WO2009098335A1 - Soportes macroporosos tridimensionales para ingeniería tisular - Google Patents

Soportes macroporosos tridimensionales para ingeniería tisular Download PDF

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tissue
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José Luís GÓMEZ RIBELLES
Manuel MONLEÓN PRADAS
Julio José SUAY ANTÓN
Myriam Lebourgh
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Universidad Politecnica de Valencia
Fundacion de la Comunidad Valenciana Centro de Investigacion Principe Felipe
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Universidad Politecnica de Valencia
Fundacion de la Comunidad Valenciana Centro de Investigacion Principe Felipe
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    • A61L2400/18—Modification of implant surfaces in order to improve biocompatibility, cell growth, fixation of biomolecules, e.g. plasma treatment

Definitions

  • the present invention falls within the field of tissue engineering, and more particularly refers to a three-dimensional macroporous support, which can be biodegradable and reabsorbable and which comprises an organic polymer matrix reinforced with inorganic particles dispersed therein, and, optionally, a biomimetic hydroxyapatite coating.
  • the invention also relates to a process for obtaining said support, as well as the use thereof in tissue engineering applications.
  • tissue engineering is becoming increasingly important, which is defined as the application of engineering principles and methods and life sciences to the fundamental knowledge of the relationships between structure and functions in mammalian tissues. , normal and pathological; and the development of biological substitutes to recover, maintain or improve tissue functionality [Williams D., Materials Today (2004) 7, 24].
  • ⁇ scaffolds three-dimensional macroporous supports, known and also called, from now on, as ⁇ scaffolds ", which should serve as support for bone growth (osteoconduction ) and induce the differentiation of osteogenic cells towards osteoblasts and osteoclasts (osteoinduction).
  • osteoconductors calcium phosphates, bioactive glasses, ceramics .
  • This type of materials allows a direct bond to the bone due to the chemical similarity with its mineral components.
  • they do not have good mechanical properties, they are fragile and brittle, which compromises the viability of the implant and much more if the material must be porous.
  • Materials of this type available today do not also offer adequate porosity (neither in proportion nor in size).
  • the high rigidity of solid or little porous ceramics can lead to the appearance of the load protection phenomenon, which is disastrous for the implant and its surroundings.
  • This support is prepared by a method comprising the combination of selective dissolution and phase inversion techniques, which provides control over the morphology of the support formed; It has utility in the field of tissue engineering, particularly as a support for cell growth in vitro and in vivo.
  • the surface of the support can be modified for example by deposition of resorbable calcium phosphate particles by osteoclasts.
  • this support has, among others, the disadvantage that its biocompatibility is limited.
  • Application US2004 / 191292 discloses a composite material, and its use in the field of biomedical engineering, where the composite material comprises bioactive microparticles that could induce human bone tissue to regenerate.
  • the support uses the combination of silica, calcium, phosphorus microparticles as bioactive substances that could actively induce the proliferation and differentiation of human osteoblasts, promoting the formation and calcification of new bone.
  • the support comprises a three-dimensional structure and an anatomical external shape according to the requirements for bone regeneration and vascularization.
  • the volume of microparticles included has to be very high for a sufficient osteoinductive effect to take place on the surface.
  • HAp hydroxyapatite
  • the inventors of the present invention have surprisingly discovered a new three-dimensional support that has properties especially suitable for use in tissue engineering applications.
  • the support has a morphology, characterized by the co-existence of macropores and micropores continuously interconnected with each other as shown in Figure 5 (left).
  • the three-dimensional support is formed by a matrix consisting of an organic polymer and in which particles of a reinforcing material are homogeneously dispersed.
  • the surface of both macropores and micropores can be activated by a suitable procedure, converting the three-dimensional support into a three-dimensional bioactive support.
  • said three-dimensional bioactive support is capable of generating, either when ⁇ is implanted in vivo "or in equivalent conditions" in vitro ", a coating of continuous biomimetic hydroxyapatite that covers all the internal surfaces of the macropores and micropores resulting in a hybrid support with a biomimetic polymer-hydroxyapatite interpenetrated structure as depicted in Figure 5 (right).
  • the three-dimensional support of the present invention which is described in detail below, is especially suitable for use in tissue engineering since it allows the growth of cells and their vascularization, essential for the development of functional and three-dimensional tissue. Specifically, one of the applications in which it is very useful is the manufacture of intervertebral fusion strips.
  • Figure 1 SEM photomicrographs of a) a polycaprolactone matrix without biomimetic hydroxyapatite coating; and b) detail of the micropore structure of the polycaprolactone matrix.
  • Figure 2 SEM photomicrographs of a) a polycaprolactone matrix in which the biomimetic hydroxyapatite coating is observed; b) detail of the structure of the coating; c) and d) detail of the growth of biomimetic hydroxyapatite inside the micropores.
  • Figure 3 SEM photomicrograph of the continuous coating of biomimetic hydroxyapatite after pyrolizing the polymer matrix.
  • Figure 4 SEM photomicrograph of a nanoparticle reinforced polycaprolactone matrix (mean diameter 100 nm) of hydroxyapatite dispersed in the polymer matrix.
  • Figure 5 Representation of the macroporous support before (left) and then (right) of its coating with biomimetic hydroxyapatite where (m) indicate micropores and (M) macropores; and where (HAp-m) and (HAp-M) indicate micropores and coated macropores respectively.
  • Figure 6 Intervertebral fusion strips of bioactive polycaprolactone obtained by the process of the invention.
  • Figure 7 shows the result of an electron microscopy analysis in EDX mode of a sample coated with biomimetic hydroxyapatite according to the described procedure (hybrid support): shows the constituent atoms of the deposited layer of hydroxyapatite and the analysis of the chemical composition.
  • Figure 8 SEM photomicrograph showing a hybrid support (polymeric matrix with biomimetic HAp coating) after calcination.
  • the present invention relates to a new three-dimensional support consisting of a polymeric matrix and particles of nanometric or micrometric size of an inorganic material, dispersed in said matrix and homogeneously distributed.
  • the support has a morphology that presents a network of macropores perfectly interconnected with each other of size between 50 and 1000 microns, and additionally a second network of micropores also interconnected with each other, and with macropores, of size between 1 and 10 microns.
  • the support has a porosity in volume between 50 and 95%.
  • said three-dimensional support hereinafter support of the invention, is It is activated as detailed in the description.
  • Said activated support is hereinafter referred to as bioactive support.
  • the support of the invention further comprises an inorganic phase consisting of a biomimetic HAp coating, and which the description hereafter refers to as hybrid support.
  • Another aspect of the invention relates to a new method of obtaining the support of the invention.
  • the process comprises the steps of: dissolving a polymer in a first solvent, adding reinforcing particles and dispersing them with ultrasonic techniques in the liquid medium, adding porogen; abrupt solidification of the mixture by cooling, maintaining the homogeneity of the dispersion of the reinforcement material and preventing its agglomeration; extraction with a second suitable solvent of the first solidified solvent; dissolution and removal of the porogen.
  • Another additional aspect of the invention relates to a support obtainable according to the process of the invention.
  • the invention in another aspect relates to a support for use in tissue generation or regeneration.
  • the invention also relates to the use of the support of the invention for the generation or regeneration of tissue, for example connective tissue, such as bone or cartilage.
  • tissue for example connective tissue, such as bone or cartilage.
  • the invention relates to a method for generating or regenerating tissue comprising obtaining a bioactive support or a hybrid support according to the invention, and culturing cells of a selected tissue on said support.
  • the procedure may also include seeding with support cells.
  • the object of the present invention relates to a three-dimensional support consisting of a polymer matrix and reinforcing particles dispersed in said matrix, of nanometric or micrometric size of a suitable inorganic material, and homogeneously distributed in the matrix ( Figure 4) .
  • This support which makes it especially effective in tissue applications, resides in the morphology of the same since it has a network of macropores perfectly interconnected with each other in sizes between 50 and 1000 microns, and additionally a second network of micropores also interconnected with each other, and with the macropores, of size between 1 and 10 microns ( Figure 1).
  • the support has a porosity in volume between 50 and 95% and a high specific surface.
  • This morphology confers advantages to the new support, and allows the activation of micropore and macropore surfaces, which facilitates and accelerates the generation of a biomimetic HAp coating as described below.
  • Figure 1 shows the double porous structure of a polymeric PLC matrix with micropores and micropores interconnected with each other.
  • the SEM scanning electron microscopy image corresponds to a cryogenic fracture of a polycaprolactone matrix.
  • the Micropores are clearly seen in the fracture section.
  • the perfect interconnection between the macropores with connecting throats of average diameter sizes greater than 100 ⁇ m is also clearly observed.
  • the morphology of the structure both in terms of the volume fraction of macropores, micropores, their sizes or the size of the throats connecting between pores can be controlled during the production process by varying the chemical composition and process parameters.
  • the polymer that is used in the present invention can be biodegradable.
  • the polymeric matrix may comprise any conventional polymer, preferably biocompatible, and reabsorbable, in particular, when the matrix is intended for physiological applications.
  • biocompatible refers in the present invention to being non-toxic and allowing cells to colonize it.
  • resorbable in the present invention refers to the support disappearing over time when it is inside an animal body as it is replaced by regenerated tissue.
  • the polymer must be selected so that it can be activated superficially by the creation of crystallization nuclei, inducers of the subsequent crystallization of biomimetic hydroxyapatite.
  • the polymer must comprise hydroxyl groups, such as carboxyl groups, silanoles, TiO 2 among others and mixtures thereof.
  • biomimetic hydroxyapatite refers to hydroxyapatite that is deposited naturally “in vivo” or that is deposited by immersing the support in an equivalent solution that reproduces the conditions in vivo, of the same salt composition as the human plasma (Simulated Body Fluid or SBF) for the necessary time.
  • polycaprolactone PCL
  • PLA polylactic acid
  • PLGA lactic acid and glycolic acid
  • PLLA-co-PEG lactic acid and ethylene glycol
  • PPF Usine lactic acid copolymers
  • ethylene glycol and fumaric acid copolymers polypropylene fumarate, as well as mixtures thereof.
  • the polymer matrix comprises a polymer approved for clinical use, such as polycaprolactone (PCL).
  • the polymeric matrix comprises particles of a suitable inorganic material or reinforcement material, which may be, among others, hydroxyapatite, fluorohydroxyapatite, calcium disilicide, calcium phosphate, and mixtures thereof.
  • a suitable inorganic material or reinforcement material which may be, among others, hydroxyapatite, fluorohydroxyapatite, calcium disilicide, calcium phosphate, and mixtures thereof.
  • the size of said particles is between 50-300 nm.
  • the particles have a size smaller than 100m so that their effect as a mechanical support of the support and its biodegradability are greater.
  • nanoparticles can be observed on the surface of the polymer matrix before being coated with HAp
  • the characteristics of the three-dimensional support of the invention vary depending on its chemical composition; they have porosities between 50-95%, preferably equal to or greater than 70%; elastic modules between 0.1MPa and 100MPa, and in vitro degradation rates between 4 and 12 months.
  • the characteristics of the support of the invention can be varied in a simple manner by a person skilled in the art within the ranges described to adapt to the needs required by the specific application.
  • the support of the invention is a bioactive support.
  • the bioactive support is obtained as explained below in the description, and refers to a support according to the invention in which micropore and macropore surfaces have crystallization nuclei, inducers of hydroxyapatite crystallization, preferably biomimetic HAp.
  • bioactive refers to the support, refers to the ability of the support to induce the proliferation and differentiation of osteoblasts, to induce the formation and calcification of new bone, and the ability to restore physiological function at the molecular and cellular level.
  • This bioactive ability can be demonstrated if the support is implanted in vivo, or alternatively as in the present invention, by applying the conventional method accepted in this field of the technique, which consists of immersing the bioactive support in a simulated body fluid solution, which Simulate blood plasma and observe how the growth of a biomimetic HAp coating takes place.
  • the support of the invention is a hybrid support, consisting of the three-dimensional support described above, and a continuous and homogeneous coating of biomimetic hydroxyapatite on the surface of the macropores and micropores.
  • the adhesion to the polymeric matrix of the biomimetic hydroxyapatite is very high and gives the support good mechanical properties and osseointegration and osteoinduction properties.
  • the structure of the hybrid support is seen in Figures 2a and 2b in which it is clearly shown that the polymer matrix, and the phase of Biomimetic hydroxyapatite intermingles microscopically and in a highly interpenetrated manner. Both the polymer matrix and the hydroxyapatite constitute continuous phases. This continuity is shown in Figure 3 which shows an SEM photomicrograph of a hybrid support after having pyrolyzed the polymer matrix, leaving only the biomimetic HAp phase.
  • the new support of the invention can be molded in the desired size and geometry, depending on the application to which it is intended; It is biocompatible, osteoinductive, osteoconductive, and preferably biodegradable and bioabsorbable. Due to its high specific surface area, and its morphology, bioactivity is also very high which constitutes an important advantage, for example, in the field of bone regeneration. The high specific surface is also associated with a high reactivity of the support, and the processes of dissolution / precipitation of minerals that constitute the biomimetic HAp are favored and accelerated. In addition, these phenomena are linked to the precipitation of organic substances of importance for the differentiation of osteogenic cells, such as various proteins and cytokines. Morphology is especially advantageous since in addition to the high specific surface area due to microporosity, the presence and size of macropores allows the entry of cells, and vascularization of tissues.
  • the invention provides a method for obtaining a support according to the invention comprising the steps of:
  • a solution of a polymer is prepared in a concentration generally comprised between 10% to 40% by weight of polymer with respect to the total weight of the solution. Said percentage by weight varies according to the type of polymer and solvent used.
  • the solvent may in principle be any suitable organic solvent capable of dissolving the polymer such as dimethyl sulfoxide (DMSO), methylene chloride, ethyl acetate, chloroform, n-heptane, n-hexane, n-pentane, dioxane, benzene, xylene, acetone, naphthalene and mixtures thereof.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • methylene chloride ethyl acetate
  • chloroform n-heptane
  • n-hexane n-pentane
  • dioxane dioxane
  • benzene xylene
  • acetone naphthalene and mixtures thereof.
  • the porogen material can be monosaccharides or polysaccharides such as glucose, sugar, organic salts, inorganic salts, acrylic microspheres, microfibers Polymers in the right proportion and size according to the macroporosity that you want to obtain. Typically said ratio is between 40/60 to 70/30 by weight of porogen particles with respect to the weight of solution.
  • the size of the diameter of the porogen particles is generally between 50 and 1000 microns, preferably between 100 and 300 ⁇ m.
  • the reinforcing particles are first added to the polymer solution, which is homogenized with ultrasound before mixing with the porogen particles; this prevents them from agglomerating or accumulating in certain parts of the support of the invention.
  • the homogeneous mixture consisting of a polymer in a first solvent, the reinforcing particles and the porogen particles is introduced into a mold, with the shape and dimensions of the support piece to be obtained.
  • various cutting tools can be used after obtaining them to obtain the desired geometry.
  • an intervertebral fusion strip generated according to the method of the invention is shown in Figure 6.
  • the mold has to withstand the organic solvent and sudden temperature changes during the procedure, so it has to be chemically and thermally stable.
  • a resin, polytetrafluoroethylene (PTFE) Teflon or metal mold is used.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the mold is closed, and the homogeneous mixture in the closed mold is subjected to the next step.
  • step (iii) the homogeneous mixture is frozen so that it stabilizes, until a piece is obtained solidified
  • Freezing can be done in a conventional manner for example by immersing the closed mold with the mixture in a container with liquid nitrogen or simply by introducing it into a device at a temperature below the solidification of the first solvent used.
  • the freezing temperature varies depending on the nature of the first solvent used with the polymer.
  • the solidified part is then rapidly demoulded to subsequently extract the first solvent with a second cold solvent.
  • step (iv) the first solvent is extracted from the cold solidified piece by immersing it in a second solvent that is at a temperature, which in a particular embodiment is -20 ° C.
  • the extraction takes place by cold diffusion, so that the temperature of the first solvent does not exceed that of its melting point and it passes directly from the crystallized state, to be dissolved in said second solvent.
  • This second solvent may in principle be any organic, inorganic solvent and its conventional mixtures. The selection thereof can easily be carried out by the person skilled in the art, depending on the first solvent.
  • the second solvent can be renewed several times by immersing the piece in fresh solvent to decrease the time necessary for the first solvent to diffuse completely out of the solidified part.
  • said solvent is selected from ethanol and ethanol-water mixtures.
  • step (v) the solidified piece is brought to room temperature, and the porogen particles are extracted by immersing the piece in a third solvent capable of dissolving said porogen particles.
  • Said third solvent can be renewed to completely extract the porogen.
  • said third solvent may be, among others, ethanol, water, acetone, and mixtures thereof.
  • the polymer matrix resulting from this stage is washed and dried to obtain the support of the invention (step (vi)).
  • the method further comprises a step of surface activation treatment of the support, in which nuclei distributed by the macropore and micropore surfaces are formed. These nuclei are inducers of the subsequent crystallization of biomimetic HAp.
  • the support obtained is a bioactive support.
  • the bioactive support is introduced again in SBF and the biomimetic hydroxyapatite is allowed to crystallize for a time between a few days to two weeks The longer the crystallization time, the greater the thickness of the deposited biomimetic hydroxyapatite coating layer.
  • a biomimetic hydroxyapatite layer grows. In This sense uses a simulated body fluid with the composition of blood plasma, described by Kokubo
  • Figure 2 shows SEM micrographs of the inner surface of the coated support. This phase of biomimetic hydroxyapatite is so continuous and effective.
  • the treatment to activate the surface of the macro and micropores, to optionally carry out a subsequent crystallization of biomimetic hydroxyapatite either in vivo or in vitro comprises the following steps:
  • Step 1) introduces functional groups containing hydroxyl groups on the surface of the macro- and micropores, such as carboxyl, silanol, hydroxide of titanium, among others, and their mixtures.
  • the gas can be among others, argon, nitrogen or oxygen.
  • step 2) calcium phosphate cores are generated on the surface of the micropores and macropores of the support characterized by its high specific surface area, by alternating immersion of the support obtained in 1) in solutions containing respectively Ca 2+ or PO 4 3 " , for example calcium chloride and potassium phosphate.
  • step 3) the support obtained in 2) is immersed in a simulated body fluid (SBF) for a period typically less than 24 hours to create the hydroxyapatite inducing nuclei in order that the crystallization of biomimetic hydroxyapatite may subsequently exist once the support has been implanted.
  • SBF simulated body fluid
  • composition of the SBF buffered with hydrochloric acid and tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (modified Kokubo solution) is used:
  • the process of the invention further comprises a step of coating the inner surfaces of the macro- and micropores, of the support, or bioactive support in a simulated body fluid (SBF).
  • SBF simulated body fluid
  • the support is submerged for a period typically between 24 hours and 2 weeks.
  • a coating of hydroxyapatite of variable thickness is generated (the greater the longer the deposition time) that completely covers the surface of macro and micropores.
  • a hybrid support is thus obtained with an interpenetrated structure as described and illustrated in the invention.
  • bioactive or hybrid supports of the invention are suitable for application in tissue engineering.
  • the invention therefore provides support for its use in the generation or regeneration of tissue.
  • the invention relates to the use of the support of the invention in tissue generation or regeneration.
  • a bioactive or hybrid support is used.
  • the generation or regeneration of tissue includes bone repair or replacement, intervertebral fusion strips, implantation of bone tissue prosthesis in vivo, among others.
  • the tissue can be for example connective tissue, such as bone or cartilage.
  • Bioactive supports and hybrid supports are used in vivo or in vitro.
  • the invention thus relates to a method for generating or regenerating tissue comprising: providing a bioactive support or a hybrid support according to the present invention, and culturing cells of a selected tissue in vitro on said support, and optionally implanting the support obtained in the previous stage in a human or animal.
  • the procedure can also comprise seeding with support cells prior to their culture and implantation.
  • Differentiated cells such as osteoblasts can be used, as well as pluripotential cells such as those in the bone marrow in conjunction with chemical signals such as the GMPl bone growth factor.
  • the present invention relates to a method of treatment for the generation or regeneration of a tissue in a subject comprising implanting a bioactive support or a hybrid support in said subject in need thereof, where subject is an animal including the human being.
  • the support may have been treated prior to its implantation by in vitro cultivating the support with the cells of interest, and / or sowing it with said cells.
  • PCL polycaprolactone
  • the support was immersed in a 1 molar solution of soda for one day. To ensure that the soda penetrate well in all micropores of the support, the construct to 'successive cycles of depressurization and pressurization is subjected until no more bubbles out of the support. It was left one day at room temperature and washed with distilled water.
  • the structure was immediately immersed for 10 seconds in calcium chloride of 0.05mol concentration. L “1 , and rinsed with distilled water. It was then immersed for ten seconds in potassium phosphate 0, O ⁇ ithiol L. " 1 , and rinsed with distilled water. This cycle was repeated five times.
  • the structure was then placed in a glass jar with simulated body fluid (Simulated Body Fluid or SBF; composition and concentrations indicated above in the description of the invention). The hydroxyapatite was allowed to crystallize for two hours. It was then washed with distilled water and dried.
  • SBF Simulated Body Fluid
  • the activated support that constitutes the basis for manufacturing any type of hybrid scaffold was obtained.
  • the geometry of the material obtained depends on the mold selected.
  • the surface activation procedure was applied to the different samples made of supports, and to simulate the situation of the scaffold once implanted, biomimetic hydroxyapatite was allowed to crystallize for two weeks, changing the SBF a week to replace the loss of species ionic in the middle due to deposition.

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Abstract

La presente invención describe un soporte tridimensional que consiste en una matriz polimérica y partículas de tamaño nanométrico o micrométrico de un material inorgánico dispersas y homogéneamente distribuidas en dicha matriz. El soporte comprende una red continua de macroporos y microporos interconectados, y puede comprender además una fase de hidroxiapatita biomimética continua. El soporte es útil en aplicaciones de ingeniería tisular. La presente invención describe asimismo un procedimiento para la obtención del soporte, y su empleo.

Description

SOPORTES MACROPOROSOS TRIDIMENSIONALES PARA INGENIERÍA
TISULAR
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuadra dentro del campo de la ingeniería tisular, y más particularmente se refiere a un soporte macroporoso tridimensional, que puede ser biodegradable y reabsorbible y que comprende una matriz polimerica orgánica reforzada con partículas inorgánicas dispersas en ella, y, opcionalmente, un recubrimiento de hidroxiapatita biomimética. La invención se refiere asimismo a un procedimiento para la obtención de dicho soporte, asi como al empleo del mismo en aplicaciones de ingeniería tisular.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La pérdida masiva de tejido óseo debido a distintas causas como pueden ser accidentes, enfermedades graves como el cáncer etc.. necesita a menudo de un implante o sustituto óseo para su recuperación. El implante de sustituto óseo más utilizado actualmente es el auto-injerto. Esta técnica sin embargo conlleva problemas como padecimiento de dolor por parte del paciente, posible necrosis en la zona de extracción del hueso y limitación en la cantidad de material óseo que es posible obtener. El uso de aloinjertos (tejido óseo de cadáver) tiene graves inconvenientes como la trasmisión de enfermedades o rechazo inmunológico [Truumees E, Herkowitz HN. Alternatives to autologous bone Harvest in spine surgery. In: UPOJ volume 12 spring. 1999. p. 77-88. Conrad EU, Gretch DR, Obermeyer KR, et al; Transmission of the hepatitis-C virus by tissue transplantation. J Bone Joint Surg Am 1995; 77-A: 214-24. Friedlaender GE, Strong DM, Tomford W, Mankin HJ. Longterm follow-up of patients with osteochondral allografts. A correlation between immunologic responses and clinical outcome.Orthop Clin North Am
1999;30:583-8.]
Frente a este tipo de estrategias cada vez cobra más importancia la ingeniería tisular que se define como la aplicación de los principios y los métodos de la ingeniería y las ciencias de la vida hacia el conocimiento fundamental de las relaciones entre estructura y funciones en tejidos de mamíferos, normales y patológicos; y el desarrollo de sustitutos biológicos para recuperar, mantener o mejorar la funcionalidad de los tejidos [Williams D., Materials Today (2004) 7, 24].
Las estrategias que se siguen en la ingeniería de tejidos y órganos se centran habitualmente en alguno de los tres enfoques principales siguientes: terapias basadas en células [Ma P. X., Materials Today (2004) 7, 30, Rodriguez H., et al, Tissue Engineered Medical Products (Temps) . ASM International, STP 1452, PA, 2004, pag. 84], terapias basadas en soportes [Langer R., Vacanti J. P., Science (1993) 260, 920; Williams D., Materials Today (2004) 7, 24], y terapias basadas en moléculas . bioactivas [Bloch J., Fine E. G., Bouche N., Zurn A. D., Aebischer P, Experimental Neurology (2001) 172, 425; King G. N. et al, Journal of Dental Research (1997) 76, 1460]. La aplicación del concepto de ingeniería tisular a la regeneración ósea ha permitido el desarrollo de distintos tipos de soportes macroporosos tridimensionales, conocidos y denominados también, de ahora en adelante, como λΛscaffolds", que deben servir de soporte para el crecimiento del hueso (osteoconducción) e inducir la diferenciación de las células osteogénicas hacia osteoblastos y osteoclastos (osteoinducción) .
Varios materiales han demostrado ser osteoconductores (fosfatos calcicos, vidrios bioactivos, cerámicas...) . Este tipo de materiales permite un enlace directo al hueso por la similitud quimica con los componentes minerales de éste. Sin embargo no tienen buenas propiedades mecánicas, son frágiles y quebradizos, lo que compromete la viabilidad del implante y mucho más si el material debe ser poroso. Los materiales de este tipo disponibles en la actualidad, no ofrecen además una porosidad adecuada (ni en proporción ni en tamaño) . Además la alta rigidez de las cerámicas macizas o poco porosas puede traer consigo la aparición del fenómeno de protección de cargas lo que es nefasto para el implante y su entorno.
Por otra parte se han desarrollado materiales poliméricos con propiedades mecánicas más próximas al tejido óseo que se quiere restituir, λλscaffolds", de estructura y morfología similar al hueso que se quiere hacer proliferar. Aunque existe una gama de polímeros bioreabsorbibles, biocompatibles y de aplicación en contacto con el tejido óseo, estos materiales no son capaces de establecer enlaces químicos directos con el hueso. Este tipo de planteamiento está descrito en la
•patente US2003008395, pero el "scaffold" de PLGA divulgado, aunque tenga una estructura porosa abierta, no tiene características osteoinductoras .
Por las razones previamente expuestas, en este campo últimamente la atención se dirige a los materiales compuestos de una matriz polimérica y cargas inorgánicas en distintas proporciones. Se puede tratar de partículas cerámicas bioactivas en proporción media o elevada (en implantes porosos hasta un 60%) en una matriz polimérica como muestra la patente WO9846164, o bien de una gran cantidad de partículas con una mínima proporción de material orgánico como agente ligante (binder) tal como muestra la patente US4192021. Otras patentes que proponen diversos materiales compuestos son US5017627 que divulga un material poliolefinico no biodegradable con partículas inorgánicas; US5552454 que divulga ceras y resinas poliméricas con cerámicas biocompatibles . Las patentes mencionadas consideran el uso de los materiales mencionados para la obtención de soportes macroporosos, pero no describen técnicas de síntesis de los mismos, ni como conseguir obtener las morfologías en el soporte que se necesitan para la regeneración efectiva del hueso (porosidad, tamaño de poro, superficie efectiva etc..) .
La mayoría de las cargas inorgánicas utilizadas en los materiales descritos, como cerámicas, fosfatos calcicos etc., tienen aún en forma nanométrica, una bioactividad limitada. Un nuevo enfoque biomimético ha visto la luz, inspirado por los trabajos de P. Ma, Kokubo et al [Kokubo T, Kushitani H, Sakka S, Kitsugi T, Yamamuro T. Solution able to reproduce in vivo surface-structure change in bioactive glass-ceramic A-W. J Biomed Mater Res 1990; 24: 723-34; Oyane A, Kawashita M, Nakanishi K, Kokubo T, Minoda M, Miyamoto T, Nakamura T. Bonelike apatite formation on ethylene-vinyl alcohol copolymer modi . ed with silane coupling agent and calcium silicate solutions. Biomaterials 2003;24: 1729-35; Oyane A, Kawashita M, Kokubo T, Minoda M, Miyamoto T, Nakamura T. Bonelike apatite formation on ethylene-vinyl alcohol copolymer modified with a silane coupling agent and titania solution. J. Ceram. Soc. Japan 2002; 110 : 248-54. Kawashita M, Nakao M, Minoda M, Kim HM, Beppu T, Miyamoto T, Kokubo T, Nakamura T. Apatite- forming ability of carboxyl group-containing polymer gels in a simulated body fluid. Biomaterials 2003; 24 : 2477-84] . Se trata de hacer precipitar sobre los soportes macroporosos desarrollados los minerales desde un fluido corporal simulado (SBF) , tal como ocurre en el cuerpo humano sobre distintos tejidos. Se ha desarrollado una técnica de recubrimiento de los soportes con hidroxiapatita biomimética que vale en todos los materiales que tengan grupos funcionales de tipo hidroxilo tales como los carboxilos, silanoles, TiOH, etc. Los resultados publicados (Preparation of bonelike apatite composite for tissue engineering scaffold; Hirotaka Maedaa, Toshihiro Kasuga, Masayuki Nogamia, Minoru Ueda, Science and Technology of Advanced Materials 6 (2005) 48-53) permiten intuir que las propiedades biológicas de la hidroxiapatita asi obtenida son significativamente mejores que las de los fosfatos calcicos o apatitas sintéticas tradicionales. Las causas que explican estos mejores resultados son variadas. Entre otras el pequeño tamaño de los cristales, que favorece la redisolución de los mismos en el organismo. Se trata éste de un fenómeno que no se observa con las apatitas sintéticas sinterizadas a altas temperaturas, que son altamente estables y no se descomponen. Otra causa es que la composición química de este tipo de apatita es mucho más similar a la del hueso natural.
Se conocen en el estado de la técnica diversas solicitudes de patentes, que describen la preparación de
"scaffolds" con características muy diversas que se obtienen mediante el uso de variados procesos de fabricación y materiales para la regeneración ósea.
La solicitud US2003082808 divulga un soporte macroporoso polimérico con una red de macroporos interconectados que presentan un diámetro comprendido entre
0,5~3,5mm, preferentemente entre l-2mm. Este soporte se prepara mediante un procedimiento que comprende la combinación de las técnicas de disolución selectiva e inversión de fase, que proporciona control sobre la morfología del soporte formado; tiene utilidad en el campo de la ingeniería tisular, particularmente como soporte para crecimiento de células in vitro e in vivo. La superficie del soporte puede ser modificada por ejemplo por deposición de partículas de fosfato calcico resorbibles por osteoclastos . Sin embargo, este soporte presenta, entre otras, la desventaja de que su biocompatibilidad es limitada.
La solicitud US2004/191292 divulga un material compuesto, y su uso en el campo de la ingeniería biomédica, donde el material compuesto comprende microparticulas bioactivas que podrían inducir al tejido óseo humano a regenerarse. El soporte usa la combinación de microparticulas de sílice, calcio, fósforo como sustancias bioactivas que podrían inducir activamente la proliferación y diferenciación de los osteoblastos humanos, promoviendo la formación y la calcificación del hueso nuevo. El soporte comprende una estructura tridimensional y una forma externa anatómica de acuerdo con los requerimientos para la regeneración de hueso y la vascularización. Sin embargo, el volumen de microparticulas incluidas tiene que ser muy elevado para que tenga lugar un efecto osteoinductivo suficiente en la superficie.
La solicitud US2005255159 describe una composición porosa que comprende un material hidroxiapatita (HAp) , obtenido a partir de una mezcla de fosfato calcico, oxido de calcio y un porógeno inorgánico que puede ser eliminado del soporte una vez formado. Éste es totalmente inorgánico, no comprende fase orgánica, por lo que su resiliencia mecánica y resistencia a la fractura son limitadas, más aún teniendo en cuenta las porosidades alcanzadas. Además su capacidad de ser biodegradado también es limitada.
De todo lo expuesto anteriormente, resulta evidente, que ninguno de los soportes macroporosos tridimensionales descritos en el estado de la técnica, cumple con todos los requisitos necesarios y deseables para su aplicación eficaz y satisfactoria en ingeniería tisular. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de proporcionar soportes macroporosos tridimensionales alternativos, que superen al menos parte de las desventajas de los soportes del estado de la técnica.
En este sentido los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente un nuevo soporte tridimensional que presenta unas propiedades especialmente adecuadas para su uso en aplicaciones de ingeniería tisular. El soporte presenta una morfología, caracterizada por la co-existencia de macropororos y microporos continuamente interconectados entre si como se representa en la Figura 5 (izq) . El soporte tridimensional está formado por una matriz constituida por un polímero orgánico y en la que se encuentran homogéneamente dispersas partículas de un material de refuerzo. La superficie tanto de los macroporos como de los microporos, puede activarse mediante un procedimiento adecuado, convirtiendo el soporte tridimensional en un soporte tridimensional bioactivo. En este sentido, dicho soporte tridimensional bioactivo es capaz de generar, bien cuando se implanta λλin vivo" o bien en condiciones equivalentes "in vitro", un recubrimiento de hidroxiapatita biomimética continuo que recubre todas las superficies internas de los macroporos y de los microporos dando lugar a un soporte híbrido con una estructura interpenetrada de polímero-hidroxiapatita biomimética como se representa en la Figura 5 (der) .
El soporte tridimensional de la presente invención, que se describe en detalle a continuación, resulta especialmente apropiado para su empleo en ingeniería tisular ya que permite el crecimiento de células y su vascularización, esencial para el desarrollo de tejido funcional y tridimensional. En concreto una de las aplicaciones en la cual resulta de gran utilidad es la fabricación de tiras de fusión intervertebral.
BKESVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: microfotografías SEM de a) una matriz de policaprolactona sin recubrimiento de hidroxiapatita biomimética; y b) detalle de la estructura de los microporos de la matriz de policaprolactona. Figura 2: microfotografías SEM de a) una matriz de policaprolactona en la que se observa el recubrimiento de hidroxiapatita biomimética; b) del detalle de la estructura del recubrimiento; c) y d) detalle del crecimiento de hidroxiapatita biomimética en el interior de los microporos.
Figura 3: microfotografía SEM del recubrimiento continuo de hidroxiapatita biomimética después de pirolizar la matriz polimérica.
Figura 4: Microfotografía SEM de una matriz de policaprolactona reforzada con nanopartículas (diámetro medio 100 nm) de hidroxiapatita dispersas en la matriz polimérica.
Figura 5: Representación del soporte macroporoso antes (izq.) y después (der.) de su recubrimiento con hidroxiapatita biomimética donde (m) indican microporos y (M) macroporos; y donde (HAp-m) y (HAp-M) indican microporos y macroporos recubiertos respectivamente.
Figura 6: Tiras de fusión intervertebral de policaprolactona bioactiva obtenidas por el procedimiento de la invención.
Figura 7: muestra el resultado de un análisis de microscopía electrónica en modo EDX de una muestra recubierta de hidroxiapatita biomimética según el procedimiento descrito (soporte híbrido) : muestra los átomos constitutivos de la capa depositada de hidroxiapatita y el análisis de la composición química. Figura 8: microfotografía SEM que muestra un soporte híbrido (matriz polimérica con recubrimiento de HAp biomimética) después de su calcinación.
OBJETO DE LA INVENCIÓN En un aspecto la presente invención se refiere a un nuevo soporte tridimensional que consiste en una matriz polimérica y partículas de tamaño nanométrico o micrométrico de un material inorgánico, dispersas en dicha matriz y homogéneamente distribuidas. El soporte tiene una morfología que presenta una red de macroporos perfectamente interconectados entre sí de tamaño comprendido entre 50 y 1000 mieras, y adicionalmente una segunda red de microporos también interconectados entre sí, y con los macroporos, de tamaño comprendido entre 1 y 10 mieras. El soporte presenta una porosidad en volumen comprendida entre un 50 y un 95%.
En una realización particular dicho soporte tridimensional, en adelante soporte de la invención, se encuentra activado como se detalla en la descripción. Dicho soporte activado se denomina de ahora en adelante soporte bioactivo.
En otra realización particular, el soporte de la invención comprende, además, una fase inorgánica que consiste en un recubrimiento de HAp biomimética, y al que la descripción en adelante denomina soporte híbrido.
Otro aspecto de la invención se refiere a un nuevo procedimiento de obtención del soporte de la invención. El procedimiento comprende las etapas de: disolución de un polímero en un primer disolvente, adición de partículas de refuerzo y su dispersión con técnicas de ultrasonidos en el medio líquido, adición de porógeno; brusca solidificación de la mezcla por enfriamiento, manteniendo la homogeneidad de la dispersión del material de refuerzo y evitando su aglomeración; extracción con un segundo disolvente adecuado del primer disolvente solidificado; disolución y retirada del porógeno.
Otro aspecto adicional de la invención, se refiere a un soporte obtenible según el procedimiento de la invención.
En otro aspecto la invención se refiere a un soporte para su uso en generación o regeneración de tejido.
Por tanto, asimismo la invención se refiere al empleo del soporte de la invención para la generación o regeneración de tejido, por ejemplo tejido conectivo, como hueso o cartílago. En otro aspecto adicional la invención se relaciona con un procedimiento para generar o regenerar tejido que comprende obtener un soporte bioactivo o un soporte híbrido según la invención, y cultivar en dicho soporte células de un tejido seleccionado. Opcionalmente el procedimiento puede comprender asimismo la siembra con células del soporte .
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objeto de la presente invención se refiere a un soporte tridimensional que consiste en una matriz polimérica y partículas de refuerzo dispersas en dicha matriz, de tamaño nanométrico o micrométrico de un material inorgánico adecuado, y homogéneamente distribuidas en la matriz (Figura 4) .
La ventaja de este soporte, que lo hace especialmente eficaz en aplicaciones tisulares, reside en la morfología del mismo ya que presenta una red de macroporos perfectamente interconectados entre sí de tamaños comprendidos entre 50 y 1000 mieras, y adicionalmente una segunda red de microporos también interconectados entre sí, y con los macroporos, de tamaño comprendido entre 1 y 10 mieras (Figura 1) . El soporte presenta una porosidad en volumen entre 50 y 95% y una elevada superficie específica. Esta morfología confiere ventajas al nuevo soporte, y permite la activación de las superficies de los microporos y macroporos, que facilita y acelera la generación de un recubrimiento de HAp biomimética como se describe más adelante. La Figura 1 muestra la doble estructura porosa de una matriz polimérica de PLC con macroporos y microporos interconectados entre sí. La imagen de microscopía electrónica de barrido SEM (Figura 1) corresponde a una fractura criogénica de una matriz de policaprolactona. Los microporos se observan claramente en la sección de fractura. También se observa claramente la perfecta interconexión entre los macroporos con gargantas de conexión de tamaños de diámetro medios superiores a los 100 μm. La morfología de la estructura tanto en lo que respecta a la fracción en volumen de macroporos, microporos, sus tamaños o el tamaño de las gargantas de conexión entre poros pueden controlarse durante el procedimiento de obtención variando la composición química y los parámetros del procedimiento.
El polímero que se utiliza en la presente invención puede ser biodegradable. La matriz polimérica puede comprender cualquier polímero convencional, preferentemente biocompatible, y reabsorbible, en particular, cuando la matriz se destina a aplicaciones fisiológicas. El término "biocompatible" se refiere en la presente invención a que no sea tóxico y a que permita a las células colonizarlo. El término "reabsorbible" en la presente invención se refiere a que el soporte desaparezca en el tiempo cuando se encuentra en el interior de un cuerpo animal a medida que es sustituido por tejido regenerado. El polímero debe seleccionarse de modo que pueda activarse superficialmente mediante la creación de núcleos de cristalización, inductores de la posterior cristalización de hidroxiapatita biomimética. Es decir, el polímero debe comprender grupos hidroxilo, tales como grupos carboxilos, silanoles, TiO2 entre otros y sus mezclas. En el contexto de la presente invención "hidroxiapatita biomimética" se refiere a la hidroxiapatita que se deposita de forma natural "in vivo" o que se deposita sumergiendo el soporte en una solución equivalente que reproduce las condiciones in vivo, de la misma composición salina que el plasma humano (Simulated Body Fluid o SBF) durante el tiempo necesario. Entre dichos polímeros y sólo con carácter ilustrativo se pueden mencionar, entre otros, policaprolactona (PCL) , ácido poliláctico (PLA) , copolímeros ácido láctico y ácido glicólico (PLGA) , copolímeros de ácido láctico y etilenglicol (PLLA-co-PEG) , copolímeros de Usina ácido láctico, (PPF), copolímeros de etilenglicol y ácido fumárico, polipropilenfumarato, así como sus mezclas. En una realización preferente la matriz polimérica comprende un polímero aprobado para su uso clínico, como por ejemplo policaprolactona (PCL) .
La matriz polimérica comprende partículas de un material inorgánico adecuado o material de refuerzo, que pueden ser entre otros, hidroxiapatita, fluorohidroxiapatita, disiliciuro de calcio, fosfato calcico, y sus mezclas. En general el tamaño de dichas partículas está comprendido entre 50-300nm. En una realización preferente las partículas presentan un tamaño inferior a lOOnm de modo que su efecto como refuerzo mecánico del soporte y su biodegradabilidad son mayores.
Algunas nanopartículas pueden observarse en la superficie de la matriz polimérica antes de su recubrimiento con HAp
(Figura 4) . Las características del soporte tridimensional de la invención, varían en función de su composición química; presentan porosidades comprendidas entre 50-95%, preferiblemente iguales o superiores al 70%; módulos elásticos entre 0,1MPa y 100MPa, y velocidades de degradación in vitro comprendidas entre 4 y 12 meses. Las características del soporte de la invención pueden variarse de forma sencilla por un experto en la materia dentro de los intervalos descritos para adaptarse a las necesidades requeridas por la aplicación concreta. En una realización particular el soporte de la invención es un soporte bioactivo. El soporte bioactivo se obtiene como se explica más abajo en la descripción, y se refiere a un soporte según la invención en el que las superficies de microporos y macroporos presentan núcleos de cristalización, inductores de la cristalización de hidroxiapatita, preferiblemente HAp biomimética.
En el contexto de la presente invención el término "bioactivo" referido al soporte, se refiere a la capacidad del soporte de inducir la proliferación y diferenciación de osteoblastos, de inducir la formación y calcificación de hueso nuevo, y a la capacidad de restituir la función fisiológica a nivel molecular y celular. Esta capacidad bioactiva se puede demostrar si el soporte se implanta in vivo, o alternativamente como en la presente invención, aplicando el método convencional aceptado en este campo de la técnica, que consiste en sumergir el soporte bioactivo en una solución de fluido corporal simulado, que simula el plasma sanguineo y observar como tiene lugar el crecimiento de un recubrimiento de HAp biomimética.
En otra realización particular el soporte de la invención es un soporte híbrido, constituido por el soporte tridimensional anteriormente descrito, y un recubrimiento continuo y homogéneo de hidroxiapatita biomimética en la superficie de los macroporos y microporos. La adherencia a la matriz polimérica de la hidroxiapatita biomimética es muy elevada y consigue conferir al soporte buenas propiedades mecánicas y propiedades de osteointegración y osteoinducción. La estructura del soporte híbrido, se observa en las Figuras 2a y 2b en las que se muestra claramente que la matriz polimérica, y la fase de hidroxiapatita biomimética se entremezclan a nivel microscópico y de manera altamente interpenetrada. Tanto la matriz polimérica como la hidroxiapatita constituyen fases continuas. Esta continuidad, se pone de manifiesto en la Figura 3 que muestra una microfotografia SEM de un soporte hibrido después de haber pirolizado la matriz polimérica, quedando sólo la fase de HAp biomimética.
El nuevo soporte de la invención puede moldearse en el tamaño y geometria deseado, dependiendo de la aplicación a la que se destine; es biocompatible, osteoinductor , osteoconductor, y preferiblemente es biodegradable y biorreabsorbible. Debido a su elevada superficie especifica, y su morfología, la bioactividad es también muy elevada lo cual constituye una ventaja importante, por ejemplo, en el campo de la regeneración ósea. La alta superficie especifica está asociada además con una alta reactividad del soporte, y los procesos de disolución/precipitación de minerales que constituyen la HAp biomimética se ven favorecidos y acelerados. Además estos fenómenos están ligados con la precipitación de sustancias orgánicas de importancia para la diferenciación de células osteogénicas, tales como diversas proteínas y citokinas . La morfología es especialmente ventajosa ya que además de la elevada superficie especifica debida a la microporosidad, la presencia y el tamaño de macroporos permite la entrada de células, y la vascularización de tejidos.
En otro aspecto la invención proporciona un procedimiento para obtener un soporte según la invención que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto en un molde una disolución de un polímero en un primer disolvente y partículas de tamaño nanométrico o micrométrico de un material inorgánico y agitar la mezcla por ultrasonidos;
(ii) añadir partículas de porógeno de un tamaño comprendido entre 50 y lOOOμm y homogenizar la mezcla resultante;
(iii) congelar la mezcla homogénea hasta obtener una pieza solidificada;
(iv) extraer en frió el primer disolvente de la pieza solidificada por disolución sumergiéndola en un segundo disolvente;
(v) extraer a temperatura ambiente las partículas de porógeno sumergiendo la pieza en un tercer disolvente que disuelve dichas partículas de porógeno; (vi) obtener un soporte polimérico con partículas de refuerzo.
En las etapas (i) y (ii) se prepara una disolución de un polímero en una concentración generalmente comprendida entre 10% al 40% en peso de polímero con respecto al peso total de la disolución. Dicho porcentaje en peso varia según el tipo de polímero y de disolvente usado. El disolvente puede ser en principio cualquier disolvente orgánico adecuado capaz de disolver el polímero como por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO) , cloruro de metileno, acetato de etilo, cloroformo, n-heptano, n-hexano, n- pentano, dioxano, benceno, xileno, acetona, naftaleno y sus mezclas. En una realización particular el disolvente es dioxano .
El material porógeno puede ser monosacáridos o polisacáridos como glucosa, azúcar, sales orgánicas, sales inorgánicas, microesferas acrilicas, microfibras poliméricas en la proporción y el tamaño adecuado según la macroporosidad que se quiere obtener. Tipicamente dicha proporción está comprendida entre 40/60 a 70/30 en peso de particulas de porógeno con respecto al peso de disolución. El tamaño del diámetro de las particulas de porógeno generalmente está comprendido entre 50 y 1000 mieras, preferentemente entre 100 y 300 μm. Las particulas de refuerzo se añaden primero a la disolución de polímero, la cual se homogeneiza con ultrasonidos antes de mezclar con las particulas de porógeno; de este modo se evita que se aglomeren o acumulen en determinadas partes del soporte de la invención.
La mezcla homogénea constituida por un polímero en un primer disolvente, las particulas de refuerzo y las particulas de porógeno se introduce en un molde, con la forma y dimensiones de la pieza de soporte que se desee obtener. Asimismo, para formas no complejas de scaffold se pueden utilizar después de su obtención, diversas herramientas de corte para obtener la geometría deseada. Por ejemplo en la figura 6 se muestra una tira de fusión intervertebral generada según el procedimiento de la invención.
El molde tiene que soportar el disolvente orgánico y los cambios bruscos de temperatura durante el procedimiento, por lo cual tiene que ser estable química y térmicamente. Generalmente se utiliza un molde de resina, de politetrafluoroetileno (PTFE) teflón o metal. En general se cierra el molde, y la mezcla homogénea en el molde cerrado se somete a la siguiente etapa.
En la etapa (iii) la mezcla homogénea se congela de modo que se estabiliza, hasta obtener una pieza solidificada. La congelación puede hacerse de forma convencional por ejemplo mediante la inmersión del molde cerrado con la mezcla en un recipiente con nitrógeno liquido o simplemente por su introducción en un dispositivo a temperatura inferior a la solidificación del primer disolvente utilizado. La temperatura de congelación varia en función de la naturaleza del primer disolvente utilizado con el polímero. La pieza solidificada se desmoldea a continuación rápidamente para posteriormente extraer el primer disolvente con un segundo disolvente en frió.
En la etapa (iv) se extrae el primer disolvente de la pieza solidificada en frió sumergiéndola en un segundo disolvente que se encuentra a una temperatura, que en una realización particular es de -20°C. La extracción tiene lugar por difusión en frió, de modo que la temperatura del primer disolvente no exceda la de su punto de fusión y éste pase directamente del estado cristalizado, a estar disuelto en dicho segundo disolvente. Este segundo disolvente puede ser en principio cualquier disolvente orgánico, inorgánico y sus mezclas convencionales. La selección del mismo puede realizarla fácilmente el experto en la materia, en función del primer disolvente. Durante la extracción del primer disolvente, el segundo disolvente puede renovarse varias veces sumergiendo la pieza en disolvente fresco para disminuir el tiempo necesario para que el primer disolvente se difunda por completo fuera de la pieza solidificada. La extracción tiene lugar durante el tiempo necesario para permitir la difusión de todo el primer disolvente de la matriz polimérica. En una realización particular dicho disolvente se selecciona de entre etanol y mezclas de etanol-agua. Asimismo, es posible realizar una extracción del disolvente del soporte al menos de forma parcial por sublimación gracias a la aplicación de presiones lo más .cercanas al vacio posible
A continuación, en la etapa (v) , la pieza solidificada se lleva a temperatura ambiente, y las partículas de porógeno se extraen sumergiendo la pieza en un tercer disolvente capaz de disolver dichas partículas de porógeno.
Dicho tercer disolvente puede renovarse para extraer completamente el porógeno. En una realización particular dicho tercer disolvente puede ser, entre otros, etanol, agua, acetona, y sus mezclas. La matriz polimérica resultante de esta etapa se lava y seca para obtener el soporte de la invención (etapa (vi) ) .
En una realización particular del procedimiento de la invención, el procedimiento comprende además una etapa de tratamiento de activación superficial del soporte, en la que se forman núcleos distribuidos por las superficies de los macroporos y de los microporos. Dichos núcleos son inductores de la cristalización posterior de HAp biomimética. El soporte obtenido es un soporte bioactivo.
Como prueba de que la activación de la superficie del soporte tiene lugar y conduce a la formación de núcleos inductores de cristalización en SBF, se introduce el soporte bioactivo de nuevo en SBF y se deja cristalizar la hidroxiapatita biomimética un tiempo comprendido entre unos días a dos semanas. Cuanto mayor sea el tiempo de cristalización mayor será el espesor de la capa de recubrimiento de hidroxiapatita biomimética depositada. En el fluido corporal simulado (equivalente y que reproduce las condiciones in vivo en las que el soporte bioactivo se implanta) crece una capa de hidroxiapatita biomimética. En este sentido se utiliza un fluido corporal simulado con la composición del plasma sanguíneo, descrita por Kokubo
(Biomaterials 27 (2006) 2907-2915- How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity? Tadashi Kokubo__, Hiroaki Takadama) . La figura 2 muestra microfotograflas SEM de la superficie interna del soporte recubierto. Esta fase de hidroxiapatita biomimética es tan continua y eficaz
(Figura 2c y 2d) que cuando se elimina por completo la matriz polimérica mediante pirólisis, tratamiento que no afecta a la fase de hidroxiapatita biomimética, la estructura de ésta permanece inalterada y continua (Figura 3) . Esto se debe a la penetración del recubrimiento de hidroxiapatita biomimética en los microporos, lo que da continuidad a la fase de hidroxiapatita biomimética y la ancla firmemente a la matriz polimérica (Figuras 2c y 2d) .
El tratamiento para activar la superficie de los macro y microporos, para opcionalmente, llevar a cabo una cristalización posterior de hidroxiapatita biomimética bien in vivo o in vitro, comprende las siguientes etapas:
1) tratamiento del soporte por exposición a un plasma de un gas o por immersión en una disolución de hidróxido sódico.
2) inmersión el soporte obtenido en 1 alternativamente en soluciones que contienen respectivamente Ca2+ o PO4 3-"-
3) inmersión del soporte obtenido en 2) en fluido corporal simulado (SBF) .
La etapa 1) introduce en la superficie de los macro- y microporos grupos funcionales que contienen grupos hidroxilo, como el carboxilo, silanol, hidróxido de titanio, entre otros, y sus mezclas. El gas puede ser entre otros, argón, nitrógeno u oxígeno. A continuación en la etapa 2) se generan núcleos de fosfato calcico en la superficie de los microporos y macroporos del soporte caracterizado por su elevada superficie específica, mediante la inmersión alternada del soporte obtenido en 1) en soluciones conteniendo respectivamente Ca2+ o PO4 3", por ejemplo cloruro calcico y fosfato de potasio. En la etapa 3) el soporte obtenido en 2) se sumerge en un fluido corporal simulado (SBF) por un periodo típicamente inferior a 24 horas para crear los núcleos inductores de hidroxiapatita a fin de que pueda existir posteriormente la cristalización de hidroxiapatita biomimética una vez que el soporte se haya implantado.
En una realización preferente se utiliza la siguiente composición del SBF tamponada con acido clorhídrico e hidrocloruro de tris (hidroximetil) aminometano (disolución de Kokubo modificada) :
componen-te g/L
NaCl 136, 8
KCl 3
CaCl2 x 6
H2O 2 , 5
MgCl2 x 6
H2O 1 , 5
Na2SO4 x 10
H2O 0 , 5
NaHCO3 4 , 2
K2HPO4 x 3
H2O 1
En otra realización particular, el procedimiento de la invención comprende además una etapa de recubrimiento de las superficies internas de los macro- y microporos, del soporte, o del soporte bioactivo en un fluido corporal simulado (SBF) . El soporte se sumerge durante un tiempo típicamente comprendido entre 24 horas y 2 semanas. Dependiendo del tiempo se genera un recubrimiento de hidroxiapatita de espesor variable (tanto mayor cuanto más tiempo de deposición) que recubre totalmente la superficie de macro y microporos. Se obtiene asi un soporte híbrido con una estructura interpenetrada según de describe e ilustra en la invención.
Los soportes bioactivos o híbridos de la invención son adecuados para su aplicación en ingeniería tisular. En un aspecto la invención proporciona por tanto, un soporte para su uso en la generación o regeneración de tejido.
Además los inventores han observado que después de dos semanas en SBF concentrado (SBFx2), se observó una deposición mineral consecuente, que representa para todas las muestras ensayadas, tanto scaffolds de polímero puro como de polímeros reforzados con microparticulas de hidroxiapatita, un aumento de su peso de al menos 25%. Es de destacar que la alta superficie especifica de las muestras, debida a la microporosidad, permite una deposición óptima de los minerales.
Asimismo, en otro aspecto la invención se refiere al empleo del soporte de la invención en generación o regeneración de tejido. En una realización particular se emplea un soporte bioactivo o híbrido. La generación o regeneración de tejido incluye la reparación o sustitución de hueso, tiras de fusión intervertebrales, implante de prótesis en tejido óseo in vivo, entre otras. El tejido puede ser por ejemplo tejido conectivo, como hueso o cartílago. Los soportes bioactivos y los soportes híbridos se utilizan in vivo o in vitro.
En otro aspecto adicional la invención se relaciona por tanto con un procedimiento para generar o regenerar tejido que comprende: proporcionar un soporte bioactivo o un soporte híbrido según la presente invención, y cultivar in vitro en dicho soporte células de un tejido seleccionado, y opcionalmente implantar el soporte obtenido en la etapa anterior en un humano o animal.
Opcionalmente el procedimiento puede comprender además una siembra con células del soporte previo a su cultivo e implante.
Se pueden usar células diferenciadas como osteoblastos, asi como células pluripotenciales como las de la médula ósea en conjunto con señales químicas tal como el factor de crecimiento de hueso GMPl.
Asimismo la presente invención se relaciona con un método de tratamiento para la generación o regeneración de un tejido en un sujeto que comprende implantar un soporte bioactivo o un soporte híbrido en dicho sujeto en necesidad del mismo, donde sujeto es un animal incluido el ser humano. Como se ha mencionado arriba el soporte puede haber sido tratado previamente a su implantación cultivando in vitro el soporte con las células de interés, y/o sembrándolo con dichas células.
A continuación se presentan ejemplos ilustrativos de la invención que se exponen para una mejor comprensión de la invención y en ningún caso deben considerarse una limitación del alcance de la misma.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Procedimiento de obtención de un soporte reforzado bioactivo según la invención
1. Preparación del soporte (scaffold)
Se preparó una disolución al 20% en peso de policaprolactona (PCL) en dioxano. Se añadió a continuación un 10% en peso (con respeto al peso de PCL) de partículas de HAp de 100 nm de diámetro a la disolución de PCL, que se dispersaron mediante exposición a ultrasonidos durante media hora.
Posteriormente la disolución anterior se mezcló con sacarosa en proporción 5/6 en peso (disolución/azúcar) , después de haber tamizado el azúcar para obtener un tamaño de partícula de entre 200-300 mieras. La mezcla resultante se colocó en un molde de teflón que se sumergió en nitrógeno liquido durante cinco minutos. A continuación se vertió etanol frió a una temperatura de -100C en el molde y el molde se colocó en el congelador a una temperatura de - 100C. Se cambió el etanol tres veces y se dio la vuelta a la pieza para que difundiera todo el dioxano fuera de ella. Después de dos dias, se sacó la pieza del congelador, se limpió con etanol y se puso en agua para disolver el azúcar, a temperatura ambiente. Se cambió el agua tres veces, y al cabo de tres dias se sacó y se procedió al secado. 2. Preparación del soporte activado
El soporte se sumergió en una disolución 1 molar de sosa durante un dia. Para asegurar que la sosa penetrara bien en todos los microporos del soporte, se sometió la estructura- a' ciclos de despresurización y presurización sucesivos hasta que no salieron más burbujas del soporte. Se dejó un dia a temperatura ambiente y se lavó con agua destilada.
Inmediatamente la estructura se sumergió durante diez segundos en cloruro calcico de concentración 0, 05mol . L"1, y se aclaró con agua destilada. A continuación se sumergió durante diez segundos en fosfato de potasio 0, Oδitiol.L"1, y se aclaró con agua destilada. Este ciclo se repitió cinco veces. Después se colocó la estructura en un frasco de vidrio con fluido corporal simulado (Simulated Body Fluid o SBF; composición y concentraciones indicadas arriba en la descripción de la invención) . Se dejó que cristalizara la hidroxiapatita durante dos horas. Después se lavó con agua destilada y se secó.
De esta forma se obtuvo el soporte activado que constituye la base para fabricar cualquier tipo de scaffold híbrido. La geometría del material obtenido depende del molde seleccionado .
Ejemplo 2.
Procedimiento de obtención y estudio de las propiedades de un scaffold híbrido.
Se prepararon varios soportes según la invención, variando las proporciones de PCL en dioxano entre un 10 a un 20% en peso. Además se mezcló la disolución con varias proporciones de porógeno/disolución (de entre 4/5 a 5/4) Las muestras (soportes) obtenidas se analizaron para ver la influencia de los parámetros indicados en la porosidad resultante del soporte. El porógeno utilizado es polietilmetacrilato (PEMA) .
Se ha comprobado que la concentración de la disolución influencia la cantidad y morfología de los microporos, mientras la cantidad de porógeno influencia la cantidad de macroporos y la interconexión entre estos. Los valores mecánicos son muy sensibles al aumento de macroporosidad, obteniéndose muestras muy blandas si la porosidad es elevada .
En la siguiente tabla se describe las diferentes muestras de soporte que se han fabricado y la porosidad en % de volumen obtenida:
Figure imgf000027_0001
A las diferentes muestras fabricadas de soportes, se les aplicó el procedimiento de activación superficial, y para simular la situación del scaffold una vez implantado, se dejó que cristalizara hidroxiapatita biomimética durante dos semanas, cambiando el SBF a la semana para suplir la pérdida de especies iónicas en el medio debido a la deposición.
Se llevó a cabo un análisis elemental de la superficie de los scaffolds utilizando microscopía electrónica en modo EDX, en el que se analizan los rayos X emitidos por la muestra durante la desexcitación después de la colisión con los electrones primarios. Estos rayos X son característicos de los átomos constitutivos de la muestra y analizan con precisión la composición química de la capa depositada de hidroxiapatita. Los resultados obtenidos en todas las muestras con diferente composición y tiempo de inmersión en SBF muestran, como se observa en la Figura 7 impurezas como magnesio, sodio, y cloruros, que han cristalizado junto al fosfato calcico; eso es típicamente el caso en la hidroxiapatita del hueso, mientras la hidroxiapatita sintetizada en laboratorio y sinterizada suele estar pura, altamente cristalizada, lo que dificulta su reabsorción una vez implantada.
En la microfotografia SEM (Figura 8) se puede observar un scaffold de policaprolactona recubierta de hidroxiapatita biomimética, siguiendo el procedimiento de activación explicado más arriba y sumergida en SBF 3 semanas y posteriormente calcinado por calentamiento hasta una temperatura de 1000°C. Se observa que después de calcinar esta muestra el residuo mantiene su integridad física, prueba de que las dos fases están altamente interpenetradas y interconectadas.

Claims

REIVINDICACIONES
1.Un soporte tridimensional que consiste en una matriz polimérica que comprende particulas de tamaño nanométrico o micrométrico de un material inorgánico dispersas y homogéneamente distribuidas en dicha matriz polimérica.
2. Soporte según la reivindicación 1, que presenta una doble estructura porosa con una red de macroporos interconectados entre si de tamaño comprendido entre 50 y 1000 mieras con gargantas de conexión entre los macroporos de tamaños de diámetro medios superiores a 100 μm, y una segunda red de microporos interconectados entre si, y con los macroporos, de tamaño comprendido entre 1 y 10 mieras.
3. Soporte según la reivindicación 1 o 2, que presenta una porosidad en volumen comprendida entre un 50 y 95% y un módulo elástico comprendido entre 0,1MPa y 100MPa.
4. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polímero de la matriz polimérica es biocompatible .
5. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polímero comprende grupos hidroxilo.
6. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en el que el polímero se selecciona de entre policaprolactona, ácido poliláctico, copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico, copolímeros de ácido láctico y etilenglicol, copolímeros de Usina y ácido láctico, copolímeros de etilenglicol y ácido fumárico, polipropilenfumarato y sus mezclas.
7 Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el polímero es policaprolactona.
8. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que las partículas de tamaño nanométrico o micrométrico son de hidroxiapatita, fluorohidroxiapatita, disiliciuro de calcio, fosfato calcico y sus mezclas.
9. Soporte según la reivindicación 8, en el que las partículas presentan un tamaño comprendido entre 50-300nm.
10. Soporte según la reivindicación 9, en el que las partículas presentan un tamaño inferior a lOOnm
11. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende además en las superficies de los microporos y macropor.os núcleos inductores de la cristalización de hidroxiapatita.
12. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además de la matriz polimérica un recubrimiento continuo y homogéneo de hidroxiapatita biomimética en la superficie de los macroporos y microporos .
13 Un procedimiento para obtener un soporte según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende las etapas de:
(i) poner en contacto en un molde una disolución de un polímero en un primer disolvente y partículas de refuerzo de tamaño nanométrico o micrométrico de un material inorgánico y agitar la mezcla por ultrasonidos;
(ii) añadir partículas de porógeno de un tamaño comprendido entre 50 y lOOOμm y homogenizar la mezcla resultante; (iü) congelar la mezcla homogénea hasta obtener una pieza solidificada;
(iv) extraer en frió el primer disolvente de la pieza solidificada por disolución sumergiéndola en un segundo disolvente; (v) extraer a temperatura ambiente las partículas de porógeno sumergiendo la pieza en un tercer disolvente que disuelve dichas partículas de porógeno;
(vi) obtener un soporte poliinérico con partículas de refuerzo.
14 Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la disolución de un polímero presenta una concentración comprendida entre 10% al 40% en peso de polímero con respecto al peso total de la disolución.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el disolvente se selecciona de entre dimetilsulfóxido, cloruro de metileno, acetato de etilo, cloroformo, n-heptano, n- hexano, n-pentanof dioxano, benceno, xileno, acetona, naftaleno y sus mezclas.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el disolvente es dioxano.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicación 14 o 15, en el que la disolución de polímero se mezcla con las partículas de refuerzo y se homogeneiza con ultrasonidos.
18. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el material de las partículas de porógeno se selecciona de entre el grupo formado por monosacáridos, polisacáridos, sales orgánicas, sales inorgánicas, microesferas acrilicas, microfibras poliméricas y sus mezclas.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en la que las partículas de porógeno se añaden a la disolución de polímero con las partículas de refuerzo en una proporción comprendida entre 40/60 a 70/30 en peso de partículas de porógeno con respecto al peso de la disolución.
20. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que el tamaño del diámetro de las partículas de porógeno está comprendido entre 100 y 300 μm.
21. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la mezcla homogénea se congela hasta obtener una pieza solidificada .
22. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que se extrae el primer disolvente de la pieza solidificada por difusión en frío sumergiéndola en un segundo disolvente que se encuentra a una temperatura de -200C y sin que la temperatura del primer disolvente exceda la de su punto de fusión.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que el segundo disolvente se encuentra a una temperatura de -200C
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que el segundo disolvente se selecciona de entre un disolvente orgánico, un inorgánico y sus mezclas.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que el segundo disolvente se selecciona de entre etanol y mezclas de etanol y agua.
26. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que las partículas de porógeno se extraen a temperatura ambiente de la pieza solidificada sumergiendo la pieza en un tercer disolvente capaz de disolver las partículas de porógeno.
27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que el tercer disolvente se selecciona de entre etanol, agua, acetona y sus mezclas.
28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 27, que comprende además una etapa de tratamiento superficial del soporte, que forma núcleos inductores de la cristalización de hidroxiapatita biomimética distribuidos por las superficies de los macroporos y de los microporos.
29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que la etapa de tratamiento comprende las siguientes etapas:
1) tratamiento del soporte por exposición a un plasma de un gas o por immersión en una disolución de hidróxido sódico.
2) inmersión el soporte obtenido en 1) alternativamente en soluciones que contienen cada una iones Ca2+ o PO4 3".
3) inmersión del soporte obtenido en fluido corporal simulado, (SBF) .
30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que el fluido corporal simulado presenta la siguiente composición taponada con acido clorhídrico y e hidrocloruro de tris (hidroximetil) aminometano (disolución de Kokubo modificada) :
componente g/L
NaCl 136 , 8
KCl 3
CaCl2 x 6
H2O 2 , 5
MgCl2 x 6
H2O 1 , 5
Na2SO4 x 10
H2O 0 , 5
NaHCO3 4 , 2
K2HPO4 x 3
H2O 1
31. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 30, que comprende además una etapa de recubrimiento de las superficies internas de los macroporos y microporos, que comprende sumergir un soporte o un soporte bioactivo en un fluido corporal simulado para obtener un soporte híbrido.
32. Soporte obtenible según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 31.
33. Soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para su uso en la generación o regeneración de tejido.
34. Empleo del soporte según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la generación o regeneración de tejido.
35. Empleo según la reivindicación 34, en la que el tejido es conectivo.
36. Empleo según las reivindicaciones 34 o 35 donde el soporte es bioactivo o híbrido.
37. Procedimiento para generar o regenerar tejido que comprende : obtener un soporte bioactivo o un soporte híbrido, y cultivar in vitro en dicho soporte células de un tejido, y opcionalmente siembra con células del soporte previo a su cultivo.
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