明 細 書
Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断する遺伝子'タンパク質マーカー 技術分野
[0001] 本発明は、 Aurora (オーロラ) A阻害剤の薬効を予測又は診断する遺伝子マーカ 一及びタンパク質マーカーに関する。また、当該遺伝子マーカー又はタンパク質マ 一力一を用いた Aurora A阻害剤の薬効の予測又は診断方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、ヒトゲノム計画の進展により、薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで理解し
、医薬の開発に応用する薬理ゲノミタス(Pharmacogenomics)が急速に進展して!/、 る。薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで判断できるようになれば、投与する薬剤 を真に薬効の期待できる患者だけに治療の初期から適切に投薬する、いわゆるォー ダーメイド医療が可能となる。その結果、患者に無用の負担を強いることもなくなり、ま た、近年高騰する傾向にある医療費の削減にも寄与することとなる。中でも、抗癌剤 は非常に強い副作用を有する場合が多ぐオーダーメイド医療が強く望まれている。
[0003] また、個々人の疾患関連遺伝子の分子レベルでの解析が可能となることによって、 同じ疾患であっても原因となるメカニズムが異なる場合に、そのメカニズムに応じた投 薬をすべきであり、かかる投薬により、副作用を避け有効な治療や予防を行うことが 可能となる。
[0004] 一方、 Aurora Aは、酵母からヒトに至るまで種を超えて存在し、細胞分裂の制御に 不可欠な役割を担うキナーゼとして知られている。 Aurora Aは Kimuraら(非特許文献 1)、 Senら(非特許文献 2)及び Zhouら(非特許文献 3)によって単離された 403アミノ酸 のキナーゼで、 Aik、 STK15又は ARK1等とも称される(NM_003600、 NM_198433、 NM_ 198434、 NM_198435、 NM_198436及び NM_198437)。 Senらは、 Aurora Aを、乳癌細 胞において高頻度に増幅が生じており染色体の 20ql3に位置する遺伝子として同定 し、また、 Zhouらは、乳癌細胞のみならず、卵巣細胞、結腸細胞、前立腺細胞、神経 芽細胞腫等にも強く発現していることを見出している。さらに、 Zhouらは、 Aurora Aを 過剰発現させた MH3T3細胞において、中心体の異常増幅や形質転換が生じること
から、 Aurora Aが癌遺伝子として機能していると考えている。従って、 Aurora Aは、抗 癌剤の標的遺伝子として研究が進められており、例えば、特許文献 1には、 Aurora ( 特に Aurora A)キナーゼ阻害活性を有するキナゾリン誘導体が開示されて!/、る。
[0005] 特許文献 1:特表 2005-525307号
非特許文献 1 : J. Biol. Chem.、第 272巻、 13766頁、 1997年
非特許文献 2 : Oncogene、第 14巻、 2195頁、 1997年
非特許文献 3: Nature genetics,第 20巻、 189頁、 1998年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] しかしながら、 Aurora A阻害剤を生体に投与した場合に、 Aurora A阻害剤の効果 を検出するマーカーは未だ知られていないのが現状であった。
[0007] 本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、 Aurora A阻 害剤を生体に投与した場合に、 Aurora A特異的に当該阻害剤が作用したか否かを 検出する遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを提供することを目的とする。また 、当該遺伝子マーカー又はタンパク質マーカーを用いた Aurora A阻害剤の薬効の 予測又は診断方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、 Aurora A阻害剤の 投与によって、組織における Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3 及び KNTC2遺伝子の発現量が変化することを見出し、本発明を完成した。
[0009] すなわち、本発明の遺伝子マーカーは、 Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断 する遺伝子マーカーであって、当該遺伝子が、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC 1、 DLG7、 TACC3及び KNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子であ ることを特徴とする。力、かる遺伝子マーカーにより、簡便且つ非侵襲的に Aurora A阻 害剤の薬効の予測又は診断を行うことが可能となる。
[0010] また、本発明の遺伝子マーカーは癌の治癒成績を判定する遺伝子マーカーであつ て、当該遺伝子が、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3及び KNT C2からなる群より選択されるレ、ずれか一つの遺伝子であることを特徴とする。かかる
遺伝子マーカーにより、簡便且つ非侵襲的に Aurora A阻害剤による癌の治癒の結 果ゃ経過を評価することが可能となる。
[0011] また、本発明の癌診断キットは、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TA CC3及び KNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子を検出可能な PCR プライマーを含むことを特徴とする。力、かる癌診断キットにより、簡便且つ非侵襲的に Aurora A阻害剤による癌の診断や治癒経過の把握が可能となる。ここで、前記 PCR プライマーとして、配列番号 1及び 2の PCRプライマーからなるプライマーセット、配列 番号 4及び 5の PCRプライマーからなるプライマーセット、配列番号 7及び 8の PCRプ ライマーからなるプライマーセット、配列番号 10及び 11の PCRプライマーからなるプ ライマーセット又は配列番号 13及び 14の PCRプライマーからなるプライマーセットを 用いること力 Sでさる。
[0012] さらに、本発明の DNAマイクロアレイは、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DL G7、TACC3及び KNTC2からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺 伝子の部分ヌクレオチドを備え、 Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断に用いるこ とを特徴とする。力、かる DNAマイクロアレイを用いることにより、本発明の遺伝子マー カーを含む複数の遺伝子について同時に評価を行うことが可能となり、迅速な薬効 の予測や診断が可能となる。
[0013] また、本発明のタンパク質マーカーは、 Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断す るタンパク質マーカーであって、当該タンパク質力 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3及び KNTC2からなる群より選択されるいずれか一つのタンパ ク質であることを特徴とする。力、かるタンパク質マーカーにより、タンパク質レベルでの 発現量の評価が可能となり、遺伝子の単離をすることなく薬効の予測や診断が可能 となる。
[0014] また、本発明のタンパク質マーカーは、癌の治癒成績を判定するタンパク質マーカ 一であって、当該遺伝子が、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3 及び KNTC2からなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質であることを特徴と する。かかるタンパク質マーカーにより、タンパク質レベルでの発現量の評価が可能 となり、遺伝子の単離をすることなく癌の治癒成績を評価することが可能となる。
[0015] また、本発明の癌診断キットは、上述したタンパク質マーカーを検出可能な抗体を 含むことを特徴とする。
[0016] さらに、本発明の抗体アレイは、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TA CC3及び KNTC2からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質の抗体を備え 、 Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断に用いることを特徴とする。力、かる抗体ァレ ィを用いることにより、本発明のタンパク質マーカーを含む複数のタンパク質につい て同時に評価を行うことが可能となり、迅速な薬効の予測や診断が可能となる。
[0017] また、本発明の Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法は、 Aurora A阻害剤 を投与した被検体由来の組織における Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7 、 TACC3及び KNTC2からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子を検出する 検出工程と、 Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工程を含むことを特 徴とする。かかる方法により、簡便且つ非侵襲的に Aurora A阻害剤の薬効の予測又 は診断を行うことが可能となる。
[0018] また、本発明の Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法は、前記検出に用い る検出手段が PCR又は DNAマイクロアレイであることを特徴とする。
[0019] さらに、本発明の Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法は、 Aurora A阻害剤 を投与した被検体由来の組織における Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7 、 TACC3及び KNTC2からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質を検出す る検出工程と、 Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工程を含むことを 特徴とする。かかる方法により、簡便且つ非侵襲的に Aurora A阻害剤の薬効の予測 又は診断を行うことが可能となる。
[0020] ここで、本発明の Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法は、前記検出に用い る検出手段が抗 Aurora B抗体、抗 Histone H3抗体、抗 BIRC5抗体、抗 PRC1抗体、 抗 DLG7抗体、抗 TACC3抗体又は抗 KNTC2抗体であることを特徴とする。
[0021] また、本発明の Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法にお!/、ては、前記組 織が血液、皮膚、毛根、口腔粘膜、消化管、骨髄又は癌組織であることを特徴とする 。これらの組織を用いることにより、比較的容易にサンプルの調製が可能となり、非侵 襲的な薬効の予測又は診断が可能となる。
発明の効果
[0022] Aurora A阻害剤を生体に投与した際に Aurora A特異的に当該阻害剤が作用した か否かを検出する遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを得ることが可能となり、 これらのマーカーの発現を指標として、簡便且つ非侵襲的に Aurora A阻害剤の薬効 の予測又は診断を行うことが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0023] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
[0024] 本発明に係る「Aurora A遺伝子」には、 Aurora A遺伝子と同等の生理機能を有し、 且つキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであれば 1又は 2以上の塩基 の置換、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。ここで、当該遺伝子としては 、力、かるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は特に制限されないが、相 同性が 50%以上であることが好ましぐ 70%以上であることがより好ましぐ 80%以上 であることカさらに好ましく、 90%以上(ί列えば、、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99%以上)であることが特に好ましい。
[0025] また、本発明に係る Aurora A遺伝子には、 Aurora A遺伝子とストリンジヱントな条件 下でハイブリダィズする核酸も含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダ ィズする」とは、二つの核酸断片力 s、 Molecular Cloning : A Laboratory Manual、第 2版、コールドスプリングハーバー(1989)、 9.47-9.62及び 11.45-11.61に記載された ハイブリダィゼーシヨン条件下で、相互にハイブリダィズすることを意味する。より具体 的には、例えば、約 45°Cにて 6.0 X SSCでハイブリダィゼーシヨンを行った後に、 50°C にて 2.0xSSCで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジエンシー選択のため、洗浄ェ 程における塩濃度を、例えば低ストリンジエンシーとしての約 2.0xSSC、 50°Cから、高 ストリンジエンシーとしての約 0.2 X SSC、 50°Cまで選択することができる。さらに、洗浄 工程の温度を低ストリンジエンシー条件の室温、約 22°Cから、高ストリンジエンシー条 件の約 65°Cまで上昇させることができる。
[0026] また、 Aurora Aは Aik、 Aurora- 2、 AIRK1、 STK15、 BTAK、 ARK1、 IAK1又は Aykl等 と称されること力 Sfcる力 これらはいずれあ本発明に係る Aurora Aと同義である。
[0027] 本発明における「Aurora A阻害剤」とは、 Aurora Aキナーゼの活性を阻害する物質
、分子をいう。力、かる阻害剤は Aurora Aの阻害剤として機能する分子であればその 分子種は特に制限されず、具体的には、例えば、低分子化合物、タンパク質、ぺプ チドを挙げること力 Sできる。前記低分子化合物としてもその種類は特に制限されず、 具体的には、例えば、天然化合物、有機化合物又は無機化合物が挙げられる。また 、前記低分子化合物の具体例としては、例えば、 MLN8054, ZM447439, 6_((4-(2,3_ aifiuorobenzoyl)piperazin-l-yl)methyl)-N-thiazol-2-ylpyriain-2-amine 6_((4_(2_flu oro-J-(,trifluoromethyl)benzoyl)piperazin- 1 _yl)methyl)_N_ 1 n-pyrazoi-J-yipyrazin-2 -amine、 6_((4_(3_chloro_2_fluorobenzoyl)piperazin_ 1 _yl) methyl)-N-thiazol-2-ylpyr idin-2-amineが挙げられる。また、前記ペプチドとしてもその種類は特に制限されず、 任意のアミノ酸数を有して!/、てもよ!/、。
[0028] また、当該阻害剤は、 Aurora Aや Aurora Aを介した細胞内情報伝達経路上の分子 の機能異常によって生じる疾患であれば特にその対象疾患は限定されない。当該阻 害剤の対象となる疾患として、例えば、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、 乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、瞵癌、瞵内分泌腫瘍、胆管癌、胆 嚢癌、陰茎癌、腎盂 ·尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子 宮癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、乳癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、悪性黒色腫 、菌状息肉症、皮膚癌、軟部肉腫、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄 腫又は白血病が挙げられる。
[0029] また、本発明に係る「Aurora B (NM_004217)、 Histone H3 (NM_002107又は NM_005 324)、 BIRC5 (NM— 001012270、 NM— 001012271又は NM— 001168)、 PRC1 (NM— 003981 、 NM_199413又は NM_199414)、 DLG7 (NM_014750)、 TACC3 (NM_006342)及び KN TC2 (NM_006101)からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子」には、 Aurora B 、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3又は KNTC2からなる群より選択される いずれか一つの遺伝子と同等の生理機能を有するタンパク質をコードするものであ れば 1又は 2以上の塩基の置換、欠失、付加又は挿入がある遺伝子も含まれる。ここ で、当該遺伝子としては、力、かるタンパク質をコードする遺伝子であればその配列は 特に制限されないが、相同性が 50%以上であることが好ましぐ 70%以上であること 力 り好ましぐ 80%以上であることがさらに好ましぐ 90%以上(例えば、 91、 92、 9
3、 94、 95、 96、 97、 98、 99%以上)であることカ特に好ましい。
また、本発明に係る Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3又は KN TC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子には、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3又は KNTC2からなる群より選択されるいずれか一つ の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、且つ、当該遺伝子と同等の 活性を有するタンパク質をコードする核酸も含まれる。ここで、「ストリンジェントな条件
つの核酸断片力 S、 Molecular Cloning : A Laboratory
Manual,第 2版、コールドスプリングハーバー(1989)、 9·47_9·62及び 11.45-11.61に 記載されたハイブリダィゼーシヨン条件下で、相互にハイブリダィズすることを意味す る。より具体的には、例えば、約 45°Cにて 6.0 X SSCでハイブリダィゼーシヨンを行った 後に、 50°Cにて 2.0xSSCで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジエンシー選択のた め、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジエンシーとしての約 2.0xSSC、 50 。じから、高ストリンジエンシーとしての約 0.2 X SSC、 50°Cまで選択することができる。さ らに、洗浄工程の温度を低ストリンジエンシー条件の室温、約 22°Cから、高ストリンジ エンシー条件の約 65°Cまで上昇させることができる。 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3又は KNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子 とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸の具体例としては、例えば、当該 遺伝子の中に SNPや RFLPのような多型を有する核酸が挙げられる。
[0031] (1)遺伝子マーカー
本発明の遺伝子マーカーは、 Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断する遺伝子 マーカーであって、当該遺伝子が、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 T ACC3及び KNTC2からなる群より選択されるいずれか一つの遺伝子又は該遺伝子と 実質的に同等の機能を有する遺伝子であることを特徴とする。
[0032] 本発明の「遺伝子マーカー」とは、評価対象となる Aurora A阻害剤の薬効や生体に 対する作用の指標となるものをいい、具体的には、 Aurora A阻害剤の作用によって 発現量や活性が変化する遺伝子又はこれらに関連する物質 (例えば、 DNA及び RN A並びにこれらの断片)を!/、う。
[0033] また、本発明の遺伝子マーカーには、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG
7、 TACC3及び KNTC2の一部からなるポリヌクレオチドも含む。このようなポリヌクレオ チドは、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3及び KNTC2遺伝子 力、ら転写された RNA、これ力、ら産生される cDNA、ならびにこれらの遺伝子由来の配 列を有する合成核酸であってもよレ、。
[0034] 本発明者らは、本発明の遺伝子マーカーの発現が Aurora A阻害剤の投与によつ て増加することを確認している。また、 Aurora A及び Aurora Bの発現を、 siRNAを用い て抑制したところ、 Aurora Aの発現が抑制された場合にのみ遺伝子マーカーとなる 遺伝子の発現が上昇することが確認された。すなわち、本発明の遺伝子マーカーは Aurora A阻害剤の選択的 ·特異的なマーカーとして機能することが確認されている。
Aurora A阻害の細胞表現型は、細胞分裂チェックポイントの活性化により惹起される 細胞分裂遅延と分裂期細胞死(mitotic catastrophe)の誘導である。一方、 Aurora B 阻害の細胞表現型は、細胞分裂チェックポイントの解除と細胞質分裂阻害による細 胞核の多倍体化である。従って、 Aurora B阻害は Aurora A阻害の効果を打ち消す方 向に作用する。また、 Aurora Aと Aurora Bとは高い相同性を示し、多くの ATP競争的 Aurora阻害剤が Aurora A及び Aurora Bの両方を阻害する。すなわち、 Aurora A選択 的マーカーは Aurora A選択的阻害剤の開発における候補化合物のスクリーニング や評価に重要なツールであると言え、また、臨床においては薬効予測又は診断のた めのマーカーとして有用である。
[0035] 本発明の遺伝子マーカーは、 Aurora A阻害剤の投与により生体内組織中でその 発現が増加する。 Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断する場合には、遺伝子マ 一力一が発現している任意の組織における当該遺伝子マーカーの発現量を測定す ればよいが、サンプルの入手が容易であるとの観点から血液又は皮膚組織における 発現量を測定することが好まし!/ヽ。
[0036] また、本発明の遺伝子マーカーの発現量の測定方法としては特に制限はないが、 具体的には、例えば、ノーザンブロット法、定量的 RT-PCR法、 DNAマイクロアレイに よって mRNA量を測定することによりその発現量を定量することができる。
[0037] ここで、前記ノーザンブロット法に使用するプローブとしては、本発明の遺伝子マー カーである Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3又は KNTC2遺伝
子を検出可能なプローブであればよぐ具体的には、これらの遺伝子の塩基配列の 部分配列又は全部を使用することができる。また、当該プローブの塩基数についても 特に制限はないが、少なくとも連続する 20塩基の長さの核酸であることが好ましぐよ り好ましくは 40塩基、さらに好ましくは 60塩基、特に好ましくは 80塩基以上のものが 使用される。また、当該プローブは、必要に応じて検出可能なように標識して用いて もよい。具体的には、例えば、 32P、 14C、 125I、 3H、 35S等の放射性同位体で標識され ていてもよく、ビォチン、蛍光色素、酵素、金コロイド等で標識されていてもよい。
[0038] また、前記定量的 RT-PCR法に使用するプライマーとしては、本発明の遺伝子マー カーである Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3又は KNTC2遺伝 子を検出可能なプライマーであればよぐその塩基数は特に制限されず、プライマー の塩基配列や単離する遺伝子の塩基配列等によって適宜設定することができるが、 一般に、連続した 10〜60塩基であることが好ましぐ 15〜30塩基であることがより好 ましい。また、その塩基配列は、検出の対象となる Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PR Cl、 DLG7、 TACC3又は KNTC2遺伝子の塩基配列に基づいて決定する。
[0039] また、前記 DNAマイクロアレイによって本発明の遺伝子マーカーの発現量を測定す る場合、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3又は KNTC2遺伝子 のうちの少なくとも一つの遺伝子又は当該遺伝子の部分核酸がスポットされた DNAマ イクロアレイを準備し、測定を行えばよい。
[0040] また、本発明の遺伝子マーカーは、 Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断するた めに用いられる。すなわち、 Aurora A阻害剤を生体に投与した後、当該遺伝子マー カーの発現量を測定し、投与前の発現量と比較して発現量が増加している場合に、 当該阻害剤が Aurora A特異的に作用し所定の薬効を発揮して!/、ると認定することが できる。具体的には、 Aurora A阻害剤を投与後、本発明の遺伝子マーカーの発現が 増加していれば、仮に Aurora A阻害剤の薬効が目に見える状態(例えば、癌症状の 改善)に至っていない場合や、癌組織が非常に小さぐ X線撮影のような従来の診断 方法では診断が困難な場合であっても、阻害剤の薬効が発揮されるであろうと予測 できる。また、 Aurora A阻害剤を薬剤として開発する段階において健常人を対象に 臨床試験を行う場合、本発明の遺伝子マーカーの発現量を指標にして当該薬剤の
効果を評価することが可能となる。
[0041] また、本発明の遺伝子マーカーは、癌の治癒成績を判定する際にも使用できる。す なわち、 Aurora A阻害剤を抗癌剤として生体に投与し癌治療を行った場合、抗癌剤 が効いた力、どうかを判定するには実際に癌組織が縮小したことや癌細胞が減少した ことを確認する必要がある。このような確認作業には、 X線断層撮影や X線造影撮影 のような放射線を浴びるような検査や、内視鏡やバイオプシーのような患者の負担を 伴う検査が必要となる。しかし、本発明の遺伝子マーカーによれば、血液や皮膚のよ うな体組織の一部を極小量採取し、当該組織における遺伝子マーカーの発現を測 定するだけで検査が完了する。従って、 X線断層撮影、 X線造影撮影、内視鏡又は バイオプシーのような検査に代えて又はこれらの検査の予備的な検査として、患者に 苦痛や負担を与えることなく Aurora A阻害剤の薬効を判定することが可能となる。
[0042] (2)タンパク質マーカー
本発明のタンパク質マーカーは、 Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断するタン パク質マーカーであって、当該タンパク質力 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1 、 DLG7、 TACC3及び KNTC2からなる群より選択されるいずれか一つのタンパク質又 は実質的に同等の機能を有することを特徴とする。
[0043] 本発明の「タンパク質マーカー」とは、評価対象となる Aurora A阻害剤の薬効や生 体に対する作用の指標となるものをいい、具体的には、 Aurora A阻害剤の作用によ つて発現量や活性が変化するタンパク質又はこれらに関連する物質 (例えば、部分 ペプチド)をいう。
[0044] 本発明者らは、これらのタンパク質をコードする遺伝子のみならずタンパク質の発 現が Aurora A阻害剤の投与によって増加することを確認している。また、 Aurora A及 び Aurora Bの発現を、 siRNAを用いて抑制したところ、 Aurora Aの発現が抑制された 場合にのみタンパク質マーカーとなるタンパク質の発現が上昇することが確認された 。すなわち、本発明のタンパク質マーカーは Aurora A阻害剤の選択的'特異的なマ 一力一として機能する。
[0045] 本発明のタンパク質マーカーは、 Aurora A阻害剤の投与により生体内組織中でそ の発現が増加する。 Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断する場合には、タンパク
質マーカーが発現している任意の組織における当該タンパク質マーカーの発現量を 測定すればょレ、が、サンプルの入手が容易であるとの観点から血液又は皮膚組織に おける発現量を測定することが好ましい。
[0046] ここで、本発明のタンパク質マーカーは、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 D LG7、 TACC3及び KNTC2からなる群より選択される!/、ずれか一つのタンパク質と実 質的に同等の機能を有するタンパク質を含む。このようなタンパク質としては、 Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3又は KNTC2タンパク質を構成するァ ミノ酸配列のうち 1又は 2以上のアミノ酸に置換、付カロ、欠失又は挿入があり、且つ、 同等の活性を有するものが挙げられる。同等の活性とは、 Aurora Bと実質的に同等 の機能を有するタンパク質であれば Aurora Bと同様のキナーゼ活性を有することをい い、 Histone H3と実質的に同等の機能を有するタンパク質であれば Histone H3活性 を、 BIRC5と実質的に同等の機能を有するタンパク質であれば BIRC5活性を、 PRC1と 実質的に同等の機能を有するタンパク質であれば PRC1活性を、 DLG7と実質的に同 等の機能を有するタンパク質であれば DLG7活性を、 TACC3と実質的に同等の機能 を有するタンパク質であれば TACC3活性を、 KNTC2と実質的に同等の機能を有する タンパク質であれば KNTC2活性を、それぞれ有することをいう。また、 Aurora B、 Hist one H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3又は KNTC2タンパク質を構成するアミノ酸配 列のうち 1又は 2以上のアミノ酸に置換、付カロ、欠失又は挿入があるタンパク質につ いて、その配列は特に制限されないが、相同性が 50%以上であることが好ましぐ 70 %以上であることがより好ましぐ 80%以上であることがさらに好ましぐ 90%以上(例 えば、、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99%以上)であることカ特に好ましい。
[0047] また、本発明の遺伝子マーカーの発現量の測定方法としては特に制限はないが、 具体的には、例えば、ウェスタンブロット法、 ELISA法、プロテインチップによってタン ノ ク質量を測定することによりその発現量を定量することができる。
[0048] ここで、前記ウェスタンブロット法は当業者に公知の方法で行うことができる。具体 的には、例えば、 Aurora A阻害剤を投与した生体から採取した組織の総タンパク質 を SDS-PAGEにより展開し、ニトロセルロース膜や PVDF膜等へ転写する。その後、当 該膜に本発明のタンパク質マーカーの抗体を添加、反応させ、さらに 2次抗体を添カロ
、反応させた後、当該 2次抗体を検出することにより、当該タンパク質マーカーを検出 すればよい。また、生体から採取した組織の総タンパク質をタンパク質マーカーの抗 体で免疫沈降し、沈降物として得られたタンパク質を SDS-PAGEにより展開し、ウェス タンプロット法により検出してもよ!/、。
[0049] 前記ウェスタンブロット法に使用する抗体としては、本発明のプロテインマーカーで ある Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3及び KNTC2タンパク質を 検出可能な抗体であればよぐポリクローナル抗体であってもよくモノクローナル抗体 であってもよい。力、かるポリクローナル抗体は当業者に公知の方法で調製すればよく 、例えば下記の方法に従って調製できる。すなわち、例えば、抗原を、必要に応じて フロイントアジュバント(Freund' s Adjuvant)とともに、マウス、ラット、ノヽムスター、 モルモット又はゥサギ等の哺乳動物に免疫し、当該免疫感作動物から得た血清から 取得すること力 Sでさる。
[0050] また、前記モノクローナル抗体は、例えば、抗原を、必要に応じてフロイントアジュバ ントとともに、マウス、ラット、ノ、ムスター、モルモットまたはゥサギ等の哺乳動物に免疫 する。次に、当該免疫感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨 髄腫系細胞(ミエローマ細胞)からハイプリドーマ(融合細胞)を調製し、ハイプリドー マをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノ クローナル抗体を産生するクローンを選択することによって調製することができる。さ らに具体的には、抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント哺乳動物の皮下内、筋 肉内、静脈内又は腹腔内等に 1又は数回注射するかあるいは移植することにより免 疫感作を施す。通常、最初の免疫から;!〜 14日毎に;!〜 4回程度免疫を行い、最終 免疫より;!〜 5日程度後に免疫感作された哺乳動物から抗体産生細胞を取得する。
[0051] モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ(融合細胞)の調製は、定法に従って 行うこと力 Sできる。すなわち、上述した方法により免疫感作された哺乳動物から取得さ れる脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞 と、マウス、ラット又はヒト等由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融 合させることにより調製する。モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマクローンの スクリーニングは、ハイプリドーマをマイクロタイタープレート等を用いて培養し、増殖
の見られたゥエルの培養上清の免疫抗原に対する反応性を、例えば RIAや ELISA 等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
[0052] ハイプリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイプリドーマをインビトロ、又 はマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはゥサギ等の腹水中等でのインビボで培 養した後、得られた培養上清、又は哺乳動物の腹水から単離することにより行うことが できる。モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和 硫酸アンモニゥム、ユーグロブリン沈澱法、力プロイン酸法、力プリル酸法、イオン交 換クロマトグラフィー(DEAEまたは DE52等)、抗ィムノグロブリンカラムあるいはプロ ティン Aカラム等のァフィ二ティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うこと ができる。
[0053] さらに、上述の方法により得られたポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用 いて抗体アレイを調製することも可能である。すなわち、上述の抗体をニトロセルロー ス膜ゃ PVDF膜等の膜や、ニトロセルロースがコートされたスライドやガラス基盤に、マ イクロアレイスポッターを用いて固定すればょレ、。
[0054] 一方、本発明のタンパク質マーカーである Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3又は KNTC2の少なくとも一つのタンパク質をニトロセルロース膜や PV DF膜等の膜や、ニトロセルロースがコートされた基盤やガラス基盤にマイクロアレイス ポッターを用いて固定することによりプロテインアレイを調製することもできる。この場 合、前記タンパク質を直接固定してもよぐタンパク質又は膜若しくは基盤との間にリ ンカーを介して固定してもよい。リンカ一を介して固定することにより、タンパク質の立 体構造を損なわず活性を維持した状態でプロテインアレイを調製することが可能とな
[0055] 本発明のタンパク質マーカーは、 Aurora A阻害剤の薬効を予測又は診断するため に用いられる。すなわち、 Aurora A阻害剤を生体に投与した後、当該タンパク質マー カーの発現量を測定し、投与前の発現量と比較して発現量が増加している場合に、 当該阻害剤が Aurora A特異的に作用し所定の薬効を発揮して!/、ると認定することが できる。具体的には、 Aurora A阻害剤を投与後、本発明のタンパク質マーカーの発 現が増加していれば、仮に Aurora A阻害剤の薬効が目に見える状態(例えば、癌症
状の改善)に至っていない場合や、癌組織が非常に小さぐ X線撮影のような従来の 診断方法では診断が困難な場合であっても、阻害剤の薬効が発揮されるであろうと 予測できる。また、 Aurora A阻害剤を薬剤として開発する段階において健常人を対 象に臨床試験を行う場合、本発明のタンパク質マーカーの発現量を指標にして当該 薬剤の効果を評価することが可能となる。
[0056] また、本発明のタンパク質マーカーは、癌の治癒成績を判定する際にも使用できる 。すなわち、 Aurora A阻害剤を抗癌剤として生体に投与し癌治療を行った場合、抗 癌剤が効いた力、どうかを判定するには実際に癌組織が縮小したことや癌細胞が減少 したことを確認する必要がある。このような確認作業には、 X線断層撮影や X線造影 撮影のような放射線を浴びるような検査や、内視鏡やバイオプシーのような患者の負 担を伴う検査が必要となる。しかし、本発明のタンパク質マーカーによれば、血液や 皮膚のような体組織の一部を極小量採取し、当該組織におけるタンパク質マーカー の発現を測定するだけで検査が完了する。従って、 X線断層撮影、 X線造影撮影、内 視鏡又はバイオプシーのような検査に代えて又はこれらの検査の予備的な検査とし て、患者に苦痛や負担を与えることなく Aurora A阻害剤の薬効を判定することが可能 となる。
[0057] (3)癌診断キット
本発明の癌診断キットは、本発明のタンパク質マーカーを検出可能の抗体を含む ことを特徴とする。当該抗体は、上述した Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DL G7、 TACC3及び KNTC2からなる群より選択される!/、ずれか一つのタンパク質又は実 質的に同等の機能を有するタンパク質に対するポリクローナル抗体及びモノクローナ ル抗体をいう。
[0058] 本発明の癌診断キットには、本発明のタンパク質マーカーを検出可能な抗体の他、 例えば、抗体検出用試薬、抗体検出用 2次抗体、反応に用いるプレートを備えてい てもよい。
[0059] 本発明の癌診断キットを用いることにより、 Aurora A阻害剤を投与した生体から採 取した組織 (例えば、血液又は皮膚)におけるタンパク質マーカーを迅速且つ簡便に 検出することが可能となり、投与前後のタンパク質量を比較することにより、 Aurora A
阻害剤の薬効を予測又は診断することが可能となる。
[0060] (4) Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法
先ず、本発明の第 1の Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法について説明 する。
[0061] 本発明の第 1の Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法は、 Aurora A阻害剤 を投与した被検体由来の組織における Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7 、 TACC3及び KNTC2からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝 子と実質的に同等の機能を有する遺伝子を検出する検出工程と、 Aurora A阻害剤 投与前後の発現量を比較する比較工程を含むことを特徴とする。
[0062] 本発明に係る検出工程は、 Aurora A阻害剤を投与した被検体由来の組織におけ る Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3及び KNTC2からなる群より 選択される少なくとも一つの遺伝子又は該遺伝子と実質的に同等の機能を有する遺 伝子(すなわち、本発明の遺伝子マーカー)を検出する工程である。
[0063] ここで、本発明に係る「組織」とは、 Aurora A阻害剤を投与した被験体由来の組織 であり、検出対象である遺伝子マーカーが発現している組織であればその組織種は 限定されなレ、が、採取が容易であるとの観点より血液又は皮膚組織であることが好ま しい。
[0064] 本工程にお!/、ては、 Aurora A阻害剤を投与した生体より前記組織を採取し、そこか ら遺伝子マーカー測定用の DNAを定法により抽出する。力、かる DNAはゲノム DNAで あってもよく、抽出した RNAから逆転写反応によって得られた cDNAであってもよい。 次に、得られた DNAを用いて Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3 又は KNTC2遺伝子の検出を行う。検出方法は定量的な手段であれば特に限定され ないが、具体的には、例えば、 PCR法又はマイクロアレイが挙げられる。
[0065] 検出工程で Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3又は KNTC2遺 伝子の検出が完了した後、 Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工程 へと進む。比較工程では、検出工程で検出した Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC 1、 DLG7、 TACC3又は KNTC2遺伝子の発現量と、 Aurora A阻害剤を投与する前の 当該遺伝子の発現量とを比較することとなる。比較の結果、 Aurora A阻害剤の投与
によって当該遺伝子の発現量が増加している場合には、投与した Aurora A阻害剤が 投与対象である人体に当該阻害剤が適切な作用機序で作用し、投与効果を示して いると判断することができる。これは癌組織が非常に小さい場合や、医薬開発の臨床 試験段階のように、物理的な癌組織の大きさだけで薬効を測定することが困難な場 合に、 Aurora A阻害剤の薬効を測定する方法として非常に有益である。
[0066] 次に、本発明の第 2の Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法につ!/、て説明 する。
[0067] 本発明の第 2の Aurora A阻害剤の効果の予測又は診断方法は、 Aurora A阻害剤 を投与した被検体由来の組織における Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7 、 TACC3及び KNTC2からなる群より選択される少なくとも一つのタンパク質又は該タ ンパク質と実質的に同等の機能を有するタンパク質を検出する検出工程と、 Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較工程を含むことを特徴とする。
[0068] 本発明に係る検出工程は、 Aurora A阻害剤を投与した被検体由来の組織におけ る Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3及び KNTC2からなる群より 選択される少なくとも一つのタンパク質又は当該タンパク質と実質的に同等の機能を 有する遺伝子(すなわち、本発明のタンパク質マーカー)を検出する工程である。
[0069] ここで、本発明に係る「組織」とは、 Aurora A阻害剤を投与した被験体由来の組織 であり、検出対象であるタンパク質マーカーが発現している組織であればその組織 種は限定されないが、採取が容易であるとの観点より血液又は皮膚組織であることが 好ましい。
[0070] 本工程にお!/、ては、 Aurora A阻害剤を投与した生体より前記組織を採取し、そこか らタンパク質マーカー測定用のタンパク質を定法により抽出する力、、又は、当該タン ノ ク質を含む総タンパク質を採取する。具体的には、例えば、ウェスタンプロット法に よる検出に供すること力できるよう、当該タンパク質を含む総タンパク質を可溶化サン プルとして調製し、本工程に係る抽出タンパク質とすることができる。また、総タンパク 質をサンプルとして、検出対象となるタンパク質の抗体を用いて免疫沈降を行い、当 該タンパク質のみを抽出してもよい。
[0071] 次に、得られたタンパク質を用いて Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、
TACC3又は KNTC2タンパク質の検出を行う。検出方法は定量的な手段であれば特 に限定されないが、具体的には、例えば、ウェスタンブロット法又は ELISA法が挙げら れる。ここで、ウェスタンブロット法又は ELISA法による検出には抗 Aurora B抗体、抗 Histone H3抗体、抗 BIRC5抗体、抗 PRC1抗体、抗 DLG7抗体、抗 TACC3抗体又は 抗 KNTC2抗体を用いる必要がある。これらの抗体はポリクローナル抗体又はモノクロ ーナル抗体のいずれであってもよい。また、これらの抗体は定法により調製すること ができ、例えば、(2)タンパク質マーカーの項で述べた方法により調製することができ
[0072] 検出工程で Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PRC1、 DLG7、 TACC3又は KNTC2タン ノ ク質の検出が完了した後、 Aurora A阻害剤投与前後の発現量を比較する比較ェ 程へと進む。比較工程では、検出工程で検出した Aurora B、 Histone H3、 BIRC5、 PR Cl、 DLG7、 TACC3又は KNTC2タンパク質の発現量と、 Aurora A阻害剤を投与する 前の当該タンパク質の発現量とを比較することとなる。比較の結果、 Aurora A阻害剤 の投与によって当該タンパク質の発現量が増加している場合には、投与した Aurora A阻害剤が投与対象である人体に当該阻害剤が適切な作用機序で作用し、投与効 果を示していると判断することができる。これは癌組織が非常に小さい場合や、医薬 開発の臨床試験段階のように、物理的な癌組織の大きさだけで薬効を測定すること が困難な場合に、 Aurora A阻害剤の薬効を測定する方法として非常に有益である。 実施例
[0073] 以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実 施例に限定されるものではない。
[0074] 試験例:!〜 14
(遺伝子発現解析)
Aurora A阻害剤の効果を評価することができる PDマーカーを同定するために、 Aur ora A阻害剤または Aurora Aの siRNAによって特異的に発現変化する遺伝子群をマ イクロアレイ解析により検索した。マイクロアレイ解析は、 GeneChip array(U_133A: Aff ymetrix社)により、下記の試料を供して実施した。
[0075] 1. Aurora A又は Aurora Bの siRNAを処置した場合の GeneChip解析
HeLa_S3細胞に Aurora A、 Aurora B又はルシフェラーゼ(Luciferase:コントローノレ) の siRNAをリボフヱクシヨンにより導入し (濃度: 12.5nM)、 24時間後と 48時間後に細胞 を回収し、マイクロアレイ解析用に RNAを調製した。すなわち、下記 6種の試料を得た
〇
[0076] Aurora A siRNA 24hr (試験例 1 )
Aurora A siRNA 48hr (試験例 2)
Aurora B siRNA 24hr (試験例 3)
Aurora B siRNA 48hr (試験例 4)
Luciferase siRNA 24hr (試験例 5)
Luciferase siRNA 48h (試験例 6)
2. Aurora-A阻害剤を処置した場合の GeneChip解析
HeLa- S3細胞に Aurora A阻害剤である 6- ((4- (2,3- difluorobenzoyDpiperazin -卜 yl) methyl)- N- thiazo卜 2- ylpyridin- 2- amineを各 1, 3, 10 M作用させ、 24時間後と 48時 間後に細胞を回収し、マイクロアレイ解析用に RNAを調製した。コントロールとして DM SOを用いた。すなわち、下記 8種の試料を得た。
[0077] Aurora A阻害剤 (1 μ M) 24hr (試験例 7)
Aurora A阻害剤 (1 μ M) 48hr (試験例 8)
Aurora A阻害剤 (3 μ M) 24hr (試験例 9)
Aurora A阻害剤 (3 μ M) 48hr (試験例 10)
Aurora A阻害剤 (10 μ M) 24hr (試験例 1 1 )
Aurora A阻害剤 (10 M) 48hr (試験例 12)
DMSO 24hr (試験例 1 3)
DMSO 48h (試験例 14)
次に、 Aurora A特異的な PD markerの候補遺伝子を抽出するため、以下の 3つの 条件を満たす遺伝子群を抽出した。すなわち、下記(1 )〜(3)の条件を満たす遺伝 子群を抽出した。
( 1 )上記 2 ·において DMSOをコントロールとした場合、試験例 7〜; 12として 6-((4-(2,3 _difluorobenzoyl)piperazin_ l _yl)methyl)- N- thiazoト 2_vlpvridin_2_amineを作用させ
た試料のなかで、発現が 1.5倍以上有意に変化しているもの。
(2)上記 1 ·にお!/、てルシフェラーゼをコントロールとした場合、 Aurora Aの siRNAを 2 4時間または 48時間処置した試料 (試験例 1及び 2)のなかで、発現が 1.5倍以上有意 に変化しているもの。
(3)上記 1 ·にお!/、てルシフェラーゼをコントロールとした場合、 Aurora Bの siRNA処 置した試料 (試験例 3及び 4)のなかで、発現が変化して!/、な!/、もの(Aurora Aで特異 的に発現変化しているもの)。
(4)上記 1.力 3.を満たし、かつ Aurora Aの基質または関連した機能を持つことが 報告されている遺伝子。
[0078] その結果、 Aurora Aの阻害により発現が変化する力 Aurora Bの阻害によっては発 現が変化しない遺伝子として、 BIRC5、 KNTC2、 PRC1、 TACC3及び DLG7が見出さ れ 。
(Aurora A又は Aurora Bの発現を抑制した場合の PDマーカー候補遺伝子の発現 変化)
試験例 1〜6の試料について、 PDマーカー候補遺伝子の発現変化を rea卜 time PC Rにて確認した。先ず、細胞より単離した total RNA力、ら、逆転写酵素を用いて cDNA を調製した。得られた cDNAから、 TaqMan試薬に添付される一般的プロトコールに従 い、 real-time PCRを行った。
[0080] real-time PCRに用いたプライマーセットは、以下のとおりである。また、いずれのプ ライマー及びプローブもヒト遺伝子を铸型とした。
[0081] [表 1]
Gene Forward primer Reverse primer Probe
BIRC5 CTTTCTTTGGAGGCAGCAGC GGGCGAATCMATCCATCAT CGCAGG GCTGAAGTCTGGCG TAA (配列番号 1 ) (配列番号 2 ) (配列番号 3 )
PRC1 TCTCATCTCCCCCATTCCTG ACTCCCAATGTGGCTGGC TGCCTG AGTTCTTCTACCCC CGC (配列番号 4 ) (配列番号 5 ) A (配列番号 6 )
KNTC2 AGA ATTCCAAAGGTTAT GACT GCCCTGTATTTGACAAGGCAG AAGTTTMTCCCGAGGCTGG TGC TTGAAA (配列番号 7 ) (配列番号 8 ) CA (配列番号 9 )
TACC3 MGAAGTGCGTGGAGGA TTAC GCCTTCAGGGCTTGGTACCT CMGGA TCACCCAGGAGGGC CA CT (配列番号 1 0 ) (配列番号 1 1 ) (配列番号 1 2 )
DLG7 GCTGGAGAGGAGACATCAAGA CCTGGTTGTAGAGGTGMAAAGT TGCCAG ACACATTTCTTTTG GTG AC (配列番号 1 3 ) MTC (配列番号 1 4 ) GTAACC (配列番号 1 5 )
[0082] 図 1〜5に示すとおり、 Aurora Aの siRNAを作用させた場合には、作用時間が 24時 間、 48時間ともに、候補遺伝子の発現が上昇していることが確認できた。一方、 Auror a Bの siRNAを作用させた場合には、 Aurora-Aに見られるような変化はなかった。
[0083] 実施例 2
(Aurora A阻害剤を作用させた場合の PDマーカー候補遺伝子の発現変化)
HeLa- S3細胞に 6- ((4- (2,3- difluorobenzoyl)piperazin- 1- yl)methyl)- N-thiazo卜 2- yl pyridin-2-amineを所定濃度作用させ、 24時間後に細胞を採取し、 total RNAを単離 後 cDNAとし、実施例 1と同様の方法で rea卜 time PCRを行った。
[0084] 図 6〜; 10に示すとおり、 PDマーカー候補遺伝子は Aurora A阻害剤の濃度依存的 に発現上昇することが確認された。
[0085] 実施例 3
(Aurora A阻害剤をラットに持続投与した場合の移植ガンにおける PDマーカー候補 遺伝子の発現変化)
先ず、 F344/N Jc卜 mu系統の雌ヌードラットの背側部皮下に子宮頸癌株 HeLa-luc 細胞を移植した。 1週間後、胆癌ヌ一ドラットの大腿静脈力二ユレーシヨン手術を行い 、シリンジポンプを用いて Aurora A阻害剤である 6-((4-(2-fluoro-3-(trifluoromethyl)b enzoyl)piperazin_丄一 yl)methyl)_N_lH_pyrazol_3_ yipyrazin_2_amineを 48時間百争月爪内
点滴投与した。投与後、摘出した移植癌及び皮膚標本は液体窒素中にて凍結保存 した。
[0086] 次に、摘出した移植ガンより total RNAを単離し cDNAを作成し、 PDマーカー候補遺 伝子の発現変化をみた。また、培養細胞で同定した 5遺伝子に加え Aurora A(AurA) 及び Aurora B(AurB)も候補遺伝子として検討した。 Aurora A及び Bのプライマー'プ ローブセットは次のとおりである。また、いずれのプライマー及びプローブもヒト遺伝子 を铸型とした。
[0087] [表 2]
[0088] 図 11及び 12に示すとおり、ラットに阻害剤を投与した場合においても、 PDマーカ 一候補遺伝子の発現は上昇することが明らかになった。また、その発現変化は、 Imp kをピークであることが確認された。また、 BIRC5、 DLG7の発現は有意に増加している ことが確認された。従って、 6- ((4- (2- fluoro- 3- (trifluoromethyl)benzoyl)piperazin- 1- y l)methyl)-N-lH-pyrazo卜 3-ylpyrazin-2-amineを薬剤として投与した場合、被検組織 における PDマーカー候補遺伝子群の発現を調べることで、薬効の予測が可能となる
〇
[0089] 実施例 4
(Aurora A阻害剤をラットに持続投与した場合の皮膚における PDマーカー候補遺伝 子の発現変化)
実施例 3で使用したのと同じラットの皮膚について、 reaト time PCRにより、 PDマーカ 一候補遺伝子の発現変化を調べた。ラットにおける候補遺伝子のプライマーは次に 示すとおりである。また、いずれのプライマー及びプローブもラット遺伝子を铸型とし た。なお、プローブは FAM/TAMRA修飾をしたものを使用した。
[0090] [表 3]
Gene Forward primer Reverse primer Probe
AurA GATCCAGTCCCACCTGCG CTGGTGGCGTCATGGMAT CACCCCAACATCCTCAGGCTGT
(配列番号 22) A (配列番号 23) ATGG (配列番号 24)
AurB TTGCGGACTTTGGCTGGT GGTGCCGCACATGGTCTT TGCATGCCC CATCCCTGAGGAG
(配列番号 25) (配列番号 26) (配列番号 27)
BIRC5 GGAACCGGATGACAACCC TTGACTGTAAGGAAGGCGC AGAGGAGCA TAGGAAGCACTCC
TA (配列番号 28) A (配列番号 29) CCTGG (配列番号 30)
DLG7 GGAACAGTGCCATCTACC TCCCCTTCTTTCTGATCCG AAAGCCAGT CACAAGAGCCACC
ACAA (配列番号 31) TT (配列番号 32) AATGA (配列番号 33)
KNTC2 TCGGTTTCCAGCTGTGGT AGGCCAGGTTTATTGAGGT CCGCCTCTC TATGCAGGAGTTA
G (配列番号 34) CC (配列番号 35) AGATCCC (配列番号 36)
PRC1 GCATATCCATCTGTCGGA TTATCTTCCTCAAATGGCT CTGAGCACC CTGTGCAGCGAGC
AGG (配列番号 37) TGACTT (配列番号 38) TA (配列番号 39)
TACC3 TGCCTTCCTCAGGCTTGC AGAGATCGCCCAAGTGCG TGGAGAGCCAGTGCCTCTGCTT
(配列番号 40) (配列番号 41) GG (配列番号 42)
[0091] 図 13〜; 16に示すとおり、ラットの皮膚においても、 trans-4-(3-chloro-2-fluorophen oxy)— 1— ((6— (1,3— tniazoi— 2— yiaminoノ pyridin— 2— yl)methyl)cyciohexanecarDoxylic acid の投与に伴い候補遺伝子が有意に発現上昇することが明らかになった。よって、移 植癌のみならず皮膚においても、 Aurora-A阻害剤の効果を予測可能であることが確 認できた。なお、図 13には AuroraA及び AuroraBの発現量の変化を、図 14には BIRC 5、 PRC1及び TACC3の発現量の変化を、図 15には DLG7の発現量の変化を、図 16 には KNTC2の発現量の変化をそれぞれ示した。
[0092] 以上の結果から、 PDマーカー候補遺伝子群は、 Aurora A特異的阻害剤の投与に よって、培養細胞、癌移植モデル動物の癌組織及び皮膚のいずれにおいても発現 が上昇しており、 PDマーカーとして利用できることを確認できた。
[0093] 実施例 5
(siRNAによる Aurora A欠失 HeLaS3細胞特異的な Aurora B (Thr232)リン酸化の上昇 )
同調又は非同調の HeLaS3細胞における Aurora A及び Bを siRNAによってノックダウ ンした場合の効果を調べることを目的として、下記の試験を行った。
[0094] 1.ダブルチミジンブロックによる Gl/S期同調培養における phospho-Aurora Bの解 析
先ず、 HeLaS3細胞を 6ゥエル培養皿に 2·5χ105個/ゥエルになるように播種して、一 晚 37°C、 5% COで培養した。次に、翌日 18:00に 200mMチミジン溶液を終濃度が 2 mMになるように培地に添加して 16時間培養した。さらに、翌日 10:00に培地を PBSで 3 回リンスし、新しい培地に交換した。このとき各ゥエルにルシフェラーゼコントロール (L uc)、 Aurora A(A1、 A2)、 Aurora B(B1、 B2) siRNAを終濃度 50nMになるように Oligofec tamine (Invitrogen社)を用いてトランスフエタトし、引き続き 8時間培養した。次に、 18:0 0に 2回目のチミジンを 2mMになるように加え、 16時間培養し、翌日 10:00に培地を PBS で 3回リンスして新しい培地に交換した。これにより細胞は同調からリリースされた。
[0095] 同調からリリース後 0、 8、 10、 12、 14及び 16時間で経時的にサンプリングし、 phospho -Aurora B抗体(Cell Signaling Technology社)を用いた Western Blotによりリン酸化 A urora Bの発現を調べた。
[0096] 2.非同調培養における Aurora A及び Bのノックダウン解析
先ず、 HeLaS3細胞を 6ゥエル培養皿に 5xl05個/ゥエルで播種してー晚 37°C、 5% COで培養した。翌日、各ゥエルにルシフェラーゼコントロール (Luc)、 Aurora A(A2)、 Aurora B(B2)siRNAを終濃度 50nMになるように Oligofectamine (Invitrogen社)を用い てトランスフエタトした。次に、 24時間後に細胞をトリプシンで剥がして回収し、半分を フローサイトメトリーによる細胞周期の解析、残り半分を Western Blotにより mitosis特 異的マーカー候袖 Aurora A、 Aurora B、 phospho-Aurora B、 Surviving cycnn Bl、 P lkl)の抗体を用いた解析を行なった。
[0097] 図 17に示すとおり、同調 HeLaS3細胞は通常リリース後 9- 10時間後に M期を通過し それに伴って Aurora Bの活性化 (リン酸化)が検出される (mock及び Luc)。ところ力 si RNAにより Aurora Aをノックダウンさせた細胞では Aurora B (Thr232)のリン酸化の亢 進と持続、すなわち mitotic delayが観察された(si-Al及び si_A2)。一方、 Aurora Bの ノックダウンでは Aurora Bリン酸化自体まったく起こらなかった(sト B1及び si_B2)。
[0098] また、図 18に示すとおり、非同調の HeLaS3細胞では通常 Aurora Bのリン酸化は観 察されないが、 Aurora A siRNA処理のときにのみ phospho-Aurora Bが検出されること
がわかった(phos_AurB)。また、図 19に示すとおり、このときの細胞は細胞周期解析 でも M期細胞の割合が増大していることがわかった。
[0099] さらに、同じ細胞抽出液中の他の M期のマーカー候補のいくつかを Western Blotで 検出した。図 18に示すとおり、これらの遺伝子は非同調細胞でも検出され、 M期での 発現上昇との倍率があまり大きくないか(Survivin及び cyclin Bl)、又は Aurora A, Bい ずれをノックダウンしても検出され Aurora A阻害特異的なマーカーとしては利用でき ない(Plkl)ことがわかった。
[0100] 以上より、 siRNAで Aurora Aを特異的に欠失させた細胞中で Aurora B (Thr232)のリ ン酸化が上昇することが明らかとなり、 Aurora A阻害に特異的なマーカーとして phosp ho-Aurora B (Thr232)が使える可能性のあることが確認できた。
[0101] 実施例 6
(Aurora A選択性阻害剤の pharmacodynamicマーカーの探索)
Aurora A選択的阻害剤による Aurora B(Thr232)リン酸化の濃度依存的な誘導を確 認するため、下記の試験を実施した。
[0102] 先ず、非同調の培養 HeLaS3細胞を lxlO6個播種してー晚 37°C、 5% CO下で培養 しに。翌日 10:00に 6_((4_(3_chloro_2_fluorobenzoyl)piperazin_l_yl) methyl)-N-thiaz o卜 2-ylpyridin-2-amineを終濃度 0、 30、 100、 300、 1000、 3000、 10000、又は 30000nM になるように添加した培地に交換し、その後 8時間及び 24時間後に細胞をトリプシン で剥がして回収し、半分を Western Blot用、残り 1/4をフローサイトメトリーによる細胞 周期の解析、残り 1/4を histoneH3 (SerlO)のリン酸化解析に使用した。また、同様に 処理した細胞サンプルを用いて TaqMan-PCRにより expression profilingも実施した。
[0103] 図 20 (8時間)及び図 21 (24時間)に示したとおり、 Aurora A選択的阻害剤の効果 として、 300nM付近から M期の割合が増加し始め 10 M付近まで見られた。
[0104] この場合、図 22に示すとおり、 phospho-Aurora B (Thr232)の発現は、 8時間、 24時 間いずれの暴露時間においても Aurora A選択的化合物の投与濃度に依存して増加 することが観察された。なお、 30 M以上でのリン酸化の減衰は化合物の Aurora Bの 阻害によるものと考えられる。一方、化合物投与によって Aurora Bの発現量はあまり 変動せず、 hospho-Aurora B/Aurora B比は化合物濃度 OnMのときを 1とすると 8時間
暴露で最大 16倍、 24時間暴露で 10倍まで上昇することが確認された。これに対して S urvivin、Plklは化合物を加えないバックグランドで発現が認められ発現誘導によるゥ インドウは phospho-Aurora Bと比べると最大で 3.5倍と小さかった。また、図 23に示す とおり、 HistoneH3(Serl0)リン酸化についてはフローサイトメトリーでも同様に大きくゥ インドウが取れないことが明ら力、となった。
[0105] 以上より、 siRNAによる Aurora Aノックダウンした場合と同様に Aurora A選択的化合 物の投与によっても phospho-Aurora B (Thr232)が特異的に誘導されることが明らか となった。さらにその誘導が Aurora A阻害による mitotic delayの薬効と相関して上昇 していた。し力、し、 Aurora B阻害が始まる濃度域(〉30 M)では Aurora Bのリン酸化 は再び阻害されることから Aurora A阻害の pharmacodynamic markerとして利用可能 であることが確認できた。
[0106] 実施例 7
(Aurora B (Thr232)リン酸化の Aurora A阻害特異性)
phospho-Aurora B (Thr232)が Aurora A阻害特異的であることを確認するため、 Aur ora B阻害剤、 pan-Aurora阻害剤(A/B-dual inhibitor)を用いて下記の試験を行つ た。
[0107] 先ず、 HeLaS3細胞を前述のダブルチミジンブロックによって G1/S境界に同調させ、 リリース開始から 4時間後にコントロール(DMSO、 final 0.5%)、 Aurora A選択的阻害剤 X ¾>o6-((4-(2,j-difluorobenzoyi) piperazin-l-yl) methyl) _N_tmazoi_2_yipyridm_2 -amine (図 24中、「Aurora A阻害剤 1」と示す。)、 Aurora B阻害剤である ZM477439 (J • Cell.BioL、第 161巻、 267頁、 2003年)又は pan-Aurora阻害剤である VX-680を 300 n M添加し、 0〜24時間までの経時的なサンプリングを行った。次に、 Western Blotによ り total Aurora Bと phospho-Aurora B (Thr232)の発現を調べた。
[0108] 図 24に示すとおり、 Aurora Bの発現は M期にかけて緩やかに上昇するがあまり大き な変動はなかった。一方、 phospho-Aurora Bは M期を通過する 9〜 10時間頃にだけ 一過性の上昇が観察された。また、細胞が M期通過後は Aurora Bも phospho-Aurora Bも急速に減少した。それに対して、 Aurora A選択的阻害剤で処理した細胞では Aur ora Bが 10時間以後も高発現しており、 phospho-Aurora Bはさらに顕著な増加を示し
た。ところが Aurora B阻害剤又は pan-Aurora阻害剤を処理した細胞では Aurora Bが コントロールとほぼ同等レベルの量が検出されるのに対して、 phospho-Aurora Bはま つたく検出されな力、つた。
[0109] 以上より、 pan-Aurora阻害剤、 Aurora B阻害剤又は Aurora B siRNA処理の!/、ずれ でも Aurora B (Thr232)リン酸化はほぼ阻害され検出不可能であることが確認できた。 従って、 Aurora Bは Aurora A阻害に特異的なマーカーであることが明ら力、となった。
[0110] 実施例 8
(非同調 HeLaS3細胞における Aurora A選択的阻害剤による histone H3 (Ser28)のリン 酸化の増大)
histone H3 (Ser28)リン酸化が phospho-Aurora Bと同じく Aurora A阻害特異的な PD マーカーとして利用可能力、どうかを確認するため、下記の試験を行った。
[0111] 先ず、非同調の培養 HeLaS3細胞を用いて、実施例 5と同様に Luc、 Aurora A(A2) 又は Aurora B(B2)siRNAをトランスフエクシヨンし、 Western blotにより histone H3の Ser 28及び SerlOのリン酸化を調べた。また Aurora A選択的阻害剤の濃度依存的な誘導 を phospho-Aurora B (Thr232)と比較し、同時に pan-Aurora阻害剤で検出されるかど うかについても確認した。
[0112] 図 25に示すとおり、 siRNAによる Aurora Aノックダウンによる histone H3 (Ser28)のリ ン酸化は SerlOと同様に上昇することがわかった。し力も Aurora Bノックダウンでは Ser 10リン酸化が依然として残っているのに対して Ser28のリン酸化はほぼ消失した。この ことから Ser28のリン酸化は phospho-Aurora Bと同様に Aurora A阻害特異的に誘導さ れるマーカーと考えられた。さらに、図 26に示すとおり、 Aurora A選択的阻害剤の濃 度依存的な誘導が phospho-Aurora Bとほぼ同じ濃度域で認められ、また pan-Aurora 阻害剤では完全にリン酸化バンドが消失することから phospho-histone H3 (Ser28)は p hospho-Aurora B (Thr232)同様に PDマーカーとして利用することが可能と考えられ た。なお、図 26において、 Compound Aは 6_((4_(2,3_difluorobenzoyl) piperazin-l-yl ) methyl) _N_thiazoト 2_ylpyridin_2_amineを不し、 Coumound Bは VX-680 不す。 産業上の利用可能性
[0113] 本発明によれば、 Aurora A阻害剤を生体に投与した際に Aurora A特異的に当該
阻害剤が作用したか否かを検出する遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーを得る ことが可能となり、これらのマーカーの発現を指標として、簡便且つ非侵襲的に Auror a A阻害剤の薬効の予測又は診断を行うことが可能となる。
[0114] 従って、 Aurora A阻害剤の投薬や臨床開発の際に、阻害剤の薬効を簡便且つ非 侵襲的に測定することが可能となり、適切な投薬や迅速な創薬研究に有用となる。 図面の簡単な説明
[0115] [図 l]siRNAにより Aurora Aの発現を抑制した場合の BIRC5遺伝子の発現量の変化を 示す図である。図中、口は Aurora A-siRNAで処理した場合の結果を示し、國は Auro ra B-siRNAで処理した場合の結果を示す。
[図 2]siRNAにより Aurora Aの発現を抑制した場合の PRC1遺伝子の発現量の変化を 示す図である。図中、口は Aurora A-siRNAで処理した場合の結果を示し、國は Auro ra B-siRNAで処理した場合の結果を示す。
[図 3]siRNAにより Aurora Aの発現を抑制した場合の DLG7遺伝子の発現量の変化を 示す図である。図中、口は Aurora A-siRNAで処理した場合の結果を示し、國は Auro ra B-siRNAで処理した場合の結果を示す。
[図 4]siRNAにより Aurora Aの発現を抑制した場合の TACC3遺伝子の発現量の変化 を示す図である。図中、口は Aurora A-siRNAで処理した場合の結果を示し、國は Au rora B-siRNAで処理した場合の結果を示す。
[図 5]siRNAにより Aurora Aの発現を抑制した場合の KNTC2遺伝子の発現量の変化 を示す図である。図中、口は Aurora A-siRNAで処理した場合の結果を示し、國は Au rora B-siRNAで処理した場合の結果を示す。
[図 6]HeLa-S3細胞に Aurora A阻害剤を作用させた場合の、 Aurora A阻害剤濃度と B IRC5遺伝子の発現量の変化を示す図である。
[図 7]HeLa-S3細胞に Aurora A阻害剤を作用させた場合の、 Aurora A阻害剤濃度と KNTC2遺伝子の発現量の変化を示す図である。
[図 8]HeLa-S3細胞に Aurora A阻害剤を作用させた場合の、 Aurora A阻害剤濃度と P RC1遺伝子の発現量の変化を示す図である。
[図 9]HeLa-S3細胞に Aurora A阻害剤を作用させた場合の、 Aurora A阻害剤濃度と T
ACC3遺伝子の発現量の変化を示す図である。
[図 10]HeLa-S3細胞に Aurora A阻害剤を作用させた場合の、 Aurora A阻害剤濃度と DLG7遺伝子の発現量の変化を示す図である。
[図 l l]Aurora A阻害剤をラットに投与した場合の、 Aurora A及び Aurora B遺伝子の 発現量の変化を示す図である。図中 *は、コントロールと比較して Pく 0.05であることを 示す。
[図 12]Aurora A阻害剤をラットに投与した場合の、 BIRC5、 KNTC2、 PRC1、 TACC3 及び DLG7遺伝子の発現量の変化を示す図である。図中 *は、コントロールと比較し て Pく 0.05であることを、 * *は Pく 0.01であることを示す。
[図 13]Aurora A阻害剤をラットに投与した場合の、 Aurora A及び Aurora B遺伝子の 発現量の変化を示す図である。図中 *は、コントロールと比較して Pく 0.05であることを 示す。
[図 14]Aurora A阻害剤をラットに投与した場合の、 BIRC5、 PRC1及び TACC3遺伝子 の発現量の変化を示す図である。図中 *は、コントロールと比較して Pく 0.05であるこ とを、 * *は Pく 0.01であることを示す。
[図 15]Aurora A阻害剤をラットに投与した場合の、 DLG7遺伝子の発現量の変化を示 す図である。図中 *は、コントロールと比較して Pく 0.05であることを示す。
[図 16]Aurora A阻害剤をラットに投与した場合の、 KNTC2遺伝子の発現量の変化を 示す図である。図中 *は、コントロールと比較して Pく 0.05であることを、 * *は Pく 0.01 であることを示す。
[図 17]siRNAにより Aurora A又は Auroraの発現を抑制した同調 HeLa_S3細胞におけ る Aurora B(Thr232)のリン酸化の状態を検討した結果を示す図である。
[図 18]siRNAにより Aurora A又は Auroraの発現を抑制した非同調 HeLa_S3細胞にお ける遺伝子マーカー候補遺伝子のリン酸化の状態を検討した結果を示す図である。
[図 19]siRNAにより Aurora A又は Auroraの発現を抑制した非同調 HeLa_S3細胞にお ける細胞周期解析の結果を示す図である。
[図 20]HeLa-S3細胞における Aurora A阻害剤の投与 8時間後の投与濃度と細胞周 期との関係を示す図である。
[図 21]HeLa-S3細胞における Aurora A阻害剤の投与 24時間後の投与濃度と細胞周 期との関係を示す図である。
[図 22]HeLa_S3細胞における Aurora A阻害剤の投与濃度と phospho-Aurora B(Thr2 32)、 Plkl及び survivinの発現量(タンパク質)との関係を示す図である。
[図 23]HeLa_S3細胞における Aurora A阻害剤の投与濃度と histone H3(Serl0)のリン 酸化との関係を示す図である。
[図 24]Aurora A阻害剤、 Aurora B阻害剤又は pan-Aurora阻害剤を投与した場合の A urora B及び phospho-Aurora Bの発現を経時的に確認した結果を示す図である。
[図 25]siRNAにより Aurora A又は Aurora Bの発現を抑制した場合の histone H3(Ser28 )又は histone H3(Serl0)のリン酸化を確認した結果を示す図である。
[図 26]Aurora A阻害剤又は pan-Aurora阻害剤の投与濃度と、 histone H3(Ser28)又 は Aurora B(Thr232)のリン酸化との関係を確認した結果を示す図である。