WO2008072741A1 - 癌の検査方法、癌の検査用キット、及び癌の検査薬 - Google Patents

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Junn Yanagisawa
Shigeyasu Ichihara
Ryuichi Hirota
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Junn Yanagisawa
Shigeyasu Ichihara
Ryuichi Hirota
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • Cancer screening method cancer screening kit, and cancer screening drug
  • the present invention relates to a biological sample inspection technique, and more particularly to a cancer inspection method, a cancer inspection kit, and a cancer inspection drug.
  • the present invention provides a cancer testing method, a cancer testing kit, and a cancer testing drug using a single protein that interacts with many proteins involved in canceration of cells as a tumor marker. Doing that is to do.
  • the first feature of the present invention is to measure the ⁇ 3 ⁇ 4 of 3 ⁇ 4? ⁇ 0 chip (CHIP: Carb oxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein) with intracellular ubiquitin ligase.
  • the gist of the present invention is a method for examining cancer including
  • the second feature of the present invention is summarized as a method for evaluating the dependency of a cell on a scaffold, including measuring the expression level of CHIP in the cell.
  • the third feature of the present invention is summarized as a method for evaluating the anoikis resistance of a cell, comprising measuring the expression level of CHIP in the cell.
  • the fourth feature of the present invention is summarized as a method for evaluating invasiveness of a cell, including measuring the expression level of CHIP in the cell.
  • a fifth feature of the present invention is that it is a cancer test kit containing a reagent for measuring the expression level of intracellular CHIP.
  • the sixth feature of the present invention is that it is a cancer test drug comprising a CHIP antibody.
  • a seventh feature of the present invention includes ubiquitin comprising measuring the expression level of CHIP in a cell.
  • the main point is that it is a method for examining abnormalities in the proteasome system.
  • a cancer testing method using a single protein that interacts with many proteins involved in cell carcinogenesis as a tumor marker, a cancer testing kit, and a cancer testing drug can be provided.
  • FIG. 1 is a graph showing the relative expression level of intracellular CHIP according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an image showing the expression level of intracellular CH IP according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the expression level of intracellular CH IP according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is an image showing the expression level of intracellular CHIP according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is an image showing a cell colony according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the number of cells per field of view according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a first graph showing the anchorage dependence of cells according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a second graph showing the dependence of the cells on the scaffold according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is an image showing the expression level of intracellular phosphorylated Akt according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is an image showing invasiveness of cells according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a first graph showing invasiveness of cells according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a second graph showing the invasiveness of cells according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a graph showing the tumor weight of a mouse according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a first graph showing the tumor volume of a mouse according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 15 is a second graph showing the tumor volume of the mouse according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 16 is a third graph showing the tumor volume of the mouse according to the embodiment of the present invention.
  • a chip (CHIP: Carboxyl ⁇ t erminu s of Hsc70 interacting protein) is a ubiquitin ligase that binds to Hsc70, a chachelon protein, and heat shock protein (HSP) 90, a chaperone protein.
  • CHIP is found in the cytoplasm as a co-chaperon that binds to Hsc70.
  • CHIP has a repeat structure called TPR (tetratricopeptide repeat) that interacts with Hsc70 on the N-terminal side.
  • CHIP has a characteristic structure of ubiquitin ligase called U_box on the C-terminal side.
  • Cystic-Fibrosis Tr is a ubiquitin ligase C HIP ansmenbrane-conductande Regulator) Gnorecoconoretinoid receptor (GR), epidermal growth factor receptor (HER2: human epidermal growth factor receptor-2 or ErbB2), and mouth gene receptor, signaling factor Smad, Perl receptor, Estrogen receptor (ER), estrogen receptor ⁇ (ERo, and mutant p53 protein etc .: ⁇
  • HSP90 an inhibitor of HSP90
  • 17-AAG allylaminogeldanamycin
  • a derivative of geldanamycin with reduced liver toxicity are anticancer agents. Therefore, some of the client proteins that require HSP90 to form a three-dimensional structure include proteins involved in cell carcinogenesis. If HSP90 is inhibited, it is involved in cell carcinogenesis. It is considered that the protein cannot form a correct three-dimensional structure and loses its function.
  • HSP90 client proteins include proteins involved in cell carcinogenesis such as HER2, ERa, and mutant p53 proteins.
  • the inventor has found that the decrease in CHIP expression and functional decline is a client protein of HSP90, leading to excessive accumulation of proteins involved in canceration of cells, resulting in malignant transformation of cells. Thought to bring. Therefore, in the process of studying the biological function of CHIP, the inventor correlated the malignancy of cancer cells with the expression level of CHIP in cancer cells, and the decrease in the expression level of CHIP I started to see cancer malignancy. Therefore, it is possible to examine the malignancy of cancer cells by measuring the expression level of intracellular CHIP. It is also possible to examine whether or not an abnormality has occurred in the intracellular ubiquitin-proteasome system. Whether the cell is cancerous by combining the measurement of the expression level of CHIP with the measurement of the expression level of other proteins involved in the canceration of cells such as HER2, ER CK, and mutant p53 protein. You can inspect it.
  • the expression level of CHIP in cells collected from mammals such as humans is, for example, Western blotting, immunoprecipitation method, enzyme immunoassay (ELISA) using anti-CHIP antibody or anti-CHIP antibody fragment. ) Method, radioimmunoassay (RIA) method, and protein analysis methods such as immune tissue staining.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • protein analysis methods such as immune tissue staining.
  • the antibody either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used.
  • the expression level of intracellular CHIP may be measured by measuring the expression level of mRNA encoding CHIP in the cell (CHIP mRNA).
  • the expression level of CHIP mRNA in the cell is, for example, reverse transcription polymer. It can be measured by nucleic acid analysis methods such as the polymerase chain reaction (RT-PCR) method, in situ PCR method, northern blotting method, in situ hybridization method, and DNA chip method.
  • the malignancy of cancer cells is evaluated by the degree of differentiation of cancer cells.
  • Normal cells can form organ structures with a high degree of differentiation and can function. However, the degree of differentiation decreases in cancer cells.
  • the degree of differentiation of cancer cells is clinically evaluated by the anchorage dependency, anoikis resistance, metastasis invasion ability, or proliferation ability of cancer cells. The higher the grade, the more cancer cells lose their anchorage dependence.
  • the higher the malignancy the higher the cancer cell's anonyx resistance, metastasis invasion ability, and proliferation ability.
  • Factors that cause cancer cells to lose anchorage dependence factors that acquire anoikis resistance, factors that acquire metastatic invasive ability, and genetic factors that acquire proliferative ability are considered to be different.
  • the inventor has found that the ability to reduce the expression level of CHIP results in the loss of anchorage dependence of cancer cells, and the acquisition of anoikis resistance, metastasis invasion ability, and proliferation ability. Therefore, by measuring the expression level of CHIP in the cell, it is possible to evaluate each of the cell anchorage dependency, anoikis resistance, metastasis invasion ability, and proliferation ability. Specifically, if the expression level of CHIP in the cell is decreased as compared with that in the normal state, the cell has lost anchorage dependency, or has acquired anoikis resistance, metastasis invasion ability, and proliferation ability. The ability to evaluate is S kurakura.
  • the inventor has also produced a cell line in which the expression of CHIP is suppressed.
  • the cell lines in which the expression of CHIP is suppressed are less anchorage-dependent than the parental MCF7 cells and have higher anoikis resistance, metastasis invasion ability, and proliferation ability compared to the parental MCF7 cells.
  • cell lines with suppressed expression of CHIP can be used to search for drugs that suppress cancer invasion and metastasis, or to elucidate CHIP client proteins.
  • a cell line in which the expression of CHIP is suppressed can also be used as a control cell when measuring the amount of CHIP in cells of a tissue suspected of being cancerous.
  • CHIP Cellular cell line strains in which the expression of these are suppressed are useful. .
  • Test method is a cancer cancer test method that detects only mutated mutations in the pp5533 protein in the subcellular vesicles. There was a method. . Many genetic genes are involved in the development of cancerous cells in cell vesicles. .
  • HHEERR22 Aaru-ai or EERR aa is used to measure the actual amount of EERR aa onset, or pp5533 Even if you detect and detect worms, it is important to accurately check whether or not the cell vesicles have become cancerous. It was difficult and difficult. .
  • CCHHIIPP is a ubiquityquitin that resolves both the HHEERR22, EERR aa, and mutated variants pp5533. It is Nuririgagaseze. . Therefore, the actual expression amount of CCHHIIPP is expressed as the expression amount of each individual protein protein that is decomposed by CCHHIIPP such as HHEERR22 and EERR aa.
  • breast cancer carcinoma cell cysts ((MMCCFF77, MMDDAA--MMBB--223311)), liver cancer carcinoma cell cysts ((HH mark GG22)), uterine cervix cancer Cancer cells ((HHeeLLaa)), lung lung cancer cells (HHII 229999)), and large intestine cancer cells ((HHCC TTll ll66, LLss——LLMM44)) (Aacciidd gguuaanniiddiinniiuumm tthhiiooccyyaannaattee—— pphheennooll—— cchhlloorrooffoorrmm eexxttrraa ccttiioonn)) All RRNNAA ((ttoottaall RRNNAA)) were extracted and extracted.
  • a comparative Ct method was used to compare multiple types of human cancers.
  • the relative expression level of CHIP mRNA in each of the derived cultured cells was quantified using breast cancer cells (MCF7) as a calibrator sample.
  • the relative expression level of CHIP mRNA in breast cancer cells is 1
  • the relative expression level of CHIP mRNA in breast cancer cells is 0.68
  • liver cancer cells H mark G2
  • the relative expression level of CHIP mRNA is 0.78
  • the relative expression level of CHIP mRNA in cervical cancer cells is 0.84
  • the relative expression level of CHIP mRNA in lung cancer cells is 1.14
  • large intestine cancer cells HCT116
  • the relative expression level of CHIP mRNA was 1.06
  • the relative expression level of CHIP mRNA in colorectal cancer cells was 2.37.
  • the relative expression level of CHP mRNA in normal tissue-derived cells was 62.
  • CHIP transferred to a nitrocellulose membrane was detected as shown in FIG. 2 using a CHIP polyclonal antibody labeled with a chemiluminescent reagent. Furthermore, the fluorescence intensity of the detected chemical fluorescent reagent was plotted in the graph shown in FIG.
  • the expression level of CHIP in breast cancer cells is based on the expression level of CHIP in breast cancer cells (MCF7).
  • MDA-MB-231) and liver cancer cells H mark G2
  • MDA-MB-2311 and liver cancer cells H mark G2
  • MDA-MB-2311 and liver cancer cells H mark G2
  • MDA-MB-2311 and liver cancer cells H mark G2
  • MCF7 breast cancer cells
  • HLa cervical cancer cells
  • HCT116 colon cancer cells
  • lung cancer cells H1299
  • Colorectal cancer The expression level of CHIP in cells (LS-LM4) was higher than the expression level of CHIP in breast cancer cells (MCF7).
  • the expression level of CHIP in each cell was almost proportional to the expression level of CHIP mRNA in each cell shown in FIG.
  • the expression level of CHIP in each of a plurality of types of human cancer-derived cultured cells is compared with the expression level of CHIP in cells derived from normal tissues (HEK293E). There were few. Therefore, it was verified that it is possible to examine whether or not a cell is cancerous by measuring the expression level of CHIP in the cell.
  • RNAi MCF-7 Breast cancer cells (MCF7) in which the expression of CHIP was suppressed were prepared as mutant cells (CHIP RNAi MCF-7) by RNA interference (RNAi) method.
  • RNAi RNA interference
  • a synthetic nucleotide corresponding to the target sequence cac gacaag tacatggcgga of the gene sequence ORF (Open Reading Frame) of the gene sequence encoding CHIP was cloned into the pSINsi vector of Takara Bio Inc., and the plasmid was prepared. .
  • the plasmid was transfected into packaging cells (293 gp), and the supernatant of the packaging cell culture medium was collected as a recombinant retrovirus vector solution for infection.
  • MCF7 breast cancer cells
  • polybrene was added to the culture solution to a final concentration of mg I ml.
  • G-418 sulfate was added to the culture solution to a final concentration of 1 mg / ml.
  • Culture of breast cancer cells (MCF7) was continued for about 2 weeks, and four neomycin-resistant breast cancer cell (MCF7) lines were selected as infected cell lines.
  • a plasmid was prepared by cloning a synthetic nucleotide corresponding to Ijgctacacaaatcagcgatt from the 2400th to 2418th positions of the ORF of the gene sequence encoding ⁇ -galatatosidase (LacZ) into the pSINsi vector. Then, a breast cancer cell (MCF7) strain in which LacZ expression was suppressed by the RNAi method was prepared as a control cell (LacZ RNAi MCF-7) strain.
  • Proteins were extracted from the four infected cell lines and control cell (LacZ RNAi MCF-7) obtained, and the expression level of CHIP was detected by Western blotting using an anti-CHIP polyclonal antibody. As shown in FIG. 4, the expression level of CHIP was decreased in all four infected cell lines compared to the control cell (LacZ RNAi MCF-7) line. However, the degree of reduction was different for each infected cell line. Each of the four infected cell lines that were confirmed to have reduced CHIP expression by Western blotting compared to control cells (LacZ RNAi MC F-7) It was.
  • the anchorage dependence of the mutant cell (CHIP RNAi MCF-7) strain was examined using the colony-forming ability in a soft agar medium as an index.
  • a sterilized 1% (mass / volume) Sigma Noble Agar solution was mixed with an equal amount of 2-fold concentrated DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) to prepare a mixed solution.
  • DMEM contains FBS (Fetal Bovine Serum), gnoretamine, and antibiotics.
  • the prepared mixed solution (2 ml) was placed in a 6-well plate and allowed to stand at room temperature and solidified to obtain the lower layer medium.
  • RNAi MCF-7 CHIP RNAi MCF-7
  • control cells LacZ
  • DMEM medium containing 10% volume (volume / volume) of serum
  • RNAi MCF-7 a suspension of mutant cells
  • HuC RNAi MCF-7 a suspension of control cells
  • a medium was used.
  • the upper cell culture medium was placed on the lower culture medium and allowed to solidify at room temperature. Thereafter, the 6-well plate was cultured at 37 ° C. for about 2 weeks, and the formed colonies were photographed using a KEYENCE computer-equipped microscope.
  • the mutant cells (CHIP RNAi MCF-7) lost anchorage dependence and the number of colonies formed was significantly increased compared to the control cells (LacZ RNAi MCF-7).
  • the number of colonies formed with a diameter larger than 100 per visual field of the microscope had a negative correlation with the expression level of CHIP. Therefore, there was a positive correlation between the cell anchorage dependency and the expression level of CHIP. Therefore, it was verified that the anchorage dependence of the cells can be evaluated by measuring the expression level of CHIP in the cells.
  • the mutant resistance of the mutant cell (CHIP RNAi MCF-7) and the breast cancer cell (MDA-MB-231) was verified.
  • Poly-HEMA solution Sigma in which polyhydroxyethyl methacrylate (Poly-HEMA) is dissolved in ethanol at a concentration of 40 mg / ml.
  • Poly-HEMA polyhydroxyethyl methacrylate
  • each cell culture dish contains 5 ml of medium containing 1 x 10 6 mutant cells (CHIP RNAi MCF-7) or 1 x 10 6 breast cancer cells (MDA-MB-231). 5 ml of the culture solution was added, and suspension culture was performed at 37 ° C for 48 hours.
  • mutant cells As a control, 1 ⁇ 10 6 mutant cells (CHIP RNAi MCF_7) or 1 ⁇ 10 6 breast cancer cells (MDA-MB-231) were placed in a cell culture dish that was not coated with Poly-HEMA solution. A seeded material was prepared. After the culture, mutant cells (CHIP RNAi MCF-7) and breast cancer cells (MDA-MB-231) were recovered, and the number of viable cells was measured by the trypan blue staining exclusion method. As shown in FIG. 7, wild type breast cancer cells (MCF7) were apoptotic in suspension culture and the proportion of viable cells decreased. Control cells (LacZ RNAi MCF-7) also caused apoptosis in suspension culture and the proportion of viable cells decreased.
  • MCF7 wild type breast cancer cells
  • Control cells (LacZ RNAi MCF-7) also caused apoptosis in suspension culture and the proportion of viable cells decreased.
  • the mutant cells did not undergo apoptosis even in suspension culture, and the rate of decrease in viable cells was low. Therefore, the mutant cells (CHIP RNAi MCF-7) had acquired anoikis resistance that did not cause apoptosis.
  • breast cancer cells MDA-MB-231
  • MCF7 breast cancer cells
  • Akt serine 'threonine kinase
  • Western blotting antibodies include anti-phosphorylated Akt antibody (cell signaling technology company, catalog number 9271), which is an Akt antibody phosphorylated on 473 residues of serine (Ser), and anti-Akt antibody ( A cell signaling technology company, catalog number 9272) was used.
  • control cells suspended in cell culture dishes coated with Poly-HEMA solution In LacZ RNAi MCF-7
  • phosphorylated Akt that inhibits apoptosis was decreased.
  • mutant cells (CHIP RNAi MCF-7) were coated with a Poly-HEMA solution! /, Nana! / Even if they were cultured in a cell culture dish, they were coated with a Poly-HEMA solution. Even when suspended in cell culture dishes, the expression level of phosphorylated Akt did not change. Therefore, it was verified that the anoikis resistance of a cell can be evaluated by measuring the expression level of CHIP in the cell.
  • the invasion ability of the mutant cells was verified by invasion analysis.
  • the mutant cells (CHIP RN Ai MCF-7) are detached from the cell culture dish by trypsin digestion, and the cell count is 3 ⁇ 4 X 10 5 cells / ml in a medium containing serum with a volume concentration of 0.2% (volume / volume). The cell suspension was prepared by resuspension.
  • the medium was removed from the insert and the well, the medium containing serum with a volume concentration of 10% (volume / volume) was added to the well, and 0.5 ml of the cell suspension was added to the insert.
  • the 24well plate was then placed in a CO incubator and incubated at 37 ° C for 24 hours.
  • the insert comprises a porous membrane coated with a thin film of Matrigel basement membrane matrix and provided with pores with a diameter force of m. During incubation, non-invasive cells are unable to migrate through the Matrigel basement membrane matrix membrane and remain on the Matrigel basement membrane matrix membrane. In contrast, invasive cells infiltrate the thin and porous membranes of the Matrigel basement membrane matrix and migrate to the lower surface of the porous membrane.
  • non-invasive cells in the insert were removed using a cotton swab and washed briefly with PBS (Phosphate Buffered Saline). Thereafter, the insert was transferred to a plate containing 0.5 ml of a paraformaldehyde (PFA) solution having a volume concentration of 4% (volume / volume) and allowed to stand at room temperature for 15 minutes to fix invasive cells.
  • PFA paraformaldehyde
  • the insert was washed with PBS for 5 minutes three times, and the infiltrating cells were stained with crystal violet, and the number of infiltrating cells was counted with a microscope. At least 5 views The number of cells was counted from the field image. Under the same conditions, the number of infiltrating cells in the control cells (LacZ RNAi MCF-7) was counted. Photograph of infiltrating cells in Fig. 10 As shown in the image, compared to the control cells (LacZ RNAi MCF-7), the expression level of CHIP is less derived from the second and fourth infected cell lines. Mutant cells (CHIP RNAi MC F-7) showed more invasiveness. As shown in Fig.
  • CHIP mutant cells derived from the fourth infected cell line 186 times as many as the control cells (LacZ RNAi MCF-7).
  • RNAi MCF-7 infiltrated the thin and porous membranes of the Matrigel basement membrane matrix.
  • the expression level of CHIP is low compared to breast cancer cells (MCF7)! /
  • MDA-MB-23 1 The metastasis invasion ability of breast cancer cells (MDA-MB-23 1) is the same as that of mutant cells (CHIP RNAi MCF-7)
  • the conditions were used to verify with inversion.
  • MC F7 1.67 ⁇ 1.15 breast cancer cells
  • 630 ⁇ 55 breast cancer cells (MD A-MB-231) Infiltrated the matrix membrane and the porous membrane.
  • the resultant force of breast cancer cells (MDA-MB-231) was also shown to decrease the expression level of CHIP and increase the invasiveness of the cells.
  • mice lacking T cell function were raised for one week.
  • 10 mice lacking T cell function were transferred to the MDA-MB-231 group to which breast cancer cells (MDA-MB-231) were transplanted and the MCF-7 group to which breast cancer cells (MCF-7) were transplanted.
  • MDA-MB-231 group MDA-MB-231 group to which breast cancer cells
  • MCF-7 group MCF-7 group to which breast cancer cells (MCF-7) were transplanted.
  • And 5 of each were rubbed.
  • the body weight distribution of mice lacking T cell function grouped in the MDA-MB-231 group was approximately equal to the weight distribution of mice lacking T cell function grouped in the MCF-7 group.
  • mice At 5 weeks of age, prepare IX 10 7 breast cancer cells (MDA-MB-231) in 0.1 ml Matrigel and adjust 0.1 ml of cell suspension using a 20 gauge needle and 1.0 ml syringe. The mice grouped in the MDA-MB-231 group were inoculated subcutaneously on the flank. Also, prepare 0.1 ml of a cell suspension of 1 x 10 7 breast cancer cells (MCF-7) in 0.1 ml Matrigel, and use a 20 gauge needle and 1.0 ml syringe to prepare MCF-7 Grouped into groups The mice were inoculated subcutaneously on the flank. Each animal was inoculated at least 5 power stations.
  • MCF-7 1 x 10 7 breast cancer cells
  • mice Ten not a One four groups, three of the infected cell lines and control cells (LacZ RNAi MCF -7) strain Matrigel 0.1ml by 1 X 10 7 cells, respectively 0.1 ml of the suspended cell suspension was prepared and inoculated subcutaneously into the flank of a mouse using a 20 gauge needle and a 1.0 ml syringe. Thereafter, the minor axis and major axis of each tumor were measured twice a week using a caliper, and the tumor volume was calculated by the following equation (1).
  • V S 2 XL ⁇ 2... hi
  • V is the tumor volume
  • S is the short axis of the tumor
  • L is the long axis of the tumor.
  • the tumor capacity reached 3,000 mm 3 45 days after transplantation.
  • the tumor volume of the mouse transplanted with the infected cell line is larger than the tumor volume of the mouse transplanted with the parental breast cancer cell (MCF-7).
  • the tumor capacity reached 3 ⁇ 4 ⁇ 5 times 77 days after transplantation.
  • no increase in tumor volume was observed in the control cell line, and it can be evaluated that the effect of increasing the tumor volume is not due to RNAi manipulation but to a decrease in CHIP expression.
  • MDA-MB-231 are high malignancy / cancer cells that have higher colony-forming ability and invasiveness than breast cancer cells (MCF-7). Suppressing the expression level of CHIP in breast cancer cells (MCF-7) with RNAi increases colony-forming ability and invasiveness in the same way as breast cancer cells (MDA-MB-231), and also increases the rate of tumor growth in vivo. To rise. Therefore, it was verified that the growth rate of the tumor depends on the expression level of CHIP.
  • SEQ ID Nos: 1 to 4 described in the sequence listing of the present specification represent the following sequences.
  • SEQ ID NO: 1 The nucleotide sequence of the forward primer used in the first example.

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Abstract

　細胞の癌化に関与する多数のタンパク質と相互作用する単一のタンパク質を腫瘍マーカとする癌の検査方法を提供する。 　細胞内のユビキチンリガーゼであるチップ(Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含む。

Description

明 細 書
癌の検查方法、癌の検查用キット、及び癌の検查薬
技術分野
[0001] 本発明は生体試料の検査技術に係り、特に癌の検査方法、癌の検査用キット、及 び癌の検査薬に関する。
背景技術
[0002] 細胞が癌化しているか否かを検査する場合、細胞内に「腫瘍マーカ」が存在するか 否かが検査される。近年、上皮成長因子受容体 (HER2： human epidermal growth fac tor rec印 tor-2あるいは ErbB2)やエストロゲン受容体 a (ER a )等力 S、癌細胞の悪性度 に応じて発現量が変化する腫瘍マーカとして注目されている。例えば、乳癌の手術 後には、採取された細胞内の HER2及び ER aの発現量を測定し、手術後のリスクカテ ゴリが判定される。また、特に ER a等の核内受容体は、細胞の癌化に関与する重要 なタンパク質と考えられている（例えば特許文献 1参照。）。しかし、細胞の癌化に関 与するタンパク質は多数存在する。そのため、細胞の癌化に関与する多数のタンパ ク質と相互作用する単一のタンパク質を、腫瘍マーカとすることが望まれていた。 特許文献 1：特開 2005-233916号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 本発明は、細胞の癌化に関与する多数のタンパク質と相互作用する単一のタンパ ク質を腫瘍マーカとする癌の検査方法、癌の検査用キット、及び癌の検査薬を提供 することを目白勺とする。
課題を解決するための手段
[0004] 上記目的を達成するために本発明の第 1の特徴は、細胞内のュビキチンリガーゼ で ¾?·0チップ (CHIP： C arb oxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の発 ξ¾ を測 定することを含む癌の検査方法であることを要旨とする。
[0005] 本発明の第 2の特徴は、細胞内の CHIPの発現量を測定することを含む細胞の足場 依存性の評価方法であることを要旨とする。 [0006] 本発明の第 3の特徴は、細胞内の CHIPの発現量を測定することを含む細胞のァノ ィキス抵抗性の評価方法であることを要旨とする。
[0007] 本発明の第 4の特徴は、細胞内の CHIPの発現量を測定することを含む細胞の浸潤 性の評価方法であることを要旨とする。
[0008] 本発明の第 5の特徴は、細胞内の CHIPの発現量を測定するための試薬を含む癌の 検査用キットであることを要旨とする。
[0009] 本発明の第 6の特徴は、 CHIPの抗体からなる癌の検査薬であることを要旨とする。
[0010] 本発明の第 7の特徴は、細胞内の CHIPの発現量を測定することを含むュビキチン
—プロテアソーム系の異常の検査方法であることを要旨とする。
発明の効果
[0011] 本発明によれば、 細胞の癌化に関与する多数のタンパク質と相互作用する単一のタ ンパク質を腫瘍マーカとする癌の検査方法、 癌の検査用キット、 及び癌の検査薬を提 供可能である。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1 ] 図 1は、本発明の実施の形態に係る細胞内の CH I Pの相対発現量を示すダラ フである。
[図 2] 図 2は、本発明の実施の形態に係る細胞内の CH I Pの発現量を示す画像であ る。
[図 3] 図 3は、本発明の実施の形態に係る細胞内の C H I Pの発現量を示すグラフで める。
[図 4〗 図 4は、本発明の実施の形態に係る細胞内の C H I Pの発現量を示す画像であ る。
[図 5 ] 図 5は、 本発明の実施の形態に係る細胞のコロニーを示す画像である。
[図 6 ] 図 6は、本発明の実施の形態に係る細胞の一視野あたりにおけるコ口ユー数を 示すグラフである。
[図 7] 図 7は、本発明の実施の形態に係る細胞の足場依存性を示す第 1のグラフであ る。
[図 8 ] 図 8は、本発明の実施の形態に係る細胞の足場依存性を示す第 2のグラフであ
Iffiされた用紙腿 U [図 9]図 9は、本発明の実施の形態に係る細胞内のリン酸化 Aktの発現量を示す画像 である。
[図 10]図 10は、本発明の実施の形態に係る細胞の浸潤性を示す画像である。
[図 11]図 11は、本発明の実施の形態に係る細胞の浸潤性を示す第 1のグラフである
[図 12]図 12は、本発明の実施の形態に係る細胞の浸潤性を示す第 2のグラフである
[図 13]図 13は、本発明の実施の形態に係るマウスの腫瘍の重量を示すグラフである
[図 14]図 14は、本発明の実施の形態に係るマウスの腫瘍の体積を示す第 1のグラフ である。
[図 15]図 15は、本発明の実施の形態に係るマウスの腫瘍の体積を示す第 2のグラフ である。
[図 16]図 16は、本発明の実施の形態に係るマウスの腫瘍の体積を示す第 3のグラフ である。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 次に本発明の実施の形態を説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の 技術的思想を具体化するための方法等を例示するものであって、この発明の技術的 思想を下記のものに特定するものではな!/、。この発明の技術的思想は、特許請求の 範囲において種々の変更を加えることができる。
[0014] チップ (CHIP： C arb oxyl~t erminu s of Hsc 70 interacting protein)は、シャヘロングン パク質である Hsc70及びシャペロンタンパク質である熱ショックタンパク質 (HSP)90と結 合するュビキチンリガーゼである。 CHIPは細胞質に存在し、 Hsc70と結合する補助因 子 (co-chaperon)として発見された。 CHIPは N末端側に、 Hsc70と相互作用する TPR(t etratricopeptide repeat)という繰り返し構造を有する。また CHIPは C末端側に、 U_box と呼ばれるュビキチンリガーゼに特徴的な構造を有する。ュビキチンリガーゼである C HIPによって、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子 (CFTR： Cystic - Fibrosis Tr ansmenbrane - conductande Regulator) グノレココノレチノイド受容体（GR)、 上皮成 長因子受容体 (HER2： human epidermal growth factor receptor-2あるいは ErbB2)、 アンド口ゲン受容体、シグナル伝達因子 Smad、 Perl受容体、エストロゲン受容体 (ER)、 エストロゲン受容体 α (ERo 、 及び変異型 p53タンパク質等が: ^军される。
[0015] HSP90の阻害剤であるゲルダナマイシン、及び肝臓への毒性を減らしたゲルダナマ イシンの誘導体である 17-AAG (allylaminogeldanamycin) は抗癌剤である。 そのた め、立体構造を形成する時に HSP90を必要とするクライアントタンパク質の一部に、 細胞の癌化に関与するタンパク質が含まれており、 HSP90が阻害されると、 細胞の 癌化に関与するタンパク質が正しい立体構造を形成できず、機能を失うと考えられる。 また HSP90のクライアントタンパク質には、 HER2、 ERa、及び変異型 p53タンパ ク質等、 細胞の癌化に関与するタンパク質が含まれる。
[0016] 発明者は、 CHIPの発現量の減少や機能の減弱は、 HSP90のクライアントタンパク 質であり、 細胞の癌化に関与するタンパク質の過剰な蓄積を招き、 結果として細胞の 癌悪性化をもたらすと考えた。 そこで発明者は、 CHIPの生物学的機能を研究する過 程で、 癌細胞の悪性度と、 癌細胞内の CHIPの発現量とが相関しており、 CHIPの発 現量の減少が細胞の癌悪性ィ匕をもたらすことを見レ、だした。そのため、細胞内の CHIP の発現量を測定することにより、癌細胞の悪性度を検査することが可能となる。また、 細胞内のュビキチン一プロテアソーム系に異常が生じているか否かを検査すること も可能となる。 なお CHIPの発現量の測定と、 HER2、 ER CK 及ぴ変異型 p53タン パク質等の細胞の癌化に関与する他のタンパク質の発現量の測定を組み合わせて、 細 胞が癌化しているか否かを検査してもよレ、。
[0017] ヒト等のほ乳類から採取された細胞内の CHIPの発現量は、例えば、抗 CHIP抗体、 あるいは抗 CHIP抗体の断片を用いたウェスタンブロッテイング法、免役沈降法、酵 素免疫測定 (ELISA)法、 放射性免疫測定 (RIA： Radio Immuno Assay)法、 及び免役 組織染色法等のタンパク質解析法により測定可能である。 なお、 抗体には、 ポリクロ ーナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも使用可能である。また、細胞内の CHIP をコードする mRNA(CHIP mRNA)の発現量を測定することにより、細胞内の CHIP の発現量を測定してもよい。 細胞内の CHIP mRNAの発現量は、 例えば、 逆転写ポ リメラ ーゼ連鎖反応 (RT-PCR)法、 In situ PCR法、ノザンブロッテイング法、 In situハイブリ ダイゼーシヨン法、及び DNAチップ法等の核酸解析法により測定可能である。
[0018] また癌細胞の悪性度は、癌細胞の分化度で評価される。正常な細胞は分化度が高 ぐ臓器の構造を形成したり、機能を発揮することが可能である。しかし癌細胞におい ては分化度が低下する。癌細胞の分化度は、臨床的には、癌細胞の足場依存性、ァ ノィキス抵抗性、転移浸潤能、あるいは増殖能力等で評価されている。悪性度が高 いほど、癌細胞は足場依存性を失う。また悪性度が高いほど、癌細胞のァノィキス抵 抗性、転移浸潤能、及び増殖能力は高くなる。癌細胞が足場依存性を失う要因、ァ ノィキス抵抗性を獲得する要因、転移浸潤能を獲得する要因、及び増殖能力を獲得 するそれぞれの遺伝的要因は異なっていると考えられている。これに対し発明者は、 CHIPの発現量の減少力 癌細胞の足場依存性の喪失、並びにァノィキス抵抗性、 転移浸潤能、及び増殖能力の獲得の総てをもたらすことを見いだした。そのため、細 胞内の CHIPの発現量を測定することにより、細胞の足場依存性、ァノィキス抵抗性、 転移浸潤能、及び増殖能力のそれぞれを評価することが可能となる。具体的には、 細胞内の CHIPの発現量が正常時と比較して減少していれば、細胞が足場依存性を 失った、あるいはァノィキス抵抗性、転移浸潤能、並びに増殖能力を獲得したと評価 すること力 S可倉 となる。
[0019] また発明者は、 CHIPの発現が抑制された細胞株を作製した。 CHIPの発現が抑制 された細胞株は、足場依存性が親株である MCF7細胞と比較して低ぐまたァノィキス 抵抗性、転移浸潤能、及び増殖能力が親株である MCF7細胞と比較して高い。従来 、癌細胞の悪性度の指標となる足場依存性の喪失、並びにァノィキス抵抗性、転移 浸潤能、及び増殖能力の獲得の総てを示す細胞で、その原因となる分子との相関関 係が明確な細胞株はなかった。そのため CHIPの発現が抑制された細胞株は、癌の 浸潤及び転移の研究に有用である。例えば、癌の浸潤及び転移を抑制する薬の探 索、あるいは CHIPのクライアントタンパク質の解明等に CHIPの発現が抑制された細 胞株は使用可能である。また、癌化が疑われる組織の細胞の CHIPの量を測定する 際のコントロール細胞としても、 CHIPの発現が抑制された細胞株は使用可能である。 さらには、 CHIPのクライアントタンパク質を大量に抽出するための材料としても、 CHIP のの発発現現がが抑抑制制さされれたた細細胞胞株株はは有有用用ででああるる。。
[[00002200]] 従従来来、、細細胞胞内内のの HHEERR22ああるるいいはは EERR aaののみみのの発発現現量量をを測測定定すするる乳乳癌癌のの検検査査方方法法、、ああ るるいいはは、、細細胞胞内内のの pp5533タタンンパパクク質質のの突突然然変変異異ののみみをを検検出出すするる癌癌のの検検査査方方法法ががああっったた。。 しし力力、、しし、、細細胞胞のの癌癌化化ににはは多多くくのの遺遺伝伝子子がが関関与与ししてていいるる。。そそののたためめ、、 HHEERR22ああるるいいはは EERR aaののみみのの発発現現量量をを測測定定ししたたりり、、 pp5533タタンンパパクク質質のの突突然然変変異異ののみみをを検検出出ししててもも、、細細胞胞がが 癌癌化化ししてていいるるかか否否かかをを正正確確にに検検査査すするるののはは困困難難ででああっったた。。ここれれにに対対しし CCHHIIPPはは、、 HHEERR22 、、 EERR aa、、及及びび変変異異型型 pp5533タタンンパパクク質質ののいいずずれれををもも分分解解すするるュュビビキキチチンンリリガガーーゼゼででああるる。。 ししたたががっってて CCHHIIPPのの発発現現量量はは、、 HHEERR22やや EERR aa等等のの CCHHIIPPでで分分解解さされれるる個個々々ののタタンンパパクク質質 のの発発現現量量とと比比較較ししてて、、細細胞胞のの癌癌化化のの要要因因にによよりり本本質質的的にに関関連連ししてていいるるとと考考ええらられれるる。。 ささららにに CCHHIIPPのの発発現現量量のの減減少少がが、、足足場場依依存存性性をを喪喪失失、、並並びびににァァノノィィキキスス抵抵抗抗性性、、転転移移 浸浸潤潤能能、、及及びび増増殖殖能能力力のの獲獲得得のの総総ててををももたたららすすこことともも、、 CCHHIIPPのの発発現現量量とと細細胞胞のの癌癌化化 のの要要因因ととのの関関連連をを裏裏付付けけるる。。そそののたためめ、、細細胞胞内内のの CCHHIIPPのの発発現現量量をを測測定定すするるここととにによよりり 、、細細胞胞がが癌癌化化ししてていいるるかか否否かかをを高高いい精精度度でで検検査査すするるここととがが可可能能ととななるる。。ままたた細細胞胞がが癌癌 化化ししてて!!//、、るる場場合合はは、、癌癌細細胞胞のの悪悪性性度度をを高高レレ、、精精度度でで検検査査すするるこことともも可可能能ととななるる。。
[[00002211]] ((第第 11のの実実施施例例））
複複数数種種類類ののヒヒトト癌癌由由来来のの培培養養細細胞胞ののそそれれぞぞれれににおおけけるる、、 CCHHIIPPををココーードドすするる mmRRNNAA(( CCHHIIPP mmRRNNAA))のの発発現現量量をを検検証証ししたた。。ままずず、、乳乳癌癌細細胞胞（（MMCCFF77、、 MMDDAA--MMBB--223311))、、肝肝臓臓 癌癌細細胞胞（（HH印印 GG22))、、子子宮宮頸頸癌癌細細胞胞（（HHeeLLaa))、、肺肺癌癌細細胞胞（（HHII 229999))、、及及びび大大腸腸癌癌細細胞胞（（HHCC TTll ll66、、 LLss—— LLMM44))力力、、りり、、 AALLTTPPしし ((aacciidd gguuaanniiddiinniiuumm tthhiiooccyyaannaattee—— pphheennooll—— cchhlloorrooffoorrmm eexxttrraa ccttiioonn))法法等等にによよりり、、 rrRRNNAA、、 ttRRNNAA、、及及びび mmRRNNAAをを含含むむ全全 RRNNAA((ttoottaall RRNNAA))ををそそれれぞぞれれ抽抽 出出ししたた。。次次ににラランンダダムムププラライイママーー及及びび逆逆転転写写酵酵素素をを用用いいてて、、全全 RRNNAAにに含含ままれれるる mmRRNNAA とと相相補補的的なな ccDDNNAAをを合合成成ししたた。。そそのの後後、、以以下下のの配配列列かかららななるるフフォォワワーードドププラライイママーー ((ffoorrww aarrdd pprriimmeerr))及及びびリリノノヽヽーーススフフフフィィママーー ((rreevveerrssee pprriimmeerrvvをを用用いいてて、、 CCHHIIPPををココーー すするる ccDDNN AA((CCHHIIPP ccDDNNAA))ををリリアアルルタタイイムム PPCCRR ((PPoollyymmeerraassee CChhaaiinn RReeaaccttiioonn))装装置置（（アアププラライイドドババイイ ォォシシスステテムムズズ社社 AABBII77770000))でで増増幅幅ししたた。。ななおおフフォォワワーードドププラライイママーー及及びびリリババーーススププラライイ ママーーののそそれれぞぞれれのの配配列列はは、、ゼゼネネテテイイツツタタスス社社のの GGEENNEETTYYXX ((登登録録商商標標））をを用用いいてて設設計計しし たた。。同同時時にに、、内内在在性性ココンントトロローールル遺遺伝伝子子ととししてて、、 //33 --ァァククチチンンををココーードドすするる ccDDNNAA (( //33 --ァァ
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[0022] フォワードプライマー 5'-aggccaagcacgacaagtacat-3'
リノ一スフ。フ マー 5 -ctgatcttgccacacaggtagt-3'
さらに、一定量の CHIP cDNAを得るために要した PCRのサイクル数と、一定量の β -ァクチン cDNAを得るために要した PCRのサイクル数に基づいて、比較 Ct法により、 複数種類のヒト癌由来の培養細胞のそれぞれにおける、 CHIP mRNAの相対発現量 を、乳ガン細胞 (MCF7)をキヤリブレーターサンプルとして定量した。図 1に示すように 、乳ガン細胞 (MCF7)における CHIP mRNAの発現量を 1とすると、乳ガン細胞 (MDA- MB-231)における CHIP mRNAの相対発現量は 0.68、肝臓癌細胞（H印 G2)における CHIP mRNAの相対発現量は 0.78、子宮頸癌細胞（HeLa)における CHIP mRNAの相 対発現量は 0.84、肺癌細胞（H1299)における CHIP mRNAの相対発現量は 1.14、大 腸癌細胞（HCT116)における CHIP mRNAの相対発現量は 1.06、大腸癌細胞（LS-L M4)における CHIP mRNAの相対発現量は 2.37であった。これに対し、正常組織由来 の細胞 (HEK293E)における CHP mRNAの相対発現量は 62であった。
[0023] (第 2の実施例）
複数種類のヒト癌由来の培養細胞のそれぞれにおける CHIPの発現量を、ゥエスタ ンブロッテイング法により検証した。まず、乳癌細胞（MCF7、 MDA-MB-231)、肝臓癌 細胞（H印 G2)、子宮頸癌細胞（HeLa)、肺癌細胞（H1299)、大腸癌細胞（HCT116、 LS-LM4)、及びコントロールとして正常組織由来の細胞 (HEK293E)のそれぞれを溶 解し、 8 gのタンパク質画分溶液を得た。次に、各細胞由来のタンパク質画分溶液 に含まれるタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (10%SDS_PAGE)で分子量 毎に分離した。その後、分離されたタンパク質を、ポリアクリルアミドゲルからニトロセ ルロース膜に転写した。さらに、化学蛍光試薬で標識された CHIPのポリクローナル抗 体を用いて、図 2に示すようにニトロセルロース膜に転写された CHIPを検出した。さら に、検出した化学蛍光試薬の蛍光強度を図 3に示すグラフにプロットした。
[0024] 図 2及び図 3に示すように、乳癌細胞（MDA-MB-231)及び肝臓癌細胞（H印 G2)に おける CHIPの発現量は、乳癌細胞（MCF7)における CHIPの発現量よりも少なかった 。子宮頸癌細胞（HeLa)、大腸癌細胞（HCT116)、及び肺癌細胞（H1299)における C HIPの発現量は、乳癌細胞（MCF7)における CHIPの発現量と同等であった。大腸癌 細胞（LS-LM4)における CHIPの発現量は、乳癌細胞（MCF7)における CHIPの発現 量よりも多かった。各細胞内の CHIPの発現量は、図 1に示した各細胞内の CHIP mR NAの発現量にほぼ比例して!/、た。
[0025] また図 2及び図 3に示すように、複数種類のヒト癌由来の培養細胞のそれぞれにお ける CHIPの発現量は、正常組織由来の細胞 (HEK293E)における CHIPの発現量と 比較して少なかった。したがって、細胞内の CHIPの発現量を測定することにより、細 胞が癌化しているか否かを検査可能であることが検証された。
[0026] (第 3の実施例）
RNA干渉 (RNAi： RNA interference)法により、 CHIPの発現が抑制された乳癌細胞（ MCF7)を変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)として作成した。まず、 CHIPをコードする遺 伝子配列の ORF (Open Reading Frame)の 610番目から 629番目までの標的配列 cac gacaag tacatggcggaに相当する合成ヌクレオチドをタカラバイオ社の pSINsiベクター にクローユングし、プラスミドを調整した。次にプラスミドをパッケージング細胞 (293gp) にトランスフエクシヨンし、パッケージング細胞の培地の上清を、感染用組み換えレトロ ウィルスベクター溶液として回収した。得られた感染用組み換えレトロウイルスベクタ 一溶液を乳癌細胞（MCF7)の培養液に添加し、さらにポリプレン (polybrene)を終濃度 力 mg I mlになるよう培養液に添加した。 24時間後、 G-418硫酸塩を終濃度が lmg / mlになるよう培養液に添加した。約 2週間、乳癌細胞（MCF7)の培養を継続し、ネオ マイシン耐性の 4つの乳癌細胞（MCF7)株を感染細胞株として選択した。
[0027] また、コントロールとして、 β -ガラタトシダーゼ (LacZ)をコードする遺伝子配列の OR Fの 2400番目から 2418番目までのコントロール標的配歹 Ijgctacacaaatcagcgattに相当 する合成ヌクレオチドを pSINsiベクターにクローユングしてプラスミドを調整し、 RNAi法 により LacZの発現が抑制された乳癌細胞（MCF7)株をコントロール細胞 (LacZ RNAi MCF-7)株として作成した。
[0028] 得られた 4つの感染細胞株及びコントロール細胞 (LacZ RNAi MCF-7)株からタンパ ク質を抽出し、 CHIPの発現量を抗 CHIPポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッ ト法により検出した。図 4に示すように、コントロール細胞 (LacZ RNAi MCF-7)株と比 較して、 4つの感染細胞株のすべてにおいて、 CHIPの発現量が減少していた。ただ し、減少の程度は、感染細胞株毎に異なっていた。コントロール細胞 (LacZ RNAi MC F-7)と比較してウェスタンブロット法により CHIPの発現量が減少していると確認された 4つの感染細胞株のそれぞれを、変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)株とした。
[0029] 次に変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)株の足場依存性を、軟寒天培地中でのコロニ 一形成能を指標に検証した。まず、滅菌した濃度 1% (質量/体積）のシグマ社の Noble Agar溶液を等量の 2倍濃縮 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)と混合し、 混合液を調整した。なお DMEMは、 FBS (Fetal Bovine Serum),グノレタミン、及び抗生 物質を含むものである。調整した混合液 2mlを 6ゥエルプレートに入れ、室温に放置し 固化させたものを下層培地とした。次にトリプシン消化後、体積濃度が 10% (体積/体 積）の血清を含有する DMEM培地を加えて懸濁状態にした 30,000個の変異細胞 (CH IP RNAi MCF-7)及びコントロール細胞 (LacZ RNAi MCF-7)のそれぞれを 2mlの 1.5倍 濃縮 DMEM培地に懸濁し、変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)の懸濁液及びコントロー ル細胞 (LacZ RNAi MCF-7)の懸濁液を調整した。次に変異細胞 (CHIP RNAi MCF- 7)の懸濁液及びコントロール細胞 (LacZ RNAi MCF-7)の懸濁液のそれぞれに濃度 1 % (質量/体積）の Noble Agar溶液を lml加え、上層細胞培地とした。上層細胞培地を 下層培地上に乗層し、室温に放置して固化させた。その後、 6ゥエルプレートを 37°C で 2週間程度培養し、形成されたコロニーをキーエンス社のコンピューター付き顕微 鏡を用いて撮影した。図 5に示すように、変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)は足場依存 性を失い、コントロール細胞 (LacZ RNAi MCF-7)と比較してコロニー形成数が顕著に 増加した。図 4及び図 6に示すように、顕微鏡の 1視野あたりにおける、直径が 100 よりも大きいコロニーの形成数は、 CHIPの発現量と負の相関関係にあった。そのため 、細胞の足場依存性と CHIPの発現量とは、正の相関関係にあった。したがって、細 胞内の CHIPの発現量を測定することにより、細胞の足場依存性を評価可能であるこ とが検証された。
[0030] (第 4の実施例）
変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)株及び乳癌細胞（MDA-MB-231)株のァノィキス抵 抗性を検証した。エタノール中に 40 mg/mlの濃度でポリヒドロキシェチルメタタリレート (Poly-HEMA： Polyhydroxyethyl methacrylate)を溶かした Poly-HEMA溶液（シグマ 社）を直径 60 mmの細胞培養皿に lml入れ、均等にコートした後にクリーンベンチで 風乾させた。次に細胞培養皿のそれぞれに、 1 X 106個の変異細胞 (CHIP RNAi MCF -7)を含む 5 mlの培養液、あるいは 1 X 106個の乳癌細胞（MDA-MB-231)を含む 5 ml の培養液を加え、 48時間 37°Cで浮遊培養した。またコントロールとして Poly-HEMA溶 液をコートしていない細胞培養皿に 1 X 106個の変異細胞 (CHIP RNAi MCF_7)、ある いは 1 X 106個の乳癌細胞（MDA-MB-231)を播種したものを作製した。培養後に変 異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)及び乳癌細胞（MDA-MB-231)を回収し、トリパンブル 一染色排除法により生細胞数を測定した。図 7に示すように、野生型の乳癌細胞 (M CF7)は、浮遊培養するとアポトーシスを起こし、生存細胞の割合が低下した。またコ ントロール細胞 (LacZ RNAi MCF-7)も、浮遊培養するとアポトーシスを起こし、生存細 胞の割合が低下した。これに対し、変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)は、浮遊培養して もアポトーシスを起こしに《なり、生存細胞が低下する割合も低力 た。したがって、 変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)は、アポトーシスを起こさないァノィキス抵抗性を獲得 していた。また図 8に示すように、 CHIPの発現量が乳癌細胞 (MCF7)と比較して少な い乳癌細胞 (MDA-MB-231)も、浮遊培養中にアポトーシスを起こさず、ほぼ 100%のァ ノィキス抵抗性を示した。したがって、細胞内の CHIPの発現量を測定することにより、 細胞のァノィキス抵抗性を評価可能であることが検証された。
(第 5の実施例）
変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)における、セリン 'スレオニンリン酸化酵素 (Akt)のリ ン酸化状態を検証した。 Aktは細胞内のァノィキス経路の情報伝達を行い、リン酸化 により活性化されると、細胞増殖を促進し、アポトーシスを阻害する。そこで、まず変 異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)から 8 gのタンパク質画分溶液を得た。次に、タンパク 質画分溶液に含まれるタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動 (10% SDS-PAGE) で分離し、ニトロセルロース膜に転写してウェスタンブロッテイングを行った。ゥエスタ ンブロッテイングの抗体には、 473残基のセリン (Ser)がリン酸化された Aktの抗体であ る抗リン酸化 Akt抗体（セルシグナリングテクノロジ一社、カタログ番号 9271)と、抗 Akt 抗体（セルシグナリングテクノロジ一社、カタログ番号 9272)を用いた。図 9に示すよう に、 Poly-HEMA溶液でコートされた細胞培養皿で浮遊培養されたコントロール細胞（ LacZ RNAi MCF-7)においては、アポトーシスを阻害するリン酸化 Aktは減少していた 。これに対して、変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)においては、 Poly-HEMA溶液でコー トされて!/、な!/、細胞培養皿で培養しても、 Poly-HEMA溶液でコートされた細胞培養 皿で浮遊培養しても、リン酸化 Aktの発現量は変化していな力、つた。したがって、細胞 内の CHIPの発現量を測定することにより、細胞のァノィキス抵抗性を評価可能である ことが検証された。
[0032] (第 6の実施例）
変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)の転移浸潤能を、インべ一ジョンアツセィで検証した 。まず、ベタトン'ディッキンソン (BD)社のマトリゲル (登録商標）インべ一ジョンチャン バー（カタログ番号 354480)のインサートを 24ゥエルプレートのゥエルにセットし、 0.5 m 1の DMEM培地をインサート及びゥエル内に入れ、二酸化炭素 (CO )インキュベーター 内で 37°C、 2時間水和させた。水和後、培地を取り除いた。次に、変異細胞 (CHIP RN Ai MCF-7)をトリプシン消化によって細胞培養皿から剥がし、体積濃度が 0.2% (体積/ 体積）の血清を含む培地で、細胞数力 ¾ X 105細胞/ mlになるように再懸濁し、細胞懸 濁液を調整した。
[0033] インサート及びゥエルから培地を除き、ゥエルには体積濃度力 10% (体積/体積）の血 清を含む培地を入れ、インサートには 0.5mlの細胞懸濁液を加えた。次に、 24ゥエル プレートを COインキュベーターにいれ、 37°Cで 24時間インキュベートした。インサー トは、マトリゲル基底膜マトリックスの薄膜でコートされ、直径力 mの孔が設けられ た多孔膜を備える。インキュベーション中、非浸潤性の細胞はマトリゲル基底膜マトリ ッタスの薄膜を移動できず、マトリゲル基底膜マトリックスの薄膜上に留まる。これに対 し浸潤性の細胞は、マトリゲル基底膜マトリックスの薄膜及び多孔膜に浸潤し、多孔 膜の下面に移動する。インキュベーション後、綿棒を用いてインサート内の非浸潤性 の細胞を取り除き、 PBS (Phosphate Buffered Saline)で簡単に洗浄した。その後、イン サートを体積濃度が 4% (体積/体積）のパラホルムアルデヒド (PFA： paraformaldehyde )溶液を 0.5 ml入れたプレートに移し、室温で 15分放置し、浸潤性の細胞を固定した。
[0034] 次にインサートを PBSで 5分間洗浄することを 3回繰り返し、クリスタルバイオレットで 浸潤性の細胞を染色して顕微鏡で浸潤性の細胞数を計測した。なお、少なくとも 5視 野の撮影画像から細胞数を計測した。また同一の条件で、コントロール細胞 (LacZ R NAi MCF-7)につ!/、ても浸潤性の細胞の数を計測した。図 10の浸潤性の細胞の撮影 画像に示すように、コントロール細胞 (LacZ RNAi MCF-7)と比較して、 CHIPの発現量 が少ない第 2の感染細胞株及び第 4の感染細胞株由来の変異細胞 (CHIP RNAi MC F-7)の方が顕著な浸潤性を示した。また図 11に示すように、 CHIPの発現量と浸潤性 は、負の相関関係にあり、コントロール細胞 (LacZ RNAi MCF-7)の 186倍の第 4の感 染細胞株由来の変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)がマトリゲル基底膜マトリックスの薄 膜及び多孔膜を浸潤していた。したがって、 CHIPの発現量の減少は、細胞の浸潤性 を増加させることが示された。よって、細胞内の CHIPの発現量を測定することにより、 細胞の浸潤性を評価可能であることが検証された。
[0035] また、 CHIPの発現量が乳癌細胞 (MCF7)と比較して少な!/、乳癌細胞 (MDA-MB-23 1)の転移浸潤能を、変異細胞 (CHIP RNAi MCF-7)と同じ条件を用いてインべージョ ンアツセィで検証した。結果として、図 12に示すように、 1.67 ± 1.15個の乳癌細胞 (MC F7)がマトリックスの薄膜及び多孔膜を浸潤したのに対し、 630± 55個の乳癌細胞 (MD A-MB-231)がマトリックスの薄膜及び多孔膜を浸潤した。乳癌細胞 (MDA-MB-231) の結果力もも、 CHIPの発現量の減少力 細胞の浸潤性を増加させることが示された。
[0036] (第 7の実施例）
CHIPの発現量と、癌細胞の悪性度との関係を、 in vivoで検証した。まず 10匹の 4週 齢の T細胞機能欠如マウス（日本クレア社、 BALBん AJc卜 nu/nu)を一週間飼育した。 その後、 10匹の T細胞機能欠如マウスを、乳癌細胞 (MDA-MB-231)が移植される MD A-MB-231群と、乳癌細胞 (MCF-7)が移植される MCF-7群に、それぞれ 5匹ずっグ ルービングした。なお、 MDA-MB-231群にグルーピングされた T細胞機能欠如マウス の体重の分布と、 MCF-7群にグルーピングされた T細胞機能欠如マウスの体重の分 布は、ほぼ等しくした。 5週齢時に I X 107個の乳癌細胞 (MDA-MB-231)を 0.1mlのマト リゲルに懸濁した細胞懸濁液 0.1 mlを調整し、 20ゲージの注射針と 1.0 mlシリンジを 用いて、 MDA-MB-231群にグルーピングされたマウスの側腹部皮下に接種した。ま た 1 X 107個の乳癌細胞 (MCF-7)を 0.1mlのマトリゲルに懸濁した細胞懸濁液 0.1 mlを 調整し、 20ゲージの注射針と 1.0 mlシリンジを用いて、 MCF-7群にグルーピングされ たマウスの側腹部皮下に接種した。なお 1匹あたり少なくとも 5力所以上に接種した。 その後、一週間に 2回、ノギスを用いて腫瘍の短径及び長径のそれぞれを測定し、腫 瘍の容量を下記 (1)式により算出した。同様に 40匹の T細胞機能欠如マウスを 10匹ず つ 4群にグルーピングし、 3つの感染細胞株及びコントロール細胞（LacZ RNAi MCF -7)株をそれぞれ 1 X 107個ずつ 0.1mlのマトリゲルに懸濁した細胞懸濁液 0.1 mlを調 整し、 20ゲージの注射針と 1.0 mlシリンジを用いてマウスの側腹部皮下に接種した。 その後、一週間に 2回、ノギスを用いて腫瘍の短径及び長径のそれぞれを測定し、腫 瘍の容量を下記 (1)式により算出した。
[0037] V = S2 X L÷2 …ひ）
ここで、 Vは腫瘍の容量を、 Sは腫瘍の短径を、 Lは腫瘍の長径を示す。腫瘍の容量 の測定を 3ヶ月程継続し、腫瘍の長径が約 3 cmになった時点でマウスを殺害し、腫瘍 の重量を測定した。乳癌細胞 (MDA-MB-231)が移植されたマウスの殺害時の腫瘍の 平均重量は、図 13に示すように、 3.7 ± 2.3gであった。また乳癌細胞 (MCF-7)が移植 されたマウスの殺害時の腫瘍の平均重量は、 1.0±0.3gであった。図 14に示すように 、 CHIPの発現量が少ない乳癌細胞 (MDA-MB-231)を移植されたマウスにおいては、 移植後 45日で腫瘍の容量力 ¾，000mm3に達した。一方、図 15に示すように、感染細胞 株が移植されたマウスの腫瘍の容積は親株である乳癌細胞 (MCF-7)が移植された マウスの腫瘍の容積と比較して大きぐ特に第 3の感染細胞株において顕著であり、 移植後 77日の腫瘍容積力 ¾·5倍に達した。また図 16に示すように、コントロール細胞 株では腫瘍容積の増大は観察されず、腫瘍容積増大効果は RNAi操作によるもので はなく CHIP発現量の減少によるものだと評価できる。乳癌細胞 (MDA-MB-231)は、コ ロニー形成能及び浸潤性が乳癌細胞 (MCF-7)と比較して高い、悪性度の高!/、癌細 胞である。乳癌細胞 (MCF-7)における CHIPの発現量を RNAiで抑制すると、乳癌細 胞 (MDA-MB-231)と同様にコロニー形成能及び浸潤性が上昇し、 in vivoでの腫瘍増 大速度も上昇する。そのため、腫瘍の増殖速度は、 CHIPの発現量に依存しているこ とが検証された。
[0038] (配列表の説明）
本明細書の配列表に記載された配列番号 1乃至 4は、以下の配列を示す。 [0039] [配列番号： 1] 第 1の実施例で用いたフォワードプライマーの塩基配列。
[0040] [配列番号： 2] 第 1の実施例で用いたリバースプライマーの塩基配列。
[0041] [配列番号： 3] 第 3の実施例で用いた CHIPの塩基配列。
[0042] [配列番号： 4] 第 3の実施例で用いた LacZの塩基配列。
[0043] 本明細書にお!/、て塩基を略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commision on Bioche mical Nomenclatureによる略号、あるいは当該分野における慣用略号を用いる。以下 に、略号の例を示す。
[0044] a：アデニン
t：チミン
g：グァニン

Claims

請求の範囲
[I] 細胞内のュビキチンリガーゼであるチップ (Carboxy卜 terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含むことを特徴とする癌の検査方法。
[2] 前記発現量を測定することにおいて、前記チップの抗体を使用することを特徴とす る請求項 1に記載の癌の検査方法。
[3] 前記抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 2に記載の癌の検 查方法。
[4] 前記発現量を測定することにおいて、前記チップをコードする mRNAを定量すること を特徴とする請求項 1に記載の癌の検査方法。
[5] 細胞内のュビキチンリガーゼであるチップ (Carboxy卜 terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含むことを特徴とする細胞の足場依存性の評価 方法。
[6] 前記発現量を測定することにおいて、前記チップの抗体を使用することを特徴とす る請求項 5に記載の細胞の足場依存性の評価方法。
[7] 前記発現量を測定することにおいて、前記チップをコードする mRNAを定量すること を特徴とする請求項 5に記載の細胞の足場依存性の評価方法。
[8] 細胞内のュビキチンリガーゼであるチップ (Carboxy卜 terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含むことを特徴とする細胞のァノィキス抵抗性の 評価方法。
[9] 前記発現量を測定することにおいて、前記チップの抗体を使用することを特徴とす る請求項 8に記載の細胞のァノィキス抵抗性の評価方法。
[10] 前記発現量を測定することにおいて、前記チップをコードする mRNAを定量すること を特徴とする請求項 8に記載の細胞のァノィキス抵抗性の評価方法。
[I I] 細胞内のュビキチンリガーゼであるチップ (Carboxy卜 terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含むことを特徴とする細胞の浸潤性の評価方法。
[12] 前記発現量を測定することにおいて、前記チップの抗体を使用することを特徴とす る請求項 11に記載の細胞の浸潤性の評価方法。
[13] 前記発現量を測定することにおいて、前記チップをコードする mRNAを定量すること を特徴とする請求項 1 1に記載の細胞の浸潤性の評価方法。
[14] 細胞内のュビキチンリガーゼであるチップ（Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定するための試薬を含むことを特徴とする癌の検査用キット。
[15] 前記試薬は、 前記チップの抗体を含むことを特徴とする請求項 1 4に記載の癌の検査 用キット。
[16] 前記試薬は、前記チップのモノクローナル抗体を含むことを特徴とする請求項 1 4に 記載の癌の検査用キット。
[17] ュビキチンリガーゼであるチップ (Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein) の抗体からなる癌の検查薬。
[18] 細胞内のュビキチンリガーゼであるチップ（Carboxyl-terminus of Hsc 70 interacting protein)の発現量を測定することを含むことを特徴とするュビキチン一プロテアソーム 系の異常の検査方法。
ΙΪ正さ.れた甩紙 (¾I
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