WO2009083660A2 - Méthode et installation de détection électrochimique d'un composé biologique - Google Patents

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WO2009083660A2
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François MAVRE
Damien Marchal
Benoît LIMOGES
Jean-Michel Saveant
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Universite Paris Diderot-Paris 7
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
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    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions

Definitions

  • the present invention relates to an electrochemical detection method and facility for detecting the presence of a given biological compound in a sample.
  • the ELISA test for example, an acronym for "Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay” is an immunological test that can detect and / or assay a protein in a biological fluid.
  • wells are provided on a plate and are lined with a capture antibody capable of binding specifically to a given antigen sought in the biological sample.
  • the capture antibody is adsorbed in the bottom of the wells, for example by electrostatic interaction, and it is this which ensures the specificity of the test.
  • the biological sample to be tested is then deposited in the wells of the plate and if the desired antigen is present it specifically binds to the capture antibody.
  • a second antibody, the tracer antibody, able to bind to the desired antigen and possibly captured is then added to the wells.
  • Wells are then rinsed to remove all tracer antibodies except those that bind to the desired and captured antigen.
  • the tracer antibody, trapped in the desired and captured antigen, is then coupled to an enzyme catalyzing the formation of a colored product.
  • the reaction can thus be quantified by colorimetry via the Beer-Lambert law.
  • the desired antigen concentration is thus deduced, since the number of tracer antibody molecules fixed depends on the number of antigen molecules immobilized by the capture antibody.
  • This method is widely used, for example to detect HIV by highlighting the presence of anti-HIV antibodies in the body. blood.
  • the colorimetric quantification is insensitive so that this method is rather used as a qualitative method.
  • the human clinic when HIV is detected by the ELISA test, the latter is supplemented by other more precise techniques.
  • an electric current can be measured thanks to the electrodes; electric current which is directly proportional to the amount of tracer antibody and therefore of biological compound captured.
  • the detection threshold of the biological compound is even lower than the space is confined.
  • the implementation of a micro-channel has disadvantages related to the flow of fluids and in particular solutions that flow inside the micro-channel, which flow is directly a function of the relative surface tensions. .
  • a problem that arises and that aims to solve the present invention is to provide an electrochemical detection facility that overcomes the difficulties of implementation of the inner wall on which is adsorbed the capture antibody, while further lowering the detection threshold of the biological compounds, and also allowing better accessibility to this inner wall so as to easily put in contact successively, the different solutions with the inner wall.
  • the present invention proposes an electrochemical detection installation for detecting the presence of a given biological compound in a sample, said installation comprising a detection cell having an internal wall and two electrodes. on said inner wall, said inner wall having two portions facing each other to form a confined space, and an active part which extends into said confined space and on which biological capture material is adsorbed, said given biological compound being capable of being specifically captured by said biological capture material when said sample is brought into contact with said active part, said captured biological compound being capable of being recognized by a specific marker when said specific marker is set in contact with said active part, said mark a specific urea being capable of producing a specific charge carrier of said marker in said confined space, said captured and recognized biological compound being subsequently detected through the charge carrier by measuring the amount of electric current flowing through said electrodes; according to the invention, said wall portions are movable relative to each other between a spaced position and a close position; and said active portion is provided on one of said wall portions, while said portions are
  • a feature of the invention lies in the implementation of an inner wall in two wall portions independent of one another, which can be brought closer to each other without being in contact with each other. contact, and so as to form the confined space.
  • said one of said wall portions, located in the open air can then be easily prepared to ultimately be covered by the other of said wall portions so as to form the confined space and then carry out the measurement. electric current.
  • the electrodes are located on one of said wall portions. In this way, these electrodes are located in the confined space where the charge carriers are produced, and consequently, the electrochemical detection is instantaneous. In addition, the electrochemical detection is not disturbed by any other external species.
  • said wall portions are respectively formed by a support plate, for example a plastic or glass, forming said one of said wall portions, and a cover plate, to cover said one of said wall portions.
  • the support plate can easily be manipulated and prepared, for example by a PLC, and the cover plate can then be attached to the support plate. by a second automaton, so that the electric current can then be measured.
  • the support plate is advantageously treated to facilitate, in particular, the adsorption of biological capture material.
  • said support plate has a plurality of wall portions on which are respectively formed active portions so as to form a plurality of detection cells. Thus, one can multiply the number of measurements for a given sample, without considerably increasing the preparation time.
  • this support plate can easily be manipulated and prepared via PLCs.
  • said wall portions are preferably flat, which further facilitates both the preparation of the support plate, since carried in a horizontal position, the various compounds in solution can be deposited in the form of drops, and also the recovery the support plate, for example by a single glass slide. Then, in a single operation, a plurality of confined spaces of liquid are formed in which the measurement of the electric current is made simultaneously.
  • said two electrodes are situated on the other of said wall portions, opposite to that on which said active part is formed, such that these electrodes are only brought into contact with the liquid at the moment of measurement or a few moments before.
  • the electrodes are neither polluted nor even disturbed by the different chemical or biological species that interfere with the active part of said one of said walls.
  • the present invention proposes an electrochemical detection method for detecting the presence of a given biological compound in a sample, said method being of the type according to which: provides a sensor cell having an inner wall and two electrodes on said inner wall, said inner wall having two closely spaced portions one of the other forming a confined space; biological capture material is adsorbed on an active portion which extends into said confined space; said sample is brought into contact with said active part, said given biological compound being capable of being specifically captured by said biological capture material; said active portion is brought into contact with a specific marker, said captured biological compound being capable of being recognized by said specific marker and said specific marker being capable of producing a specific charge carrier of said marker in said confined space; and, measuring the amount of electric current flowing through said electrodes to detect said given biological compound captured and recognized through the charge carrier; according to the invention, there are provided two wall portions, movable between a spaced apart position and a position close to one another to form said wall portions; and said active portion is maintained on one of said wall portions, while said
  • a feature of the invention lies in the implementation of the active portion and the biological sample and the specific marker in an open space delimited by said one of said wall portions and in a first phase. It is only then, in a second phase, that the two wall portions are brought together to form the confined space. Finally, the measurement of the electric current can be carried out. According to the prior art, the preparation prior to the measurement of the electric current is carried out in a microchannel and therefore in the confined space, which makes it all the more difficult. Or 1 according to the invention, during the preparation of said one of said wall portions, the active part can be formed by depositing simply by pipetting, a drop of biological capture material more commonly referred to as capture probe, on the surface of said one of said wall portions, for example on the surface of an electrode.
  • This portion of the wall is thus left for a determined time in a controlled atmosphere in order to allow the adsorption or the covalent attachment of the capture probe on its surface. Then, this surface is rinsed to remove unadsorbed capture probes. Then, the surface is brought into contact with a biological sample incorporating a biological compound to be detected, ie a target molecule. After a given incubation period, the surface of the wall portion is rinsed so as to eliminate the molecules not specifically recognized by the capture probe, then it is brought into contact with the specific marker whose surplus is also removed by rinsing. . The specific marker focused on target molecules immobilized by the capture probe.
  • the active part is covered by the other of said wall portions after having been deposited on this active part, an aqueous phase compound capable of generating with the specific marker, the charge carrier.
  • the other of said wall portions allows to imprison a thin layer of liquid to the right of the active surface. This thin layer of liquid is thinner as the pressure exerted on the other of said wall portions against the electrode is strong.
  • the target molecules sandwiched between the capture probes and the specific marker molecules bathe in a thin liquid layer immobilized between the wall portions. Consequently, as soon as the compound in the aqueous phase has been brought into contact with the active part, specific charge carriers of the label are produced, and their concentration increases more rapidly than the liquid layer is thin.
  • said electrodes are formed on one of said wall portions by a screen printing method.
  • a thin layer of a conductive material incorporating for example carbon and in a predetermined form for drawing at least two electrodes, is produced precisely on one of said wall portions.
  • a support plate is advantageously provided on which the active part and a cover plate will be made to confine the space with respect to said active part and so as to respectively form said wall portions.
  • a plurality of wall portions are reserved on said support plate in which an active part is cleaned, so as to be able to form a plurality of detection cells with the same support plate.
  • a plurality of electrode pairs spaced apart by a distance corresponding to the spacing distance of the active parts is formed parallel to said cover plate. Said plurality of pairs of electrodes is easily made with perfect reproducibility, by said screen printing method. We then obtain pairs of identical electrodes spaced from the same distance. In this way, by covering the support plate with the cover plate and by ensuring that the pairs of electrodes coincide with the corresponding active parts, a plurality of detection cells are made on the same support plate.
  • a layer of an aqueous solution is trapped conductor of the electric current, between said wall portions.
  • this aqueous solution is capable of holding the cover plate in a fixed position by the simple play of the surface tensions of the solution, the support plate and the cover plate.
  • a flat layer of the conductive aqueous solution of a thickness of the order of ten microns, for example 40 microns, is likely to be trapped between the cover plate and the support plate.
  • the support plate by covering the support plate with the cover plate carrying the electrodes, the latter are brought into contact with the aqueous medium at the last moment, just before the measurement.
  • the surface of the electrodes is devoid of chemical compounds that could disturb this measurement.
  • a potential difference is incremented as a function of time between said electrodes, and one chooses the maximum intensity in response, as a measure of said amount of current flowing therethrough.
  • FIG. 1 is a schematic top view of an element of the electrochemical detection system according to the invention
  • FIG. 2 is a schematic perspective view of another element of the electrochemical detection system
  • Figure 3 is a schematic perspective view showing the two elements shown in Figures 1 and 2, associated;
  • - Figure 4 is a partial schematic view in perpendicular section of the elements shown in Figure 3, in a measurement position;
  • - Figure 5 is a voltammetric curve obtained through the elements shown in Figure 4;
  • the electrochemical detection method according to the invention aims to indirectly detect the presence of a biological compound, a complex molecule, in any sample. It involves revealing the presence of DNA, oligonucleotide, RNA, microRNA or any other protein in a given sample.
  • the principle is based on the affine recognition between a biological compound, a target molecule, a capture probe consisting of biological capture material and a specific marker of the target molecule. The latter is then sandwiched between the capture probe and the specific marker.
  • the capture probe in a first step of the method, the capture probe is adsorbed or covalently attached to a given surface, by depositing a drop of a solution comprising the biological material forming the capture probe.
  • the surface is rinsed to remove non-adsorbed or non-hooked capture probes.
  • the surface is brought into contact with the sample incorporating the biological compound or target molecule. Then, in a fourth step, the surface is rinsed to eliminate target molecules not specifically recognized and not captured by the capture probe.
  • the present invention also relates to an electrochemical detection installation which makes it possible to carry out this electrochemical measurement.
  • Elements of this installation are shown in FIG. 1 and include in particular a plate 10, called a "cover plate", made of plastic material on which a triplet of electrodes has been screen printed. 12.
  • the screen printing makes it possible to apply with a precision of the order of 1/100 of a millimeter, in the liquid or pasty state, a conductive composition of the electric current which, once solidified, constitutes an electrode.
  • These electrodes comprise a central electrode 14 having a circular disc 16 with a diameter of less than 10 mm, for example 4 mm, and from which extends a linear connecting portion 18, and two peripheral electrodes 20 and 22 which respectively have a semicircular portion 24, 26 which borders the circular disk 16 and a linear portion 28, 30 which runs along the linear connecting portion 18.
  • the two peripheral electrodes 20, 22 extend spaced from the central electrode 14 without to be in contact with it, but also, these two electrodes do not meet either and are therefore not in contact with each other.
  • the linear connecting portion 18 and the linear portions 28, 30, are respectively connected to terminals 32, 34, 36.
  • the electrochemical measurement mentioned above consists in applying a potential between the terminal 32 corresponding to the central electrode 14 and one or the other of the terminals 34, 36 of the peripheral electrodes 20, 22 and measuring the electric current which then passes therethrough.
  • the feasibility of the method by adopting the elements of the aforementioned installation.
  • the third, fourth and fifth steps mentioned above are carried out in a single step, providing a target molecule, that is to say the biological compound, which has already been recognized by a specific marker.
  • Each The target molecule is therefore already linked to a specific marker molecule.
  • FIG. 2 represents a support plate 38 on which the capture probe, or the biological capture material which is here an IgG 1 antibody, is adsorbed on a surface portion.
  • the PBS buffer is a pH 7.4 phosphate buffer containing: 4.3 mM NaH 2 PO 4 (milli-mole per liter), 5.1 mM Na 2 HPO 4 I, and 50 mM NaCl.
  • the support plate 38 is allowed to incubate for two hours in a humid atmosphere.
  • the surface portion S of the support plate 38 is then rinsed three times by simply soaking in a solution of PBS containing no IgG antibody.
  • the surface portion S then covered with capture probes constitutes an active part of the support plate 38.
  • the support plate 38 is immersed in a buffered solution of a volume of 5 ml containing the target molecule already recognized by the specific marker.
  • the marker is an enzyme, alkaline phosphatase, chemically modified with the addition of an anti-IgG that corresponds to the target molecule.
  • the concentration of the aforementioned incubation solution then corresponds to the target molecule concentration of the biological sample. The feasibility of the method is demonstrated hereinafter with five different concentrations ranging from 5.10 "to 15 1000. 10" 15 M (mole per liter).
  • the buffer of the solution is Tris (Tris- (hydroxymethyl) aminomethane) at 0.1 M TB (Tris Buffer) pH 9.0, containing 1 mM MgCb.
  • the incubation time is 12 hours to reach a state of equilibrium for the formation of the IgG-anti-IgG-label complex.
  • the speed with which this state of equilibrium is reached depends on (i) the equilibrium constant defined by the ratio of the equilibrium concentrations of the different species, (ii) the diffusion of the marker associated with the anti-IgG and (iii) the relationship between the concentration volume of the associated marker, the surface S and the surface concentration of PIgG, that is to say the amount of IgG antibody adsorbed on the surface portion S.
  • This time can be reduced, then work out of equilibrium.
  • the surface is rinsed to remove the associated marker not specifically recognized by I 1 IgG and this simply by successive soaking in a TB buffer solution.
  • a 4 ⁇ L drop 40 containing the substrate of the marker enzyme is deposited on the surface portion S.
  • the substrate of the marker enzyme is here 2.6 di 1mM chloro-amino-phenyl-phosphate (2,6-DCPAPP) in a TB buffer solution.
  • this drop is crushed by applying the cover plate 10 to the support plate 38, so that the surface portion S is covered by the circular disc 16 and the hemicircular portions 24, 26 of the electrodes 12.
  • FIG. 4 thus illustrates the support plate 38 and the cover plate 10 which define a confined space 44 in which a thin layer of solution of a thickness d between 20 ⁇ m and 100 ⁇ m, 40 ⁇ m by example.
  • this thin layer is trapped between a first inner wall portion 41, corresponding to the surface of the support plate 38 and a second inner wall portion 43, corresponding to the surface of the cover plate 10.
  • the cover plate 10 is left free, and is held in a fixed position relative to the support plate 38 by simple surfactant forces which act between the solution, the cover plate 10 and the support plate 38.
  • This thin layer of trapped solution present then a portion located at the right of the surface portion S, which portion defines a volume of substantially cylindrical shape, a thickness of 40 microns to resume the aforementioned example of a diameter of about 5 mm. It is in this volume that the product generated by the enzyme, which is the 2,6-chloro amino phenol in its reduced form.
  • This product is an electrochemically active charge carrier. The rate of accumulation of this product is a function of the surface concentration of IgG-anti-IgG-label complex and consequently of the initial concentration of target molecule associated with the specific marker.
  • the determination of the concentration of the molecule produced by the enzymatic activity, at a time t, is carried out by an electrochemical measurement and precisely, by measuring the electric current flowing in the central electrode 14 and one of the peripheral electrodes 20 , 22 for a given potential applied between these electrodes.
  • the most sensitive technique used here is cyclic voltammetry. In this case, the potential is incremented, then decremented by 0.1 mVolt (milli-VoIt) per second, between -0.4 and 0.6 V. This gives an intensity / / potential curve v as illustrated. in Figure 5.
  • the extremum of the curve corresponding to the maximum value i max of the electric current expressed in ⁇ A (micro-ampere) which passes through the electrodes, during the potential sweep, is then recorded because it corresponds to the electrochemical sensitivity maximum detection.
  • Figure 6 where the values in the table above have been reported, illustrates this variation and thus defines a calibration curve. In this way, it is easy by measuring the electric current flowing through the electrodes for a potential value corresponding to the maximum value of electric current, and then by transferring this maximum value to the calibration curve shown in FIG. corresponding molar concentration in associated target molecules.
  • the cover plate 10 and the support plate 38 at a distance d less than 40 ⁇ m.
  • the production of the molecule produced by the enzymatic activity depends only on the concentration of biological compound in the sample. It is therefore identical if the volume of the confined space is smaller, but the concentration increases more rapidly. And therefore, since the intensity of the electric current flowing through the electrodes depends on the concentration of molecules produced, the target biological compound will be more rapidly detectable.
  • the distance d between the two plates, or the ratio active surface area on the volume which extends between the two plates to the right of the active surface makes it possible to adjust the dynamics of the response of the detection installation, insofar as all the catch sites are not saturated by the target molecule.
  • the electrodes are not screen printed on the cover plate, but on the opposite side on the support plate.
  • This second embodiment is advantageous when the electrodes are insensitive to chemical species or biological compounds that could accumulate on its surface. Indeed, in this case it is easier to match the position of the active surface with that of the electrodes, since it is sufficient to apply the solutions on the electrodes arranged on the support plate.
  • a plurality of electrochemical cells are formed on the same support plate.
  • a plurality of electrode triplets aligned on the support plate for example four triplets, each triplet corresponding to the electrodes illustrated in FIG. 1, are produced first.
  • the various deposits on the support plate are then carried out on the support plate. level of each of the central electrodes of said triplets to prepare the measurement.
  • the support plate is covered with a single glass slide.
  • a measurement of the intensity of the electric current passing through the electrodes is carried out simultaneously. In this way, one can either perform a series of measurements for the same biological sample and then be certain of the presence of the target molecule or, simultaneously, perform several measurements of different samples.
  • a support for example nanoparticles, dendrimers or "branched" DNA, on which a plurality of enzymes are present; and preferably a large number.
  • a support for example nanoparticles, dendrimers or "branched" DNA, on which a plurality of enzymes are present; and preferably a large number.
  • the electrochemical signal by a redox recycling of the electrodetectable product.
  • This can be achieved either by another electrode at a suitable potential or by an enzyme, a redox enzyme for example, in the presence of its substrate.
  • the amplification of the signal is all the stronger as the electrodes are close to one another. It is then necessary to use a network of interdigital electrodes.
  • it can be either left to react in the solution film which constitutes the confined space, is immobilized on the surface of the working electrode, or is grafted onto particles. .
  • the active part on one of the walls, and on the other wall, the electrodes modified with this redox enzyme.
  • the detection is based on enzymatic activity.
  • the production of the charge carrier can also result, according to yet another variant, the dissolution of a metal particle.
  • the marker is a gold particle that will be dissolved after the confinement step. Its dissolution is achieved by the electrogeneration of Br 2 in a medium containing HBr and its detection is carried out by electrodeposition on the electrode.
  • the active surface may be formed on magnetic particles.
  • these magnetic particles are treated so as to ensure the capture and then the labeling of the target molecule.
  • the particles are deposited on one of the two walls and, after formation of the confined space using the second wall, the revelation and the electrochemical measurement are carried out.
  • the advantage of such a variant lies in the possibility of producing the "sandwich" structure independently of the implementation of the two walls.

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Abstract

L'invention concerne une installation et une méthode pour détecter la présence d'un composé biologique dans un échantillon. L'installation comprend une cellule de détection présentant une paroi interne et deux électrodes. La paroi interne présente deux portions rapprochées pour former un espace confiné, et une partie active qui s'étend dans ledit espace confiné et sur laquelle est adsorbé un matériel biologique de capture. Selon l'invention lesdites portions de paroi sont mobiles l'une par rapport à l'autre entre une position écartée et une position rapprochée; et ladite partie active est ménagée sur l'une desdites portions de paroi, tandis que lesdites portions sont portées dans ladite position rapprochée pour former ledit espace confiné.

Description

Méthode et installation de détection électrochimique d'un composé biologique
La présente invention se rapporte à une méthode et à une installation de détection électrochimique pour détecter la présence d'un composé biologique donné dans un échantillon.
On connaît des installations permettant de mettre en œuvre des méthodes pour détecter la présence d'un composé biologique dans un échantillon. Le test ELISA, par exemple, acronyme de « Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay » est un test immunologique qui permet de détecter et/ou de doser une protéine dans un liquide biologique. Dans la technique de dosage dite "en sandwich", des puits sont ménagés sur une plaque et ils sont tapissés avec un anticorps de capture capable de se lier spécifiquement à un antigène donné que l'on recherche dans l'échantillon biologique. L'anticorps de capture est adsorbé dans le fond des puits, par interaction électrostatique par exemple, et c'est lui qui assure la spécificité du test. L'échantillon biologique à tester est ensuite déposé dans les puits de la plaque et si l'antigène recherché est présent il se lie spécifiquement à l'anticorps de capture. Un deuxième anticorps, l'anticorps traceur, apte à pouvoir se lier à l'antigène recherché et éventuellement capturé est alors ajouté dans les puits. Les puits sont ensuite rincés de manière à éliminer tous les anticorps traceurs exceptés ceux qui se sont liés à l'antigène recherché et capturé. L'anticorps traceur, prisonnier de l'antigène recherché et capturé, est alors couplé à une enzyme catalysant la formation d'un produit coloré. La réaction peut ainsi être quantifiée par colorimétrie par l'intermédiaire de la loi de Beer-Lambert. On en déduit ainsi la concentration en antigène recherché, puisque le nombre de molécules d'anticorps traceur fixées dépend du nombre de molécules d'antigènes immobilisées par l'anticorps de capture.
Cette méthode est largement utilisée, par exemple pour dépister le VIH en mettant en évidence la présence d'anticorps anti-VIH dans le sang. Cependant, la quantification colorimétrique est peu sensible de sorte que cette méthode est plutôt utilisée comme une méthode qualitative. Et d'ailleurs, en clinique humaine, lorsque le VIH est dépisté par le test ELISA, ce dernier est complété par d'autres techniques plus précises.
Aussi, il a été imaginé d'adopter des méthodes électrochimiques en espace confiné. La méthode n'est plus photométrique mais électrochimique, et elle n'est plus mise en oeuvre dans des puits, mais dans des micro-canaux. On pourra notamment se référer au document EP.1 404 448 lequel décrit une telle méthode. Selon le même principe de dosage dit "en sandwich", un micro-canal dont la paroi interne est équipée d'électrodes, est tout d'abord rempli d'une solution comprenant un anticorps de capture qui vient s'adsorber sur ladite paroi interne. Puis l'échantillon est injecté dans le micro-canal, de manière à ce que le composé biologique puisse être capturé par l'anticorps de capture. Après rinçage, un deuxième anticorps traceur est injecté dans le micro-canal et il vient se lier à l'antigène capturé. Ensuite, par l'intermédiaire d'une enzyme catalysant la formation d'un composé électrochimiquement actif, on peut mesurer un courant électrique grâce aux électrodes ; courant électrique qui est directement proportionnel à la quantité d'anticorps traceur et par conséquent de composé biologique capturé. Ainsi, il n'est plus ici mesuré une quantité de photons, mais une quantité d'électrons. En outre, le seuil de détection du composé biologique est d'autant plus bas que l'espace est confiné. Cependant, la mise en œuvre d'un micro-canal présente des inconvénients liés à l'écoulement des fluides et en particulier des solutions qui s'écoulent à l'intérieur du micro-canal, lequel écoulement est directement fonction des tensions de surface relatives. En réalité, il est non seulement malaisé d'adsorber l'anticorps de capture sur la surface interne du micro-canal, mais il est aussi difficile d'y injecter l'échantillon pour le stabiliser ensuite à l'intérieur, afin que le composé biologique puisse y être capturé. Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente invention, est de fournir une installation de détection électrochimique qui permette de s'affranchir des difficultés de mise en oeuvre de la paroi interne sur laquelle est adsorbé l'anticorps de capture, tout en abaissant encore le seuil de détection des composés biologiques, et également qui permette une meilleure accessibilité à cette paroi interne de manière à pouvoir mettre aisément en contact successivement, les différentes solutions avec la paroi interne.
La présente invention propose selon un premier objet, dans le but de résoudre ce problème, une installation de détection électrochimique pour détecter la présence d'un composé biologique donné dans un échantillon, ladite installation comprenant une cellule de détection présentant une paroi interne et deux électrodes sur ladite paroi interne, ladite paroi interne présentant deux portions rapprochées en regard l'une de l'autre pour former un espace confiné, et une partie active qui s'étend dans ledit espace confiné et sur laquelle est adsorbé un matériel biologique de capture, ledit composé biologique donné étant susceptible d'être capturé spécifiquement par ledit matériel biologique de capture lorsque ledit échantillon est mis en contact avec ladite partie active, ledit composé biologique donné capturé étant susceptible d'être reconnu par un marqueur spécifique lorsque ledit marqueur spécifique est mis en contact avec ladite partie active, ledit marqueur spécifique étant susceptible de produire un porteur de charge spécifique dudit marqueur dans ledit espace confiné, ledit composé biologique donné capturé et reconnu étant détecté ensuite par l'intermédiaire du porteur de charge en mesurant la quantité de courant électrique qui traverse lesdites électrodes ; selon l'invention, lesdites portions de paroi sont mobiles l'une par rapport à l'autre entre une position écartée et une position rapprochée ; et ladite partie active est ménagée sur l'une desdites portions de paroi, tandis que lesdites portions sont portées dans ladite position rapprochée pour former ledit espace confiné, après que ledit échantillon et ledit marqueur ont été successivement mis en contact avec ladite partie active.
Ainsi, une caractéristique de l'invention réside dans la mise en œuvre d'une paroi interne en deux portions de paroi indépendantes l'une de l'autre, susceptibles d'être rapprochées en regard Tune de l'autre sans pour autant être en contact, et de façon à former l'espace confiné. De la sorte, ladite une desdites portions de paroi, située à l'air libre, peut alors être préparée aisément pour in fine, être recouverte par l'autre desdites portions de paroi de manière à former l'espace confiné et réaliser ensuite la mesure du courant électrique. Ainsi qu'on l'expliquera ci-après, il est en effet bien plus aisé de réaliser la préparation de ladite une desdites paroi dans l'espace ouvert qu'elle délimite, plutôt que dans l'espace déjà confiné d'un micro-canal dans lequel il est impossible d'ajuster précisément la position de ladite partie active et où l'échantillon biologique et le marqueur spécifique notamment, ne peuvent être mis en contact avec ladite surface active, que par écoulement à l'intérieur dudit canal. Compte tenu des tensions de surface des solutions utilisées pour véhiculer successivement les différents composés actifs, ces solutions doivent être injectées sous pression à l'intérieur du micro-canal. Précisément, selon un mode de mise en oeuvre de l'invention particulièrement avantageux, les électrodes sont situées sur l'une desdites portions de paroi. De la sorte, ces électrodes sont situées dans l'espace confiné où sont produits les porteurs de charge, et par conséquent, la détection électrochimique est instantanée. En outre, la détection électrochimique n'est ainsi perturbée par aucune autre espèce extérieure.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, lesdites portions de paroi sont respectivement formées par une plaque support, par exemple en matière plastique ou encore en verre, formant ladite une desdites portions de paroi, et une plaque de recouvrement, pour recouvrir ladite une desdites portions de paroi. Ainsi, la plaque support peut aisément être manipulée et préparée, par exemple par un automate, et la plaque de recouvrement peut alors être rapportée sur la plaque support par un second automate, de manière à pouvoir mesurer le courant électrique ensuite. Par ailleurs, la plaque support est avantageusement traitée pour faciliter notamment, l'adsorption du matériel biologique de capture. Avantageusement, ladite plaque support présente une pluralité de portions de paroi sur lesquelles sont respectivement ménagées des parties actives de façon à former une pluralité de cellules de détection. Ainsi, on peut multiplier le nombre de mesures pour un échantillon donné, sans augmenter considérablement pour autant le temps de préparation. Car en effet, certaines des étapes de préparation, ainsi qu'on l'expliquera ci-après plus en détail, et notamment les phases de rinçage, peuvent être réalisées simultanément en une seule opération. Par ailleurs, on comprend également que cette plaque support peut aisément être manipulée et préparée par l'intermédiaire d'automates. Au surplus, lesdites portions de paroi sont avantageusement planes, ce qui facilite plus encore à la fois la préparation de la plaque support, puisque portée dans une position horizontale, les différents composés en solution peuvent être déposés sous forme de gouttes, et aussi le recouvrement de la plaque support, par une seule lamelle de verre par exemple. Sont alors formées, en une seule opération, une pluralité d'espaces confinés de liquide à l'intérieur desquels on réalise simultanément la mesure du courant électrique.
Préférentiellement, lesdites deux électrodes sont situées sur l'autre desdites portions de paroi, opposée à celle sur laquelle est formée ladite partie active, de telle sorte que ces électrodes ne sont mises en contact avec le liquide qu'au moment de la mesure ou quelques instants avant. Ainsi, les électrodes ne sont ni polluées ni même perturbées par les différentes espèces chimiques ou biologiques qui interfèrent avec la partie active de ladite une desdites parois. Selon un second objet, la présente invention propose une méthode de détection électrochimique pour détecter la présence d'un composé biologique donné dans un échantillon, ladite méthode étant du type selon laquelle : on fournit une cellule de détection présentant une paroi interne et deux électrodes sur ladite paroi interne, ladite paroi interne présentant deux portions rapprochées en regard Tune de l'autre formant un espace confiné ; on adsorbe un matériel biologique de capture sur une partie active qui s'étend dans ledit espace confiné ; on met ledit échantillon en contact avec ladite partie active, ledit composé biologique donné étant susceptible d'être capturé spécifiquement par ledit matériel biologique de capture ; on met ladite partie active en contact avec un marqueur spécifique, ledit composé biologique donné capturé étant susceptible d'être reconnu par ledit marqueur spécifique et ledit marqueur spécifique étant susceptible de produire un porteur de charge spécifique dudit marqueur dans ledit espace confiné ; et, on mesure la quantité de courant électrique qui traverse lesdites électrodes pour détecter ledit composé biologique donné capturé et reconnu par l'intermédiaire du porteur de charge ; selon l'invention, on fournit deux portions de paroi, mobiles entre une position écartée et une position rapprochée l'une de l'autre pour former lesdites portions de paroi ; et on ménage ladite partie active sur l'une desdites portions de paroi, tandis qu'on porte lesdites portions dans ladite position rapprochée pour former ledit espace confiné après que ledit échantillon et ledit marqueur ont été successivement mis en contact avec ladite partie active.
Ainsi, une caractéristique de l'invention réside, dans la mise en oeuvre de la partie active et de l'échantillon biologique ainsi que du marqueur spécifique dans un espace ouvert délimité par ladite une desdites portions de paroi et ce dans une première phase. Ce n'est qu'ensuite, dans une seconde phase, que l'on rapproche les deux portions de paroi pour former l'espace confiné. Enfin, la mesure du courant électrique peut être réalisée. Selon l'art antérieur, la préparation en préalable à la mesure du courant électrique est réalisée dans un micro- canal et par conséquent dans l'espace confiné, ce qui la rend d'autant plus malaisée. Or1 selon l'invention, durant la préparation de ladite une desdites portions de paroi, la partie active peut être ménagée en déposant simplement à la pipette, une goutte d'un matériel biologique de capture plus communément dénommé sonde de capture, à la surface de ladite une desdites portions de paroi, par exemple à la surface d'une électrode. Cette portion de paroi est ainsi laissée un temps déterminé en atmosphère contrôlée afin de permettre l'adsorption ou l'accrochage de façon covalente de la sonde de capture sur sa surface. Puis, cette surface est rincée afin d'éliminer les sondes de capture non adsorbées. Ensuite, la surface est mise en contact avec un échantillon biologique incorporant un composé biologique à détecter, soit une molécule cible. Après une durée d'incubation donnée, la surface de la portion de paroi est rincée de façon à éliminer les molécules non reconnues spécifiquement par la sonde de capture, puis elle est mise en contact avec le marqueur spécifique dont le surplus est également éliminé par rinçage. Le marqueur spécifique s'est fixé sur les molécules cibles immobilisées par la sonde de capture. Enfin, la partie active est recouverte par l'autre desdites portions de paroi après qu'a été déposé sur cette partie active, un composé en phase aqueuse apte à générer avec le marqueur spécifique, le porteur de charge. Ainsi, l'autre desdites portions de paroi permet d'emprisonner une mince couche de liquide au droit de la surface active. Cette mince couche de liquide est d'autant plus mince que la pression exercée sur l'autre desdites portions de paroi contre l'électrode est forte. Ainsi, les molécules cibles prises en sandwich entre les sondes de capture et les molécules du marqueur spécifique baignent-elles dans une mince couche liquide immobilisée entre les portions de paroi. Par conséquent, dès l'instant où le composé en phase aqueuse a été mis en contact avec la partie active, des porteurs de charge spécifiques du marqueur sont produits, et leur concentration augmente d'autant plus rapidement que la couche de liquide est mince. Ainsi, les porteurs de charge échangeront d'autant plus d'électrons aux électrodes et le courant électrique qui traversera ces dernières sera d'autant plus important. Selon un mode de réalisation de l'invention particulièrement avantageux, lesdites électrodes sont formées sur l'une desdites portions de paroi par une méthode de sérigraphie. Ainsi, on réalise précisément sur l'une desdites portions de paroi, l'impression d'une fine couche d'un matériau conducteur, incorporant par exemple du carbone et selon une forme prédéterminée pour dessiner au moins deux électrodes. Un tel mode de réalisation permet non seulement de réaliser aisément les électrodes, mais aussi de leur donner une même forme lorsque l'on utilise une pluralité de portions de paroi. De la sorte, les mesures des quantités de courant pour lesdites pluralité de portions de paroi recouvertes, peuvent alors être comparées en s'affranchissant des dimensions des électrodes.
En outre, avantageusement on fournit une plaque support sur laquelle on va réaliser la partie active et une plaque de recouvrement pour venir confiner l'espace au regard de ladite partie active et de manière à former respectivement lesdites portions de paroi.
Selon un mode privilégié de réalisation on réserve une pluralité de portions de paroi sur ladite plaque support dans lesquelles on ménage une partie active, de façon à pouvoir former une pluralité de cellules de détection avec la même plaque support.
En outre, on forme parallèlement une pluralité de paires d'électrodes espacées d'une distance correspondant à la distance d'espacement des parties actives, sur ladite plaque de recouvrement. Ladite pluralité de paires d'électrodes est aisément réalisée avec une parfaite reproductibilité, par ladite méthode de sérigraphie. On obtient alors des paires d'électrodes identiques espacées d'une même distance. De la sorte, en recouvrant la plaque support avec la plaque de recouvrement et en veillant à ce que les paires d'électrodes coïncident avec les parties actives correspondantes, on réalise une pluralité de cellules de détection sur une même plaque support.
En outre, lorsque la plaque de recouvrement est rapportée sur la plaque support, on emprisonne une couche d'une solution aqueuse conductrice du courant électrique, entre lesdites portions de paroi. Ainsi, cette solution aqueuse est susceptible de maintenir en position fixe la plaque de recouvrement par le simple jeu des tensions superficielles de la solution, de la plaque support et de la plaque de recouvrement. De la sorte, une couche plane de la solution aqueuse conductrice, d'une épaisseur de l'ordre de la dizaine de μm, par exemple 40 μm, est susceptible d'être emprisonnée entre la plaque de recouvrement et la plaque support.
Par ailleurs, en recouvrant la plaque support avec la plaque de recouvrement portant les électrodes, ces dernières sont mises en contact avec le milieu aqueux au dernier moment, juste avant la mesure. Ainsi, la surface des électrodes est dépourvue de composés chimiques qui pourraient perturber cette mesure.
Selon un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, et ainsi qu'on l'expliquera plus en détail dans la suite de la description, on incrémente une différence de potentiel en fonction du temps entre lesdites électrodes, et on choisit l'intensité maximale en réponse, comme mesure de ladite quantité de courant qui les traverse.
D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après de modes de réalisation particuliers de l'invention, donnés à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels :
- la Figure 1 est une vue schématique de dessus d'un élément de l'installation de détection électrochimique conforme à l'invention ; - la Figure 2 est une vue schématique en perspective d'un autre élément de l'installation de détection électrochimique ;
- la Figure 3 est une vue schématique en perspective montrant les deux éléments illustrés sur les Figures 1 et 2, associés ;
- la Figure 4 est une vue schématique partielle en coupe perpendiculaire des éléments représentés sur la Figure 3, dans une position de mesure ; - la Figure 5 est une courbe voltampérométrique obtenue grâce aux éléments représentés sur la Figure 4 ; et,
- la Figure 6 est une courbe de calibration, d'une intensité en fonction d'une concentration. La méthode de détection électrochimique conforme à l'invention vise à détecter indirectement la présence d'un composé biologique, une molécule complexe, dans un échantillon quelconque. Il s'agit notamment de révéler la présence d'ADN, d'oligonucléotide, d'ARN, de microARN ou de tout autre protéine dans un échantillon donné Le principe est basé sur la reconnaissance affine entre un composé biologique, soit une molécule cible, une sonde de capture constituée d'un matériel biologique de capture et un marqueur spécifique de la molécule cible. Cette dernière est alors prise en sandwich entre la sonde de capture et le marqueur spécifique. Ainsi, conformément à l'invention, dans une première étape de la méthode, la sonde de capture est adsorbée ou accrochée de façon covalente sur une surface déterminée, en déposant une goutte d'une solution comportant le matériel biologique formant la sonde de capture.
Dans une deuxième étape, et après incubation pendant une durée déterminée, la surface est rincée afin d'éliminer les sondes de capture non adsorbées ou non accrochées.
Dans une troisième étape, la surface est mise en contact avec l'échantillon incorporant le composé biologique ou molécule cible. Puis, selon une quatrième étape, la surface est rincée afin d'éliminer les molécules cibles non reconnues spécifiquement et non capturées par la sonde de capture.
Ensuite, dans une cinquième étape, la surface est mise en contact avec le marqueur spécifique ; puis rincée dans une sixième étape afin d'éliminer les molécules du marqueur qui n'ont pas pu être capturées. Enfin, dans une dernière étape le marqueur spécifique, qui a reconnu les molécules cibles capturées et qui s'est fixé dessus, est détecté par l'intermédiaire d'une mesure électrochimique. La présente invention concerne également une installation de détection électrochimique laquelle permet de réaliser cette mesure électrochimique. Des éléments de cette installation, selon un premier mode de mise en oeuvre particulier, sont représentés sur la Figure 1 et ils comportent notamment une plaque 10, dite « plaque de recouvrement », en matière plastique sur laquelle a été sérigraphié un triplet d'électrodes 12. La sérigraphie permet en effet d'appliquer avec une précision de l'ordre du 1/100 de millimètre, à l'état liquide ou pâteux, une composition conductrice du courant électrique qui, une fois solidifiée, constitue une électrode. Ces électrodes comprennent une électrode centrale 14 présentant un disque circulaire 16 d'un diamètre inférieur à 10 mm par exemple de 4 mm et à partir duquel s'étend une portion linéaire de raccordement 18, et deux électrodes périphériques 20 et 22 qui présentent respectivement une partie hémicirculaire 24, 26 qui borde le disque circulaire 16 et une partie linéaire 28, 30 qui longe la portion linéaire de raccordement 18. Bien évidemment, non seulement les deux électrodes périphériques 20, 22 s'étendent espacées de l'électrode centrale 14 sans être en contact avec elle, mais aussi, ces deux électrodes ne se rejoignent pas non plus et ne sont donc pas en contact l'une avec l'autre. Quant à la portion linéaire de raccordement 18 et aux parties linéaires 28, 30, elles sont respectivement reliées à des bornes 32, 34, 36. Ainsi qu'on l'expliquera ci-après, la mesure électrochimique précitée consiste à appliquer un potentiel entre la borne 32 correspondant à l'électrode centrale 14 et l'une ou l'autre des bornes 34, 36 des électrodes périphériques 20, 22 et de mesurer le courant électrique qui les traverse alors.
Il sera montré dans la description qui va suivre, la faisabilité de la méthode, en adoptant les éléments de l'installation précitée. Toutefois, les troisième, quatrième et cinquième étapes précitées sont réalisées en une seule étape, en fournissant une molécule cible c'est-à-dire le composé biologique, qui a déjà été reconnu par un marqueur spécifique. Chaque molécule cible est par conséquent déjà reliée à une molécule de marqueur spécifique.
La Figure 2 représente une plaque support 38 sur laquelle la sonde de capture, ou le matériel biologique de capture qui est ici un anticorps IgG1 est adsorbé sur une portion de surface. Pour cela, une goutte de 10μL d'une solution d'IgG dans un tampon PBS, décrit ci-après, est déposée et elle s'étend alors sur une portion de surface référencée S de la plaque support 38, valant environ 0,125 cm2. Le tampon PBS est un tampon phosphate à pH 7,4 contenant : NaH2PO4 4.3 mM (milli-mole par litre), Na2HPO4I 5.1 mM, et NaCI 50 mM. La plaque support 38 est laissée à incuber pendant deux heures en atmosphère humide.
La portion de surface S de la plaque support 38 est ensuite rincée à trois reprises par simple trempage dans une solution de PBS ne contenant pas d'anticorps IgG. La portion de surface S alors recouverte de sondes de capture, constitue une partie active de la plaque support 38.
Puis, la plaque support 38 est plongée dans une solution tamponnée d'un volume de 5 mL contenant la molécule cible déjà reconnue par le marqueur spécifique. Le marqueur est une enzyme, l'alcaline phosphatase, chimiquement modifiée avec l'ajout d'un anti-lgG qui lui, correspond à la molécule cible. La concentration de la solution d'incubation précitée correspond alors à la concentration en molécule cible de l'échantillon biologique. La faisabilité de la méthode sera démontrée ci-après avec cinq concentrations différentes variant de 5.10"15 à 1000. 10"15 M (mole par litre). En outre, le tampon de la solution est du Tris (Tris-(hydroxymethyl) aminomethane) à 0.1 M TB (Tris Buffer) de pH 9.0, contenant du MgCb à 1 mM. Le temps d'incubation est de 12 heures de façon à atteindre un état d'équilibre pour la formation du complexe IgG-anti-lgG-marqueur. La rapidité avec laquelle cet état d'équilibre est atteint dépend (i) de la constante d'équilibre définie par le rapport des concentrations à l'équilibre des différentes espèces, (ii) de la diffusion du marqueur associé à l'anti-lgG et (iii) du rapport entre la concentration volumique du marqueur associé, la surface S et de la concentration surfacique de PIgG, c'est-à-dire de la quantité d'anticorps IgG adsorbée sur la portion de surface S. Ce temps peut être réduit, on travaillera alors hors équilibre. Ensuite, la surface est rincée afin d'éliminer le marqueur associé non reconnu spécifiquement par I1IgG et ceci par simple trempage successif dans une solution tampon TB.
Alors, et ainsi que l'illustre maintenant la Figure 3, une goutte 40 de 4μL contenant le substrat de l'enzyme marqueur, est déposée sur la portion de surface S. Le substrat de l'enzyme marqueur est ici le 2,6 di- chloro-amino-phényl-phosphate (2,6-DCPAPP) 1 mM dans une solution tampon TB.
Puis, cette goutte est écrasée en appliquant la plaque de recouvrement 10 sur la plaque support 38, de façon que la portion de surface S soit recouverte par le disque circulaire 16 et les parties hémicirculaires 24, 26 des électrodes 12.
Sur la Figure 4, on retrouve ainsi illustrées, la plaque support 38 et la plaque de recouvrement 10 qui définissent un espace confiné 44 dans lequel est emprisonnée une fine couche de solution d'une épaisseur d comprise entre 20 μm et 100 μm, 40μm par exemple. Ainsi, cette fine couche est emprisonnée entre une première portion de paroi interne 41 , correspondant à la surface de la plaque support 38 et une seconde portion de paroi interne 43, correspondant à la surface de la plaque de recouvrement 10. La plaque de recouvrement 10 est laissée libre, et elle est maintenue en position fixe par rapport à la plaque support 38 par les simples forces tensio-actives qui agissent entre la solution, la plaque de recouvrement 10 et la plaque support 38. Cette fine couche de solution emprisonnée, présente alors une partie située au droit de la portion de surface S, laquelle partie définit un volume de forme sensiblement cylindrique, d'une épaisseur de 40 μm pour reprendre l'exemple précité d'un diamètre voisin de 5 mm. C'est dans ce volume que s'accumule alors rapidement le produit généré par l'enzyme et qui est le 2,6 di-chloro- amino-phénol sous sa forme réduite. Ce produit constitue un porteur de charges électrochimiquement actif. La vitesse d'accumulation de ce produit est fonction de la concentration surfacique en complexe IgG-anti- IgG-marqueur et par conséquent de la concentration initiale en molécule cible associée au marqueur spécifique.
La détermination de la concentration de la molécule produite par l'activité enzymatique, à un instant t, est réalisée par une mesure électrochimique et précisément, en mesurant le courant électrique qui circule dans l'électrode centrale 14 et l'une des électrodes périphériques 20, 22 pour un potentiel donné appliqué entre ces électrodes. La technique la plus sensible retenue est ici la voltamètrie cyclique. En l'espèce, le potentiel est incrémenté, puis décrémenté de 0,1 mVolt (milli- VoIt) par seconde, entre -0,4 et 0,6 V. On obtient alors une courbe intensité / /potentiel v telle qu'illustrée sur la Figure 5. L'extremum de la courbe correspondant à la valeur maximale imax du courant électrique exprimé en μA (micro-ampère) qui traverse les électrodes, durant le balayage en potentiel, est alors enregistré car il correspond à la sensibilité électrochimique maximale de détection.
Ainsi, cinq essais ont été réalisés avec cinq solutions distinctes présentant des concentrations en marqueur enzymatique associé à un anti-lgG, respectivement de 0, 5 fM (5.10"15 mole par litre), 20 fM, 150 fM et 1000 fM. Pour ces cinq essais, la mesure électrochimique est réalisée 20 minutes après avoir déposé une goutte du substrat de l'enzyme marqueur puis recouvert cette goutte avec la plaque de recouvrement 10. Les résultats obtenus sont ainsi consignés dans le tableau ci- dessous.
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Des considérations théoriques non développées ici, montrent que la valeur du courant électrique varie linéairement en fonction de la concentration en molécules cibles associées au marqueur enzymatique.
La Figure 6, où les valeurs du tableau ci-dessus ont été reportées, illustre cette variation et définit ainsi une courbe de calibration. De la sorte, il est aisé en mesurant le courant électrique qui traverse les électrodes pour une valeur de potentiel correspondant à la valeur maximale de courant électrique, et en reportant ensuite cette valeur maximale sur la courbe de calibration représentée sur la Figure 6 de déduire la concentration molaire correspondante en molécules cibles associées.
En outre, si l'on souhaite améliorer le seuil de détection de la molécule cible, ou bien le temps nécessaire à la détection, il est possible de forcer le rapprochement de la plaque de recouvrement 10 et de la plaque support 38 à une distance d inférieure à 40 μm. La production de molécule produite par l'activité enzymatique, ne dépend que de la concentration en composé biologique dans l'échantillon. Elle est par conséquent identique si le volume de l'espace confiné est plus faible, en revanche la concentration, elle, augmente d'autant plus rapidement. Et par conséquent, puisque l'intensité du courant électrique qui traverse les électrodes dépend de la concentration en molécules produites, le composé biologique cible sera d'autant plus rapidement détectable. On observera que la distance d entre les deux plaques, ou le rapport surface active sur le volume qui s'étend entre les deux plaques au droit de la surface active, permet d'ajuster la dynamique de la réponse de l'installation de détection, dans la mesure où l'ensemble des sites de captures ne sont pas saturés par la molécule cible.
Bien évidemment, la mise en oeuvre de la méthode décrite ci- dessus selon le mode de mise en oeuvre particulier, dans lequel la molécule cible est directement associée à son marqueur, est identiquement transposable à l'identification d'une molécule cible dans un échantillon biologique donné. Les troisième, quatrième et cinquième étapes sont alors rétablies distinctement.
Par ailleurs, selon un deuxième mode particulier de réalisation de l'invention non représenté, les électrodes sont, non pas sérigraphiées sur la plaque de recouvrement, mais à l'opposé sur la plaque support. Ce deuxième mode de réalisation est avantageux lorsque les électrodes sont insensibles aux espèces chimiques ou aux composés biologiques qui pourraient s'accumuler à sa surface. Car en effet, dans ce cas il est plus aisé de faire coïncider la position de la surface active avec celle des électrodes, puisqu'il suffit d'appliquer les solutions sur les électrodes disposées sur la plaque support.
En outre, selon un troisième mode particulier de réalisation non représenté, une pluralité de cellules électrochimiques sont formées sur une même plaque support. Ainsi par exemple, on réalise tout d'abord une pluralité de triplets d'électrodes alignées sur la plaque support, par exemple quatre triplets, chaque triplet correspondant aux électrodes illustrées sur la Figure 1. On réalise ensuite sur la plaque support les différents dépôts au niveau de chacune des électrodes centrales desdits triplets pour préparer la mesure. Et après avoir déposé une goutte de solution contenant le substrat de l'enzyme marqueur sur chacun des dépôts, on recouvre la plaque support avec une seule lamelle de verre. Ainsi on réalise simultanément une mesure de l'intensité du courant électrique qui traverse les électrodes. De la sorte, on peut soit réaliser une série de mesures pour un même échantillon biologique et être alors certain de la présence de la molécule cible ou alors, réaliser simultanément plusieurs mesures de différents échantillons.
Selon une variante de réalisation de l'invention particulièrement avantageuse, visant à augmenter la sensibilité de la méthode et ce, dans le cas où les porteurs de charges peuvent être produits par une enzyme, on démultiplie la production des porteurs de charges. Pour ce faire, on utilise un support, par exemple des nanoparticules, des dendrimères ou encore des «branched » ADN, sur lesquels une pluralité d'enzymes sont présentes ; et préférentiellement un grand nombre. Ainsi pour chaque composé biologique capturé, il y aura une multitude d'enzymes qui produiront le porteur de charges et par conséquent l'augmentation de la concentration de celui-ci dans l'espace confiné se fera plus rapidement. Des dendrimères sur lesquels plus d'une centaine de phosphatases alcalines sont accrochées, existent dans le commerce. Selon une autre variante de réalisation de l'invention, toujours dans le but d'augmenter la sensibilité de la détection, il est possible d'amplifier le signal électrochimique par un recyclage redox du produit électrodétectable. Ceci peut être réalisé soit par une autre électrode à un potentiel approprié soit par une enzyme, une enzyme redox par exemple, en présence de son substrat. Dans le cas d'un recyclage par une autre électrode, l'amplification du signal est d'autant plus forte que les électrodes sont proches l'une de l'autre. Il convient alors d'utiliser un réseau d'électrodes interdigitées. Dans le cas d'un recyclage par une enzyme redox, celle-ci peut être soit laissée à réagir dans le film de solution qui constitue l'espace confiné, soit immobilisée à la surface de l'électrode de travail, soit greffée sur des particules. Par exemple, il peut être pratique d'avoir la partie active sur une des parois, et sur l'autre paroi, les électrodes modifiées avec cette enzyme redox. Dans l'exemple détaillé ci-dessus la détection est basée sur une activité enzymatique. Mais la production du porteur de charge peut également résulter, selon encore une autre variante, de la dissolution d'une particule métallique. Par exemple, le marqueur est une particule d'or qui va être dissoute après l'étape de confinement. Sa dissolution est réalisée par la l'électrogénération de Br2 dans un milieu contenant du HBr et sa détection est réalisée par son électrodépostion sur l'électrode. On pourra notamment se référer au document FR 00 00814, lequel divulgue un dosage immunologique à l'aide de marqueurs colloïdaux métalliques.
Selon une dernière variante de réalisation, la surface active peut être ménagée sur des particules magnétiques. Ainsi, ces particules magnétiques sont traitées de manière à assurer la capture puis le marquage de la molécule cible. Ensuite, les particules sont déposées sur l'une des deux parois et, après formation de l'espace confiné à l'aide de la deuxième paroi, la révélation et la mesure électrochimique sont réalisées. L'avantage d'une telle variante réside dans la possibilité de réaliser la structure « sandwich » indépendamment de la mise en oeuvre des deux parois.

Claims

REVENDICATIONS
1. Installation de détection électrochimique pour détecter la présence d'un composé biologique donné dans un échantillon, ladite installation comprenant une cellule de détection présentant une paroi interne et deux électrodes (14 ; 20, 22) sur ladite paroi interne, ladite paroi interne présentant deux portions (41 , 43) rapprochées en regard l'une de l'autre pour former un espace confiné (44), et une partie active (S) qui s'étend dans ledit espace confiné et sur laquelle est adsorbé un matériel biologique de capture, ledit composé biologique donné étant susceptible d'être capturé spécifiquement par ledit matériel biologique de capture lorsque ledit échantillon est mis en contact avec ladite partie active (S)1 ledit composé biologique donné capturé étant susceptible d'être reconnu par un marqueur spécifique lorsque ledit marqueur spécifique est mis en contact avec ladite partie active, ledit marqueur spécifique étant susceptible de produire un porteur de charge spécifique dudit marqueur dans ledit espace confiné, ledit composé biologique donné capturé et reconnu étant détecté ensuite par l'intermédiaire du porteur de charge en mesurant la quantité de courant électrique qui traverse lesdites électrodes ; caractérisée en ce que lesdites portions de paroi (41 , 43) sont mobiles l'une par rapport à l'autre entre une position écartée et une position rapprochée ; et en ce que ladite partie active (S) est ménagée sur l'une desdites portions de paroi (41) lorsque lesdites portions de paroi sont dans ladite position écartée pour mettre successivement en contact ledit échantillon et ledit marqueur avec ladite partie active (S), tandis que lesdites portions de paroi (41 , 43) sont ensuite portées dans ladite position rapprochée pour former ledit espace confiné (44) et mesurer la quantité de courant électrique qui traverse lesdites électrodes.
2. Installation de détection électrochimique selon la revendication 1 , caractérisée en ce que lesdites électrodes (14 ; 20, 22) sont situées sur l'une desdites portions de paroi (41).
3. Installation de détection électrochimique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdites portions de paroi (41 , 43) sont respectivement formées par une plaque support (38) formant ladite une desdites portions de paroi et une plaque de recouvrement (10) pour recouvrir ladite une desdites portions de paroi.
4. Installation de détection électrochimique selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite plaque support (38) présente une pluralité de portions de paroi sur lesquelles sont respectivement ménagées des parties actives (S) de façon à former une pluralité de cellules de détection.
5. Installation de détection électrochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que lesdites portions de paroi (41 , 43) sont planes.
6. Installation de détection électrochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdites deux électrodes (14 ; 20, 22) sont situées sur l'autre desdites portions de paroi (43).
7. Méthode de détection électrochimique pour détecter la présence d'un composé biologique donné dans un échantillon, ladite méthode étant du type selon laquelle :
- on fournit une cellule de détection présentant une paroi interne et deux électrodes (14 ; 20, 22) sur ladite paroi interne, ladite paroi interne présentant deux portions (41, 43) rapprochées en regard l'une de l'autre formant un espace confiné (44) ;
- on adsorbe un matériel biologique de capture sur une partie active (S) qui s'étend dans ledit espace confiné (44) ;
- on met ledit échantillon en contact avec ladite partie active, ledit composé biologique donné étant susceptible d'être capturé spécifiquement par ledit matériel biologique de capture ; - on met ladite partie active en contact avec un marqueur spécifique, ledit composé biologique donné capturé étant susceptible d'être reconnu par ledit marqueur spécifique et ledit marqueur spécifique étant susceptible de produire un porteur de charge spécifique dudit marqueur dans ledit espace confiné ; et,
- on mesure la quantité de courant électrique qui traverse lesdites électrodes pour détecter ledit composé biologique donné capturé et reconnu par l'intermédiaire du porteur de charge; caractérisée en ce qu'on fournit deux portions de paroi (41 , 43), mobiles entre une position écartée et une position rapprochée l'une de l'autre ; et en ce qu'on ménage ladite partie active (S) sur l'une desdites portions de paroi (41), tandis qu'on porte lesdites portions dans ladite position rapprochée pour former ledit espace confiné (44) après que ledit échantillon et ledit marqueur ont été successivement mis en contact avec ladite partie active.
8. Méthode de détection électrochimique selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'on forme lesdites électrodes (14, 20, 22) sur l'une desdites portions de paroi (41) par une méthode sérigraphique.
9. Méthode de détection électrochimique selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu'on fournit une plaque support (38) et une plaque de recouvrement (10) pour former respectivement lesdites portions de paroi (41 , 43).
10. Méthode de détection électrochimique selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'on réserve une pluralité de portions de paroi sur ladite plaque support (38) dans lesquelles on ménage une partie active, de façon à former une pluralité de cellules de détection.
11. Méthode de détection électrochimique selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'on forme une pluralité de paires d'électrodes sur ladite plaque de recouvrement (10).
12. Méthode de détection électrochimique selon l'une quelconque des revendications 7 à 11 , caractérisée en ce qu'on emprisonne une couche d'une solution aqueuse entre lesdites portions de paroi.
13. Méthode de détection électrochimique selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, caractérisée en ce qu'on incrémente la différence de potentiel en fonction du temps entre lesdites électrodes pour mesurer ladite quantité de courant qui les traverse.
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