WO2009115288A1 - Thiostrepton probe - Google Patents

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WO2009115288A1
WO2009115288A1 PCT/EP2009/001949 EP2009001949W WO2009115288A1 WO 2009115288 A1 WO2009115288 A1 WO 2009115288A1 EP 2009001949 W EP2009001949 W EP 2009001949W WO 2009115288 A1 WO2009115288 A1 WO 2009115288A1
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WO
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radical
molecular probe
general formula
phenyl
probe according
Prior art date
Application number
PCT/EP2009/001949
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French (fr)
Inventor
Hans-Dieter Arndt
Sebastian Schoof
Sascha Baumann
Original Assignee
Technische Universität Dortmund
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to compounds of the general formula (I)
  • Thiopeptide natural compounds such as thiostrepton, nosiheptide or nocathiacin are potent inhibitors of protein biosynthesis, which exert their effect by sub-nM binding at the so-called GTPase center of the ribosome.
  • GTPase center of the ribosome So far, all prokaryotic ribosomes, but also ribosomes from protozoa (eg plasmodia, toxoplasma) and the cell organelles of higher multicellular organisms (eg eukaryotic mitochondria) are known as thiopeptide-sensitive. but not the cytoplasmic ribosomes in eukaryotes. So far, no active ingredients in human therapy, which use this principle of action, as well as no methods known to find such agents specifically.
  • HTS high-throughput screening
  • HCS high-content screening
  • This object is achieved by providing the compounds listed below, as by attaching functional molecular entities such as e.g. fluorescent dyes to thiopeptides such as e.g. Thiostrepton, with the help of organic chemical synthesis, it is possible to produce compounds from thiostrepton, which show an exceptionally high affinity to the complex of ribosomal RNA and the ribosomal protein L11, which is essential for the effect.
  • Such compounds are stable, highly affine, and selective, and are particularly useful as molecular probes for a variety of molecular biology, biochemical, and biophysical test methods, i.a. for the discovery of antibiotic agents or for the characterization of ribosome complexes, in particular of eukaryotic ribosome complexes.
  • n is 0 or an integer equal to 1 or 2, preferably 1 or 2
  • Nitrogen atom is present as a ring member
  • R 1 and R 2 each independently of one another, represent a radical of the general formula (L) or (M)
  • X is a saturated or unsaturated, linear or branched, aliphatic hydrocarbon radical having 1 to 18 carbon atoms, which is unsubstituted or optionally with 1, 2, 3, 4 or 5 substituents, independently selected from the group consisting of -F 1 -Cl, -Br 1 -I 1 -CN 1 -NO 2 , -OH 1 -CH 2 -CN, -SH 1 -NH 2 , -S-CH 3 , -SC 2 H 5 , -S-phenyl, -S-CH 2 -phenyl, -O-CH 3 , -O-C 2 H 5 .
  • p is an integer from 1 to 8
  • n O or an integer from 1 to 8
  • C is hydrogen or an aliphatic carboxyl radical
  • FL stands for a fluorescent dye residue, their corresponding salts or solvates, their stereoisomers, racemates, enantiomers or mixtures of the enantiomers in any ratio,
  • B is a radical (BII) or A is a radical (All),
  • (hetero) cycloalkylene as used herein includes cyclic, saturated hydrocarbon chains.
  • suitable cycloalkylene radicals include cyclopropylene, cyclobutylene, cyclopentylene and cyclohexylene.
  • X is a hydrocarbon radical which is selected from the group consisting of "methylene, ethylene, n-propylene, / so-propylene, n-butylene, / so-butylene, 2-butylene, tert-butylene, pentylene, hexylene, heptylene , Octylene, nonylene and decylene, where the abovementioned hydrocarbon radicals are saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or optionally having 1, 2, 3, 4 or 5 substituents independently of one another selected from the group consisting of -F, -Cl, - Br, -I 1 -CN, -NO 2 , -OH, -CH 2 -CN, -SH 1 -NH 2 , -S-CH 3 , -SC 2 H 5 , -S-phenyl, -S-CH 2 phenyl, -0-CH3, -0-C 2 H 5, -O-C 3
  • p is an integer from 1 to 3
  • n is 0 or an integer from 1 to 3
  • C is hydrogen or an acyl radical, preferably hydrogen
  • FL stands for a fluorescent dye residue.
  • Particularly preferred compounds of the general formulas (I) - (V) given above are compounds in which R 1 and R 2 , in each case independently of one another, represent a radical of the formula (L1) or (M1)
  • fluorescent dye moiety is selected from the group comprising fluorescein, Alexa Fluor 488, eosin yellowish, eosin bluish, phloxine, erythrosine, rose bengal, rhodamine , Rhodamine Green, Hydroxycumarin, Benzofuran, Texas Red, Oregon Green 488, Biman, NBD, dansyl, Dabsyl, Bodipy, Phycoerythrin, Cyanine Fluorophore Cy3 TM, Cy5 TM, Xanten and a dye moiety of Formula Z
  • Such fluorescent dyes are generally known to the person skilled in the art and are commercially available.
  • Another aspect of the present invention relates to a probe of the above-mentioned general formulas (I) - (V) 1 preferably for use as listed below.
  • Ribosomes are complexes of proteins and ribonucleic acids (RNA), which among other things in the cytoplasm of the cells of living things as well as in cell organelles such as the Mitochondria occur. Ribosomes are composed of two subunits, a large subunit that links the amino acids to the chain in protein biosynthesis (peptidyltransferase activity), and a small subunit responsible for mRNA recognition. Both prokaryotes and eukaryotes have ribosomes, but these differ from each other.
  • the molecular probes according to the invention have a high affinity for both prokaryotic and eukaryotic ribosome complexes, which is why such molecular probes allow a characterization and / or a diagnosis of ribosomes in prokaryotes and / or in eukaryotes, wherein a characterization and / or a diagnosis of ribosomes in eukaryotes is particularly preferred.
  • Characteristics of the molecular probes according to the invention are further allowed to characterize and / or diagnose ribosome subtypes in eukaryotes, in particular mitochondrial, cytoplasmic or pre-ribosomes.
  • Terms such as “mitochondrial ribosomes”, “cytoplasmic ribosomes” or “pre-ribosomes” are generally known and familiar to the person skilled in the art.
  • substance testing methods are used to find drugs, including the testing of large molecule libraries to find those substances that later serve as a lead for further development.
  • substance testing methods are preferably cellular, biochemical, molecular biological or biophysical and, according to the number of substances to be tested, under the terms high-throughput (HTS), medium throughput (MTS), low-throughput (LTS), and / or high-content screening (HCS).
  • HTS high-throughput
  • MTS medium throughput
  • LTS low-throughput
  • HCS high-content screening
  • HTS HTS, MTS and LTS
  • biochemical, molecular biological, cellular and biophysical test procedures are usually performed in microtiter plates in a few micro / nanoliter sample volumes which, with a desired biological effect, result in a color change or fluorescence which can be rapidly and accurately quantified.
  • the technique of HTS, MTS and LTS is well known to those skilled in the art.
  • HCS testing methods include, for example, ImageXpress ULTRA (Molecular Devices, Union City, USA), Pathway 855 and 435 (BD Biosciences), OPERA (Evotec Technologies, Hamburg, DE), Incell 1000 and 3000 ( GE / Amersham Biosciences,shire, UK), Arrayscan (Cellomics), Scanalyzer (Scanalyzer LemnaTec) and ImageXpress MICRO (Molecular Devices).
  • the HCS substance testing methods are preferably carried out with the molecular probe according to the invention on at least one of these devices.
  • the term "High Content Screening" is well known to those skilled in the art.
  • biochemical, cellular, molecular biological or biophysical substance testing methods for finding active substances, as well as in substance test methods for finding active ingredients in high molecular weight.
  • Throughput, medium throughput, low-throughput, and / or high-content screening assays where the term "assay” in the sense of the description is to be understood as meaning a standardized reaction sequence for detecting a substance with a specific method.
  • the molecular probe according to the invention binds with high affinity to the ribosomal GTPase center, it is possible with the aid of this probe to perform a quantification of binding parameters of ligands of the ribosomal GTPase center using appropriate measurement methods.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of a molecular probe as described above for the quantification of binding parameters of ligands of the ribosomal GTPase center.
  • the molecular probe of the present invention binds to ribosome complexes with high affinity
  • another aspect of the present invention relates to its use for finding agents that are inhibitors of protein biosynthesis, in particular for finding antibacterial agents and / or unicellular parasitic agents, such as for example, Plasmodium falciparum or Toxoplasma ghondii, and generally against bacterial pathogens, such as S. aureus, M. tuberculosis, Enterococci, streptococci (all Gram-positive), pseudomonads, Acitenobacter or Klebsiella (gram-negative).
  • Ribosome staining reagents are not yet commercially available, but have a wide range of uses in basic biological and clinical research (cell and tissue microscopy) as well as a large application potential in clinical diagnostics. Because of their exceptionally high affinity for ribosome complexes, the molecular probes according to the invention are particularly suitable for selectively staining thiopeptide-sensitive ribosomes, preferably of eukaryotes, in cells and tissues.
  • a further aspect of the present invention therefore relates to the use of a molecular probe according to the invention as described above as a fluorescence marker of ribosome complexes, for detecting the inhibition of the ribosomal GTPase center, as well as in fluorescence microscopy methods.
  • a further aspect of the present invention relates to a process for the preparation of the compounds of the abovementioned general formula (I) - (V), comprising the steps:
  • a suitable solvent preferably an organic solvent, more preferably a polar, organic solvent, and then adding an amine, preferably an aliphatic amine, preferably at a temperature between -8O 0 C and 100 0 C, more preferably from -2O 0 C to 2O 0 C and then removing the solvent and optionally cleaning / isolating the compound obtained;
  • radicals FL and X have the abovementioned meaning.
  • the starting compounds in particular the fluorescent dyes, are commercially available or can be prepared by the customary processes known to the person skilled in the art.
  • the intermediate and end products obtained according to the above-described reactions can each be purified and / or isolated, if desired and / or required, by customary methods known to those skilled in the art. Suitable purification methods are, for example, extraction methods and chromatographic methods, such as column chromatography or preparative chromatography.
  • RNA The synthesis of 58 nt fragments (1051-1108) of the Escherichia coli wild-type or mutated 23S rRNA was carried out by means of in vitro transcription (T7 RNA polymerase; MEGAscript Kit, Ambion).
  • the carrier vector for the DNA template was the pUC 19 vector system.
  • RNA products were purified by PAGE and gel filtration. PAGE and gel filtration are standard methods of molecular biology. The 2'-O-methyl-A1067 fragment was obtained from Dharmacon.
  • the DNA ORF from Thermus thermophilus and Escherichia coli coding for the L11 protein was heterologously overexpressed in E. coli using the pQE30 Xa vector system as N-terminal His 6 fusion protein.
  • the purification was carried out by means of Ni 2+ -NTA affinity chromatography and subsequent gel filtration. Such methods for cloning, protein expression and purification are well known to those skilled in the art.
  • Example Compound 1 (Compound 1) shown above in a reaction buffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 2 % TFE) with varying amounts of RNA (10 ⁇ M max.) And fluorescence anisotropy change after 15 min. Incubation determined.
  • RNA / protein / example compound 1 is taken into account.
  • the following formula was used to determine the probe affinity:
  • Example Compound 1 To determine the affinity of Example Compound 1, the same experimental conditions were used as in point I.2. selected. In contrast to the point 1.2. however, the corresponding protein from E. coli was used instead of T. thermophilus.
  • Example compound 1 also binds to E.coli 23S rRNA complexes with E. coli L11 protein, the K 0 being about 540 pM (see fit of the above equation).
  • 10 nM example compound 1 10 nM RNA and 0.6 uM protein are for about 10 min. in reaction buffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 2% TFE), then titrated with varying concentrations of the thiopeptide natural product and the fluorescence anisotropy change after 15 min. Incubation determined. Results:
  • Nosiheptide binds 2 times more to the complex than thiostrepton and slightly higher
  • Example Compound 1 shows the affinity of Example Compound 1 for the 23S rRNA fragment / L11 protein complex (plot of anisotropy versus RNA concentration, see item l.2.c) and I.2.C 1 ))
  • reaction buffer 10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 2% TFE. They are then titered with various concentrations of RNA, and after 15 minutes of incubation, the change in fluorescence anisotropy is determined.
  • Example Compound 1 Titration of Example Compound 1 in the presence of thiostrepton or nosiheptide gives a significant shift of the binding curve to the right.
  • the binding curve can be used to determine the binding constants using the standard methods of numerical simulation and the known target affinity of the fluorescent probe.
  • Example Compound 1 shows the KD values of Example Compound 1 as well as thiostrepton, nosiheptide and micrococcin with respect to a 23S rRNA (Eco //) / L11 protein (T. thermophilus) complex.
  • the measured physical quantity is the fluorescence polarization / anisotropy with an excitation wavelength of 475 nm and an emission wavelength of 520 nm.
  • the duration of the measurement of a full microtiter plate with 50 measurements per well was 5 min.
  • Retaining purine base has no effect on binding.
  • the 2'O-methyl-A1067 fragment (the natural defense mechanism of thiopeptide-producing Streptomyces strains) has the highest K D , a 3000-fold decrease in affinity compared to wild-type RNA.
  • BSC-1 cells (ATCC No. CCL 26) are incubated in D-MEM medium (Gibco) supplemented with 4500 mg / L glucose, pyruvate, glutamine, nonessential amino acids and 10% FCS (Gibco) at 37 ° C and 5% CO 2 cultured. In the present case, only cells are used after 5-25 passages.
  • the cells are washed with 0.25% trypsin and 1 mM EDTA in HBSS (8 g / L NaCl, 0.4 g / L KCl, 60 mg / L KH 2 PO 4 , 1 g / L glucose, 48 mg / L Na 2 HPO 4 , 98 mg / L MgSO 4 , 140 mg / L CaCl 2 , 350 mg / L Na 2 CO 3 ) and in a density of 20,000 cells per slide in D-MEM with 4500 mg / L glucose, pyruvate, glutamine, not Essential amino acids and 10% FCS plated.
  • HBSS 8 g / L NaCl, 0.4 g / L KCl, 60 mg / L KH 2 PO 4 , 1 g / L glucose, 48 mg / L Na 2 HPO 4 , 98 mg / L MgSO 4 , 140 mg / L CaCl 2 , 350 mg / L Na 2 CO 3
  • the fixation is 10 min. by means of a fixative solution containing 37% formaldehyde, 100 mM KPipes, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl, 0.1% TX-100 (Sigma) in water.
  • the fixed cells are washed with TBS-T and blocked with 2% BSA (Sigma) in TBS-T for 1 h and washed again in TBS-T.
  • the chemicals and solvents used were obtained commercially from the conventional suppliers (Acros, Avocado, Aldrich, Bachern, Fluka, Lancaster, Maybridge, Merck, Sigma, TCI, etc.) or synthesized according to methods known to those skilled in the art.
  • the concentrated reaction mixture is taken up in CHCl 3 / MeOH 2% and separated by means of a silica column.
  • the eluent used is CHCl 3 / MeOH 2-5%.
  • the thiazoline ring of the thiostrepton skeleton can be selectively oxidized to the corresponding thiazole ring. This modification can be inserted both to thiostrepton itself, as well as to the shortened variants V1 and V2.
  • the thiostrepton derivative V1ox is obtained by oxidation of the thiazoline ring of the singly truncated thiostrepton variant V1.
  • the product is purified by preparative HPLC at a gradient of 40 to 75%.
  • Thiostrepton (50 mg, 0.03 mmol) is dissolved in dry THF (2ml) and agitt to -10 0 C in an inert atmosphere.
  • NaBH 3 CN (3 eq) is dissolved in dry THF (0.5 ml) and added slowly to the thiostrepton solution dropwise.
  • the reaction mixture is after 1 No longer cooled and then stirred at room temperature for 15 hours.
  • the volatiles are removed under reduced pressure and the residue dissolved in trifluoroethanol.
  • the solution is purified by preparative HPLC (C4-RP column) in a water-acetonitrile gradient or by means of a silica gel column (CHCVMethonal), chromatographically.
  • Thiostrepton derivatives of general structure D1 can be obtained by reaction of singly truncated thiostrepton derivative V1 (see above) with various functionalized thiols (LX), where the radicals FL and X have the abovementioned meaning [Scheme 1].
  • Analogous addition products D2 can be obtained by reaction of the trisubstituted thiostrepton derivative V2 with various functionalized thiols (LX), where the radicals FL and X have the abovementioned meaning [Scheme 2].
  • double adducts D3 which, starting from thiostrepton derivative V1, are formed by addition of two functionalized thiols (LX), where the radicals FL and X have the abovementioned, if appropriate, different meanings [Scheme 3].
  • Functionalized thiols with the rest of the general formula (L1) can be obtained starting from diamine A1, trityl-protected mercaptopropionic acid A2 and acylating reagent A3.
  • the amine A4 is obtained by an amide linkage, which is converted in a further step by means of acylating reagent A3 in the presence of a fluorescent dye A5 to the functionalized (and protected) thiol (L1a).
  • Trityl deprotection leads to functional thiol with the remainder (L1), [Scheme 4], which has the abovementioned meaning.
  • Trt-mercaptopropionic acid 1 mmol
  • DMF dimethyl methoxysulfoxide
  • HBTU hydroxybenzyl sulfonate
  • this mixture is slowly added dropwise to a solution of 2.19 ml of PEG (10 eq) in 10 ml of DCM at 0 ° C. with constant stirring. After 30 minutes, the cold bath is removed and stirred overnight at room temperature.
  • the product is purified by silica flash chromatography with a solvent gradient of CHCl 3 / MeOH 5-9%.
  • the product is purified by silica flash chromatography with a solvent gradient of ethyl acetate / MeOH 5-10%.
  • the concentrated reaction mixture is resumed in 5 ml of TFE / 1 ml of 50 mM sodium carbonate buffer pH 10.
  • the pH of the solution is adjusted to pH 8 with saturated NaHCO 3 solution.
  • To this solution is added 66 mg of singly truncated thiostrepton derivative V1.
  • the reaction is carried out under Ar protective gas atmosphere. After 4 days, the reaction solution is concentrated under reduced pressure and purified [Scheme 7].
  • the product is purified by preparative HPLC at a gradient of 10 to 40%.
  • UV-Vis 30 ⁇ M in 10% TFE in 50 mM sodium phosphate buffer pH 9. ⁇ max 496 nm, 283 nm,
  • the fluorescein compound (90 mg, 0.127 mmol) and triethylamine (30 ⁇ l, 1.1 eq) obtained according to 11.9.2 are dissolved in undiluted trifluoroacetic acid (1.5 ml) and stirred for 20 minutes. The volatiles are removed and it is evaporated 3 times with toluene.
  • Example Compound 2 The remaining residue is dissolved in trifluoroethanol (4 ml) and treated with sodium phosphate buffer (50 mmol, pH 9, 1 ml) and then treated with the thiostreptone derivative V1 (1-fold shortened thiostrepton) and diethylamine (88 ul, 5 eq). The reaction mixture is stirred under an inert gas atmosphere for 16 hours. Thereafter, the probe shown above (Example Compound 2) is obtained by HPLC purification.

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Abstract

The invention relates to compounds of general formula (I), methods for the production thereof, molecular probes based on such compounds, the use thereof for characterizing and/or diagnosing ribosomes in prokaryotes and/or eukaryotes or subtypes of ribosomes in eukaryotes, the use thereof as a pharmacological tool for biochemical, cellular, molecular biological, or biophysical substance test methods for detecting agents, the use thereof in substance test methods for detecting agents, high throughput, medium throughput, low throughput, and/or high-content screening assays, as fluorescence markers of ribosome complexes, for quantifying binding parameters of ligands of the ribosomal GTPase center, detecting protein biosynthesis inhibitors, detecting agents having an antibacterial effect and/or agents against unicellular parasites, and for clinical diagnosis.

Description

Thiostrepton-Sonde Thiostrepton probe
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I)The present invention relates to compounds of the general formula (I)
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Figure imgf000003_0001
(I)(I)
Verfahren zu deren Herstellung, molekulare Sonden, welche auf derartigen Verbindungen basieren, deren Verwendung zur Charakterisierung und/oder Diagnose von Ribosomen in Prokaryoten und/oder Eukaryoten bzw. Ribosomen-Subtypen in Eukaryoten, deren Verwendung als pharmakologisches Tool für biochemische, zelluläre, molekularbiologische oder biophysikalische Substanztestverfahren zum Auffinden von Wirkstoffen, deren Verwendung in Substanztestverfahren zum Auffinden von Wirkstoffen in High-Throughput-, Medium Throughput-, Low-Throughput, und/oder High-Content-Screening-Assays, als Fluoreszenzmarker von Ribosomenkomplexen, zur Quantifizierung von Bindeparametern von Liganden des ribosomalen GTPase-Zentrums, zum Auffinden von Inhibitoren der Proteinbiosynthese, zum Auffinden von Wirkstoffen mit antibakterieller Wirkung und/oder Wirkstoffen gegen einzellige Parasiten sowie zur klinischen Diagnose.A process for their preparation, molecular probes based on such compounds, their use for the characterization and / or diagnosis of ribosomes in prokaryotes and / or eukaryotes or ribosome subtypes in eukaryotes, their use as a pharmacological tool for biochemical, cellular, molecular biological or biophysical substance testing methods for drug discovery, their use in substance testing to detect drugs in high-throughput, medium throughput, low-throughput, and / or high-content screening assays, as fluorescent markers of ribosome complexes, to quantify binding parameters of Ligands of the ribosomal GTPase center, to find inhibitors of protein biosynthesis, to find active substances with antibacterial activity and / or agents against unicellular parasites and for clinical diagnosis.
Thiopeptidnaturstoffe wie beispielsweise Thiostrepton, Nosiheptid oder Nocathiacin sind potente Inhibitoren der Proteinbiosynthese, die durch sub-nM Bindung am sog. GTPase Zentrum des Ribosoms ihre Wirkung entfalten. Als thiopeptidsensitiv bekannt sind bislang alle prokaryotischen Ribosomen, aber auch Ribosomen aus Protozoen (z.B. Plasmodien, Toxoplasmen) und den Zellorganellen höherer Vielzeller (z.B. eukaryotische Mitochondrien), jedoch nicht die cytoplasmischen Ribosomen in Eukaryoten. Bislang sind keine Wirkstoffe in der Humantherapie im Einsatz, die dieses Wirkprinzip nutzen, sowie keine Methoden bekannt, derartige Wirkstoffe gezielt aufzufinden.Thiopeptide natural compounds such as thiostrepton, nosiheptide or nocathiacin are potent inhibitors of protein biosynthesis, which exert their effect by sub-nM binding at the so-called GTPase center of the ribosome. So far, all prokaryotic ribosomes, but also ribosomes from protozoa (eg plasmodia, toxoplasma) and the cell organelles of higher multicellular organisms (eg eukaryotic mitochondria) are known as thiopeptide-sensitive. but not the cytoplasmic ribosomes in eukaryotes. So far, no active ingredients in human therapy, which use this principle of action, as well as no methods known to find such agents specifically.
Zudem besteht durch zunehmende Resistenzbildung von Mikroorganismen gegenüber Wirkstoffen ein permanenter Innovationsdruck, neue Antiinfektiva bereitzustellen, insbesondere solche mit neuartigen Wirkprinzipien.In addition, there is a constant pressure for innovation to provide new anti-infective agents, in particular those with novel active principles, by increasing the resistance of microorganisms to active substances.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es Verbindungen zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe es unter anderem möglich ist, neue antibiotische Wirkstoffe zu finden, welche nicht nur an prokaryotische, sondern auch an eukaryotische Ribosomen binden können, um so über ein breites Spektrum effektiv die Proteinbiosynthese zu inhibieren. Ferner sollten derartige Verbindungen auch eine Charakterisierung von prokaryotischen und insbesondere von eukaryotischen Ribosomen ermöglichen sowie in einer Vielzahl von biologischen, biophysikalischen bzw. biochemischen Substanztestverfahren, vorzugsweise in High- Throughput-Screening (HTS)- oder High-Content-Schreening- (HCS) Verfahren, einsetzbar sein.It was an object of the present invention to provide compounds which, inter alia, make it possible to find new antibiotic agents which can bind not only to prokaryotic, but also to eukaryotic ribosomes, thus effectively over a broad spectrum protein biosynthesis to inhibit. Furthermore, such compounds should also allow characterization of prokaryotic and in particular eukaryotic ribosomes and in a variety of biological, biophysical or biochemical substance testing methods, preferably in high-throughput screening (HTS) or high-content screening (HCS) methods be usable.
Diese Aufgabe wird durch das zur Verfügungstellen der nachstehend aufgeführten Verbindungen gelöst, da durch das Anknüpfen von funktionalen molekularen Einheiten wie z.B. fluoreszenten Farbstoffen an Thiopeptide wie z.B. Thiostrepton, mit Hilfe organischchemischer Synthese, es gelingt, aus Thiostrepton Verbindungen herzustellen, die eine ausserordentlich hohe Affinität an den für die Wirkung wesentlichen Komplex aus ribosomaler RNA und dem ribosomalen Protein L11 zeigen. Derartige Verbindungen sind stabil, hochaffin und selektiv und eignen sich insbesondere als molekulare Sonden für eine Vielzahl von molekularbiologischen, biochemischen bzw. biophysikalischen Testverfahren, u.a. zur Auffindung von antibiotischen Wirkstoffen oder zur Charakterisierung von Ribosomenkomplexen, insbesondere von eukaryotischen Ribosomenkomplexen.This object is achieved by providing the compounds listed below, as by attaching functional molecular entities such as e.g. fluorescent dyes to thiopeptides such as e.g. Thiostrepton, with the help of organic chemical synthesis, it is possible to produce compounds from thiostrepton, which show an exceptionally high affinity to the complex of ribosomal RNA and the ribosomal protein L11, which is essential for the effect. Such compounds are stable, highly affine, and selective, and are particularly useful as molecular probes for a variety of molecular biology, biochemical, and biophysical test methods, i.a. for the discovery of antibiotic agents or for the characterization of ribosome complexes, in particular of eukaryotic ribosome complexes.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung sind daher Verbindungen der allgemeinen Formel (I) One aspect of the present invention are therefore compounds of the general formula (I)
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0001
(I) vorzugsweise Verbindungen der allgemeinen Formel (II) oder (IM) oder (IV) oder (V)
Figure imgf000005_0002
(I) preferably compounds of general formula (II) or (III) or (IV) or (V)
Figure imgf000005_0002
("I) (I ")
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Figure imgf000006_0001
(III)(III)
Figure imgf000006_0002
Figure imgf000006_0002
(IV) (IV)
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0001
(V) worin(V) wherein
für einen Restfor a rest
Figure imgf000007_0002
Figure imgf000007_0002
(AI) (All)(AI) (All)
B für einen Rest B for a rest
Figure imgf000008_0001
n
Figure imgf000008_0001
n
(Bl) (BII) steht,(Bl) (BII),
worin n 0 oder eine ganze Zahl gleich 1 oder 2, vorzugsweise 1 oder 2, istwherein n is 0 or an integer equal to 1 or 2, preferably 1 or 2
die gestrichelte Linie ggf. für eine Doppelbindung (-C=C- oder -C=N-, wenn einthe dashed line may be for a double bond (-C = C- or -C = N-, if a
Stickstoffatom als Ringglied vorhanden ist) steht;Nitrogen atom is present as a ring member);
R1 und R2, jeweils unabhängig voneinander, für einen Rest der allgemeinen Formel (L) oder (M)R 1 and R 2 , each independently of one another, represent a radical of the general formula (L) or (M)
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000008_0002
(L)(L)
.FL.FL
N HN H
(M) stehen,(M) stand,
worinwherein
X für einen gesättigten oder ungesättigten, linearen oder verzweigten, aliphatischen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen steht, welcher unsubstituiert oder mit ggf. 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten, unabhängig voneinander, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -F1 -Cl, -Br1 -I1 -CN1 -NO2, -OH1 -CH2-CN, -SH1 -NH2, - S-CH3, -S-C2H5, -S-Phenyl, -S-CH2-Phenyl, -0-CH3, -0-C2H5. -0-C3H7, -O-C(CH3)3l - O-Phenyl, -O-CH2-Phenyl, -CF3, -CHF2, -CH2F, -0-CF3, -O-CHF2, -0-CH2F1 -C(=O)- CF3, -S-CF3, -S-CHF2, -S-CH2F, -N(CH3J2, -N(C2H5)2l -NH-CH3, -NH-C2H5, -C(=O)-O- C2H5, -C(=O)-O-C(CH3)3, -C(=O)-H, -C(=O)-OH, -C(=O)-C2H5, -NH-C(=O)-C2H5, - C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3, -C(=O)-N(CH3)2, -S(=O)2-NH2, -CH(NH2)-C(=O)-OH, Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Phenyl und Benzyl substituiert ist,X is a saturated or unsaturated, linear or branched, aliphatic hydrocarbon radical having 1 to 18 carbon atoms, which is unsubstituted or optionally with 1, 2, 3, 4 or 5 substituents, independently selected from the group consisting of -F 1 -Cl, -Br 1 -I 1 -CN 1 -NO 2 , -OH 1 -CH 2 -CN, -SH 1 -NH 2 , -S-CH 3 , -SC 2 H 5 , -S-phenyl, -S-CH 2 -phenyl, -O-CH 3 , -O-C 2 H 5 . -O-C 3 H 7 , -OC (CH 3 ) 3l -O-phenyl, -O-CH 2 -phenyl, -CF 3 , -CHF 2 , -CH 2 F, -O-CF 3 , -O- CHF 2 , -O-CH 2 F 1 -C (= O) -CF 3 , -S-CF 3 , -S-CHF 2 , -S-CH 2 F, -N (CH 3 J 2 , -N ( C 2 H 5 ) 2l -NH-CH 3 , -NH-C 2 H 5 , -C (= O) -O- C 2 H 5 , -C (= O) -OC (CH 3 ) 3 , -C (= O) -H, -C (= O) -OH, -C (= O) -C 2 H 5 , -NH-C (= O) -C 2 H 5 , -C (= O) -NH 2, -C (= O) -NH-CH 3, -C (= O) -N (CH 3) 2, -S (= O) 2 -NH 2, -CH (NH 2) -C (= O ) -OH, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, phenyl and benzyl,
für einen Rest ausgewählt aus der Gruppe umfassend -C3-20-Cycloalkylen und -C3-20- Heterocycloalkylen , wobei die vorstehend genannten Reste ggfs. wenigstens ein Heteroatom als Ringglied enthalten können und jeweils unsubstituiert oder mit ggf. 1 , 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F1 Cl, Br, I, -CN, -NO2, -OH1 -CH2-CN, -SH, -NH2, -C(=O)-OH, Methyl, Ethyl, n-Propyl, /so-Propyl, n-Butyl, /so-Butyl, 2-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl und neo- Pentyl substituiert sind,is a radical selected from the group comprising C 3-20 cycloalkylene, and -C 3-20 - heterocycloalkylene, may contain a hetero atom as ring member, at least where the abovementioned radicals optionally and in each case unsubstituted or substituted with optionally 1, 2 or 3rd Substituents independently selected from the group consisting of F 1 Cl, Br, I, -CN, -NO 2 , -OH 1 -CH 2 -CN, -SH, -NH 2 , -C (= O) -OH, methyl , Ethyl, n-propyl, / so-propyl, n-butyl, / so-butyl, 2-butyl, tert-butyl, n-pentyl and neo-pentyl are substituted,
oderor
für einen ggfs. eine Polyethergruppierung aufweisenden Rest der allgemeinen Formel (Y)for a possibly having a polyether grouping radical of the general formula (Y)
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0001
(Y) steht,(Y) stands,
worinwherein
p für eine ganze Zahl von 1 bis 8 steht,p is an integer from 1 to 8,
m für O oder eine ganze Zahl von 1 bis 8 steht,m is O or an integer from 1 to 8,
C für Wasserstoff oder einen aliphatischen Carboxylrest,C is hydrogen or an aliphatic carboxyl radical,
undand
FL für einen fluoreszierenden Farbstoffrest steht, deren entsprechende Salze oder Solvate, deren Stereoisomeren, Racemate, Enantionmeren oder Mischungen der Enantiomeren in jedem Verhältnis,FL stands for a fluorescent dye residue, their corresponding salts or solvates, their stereoisomers, racemates, enantiomers or mixtures of the enantiomers in any ratio,
wobei immer wenigstens B für einen Rest (BII) oder A für einen Rest (All) steht,where at least B is a radical (BII) or A is a radical (All),
Unter einem linearen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest ist im Sinne der Beschreibung ein aliphatischer, gesättigter (=Alkylen) bzw. einfach oder mehrfach ungesättigter (=Alkenylen bzw. Alkinylen) Kohlenwasserstoffrest zu verstehen. Ist der Kohlenwasserstoffrest ungesättigt, so kann er wenigstens eine Doppelbindung und/oder eine Dreifachbindung, bevorzugt 1 , 2 oder 3 Doppelbindungen und/oder Dreifachbindungen aufweisen. Als geeignete lineare oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffreste seien beispielhaft Methylen, Ethylen, n-Propylen, /so-Propylen, n- Butylen, /so-Butylen, 2-Butylen, tert-Butylen, n-Pentylen, neo-Pentylen, π-Hexylen, n- Heptylen, n-Octylen, n-Nonylen, n-Decylen, Ethenylen, 1-Propenylen, 2-Propenylen, 1- Butenylen, 2-Butenylen, 3-Butenylen, 1-Pentenylen, 2-Pentenylen, 3-Pentenylen, 4- Pentenylen, Hexenylen, -CH=CH-CH=CH-CH2- und -CH2-CH=CH-CH2- genannt.In the context of the description, a linear or branched hydrocarbon radical is to be understood as meaning an aliphatic, saturated (= alkylene) or mono- or polyunsaturated (= alkenylene or alkynylene) hydrocarbon radical. If the hydrocarbon radical is unsaturated, it may have at least one double bond and / or one triple bond, preferably 1, 2 or 3 double bonds and / or triple bonds. Examples of suitable linear or branched, saturated or unsaturated hydrocarbon radicals are methylene, ethylene, n-propylene, n-propylene, n-butylene, n-butylene, 2-butylene, tert-butylene, n-pentylene, neo-pentylene, π-hexylene, n-heptylene, n-octylene, n-nonylene, n-decylene, ethenylene, 1-propenylene, 2-propenylene, 1-butenylene, 2-butenylene, 3-butenylene, 1-pentenylene, 2-pentenylene, 3-pentenylene, 4-pentenylene, hexenylene, -CH = CH-CH = CH-CH 2 - and -CH 2 -CH = CH-CH 2 - called.
Der Begriff "(Hetero-)Cycloalkylen" umfasst im Sinne der Beschreibung cyclische, gesättigte Kohlenwasserstoffketten. Als geeignete Cycloalkylen-Reste seien beispielhaft Cyclopropylen, Cyclobutylen, Cyclopentylen und Cyclohexylen genannt.The term "(hetero) cycloalkylene" as used herein includes cyclic, saturated hydrocarbon chains. Examples of suitable cycloalkylene radicals include cyclopropylene, cyclobutylene, cyclopentylene and cyclohexylene.
Bevorzugt sind Verbindungen der vorstehend angegebenen allgemeinen Formeln (I)-(V), worin R1 und R2, unabhängig voneinander, für einen Rest der allgemeinen Formel (L) oder (M) stehen, worinPreference is given to compounds of the general formulas (I) - (V) given above, in which R1 and R2, independently of one another, are a radical of the general formula (L) or (M) embedded image in which
X für einen Kohlenwasserstoffrest steht, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus " Methylen, Ethylen, n-Propylen, /so-Propylen, n-Butylen, /so-Butylen, 2-Butylen, tert- Butylen, Pentylen, Hexylen, Heptylen, Octylen, Nonylen und Decylen, wobei die vorstehend genannten Kohlenwasserstoffreste gesättigt oder ungesättigt, linear oder verzweigt, unsubstituiert oder mit ggf. 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -F, -Cl, -Br, -I1 -CN, -NO2, -OH, - CH2-CN, -SH1 -NH2, -S-CH3, -S-C2H5, -S-Phenyl, -S-CH2-Phenyl, -0-CH3, -0-C2H5, -O- C3H7, -O-C(CH3)3, -O-Phenyl, -O-CH2-Phenyl, -CF3, -CHF2, -CH2F, -0-CF3, -0-CHF2, -O- CH2F, -C(=O)-CF3, -S-CF3, -S-CHF2, -S-CH2F, -N(CH3J2, -N(C2H5)2, -NH-CH3, -NH-C2H5, -C(=O)-O-C2H5, -C(=O)-O-C(CH3)3, -C(=O)-H, -C(=O)-C2H5, -NH-C(=O)-C2H5, -C(=0)- NH2, -C(=O)-NH-CH3, -C(=O)-N(CH3)2, -S(=O)2-NH2, Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Phenyl und Benzyl substituiert sind,X is a hydrocarbon radical which is selected from the group consisting of "methylene, ethylene, n-propylene, / so-propylene, n-butylene, / so-butylene, 2-butylene, tert-butylene, pentylene, hexylene, heptylene , Octylene, nonylene and decylene, where the abovementioned hydrocarbon radicals are saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or optionally having 1, 2, 3, 4 or 5 substituents independently of one another selected from the group consisting of -F, -Cl, - Br, -I 1 -CN, -NO 2 , -OH, -CH 2 -CN, -SH 1 -NH 2 , -S-CH 3 , -SC 2 H 5 , -S-phenyl, -S-CH 2 phenyl, -0-CH3, -0-C 2 H 5, -O-C 3 H 7, -OC (CH 3) 3, -O-phenyl, -O-CH 2 -phenyl, -CF 3, -CHF 2 , -CH 2 F, -O-CF 3 , -O-CHF 2 , -O- CH 2 F, -C (= O) -CF 3 , -S-CF 3 , -S-CHF 2 , -S-CH 2 F, -N (CH 3 J 2 , -N (C 2 H 5 ) 2 , -NH-CH 3 , -NH-C 2 H 5 , -C (= O) -OC 2 H 5 , -C (= O) -OC (CH 3 ) 3 , -C (= O) -H, -C (= O) -C 2 H 5 , -NH-C (= O) -C 2 H 5 , -C (= 0) - NH 2 , -C (= O) -NH-CH 3 , -C (= O) -N (CH 3 ) 2 , -S (= O) 2 -NH 2 , cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, phenyl and Benzyl are substituted,
oderor
für einen Rest ausgewählt aus der Gruppe umfassend -Cs-β-Cycloalkylen und -C3-6- Heterocycloalkylen , wobei die vorstehend genannten Reste mindestens ein Heteroatom als Ringglied aufweisen können und jeweils unsubstituiert oder mit ggf. 1 , 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, Br, I, -CN1 -NO2, -OH, -CH2-CN, -SH, -NH2, -C(=O)-OH, Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso- Propyl, n-Butyl, /so-Butyl, 2-Butyl, tert-Butyl, /7-Pentyl und neo-Pentyl substituiert sind,a radical selected from the group consisting of -Cs-β-cycloalkylene and -C 3-6 -heterocycloalkylene, where the abovementioned radicals can have at least one heteroatom as ring member and are each unsubstituted or optionally having 1, 2 or 3 substituents independently of one another selected from the group consisting of F, Cl, Br, I, -CN 1 -NO 2 , -OH, -CH 2 -CN, -SH, -NH 2 , -C (= O) -OH, methyl, ethyl, substituted n-propyl, iso-propyl, n-butyl, / so-butyl, 2-butyl, tert-butyl, / 7-pentyl and neo-pentyl,
oderor
für einen ggfs. eine Polyethergruppierung aufweisenden Rest der allgemeinen Formel (Y)for a possibly having a polyether grouping radical of the general formula (Y)
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0001
(Y) steht,(Y) stands,
worinwherein
p für ganze Zahl von 1 bis 3 steht,p is an integer from 1 to 3,
m für O oder eine ganze Zahl von 1 bis 3m is 0 or an integer from 1 to 3
C für Wasserstoff oder ein Acylrest, vorzugsweise Wasserstoff, stehtC is hydrogen or an acyl radical, preferably hydrogen
undand
FL für einen fluoreszierenden Farbstoffrest steht.FL stands for a fluorescent dye residue.
Besonders bevorzugte Verbindung der vorstehend angegebenen allgemeinen Formeln (I)-(V) sind Verbindungen, worin R1 und R2, jeweils unabhängig voneinander, für einen Rest der Formel (L1 ) oder (M1 )
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Particularly preferred compounds of the general formulas (I) - (V) given above are compounds in which R 1 and R 2 , in each case independently of one another, represent a radical of the formula (L1) or (M1)
Figure imgf000012_0001
(LD
Figure imgf000012_0002
(LD
Figure imgf000012_0002
(M1) stehen.(M1) stand.
Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel (I)-(V)1 worin der fluoreszierende Farbstoffrest (FL) ein Rest ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fluorescein, Alexa Fluor 488, Eosin gelblich, Eosin bläulich, Phloxin, Erythrosin, Bengalrosa, Rhodamin, Rhodamin-Grün, Hydroxycumarin, Benzofuran, Texas-Rot, Oregon- Grün 488, Biman, NBD, Dansyl, Dabsyl, Bodipy, Phycoerythrin, Cyanin-Fluorophore Cy3™, Cy5™, Xanten und ein Farbstoffrest der Formel ZFurther preferred are compounds of the general formula (I) - (V) 1 given above wherein the fluorescent dye moiety (FL) is selected from the group comprising fluorescein, Alexa Fluor 488, eosin yellowish, eosin bluish, phloxine, erythrosine, rose bengal, rhodamine , Rhodamine Green, Hydroxycumarin, Benzofuran, Texas Red, Oregon Green 488, Biman, NBD, Dansyl, Dabsyl, Bodipy, Phycoerythrin, Cyanine Fluorophore Cy3 ™, Cy5 ™, Xanten and a dye moiety of Formula Z
Figure imgf000012_0003
Figure imgf000012_0003
Derartige Fluoreszenzfarbstoffe sind dem Fachmann allgemein bekannt und kommerziell erhältlich. Such fluorescent dyes are generally known to the person skilled in the art and are commercially available.
Insbesondere bevorzugt sind folgende erfindungsgemäße Verbindungen:Particular preference is given to the following compounds according to the invention:
Figure imgf000013_0001
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Sonde der vorstehend aufgeführten, allgemeinen Formeln (I)-(V)1 vorzugsweise zur Verwendung wie nachstehend aufgeführt.Another aspect of the present invention relates to a probe of the above-mentioned general formulas (I) - (V) 1 preferably for use as listed below.
Ribosomen sind Komplexe aus Proteinen und Ribonukleinsäuren (RNA), die unter anderem im Cytoplasma der Zellen von Lebewesen sowie in Zellorganellen wie beispielsweise den Mitochondrien vorkommen. Ribosomen setzen sich aus zwei Untereinheiten zusammen, einer großen Untereinheit, die bei der Proteinbiosynthese die Aminosäuren zur Kette verknüpft (Peptidyltransferaseaktivität), und einer kleinen Untereinheit, die für die mRNA- Erkennung verantwortlich ist. Sowohl Prokaryoten als auch Eukaryoten besitzen Ribosomen, jedoch unterscheiden diese sich voneinander.Ribosomes are complexes of proteins and ribonucleic acids (RNA), which among other things in the cytoplasm of the cells of living things as well as in cell organelles such as the Mitochondria occur. Ribosomes are composed of two subunits, a large subunit that links the amino acids to the chain in protein biosynthesis (peptidyltransferase activity), and a small subunit responsible for mRNA recognition. Both prokaryotes and eukaryotes have ribosomes, but these differ from each other.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass die erfindungsgemäßen molekularen Sonden eine hohe Affinität zu sowohl zu prokaryotischen als auch zu eukaryotische Ribosomenkomplexen aufweisen, weshalb derartige molekulare Sonden eine Charakterisierung und/oder eine Diagnose von Ribosomen in Prokarzoten und/oder in Eukaryoten ermöglichen, wobei eine Charakterisierung und/oder eine Diagnose von Ribosomen in Eukaryoten besonders bevorzugt ist.It has now surprisingly been found that the molecular probes according to the invention have a high affinity for both prokaryotic and eukaryotic ribosome complexes, which is why such molecular probes allow a characterization and / or a diagnosis of ribosomes in prokaryotes and / or in eukaryotes, wherein a characterization and / or a diagnosis of ribosomes in eukaryotes is particularly preferred.
Durch die o.g. Eigenschaften der erfindungsgemäßen molekularen Sonden wird ferner eine Charakterisierung und/oder Diagnose von Ribosomen-Subtypen in Eukaryoten, insbesondere mitochondrialer, cytoplasmatischer oder Prä-Ribosomen, ermöglicht. Dem Fachmann sind Begriffe wie "mitochondrialer Ribosomen", "cytoplasmatischer Ribosomen" bzw. "Prä-Ribosomen" allgemein bekannt und geläufig.By the o.g. Characteristics of the molecular probes according to the invention are further allowed to characterize and / or diagnose ribosome subtypes in eukaryotes, in particular mitochondrial, cytoplasmic or pre-ribosomes. Terms such as "mitochondrial ribosomes", "cytoplasmic ribosomes" or "pre-ribosomes" are generally known and familiar to the person skilled in the art.
In der Pharmaforschung werden zum Auffinden von Wirkstoffen verschiedene Substanztestverfahren verwendet, die unter anderem das Testen grosser Molekülbibliotheken umfasst, um jene Substanzen zu finden, welche später als Leitstruktur für die weitere Entwicklung dienen. Diese Substanztestverfahren sind vorzugsweise zellulär, biochemisch, molekularbiologische oder biophysikalisch und werden, entsprechend der Anzahl der zu testenden Substanzen, unter den Begriffen High-Throughput- (HTS), Medium Throughput- (MTS), Low-Throughput- (LTS), und/oder High-Content-Screening (HCS) zusammengefasst.In drug discovery, different substance testing methods are used to find drugs, including the testing of large molecule libraries to find those substances that later serve as a lead for further development. These substance testing methods are preferably cellular, biochemical, molecular biological or biophysical and, according to the number of substances to be tested, under the terms high-throughput (HTS), medium throughput (MTS), low-throughput (LTS), and / or high-content screening (HCS).
Beim HTS, MTS und LTS werden üblicherweise biochemische, molekularbiologische, zelluläre und biophysikalische Testverfahren in Mikrotiterplatten in wenigen Mikro-/Nanolitern Probenvolumen durchgeführt, die bei einer gewünschten biologischen Wirkung zu einer Farbänderung oder Fluoreszenz führen, welche schnell und genau quantifizierbar ist. Die Technik des HTS, MTS und LTS ist dem Fachmann allgemein bekannt. Diesbezüglich wird auf die allgemeine Literatur, wie beispielsweise Hüser et al., "High Througput-Screening in Drug Discovery, Vol. 35, Wiley-VCH, 2006, verwiesen. High Content Screening ist eine automatisierte, bildorientierte Testmethode zur schnellen, parallenen Auffindung von Wirkstoffen, welche ebenfalls in Mikrotiterplatten durchgeführt wird und den Vorteil aufweist, dass die Tests an lebenden Zellen in vitro durchgeführt werden können. Übliche, kommerziell erhältliche Geräte zur Durchführung von HCS- Testverfahren umfassen beispielsweise den ImageXpress ULTRA (Molecular Devices, Union City, USA), Pathway 855 und 435 (BD Biosciences), OPERA (Evotec Technologies, Hamburg, DE), Incell 1000 und 3000 (GE/Amersham Biosciences, Cardiff, UK), Arrayscan (Cellomics), Scanalyzer (Scanalyzer LemnaTec) und ImageXpress MICRO (Molecular Devices). Vorzugsweise werden die HCS-Substanztestverfahren mit der erfindungsgemäßen molekularen Sonde auf wenigstens einem dieser Geräte durchgeführt. Der Begriff "High Content Screening" ist dem Fachmann allgemein bekannt.In HTS, MTS and LTS, biochemical, molecular biological, cellular and biophysical test procedures are usually performed in microtiter plates in a few micro / nanoliter sample volumes which, with a desired biological effect, result in a color change or fluorescence which can be rapidly and accurately quantified. The technique of HTS, MTS and LTS is well known to those skilled in the art. In this regard, reference is made to the general literature, such as Hüser et al., High Througput Screening in Drug Discovery, Vol. 35, Wiley-VCH, 2006. High Content Screening is an automated, image-oriented test method for the rapid, parallel discovery of drugs, which is also performed in microtiter plates and has the advantage that the tests on living cells can be performed in vitro. Conventional commercially available devices for carrying out HCS testing methods include, for example, ImageXpress ULTRA (Molecular Devices, Union City, USA), Pathway 855 and 435 (BD Biosciences), OPERA (Evotec Technologies, Hamburg, DE), Incell 1000 and 3000 ( GE / Amersham Biosciences, Cardiff, UK), Arrayscan (Cellomics), Scanalyzer (Scanalyzer LemnaTec) and ImageXpress MICRO (Molecular Devices). The HCS substance testing methods are preferably carried out with the molecular probe according to the invention on at least one of these devices. The term "High Content Screening" is well known to those skilled in the art.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher die Verwendung einer wie vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen molekularen Sonde als pharmakologisches Tool(=Hilfsmittel), für biochemische, zelluläre, molekularbiologische oder biophysikalische Substanztestverfahren zum Auffinden von Wirkstoffen, sowie in Substanztestverfahren zum Auffinden von Wirkstoffen in High-Throughput-, Medium Throughput-, Low-Throughput, und/oder High-Content-Screening-Assays, wobei unter dem Begriff "Assay" im Sinne der Beschreibung ein standardisierter Reaktionsablauf zum Nachweis einer Substanz mit einer spezifischen Methode zu verstehen ist.Another aspect of the present invention therefore relates to the use of a molecular probe according to the invention as described above as a pharmacological tool (= adjuvant), for biochemical, cellular, molecular biological or biophysical substance testing methods for finding active substances, as well as in substance test methods for finding active ingredients in high molecular weight. Throughput, medium throughput, low-throughput, and / or high-content screening assays, where the term "assay" in the sense of the description is to be understood as meaning a standardized reaction sequence for detecting a substance with a specific method.
Da die erfindungsgemäße, molekulare Sonde mit hoher Affinität an das ribosomale GTPase- Zentrum bindet, ist es mit Hilfe dieser Sonde möglich, bei Anwendung entsprechender Messmethoden eine Quantifizierung von Bindeparametern von Liganden des ribosomalen GTPase-Zentrums durchzuführen.Since the molecular probe according to the invention binds with high affinity to the ribosomal GTPase center, it is possible with the aid of this probe to perform a quantification of binding parameters of ligands of the ribosomal GTPase center using appropriate measurement methods.
Entsprechend betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer wie vorstehend beschriebenen molekularen Sonde zur Quantifizierung von Bindeparametern von Liganden des ribosomalen GTPase-Zentrums.Accordingly, a further aspect of the present invention relates to the use of a molecular probe as described above for the quantification of binding parameters of ligands of the ribosomal GTPase center.
Da die erfindungsgemäße, molekulare Sonde mit hoher Affinität an Ribosomenkomplexe bindet, betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung deren Verwendung zum Auffinden von Wirkstoffen, die Inhibitoren der Proteinbiosynthese sind, insbesondere zum Auffinden von Wirkstoffen mit antibakterieller Wirkung und/oder Wirkstoffen gegen einzellige Parasiten, wie beispielsweise Plasmodium falciparum oder Toxoplasma ghondii sowie allgemein gegen bakterielle Pathogene, wie beispielsweise S. aureus, M. tuberculosis, Enterokokken, Streptokokken (alle Gram-positiv), Pseudomonaden, Acitenobacter oder Klebsiella (gram-Negativ).Since the molecular probe of the present invention binds to ribosome complexes with high affinity, another aspect of the present invention relates to its use for finding agents that are inhibitors of protein biosynthesis, in particular for finding antibacterial agents and / or unicellular parasitic agents, such as for example, Plasmodium falciparum or Toxoplasma ghondii, and generally against bacterial pathogens, such as S. aureus, M. tuberculosis, Enterococci, streptococci (all Gram-positive), pseudomonads, Acitenobacter or Klebsiella (gram-negative).
Anfärbereagenzien für Ribosomen sind bislang nicht kommerziell erhältlich, haben jedoch ein grosses Einsatzspektrum in der biologischen und klinischen Grundlagenforschung (ZeII- und Gewebemikroskopie) sowie ein großes Anwendungspotential in der klinischen Diagnostik. Aufgrund ihrer ausserordentlich hohen Affinität an Ribosomenkomplexe eignen sich die erfindungsgemäßen, molekularen Sonden insbesondere, um selektiv thiopeptidsensitive Ribosomen, vorzugsweise von Eukaryoten, in Zellen und Geweben anzufärben.Ribosome staining reagents are not yet commercially available, but have a wide range of uses in basic biological and clinical research (cell and tissue microscopy) as well as a large application potential in clinical diagnostics. Because of their exceptionally high affinity for ribosome complexes, the molecular probes according to the invention are particularly suitable for selectively staining thiopeptide-sensitive ribosomes, preferably of eukaryotes, in cells and tissues.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher die Verwendung einer wie vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen molekularen Sonde als Fluoreszenzmarker von Ribosomenkomplexen, zum Nachweis der Inhibition des ribosomalen GTPase- Zentrums, sowie in fluoreszenzmikroskopischen Methoden.A further aspect of the present invention therefore relates to the use of a molecular probe according to the invention as described above as a fluorescence marker of ribosome complexes, for detecting the inhibition of the ribosomal GTPase center, as well as in fluorescence microscopy methods.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellungen der Verbindungen der vorstehend genannten, allgemeinen Formel (I)-(V), umfassend die Schritte:A further aspect of the present invention relates to a process for the preparation of the compounds of the abovementioned general formula (I) - (V), comprising the steps:
a) ggfs. Verkürzung des Thiostreptons durch Lösen des Thiostreptons in einem geeigneten Lösemittel, vorzugsweise einem organischen Lösemittel, besonders bevorzugt einem polaren, organischen Lösungsmittel, und anschließender Zugabe eines Amins, vorzugsweise eines aliphatischen Amins, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen -8O0C und 1000C, besonders bevorzugt von -2O0C bis 2O0C und anschließendem Entfernen des Lösemittels und ggf. Reinigen/Isolieren der erhaltenen Verbindung;a) optionally shortening of the thiostrepton by dissolving the thiostrepton in a suitable solvent, preferably an organic solvent, more preferably a polar, organic solvent, and then adding an amine, preferably an aliphatic amine, preferably at a temperature between -8O 0 C and 100 0 C, more preferably from -2O 0 C to 2O 0 C and then removing the solvent and optionally cleaning / isolating the compound obtained;
b) ggfs. Reduktion des Thiostreptons oder eines nach a) erhaltenen, einfach oder zweifach verkürzten Thiostreptons durch Lösen in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise in einem organischen Lösungsmittel, und Versetzen der gekühlten Lösung mit einem geeigneten Reduktionsmittel, vorzugsweise einer Lösung von NaBH3CN, unter Kühlung, weiteres Rühren des Reaktionsgemisches bei Zimmertemperatur bis zu einem Tag und nach Konzentrierung der Reaktionsmischung Isolierung und ggfs. weitere Reinigung; c) ggfs. Oxidation des Thiostreptons oder einer der nach a) oder b) erhaltenen Verbindungen durch selektive Oxidation des Thiazolinrings zum entsprechenden Thiazolring und ggf. Reinigen/Isolieren der erhaltenen Verbindung;b) optionally reduction of the thiostreptone or a one or two truncated thiostrepton obtained according to a) by dissolving in a suitable solvent, preferably in an organic solvent, and adding the cooled solution with a suitable reducing agent, preferably a solution of NaBH 3 CN, with cooling, further stirring of the reaction mixture at room temperature for up to one day and after concentration of the reaction mixture isolation and, if necessary, further purification; c) if necessary. Oxidation of the thiostrepton or one of the compounds obtained according to a) or b) by selective oxidation of the thiazoline ring to the corresponding thiazole ring and optionally cleaning / isolating the compound obtained;
d) Umsetzen des Thiostreptons oder einer der gemäß Schritt a), b) oder c) erhaltenen Verbindungen der allgemeinen Formel (X)d) Reaction of the thiostrepton or one of the compounds of the general formula (X) obtained according to step a), b) or c)
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Figure imgf000017_0001
(X) worin n 0 oder eine ganze Zahl 1 oder 2 ist, und C die vorstehend angegebene Bedeutung hat,(X) in which n is 0 or an integer 1 or 2, and C has the meaning given above,
mit wenigstens einem Thiol der allgemeinen Formel (LX) oder (MX),with at least one thiol of the general formula (LX) or (MX),
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000017_0002
(LX)
Figure imgf000018_0001
(LX)
Figure imgf000018_0001
(MX)(MX)
worin die Reste FL und X die vorstehend genannte Bedeutung haben.wherein the radicals FL and X have the abovementioned meaning.
Die Ausgangsverbindungen, insbesondere die fluoreszierenden Farbstoffe sind kommerziell erhältlich bzw. können nach den üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden.The starting compounds, in particular the fluorescent dyes, are commercially available or can be prepared by the customary processes known to the person skilled in the art.
Verbindung der allgemeinen Formel (LX) können nach dem nachstehend im experimentellenCompounds of the general formula (LX) can be obtained by the following in the experimental
Teil aufgeführten Schema 4 im Teil 11.5. hergestellt werden.Part 4 Scheme 4 in Part 11.5. getting produced.
Verbindungen der allgemeinen Formel (MX) können ebenfalls nach der nachstehend im experimentellen Teil aufgeführten Synthese der Beispielverbindung 2 hergestellt werden.Compounds of the general formula (MX) can also be prepared according to the synthesis of the example compound 2 given below in the experimental section.
Die Umsetzung von Doppelbindungen mit Thiolverbindungen ist aus der Literatur allgemein bekannt, wie beispielsweise aus Naidu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett, 2005, V 15, 2069- 2072.The reaction of double bonds with thiol compounds is well known in the literature, for example, from Naidu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2005, V 15, 2069-2072.
Die vorstehend beschriebenen Umsetzungen können jeweils unter üblichen, dem Fachmann geläufigen Bedingungen, wie z. B. in Hinblick auf anzuwendenen Druck oder der jeweiligen Zugabe der Komponenten durchgeführt werden. Ggf. kann die gemäß den jeweiligen Bedingungen optimale Verfahrensführung vom Fachmann durch einfache Vorversuche ermittelt werden.The reactions described above may in each case under conventional conditions known in the art, such. B. with regard to applied pressure or the respective addition of the components. Possibly. can be determined by the skilled worker by simple preliminary tests, the optimal process according to the respective conditions.
Die nach den vorstehend beschriebenen Umsetzungen erhaltenen Zwischen- und Endprodukte können jeweils, falls gewünscht und/oder erforderlich, nach üblichen, dem Fachmann bekannten Methoden gereinigt und/oder isoliert werden. Geeignete Reinigungsverfahren sind beispielsweise Extraktionsverfahren und chromatographische Verfahren wie Säulenchromatographie oder präparative Chromatographie.The intermediate and end products obtained according to the above-described reactions can each be purified and / or isolated, if desired and / or required, by customary methods known to those skilled in the art. Suitable purification methods are, for example, extraction methods and chromatographic methods, such as column chromatography or preparative chromatography.
Sämtliche der vorstehend beschriebenen Verfahrensschritte sowie jeweils auch die Reinigung und/oder Isolierung von Zwischen- oder Endprodukten können teilweise oder vollständig unter einer Inertgasatmosphäre, vorzugsweise unter Stickstoffatmosphäre, durchgeführt werden. Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen der vorstehend angegebenen allgemeinen Formeln (I)-(V) nach ihrer Herstellung in Form ihrer reinen Stereoisomeren oder deren Mischung erhalten werden, können diese nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren getrennt und ggf. isoliert werden. Beispielhaft seien chromatographische Trennverfahren, insbesondere Flüssigkeitschromatographie-Verfahren unter Normaldruck oder unter erhöhtem Druck, vorzugsweise MPLC- und HPLC-Verfahren, sowie Verfahren der fraktionierten Kristallisation genannt. Dabei können insbesondere einzelne Enantiomere, z.B. mittels HPLC an chirale Phasen oder mittels Kristallisation mit chiralen Säuren, etwa (+)- Weinsäure, (-)-Weinsäure oder (+)-10-Camphersulfonsäure, gebildete diastereomere Salze voneinander getrennt werden.All of the above-described process steps and in each case also the purification and / or isolation of intermediate or end products can be carried out partially or completely under an inert gas atmosphere, preferably under a nitrogen atmosphere. If the compounds according to the invention of the abovementioned general formulas (I) - (V) are obtained after their preparation in the form of their pure stereoisomers or mixtures thereof, these can be separated by conventional methods known to the person skilled in the art and optionally isolated. Examples which may be mentioned are chromatographic separation processes, in particular liquid chromatography processes under atmospheric pressure or under elevated pressure, preferably MPLC and HPLC processes, and fractional crystallization processes. In particular, individual enantiomers, for example by means of HPLC on chiral phases or by crystallization with chiral acids, such as (+) - tartaric acid, (-) - tartaric acid or (+) - 10-camphorsulfonic acid, formed diastereomeric salts are separated.
I Allgemeine experimentelle ArbeitsschritteI General experimental work steps
1.1. Herstellung benötigter Biomoleküle1.1. Production of required biomolecules
RNA: Die Synthese von 58 nt Fragmenten (1051-1108) der Escherichia coli Wildtyp bzw. mutierten 23S rRNA wurde mittels in vitro Transkription (T7-RNA- Polymerase; MEGAscript Kit, Ambion) durchgeführt. Als Trägervektor für das DNA-Templat diente das pUC 19 Vektorsystem.RNA: The synthesis of 58 nt fragments (1051-1108) of the Escherichia coli wild-type or mutated 23S rRNA was carried out by means of in vitro transcription (T7 RNA polymerase; MEGAscript Kit, Ambion). The carrier vector for the DNA template was the pUC 19 vector system.
Die RNA-Produkte wurden mittels PAGE und Gelfiltration gereinigt. PAGE und Gelfiltration sind Standardmethoden der Molekularbiologie. Das 2'O-methyl-A1067-Fragment wurde von Dharmacon bezogen.The RNA products were purified by PAGE and gel filtration. PAGE and gel filtration are standard methods of molecular biology. The 2'-O-methyl-A1067 fragment was obtained from Dharmacon.
Protein: Die für das L11 -Protein kodierenden DNA-ORF aus Thermus thermophilus und Escherichia coli wurde mit Hilfe des pQE30 Xa Vektor-systems als N-terminal His6-Fusionsprotein heterolog in E.coli zur Überexpression gebracht. Die Reinigung erfolgte mittels Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie und anschließender Gelfiltration. Derartige Methoden zur Klonierung, Proteinexpression und -reinigung sind dem Fachmann allgemein bekannt.Protein: The DNA ORF from Thermus thermophilus and Escherichia coli coding for the L11 protein was heterologously overexpressed in E. coli using the pQE30 Xa vector system as N-terminal His 6 fusion protein. The purification was carried out by means of Ni 2+ -NTA affinity chromatography and subsequent gel filtration. Such methods for cloning, protein expression and purification are well known to those skilled in the art.
I.2. Bestimmung der Sondenaffinität (K0)I.2. Determination of the probe affinity (K 0 )
Alle Messungen zur Affinitäsbestimmung wurden in 384-well-Platten (Platten: Perkin Eimer, flat black, 25 bzw. 50 μl Reaktionsvolumen; Reader. TECAN Safire II) durch-geführt. Die betrachtete physikalische Messgröße ist die Fluoreszenzpolarisation bzw. Anisotropie bei einer Anregungswellenlänge von 475 nm und einer Emissions-wellenlänge von 520 nm. Messdauer bei 50 Messungen/well ca. 5 min.All measurements for affinity determination were carried out in 384-well plates (plates: Perkin Elmer, flat black, 25 or 50 μl reaction volume, reader TECAN Safire II). The considered physical quantity is the fluorescence polarization or anisotropy an excitation wavelength of 475 nm and an emission wavelength of 520 nm. Measuring time at 50 measurements / well about 5 min.
l.2.a) Experimentelle Bestimmung der Sondenaffinität an E. coli 23S Wildtyp-rRNA Fragmente (1051-1108)l.2.a) Experimental Determination of Probe Affinity on E. coli 23S Wild-Type rRNA Fragments (1051-1108)
Zur Bestimmung der Sondenaffinität an die RNA, wurden 3 nM, bzw. 5 nM, bzw. 500 nM der vorstehend dargestellten Beispielverbindung 1 (Verbindung 1 ) in einem Reaktionspuffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCI2, 2% TFE) mit variierenden Mengen RNA (10 μM max.) titriert und die Fluoreszenzanisotropieänderung nach 15 min. Inkubation bestimmt.To determine the probe affinity to the RNA, 3 nM, or 5 nM, and 500 nM of Example Compound 1 (Compound 1) shown above in a reaction buffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 2 % TFE) with varying amounts of RNA (10 μM max.) And fluorescence anisotropy change after 15 min. Incubation determined.
l.2.b) Experimentelle Bestimmung der Sondenaffinität an das T. thermophilus bzw. E. coli wtL11 Proteinl.2.b) Experimental determination of probe affinity to T. thermophilus or E. coli wtL11 protein
Zur Bestimmung der Sondenaffinität an das L11 Protein, wurden 3 nM bzw. 5 nM bzw. 500 nM der Beispielverbindung 1 in einem Reaktionspuffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCI2, 2% TFE) mit variierenden Mengen Protein (10 μM max.) titriert und die Fluoreszenzanisotropie-Änderung nach 15 min. Inkubation bestimmt.To determine the probe affinity to the L11 protein, 3 nM and 5 nM and 500 nM, respectively, of Exemplified Compound 1 in a reaction buffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 2% TFE) with varying amounts of protein (10 μM max.) Titrated and the fluorescence anisotropy change after 15 min. Incubation determined.
l.2.c) Experimentelle Bestimmung der Sondenaffinität an 23S rRNA Fragment/T. thermophilus wtL 11 -Protein-komplexel.2.c) Experimental determination of probe affinity to 23S rRNA fragment / T. thermophilus wtL 11 protein complexes
Zur Bestimmung der Sondenaffinität an den RN A/wtL 11 -Komplex wurden Protein im Überschuss (0,6 μM) und 3 nM der Beispielverbindung 1 in Reaktionspuffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCI2, 2% TFE) mit variierenden Mengen RNA (100 nM max) titriert und die Fluoreszenzanisotropie-Änderung nach 15 min. Inkubation bestimmt.To determine the probe affinity to the RN A / wtL 11 complex, excess protein (0.6 μM) and 3 nM of Exemplified Compound 1 in reaction buffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 2% TFE ) with varying amounts of RNA (100 nM max) and the fluorescence anisotropy change after 15 min. Incubation determined.
Ergebnisse:Results:
l.2.a') Im betrachteten Messbereich war bei Titration des fluoreszenten Liganden mit RNA, keine Änderung der Fluoreszenzanisotropie zu beobachten. Dies deutet auf Affinitäten > 10μM hin. l.2.b') Im betrachteten Messbereich war ebenfalls bei Titration des fluoreszenten Liganden mit Protein, keine Änderung der Fluoreszenzanisotropie zu beobachten. Dies deutet auf Affinitäten > 10μM hin.l.2.a ') In the measuring range under consideration, no change in fluorescence anisotropy was observed when the fluorescent ligand was titrated with RNA. This indicates affinities> 10μM. l.2.b ') In the measuring range under consideration, no change in fluorescence anisotropy was observed when the fluorescent ligand was titrated with protein. This indicates affinities> 10μM.
I.2.C') Im betrachteten Messbereich war bei Titration von konstanten Mengen T. thermophilus Protein (0,6 μM) und der Beispielverbindung 1 (3 nM) mit RNA, eine deutliche Änderung der Fluoreszenzanisotropie zu beobachten (vgl. Figur 1 ). Die graphische Auftragung der Anisotropie gegen die RNA-Konzentration zeigt einen typisch sigmoidalen Verlauf mit einem IC50 von ca. 1 nM (Hill-Fit).I.2.C ') In the measuring range considered, a significant change in the fluorescence anisotropy was observed when titrating constant amounts of T. thermophilus protein (0.6 μM) and the example compound 1 (3 nM) with RNA (see FIG. , The graphical plot of anisotropy versus RNA concentration shows a typical sigmoidal course with an IC50 of about 1 nM (Hill-Fit).
Da es sich bei diesem Experiment um die parallele Betrachtung mehrerer chemischer Gleichgewichte handelt, kann die wahrscheinliche Affinität Kapp nicht durch die Hill- Gleichung, sondern nur unter Berücksichtigung aller Gleichgewichte des Systems ermittelt werden.Since this experiment involves the parallel consideration of multiple chemical equilibria, the probable affinity K app can not be determined by the Hill equation, but only taking into account all the equilibria of the system.
Experimente l.2.a) und l.2.b) zeigen eine relativ geringe bis keine Affinitäten von RNA bzw. L11 allein an die fluoreszente Sonde und können somit vernachlässigt werden. Für die Affinität der RNA an das T. thermophilus L11 Protein konnte über EMSA- Studien ein KD-Wert von 17,69 +/- 2,47 nM bestimmt werden.Experiments l.2.a) and l.2.b) show a relatively low to no affinities of RNA or L11 alone to the fluorescent probe and can thus be neglected. For the affinity of the RNA for the T. thermophilus L11 protein, a K D value of 17.69 +/- 2.47 nM was determined by EMSA studies.
Für die Bestimmung der Sondenaffinität werden im Folgenden nur dieFor the determination of the probe affinity, only the
Gleichgewichte:Equilibria:
RNA + Protein -» RNA/Protein und RNA/Protein + Beispielverbindung 1 ->RNA + protein - »RNA / protein and RNA / protein + example compound 1 ->
RNA/Protein/ Beispielverbindung 1 berücksichtigt. Zur Ermittlung der Sondenaffinität wurde folgende Formel verwendet:RNA / protein / example compound 1 is taken into account. The following formula was used to determine the probe affinity:
Figure imgf000021_0001
mit: A: Anisotropie k1 : RNA + Protein -» RNA/Protein cRNA: RNA-Konzentration k2: RNA/Protein + FluoroTS -> RNA/Protein/FluoroTS = K0
Figure imgf000021_0001
with: A: anisotropy k1: RNA + protein - »RNA / protein cRNA: RNA concentration k2: RNA / protein + fluorosets -> RNA / protein / fluorousTS = K 0
T: SondenkonzentrationT: probe concentration
L: Proteinkonzentration Der Fit an die oben genannte Gleichung, liefert einen KD von 140 +/- 88 pML: protein concentration The fit to the above equation gives a K D of 140 +/- 88 pM
l.3.c) Affinitätsbestimmung an E.coli 23S rRNA/E.co// wtL11 Komplexel.3.c) Affinity determination of E. coli 23S rRNA / E.co // wtL11 complexes
Zur Bestimmung der Affinität der Beispielverbindung 1 wurden die gleichen experimentellen Bedingungen wie vorstehend unter Punkt I.2. gewählt. Im Unterschied zu den unter Punkt 1.2. genannten Bedingungen wurde hier jedoch das entsprechende Protein aus E.coli anstatt aus T.thermophilus verwendet.To determine the affinity of Example Compound 1, the same experimental conditions were used as in point I.2. selected. In contrast to the point 1.2. however, the corresponding protein from E. coli was used instead of T. thermophilus.
l.3.c') Ergebnisse:l.3.c ') Results:
Die Beispielverbindung 1 bindet ebenfalls an Komplexe E.coli 23S rRNA mit E.coli L11 Protein, wobei der K0 ca. 540 pM beträgt (vgl. Fit der vorstehend genannten Gleichung).Example compound 1 also binds to E.coli 23S rRNA complexes with E. coli L11 protein, the K 0 being about 540 pM (see fit of the above equation).
I.4. Verdrängungstitration der Beispielverbindung 1 zur Bestimmung der Komplexaffinitäten von Thiopeptid-NaturstoffenI.4. Displacement titration of Example Compound 1 to determine the complex affinities of thiopeptide natural products
Alle Verdrängungstitrationen wurden in 384-well-Platten (Platten: Perkin Eimer, flat black, 25 bzw. 50 μl Reaktionsvolumen; Reader. TECAN Safire II) durchgeführt. Die betrachtete physikalische Messgröße ist die Fluoreszenzpolarisation bzw. Anisotropie bei einer Anregungswellenlänge von 475 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm.All displacement titrations were carried out in 384-well plates (plates: Perkin Elmer, flat black, 25 or 50 μl reaction volume, Reader TECAN Safire II). The considered physical quantity is the fluorescence polarization or anisotropy at an excitation wavelength of 475 nm and an emission wavelength of 520 nm.
Allgemein können diese Verdrängstitrationen wie folgt durchgeführt werden:In general, these displacement titrations can be carried out as follows:
l.4.a) niedrig-affine Ligandenl.4.a) low-affinity ligands
10 nM Beispielverbindung 1, 10 nM RNA und 0,6 μM Protein werden für ca. 10 min. in Reaktions-puffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCI2, 2% TFE) präinkubiert, im Anschluss mit variierenden Konzentrationen des Thiopeptid-Naturstoffs titriert und die Fluoreszenzanisotropie-Änderung nach 15 min. Inkubation bestimmt. Ergebnisse:10 nM example compound 1, 10 nM RNA and 0.6 uM protein are for about 10 min. in reaction buffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 2% TFE), then titrated with varying concentrations of the thiopeptide natural product and the fluorescence anisotropy change after 15 min. Incubation determined. Results:
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0001
Alle Naturstoffe mit Ausnahme von Nosiheptid binden schlechter an die Zielstruktur als dieAll natural products with the exception of nosiheptide bind worse to the target structure than the
Sonde.Probe.
Nosiheptid bindet 2fach stärker an den Komplex als Thiostrepton und mit leicht höhererNosiheptide binds 2 times more to the complex than thiostrepton and slightly higher
Affinität als die Sonde.Affinity as the probe.
Fig. 1 zeigt die Affinität der Beispielverbindung 1 an den 23S rRNA Fragment/L11 -Proteinkomplex (graphische Auftragung der Anisotropie gegen die RNA-Konzentration; vgl. Punkt l.2.c) bzw. I.2.C1))1 shows the affinity of Example Compound 1 for the 23S rRNA fragment / L11 protein complex (plot of anisotropy versus RNA concentration, see item l.2.c) and I.2.C 1 ))
IAb) hoch-affine LiqandenIAb) high-affinity ligands
1OnM Beispielverbindung 1 , 10 nM der jeweiligen Testsubstanz und 0,6 μM Protein werden für 10 min im Reaktionspuffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCI2, 2% TFE) präinkubiert. Anschließend werden sie mit verschiedenen Konzentrationen von RNA titriert und nach 15-minütiger Inkubation wird die Änderung der Fluroeszenz-Anisotropie bestimmt.10 mM of the respective test substance and 0.6 μM of protein are preincubated for 10 min in the reaction buffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 2% TFE). They are then titered with various concentrations of RNA, and after 15 minutes of incubation, the change in fluorescence anisotropy is determined.
Ergebnisse:Results:
Die Titration der Beispielverbindung 1 in der Anwesenheit von Thiostrepton oder Nosiheptid ergibt eine signifikante Verschiebung der Bindungskurve nach rechts.Titration of Example Compound 1 in the presence of thiostrepton or nosiheptide gives a significant shift of the binding curve to the right.
-> beide natürlichen Substanzen binden an die Target-Struktur-> both natural substances bind to the target structure
-* Nosiheptid bindet starker als Thiostrepton Die Bindungskurve kann, unter Verwendung der Standardverfahren zur numerischen Simulation und der bekannten Target-Affinität der fluoreszierenden Probe, zur Bestimmung der Bindungskonstanten verwendet werden.- * Nosiheptide binds stronger than thiostrepton The binding curve can be used to determine the binding constants using the standard methods of numerical simulation and the known target affinity of the fluorescent probe.
Die folgende Übersicht zeigt die KD-Werte der Beispielverbindung 1 sowie Thiostrepton, Nosiheptid und Micrococcin in Bezug auf einen 23 S rRNA (E co//)/L11 -Protein (T. thermophilus)-Komp\ex.The following overview shows the KD values of Example Compound 1 as well as thiostrepton, nosiheptide and micrococcin with respect to a 23S rRNA (Eco //) / L11 protein (T. thermophilus) complex.
Figure imgf000024_0001
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1.5. Mutierte Biomakromoleküle1.5. Mutated biomacromolecules
Alle Messungen bzgl. der Affinitätsbestimmung wurden in 384-well Mikrotiterplatten (Mikrotiterplatten: Perkin Eimer, flat black, 50 μl Reaktionsvolumen; Lesegerät: TECAN Safire II) ausgeführt.All measurements for affinity determination were carried out in 384-well microtiter plates (microtiter plates: Perkin Elmer, flat black, 50 μl reaction volume, reader: TECAN Safire II).
Bei der gemessenen physikalischen Größe handelt es sich um die Fluoreszenz- Polarisierung/Anisotropie mit einer Anregungswellenlänge von 475 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm. Die Dauer der Messung einer vollen Mikrotiterplatte mit 50 Messungen pro well betrug 5 min.The measured physical quantity is the fluorescence polarization / anisotropy with an excitation wavelength of 475 nm and an emission wavelength of 520 nm. The duration of the measurement of a full microtiter plate with 50 measurements per well was 5 min.
l.5.a) Experimentelle Bestimmung der Sondenaffinität zum mutierten 23S rRNA- Fragment/wtL11 Protein-Komplex.l.5.a) Experimental determination of probe affinity to the mutated 23S rRNA fragment / wtL11 protein complex.
Zur Bestimmung der Sonden-Affinität zum mutierten 23S rRNA-Fragment/wtl_11 Proteinkomplex, wurden 5 nM der nachstehend hergestellten Beispielverbindung 2 und ein Überschuß von Protein (0,6 μM) mit verschiedenen Mengen der mutierten RNA in einem Reaktionspuffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCI2, 2% TFE) titriert. Die Änderung der Fluoreszenz-Anisotropie wurde nach 15-minütiger Inkubation bestimmt.To determine the probe affinity for the mutated 23S rRNA fragment / wtl_11 protein complex, 5 nM of Exemplified Compound 2 prepared below were used and an excess of protein (0.6 μM) with different amounts of mutant RNA in one Reaction buffer (10 mM MOPS pH 8.0, 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 2% TFE) titrated. The change in fluorescence anisotropy was determined after a 15 minute incubation.
Ergebnisse:Results:
2020
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0001
1E-7 1 E-6 1E-5 1E-4 1 E-3 0,01 0,1 10 G1068U 0,28 +/- 0,091E-7 1 E-6 1E-5 1E-4 1 E-3 0.01 0.1 10 G1068U 0.28 +/- 0.09
[RNA]/μM[RNA] / uM
A1089G 0,36 +/- 0,17A1089G 0.36 +/- 0.17
Lediglich Mutationen an den essentiellen Positionen A1067 wt 0,33 +/- 0,17 und A1095 haben einen Einfluss auf die Sondenaffinität. Die stärkste Auswirkung mit einem 1200- bis 1400-fachen Abfall in der Bindungsaffinität wurde für die Mutation A1067C oder U beobachtet. Eine Änderung zu einem G, somit eineOnly mutations at the essential positions A1067 wt 0.33 +/- 0.17 and A1095 have an influence on the probe affinity. The strongest effect, with a 1,200 to 1,400 fold decrease in binding affinity, was observed for the A1067C or U mutation. A change to a G, thus a
Purinbase beibehaltend, hat keinen Effekt auf die Bindung.Retaining purine base has no effect on binding.
Das 2'O-methyl-A1067-Fragment (der natürliche Abwehrmechanismus von Thiopeptid- produzierenden Streptomyces-Stämmen) hat den höchsten KD, ein 3000-facher Affinitätsabfall im Vergleich zur Wildtyp-RNA.The 2'O-methyl-A1067 fragment (the natural defense mechanism of thiopeptide-producing Streptomyces strains) has the highest K D , a 3000-fold decrease in affinity compared to wild-type RNA.
Hinsichtlich der getesteten A1095-Mutanten konnten nur geringe Effekte, ein 10-15-facher Abfall der Bindungsaffinität, beobachtet werden. .6. Herstellung gefärbter ZellenWith respect to the tested A1095 mutants, only minor effects, a 10-15 fold decrease in binding affinity, could be observed. .6. Production of stained cells
l.β.a) Zeilkulturpräparationl.β.a) Zeilkulturpräparation
BSC-1 -Zellen (ATCC No. CCL 26) werden in D-MEM-Medium (Gibco), versetzt mit 4500 mg/L Glukose, Pyruvat, Glutamin, nicht-essentielle Aminosäuren und 10% FKS (Gibco) bei 37°C and 5% CO2 kultiviert. Im vorliegenden Fall werden ausschließlich Zellen nach 5-25 Passagen verwendet. Die Zellen werden mit 0.25% Trypsin und 1 mM EDTA in HBSS (8 g/L NaCI, 0.4 g/L KCl, 60 mg/L KH2PO4, 1 g/L Glukose, 48 mg/L Na2HPO4, 98 mg/L MgSO4, 140 mg/L CaCI2, 350 mg/L Na2CO3) trypsiniert und in einer Dichte von 20,000 Zellen pro Slide in D-MEM versetzt mit 4500 mg/L Glukose, Pyruvat, Glutamin, nicht-essentielle Aminosäuren und 10% FKS plattiert.BSC-1 cells (ATCC No. CCL 26) are incubated in D-MEM medium (Gibco) supplemented with 4500 mg / L glucose, pyruvate, glutamine, nonessential amino acids and 10% FCS (Gibco) at 37 ° C and 5% CO 2 cultured. In the present case, only cells are used after 5-25 passages. The cells are washed with 0.25% trypsin and 1 mM EDTA in HBSS (8 g / L NaCl, 0.4 g / L KCl, 60 mg / L KH 2 PO 4 , 1 g / L glucose, 48 mg / L Na 2 HPO 4 , 98 mg / L MgSO 4 , 140 mg / L CaCl 2 , 350 mg / L Na 2 CO 3 ) and in a density of 20,000 cells per slide in D-MEM with 4500 mg / L glucose, pyruvate, glutamine, not Essential amino acids and 10% FCS plated.
Für die Färbung der Mitochondrien werden lebende Zellen für nach 12-24 h mit 170 nM MitoTracker Red (Invitrogen) für 30 min inkubiert und vorsichtig mit PBS-Puffer (150 mM NaCI, 25 mM NaH2PO4) gewaschen.For the staining of the mitochondria, live cells are incubated for 12-24 h with 170 nM MitoTracker Red (Invitrogen) for 30 min and washed carefully with PBS buffer (150 mM NaCl, 25 mM NaH 2 PO 4 ).
Die Fixierung wird 10 min. mittels einer Fixierungslösung enthaltend 37% Formaldehyd, 100 mM KPipes, 10 mM EGTA, 1 mM MgCI , 0,1% TX-100 (Sigma) in Wasser durchgeführt. Die fixierten Zellen werden mit TBS-T gewaschen und 1 h mit 2% BSA (Sigma) in TBS-T geblockt und wiederum in TBS-T gewaschen.The fixation is 10 min. by means of a fixative solution containing 37% formaldehyde, 100 mM KPipes, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl, 0.1% TX-100 (Sigma) in water. The fixed cells are washed with TBS-T and blocked with 2% BSA (Sigma) in TBS-T for 1 h and washed again in TBS-T.
l.6.b) Zellfärbunαl.6.b) cell staining
Zur Färbung mit einer erfindungsgemäßen Thiopeptid-Sonde werden fixierte Zellen mit 10 μM fluoreszierender Thiostrepton-Sonde mit oder ohne nicht-markierten Thiostrepton als Kompetitor (apparent c = 50 μM) eine Stunde lang behandelt.For staining with a thiopeptide probe of the invention, fixed cells are treated with 10 μM fluorescent thiostrepton probe with or without unlabelled thiostrepton as competitor (apparent c = 50 μM) for one hour.
Nach der Färbung werden die Zellen gründlich gewaschen und mit AquaPolyMount (Polysciences Inc.) auf einem Objektträger befestigt. Die Zellen können mit einem konfokalen DM IBRE-Mikroskop (Leica) visualisiert werden. II. BeispieleAfter staining, cells are washed thoroughly and mounted on a microscope slide with AquaPolyMount (Polysciences Inc.). The cells can be visualized with a confocal DM IBRE microscope (Leica). II. Examples
Die eingesetzten Chemikalien und Lösungsmittel wurden kommerziell bei den herkömmlichen Anbietern (Acros, Avocado, Aldrich, Bachern, Fluka, Lancaster, Maybridge, Merck, Sigma, TCI, etc.) bezogen oder nach den für den Fachmann bekannten Methoden synthetisiert.The chemicals and solvents used were obtained commercially from the conventional suppliers (Acros, Avocado, Aldrich, Bachern, Fluka, Lancaster, Maybridge, Merck, Sigma, TCI, etc.) or synthesized according to methods known to those skilled in the art.
11.1. Allgemeine Vorschrift zum verkürzenden Abbau von Thiostrepton11.1. General rule for the shortening degradation of thiostrepton
Einfach- ( V1 ) bzw. zweifach- ( V2) verkürztes Thiostrepton wird durch folgende Reaktion erhalten:Single (V1) or double (V2) truncated thiostrepton is obtained by the following reaction:
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000027_0001
Thiostrepton
Figure imgf000027_0002
thiostrepton
Figure imgf000027_0002
V1 V2V1 V2
Reaktionreaction
1 g Thiostrepton (0,6 mmol) wird in 50 ml CHCI3 gelöst. Es werden 5 ml Et2NH bei 00C unter ständigem Rühren langsam hinzugegeben. Das Eisbad wird nach 5 min entfernt und die Reaktionslösung bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 2 h gerührt. Das Lösungsmittel wird bei reduziertem Druck entfernt, wobei zweimal mit Toluol coevaporiert wird.1 g of thiostrepton (0.6 mmol) is dissolved in 50 ml of CHCl 3 . 5 ml of Et 2 NH are slowly added at 0 ° C. with constant stirring. The ice bath is removed after 5 minutes and the reaction solution is stirred at room temperature for a period of 2 hours. The Solvent is removed under reduced pressure, coevaporating twice with toluene.
AufreiniqunqAufreiniqunq
Die eingeengte Reaktionsmischung wird in CHCI3 / MeOH 2% wieder aufgenommen und mittels einer Silica-Säule aufgetrennt. Als Laufmittel wird CHCI3 / MeOH 2-5 % verwendet.The concentrated reaction mixture is taken up in CHCl 3 / MeOH 2% and separated by means of a silica column. The eluent used is CHCl 3 / MeOH 2-5%.
Ausbeuteyield
Einfach verkürztes Thiostrepton-Derivat V1: 494 mgSimply truncated thiostrepton derivative V1: 494 mg
Zweifach verkürztes Thiostrepton-Derivat V2: 77 mg.Twofold shortened thiostrepton derivative V2: 77 mg.
II.2. Allgemeine Vorschrift zur Synthese der oxidierten Variante von Thiostrepton(-Derivaten)II.2. General procedure for the synthesis of the oxidized variant of thiostrepton (derivatives)
Der Thiazolinring des Thiostrepton-Grundgerüstes kann selektiv zum entsprechenden Thiazolring oxidiert werden. Diese Modifikation kann sowohl an Thiostrepton selbst, als auch an die verkürzten Varianten V1 und V2 eingefügt werden.The thiazoline ring of the thiostrepton skeleton can be selectively oxidized to the corresponding thiazole ring. This modification can be inserted both to thiostrepton itself, as well as to the shortened variants V1 and V2.
Figure imgf000028_0001
Beispielsweise erhält man das Thiostrepton-Derivat V1ox durch Oxidation des Thiazolinrings der einfach verkürzten Thiostrepton-Variante V1.
Figure imgf000028_0001
For example, the thiostrepton derivative V1ox is obtained by oxidation of the thiazoline ring of the singly truncated thiostrepton variant V1.
Reaktionreaction
240 mg des einfach-verkürzten Thiostrepton-Derivats V1 werden in 20 ml CHCI3 gelöst und bei 00C mit 2,2 Äquivalenten DBU versetzt. Daraufhin werden 1 ,5 Äquivalente BrCCI3 langsam zugegeben. Nach 3 Tagen wird die Reaktionslösung bei reduziertem Druck eingeengt und aufgereinigt.240 mg of the single-condensed thiostrepton derivative V1 are dissolved in 20 ml of CHCI 3 was added at 0 0 C and 2.2 equivalents of DBU. Then, 1.5 equivalents of BrCCl 3 are added slowly. After 3 days, the reaction solution is concentrated under reduced pressure and purified.
AufreiniqunqAufreiniqunq
Das Produkt wird mittels präparativer HPLC bei einem Gradienten von 40 bis 75 %The product is purified by preparative HPLC at a gradient of 40 to 75%.
Acetonitril in Wasser auf einer C4-RP-Säule aufgereinigt.Acetonitrile in water on a C4 RP column.
Ausbeuteyield
Es werden 55 mg V1ox erhalten.55 mg of V1ox are obtained.
Analytikanalytics
MALDI-MS gefunden: m/z = 1615,48 [M+Na]+ berechnet: 1615,44. ESI-LCMS gefunden: m/z = 1593,12 [M+H]+ berechnet: 1593,46.MALDI-MS found: m / z = 1615.48 [M + Na] + calculated: 1615.44. ESI LCMS found: m / z = 1593.12 [M + H] + calculates: 1593.46.
1H-NMR (400 MHz, CDCI3-MeOD 4:1 ): δ = 0.73 (t, J = 7.28 Hz, 4H), 0.84 (m, 6H), 0.93 (m, 2H), 1.03 (m, 7H), 1.12 (d, J = 6.41 Hz, 3H), 1.24 (d, J = 6,65 Hz1 3H), 1.28 (d, J = 6,64 Hz, 3H), 1.51 (d, J = 7,02 Hz, 3H), 1.55 (d, J = 6,57 Hz, 3H), 1.86 (s, 1 H), 2.14 (td, J = 5.54, 13.25, 12,91 Hz, 1 H), 2.76 (m, 1 H), 2.81 (d, J = 4.43 Hz, 1 H), 3.31 (dd, J = 5.86, 19.26 Hz, 1 H), 3.46 (dd, J = 2.07, 5.79 Hz, 1 H), 3.53 (s, 1 H), 3.63 (q, J = 6.60, 6.45 Hz, 1 H), 3.71 (q, J = 6.33, 6.19 Hz, 1 H), 4.26 (s, 1 H)1 4.39 (d, J = 3.79 Hz, 1 H), 4.58 (q, J = 6.50, 6.63 Hz, 1 H), 5.17 (m, 3H), 5.48 (d, J = 1.66 Hz), 5.69 (m, 3H), 6.13 (m, 1 H)1 6.22 (m, 2H)1 6.48 (d, J = 1.71 Hz, 1 H), 6.74 (d, J = 10.08 Hz, 1 H), 7.17 (s, 1 H), 7.39 (s, 1 H), 7.87 (s, 1 H), 8.05 (s, 1 H), 8.11 (s, 1 H). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 -MeOD 4: 1): δ = 0.73 (t, J = 7.28 Hz, 4H), 0.84 (m, 6H), 0.93 (m, 2H), 1.03 (m, 7H ), 1.12 (d, J = 6.41 Hz, 3H), 1.24 (d, J = 6.65 Hz 1 3H), 1.28 (d, J = 6.64 Hz, 3H), 1.51 (d, J = 7, 02 Hz, 3H), 1.55 (d, J = 6.57 Hz, 3H), 1.86 (s, 1H), 2.14 (td, J = 5.54, 13.25, 12.91 Hz, 1H), 2.76 (m , 1 H), 2.81 (d, J = 4.43 Hz, 1 H), 3.31 (dd, J = 5.86, 19.26 Hz, 1 H), 3.46 (dd, J = 2.07, 5.79 Hz, 1 H), 3.53 ( s, 1 H), 3.63 (q, J = 6.60, 6.45 Hz, 1 H), 3.71 (q, J = 6.33, 6.19 Hz, 1 H), 4.26 (s, 1 H) 1 4.39 (d, J = 3.79 Hz, 1 H), 4.58 (q, J = 6.50, 6.63 Hz, 1 H), 5.17 (m, 3H), 5.48 (d, J = 1.66 Hz), 5.69 (m, 3H), 6.13 (m, 1 H) 1 6.22 (m, 2H) 1 6.48 (d, J = 1.71 Hz, 1 H), 6.74 (d, J = 10.08 Hz, 1 H), 7.17 (s, 1 H), 7.39 (s, 1 H), 7.87 (s, 1 H), 8.05 (s, 1 H), 8.11 (s, 1 H).
II.3. Allgemeine Vorschrift zur Synthese der reduzierten Variante von Thiostrepton (-Derivaten)II.3. General procedure for the synthesis of the reduced variant of thiostrepton (derivatives)
Thiostrepton (50 mg, 0,03 mmol) wird in trockenen THF (2ml) gelöst und auf -10 0C bei einer inerten Atmosphäre gekült. NaBH3CN (3 eq) wird in trockenem THF (0,5 ml) gelöst und der Thiostreptonlösung tropfenweise, langsam zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird nach 1 Stunde nicht mehr gekühlt und anschließend bei Zimmertemperatur 15 Stunden lang gerührt. Die flüchtigen Anteile werden unter reduziertem Druck entfernt und der Rest in Triflourethanol gelöst. Die Lösung wird mittels präparativer HPLC (C4-RP-Säule) bei einem Wasser-Acetonitril Gradienten oder mit Hilfe einer Silica-Gel-Kolonne (CHCVMethonal), chromatographisch gereinigt.Thiostrepton (50 mg, 0.03 mmol) is dissolved in dry THF (2ml) and gekült to -10 0 C in an inert atmosphere. NaBH 3 CN (3 eq) is dissolved in dry THF (0.5 ml) and added slowly to the thiostrepton solution dropwise. The reaction mixture is after 1 No longer cooled and then stirred at room temperature for 15 hours. The volatiles are removed under reduced pressure and the residue dissolved in trifluoroethanol. The solution is purified by preparative HPLC (C4-RP column) in a water-acetonitrile gradient or by means of a silica gel column (CHCVMethonal), chromatographically.
II.4. Allgemeine Vorschrift zur Synthese der Thiol-Michael-Addukte von Thiostrepton(-Derivaten)II.4. General procedure for the synthesis of the thiol-Michael adducts of thiostrepton (derivatives)
Thiostrepton-Derivate der generellen Struktur D1 können durch Reaktion von einfach verkürztem Thiostrepton-Derivat V1 (vgl. oben) mit verschiedenen funktionalisierten Thiolen (LX) erhalten werden, wobei die Reste FL und X die vorstehend genannte Bedeutung haben [Schema 1].Thiostrepton derivatives of general structure D1 can be obtained by reaction of singly truncated thiostrepton derivative V1 (see above) with various functionalized thiols (LX), where the radicals FL and X have the abovementioned meaning [Scheme 1].
Schema 1Scheme 1
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0001
Analoge Additionsprodukte D2 können erhalten werden durch Reaktion des zweifachverkürzten Thiostrepton-Derivats V2 mit verschiedenen funktionalisierten Thiolen (LX), wobei die Reste FL und X die vorstehend genannte Bedeutung haben [Schema 2]. Schema 2Analogous addition products D2 can be obtained by reaction of the trisubstituted thiostrepton derivative V2 with various functionalized thiols (LX), where the radicals FL and X have the abovementioned meaning [Scheme 2]. Scheme 2
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0001
Weiterhin können Doppeladdukte D3 erhalten werden, die ausgehend von Thiostrepton- Derivat V1 durch Addition zweier funktionalisierten Thiole (LX) entstehen, wobei die Reste FL und X die vorstehend genannte, ggfs. jeweils unterschiedliche Bedeutung haben [Schema 3].Furthermore, it is possible to obtain double adducts D3 which, starting from thiostrepton derivative V1, are formed by addition of two functionalized thiols (LX), where the radicals FL and X have the abovementioned, if appropriate, different meanings [Scheme 3].
Figure imgf000031_0002
Figure imgf000031_0002
D3D3
Werden bei den Umsetzungen gemäß dem vorstehenden Schema 1 , Schema 2 bzw. Schema 3 an Stelle der dort aufgeführten funktionalisierten Thiole der allgemeinen Formel LX die vorstehend erläuterten funktionalisierten Thiole der allgemeinen Formal (MX),If, in the reactions according to the above Scheme 1, Scheme 2 or Scheme 3, instead of the functionalized thiols of the general formula LX listed there, the above-described functionalized thiols of the general formula (MX),
Figure imgf000031_0003
Figure imgf000031_0003
(MX) wobei X und FL die vorstehend angegebene Bedeutung haben, eingesetzt, so erhält man bei der Umsetzung mit V1 das nachfolgende Derivat D4,(MX) where X and FL have the abovementioned meaning, the following derivative D4 is obtained in the reaction with V1,
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000032_0001
bei der Umsetzung mit V2 das nachfolgende Derivat D5,in the reaction with V2 the following derivative D5,
Figure imgf000032_0002
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(D5)(D5)
bzw. bei der Umsetzung von V1 mit zwei, ggfs. unterschiedlichen, funktionalisierten Thiolen (MX) des nachfolgenden Derivats D6
Figure imgf000033_0001
or in the reaction of V1 with two, optionally different, functionalized thiols (MX) of the following derivative D6
Figure imgf000033_0001
(D6)(D6)
IM.5. Allgemeine Vorschrift zur Synthese der funktionalisierten Thiole mit dem Rest der allgemeinen Formel (L1)IM.5. General procedure for the synthesis of the functionalized thiols with the rest of the general formula (L1)
Funktionalisierte Thiole mit dem Rest der allgemeinen Formel (L1) können ausgehend von Diamin A1 , Trityl-geschützter Mercaptopropionsäure A2 und Acylierungsreagenz A3 erhalten werden. In einem ersten Schritt wird durch eine Amidknüpfung das Amin A4 erhalten, welches in einem weiteren Schritt mittels Acylierungsreagenz A3 in Anwesenheit eines Fluoreszenzfarbstoffs A5 zum funktionalisierten (und geschützten) Thiol (L1a) umgesetzt wird. Durch Trityl-Entschützung gelangt man zu funktionellem Thiol mit dem Rest (L1), [Schema 4], der die vorstehend genannte Bedeutung hat.Functionalized thiols with the rest of the general formula (L1) can be obtained starting from diamine A1, trityl-protected mercaptopropionic acid A2 and acylating reagent A3. In a first step, the amine A4 is obtained by an amide linkage, which is converted in a further step by means of acylating reagent A3 in the presence of a fluorescent dye A5 to the functionalized (and protected) thiol (L1a). Trityl deprotection leads to functional thiol with the remainder (L1), [Scheme 4], which has the abovementioned meaning.
Schema 4:Scheme 4:
Figure imgf000033_0002
Figure imgf000033_0002
Thiol (L1a) Analoges gilt für die Synthese weiterer funktionalisierter Thiole der allgemeinen Formel (LX). 11.6. Synthese des geschützten Amins A4Thiol (L1a) The same applies to the synthesis of further functionalized thiols of the general formula (LX). 11.6. Synthesis of the protected amine A4
Reaktionreaction
350 mg Trt-Mercaptopropionsäure (1 mmol) wird zusammen mit 948 mg HBTU (2.5 eq) in 10 ml DMF gelöst. Nach 10 min wird diese Mischung zu einer Lösung von 2,19 ml PEG (10 eq) in 10 ml DCM bei 00C unter ständigem Rühren langsam zugetropft. Nach 30 min wird das Kältebad entfernt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.350 mg Trt-mercaptopropionic acid (1 mmol) is dissolved in 10 ml DMF together with 948 mg HBTU (2.5 eq). After 10 minutes, this mixture is slowly added dropwise to a solution of 2.19 ml of PEG (10 eq) in 10 ml of DCM at 0 ° C. with constant stirring. After 30 minutes, the cold bath is removed and stirred overnight at room temperature.
Aufarbeitungworkup
Die Lösungsmittel werden unter Vakuum entfernt und der Rückstand in Ethylacetat wieder aufgenommen. Es wird mit gesättigter NaHCO3-Lösung und gesättigter NaCI-Lösung gewaschen und die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 getrocknet.The solvents are removed in vacuo and the residue is taken up in ethyl acetate. It is washed with saturated NaHCO 3 solution and saturated NaCl solution and the combined organic phases are dried over Na 2 SO 4 .
AufreinigunqAufreinigunq
Das Produkt wird durch Silica-Flash-Chromatographie mit einem Lösungsmittelgradienten von CHCI3 / MeOH 5-9 % aufgereinigt.The product is purified by silica flash chromatography with a solvent gradient of CHCl 3 / MeOH 5-9%.
Ausbeuteyield
Es werden 329 mg eines leicht gelblich gefärbten Öls erhalten (59 % Ausbeute).329 mg of a slightly yellowish-colored oil are obtained (59% yield).
Analytikanalytics
MALDI-MS gefunden: m/z = 551 ,34 [M+H]+ berechnet: 551 ,29.MALDI-MS found: m / z = 551, 34 [M + H] + calculated: 551, 29.
ESI-LCMS gefunden: m/z = 551 ,20 [M+H]+ berechnet: 551 ,29.ESI-LCMS found: m / z = 551, 20 [M + H] + calculated: 551, 29.
DC R, = 0,38 (DCM, 10% MeOH)DC R, = 0.38 (DCM, 10% MeOH)
1H-NMR (400 MHz, CDCI3) δ 7.39 - 7.31 (m, 6H)1 7.27 - 7.25 (m, 1 H), 7.23 - 7.21 (m, 3H), 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 7.39-7.31 (m, 6H) 1 7.27-2.25 (m, 1H), 7.23-2.21 (m, 3H),
7.19 - 7.13 (m, 3H), 7.02 (s, 2H), 5.94 (s, 1 H), 3.69 (t, J = 5.2, 2H), 3.63 - 3.58 (m, 2H), 3.587.19 - 7.13 (m, 3H), 7.02 (s, 2H), 5.94 (s, 1H), 3.69 (t, J = 5.2, 2H), 3.63 - 3.58 (m, 2H), 3.58
- 3.51 (m, 5H), 3.51 - 3.47 (m, 2H), 3.40 - 3.35 (m, 2H), 3.20 - 3.10 (m, 4H), 2.89 (s, 1 H),- 3.51 (m, 5H), 3.51 - 3.47 (m, 2H), 3.40 - 3.35 (m, 2H), 3.20 - 3.10 (m, 4H), 2.89 (s, 1 H),
2.40 (t, J = 7.1 , 2H), 2.05 (t, J = 7.0, 2H), 1.89 - 1.82 (m, 2H), 1.65 - 1.57 (m, 2H). 11.7. Umsetzen des geschützten Amins A4 mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) als fluoreszierender Farbstoff zum Erhalt des (geschützten) funktionalisierten Thiols (L1a- FITC)2.40 (t, J = 7.1, 2H), 2.05 (t, J = 7.0, 2H), 1.89 - 1.82 (m, 2H), 1.65 - 1.57 (m, 2H). 11.7. Reaction of the protected amine A4 with FITC (fluorescein isothiocyanate) as a fluorescent dye to obtain the (protected) functionalized thiol (L1a-FITC)
Reaktionreaction
136 mg des Amins A4 (0.25 mmol) werden in 30 ml Aceton / CHCI3 1 :2 gelöst und mit 106 mg FITC (B5) (1.1 eq) versetzt. Es werden 43 μl DIPEA (A3) (1 eq) hinzugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen der Lösungsmittel unter Vakuum wird der Rückstand direkt ohne Aufarbeitung der Chromatographie zugeführt [Schema 5].136 mg of the amine A4 (0.25 mmol) are dissolved in 30 ml of acetone / CHCl 3 1: 2 and admixed with 106 mg of FITC (B5) (1.1 eq). 43 μl of DIPEA (A3) (1 eq) are added and the reaction mixture is stirred at room temperature overnight. After removal of the solvents under vacuum, the residue is passed directly to the chromatography without further workup [Scheme 5].
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000035_0001
AufreiniqunqAufreiniqunq
Das Produkt wird durch Silica-Flash-Chromatographie mit einem Lösungsmittelgradienten von Ethylacetat / MeOH 5-10 % aufgereinigt.The product is purified by silica flash chromatography with a solvent gradient of ethyl acetate / MeOH 5-10%.
Ausbeuteyield
Es werden 65 mg erhalten (28% Ausbeute).65 mg are obtained (28% yield).
Analytikanalytics
ESI-LCMS gefunden: m/z = 940,12 [M+H]+ berechnet: 940,33.ESI-LCMS found: m / z = 940.12 [M + H] + calculated: 940.33.
DC R, = 0,55 (Ethylacetat, 10% MeOH)TLC R, = 0.55 (ethyl acetate, 10% MeOH)
1H-NMR (400 MHz, CDCI3 / MeOD 6:1 ) δ 7.85 (s, 1 H), 7.78 (d, J = 8.3, 1 H), 7.22 (s, 3H)1 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 / MeOD 6: 1) δ 7.85 (s, 1H), 7.78 (d, J = 8.3, 1H), 7.22 (s, 3H) 1
7.11 (t, J = 7.5, 6H), 7.06 - 7.01 (m, 3H), 6.96 (d, J = 8.3, 1 H), 6.56 (d, J = 2.3, 2H), 6.51 (d,7.11 (t, J = 7.5, 6H), 7.06-7.01 (m, 3H), 6.96 (d, J = 8.3, 1H), 6.56 (d, J = 2.3, 2H), 6.51 (d,
J = 8.7, 2H), 6.38 (dd, J = 2.3, 8.7, 2H), 3.84 (s, 5H), 3.59 (s, 2H), 3.49 - 3.42 (m, 8H), 3.41 -J = 8.7, 2H), 6.38 (dd, J = 2.3, 8.7, 2H), 3.84 (s, 5H), 3.59 (s, 2H), 3.49 - 3.42 (m, 8H), 3.41 -
3.36 (m, 2H), 3.33 (t, J = 6.2, 2H), 3.06 (t, J = 6.7, 2H), 2.29 (t, J = 7.3, 2H), 1.97 (t, J = 7.3,3.36 (m, 2H), 3.33 (t, J = 6.2, 2H), 3.06 (t, J = 6.7, 2H), 2.29 (t, J = 7.3, 2H), 1.97 (t, J = 7.3,
2H), 1.80 - 1.72 (m, 2H), 1.60 - 1.52 (m, 2H), 1.10 (s, 1 H). 11.8. Synthese der Beispielverbindung 12H), 1.80 - 1.72 (m, 2H), 1.60 - 1.52 (m, 2H), 1.10 (s, 1H). 11.8. Synthesis of Exemplified Compound 1
11.8.1. Trityl-Entschützυng:11.8.1. Trityl Entschützυng:
26 mg des Trityl-geschützten Thiols (LIa-FITC) (0,028 mmol) werden für 10 min mit 3 ml einer Lösung aus 8 % TFA und 1 ,1 Äquivalenten TES (4,8 μl) in CHCI3 behandelt. Der Reaktionsverlauf wird mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt. Nach vollständiger Entschützung des Thiols, d.h. nach Erhalt der Verbindung der allgemeinen Formel (L1- FITC), wird das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt, wobei zweimal mit Toluol coevaporiert wird [Schema 6].26 mg of the trityl-protected thiol (LIA-FITC) (0.028 mmol) are treated for 10 min with 3 ml of a solution of 8% TFA and 1.1 equivalents TES (4.8 μl) in CHCl 3 . The course of the reaction is monitored by thin layer chromatography. After complete deprotection of the thiol, ie after obtaining the compound of general formula (L1-FITC), the solvent is removed under reduced pressure, coevaporating twice with toluene [Scheme 6].
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000036_0001
11.8.2. Thiol-Michael Addition11.8.2. Thiol-Michael Addition
Die eingeengte Reaktionsmischung wird in 5 ml TFE / 1 ml 50 mM Natriumcarbonat-Puffer pH 10 wieder aufgenommen. Der pH-Wert der Lösung wird mit gesättigter NaHCO3-Lösung auf pH 8 eingestellt. Zu dieser Lösung wird 66 mg des einfach verkürzten Thiostrepton- Derivats V1 gegeben. Die Reaktion wird unter Ar-Schutzgasatmosphäre durchgeführt. Nach 4 Tagen wird die Reaktionslösung bei reduziertem Druck eingeengt und aufgereinigt [Schema 7]. The concentrated reaction mixture is resumed in 5 ml of TFE / 1 ml of 50 mM sodium carbonate buffer pH 10. The pH of the solution is adjusted to pH 8 with saturated NaHCO 3 solution. To this solution is added 66 mg of singly truncated thiostrepton derivative V1. The reaction is carried out under Ar protective gas atmosphere. After 4 days, the reaction solution is concentrated under reduced pressure and purified [Scheme 7].
Schema 7:Scheme 7:
V1
Figure imgf000037_0001
V1
Figure imgf000037_0001
(L1 -FITC)(L1 -FITC)
Figure imgf000037_0002
Figure imgf000037_0002
(1) (= Beispielverbindung 1)(1) (= Example compound 1)
II.8.3 AufreiniqunqII.8.3 Aufreiniqunq
Das Produkt wird mittels präparativer HPLC bei einem Gradienten von 10 bis 40 %The product is purified by preparative HPLC at a gradient of 10 to 40%.
Acetonitril in Wasser auf einer C4-RP-Säule aufgereinigt.Acetonitrile in water on a C4 RP column.
Ausbeute: Es werden 4 mg erhalten (4 % Ausbeute).Yield: 4 mg are obtained (4% yield).
Analytikanalytics
MALDI-MS gefunden: m/z = 2313,20 [M+Na]+ berechnet: 2314,67.MALDI-MS found: m / z = 2313.20 [M + Na] + calculated: 2314.67.
ESI-LCMS gefunden: m/z = 1146,95 [M+2H]2+ berechnet: 1146,85.ESI-LCMS found: m / z = 1146.95 [M + 2H] 2+ calculated: 1146.85.
UV-Vis 30 μM in 10% TFE in 50 mM Natriumphosphat-Puffer pH 9. λmax = 496 nm, 283 nm,UV-Vis 30 μM in 10% TFE in 50 mM sodium phosphate buffer pH 9. λ max = 496 nm, 283 nm,
238 nm.238 nm.
Sp Zersetzung ab 2200C. 1H-NMR (400 MHz, CDCI3-MeOD 4:1 ): δ = 0.65 (d, J = 6.78 Hz, 3H)1 0.73 (t, J = 7.40 Hz1 4H)1 0.85 (d, J = 6.88 Hz, 4H)1 0.96 (d, J = 6.60 Hz1 2H)1 1.01 (m, 8 H), 1.14 (d, J = 6.47 Hz, 4H)1 1.23 (d, J = 6.56, 4H)1 1.27 (m, 3H)1 1.46 (d, J = 7.24, 3H), 1.56 (d, J = 6.77 Hz1 6H)1 1.78 (m, 3H), 2.30 (m, 1 H)1 2.69 (m, 2H)1 2.82 (m, 3H), 3.04 (m, 3H)1 3.33 (m, 2H)1 3.41 (s, 2H)1 3.46 (s, 12H)1 3.65 (m, 5H)1 4.26 (m, 2H), 4.56 (d, J = 6.17 Hz, 1 H), 4.63 (m, 1 H)1 4.82 (dd, J = 9.02 Hz1 12.76 Hz, 1 H), 5.17 (m, 3H), 5.60 (m, 2H), 5.68 (s, 1 H)1 6.07 (q, J = 6.73 Hz1 6.74 Hz1 1 H), 6.21 (m, 2H), 6.44 (m, 4 H), 6.74 (d, J = 9.76 Hz1 1 H)1 6.95 (d, J = 9.13 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 8.51 Hz, 1 H)1 7.15 (s, 1H)1 7.41 (s, 1 H)1 7.72 (s, 1 H), 8.02 (s, 1 H)1 8.08 (s, 1H)1 8.13 (s, 1 H).Sp decomposition from 220 ° C. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 -MeOD 4: 1): δ = 0.65 (d, J = 6.78 Hz, 3H) 1 0.73 (t, J = 7.40 Hz 1 4H) 1 0.85 (d, J = 6.88 Hz, 4H) 1 0.96 (d, J = 6.60 Hz 1 2H) 1 1.01 (m, 8H), 1.14 (d, J = 6.47 Hz, 4H) 1 1.23 (d, J = 6.56, 4H) 1 1.27 ( m, 3H) 1 1.46 (d, J = 7.24, 3H), 1.56 (d, J = 6.77 Hz 1 6H) 1 1.78 (m, 3H), 2.30 (m, 1H) 1 2.69 (m, 2H) 1 2.82 (m, 3H), 3.04 (m, 3H) 1 3.33 (m, 2H) 1 3.41 (s, 2H) 1 3.46 (s, 12H) 1 3.65 (m, 5H) 1 4.26 (m, 2H), 4.56 (d, J = 6.17 Hz, 1H), 4.63 (m, 1H) 1 4.82 (dd, J = 9.02 Hz 1 12.76 Hz, 1H), 5.17 (m, 3H), 5.60 (m, 2H), 5.68 (s, 1 H) 1 6.07 (q, J = 6.73 Hz 1 6.74 Hz 1 1 H), 6.21 (m, 2H), 6.44 (m, 4 H), 6.74 (d, J = 9.76 Hz 1 1 H ) 1 6.95 (d, J = 9.13 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 8.51 Hz, 1 H) 1 7.15 (s, 1H) 1 7.41 (s, 1 H) 1 7.72 (s, 1 H), 8.02 (s, 1 H) 1 8.08 (s, 1H) 1 8.13 (s, 1 H).
11.9. Beispielverbindung 211.9. Example compound 2
11.9.1 Synthese von S-Trityl-2-aminoethanthiol 111.9.1 Synthesis of S-trityl-2-aminoethanethiol 1
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000038_0001
Eine Lösung von 2-aminoethanthiol-HCL (1 g, 8,8 mmol) in CH2CI2 (40 ml) und Triflouressigsäure (1 ,3 ml, 2 eq) wird mit Tritylchlorid (2,45 g, 1 eq) vermischt. Die Lösung wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 1 M NaOH-Lösung (25 ml) behandelt. Die organische Phase wird gewaschen (20 ml) und über Na2SO4 getrocknet. Nachdem die flüchtigen Bestandteile entfernt sind, erhält man ein blassgelbes Öl, das in Diethylether (20 ml) resuspensiert wird. Das Produkt kristallisiert nach Zugabe von n-Pentan (80 ml) als farblose Kristalle aus.A solution of 2-aminoethanethiol HCL (1 g, 8.8 mmol) in CH 2 Cl 2 (40 mL) and trifluoroacetic acid (1, 3 mL, 2 eq) is mixed with trityl chloride (2.45 g, 1 eq) , The solution is stirred for 20 hours at room temperature and then treated with 1 M NaOH solution (25 ml). The organic phase is washed (20 ml) and dried over Na 2 SO 4 . After the volatiles are removed, a pale yellow oil is obtained which is resuspended in diethyl ether (20 ml). The product crystallizes out as colorless crystals after addition of n-pentane (80 ml).
Ausbeute: 30 %, farblose KristalleYield: 30%, colorless crystals
Schmelzpunkt: 86-910CMelting point: 86-91 0 C
TLC: Rf = 0, 19 (CHCI3ZMeOH 9:1 )TLC: R f = 0.19 (CHCl 3 Z MeOH 9: 1)
LCMS: berechnet [C2iH21NS+H+] 320.15, gefunden 319.65LCMS: calculated [C 2 iH 21 NS + H +] 320.15, found 319.65
1 H NMR (400MHz, cdcl3) δ 7.41 - 7.36 (m, 6H), 7.27 - 7.25 (m, 3H), 7.23 - 7.21 (m, 3H), 7.19 - 7.14 (m, 3H)1 2.55 (t, J=6.5, 2H), 2.28 (t, J=6.5, 2H). 11.9.2. Umsetzung mit Flourescein1 H NMR (400MHz, cdcl 3 ) δ 7.41-7.36 (m, 6H), 7.27 - 7.25 (m, 3H), 7.23 - 7.21 (m, 3H), 7.19 - 7.14 (m, 3H) 1 2.55 (t, J = 6.5, 2H), 2.28 (t, J = 6.5, 2H). 11.9.2. Implementation with Flourescein
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000039_0001
S-Tιϊtyl-2-aminoethanthiol (300 mg, 0,939 mmol) wird in CHCI3 (25 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurde Flouresceinisothiocyanat (402 mg, 1 ,1 eq) und DIPEA (300 ml, 2 eq) gelöst in Aceton (45 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wird 42 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt und anschließend nach Entfernung der organischen Lösungsmittel mit Hilfe einer Silikagel-Chromatographie (8 % MeOH in Ethylacetat) gereinigt.S-Tιϊtyl-2-aminoethanethiol (300 mg, 0.939 mmol) is dissolved in CHCl 3 (25 mL). To this solution was added flourescein isothiocyanate (402 mg, 1.1 eq) and DIPEA (300 ml, 2 eq) dissolved in acetone (45 ml). The reaction mixture is stirred at ambient temperature for 42 hours and then, after removal of the organic solvents, purified by silica gel chromatography (8% MeOH in ethyl acetate).
Ausbeute: 70 %, orange-roter FeststoffYield: 70%, orange-red solid
Schmelzpunkt: 160-1670CMelting point: 160-167 0 C
TLC: Rf = 0,66 (Ethylacetat/MeOH 9:1 )TLC: R f = 0.66 (ethyl acetate / MeOH 9: 1)
LCMS: berechnet [C2iH2iNS+H+] 709.18, gefunden 709.02LCMS: calculated [C 2 iH 2 iNS + H +] 709.18, found 709.02
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.12 (s, 1 H), 7.74 (d, J = 2.0, 1 H), 7.72 (d, J = 2.1 , 1 H), 7.44 — 7.38 (m, 6H), 7.32 — 7.20 (m, 12H), 7.19 (t, J = 1.3, 1 H), 7.13 (s, IH), 7.11 (s, 1 H), 6.70 (S, 1 H), 6.68 — 6.67 (m, 2H)1 6.54 (d, J = 2.4, 1 H), 6.52 (d, J = 2.5, 1 H), 3.52 (t, J = 6.8, 1 H), 2.54 (t, J = 6.8, 2H). 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD) δ 8.12 (s, 1H), 7.74 (d, J = 2.0, 1H), 7.72 (d, J = 2.1, 1H), 7.44 - 7.38 (m, 6H), 7.32 - 7.20 (m, 12H), 7.19 (t, J = 1.3, 1H), 7.13 (s, IH), 7.11 (s, 1H), 6.70 (S, 1H), 6.68 - 6.67 (m, 2H) 1 6.54 (d, J = 2.4, 1 H), 6.52 (d, J = 2.5, 1 H), 3.52 (t, J = 6.8, 1 H), 2.54 (t, J = 6.8, 2H).
11.9.3. Umsetzung mit V1 zur (Beispielverbindunq 2)11.9.3. Implementation with V1 for (example compound 2)
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000040_0001
(2) (=Beispielverbindung 2)(2) (= Example compound 2)
Die nach 11.9.2 erhaltene Flourescein Verbindung (90 mg, 0,127 mmol) und Triethylamin (30 μl, 1 ,1 eq) werden in unverdünnter Triflouressigsäure (1 ,5 ml) gelöst und für 20 Minuten gerührt. Die flüchtigen Anteile werden entfernt und es wird 3-mal mit Toluol abgedampft.The fluorescein compound (90 mg, 0.127 mmol) and triethylamine (30 μl, 1.1 eq) obtained according to 11.9.2 are dissolved in undiluted trifluoroacetic acid (1.5 ml) and stirred for 20 minutes. The volatiles are removed and it is evaporated 3 times with toluene.
Der verbleibende Rest wird in Triflourethanol (4 ml) gelöst und mit Natriumphosphat Puffer (50 mmol, pH 9, 1 ml) versetzt und anschließend mit dem Thiostreptonderivat V1 (1-fach verkürztes Thiostrepton) und Diethylamin (88 μl, 5 eq) versetzt. Die Reaktionsmischung wird unter einer inerten Gasatmosphäre 16 Stunden gerührt. Danach wird durch eine HPLC Reinigung die vorstehend dargestellte Sonde (Beispielverbindung 2) erhalten.The remaining residue is dissolved in trifluoroethanol (4 ml) and treated with sodium phosphate buffer (50 mmol, pH 9, 1 ml) and then treated with the thiostreptone derivative V1 (1-fold shortened thiostrepton) and diethylamine (88 ul, 5 eq). The reaction mixture is stirred under an inert gas atmosphere for 16 hours. Thereafter, the probe shown above (Example Compound 2) is obtained by HPLC purification.
Ausbeute: 21 %, orangener FeststoffYield: 21%, orange solid
Schmelzpunkt: 1900C ZersetzungMelting point: 190 ° C. Decomposition
TLC: Rf = 0,07 (Ethylacetat/MeOH 9:1)TLC: R f = 0.07 (ethyl acetate / MeOH 9: 1)
HPLC: R, = 7,5 minHPLC: R, = 7.5 min
HRMS: berechnet [C92H10oN2oθ22S7+2H+] 1031.276, gefunden (ESI) 1031.276 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 8.11 (d. J = 1.8.1 H), 8.04 (s, 1 H), 8.02 (s, 1 H), 7.99 (s, 1 H), 7.98 (s, 1H), 7.87 (s, 1H)17.43 - 7.37 (m, 1H), 7.35 (s, 1H)17.13 (s, 1H), 6.98 - 6.87 (m, 3H), 6.71 (d. J = 10.1, 1H)16.55 - 6.44 (m, 6H), 6.39 - 6.31 (m.2H), 6.31 - 6.26 (m, 1H), 6.26 - 6.12 (m, 3H)16.09 - 6.00 (m, J = 7.1, 1H)15.66 (s.1H), 5.62 - 5.54 (m, 3H), 5.21 - 5.08 (m, 4H), 4.81 (dd, J = 12.0, 8.5, 1H), 4.66 (t, J = 6.5, 1H), 4.54 (dd, J = 13.3, 6.9, 1H), 4.27 - 4.20 (m, 3H)13.85 (dd, J = 13.1, 5.3, 1H), 3.74-3.58 (m, 5H), 3.53 - 3.40 (m, 3H), 2.89 (dd, J = 13.4, 6.4, 1H), 2.86 -2.76 (m, 9H), 2.76 -2.68 (m, 2H), 2.18- 2.06 (m, 1H), 1.76 (s, 1H), 1.54 (dd, J = 6.5, 2.4, 5H), 1.43 (dd, J = 6.7, 1.8, 3H), 1.28- 1.18 (m, 12H), 1.03-0.95 (m, 6H), 0.94 - 0.87 (m, 1H), 0.83 (d, J = 6.9, 3H), 0.71 (t, J = 7.3, 3H), 0.63 (d, J = 6.0, 3H). HRMS: calculated [C 92 H 10 oN 2 oθ 22 S 7 + 2H +] 1031.276, found (ESI) 1031.276 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 8.11 (i.e., J = 1.8.1 H), 8.04 (s, 1 H), 8.02 (s, 1 H), 7.99 (s, 1 H), 7.98 (s , 1H), 7.87 (s, 1H) 1 7.43 - 7.37 (m, 1H), 7.35 (s, 1H) 1 7.13 (s, 1H), 6.98 - 6.87 (m, 3H), 6.71 (i.e., J = 10.1 , 1H) 1 6.55 - 6.44 (m, 6H), 6.39 - 6.31 (m.2H), 6.31 - 6.26 (m, 1H), 6.26 - 6.12 (m, 3H) 1 6.09 - 6.00 (m, J = 7.1, 1H) 1 5.66 (s.1H), 5.62 - 5.54 (m, 3H), 5.21 - 5.08 (m, 4H), 4.81 (dd, J = 12.0, 8.5, 1H), 4.66 (t, J = 6.5, 1H ), 4.54 (dd, J = 13.3, 6.9, 1H), 4.27 - 4.20 (m, 3H) 1 3.85 (dd, J = 13.1, 5.3, 1H), 3.74-3.58 (m, 5H), 3.53 - 3.40 ( m, 3H), 2.89 (dd, J = 13.4, 6.4, 1H), 2.86-2.76 (m, 9H), 2.76-2.68 (m, 2H), 2.18-2.06 (m, 1H), 1.76 (s, 1H ), 1.54 (dd, J = 6.5, 2.4, 5H), 1.43 (dd, J = 6.7, 1.8, 3H), 1.28-1.18 (m, 12H), 1.03-0.95 (m, 6H), 0.94-0.87 ( m, 1H), 0.83 (d, J = 6.9, 3H), 0.71 (t, J = 7.3, 3H), 0.63 (d, J = 6.0, 3H).

Claims

Patentansprüche: claims:
1. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)1. Compounds of the general formula (I)
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000042_0001
(l) worin(l) wherein
A für einen RestA for a rest
Figure imgf000042_0002
Figure imgf000042_0002
(AI) (AII)(AI) (AII)
B für einen RestB for a rest
Figure imgf000042_0003
Figure imgf000042_0003
(Bl) (BII) steht, worin n für 0 oder eine ganze Zahl gleich 1 oder 2 ist,(Bl) (BII), wherein n is 0 or an integer equal to 1 or 2,
die gestrichelte Linie ^^^ ggf. für eine Doppelbindung (-C=C- oder -C=N-) steht;the dashed line ^^^ if necessary for a double bond (-C = C- or -C = N-) is;
R1 und R2, jeweils unabhängig voneinander, für einen Rest der Formel (L) oder (M)R 1 and R 2 , each independently of one another, represent a radical of the formula (L) or (M)
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000043_0001
(L)(L)
X NT /-FL X NT / - FL
HH
(M) stehen,(M) stand,
worinwherein
X für einen gesättigten oder ungesättigten, linearen oder verzweigten, aliphatischenX is a saturated or unsaturated, linear or branched, aliphatic
Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen steht, welcher unsubstituiert oder mit ggf. 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -F, -Cl, -Br, -I, -CN, - NO2, -OH, -CH2-CN, -SH, -NH2, -S-CH3, -S-C2H5, -S-Phenyl, -S-CH2-Phenyl, -O- CH3, -0-C2H5, -0-C3H7, -O-C(CH3)3, -O-Phenyl, -O-CH2-Phenyl, -CF3, -CHF2, - CH2F, -O-CF3l -0-CHF2, -0-CH2F, -C(=O)-CF3, -S-CF3, -S-CHF2, -S-CH2F, - N(CHa)2, -N(C2H5J2, -NH-CH3, -NH-C2H5, -C(=O)-O-C2H5, -C(=O)-O-C(CH3)3, - C(=O)-H, -C(=O)-OH, -C(=O)-C2H5, -NH-C(=O)-C2H5, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH- CH3, -C(=O)-N(CH3)2, -S(=O)2-NH2, -CH(NH2)-C(=O)-OH, Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Phenyl und Benzyl substituiert ist,Hydrocarbon radical having 1 to 18 carbon atoms, which is unsubstituted or optionally with 1, 2, 3, 4 or 5 substituents independently selected from the group consisting of -F, -Cl, -Br, -I, -CN, - NO 2 , -OH, -CH 2 -CN, -SH, -NH 2, -S-CH 3, -SC 2 H 5, -S-phenyl, -S-CH 2 -phenyl, -O-CH 3, -0 -C 2 H 5 , -O-C 3 H 7 , -OC (CH 3 ) 3 , -O-phenyl, -O-CH 2 -phenyl, -CF 3 , -CHF 2 , - CH 2 F, -O -CF 3l -O-CHF 2 , -O-CH 2 F, -C (= O) -CF 3 , -S-CF 3 , -S-CHF 2 , -S-CH 2 F, - N (CHa) 2 , -N (C 2 H 5 J 2 , -NH-CH 3 , -NH-C 2 H 5 , -C (= O) -OC 2 H 5 , -C (= O) -OC (CH 3 ) 3 , -C (= O) -H, -C (= O) -OH, -C (= O) -C 2 H 5 , -NH-C (= O) -C 2 H 5 , -C (= O) -NH 2 , -C (= O) -NH-CH 3 , -C (= O) -N (CH 3 ) 2 , -S (= O) 2 -NH 2 , -CH (NH 2 ) - C (= O) -OH, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, phenyl and benzyl is substituted,
für einen Rest ausgewählt aus der Gruppe umfassend einen C3-20-Cycloalkylen- Rest und einen C3-20-Heterocycloalkylen-Rest, wobei die vorstehend genannten Reste ggfs. wenigstens ein Heteroatom als Ringglied aufweisen können und jeweils unsubstituiert oder mit ggf. 1 , 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, Br1 I, -CN1 -NO2, - OH1 -CH2-CN, -SH1 -NH2, -C(=O)-OH, Methyl, Ethyl, n-Propyl, /so-Propyl, n-Butyl, /so-Butyl, a radical selected from the group comprising a C 3-20 -cycloalkylene radical and a C 3-20 -heterocycloalkylene radical, the abovementioned Radicals may optionally have at least one heteroatom as ring member and are each unsubstituted or optionally with 1, 2 or 3 substituents independently selected from the group consisting of F, Cl, Br 1 I, -CN 1 -NO 2 , - OH 1 - CH 2 -CN, -SH 1 -NH 2 , -C (= O) -OH, methyl, ethyl, n-propyl, / so-propyl, n-butyl, / so-butyl,
2-Butyl, tert-Butyl, n-Pentyl und πeo-Pentyl substituiert sind,2-butyl, tert-butyl, n-pentyl and πeo-pentyl are substituted,
oderor
für einen ggfs. eine Polyethergruppierung aufweisenden Rest der allgemeinen Formel (Y)for a possibly having a polyether grouping radical of the general formula (Y)
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0001
(Y) steht,(Y) stands,
wobeiin which
p für eine ganze Zahl von 1 bis 8 steht,p is an integer from 1 to 8,
m für O oder eine ganze Zahl von 1 bis 8 steht,m is O or an integer from 1 to 8,
C für Wasserstoff oder einen aliphatischen Carboxylrest undC is hydrogen or an aliphatic carboxyl radical and
FL für einen fluoreszierenden Farbstoffrest steht,FL stands for a fluorescent dye residue,
deren entsprechende Salze oder Solvate, deren Stereoisomeren, Racemate, Enantionmeren oder Mischungen der Enantiomeren in jedem Verhältnis,their corresponding salts or solvates, their stereoisomers, racemates, enantiomers or mixtures of the enantiomers in any ratio,
wobei immer wenigstens B für einen Rest (BII) oder A für einen Rest (All) steht, Verbindungen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie Verbindungen mit der allgemeinen Formel (II) oder (III) oder (IV) oder (V)
Figure imgf000045_0001
where at least B is a radical (BII) or A is a radical (All), Compounds according to Claim 1, characterized in that they contain compounds of the general formula (II) or (III) or (IV) or (V)
Figure imgf000045_0001
(H) oder
Figure imgf000045_0002
(H) or
Figure imgf000045_0002
(III) oder
Figure imgf000046_0001
(III) or
Figure imgf000046_0001
(IV) oder
Figure imgf000046_0002
(IV) or
Figure imgf000046_0002
(V) sind, worin die Reste A1 B und C die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, und unter der in Anspruch 1 angegebenen Bedingung.(V) in which the radicals A 1 B and C have the meaning given in claim 1, and under the condition indicated in claim 1.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass3. Compounds according to claim 1 or 2, characterized in that
die Reste R1 und R2, jeweils unabhängig voneinander, für einen Rest der allgemeinen Formal (L) oder (M) stehen, worinR 1 and R 2 each independently represent a radical of the general formula (L) or (M) in which
X für einen Kohlenwasserstoffrest steht, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methylen, Ethylen, n-Propylen, /so-Propylen, n-Butylen, iso- Butylen, 2-Butylen, terf-Butylen, Pentylen, Hexylen, Heptylen, Octylen, Nonylen und Decylen, wobei die vorstehend genannten Kohlenwasserstoffreste gesättigt oder ungesättigt, linear oder verzweigt, unsubstituiert oder mit ggf. 1 , 2, 3, 4 oder 5 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -F, -Cl, -Br1 -I1 -CN, -NO2, -OH, -CH2-CN, -SH, -NH2, -S-CH3, -S-C2H5, -S- Phenyl, -S-CH2-Phenyl, -O-CH3, -0-C2H5, -0-C3H7, -O-C(CH3)3, -O-Phenyl, -O- CH2-Phenyl, -CF3, -CHF2, -CH2F, -O-CF3, -0-CHF2, -0-CH2F, -C(=O)-CF3, -S-CF3, -S-CHF2, -S-CH2F, -N(CH3J2, -N(C2H5)2, -NH-CH3, -NH-C2H5, -C(=O)-O-C2H5, - C(=O)-O-C(CH3)3, -Cf=O)-H1 -Cf=O)-C2H5, -NH-C(=O)-C2H5, -C(=O)-NH2> -C(=0)- NH-CH3, -C(=O)-N(CH3)2, -S(=O)2-NH2, Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Phenyl und Benzyl substituiert sind,X is a hydrocarbon radical which is selected from the group consisting of methylene, ethylene, n-propylene, / so-propylene, n-butylene, isobutylene, 2-butylene, terf-butylene, pentylene, hexylene, heptylene, octylene , Nonylene and decylene, where the abovementioned hydrocarbon radicals are saturated or unsaturated, linear or branched, unsubstituted or optionally having 1, 2, 3, 4 or 5 substituents independently selected from the group consisting of -F, -Cl, -Br 1 -I 1 -CN, -NO 2 , -OH, -CH 2 -CN, -SH, -NH 2 , -S-CH 3 , -SC 2 H 5 , -S-phenyl, -S-CH 2 -phenyl , -O-CH 3 , -O-C 2 H 5 , -O-C 3 H 7 , -OC (CH 3 ) 3 , -O-phenyl, -O-CH 2 -phenyl, -CF 3 , -CHF 2 , -CH 2 F, -O-CF 3 , -O-CHF 2 , -O-CH 2 F, -C (= O) -CF 3 , -S-CF 3 , -S-CHF 2 , -S -CH 2 F, -N (CH 3 J 2 , -N (C 2 H 5 ) 2 , -NH-CH 3 , -NH-C 2 H 5 , -C (= O) -OC 2 H 5 , - C (= O) -O-C (CH 3) 3, -CF = O) -H 1 -Cf = O) -C 2 H 5, -NH-C (= O) -C 2 H 5, (-C = O) -NH 2> -C (= O) -NH-CH 3 , -C (= O) -N (CH 3 ) 2 , -S (= O) 2 -NH 2 , cyclopropyl, Cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, phenyl and benzyl are substituted,
oderor
für einen Rest ausgewählt aus der Gruppe umfassend -C3^-Cycloalkylen und -C3- 6-Heterocycloalkylen , wobei die vorstehend genannten Reste mindestens ein Heteroatom als Ringglied aufweisen können und jeweils unsubstituiert oder mit ggf. 1 , 2 oder 3 Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F1 Cl, Br1 I1 -CN1 -NO2, -OH1 -CH2-CN1 -SH, -NH2, -C(=0)- OH1 Methyl, Ethyl, /7-Propyl, /so-Propyl, n-Butyl, /so-Butyl, 2-Butyl, terf-Butyl, n- Pentyl und neo-Pentyl substituiert sind,a radical selected from the group comprising C 3 -Cycloalkylene and C 3 -C 6 -heterocycloalkylene, where the abovementioned radicals can have at least one heteroatom as ring member and are each unsubstituted or optionally having 1, 2 or 3 substituents independently of one another selected from the group consisting of F 1 Cl, Br 1 I 1 -CN 1 -NO 2 , -OH 1 -CH 2 -CN 1 -SH, -NH 2 , -C (= O) -OH 1 methyl, ethyl, / 7-propyl, / so -propyl, n-butyl, / so-butyl, 2-butyl, terf-butyl, n-pentyl and neo-pentyl are substituted,
oder für einen ggfs. eine Polyethergruppierung aufweisenden Rest der allgemeinen Formel (Y)or for a possibly having a polyether grouping radical of the general formula (Y)
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000048_0001
(Y) steht,(Y) stands,
worinwherein
p für ganze Zahl von 1 bis 3 steht,p is an integer from 1 to 3,
m für 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 3 steht,m is 0 or an integer from 1 to 3,
C für Wasserstoff oder einen Acylrest, vorzugsweise Wasserstoff, undC is hydrogen or an acyl radical, preferably hydrogen, and
FL für einen fluoreszierenden Farbstoffrest steht.FL stands for a fluorescent dye residue.
4. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die4. Compounds according to any one of claims 1-3, characterized in that the
Reste R1 und R2, jeweils unabhängig voneinander, für einen Rest der Formel (L1 ) oder (M1 )Radicals R 1 and R 2 , each independently of one another, represent a radical of the formula (L1) or (M1)
Figure imgf000048_0002
Figure imgf000048_0002
(L1)(L1)
oderor
,FL, FL
H (M1) stehen. H (M1) stand.
5. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der fluoreszierende Farbstoffrest (FL) ein Rest ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fluorescein, Alexa Fluor 488, Eosin gelblich, Eosin bläulich, Phloxin, Erythrosin, Bengalrosa, Rhodamin, Rhodamin-Grün, Hydroxycumarin, Benzofuran, Texas-Rot, Oregon-Grün 488, Biman, NBD, Dansyl, Dabsyl, Bodipy, Phycoerythrin, Cyanin- Fluorophore Cy3™, Cy5™, Xanten und ein Farbstoffrest der Formel Z5. Compounds according to one of claims 1 to 4, characterized in that the fluorescent dye residue (FL) is a radical selected from the group comprising fluorescein, Alexa Fluor 488, eosin yellowish, eosin bluish, phloxine, erythrosine, rose bengal, rhodamine, rhodamine Green, hydroxycumarin, benzofuran, Texas red, Oregon green 488, biman, NBD, dansyl, dabsyl, bodipy, phycoerythrin, cyanine fluorophore Cy3 ™, Cy5 ™, xanten, and a dye moiety of formula Z.
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000049_0001
6. Eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit der Strukturformel 1 :6. A compound according to any one of claims 1 to 5 having the structural formula 1:
Figure imgf000049_0002
Figure imgf000049_0002
7. Eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 mit der Strukturformel 27. A compound according to any one of claims 1-5 with the structural formula. 2
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000050_0001
8. Eine molekulare Sonde der allgemeinen Formel (I)-(V) nach einem der Ansprüche 1 bis 7.8. A molecular probe of the general formula (I) - (V) according to one of claims 1 to 7.
9. Verwendung einer molekularen Sonde nach Anspruch 8 zur Charakterisierung und/oder Diagnose von Ribosomen in Prokaryoten und/oder Eukaryoten.9. Use of a molecular probe according to claim 8 for the characterization and / or diagnosis of ribosomes in prokaryotes and / or eukaryotes.
10. Verwendung einer molekularen Sonde gemäß Anspruch 9 zur Charakterisierung und/oder Diagnose von Ribosomen-Subtypen in Eukaryoten, vorzugsweise mitochondriale, cytoplasmatische oder Prä-Ribosomen.10. Use of a molecular probe according to claim 9 for the characterization and / or diagnosis of ribosome subtypes in eukaryotes, preferably mitochondrial, cytoplasmic or pre-ribosomes.
11. Verwendung einer molekularen Sonde gemäß Anspruch 9 oder 10 als pharmakologisches Tool für biochemische, zelluläre, molekularbiologische oder biophysikalische Substanztestverfahren zum Auffinden von Wirkstoffen.11. Use of a molecular probe according to claim 9 or 10 as a pharmacological tool for biochemical, cellular, molecular biological or biophysical substance test method for finding active ingredients.
12. Verwendung einer molekularen Sonde gemäß Anspruch 11 , in Substanztestverfahren zum Auffinden von Wirkstoffen High-Throughput-, Medium Throughput-, Low- Throughput, und/oder High-Content-Screening-Assays.12. Use of a molecular probe according to claim 11, in substance testing method for finding active ingredients high-throughput, medium throughput, low-throughput, and / or high-content screening assays.
13. Verwendung einer molekularen Sonde gemäß Anspruch 11 zur Quantifizierung von Bindeparametern von Liganden des ribosomalen GTPase-Zentrums. 13. Use of a molecular probe according to claim 11 for the quantification of binding parameters of ligands of the ribosomal GTPase center.
14. Verwendung einer molekularen Sonde gemäß Anspruch 11 zum Auffinden von Wirkstoffen, die Inhibitoren der Proteinbiosynthese sind.14. Use of a molecular probe according to claim 11 for the discovery of drugs that are inhibitors of protein biosynthesis.
15. Verwendung einer molekularen Sonde gemäß Anspruch 11 , zum Auffinden von Wirkstoffen mit antibakterieller Wirkung und/oder Wirkstoffen gegen einzellige Parasiten.15. Use of a molecular probe according to claim 11, for finding active substances with antibacterial activity and / or active substances against unicellular parasites.
16. Verwendung einer molekularen Sonde gemäß Anspruch 11 , zum allgemeinen Auffinden von Wirkstoffen durch High-Content-Methoden.16. Use of a molecular probe according to claim 11, for the general discovery of active ingredients by high-content methods.
17. Verwendung einer molekularen Sonde gemäß Anspruch 8 als Fluoreszenzmarker von Ribosomenkomplexen.17. Use of a molecular probe according to claim 8 as a fluorescent marker of ribosome complexes.
18. Verwendung einer molekularen Sonde gemäß Anspruch 8 zum Nachweis der Inhibition des ribosomalen GTPase-Zentrums.18. Use of a molecular probe according to claim 8 for detecting the inhibition of the ribosomal GTPase center.
19. Verwendung einer molekularen Sonde gemäß Anspruch 8 in fluoreszenzmikroskopischen Methoden.19. Use of a molecular probe according to claim 8 in fluorescence microscopy methods.
20. Verwendung einer molekularen Sonde gemäß Anspruch 8 zur klinischen Diagnose.20. Use of a molecular probe according to claim 8 for clinical diagnosis.
21. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)-(V) nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfassend die Schritte:21. A process for preparing a compound of general formula (I) - (V) according to any one of claims 1 to 7, comprising the steps:
a) Umsetzen einer Verbindung der allgemeinen Formel (X)a) Reaction of a compound of the general formula (X)
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000051_0001
(X) worin n 0 oder eine ganze Zahl 1 oder 2 ist, und der Rest C die Bedeutung nach einem der Ansprüche 1-7 hat, mit wenigstens einem Thiol der allgemeinen Formel (LX) oder (MX),
Figure imgf000052_0001
(X) wherein n is 0 or an integer 1 or 2, and the radical C has the meaning of any one of claims 1-7, with at least one thiol of the general formula (LX) or (MX),
Figure imgf000052_0001
(LX) oder
Figure imgf000052_0002
(LX) or
Figure imgf000052_0002
(MX) worin die Reste FL und X die Bedeutung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 haben. (MX) wherein the radicals FL and X have the meaning of any one of claims 1 to 7.
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