  • the lipid membrane according to the present invention may contain glycols.
  • the glycols include ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, trimethylene glycol, and 1,4-butanediol.
  • the content thereof is preferably 0.01 to 20 mol%, more preferably 0.5 to 10 mol%, based on the total lipid of the lipid membrane according to the present invention. According to the said structure, a water-soluble substance can be efficiently hold
  • the lipid membrane according to the present invention may contain a dialkyl phosphate such as dicetyl phosphate which is a negatively charged substance, an aliphatic amine such as stearylamine as a compound that imparts a positive charge, and the like.
  • a dialkyl phosphate such as dicetyl phosphate which is a negatively charged substance
  • an aliphatic amine such as stearylamine as a compound that imparts a positive charge, and the like.
  • the lipid membrane according to the present invention may have a substituent for imparting a specific function on the particle surface, or a molecule for imparting a specific function may be added or inserted.
  • a substituent for imparting a specific function on the particle surface
  • a molecule for imparting a specific function may be added or inserted.
  • the substituent and molecule include the substituent and molecule for targeting a specific organ or tissue when the lipid membrane according to the present invention is administered to a living body, and the stability of the lipid membrane according to the present invention. Substituents and molecules for improving can be mentioned.
  • a phospholipid having a polyalkylene oxide (PAO) group (polyoxyalkylene chain) which is a polymer chain or a similar group Or a compound can be mentioned.
  • PAO polyalkylene oxide
  • PEG polyethylene glycol
  • the PEG group is preferably a PEG group having 10 to 3500 oxyethylene units, and more preferably PEG having 100 to 2000 oxyethylene units.
  • the content thereof is preferably 0.01 to 30 mol%, preferably 0.1 to 15 mol% with respect to the total lipid of the lipid membrane according to the present invention. It is more preferable that For the PEGylation of the lipid membrane according to the present invention, a conventionally known liposome PEGylation technique can be used.
  • n is preferably 1 to 2000, more preferably 10 to 500, in the case where it has a PAO group represented by: a hydrogen atom, an alkyl group or a functional functional group. More preferably, it is 20 to 200.
  • PAO group represented by: a hydrogen atom, an alkyl group or a functional functional group. More preferably, it is 20 to 200.
  • the oxyalkylene group having 2 to 4 carbon atoms include oxyethylene group, oxypropylene group, oxytrimethylene group, oxy-1-ethylethylene group, oxy-1,2-dimethylethylene group and the like.
  • the oxyalkylene groups may be the same or different. If they are different, they may be added randomly or in blocks.
  • hydrophilicity is imparted to the PAO group
  • ethylene oxide is preferably added alone as the oxyalkylene group, and n in the above formula is more preferably 10 or more.
  • ethylene oxide is preferably added in an amount of 20 mol% or more, more preferably 50 mol% or more.
  • lipophilicity is imparted to the PAO group, it is preferable that the number of added moles of oxyalkylene groups other than ethylene oxide is large.
  • a block copolymer of polyethylene oxide and polypropylene oxide is preferable.
  • examples of the Y alkyl group in the above formula include an aliphatic hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms (which may be branched).
  • the above-mentioned “functional functional group” is intended to be a substituent for adding a “functional substance” such as sugar, glycoprotein, antibody, lectin, and cell adhesion factor to the tip of the PAO group.
  • Specific examples include highly reactive substituents such as an amino group, an oxycarbonylimidazole group, and an N-hydroxysuccinimide group.
  • the lipid membrane on which the PAO group having the functional substance bound to the tip is immobilized has a function of the functional substance, for example, a “recognition element” such as cancer tissue directivity or cancer cell recognizability.
  • a “recognition element” such as cancer tissue directivity or cancer cell recognizability.
  • the lipid membrane according to the present invention contains a phospholipid or compound having a PAO group, the phospholipid or compound may be a single species or a combination of a plurality of species.
  • the content thereof is preferably 0.001 to 50 mol%, more preferably 0.01 to 25 mol%, and more preferably 0.1 to 10 mol% of all components of the lipid membrane according to the present invention. More preferably, it is mol%.
  • the introduction of the PAO group into the lipid membrane according to the present invention can be performed using a conventionally known technique.
  • the size of the liposome is not particularly limited as long as it is designed to a suitable size according to the use of the lipid membrane according to the present invention.
  • the average particle size of the liposome is 50 nm. It is preferably from ⁇ 200 nm, more preferably from 60 nm to 200 nm, and particularly preferably from 70 nm to 150 nm.
  • the average particle size of the liposome is preferably 500 nm to 1.0 ⁇ m, more preferably 700 nm to 900 nm.
  • the thickness is preferably 750 nm to 850 nm, more preferably around 800 nm.
  • the content of the photoactivator contained in the lipid membrane according to the present invention is not particularly limited, and those skilled in the art can appropriately change the content of the photoactivator in the lipid membrane according to the present invention.
  • the properties of the lipid membrane can be changed. More specifically, when the photoactivator is associated in the lipid membrane, the association state of the photoactivator in the lipid membrane is changed by changing the content of the photoactivator. Therefore, in addition to the change in property due to the change in the content of the photoactivatable substance, a change in property due to a change in the association state is expected. Therefore, the content of the photoactivatable substance in the lipid membrane is preferably changed as appropriate depending on the use of the lipid membrane.
  • the lipid membrane when used for PDT applications, it is preferable that 0.1 to 20 mol% of the photoactivatable substance is contained with respect to the total lipid, and 0.5 to 15 mol% of the photoactivatable substance is contained. More preferably it is contained. With such a configuration, the amount of active oxygen produced by light irradiation per molecule of lipid membrane can be increased. Therefore, the effect of PDT can be obtained with a small amount of lipid membrane.
  • the lipid membrane according to the present invention Since the lipid membrane according to the present invention has the above-described configuration, it is soluble in an aqueous solvent.
  • the physical properties of the lipid membrane can be controlled by adding the average particle size, the content of the photosensitive substance and the photoactivating substance, the composition of the lipid, and other components. Therefore, the lipid membrane according to the present invention can be used for various applications depending on its physical properties. Specifically, the lipid membrane according to the present invention can generate a large amount of active oxygen even by excitation with light having a wavelength of 500 to 800 nm. Therefore, such a lipid membrane can be suitably used for applications such as PDT, sterilization, and sterilization. Moreover, it can be used as a use for cleaving DNA, for example, as a research reagent.
  • composition containing lipid membrane The present invention also provides a composition comprising a lipid membrane according to the present invention.
  • the composition according to the present invention only needs to contain the lipid membrane described above, and other specific configurations are not particularly limited.
  • a solution in which a lipid membrane is dissolved in an aqueous solvent is also a composition according to the present invention.
  • a photodynamic therapeutic agent and a cell growth inhibitor will be described as one embodiment of the composition according to the present invention, the present invention is not limited thereto.
  • the composition according to the present embodiment can react with active oxygen by light irradiation, preferably light irradiation with a wavelength range of 500 to 800 nm, more preferably light irradiation with a wavelength range of 600 to 700 nm.
  • Preferable cationic lipids include, for example, the above-described cationic lipids, and lipids represented by the above formula (1) are particularly preferable.
  • the content thereof is preferably 1 to 50 mol% of the total lipid amount, and more preferably 10 mol%.
  • the lipid membrane preferably contains a bipolar lipid in addition to the cationic lipid.
  • Preferable bipolar lipids include, for example, the above-described bipolar lipids, and lipids represented by the above formula (3) are particularly preferable.
  • the content thereof is preferably 50 to 99 mol%, more preferably 90 mol% of the total lipid amount.
  • the lipid membrane contained in the composition according to the present embodiment is represented by 10 mol% of the lipid represented by the above formula (1) and the above formula (3) with respect to the total lipid amount. It may contain 90 mol% lipid.
  • the content of the lipid membrane in the composition according to the present embodiment is not particularly limited, but is preferably 2 to 20 mol%, more preferably 5 to 15 mol%.
  • the composition according to this embodiment may further contain a pharmaceutically acceptable component in addition to the lipid membrane.
  • pharmaceutically acceptable ingredients include buffers, chelating agents, pharmacologically active substances (eg, vasodilators, coagulation inhibitors, etc.), osmotic pressure regulators, stabilizers, antioxidants ( Examples thereof include ⁇ -tocopherol and ascorbic acid), viscosity modifiers, preservatives and the like.
  • the osmotic pressure adjusting agent include physiological saline (0.9% saline).
  • pH buffering agents include amine-based buffers and carbonate-based buffers.
  • the composition according to this embodiment can be used as a photodynamic therapeutic agent.
  • the method for administering the composition according to the present embodiment is not particularly limited, and for example, it can be administered to the affected area to be treated by subcutaneous injection, intravenous injection, surgical means, or the like.
  • the composition according to this embodiment is used as a photodynamic therapeutic agent, after the composition is administered, the affected part is placed in an environment where it is not exposed to light for a certain period of time, and then light is applied to the affected part for a certain period of time. Irradiate.
  • the wavelength of light is not particularly limited, but is preferably 500 to 800 nm, and more preferably 600 to 700 nm.
  • the affected area can be efficiently irradiated with light.
  • the method of irradiating light is not specifically limited,
  • various light sources such as an artificial diffusion light source and a laser, can be used.
  • the light source include a halogen lamp, a xenon lamp, and a metal halide lamp.
  • a metal halide lamp is preferable as a light source having a radiation intensity spectrum strong against visible light.
  • light emitting elements such as LED and an organic EL element, can also be used as a light source.
  • the treatment target is not particularly limited.
  • the composition according to this embodiment can be applied to the treatment of cancer cells, age-related macular degeneration, atherosclerotic lesions, rheumatoid arthritis lesions, refractory warts, acne vulgaris, and papilloma virus. is there.
  • it is suitably used for the treatment of cancer cells and age-related macular degeneration.
  • the kind of cancer cell is not specifically limited, The composition which concerns on this embodiment is used with respect to various cancer cells.
  • age-related macular degeneration is a disease in which a portion called the macular of the retina having cells that distinguish colors changes with age, but the composition according to this embodiment is also among age-related macular degeneration. It can be suitably used for the treatment of “wet” age-related macular degeneration with choroidal neovascularization.
  • the composition according to the present embodiment provides active oxygen by light irradiation, preferably light irradiation with a wavelength range of 500 to 800 nm, more preferably light irradiation with a wavelength range of 600 to 700 nm.
  • the content of the lipid membrane in the composition according to the present embodiment is not particularly limited as long as it is an amount that can suppress cell growth by active oxygen generated by the lipid membrane by light irradiation. Although it does not specifically limit as a cell of application object, Microorganisms etc. may be sufficient, In this case, the composition which concerns on this embodiment may be an antibacterial agent or a disinfectant.
  • the specific method of using the composition according to the present embodiment is not particularly limited.
  • the composition according to the present embodiment is sprayed, and the sprayed area is exposed to natural sunlight, Alternatively, light is irradiated for a certain period of time using an artificial light source.
  • an artificial light source it is preferable to irradiate light obtained by cutting ultraviolet light with a filter or the like.
  • the microorganisms used as sterilization object are not specifically limited,
  • the composition which concerns on bacteria such as colon_bacillus
  • the shape of the composition according to this embodiment is not particularly limited, and may be powder, bulk, paste, solution, dispersed liquid, film, gel, or the like.
  • This thin film was dried under reduced pressure at 35 ° C. for 1 hour, 1 ml of 0.9% NaCl aqueous solution was added, and the mixture was stirred with a vortex mixer. Using an extruder, the solution was passed through a membrane filter having a pore diameter of 50 nm 11 times to prepare a liposome solution (lipid concentration 4 mM). Moreover, the cationic liposome was similarly prepared, without mixing a carbocyanine pigment
  • the cationic lipid used was
  • the bipolar lipid is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • Cell viability is determined by collecting cells in a petri dish by trypsin treatment, staining dead cells with 0.25% (W / V) trypan blue, and then calculating the number of viable cells on a hemocytometer, or Cell Calculation was performed using Counting Kit-8.
  • FIG. 1 The results are shown in FIG.
  • the left side of FIG. 1 is a graph showing the cell viability without light irradiation. When there is no light irradiation, each liposome solution has no cytotoxicity.
  • Right side of FIG. 1 is a graph showing the cell viability when irradiated light for 15 minutes, were observed cytotoxicity in combination with C 60 and DiI or DiD. In particular, it was observed significant cytotoxicity in combination with the C 60 and DiI.
  • the cells were washed with PBS, the medium was added again, the cells were transferred to an incubator at 25 ° C., and irradiated with light (irradiation wavelength: 610 to 740 nm, 17 mWcm ⁇ 2 , 30 minutes). After 24 hours of light irradiation, the cell viability was calculated using Cell Counting Kit-8. The results are shown in FIG. 5 (see DiD-C70).
  • Example 1 In the same manner as in [4] of the obtained by the same procedures and methods, using a liposome solution containing the C 60 Example 2 [3] The cell viability was calculated (see “DiD-C60” in FIG. 5). Further, the same operation as described above was performed to prepare a liposome solution containing only DiD in the liposome, and the cell survival rate was calculated (see “DiD” in FIG. 5). Furthermore, it performs above the same procedure, only the C 70 to produce a liposome solution containing the liposomes was calculated cell viability (in FIG. 5, see "C70").
  • the liposomes containing DiD and C 70, and the liposomes containing DiD and C 60 it was confirmed that it was possible induce cell death by light irradiation from a low concentration.
  • liposomes comprising DiD and C 70 are to be able to induce cell death was confirmed by light irradiation from the lower concentration compared to liposomes comprising DiD and C 60.
  • the present invention provides a new technique related to photodynamic therapy that has been attracting attention in the medical field, it greatly contributes to the development of medicine-related fields and research tools.

Abstract

　本発明の課題は、光線力学的治療において好ましい波長範囲において利用し得なかった物質を同波長範囲にて利用可能にするための新たな技術を開発することである。本発明は、ドナー分子としての光感受性物質およびアクセプター分子としての光活性化物質を含有している脂質膜を提供する。また、この脂質膜を含んでいる細胞増殖抑制剤および光線力学的治療剤を提供する。

Description

光線力学的治療に利用可能な脂質膜およびその利用
　本発明は、光線力学的治療に利用可能な脂質膜およびその利用に関するものであり、より詳細には、異なる波長範囲に吸収極大を有する光感受性物質および光活性化物質を含有する脂質膜およびその利用に関するものである。
　近年、医療分野において光線力学的治療（photodynamic therapy；以下「ＰＤＴ」とも称する。）が注目されている。ＰＤＴは、癌等の治療に用いられる治療法であり、光感受性の物質に光を照射することにより、発生する活性酸素を用いて、癌細胞等を殺傷する治療法である。より具体的には、ＰＤＴでは、光で活性化する物質を投与した患部に光を照射することによって、水および／または酸素の光化学反応により生成する活性酸素（一重項酸素、ヒドロキシラジカル等）を患部にて生成する。生成した活性酸素が、患部の癌細胞の活動および／または増殖を阻害することにより、癌細胞を破壊して死滅させる。
　炭素原子のみからなる閉殻構造を有するフラーレン類は、以下のような独特な性質に基づいて、光の照射により一重項酸素等の活性酸素を効率よく発生する：（１）特異的にπ電子雲が非局在化している、（２）電子親和力が大きい、（３）イオン化エネルギーが比較的小さい、（４）電子受容能が高い、（５）可視光で光励起される。また、フラーレン類は極性溶媒に不溶であるが、フラーレンをポリマー鎖で被覆することによりフラーレンを可溶化する方法、Ｃ６０－シクロデキストリン錯体からリポソーム内へＣ６０を移動させること（交換反応）によりＣ６０含有リポソームを得る方法のような、フラーレン類を水性溶媒に溶解させるための技術がこれまでに開示されている（例えば、特許文献１および２参照）。また、光増感性化合物を含むリポソームを用いて、光照射によって癌組織を治療する技術もまた開示されている（例えば、特許文献３および４参照）。
日本国公開特許公報「特開２００５－２２５７７２号公報（平成１７年８月２５日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００６－６９８１２号公報（平成１８年３月１６日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００６－５６８０７号公報（平成１８年３月２日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００７－２７７２１８号公報（平成１９年１０月２５日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００６－８０３４６号公報（平成１８年３月２３日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００３－３１８３２号公報（平成１５年１月３１日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００４－２２４２４号公報（平成１６年１月２２日公開）」 日本国公開特許公報「特開２００２－８８３５４号公報（平成１４年３月２７日公開）」 国際公開ＷＯ２００７／１３２９２３（２００７（平成１９）年１１月２２日公開）
　波長６００ｎｍ未満の光は細胞内にて吸収されやすいので、適用部位まで光が透過しにくい。皮膚透過性を考慮すると、ＰＤＴに用いる光線は長波長であることが好ましい。しかし、波長７００ｎｍを超える光は水に吸収されやすい。よって、ＰＤＴに用いる光線は、その波長範囲が６００～７００ｎｍであることがより好ましい。特許文献３および４に記載の技術においても、同様の波長範囲が用いられている。しかし、Ｃ６０フラーレンは、その吸収極大が５００～８００ｎｍの範囲外であり、波長範囲が６００～７００ｎｍの光照射に基づいて活性酸素を生成し得ない。また、すでにＰＤＴに適用されている光源として５００～８００ｎｍのレーザ光が用いられているので、Ｃ６０フラーレンを用いたＰＤＴを実施するためには、新たな設備が必要となる。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、波長範囲が５００～８００ｎｍではＰＤＴに利用し得なかった物質を同波長範囲にて利用可能にするための新たな技術を提供することにある。
　電子移動／エネルギー移動を首尾よく行い得る二分子（ドナー分子およびアクセプター分子）が光電変換等に用いられている。本発明者らは、Ｃ６０フラーレンを活性化し得ない波長範囲の光であっても、アクセプター分子としてのＣ６０フラーレンに対して適切なドナー分子を共存させれば、Ｃ６０フラーレンを活性化することができることを期待した。そこで、生体に悪影響を及ぼすことが少ないカロテン（アスタキサンチン）を、Ｃ６０フラーレンとともに含有させたリポソームを用いて、細胞毒性を観察した。しかし、カロテンの存在は、Ｃ６０フラーレンの活性化を導かなかった。この結果により、リポソームは、ドナー分子からアクセプター分子への電子／エネルギー移動を生じさせるに適した環境を提供し得ない（これら二分子は、リポソーム中で電子／エネルギー移動が生じる程度に近接し得ない）ことが示唆された。
　太陽電池の研究分野において、ポルフィリンおよびＣ６０フラーレンが非常に良好なドナー／アクセプターの関係にあることは、以前からよく知られている。例えば、特許文献５には、ポルフィリンとフラーレンの自己組織化を利用した、エネルギー変換効率の高い有機太陽電池が記載されている。本発明者らもまた、このことを利用した光電変換素子用材料を開発している（特許文献６および７参照）。また、特許文献８には、ポルフィリンとフラーレンとが電荷移動状態を形成している二分子固体フィルムからなる近赤外発光材料が記載されている。そこで、本発明者らは、ポルフィリンをＣ６０フラーレンとともに含有させたリポソームを用いて、細胞毒性を観察した。しかし、カロテンの場合と同様に、ポルフィリンをリポソームに共存させてもＣ６０フラーレンが活性化されなかった。また、Ｃ６０フラーレンと共存させることによって、ポルフィリンが元来有している細胞毒性まで低下させてしまった。
　これらの結果を導いた機序は不明である。しかし、非常に良好なドナー／アクセプターの関係にあるポルフィリンとＣ６０フラーレンとの組合せを用いた場合であっても、Ｃ６０フラーレンに基づく細胞毒性が観察されない以上、ドナー／アクセプターの関係を利用した光線力学的治療剤の開発は非常に困難であると考えられた。
　しかし、本発明者らは、独自の着眼点に基づく創意工夫の結果、特定の構造を有する化合物を用いれば、Ｃ６０フラーレンを活性化し得ない波長範囲の光照射下にてＣ６０フラーレンによる細胞毒性を導き得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明に係る脂質膜は、波長範囲５００～８００ｎｍの光照射によって活性酸素を生成し得、５００～８００ｎｍの範囲内の光を吸収し得る光感受性物質、および５００～８００ｎｍの範囲内の光を吸収し得ないかまたは５００～８００ｎｍの範囲内の光の吸収が非常に弱い光活性化物質を含有し、該光活性化物質は、該光照射によって該光感受性物質が生成する第１の光エネルギーを受容して、酸素に供与される第２の光エネルギーを生成し、該光感受性物質は、炭素数８～２０の炭化水素基を２個含んでいることを特徴としている。
　本発明に係る脂質膜は、上記構成の光感受性物質を光活性化物質とともに含有していることにより、波長範囲５００～８００ｎｍの光照射であっても、光感受性物質から光活性化物質への電子／エネルギー移動に基づいて光活性化物質を首尾よく活性化し、細胞毒性を示す活性酸素を生成し得る。本発明における長鎖炭化水素基の炭素数は、１２～１８であることがより好ましく、１２～１６であることがさらに好ましい。
　本発明に係る脂質膜において、上記炭化水素基は直鎖であることが好ましいが、１または数個の分岐があってもよく、１または数個の二重結合があってもよい。
　本発明に係る脂質膜において、上記光活性化物質は、フラーレン、ポルフィリン、オリゴチオフェン、カロテノイドおよびピレンからなる群より選択されることが好ましい。また、本発明に係る脂質膜において、上記光感受性物質は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 として示される化合物であることが好ましい（式中、ｎは１～３であり、Ｒは、Ｃ１２－１８のアルキル基、（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３、または（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨＣＨ２＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３である。）。
　本発明に係る脂質膜は、人工の脂質膜であることが好ましく、膜構造の安定性の観点から脂質二重膜であることがより好ましく、リポソーム形態またはミセル形態であることがさらに好ましい。
　本発明に係る細胞増殖抑制剤は、上記脂質膜を含んでいることを特徴としている。また、本発明に係る光線力学的治療剤は、上記脂質膜を含んでいることを特徴としている。
　本発明を用いれば、ＰＤＴに好ましい波長範囲（６００～７００ｎｍ）において活性化し得ない物質であっても、その波長範囲内で活性化させることができる。よって、本発明は、光照射によって活性酸素を生成し、細胞の活動および／または増殖を阻害し得る。そして、このような性質に基づいて、本発明は、ＰＤＴに利用可能である。
　光線力学的治療剤は、毒性を有する活性酸素を用いている。公知の光増感性化合物をＰＤＴに用いる場合、その毒性が光照射によって制御されているとはいえ、この化合物が分解／代謝されるまで時間を要する。よって、被験者は治療後約一週間にわたって暗所に留まる必要がある。本発明は、可視光領域下で毒性を有していない二化合物から構成されているので、リポソームの分解に伴って両者の近接状態が解かれる。これにより、毒性が体内に残存する可能性が大いに低下し得、光線過敏症を低減し得る。
本発明の一実施形態に係るリポソームが、光照射により細胞死を誘導することを示すグラフである。 本発明の一実施形態に係るリポソームが、光照射により細胞死を誘導することを示すグラフである。 本発明の一実施形態に係るリポソームが、光照射により細胞死を誘導することを示す図である。 本発明の一実施形態に係るリポソームが、光照射により細胞死を誘導することを示すグラフである。 本発明の別の一実施形態に係るリポソームが、光照射により細胞死を誘導することを示すグラフである。
　〔１：脂質膜〕
　本発明は、光活性化物質および光感受性物質を含有している脂質膜を提供する。本発明において、光感受性物質は光活性化物質に光エネルギーを供与するドナー分子であり、光活性化物質はドナー分子からの光エネルギーを受容するアクセプター分子である。本明細書中で使用される場合、「光エネルギーの供与／受容」は、光の受容に直接的または間接的に起因して生成されるエネルギーおよび電子の少なくとも一方の移動が意図される。また、「光エネルギー」は、光の受容に起因して生成されるエネルギーおよび電子の少なくとも一方だけでなく、光エネルギーの供与／受容に起因して生成されるさらなるエネルギーおよび電子の少なくとも一方が意図される。本発明に係る脂質膜は、人工の脂質膜であることが好ましく、膜構造の安定性の観点から脂質二重膜であることがより好ましい。脂質二重膜は、極性脂質（特にリン脂質）が二層となった膜状の構造（脂質二重層）である。脂質二重層構造が二次元構造として安定化するのは球状であるが、末端を水分子から隔離すれば平面構造になり得る。本明細書中で使用される場合、人工的に作製される脂質二重層のうち球状のものをリポソーム、平面状のものを脂質平面膜という。なお、脂質一重層からなるミセルは一般に不安定であるが、特許文献９に記載されているような、ブロック共重合分子（ブロックコポリマー）が形成するミセルであれば安定性がよいことを、当業者は十分認識している。このようなミセルは薬物送達（ＤＤＳ）の手段の一つとして研究されている。
　リポソームは、ベシクルとも称される脂質人工膜であり、脂質（例えば、リン脂質）の懸濁液を分散させた後に超音波処理を施す等によって作製され得る。リポソームを用いた研究は広く行われており、細胞膜モデルとして、または薬物送達（ＤＤＳ）の手段の一つとして利用されている。なお、本発明に係るリポソーム組成物は、光活性化物質および光感受性物質が内包されていてもよいが、光活性化物質および光感受性物質の両方が脂質膜中に埋め込まれていることが好ましい。本明細書中で使用される場合、「埋め込まれている」状態は、対象となる物質の一部または全部が脂質部分に存在する状態が意図され、「（脂質部分に）取り込まれている」状態、「（脂質部分に）刺さっている」状態、または「（脂質部分に）安定に取り込まれている」状態と交換可能に用いられる。
　脂質平面膜は、膜タンパク質（例えば、チャネルタンパク質）の活性をインビトロで測定する際に使用されており、その作製方法も当該分野において周知である。なお、本発明に係る脂質平面膜は、光活性化物質および光感受性物質の両方が脂質膜中に埋め込まれていればよい。
　本発明に係る脂質膜は、５００～８００ｎｍの範囲内の光を吸収し得る光感受性物質、および５００～８００ｎｍの範囲内の光を吸収し得ない光活性化物質を含有していることにより、光照射によって光感受性物質が励起されて第１の光エネルギーを生成し、第１の光エネルギーを光活性化物質が受容して、光活性化物質が励起されて第２の光エネルギーを生成する。そして、第２のエネルギーが酸素に供与されることにより、活性酸素が生成される。このような光エネルギーの供与／受容が首尾よく行われるために、光感受性物質は、長鎖炭化水素基を２個含んでいる。このような構成に基づいて、本発明は、光活性化物質を活性化し得ない波長範囲（５００～８００ｎｍ）の光照射であっても、光活性化物質を活性化することができ、その結果、活性酸素を生成し得る。
　本明細書中で使用される場合、「活性酸素」は、特に限定されないが、例えば、一重項酸素およびヒドロキシラジカルが意図される。
　本明細書中で使用される場合、特定の波長範囲の「光を吸収し得る」は、その波長範囲の「光に対する光活性を有する」、「光によって活性化し得る」と交換可能に用いられる。また、特定の波長範囲の「光を吸収し得ない」は、その波長範囲の「光に対する光活性を有さない」、「光によって活性化し得ない」と交換可能に用いられる。なお、本明細書中で使用される場合、「光活性」は、照射光によって励起されて照射光とは別の光エネルギーを生成する活性が意図され、好ましくは、光の照射により他の物質（例えばアクセプター分子）へ光エネルギーを供与し得る活性が意図される。光感受性物質については、光照射に基づいて光活性化物質に光エネルギーを供与し得る（すなわち光活性化物質を励起し得る）ことが意図され、光活性化物質については、光エネルギーの受容に基づいて酸素に光エネルギーを供与し得る（すなわち活性酸素を生成し得る）ことが意図される。
　本明細書中で使用される場合、「光活性化物質」は、５００～８００ｎｍの範囲内の光を吸収し得ないが、励起された「光感受性物質」からの光エネルギーを受容して、酸素に光エネルギーを供与し得る化合物（すなわち、励起された「光感受性物質」からの光エネルギーに対する光活性を有する化合物）であればよい。
　本発明に係る脂質膜において、上記光活性化物質は、フラーレン、ポルフィリン、オリゴチオフェン、カロテノイドおよびピレンからなる群より選択されることが好ましく、フラーレンおよびポルフィリンがより好ましく、Ｃ６０フラーレン、Ｃ７０フラーレンが特に好ましい。一実施形態において、本発明に係る脂質膜は、光活性化物質としてのＣ６０フラーレン（以下、「Ｃ６０」とも称する。）を含有する脂質膜である。本実施形態において、Ｃ６０は表面が修飾されることなく、脂質膜内に存在している。よって、Ｃ６０が本来有している物性を保持した状態で、Ｃ６０を水性溶媒に可溶化し得、水溶性のＣ６０を用いることが望まれる技術分野に広く用いることができる。また、Ｃ６０は、光の照射により活性酸素を生成することが知られている。本実施形態において、活性酸素の生成効率の観点からは、Ｃ６０が互いに相互作用することなく単独分子で存在していることが好ましいが、複数の分子が会合した状態で存在しても、Ｃ６０の一部の分子のみが会合した状態で存在してもよい。なお、フラーレンをリポソーム中に含有させるには、特許文献２記載の手順に従ってフラーレン・γ－シクロデキストリン錯体を作製し、リポソームと混合した後に、加熱（例えば８０℃で２時間）、マイクロウェーブ照射（例えば５～１０秒間）、または光照射（例えば、ＮＡＤＨ存在下で５～１０時間）を行うことにより、フラーレンを錯体からリポソームへ首尾よく移動させることができる。また、光感受性物質をリポソーム中に含有させるには、リポソームの調製時に光感受性物質を共存させればよい。
　本明細書中で使用される場合、「光感受性物質」は、５００～８００ｎｍの範囲内の光を吸収し得かつ脂質部分に安定に取り込まれる化合物であればよい。本発明において「光感受性物質」が所望の作用を生じる程度に「脂質部分に安定に取り込まれる」ためには、長鎖炭化水素基を２個含んでいる化合物であることが好ましい。また、「光感受性物質」は、好ましくは４００～８００ｎｍ、より好ましくは５００～８００ｎｍ、さらに好ましくは５５０～７５０ｎｍの範囲内に吸収極大を有する化合物である。なお、光感受性物質は、５００～８００ｎｍの範囲内の光に対する光活性を有していれば、上述した波長範囲外にさらなる吸収極大を有していてもよい。
　光感受性物質の長鎖炭化水素基の炭素数は、８～２０であることが好ましく、１２～１８であることがより好ましく、１２～１６であることがさらに好ましい。また、光感受性物質の長鎖炭化水素基は、直鎖であっても、１または数個の分岐があってもよく、さらに１または数個の二重結合があってもよい。当業者は、このような長鎖炭化水素基を適宜合成し得るので、市販の蛍光色素に長鎖炭化水素基を２個付加した光感受性物質を容易に合成し得る。例えば、色素とスクシンイミドとのエステルを、長鎖炭化水素基を２個有するアミンと反応させることによって、本発明に用いる光感受性物質を容易に合成し得る。当業者は上記エステルおよび上記アミンを容易に調製し得、あるいは市販品として容易に入手し得る。Alexa Fluor（登録商標）488スクシンイミジルエステル（Invitrogen社）を用いる場合、このエステルとその１．１当量の３－アミノ－Ｎ，Ｎ－ジドデシルプロパンアミドを窒素雰囲気下にて室温で乾燥ＤＭＳＯ中に溶解し、その溶液を２４時間窒素雰囲気下にて室温で撹拌した後、減圧下溶媒を取り除き、塩化メチレンを加え、その有機相を１ＭＨＣｌ水溶液で３回、１０％ＮａＨＣＯ３溶液で３回、そして飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下にて乾燥し、クロロホルム：メタノールを展開溶媒としてカラムクロマトグラフィーによって精製することによって目的物を得ることができる。反応スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 また、上記目的物と同様の構造を有するローダミン誘導体であるrhodamine DHPE（Invitrogen社）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 を光感受性物質として用いてもよい。なお、合成した光感受性物質の励起波長および発光波長を測定すれば、所望の光活性化物質のドナー分子として利用可能であるか否かを容易に知ることができる。
　本発明に用いる光感受性物質としては、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 として示される化合物（式中、ｎは１～３であり、Ｒは、Ｃ１２－１８のアルキル基、（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３、または（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨＣＨ２＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３である。）であることが好ましく、カルボシアニン色素またはローダミン誘導体がより好ましく、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 からなる群より選択されることがさらに好ましい。
　また、本発明に用いる光感受性物質としては、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 で示されるＢＯＤＩＰＹ誘導体である、BODIPY FL DHPE（正式名：N-(4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt、Invitrogen社）も好ましい。
　本発明に係る脂質膜を構成する脂質の具体的な組成は、特に限定されず、カチオン性脂質、アニオン性脂質、および双極性脂質のいずれか１つまたは任意の組合せであり得る。なお、Ｃ６０を含有している脂質膜は、カチオン性脂質を含有することが好ましく、カチオン性コレステロールを含有することがさらに好ましい。上記構成によれば、光照射により活性酸素を生成するとともに、活性酸素により分解されることのない安定した脂質膜を形成することができる。また、カチオン性脂質を含有させることにより、細胞透過性に優れた脂質膜を提供することができる。活性酸素を生成し、かつ細胞透過性に優れる脂質膜は、ＰＤＴに好適に用いることができる。
　本発明に係る脂質膜を構成するカチオン性脂質として、例えば、１、２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ、Ｎ－ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３β［Ｎ－（Ｎ７，Ｎ’－ジメチルアミノ－エタン）－カルバモイル］コレステロール、ステアリルアミン、Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）ドデシル－Ｄ－グルタメートクロリド、Ｎ－［１－（２，３－オレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ－［１－（２、３－ジミリスチルオキシ）プロピル］－Ｎ、Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパンジオール（ＤＯＤＡＰ）等のカチオン性脂質を挙げることができる。さらに、ホスファチジン酸とアミノアルコールとのエステル、例えばジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）もしくはジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステル等のカチオン性リン脂質を用いることもできる。また、本発明には、下記式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 で表される脂質をカチオン性脂質として好適に用いることができる。このようなカチオン性脂質を用いれば、本発明に係る脂質膜として５０ｎｍ～２００ｎｍの平均粒径を有するリポソームを作製することができる。このような平均粒径を有するリポソームは、ＥＰＲ（Enhanced permeability and retention）効果により癌細胞に選択的にターゲティングさせることができる。このようなリポソームにカチオン性脂質を含有させる場合、その含有量は、全脂質量に対し９０モル％以下であることが好ましく、５０モル％以下であることがより好ましく、２０モル％以下であることがさらに好ましい。
　本発明に係る脂質膜を構成するアニオン性脂質として、例えば、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、卵黄、または大豆のような天然物質由来のホスファチジルグリセロール、完全水素添加ホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファジルグリセロール等の炭素数１０～３０程度の飽和又は不飽和の直鎖状又は分枝状の脂肪酸残基を有するアニオン性リン脂質を挙げることができる。また、本発明には、下記式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 で表される脂質をアニオン性脂質として好適に用いることができる。
　本発明に係る脂質膜がリポソーム形態である場合、上記例示したような脂質のうち、単一の脂質を含むものであってもよいし、複数の脂質を組み合わせて含むものであってもよい。また、複数の荷電脂質（アニオン性脂質またはカチオン性脂質）を組み合わせて含有する場合、負電荷の脂質同士または正電荷の脂質同士を組み合わせて含有することが好ましい。これにより、リポソーム同士が結合し、凝集するのを低減することができる。また、双極性脂質と荷電脂質とを組み合わせて含有する場合、双極性脂質：荷電脂質（モル比）は、２００：１～１：９であることが好ましく、１００：１～１：１であることがより好ましく、４０：１～５：１であることがさらに好ましい。
　本発明に係る脂質膜を構成する双極性脂質としては、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストリルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン、並びにこれらを定法により水素添加したもの（例えば水素添加大豆レシチン等）および水酸化物等のリン脂質を挙げることができる。また、本発明には、下記式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 で表される脂質を双極性脂質として好適に用いることができる。
　カチオン性脂質は、細胞透過性を有することが知られている。そのため、本発明に係る脂質膜を、細胞増殖抑制または光線力学的治療の用途に用いる場合、脂質膜を構成する脂質にカチオン性脂質が含有されていることが好ましい。ただし、カチオン性脂質は、毒性を有することが一般的に知られている。したがって、カチオン性脂質の含有量は、細胞透過性と毒性による副作用とを考慮して決定されるものである。このとき、カチオン性脂質の含有量は、双極性脂質とカチオン性脂質とを組み合わせて用いることによって、調製されることが好ましい。このように、双極性脂質とカチオン性脂質とを組み合わせて用い、カチオン性脂質の含有量を上述した範囲内で適宜変更することにより、良好な細胞透過性を有し、かつ毒性による副作用が低減された脂質膜を製造することができる。
　また、本発明に係る脂質膜は、糖脂質を含有していてもよい。上記糖脂質としては、例えば、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステル等のグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドＧ７、ガングリオシドＧ６、ガングリオシドＧ４等のスフィンゴ糖脂質等を挙げることができる。
　本発明に係る脂質膜は、光感受性物質、光活性化物質および脂質以外の成分を含有していてもよい。具体的には、例えば、膜安定化剤として作用するステロール類を含有していてもよい。上記ステロール類としては、例えば、コレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、またはラノステロール等が挙げられる。また、安定剤として、１－Ｏ－ステロールグルコシド，１－Ｏ－ステロールマルトシドまたは１－Ｏ－ステロールガラクトシドといったステロール誘導体を含有していてもよい。本発明に係る脂質膜がステロール類を含有する場合、その含有量は、脂質全分子に対して０．０５～７０モル％であることが好ましく、０．１～６０モル％であることがより好ましく、０．５～４０モル％であることがさらに好ましい。上記範囲内であれば、リポソームの形成を阻害することなく、リポソーム形態の脂質膜を安定化させることができる。また、脂質膜がコレステロールを含有する場合、コレステロールは、ポリアルキレンオキシド導入用のアンカーにもなり得る。ポリオキシアルキレン鎖の先端には、種々の機能性物質を共有結合により固定化することができる。
　また、本発明に係る脂質膜は、グリコール類を含有していてもよい。上記グリコール類としては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリメチレングリコール、１，４－ブタンジオール等を挙げることができる。また、その含有量は、本発明に係る脂質膜の全脂質に対して０．０１～２０モル％であることが好ましく、０．５～１０モル％であることがより好ましい。上記構成によれば、リポソーム形態の脂質膜の内側に、水溶性の物質を効率よく保持させることができる。また、本発明に係る脂質膜は、負荷電物質であるジセチルホスフェートといったリン酸ジアルキルエステルや、正電荷を与える化合物としてステアリルアミン等の脂肪族アミン等を含有していてもよい。
　さらに、本発明に係る脂質膜は、その粒子表面に、特定の機能を付与するための置換基を有していたり、特定の機能を付与するための分子が付加もしくは挿入されたりしていてもよい。上記置換基および分子としては、例えば、本発明に係る脂質膜を生体に投与した場合に、特定の臓器や組織にターゲティングさせるための置換基および分子、並びに本発明に係る脂質膜の安定性を向上させるための置換基および分子等を挙げることができる。より具体的には、リポソーム形態の脂質膜の安定性を向上させるための分子として、例えば、高分子鎖であるポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）基（ポリオキシアルキレン鎖）または類似の基を有するリン脂質または化合物を挙げることができる。ＰＡＯ基またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖をリポソーム表面に付けることにより、リポソームの安定性を向上させることができる。また、－（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n－ＨであらわされるＰＥＧ基のオキシエチレン単位の長さと導入する割合を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。ＰＥＧ基としては、オキシエチレン単位が１０～３５００のＰＥＧ基であることが好ましく、オキシエチレン単位が１００～２０００のＰＥＧであることがより好ましい。本発明に係る脂質膜がＰＥＧを含有する場合、その含有量は、本発明に係る脂質膜の全脂質に対して０．０１～３０モル％であることが好ましく、０．１～１５モル％であることがより好ましい。なお、本発明に係る脂質膜のＰＥＧ化には、従来公知のリポソームのＰＥＧ化技術を用いることができる。
　また、本発明に係る脂質膜が－（ＡＯ）n－Ｙ（式中、ＡＯは炭素数２～４のオキシアルキレン基を表し、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数を表し、Ｙは、水素原子、アルキル基または機能性官能基を表す。）で表されるＰＡＯ基を有する場合、上記式中、ｎは、１～２０００であることが好ましく、１０～５００であることがより好ましく、２０～２００であることがさらに好ましい。上記炭素数２～４のオキシアルキレン基としては、例えばオキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシ－１－エチルエチレン基、オキシ－１，２－ジメチルエチレン基等を挙げることができる。
　また、上記式のｎが２以上の場合、オキシアルキレン基は、同一のものであってもよいし、異なるものであってもよい。異なるものである場合、ランダム状に付加されても、ブロック状に付加されてもよい。また、ＰＡＯ基に親水性が付与される場合、オキシアルキレン基としてはエチレンオキシドが単独で付加されていることが好ましく、さらに、上記式のｎが１０以上であることがより好ましい。また種類の異なるアルキレンオキシドが付加される場合、エチレンオキシドが２０モル％以上付加されることが好ましく、５０モル％以上付加されることがより好ましい。ＰＡＯ基に親油性が付与される場合、エチレンオキシド以外のオキシアルキレン基の付加モル数が多いことが好ましい。例えば、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドとのブロック共重合物であることが好ましい。
　また、上記式のＹのアルキル基としては、炭素数１～５の脂肪族炭化水素基（分岐していてもよい）を挙げることができる。上記「機能性官能基」とは、ＰＡＯ基の先端に糖、糖タンパク質、抗体、レクチン、細胞接着因子といった「機能性物質」を付加するための置換基が意図される。具体的には、例えば、アミノ基、オキシカルボニルイミダゾール基、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド基といった反応性に富む置換基が挙げられる。先端に上記機能性物質が結合したＰＡＯ基が固定化された脂質膜は、ＰＡＯ基の効果に加えて、上記機能性物質の機能、例えば癌組織指向性または癌細胞認識性といった「認識素子」としての効果を有する。また、本発明に係る脂質膜がＰＡＯ基を有するリン脂質または化合物を含有する場合、リン脂質または化合物は、単一種であっても、複数種の組合せであってもよい。また、その含有量は、本発明に係る脂質膜の全構成成分の０．００１～５０モル％であることが好ましく、０．０１～２５モル％であることがより好ましく、０．１～１０モル％であることがさらに好ましい。また、本発明に係る脂質膜へのＰＡＯ基の導入は、従来公知の技術を用いて行うことができる。
　本発明に係る脂質膜がリポソーム形態にて提供される場合、リポソームの大きさは、本発明に係る脂質膜の用途に応じて、適した大きさに設計されればよく、特に限定されない。例えば、本発明に係る脂質膜を向腫瘍性治療薬として用いて、ＥＰＲ効果によって癌組織へ選択的にリポソーム形態にて本発明に係る脂質膜をターゲティングさせる場合、リポソームの平均粒径は、５０ｎｍ～２００ｎｍであることが好ましく、６０ｎｍ～２００ｎｍであることがより好ましく、特に７０ｎｍ～１５０ｎｍであることがさらに好ましい。また、局所化学療法として、癌病巣近傍の血管までカテーテルを介してリポソームを直接適用する場合、リポソームの平均粒径は、５００ｎｍ～１.０μｍであることが好ましく、７００ｎｍ～９００ｎｍであることがより好ましく、７５０ｎｍ～８５０ｎｍであることがさらに好ましく、８００ｎｍ前後であることが特に好ましい。上記平均粒径であれば、カテーテルから透過性が増した栄養動脈中に放出されても、癌組織に通じるその血管の壁孔から漏出することなく、標的の癌組織に、リポソームを直接到達させることができる。
　本発明に係る脂質膜に含有される光活性化物質の含有量は、特に限定されず、当業者は本発明に係る脂質膜における光活性化物質の含有量を適宜変更し得る。光活性化物質の含有量を変更することで、脂質膜の性質を変化させることができる。より具体的に説明すると、脂質膜にて光活性化物質が会合している場合、光活性化物質の含有量を変更することにより、脂質膜での光活性化物質の会合状態が変化する。そのため、単に光活性化物質の含有量が変化したことによる性質の変化に加えて、会合状態の変化による性質の変化が期待される。したがって、脂質膜における光活性化物質の含有量は、脂質膜の用途によって、適宜変更することが好ましい。例えば、脂質膜がＰＤＴ用途に用いられる場合、全脂質に対して０．１～２０モル％の光活性化物質が含有されることが好ましく、０．５～１５モル％の光活性化物質が含有されることがより好ましい。このような構成とすれば、脂質膜１分子当たりの光照射による活性酸素生成量を増加させることができる。それゆえ、少量の脂質膜で、ＰＤＴの効果を得ることができる。
　本発明に係る脂質膜は、上述したような構成を備えているため、水性溶媒に対して可溶である。また、平均粒径、光感受性物質および光活性化物質の含有量、脂質の組成、ならびにその他の成分の添加により、脂質膜の物性を制御することができる。それゆえ、本発明に係る脂質膜は、その物性に応じて、様々な用途に用いることができる。具体的には、本発明に係る脂質膜は、波長が５００～８００ｎｍの光による励起によっても、多くの活性酸素を生成することができる。それゆえ、このような脂質膜は、ＰＤＴ、殺菌、滅菌等の用途に好適に用いることができる。また、ＤＮＡを切断するための用途、例えば、研究用試薬としても用いることができる。
　〔２：脂質膜を含む組成物〕
　本発明はまた、本発明に係る脂質膜を含んでいる組成物を提供する。本発明に係る組成物は、上述した脂質膜を含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されず、例えば、脂質膜が水性溶媒に溶解した溶液もまた本発明に係る組成物に含まれる。以下、本発明に係る組成物の一実施形態として、光線力学的治療剤および細胞増殖抑制剤について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（Ａ）光線力学的治療剤
　本実施形態に係る組成物は、光照射、好ましくは、波長範囲が５００～８００ｎｍの光照射、より好ましくは、波長範囲が６００～７００ｎｍの光照射により、活性酸素を生成する脂質膜を含んでいる。具体的には、上述した光活性化物質および光感受性物質を含有し、カチオン性脂質を含む脂質膜であることが好ましい。好ましいカチオン性脂質としては、例えば、上述したカチオン性脂質が挙げられるが、特に、上記式（１）で表される脂質が好ましい。また、その含有量は、全脂質量の１～５０モル％であることが好ましく、１０モル％であることがより好ましい。
　また、本実施形態に係る組成物において、脂質膜は、カチオン性脂質に加えて双極性脂質を含むことが好ましい。好ましい双極性脂質としては、例えば、上述した双極性脂質が挙げられるが、特に、上記式（３）で表される脂質が好ましい。その含有量は、全脂質量の５０～９９モル％であることが好ましく、９０モル％であることがより好ましい。１つの局面において、本実施形態に係る組成物に含まれる脂質膜は、全脂質量に対して、上記式（１）で表される脂質を１０モル％、上記式（３）で表される脂質を９０モル％含み得る。
　本実施形態に係る組成物における脂質膜の含有量は、特に限定されないが、２～２０モル％であることが好ましく、５～１５モル％であることがより好ましい。また、本実施形態に係る組成物では、脂質膜以外に、薬学的に受容可能な成分をさらに含んでいてよい。薬学的に受容可能な成分としては、例えば、緩衝剤、キレート化剤、薬理的活性物質（例えば血管拡張剤、凝固抑制剤等）、さらには浸透圧調節剤、安定化剤、抗酸化剤（例えばα‐トコフェロール、アスコルビン酸）、粘度調節剤、保存剤等が挙げられる。浸透圧調節剤としては、例えば、生理食塩水（０．９％食塩水）が挙げられる。また、ｐＨ緩衝剤としては、アミン系緩衝剤および炭酸塩系緩衝剤が挙げられる。
　本実施形態に係る組成物は、光線力学的治療剤として用いることができる。その場合、本実施形態に係る組成物を投与する方法は特に限定されるものではなく、例えば、治療すべき患部に対して皮下注射、静脈注射、外科的手段等によって投与することができる。また、本実施形態に係る組成物を光線力学的治療剤として用いる場合、組成物を投与した後、患部を一定時間、光に曝露しない環境に置いたのちに、患部に対して一定時間の光を照射する。この際、光の波長は特に限定されるものではないが、５００～８００ｎｍであることが好ましく、６００～７００ｎｍであることがより好ましい。このような波長の光は皮膚透過性が優れているので、患部に効率よく光を照射することができる。また、光を照射する方法は特に限定されず、例えば、人工拡散光源、レーザ等各種の光源が用いられ得る。好ましい光源としては、より具体的には、ハロゲン灯、キセノン灯、メタルハライド灯等が挙げられる。特に、可視光に強い放射強度スペクトルを持つ光源としてメタルハライド灯が好ましい。また、光源としてＬＥＤや有機ＥＬ素子等の発光素子も利用可能である。
　また、本実施形態に係る組成物を光線力学的治療剤として用いる場合、その治療対象は特に限定されない。例えば、本実施形態に係る組成物は、癌細胞、加齢黄斑変性症、粥状動脈硬化病変、関節リウマチ病変、難治性疣贅、尋常性座瘡、およびパピロマーウイルスに対する治療に適用可能である。特に、癌細胞、および加齢黄斑変性症の治療に好適に用いられる。癌細胞の種類は特に限定されず、本実施形態に係る組成物は、各種の癌細胞に対して用いられる。また、加齢黄斑変性症は、色を識別する細胞を持つ網膜の黄斑と呼ばれる部分が加齢に伴い変化する疾患であるが、本実施形態に係る組成物は、加齢黄斑変性症の中でも、脈絡新生血管を伴う「滲出型」の加齢黄斑変性症の治療に好適に用いられ得る。
　（Ｂ）細胞増殖抑制剤
　本実施形態に係る組成物は、光照射、好ましくは、波長範囲が５００～８００ｎｍの光照射、より好ましくは、波長範囲が６００～７００ｎｍの光照射により、活性酸素を生成する脂質膜を含んでいる。本実施形態に係る組成物における脂質膜の含有量は、特に限定されないが、光照射により脂質膜が生成する活性酸素により細胞の増殖を抑制することができる程度の量であればよい。適用対象の細胞としては特に限定されないが、微生物等であってもよく、この場合、本実施形態に係る組成物は、抗菌剤または殺菌剤であり得る。また、本実施形態に係る組成物の具体的な使用方法は、特に限定されるものではないが、例えば、本実施形態に係る組成物を散布し、散布した領域を自然太陽光に曝すか、もしくは人工光源によって一定時間光照射する。人工光源によって照射する場合は、紫外光をフィルター等でカットした光を照射することが好ましい。
　また、本実施形態に係る組成物を用いて殺菌を行う場合、殺菌対象となる微生物は特に限定されず、本実施形態に係る組成物を、例えば、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌等の細菌に対する殺菌あるいは抗菌に用いることができる。
　なお、本実施形態に係る組成物の形状は特に限定されるものではなく、粉末状、バルク状、ペースト状、溶液状、分散液状、膜状、あるいはゲル状等であり得る。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
　〔実施例１〕
　〔１〕Ｃ６０・γ－シクロデキストリン（γＣＤ）錯体水溶液の調製
　５．０ｍｇのＣ６０と３５．８ｍｇのγＣＤを、高速振動粉砕法（３０Ｈｚ，２０分間）によって混合した後、０．９％ＮａＣｌ水溶液１．５ｍｌを加えて抽出した。不溶なフラーレンを遠心分離（１８０００×ｇ，２０分間）により沈降させ、上清を回収した後、メンブランフィルタ（０．２μｍ）を用いて濾過した。濃度を、紫外－可視光吸収スペクトルにより決定し、０．２ｍＭとなるように希釈した（ε３３２ｎｍ＝４．２７×１０４ｃｍ－１ｍｏｌ－１ｄｍ３）。
　〔２〕カルボシアニン色素を含有するカチオン性リポソームの調製
　双極性脂質（ＤＭＰＣ）／ＣＨＣｌ３　３．６μｍｏｌ、カチオン性脂質（Ｎ＋Ｃ５Ａｌａ２Ｃ１６）／ＣＨＣｌ３　０．４μｍｏｌ、カルボシアニン色素（１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドカルボシアニンパークロレート（「ＤｉＩ」；ＤｉＩＣ１８（３））、１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドジカルボシアニンパークロレート（「ＤｉＤ」　ｏｉｌ；ＤｉＩＣ１８（５）　ｏｉｌ）、または１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドトリカルボシアニンアイオダイド（「ＤｉＲ」；ＤｉＩＣ１８（７））（いずれもInvitrogen社））／ＥｔＯＨ　０．１μｍｏｌ（２．５％）を混合し、Ｎ２ガスで薄膜を形成した。この薄膜を、３５℃で１時間減圧乾燥した後、０．９％ＮａＣｌ水溶液　１ｍｌを加え、ボルテックスミキサーで撹拌した。エクストルーダーを用いて、孔径５０ｎｍのメンブレンフィルターに１１回通すことで、リポソーム溶液（脂質濃度４ｍＭ）を調製した。また、カルボシアニン色素を混合せずに、カチオン性リポソームを同様に調製した。なお、用いたカチオン性脂質は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 で示され、双極性脂質は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 で示され、カルボシアニン色素は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 で示される化合物である。
　〔３〕Ｃ６０フラーレンのリポソームへの交換反応
　上述したリポソーム溶液（カルボシアニン色素あり／なし）を、脂質濃度２ｍＭとなるように希釈し、上述した０．２ｍＭ　γＣＤ－Ｃ６０錯体水溶液とを等量ずつ混合し、８０℃で１時間加熱攪拌することによって、Ｃ６０フラーレンの交換反応を行った。
　〔４〕細胞のリポソーム処理および光照射実験
　ＨｅＬａ細胞を２．１３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。培養後の細胞に、各リポソーム溶液を、脂質の最終濃度が５０μＭとなるように添加し、２４時間インキュベートして細胞にリポソームを取り込ませた。２４時間後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、培地を再度加えた後に２５℃のインキュベータに細胞を移し、光照射（照射波長：５００～７４０ｎｍ）を行なった。光照射２４時間後に顕微鏡下で観察し、位相差像を撮影した。細胞生存率は、シャーレ中の細胞をトリプシン処理により回収し、０．２５％（Ｗ／Ｖ）トリパンブルーにより死細胞を染色した後、生存細胞数を血球計算盤上で算出する手法、またはＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を用いて算出した。
　結果を図１に示す。図１の左側は、光照射なしの状態での細胞生存率を示すグラフであり、光照射がない場合は各リポソーム溶液に細胞毒性がないことを示している。図１の右側は、１５分間光照射した場合の細胞生存率を示すグラフであり、Ｃ６０とＤｉＩまたはＤｉＤとの組合せにおいて細胞毒性を観察した。特に、Ｃ６０とＤｉＩとの組合せにおいて顕著な細胞毒性を観察した。
　光照射の時間をさらに延長した場合の、ＤｉＤおよびＤｉＲの効果を調べた結果を、図２に示す。１５分間の光照射ではＣ６０とＤｉＲとの組合せにおいて細胞毒性が観察されなかったが、照射時間を延長することにより、ＤｉＲもまた、ＤｉＩおよびＤｉＤと同様の効果を示すことがわかった。
　３０分間の光照射の２４時間後における細胞について、位相差顕微鏡による全細胞の観察（図３）および細胞生存率の算出（図４）を行ったところ、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８による結果と同様に、ＤｉＩ、ＤｉＤおよびＤｉＲのいずれもＣ６０と組み合わせることにより細胞死を誘導することがわかった。また、カルボシアニン色素の代わりにrhodamine DHPE（Invitrogen社)やBODIPY FL DHPE（Invitrogen社)を用いた場合にも、同様の結果が観察された（結果は示さず）。
　なお、上述した色素の代わりに、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 で示されるアスタキサンチン（A9335-250MG; Aldrich）を脂質分子の２．５モル％含有させて、同様の実験を行ったところ、Ｃ６０およびアスタキサンチンを単独または組み合わせて用いた場合、いずれの場合においても細胞死が全く観察されなかった（結果は示さず）。また、上述した色素の代わりに、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 で示されるプロトポルフィリンＩＸ（P8293-1G; Aldrich）を脂質分子の２．５モル％含有させて、同様の実験を行ったところ、プロトポルフィリンＩＸ単独で用いても細胞に対して毒性を示すが、Ｃ６０と組み合わせて用いた場合には、その毒性がほとんど消滅した（結果は示さず）。このように、アスタキサンチンおよびプロトポルフィリンＩＸは、本発明における光感受性物質として機能し得ないことがわかった。
　〔実施例２〕
　〔１〕Ｃ７０・γ－シクロデキストリン（γＣＤ）錯体水溶液の調製
　５．０ｍｇのＣ７０と６０ｍｇのγＣＤを、高速振動粉砕法（３０Ｈｚ，２０分間）によって混合した後、０．９％ＮａＣｌ水溶液１．５ｍｌを加えて抽出した。不溶なフラーレンを遠心分離（１８０００×ｇ，２０分間）により沈降させ、上清を回収した後、メンブランフィルタ（０．２μｍ）を用いて濾過した。濃度を、紫外－可視光吸収スペクトルにより決定し、０．２ｍＭとなるように希釈した（ε３８０ｎｍ＝３．８０×１０４ｃｍ－１ｍｏｌ－１ｄｍ３）。
　〔２〕カルボシアニン色素を含有するカチオン性リポソームの調製
　双極性脂質（ＤＭＰＣ）／ＣＨＣｌ３　３．６μｍｏｌ、カチオン性脂質（Ｎ＋Ｃ５Ａｌａ２Ｃ１６）／ＣＨＣｌ３　０．４μｍｏｌ、カルボシアニン色素（１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドジカルボシアニンパークロレート（「ＤｉＤ」　ｏｉｌ；ＤｉＩＣ１８（５）　ｏｉｌ）、Invitrogen社）／ＥｔＯＨ　０．１μｍｏｌ（２．５％）を混合し、Ｎ２ガスで薄膜を形成した。この薄膜を、３５℃で１時間減圧乾燥した後、０．９％ＮａＣｌ水溶液　１ｍｌを加え、ボルテックスミキサーで撹拌した。エクストルーダーを用いて、孔径５０ｎｍのメンブレンフィルターに１１回通すことで、リポソーム溶液（脂質濃度４ｍＭ）を調製した。
　〔３〕Ｃ７０フラーレンのリポソームへの交換反応
　上述したリポソーム溶液を、脂質濃度２ｍＭとなるように希釈し、上述した０．２ｍＭ　γＣＤ－Ｃ７０錯体水溶液とを等量ずつ混合することで、Ｃ７０フラーレンの交換反応を行った。
　〔４〕細胞のリポソーム処理および光照射実験
　ＨｅＬａ細胞を２．１３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で48 well plateに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。培養後の細胞に、各リポソーム溶液を、
Ｃ７０の濃度が０．５～２０μＭ（ＤｉＤ＝０．１２５～５μＭ）となるように添加し、２４時間インキュベートして細胞にリポソームを取り込ませた。２４時間後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、培地を再度加えた後に２５℃のインキュベータに細胞を移し、光照射（照射波長：６１０～７４０ｎｍ、１７ｍＷｃｍ－２、３０分）を行なった。光照射２４時間後、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８を用いて細胞の生存率を算出した。結果を図５に示す（ＤｉＤ－Ｃ７０」参照）。
　なお、〔実施例１〕の〔１〕－〔３〕の方法と同様の操作により得られた、Ｃ６０を含むリポソーム溶液を用いて〔実施例２〕の〔４〕と同様の操作を行い、細胞の生存率を算出した（図５中、「ＤｉＤ－Ｃ６０」参照）。また、上述と同様の操作を行い、ＤｉＤのみをリポソームに含むリポソーム溶液を作製し、細胞の生存率を算出した（図５中、「ＤｉＤ」参照）。更には、上述と同様の操作を行い、Ｃ７０のみをリポソームに含むリポソーム溶液を作製し、細胞の生存率を算出した（図５中、「Ｃ７０」参照）。
　図５に示すように、ＤｉＤおよびＣ７０を含むリポソームと、ＤｉＤおよびＣ６０を含むリポソームとは、低い濃度から光照射により細胞死を誘起できることが確認できた。特に、ＤｉＤおよびＣ７０を含むリポソームは、ＤｉＤおよびＣ６０を含むリポソームに比べより低い濃度から光照射により細胞死を誘起できることが確認できた。
　本発明は、医療分野において注目されている光線力学的治療に関する新たな技術を提供するので、医薬関連分野および研究ツールの開発に大いに寄与する。

Claims (7)

  1. 　波長範囲５００～８００ｎｍの光照射によって活性酸素を生成し得る脂質膜であって、
    　５００～８００ｎｍの範囲内の光を吸収し得る光感受性物質、および５００～８００ｎｍの範囲内の光を吸収し得ないかまたは５００～８００ｎｍの範囲内の光の吸収が非常に弱い光活性化物質を含有し、
    　該光活性化物質は、光照射によって該光感受性物質が生成する第１の光エネルギーを受容して、酸素に供与される第２の光エネルギーを生成し、
    　該光感受性物質は、炭素数８～２０の炭化水素基を２個含んでいることを特徴とする脂質膜。
  2. 　上記炭化水素基が、直鎖であることを特徴とする請求項１に記載の脂質膜。
  3. 　上記光活性化物質が、フラーレン、ポルフィリン、オリゴチオフェン、カロテノイドおよびピレンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の脂質膜。
  4. 　上記光感受性物質が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、ｎは１～３であり、Ｒは、Ｃ１２－１８のアルキル基、（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３、または（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨＣＨ２＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３である。）
    として示される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の脂質膜。
  5. 　リポソーム形態であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の脂質膜。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の脂質膜を含んでいることを特徴とする細胞増殖抑制剤。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の脂質膜を含んでいることを特徴とする光線力学的治療剤。
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