WO2009098838A1 - 雄性不稔ネギ属植物及びそれに由来する細胞ならびにその作製方法 - Google Patents

雄性不稔ネギ属植物及びそれに由来する細胞ならびにその作製方法 Download PDF

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WO2009098838A1
WO2009098838A1 PCT/JP2009/000228 JP2009000228W WO2009098838A1 WO 2009098838 A1 WO2009098838 A1 WO 2009098838A1 JP 2009000228 W JP2009000228 W JP 2009000228W WO 2009098838 A1 WO2009098838 A1 WO 2009098838A1
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plant
roylei
allium
species
genus
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PCT/JP2009/000228
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Inventor
Masayoshi Shigyo
Machiko Iwata
Original Assignee
Yamaguchi University
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/04—Amaryllidaceae, e.g. onion
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A01H1/022—Genic fertility modification, e.g. apomixis
    • A01H1/023—Male sterility

Definitions

  • the present invention relates to a male sterile plant useful for breeding in the genus Allium and a method for producing the same, and more specifically, the cytoplasm of the Roilei species and the non-Roylei genus plant (the Allium genus plant which is not the Roilei species, the same shall apply hereinafter). ) -Derived nuclear genome and a male sterility trait, a cell thereof, a production method thereof, and the like.
  • male sterility is a trait that is usually isolated as a spontaneous mutation, when it is controlled by factors present in the nuclear gene (Genic male sterility), it is subject to both cytoplasmic and nuclear factors. There are two types (Gene-cytoplasmic male sterility), depending on the plant species to be bred.
  • S-msms male sterile line S1 isolated as a natural mutation and a breed N1 (N-MSMS) to be improved were crossed to obtain fertile F1 (S-MSms).
  • Patent Document 1 a method for producing male sterile ryegrass by mating Italian ryegrass and perennial ryegrass (Patent Document 1), Brassica oleracea cells, a method for producing a male sterile Brassicaceae plant by fusing cells such as napus (Patent Documents 2 and 4), a male sterile cedar using a male sterile line isolated from nature (Patent Document 3), A method for producing soybeans (Patent Document 5), a wheat (Patent Document 6), a method for suppressing pollen of lily class plants using cinnoline compounds (Patent Document 7), and a male sterility trait using genetic recombination.
  • nuclear replacement is a cross between different species or different varieties, and the back-crossing of pollen parents to their descendant strains in succession makes the nuclear genome as close to the pollen parent as possible (theoretical value not considering chromosome recombination is 1 ⁇ 1 / 2 n , where n is the number of backcrosses), and in some combinations, some incompatibility occurs between the cytoplasm and the formed nucleus, and male pollen is not formed normally. It uses the phenomenon that the traits of moths appear.
  • Non-patent Document 3 a nuclear replacement line derived from crossing an indica variety (Oryza sativa subsp. Indica) with a japonica variety (O. sativa subsp. Japonica)
  • indica variety Oryza sativa subsp. Indica
  • japonica variety O. sativa subsp. Japonica
  • Non-patent Document 3 male sterility lines exist in the lines where the galantum species nuclei have been replaced by the respective nuclei derived from the cross between Allium galanthum and leek (A. fistulosum) or Shallot (A. cepa Aggregatum group). It has been found (Non-Patent Documents 4 and 5).
  • Roilei is known for its resistance to gray mold and downy mildew, and is a kind of wild onion that has cross-compatibility with general cultivars of the genus Allium. None was known about spider traits. The present inventors have found the fact that a strong male sterility trait appears in a plant having the cytoplasm of a Roylay species and whose nucleus has been replaced with the nucleus of a non-Roylei species, and has completed the present invention. .
  • the present invention is characterized by having (1) a cytoplasm derived from an Allium roylei plant and a nuclear genome derived from a plant of the genus Allium (non-Roylei species). And (2) a male sterile leek plant as described in (1) above, which has a nuclear genome derived from at least one non-Roylei species. (3) The present invention relates to the male sterile leek plant according to (2) above, which has a nuclear genome derived from a single species of non-Roylei leek plant.
  • the present invention provides (4) the male male as described in (3) above, wherein the non-Roylei genus Allium plant is onion (Allium cepa Common onion group) and / or charlotte (Allium cepa Aggregatum group).
  • the present invention relates to a sterile genus plant and (5) a plant cell derived from the male sterile genus plant according to any one of (1) to (4) above.
  • the present invention provides (6) [1] a step of obtaining a hybrid plant by crossing both an allium roylay plant as a seed parent and a non-Roylei genus plant as a pollen parent; and [2] step [1].
  • which is sequentially provided Present invention relates to a method for manufacturing of a plant of the genus.
  • the method for producing a male sterile leek plant of the present invention differs from the method using a galantham species that has been reported in the past, and includes the doubling of chromosomes and the production of allotriploids in the process, so Elimination of chromosomes is easy and reliable, thereby eliminating the pollen fertility recovery gene contained in the Roylay species genome and producing a complete cytoplasmic male sterile leek plant. This also greatly reduces the time to produce new varieties.
  • the cytoplasm of Roilei may be resistant to diseases that are susceptible to cultivars of the genus Allium, such as downy mildew and leaf blight, and is expected to confer disease resistance at the same time as male sterility. Is done.
  • the manufacturing method of the male sterile leek plant provided in embodiment of this invention is shown typically.
  • the result of the Lap-1 isozyme analysis in each generation of crosses according to the embodiment of the present invention is schematically shown.
  • the analysis result of the polymorphism of the chloroplast DNA of the Roy Ray species, shallot, onion, and BC2 generation used in the embodiment of the present invention is shown.
  • the schematic diagram of the analysis result of the polymorphism (ccSSR-11 primer use) of the chloroplast DNA in the Example of this invention is shown.
  • the schematic diagram of the analysis result of polymorphism (ccSSR-17 primer use) of chloroplast DNA in the Example of this invention is shown.
  • the cytoplasm derived from Allium roylei (hereinafter also referred to as Roy Ray) seed plant, and the Allium genus plant other than the Allium Roylei species (non-Roylei species)
  • the plant is not particularly limited as long as it is a male sterile leek plant having a nuclear genome derived from a plant.
  • the “nuclear genome” is essential to make an organism present in the nucleus to be a living organism. Genetic information, and includes a minimum of one set of chromosomes (x) and two sets of chromosomes (2x) necessary for survival.
  • the male sterile leek plant of the present invention includes a cytoplasm that does not have a nuclear genome derived from a Roylei species, and a nuclear genome derived from at least one non-Roylei plant, which is a homogeneous species consisting of a single species of nuclear genome.
  • Roilei is known for its resistance to gray mold and downy mildew, and is a kind of wild onion that has cross-compatibility with general cultivars of the genus Allium. No attention was paid to spider traits.
  • the non-Roylei species Allium genus plant used in the present invention is a plant belonging to the genus Allium species and is not particularly limited as long as it is a plant other than the Roilei species. Plants other than Roilei species belonging to the above are preferred, and can be specifically mentioned by way of examples of the genus Allium genus shown in Tables 1 to 21 below.
  • leeks Allium fistulosum
  • garlic Allium sativum
  • leek Allium tuberosum
  • Arctic Allium chinese
  • Chives Allium schoenoprasum
  • Asatsuki Allium schoenoprasum var.foliosum
  • Nobil Allium grayi
  • Gyoja garlic Allium victoralis
  • Riki Allium ampeloprasum
  • Allium ⁇ giganteum Allium neapolitanum
  • Allium azureum Allium roseum Allium roseum
  • Allium sphaerocephalum Allium triquetrum
  • Allium dickinsonii Allium aflatunense
  • Allium dichlam -Ornamental leeks such as Allium mongolicum
  • Allium mongolicum can be cited as particularly preferred examples.
  • the non-Roylei species can also be a species that is difficult to mate with Roylei species plants.
  • the nuclear genome of the Roilei species plant is expressed as an onion ( After substituting the nuclear genome of the genus Allium, which can be crossed with Roylay species such as A. cepa), this offspring and A.altyncolicum, A.chevsuricum, A.globosum, A.obliquum, A.saxatile, A
  • the male sterile leek genus plant of the present invention can be produced by crossing with a species such as .senescens that has already been reported to be able to cross with onions.
  • Tables 1 to 21 below show a list of allium plants applicable to the present invention. In these tables, the currently reported genus Allium plants are listed in alphabetical order, and in the tables, “A.” is an abbreviation for the genus name Allium.
  • the male sterile leek plant of the present invention has a cytoplasm of Roilei species and the nuclear genome of the non-Roylei species, and is particularly a plant exhibiting a male sterile character.
  • the technology of the genus Leek also applies to the case where the genome of a non-Roylei species is derived at the chromosome level instead of the entire set (n). And are included within the scope of the present invention.
  • those having the nucleus of a single species of non-Roylei species of genus Allium are suitable as embodiments of the present invention from the viewpoint of breeding, particularly from the viewpoint of stability of traits.
  • the non-Roylei species of genus Allium especially charlotte (Allium cepa Aggregatum group) and onion (A.cepa Common onion group) are also in high demand as vegetables that are eaten everyday. Is preferred.
  • charlotte Allium cepa Aggregatum group
  • onion A.cepa Common onion group
  • cells derived from these male sterile leek plants also form new plants by cell engineering techniques, such as regeneration of plant bodies by tissue culture, etc., formation of protoplasts and use for cell fusion. Can be used as a raw material for and is included within the scope of the present invention.
  • the method for producing a male sterile leek genus plant of the present invention includes (1) a step of obtaining a hybrid plant by crossing both an allium roylay species plant as a seed parent and a non-Roylei genus leek plant as a pollen parent; ) Doubling the chromosome of the hybrid plant-derived cell obtained in step (1) to obtain a tetraploid hybrid plant; (3) using the tetraploid hybrid plant obtained in step (2) as a seed parent, A step of crossing both non-Roylei species Allium genus plants as pollen parents to obtain an extraneous triploid plant; (4) the non-Roylei species using the heterotriploid plant obtained in step (3) as a seed parent.
  • a step of obtaining a nuclear replacement plant having no chromosome of the Roylay species plant (backcrossing step) by crossing both plants using the genus Leek as a pollen parent and investigating the chromosome of the obtained progeny plant (backcrossing step); )
  • the mated both seed parent and pollen parent means a female gamete from a seed parent, that mating the male gamete from the pollen parent.
  • a Roylei plant can be used as a seed parent, and a non-Roylei onion genus plant capable of forming an interspecific hybrid by natural mating or artificial mating can be used as a pollen parent. Does not limit the invention.
  • the first step (3) and (4) is a step of crossing the tetraploid plant (compound diploid plant) obtained in step (2) with the pollen parent plant used in step (1). Is a backcrossing process in a broad sense, and is performed for the purpose of excluding the genome or chromosome of a Roylay plant from the nuclear genome. As the number of backcrosses increases, the nuclear genome is considered to be as close as possible to the nuclear genome of the non-Roylei species, which is considered to be effective.
  • the number of times and the like do not limit the present invention.
  • the accuracy of nuclear replacement has been increased by the number of matings, but as shown in the following examples, dividing cells are collected from the obtained progeny plant tissue and the chromosomes are morphologically observed, or Chromosome-specific marker genes, polymorphisms of specific motifs such as repeat sequences, or isozyme markers are used to identify chromosomes by molecular biology, investigate chromosomes contained in the nuclear genome, and If you select a progeny plant that does not have a chromosome, the number of backcrosses can be reduced.
  • FIG. 1 is a flowchart schematically showing a method for producing a male sterile leek plant according to the present example.
  • a male sterile leek plant having the cytoplasm of Roylei species (Allium roylei) and having its nuclear genome replaced with the nuclear genome of a non-Roylei species.
  • a cross between Roylay species and Shallot was performed as a step (1).
  • rRR: 2n 16; r is the Royley species cytoplasm, R is the Royley species genome, the same applies hereinafter
  • males were cut so that self-pollination did not occur in the CPRO97175 strain (Roylei species), and a small amount of Charlotte pollen was manually poll
  • a part of the collected seeds was placed on a petri dish with moistened filter paper and germinated at 25 ° C. under dark conditions. After germination, the plant was greened under illumination at 25 ° C., grown to a certain extent, acclimated, transplanted to culture soil, and cultivated in a greenhouse. The same method was used for subsequent mating.
  • step (2) of FIG. 1 doubling of the chromosome of Roylei species and Charlotte's F1 (rAR) was performed.
  • the shoot apical tissue was excised from F1 obtained in the previous step (1), placed on Linsmeier-Skoog (LS) solid medium containing 0.1% colchicine, and cultured under dark conditions for 4 days. Thereafter, the tissue was transferred onto an LS-free medium and cultured for 2 months, and then the chromosomes of root tip cells were stained with carmine acetate for the obtained regenerated plants, and the chromosomes were examined under a microscope.
  • LS Linsmeier-Skoog
  • the shape and size of Roylay species and Charlotte's chromosomes were examined in advance under a microscope, and the chromosomal image of the regenerated plant was morphologically compared to determine which chromosomes had how much. Chromosomes were observed by the following method. First, secondary roots extending to 5-10 mm were collected and fixed overnight in a refrigerator in an acetic acid-ethanol mixture (1: 3). Next, the fixed roots were treated with 1N hydrochloric acid at 60 ° C. for 6 minutes, dissociated and hydrolyzed, and then subjected to foilen staining with basic fuchsin.
  • step (3) of FIG. 1 the double diploid obtained in the previous step (2) was used as a seed parent, and the Charlotte 18-5 strain (aAA) and the onion evening extract (cCC) The first heterogeneous triploid (BC1) was produced by backcrossing using as a pollen parent.
  • Table 22 below shows the results of the mating.
  • the heterogeneous triple that is derived from the crossing of the double diploid (rAARR) and the Charlotte (aAA) and has 24 chromosomes was used as a material, and onion Kitami crossing 39 (cCC) was crossed here, and backcrossing in step (4) was performed to produce the second generation (BC2).
  • the results of the mating are shown in Table 23 below.
  • the number of chromosomes was 16, that is, the chromosomes derived from Roilei species were excluded, and there were 68 individuals in which the nuclear genome was considered to have been replaced with the nuclear genomes of Charlotte and onion, accounting for 63% of the total It was. Subsequently, the number of chromosomes was 17, that is, 38 individuals having a single chromosome derived from Roylay species, and the ratio was 35%. There are no chromosomes with 18-22 chromosomes. The number of chromosomes is 23, that is, one individual who has lost one chromosome derived from Royray species. The number of chromosomes is 24. There was one body and the ratio was very small, 0.9% each.
  • Lap-1 (leucine aminopeptidase-1) is a protein that is widely used as a marker for isozyme analysis because it exists as a monomer in the cell and varies in molecular weight depending on the species.
  • Leek it is known that a gene encoding Lap-1 is present on the first chromosome, and Lap-1 can be used as a marker for the first chromosome.
  • About 0.2 g of leaf blades were cut from each plant sample and placed in a mortar, and Wendel's extract (0.6% hydrogen phosphate 2Na, 7% sucrose, 5% PVP-40, 0.05% EDTA).
  • the gel was stained with a staining solution [0.02% L-Leucine ⁇ -Naphthylamide, 0.05% Fast Garnet GBC salt, 10 mM MgCl 2 ⁇ 6H 2 in 0.2 M phosphate buffer (pH 4.8). O] and stained with shaking for 30 minutes at 37 ° C. under dark conditions. After a band appeared on the gel, the staining reaction was stopped with 1.5% acetic acid, and the gel was washed 5-6 times with tap water to remove acetic acid.
  • a staining solution [0.02% L-Leucine ⁇ -Naphthylamide, 0.05% Fast Garnet GBC salt, 10 mM MgCl 2 ⁇ 6H 2 in 0.2 M phosphate buffer (pH 4.8). O] and stained with shaking for 30 minutes at 37 ° C. under dark conditions. After a band appeared on the gel, the staining reaction was stopped with 1.5% acetic acid, and the gel was washed 5-6 times with tap water
  • Gelbond (registered trademark) PAG film manufactured by Takara Bio Inc. was placed on a glass plate, the gel was placed thereon, 10% glycerol was overlaid on the gel, and cellophane was placed on the gel plate and sealed. In this state, the whole was placed in a dark place at 25 ° C. and dried.
  • lanes 1-6 are schematic representations of the band patterns obtained by electrophoresis
  • lane 1 is Royray species
  • lane 2 is Charlotte
  • lane 3 is Royley species and Charlotte F1
  • lane 4 is BC1 heterogeneous.
  • the product of Lap-1 encoded by Roylei species chromosome 1 is denoted by ⁇
  • the product of Lap-1 encoded by Charlotte and onion chromosome 1 is denoted by ⁇ .
  • Example 3 (Identification of cytoplasm by SSR polymorphism analysis)
  • the cytoplasm was identified by SSR polymorphism analysis. The details will be described below.
  • SSR sequences derived from chloroplast DNA Short Sequence Repeat: Focusing on ccSSR11
  • DNA polymorphism analysis was performed, and each cytoplasm was identified. Chloroplasts are known to be inherited maternally, and the polymorphism of DNA contained in the chloroplast serves as a marker for knowing the origin of cytoplasm. Extraction of total DNA from the sample followed the method of van Heusden et al. (See Non-Patent Document 11).
  • 0.05 g of a leaf blade was cut out from a plant sample, and 750 ⁇ l of an extract (mixed with Lysis buffer 312.5 ⁇ l, Extraction buffer 312.5 ⁇ l, Sarkosyl 125 ⁇ l, sodium sulfite 2.85 mg) was added thereto. And then incubated at 65 ° C. for 1 hour. Next, the ground sample was transferred to a tube, centrifuged at 14000 rpm, 4 ° C. for 90 seconds, 750 ⁇ l of chloroform-isoamyl alcohol (24: 1) was added to the supernatant, shaken, and centrifuged at 14000 rpm, 4 ° C. for 5 minutes. .
  • This sample solution was used for PCR.
  • PCR was performed using the ccSSR-11 primer in the primer set developed by Chung & Staub (Non-patent Document 12) under the following conditions.
  • the composition of the reaction solution was 25 ⁇ l in total; 50 mM KCl, 4 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTP, 0.4 mM Forward Primer, 0.4 mM Reverse Primer, 0.125 unit Taq Gold, 100 ng template DNA, 15 mM Tris-HCl (pH 8. 0).
  • the PCR reaction was carried out in 40 cycles of preliminary reaction 95 ° C. 11 minutes; denaturation 94 ° C. 30 seconds, annealing 56 ° C. 30 seconds, extension reaction 72 ° C. 30 seconds; post-treatment 72 ° C. 10 minutes.
  • FIG. 3 shows the PCR amplification pattern of cpDNA ccSSR-11.
  • lane m represents a molecular weight marker (bp)
  • lane R represents a Royray species
  • lane A represents a charlotte
  • lane C represents an onion
  • the following 5-41 are the results of samples of each strain of BC2.
  • the onion one base smaller than the Roylay species
  • the smallest charlotte is comparable to the polymorphism shown by the chloroplast DNA of BC2 cells.
  • lane 5-41 a single band appears at the same position as the Roylei species in all BC2 individuals, and it is clear that these BC2 individuals have a cytoplasm derived from the Roylei species. It became.
  • Example 4 (Investigation of pollen fertility of BC2 generation) In Example 4, the pollen fertility of BC2 generation was investigated. The results will be described below.
  • pollen fertility of individuals in which flowering was observed by cultivation was measured by two indexes of staining ability of carmine acetate and germination rate on 10% (w / v) sucrose agar medium.
  • the dyeability of carmine acetate is determined by collecting three or more florets per individual, total 1500 or more pollen immediately after the first floret blooms and about one week afterwards, and staining with carmine acetate for morphological observation. , Pollen with both germ and vegetative nuclei is considered normal pollen, and pollen without germ nuclei is considered as sterile pollen. Asked.
  • the germination rate on the sucrose agar medium was determined after the second investigation by staining with carmine acetate, and 3 florets from one individual, a total of 300 or more pollen were collected and seeded on the sucrose agar medium at 25 ° C, humidity Cultivate under 50% condition for 2 hours. Under the microscope, the pollen tube was elongated and the pollen was polluted, and the one without elongation was sterile pollen. The ratio (%) of the pretty pollen was calculated. The results of pollen fertility survey are shown in Table 25 below.
  • Example 4 The pollen fertility survey results of Example 4 were tabulated again focusing on the more essential male sterility traits, that is, the frequency of individuals with pollen fertility of 0 or less than 1%.
  • the results are shown in Table 26 below.
  • Table 26 is basically based on the same survey results as Table 25, and the percentage (%) of fallen pollen per individual is more finely divided than Table 25, with 0 fallen pollen and less than 1%. Shows things. In the first survey of carmine staining, 12 individuals with 0 fine pollen were observed, representing 20% of the total, and 16 individuals (26.7%) with less than 1% were observed. In the second survey, individuals with 0 or 1% of cute pollen accounted for 18.5% and 14.8%, respectively.
  • Samples include multiple species of genus Allium, including cultivated and wild species-A. There are four cultivated species belonging to the cepa species, namely, the onion 'Kujoho' line, the onion 'Kitami 39' line, the Charlotte '86208' line, the Wakegi's 'Knowakusen (Genari)' line, and 4 wild species A.galanthum '97205-22', A.roylei '9501-1', A.vavilovii '97203-8', A.altaicum '97010-25' In addition to 10 types of strains and raccoon A.
  • chinense (line unknown) CM23-RB6, CM23-RB15, CM23-RB25, CM23-RB30, CM23-RB36, CM23-RB36, CM23-RB39, A total of 17 lines of 7 lines of CM23-RB41 were used as samples.
  • Total DNA was extracted from each sample by a trace sample extraction method (according to the method of Example 3). Using this total DNA as a template, for the above two sets of primers, the 5 ′ end of the Forward primer is fluorescently labeled with one of 6-FAM, HEX, and NED, and these fluorescent primers are used in one set per reaction.
  • the ccSSR region was amplified from the DNA of each sample.
  • the PCR product was subjected to capillary electrophoresis using ABI Prism 310 genetic analyzer (Applied Biosystems), and the fragment size was determined using GeneScan Analysis Software (Applied Biosystems).
  • Table 27 shows the results of fragment analysis.
  • the species name and cultivar name in the table indicate the above-mentioned wild species, cultivated species, and nuclear replacement lines, respectively, and the molecular weight of the product is the molecular weight of the product amplified from chloroplast DNA with the ccSSR-11 primer and ccSSR-17 primer ( The measurement result of bp) is shown.
  • the ccSSR-11 primer amplified a 102-120 bp PCR product, and the nuclear replacement line of the present invention amplified an 111.6-111.7 bp product. Compared with other species, wild species is consistent with A. roylei's 111.6 bp, while A.
  • galanthum's male sterility due to nuclear replacement is reported in the prior art is different from 102.7 bp. It was shown that the male sterile line produced by the nuclear replacement of the present invention is a different line from the conventionally known line. Further, it was also different from the charlotte (106.1 bp) and onion (110.7 bp) used for the crossing, and it was shown that the male sterile line of the present invention has the cytoplasm of A. roylei.
  • the 194 to 202 bp PCR product was amplified by the ccSSR-17 primer, and the 194.4 to 194.8 bp product was amplified in the nuclear replacement system of the present invention. This was consistent with A. roylei's 194.7 bp, while the ccSSR-11 primer was significantly different from the 199.6 bp in onions where the molecular weight of the PCR product was relatively close.
  • line 39 is an F1 cultivar with a male sterility line (a male sterility line produced from a natural mutation by a conventional technique) based on cytoplasm-nuclear gene, and a cytoplasm of male sterility ( s cytoplasm), the male sterile line produced in the present invention was once again shown to be a male sterile line different from the conventionally used onion male sterile line.
  • the molecular weight of the PCR product in this example is a calculated value using analysis software, it is indicated by a value including a number after the decimal point.
  • FIG. 4 is a graph schematically showing the results of PCR using the ccSSR-11 primer on the basis of the molecular weight of the product.
  • Lanes 1-4 are wild species (1: A.roylei, 2: A.galanthum, 3: A.altaicum, 4: A.vavilovii)
  • lanes 5-10 are cultivated varieties (5: shallot, 6: onion, 7: rakkyo, 8: leek, 9: leek, 10: bakeggi)
  • lane 11 -17 represents the nuclear replacement system of the present invention (CM23-RB system, number is strain number)
  • the vertical axis of the graph represents molecular weight (bp).
  • FIG. 5 schematically shows the results of PCR using the ccSSR-17 primer on the graph from the molecular weight of the product.
  • Lanes 1-4 are wild species (1: A.roylei, 2: A.galanthum, 3: A.altaicum, 4: A.vavilovii), lanes 5-10 are cultivated varieties (5: shallot, 6: onion, 7: rakkyo, 8: leek, 9: leek, 10: bakeggi), lane 11 -17 represents the nuclear replacement system of the present invention (CM23-RB system, number is strain number), and the vertical axis of the graph represents molecular weight (bp). As indicated by the arrows in the figure, the PCR product of the nuclear replacement strain is A.
  • the size was almost the same as that of Roylei, and in addition, it was a different size from the onion (with male sterile s cytoplasm) shown in the box in the figure. These results indicate that the male sterile line produced by nuclear replacement produced in the present invention has a cytoplasm of Roylei species (A. roylei).
  • the present invention is a male sterile green onion genus plant produced by crossing a Roylei genus Allium plant and a non-Roylei genus Allium plant, which enables a significant reduction in the time until the production of a new variety, etc. Available in the field.

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Abstract

　本発明は、ネギ属植物において育種上利用可能な雄性不稔植物及びその作製方法を提供することをその課題とするものである。上記課題の解決のため、本発明は、ネギ属植物において、アリウム・ロイレイ（Ａｌｌｉｕｍ　ｒｏｙｌｅｉ）種由来の細胞質と、非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムとを有し、雄性不稔の形質を示すことを特徴とする、ネギ属植物を提供する。

Description

雄性不稔ネギ属植物及びそれに由来する細胞ならびにその作製方法
　本発明は、ネギ属植物において品種改良などに有用な雄性不稔植物及びその作製方法に関し、より詳しくは、ロイレイ種の細胞質と非ロイレイ種ネギ属植物（ロイレイ種ではないネギ属植物、以下同じ）由来の核ゲノムとを有し、雄性不稔の形質を有するネギ属植物及びその細胞、ならびにその作製方法等に関する。
　種子植物において、雄性器官に異常を生じ、稔性のある正常な花粉の形成が阻害される現象は雄性不稔（Male sterility）と呼ばれ、例えば、花の構造上おしべの除去（除雄）が困難な野菜等であっても、雄性不稔の形質を持っていればその必要がなくなるため、雑種の形成やその制御が容易になるという利点を持っている（非特許文献１）。雄性不稔は通常、自然突然変異として単離される形質であり、その原因としては、核遺伝子に存在する因子の支配を受ける場合（Genic male sterility）、細胞質及び核の両方の因子の支配を受ける場合（Gene-cytoplasmic male sterility）の２つの型があり、育種対象の植物種などにより使い分けられている。
　有用植物の雄性不稔のうち、ネギ属植物においては、雄性不稔の形質が細胞質（Ｓ＝雄性不稔細胞質、Ｎ＝正常細胞質）及び核（優性稔性回復遺伝子ＭＳ、劣性対立遺伝子ｍｓ）の両方の因子の支配を受ける型であることが知られている（非特許文献２）。雄性不稔形質を有用品種に付与することは、育種上、また種苗生産上きわめて有用であるが、ネギ属植物を用いて雄性不稔系統を作出するためには、タマネギを用いた例では、（Ａ）自然突然変異として単離された雄性不稔系統Ｓ１（Ｓ－ｍｓｍｓ）と改良対象となる品種Ｎ１（Ｎ－ＭＳＭＳ）とを交配して稔性Ｆ１（Ｓ－ＭＳｍｓ）を得、（Ｂ）次いでＦ１（Ｓ－ＭＳｍｓ）を花粉親としてＮ１（Ｎ－ＭＳＭＳ）との間で交配・採種して核因子がヘテロの子孫を得、（Ｃ）更に（Ｂ）で得られた子孫同士（Ｎ－ＭＳＭＳ及びＮ－ＭＳｍｓ：両者は区別できない）を多数交配してＮ－ｍｓｍｓの形質を持った子孫（雄性不稔維持系統）を作出し、（Ｄ）最終的にＳ１（Ｓ－ｍｓｍｓ）とＮ－ｍｓｍｓ形質を持つ子孫とを交配することによって、品種としてはＮ１の形質を持ち、かつ雄性不稔形質を有する雄性不稔子孫（Ｓ－ｍｓｍｓ）という工程を経るのが従来の方法であった。
　この様な従来の方法においては、採種と定植の過程を含むことから作出には最低でも７年間が必要であり、また特に工程（Ｂ）及び（Ｃ）では外見では区別がつかない子孫株どうしを多数かけ合わせる必要があるなど、非常な労力を要するのが現状であった。
　また、他種植物においては、イタリアンライグラスとペレニアルライグラスとを交配して雄性不稔ライグラスを作製する方法（特許文献１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａの細胞とＢ．ｎａｐｕｓ等の細胞とを融合させ、雄性不稔アブラナ科植物を作製する方法（特許文献２，４）、自然界から単離された雄性不稔系統を用いる雄性不稔のスギ（特許文献３）、大豆（特許文献５）、コムギ（特許文献６）の作製方法、その他シンノリン化合物を用いてユリ綱植物の花粉を抑制する方法（特許文献７）や遺伝子組み換えを用いて雄性不稔形質を付与する方法等が提案されているが、化合物を用いたり遺伝子組み換えを用いる方法は、特に食に関するものでは社会的な抵抗感があり、また他種植物における雄性不稔形質の事例ではその植物に固有の因子を利用するものであるため、ネギ属植物には適用できないという問題があった。このため、ネギ属植物においても、育種上利用可能で遺伝子組み換えや化合物処理などによらない雄性不稔植物の開発が望まれていた。
特開２００４－２２２６４６号公報 特開平１０－０５２１８５号公報 特開平１０－２４８４１８号公報 特開平７－０３１３０７号公報 特表２０００－５１０３４６号公報 特表２０００－５１４６６４号公報 特開平５－３０１８０７号公報 鈴木芳夫ほか著　１９９３「新　蔬菜園芸学」朝倉書店 山口彦之監修　２００３「細胞質雄性不稔と育種技術（普及版）」シーエムシー出版 田丸典彦、木下俊郎、高橋萬右衛門　１９８０　北海道大学農学部邦文紀要１２（２）：１２４－１２８ Yamashita K. & Tashiro Y. 1999. J.Japan.Soc.Hort.Sci.68(2): 256-263. Yamashita K. et al. 1999. J.Japan.Soc.Hort.Sci. 68(4): 788-797. Keusgen M. et al. 2002. J.Agric.Food Chem. 50: 2884-2890. Masuzaki S. et al. 2006. Genes Genet.Syst. 81(4): 255-263. Umehara M. et al. 2006. Euphytica 148(3): 295-301. 執行正義　２００２　園学研　１（１）：７５－８０． Wendel J.F. 1983. Ph.D.Thesis Univ.North Carolina Chapel  Hill. van Heusden A.W. et al. 2000. Theor.Appl.Genet. 100: 480-486. Chung S-M. & Staub J.E. 2003. Theor.Appl.Genet. 107: 757-767. 荒木直幸、執行正義　２００５　園学雑　７４　別１：１９９．
　上記の様な現状に鑑み、本発明は、ネギ属植物において育種上利用可能な雄性不稔植物及びその細胞ならびにその作製方法等を提供することを課題とする。
　上記課題の解決のため、本発明者らは、核置換による細胞質雄性不稔系統の作出技術に着目した。核置換とは、異種間または異品種間で交配を行い、その子孫株に花粉親を連続して戻し交配して、核ゲノムを限りなく花粉親に近づける（染色体組換えを考慮しない理論値は１－１／２ｎ、ｎは戻し交配の回数）という技術であり、ある組合せにおいては細胞質と形成された核との間で何らかの不和合性が生じて、花粉が正常に形成されないなど雄性不稔の形質が表れるという現象を利用するものである。イネにおいてインディカ品種（Oryza sativa subsp.indica）とジャポニカ品種（O.sativa subsp.japonica）との交配に由来する核置換系統で雄性不稔系統が作出されているほか（非特許文献３）、ネギ属植物でもガランサム種（Allium galanthum）とネギ（A.fistulosum）またはシャロット（A.cepa Aggregatum group）との交配に由来しガランサム種の核がそれぞれの核で置換された系統に雄性不稔系統が見いだされている（非特許文献４，５）。しかしながら、これまでのところ、ネギ属植物では核置換による細胞質雄性不稔系統の利用は進んでおらず、また北米におけるトウモロコシでのごま葉枯病の大流行の例、すなわちＦ１種子として広く用いられていた単一の雄性不稔系統が新型病原菌に感受性であったため、この細胞質を持つ多くの品種が感染し被害が拡大した例、での教訓から、雄性不稔系統は複数の、由来を異にする系統が並立するのが望ましいと考えられた。この観点から、本発明者らは核置換による細胞質雄性不稔系統の作出を可能とするネギ属植物を広く探索し、その中で野生種のネギの一種のロイレイ種植物（Allium roylei）に注目した。ロイレイ種は灰色かび病やべと病への抵抗性が知られ、一般的なネギ属栽培種植物と交配親和性を持つ野生種のタマネギの一種であるが、ロイレイ種の細胞質が持つ雄性不稔形質については全く知られていなかった。本発明者らは、ロイレイ種の細胞質を持ち、核が非ロイレイ種のネギ属植物の核で置換された植物に強い雄性不稔形質が表れるという事実を見い出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は、（１）アリウム・ロイレイ（Allium roylei）種植物由来の細胞質と、前記アリウム・ロイレイ種以外のネギ属植物（非ロイレイ種ネギ属植物）由来の核ゲノムとを有することを特徴とする雄性不稔ネギ属植物や、（２）少なくとも１種類の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムを有することを特徴とする、上記（１）に記載の雄性不稔ネギ属植物や、（３）単一種の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムを有することを特徴とする、上記（２）記載の雄性不稔ネギ属植物に関する。
　また本発明は、（４）非ロイレイ種ネギ属植物が、タマネギ（Allium cepa Common onion group）、及び／又はシャロット（Allium cepa Aggregatum group）であることを特徴とする上記（３）に記載の雄性不稔ネギ属植物や、（５）上記（１）～（４）のいずれかに記載の雄性不稔ネギ属植物に由来する植物細胞に関する。
　さらに本発明は、（６）［１］アリウム・ロイレイ種植物を種子親として、非ロイレイ種ネギ属植物を花粉親として両者を交配させ雑種植物を得る工程；［２］工程［１］で得られた雑種植物由来の細胞の染色体を倍加し、４倍体雑種植物を得る工程；［３］工程［２］で得られた４倍体雑種植物を種子親として、前記非ロイレイ種ネギ属植物を花粉親として両者を交配させ、異質３倍体植物を得る工程；［４］工程［３］で得られた異質３倍体植物を種子親として、前記非ロイレイ種ネギ属植物を花粉親として両者を交配させ、得られた子孫植物由来の細胞の染色体を調査することにより、前記ロイレイ種植物の染色体を持たない核置換植物を得る工程（戻し交配工程）；の工程［１］～［４］を順次備えることを特徴とする雄性不稔ネギ属植物の作製方法に関する。
　本発明によれば、育種上極めて有用な「細胞質雄性不稔」の形質を、食用、観賞用と広く利用されているネギ属植物に付与することが可能となる。また、本発明の雄性不稔ネギ属植物の作製方法は、過去に報告のあるガランサム種を用いた方法と異なり、その工程に染色体の倍加と異質３倍体の作出を含むことによって、ロイレイ種染色体の排除を容易かつ確実にしており、これによってロイレイ種ゲノム中に含まれる花粉稔性回復遺伝子を排除し、完全な細胞質雄性不稔ネギ属植物を作出可能である。このことはまた、新品種作出までの時間を大幅に短縮するものである。更に、ロイレイ種の細胞質にはべと病や葉枯れ病などネギ属栽培種が罹患しやすい病気への抵抗性がある可能性があり、雄性不稔形質と同時に耐病性も付与することも期待される。
本発明の実施の形態において提供する雄性不稔ネギ属植物の作製方法を模式的に示す。 本発明の実施の形態の交配各世代におけるＬａｐ－１アイソザイム分析の結果を模式的に示す。 本発明の実施の形態で用いたロイレイ種、シャロット、タマネギ及びＢＣ２世代の葉緑体ＤＮＡの多型の解析結果を示す。 本発明の実施例における葉緑体ＤＮＡの多型（ｃｃＳＳＲ－１１プライマー使用）の解析結果の模式図を示す。 本発明の実施例における葉緑体ＤＮＡの多型（ｃｃＳＳＲ－１７プライマー使用）の解析結果の模式図を示す。
　本発明の雄性不稔ネギ属植物としては、アリウム・ロイレイ（Allium roylei；以下、ロイレイということもある）種植物由来の細胞質と、前記アリウム・ロイレイ種以外のネギ属植物（非ロイレイ種ネギ属植物）由来の核ゲノムとを有する雄性不稔ネギ属植物であれば特に制限されるものではなく、本明細書において「核ゲノム」とは、核に存在する生物をその生物足らしめるのに必須な遺伝情報をいい、生存に必要な最小限の１組の染色体（ｘ）や、２組の染色体（２ｘ）が含まれる。本発明の雄性不稔ネギ属植物として、ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムを有さない細胞質と、少なくとも１種類の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノム（単一種の核ゲノムからなる同質倍数体や１種類以上の核ゲノムからなる異質倍数体など）とを有する雄性不稔ネギ属植物を好適に例示することができ、非ロイレイ種ネギ属植物の２組のゲノム染色体（２ｎ＝２ｘ）や４組のゲノム染色体（２ｎ＝４ｘ）を有する雄性不稔ネギ属植物がより好ましい。
　ロイレイ種は灰色かび病やべと病への抵抗性が知られ、一般的なネギ属栽培種植物と交配親和性を持つ野生種のタマネギの一種であるが、ロイレイ種の細胞質が持つ雄性不稔形質については全く注目されていなかった。本発明に用いられる非ロイレイ種ネギ属植物としては、ネギ属に属する植物であって、且つ、ロイレイ種以外の植物であれば特に制限されるものではないが、ロイレイ種と交配可能なネギ属に属するロイレイ種以外の植物が好ましく、以下の表１～２１に示すネギ属植物を例として具体的に挙げることができるが、なかでも、ネギ（Allium fistulosum）、ニンニク（Allium　sativum）、ニラ（Allium tuberosum）、ラッキョウ（Allium chinese）、チャイブ（Allium schoenoprasum）、アサツキ（Allium schoenoprasum var.foliosum）、ノビル（Allium grayi）、ギョウジャニンニク（Allium victoralis）、リーキ（Allium ampeloprasum）などから選択される食用作物や、花ネギ（Allium giganteum）、コワニー（Allium neapolitanum）、アリウム・アズレウム（Allium azureum）、アリウム・ロゼウム（Allium roseum）、アリウム・スファエロセファルム（Allium sphaerocephalum）、アリウム・トリクエトルム（Allium triquetrum）、アリウム・ディッキンソニイ（Allium dickinsonii）、アリウム・アフラチュネンセ（Allium aflatunense）、アリウム・ディクラミディウム（Allium dichlamydeum）、アリウム・モンゴリクム（Allium mongolicum）等の観賞用ネギ属植物を特に好ましい例として挙げることができる。また、前記非ロイレイ種ネギ属植物としては、ロイレイ種植物との交配が難しい種であってもよく、この場合は、下記実施例にも示されるように、ロイレイ種植物の核ゲノムをタマネギ（A. cepa）等のロイレイ種植物との交配が可能なネギ属植物の核ゲノムと置換した後、この子孫とA.altyncolicum、A.chevsuricum、A.globosum、A.obliquum、A.saxatile、A.senescens等のすでにタマネギとの交配が可能であることが報告されている種との交配を行うことにより、本発明の雄性不稔ネギ属植物を作製することができる。以下の表１～２１に本発明に適用可能なネギ属植物のリストを示す。これらの表は現在報告されているネギ属植物をアルファベット順に列記したものであり、表中において、「Ａ．」は属名のAllium（ネギ）を省略したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　また、本発明の雄性不稔ネギ属植物は、ロイレイ種の細胞質と前記非ロイレイ種ネギ属植物の核ゲノムを有するものであって、且つ、雄性不稔性の形質を示す植物であれば特に制限されるものではないが、好適には少なくとも１種類の非ロイレイ種ネギ属植物のゲノムからなる核を有しているのが良い。ネギ属植物は異種間交配が容易な植物群であり、これまでにもネギとシャロットとの雑種（非特許文献７）、ネギとチャイブとの雑種（非特許文献８）などが報告されており、ロイレイ種と非ロイレイ種との交配によりロイレイ種の染色体を排除した後、別の非ロイレイ種ネギ属植物と交配して品種改良等を行うこともできる。複数種の非ロイレイ種ネギ属植物のゲノムを持つ場合における、非ロイレイ種ネギ属植物の組み合わせ、数、ゲノム内の各種の比率などは必要に応じて適宜変更すれば良い。また、ゲノムの倍数性についても、半数体（１倍体）、２倍体、３倍体以上の高次倍数体等、育種目的に沿ったものであればその内容は適宜選択可能である。更に、生物をその生物足らしめるのに必須な遺伝情報を備える場合、非ロイレイ種ネギ属植物のゲノムを１セット（ｎ）全部ではなく染色体レベルで付与する場合についても、ネギ属植物ではその技術を利用可能であり、本発明の範囲内に含まれるものである。これらの中でも育種上、特に形質の安定性の観点から、単一種の非ロイレイ種ネギ属植物の核を持つものが本発明の実施の態様としては好適である。下記の実施例で示すとおり、非ロイレイ種ネギ属植物の中でも特にシャロット（Allium cepa Aggregatum group）や、タマネギ（A.cepa Common onion group）は日常食される野菜として需要も高く、実施の態様として好適である。ロイレイ種の核ゲノムを非ロイレイ種の核ゲノムで置換する方法としては、通常の交配技術を用いるのが好適であるが、細胞工学的な手法、すなわち顕微手術によって直接核を入れ替える手法も原理的には適用可能である。なお、これらの雄性不稔ネギ属植物に由来する細胞も、組織培養などで植物体を再生したり、プロトプラストを形成させ細胞融合に用いたりと、細胞工学的手法により新たな植物体を形成させるための原材料として利用可能であり、本発明の範囲内に含まれるものである。
　本発明の雄性不稔ネギ属植物の作製方法としては、（１）アリウム・ロイレイ種植物を種子親として、非ロイレイ種ネギ属植物を花粉親として両者を交配させ雑種植物を得る工程；（２）工程（１）で得られた雑種植物由来の細胞の染色体を倍加し、４倍体雑種植物を得る工程；（３）工程（２）で得られた４倍体雑種植物を種子親として、前記非ロイレイ種ネギ属植物を花粉親として両者を交配させ、異質３倍体植物を得る工程；（４）工程（３）で得られた異質３倍体植物を種子親として、前記非ロイレイ種ネギ属植物を花粉親として両者を交配させ、得られた子孫植物の染色体を調査することにより、前記ロイレイ種植物の染色体を持たない核置換植物を得る工程（戻し交配工程）；の工程（１）～（４）を順次備えるものであれば特に制限されるものではなく、ここで、種子親と花粉親の両者を交配させるとは、種子親由来の雌性配偶子と、花粉親由来の雄性配偶子とを交配させることを意味する。前記工程（１）においては、ロイレイ種植物を種子親とし、自然交配や人工交配で種間雑種を形成可能な非ロイレイ種ネギ属植物を花粉親に用いることができ、その種類や交配の手法は本発明を限定するものではない。前記工程（２）においては、形成された雑種植物の染色体を倍加するために植物育種で通常用いられる手法を適宜選択することができ、具体例として、成長点を植物体から単離し、コルヒチン処理によって倍加する方法等を挙げることができる。前期工程（３）及び（４）は、工程（２）で得られた４倍体植物（複２倍体植物）と工程（１）で用いた花粉親植物とを交配する工程であり、これは広い意味での戻し交配工程であって、核ゲノムからロイレイ種植物のゲノムすなわち染色体を排除する目的で行われるものである。戻し交配の回数は、多ければ多いほど核ゲノムが非ロイレイ種ネギ属植物の核ゲノムに限りなく近づくと考えられ、有効であると考えられるが、実質的に得られた子孫が雄性不稔になればよく、その回数などが本発明を限定するものではない。従来方法では交配の回数によって核置換の確度を上げていたが、下記実施例に示すとおり、得られた子孫植物の組織から分裂中の細胞を採取して染色体を形態的に観察するか、または染色体特異的マーカー遺伝子やくり返し配列などの特定モチーフの多型、あるいはアイソザイムマーカーなどを用いて分子生物学的に染色体を同定するかして、核ゲノム中に含まれる染色体を調査し、ロイレイ種の染色体を持たない子孫植物を選択すれば戻し交配の回数が少なくてすむ。ロイレイ種細胞質の雄性不稔形質が強いため、シャロット（Allium cepa Aggregatum group）及び／又はタマネギ（A. cepa Common onion group）の核ゲノムで置換された子孫植物を作製するためには、工程（４）の戻し交配工程は理論上１回で可能である。こうして得られた雄性不稔ネギ属植物を種子親として、種々のネギ属植物との間で交配を行い、更なる品種改良に供することも可能である。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
　（材料、及び雄性不稔系統の作出工程）
　まず、材料及び雄性不稔系統の作出工程について説明する。図１は、本実施例に係る雄性不稔ネギ属植物の作製方法を模式的に示すフローチャート図である。本実施例においては、図１に示す様に、ロイレイ種ネギ属植物（Allium roylei）の細胞質を有し、核ゲノムが非ロイレイ種ネギ属植物の核ゲノムで置換された雄性不稔ネギ属植物を得るために、工程（１）として、ロイレイ種とシャロット（A.cepa Aggregatum group）との交配を行った。ロイレイ種のＣＰＲＯ９７１７５株を種子親（ｒＲＲ：２ｎ＝１６；ｒはロイレイ種細胞質を、Ｒはロイレイ種ゲノムをそれぞれ表す。以下同じ）とし、シャロットの８６２０８株（ａＡＡ：２ｎ＝１６；ａはシャロット細胞質を、Ａはシャロットゲノムをそれぞれ表す。以下同じ）を花粉親として交配を行った。交配の際にはＣＰＲＯ９７１７５株（ロイレイ種）で自家受粉が起こらないように除雄を行い、少量のシャロット花粉を手作業にてＣＰＲＯ９７１７５株（ロイレイ種）に受粉させてＦ１を得た。これらの交配で得られた果実から、成熟した種子を採取した。採取された種子の一部を、湿らせた濾紙を敷いたシャーレ上に置き、２５℃、暗黒条件下で発芽させた。発芽後は２５℃、照明下で緑化させ、ある程度まで成長させた後、順化させて培養土に移植し、温室内で栽培した。以後の交配についても、同様の方法を用いた。
　次に、図１の工程（２）に示すように、ロイレイ種とシャロットのＦ１（ｒＡＲ）の染色体の倍加を行った。先の工程（１）で得られたＦ１から茎頂部組織を切り出し、コルヒチン０．１％を含むＬｉｎｓｍｅｉｅｒ－Ｓｋｏｏｇ（ＬＳ）固形培地上に組織を置床して、暗黒条件下で４日間培養した。その後、組織をＬＳフリー培地上に移し、２ヶ月間培養した後、得られた再生植物体について根端細胞の染色体を酢酸カーミンで染色し、顕微鏡下で染色体調査を行った。予めロイレイ種とシャロットの染色体の形や大きさを顕微鏡下で調べておき、これと再生植物体の染色体像を形態的に比較することで、どの染色体をどれだけもっているかを決定した。染色体の観察は以下の方法で行った。まず、５－１０ｍｍに伸長した二次根を採取し、酢酸－エタノール混合液（１：３）内にて冷蔵庫内で一晩固定した。次に、固定後の根を６０℃の１Ｎ塩酸で６分間処理し、解離・加水分解させた後、塩基性フクシンを用いてフォイルゲン染色を行った。続いて、スライドガラス上に４５％酢酸を１滴落とし、その中に染色した根端を入れ、カバーガラスを載せて先の尖った棒でカバーガラス上から試料を叩き、カバーガラスを圧した。この操作により細胞や染色体を分散させ、染色体を一平面上に配列させた後、光学顕微鏡下で染色体を観察した。この観察により、再生植物体の中から、ロイレイ種染色体とシャロットの染色体をそれぞれ２組ずつ持つもの、すなわち複２倍体（ｒＡＡＲＲ：２ｎ＝３２）を選抜して次代の交配に用いた。
　更に図１の工程（３）に示すように、先の工程（２）で得られた複２倍体を種子親とし、シャロット１８－５株（ａＡＡ）、及びタマネギ晩抽苔株（ｃＣＣ）を花粉親として戻し交配を行って第一代の異質３倍体（ＢＣ１）を作出した。下記表２２に、交配の結果を示す。なお、下記表２２において種子形成胚珠率は、種子形成胚珠率＝［種子数／（交配小花数×６）］で示す計算式により求めたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　上記表２２からも明らかな様に、複２倍体（ｒＡＡＲＲ）×シャロット（ａＡＡ）の組み合わせでは、５６８個の小花に交配を行い、うち１２４個の小花が結実し、種子数は２３２個であった。この値を基に種子形成胚珠率［種子数／（交配小花数×６）］を計算すると、６．８％という値を示した。このうち７９個の種を前述の方法にて発芽させたところ、２９個が発芽し、発芽率は３６．７％であった。この２９個体を培養したところ、２３個体が正常に成長し、その生存率は８６．２％であった。
　一方、複２倍体（ｒＡＡＲＲ）とタマネギ晩抽苔株（ｃＣＣ）との組み合わせでは、７９個の小花に交配を行い、うち３３個の小花が結実し、種子数は７５個であった。種子形成胚珠率はシャロットよりも高く１５．８％の値を示した。種子のうち５２個を発芽させたところ、１０個が発芽し、発芽率は１９．２％であった。この１０個体を培養したところ、６個体が正常に成長し、その生存率は６０％であった。タマネギとシャロットは形態的に違いはあるが、種レベルでは同種とされ、そのゲノムＡとＣとは等価であると指摘されているが、この結果はそれを裏付けるものである。
　続いて、図１に示すように、工程（３）で得られた子孫株のうち、複２倍体（ｒＡＡＲＲ）とシャロット（ａＡＡ）の交配に由来し、染色体数が２４である異質３倍体（ｒＡＡＲ）ＣＭ２３系統を材料とし、ここにタマネギ北見交３９号（ｃＣＣ）をかけ合わせ、工程（４）の戻し交配を行って第二代（ＢＣ２）を作出した。交配の結果を、下記表２３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　上記表２３で示すように、交配で得られた種子１７８個のうち、１３０個が発芽し、発芽率は７３．０％であった。発芽した個体のうち正常に成長したものは１２７個体あり、生存率は９７．７％と高い値を示した。
　正常に成長したＢＣ２世代１０８個体につき、その染色体数を上記の方法で形態学的に調査した。結果を下記表２４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　上記表２４に示すように、染色体数が１６、すなわちロイレイ種由来の染色体が排除され、核ゲノムがシャロット及びタマネギの核ゲノムで置換されたと考えられるものが６８個体あり、全体の６３％を占めた。次いで、染色体数が１７、すなわちロイレイ種由来の単一染色体を有するものが３８個体で、割合は３５％であった。染色体数が１８－２２のものは見られず、染色体数が２３すなわちロイレイ種由来の染色体が１本欠失した個体が１個体、染色体数が２４すなわちロイレイ種由来の染色体を全て持つ異質３倍体が１個体で、割合はそれぞれ０．９％と非常に少なかった。４倍体（２ｎ＝３２）は観察されなかった。
　これらの結果は、本発明の提供する、ロイレイ種由来の細胞質を有し、核ゲノムが非ロイレイ種由来の核ゲノムからなるネギ属植物の作製方法（工程１－４）を用いれば、ＢＣ２世代でロイレイ種の染色体を持たないものが７割近くと効率よく目的の系統を作製することが可能であることを示している。
　（アイソザイム分析による核ゲノムの同定）
　実施例２においては、アイソザイム分析による核ゲノムの同定を行った。以下に、その詳細を説明する。染色体数が２ｎ＝１６を示したＢＣ２系統、及び２ｎ＝１７を示し染色体の形態からロイレイ種の第１染色体を有すると推定されたＢＣ２系統の各１個体を、ネギ属植物第１染色体特異的アイソザイムマーカーＬａｐ－ｌ（非特許文献９参照）を用いて分析し、ロイレイ種、シャロット、ロイレイ種とシャロットのＦ１及びＢＣ１におけるアイソザイムの出現パターンを比較・検討した。Ｌａｐ－１（ロイシンアミノペプチダーゼ－１）は細胞内では単量体（モノマー）として存在し、種によってその分子量にばらつきがあることから、アイソザイム分析のマーカーとして広く利用されているタンパク質である。またネギ属植物では、Ｌａｐ－１をコードする遺伝子が第１染色体上に存在することが知られており、Ｌａｐ－１は第１染色体のマーカーとして利用可能である。各植物試料から、それぞれ葉身部を０．２ｇ程度切り取って乳鉢に入れ、Ｗｅｎｄｅｌの抽出液（０．６％リン酸水素２Ｎａ，７％ショ糖，５％ＰＶＰ－４０，０．０５％ＥＤＴＡ，０．０５％Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，０．１％Ｌ－アスコルビン酸Ｎａ，０．１％Ｄｉｅｔｈｙｌｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍｉｃ　ａｃｉｄ－ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ，０．０５％ピロ亜硫酸Ｎａ，０．１％　ｖ／ｖ　メルカプトエタノール；非特許文献１０参照）を１ｍｌと石英砂を加え、氷上にて乳棒を用いて磨砕した。磨砕した試料を、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清２０μｌを電気泳動用の試料とした。電気泳動は５％ポリアクリルアミドゲルを用い、１５Ａ（ゲル１枚あたり）の定電流で３時間半、冷蔵庫内にて泳動した。電気泳動の終了後、ゲルを染色液［０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．８）中に０．０２％Ｌ－Ｌｅｕｃｉｎｅβ－Ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ，０．０５％Ｆａｓｔ　Ｇａｒｎｅｔ　ＧＢＣ　ｓａｌｔ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ］に移し、３７℃、暗黒条件下で３０分間、振とうさせながら染色した。ゲル上にバンドが出現した後、１．５％酢酸で染色反応を止め、ゲルを水道水で５－６回洗浄して酢酸を除去した。ガラス板上にＧｅｌｂｏｎｄ（登録商標）ＰＡＧ　ｆｉｌｍ（タカラバイオ社製）を乗せ、その上にゲルを乗せ、１０％グリセロールをゲルの上に重層し、更にその上からセロファンを乗せてシールした。この状態で２５℃の暗所に置き、全体を乾燥させた。
　アイソザイム分析の結果を模式化したものを、図２に示す。図中レーン１－６は電気泳動で得られたバンドパターンを模式化したものであり、レーン１はロイレイ種、レーン２はシャロット、レーン３はロイレイ種とシャロットのＦ１、レーン４はＢＣ１の異質３倍体、レーン５は２ｎ＝１６を示したＢＣ２、レーン６は２ｎ＝１７を示したＢＣ２の結果をそれぞれ表している。ロイレイ種第１染色体にコードされたＬａｐ－１の産物をαで、シャロット及びタマネギの第１染色体にコードされたＬａｐ－１の産物をβでそれぞれ示しており、これらの結果から、２ｎ＝１７のＢＣ２個体はロイレイの第１染色体とシャロット及び／またはタマネギの第１染色体の両方を持っており、反対に２ｎ＝１６のＢＣ２個体はロイレイ種の染色体を持たず、シャロット及び／またはタマネギの染色体を持っていることが明らかとなった。この結果はまた、本発明の方法を用いることでロイレイ種の染色体がＢＣ２世代で排除可能であることも示している。
　（ＳＳＲ多型解析による細胞質の同定）
　実施例３においては、ＳＳＲ多型解析による細胞質の同定を行った。以下に、その詳細を説明する。上記の様なＢＣ２系統において染色体数が２ｎ＝１６を示した個体７個体（５，６，１４，２２，２４，３０，４１株）について、葉緑体ＤＮＡ由来のＳＳＲ配列（Ｓｈｏｒｔ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｐｅａｔ：ｃｃＳＳＲ１１）に着目してＤＮＡ多型解析を行い、それぞれの細胞質の同定を行った。葉緑体は母系遺伝することが知られており、その葉緑体中に含まれるＤＮＡの多型は細胞質の由来を知るためのマーカーとなる。
　試料からの全ＤＮＡの抽出は、ｖａｎ　Ｈｅｕｓｄｅｎらの方法（非特許文献１１参照）に従った。具体的には、植物試料から葉身部０．０５ｇを切り取り、これに抽出液（Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　３１２．５μｌ，Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　３１２．５μｌ，Ｓａｒｋｏｓｙｌ　１２５μｌ，亜硫酸ナトリウム２．８５ｍｇを混合したもの）７５０μｌを加えて磨砕した後、６５℃で１時間インキュベートした。次に、磨砕試料をチューブに移し、１４０００ｒｐｍ、４℃で９０秒遠心し、上清にクロロホルム－イソアミルアルコール（２４：１）を７５０μｌ加えて振とうし、１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。続いて、上清（水相）４００μｌを別チューブに移し、等量の冷やしたイソプロパノールを加えて混合し、１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心してペレットを得た。そして、上清を捨て、ペレットに７０％エタノールを５００μｌ加えて１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清を捨ててペレットを室温で乾かし、１００μｌのＴＥ（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ　ｂｕｆｆｅｒ）を加えて懸濁し葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）試料とした。分光高度計を用い試料液中のＤＮＡ濃度を測定し、終濃度が２０ｎｇ／μｌとなるように調整した。この試料液をＰＣＲ用に供した。
　ＰＣＲは、Ｃｈｕｎｇ＆Ｓｔａｕｂにより開発されたプライマーセット（非特許文献１２）のうちｃｃＳＳＲ－１１プライマーを用いて，以下の条件により行った。反応液組成は、全量２５μｌ；５０ｍＭ ＫＣｌ，４ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，０．４ｍＭ Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ，０．４ｍＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ，０．１２５ ｕｎｉｔ　Ｔａｑ　Ｇｏｌｄ，１００ｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ，１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に調整した。ＰＣＲ反応は，予備反応９５℃　１１分；変性９４℃　３０秒，アニーリング５６℃　３０秒，伸長反応７２℃　３０秒を４０サイクル；後処理７２℃　１０分で行った。ＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲルにアプライして電気泳動を行い、そのバンドパターンをロイレイ種、シャロット、タマネギ、２ｎ＝１６であるＢＣ２で比較した。
　ＰＣＲの結果を、図３に示す。図３はｃｐＤＮＡのｃｃＳＳＲ－１１のＰＣＲ増幅パターンを示す図である。図中レーンｍは分子量マーカー（ｂｐ）を表し、レーンＲはロイレイ種を、レーンＡはシャロットを、レーンＣはタマネギを表し、以降の５－４１はＢＣ２各株のサンプルの結果である。本解析で用いたｃｃＳＳＲ－１１プライマー（非特許文献１２）でＰＣＲを行うと、葉緑体ＤＮＡの多型が増幅されるバンドの分子量の違いとして表れ、今回用いた試料ではロイレイ種が最も大きく、次いでタマネギ（ロイレイ種よりも１塩基小さい）、最も小さいシャロットとなり、ＢＣ２細胞の葉緑体ＤＮＡが示す多型と比較可能である。レーン５－４１が示す通り、全てのＢＣ２個体でロイレイ種と同じ位置に単一のバンドが出現し、このことから、これらのＢＣ２個体はロイレイ種に由来する細胞質を有していることが明らかとなった。
　（ＢＣ２世代の花粉稔性の調査）
　実施例４では、ＢＣ２世代の花粉稔性の調査を行った。以下に、その結果について説明する。ＢＣ２世代において、栽培により開花が見られた個体の花粉稔性を、酢酸カーミンの染色性と１０％（ｗ／ｖ）ショ糖寒天培地上における発芽率の２つの指標により測定した。酢酸カーミンの染色性は、最初の小花が開花した直後とその約１週間後に、１個体につき３小花、合計１５００粒以上の花粉を採取し、酢酸カーミンで染色して形態学的に観察して、生殖核と栄養核の両方を持つ花粉を可稔の正常な花粉、生殖核を持たない花粉を不稔の花粉とし、それぞれの個体について全花粉中の可稔の花粉の割合（％）を求めた。またショ糖寒天培地上における発芽率は、酢酸カーミン染色による２回目の調査後に行い、１個体から３小花、合計３００粒以上の花粉を採取してショ糖寒天培地上に蒔き、２５℃、湿度５０％の条件下で２時間培養して、顕微鏡下で花粉管が伸長していたものを可稔の花粉、伸長がみられなかったものを不稔の花粉とし、それぞれの個体について全花粉中の可稔の花粉の割合（％）を算出した。
　花粉稔性の調査の結果を下記表２５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　上記表２５に示すように、カーミン染色による２回の調査から、全個体のうち８割－９割近くの個体が、生殖核と栄養核の両方を持ち正常（可稔）と考えられる花粉を１０％も持たず、花粉稔性が極めて低いことが示された。更に、ショ糖寒天培地上における花粉の発芽率は、カーミン染色による結果よりも更に低く、ほとんどの個体が正常花粉を花粉全体の１２％未満しかもたないことが明らかとなった。カーミン染色と花粉培養の両調査結果から、２ｎ＝１６であるＢＣ２世代の各個体に、強い雄性不稔形質が表れていることが示された。
　これらの結果から、本発明の提供する、ロイレイ種の細胞質を有し非ロイレイ種の核ゲノムを有するネギ属植物が、雄性不稔形質を有していることが示された。
　実施例４の花粉稔性調査結果について、より本質的な雄性不稔形質、すなわち花粉稔性が０または１％未満という個体の頻度に着目して改めて集計した。結果を下記表２６に示す。表２６は表２５と基本的に同じ調査結果を元にしており、個体あたりの可稔花粉の割合（％）を表２５よりも細かく分け、可稔花粉が０のもの、及び１％未満のものを示している。
　カーミン染色１回目の調査では、可稔花粉が０のものが全体の２０％にあたる１２個体観察され、また１％未満のものも１６個体（２６．７％）観察された。２回目の調査でも可稔花粉が０、１％未満の個体がそれぞれ全体の１８．５％、１４．８％を占めていた。更に、花粉の発芽率に着目した調査では、全体の実に７５％が可稔花粉をまったく持たない不稔の個体であり、本発明の提供するロイレイ種の細胞質を有し非ロイレイ種の核ゲノムを有する２倍体のネギ属植物に、強い雄性不稔の形質が付与されていることが改めて示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　（葉緑体ＳＳＲの塩基配列を用いた他種ネギ属植物との比較）
　実施例３で解析した葉緑体ＤＮＡ上のくり返し配列（Consensus Chloroplast Simple sequence repeat：ｃｃＳＳＲ）について、より詳細な多型解析を行い、本発明において作出した核置換系統が確かにロイレイ種の細胞質を有しているかどうかを検証した。
　多型解析用のプライマーとしては、先行研究（非特許文献１３）において本発明者らが明らかにした結果より、Ｃｈｕｎｇ＆Ｓｔａｕｂにより開発されたｃｃＳＳＲのプライマー（非特許文献１２）のうち、ｃｃＳＳＲ－１１プライマー及びｃｃＳＳＲ－１７プライマーの２組のプライマーを用いた。試料としては栽培種、野生種を含む複数種のネギ属植物－Ａ．ｃｅｐａ種に属する４つの栽培種、すなわちネギ’九条細’系統、タマネギ’北見交３９号’系統、シャロット’８６２０８’系統、ワケギ’寒知らず（晩成）’系統、及び４種の野生種であるA.galanthum’９７２０５－２２’系統、A.roylei’９５００１－１’系統、A.vavilovii’９７２０３－８’系統、A.altaicum’９７０１０－２５’系統の４系統、ニラA.tuberosum’広幅にら’系統とラッキョウA.chinense（系統不詳）の１０種類に加え、本発明の核置換系統であるＣＭ２３－ＲＢ６、ＣＭ２３－ＲＢ１５、ＣＭ２３－ＲＢ２５、ＣＭ２３－ＲＢ３０、ＣＭ２３－ＲＢ３６、ＣＭ２３－ＲＢ３９、ＣＭ２３－ＲＢ４１の７系統の合計１７系統を試料として供した。
　各試料から微量サンプル抽出法（実施例３の方法に従う）により全ＤＮＡを抽出した。この全ＤＮＡを鋳型とし、上記２組のプライマーについて、Ｆｏｒｗａｒｄプライマーの５’末端を６－ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＮＥＤのうち１種類で蛍光標識し、これらの蛍光プライマーを１反応につき１組用いてＰＣＲを行い、各試料のＤＮＡからｃｃＳＳＲ領域を増幅させた。ＰＣＲ産物はＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ３１０　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems社製）によりキャピラリー電気泳動を行い、ＧｅｎｅＳｃａｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Applied Biosystems社製）によりフラグメントサイズを決定した。
　下記表２７に、フラグメント解析の結果を示す。表中の種名・品種名はそれぞれ上記野生種、栽培種、核置換の各系統を示し、産物の分子量は葉緑体ＤＮＡからｃｃＳＳＲ－１１プライマー、ｃｃＳＳＲ－１７プライマーで増幅した産物の分子量（ｂｐ）の測定結果を示す。
　ｃｃＳＳＲ－１１プライマーにより、１０２－１２０ｂｐのＰＣＲ産物が増幅され、本発明の核置換系統では１１１．６－１１１．７ｂｐの産物が増幅された。これを他種と比較すると、野生種ではA.royleiの１１１．６ｂｐと一致し、一方で従来技術において核置換による雄性不稔が報告されているA.galanthumの１０２．７ｂｐとは異なっており、本発明の核置換により作出された雄性不稔系統が従来知られた系統とは異なる系統であることが示された。更に交配に用いたシャロット（１０６．１ｂｐ）及びタマネギ（１１０．７ｂｐ）とも異なっており、本発明の雄性不稔系統がA.royleiの細胞質を有していることが示された。
　一方、ｃｃＳＳＲ－１７プライマーにより、１９４－２０２ｂｐのＰＣＲ産物が増幅され、本発明の核置換系統では１９４．４－１９４．８ｂｐの産物が増幅された。これはA.royleiの１９４．７ｂｐと一致し、一方ｃｃＳＳＲ－１１プライマーではＰＣＲ産物の分子量が比較的近かったタマネギにおける１９９．６ｂｐとは大きく異なっていた。ここで、北見交３９号系統が細胞質－核遺伝子支配による雄性不稔系統（自然突然変異から従来技術により作製された雄性不稔系統）を母方とするＦ１品種であり、雄性不稔の細胞質（ｓ細胞質）を有することから、本発明で作製された雄性不稔系統が、従来用いられてきたタマネギの雄性不稔系統とは異なる雄性不稔系統であることが改めて示された。
　なお本実施例におけるＰＣＲ産物の分子量は、解析ソフトを用いた計算値であるため、小数点以下の数字を含む値で示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　以上の結果を、図４及び図５に可視化して表す。図４はｃｃＳＳＲ－１１プライマーを用いたＰＣＲの結果を、その産物の分子量からグラフ上に模式化したものであり、レーン１－４は野生種（１：A.roylei，２：A.galanthum，３：A.altaicum，４：A.vavilovii）を、レーン５－１０は栽培種（５：シャロット、６：タマネギ、７：ラッキョウ、８：ニラ、９：ネギ、１０：ワケギ）を、レーン１１－１７は本発明の核置換系統（ＣＭ２３－ＲＢ系統、番号は株番号）をそれぞれ表し、またグラフ縦軸は分子量（ｂｐ）を表している。図中矢印で示した様に、核置換系統のＰＣＲ産物はＡ．ｒｏｙｌｅｉのものとほぼ一致し、他の野生種や栽培種とは異なっていた。
　図５はｃｃＳＳＲ－１７プライマーを用いたＰＣＲの結果を、その産物の分子量からグラフ上に模式化したものであり、レーン１－４は野生種（１：A.roylei，２：A.galanthum，３：A.altaicum，４：A.vavilovii）を、レーン５－１０は栽培種（５：シャロット、６：タマネギ、７：ラッキョウ、８：ニラ、９：ネギ、１０：ワケギ）を、レーン１１－１７は本発明の核置換系統（ＣＭ２３－ＲＢ系統、番号は株番号）をそれぞれ表し、またグラフ縦軸は分子量（ｂｐ）を表している。図中矢印で示した様に、核置換系統のＰＣＲ産物はＡ．ｒｏｙｌｅｉのものとほぼ一致し、加えて図中囲みで示したタマネギ（雄性不稔のｓ細胞質を持つ）とは異なるサイズであった。
　これらの結果は、本発明で作製した核置換による雄性不稔系統が、ロイレイ種（A.roylei）の細胞質を有している事を示している。
　本発明は、ロイレイ種ネギ属植物と非ロイレイ種ネギ属植物との交配によって作出される雄性不稔ネギ属植物であり、新品種作出までの大幅な時間短縮を可能にするなど、農業の育種分野において利用可能である。

Claims (6)

  1. 　アリウム・ロイレイ（Allium roylei）種植物由来の細胞質と、前記アリウム・ロイレイ種以外のネギ属植物（非ロイレイ種ネギ属植物）由来の核ゲノムとを有することを特徴とする雄性不稔ネギ属植物。
  2. 　少なくとも１種類の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムを有することを特徴とする、請求項１に記載の雄性不稔ネギ属植物。
  3. 　単一種の非ロイレイ種ネギ属植物由来の核ゲノムを有することを特徴とする、請求項２記載の雄性不稔ネギ属植物。
  4. 　非ロイレイ種ネギ属植物が、タマネギ（Allium cepa Common onion group）、及び／又はシャロット（Allium cepa Aggregatum group）であることを特徴とする請求項３に記載の雄性不稔ネギ属植物。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載の雄性不稔ネギ属植物に由来する植物細胞。
  6. 　以下の工程（１）～（４）を順次備えることを特徴とする雄性不稔ネギ属植物の作製方法。
    　（１）アリウム・ロイレイ種植物を種子親として、非ロイレイ種ネギ属植物を花粉親として両者を交配させ雑種植物を得る工程；
    　（２）工程（１）で得られた雑種植物由来の細胞の染色体を倍加し、４倍体雑種植物を得る工程；
    　（３）工程（２）で得られた４倍体雑種植物を種子親として、前記非ロイレイ種ネギ属植物を花粉親として両者を交配させ、異質３倍体植物を得る工程；
    　（４）工程（３）で得られた異質３倍体植物を種子親として、前記非ロイレイ種ネギ属植物を花粉親として両者を交配させ、得られた子孫植物由来の細胞の染色体を調査することにより、前記ロイレイ種植物の染色体を持たない核置換植物を得る工程（戻し交配工程）；
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