WO2008034621A2 - Nukleotid- phosphorylase zur prophylaxe, behandlung oder diagnostik von akutem lungenversagen (ali) - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung oder Diagnostik von akutem Lungenversagen (ALI), Verfahren, um bei einem Lebewesen eine Veranlagung für oder eine Erkrankung an ALI zu diagnostizieren, sowie eine pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzung.

Description

Arzneimittel zur Prophylaxe oder Behandlung oder Diagnostik von akutem Lungen- versagen (ALI)

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von akutem Lungenversagen (ALI), ein Verfahren, um bei einem Lebewesen eine Veranlagung für oder eine Erkrankung an ALI zu diagnostizieren, sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung.

Die derzeit am häufigsten verwendete, von einer amerikanisch-europäischen Consen- sus-Konferenz erstellte Definition des Lungenversagens benutzt den Oberbegriff „akutes Lungenversagen" [„acute lung injury" (ALI)] für jede akute, alveoläre Erkrankung, die zu einer Störung der Oxygenierung mit einem Abfall des Paθ2/Fiθ2- Quotienten < 300 mmHg führt. Unscharf abgegrenzt hiervon ist das „akute Atemnot- syndrom" [„acute respiratory distress Syndrom" (ARDS)], das durch einen Abfall des Paθ2/FiO₂-Quotienten < 200 mmHg charakterisiert ist. ALI kann durch direkte Lungenschädigung, das heißt durch Einwirkung einer Noxe auf die Alveozyten hervorgerufen werden, was bspw. bei einer Rauchgasinhalation der Fall ist. ALI kann auch indirekt durch Schädigung der Lungenkapillaren entstehen. So werden bspw. etwa 25 % der Fälle durch eine bakterielle Sepsis hervorgerufen. Eine häufige Mitursache von ALI ist dabei eine Störung des Immunsystems, was zu Pneumonien durch meist opportunistische Erreger oder Pneumonien ohne Erregernachweis führt.

ALI ist charakterisiert durch eine Läsion der alveolokapillären Membran, was eine schwere Diffusionsstörung verursacht, welche sich klinisch durch Tachypnö und stöhnende Atmung, anfangs eventuell begleitet von einer respiratorischen Alkalose, äußert. Die alveolokapilläre Läsion bzw. der ursächliche oder sekundär entstehende Entzündungsprozess hat die Leckage von Proteinen in den Alveolarraum zur Folge. Der Proteinübertritt verhindert auch bei normalem Kapillardruck die Rückresorption von Flüssigkeit aus dem interstitiellen Lungengewebe und den Alveolen und führt so zum sog. Permeabilitätsödem. Durch die intraalveoläre Proteinansammlung, durch Entzündungsvorgänge und Zellschädigungen kommt es ferner zu einem sekundären Verlust an Surfactant und zum Alveolarkollaps. Das Lungengewebe kann, insbesondere bei therapieinduzierter Schädigung durch mechanische Beatmung, selbst zum Herd einer systemischen Entzündungsreaktion (SIRS) werden. Sekundäre Pneumonien und Überwässerung können die Lungenschädigung zusätzlich verschlimmern. Die Erkrankung kann in eine fibroproliferative Phase mit restriktiver und obstruktiver Lungenfunktionsstörung übergehen oder einen fulminanten hypoxämischen Verlauf nehmen.

Die Therapie von ALI ist im Wesentlichen auf die Elimination der auslösenden Noxe ausgerichtet. Diese wird von unterstützenden therapeutischen Maßnahmen, wie einer lungenprotektiven Beatmung, begleitet. Die Beatmung soll das Auftreten von Scherkräften durch zu hohe Atemzugvolumina und mangelnden PEEP („positive endexpiratory pressure") mindern und einen Alveolarkollaps durch PEEP verhindern. Ein weiterer Ansatz besteht in einer differenzierten Kreislauftherapie, die darauf abzielt, ein ausreichendes Herzzeitvolumen durch adäquaten Preload aufrechtzuer- halten, das Lungenwasser zu reduzieren und eine hämodynamisch relevante, pulmonale Hypertension und eine eventuelle Myokarddysfunktion zu behandeln.

Trotz dieses Therapiekonzeptes liegt die Mortalitätsrate von Patienten, die von ALI betroffen sind, bei 35 bis 60 %. In den USA entwickeln ca. 200.000 Patienten jährlich ALI, was zu 75.000 Todesfällen und bis zu 3,6 Millionen Tagen Klinikaufenthalt führt.

Vor diesem Hintergrund gibt es umfassende Bemühungen, die molekularen Mechanismen, die zu ALI führen, aufzuklären und entsprechende ursächliche Therapiekonzepte zu entwickeln.

Thiel, M. et al., Oxygenation inhibits the physiological tissue-protecting mechanism and thereby exacerbates acute inflammatory lung injury. PLoS Biol. 3, el74 (2005), und Eltzschig, H. K. et al., Coordinated adenine nucleotide phosphohydrolysis and nucleoside signaling in posthypoxic endothelium: role of ectonucleotidases and adenosine A2F receptors. /. Exp. Med. 198, 783-96 (2003), schlagen zur Behandlung von ARDS die exogene Zufuhr eines Agonisten für den Adenosin-A2B-Rezeptor vor.

Thompson, L. F. et al., Crucial Role for Ecto-5'-Nucleotidase (CD73) in Vascular Leakage during Hypoxia. /. Exp. Med. 200, 1395-1405 (2004) und Eltzschig et al. (2003; a.a.O.) beschreiben einen Zusammenhang zwischen den membrangebundenen Enzymen Ecto-Apyrase (CD39) und Ecto-5'-Nucleotidase (CD 73) und der Entstehung von Lungenödemen und einer Leckage von Proteinen in den Alveolarraum.

Trotz des zunehmenden Erkenntnisgewinns im Hinblick auf die molekularen Mechanismen, die zur Entstehung von ALI führen, ist es bislang nicht gelungen, therapeutische Ansätze zu entwickeln, mit denen der Entstehung von ALI ursächlich entgegengewirkt bzw. zielgerichtet und ursächlich eine bereits existierende ALI behandelt werden kann. Vor diesem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Arzneimittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von ALI bereitzustellen, das zielgerichtet an den molekularen Ursachen von ALI ansetzt und dadurch die existierenden Therapiekonzepte zur Behandlung dieser Erkrankung bzw. Diagnostiken unterstützt oder ggf. sogar ersetzt.

Diese Aufgabe wird durch die Verwendung von Nucleotid-Phosphohydrolase zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von ALI gelöst.

Die Erfinder haben im Tierversuch überraschenderweise festgestellt, dass durch die Verabreichung von Nucleotid-Phosphohydrolase die Symptome von ALI, die in Mäusen künstlich induziert wurden, stark reduziert werden können und die betroffenen Tiere gegenüber unbehandelten Tieren eine deutlich höhere Überlebensrate zeigen. Dabei wurde auch festgestellt, dass die verabreichte Nucleotid- Phosphohydrolase eine Lungenprotektion bewirkt, so dass nicht nur eine akute Behandlung von ALI, sondern auch eine prophylaktische Behandlung von ALI möglich ist.

Eine Nucleotid-Phosphohydrolase oder auch Nucleotidase bzw. Nucleotidphosphata- se ist ein Enzym, das die hydrolytische Spaltung von Phosphatgruppen von Nucleo- sidmonophosphaten und damit den Abbau von Mononucleotiden zu den entsprechenden Nucleosiden katalysiert. Bei einer Substratspezifität für 5'-Phosphatgruppen spricht man auch von einer 5 '-Nucleotidase bzw. 5'-Nucleotid-Phosphohydrolase.

Die Erfindung lässt sich auch diagnostisch einsetzen. So kann bei einen Risikopatienten, bei dem wegen eines entsprechenden familiären Hintergrunds angenommen wird, dass eine Prädisposition für ein ALI vorliegt, oder der bereits erste Symptome für ALI zeigt, leicht feststellen, ob dies tatsächlich der Fall ist. So werden sich in einem solchen Fall nach einer Verabreichung der Nucleotid-Phosphohydrolase die Symptome nämlich messbar verbessern, so dass dann eine positive Diagnose erfolgen kann.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst. Die Erfinder mache sich erstmals erkannte molekulare Mechanismen, die zur Entstehung von ALI führen, zunutze, um ein potentes Arzneimittel bzw. Diagnostikum zu schaffen.

Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn als Nucleotid-Phosphohydrolase Apyrase (CD39) verwendet wird.

Die Apyrase ist ein Enzym, das durch Calcium oder Magnesium aktiviert wird, und in biologischen Systemen - als Apyrase - in plasmamembrangebundener Form als Ecto- Enzym vorliegt (EC 3.6.1.5). Apyrase wird gemäß der Nomenklatur der CD-Marker auch als CD39 bezeichnet. Weitere Synonyme für die Apyrase sind NTPDasel, ATP- Diphosphohydrolase, ATPDase und Lymphoid cell activation antigen. Die Apyrase katalysiert als Nucleotid-Phosphohydrolase die Hydrolyse von ATP unter Bildung von AMP und Orthophosphat. Die Ecto-Apyrase kann ferner ADP und weitere Nucleosid- Diphosphate und -Triphosphate umsetzen.

Die erfindungsgemäße Verwendung von Apyrase hat den Vorteil, dass eine solche Nucleotid-Phosphohydrolase zum Einsatz kommt, die sich nach Erkenntnissen der Erfinder zur Prophylaxe bzw. Behandlung von ALI besonders eignet. So konnte gezeigt werden, dass cd39 ^Λ-Mäuse, die nach experimenteller Schädigung Symptome von ALI zeigen, erfolgreich durch die Gabe von Apyrase behandelt werden können. Konkret konnte hierdurch bspw. die Leckage von Albumin in den Alveolarraum vollständig aufgehoben werden. Auch die Veränderungen des Lungenwassers, die Entzündungsmediatoren und der pO₂/FiO₂-Gradient als Maß für die Schwere von ALI konnten nahezu normalisiert werden. Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn alternativ oder zusätzlich als Nucleotid- Phosphohydrolase 5'-Nucleotidase (CD73) verwendet wird.

Die 5'-Nucleotidase wird gemäß der Nomenklatur der CD-Marker auch als CD73 (EC 3.1.3.5) bezeichnet. Ein weiteres Synonym für die 5'-Nucleotidase ist 5'-NT. CD73 ist in seiner nativen Form ein Ecto-Enzym, d.h. es entfaltet seine Aktivität im Interstiti- um bzw. im Extrazellulär-Raum. Es hydrolysiert 5'-AMP zu Adenosin, das seinerseits von der extrazellulären Seite auf spezifische Membranrezeptoren der Zellen wirkt.

Durch die Gabe von 5'-Nucleotidase konnten die Erfinder bei cdys ' -Mäusen die Symptome von ALI überraschenderweise ebenfalls nahezu vollständig aufheben. Auch in diesen Experimenten wurde festgestellt, dass die Leckage von Albumin in den Alveolarraum auf das Maß zurückgeführt wird, das in Wildtyp-Mäusen beobachtet wird. Auch die Entzündungsmarker wurden durch die Gabe von 5'-Nucleotidase auf das Normalmaß reduziert.

Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Nucleotid-Phosphohydrolase bzw. Ecto-Apyrase oder Ecto-5'-Nucleotidase in löslicher Form vorliegen.

Die Erfinder haben festgestellt, dass die Nucleotid-Phosphohydrolase, bspw. Apyrase oder 5'-Nucleotidase, für eine Wirksamkeit gegenüber ALI nicht in membrangebundener Form vorliegen muss. Auch die lösliche Form zeigt Wirksamkeit, was insbesondere bei der Formulierung des Arzneimittels Vorteile mit sich bringt.

Erfindungsgemäß ist es ferner bevorzugt, wenn die Nucleotid-Phosphohydrolase in mikronisierter Form vorliegt.

Unter mikronisierter Form wird erfindungsgemäß eine Ausgestaltung einer Nucleotid-Phosphohydrolase verstanden, die in ihrer Größe gegenüber der natürlichen bzw. Wildtypvariante reduziert ist. Vorzugsweise erfolgt die Größenreduzierung bis auf eine solche Größe, bei der das Enzym noch enzymatisch aktiv ist, d.h. noch das aktive Zentrum enthält, anderer bspw. strukturgebende Abschnitte jedoch fehlen. Diese Reduzierung kann auf enzymatische Art und Weise oder aber durch Methoden der DNA-Rekombinationstechnologie erfolgen. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine solche Nucleotid-Phosphohydrolase verwendet wird, die das Gefäßsystem verlassen und ihre Wirkung im Interstitium entfalten kann. Erfahrungsgemäß ist dies bei der natürlichen bzw. Wildtypvariante nur erschwert möglich.

Die Nucleotid-Phosphohydrolase kann erfindungsgemäß ferner in Form einer Codierungssequenz in einem Expressionsvektor vorliegen.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass der behandelte Patient „selbst" die benötigte Nucleotid-Phosphohydrolase herstellt und ggf. genetische Defekte, die zu einer Mutation von endogener Nucleotid-Phosphohydrolase geführt haben, ausgeglichen werden können. Die Codierungssequenzen von Nucleotid-Phosphohydrolasen sind der NCBI-Datenbank zu entnehmen. Die Codierungssequenz von humaner Ecto- Apyrase ist unter der Zugangsnummer NP_001767 erhältlich. Die Codierungssequenz von humaner Ecto-5'-Nucleotidase ist unter der Zugriffsnummer NMJD01776 erhältlich. Diese Referenzen sind durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Es versteht sich, dass der Expressionsvektor weitere Abschnitte, wie Promotoren, Enhancer etc. aufweisen kann, die die Expression der Nucleotid- Phosphohydrolase in dem Patienten sicherstellen.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, wenn das Arzneimittel einen Wirkungsverstärker aufweist.

Als Wirkungsverstärker kommt jede Verbindung oder Zusammensetzung in Frage, die zur Prophylaxe oder Behandlung von ALI geeignet ist und die therapeutische Wirkung von Nucleotid-Phosphohydrolase gegenüber ALI nicht negativ beeinflusst bzw. ggf. sogar verstärkt. Dabei kann es sich bspw. um Substanzen handeln, die antiinflammatorische bzw. immunmodulatorische Wirkung haben. Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die von den Erfindern erstmals erkannte und therapeutisch genutzte Wirkung von Nucleotid-Phosphohydrolase zusätzlich verstärkt wird und das Arzneimittel dadurch in seiner Potenz nochmals verbessert wird.

Als Wirkungsverstärker wird erfindungsgemäß bevorzugt ein Adenosin-A2B-Rezeptor- Agonist, bspw. BR4887, verwendet.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein solcher Wirkungsverstärker zum Einsatz kommt, der nach Erkenntnissen der Erfinder zur Weiterentwicklung des Arzneimittels besonders geeignet ist. Bei BR4887, das auch als BAY 60-6583 bezeichnet wird, handelt es sich um einen spezifischen Adenosin-A₂B-Rezeptor-Agonisten, hergestellt von Bayer HealthCare. So konnten die Erfinder feststellen, dass bereits die isolierte Verabreichung von BR4887 die Leckage von Proteinen in den Alveolarraum reduzieren kann. Eine kombinierte Verabreichung mit Nucleotid-Phosphohydrolase führt sogar zu einer deutlichen Verbesserung des erfindungsgemäßen Arzneimittels.

Als Wirkungsverstärker ist erfindungsgemäß ferner ein Inhibitor des Nucleosid- Transporters bevorzugt, wobei vorzugsweise ein solcher Inhibitor verwendet wird, der den Nucleosid-Transporter ENT-I bzw. ENT-2 inhibiert.

Durch diese Maßnahme machen sich die Erfinder kürzlich im Stand der Technik gewonnene Erkenntnisse zu Nutze. Vaskuläres Adenosin wird vorwiegend durch die equilibrativen Nucleosid-Transporter (ENT)-I und -2 aufgenommen. Diese Transporter sind in die Regulation der Adenosin-Signalantworten involviert. Es konnte gezeigt werden, dass die Repression von ENT-I in Abhängigkeit des hypoxyinduzierbaren Faktors 1 (HIF 1) während der Hypoxie in einer verminderten vaskulären Adenosi- naufnahme und in verminderten Adenosin-Signaleffekten resultiert; vgl. Eltzschig, H. K. et al., HIF-1-dependent repression of equilibrative nucleoside transporter (ENT) in hypoxia. /. Exp. Med. 202, 1493-1505 (2005).

Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn als Inhibitor von ENT-I bzw. ENT-2 Dipyridamol verwendet wird. Auch hiermit machen sich die Erfinder kürzlich gewonnene Erkenntnisse zu Nutze, nach denen Lungen von Mäusen, die mit Dipyridamol (Boehringer Ingelheim) behandelt wurden, eine verminderte Ausbildung von Lungenödemen und eine reduzierte Leckage von Albumin in den Alveolarraum zeigten, nachdem in diesen Hypoxie induziert wurde; vgl. Eltzschig H. K. et al. (2005; a.a.O.).

Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, um bei einem Lebewesen eine Veranlagung für oder Erkrankung an akutem Lungenversagen (ALI) zu diagnostizieren, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Bereitstellung einer aus dem Lebewesen stammenden biologischen Probe, (2) Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein einer Nucleotid- Phosphohydrolase, (3) ggf. Bestimmung der Funktionsfähigkeit und/oder Aktivität der Nucleotid-Phosphohydrolase, (4) Korrelation der Abwesenheit von Nucleotid- Phosphohydrolase in der biologischen Probe oder einer in der biologischen Probe gegenüber dem Wildtyp reduzierten Funktionsfähigkeit und/oder Aktivität der Nucleotid-Phosphohydrolase in der biologischen Probe mit einer positiven Diagnose.

Unter einer biologischen Probe wird eine jegliche Probe verstanden, anhand derer festgestellt werden kann, ob das Lebewesen eine funktionsfähige Nucleotid- Phosphohydrolase exprimiert. Beispiel für eine biologische Probe stellen Gewebe der Atemwege dar, bspw. Lungengewebe, eine Speichel- oder Blut-, Haarprobe etc. Geeignete biologische Proben können aber auch aus anderen Regionen des Lebewesens stammen. Vorzugsweise enthalten diese Proben repräsentatives genetisches Material, wie Gesamt-DNA. Geeignet sind deshalb allgemein kernhaltige Zellen.

Die Untersuchung auf das Vorhandensein einer Nucleotid-Phosphohydrolase gemäß Schritt (2) erfolgt mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren, bspw. unter Verwendung von spezifischen Antikörpern. Bevorzugt ist es auch, wenn in Schritt (2) ein Mutations-Screening durchgeführt wird, bei dem festgestellt wird, ob in der Codierungssequenz für die Nucleotid-Phosphohydrolase eine Mutation vorliegt, die zu einem vollständigen Ausfall des Proteins oder aber zu einem Aktivitätsverlust gegenüber dem Wildtyp führt. Die Funktionsfähigkeit oder Aktivität der Nucleotid-Phosphohydrolase wird in Schritt (3) gemäß im Stand der Technik allgemein bekannter Methoden bestimmt. Dabei ist es bevorzugt, wenn die Adenosin-Bildungsrate der Nucleotid-Phosphohydrolase in der biologischen Probe im Vergleich zur Adenosin-Bildungsrate von Wildtyp- Nucleotid-Phosphohydrolase bzw. vollaktiver bzw. funktionsfähiger Nucleotid- Phosphohydrolase bestimmt wird.

Bei einer Feststellung, dass die biologische Probe keine aktive bzw. funktionsfähige Nucleotid-Phosphohydrolase enthält, bspw. aufgrund eines Polymorphismus, kann diagnostiziert werden, dass das betroffene Lebewesen eine Veranlagung für eine Erkrankung an ALI oder eine bereits sich manifestierte ALI hat.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat den Vorteil, dass erstmals die molekularen Ursachen von ALI diagnostisch genutzt werden. Bislang basiert die Diagnostik von ALI weitgehend auf empirisch bestimmten Parametern, wie dem Paθz/Fiθ2-Quotienten sowie der Verwendung von bildgebenden Verfahren, wie Röntgen-Thoraxaufnahmen oder auch der Computertomographie. Diese Messmethoden sind allerdings mit einem hohen Fehlerrisiko behaftet, so dass das erfindungsgemäße Verfahren zu einer sicheren Diagnose beiträgt und eine zielgerichtete Behandlung von ALI ermöglicht.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische und/oder diagnostische Zusammensetzung, die Nucleotid-Phosphohydrolase in einer therapeutisch wirksamen Menge sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ggf. einen Wirkungsverstärker aufweist.

In Bezug auf die Nucleotid-Phosphohydrolase sowie den Wirkungsverstärker wird auf die obigen Ausführungen im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verwendung verwiesen, die hier gleichermaßen gelten. Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik allgemein bekannt, vgl. Kibbe A. H., Handbook of Phar- maceutical Excipients. American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press, 3rd Edition (2000). Es versteht sich, dass die pharmazeutische Zusammensetzung weitere Inhalts- oder Hilfsstoffe aufweisen kann, wie Binde-, Spreng-, Gleitmittel und Salze etc., um eine galenisch geeignete Form bereitzustellen, und um eine ausreichende Konzentration des Wirkstoffes am Wirkort zu gewährleisten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren, um bei einem Lebewesen eine Veranlagung für oder Erkrankung an ALI zu diagnostizieren, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Verabreichung der vorstehenden diagnostischen Zusammensetzung an ein Lebewesen, das Symptome einer ischämischen Krankheit zeigt; (2) Feststellung, ob sich die Symptome verbessern, und (3) Korrelation einer Verbesserung der Symptome mit einer positiven Diagnose.

Mit diesem Test können bspw. Patienten untersucht werden, in deren Familie relativ häufig ALI oder andere lungenassoziierte Krankheiten aufgetreten sind, und festgestellt werden soll, ob eine Prädisposition für eine ALI gegeben ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Adenosin-A2B-Rezeptor-Agonisten, vorzugsweise von BR4887 (BAY 60-6583), zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von ALI.

Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass die Verabreichung eines spezifischen Adenosin-A₂B-Rezeptor-Agonisten zur Protektion des Lungengewebes führt. Die chemische Struktur und die ECso-Werte von BR4887/BAY 60-6583 auf die Adenosin-Rezeptoren AIAAR, A₂AAR und A₂BAR sind in der beigefügten Fig. 7 offenbart.

Die Erfinder haben ferner ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung von akutem Lungenversagen (ALI) bei einem Patienten entwickelt, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Verabreichung des zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Arzneimittels in einen Patienten, und (2) ggf. Wiederholen der Verabreichung gemäß Schritt (1).

Die Erfinder haben ferner ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung von ALI bei einem Patienten entwickelt, das die folgenden Schritte aufweist: (1) Aktivierung der endogenen Nucleotid-Phosphohydrolase, wie bspw. der Ecto-5'- Nucleotidase (CD73) und/oder Ecto-Apyrase (CD39) in einen Patienten, und (2) ggf. wiederholen der Aktivierung gemäß Schritt (1).

Dieses Verfahren beruht darauf, dass die Aktivität der endogenen Nucleotid- Phosphohydrolase erhöht wird. Dies könnte bspw. durch die Steigerung des extrazellulär bereitgestellten 5'-AMP erfolgen, was wiederum bspw. durch CD39 möglich ist.

Insofern stellen die Erfinder auch Aktivatoren bereit, die die Aktivität der endogenen Nucleotid-Phosphohydrolase erhöhen. Diese Aktivatoren sind geeignet zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von ALI.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Nucleotid-Phosphohydrolase, vorzugsweise von Apyrase (CD39) oder/und 5'-Nucleo- tidase (CD73), weiter vorzugsweise in löslicher Form, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik einer durch Beatmung verursachten Lungenschädigung.

Es ist bekannt, dass es bei einer mechanischer Beatmung bzw. einer Überdruckbeatmung eines Patienten, z.B. zu therapeutischen Zwecken, zur Schädigung der Lunge kommen kann. So ist beschrieben worden, dass Hypoxien, Ischämien, Ventilationsstörungen und systemische Entzündungen auftreten können. Die Erfinder haben Mäuse mechanisch beatmet und derartige Lungenschädigungen induziert. Mäuse, die zuvor mit Nucleotid-Phosphohydrolase behandelt wurden zeigten eine deutlich schwächere Lungenschädigung als Kontrollmäuse. Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Im Anschluss wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die rein illustrativen Charakter haben und die Reichweite der Erfindung nicht einschränken. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:

Fig. 1: Induktion von pulmonalem CD39 und CD73 durch mechanische Ventilation, (a) BL6-Mäuse wurden mechanisch ventiliert, wobei der Druck der eingeatmeten Sauerstofffraktion [FiO₂] von 1,0 und der Einatmungsdruck von 15 mbar kontrolliert wurde. Die Respirationsrate und das Verhältnis von Einatmungs- zu Ausatmungsdauer wurde eingestellt, um den normalen, arteriellen Kohlendi- oxidpartialdruck (PaCθ2, 35 bis 40 mmHg) und den pH (7,35 bis 7,40) aufrechtzuerhalten, was mittels einer Blutgasanalyse, gefolgt von einer Herzpunktion, in gleichermaßen ventilierten Kontrollmäusen bestimmt wurde. Nach den angegebenen Zeitpunkten wurden die Lungen präpariert, die Gesamt-RNA isoliert und die CD39/CD73-mRNA-Spiegel wurden mittels Echtzeit-PCR bestimmt. Die Daten wurden relativ zu einem internen Haushaltsgen (ß-Actin) berechnet und werden als x-fache Veränderung im Vergleich zur Kontrolle (0 min Ventilation) ± SD zum jeweiligen angegebenen Zeitpunkt ausgedrückt. Die Ergebnisse stammen aus vier Experimenten zur jeweiligen Bedingung (* P<0,02 im Vergleich zu 0 min), (b) Um einen potenziellen Einfluss des FiO₂ auf die Expressionsmuster von Nucleotidasen zu untersuchen, wurden die Mäuse mit druckkontrollierter Ventilation bei einem Einatmungsdruck von 15 mbar über 120 min unter Verwendung der gleichen Ventilatoreinstellungen ventiliert. Unterschiedliche FiO₂-Werte sind angezeigt. Die Ergebnisse stammen aus vier Tieren zu jeder Bedingung, (c) Anstieg des CD39- und des CD73-Proteins bei mechanischer Ventilation. Die Mäuse wurden unter Verwendung von druckkontrollierter Ventilation mechanisch ventiliert (15 mbar Ein- atmungsdruck, FiCh = 1,0). Die Lungen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten präpariert, schockgefroren, lysiert, und die Proteine wurden mittels SDS- PAGE aufgetrennt. Die resultierenden Western Blots wurden mit Anti-CD39- oder Anti-CD73-Antikörpern untersucht. Eines von drei repräsentativen Experimenten ist dargestellt, (d) Um den Einfluss der mechanischen Ventilation auf pulmonales CD39 und CD73 zu untersuchen, wurden BL6-Mäuse unter druckkontrollierten Einstellungen über 0 h oder 3 h ventiliert. Die Lungen wurden präpariert, zerschnitten und mit Antikörpern gegen CD39 oder CD73 gefärbt und unter einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop visualisiert. Als Kontrolle wurde der Sekundärantikörper allein verwendet („neg"). In weiteren Kontrollen wurde der Primär- und Sekundärantikörper in Mäusen mit cd39- oder cd73-Gendeletion verwendet (3 h KO). WT: Wildtyp-Mäuse, KO: cd39 ^A- oder cd 73 '-Mäuse.

Fig. 2: Das akute Lungenver sagen, das durch mechanische Ventilation induziert wird, wird nach zielgerichteter Gendeletion von cd39 verstärkt, (a-c) Cd39^~Λ-Mäuse und entsprechende Wurfgeschwisterkontrollen (WT, BL6/C57, SVJ 129) wurden mechanisch unter Verwendung von druckkontrollierter Ventilation mit einer eingeatmeten Sauerstofffraktion [FiOz] von 1,0 für 30, 60 oder 90 Minuten mit den angegebenen Einatmungsdrücken (15 bis 45 mbar) mechanisch ventiliert. Die Albuminkonzentration in der broncheoalveolaren Flüssigkeit wurde unter Verwendung eines Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt, (a) * P<0,05 im Vergleich mit 30 min, # P<0,001 im Vergleich mit 30 min und mit WT. (b) *<0,001 im Vergleich mit 30 min, # P<0,05 im Vergleich mit 30 min und WT, (c) § P<0,0001 im Vergleich zu WT, * P<0,0001 im Vergleich zu 30 min, # P<0,001 im Vergleich mit 30 min und mit WT. (d-f) Der Gehalt des Lungenwassers (Nass-zu-Trocken-Verhältnis, mg Lungenwasser/mg Trockengewebe), die Neutrophilenakkumulation (Myeloperoxidase-Assay) und das Verhältnis des arteriellen Partialdrucks von Sauerstoff (PaO₂) zu der Fraktion von eingeatmetem Sauerstoff (FiOz) wurden nach den angegebenen Zeiten der druckkontrollierten Ventilation bei 45 mbar (Fiθ2 = 1,0) bestimmt, (d) § P<0,001 im Vergleich zu WT, * P<0,0001 im Vergleich zu 30 min und # P<0,0001 im Vergleich zu 30 min und WT. (e) § P<0,0001 im Vergleich zu WT, * P<0,0001 im Vergleich zu 30 min und # P<0,0001 im Vergleich zu 30 min und WT. (f) § P<0,005 im Vergleich zu WT, * P<0,0001 im Vergleich zu 30 min, # P<0,0002 im Vergleich zu 30 min und WT. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SD dargestellt und stammen von sechs Tieren zu jeder Bedingung.

Fig. 3 Die makroskopischen und histologischen Anzeichen einer akuten Schädigung nehmen nach der zielgerichteten Deletion von cd39 zu. (a, b) Cd39 ^/ -Mäuse und ihre entsprechenden Wurfgeschwisterkontrollen (WT, BL6/C57, SVJ129) wurden anästhesiert und für 90 Minuten bei 15 oder 45 mbar ventiliert (Fraktion von eingeatmetem Sauerstoff [FiCh] von 1,0). Es werden repräsentative Fotomikrografen (xlOO und x400) mit H&E-Färbung der Lunge und entsprechende makroskopische Aufnahmen von gesamten Lungen dargestellt. Rekonstitution von cd39^~'^' -Mäusen mit löslicher Apyrase. Dreißig Minuten vor der Einleitung der Anästhesie wurden cd39^~Λ-Mäuse und deren entsprechende Wurfgeschwisterkontrollen (WT, BL6/C57, SVJ129) mit 10 U Apyrase (aus Kartoffeln, Sigma- Aldrich, + Apyrase) oder mit Vehikelkontrolle (- Apyrase) behandelt. Nach der Einleitung der Anästhesie wurden die Tiere einer Tracheotomie unterzogen und bei druckkontrollierten Einstellungen mit einem Einatmungsdruck von 45 mbar für 90 Minuten mechanisch ventiliert. (Fiθ2=l). (c) Die Albumin- Leckage wurde aus der broncheoalveolaren Lavage mittels Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA, * P<0,0001 im Vergleich zu WT, # P<0,0001 im Vergleich zu cd39 ^Λ-Mäusen ohne Apyrase-Behandlung) gemessen, (d) Lungenwassergehalt (* P<0,0001 im Vergleich zu WT, # P<0,0005 im Vergleich zu cd39"^/ -Mäusen ohne Apyrase-Behandlung). (e) Die Neutrophileninfiltration wurde durch die Bestimmungen von pulmonaler Myeloperoxidase gemessen (* P<0,0005 im Vergleich zu WT, # P<0,001 im Vergleich zu cd39 '--Mäusen ohne Apyrase-Behandlung). (f) Als inflammatorischer Marker wurde in der broncheoalveolaren Lavage MIP-2 unter Verwendung von ELISA gemessen *P<0,0001 im Vergleich zu WT, * P<0,0001 im Vergleich zu cd39 ^A-Mäusen ohne Apyrase-Behandlung). (g) Bestimmung des pulmonalen Gasaustausches durch den Gradient von arteriellem Sauerstoffpartialdruck (PaCh) zu FiCh (* P<0,005 im Vergleich zu WT, # P<0,005 im Vergleich zu cd39 ^/ -Mäusen ohne Apyrase-Behandlung. Festzuhalten ist eine nahezu vollständige Rekonstitution eines „ Wildtyp-Phänotγps" durch die Apyrase-Behandlung von cd39^~'^~ -Mäusen.

Fig. 4 Das akute Lungenversagen, das durch mechanische Ventilation induziert wird, wird nach zielgerichteter Deletion von cd73 verstärkt, (a-c) CdyS '-Mäuse und entsprechende Wurfgeschwisterkontrollen (WT, BL6) wurden unter Verwendung von druckkontrollierter Ventilation mit einer eingeatmeten Fraktion von Sauerstoff [FiO₂] von 0,1 für 30, 60 oder 90 Minuten bei den angegebenen Einatmungsdrücken (15 bis 45 mbar) mechanisch ventiliert. Die Albuminkonzentration in der broncheoalveolaren Flüssigkeit wurde mittels Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt.(a) § P<0,05 im Vergleich zu WT, * P<0,01 im Vergleich zu 30 min, # P<0,05 im Vergleich zu 30 min und WT. (b) § P<0,05 im Vergleich zu WT, * P<0,01 im Vergleich zu 30 min, # P<0,0005 im Vergleich zu 30 min und WT. (c) § P<0,005 im Vergleich zu WT, * P<0,0001 im Vergleich zu 30 min, # P<0,001 im Vergleich zu 30 min und WT. (d-f) Der Lungenwassergehalt (Nass-zu-Trocken- Verhältnis, mg Lungenwasser/mg Trockengewebe), die Neutrophilenakkumulation (Myeloperoxidase-Assay) und das Verhältnis des arteriellen Sauerstoffpartialdrucks (PaOz) zu der Fraktion von eingeatmetem Sauerstoff (FiO₂) wurden nach den angegebenen Zeiträumen von druckkontrollierter Ventilation bei 45 mbar (FiO₂=I, 0) bestimmt, (d) § P<0,005 im Vergleich zu WT, * P<0,0001 im Vergleich zu 30 min, # P<0,0005 im Vergleich zu 30 min und WT. (e) § P<0,005 im Vergleich zu WT, * P<0,0001 im Vergleich zu 30 min, # P<0,0001 im Vergleich zu 30 min und WT. (f) * P<0,0001 im Vergleich zu 30 min, # P<0,0005 im Vergleich zu 30 min und WT. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SD dargestellt und stammen aus sechs Tieren zu jeder Bedingung.

Fig. 5 Die makroskopischen und histologischen Anzeichen von akuter Schädigung werden nach zielgerichteter Gendeletion von cd73 verstärkt, (a, b) Cd73 ^Λ-Mäuse und deren entsprechende Wurfgeschwisterkontrollen (WT, BL6) wurden anästhesiert und für 90 Minuten bei 15 oder 45 mbar ventiliert (Fraktion von eingeatmetem Sauerstoff (FiO₂) von 1,0. Dargestellt sind repräsentative Fotomikrografien (xlOO und x400) mit H&E-Färbung der Lunge und die entsprechenden makroskopischen Aufnahmen der gesamten Lungen. Rekonstitution von cd73'- Mäusen mit löslicher 5'-Nucleotidase. Dreißig Minuten vor der Einleitung der Anästhesie wurden cd73 ^Λ-Mäuse oder deren entsprechende Wurfgeschwisterkontrollen (WT, BL6) mit 10 U von löslicher 5'-Nucleotidase aus Crotalus atrox-Gift (Sigma-Aldrich, + 5'-Nucleotidase) oder mit Vehikelkontrolle (- 5'- Nucleotidase) behandelt. Nach der Induktion der Anästhesie wurden die Tiere einer Tracheotomie unterzogen und unter druckkontrollierten Einstellungen mit einem Einatmungsdruck von 45 mbar für 90 Minuten mechanisch ventiliert. (FiO₂=I). (c) Die Albumin-Leckage wurde aus der broncheoalveolaren Lavage mittels (ELISA) bestimmt (* P<0,0001 im Vergleich zu WT, # P<0,001 im Vergleich zu cd73 ^/-Mäusen ohne 5'-Nucleotidase-Behandlung). (d) Lungenwassergehalt (* P<0,0001 im Vergleich zu WT, # P<0,001 im Vergleich zu cd73^~Λ-Mäusen ohne 5'-Nucleotidase-Behandlung). (e) Die Neutrophileninfil- tration wurde durch die Bestimmungen der pulmonaler Myeloperoxidase gemessen (* P<0,005 im Vergleich zu WT, # P<0,05 im Vergleich zu cd73 ^A- Mäusen ohne 5'-Nucleotidase-Behandlung). (f) Als inflammatorischer Marker wurde MIP-2 in der broncheoalveolaren Lavage mittels ELISA gemessen (*P<0,0001 im Vergleich zu WT, * P<0,0001 im Vergleich zu cd73 ^/-Mäusen ohne 5'-Nucleotidase-Behandlung). (g) Pulmonaler Gasaustausch, bestimmt durch den Gradienten von arteriellem Sauerstoffpartialdruck (PaO₂) zu FiO₂ (* P<0,0001 im Vergleich zu WT, # P<0,0005 im Vergleich zu cd73 ^Λ-Mäusen ohne 5'-Nucleotidase-Behandlung. Festzuhalten ist die Rekonstitution eines „Wild- tγp-Phänotyps" durch i.p. 5'-Nucleotidase-Behandlung von cd73^Λ -Mäusen.

Fig. 6 Die Behandlung mit löslicher Apyrase oder 5'-Nucleotidase schwächt die Lungenschädigung ab und erhöht die Überlebensrate während ALI. (a) Alters- und geschlechtsabgestimmte Mäuse (BL6/C57, SVJ129) wurden mit 10 Einheiten von löslicher Apyrase (aus Kartoffeln, Sigma-Aldrich, WT + Apyrase) oder Vehikelkontrolle (WT - Apyrase) 30 Minuten vor der Einleitung der Anästhesie behandelt. Die mechanische Ventilation wurde gestartet und die Mäuse wurden für 90 Minuten unter Verwendung von druckkontrollierten Einstellungen (ein Einatmungsdruck von 45 mbar, eingeatmete Sauerstoffkonzentration [FiOz] von 1, eine Respirationsrate und ein Einatmungs-zu-Ausatmungs-Verhältnis wurden eingestellt, um den normalen pH-Wert aufrechtzuerhalten). Dargestellt sind repräsentative histologische Schnitte (Hematoxylin/Eosin-Färbung bei 100 oder 400facher Vergrößerung. Festzuhalten ist, dass es zu einer abgeschwächten pulmonalen Infiltration mit Neutrophilen, Alveolarenanhäufung, Hyalinmembranen und Atemwegs Zerstörungen auf Grund der Apyrase-Behandlung kommt, (b) Untersuchung der broncheoalveolaren Flüssigkeit hinsichtlich des Gehalts an Albumin (* P<0_;0001), und MIP-2 (* P<0,0001), der pulmonalen neutrophilen Infiltration (Myeloperoxidase-Assay, * P<0,001) und Gasaustausch (arterieller Sauerstoffpartialdruck [Paθ2J/FiO₂, * P<0,05, n=6 für sämtliche Experimente), (c) Einfluss der Apyrase-Behandlung auf das Überleben während ALL Alters- und geschlechtsabgestimmte Mäuse (BL6/C57, SVJ 129) wurden mit 10 Einheiten Apyrase (WT + Apyrase) oder Vehikelkontrolle (WT - Apyra- se) 30 Minuten vor der Einleitung der Anästhesie behandelt. Die mechanische Ventilation wurde gestartet und die Mäuse wurden unter Verwendung von druckkontrollierten Einstellungen ventiliert (Einatmungsdruck von 45 mbar, eingeatmete Sauerstoffkonzentration [FiOz] von 1, die Respirationsrate und das Einatmungs-zu-Ausatmungs- Verhältnis wurden eingestellt, um einen normalen pH-Wert aufrechtzuerhalten), bis in dem Oberflächenelektrokardiogramm ein Herzstillstand beobachtet wurde (p<0,0001, n=8). Man beachte die erhöhte Überlebensrate nach Apyrase-Behandlung. (d) Alters- und geschlechtsabgestimmte Mäuse (BL6) wurden mit 10 Einheiten von löslicher 5'-Nucleotidase (5'- Nucleotidase aus Crotalus αfcro*-Gift, Sigma-Aldrich, WT + 5'NT) oder Vehikelkontrolle (WT-5'NT) 30 Minuten vor der Einleitung der Anästhesie behandelt. Die Mäuse wurden wie oben angegeben ventiliert, wobei repräsentative histologische Schnitte aus den Lungen dargestellt sind. Festzuhalten ist eine abgeschwächte pulmonale Infiltration mit Neutrophilen, alveolare Anhäufung, Hyalinmembranen und Atemwegszerstörung nach 5'-Nucleotidase-Behandlung. (e) Untersuchung der broncheoalveolaren Flüssigkeit hinsichtlich des Gehalts von Albumin (* P<0,005) und MIP-2 (* P<0,005), der pulmonalen Neutrophilen- infiltration (Myeloperoxidase, * P<0,005) und des pulmonalen Gasaustausches (* P<0,01, n=6 für alle Experimente), (f) Einfluss der S'-Nucleotidase-Behandlung auf das Überleben während ALI. Alters- und geschlechtsabgestimmte Mäuse (BL6) wurden mit 10 Einheiten von 5'-Nucleotidase (WT + 5'NT) oder Vehikelkontrolle (WT-5'NT) 30 Minuten vor der Einleitung der Anästhesie untersucht. Die mechanische Ventilation wurde gestartet und die Mäuse unter druckkontrollierten Einstellungen ventiliert (ein Einatmungsdruck von 35 mbar, eine eingeatmete Sauerstoffkonzentration [FiO₂] von 1, eine Respirationsrate und das Einatmungs-zu-Ausatmungs-Verhältnis wurde eingestellt, um einen normalen pH-Wert aufrechtzuerhalten, bis in dem Oberflächenelektrokardiogramm ein Herzstillstand beobachtet wurde (P<0,0001, n=8)). Festzuhalten ist eine erhöhte Überlebensrate nach 5'-Nucleotidase-Behandlung.

Fig. 7 BR4887/BAY 60-6583. (a) Chemische Struktur und (b) EC₅₀-Werte von BR4887/ BAY 60-6583 auf die Adenosin-Rezeptoren AIAAR, A₂AAR undA₂üAR.

Ausfuhrungsbeispiele

1. Methoden

1.1 Mechanische Ventilation der Mäuse

Sämtliche Tierprotokolle standen in Einklang mit den deutschen Richtlinien über die Verwendung von lebenden Tieren und wurden von der Tierschutzkommission des Universitätsklinikums Tübingen und des Regierungspräsidiums Tübingen genehmigt. Mäuse, die defizient in cd39 waren, wurden ausgehend von dem C57BL/6/129SVJ-Stamm, und die defizient in cd73 waren, wurden ausgehend von dem BL6-Stamm generiert, validiert und charakterisiert, wie zuvor beschrieben; Thompson, L. F. (2004, a.a.O), Enjiyoji, K et al., Targe- ted disruption of cd39/ATP diphosphohydrolase results in disordered he- mostasis and thromboregulation. Nat. Med. 5, 1010-7 (1999). Kontrollmäuse wurden hinsichtlich des Geschlechtes, Alters und Gewichts abgeglichen. Die Tiere wurden mit Pentobarbital anästhesiert (70 mg/kg i.p. zur Einleitung; 20 mg/kg/h zur Aufrechterhaltung) und auf einer temperaturkontrollierten Heizplatte (RT, Effenberg, München, Deutschland) mit einer rektalen Thermometersonde platziert, die mit einem thermalen Feedback-Controller verbunden war, um die Körpertemperatur bei 37°C aufrechtzuerhalten. Zusätzlich wurden sämtliche Tiere mit einem Elektrokardiogramm (Hewlett Packard, Böblingen, Deutschland) überwacht. Ein Flüssigkeitsaustausch erfolgte mit normaler Kochsalzlösung, 0,05 ml/Stunde i.p. Die Tracheotomie erfolgte in Rückenlage. In Kürze, die Trachea wurde chirurgisch freigelegt, horizontal eingeschnitten und eine stumpfe Polyurethankanüle (Insyte 22G, Beckton Dickinson, USA) wurde eingeführt und ortsfixiert. Die Trachealröhre wurde mit einem mechanischen Ventilator (Servo 900C, Siemens, Deutschland, mit einer pädiatrischen Röhreneinrichtung) verbunden. Die Mäuse wurden in einem druckkontrollierten Ventilationsmodus mit verschiedenen Einatmungsdrücken (15, 35 und 45 mbar) für verschiedene Zeiträume (30 bis 90 min) ventiliert. Die Respirationsrate und I:E-Verhältnisse wurden auf der Basis von arteriellen Blutgasproben eingestellt, die durch Herzpunktion in Kontrolltieren gewonnen wurden, um einen Kohlendioxid-Partialdruck zwischen 35 und 40 mmHg und einem pH-Wert zwischen 7,35 und 7,40 aufrechtzuerhalten. Sämtliche Tiere wurden mit einem FiC«2 von 1 ventiliert, außer während der Experimente, um einen möglichen Einfluss von FiO₂ auf die CD39- oder CD73-Transkription zu bestimmen.

1.2 Transkriptionsanalyse

Um den Einfluss der mechanischen Ventilation auf die CD39- und CD73- Transkriptionsspiegel zu untersuchen, wurden C57BL/6J-Mäuse (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) auf druckkontrollierte Art und Weise mit den angegebenen Einstellungen ventiliert. Die Mäuse wurden zu den angegebenen Zeitpunkten getötet und das verbleibende Blut wurde aus der pulmonalen Zirkulation durch Injektion von 1 ml von PBS in das rechte Herz entfernt. Die Lun- gen wurden exzidiert und unmittelbar bei -80⁰C bis zum Transkriptionsprofi- ling eingefroren. Zu diesen Zwecken wurde die RNA unter Verwendung des Gesamt-RNA-Isolation-NucleoSpin-RNA-II-Kit gemäß der Anweisungen des Herstellers (Macherey & Nagel, Düren, Deutschland) isoliert. In Kürze, die gefrorenen Gewebe wurden in Gegenwart von RAl-Lysepuffer mit Beta- Mercaptoethanol (Micra D8 Homogenizer, ART-Labortechnik, Müllheim, Deutschland) homogenisiert. Nach der Filtration wurden die Lysate auf Nuc- leoSpin-RNA-II-Säulen geladen, entsalzt und mit DNase I verdaut (Macherey & Nagel, Düren, Deutschland). Die RNA wurde gewaschen und die Konzentration wurde quantifiziert. Die cDNA-Synthese erfolgte unter Verwendung von reverser Transkription gemäß den Anweisungen des Herstellers (i-script-Kit, Bio- Rad Laboratories, Inc., München, Deutschland). Die Primeransätze für die PCR-Reaktion enthielten 1 μM Sinn- und 1 μM Gegensinn-Primer mit SYBR Green I (Molecular Probes Inc.). Die Primersequenzen für murines CD39/CD73 waren 5'-TACCACCCCATCTGGTCATT-3' (SEQ ID-Nr. 1) und 5'- GGACGTTTTGTTTGGTTGGT-3' (SEQ ID-Nr. 2) (Sinn/Gegensinn) bzw. 5'- CAAATCCCACACAACCACTG-3 (SEQ ID-Nr. 3) und 5'- TGCTCACTTGGTCACAGGAC-3' (SEQ ID-Nr. 4). Die Primeransätze wurden amplifiziert, indem zunehmende Anzahlen von Zyklen von 94°C für 1 min, 58°C für 0,5 min, 72°C für 1 min verwendet wurden. Als Kontrolle wurde murines ß-Actin [Sinn-Primer, 5'-ACATTGGCATGGCTTTGTTT-S' (SEQ ID-Nr. 5) und Gegensinn-Primer, 5'-GTTTGCTCCAACCAACTGCT-3' (SEQ ID-Nr. 6)] in identischen Reaktionen für das Starttemplate verwendet. Die Spiegel und x- fache Veränderung von mRNA wurden bestimmt, wie zuvor beschrieben; vgl. Pfaffl, M. W., A new mathematical model for relative quantification in real- time RT-PCR. NudeicAcids Res. 29, e45 (2001).

1.3 Immunblotting-Experimente

In verschiedenen Experimenten wurde der Gehalt von CD39- und CD73- Protein aus der Gesamtlunge bestimmt. Zu diesen Zwecken wurden C57BL/6J- Mäuse (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) mit den angegebenen Ventilator- einstellungen ventiliert und anschließend getötet. Das verbleibende Blut wurde aus der pulmonalen Zirkulation durch die Injektion von 1 ml von PBS in das rechte Herz entfernt. Die Lungen wurden exzidiert und unmittelbar bei -80⁰C bis zum Immunblotting eingefroren. Hierzu wurden die Gewebe homogenisiert und für 10 min in eiskaltem Lysepuffer (10⁷PMN/500 μl; 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA, 2 % Triton X-100, und 10 % Säuge- tiergewebe-Proteaseinhibitor-Cocktail; Sigma-Aldrich) lysiert und in Mikrofu- genröhrchen gesammelt. Nach der Zentrifugation bei 14.000 g, um die Zelltrümmer zu entfernen, wurde das Pellet verworfen. Die Proteine wurden in reduzierendem Laemmli-Probenpuffer gelöst und für 5 min auf 90⁰C erhitzt. Die Proben wurden auf einem 12%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nit- rocellulosemembranen transferiert. Die Membranen wurden für 1 h bei Raumtemperatur in PBS, versetzt mit 0,2 % Tween 20 (PBS-T) und 4 % BSA blockiert. Die Membranen wurden in 10 μg/ml CD39-Ziege-polyklonaler Antikörper gegen den C-Terminus (Santa Cruz, Danvers, USA) oder in CD73- Kaninchen-polyklonaler Antikörper gegen die Aminosäuren 275 bis 574 (Santa Cruz, Danvers, USA) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von lOminütigem Waschen in PBS. Die Membranen wurden in 1:3000 Esel-AntiZiege-HRP für CD39 (Santa Cruz, Danvers, USA) oder Ziege-Anti-Kaninchen- HRP für CD 73 (Perbio Science, Bonn, Deutschland) inkubiert. Das Waschen wurde wiederholt und die Proteine wurden durch verstärkte Chemilumines- zenz detektiert.

1.4 Immunhistochemie

Um den Einfluss der mechanischen Ventilation auf pulmonales CD39 und CD73 zu untersuchen, wurden C57BL/6J-Mäuse (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) auf druckkontrollierte Art und Weise mit den angegebenen Einstellungen ventiliert. Die Mäuse wurden getötet und die Lungen wurden über den rechten Ventrikel mit 5 ml von PBS perfundiert. Die Lungen wurden anschließend entfernt und in Tissue-Tek (Sakura) für 24 Stunden fixiert. Kryo- statschnitte wurden auf Glasobjektträger eingebettet, luftgetrocknet und in Aceton/Methanol (1:1) für 10 Minuten bei Raumtemperatur nachfixiert. Die Schnitte wurden durch Inkubation in 5 % [w/v (Gewicht pro Volumen)] Magermilch und 0,1 % (w/v) Triton X-100 (Sigma, München, Deutschland) und Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) für 30 Minuten blockiert. CD39-Ziege- polyklonaler Antikörper gegen den C-Terminus (Santa Cruz, Danvers, USA) oder CD73-Kaninchen-polyklonaler Antikörper gegen die Aminosäuren 275- 574 (Santa Cruz, Danvers, USA) wurden 1:200 in der gleichen Lösung verdünnt und die Schnitte wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach drei Waschvorgängen mit TBS wurden die Schnitte für 45 Minuten mit dem Sekundärantikörper (CD39: Ziege-Anti-Kaninchen Cy3, Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland; CD73: Kaninchen-Anti-Ziege Cy3, Dianova, Hamburg, Deutschland) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fluoreszenz wurde mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop (Leica, Deutschland) visualisiert.

1.5 Broncheoalveolare Lavage (BAL)

Um BAL-Flüssigkeit zu erhalten, wurde der Trachealtubus von dem mechanischen Ventilator abgekoppelt und die Lungen wurden dreimal mit 0,5 ml von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült. Sämtliche entfernte Flüssigkeit wurde unmittelbar anschließend zentrifugiert und der Überstand wurde für die Albumin- oder MIP-2-Bestimmung aliquotiert.

1.6 Messung von Albumin und MIP-2 in BAL-Flüssigkeit

Die BAL-Flüssigkeitsproben wurden auf 4°C aufgetaut und die Albumin- oder MIP-2-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines murinen quantitativen Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)-Systems gemäß der Anweisungen des Herstellers gemessen (Albumin: Bethyl, Montgomery, TX; MIP-2: R&D Systems, Minneapolis, MN). Sämtliche Analysen erfolgten im Dreifachansatz und die Mittelwerte wurden für die statistische Analyse verwendet. 1.7 Myeloperoxidase-Assay

Die pulmonale neutrophile Sequestration wurde unter Verwendung eines Myeloperoxidase(MPO)-Assays quantifiziert, wie zuvor beschrieben; vgl. Spey- er, C .L. et al., Regulatory effects of estrogen an acute lung inflammation in mice. Am. J. Physiol. Cell. Phγsiol. 288, C881-90 (2005); Graff, G. et al., Im- proved myeloperoxidase assay for quantitation of neutrophil influx in a rat model of endotoxin-induced Uveitis. /. Pharmacol. Toxicol. Methods 39, 169-78 (1998); Schneider, T. & Issekutz, A. C, Quantitation of eosinophil and neutrophil infiltration into rat lung by specific assays for eosinophil peroxidase and myeloperoxidase. Application in a Brown Norway rat model of allergic pulmonary inflammation. /. Immunol. Methods 198, 1-14 (1996). In Kürze, die Tiere wurden getötet und die Lungen wurden mit 5 ml von PBS durch den rechten Ventrikel perfundiert. Die Lungen wurden exzidiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren, lyophilisiert, mechanisch homogenisiert und in einer Pufferlösung von 50 mM Kaliumphosphat (pH 6,0) gewaschen, um sämtliches Hämoglobin zu entfernen. Das resultierende Pellet wurde in 1,5 ml einer Lösung resuspendiert, die Hexadecyltrimethylammoniumbromid (5g/l) enthielt. Die Lösung wurde drei Zyklen des Einfrierens (auf Trockeneis) und Auftauens (bei Raumtemperatur) unterzogen, für 40 s sonifiziert und bei 10.000 g für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dann auf MPO-Aktivität unter Verwendung einer spektrofotometrischen Reaktion mit O-dianisidinhydro- chlorid (Sigma-Aldrich) bei 450 nm unterzogen. Die Absorption bei 450 nm wurde gemessen und als Unterschied in der optischen Dichte (ΔOD) über 5 Minuten dargestellt.

1.8 Nass-zu-Trocken- Verhältnisse

Nach der Ventilation mit den angegebenen Einstellungen wurden die Lungen en bloc exzidiert. Das Gewicht wurde unmittelbar bestimmt, um einen Verdampfungsverlust von Gewebeflüssigkeit zu vermeiden. Die Lungen wurden dann für 48 Stunden lyophilisiert und das Trockengewicht wurde gemessen. Nass-zu-trocken-Verhältnisse wurden dann als mg von Wasser pro mg von Trockengewebe berechnet.

1.9 Blutgasanalyse

Um den pulmonalen Gasaustausch zu bestimmen, wurden Blutgasanalysen durch den Erhalt von arteriellem Blut über eine Herzpunktion durchgeführt. In Kürze, eine laterale Thorakotomie wurde durchgeführt, um auf das linke Herz zugreifen zu können, und das Blut wurde via Herzpunktion erhalten. Die Analyse erfolgte unmittelbar nach der Blutgewinnung mit dem I-STAT- Analyzer (Abbott, Wiesbaden, Deutschland).

1.10 Histopathologische Evaluierung von ALI

Nach der Ventilation mit den angegebenen Einstellungen wurden die Mäuse getötet und die Lungen wurden durch Einträufelung von 10 % Formaldehyd- lösung durch die Trachealkanüle bei einem Druck von 20 mbar fixiert. Die Lungen wurden dann in Paraffin eingebettet und mit Hematoxylin und Eosin angefärbt. Zwei zufällige Gewebeschnitte aus vier unterschiedlichen Lungen in jeder Gruppe wurden von einem Pathologen untersucht, dem der genetische Hintergrund bzw. die Behandlung der Mäuse unbekannt war. Das akute Lun- genversagen wurde, wie zuvor beschrieben (vgl. Belperio, J. A. et al., Critical role for CXCR2 and CXCR2 ligands during the pathegenesis of ventilator- induced lung injury. /. Clin. luvest. 110, 1703-1716 (2002)) gemäß der folgenden Kriterien eingestuft: (1) alveolare Anhäufung, (2) Hämorrhagie, (3) Infiltration und Aggregation von Neutrophilen im Luftraum oder der Gefäßwand, und (4) Dicke der Alveolarwand(Hyalinrnembranformation. Für jedes Kriterium wurde eine Fünfpunkteskala verwendet: 0 = minimale (geringe) Schädigung, 1+ = leichte Schädigung, 2+ = moderate Schädigung, 3+ = starke Schädi- gung, und 4+ = maximale Schädigung. Die Werte wurden aufsummiert und als Mediane ±-Bereich angegeben.

1.11 Datenanalyse

Die Werte für die Lungenschädigung und das Überleben werden als Median (Bereich) angegeben, sämtliche anderen Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (s.d.) aus 4 bis 6 Tieren pro Bedingung angegeben. Es wurden statistische Analysen unter Verwendung des Student's t-Tests (zweiseitig, α<0,05) oder eine Varianzanalyse durchgeführt, um Gruppenunterschiede zu bestimmen. Die Einstufung der Lungenschädigung wurde mit dem Kruskal- Wallis-Rank-Test analysiert. Kaplan Maier-Kurven wurden unter Verwendung eines Logrank-Tests (Mantel-Haenszel-Test) verglichen. P<0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

2. Ergebnisse

2.1 CD39 und CD73 werden durch mechanische Ventilation induziert

Wie erwartet kam es durch die mechanische Ventilation bzw. Beatmung der Mäuse zur Schädigung der Lunge, bspw. zu Hypoxien, Ischämien, Ventilationsstörungen und systemischen Entzündungen. Wie bereits gezeigt wurde, werden CD39 und CD73 durch Hypoxie induziert. Dabei handelt es sich um einen kritischen Schritt für die Aufrechterhaltung der Funktion der Gefäßwand durch den Anstieg der Bildung von extrazellulärem Adenosin und der Signalübertragung; Thompson et al. (2004, a.a.O.), Eltzschig et al. (2003, a.a.O.).

Um zu untersuchen, ob CD39 und CD73 auch eine wichtige Rolle in der Gefäßwand während der Ventilation spielen, wurden die Folgen der mechanischen Ventilation auf die Transkription im Hinblick auf die CD39/73- Expressionsmuster untersucht. Zu diesem Zwecke wurden Mäuse für 0 bis 150 min unter druckkontrollierter Ventilation ventiliert [eingeatmete Sauerstofffraktion (FiOz) 1, Einatmungsdruck 15 mbar]. Die Respirationsrate und das Verhältnis von Einatmungs- zu Ausatmungszeit wurden eingestellt, um einen arteriellen Kohlendioxidpartialdruck (PaCO₂) von 35 bis 40 mmHg und einen pH-Wert von 7,35 bis 7,40 aufrechtzuerhalten. Nachdem die Tiere zu den angegebenen Zeitpunkten getötet wurden, die Lungen präpariert und die RNA isoliert wurde, wurden die Transkriptionsspiegel der Nucleotidasen mittels Echtzeit-RT-PCR bestimmt.

Diese Experimente zeigten eine sofortige und deutliche Induktion der CD39- und CD73-Transkriptionsspiegel mit zunehmender Ventilationszeit (Fig. Ia).

Da eine frühere Untersuchung eine Fiθ2-abhängige Modulation von Adenosin- Signalübertragungseffekten gezeigt hatte, wurden die relativen Transkriptionsspiegel von CD39/73 nach 150 min der Ventilation bei verschiedenen FiO₂- Werten gemessen (Fig. Ib). Es konnten allerdings keinerlei Transkriptionseffekte der eingeatmeten Sauerstoff fraktion auf die CD39/73-Expressions- muster beobachtet werden. Deshalb wurden die weiteren Experimente mit einem FiO₂ von 1 durchgeführt, da dies die Situation von ventilierten Patienten mit ALI am besten widerspiegelt.

Als nächsten Schritt wurde CD39/73 durch Western-Blot-Analyse von gesamten Lungen von ventilierten Mäusen gemessen, wobei ventilationszeitabhängige Zunahmen des CD39/73-Proteins bestätigt wurden (Fig. Ic). Gleichermaßen bestätigte die immunhistochemische Färbung von CD39 und CD73 in gesamten Lungen nach mechanischer Ventilation (3 h) die Induktion von CD39 und CD73 (Fig. Id). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse eine Fiθ2-unabhängige Koordination der pulmonalen CD39- und CD73-Induktion durch mechanische Ventilation.

2.2 ALI ist in cd39 ^A-Mäusen verstärkt

Nachdem gezeigt wurde, dass die Ecto-Apyrase und Ecto-5'-Nucleotidase durch mechanische Ventilation induziert wird, wurde als Nächstes deren funktioneller Beitrag zu ALI untersucht, das durch mechanische Ventilation induziert wurde. Zu diesem Zwecke wurden bereits zuvor charakterisierte cd39 ^/ -Mäuse verwendet und mittels Hochdruckventilation für verschiedene Ventilationszeiten (30 bis 90 min) und unterschiedlichen Einatmungsdrücken (15 bis 45 mbar) wurde ein nicht-infektiöses ALI induziert.

Wie in Fig. 2a-c gezeigt, zeigten Wildtyp-Mäuse Zeit/Dosis- und Druck/Dosisabhängige Anstiege in der Albuminleckage in die Bronchoalveolar- Lavage(BAL)-Flüssigkeit. Ebenso, wie bei den Wildtyp-Tieren nahm in den cd39 ^/ -Mäusen die Albuminleckage mit dem Druck und der Zeit zu. Allerdings waren die Zunahmen in den mutierten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen wesentlich deutlicher. Bspw. war die BAL-Albuminleckage 3,lfach höher nach 90 min der mechanischen Ventilation mit 45 mbar in cd39 ^Λ-Mäusen im Vergleich zu den Wurfgeschwistern (Fig. 2c). Gleichermaßen waren die Zunahmen der Lungenwasser (Fig. 2d) und der PMN-Infiltration [Myeloper- oxidase(MPO)-Gewebeaktivität, Fig. 2e] nach der cd39-Gendeletion signifikant erhöht.

Die Tatsache, dass cd39 ^A-Mäuse anfälliger für durch mechanische Ventilation induziertes ALI waren, wurde auch in den funktionellen Untersuchungen widergespiegelt. Während der Gradient von arteriellem Sauerstoffpartialdruck (PaCh) zu FiÜ2 sowohl in Wildtyp- als auch in Knockout-Tieren mit der Venti- lationsdauer abnahm (Fig. 2f), war diese Abnahme in cd39 ^Λ-Mäusen deutlich verstärkt.

Zusammengefasst zeigen diese Daten zum ersten Mal eine funktionelle Rolle von CD39 in durch mechanische Ventilation induziertem akutem Lungenver- sagen.

2.3 Makroskopische und histologische Charakteristiken von ALI in Lungen aus cdS^-Mäusen

Um die erhöhte Anfälligkeit von cd39 ^Λ-Mäusen für Lungenversagen durch mechanische Ventilation zu bestätigen, wurden Lungen aus Wildtyp- und cd39 ^/ -Mäusen nach 90 Minuten der Ventilation bei 15 oder 45 mbar untersucht.

Wie in makroskopischen Aufnahmen der gesamten Lungen aus den ventilierten Wurf geschwi stern (CD57BL/6/129svj-Stamm) gezeigt, nehmen Ödeme und Hämorrhagie mit der Hochdruckventilation zu (45 mbar, Fig. 3a).

Gleichermaßen wurde im Rahmen der quantitativen Analyse der pulmonalen Histologie eine erhöhte alveolare Anhäufung, Leukozyten-Infiltration, alveolare Hämorrhagie und alveolare Wanddicke in Lungen beobachtet, wenn die Lungen mit Hochdruck ventiliert wurden (Lungenschädigungswert 1 [Bereich 1 bis 2, 15 mbar] gegenüber 4 [Bereich 3 bis 5, 45 mbar, p<0,05]). Wie in dem makroskopischen Einschub in Fig. 3b gezeigt, waren diese Befunde in cd39 ^Λ- Mäusen deutlicher. Tatsächlich zeigte die quantitative histologische Analyse in Mäusen mit zielgerichteter Deletion von cd39 höhere Lungenschädigungswerte als bei deren Wurfgeschwisterkon trollen (5, Bereich 4 bis 6, 90 min bei 15 mbar, 10,5, Bereich 9 bis 12m, 90 min bei 45 mbar, p<0,05 im Vergleich zum Wildtyp). Zusammengefasst bestätigen diese Ergebnisse die erhöhte Anfälligkeit von cd39 ^Λ-Mäusen für ventilatorinduziertes ALI.

2.4 Rekonstitution von cd39 ^Λ-Mäusen mit löslicher Apyrase

Als „proof of principle" wurden cd39^~Λ-Mäuse über die Injektion i.p. von löslicher Apyrase (10 Einheiten i.p.) rekonstituiert.

In der Tat konnte die Zunahme der Albuminleckage in cd39 ^/~-Mäusen bis auf ein ähnliches Maß revertiert werden, das in Wildtyp-Mäusen unter Apyrase- Behandlung beobachtet wird (Fig. 3c). Gleichermaßen wurden die Veränderungen des Lungenwassers (Fig. 3d) der inflammatorischen Marker [MPO, Fig. 3e und makrophageninflammatorisches Protein (MIP)-2, Fig. 3f] und der pθ2/Fiθ2-Gradient nahezu vollständig revertiert.

Zusammengefasst liefern diese Untersuchungen einen starken Beweis dafür, dass CD39 eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der Funktion der ka- pillaren-alveolaren Barriere während der Episoden der nicht-infektiösen ALI spielt.

2.5 Die Inhibition von CD73 verstärkt ALI

Nachdem gezeigt wurde, dass CD39 in ALI eine protektive Rolle spielt, wurde als Nächstes der funktionelle Beitrag von CD 73 untersucht, das die finale Konversion von AMP in Adenosin katalysiert und als Schrittmacher für die extrazelluläre Adenosinbildung angesehen wird. Zu diesem Zwecke wurden BL6-Mäuse mit 100 mg/kg i.p. des hochspezifischen CD73-Inhibitors APCP behandelt.

In der Tat nahm die BAL-Albuminleckage (l,6±0,l-fach, p<0,001), der Lungenwassergehalt von 7,3±0,5 bis 8,0 ±0,1 mg/mg Trockengewicht (p<0,05), MPO (l,8±0,6-fach, p<0,0001) nach APC-Behandlung zu (90 min Ventilationsdauer, 45 mbar Einatmungsdruck, Daten nicht gezeigt). In Übereinstimmung mit den Erkenntnissen für die cd39 ^Λ-Mäuse nahm das Verhältnis von PaO₂/FiO₂ von 39±3,6 auf 30±2,8 mmHg nach der APCP-Behandlung ab (90 min Ventilation bei 45 mbar Einatmungsdruck, p<0,01, Daten nicht gezeigt).

Zusammengefasst liefern diese Untersuchungen den pharmakologischen Beweis, dass die Inhibition der CD73-Funktion in einer erhöhten Anfälligkeit für durch mechanische Ventilation induziertes akutes Lungenversagen resultiert.

2.6 ALI ist in cd73 ^/-Mäusen verstärkt.

Basierend auf diesen pharmakologischen Untersuchungen, die nach CD73- Inhibition eine erhöhte Stärke von ALI zeigten, wurden als Nächstes die Auswirkungen der mechanischen Ventilation auf ALI in den zuvor charakterisierten cd73 ^/-Mäusen untersucht (BL6-Hintergrund).

Gleichermaßen wie in den cd39"'-Mäusen zeigten diese Studien Zeit/Dosis- und Druck/Dosis-abhängige Zunahmen der Albuminleckage, Lungenödeme und der Gewebe-MPO-Aktivität sowie eine Abnahme des Paθz/Fiθ2- Gradienten in cd73^~/~-Mäusen im Vergleich zu deren Wurfgeschwisterkontrollen (Fig. 4).

Zusammengefasst liefern diese Untersuchungen zum ersten Mal den genetischen Beweis für eine protektive Rolle der extrazellulären Adenosinbildung über CD 73 während durch mechanische Ventilation induziertes ALI.

2.7 Makroskopische und histologische Charakteristiken von ALI in Lungen aus cd73"^/ -Mäusen Um die zuvor für cd39 ^Λ-Mäuse erlangten makroskopischen und histologi- schen Befunde zu erweitern und um zusätzliche Beweise für eine protektive Rolle von CD73 in muriner ALI zu erhalten, wurden Lungen aus cd73 ^/~- Mäusen nach 90-minütiger Ventilation bei 15 oder 45 mbar im Vergleich mit Wurfgeschwistern untersucht.

Makroskopische Aufnahmen von gesamten Lungen aus den ventilierten Kontrollen zeigten mit der Hochdruckventilation eine zunehmende Lungenödembildung und Hämorrhagie (45 mbar, Fig. 5a). Die quantitative Analyse der pulmonalen Histologie bestätigte eine Zunahme der Lungenschädigungswerte von 1,5 (Bereich 1 bis 2, 15 mbar) gegenüber 5,5 (Bereich 5 bis 6, 45 mbar, p<0,05). Allerdings waren diese Befunde deutlicher in den cd73^7*- Mäusen mit Lungenschädigungswerten von 6,0 (Bereich 4 bis 7, 90 min bei 15 mbar) und 7,5 (Bereich 6 bis 8, 90 min bei 45 mbar, p<0,05 im Vergleich zu Wurf geschwisterkontrollen) .

Zusammengefasst liefern diese Ergebnisse pharmakologische und genetische Beweise für die erhöhte Anfälligkeit von cd73 ^/ -Mäusen für durch mechanische Ventilation induziertes ALI.

2.8 Rekonstitution von cd73^~Λ-Mäusen mit löslicher 5'-Nucleotidase

Als „proof of principle" und um zu demonstrieren, dass die erhöhte Stärke von ALI -Symptomen in cd73 ^Λ-Mäusen das Fehlen von extrazellulärer 5'- Nucleotidaseaktivität reflektiert, wurden als Nächstes cd73 ^Λ-Mäuse über die i.p. -Injektion mit löslicher 5'-Nucleotidase (Sigma, 5'-Nucleotidase aus dem Crotalns atrox-Gift) rekonstituiert.

Wie in Fig. 5b gezeigt, wurde die Albuminleckage bei cd73 ^Λ-Mäusen vollständig auf den „Wildtyp-Spiegel" nach i.p.-Nucleotidasebehandlung revertiert. Gleichermaßen wurden die inflammatorischen Marker (MPO, Fig. 5d und MIP-2, Fig. 5f) durch i.p.-5'-Nucleotidase-Therapie abgeschwächt.

Zusammengefasst liefern diese Untersuchungen den starken Beweis, dass sowohl CD39 als auch CD73 wichtige Rollen für die Aufrechterhaltung der kapillaren-alveolaren Barrierefunktion während der Episoden von nichtinfektiöser ALI spielen.

2.9 Die Behandlung mit löslichen Nucleotidasen schwächt die Lungenschädigung ab und erhöht die Überlebensrate

Nachdem demonstriert wurde, dass pharmakologische oder genetische Interventionen in das extrazelluläre Nucleotid-Phosphohydrolyse-System über CD39 und CD73 mit einer dramatischen Verschlimmerung von ALI während der mechanischen Ventilation einhergehen, wurde die Hypothese aufgestellt, dass die erhöhte extrazelluläre Adenosinbildung durch die Behandlung mit löslichen Nucleotidasen eine therapeutischen Ansatz für nicht-infektiöses ALI oder durch Beatmung verursachten Lungenschädigung darstellen könnte. Deshalb wurden Wildtyp-Mäuse (SVJ 129) mit 10 Einheiten von löslicher Apy- rase i.p. behandelt.

Wie in den histologischen Schnitten der Lungen nach 90 min der Ventilation bei 45 mbar (Fig. 6a) gezeigt, sind die mikroskopischen Anzeichen von Lun- genversagen nach der Apyrase-Behandlung weniger deutlich ausgeprägt. Tatsächlich wurden die quantitativen histologischen Werte von 4 (Bereich 3 bis 5) auf 3 (Bereich 2 bis 4, p<0,05) reduziert. Gleichermaßen wurde die BAL- Albuminleckage, MIP-2 und pulmonales MPO abgeschwächt, während der Gasaustausch (PaO₂/FiO₂-Gradient) erhöht wurde (Fig. 6b).

Um zu demonstrieren, dass die Apyrase-Behandlung das Auftreten von ALI beeinflusst, wurde als Nächstes die Überlebenszeit während der Ventilation bei 35 mbar gemessen, die über den Herzstillstand definiert wurde, der im Oberflächenelektrokardiogramm beobachtet wurde.

In der Tat war das Überleben nach der Apyrase-Behandlung mit einer Erhöhung der mittleren Überlebenszeit von 156,5 min (Bereich 148 bis 167 min) auf 190,5 min (Bereich 185 bis 205 min, p<0,0001, n=8) assoziiert, was einen therapeutischen Effekt der Apyrase-Behandlung in nicht-infektiösem ALI demonstriert (Fig. 6c).

Als nächsten Schritt wurden DL6-Mäuse mit löslichen Nucleotidasen behandelt, die aus C. atrox gereinigt wurden.

Entsprechend der Apyrase-Behandlung waren die Anzeichen von ALI reduziert [Fig. 6d, der histologische Wert verbesserte sich von 5,5 (Bereich 5 bis 6) auf 3 (Bereich 3 bis 5)]. Ferner waren die Albumin- und MIP-2-Gehalte der BAL und die pulmonalen MPO-Messungen abgeschwächt, wohingegen die Sauerstoffversorgung verbessert war (Fig. 6e). Gleichermaßen wie bei der Apyrase- Behandlung führte die Verabreichung i.p. zu einer Erhöhung der Überlebensdauer [mittlere Überlebensdauer ohne Behandlung 142 min (Bereich 137 bis 152 min) gegenüber 173,5 min (Bereich 158 bis 180 min) mit Behandlung p<0,0001, n=8, Fig. 6f].

Zusammengefasst zeigen diese Daten einen therapeutischen Effekt der Apyra- se/Nucleotidase-Behandlung während der ALI. Die Nucleotid-Phosphohydro- lase stellt deshalb ein nützliche Verbindung zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von akutem Lungenversagen (ALI) bzw. einer durch Beatmung verursachten Lungenschädigung dar.

Claims

Patentansprüche

1. Verwendung von Nucleotid-Phosphohydrolase zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von akutem Lun genversagen (ALI).

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Nucleotid-Phosphohydrolase Apyrase (CD39) verwendet wird.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Nucleotid-Phosphohydrolase 5'-Nucleotidase (CD73) verwendet wird.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotid-Phosphohydrolase in löslicher Form vorliegt.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotid-Phosphohydrolase in mikronisierter Form vorliegt.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotid-Phosphohydrolase in Form einer Codierungssequenz in einem Expressionsvektor vorliegt.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel einen Wirkungsverstärker aufweist.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirkungsverstärker ein Adenosin-A₂B-Rezeptor-Agonist verwendet wird.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Adeno- sin-A2B-Rezeptor-Agonist BR4887 verwendet wird.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirkungsverstärker ein Inhibitor des Nucleosid-Transporters verwendet wird.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Nucleosid-Transporter ENT-I und/oder ENT-2 ist.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Inhibitor von ENT-I und/oder ENT-2 Dipyridamol verwendet wird.

13. Verfahren, um bei einem Lebewesen eine Veranlagung für oder Erkrankung an akutem Lungenversagen (ALI) zu diagnostizieren, das die folgenden Schritte aufweist:

(1) Bereitstellung einer aus dem Lebewesen stammenden biologischen Probe,

(2) Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein einer Nucleotid-Phosphohydrolase,

(3) Ggf. Bestimmung der Funktionsfähigkeit und/oder Aktivität der Nucleotid-Phosphohydrolase,

(4) Korrelation der Abwesenheit von Nucleotid-Phosphohydrolase in der biologischen Probe oder einer in der biologischen Probe gegenüber dem Wildtyp reduzierten Funktionsfähigkeit und/oder Aktivität der Nucleotid-Phosphohydrolase in der biologischen Probe mit einer positiven Diagnose.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (2) ein Mutationsscreening durchgeführt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (3) die Adenosinbildungsrate der in der biologischen Probe vorhande- nen Nucleotid-Phosphohydrolase im Vergleich zu Wildtyp-Nucleotid- Phosphohydrolase bestimmt wird.

16. Pharmazeutische und/oder diagnostische Zusammensetzung, die eine Nucleotid-Phosphohydrolase in einer therapeutisch wirksamen Menge sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ggf. einen Wirkungsverstärker aufweist.

17. Verfahren, um bei einem Lebewesen eine Veranlagung für akutes Lungenver- sagen (ALI) oder Erkrankung an ALI zu diagnostizieren, das die folgenden Schritte aufweist:

(1) Verabreichung der diagnostischen Zusammensetzung nach Anspruch 16 an ein Lebewesen, das Symptome von ALI zeigt;

(2) Feststellung, ob sich die Symptome verbessern, und

(3) Korrelation einer Verbesserung der Symptome mit einer positiven Diagnose.

18. Verwendung von Nucleotid-Phosphohydrolase zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik einer durch Beatmung verursachten Lungenschädigung.

19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Nucleotid- Phosphohydrolase Apyrase (CD39) verwendet wird.

20. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Nucleotid- Phosphohydrolase 5'-Nucleotidase (CD73) verwendet wird.

21. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotid-Phosphohydrolase in löslicher Form vorliegt.

22. Verwendung eines Adenosin-A2B-Rezeptor-Agonisten, vorzugsweise von BR4887 (BAY 60-6583), zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung und/oder Diagnostik von ALI.