WO2009092697A2

WO2009092697A2 - Verfahren und vorrichtung zur untersuchung von eigenschaften eines objekts in einem medium

Info

Publication number: WO2009092697A2
Application number: PCT/EP2009/050566
Authority: WO
Inventors: Ning Wei; Erwin Flaschel; Tim Nattkemper
Original assignee: Universität Bielefeld
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2009-01-19
Publication date: 2009-07-30
Also published as: WO2009092697A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von Eigenschaften eines Objekts in einem Medium sowie die Verwendung des Verfahrens und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Untersuchung von Eigenschaften eines Objekts in einem Medium zur Verfügung gestellt, bei dem ein Objekts im Medium beleuchtet wird und anschließend ein optisches Signal vom Objekt detektiert wird. Das optische Signal wird in eine Mehrzahl von Flächensignalen umgewandelt und danach mittels Anwendung eines mathematischen Verfahrens auf die Mehrzahl von Flächensignalen zur Berechnung einer Mehrzahl von deren Merkmale, und somit zur Erzeugung einer Mehrzahl von elektronischen Werten, welche Signal-Merkmale darstellen, verarbeitet. Abschließend werden die Signal-Merkmale des Objekts mit den gespeicherten Signal-Merkmalen einer oder mehrerer kalibrierender Proben zur Erzeugung mindestens eines Wertes, welcher der untersuchten Eigenschaft entspricht, verglichen.

Description

Titel: Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von Eigenschaften eines

Objekts in einem Medium Anmelder: Universität Bielefeld

Unser Zeichen: 90094WO

Beschreibung

Gebiet der Erfindung

[0001] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von Eigenschaften eines Objekts in einem Medium sowie die Verwendung des Verfahrens und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Hintergrund der Erfindung

[0002] In einer Vielzahl industrieller Anwendungen werden Medien unterschiedlicher Art verwendet. Einerseits kann das Medium das Endprodukt eines industriellen Prozesses sein, wie z. B. ein in der Nahrungsmittel-Industrie produzierter Saft, oder das Leitungswasser aus dem Wasserwerk. Andererseits kann es erforderlich sein, dass die Endprodukte in einem Medium produziert werden, beispielsweise werden Zellen in einem bestimmten Medium kultiviert, um ein Medikament zu produzieren, welches biologische Makromoleküle enthält. In beiden Fällen müssen die Eigenschaften der Objekte im Medium untersucht werden, damit die Qualität der Endprodukte garantiert werden kann.

[0003] In industriellen Prozessen oder in Laboren wird das Medium oft in einem Behälter oder Bioreaktor verwendet. Daraufhin ist es erforderlich, die Untersuchung des Mediums im Behälter mit einem Inline- Verfahren durchzuführen.

[0004] Eine Art von Inline-Untersuchungen wird In-Situ-Untersuchung genannt. Da- bei wird die Probe des Mediums an der ursprünglichen Stelle genommen und untersucht, wie es im Patent DE 40 32 003 Al beschrieben wird. Bei einer In-Situ-Untersuchung, wird die Probe in einer Messzone oder Messkammer untersucht. Einer der Vorteile der In-Situ- Untersuchung ist, dass die wahren Eigenschaften des Mediums am ursprünglichen Platz überprüft werden können. [0005] Dennoch haben In-Situ-Untersuchungen viele Nachteile. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn sich bei einer In-Situ-Untersuchung die Messkammer im Medium befindet. Eine Folge davon ist, dass die optischen Elemente vom Medium mit transparenten Materialien getrennt werden müssen. Diese Materialien werden normalerweise durch einen Kleber fixiert. Daraufhin muss die Stabilität des Klebers, der sich im Medium (normalerweise ist es Flüssigkeit, die hauptsächlich Wasser enthält) befindet, sehr gut sein, sonst wird das Medium ins Innere des Systems eingehen, und Verschmutzung und Schaden verursachen.

[0006] Ein anderer Nachteil ist die Schwierigkeit der Kontrolle der Geschwindigkeit des Mediums, das die Messkammer durchläuft. Muss die Belichtungszeit wegen einer nichtausreichenden Beleuchtung verlängert werden, so werden die erworbenen Bilder verschwommen. Daher ist es dann erforderlich ein Antriebssystem zu verwenden, um die Geschwindigkeit des Mediums zu kontrollieren.

[0007] Bei der Untersuchung des Mediums kann das Hinzufügen von zusätzlichen Reagenzien vorteilhaft sein, wobei es bei der In-Situ-Untersuchung schwierig ist, ein Reagenz ins Medium hinzuzufügen. Dies stellt einen anderen Nachteil der In-Situ-Untersuchung dar.

[0008] Da bei der In-Situ-Untersuchung die Messzone oder Messkammer im Medium ist, ist es zumeist schwierig, diese zu reinigen, ohne den Prozess zu unterbrechen.

[0009] In der Biotechnologie ist die Untersuchung der Eigenschaften von Zellen im Medium eines Bioreaktors von Bedeutung. Die wichtigsten Zelleigenschaften umfassen im Allgemeinen Vitalität, Lebensfähigkeit, Alterung, etc.. Es ist bekannt, dass in der Zellkultur die Zelleigenschaften mit der Wachstumsumgebung zusammen hängen. Das Zellwachstum wird durch die Zuführung von Sauerstoff, den pH- Wert, die Temperatur, Konzentration der Nahrung und Mineralien, etc. beeinflusst. Für verschiedene Zellen gibt es verschiedene günstigste Bedingungen fürs Wachstum. Diese günstigsten Bedingungen werden normalerweise im Voraus durch Versuche bestimmt, und in der Zellkultur kontrolliert, damit die Zellen immer unter den optimalen Bedingungen wachsen können. Aber auch unter optimalen Bedin- gungen ist es erforderlich, die Zelleigenschaften zu überwachen, um den aktuellen Zustand des Zellwachstums zu erfahren. Es kann durch die Untersuchung der Zellvitalität das Niveau der metabolischen Aktivitäten beurteilt werden. Zudem kann der Lebenszustand einer Zelle in „lebend", „nekrotisch" und „apoptotisch" eingestuft werden. Dadurch wird beurteilt, ob die Umgebung bzw. die Bedingungen tatsächlich als günstig oder optimal für das Zellwachstum einzustufen sind.

[0010] Zudem ist die Diagnose der Zellalterung relevant. Ein Beispiel zeigt sich in der Medizin, denn vielfältige Krankheiten gehen auf Zellalterung zurück. In der Bierindustrie hängt das Bieraroma mit der Zellalterung der verwendeten Hefen zusammen. Wenn der verwendete Zellstamm der Alterung nicht widersteht, oder die Umgebung während des Produktionsprozesses im Bioreaktor verschlechtert wird, altern die Zellen, wodurch das Bieraroma und damit letztlich die Qualität des Produktes beeinflusst wird. Es wird davon ausgegangen, dass in Biotechnologie die Bestimmung der Alterung von Zellen im Allgemeinen ein weiterer Indikator für den physiologischen Zustand der Zellen ist.

[0011] Die Untersuchung der Eigenschaften der Zellen lässt sich ungefähr in zwei Gruppen eingestuft: manuelle Verfahren und automatisierte Verfahren.

[0012] Manuelle Verfahren sind eine Art von Verfahren, welche mithilfe eines Mikroskops von einer Person durchgeführt werden. Normalerweise werden die Zellen vor der Untersuchung mit bestimmten Farbstoffen oder Kennzeichenmaterialien behandelt. Diese Materialien haben wegen unterschiedlicher Zelleigenschaften unterschiedliche Interaktionen mit den Zellen, weil Zellen mit unterschiedlichen Eigenschaften normalerweise unterschiedliche physikalische Charakteristiken (wie z. B. Permeabilität der Zellmembrane) oder metabolische Aktivitäten (wie z. B. die Fähigkeit des Umwandeins der Energie, und die Fähigkeit der Synthese des Makromoleküls), etc. haben.

[0013] Propidium Iodid ( PI ), HOHECHST und Annexin-V sind beispielsweise weit verbreitet für Untersuchung des Lebenszustands von Zellen. PI ist ein Farbstoff der Nukleinsäure. Er wird normalerweise von einem grünen Laser angeregt, und emittiert rote Fluoreszenz. PI kann die unbeschädigte Zellmembran nicht durchdringen, dennoch für Zellen, die eine Apoptose der Mittephase oder der späten Phase durchlaufen, kann PI durch die ZeIl- membrane an den Zellkern gelangen, und den Zellkern rot färben. HOECHST ist ein Farbstoff, der sich speziell an DNA binden lässt. Er kann die normale Zellmembran durchdringen, dennoch hat er keine giftige Wirkung auf die Zelle. Die Fluoreszenz-Intensität von HOECHST in einer Zelle, die eine Apoptose durchläuft, ist höher als die in der normalen Zelle. Ein kombinierter Farbstoff, der aus PI und HOECHST besteht, kann für Untersuchung des Lebenszustands der Zellen genutzt werden. Wenn die Zelle lebend ist, wird ihr Zellkern durch HOECHST ein wenig blau gefärbt. Wenn die Zelle eine Nekrose erleidet, wird ihr Zellkern von PI stark rot gefärbt. Wenn die Zelleigenschaft "apoptotisch" ist sieht der Zellkern wegen seiner Verdichtung hellblau aus. Auf diese Weise können diese drei verschiedenen Zelleigen- Schäften durch menschliche Beobachter bestimmt werden.

[0014] Ein Farbstoff, der aus Annexin- V und PI besteht, kann auch für Untersuchung dieser drei verschiedenen Eigenschaften des Lebenszustands der Zellen verwendet werden. Phosphatidylserin (PS) befindet sich normalerweise an der Innenseite der Zelle. Dennoch kann es durch apoptotische Prozesse von der Innenseite der Zelle auf die Oberfläche der Zelle gelangen. Da sich Annexin-V speziell an PS binden lässt, kann eine apoptotische oder nekro- tisceh Zelle Annexin-V positiv sein. Dennoch ist PI nur in nekrotischen Zellen positiv. Die Folge: lebende Zellen emittieren grundsäzlich keine Fluoreszenz; die Membran einer nekrotischen Zelle hat helle grüne Fluoreszenz, und der Zellkern emittiert helle rote Fluoreszenz; apoptotische Zellen haben helle grüne Fluoreszenz nur an der Membran. So können diese drei verschiedenen Zeil-Eigenschaften durch menschliche Beobachtung bestimmt werden.

[0015] Bei der Untersuchung der Zellvitalität ist es auch erforderlich, gewisse Farbstoffe im Voraus ins Medium hinzuzufügen, um die Zellen zu kennzeichnen. So kann man einen Farbstoff, der aus C12-Resazurin und SYTOX besteht (Invitrogen GmbH), benutzen. Diese Untersuchungstechnik beruht auf zwei Tatsachen: In metabolisch aktiven Zellen wird C12-Resazurin in C12-Resorufm, das rote Fluoreszenz emittiert, reduziert. Normalerweise kann der grüne Fluoreszenzfarbstoff, SYTOX, nicht durch normale Zellmembrane durchdringen. Dennoch kann er in den Innenraum der Zellen, die Apoptose der Mittephase oder der späten Phase durchlaufen, eindringen, da diese eine beschädigte Membran haben. Daher emittieren die toten Zellen bei der Untersuchung grundsätzlich grüne Fluoreszenz, dennoch emittieren die gesunden, metabolisch aktiven Zellen grundsätzlich rote Fluoreszenz, und emittieren die beschädigten Zellen geschwächte grüne bzw. rote Fluoreszenz.

[0016] Ein anderes, übliches Verfahren für die Untersuchung der Zellvitalität ist die radioaktive Kennzeichnung der Zellen. Dabei wird ein Isotop, wie z. B. 3[H]-Thymidin, in die Probe hinzugefügt. Da lebende Zellen die erforderliche Nahrung aus der Umgebung aufnehmen, werden sie unvermeidlich in der Nährlösung enthaltene, radioaktive Isotope aufnehmen. Tote Zellen besitzen diese Fähigkeit nicht und somit ist die Geschwindigkeit der Sammlung des Isotops in Zellen ein Zeichen des Niveaus des Zellmetabolismus, und dies kann für die Diagnose der Zellvitalität verwendet werden.

[0017] Heutzutage ist die Diagnose der Zellalterung hauptsächlich von der Messung des Zell-Telomers, der DNA, den Mitochondrien, etc. abhängig. Diese Methoden erfordern normalerweise die Untersuchung gewisser Eigenschaften des Makromoleküls, z. B. mit Fluoreszenz-Färbung, PCR, Elektrophorese, Hybridisierung, etc., welche dauerhaft und teuer sind.

[0018] Die oben erwähnten automatisierten Verfahren nutzen Automationstechniken, um die Färbung der Zelle, Kennzeichnung, und Untersuchung etc. zu mechanisieren. Diese Prozesse werden normalerweise von einem PC kontrolliert.

[0019] Wei et al. haben (Biotechno Io gy and Bioenineering, VoI 97, No. 6, August 15, 2007) eine Methode zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Brauereihefen vorgeschlagen, welche auf Dunkelfeld-Mikroskopie in Verbindung mit Bildverarbeitung und Support- Vektor-Maschinen (SVM) beruht. Dabei wird bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen die SVM darauf trainiert eine lebende Zelle oder eine tote Zelle zu erkennen. Die Autoren offenbaren nicht, ob die Methode auch geeignet ist, um andere Zustände einer Zelle, wie beispielsweise Nekrose oder Apoptose zu erkennen.

[0020] Weiterhin wurde von Wei et. al. ein Verfahren zur automatisierten Bestimmung der Zellviabilität unter Verwendung eines neuronalen Netzwerkes vorgeschlagen, mit dem eine Treffergenauigkeit von 90 % erzielt werden kann. (Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2005;6:6305-8). Dieses Verfahren beruht auf der Verarbeitung von mehreren zeitabhängigen Informationen. Dabei wird die Probe einer Kultur zu mehreren Zeitpunkten fotografiert, um so genannte Zeitserienbilder zu erhalten, wobei anschließend eine Hauptkomponentenanalyse (englisch: Principal Component Ananlysis, PCA) im Zeitbereich des Vektors angewendet wird, welcher aus Grauwerten derselben Pixel im Zeitverlauf besteht.

[0021] Long et al. haben 2006 (Computers in Biology and Medicine 36, 339 - 362) ein automatisches Verfahren zur Detektion ungefärbter lebender Zellen unter Verwendung einer SVM offenbart. Dabei wird eine sich wiederholende Trainingsprozedur angewendet, durch welche die repräsentativsten Proben für die Festlegung von Erkennungskriterien ausgewählt ό werden. Diese Methode verwendet jedoch die Rohdaten der Zellbilder zur Klassifizierung, was sich in einer geringeren Genauigkeit bei der Bestimmung von Merkmalen niederschlägt.

[0022] In 2007 wurde von Wei et al. (2007 European Biosperpectives, 25th DECHE- MA annual Convention of biotechnologies, 30 May - 1 June 2007, Köln, Deutschland) eine vergleichende Untersuchung hinsichtlich Zuverlässigkeit automatisierter Erkennungssysteme veröffentlich, welche eine SVM verwenden. Dabei wurden für das Training der SVM verschieden Testverfahren verwendet. Neben Rohbilddaten wurden auch vollständige und ein reduzierter Satz an bestimmten Merkmalseigenschaften verwendet. Den Autoren war es mög- lieh zu zeigen, dass eine gezielte Auswahl von Merkmalseigenschaften geeignet ist, um die Trefferquote zu erhöhen und die Abweichung der Treffer zu verringern. Im Ergebnis ist jedoch nur die Bestimmung möglich, ob eine Zelle lebt, oder tot ist, insbesondere in Mischungen von lebenden und toten Zellen. Es ist nicht möglich mehrere unterschiedliche Zustände einer Zelle zu bestimmen, wie beispielsweise, ob eine Zelle apoptotisch ist, oder wie vital eine Zelle noch ist.

[0023] Die beiden Arten von Verfahren (manuelle Verfahren und automatisierte Verfahren) können die Untersuchung der Zeil-Eigenschaften zumeist nur dadurch erfüllen, dass Farbstoffe oder Kennzeichenmaterien hinzugefügt werden. Es gibt folgende Probleme beim Einsatz dieser Verfahren: Da die Farbstoffe oder Kennzeichenmaterien verbraucht werden, müssen diese nachgeführt werden wodurch sich der Aufwand erhöht. Außerdem beansprucht der Prozess der Färbung oder Kennzeichnung normalerweise eine lange Zeit (über fünf Minuten), um eine völlige Interaktion zwischen den Zellen und dem Farbstoff oder Kennzeichenmaterial zu ermöglichen.

Kurze Beschreibung der Erfindung

[0024] Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein präzises, einfaches, und preisgünstigen Inline- Verfahrens zur Untersuchung von Eigenschaften der Objekte in einem Medium zur Verfügung zu stellen, welches ohne Verwendung von Farbstoffen oder anderen Ma- terialien durchgeführt werden kann und zuverlässige Ergebnisse hinsichtlich der Detektion von definierten Eigenschaften der untersuchten Objekte liefert.

[0025] Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Untersuchung von Eigenschaften eines Objekts in einem Medium vorgesehen, welches die folgenden Schritte umfasst: Beleuchtung des Objekts im Medium; Detektion eines optischen Signals vom Objekt;

Umwandlung des optischen Signals in eine Mehrzahl von Flächensignalen; Anwendung eines mathematischen Verfahrens auf die Mehrzahl von Flächensignalen zur Berechnung einer Mehrzahl von deren Merkmale, und somit zur Erzeugung einer Mehrzahl von elektronischen Werten, welche Signal-Merkmale darstellen;.

Vergleichen der Signal-Merkmale des Objekts mit den gespeicherten Signal- Merkmalen einer oder mehrerer kalibrierender Proben zur Erzeugung mindestens eines Wertes, welcher der untersuchten Eigenschaft entspricht.

[0026] Weiterhin umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Erstellung der gespeicherten Signal-Merkmale aus einer oder mehreren kalibrierenden Proben. Weiter ist ein Auswählen einer Teilmenge von einer Mehrzahl von elektronischen Werten der kalibrierenden Proben vorgesehen. Bevorzugt wird eines der nachfolgenden mathematischen Verfahren auf die Mehrzahl von Flächensignalen angewandt: Fourier-Transformation, Wavelet- Transformation, Hauptkomponentenanlalyse, Garbor-Filter. In einer Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ein mathematisches Verfahren auf die Mehrzahl von elektronischen Werten zur Erzeugung eines räumlichen Spektrums, und das mathematische Verfahren ist eines der folgenden: Fourier-Transformation, Wavelet-Transformation. Weiterhin ist das Ver- gleichen der Signal-Merkmale des Objekts im Medium mit den gespeicherten Signal- Merkmalen mittels eines Klassifizierers vorgesehen. Bevorzugt wird Klassifizierer benutzt, die auf einem der nachfolgenden Verfahren basiert: Support- Vector-Maschine, Gaussian- Mix-Modell (Gaussian-Mix-Model), Nähreste-Nachbarn (Nearest Neighbor).

[0027] Eine erfmdungsgemäße Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst ein Unterscheiden des Objekts in dem Medium vom Hintergrund.

[0028] Für das erfmdungsgemäße Verfahren ist auf Zelle oder einen Mikroorganismus als Objekte anwendbar, wobei es sich bei einer Zelle um eine Tierzelle, eine Pflanzzelle, eine Zelle tumorgenetischen Ursprungs oder eine Zelle eines Mikroorganismus handeln kann.

[0029] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Eigenschaften des Objekts bestimmt werden, wobei das Objekt apoptotisch, nekrotisch, gealtert, tot, lebendig, oder mit unterschiedlichem Niveau der metabolischen Aktivitäten sein kann. Vorzugsweise erfolgt die De- tektion durch Hellfeld-, Dunkelfeld-, Fluoreszenz-, Phasenkontraste- oder Differenz- Intererferenz-Mikroskopie.

[0030] Die Erfindung betrifft weiter eine Vorrichtung zur Untersuchung mindestens eines Objekts mit: einer Lichtquelle zur Beleuchtung des Objekts; einem Detektor zum Erwerb des optischen Signals von dem Objekt und zur Erzeugung einer Mehrzahl von Flächensignalen; einer Signalanalyseeinheit zur Anwendung eines mathematischen Verfahrens auf die Mehrzahl von Flächensignalen, und dadurch zur Erzeugung einer Mehrzahl von elektronischen Werten, welche Signal-Merkmale darstellen, und einem Vergleicher zum Vergleichen der Signal-Merkmale eines Objekts mit den gespeicherten Signal-Merkmalen einer oder mehrerer kalibrierender Proben zur Erzeugung mindestens eines Wertes, welcher der untersuchten Eigenschaften entspricht.

[0031] In einer Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist die Vorrichtung zusätzlich eine Messkammer auf, die vorzugsweise ein flüssiges Medium enthält bzw. wobei sich die zu untersuchenden Objekte in einem flüssigen Medium befinden. Bevorzugt kann es sich bei dem flüssigen Medium um ein Wachstumsmedium für Zellen handeln.

[0032] Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Überwachung biologischer Prozesse in Bioreaktoren, zur Bestimmung des Zellwachstums in Fermentationsprozessen, zur Überprüfung von Zelleigenschaften in entnommenen biologischen Proben, Blutproben, isoliertem Blutplasma oder -serum, zur Über- prüfung oder Überwachung eines Therapieverlaufes, insbesondere bei Tumortherapien, zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen, Reagenzien oder biologischen Makromolekülen auf die Lebens- und Entwicklungsfähigkeit von Zellen bei der Entwicklung und Herstellung von pharmazeutischen Mitteln, zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksamen Substanzen, Reagenzien oder biologischen Makromolekülen.

[0033] Weiterhin ist eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens im Brauereiwesen zur Überwachung von Gärungsprozessen vorgesehen. [0034] Ein Unterschied des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem Stand der Technik ist, dass räumliche Signale, insbesondere Flächensignale verarbeitet werden, und nicht zeitabhängige Signal oder Bilder, wie dies beispielsweise im Stand der Technik bei der von Wei et al. (Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2005;6:6305-8) beschriebenen Methode der Fall ist. Bei der Verwendung von zeitabhängigen Bildern kann zwar eine Beurteilung von Zellen in Kulturen mit ausschließlich lebenden oder toten Zellen erfolgen, jedoch ist es nicht möglich dieses Verfahren erfolgreich auf Kulturen anzuwenden, die sich beispielsweise in eine Wachstumsphase befinden, wodurch eine Vielzahl unterschiedlicher Lebenszustände in einer Probe vorliegen.

[0035] Es hat sich weiterhin in Experimenten gezeigt, dass die Anwendung von mathematischen Verfahren, wie beispielsweise PCA, auf Flächensignale zum Erhalt von deutlich besser verwertbaren Merkmalen zur Auswertung einer Probe führt, als bei der Auswertung von zeitabhängigen Signalen.

[0036] Bezüglich der 2007 auf der European Biosperpectives veröffentlichten Untersuchung von Wei et. al. ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung deutlich vereinfacht worden. So enthält ein Testmodul nicht drei Untermodule (ohne Merkmalsverarbeitung; Merkmalsverarbeitung; Merkmalsverarbeitung und Auswahl) in Zusammenhang mit einem komplizierten Selektionsabgleich, sondern lediglich das Untermodul Merkmalsverarbeitung, wobei der Se- lektionsabgleich ebenfalls nicht durchgeführt wird.

[0037] Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet im Vergleich zum Verfahren von Long et al. (Computers in Biology and Medicine 36, 339 - 362) verschieden mathemati- sehe Merkmale eines Zellbildes und klassifiziert diese. Dies ist ein Unterschied zur Klassifizierung der Rohdaten eines Zellbildes, wodurch nicht die Genauigkeit bei der Bestimmung von Zelleigenschaften erzielt werden kann, wie es bei der Klasifizierung gemäß der vorliegenden Erfindung der Fall ist.

Beschreibung der Figuren

[0038] Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Figuren und Beispielen beschrieben, ohne auf die Ausführungsformen in den Figuren und Beispielen beschränkt zu sein: Fig. 1 Schematische Darstellung der Grundlage dieser Erfindung.

Fig. 2 Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Prinzips und der Struktur vom Beispiel 1

Fig. 3 Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Zeil-Eigenschaften im Beispiel 1

Fig. 4 Flussdiagramm des erfindungsgemäßen Prozesses des Erwerbs der Kalibrie- rungsinformation im Beispiel 1

Fig.5 Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens der Berechnung der 49 Fourier-Merkmale im Schritt 68 in von Fig. 4.

Fig. 6 Flussdiagramm der erfindungsgemäßen Untersuchung der Zelleigenschaften anhand der geladenen Kalibrierungsinformation im Beispiel 1

Fig. 7 Flussdiagramm des erfindungsgemäßen Algorithmus für die Zellerkennung im

Schritt 77 in der Figur 6.

Fig. 8 Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Prinzips und der Struktur vom Beispiel 2 unter Integration eines Reinigungssystem

Fig. 9 Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Prinzips und der Struktur vom Beispiel 3, wobei ein Reagenz hinzufügendes System integriert ist.

Fig. 10 Flussdiagramm des erfindungsgemäßen Prozesses des Erwerbs der Kalibrierungsinformation im Beispiel A2 dieser Erfindung.

Fig. 11 Flussdiagramm des erfindungsgemäßen Prozesses des Erwerbs der Kalibrierungsinformation im Beispiel A3 dieser Erfindung.

Fig. 12 Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Prinzips und der Struktur des Apparats im Beispiel A4 Fig. 13 Schematische Darstellung des erfϊndungsgemäßen Prinzips und der Struktur des Apparats, der eine Seitebeleuchtung benutzt, im Beispiel A4

Fig. 14 Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Prinzips und der Struktur des Apparats, der die evaneszente Welle zur Beleuchtung benutzt, im Beispiel A4

Fig. 15 Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Prinzips und der Struktur des Apparats, der die evaneszente Welle zur Beleuchtung und ein Mikroskop und eine Kame- ra benutzt, im Beispiel A4

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

[0039] Die erfindungsgemäße Aufgabe wird folgendermaßen gelöst: Ein Teil des Mediums im Behälter wird vom Antriebssystem in die Messkammer gebracht. Anschließend wird die Probe, die Zellen enthält, und mit keinem Farbstoff oder Kennzeichenmaterial behandelt wird, von einer Lichtquelle beleuchtet. Das optische Signal der Zellen wird an einen zweidimensionalen Apparat, der das optische Signal in ein elektronisches Signal umwandelt, gesendet. Daraufhin werden zweidimensionale, elektronische Signale bzw. zweidimensionale digitale Information erzeugt. Dieses elektronische Signal bzw. diese Information werden in den Analyser gesendet, und Bilder werden erzeugt. Der Analyser analysiert und verarbeitet die Bilder anhand der aufgezeichneten Kalibrierungsinformation. Daraufhin werden die Eigenschaften der Objekte im Medium bestimmt. Die sogenannte Kalibrierungsinformation wird vor der Untersuchung der Probe erworben, und der Prozess des Erwerbs wird so durchgeführt: Bilder der Objekte, die eine gewisse Eigenschaft haben, werden als der Trainingda- tensatz genutzt. Merkmale der Bilder, welche die korrekte Klassifikation der untersuchten Objekte, die verschiedene Eigenschaften haben, begünstigt, werden als Kalibrierungsinformation extrahiert.

[0040] Um die Verteilung von Multischichten der Objekte in der Messkammer zu vermeiden (weil dies verschwommene Bilder verursacht), wird die Höhe der Messkammer der durchschnittlichen Größe der Objekte im Medium angepasst, so wird nur eine Schicht der Objekte geformt. [0041] Im Apparat, der dieser Erfindung durchführt, enthält das Antriebssystem mindestens eine Pumpe, um die Sammlung eines Teils des Mediums und die Übertragung in die Messkammer zu begünstigen. Außerdem kann die Geschwindigkeit des Fließens des Mediums durch Einstellung der Geschwindigkeit der Pumpe kontrolliert werden. So kann es ver- wirklicht werden, dass die Geschwindigkeit des Fließens des Mediums der Intensität der Beleuchtung angepasst wird. Unter den Bedingungen, dass die Beleuchtung nicht ausreichend ist, kann man die Geschwindigkeit der Pumpe reduzieren, um deutlichere Bilder zu erlangen.

[0042] Nach einem dauerhaften Laufen können sich die Substanzen im Medium in der Messkammer absetzen und anstauen und können sogar eine Verstopfung des Systems verursachen. Um dieses Problem zu lösen wird in einem Beispiel dieser Erfindung ein Reinigungssystem integriert, das mindestens einen Reinigungsmittelbehälter und einen Müllbehälter enthält. Der Reinigungsmittelbehälter wird durch eine Leitung mit dem Antriebssystem und der Messkammer verbunden. Der Müllbehälter ist durch eine Leitung mit der Messkam- mer verbunden. Jede dieser Leitungen wird mit mindestens einem Schalter (insbesondere einem Ventil) zur Kontrolle des Fließens der Objekte ausgerüstet. Mit diesem integrierten Reinigungssystem können die Medium-Untersuchung und die Messkammer-Reinigung durch die Einstellung des Zustands des Ventils abwechseln.

[0043] In einem Beispiel dieser Erfindung, kann ein gewisses Reagenz beim Einsatz eines anderen Antriebssystems in die Messkammer hinzugefügt werden. Dieses Reagenz kann die Untersuchung der Objekte im Medium begünstigen. Beispiele für solche Reagenzien sind Antischaum-Emulsionen, Kontrast erhöhende Mittel, Farbstoffe (zum Zweck vom Vergleich) Fluorophore, etc.

[0044] In einem Beispiel dieser Erfindung, werden vom Analyser Fourier-Merkmale als Kalibrierungsinformation genutzt, die aus dem Bild des Objekts berechnet wurden und der Klassifizierer, nutzt diese Merkmale als Trainingdatensatz. Die Verarbeitung der Bilder der Probe anhand der Kalibrierungsinformation umfasst die folgenden Schritte: Erkennung der Objekte, Berechnung eines Spektrums mittels eines mathematischen Verfahrens des Bildes der Objekte, und Klassifikation. Normalerweise sind die Objekte Zellen, wie z. B., Tierzellen, Pflanzzellen, oder Zellen des Mikroorganismus. [0045] Der Apparat für Analyse des Mediums umfasst die folgenden Komponenten: einen Lichtsender, der die Probe beleuchtet, ein optisches mikroskopisches System, das Bilder erzeugt, einen Empfänger, der das Licht aus der Objekte empfängt, - und einen Analyser, in dem die Kalibrierungsinformation aufgezeichnet wird. Außerdem kann dieser die Bilder anhand der aufgezeichneten Kalibrierungsinformation analysieren und verarbeiten.

[0046] Das vom Lichtsender emittierte Licht ist eines von folgenden: Infrarotlicht, sichtba- res Licht, und Ultraviolet licht, oder die Kombination von mehreren von denen. Das optische System beruht auf einem von folgenden: Phasenkontrastmikroskop, Hellfeldmikroskop, Dunkelfeldmikroskop, Differenz-Interferenz-Mikroskop, Fluoreszenzmikroskop, und Konfokalmikroskop, oder die Kombination von mehreren von denen. Der Lichtempfänger ist eine dem IEEE-1394-Standard entsprechende CCD- oder CMOS-Kamera. Der Analyser enthält einen 1394- Adapter, einen Prozessor, Speicher, und Festplatte, in der die Kalibrierungsinformation aufgezeichnet ist. Man kann auch die Kamera und den Analyser durch eine intelligente Kamera ersetzen, welche die Fähigkeit der Wandlung optisch/elektronisch mit dem Signalanalyse- und Signalverarbeitungeinheit kombiniert. Dieser Apparat kann den Abstand zwischen dem Mikroskopobjektiv und der Probe einstellen, somit kann die Qualität der Abbildung erhöht werden.

[0047] In einem Beispiel dieser Erfindung, breitet sich das Licht durch kein optisches System, sondern direkt auf den Apparat aus, der die Wandlung von optischen Werten auf elektronischen Werten durchführt. Anschließend werden Bilder erzeugt. Auf diese Weise wird das System vereinfacht.

[0048] In einem Beispiel dieser Erfindung haben die Zellen in der zu untersuchenden Probe drei verschiedene Eigenschaften des Lebenszustands: lebend, nekrotisch, und apopto- tisch.

[0049] In einem Beispiel dieser Erfindung haben die Zellen in der zu untersuchenden Probe unterschiedliche Eigenschaften der Aktivitäten, d. h., unterschiedliches Niveau der metabolischen Aktivitäten. [0050] In einem Beispiel dieser Erfindung haben die Zellen in der zu untersuchenden Probe unterschiedliches Niveau der Alterung.

[0051 ] Die Erfindung wird jetzt anhand der Figuren näher erläutert:

[0052] In der Figur 1 wird die Grundlage dieser Erfindung schematisch dargestellt. Der Behälter 1 enthält ein Medium 2. Ein Teil des Mediums 2 wird vom Antriebssystem 4 aufgenommen, und in die Messkammer 6 übertragen. In der Messkammer 6 wird eine dünne Schicht des Medium 2 geformt. Diese dünne Schicht wird von einem Lichtsender 8 beleuch- tet. Von einem Apparat 12 für Wandlung werden die optischen Signale in elektronische Flächensignale umgewandelt, und in die Signalanalyseeinheit 14 zur automatisierten Untersuchung und Analyse gesendet. Daraufhin werden die Objekte im Medium 2 erkannt, gezählt und klassifiziert.

Beispiel 1

[0053] Figur 2 ist eine schematische Darstellung des Prinzips und der Struktur eines ersten Beispiels dieser Erfindung dargestellt. Dabei werden die Eigenschaften des Lebenszustands der Zellen im Medium 2 in einem Bioreaktor 20 untersucht. Es wurden Tierzellen, nämlich Chinese-Hamster-Ovary (CHO)- und Heia-Zellen sowie Hefe-Zellen in den Versu- chen verwendet. Ein Teil des sich im Bioreaktor 20 befindenden Mediums 2 wird von der Pumpe 29 als Probe durch die Leitung 38a aufgenommen, und in die Messkammer 6 gesendet. Die Höhe der Messkammer 6 wird der durchschnittlichen Größe der Objekte im Medium 2 angepasst. Die Messkammer 6 befindet sich vor dem Mikroskop 10. Das Medium 2 und die Objekte in dem Medium 2 werden als erzeugten Bilder vom Mikroskop 10 aufgenommen, wobei der Lichtsender 8 die Objekte beleuchtet. Die optischen Signale der erzeugten Bilder werden an die Kamera 12a gesendet. Die Kamera 12a wird mit einer Analyseeinheit verbunden. In der Analyseneinheit werden die erzeugten Bilder durch die auf maschinellem Lernen beruhende Mustererkennungstechnik verarbeitet. Daraufhin werden die Eigenschaften des Lebenszustands der Zellen, d. h., ob eine Zelle lebend, nekrotisch, oder apoptotisch ist, in der Probe bestimmt. Ähnlich kann die Probe auch Pflanzzellen, oder Zellen des Mikroorganismus enthalten. Das Untersuchungsverfahren für solche Pflanzenzellen bzw. Zellen der Mikroorganismus ist dasselbe wie für Tierzellen und Hefe-Zellen. Durch ein Bioreaktorfenster 21 ist es möglich in das Innere des Bioreaktors zu sehen. [0054] In diesem Beispiel werden die Bilder durch Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen. Wie es in der Figur 3 gezeigt wird, emittiert der Lichtsender 8 ein paralleles Licht, um das ringförmige Diaphragma 11 zu beleuchten. Das vom Lichtsender 8 emittierte Licht ist eines von folgenden: Infrarotlicht, sichtbares Licht, und Ultra violetlicht, oder eine Kombina- tion davon. Nur die Strahlen in dem in der Figur dargestellten, ringförmigen Bereich können durch das ringförmige Diaphragma 11 durchgehen. Dieser Teil der Strahlen wird vom Kondensor 9 fokussiert, und geht durch das Loch 49 am Träger 48 durch, und beleuchtet die zu untersuchende Probe 22 in der Messkammer 25. Die Probe 22 ist eine Suspension der Zellen, in der die Zellen verschiedene Eigenschaften haben: lebend, nekrotisch oder apoptotisch. Die auf die Probe 22 geworfenen Strahlen werden in zwei Teile eingeteilt: Ein Teil der Strahlen sind die aus dem ringförmigen Diaphragma 11 kommenden, ringförmigen, direkten Strahlen I Ia. Der andere Teil der Strahlen ist die von der Probe 22 abstrahlende Streustrahlung I Ib. Diese zwei Teile der Strahlen werden vom Mikroskopobjektiv 16 gesammelt, und auf die Phasenplatte 17 projiziert. Die direkten Strahlen I Ia und die Streustrahlung I Ib werden von der Phasenplatte 17 unterschiedlich moduliert. Abschließend wird eine Mehrzahl von Flächensignale, in diesem Fall ein Bild am Lichtempfang-Chiparray 18 der CCD-Kamera 19 erzeugt. Im Sinne der Erfindung kann die Kamera auch eine CMOS-Kamera sein. Der Lichtsender 8, das ringförmige Diaphragma 11, der Kondensor 9, das Mikroskopobjektiv 16, und die Phasenplatte 17 bilden zusammen ein Phasenkontrastmikroskop. Außerdem kann der Ap- parat auch eines der folgenden oder die Kombination von mehreren davon umfassen: Hellfeldmikroskop, Dunkelfeldmikroskop, Differenz-Interferenz-Mikroskop, Fluoreszenzmikroskop, und Konfokalmikroskop. Die CCD- oder CMOS-Kamera 19 entspricht in einem Beispiel dem IEEE-1394-Standard. Die CCD-Kamera 19 wandelt die optischen Signale des Bildes der Probe 22 in elektronische Signale um, und sendet diese elektronischen Signale durch ein dem IEEE-1394-Standard entsprechendes FireWire-Kabel 33 an den Analyser 30. Der Analyser 30 überträgt das Bild der Probe 22 durch einen mit dem FireWire-Kabel 33 verbundenen 1394-Adapter 32 in den Speicher 31. Der Analyser 30 lädt die in der Festplatte 37 gespeicherte Kalibrierungsinformation auch in den Speicher 31. Der Prozessor 34 verarbeitet die Daten (Kalbrierungsinformation und elektronische Signale) im Speicher 31, berechnet und analysiert das Bild der Probe 22. Daraufhin werden die Eigenschaften der Zellen in der Probe 22 bestimmt. Hier kann man auch die CCD-Kamera 19 und den Analyser 30 durch eine intelligente Kamera, welche die Fähigkeit der Wandlung mit dem Signalanalyse- und Signalverarbeitungeinheit kombiniert, ersetzen. [0055] Der Analyser 30 enthält eine Platine 36 für eine Schrittmotorkontrolle. Die Schrittmortorkontrolle kontrolliert durch ein Kontrollekabel 35 die Rotation eines Schrittmotors 40 und lässt folglich eine Gewindespindel 43 rotieren. Ein Träger 42 wird an einem Boden 46 fixiert. Eine Innenschraube des Trägers 42 entspricht der Schraube 44 der Gewinde- spindel 43. Wenn die Gewindespindel 43 durch den Schrittmotor 40 angetrieben rotiert, entsteht eine relative Bewegung zwischen dem Träger 42 und dem Schrittmotor 40 oder der Gewindespindel 43. Diese relative Bewegung bewirkt gleichzeitig, dass sich ein gleitender Block 41 und der mit dem gleitenden Block 41 fixierte Träger 48 auf- und abbewegen. Somit wird der Abstand zwischen dem Mikroskopobjektiv 16 und der Probe 22 eingestellt wird. Auf diese Weise kann die Qualität der am Lichtempfang-Chiparray 18 der CCD-Kamera 19 erzeugten Bilder maximiert werden.

[0056] In diesem Beispiel wird die vom Analyser 30 genutzte Kalibrierungsinformation durch den in der Figur 4 gezeigten Prozess erworben. Im Schritt 64 werden die Bilder der folgenden kalibrierenden Proben aufgenommen: die nur lebende Zellen enthaltende erste Probe 61, die nur nekrotische Zellen enthaltende zweite Probe 62, und die nur apoptotische Zellen enthaltende dritte Probe 63. Diese erzeugten Bilder werden als ein Trainingdatensatz genommen. In allen trainierenden Bildern ist die Eigenschaft des Lebenszustands der Zelle bekannt (d.h. lebend, nekrotisch, apoptisch). Zum Beispiel, in der erste Probe 61 ist die Eigen- schaft des Lebenszustands jeder Zelle „lebend", in der zweiten Probe 62 ist die Eigenschaften des Lebenszustands jeder Zelle „nekrotisch", und in der dritten Probe 63 ist die Eigenschaften des Lebenszustands jeder Zelle „apopto tisch". Das Verfahren für den Erwerb der ersten Probe 61, der zweiten Probe 62 und der dritten Probe 63 umfasst folgende Schritte: Die suspendierte Kultivierung der Zellen wird in dem flüssigen Medium 22 durchgeführt. Wenn die Zellen in die logarithmische Phase des Wachstums übergehen, wird Cisplatin (eine Substanz gegen Krebs) mit einer Konzentration von 2 μg / ml hinzugefügt und die Kultur wird für 16 Stunden aufbewahrt. Danach werden die erste Probe 61, die zweite Probe 62 und die dritte Probe 63 aus der Zellsuspension genommen und einem Zellsorter zugeleitet, um die lebendigen, nekrotischen und apoptotischen Zellen zu erkennen und jeweils in einen unterschiedlichen Behälter zu senden. Dabei wird ein doppelter Farbstoff, der aus Annexin- V und PI besteht, vom Zellsorter verwendet. Der Erwerb von Proben 61, 62 und 63 wurde auch dadurch realisiert, dass die Auszüge von Kulturen, die unter verschiedenen Bedingungen (wie z. B. unterschiedliche pH Werten, O₂ Konzentrationen, Temperaturen, physischen Behandlungen) aufbewahrt wor- den waren, in den Zellsorter geleitet wurden, und somit ließen sich die Zellen ähnlich wie oben in drei Gruppen teilen.

[0057] Im Schritt 68 werden 49 Fourier-Merkmale für jede Zelle in den Bildern berechnet. Diese Fourier-Merkmale werden auf der Festplatte gespeichert. Im Schritt 69 werden verschiedene Teilmengen der im Schritt 68 erworbenen 49 Fourier-Merkmale der Zellbilder genutzt, um einen SVM-Klassifϊzierer (SVM: support vector machine) mit drei Klassen zu trainieren. Daraufhin wird dieser Klassifizierer im Schritt 70 genutzt, um einen besonderen Bilddatensatz, in dem das Verhältnis jeder Klasse von Zellen (mit unterschiedlichen Eigenschaf- ten) bekannt ist, zu testen. Dieser besondere Bilddatensatz wird in der folgenden Weise erworben. Es werden die erste Probe 61, die zweite Probe 62 und die dritte Probe 63 in einem definierten Verhältnis gemischt. Anschließend wird das Gemisch der ersten Probe 61, der zweiten Probe 62 und der dritten Probe 63 durch ein normales Phasenkontrastmikroskop aufgenommen. In diesem Gemisch wird das wirkliche Verhältnis jeder Klasse von Zellen (mit den unterschiedlichen Eigenschaften der drei Proben) durch den Zellsorter bestimmt. Die gemischten Proben werden als Referenz verwendet. Im Schritt 69 führen unterschiedliche Teilmengen zu unterschiedlich genauen Ergebnissen. In Schritt 70 wird die Teilmenge als die beste Teilmenge ausgewählt, welche zur genausten Bestimmung der Eigenschaften der Zellen geführt hat, welche ja zuvor durch den Zellsorter bestimmt wurden und so bekannt waren. Es wurde beispielsweise in einem Versuch eine Teilmenge, die aus 12 Merkmalen (mit Indizies 2, 7, 8, 15, 18, 20, 23, 29, 31, 37, 43, 48) besteht, als die beste aus den 49 Merkmalen ausge- wält. Im Schritt 71 werden die in der besten Teilmenge enthaltenen Merkmals-Indices auf die Festplatte gespeichert. Gleichzeitig wird der Klassifizierer, der die beste Teilmenge als Trainingdatensatz nutzt, auch auf die Festplatte gespeichert. Die in der besten Teilmenge enthal- tenen Indexe der Merkmale und der die beste Teilmenge als Trainingdatensatz nutzende Klassifizierer dienen als die Kalibrierungsinformation dieses Beispiels.

[0058] Normalerweise wird mittels der Selektion der Merkmale die Leistung des Systems gesteigert. In gewissen Fällen wird es jedoch zu guten Ergebnissen kommen, selbst ohne die Selektion der Merkmale. In diesen Fällen können die Eigenschaften der Objekte bestimmt werden anhand des kompleten Sets der Merkmale.

[0059] Figur 5 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens der Berechnung der 49 Fourier-Merkmale im Schritt 68 in der Figur 4. Wenn die schnelle Fouriertransformation 56 für jedes der Zellbilder 55 durchgeführt wird, ergibt es ein räumliches Spektrum 51. Anschließend wird dieses räumliche Spektrum 51 in 7 Reihen und 7 Spalte geteilt. Es ergibt somit 49 Sub-Bilder. Anschließend wird die Energie für jedes dieser Sub-Bilder 57 (d. h., die Summe des Quadrats der Pixelwerte jedes Sub-Bildes) berechnet. Somit werden 49 Merkmale ergibt. Die Merkmale-Indizes 52 werden unten in der Figur 5 dargestellt.

[0060] Das Verfahren zur Untersuchung der Zeil-Eigenschaften der zu überprüfenden Probe wird in der Figur 6 gezeigt. Im Schritt 75 werden der Klassifizierer und die ausgewählten Indexe der Merkmale, die als die Kalibrierungsinformation dienen, eingelesen. Danach wird das Bild der zu prüfenden Probe im Schritt 76 auch eingelesen. Daraufhin werden die im Bild enthaltenen Zellen im Schritt 77 aus dem Hintergrund erkannt. Danach werden die Fourier- Merkmalwerte jedes Zellbildes, die den in der Kalibrierungsinformation enthaltenen Indizes entsprechen, im Schritt 78 ausgerechnet. Es wurden beispielsweise in einem Versuch 12 Merkmalen (mit Indizies 2, 7, 8, 15, 18, 20, 23, 29, 31, 37, 43, 48) des Zellbildes berechnet, somit wurde das Zellbild in 12 elektronischen Werte umgewandelt. Im Schritt 79 werden die elektronischen Werte jedes Zellbildes anschließend mit den gespeicherten elektronischen Werten der kalibrierenden Proben vergliechen, und um konkret zu sein, in diesem Beispiel wird er von dem in der Kalibrierungsinformation enthaltenen Klassifizierer in lebende, nekrotische, und apoptotische Zellen klassifiziert.

[0061] Dies liegt daran, dass eine tote Zelle entweder nekrotisch oder apoptotisch ist. Aus diesem Grund werden nekrotische und apoptotische Zellen als „tot" gekennzeichnet, und somit lassen sich die gesamten Zellen in „lebend" oder „tot" klassifizieren.

[0062] In unseren Versuchen sind auch andere mathematische Verfahren im Umwandeln des Zellbildes in eine Mehrzahl von Merkmal repräsentierenden elektronischen Werten angewendet worden. Einige davon lauten: Wavelet-Transformation, Hauptkomponentenanalyse, Gabor-Filter, etc. Die aus diesen Methoden entstandenen Treffgenauigkeiten sind vergleichbar gewesen mit den Treffgenauigkeiten aus der oben beschriebenen Fourier-Transformation.

[0063] In unseren Versuchen sind andere Typen von Klassifizierern im Vergleichen der Mehrzahl von elektronischen Werten des Zellbildes mit den gespeicherten elektronischen Werten der kalibrierenden Proben angewandet worden. Einige davon lauten: Gaussian-Mix- Modell- Klassifizierer (Gaussian-Mix-Model-Klassifϊzierer), Nähreste-Nachbarn- Klassifizierer (Nearest-Neighbor-Klassifizierer), etc. Die aus diesen Klassifizierern entstandenen Treffgenauigkeiten sind vergleichbar gewesen mit den Treffgenauigkeiten aus dem oben beschriebenen SVM-Klassifizierer.

[0064] In der Figur 7 wird das Verfahren für die Zellerkennung im Schritt 77 in der Figur 6 erläutert. Die Basis der Zellerkennung ist, dass zwei Klassen von Bildern - Zellbilder und Bilder von Nicht-Zellen - fürs Trainieren eines Klassifizierer eingesetzt werden. Anschließend wird dieser trainierte Klassifizierer genutzt, um die Zellen im Bild der zu untersuchenden Probe aus dem Hintergrund zu erkennen. Bilder von Nicht-Zellen sind dadurch definiert, dass in diesen keine Zelle abgebildet ist. In diesem Beispiel werden die Bilder von NichtZellen dadurch erworben, dass die Pixel des Hintergrundbereichs des Bildes der Probe durch ein Fenster einer definierten Größe zufällig aufgenommen werden. Im Schritt 81 wird eine Hauptkomponentenanalyse für die Zellbilder im Trainingdatensatz durchgeführt. Anschließend werden sechs Eigenvektoren, die den maximalen Eigenwerten entsprechen, im Schritt 82 berechnet. Im Schritt 83 werden die Bilder von Nicht-Zellen aus dem Trainingdatensatz eingelesen. Diese Bilder sowie die im Schritt 81 eingesetzten Zellbilder im Trainingdatensatz werden im Schritt 84 auf die sechs im Schritt 82 berechneten Eigenvektoren projiziert. Diese projizierten Vektoren werden im Schritt 85 fürs Trainieren eines SVM-Klassifizierers mit drei Klassen genutzt. So ist das Trainieren des Klassifizierers abgeschlossen. Daraufhin werden die Bilder der zu untersuchenden Probe im Schritt 86 eingelesen. Im Schritt 85 wird der trainierte Klassifizierer eingesetzt, um eine Zuversicht-Mappe im Schritt 87 zu berechnen. Es wird ein Fenster der Größe N x N um jedes Pixel eines Bildes gelegt und es werden die Pixelwerte innerhalb dieses Fensters in einen Vektor umgewandelt, und die Entfernung von diesem Vektor zur Grenze der zwei Klassen (Zellen und Nicht-Zellen) wird als Zuversichts- wert bezeichnet. Anschließend werden Pixel in der Zuversichtsmappe im Schritt 88 herausgefunden, an denen die Zuversichtswerte in einem bestimmten Umkreis maximal sind und über einem definierten Schwellenwert sind. Diese Pixel werden als die Positionen der Zellen angesehen.

Beispiel 2

[0065] Figur 8 ist eine schematische Darstellung des Prinzips und der Struktur vom Beispiel 2. Dabei wird ein Reinigungssystem integriert. Wenn ein erstes Ventil 28 geöffnet und eine zweites Ventil 26 geschlossen wird, wird einiges Reinigungsmittel von einer Pumpe 29 durch eine Leitung 38c vom Behälter 53 an die Messkammer 6 gesendet, und durch die Leitung 38b in den Müllbehälter 54 weitergeleitet. So wird die Messkammer 6 gereinigt. Andererseits, wenn das zweite Ventil 26 geöffnet und das erste Ventil 28 geschlossen wird, nimmt die Pumpe 29 kein Reinigungsmittel auf, sondern einen Teil des Mediums 2 als Probe 22 auf. Somit können die Untersuchung des Mediums 2 und die Reinigung der Messkammer 6 durch die Einstellung der Zustände des ersten Ventils 26 und des zweiten Ventils 28 abwechseln.

Beispiel 3

[0066] Figur 9 ist eine schematische Darstellung des Prinzips und der Struktur vom Beispiel 3. Dabei wird ein Reagenzien hinzufügendes System integriert. Im Vergleich zu Figur 8, wer- den eine Reagenzpumpe 29a und eine Reagenz-Patrone 32 hinzugefügt, damit einiges Reagenz in der Reagenz-Patrone 32 von der Pumpe 29a in die Messkammer 6 geleitet wird. Dort wird es mit der Probe 22 gemischt, um die Untersuchung zu begünstigen.

Beispiel A2 [0067] In Beispiel A2 wird Phasenkontrastmikroskopie für die Aufnahme der Bilder der Probe 22 eingesetzt. Es wird die beschriebene Mustererkennungstechnik genutzt, um die Vitalität der Tierzellen, d. h., das Niveau der metabolischen Aktivitäten der Tierzellen, in der Probe 22 zu untersuchen. Es wurden CHO- und Heia-Zellen in den Versuchen verwendet. Der in diesem Beispiel angewandte Apparat ist derselbe wie im Beispiel 1 (wie es in der Figur 3 ge- zeigt wird). Trotzdem wird in diesem Beispiel andere Kalibrierungsinformation als im Beispiel 1 genutzt.

[0068] In diesem Beispiel wird die vom Analyser 30 genutzte Kalibrierungsinformation durch das in der Figur 10 dargestellte Verfahren erworben. Zuerst, wird die Suspension der Tierzellen in einen geschlossenen Behälter überführt. Anschließend wird die Suspension bei einer Temperatur von 45 ⁰C in einem Wasserbad für 30 Minuten aufbewahrt. Daraufhin wird die Suspension mit C12-resazurin und SYTOX gefärbt. Anschließend wird die Suspension in den Zellsorter gestellt, um die Zellen je nach ihrer eigenen Vitalität in acht Gruppen zu teilen. Folglich ergeben sich eine Vielzahl von kalibrierenden Proben 101, ...108. Das Niveau der Vitalität wird nach der Intensität der von der Zelle emittierten, roten Fluoreszenz beurteilt. Dabei besitzt die Probe 108 die höchste Intensität der roten Fluoreszenz, während die Probe 101 die niedrigste Intensität der roten Fluoreszenz hat. Es wird ein Vitalitätswert von 100% auf die höchste Intensität der roten Fluoreszenz bezogen, und ein Vitalitätwert von -100% auf die niedrigste Intensität der roten Fluoreszenz beszogen. Es wird der jeweiligen Bereich der Vitalitätwerte der Probe 101, der Probe 102, ... und der Probe 108 in der Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1 : Bereichen der Zellvitalität- Werte der trainierenden Proben im Beispiel A2

[0069] Im Schritt 114 werden die Probe 101,... 108 durch ein normales Phasenkontrastmikroskop aufgenommen. Die erzeugten Bilder vom Phasenkontrastmikroskop werden als Trainingdatensatz eingesetzt. In allen trainierenden Bildern ist der Bereich der Vitalitätwerte jeder Zelle bekannt.

[0070] Im Schritt 118 werden die 49 Fourier-Merkmale jeder Zelle in den Bildern berechnet und auf der Festplatte gespeichert. Im Schritt 119 werden verschiedene Teilmengen der im Schritt 118 erworbenen 49 Fourier-Merkmale der Zellbilder genutzt, um einen SVM- Klassifizierer mit zwei Klassen zu trainieren. Während die Bilder der Probe 101 -104 als Trainingdatensatz für eine Klasse genutzt werden, sind die Bilder der Probe 105-108 als Trainingdatensatz für die andere Klasse zu verwenden. Ein Vitalitätswert bezieht sich im Klassifizierer auf eine Entfernung zwischen dem Fourier-Merkmalvektor, der vom Verketten der Werte der Teilmenge der Fourier-Merkmale entstanden ist, und der Grenze der zwei Klassen. Im Schritt 120, je näher der vom Klassifizierer bestimmte Vitalitätswerte bei dem vom ZeIl- sorter bestimmten Vitalitätwert ist, desto genauer ist der Klassifizierer. Die Nutzung von unterschiedlichen Teilmengen der Merkmale führt zu unterschiedlich genauen Ergebnissen. Deswegen wird die Teilmenge der Merkmale, die zur höchsten Genauigkeit führt, als die beste Teilmenge ausgewählt. Es wurde beispielsweise in einem Versuch eine Teilmenge, die aus 10 Merkmalen (mit Indizies 1, 2, 5, 14, 18, 24, 28, 33, 39, 47) besteht, als die beste aus den 49 Merkmalen ausgewählt. Im Schritt 121 werden die von der besten Teilmenge enthaltenen Indexe der Merkmale auf die Festplatte gespeichert. Gleichzeitig wird der Klassifizierer, der die beste Teilmenge als Trainingdatensatz nutzt, auch auf die Festplatte gespeichert. Die von der besten Teilmenge enthaltenen Indexe der Merkmale und der die beste Teilmenge als Trai- ningdatensatz nutzende Klassifϊzierer dienen als die Kalibrierungsinformation dieses Beispiels.

[0071] Das Verfahren, in dem die Zeil-Eigenschaften durch die Kalibrierungsinformation untersucht werden, ist identisch zu dem Verfahren von Beispiel 1. Dennoch ist die Kalibrierungsinformation in diesem Beispiel die im Schritt 121 (wie es in der Figur 10 gezeigt wird) gespeicherte Information. Es wurden beispielsweise in einem Versuch 10 Merkmalen (mit Indizies 1, 2, 5, 14, 18, 24, 28, 33, 39, 47) des Zellbildes berechnet, somit wurde jedes Zellbild in 12 elektronische Werte umgewandelt. Wenn die elektronischen Werte des Zellbildes mit der Kalibrierungsinformation verglichen werden, um konkret zu sein, vom Klassifϊzierer aus der Kalibrierungsinformation klassifiziert werden, wird die Entfernung vom Fourier- Merkmalvektor des Bildes der Zelle zur Grenze der zwei Klassen im Bereich [0, 1] normalisiert, und es wird diese normalisierte Entfernung als Zellvitalitätswert verwendet.

[0072] In unseren Versuchen sind auch andere mathematische Verfahren im Umwandeln des Zellbildes in eine Mehrzahl von merkmale-repreäsentierenden elektronischen Werten an- gewandet worden. Einige davon lauten: Wavelet-Transformation, Hauptkomponentenanalyse, Gabor-Filter, etc. Die aus diesen Methoden entstandenen Treffgenauigkeiten sind vergleichbar gewesen mit den Treffgenauigkeiten aus der oben beschriebenen Fourier-Transformation.

[0073] In unseren Versuchen sind andere Typen von Klassifizierern im Vergleichen der Mehrzahl von elektronischen Werten des Zellbildes mit den gespeicherten elektronischen Werten der kalibrierenden Proben angewandet worden. Einige davon lauten: Gaussian-Mix- Modell- Klassifϊzierer (Gaussian-Mix-Model-Klassifϊzierer), Nähreste-Nachbarn- Klassifϊzierer (Nearest-Neighbor-Klassifϊzierer), etc. Die aus diesen Klassifizierern entstandenen Treffgenauigkeiten sind vergleichbar gewesen mit den Treffgenauigkeiten aus dem oben beschriebenen SVM-Klassifϊzierer.

Beispiel A3 [0074] In Beispiel A3 wird die Phasenkontrastmikroskopie auch für die Abbildung der Probe eingesetzt. Es wird die Mustererkennungstechnik dieser Erfindung genutzt, um die Alterung der Tierzellen in der Probe zu untersuchen. Es wurden CHO-Zellen in den Versuchen verwendet. Der in diesem Beispiel angewandte Apparat ist derselbe wie im Beispiel 1 (wie es in der Figur 3 gezeigt wird). Trotzdem wird in diesem Beispiel andere Kalibrierungsinformation als Beispiel 1 verwendet.

[0075] In diesem Beispiel wird die vom Analyser 30 genutzte Kalibrierungsinformation durch das in der Figur 11 gezeigte Verfahren erworben. Im Schritt 164 werden die Bilder der folgenden kalibrierenden Proben aufgenommen: die nur gealterte Zellen enthaltende erste Probe 161, und die nur nichtgealterte Zellen enthaltende zweite Probe 162. Diese erzeugten Bilder werden als der Trainingdatensatz genommen. In allen trainierenden Bildern ist die Eigenschaft jeder Zelle bekannt. Zum Beispiel ist in der ersten Probe 161 die Eigenschaft jeder Zelle „gealtert". In der zweiten Probe 162 ist die Eigenschaft jeder Zelle „nichtgealtert".

[0076] Im Schritt 168 werden 49 Fourier-Merkmale für jede Zelle in den Bildern berechnet. Diese 49 Fourier-Merkmale werden auf die Festplatte aufgezeichnet. Im Schritt 169 werden verschiedene Teilmengen der im Schritt 168 erworbenen 49 Fourier-Merkmale der Zellbilder genutzt, um einen SVM-Klassifizierer mit zwei Klassen zu trainieren. Daraufhin wird dieser Klassifizierer im Schritt 170 genutzt, um einen Bilddatensatz zu testen, in welchem das Verhältnis zwischen den gealterten und nichtgealterten Zellen in jedem Bild bekannt ist. Dieser Bilddatensatz wird folgendermaßen erworben: Es werden die erste Probe 161 und die zweite Probe 162 mit einem gewissen Verhältnis gemischt. Anschließend werden die gemischten erste Probe 161 und die zweite Probe durch ein normales Phasenkontrastmikroskop aufgenommen. In der gemischten Probe leitet sich das Verhältnis zwischen den gealterten und nichtgealterten Zellen aus dem Mischungsverhältnis ab. Diese gemischte Probe wird als Referenz genutzt. Zum Beispiel, wenn das Mischungsverhältnis 3 Teile gealterter Zellen mit 1 Teil nicht gealterter Zellen ist, enthält die Probe der 75% gealterte Zellen. In Schritt 169 wird der Klassifizierer mit unterschiedlichen Teilmengen der Merkmale trainiert. Die Verwendung unterschiedlicher Teilmengen führt zu unterschiedlichen Genauigkeiten bei der Bestimmung. In Schritt 170 wird die Teilmenge (oder die Teilmengen) der Merkmale ausgewählt, die zu einem Ergebnis geführt hat (haben), welches möglichst nahe am vorbekannten Referenzergebnis lag(en). Deswegen wird die Teilmenge der Merkmale, die zur höchsten Genauigkeit führt, als die beste Teilmenge ausgewählt. Im Schritt 171 werden die von der besten Teilmenge enthaltenen Indizes der Merkmale auf die Festplatte gespeichert. Es wurde beispielsweise in einem Versuch eine Teilmenge, die aus 11 Merkmalen (mit Indizies 0, 5, 15, 19, 21, 27, 28, 30, 40, 41, 44) besteht, als die beste aus den 49 Merkmalen ausgewählt. Gleichzeitig wird der Klassifizierer, der die beste Teilmenge als Trainingdatensatz nutzt, auch auf die Festplatte gespeichert. Die von der besten Teilmenge enthaltenen Indizes der Merkmale und der die beste Teilmenge als Trainingdatensatz nutzende Klassifϊzierer dienen als die Kalibrierungsinformation dieses Beispiels.

[0077] In unseren Versuchen sind auch andere mathematische Verfahren im Umwandeln des Zellbildes in eine Mehrzahl von Merkmal repräsentierenden elektronischen Werten ange- wandet worden. Einige davon lauten: Wavelet-Transformation, Hauptkomponentenanalyse, Gabor-Filter, etc. Die aus diesen Methoden entstandenen Treffgenauigkeiten sind vergleichbar gewesen mit den Treffgenauigkeiten aus der oben beschriebenen Fourier-Transformation.

[0078] In unseren Versuchen sind andere Typen von Klassifizierern im Vergleichen der Mehrzahl von elektronischen Werten des Zellbildes mit den gespeicherten elektronischen Werten der kalibrierenden Proben angewandet worden. Einige davon lauten: Gaussian-Mix- Modell- Klassifϊzierer (Gaussian-Mix-Model-Klassifϊzierer), Nähreste-Nachbarn- Klassifizierer (Nearest-Neighbor-Klassifizierer), etc. Die aus diesen Klassifizierern entstandenen Treffgenauigkeiten sind vergleichbar gewesen mit den Treffgenauigkeiten aus dem oben beschriebenen SVM-Klassifizierer.

Beispiel A4 [0079] In Beispiel A4 wird kein optisches Abbildungssystem verwendet. Das Licht aus den zu untersuchenden Objekten wird direkt auf den Lichtempfänger geworfen. Dadurch werden Bilder erzeugt. Daraufhin werden die Eigenschaften der Tierzellen in der Probe durch die auf maschinellem Lernen beruhende Mustererkennungstechnik untersucht.

[0080] Der in diesem Beispiel angewandte Apparat ist ähnlich zu dem Apparat aus Beispiel 1. Dennoch benutzt dieses Beispiel kein optisches Abbildungssystem und keinen Mechanismus zur Einstellung der Distanz zwischen den Zellen und dem Lichtempfänger, wie es in der Figur 12 gezeigt wird. Das vom Lichtsender 8 emittierte Licht beleuchtet die Zellen der Probe 22. Die Strahlen aus den Zellen der Probe 22 gehen auf den Lichtempfänger 122. Dort werden elektronische Signale erzeugt. Diese Signale werden durch das Kabel 33 in den Analyser 30 gesendet, und werden dort verarbeitet. Somit werden die Zeil-Eigenschaften bestimmt.

[0081] Es ist auch möglich, dass die Strahlen aus dem Lichtsender 8 aus der Seite des Systems kommen, wie es in der Figur 13 gezeigt wird. Die Strahlen, die von den Zellen der Probe 22 gebeugt, gebrochen, oder verstreut werden, gehen auf den Lichtempfänger 122. In diesem Fall werden die meisten Strahlen, die vom Lichtsender 8 emittiert werden, nicht mit den Strahlen aus den Zellen der Probe 22 gemischt und nicht auf den Lichtempfänger 122 projiziert. Deswegen erhöht sich der Kontrast der Bilder.

Beispiel A5

[0082] In Beispiel A5 werden die Zellen mit einer evaneszenten Welle 13 beleuchtet, wie es in der Figur 14 gezeigt wird. Das vom Lichtsender 8 emittierte Licht wird auf das transparente Material 115 geworfen. Die Richtung der Ausbreitung des Lichtes wird so fest- gesetzt, dass eine Totalreflexion an der Grenze zwischen dem transparenten Material 115 und dem Medium 2, das die Zellen der Probe 22 enthält, entsteht. Die evaneszente Welle 13, die aus der Totalreflexion stammt, beleuchtet die Zellen der Probe 22, und anschließend werden die Strahlen aus den Zellen der Probe 22 auf den Lichtempfänger 122 geworfen. Der Lichtempfänger 122 erzeugt elektronische Signale und diese Signale werden durch das Kabel 33 in den Analyser 30 gesendet, wo sie verarbeitet werden. Somit werden die Zeil-Eigenschaften bestimmt.

[0083] In diesem Beispiel können ein Mikroskop und eine CCD- oder CMOS-Kamera 19 eingesetzt werden, wie es in der Figur 15 gezeigt wird. Im Vergleich zu Figur 14 werden zu- sätzlich ein Mikroskopobjektiv 16 und eine CCD- oder CMOS-Kamera 19 genutzt. Die Kamera 19 enthält ein Lichtempfang-Chiparray 18. Die Strahlen aus den Zellen der Probe 22 gehen auf das Lichtempfang-Chiparray 18. Das Mikroskopobjektiv 16 kann das Objektiv eines der folgenden sein: Phasenkontrastmikroskop, Hellfeldmikroskop, Dunkelfeldmikroskop, Differenz-Interferenz-Mikroskop, Fluoreszenzmikroskop, und Konfokalmikroskop, oder eine Kombination von mehreren davon.

Beispiel A6

[0084] In dieser Erfindung können in Bezug auf die Klassifikation der Objekte nicht nur auf Fourier-Transform basierende Merkmale eingesetzt werden (s. Beschreibung des Bei- spiels 1 und Figur 5), sondern auch Merkmale genutzt werden können, die auf Wavelet- Transform basieren.

[0085] Eine Wavelet-Paket-Dekomposition mit zwei Ebenen wird auf die Zellbilder angewandt. Auf jeder Ebene der Dekomposition wird der Frequenz-Raum in vier Sub-Räume abgeteilt, was insgesamt 4² = 16 Sub-Bilder ergibt. Wenn jedes Sub-Bild eine Größe mit N x N Pixel hat, dann können dessen Energie (E) und Entropie (E_p) gemäß der folgenden Formeln I und II berechnet werden:

hier ist u_1} das z/-tel Pixel- Wert des Sub-Bildes, und p( ) kennzeichnet die Wahrscheinlichkeit des Vorfalls des Wertes U₁/. Energie und Entropie werden für jedes Sub-Bild berechnet, des- wegen werden jeweils 32 Merkmale erzeugt.

[0086] Die restlichen Verfahren in diesem Beispiel sind identisch oder ähnlich wie jene, die im Beispiel 1 beschrieben sind.

Bezugszeichen

1 Behälter

2 Medium

4 Antriebssystem

6 Messkammer

8 Lichtsender

9 Kondensor

10 Mikroskop

11 Diaphragma

I Ia direkte Strahlen

I Ib Streustrahlung

12 Apparat für Signalwandlung

12a Kamera

13 evaneszente Welle

14 S ignalanaly seeinheit

16 Mikroskopobj ektiv

17 Phasenplatte

18 Lichtempfang-Chiparray

19 CCD-Kamera

20 Bioreaktor

22 Probe

25 Messkammer

26 zweites Ventil

28 erstes Ventil

29 Pumpe

29a Reagenzpumpe

30 Analyser

31 Speicher

32 Reagenzpatrone

33 FireWire-Kabel

34 Prozessor

35 Kontrollkabel

36 Platine 37 Festplatte

38a Leitung

38b Leitung

38c Leitung

40 Schrittmotor

41 gleitender Block

42 Träger

43 Gewindespindel

44 Schraube

46 Boden

48 Träger

49 Loch

51 räumliches Spektrum

52 Merkmale-Indizes

53 Behälter mit Reinigungsmittel

54 Müllbehälter

55 Zellbilder

56 schnelle Fouriertransformation

57 Berechnung der Energie der Sub-Bilder

61 erste Probe nur lebender Zellen

62 zweite Probe nur nekrotischer Zellen

63 dritte Probe nur apoptotischer Zellen

68 Merkmalsberechnung

69 Trainieren eines Klassifϊzierers mit Teilmengen der Merkmale

70 Selektion der besten Teilmengen

75 Einlesen der a-priori-Informationen

76 Einlesen der Bilder

77 Zellerkennung

78 Berechnung der Merkmalswerte

79 Untersuchung mit dem Klassifizierer

81 Hauptkomponentenanalyse

82 Berechnung der Eigenvektoren

83 Einelesen von Bildern ohne Zellen

84 Projektion der Bilder ohne Zellen auf die Eigenvektoren

85 Trainieren des Klassifizierers 86 Einlesen der Zellbilder

87 Berechnung der Zuversichts-Mappe

88 Bestimmung der Positionen der Zellen

101 - 108 Proben unterschiedlicher Vitalität, ansteigend von 101 zu 108 114 Abbildung im Phasenkontrastmikroskop

115 transparente Materialien

118 Merkmalsberechnung

119 Trainieren des Klassifizierers mit Teilmengen der Merkmale

120 Selektion der Teilmengen der Merkmale 121 Speicherung der besten Teilmenge der Merkmale

122 Lichtempfänger

161 erste Probe nur gealterte Zellen

162 zweite Probe nur nichtgealterte Zellen 168 Merkmalsberechnung 169 Trainieren eines Klassifizierers mit Teilmengen der Merkmale

170 Selektion der besten Teilmenge

Claims

Titel: Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von Eigenschaften einesObjekts in einem Medium Anmelder: Universität BielefeldUnser Zeichen: 90094WOAnsprüche

1. Verfahren zur Untersuchung von Eigenschaften eines Objekts in einem Medium (2) umfassend:

Beleuchtung des Objekts im Medium (2) - Detektion eines optischen Signals vom Objekt;

Umwandeln des optischen Signals in eine Mehrzahl von Flächensignalen; Anwendung eines mathematischen Verfahrens auf die Mehrzahl von Flächensignalen zur Berechnung einer Mehrzahl von deren Merkmale und somit zur Erzeugung einer Mehrzahl von elektronischen Werten, welche Signal-Merkmalen darstellen; - Vergleichen der Signal-Merkmale des Objekts mit den gespeicherten Signal-

Merkmalen einer oder meherer kalibrierender Proben zur Erzeugung mindestens eines Wertes, welcher der untersuchten Eigenschaft entspricht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend die Erstellung der gespeicherten Sig- nal-Merkmale aus einer oder mehreren kalibrierenden Proben.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend ein Auswählen einer Teilmenge von einer Mehrzahl von elektronischen Werten der kalibrierenden Proben.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Auswahl unter wenigstens einem Kriterium durchgeführt wird, dass die durch dieses Verfahren erworbenen Ergebnisse an die durch ein oder mehrere Referenzverfahren erwobenen Ergebnisse angenähert werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das auf die Mehrzahl von Flächensignalen angewandte mathematische Verfahren eines der folgenden Verfahren ist: Fourier-Transformation, Wavelet- Transformation, Hauptkomponentenanlalyse, Garbor- Filter.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein mathematisches Verfahren auf die Mehrzahl von Flächensignalen zur Erzeugung eines räumlichen Spektrums

(51) angewandt wird, und das mathematische Verfahren eines der folgenden ist: Fourier- Transformation, Wavelet-Transformation.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Vergleichen der Signal-Merkmale des Objekts mit den gespeicherten Signal-Merkmalen mittels eines Klassifizierers durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Klassifizierer auf einem der nachfolgenden Verfahren basiert: Support- Vector-Maschine, Gaussian-Mix-Modell (Gaussian-Mix-Model), Nächste-Nachbarn (Nearest Neighbor).

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein Unterscheiden des Objekts in dem Medium (2) vom Hintergrund.

10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Objekt eine Zelle oder einen Mikroorganismus umfasst.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Zelle eine Tierzelle, eine Pflanzzelle, eine Zelle tumorgenetischen Ursprungs oder eine Zelle eines Mikroorganismus ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Eigenschaft des Objekts bestimmt, ob das Objekt apoptotisch, nekrotisch, gealtert, tot oder lebendig ist.

13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Eigenschaft des Objekts bestimmt, wie metabolisch aktiv das Objekt ist.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei für eine oder mehrer Eigenschaften eines Objekts bei der Kalibrierung Schwellenwerte definiert werden, die zur Bestimmung der Eigenschaften eines Objektes im Medium verwendet werden.

15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Detektion durch Hellfeld-, Dunkelfeld-, Fluoreszenz-, Phasenkontraste- oder Differenz-Intererferenz-Mikroskopie erfolgt.

16. Vorrichtung zur Untersuchung mindestens eines Objekts mit: einer Lichtquelle (8) zur Beleuchtung des Objekts; einem Detektor zum Erwerb des optischen Signals von dem Objekt und zur Erzeugung einer Mehrzahl von Flächensignalen; - einer Signalanalyseeinheit (14) zur Anwendung eines mathematischen Verfahrens auf die Mehrzahl von Flächensignalen, und dadurch zur Erzeugung einer Mehrzahl von elektronischen Werten, welche Signal-Merkmale darstellen, und einem Vergleicher zum Vergleichen der Signal-Merkmale eines Objekts mit den gespeicherten Signal-Merkmalen einer oder mehrerer kalibrierender Proben zur Erzeugung mindestens eines Wertes, welcher der untersuchten Eigenschaften entspricht.

17. Vorrichtung nach Ansprüche 16, wobei diese zusätzlich eine Messkammer (6) aufweist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei die Messkammer (6) ein flüssiges Medium (2) aufweist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem flüssigen Medium (2) um ein Wachstumsmedium für Zellen handelt.

20. Verwendung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 15 zur Überwachung biologischer Prozesse in Bioreaktoren.

21. Verwendung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 15 zur Bestimmung des Zellwachstums in Fermentationsprozessen.

22. Verwendung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 15 zur Überprüfung von Zelleigenschaften in entnommenen biologischen Proben, Blutproben, isoliertem Blutplasma oder -serum.

23. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, zur Überprüfung oder Überwachung eines Therapieverlaufes, insbesondere bei Tumortherapien.

24. Verwendung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 15 zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen, Reagenzien oder biologischen Makromolekülen auf die Lebensund Entwicklungsfähigkeit von Zellen bei der Entwicklung und Herstellung von pharmazeutischen Mitteln.

25. Verwendung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 15 zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksamen Substanzen, Reagenzien oder biologischen Makromolekülen.

26. Verwendung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 15 im Brauereiwesen zur Überwachung von Gärungsprozessen.