WO2008016133A1 - Enzyme de phosphorylation d'un médicament - Google Patents

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WO2008016133A1
WO2008016133A1 PCT/JP2007/065232 JP2007065232W WO2008016133A1 WO 2008016133 A1 WO2008016133 A1 WO 2008016133A1 JP 2007065232 W JP2007065232 W JP 2007065232W WO 2008016133 A1 WO2008016133 A1 WO 2008016133A1
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WO
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amino acid
polypeptide
group
compound
amino
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PCT/JP2007/065232
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English (en)
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Futoshi Nara
Kiyoaki Yonesu
Kazuishi Kubota
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Daiichi Sankyo Company, Limited
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme that phosphorylates a drug in vivo. Furthermore, the present invention relates to a method for phosphorylating a compound using the above enzyme, a method for screening a compound phosphorylated by the enzyme, a method for determining the phosphorylation ability of a test compound of a subject, and the like. Background art
  • Some medicinal products have a structure different from that of a compound having an actual medicinal effect at the stage of administration to a patient, and when administered to a patient, there are those that are metabolized in vivo to change the structure and exert their medicinal effects. .
  • a compound before being metabolized in vivo is called a prodrug, and various enzymes that metabolize a prodrug to a compound having a medicinal effect are known.
  • Some amino alcohol derivatives exhibit immunosuppressive activity by being phosphorylated in vivo.
  • FTY720 (2-Amino-2- [2- (4-octylphenyl) ethyl] propane-1,3-diol hydrochloride) receives a phosphate salt by sphingosin kinase 1 and 2 in vivo, ⁇ 20-phosphate ue, :: 2_ammo_ 2 phosphoryloxymethyl_4_ (4_oct ylphenyDbutanol], and is considered to exhibit immunosuppressive action (The Journal of Biological Chemistry, (2003), 278, ⁇ ⁇ 47408-47415) .
  • R 1 and R 2 are hydrogen atoms, is a CI—C6 alkyl group or a hydroxymethyl group
  • R 4 is a hydrogen atom, a halogen atom or C1—C6 alkyl group
  • R 5 is a hydrogen atom, halogen atom, cyano group, C1 C6 alcoholoquinol group, C1 —C6 alkoxy group, C3—C6 cycloalkyl group, halogeno CI—C6 alkyl group, phenyl group And a phenyl group, a halogen atom or a hydrogen atom substituted with 1 to 3 groups selected from the group consisting of a benzyloxy group
  • the elucidation of the phosphorylation mechanism of these compounds includes the search for compounds that show activity by being phosphorylated in vivo, the elucidation of the mechanism of activity expression, and the sensitivity to drugs. This was considered effective in selecting patients with sex.
  • Human fructosamine 1-kinase-related protein (hereinafter, also referred to as “human FN3KRPJ”) has been reported to have an activity to phosphorylate the 3-position of ketosamine such as librosamine and psychosamine. (Diabetes, (2003), 52, p.2888-2895), but its role in vivo is unknown.
  • the present inventor has conducted extensive studies to elucidate the phosphorylation mechanism in vivo, and is also referred to as human FN3KRP or fructosamine-3-kinase (hereinafter referred to as “human FN3K”).
  • human FN3K fructosamine-3-kinase
  • the present invention was completed by finding that a protein called) is involved in phosphorylation of the compound represented by the general formula (I).
  • One subject of the present invention is that, for example, (2R) -2 amino-2 methyl-4 [5- (5 phenylpentanoinole) thiophene 2-yl] butane 1 ol, It is to clarify the enzyme that phosphorylates the compound represented by I) in vivo. Furthermore, one object of the present invention is to provide a method for phosphorylating the compound using an enzyme that phosphorylates the compound. Furthermore, one object of the present invention is to provide a method for screening a compound that is phosphorylated by the enzyme. Furthermore, one subject of the present invention is to provide a method for determining the phosphorylation ability of a test compound in a subject.
  • the present invention provides:
  • a screening method for a substance phosphorylated by human FN3KRP and / or human FN3K including the following steps 1) to 3):
  • c) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide selected from a) or b) above, and (2R) -2-amino-2 methyl 4 [5-(5 phenylpentanoinole) thiophene 2-inole] polypeptide having the ability to phosphorylate butan-1ol;
  • a screening method for a substance phosphorylated by human FN3KRP and / or human FN3K including the following steps 1) to 4):
  • polypeptide selected from the group consisting of: a) a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 309 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
  • c) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide selected from a) or b) above, and (2R) -2-amino-2 methyl 4 [5-(5 phenylpentanoinole) thiophene 2-inole] polypeptide having the ability to phosphorylate butan-1ol;
  • the amount of phosphate ester measured in 2) above is higher than the amount of phosphate ester measured when the test substance is not contacted with the polypeptide selected from a) to c) above. Determining that the test substance is phosphorylated in some cases.
  • a screening method for a substance having immunosuppressive activity comprising the following steps 1) to 3)
  • c) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide selected from a) or b) above, and (2R) -2-amino-2 methyl 4 [5-(5 phenylpentanoinole) thiophene 2-inole] polypeptide having the ability to phosphorylate butan-1ol;
  • a screening method for a substance having immunosuppressive activity comprising the following steps 1) to 4)
  • c) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide selected from a) or b) above, and (2R) -2-amino-2 methyl 4 [5-(5 phenylpentanoinole) thiophene 2-inole] polypeptide having the ability to phosphorylate butan-1ol;
  • the amount of phosphate ester measured in 2) above is higher than the amount of phosphate ester measured when the test substance is not contacted with the polypeptide selected from a) to c) above.
  • the test substance has the following general formula (I) (wherein R 1 and R 2 are hydrogen atoms.
  • R 3 is a C1-C6 alkyl group or a hydroxymethyl group.
  • R 4 is hydrogen.
  • R 5 is a hydrogen atom, a halogen atom, a cyano group, a C1—C6 alkyl group, a CI—C6 alkoxy group, a C3—C6 cycloalkyl group, a halogeno CI— A phenyl group, a halogen atom or a hydrogen atom substituted with 1 to 3 groups selected from the group consisting of a C6 alkyl group, a phenyl group and a benzyloxy group, and
  • Y is a single bond, an oxygen atom, a sulfur atom or a carbony
  • c) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide selected from a) or b) above, and (2R) -2-amino-2 methyl 4 [5-(5 phenylpentanoinole) thiophene 2-inole] polypeptide having the ability to phosphorylate butan-1ol;
  • a method for determining the ability of a compound having the general formula (I) to produce a phosphate ester comprising the following steps 1) to 3):
  • a method for determining the ability of a compound having the general formula (I) to produce a phosphate ester comprising the following steps 1) and 2):
  • c) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide selected from a) or b) above, and (2R) -2-amino-2 methyl 4 [5-(5 phenylpentanoinole) thiophene 2-inole] polypeptide having the ability to phosphorylate butan-1ol;
  • c) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide selected from a) or b) above, and (2R) -2-amino-2 methyl 4 [5-(5 phenylpentanoinole) thiophene 2-inole] polypeptide having the ability to phosphorylate butan-1ol;
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 1466 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • a subject having a nucleotide sequence mutation that decreases the phosphorylation activity of the polypeptide encoded by the polynucleotide is determined to have a low phosphorylation ability of the compound having the general formula (I), and No nucleotide sequence mutations that reduce oxidative activity!
  • the examiner determines that the compound having the general formula ((II)) has the ability to oxidize phosphorylation.
  • the specimen is characterized by the fact that it is terminal peripheral blood, ((77)) ⁇ to solstice ((11 11) ), The method of the method described in item 11,
  • At least 11 or more must be selected from the group consisting of Included drugs Drug metabolite metabolism tolerance Diagnostic kit for diagnostic diagnosis
  • c) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide selected from a) or b) above, and (2R) -2-amino-2 methyl 4 [5-(5 phenylpentanoinole) thiophene 2-inole] polypeptide having the ability to phosphorylate butan-1ol;
  • human fructosamine-3-kinase-related protein hereinafter also referred to as “human FN3KRP”
  • human fructosamine-3-kinase human fructosamine-3 kinase-A method for phosphorylating the compound using kinase, hereinafter referred to as “human FN3K”
  • a method for screening a compound phosphorylated by the enzyme can be provided.
  • a method for determining the phosphorylation ability of a test compound of a subject could be provided.
  • RNA fraction refers to a fraction containing RNA.
  • cell refers to an individual animal. It includes cells and cultured cells.
  • total RNA fraction refers to a fraction containing total RNA, which is extracted from blood, various organs, various tissues, cultured cells, etc.
  • Hybridize under stringent conditions means to hybridize at 68 ° C in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech) or to use a filter on which DNA is fixed. After hybridization at 68 ° C in the presence of 0.7-1.0 M NaC 1, 0.1-2 fold SSC solution (1 fold concentration SSC consists of 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate) Hybridization under conditions that can be identified by washing at 68 ° C or equivalent conditions.
  • human fructosamine-3-kinase (human FN3K) and human fructosamine-3-kinase-related protein (human FN3KRP) used in the present invention are the full-length proteins.
  • a partial peptide having a partial sequence thereof may be used.
  • it may be a natural protein obtained from a human-derived cell, or a protein obtained from a cell that has been genetically modified to express the protein by a gene cloned by PCR or the like. These proteins may be partially purified in addition to purified ones.
  • nucleotide sequence of cDNA of human FN3K is shown, for example, in nucleotide numbers 1 to 1466 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of human FN3K is represented by amino acid numbers 1 to 309 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, for example.
  • Nucleotide sequence of human FN3K cDNA is registered in GenBank with accession number: NM-0222158! / ⁇
  • the nucleotide sequence of human FN3KRP cDNA is, for example, represented by nucleotide numbers 1 to 1781 in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of human FN3KRP is shown, for example, in amino acid numbers 1 to 309 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • human FN3K gene refers to a gene consisting of nucleotide numbers 6 to 935 of SEQ ID NO: 1 in the nucleotide sequence power sequence table, or a nucleotide complementary to the gene consisting of the nucleotide sequence.
  • a gene comprising a nucleotide sequence that hybridizes with a polynucleotide comprising a sequence under stringent conditions and encodes a protein having the same biological activity as human FN3K.
  • human FN3K refers to a protein whose amino acid sequence consists of the amino acid sequences represented by amino acid numbers 1 to 309 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or the amino acid of the protein.
  • human FN3KRP gene means that a nucleotide sequence IJ is complementary to a gene consisting of nucleotide numbers 27 to 956 of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, or a gene consisting of the nucleotide sequence IJ.
  • a gene comprising a nucleotide sequence that hybridizes with a polynucleotide comprising a typical nucleotide sequence under stringent conditions and encodes a protein having the same biological activity as human FN3KRP.
  • human FN3KR P refers to a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 309 of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, or an amino acid sequence of the protein, A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and having the same biological activity as human FN3K RP.
  • Human FN3K, human FN3KRP, and fusion proteins obtained by adding other amino acid sequences to the partial peptide are also included in human FN3K, human FN3KRP, and partial peptides thereof.
  • the fusion protein include, but are not limited to, a histidine tag fusion protein, a FLAG fusion protein, and a fluorescent dye fusion protein such as GFP.
  • human FN3K and / or human FN3KRP The enzyme activity of human FN3K and / or human FN3KRP is measured by incubating human FN3K and / or human FN3K RP, a substance serving as a substrate, with an appropriate buffer, and quantifying the phosphorylated compound as a product. I can do it.
  • human FN3K and / or human FN3KRP is (2R) -2-amino-1, 2-methylolone 4- [5- (5-phenylpentanol) Enzyme activity can be measured by incubating with thiophene-2-yl] butane 1ol and quantifying the resulting phosphate ester by HPLC.
  • a commercially available human FN3K cDNA can be used, for example, available from GeneCopoeia (Catalog No. GC_W1392).
  • human FN3K cDNA can be obtained as follows using a cDNA library containing human FN3K gene.
  • a full-length cDNA is obtained from a cDNA library expressing the human FN3K gene according to a known method such as a colony hybridization method. Using this full-length cDNA as a template, human FN3K cDNA is obtained using PCR.
  • a human bone marrow-derived cDNA library can be used.
  • a commercially available human cDNA library for example, Clonetech's Creator SMART Human cDNA Library can be used, or a cDNA library can be prepared by itself.
  • an appropriate primer can be selected by a known method as long as human FN3K cDNA can be amplified.
  • a PCR primer for amplifying human FN3K cDNA for example, an oligonucleotide having the following nucleotide sequence can be selected.
  • a full-length cDNA is obtained from a cDNA library expressing the human FN3KRP gene according to a known method such as a colony hybridization method.
  • Human FN3KRP cDNA can be obtained by PCR using this full-length cDNA as a saddle.
  • a cDNA library derived from human bone marrow can be used as the cDNA library.
  • Commercially available human cDNA For example, Clonetech's Creator SMART Human cDNA Libraries can be used as the library, or a cDNA library can be prepared by itself.
  • a human FN3KRP cDNA is obtained by performing direct PCR using a cDNA library as a saddle type.
  • an appropriate primer can be selected by a known method as long as human FN3KRP cDNA can be amplified.
  • an oligonucleotide having the following nucleotide sequence can be selected.
  • nucleotide sequence alterations include, for example, deletion introduction using restriction enzymes or DNA exonucleases, mutation introduction using site-directed mutagenesis, modification of nucleotide sequences using PCR with mutation primers, and synthetic mutation DNA. It can be performed by a method such as direct introduction.
  • Human FN3K and human FN3KRP can be produced by in vitro synthesis or production in a host cell by genetic manipulation. Specifically, human FN 3K gene and / or human FN3KRP gene is incorporated into an expressible vector and then synthesized in a solution containing enzymes, substrates and energy substances necessary for transcription and translation, or other Human FN3K and / or human FN3KRP can be obtained by expressing human FN3K and / or human FN3KRP by transforming prokaryotic or eukaryotic host cells.
  • prokaryotic host cells examples include Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • the host cells are transformed with a plasmid vector containing a rebricon derived from a species compatible with the host, ie, an origin of replication, and regulatory sequences.
  • a vector having a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to transformed cells is preferred.
  • K12 strain, DH5a strain, etc. are often used as E. coli, and plasmids such as PBR322, pUC, pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) are generally used as vectors.
  • plasmids such as PBR322, pUC, pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) are generally used as vectors.
  • PBR322 plasmids
  • pUC plasmids
  • pcDNA3.1 (+) Invitrogen
  • Bacillus subtilis for example, pTUB228 (Ohm ura,. Et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) is used as a preferred vector. It is not limited. By ligating the DNA sequence encoding the signal peptide sequence of ⁇ -amylase of Bacillus subtilis, secretory expression outside the cell is also possible.
  • Examples of eukaryotic host cells include vertebrates, insects, and yeast cells.
  • Examples of vertebrate cells include monkey cells such as COS cells (Gluzman, ⁇ . (1981) Cell 23 175-182, ATCC: CRL-1650) and Chinese'no, Muster ovary cells (CHO cells, A TCC: CCL-61) dihydrofolate reductase deficient strains (Urlaub, G. and Chasin, A. ( 1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) are often used, but are not limited thereto.
  • HEK293 cells As host cells, for example, p cDNA3.2-DEST (Invitrogen) can be used.
  • the transformant obtained as described above can be cultured according to a conventional method, and the desired polypeptide is produced intracellularly or extracellularly by the culture.
  • the medium used for the culture various commonly used media can be appropriately selected depending on the host cells employed.
  • the HEK293 cells described above can be used as a medium such as RPMI1640 medium or Dulbecco's modified Eagle medium. If necessary, those supplemented with serum components such as rabbit fetal serum can be used.
  • Recombinant protein produced inside or outside of the transformant by the above culture is separated by various known separation methods utilizing the physical and chemical properties of the protein.
  • Specific examples of the method include treatment with an ordinary protein precipitating agent, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity mouth matography, high performance liquid Examples include various liquid chromatography such as chromatography (HPLC), dialysis, and combinations thereof.
  • HPLC chromatography
  • the polypeptide of the present invention can be easily produced in large quantities with high yield and high purity.
  • the molecular weight of the purified polypeptide can be determined by a usual method such as mass spectrometry or SDS-PAGE.
  • Enzyme activity can be used as an index in the purification of human FN3K and / or human FN3KRP.
  • the compound that can be used as a substrate for human FN3K and / or human FN3KRP in the present invention is not particularly limited as long as it is phosphorylated by human FN3K and / or human FN3KRP.
  • the amino alcohol derivatives having the above general formula (I) include, for example, International Publication No. 94/08943 pamphlet (FTY720), International Publication No. 96/06068 pamphlet (FTY-like compound), International Publication No. Pamphlet No. 98/45249 (FTY analog), WO03 / 029184 pamphlet (ROX-2127: KRP-203 analog), International Publication No. 03/029205 Pamphlet (KRP-203), International Publication No.
  • R 1 and R 2 are preferably a hydrogen atom.
  • R 3 is preferably a C1 C6 alkyl group or a hydroxymethyl group, and more preferably a methyl group or a hydroxymethyl group.
  • R 4 is preferably a hydrogen atom, a halogen atom or a C1 C6 alkyl group, more preferably a hydrogen atom, a chlorine atom or a methyl group, and even more preferably a hydrogen atom or a methyl group. Is a chlorine atom.
  • R 5 is, for example, from a hydrogen atom, a halogen atom, a cyano group, a C1 C6 anolenoquine group, a C1 -C6 alkoxy group, a C3-C6 cycloalkyl group, a halogeno C1-C6 alkyl group, a phenyl group, and a benzyloxy group.
  • Y is preferably a single bond, an oxygen atom, a sulfur atom or a carbonyl group, and more preferably a single bond, an oxygen atom or a carbonyl group.
  • Z is preferably a single bond or a C1 C8 alkylene group, and more preferably a single bond, trimethylene, tetramethylene or otatamethylene.
  • n is preferably 2 or 3, and more preferably 2.
  • compounds suitable as an amino alcohol derivative having the general formula (I) are:
  • Piro-inole-2 Inole ⁇ butane-one-all,
  • R 2 “C 1 -C 6 alkyl group” in the definition of R 4 and IT means, for example, a methylol group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, a 2 methylpropyl group, a 3 methylpropyl group, 2, 2, It may be a 2-trimethylmethyl group, a pentyl group or a hexyl group, preferably a methyl group, an ethyl group or a propyl group, and more preferably a methyl group or an ethyl group.
  • halogen atom in the definitions of R 4 and R 5 is a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom, preferably a fluorine atom or a chlorine atom.
  • the "C1-C6 alkoxy group" in the definition of R 4 and R 5 is, for example, a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, an isopropoxy group, a butoxy group, a 2 methylpropoxy group, a 3 methylpropoxy group, 2, 2, 2-trimethylmethoxy group, pentyloxy group or hexyloxy group, preferably methoxy group or ethoxy group.
  • C3-C6 cycloalkyl group in the definition of R 5 can be, for example, a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, or a cyclohexyl group, and preferably a cyclopropyl group or A cyclohexyl group;
  • halogeno C1-C6 alkyl group means the above C1-C6 alkyl.
  • fluorobutyl group fluorobutyl group, difluorobutyl group, trifluorobutyl group, fluoropentyl group, difluoropentyl group, trifluoropentyl group, fluoro-hexyl group, difluoro-hexoxy group, trifluoro-hexyl group, pentafluoro group Loetyl group, Hexafluoropropyl group, Nonafluorobutyl group, Chloromethyl group, Dichloromethyl group, Trichloromethyl group, Chloroethylinole group, Dichloroethinole group, Trichloroethinole group, Cloropropynole group, Dichloropropinole group, Chloropropyl, Chlorobutyl, Dichlorobutyl, Trichlorobutyl, Chloropentinore, Dichloropentinole, Trichloropentinole, Chlorohexino
  • the "C1 C8 alkylene group" in the definition of Z may be, for example, a methylene group, an ethylene group, a propylene group, a tetramethylene group, a pentamethylene group, a hexamethylene group, a heptamethylene group, or an otatamethylene group,
  • An alkylene group having 2 to 8 carbon atoms is preferable, and an ethylene group, a propylene group, a tetramethylene group, a heptamethylene group, or an otatamethylene group is more preferable.
  • the "C1-C8 alkylene group substituted with 2 to 8 fluorine atoms" in the definition of Z is, for example, a difluoromethylene group, a 1,1-difluoroethylene group, 1, 1, 2,2-tetrafluoroethylene group, 1,1-difluoropropylene group, 1,1,2,2-tetrafluoropropylene group, 1,1-difluorotetramethylene group, 1,1,2, It can be a 2-tetrafluorotetramethylene group, a 1,1-difluoropentamethylene group or a 1,1,2,2-tetrafluoropentamethylene group, preferably a 1,1-difluoropentamethylene group Lopropylene group, 1,1,2,2,2-tetrafluoropropylene group, 1,1-difluorotetramethylene group, 1,1,2,2-tetrafluorotetramethylene group, 1,1-difluoro Pentamethylene group or 1,1,2,2-tetrafluor
  • the salt in the above is a salt obtained by reacting with an acid because it has an amino group as a basic group having an amino alcohol derivative having the general formula (I).
  • Hydrohalates such as acid salts, hydrochlorides, hydrobromides, hydroiodides, inorganic acid salts such as nitrates, perchlorates, sulfates, phosphates; methanesulfonates, Lower alkane sulfonates such as trifluoromethane sulfonate, ethane sulfonate, aryl sulfonates such as benzene sulfonate, p-toluene sulfonate, acetate, malate, fumarate
  • Organic acid salts such as succinate, succinate, ascorbate, tartrate, oxalate, maleate; or glycine salt, lysine salt, arginine salt, ornithine salt, gluta
  • the amino alcohol derivative having the general formula (I) and the pharmacologically acceptable salt thereof in the present invention have an asymmetric carbon atom in the molecule
  • optical isomers exist.
  • the compound having an asymmetric carbon atom has a single formula, that is, the force shown in the R form. The case where it mixes is considered. Therefore, in such a case, the amino alcohol derivative having the general formula (I) has an optical isomer as a mixture mainly containing the R isomer and a mixture containing the S isomer in part. Is included.
  • the amino alcohol derivative having the general formula (I) and a pharmacologically acceptable salt thereof can be left in the air or recrystallized to absorb moisture and be adsorbed water.
  • the hydrate is also included in the pharmacologically acceptable salt of the amino alcohol derivative having the general formula (I) of the present invention.
  • a compound having the following general formula (II) can be produced from the compound having the above general formula (I) using human FN3KRP and / or human FN3K. [0073] [Chemical 10]
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , X, Y and Z are the same as in the above compound (I).
  • the compound represented by the general formula (II) is also referred to as “compound (II)”.
  • compound (II) which is a phosphate ester of the above compound.
  • Human FN3KRP and / or human FN3K that can be used for the production of compound (II) can be those obtained from erythrocytes by the method described in the above section “4”, and human FN3KRP and / or human FN3K can be used. Those obtained from expressing cells can also be used. Human FN3K and / or human FN3KRP can be used in a purified form, or can be used as a crude product or a cell extract as it is. In addition, cells expressing human FN3KRP and / or human FN3K can be used as they are.
  • the production method of the present invention can be carried out in various modes. For example, (a) contacting compound (I) with cells expressing human FN3K and / or human FN3KRP, (b) contacting compound (I) with an extract from cells expressing human FN3K and / or human FN3KRP (C) purified or roughly purified human FN3K and / or human FN3KRP and compound (I) are brought into contact with each other.
  • the amount of the compound (II) that is the enzymatic reaction product is measured for the enzymatic reaction product Analyzing power by doing s.
  • the amount of compound (II) produced is not particularly limited as long as the production of compound (II) can be measured. For example, it is measured by subjecting the reaction product to HPLC and measuring the peak of compound (II). can do.
  • Compound (II), which is an enzyme reaction product, can be purified from the reaction system.
  • the following method can be used to identify substances that are phosphorylated by human FN3KRP or human FN3K.
  • the method includes the following steps.
  • iii) A step of comparing the amount of phosphate ester of the test substance measured when the test substance is not brought into contact with human FN3KRP or human FN3K with the amount of phosphate ester produced measured in ii) above.
  • iii) A step of comparing the amount of phosphate ester of the test substance measured when the test substance is not brought into contact with human FN3KRP or human FN3K with the amount of phosphate ester produced measured in ii) above.
  • the amount of phosphate ester measured in ii) above is higher than the amount of phosphate ester measured when the test substance is not contacted with human FN3KRP or human FN3K! Determining that is phosphorylated.
  • human FN3KRP or human FN3K used in this step, but human FN3 Cells expressing KRP or human FN3K can be used as they are, or a disruption solution of these cells, human FN3KRP or human FN3K roughly purified from these cells, or purified human FN3KRP or human FN3K can be used. I can do it. In addition, those obtained by the method described in the section “4. Expression of human FN3K and human FN3KRP” can also be used.
  • test substance the substance described in the section "5.
  • Compound that is phosphorylated by phosphorylase can be used, and other compounds can also be used.
  • other compounds include compounds other than the compound having the general formula (I), metabolites of microorganisms, extracts of plants and animal tissues, derivatives thereof or mixtures thereof.
  • the dose and concentration of the test substance can be set as appropriate, or can be administered in an appropriate state such as an individual or a liquid that can be set in multiple doses, for example by creating a dilution series. Alternatively, it may be dissolved in an appropriate buffer or a stabilizer may be added. In the case of a screening method using cultured cells, it can be added to a medium and cultured.
  • the medium When added to the medium, it may be added from the beginning of the culture or may be added during the culture. The number of additions is not limited to one.
  • the culture period in the presence of the test substance may be set as appropriate, but is preferably 30 minutes to 48 hours.
  • the administration form such as oral administration, intravenous injection, intraperitoneal injection, transdermal administration and subcutaneous injection is properly used depending on the physical properties of the test substance.
  • the time from administration to obtaining a sample can be appropriately selected.
  • a buffer solution for pH adjustment may be added to the reaction solution as necessary.
  • Reaction time 30 seconds to 24 hours, preferably 3 hours
  • the reaction can be performed using, for example, a 384-well assembly plate.
  • An example of a method for measuring the amount of the phosphate of the test substance is a method of separating and quantifying the product using HPLC. Examples of such a method include the following methods, but are not limited to this method.
  • the amount of the phosphate of the test substance measured when the test substance is not contacted with human FN3KRP or human FN3K can be measured by the same method as described in 1) ii) above. Then, it is possible to compare the amount of phosphate ester produced by the test substance when it is contacted with human FN3KRP or human FN3K and when it is not contacted.
  • Human FN3KRP and / or human FN3K has a function of phosphorylating a compound having the general formula (I) into a phosphate ester having the general formula ( ⁇ ) in vivo.
  • Human FN3K and / or human FN3KRP has the ability to phosphorylate compounds having activity by being phosphorylated in vivo. Therefore, the subject's ability to metabolize drugs can be examined by using the following kit.
  • the kit is specifically as follows:
  • a kit for diagnosing drug metabolic capacity comprising at least one selected from the group consisting of 1) to 5) below:
  • a continuous oligonucleotide primer having a length of 15 to 30 bases for specifically amplifying a part or all of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3 in the sequence listing;
  • c) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide selected from a) or b) above, and (2R) -2-amino-2 methyl 4 [5-(5 phenylpentanoinole) thiophene 2-inole] polypeptide having the ability to phosphorylate butan-1ol;
  • FIG. 1 Phosphorylation of compound 1 by each component in human blood
  • compound 1 2-amino-2-methyl—4 -— [5- (5-phenylpentanoyl) thiophene 2-yl] butane 1 ol (hereinafter referred to as “compound 1”) represented by the formula (I) used in the following experiment
  • peripheral blood Approximately 1 lOOmL of peripheral blood is collected from two anonymized blood donors, and 3.2% (w / v) trisodium citrate dihydrate solution as an anticoagulant is approximately l lmL per lOOmL of human peripheral blood. It was added to obtain human whole blood, and fractionated from whole blood into red blood cell, plasma, platelet and lymphocyte fractions according to a conventional method.
  • the phosphorylation activity for compound 1 was measured for the various components obtained in Example 1.
  • Compound 1 is used as the reaction substrate, and phosphoric acid mono- (2R) -2 amino-2 methylolene 4 [5- (5 phenylpentanoinole) thiophene 2-yl, which is the phosphate ester of compound 1, the reaction product
  • the phosphorylation activity was measured by quantifying the amount of butyl ester (phosphate ester of Compound 1) produced.
  • 250 L was dispensed in the case of mixing two types, 166.7 HL each in the case of mixing three types, 125 HL in the case of four types of mixing, and the total amount dispensed was 500 ⁇ .
  • the amount of phosphoric acid mono (2R) -2 amino-2 methyl-4 [5- (5 phenylpentanoinole) thiophene 2-yl] butyl esterol (compound 1 phosphate ester) produced as the reaction product is as follows. And measured under the conditions.
  • Retention time 6.7 min (phosphate of compound 1), 11.1 min (compound 1), 14.2 min (1 naphthol, internal standard) 10 H gZmL of 1-naphthol in the tube after the reaction is complete / Methanol solution was added to a final concentration of 2.5 g / mL, mixed, and centrifuged at 21, 600 X g for 3 minutes at 4 ° C. 30 L of the supernatant was loaded onto the HPLC apparatus, and the AUC value of the peak appearing at each holding time was measured. The AUC value of the compound was corrected with the AUC value of 1-naphthol, which is an internal standard substance, and the concentration of the compound was obtained by applying a calibration curve prepared separately.
  • a soluble fraction and a membrane fraction were fractionated from erythrocytes according to a conventional method.
  • the phosphorylation reaction of Compound 1 was examined in the same manner as in Example 2. As shown in FIG. 2, the soluble fraction of erythrocytes was It was revealed that the enzyme phosphorylating Compound 1 is mainly present in the soluble fraction of erythrocytes.
  • Example 4 Purification of enzyme that phosphorylates compound 1 from human erythrocyte soluble fraction (1)
  • the enzyme that phosphorylates compound 1 from the soluble fraction of human erythrocyte was purified by the following method.
  • a total of 500 mL of blood was collected from 5 anonymized volunteers, and a total of 500 mL of blood was collected. From the erythrocyte soluble fraction prepared according to a conventional method, ammonium sulfate salting out and hydrophobic interaction were performed using the phosphorylation activity of Compound 1 as an indicator.
  • Example 4 The active fraction obtained in Example 4 was subjected to SDS-PAGE, each band on the SDS-PAGE gel was excised from the gel, and trypsin (modified trypsin, Promega) was added according to a conventional method at 37 ° C. The digestion reaction was performed for 12 hours. The produced digested peptide was subjected to liquid chromatography (LC) / tandem mass spectrometer (MS / MS). The obtained mass spectrum data was solved by database search software (Mascot, Matrix Science). The database used was the GenBank nr database compiled by the National Center for Biotechnology Information.
  • Example 6 Purification of enzyme that phosphorylates compound 1 from human erythrocyte soluble fraction (2) Competitive inhibition of human FN3K to confirm that human FN3K is an enzyme that phosphorylates compound 1 Inhibition experiments were conducted using DMF (Biochem. J. (2000) vol. 352, ⁇ ⁇ 835-839), which is known as an agent. The active fraction of the hydrophobic interaction column in the second purification stage in Example 4 was significantly inhibited by DMF, and its IC value was about 1 ⁇ ⁇ . This
  • human FN3K is an enzyme that phosphorylates Compound 1.
  • almost no inhibition by DMF was observed in the sample obtained by resolubilizing the soluble fraction and the first purification stage ammonium sulfate precipitate, and the presence of an enzyme that phosphorylates Compound 1 different from human FN3K was also observed. It was strongly suggested. Considering the degree of DMF inhibition, this enzyme was estimated to be the main enzyme that phosphorylates compound 1 which is different from human FN3K. Therefore, this enzyme was purified.
  • the ammonium sulfate precipitate obtained in Example 4 was subjected to an anion exchange column (HiPrep Q 16/10 XL, GE Healthcare Bioscience), a dye-binding affinity column (HiTrap Blue HP lmL), and a cation exchange column. (Mono S PC 1.6 / 5) and fractionated by gel filtration column (Superde x 75 PC 3.2 / 30).
  • the purified active fraction was subjected to SDS-PAGE, and the band around 33 kDa was subjected to mass spectrometry to identify the protein in this band. As a result, it was confirmed that all bands were identical to the human eye [ ⁇ hypothetical fructosamine Kinase-like protein (registered in Accession No. Q9HA64 in the protein database of FN dKRP ⁇ GenBank). It was.
  • the molecular weight predicted from the sequence of human FN3KRP was 35 kDa, which was consistent with the molecular weight estimated by SDS-PAGE (33 kDa) and the molecular weight estimated by gel filtration (24-38 kDa).
  • a cDNA clone (clone ID: 3351601) purchased from Invitrogen was treated with restriction enzymes Xhol and EcoRI to extract cDNA, and a plasmid vector treated with Xhol and EcoRI, pcDNA3.1 (+) neo (Invitrogen) Company). Escherichia coli DH5a was transformed with the plasmid, which was the binding reaction product. The obtained transformant was mass-cultured to obtain an expression plasmid vector containing human FN3KRP cDNA, hFN3KRP / pcDNA3.1 (+) neo.
  • cDNA was transferred from human FN3K cDNA clone (Catalog No. GC-W1392) purchased from GeneCopoeia to the expression plasmid vector for mammalian cells, pcDNA3.2-DEST. . Escherichia coli DH5a was transformed with the DNA solution after the reaction. The obtained transformant was mass-cultured to obtain an expression plasmid vector, hFN3K / pcDNA3.2-DEST, containing human FN3K cDNA.
  • Sphingosine kinases 1 and 2 are known to phosphorylate force S, FTY720, an enzyme that converts sphingosine to sphingosine 1 phosphate (S 1P) in vivo to produce FTY720 phosphate ester.
  • S 1P sphingosine 1 phosphate
  • HPLC name Agilent 1100 series (Agilent Technologies) Autosampler name: HTC PAL (CTC Analytics)
  • Example 13 Compound 1 and Analogues of Compound 1 by Human FN3KRP Expressing Cytoplasmic Fraction Phosphorylation reaction
  • Example 10 Using the human FN3KRP-expressing cytoplasmic fraction prepared in Example 10, the following compounds were phosphorylated.
  • Reaction solution lOOmM HEPES, ⁇ 7.4, 5mM magnesium chloride, 5mM ATP, ImM dithiothreate mononole, 0.5% CHAPS, 0.38mg / mL human FN3K RP-expressing cytoplasmic fraction
  • HPLC system HP1100 (Agilent Technologies)
  • Elution method Perform gradient elution. The initial acetonitrile concentration and gradient were varied depending on the compound. A typical method is
  • the phosphorylation efficiency of each compound was calculated using the phosphate ester and the peak area of the unreacted substrate as shown in the following formula.
  • human FN3KRP is an enzyme that phosphorylates various compounds (Table 3).
  • Example 14 Phosphorylation of Compound 1 and Analogs of Compound 1 by Human FN3K Expressing Cytoplasmic Fraction Using the human FN3K-expressing cytoplasmic fraction prepared in Example 10, the same phosphorylation reaction of Compound 1 and Compound 1 as in Example 13 was performed under the conditions shown below.
  • human FN3K is an enzyme that phosphorylates Compound 1 and its analogs (Table 4).
  • Red blood cells were prepared from Wistar- Imamichi rats (purchased from the Institute for Animal Breeding) in the same manner as in Example 1, and phosphorylation of the same compound 1 and compound 1 as in Example 13 was carried out under the conditions shown below. went.
  • Example 13 After completion of the reaction, 1 mL of methanol was added and stirred, followed by centrifugation (16, OOO X g, 5 minutes, 4 ° C). The supernatant was centrifuged again (16, OOO X g, 10 minutes, 4 ° C.), and the newly obtained supernatant was subjected to HPLC and analyzed under the conditions shown in Example 13. For each analog The oxidation efficiency was calculated using the formula shown in Example 13.
  • human FN3K RP and human FN3K exist in human erythrocytes, and that they are compound 1, an analog of compound 1, and FTY720. It was shown to be an enzyme that phosphorylates.
  • a compound such as (2R) -2-amino-1, 2-methyl-1, 4- [5- (5-phenylpentanol) thiophene 2-yl] butane-1, 1ol
  • a screening method for a substance phosphorylated by the enzyme could be provided.

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Description

明 細 書
薬物リン酸化酵素
技術分野
[0001] 本発明は、生体内で薬物をリン酸化する酵素に関する。更に、本発明は、上記酵 素を用いた化合物のリン酸化方法、該酵素によってリン酸化される化合物のスクリー ユング方法、及び被験者の被験化合物のリン酸化能を判定する方法等に関する。 背景技術
[0002] 医薬品の中には、患者に投与する段階では実際の薬効を有する化合物とは構造 を異にし、患者に投与すると生体内で代謝され構造が変化し、その薬効を発揮する ものがある。このような生体内で代謝される前の化合物はプロドラッグと呼ばれ、プロ ドラッグを薬効を示す化合物に代謝する酵素についても種々のものが知られている。
[0003] ァミノアルコール誘導体の中には生体内でリン酸化されることによって免疫抑制活 十生を示すものがある。例えば、 FTY720 (2-Amino-2-[2-(4-octylphenyl)ethyl]propane -1,3-diol hydrochloride)は、生体内でスフインゴシンキナーゼ 1及び 2によってリン酸 ィ匕を受 " 、 Γ 20-phosphate u.e.,、：ノ 2_ammo_ 2 phosphoryloxymethyl_4_(4_oct ylphenyDbutanol]，になり、免疫抑制作用を示すと考えられている（The Journal of Biol ogical Chemistry, (2003)， 278， ρ·47408— 47415)。
[0004] 一方、一般式（I) (式中、 R1及び R2は、水素原子である。 は、 CI— C6アルキル 基又はヒドロキシメチル基である。 R4は、水素原子、ハロゲン原子又は C1— C6アル キル基である。 R5は、水素原子、ハロゲン原子、シァノ基、 C1 C6ァノレキノレ基、 C1 —C6アルコキシ基、 C3— C6シクロアルキル基、ハロゲノ CI— C6アルキル基、フエ ニル基及びべンジルォキシ基からなる群より選択される基で 1乃至 3個置換されたフ ェニル基、ハロゲン原子又は水素原子であり、 Xは、ビニレン基（CH = CH基）、酸素 原子、硫黄原子又はメチルァミノ基である。 Yは、単結合、酸素原子、硫黄原子又は カルボニル基である。 Zは、単結合又は C1— C8アルキレン基である。 nは、 2又は 3 である。）で表される化合物についても生体内でリン酸化されることによって活性体に 変化し、免疫抑制活性を示すと考えられているが（日本国特許公開公報:特開 2005- 46141号公報）、生体内におけるリン酸化機構は不明であった。
[0005] これらの化合物のリン酸化機構を解明することは、生体内でリン酸化されることによ つて活性を示す化合物の探索や、活性発現の機構の解明、更には薬剤に対して感 受性を有する患者の選択等に有効であると考えられた。
[0006] [化 1]
Figure imgf000003_0001
[0007] ヒト フノレクトサミン一 3—キナーゼ関連タンパク質（human fructosamine_3_kinase-rel ated protein :以下、「ヒト FN3KRPJともいう。）はリブロサミンやサイコサミンのようなケ トサミンの 3位をリン酸化する活性を持つことが報告されている（Diabetes, (2003)， 52， p.2888— 2895)が、生体内における役割は不明であった。
[0008] 本発明者は、生体内におけるリン酸化機構を解明するために鋭意研究をしたところ 、ヒト FN3KRP又はフルクトサミン一 3—キナーゼ（human fructosamine - 3 - kinase、 以下、「ヒト FN3K」ともいう。）と呼ばれているタンパク質が上記一般式 (I)で示される 化合物のリン酸化に関与していることを見出し、本発明を完成させた。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の 1つの課題は、例えば、（2R)— 2 アミノー 2 メチルー 4 [5—（5 フ ェニルペンタノィノレ）チォフェン 2—ィル]ブタン 1 オールのような、上記一般式 (I)で示される化合物を生体内でリン酸化する酵素を明らかにすることである。更に、 本発明の 1つの課題は、上記化合物をリン酸化する酵素を用いた該化合物のリン酸 化方法を提供することである。更に本発明の 1つの課題は該酵素によってリン酸化さ れる化合物をスクリーニングする方法を提供することである。更に本発明の 1つの課 題は、被験者の被験化合物のリン酸化能を判定する方法を提供すること等である。 課題を解決するための手段 [0010] 本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を行ったところ、 (2R) - 2 - アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのような、上記一般式 Iで示される化合物をリン酸化する酵素がフルク トサミン一 3—キナーゼ関運タンノ ク質 (fructosamine— 3— kinase— related protein :以下 、「FN3KRP」ともいう。）及び/又はフルクトサミンー3—キナーゼ（fructosamine— 3 -kinase,以下、「FN3K」ともいう。）と呼ばれるタンパク質であることを見出し本発明 を完成させた。
[0011] すなわち、本発明は、
(1)下記の工程 1)乃至 3)を含む、ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kによってリン 酸化される物質のスクリーニング方法：
1)以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリペプチドと被験物質を接触させるェ 程；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2)被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
3)被験物質を上記 a)乃至 c)から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定 された、被験物質のリン酸エステルの量と上記 2)で測定されたリン酸エステルの生成 量を比較する工程、
(2)下記の工程 1)乃至 4)を含む、ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kによってリン 酸化される物質のスクリーニング方法：
1)以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリペプチドと被験物質を接触させる 工程； a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2)被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
3)被験物質を上記 a)乃至 c)から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定 された、被験物質のリン酸エステルの量と上記 2)で測定されたリン酸エステルの生成 量を比較する工程；
4)被験物質を上記 a)乃至 c)から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定 された、リン酸エステルの量と比較して、上記 2)で測定されたリン酸エステルの量が 多い場合に被験物質がリン酸化されたと判定する工程。
(3)下記の工程 1)乃至 3)を含む、免疫抑制活性を有する物質のスクリーニング方法
1)以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリペプチドと被験物質を接触させるェ 程；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2)被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程； 3)被験物質を上記 a)乃至 c)から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定 された、被験物質のリン酸エステルの量と上記 2)で測定されたリン酸エステルの生成 量を比較する工程、
(4)下記の工程 1)乃至 4)を含む、免疫抑制活性を有する物質のスクリーニング方法
1)以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリペプチドと被験物質を接触させるェ 程；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2)被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
3)被験物質を上記 a)乃至 c)から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定 された、被験物質のリン酸エステルの量と上記 2)で測定されたリン酸エステルの生成 量を比較する工程。
4)被験物質を上記 a)乃至 c)から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定 された、リン酸エステルの量と比較して、上記 2)で測定されたリン酸エステルの量が 多い場合に被験物質が免疫抑制活性を有すると判定する工程、
(5)被験物質が、下記一般式 (I) (式中、 R1及び R2は、水素原子である。 R3は、 C1 - C6アルキル基又はヒドロキシメチル基である。 R4は、水素原子、ハロゲン原子又は C 1— C6アルキル基である。 R5は、水素原子、ハロゲン原子、シァノ基、 C1— C6アル キル基、 CI— C6アルコキシ基、 C3— C6シクロアルキル基、ハロゲノ CI— C6アルキ ル基、フエニル基及びべンジルォキシ基からなる群より選択される基で 1乃至 3個置 換されたフエニル基、ハロゲン原子又は水素原子であり、 Xは、ビニレン基（CH = C H基）、酸素原子、硫黄原子又はメチルァミノ基である。 Yは、単結合、酸素原子、硫 黄原子又はカルボニル基である。 Zは、単結合又は CI— C8アルキレン基である。 n は、 2又は 3である。）で表される化合物であることを特徴とする、（1)乃至（4)のいず れカ、 1項に記載のスクリーニング方法、
[0012] [化 2]
Figure imgf000007_0001
[0013] (6)以下の工程 1)及び 2)を含む、リン酸エステルの製造方法
1)一般式 (I)を有する化合物と以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリぺプチ ドとを接触させる工程；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2) 1)における反応溶液から一般式 (I)を有する化合物のリン酸エステルを取得する 工程、
(7)下記の工程 1)乃至 3)を含む、被験者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸エス テルを生成する能力を判定する方法
1)被験者より採取した検体より全 RNAを抽出する工程；
2)全 RNAにおける、下記の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリヌクレオチドの発 現量を測定する工程；
a)配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 6乃至 935に示されるヌクレオチド配列を 含むことからなるポリヌクレオチド b)配列表の配列番号 3のヌクレオチド番号 27から 956に示されるヌクレオチド配列を 含むことからなるポリヌクレオチド
c)上記 a)又は b)に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリ ヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、一般式 (I)を有する化合物 を生体内でリン酸化する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
3) 2)で測定されたポリヌクレオチドの発現量と一般式 (I)を有する化合物を生体内で リン酸化する能力を有することが確認されている検体における、該ポリヌクレオチドの 発現量を比較し、被験者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸化能を検定する工程
(8)下記の工程 1)及び 2)を含む、患者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸エステ ルを生成する能力を判定する方法
1)被験者より採取した検体における、下記の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリ ペプチドの発現量を測定する工程；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2) 1 )で測定されたポリペプチドの発現量と一般式 (I)を有する化合物を生体内でリン 酸化する能力を有することが確認されている検体における、該ポリペプチドの発現量 を比較し、被験者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸化能を検定する工程、
(9)下記の工程 1)及び 2)を含む、患者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸エステ ルを生成する能力を判定する方法
1)被験者より採取した検体における、下記の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリ ペプチドの酵素活性を測定する工程； a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2) 1 )で測定されたポリペプチドの酵素活性と一般式 (I)を有する化合物を生体内で リン酸化する能力を有することが確認されている検体における、該ポリペプチドの酵 素活性を比較し、被験者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸化能を検定する工程
(10)下記の工程 1)乃至 3)を含む、被験者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸ェ ステルを生成する能力を判定する方法
1)被験者より採取した検体における以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリヌ クレオチドのヌクレオチド配列を調べる工程；
a)配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 1乃至 1466に示されるヌクレオチド配列 を含むことからなるポリヌクレオチド
b)配列表の配列番号 3のヌクレオチド番号 1から 1781に示されるヌクレオチド配列を 含むことからなるポリヌクレオチド
c)上記 a)又は b)に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリ ヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、一般式 (I)を有する化合物 を生体内でリン酸化する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
2) 上記ポリヌクレオチドにおける酵素活性に影響のあるヌクレオチド配列の変異の 有無を調べる工程；
3)該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのリン酸化活性を低下させるヌクレオ チド配列の変異がある被験者は一般式 (I)を有する化合物のリン酸化能が低いと判 定し、該ポリペプチドのリン酸化活性を低下させるヌクレオチド配列の変異がな!/、被 験験者者はは一一般般式式 ((II))をを有有すするる化化合合物物ののリリンン酸酸化化能能をを有有すするるとと判判定定すするる工工程程、、
((1111 ))下下記記のの工工程程 11))乃乃至至 33))をを含含むむ、、以以下下のの aa))乃乃至至 cc))かかららななるる群群かからら選選択択さされれるるポポリリヌヌ ククレレオオチチドドががココーードドすするるポポリリペペププチチドドののリリンン酸酸化化活活性性にに影影響響ののああるるヌヌククレレオオチチドド配配列列のの 変変異異をを同同定定すするる方方法法。。
aa))配配列列表表のの配配列列番番号号 11ののヌヌククレレオオチチドド番番号号 11乃乃至至 11446666にに示示さされれるるヌヌククレレオオチチドド配配列列 をを含含むむここととかかららななるるポポリリヌヌククレレオオチチドド
bb))配配列列表表のの配配列列番番号号 33ののヌヌククレレオオチチドド番番号号 11かからら 11778811にに示示さされれるるヌヌククレレオオチチドド配配列列をを 含含むむここととかかららななるるポポリリヌヌククレレオオチチドド
cc))上上記記 aa))又又はは bb))にに記記載載ののヌヌククレレオオチチドド配配列列とと相相補補的的ななヌヌククレレオオチチドド配配列列かかららななるるポポリリ ヌヌククレレオオチチドドととスストトリリンンジジェェンントトなな条条件件下下ででハハイイブブリリダダィィズズしし、、一一般般式式 ((II))をを有有すするる化化合合物物 をを生生体体内内ででリリンン酸酸化化すするる能能力力をを有有すするるポポリリペペププチチドドををココーードドすするるポポリリヌヌククレレオオチチドド
11))被被験験者者よよりり採採取取ししたた検検体体ににおおけけるる上上記記 aa))乃乃至至 cc))かかららななるる群群かからら選選択択さされれるるポポリリヌヌクク レレオオチチドドののヌヌククレレオオチチドド配配列列をを調調べべるる工工程程；；
22))上上記記ポポリリヌヌククレレオオチチドドににおおけけるるヌヌククレレオオチチドド配配列列のの変変異異のの有有無無をを調調べべるる工工程程；；
33))該該ポポリリヌヌククレレオオチチドド配配列列のの変変異異とと該該ポポリリヌヌククレレオオチチドドががココーードドすするるポポリリペペププチチドドののリリンン 酸酸化化活活性性のの関関連連をを調調べべ、、リリンン酸酸化化活活性性にに影影響響ののああるる、、ポポリリヌヌククレレオオチチドド配配列列のの変変異異をを 同同定定すするる工工程程、、
((1122))検検体体がが、、末末梢梢血血ででああるるここととをを特特徴徴ととすするる、、（（77))乃乃至至（（11 11))ののいいずずれれ力力、、 11項項にに記記載載 のの方方法法、、
((1133))下下記記のの 11))乃乃至至 55))かかららななるる群群かからら選選択択さされれるる少少ななくくとともも 11以以上上をを含含むむ薬薬物物代代謝謝能能 診診断断用用キキッットト
11))配配列列表表のの配配列列番番号号 11ままたたはは 33にに記記載載ののヌヌククレレオオチチドド配配列列かかららななるるポポリリヌヌククレレオオチチドドのの 一一部部乃乃至至全全部部をを特特異異的的にに増増幅幅すするるたためめのの 1155かからら 3300塩塩基基長長のの連連続続ししたたオオリリゴゴヌヌタタレレ ォォチチドドププラライイママ一一；；
22))配配列列表表のの配配列列番番号号 11ままたたはは 33にに記記載載ののヌヌククレレオオチチドド配配列列かかららななるるポポリリヌヌククレレオオチチドドにに スストトリリンンジジェェンントトなな条条件件下下ででハハイイブブリリダダィィズズしし、、該該ポポリリヌヌククレレオオチチドドをを検検出出すするるたためめのの 1155
Figure imgf000010_0001
3)上記 1 )に記載のォ 一または上記 2)に記載のポリヌクレオ チドプローブのいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料；
4)下記の a)乃至 c)から選択されるポリペプチドに特異的に結合し、該タンパク質を検 出するための抗体；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
5)上記 4)に記載の抗体に結合する二次抗体、
力 なる。
発明の効果
[0014] 本発明により、ヒト フルクトサミンー3 キナーゼ関連タンパク質（human fructosami ne-3-kinase-related protein :以下、「ヒト FN3KRP」ともいう。）及び/又はヒト フル クトサミンー3—キナーゼ（human fructosamine - 3 - kinase,以下、「ヒト FN3K」ともい う。）を用いた該化合物のリン酸化方法を提供することができた。更に本発明により、 該酵素によってリン酸化される化合物をスクリーニングする方法を提供することができ た。更に本発明により、被験者の被験化合物のリン酸化能を判定する方法を提供す ること等ができた。
[0015] 1.定義
本明細書中において、「遺伝子」という語には、 DNAのみならずその mRNA、 cD NA及びその cRNAも含まれるものとする。また、本明細書中において、「ポリヌクレオ チド」という語は核酸と同じ意味で用いており、 DNA、 RNA、プローブ、オリゴヌタレ ォチド、及びプライマーも含まれている。本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋 白質」は区別せずに用いている。また、本明細書中において、「RNA画分」とは、 RN Aを含んでいる画分をいう。また、本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の 細胞、培養細胞も含んでいる。本明細書中における「全 RNA画分」とは、全 RNAを 含む画分をいい、血液、各種臓器、各種組織、培養細胞等から RNAの抽出用の溶 媒等、通常の方法によって抽出された全 RNAが含まれている画分のことをいう。本明 細書中において、「ストリンジェントな条件でハイブリダィズする」とは、市販のハイブリ ダイゼーシヨン溶液 ExpressHyb Hybridization Solution (クロンテック社製）中、 68°Cで ハイブリダィズすること、または、 DNAを固定したフィルターを用いて 0.7-1.0Mの NaC 1存在下 68°Cでハイブリダィゼーシヨンを行なった後、 0.1-2倍濃度の SSC溶液（1倍濃 度 SSCとは 150mM NaCl、 15mM クェン酸ナトリウムからなる）を用い、 68°Cで洗浄す ることにより同定することができる条件またはそれと同等の条件でハイブリダィズする ことをいう。
[0016] 2.ヒト FN3KRP及びヒト FN3K
本発明で用いるヒト フルクトサミンー3—キナーゼ（human fructosamine-3-kinase： ヒト FN3K)及びヒトフルクトサミンー3—キナーゼ関連タンパク質（human fructosam ine-3-kinase-related protein：ヒト FN3KRP)はその全長タンパク質に限らず、本発 明で用いることができる化合物のリン酸化反応を行うことができる限りにおいて、その 一部の配列からなる部分ペプチドでも良い。また、ヒト由来細胞より取得された天然の タンパク質でもよいし、 PCR法等によってクローニングされた遺伝子によって当該タン ノ ク質を発現するように遺伝子組換えされた細胞より取得されたタンパク質でもよい。 また、これらのタンパク質は、精製されたものの他に、部分精製されたものでもよい。
[0017] ヒト FN3Kの cDNAのヌクレオチド配列は例えば、配列表の配列番号 1のヌクレオ チド番号 1乃至 1466に示されている。また、ヒト FN3Kのアミノ酸配列は、例えば、配 列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されている。ヒト FN3Kの cDNAの ヌクレオチド配列は GenBankにァクセッション番号： NM— 022158で登録されて!/ヽ
[0018] また、ヒト FN3KRPの cDNAのヌクレオチド配列は例えば、配列表の配列番号 3の ヌクレオチド番号 1乃至 1781に示されている。また、ヒト FN3KRPのアミノ酸配列は、 例えば、配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されている。ヒト FN3KR Pの cDNAのヌクレオチド配列は GenBankにァクセッション番号： NM 024619で 登録されている。
[0019] 本明細書中において、「ヒト FN3K遺伝子」とは、ヌクレオチド配列力 配列表の配 列番号 1のヌクレオチド番号 6乃至 935からなる遺伝子、または該ヌクレオチド配列か らなる遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな 条件でハイブリダィズし、ヒト FN3Kと同一の生物活性を有する蛋白質をコードするヌ クレオチド配列からなる遺伝子を!/、う。
[0020] 本明細書中において、「ヒト FN3K」とは、アミノ酸配列が、配列表の配列番号 2のァ ミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または、該蛋白質のァ ミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ 酸配列からなり、かつ、ヒト FN3Kと同一の生物活性を有する蛋白質をいう。
[0021] 本明細書中において、「ヒト FN3KRP遺伝子」とは、ヌクレオチド配歹 IJが、配列表の 配列番号 3のヌクレオチド番号 27乃至 956からなる遺伝子、または該ヌクレオチド配 歹 IJからなる遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェ ントな条件でハイブリダィズし、ヒト FN3KRPと同一の生物活性を有する蛋白質をコ ードするヌクレオチド配列からなる遺伝子をいう。本明細書中において、「ヒト FN3KR P」とは、アミノ酸配列が、配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるァ ミノ酸配列からなる蛋白質、または、該蛋白質のアミノ酸配列において、 1若しくは数 個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒト FN3K RPと同一の生物活性を有する蛋白質をいう。
[0022] ヒト FN3K及びヒト FN3KRP、並びにその部分ペプチドに他のアミノ酸配列を付加 した融合タンパク質も、ヒト FN3K及びヒト FN3KRP、並びにその部分ペプチドに含 まれる。融合タンパク質としてはヒスチジンタグ融合タンパク質、 FLAG融合タンパク 質、 GFP等の蛍光色素融合タンパク質等を挙げることができるが、これらに限定され ない。
[0023] ヒト FN3K及び/又はヒト FN3KRPの酵素活性はヒト FN3K及び/又はヒト FN3K RP、基質になる物質を適当なバッファーでインキュベートし、生成物であるリン酸化 化合物を定量することによって測定することが出来る。例えばヒト FN3K及び/又は ヒト FN3KRPを（2R)—2—ァミノ一 2—メチノレ一 4— [5— (5—フエ二ルペンタノィル） チォフェン 2—ィル]ブタン 1 オールとインキュベートし、生成されるリン酸エス テルを HPLCで定量することによって、酵素活性を測定することが出来る。
[0024] 3.ヒト FN3K cDNA及びヒト FN3KRP cDNAの取得
( 1 )ヒト FN3K cDNA
ヒト FN3K cDNAは市販品を用いることができ、例えば GeneCopoeia社より入手で きる（カタログ No. GC_W1392)。
[0025] また、ヒト FN3K cDNAはヒト FN3K遺伝子を含む cDNAライブラリーを用いて以 下のようにして取得することあでさる。
[0026] ヒト FN3K遺伝子を発現している cDNAライブラリーから、コロニーハイブリダィゼー シヨン法等、公知の方法に従い、完全長 cDNAを取得する。この完全長 cDNAを铸 型として PCR法を用いてヒト FN3K cDNAを取得する。 cDNAライブラリ一は例えば 、ヒト骨髄由来の cDNAライブラリーを用いることができる。市販のヒト cDNAライブラリ 一としては例えば、クロンテック社の Creator SMART Human cDNA Librariesを用い ることもできるし、また自ら cDNAライプ'ラリーを調製することもできる。
[0027] なお、コロニーハイブリダィゼーシヨンを行わずに、 cDNAライブラリーを铸型として 直接 PCRを行なってヒト FN3K cDNAを取得することもできる。
[0028] PCRプライマーとしてはヒト FN3K cDNAを増幅することができればよぐ公知の 方法で適当なプライマーを選択することができる。ヒト FN3K cDNAを増幅する PC R用プライマーとしては例えば以下のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを 選択すること力 Sでさる。
5 - atggagcagctgctgcgcgccgagctgcgc—3，、ノ。フ マー 1：目 ti歹1 J表の酉 ti歹1 J番 ： oリ及び
5，_ ctacttgagcagccttcgcatggtgcccaa _3， (プライマー 2：酉己歹 IJ表の酉己歹 IJ番号： 6) 0
[0029] (2)ヒト FN3KRP cDNA
ヒト FN3KRP遺伝子を発現している cDNAライブラリーから、コロニーハイブリダィ ゼーシヨン法等、公知の方法に従い、完全長 cDNAを取得する。この完全長 cDNA を铸型として PCR法を用いてヒト FN3KRP cDNAを取得できる。 cDNAライブラリー は例えば、ヒト骨髄由来の cDNAライブラリーを用いることができる。市販のヒト cDNA ライブラリ一として例えば、クロンテック社の Creator SMART Human cDNA Libraries を用いることもできるし、自ら cDNAライプ'ラリーを調製することもできる。
[0030] なお、 cDNAライブラリーを铸型として直接 PCRを行なってヒト FN3KRP cDNAを 取得することあでさる。
[0031] PCRプライマーとしてはヒト FN3KRP cDNAを増幅することができればよぐ公知 の方法で適当なプライマーを選択することができる。ヒト FN3KRP cDNAを増幅す る PCR用プライマーとしては例えば以下のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチ ドを選択すること力 Sできる。
0 ― ataagaatgcggccgccaccatggaggagctgctgaggcg— 3 (プフ マー 3：酉己歹 IJ表の目 歹 lj 号: 7)及び、
5 ' - atagtttagcggccgctcacttgaccagattcctcat-3 ' (プライマー 4：酉己歹 IJ表の酉己歹 IJ番号： 8)
〇
[0032] なお、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、ヒト FN 3K遺伝子及び/又はヒト FN3KRP遺伝子の天然型のヌクレオチド配列の一部を他 のヌクレオチドへの置換やヌクレオチドの欠失、付加などの改変により、天然型のヒト FN3K遺伝子及び/又はヒト FN3KRP遺伝子と同等の生物活性を有するポリヌクレ ォチドを調製することが可能である。このように天然型のヌクレオチド配列においてヌ クレオチドが置換、欠失、もしくは付加したヌクレオチド配列を有し、天然型のヒト FN3 K遺伝子及び/又はヒト FN3KRP遺伝子と同等の生物活性を示すポリヌクレオチド もまた本発明に用いることができる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あ るいは DNAェキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異 導入、変異プライマーを用いた PCR法によるヌクレオチド配列の改変、合成変異 DN Aの直接導入などの方法により行うことができる。また、ヒト FN3K遺伝子又はヒト FN 3KRP遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント な条件でハイブリダィズし、ヒト FN3K又はヒト FN3KRPと同様の生物活性を有する ポリヌクレ才チドを使用することもできる。
[0033] 4. ヒト FN3K及びヒト FN3KRPの発現
(1)ヒト FN3K及びヒト FN3KRP発現ベクターの構築 ヒト FN3K及び/又はヒト FN3KRPは in vitroにて合成する、あるいは遺伝子操作 により宿主細胞に産生させることによって生産することができる。具体的には、ヒト FN 3K遺伝子及び/又はヒト FN3KRP遺伝子を発現可能なベクターに組み込んだ後、 転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あ るいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってヒト FN3K及び/又はヒト FN3KRPを発現させることにより、ヒト FN3K及び/又はヒト F N3KRPを得ることが出来る。
[0034] 原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli)や枯草菌（Bacillus su btilis)などが挙げられる。 目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるに は、宿主と適合し得る種由来のレブリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでい るプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転 換細胞に表現形質 (表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好 ましい。
[0035] 例えば、大腸菌としては K12株、 DH5 a株などがよく用いられ、ベクターとしては、 一般に PBR322や pUC系、 pcDNA3. 1(+ ) (インビトロジェン社)等のプラスミドが用 いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用 できる。
[0036] 枯草菌としては、例えば 207— 25株が好ましぐベクターとしては pTUB228 (Ohm ura、 . et al. (1984) J. Biochem. 95、 87— 93)などが用いられるが、これに限定され るものではない。枯草菌の α—アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードする DNA 配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
[0037] 真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物 細胞としては、例えば、サルの細胞である COS細胞（Gluzman、 Υ. (1981) Cell 23、 1 75— 182、 ATCC： CRL— 1650)やチャイニーズ'ノ、ムスター卵巣細胞（CHO細胞、 A TCC : CCL— 61)のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub、 G. and Chasin、し A. ( 1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77、 4126— 4220)等がよく用いられているが、これ らに限定されない。
[0038] 宿主細胞として、 HEK293細胞を用いる場合を例に取ると、例えば、ベクターとして p cDNA3. 2— DEST (インビトロジェン社）を用いることが出来る。
[0039] 上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養 により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられ る培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、 例えば、上記 HEK293細胞であれば、 RPMI1640培地やダルベッコ変法イーグル培 地などの培地に、必要に応じゥシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用で きる。
[0040] 上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換えタンパク 質は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離 操作法により分離 ·精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常 のタンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、 吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティーク口マトグラフィ 一、高速液体クロマトグラフィー（HPLC)などの各種液体クロマトグラフィー、透析法 、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換えタンパク質に 6残基から なるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルァフィ二ティーカラムで効率的に精製する こと力 Sできる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明の ポリペプチドを大量に製造できる。また、精製したポリペプチドの分子量は質量分析 器、 SDS— PAGE等通常の方法で決定することができる。
[0041] ヒト FN3K及び/又はヒト FN3KRPの精製に際しては酵素活性を指標にすること ができる。
[0042] 5.リン酸化酵素によってリン酸化を受ける化合物
本発明にお!/、てヒト FN3K及び/又はヒト FN3KRPの基質として用いることができ る化合物は、ヒト FN3K及び/又はヒト FN3KRPによってリン酸化される限りにおい て特に制限はないが例えば、下記一般式 (I)を有する化合物である。
[0043] [化 3]
Figure imgf000018_0001
[0044] また、上記一般式 (I)を有するァミノアルコール誘導体は、例えば、国際公開第 94 /08943号パンフレット（FTY720)、国際公開第 96/06068号パンフレット（FTY 類似化合物）、国際公開第 98/45249号パンフレット (FTY類似化合物）、国際公 開第 03/029184号パンフレット（ROX— 2127 : KRP— 203類似化合物）、国際 公開第 03/029205号パンフレツ卜（KRP— 203)、国際公開第 02/06268号パン フレット（チォフェン誘導体）、国際公開第 03/059880号パンフレット（ピロール誘 導体）、国際公開第 05/005383号パンフレット（置換ピロール誘導体）、国際公開 第 05/063671号パンフレット（ベンゼン環のエーテル誘導体）等に記載する方法に 従って製造することができる。
[0045] 本発明における上記一般式 (I)有するァミノアルコール誘導体を医薬組成物の有 効成分として用いるときの置換基として、好適な置換基を以下に示す。
[0046] R1及び R2は、好適には、水素原子である。
[0047] R3は、好適には、 C1 C6アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、更に好適に は、メチル基又はヒドロキシメチル基である。
[0048] R4は、好適には、水素原子、ハロゲン原子又は C1 C6アルキル基であり、更に好 適には、水素原子、塩素原子又はメチル基であり、特に更に好適には、水素原子又 は塩素原子である。
[0049] R5は、例えば、水素原子、ハロゲン原子、シァノ基、 C1 C6ァノレキノレ基、 C1 -C6 アルコキシ基、 C3— C6シクロアルキル基、ハロゲノ C1— C6アルキル基、フエニル基 及びべンジルォキシ基からなる群より選択される基で 1乃至 3個置換されたフエニル 基、ハロゲン原子又は水素原子であり、好適には、水素原子、フッ素原子、塩素原子 、シァノ基、メチル基、メトキシ基、シクロプロピル基、トリフルォロメチル基、フエニル 基及びベンジルォキシ基からなる群より選択される基で 1乃至 3個置換されたフエ二 ル基、フッ素原子又は水素原子であり、更に好適には、水素原子、メチル基、メトキシ 基、トリフルォロメチル基、フエニル基及びベンジルォキシ基からなる群より選択され る基で 1乃至 3個置換されたフエ二ル基、フッ素原子又は水素原子であり、特に更に 好適には、フエニル基、 4 メチルフエニル基、 4ーメトキシフエ二ル基、 3—メトキシー 4 メチルフエニル基、 3—トリフルォロメチルフエニル基、 3—べンジルォキシフエ二 ル基、フッ素原子又は水素原子である。
[0050] Xは、好適には、ビニレン基（CH = CH基）、酸素原子、硫黄原子又はメチルァミノ 基であり、更に好適には、ビニレン基（CH = CH基）又はメチルァミノ基である。
[0051] Yは、好適には、単結合、酸素原子、硫黄原子又はカルボニル基であり、更に好適 には、単結合、酸素原子、又はカルボニル基である。
[0052] Zは、好適には、単結合又は C1 C8アルキレン基であり、更に好適には、単結合 、トリメチレン、テトラメチレン又はオタタメチレンである。
[0053] nは、好適には、 2又は 3であり、更に好適には、 2である。
[0054] 本発明におけるヒト FN3K及び/又はヒト FN3KRPの基質として用いることができ る化合物のうち、一般式 (I)を有するァミノアルコール誘導体として好適な化合物は、
2 アミノー 2 メチノレー 4 [1ーメチノレー 5- (5—フエニノレぺ 一ノレ 2—ィノレ]ブタン 1ーォーノレ、
2 ァミノ一 2 メチル 4— { 1—メチル 5— [5 (2—メチルフエ二ノレ）ペンタノィ ノレ]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール、
2 ァミノ一 2 メチル 4— { 1—メチル 5— [5 (3—メチルフエ二ノレ）ペンタノィ ノレ]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール、
2 ァミノ一 2 メチル 4— { 1—メチル 5— [5 (4 メチルフエ二ノレ）ペンタノィ ノレ]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール、
2 ァミノ一 2 メチル 4— { 1—メチル 5— [5 (2, 3 ジメチルフエニル）ペン タノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1ーォーノレ、
2 ァミノ一 2 メチル 4— { 1—メチル 5— [5 (2, 4 ジメチルフエニル）ペン ！ールー 2—ィル }ブタン 1ーォーノレ、 2 アミノー 2 メチル 4— {1 メチルー 5— [5— (2, 5 ジメチルフエ二ノレ）ペン -ノレー 2 ォーノレ、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 メチルー 5— [5— (3, 4—ジメチルフエ二ノレ）ペン ローノレ一 2 1—オール、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 メチルー 5— [5—（3, 5—ジメチルフエニル）ペン タノィノレ]ピロ一ノレ 2 ォーノレ、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 メチルー 5— [5—（3—メチルー 4ーメトキシフエ二 ノレ）ペンタノィル]ピロ一ノレ 2— 'レ }ブタン 1 オール、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 メチル 5— [5— (3—メトキシ一 4—メチルフエ二 ノレ）ペンタノィル]ピロ一ルー 2— -1一才一ノレ、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 メチルー 5— [5—（4 シァノフエ二ノレ）ペンタノィ ノレ]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン ーォーノレ、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 メチルー 5— [4一（2 メチルフエ二，
]ピロール 2—ィル }ブタン 才ーノレ、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 メチルー 5— [4一（3—メチルフエ二'
]ピロール 2—ィル }ブタン一;！ オール、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 メチル 5— [4— (4—メチルフエ二，
]ピロール 2—ィル }ブタン一;！ ォーノレ、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 メチルー 5— [4一（2， 3 ジメチルフエニル）ブタ ノィル]ピロール一 2—ィル }ブタ： — 1—オール、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 -メチルー 5— [4一（2, 4 ジメチルフエ二ノレ）ブタ ノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタ: — 1—才ーノレ、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 -メチルー 5— [4— (2, 5 ジメチルフ '：エー ノィル]ピロ一ノレ一 2—ィル }ブタ: — 1—オール、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 -メチルー 5— [4— (3， 4—ジメチルフ '：エ ノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタ: 1 オール、
2 アミノー 2 メチル 4— {1 -メチルー 5— [4— (3, 5—ジメチルフ '：エ
ίール一 2- ' 1 オール、 22 ァァミミノノ一一 22 メメチチルル 44—— {{ 11——メメチチルル 55—— [[44——（（33 メメチチルル 44 メメトトキキシシフフエエ二二 ノノレレ））ブブタタノノィィルル]]ピピロロ一一ルルーー 22——ィィルル }}ブブタタンン 11 オオーールル、、
22 ァァミミノノ一一 22 メメチチルル 44—— {{ 11——メメチチルル 55—— [[44——（（33 メメトトキキシシ一一 44 メメチチルルフフエエ二二 ノノレレ））ブブタタノノィィルル]]ピピロローールル一一 22——ィィルル }}ブブタタンン一一 11 オオーールル及及びび
22 ァァミミノノ一一 22 メメチチルル 44—— {{ 11——メメチチルル 55—— [[44——（（44 シシァァノノフフエエニニルル））ブブタタノノィィルル ]]ピピロローールル 22——ィィルル }}ブブタタンン 11 オオーールル並並びびにに、、
22 アアミミノノーー 22—— [[22——（（44ーーォォククチチルルフフエエ二二ノノレレ））ェェチチルル]]ププロロパパンン 11 ,, 33 ジジオオーールル、、
22 アアミミノノーー 22—— [[22—— ((44 ヘヘププチチルルォォキキシシフフエエニニルル））ェェチチルル]]ププロロパパンン 11 ,, 33 ジジォォ 一一ノノレレ、、
22 アアミミノノーー 22—— {{ 22—— [[44—— ((55——フフエエ二二ルルペペンンタタノノィィルル））フフエエニニルル]]ェェチチルル }}ププロロパパンン一一 11 ,, 33——ジジオオーールル、、
22 アアミミノノーー 22—— {{ 22—— [[44一一（（55 シシククロロへへキキシシルルペペンンタタノノィィルル））フフエエニニルル]]ェェチチルル }}ププロロ パパンン—— 11 ,, 33——ジジ才才ーールル、、
22 アアミミノノーー 22—— {{ 22—— [[44一一（（77 フフエエニニルルヘヘププタタノノィィルル））フフエエニニルル]]ェェチチルル }}ププロロパパンン一一 11 ,, 33——ジジオオーールル、、
22 アアミミノノーー 22——（（22—— {{44 [[22——（（44ーーメメトトキキシシフフエエニニルル））エエトトキキシシ]]フフエエ二二ルル}}ェェチチルル））ププ 口口パパンン 11 ,, 33——ジジオオーールル、、
22 アアミミノノーー 22——（（22—— {{44 [[22——（（44 エエトトキキシシフフエエニニルル））エエトトキキシシ]]フフエエニニルル }}ェェチチルル）） ププロロパパンン 11 ,, 33——ジジォォ一一ノノレレ、、
22 アアミミノノーー 22—— ((22—— {{44—— [[22—— ((33 フフルルオオロローー 44ーーメメトトキキシシフフエエニニルル））エエトトキキシシ]]フフエエ 二二ノノレレ }}ェェチチルル））ププロロパパンン 11 ,, 33——ジジォォ一一ノノレレ、、
22 アアミミノノーー 22 メメチチルル 44—— [[44—— ((44,, 44,, 55，， 55，， 55 ペペンンタタフフルルォォロロペペンンチチルルォォキキシシ）） フフエエニニルル]]ブブタタンン一一 11——オオーールル、、
22 ァァミミノノ一一 22 メメチチルル 44—— [[44—— ((33 ビビフフエエニニルル 44 ィィルルププロロポポキキシシ））フフエエニニルル]]
Figure imgf000021_0001
2 ァミノ一 2 メチル 4— [4— (3 ビフエ二ノレ 4 ィルプロピオニル）フエニル ]ブタン 1 オール、
2 アミノー 2 メチル 4— [3 メトキシ 4— (4—フエニルブトキシ）フエニル]ブ タン 1一才一ノレ、
2 アミノー 2 メチル 4 [4- (5 フエ二ルペンチルォキシ）フエニル」ブタン 1一才一ノレ、
2 アミノー 2 メチル 4 [4一（5—フエ二ルペンタノィル）フエニル]ブタン 1 オール、
2 アミノー 2 メチル 4 (4一へキシルォキシフエニル）ブタン 1 オール、
2 アミノー 2 メチル 4 [4一（3—フエニルプロポキシ）フエニル]ブタン 1 - ォーノレ、
2 アミノー 2 メチルー 4 [4一（3—シクロへ： ェニル]ブタン
2 アミノー 2 メチル 4— [4— ( 5 シクロへキシルペンタノィノレ）フエニル]ブタ ン一 1—ォーノレ、
2—アミノー 2—メチルー 4一（4 ヘプチルォキシフエ二ノレ）ブタン 1 オール、
2 アミノー 2— [4— (3 ベンジルォキシフエノキシ） 2—クロ口フエニル]プロピ ノレ 1 , 3—プロパンジオール、
2 アミノー 2— [4— (3 ベンジルォキシフエ二ルチオ） 2 クロ口フエニル]プロ ピノレー 1 , 3—プロパンジオール、
2 アミノー 2 メチノレ 5— [4— (3 ベンジノレオキシフエノキシ） 2 クロ口フエ ニノレ]ペンタン一 1—ォーノレ、
2 アミノー 2 メチルー 5— [4— (3 ベンジルォキシフエ二ルチオ） 2 クロロフ ェニノレ]ペンタン一 1—ォーノレ、
2 アミノー 2 メチノレ 4 [ 5—（ 5 フエ二ノレペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]
Figure imgf000022_0001
2 アミノー 2— [4— (3 ベンジルォキシフエ二ルチオ） 2 クロロフエ二ノレ]プロピ ルー 1 , 3—プロパンジオール（R〇X— 2127)、
2 アミノー 2— [4一（3 べンジルォキシフエ二ルチオ）ー2 クロ口フエ二ノレ]ェチル - 1 , 3 プロパンジオール（KRP— 203)、
2 アミノー 2 メチル 4— [1—メチル 5— (5 フエ二ルペンタノィノレ）ピロール一 2- 才ーノレ
2—ァミノ 2—メチルー 4一 1ーメチノレー 5— [4一（4ーメチノレフエ二，
ピロ一ノレ- 2—イノレ}ブタン- 1一オール、
2—ァミノ - 2—メチルー 4一 3—メチルー 5— [4— (3， 4ージメチルフエ：
2 - 1一才一ノレ、
2—ァミノ- 2—メチルー 4一 3—メチル一5— [4— (3, 4—ジメトキシフエ二，
2—ィル プ、タン一 1一才一ノレ、
2—ァミノ- 2—メチルー 4一 1ーメチルー 5—[4ー（3, 4—ジメチルフエ： ィルコピロ' ノレ一2- 一オール、
2—ァミノ- 2—メチルー 4一 3—クロロー 5— [4一（3, 4—ジメチルフエ二'
2 - 1一才一ノレ、
2—ァミノ- 2—メチルー 4一 1 , 3—ジメチルー 5— [4— (3, 4—ジメチルフエニル） 一ルー 2 レ}ブタン一 1ーォ一ノレ、
2—ァミノ- 2—メチルー 4一 1—メチル一3—クロ口一 5— [4— (3, 4—ジメトキシフ ェ 一ノレ - 2—ィル }ブタン一 1一オール、
2—ァミノ- 2—メチルー 4一 1 , 3—ジメチルー 5— [4— (3, 4—ジメトキシフエニル） 一ルー 2 レ}ブタンー1ーォ一ノレ、
2—ァミノ- 2—メチルー 3— 4一ヘプタノィルフエノキシ）プロパン一 1ーォーノレ、 2—アミノ2—メチルー 5— 1ーメチノレー 5— [4一（4ーメチノレフエ二，
ビローノレ- 2—ィル }ペンタン— 1—才ーノレ、
2—ァミノ- 2—メチルー 5— 5- [4 - (4-メチルフエ二'
2—ィルト ル、
2—ァミノ- 2—メチルー 3— 4一 [4一（4一メチルフエ二ノレ）ブタノィル]フエ二ルメト 才ーノレ
2—ァミノ- 2—メチルー 3— 2—クロ口一 4— [4— (4- エ
フエ二， ーォーノレ、
2—アミノ- - 2—メチル一3— 5—[4ー（3, 4—ジメチノレフ
エン一 2— - 1ーォーノレ、及び 2 アミノー 2— [2— (4 ォクチルフエニル）ェチル]プロパン 1, 3—ジオール（FT Y720)
であり、
更に好適な化合物は、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 4 [1 -メチルー 5— (5—フエニルぺ
ロール 2—ィル]ブタン 1ーォーノレ、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 4 {1 メチルー 5— [5—（2 メチルフエ二ノレ）ぺ ンタノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン- L—オール、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 4 {1 メチルー 5— [5—（3—メチルフエニル）ぺ ンタノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン- L—オール、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 4 {1 メチルー 5— [5—（4 メチルフエ二ノレ）ぺ ンタノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン- L—オール、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 4 {1 メチルー 5— [5— (2, 3 ジメチルフエニル )ペンタノィル]ピロ一ノレ 2—ィル }ブタ 1—才ーノレ、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 4 {1 メチルー 5— [5— (2, 4 ジメチルフエニル )ペンタノィル]ピロ一ノレ 2—ィル }ブタ 1—才ーノレ、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 4 {1 メチルー 5— [5— (2, 5 ジメチルフエニル )ペンタノィル]ピロ一ノレ 2—ィル }ブタ 1—才ーノレ、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 4 {1 メチルー 5— [5— (3, 4—ジメチルフエニル )ペンタノィル]ピロ一ノレ 2—ィル }ブタ 1—才ーノレ、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 4 {1 メチルー 5— [5— (3, 5—ジメチルフエニル )ペンタノィル]ピロ一ノレ 2—ィル }ブタ 1—才ーノレ、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 4 {1 メチルー 5— [5— (3—メチルー 4ーメトキシ フェニル）ペンタノィル]ピロール一 2 イノレ}ブタン 1ーォーノレ、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 4 {1 メチルー 5— [5— (3—メトキシー4 メチル フェニル）ペンタノィル]ピロール一 2 イノレ}ブタン 1ーォーノレ、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 4 {1 メチル 5— [ 5—（4ーシァノフェニル）ペン
i一ルー 2- —才ーノレ、 (2R) 2—了 -2- -メチルー■4— {1ーメチル- -5-[4- (2- -メチル 7ェニノレ）ブタ ノィル ]ピ1： 2—ル一 2 レ}ブタン -1- -オール、
(2R) 2 —了 - -2- -メチルー ■4 — {1ーメチル- -5-[4- (3- -メチル 7ェニノレ）ブタ ノィル ]ピ1： 2—ル一 2 レ}ブタン -1- -オール、
(2R) 2 —了ソ- -2- -メチルー ■4 — {1ーメチル- -5-[4- (4- -メチル 7ェニノレ）ブタ ノィル ]ピ1： 2—ル一 2 レ}ブタン -1- -オール、
(2R) 2 —了ソ- -2- -メチルー ■4 — {1ーメチル- -5-[4- (2, 3 ジメ : fルフ エル
)ブタノイノレ]ピ'ロー -ル一 -2—ィル 7、、タン 1ーォ'ール、
(2R) 2 —了ソ- -2- -メチルー ■4 — {1ーメチル- -5-[4- (2, 4ージメ : fルフ エル
)ブタノイノレ]ピ'ロー -ル一 -2—ィル 7、、タン 1ーォ'ール、
(2R) 2 —了ソ- -2- -メチルー ■4 — {1ーメチル- -5-[4- (2, 5 ジメ : fルフ エル
)ブタノイノレ]ピ'ロー -ル一 -2—ィル 7、、タン 1ーォ'ール、
(2R) 2 —了ソ- -2- -メチルー ■4 — {1ーメチル- -5-[4- (3, 4ージメ : fルフ エル
)ブタノイノレ]ピ'ロー -ル一 -2—ィル 7、、タン 1ーォ'ール、
(2R) 2 —了ソ- -2- -メチルー ■4 — {1ーメチル- -5-[4- (3, 5 ジメ : fルフ エル
)ブタノイノレ]ピ'ロー -ル一 -2—ィル 7、、タン 1ーォ'ール、
(2R) 2 —了ソ- -2- -メチルー ■4 — {1ーメチル- -5-[4- (3- -メチル-4ーメトキシ フエ-ル) 'ブタノ 'ィ'ルコピローノレ 2 —イノレ }ブタン- — 1ーォー 'ル、
(2R) 2 —了ソ- -2- -メチルー ■4 — {1ーメチル- -5-[4- (3- -メトキシ 4 メチル フエ-ル) 'ブタノ 'ィ'ルコピローノレ 2 —イノレ }ブタン- — 1ーォー 'ル及び
(2R) 2 —了 -2- -メチルー ■4 — {1ーメチル- -5-[4- (4- —、、/ァノっ 'ェニノレ）ブタ ノィル ]ピ1： 2—ル一 2 レ}ブタン -1- -オール並びに、
(2R) 2 —了 - -2- -[2 -（4 オク F レフェニ .ル）ェチノ I ブ 'ロノくン一 1, 3 ジォ ール、
(2R) 2 —了 - -2- -[2 -（4 ヘプ:チルォキ、:ンフエニノレ）ェ : fル]プロ ：パン— 1, 3 ジストル、
(2R) 2 —了 - -2- -{2— [4 (5—フエ二ルン ンタノイノレ)フ 'ェニル]ェチル }プロ パン— 1, 3—ジ才ール (2 ）ー2—ァミノー2—{ 2—[4ー（5—シクロへキシルペンタノィル）フエニル]ェチル }プロパン 1 , 3—ジオール、
(2R)— 2 アミノー 2— { 2— [4一（7 フエニルヘプタノィル）フエニル]ェチル }プロ パン— 1 , 3—ジ才ール、
(2R) 2 アミノー 2— (2- {4- [2- (4ーメトキシフエニル）エトキシ]フエ二ル}ェ チノレ）プロパン 1 , 3—ジォーノレ、
(2R) 2 アミノー 2— (2- {4- [2- (4 エトキシフエュル）エトキシ]フエ二ル}ェ チノレ）プロパン 1 , 3—ジォーノレ、
(2R)—2 ァミノ一 2—（2— {4— [2— (3 フルォロ一 4 メトキシフエニル）エトキシ ]フエ二ル}ェチノレ）プロパン 1 , 3—ジオール、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル 4— [4— (4， 4， 5, 5, 5 ペンタフノレォロペンチル ォキシ）フエニル]ブタン 1 オール、
(2R)— 2 アミノー 2 メチノレ一 4— [4— (3 ビフエ二ノレ一 4 ィノレプロポキシ）フェ ニノレ]ブタン一 1—ォーノレ、
(2R)— 2 ァミノ一 2 メチル 4— [4— (3 ビフエ二ノレ 4 ィルプロピオニル）フ ェニノレ]ブタン 1 オール、
(2R)— 2 ァミノ一 2 メチル 4— [3 メトキシ一 4— (4 フエニルブトキシ）フエ二 ノレ]ブタン 1ーォーノレ、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル一 4一 [4一（ 5 フエ二ルペンチルォキシ）フエニル]ブ タン 1一才一ノレ、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル 4— [4— ( 5—フエ二ルペンタノィル）フエニル]ブタ ン 1 オール、
( 2R)— 2 アミノー 2 メチル 4— (4 へキシルォキシフエニル）ブタン 1ーォー ル、
(2R)— 2 アミノー 2 メチルー 4 [4一（3 フエニルプロポキシ）フエニル]ブタン — 1—才ーノレ、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル 4— [4— (3 シクロへキシルプロポキシ）フエニル] プ、タン 1一才一ノレ、 (2R)— 2 アミノー 2 メチノレー 4— [4— (5 シクロへキシルペンタノィノレ）フエ二ノレ ]ブタン 1 オール、
( 2R)— 2 アミノー 2 メチル 4一（4 ヘプチルォキシフエ二ノレ）ブタン 1ーォー ル、
(2R)—2 アミノー 2— [4— (3—ペンジノレオキシフエノキシ） 2 クロ口フエ二ノレ] プロピノレー 1 , 3—プロパンジオール、
(2R)—2 アミノー 2— [4— (3 ベンジルォキシフエ二ルチオ） 2 クロ口フエニル ]プロピル 1 , 3—プロパンジオール、
(2R)—2 アミノー 2 メチノレ一 5— [4— (3 ベンジルォキシフエノキシ） 2 クロ 口フエニノレ]ペンタン一 1—ォーノレ、
(2R) 2 アミノー 2 メチノレー 5— [4一（3 べンジルォキシフエ二ルチオ）ー2— クロ口フエニノレ]ペンタン一 1—ォーノレ、
(2R)—2 アミノー 2 メチノレ一 4— [5— (5 フエ二ノレペンタノィノレ）チォフェン一 2 ーィノレ]ブタン 1ーォーノレ、
(2R)—2 アミノー 2— [4— (3 ベンジルォキシフエ二ルチオ） 2 クロ口フエニル ]プロピル—1 , 3—プロパンジオール（ROX— 2127)、
(2R)—2 アミノー 2— [4— (3 ベンジルォキシフエ二ルチオ） 2 クロ口フエニル ]ェチノレー 1 , 3 プロパンジォーノレ (KRP 203)、
(2R)— 2 ァミノ一 2 メチル 4— [ 1—メチル 5— ( 5—フエ二ルペンタノィノレ）ピ ロール 2—ィル]ブタン 1 オール、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル一 4一 { 1一メチル一 5— [4一（4一メチルフエ二ノレ）ブタ ノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール、
(2R) 2 アミノー 2 メチルー 4 { 3 メチルー 5— [4一（3, 4 ジメチルフエ二 ノレ）ブタノィル]チォフェン 2—ィル }ブタン 1 オール、
(2R)— 2 ァミノ一 2 メチル 4— { 3 メチル 5— [4— (3, 4 ジメトキシフエ二 ノレ）ブタノィル]チォフェン 2—ィル }ブタン 1 オール、
(2R) 2 アミノー 2 メチルー 4 { 1ーメチルー 5—[4一（3, 4 ジメチルフエニル )ブタノィル]ピロ一ノレ 2—ィル }ブタン 1 オール、 (2R)—2 ァミノ一 2 メチノレ一 4— { 3 クロ口一 5— [4— (3, 4 ジメチルフエニル )ブタノィル]チォフェン 2—ィル }ブタン 1 オール、
(2R)— 2—ァミノ一 2—メチノレ一 4— { 1 , 3—ジメチル一 5— [4— (3, 4—ジメチルフ ェニル）ブタノィル]ピロ一ノレ一 2—ィル }ブタン一 1—オール、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル 4— { 1—メチル 3 クロ口一 5— [4— (3, 4 ジメ トキシフエ二ノレ）ブタノィル]ピロ一ノレ一 2—ィル }ブタン一 1—オール、
(2R)— 2 ァミノ一 2 メチノレ一 4— { 1 , 3 ジメチル一 5— [4— (3, 4 ジメトキシフ ェニル）ブタノィル]ピロ一ノレ一 2—ィル }ブタン一 1—オール、
(2S)—2—アミノー 2—メチルー 3—（4 ヘプタノィルフエノキシ）プロパンー1ーォ 一ノレ、
(2R)— 2—アミノー 2—メチル一 5— { 1一メチル一 5— [4一（4一メチルフエ二ノレ）ブ タノィル]ピロ一ノレ一 2—ィル }ペンタン一 1—オール、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル一 5— { 5— [4一（4一メチルフエニル）ブタノィル]チォ フェン一 2—イノレ}ペンタン一 1一才一ノレ、
(2S)— 2 アミノー 2 メチノレー 3— { 4— [4— (4 メチルフエニル）ブタノィル]フエ ニルメトキシ}プロパン一 1—オール、
(2S)—2 アミノー 2 メチノレ一 3— { 2 クロ口一 4— [4— (4 メチルフエ二ノレ）ブタ ノィル]フエニルメトキシ}プロパン 1 オール、
(2S)— 2 アミノー 2 メチルー 3— { 5— [4一（3, 4 ジメチルフエニル）ブタノィル] チォフェン 2—ィルメトキシ}プロパン 1 オール、及び
(2R) 2—アミノー 2—[2—（4ーォクチルフエ二ノレ）ェチノレ]プロパン 1 , 3—ジォ 一ノレ（FTY720)
であり、
更に特に好適な化合物は、
(2R)— 2 ァミノ一 2 メチル 4— [ 1—メチル 5— ( 5—フエ二ルペンタノィノレ）ピ ロール 2—ィル]ブタン 1 オール、
(2R) 2 アミノー 2 メチルー 4 { 1ーメチルー 5—[5—（4 メチルフエ二ノレ）ぺ ンタノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール、 (2R) 2 アミノー 2 メチルー 4 {1ーメチルー 5—[5—（3, 4 ジメチルフエニル )ペンタノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル 4— {1—メチル 5— [5— (3 メチル 4 メトキシ フェニル）ペンタノィル]ピロ一ノレ一 2—ィル }ブタン一 1—オール、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル 4— {1—メチル 5— [5— (3 メトキシ一 4 メチル フェニル）ペンタノィル]ピロ一ノレ一 2—ィル }ブタン一 1—オール、
( 2R)— 2 アミノー 2 メチル 4— { 1—メチル 5— [ 5— (4 シァノフェニル）ペン タノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル 4 { 1 メチル 5— [4 4 メチルフエ二ノレ）ブタ ノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール、
(2R) 2 アミノー 2 メチルー 4 {1ーメチルー 5—[4一（3, 4 ジメチルフエニル )ブタノィル]ピロ一ノレ 2—ィル }ブタン 1 オール、
(2R)—2 アミノー 2 メチル 4— {1—メチル 5— [4— (3 メチル 4 メトキシ フエ二ノレ）ブタノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール、
(2R)—2 アミノー 2 メチル 4— {1—メチル 5— [4— (3 メトキシ一 4 メチル フエニル）ブタノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール及び
( 2R)— 2 アミノー 2 メチル一 4一 { 1一メチル一 5— [4一（4ーシァノフェニル）ブタ ノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール並びに、
(2R) 2 アミノー 2—[2—（4ーォクチルフエ二ノレ）ェチノレ]プロパン 1, 3 ジォ ールであり、
更に好適には、
(2R)— 2 ァミノ一 2 メチル 4— [ 1—メチル 5— ( 5—フエ二ルペンタノィノレ）ピ ロール 2—ィル]ブタン 1 オール、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル 4 { 1 メチル 5— [4 4 メチルフエ二ノレ）ブタ ノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール、
(2R) 2 アミノー 2 メチルー 4 {1ーメチルー 5—[4一（3, 4 ジメチルフエニル )ブタノィル]ピロ一ノレ 2—ィル }ブタン 1 オール、
(2R)—2 アミノー 2 メチル 4— {1—メチル 5— [4— (3 メチル 4 メトキシ フエ二ノレ）ブタノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール、
(2R)—2 アミノー 2 メチル 4— { 1—メチル 5— [4— (3 メトキシ一 4 メチル フエニル）ブタノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール及び
( 2R)— 2 ァミノ一 2 メチル 4— { 1—メチル 5— [4— (4 シァノフェニル）ブタ ノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール並びに、
(2R) 2 アミノー 2—[2—（4ーォクチルフエ二ノレ）ェチノレ]プロパン 1 , 3 ジォ 一ノレである。
[0055] 以下に一般式 (I)を有するァミノアルコール誘導体として好適な化合物の構造式を 示す。
[0056] [化 4]
Figure imgf000031_0001
¾魏^
ieZS90/.00ZdfX3d οε εεΐ9譲 ooz OAV
n [ soo]
Figure imgf000032_0001
Z£ZS90/L0QZd£/13d εεΐ9ΐο8θοζ OAV ο ™
32 PCT/JP2007/065232 化^ ¾番 構造式 化合物番号 構造式
Figure imgf000033_0001
6]
Figure imgf000034_0001
[L^] [6S00]
Figure imgf000035_0001
Z£ZS90/L00Zd£/lDd εεΐ9難 ooz OA
Figure imgf000036_0001
[0060] [化 8]
Figure imgf000037_0001
Z£ZS90/L00Zd£/13d 9ε εεΐ9ΐο/8θοζ OAV
[6^] [T 900]
Figure imgf000038_0001
ZCZS90/Z,00Zdf/X3d ZC fei9T0/800Z ΟΛ\
Figure imgf000039_0001
[0062] 上記 、 R2
Figure imgf000039_0002
R4及び ITの定義における「C 1— C6アルキル基」とは、例えば、メ チノレ基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、 2 メチルプロピル基、 3 メチルプロピル基、 2, 2, 2—トリメチルメチル基、ペンチル基又はへキシル基であ り得、好適には、メチル基、ェチル基又はプロピル基であり、更に好適には、メチル基 又はェチル基である。
[0063] 上記 R4及び R5の定義における「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素 原子又はヨウ素原子であり、好適には、フッ素原子又は塩素原子である。
[0064] 上記 R4及び R5の定義における「C1— C6アルコキシ基」とは、例えば、メトキシ基、 エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、 2 メチルプロポキシ基、 3 メチルプロポキシ基、 2, 2, 2—トリメチルメトキシ基、ペンチルォキシ基又はへキシ ルォキシ基であり、好適には、メトキシ基又はエトキシ基である。
[0065] 上記 R5の定義における、「C3— C6シクロアルキル基」とは、例えば、シクロプロピル 基、シクロブチル基、シクロペンチル基又はシクロへキシル基であり得、好適には、シ クロプロピル基又はシクロへキシル基である。
[0066] 上記 R5の定義における、「ハロゲノ C1— C6アルキル基」とは、上記 C1— C6アルキ ル基にハロゲン原子が置換した基であり、例えば、フルォロメチル基、ジフルォロメチ ノレ基、トリフルォロメチル基、フルォロェチル基、ジフルォロェチル基、トリフルォロェ チル基、フルォロプロピル基、ジフルォロプロピル基、トリフルォロプロピル基、フルォ ロブチル基、ジフルォロブチル基、トリフルォロブチル基、フルォロペンチル基、ジフ ノレォロペンチル基、トリフルォロペンチル基、フルォ口へキシル基、ジフルォ口へキシ ノレ基、トリフルォ口へキシル基、ペンタフルォロェチル基、へキサフルォロプロピル基 、ノナフルォロブチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、クロ口 ェチノレ基、ジクロロェチノレ基、トリクロロェチノレ基、クロ口プロピノレ基、ジクロロプロピノレ 基、トリクロ口プロピル基、クロロブチル基、ジクロロブチル基、トリクロロブチル基、クロ 口ペンチノレ基、ジクロロペンチノレ基、トリクロ口ペンチノレ基、クロ口へキシノレ基、ジクロロ へキシノレ基、トリクロ口へキシノレ基、ペンタクロロェチノレ基、へキサクロ口プロピノレ基、 ノナクロロブチル基であり得、好適には、フルォロメチル基、ジフルォロメチル基、トリ フルォロメチル基、フルォロェチル基、ジフルォロェチル基、トリフルォロェチル基、 フルォロプロピル基、ジフルォロプロピル基又はトリフルォロプロピル基であり、更に 好適には、トリフルォロメチル基又はトリフルォロェチル基である。
[0067] 上記 Zの定義における「C1 C8アルキレン基」とは、例えば、メチレン基、エチレン 基、プロピレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、へキサメチレン基、ヘプタメチ レン基又はオタタメチレン基であり得、好適には、炭素数 2乃至 8のアルキレン基であ り、更に好適には、エチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基、ヘプタメチレン基又 はオタタメチレン基である。
[0068] 上記 Zの定義における「フッ素原子で 2乃至 8個置換された C1— C8アルキレン基」 とは、例えば、ジフルォロメチレン基、 1 , 1ージフルォロエチレン基、 1 , 1 , 2, 2—テト ラフルォロエチレン基、 1 , 1ージフルォロプロピレン基、 1 , 1 , 2, 2—テトラフルォロ プロピレン基、 1 , 1ージフルォロテトラメチレン基、 1 , 1 , 2, 2—テトラフルォロテトラメ チレン基、 1 , 1ージフルォロペンタメチレン基又は 1 , 1 , 2, 2—テトラフルォロペンタ メチレン基であり得、好適には、 1 , 1ージフルォロプロピレン基、 1 , 1 , 2, 2—テトラフ ノレォロプロピレン基、 1 , 1ージフルォロテトラメチレン基、 1 , 1 , 2, 2—テトラフルォロ テトラメチレン基、 1 , 1ージフルォロペンタメチレン基又は 1 , 1 , 2, 2—テトラフルォロ ペンタメチレン基である。
[0069] 上記における塩とは、上記一般式 (I)を有するァミノアルコール誘導体力 塩基性 基としてアミノ基を有するため、酸と反応させることにより得られる塩であり、例えば、フ ッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸 塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩;メタンスルホン酸塩、トリ フルォロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩 、ベンゼンスルホン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩のようなァリールスルホン酸塩、 酢酸塩、リンゴ酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クェン酸塩、ァスコルビン酸塩、酒 石酸塩、シユウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；又は、グリシン塩、リジン塩、アル ギニン塩、オル二チン塩、グルタミン酸塩、ァスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩であり 得、好適には、塩酸塩、酢酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩又はマレイン酸塩である
[0070] 本発明における一般式 (I)を有するァミノアルコール誘導体及びその薬理上許容さ れる塩は、その分子内に不斉炭素原子を有する場合には、光学異性体が存在する。 一般式 (I)を有するァミノアルコール誘導体のうち不斉炭素原子を有する化合物は、 単一の式、即ち R体として示されている力 製造方法等の都合により、 S体が副生成 物として混入する場合が考えられる。従って、そのような場合には、一般式 (I)を有す るァミノアルコール誘導体は光学異性体として、主に R体を含有するものである力 一 部に S体を含有する混合物をも含むものである。
[0071] 一般式 (I)を有するァミノアルコール誘導体及びその薬理上許容される塩は、大気 中に放置したり、又は、再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、 水和物となる場合があり、そのような水和物も本発明の一般式 (I)を有するアミノアル コール誘導体の薬理上許容される塩に包含される。
[0072]
6.ヒト FN3KRP及び/またはヒト FN3Kを用いた化合物（I)のリン酸エステルの製造 方法
上記一般式（I)を有する化合物からヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kを用いて下 記一般式 (II)を有する化合物を製造することができる。 [0073] [化 10]
Figure imgf000042_0001
[0074]
Figure imgf000042_0002
R2、 R3、 R4、 R5、 X、 Y及び Zは前掲の化合物（I)と同じである。以下、一般 式 (II)で表される化合物を「化合物（II)」ともレ、う。 )
化合物（I)並びに、ヒト FN3KRP及び/またはヒト FN3Kを接触させることによって 上記化合物のリン酸エステルである化合物（II)を製造すること力 Sできる。
[0075] 化合物（II)の製造方法としては具体的には以下の方法を挙げることができるが化 合物（II)を製造できる限りにお!/、てこれらに限定されなレ、。
(1)ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3K
化合物（II)の製造に用いることができるヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kは上記 「4」の項目に記載した方法によって赤血球から取得したものを用いることができるし、 ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kを発現する細胞から取得したものを用いることも できる。ヒト FN3K及び/又はヒト FN3KRPは精製したものを用いることもできるし、 粗精製のもの、細胞抽出液そのままを用いることもできる。また、ヒト FN3KRP及び/ 又はヒト FN3Kを発現する細胞をそのまま用いることもできる。
(2) 酵素反応
本発明の製造方法は、種々の態様で実施することができる。例えば、（a)ヒト FN3K 及び/又はヒト FN3KRPを発現する細胞に化合物（I)を接触させる、 (b)ヒト FN3K 及び/又はヒト FN3KRPを発現する細胞からの抽出物と化合物（I)を接触させる、 ( c)精製又は粗精製ヒト FN3K及び/又はヒト FN3KRPと化合物（I)を接触させる等 の方法を挙げること力できる。
[0076] なお、ヒト FN3K及びヒト FN3KRPによって化合物（I)から化合物（II)を製造するに 際しては、該酵素反応が起こるような条件とするのが望ましレ、。
[0077] 酵素反応産物は酵素反応後に、酵素反応産物である化合物（II)の生成量を測定 することによって分析すること力 sできる。化合物（II)の生成量は化合物 (II)の生成を測 定できる限りにおいて特に制限はないが、例えば、反応産物を HPLCに供して、化 合物（II)のピークを測定することによって測定することができる。
[0078] また、酵素反応産物である化合物（II)は反応系より精製することができる。
[0079] 7.ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kによってリン酸化される物質のスクリーニン グ方法
以下の方法によってヒト FN3KRPまたはヒト FN3Kによってリン酸化される物質を同 定すること力 Sできる。本方法は以下の工程を含む。
1)
i)ヒト FN3KRP又はヒト FN3Kを被験物質と接触させる工程；
ii)被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
iii)被験物質をヒト FN3KRP又はヒト FN3Kと接触させない場合に測定された、被験 物質のリン酸エステルの量と上記 ii)で測定されたリン酸エステルの生成量を比較す る工程。
[0080]
2)
i)ヒト FN3KRP又はヒト FN3Kを被験物質と接触させる工程；
ii)被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
iii)被験物質をヒト FN3KRP又はヒト FN3Kと接触させない場合に測定された、被験 物質のリン酸エステルの量と上記 ii)で測定されたリン酸エステルの生成量を比較す る工程。
iv)被験物質をヒト FN3KRP又はヒト FN3Kと接触させない場合に測定された、リン 酸エステルの量と比較して、上記 ii)で測定されたリン酸エステルの量が多!/、場合に 被験物質がリン酸化されたと判定する工程。
以下、各工程を説明する。
[0081] 1)について
1) i)について
本工程で用いるヒト FN3KRP又はヒト FN3Kとしては特に制限はないが、ヒト FN3 KRP又はヒト FN3Kを発現している細胞をそのまま用いることが出来るし、これらの細 胞の破砕液、これらの細胞から粗精製したヒト FN3KRP又はヒト FN3K、精製したヒト FN3KRP又はヒト FN3Kを用いることも出来る。また、上記「4·ヒト FN3K及びヒト FN 3KRPの発現」の項に記載の方法によって取得されたものを用いることも出来る。
[0082] 被験物質としては、上記「5.リン酸化酵素によってリン酸化を受ける化合物」の項に 記載した物質を用いることができるし、その他の化合物を用いることもできる。その他 の化合物の例としては、一般式 (I)を有する化合物以外の化合物、微生物の代謝産 物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等が挙げられ る。被験物質の投与量や濃度は適宜設定するか、または例えば希釈系列を作成す るなどして複数種の投与量を設定してもよぐ個体、液体等適当な状態で投与するこ とができ、適当なバッファーに溶解したり、安定化剤等を加えたりしてもよい。培養細 胞を用いるスクリーニング方法の場合には、培地に添加して培養することができる。 培地に添加する場合には培養開始時から添加してもよいし、培養途中で添加しても 良ぐまた、添加の回数も 1回に限らない。被験物質存在下で培養する期間も適宜設 定してよいが、好ましくは 30分乃至 48時間である。哺乳動物個体に被験物質を投与 する場合は、被験物質の物性等により経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与 、皮下注射等の投与形態を使い分ける。また、投与から、検体を得るまでの時間は適 当に選択することができる。
[0083] その他、反応液には、必要に応じ、 pH調整のための緩衝液が添加され得る。
[0084] これらの材料を混合し、例えば以下に示す反応を行う。
[0085] 温度条件： 0°C〜45°C、好適には 37°C
反応液の pH : 6〜9、好適には 7. 4
反応時間： 30秒〜 24時間、好適には 3時間
反応は、例えば、 384穴アツセィプレートを用いて行うことができる。
[0086] 1) ii)について
被験物質のリン酸エステルの量を測定する方法としては例えば HPLCを用いて生成 物を分離定量する方法を挙げることができる。そのような方法としては例えば以下の 方法を挙げることが出来るがこの方法に限定されない。 カラム： YMC— Pack ODS-A A— 312 (直径 6· Omm X長さ 150mm、粒子径 5〃 m 、（株）ワイ'ェム'シー）
移動相： 40%ァセトニトリル /0. 1 %トリフルォロ酢酸
流速： lmL/分
溶出方法:イソクラティック溶出
カラム温度： 40°C
検出波長： 295nm
1) iii)について
被験物質をヒト FN3KRP又はヒト FN3Kと接触させない場合に測定された被験物 質のリン酸エステルの量は、上記 1) ii)に記載した方法と同様の方法によって測定 することが出来る。そして、ヒト FN3KRP又はヒト FN3Kと接触させた場合と接触させ ない場合の被験物質のリン酸エステルの生成量を比較することが出来る。
[0087] 2)について
2)— i)乃至 iii)について
これらの工程は上記 1) i)乃至 iii)と同様の方法によって行うことが出来る。
2)— iv) について
上記 2)— iii)による比較の結果、上記 ii)における被験物質のリン酸エステルの生成 量が iii)に比べて多い場合に被験物質力 Sリン酸化されたと判定することが出来る。
[0088] 8.リン酸化能を利用した患者の薬物代謝能を調べる方法
ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kは一般式（I)を有する化合物を生体内でリン酸 化して、一般式 (Π)を有するリン酸エステルに変換する機能を有する。
[0089] 以下の方法によって、一般式 (I)を有する薬剤の患者における代謝能を調べること が出来る。
1)ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3K遺伝子の発現量を指標とした方法
以下の工程 i)乃至 iii)を含む：
i)被験者より採取した検体より全 RNAを抽出する工程；
ii)全 RNAにおけるヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3K遺伝子の発現量を測定する 工程； iii) ii)で測定されたヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3K遺伝子の発現量と一般式（I) を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有することが確認されている検体に おける、ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3K遺伝子の発現量を比較し、被験者の一 般式 (I)を有する化合物のリン酸化能を検定する工程。
2)ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kタンパク質の発現量を指標とした方法
以下の工程 i)乃至 ii)を含む：
i)被験者より採取した検体中におけるヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kタンパク質 の発現量を該タンパク質に特異的に結合する抗体又はリガンドを用いて測定するェ 程；
ii) i)で測定されたタンパク質の発現量と、一般式 (I)を有する化合物を生体内でリン 酸化する能力を有することが確認されている検体における、ヒト FN3KRP及び/又 はヒト FN3Kタンパク質の発現量を比較し、被験者の一般式 (I)を有する化合物のリ ン酸化能を検定する工程。
3)ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kタンパク質の酵素活性を指標とした方法 i)被験者より採取した検体中におけるヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kタンパク質 の酵素活性を測定する工程；
ii) i)で測定されたタンパク質の酵素活性と、一般式 (I)を有する化合物を生体内でリ ン酸化する能力を有することが確認されている検体における、ヒト FN3KRP及び/ 又はヒト FN3Kタンパク質の酵素活性を比較し、被験者の一般式 (I)を有する化合物 のリン酸化能を検定する工程。
4)遺伝子の変異を利用した方法
i)被験者より採取した検体におけるヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3K遺伝子にお けるヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kのヌクレオチド配列を調べる工程；
ii) i)ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3K遺伝子における酵素活性に影響のあるヌク レオチド配列の変異の有無を調べる工程；
iii)ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3K遺伝子の活性を低下させるヌクレオチド配列 の変異がある被験者は一般式 (I)を有する化合物のリン酸化能が低いと判定し、ヒト F N3KRP及び/又はヒト FN3K遺伝子の活性を低下させるヌクレオチド配列の変異 カ い被験者は一般式 (I)を有する化合物のリン酸化能を有すると判定する工程。
[0091] 9.診断用キット
ヒト FN3K及び/又はヒト FN3KRPは生体内においてリン酸化されることによって 活性を有する化合物のリン酸化能を有する。したがって、以下のキットを用いることで 、被験者の薬物代謝能を調べることが出来る。該キットは具体的には以下のものであ
[0092] 下記の 1)乃至 5)からなる群から選択される少なくとも 1以上を含む薬物代謝能診断 用キット
1)配列表の配列番号 1または 3に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの 一部乃至全部を特異的に増幅するための 15から 30塩基長の連続したオリゴヌタレ ォチドプライマ一；
2)配列表の配列番号 1または 3に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、該ポリヌクレオチドを検出するための 15 ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
3)上記 1)に記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたは上記 2)に記載のポリヌクレオ チドプローブのいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料；
4)下記の a)乃至 c)から選択されるポリペプチドに特異的に結合し、該タンパク質を 検出するための抗体；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
5)上記 4)に記載の抗体に結合する二次抗体。
図面の簡単な説明 [0093] [図 1]ヒト血液中の各構成成分による化合物 1のリン酸化
[図 2]各分画における反応産物濃度
[図 3]化合物 1のリン酸化活性
[図 4] (A) FTY720のリン酸化、（B)スフインゴシンのリン酸化
実施例
[0094] 以下実施例によって本発明を説明するが本発明は実施例に限定されるものではな い。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り 、 「モレキュラークローニング（Molecular Cloning) J (Sambrook, J.,Fritsch, E.F.および Maniatis, T.著、 Cold Spring Harbor Laboratory Press刊、 1989年）、その他の実験 書に記載されている方法、及び当業者に知られている方法により行った。また、市販 の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施した。
(参考例）
(2R)—2 ァミノ一 2 メチノレ一 4— [5— (5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン一 2 ィル]ブタン 1 オールの取得
以下の実験で用いる式 (I)で示される、（2R)— 2 ァミノ 2 メチル—4— [5— ( 5 フェニルペンタノィル）チォフェン 2 ィル]ブタン 1 オール（以下、「化合物 1」ともいう。）は、例えば、国際公開第 94/08943号パンフレット、国際公開第 96/ 06068号パンフレット、国際公開第 98/45249号パンフレット、国際公開第 03/02 9184号パンフレット、国際公開第 03/029205号パンフレット、国際公開第 02/06 268号パンフレット（実施例 19)、国際公開第 03/059880号パンフレット、国際公 開第 05/005383号パンフレット、国際公開第 05/063671号パンフレット等に記 載する方法に従って製造することができる。
[0095] [化 11]
Figure imgf000048_0001
[0096] (I) (2R)—2 アミノー 2 メチノレ一 4— [5— (5 フエニルぺ
2—ィル]ブタン 1 オール（化合物 1 ) (実施例 1)ヒト全血の調製
匿名化された 2名の供血者から約 lOOmLずつ末梢血を採血し、抗凝固剤として 3. 2% (w/v)クェン酸 3ナトリウム 2水和物溶液をヒト末梢血 lOOmL当り約 l lmL添加 してヒト全血とし、常法に従って、全血から赤血球、血漿、血小板、リンパ球の各画分 に分画した。
[0097]
(実施例 2)リン酸化活性の確認及びリン酸化活性の局在
実施例 1で得た各種構成成分について化合物 1に対するリン酸化活性を測定した 。反応基質には化合物 1を使用し、反応産物である化合物 1のリン酸エステルである 、リン酸 モノ（2R)—2 アミノー 2 メチノレー 4 [5—（5 フエ二ルペンタノィノレ）チ ォフェン 2—ィル]ブチル エステル（化合物 1のリン酸エステル）の生成量を定量 することによりリン酸化活性を測定した。
[0098] [化 12]
Figure imgf000049_0001
リン酸 モノ（2R)—2 アミノー 2 メチノレー 4 [5—（5 フエ二ルペンタノィノレ）チ
Figure imgf000049_0002
1. 5mL容ポリプロピレンチューブを 13本用意し、それぞれに実施例 1で得た全血 、血漿、赤血球、血小板、またはリンパ球を、全血、血漿、赤血球、血小板、リンパ球 、赤血球 +血漿、血小板 +血漿、リンパ球 +血漿、赤血球 +血小板 +リンパ球 +血 漿、赤血球 +血小板 +リンパ球、赤血球 +血小板 +血漿、赤血球 +リンパ球 +血漿 、血小板 +リンパ球 +血漿の組み合わせで分注し氷冷した。何れのチューブの分注 量も 500 Lとし、 2種類以上の構成成分を混ぜる場合は、各々等量を混合した上で 500 しとした。即ち 2種類混合の場合は 250 Lずつ、 3種類混合の場合は 166· 7 H Lずつ、四種類混合の場合は 125 H Lずつ分注し、総分注量を 500 μしとした。各 チューブに 100mg/mL 化合物 1/ジメチルスルホキシド溶液を 0. 5 しカロえて混 合（終濃度 ΙΟΟ g/mUした後氷冷し、これを 37°Cの湯浴中で 30分間インキュべ ーシヨンした後、氷上に移した。各チューブに lmLのメタノールを加えて混合後、 HP LC測定時まで 20°Cで保存した。
[0099] 反応産物であるリン酸 モノ（2R)— 2 アミノー 2 メチルー 4 [5—（5 フエニル ペンタノィノレ）チォフェン 2—ィル]ブチル エステノレ（化合物 1のリン酸エステノレ）の 生成量は以下の装置及び条件下で測定した。
HPLC : LC- 10A システム（(株）島津製作所）
VP
カラム： YMC— Pack ODS -A A— 312 (直径 6. OmmX長さ 150mm、粒子径 5 μ ΐ ^ (株）ワイ'ェム'シー）
移動相： 40%ァセトニトリル /0. 1 %トリフルォロ酢酸
流速： lmL/分
溶出方法:イソクラティック溶出
カラム温度： 40°C
検出波長： 295nm
保持時間： 6. 7分 (化合物 1のリン酸エステル）、 11. 1分 (化合物 1)、 14. 2分（1 ナフトール、内部標準物質） 反応終了後のチューブに 10 H gZmLの 1—ナフトール/メタノール溶液を、終濃 度 2. 5 g/mLとなるように添加した後混合し、 21 , 600 X g、 3分間、 4°Cで遠心分 離した。その上清 30 Lを上記 HPLC装置にロードし、各保持時間に出現するピー クの AUC値を測定した。化合物の AUC値を内部標準物質である 1 ナフトールの A UC値で補正した後、別途作成した検量線に外揷して化合物の濃度を得た。
[0100] 測定の結果、図 1に示したように、反応系に赤血球が存在する場合に化合物 1のリ ン酸エステルの生成量が多ぐ化合物 1がリン酸化されていることが判明し、全血中の 構成成分の内、赤血球が化合物 1をリン酸化する主たる存在であることが明らかにな つた。
[0101] (実施例 3)ヒト赤血球中における化合物 1をリン酸化する酵素の局在
赤血球より常法に従って、可溶性画分と膜画分を分画した。実施例 2と同様の方法 で化合物 1のリン酸化反応を調べたところ、図 2に示すように、赤血球の可溶性画分 に強いリン酸化活性が存在することが確認され、化合物 1をリン酸化する酵素は主に 赤血球の可溶性画分に存在することが明らかになった。
(実施例 4)ヒト赤血球可溶性画分からの化合物 1をリン酸化する酵素の精製 ( 1 ) 以下の方法により、ヒト赤血球の可溶性画分から化合物 1をリン酸化する酵素を精
； ^^し/
(1)酵素活性測定方法
酵素活性測定用の検体 4511 Lに対して、それぞれ終濃度で 10011 g/mL 化合 物 、 ImM ATP, 0. 5% CHAPS及び lOOmM HEPES, pH 7· 0、総量 75 μ Lとなるように添加した。 1—デォキシ一 1—モルフォリノフルクトース（1— deoxy— 1 -morpholinofructose； DMF,シグマ社）を加える場合は終濃度で ImMとなる ように反応液に加えた。 37°Cにて 1時間保温することにより化合物 1をリン酸化した後 150 Lのメタノールを添カロし、孔径 0· 45 mのフィルターで濾過することにより反 応停止及び蛋白質除去を行った。 10 Lの濾液を逆相クロマトグラフィーカラム (TS K-gel ODS— 100S、 直径 4. 6mm X長さ 150mm、東ソ一社）に供し、流速 lm L/分、カラム温度 40°Cにおいて 0· 1 % トリフルォロ酢酸を含む 40% ァセトニトリ ルによりイソクラティック溶出した。化合物 1及び化合物 1のリン酸エステルの検出は 2 95nmで行い、ピーク面積により化合物 1のリン酸エステルの生成量を測定した。上 記条件で 1 H g/mLの化合物 1のリン酸エステルを生成する活性を lU/mLと定義 した。以降の精製過程において、化合物 1をリン酸化する酵素の活性の測定には本 測定法を使用した。
(2)ヒト赤血球可溶性画分からの化合物 1をリン酸化する酵素の精製
匿名化されたボランティア 5名から各 lOOmLずつ、計 500mL採血し、常法に従つ て調製した赤血球可溶性画分から、化合物 1のリン酸化活性を指標に、硫酸アンモ ユウム塩析、疎水性相互作用カラム（HiTrap Phenyl HP 5mL GEヘルスケア ノ ィォサイエンス社）、色素結合ァフィ二ティカラム（HiTrap Blue HP lmL GEヘル スケア バイオサイエンス社）、陰イオン交換カラム（Resource Q lmL GEヘルス ケア バイオサイエンス社）、陽イオン交換カラム（Resource S lmL GEヘルスケ ァ バイオサイエンス社）、陽イオン交換カラム（Mono S PC 1. 6/5 GEヘルス ケア バイオサイエンス社）、及びゲル濾過カラム（Superdex 75 PC 3.2/30、 GEヘル スケア ノ ィォサイエンス社）によって精製した。その結果、ヒト赤血球可溶性画分中 の化合物 1のリン酸化活性は、表 1に示した通り約 10,000倍まで濃縮された。
[0103] (表 1) 表 1 ヒト FN3K の精製表
蛋白質濃 活性回收
活性 容量 総蛋白質量 総活性 比活性 精製効
精製ステップ 度 率
[U/mL] [mL] [mg] [U] [U/mg] 率
[%] 可溶性画分 83000 3.2 50 4100 160 0.039 1.0 100
1) 硫酸アンモニゥム沈殿 9000 7.3 50 450 367 0.81 21 230
2) 疎水性相互作用カラム 170 1.7 60 10 100 10 260 63
3) 色素結合ァフィニ亍イカラム 870 5.1 4.0 3.5 20 5.9 150 13
4) 陰イオン交換カラム 210 2,1 10 2.1 21 10 260 13
5) 1 イオン交換カラム 87 2.8 4.0 0.35 11 32 820 6.9
6) 陽イオン交換カラム 10 7.1 0.20 0.0020 1.4 710 18000 0.88
7) ゲル璩過カラム 4.0 1.6 0.10 0.00040 0.16 410 10000 0.10
[0104] (実施例 5)質量分析による化合物 1をリン酸化する酵素の同定（1 )
実施例 4で得られた活性画分を SDS— PAGEに供し、 SDS— PAGEゲル上の各バン ドをゲルより切出し、常法に従い、トリプシン (モディファイドトリプシン、プロメガ社）を 加え 37°Cにて 12時間消化反応を行った。生成した消化ペプチドは液体クロマトダラ フィー（LC) /タンデム質量分析装置 (MS/MS)に供した。得られた質量スペクトル データは、データベース検索ソフトウェア（Mascot、マトリクスサイエンス社）により解 ネ丌した。ァータベースは National Center for Biotechnology Informationにより編纂さ れた GenBank nrデータベースを用いた。
[0105] その結果、化合物 1をリン酸化する酵素は、ヒト配列 fructosamine-3-kinase (FN3K 、 GenBank accession number NP— 071441 )であることが明らかになった。
[0106] (実施例 6)ヒト赤血球可溶性画分からの化合物 1をリン酸化する酵素の精製（2) ヒト FN3Kが化合物 1をリン酸化する酵素であることを確認するために、ヒト FN3Kの 競合阻害剤として知られている DMF (Biochem. J. (2000) vol. 352, ρ·835— 839)を用 いた阻害実験を行った。実施例 4における第 2精製段階の疎水性相互作用カラムの 活性分画は DMFにより顕著に阻害され、その IC 値は約 1 μ Μであった。これにより
50
、ヒト FN3Kが化合物 1をリン酸化する酵素であることが確認された。 [0107] 一方、可溶性画分及び第 1精製段階である硫酸アンモユウム沈殿を再可溶化した サンプルでは DMFによる阻害はほとんど観察されず、ヒト FN3Kとは異なる化合物 1 をリン酸化する酵素の存在もまた強く示唆された。 DMFの阻害の程度から考えて、こ の、ヒト FN3Kとは異なる酵素力 化合物 1をリン酸化する主な酵素であると推定され た。そこでこの酵素の精製を行った。
[0108] 精製にあたっては常に ImM DMF存在下、非存在下で酵素活性測定を行い、 DM Fにより阻害されない活性を指標に精製を進めた。
[0109] 実施例 4で得た硫酸アンモニゥム沈殿を陰イオン交換カラム（HiPrep Q 16/10 XL、 GEヘルスケア バイオサイエンス社）、色素結合ァフィ二ティカラム（HiTrap Blu e HP lmL)、陽イオン交換カラム（Mono S PC 1.6/5)、ゲル濾過カラム（Superde x 75 PC 3.2/30)により分画した。
[0110] 以上 5段階の精製過程を経た結果、表 2に示すように、第 2精製段階以降の酵素活 性は DMFにより阻害されず、最終的にこの精製法により化合物 1をリン酸化する酵 素の比活性は約 16 , 000倍に上昇した。
[0111] (表 2) ヒト FN3KRP の精製表 活性回収残存活性 活性 容量 総蛋白貧量総活性比活性精製効
精製ステップ 度 率 [%】
[U/mL] [mL] [mg] [U] [U/mg] 率
[%]
可溶性画分 100000 3.0 50 5200 150 0.029 1.0 100 81
1) 硫酸アンモニゥム沈殿 9100 5.0 50 460 250 0.55 19 170 89
2) 陰イオン交換カラム 640 5.5 10 6.4 55 8.7 300 36 98
3) 色素結合ァフィ二ティカラム 310 10 1.0 0.31 10 32 1100 6.6 110
4) 暘イオン交換カラム 5.0 8.5 0.20 0.00010 1.7 170058000 1.1 98
5) ゲル璩過カラム 3.0 1.4 0.10 0.00030 0.14 45016000 0.090未測定
残存活性：（1mM DMF存在下における酵素活性） ÷ (DMF非存在下における酵素活性） X 100(%)
[0112] (実施例 7)質量分析による化合物 1をリン酸化する酵素の同定 (2)
精製された活性画分を SDS— PAGEに供して得られた 33kDa付近のバンドを質量 分析にかけてこのバンドの蛋白質の同定を行った。その結果、いずれのバンドもヒト 目 [^hypothetical fructosamine Kinase— like protein (FN dKRP^ GenBankの protein databaseに Accession No. Q9HA64で登録されている。）と同一であることが確認され た。
[0113] ヒト FN3KRPの配列から予想された分子量は 35kDaと SDS— PAGEによる推定 分子量（33kDa)及びゲル濾過による推定分子量（24— 38kDa)と一致した。
[0114] 従って、本実施例により精製された化合物 1をリン酸化する酵素はヒト FN3KRPで あることが明らかになった。
(実施例 8)ヒト FN3KRP発現ベクターの構築
インビトロジェン社より購入したヒト FN3KRPの cDNAクローン（クローン ID : 335160 1)を制限酵素 Xhol及び EcoRIで処理して cDNAを取り出し、 Xhol及び EcoRIで処 理したプラスミドベクター、 pcDNA3. l ( + ) neo (インビトロジェン社）と結合した。結 合反応産物であるプラスミドで大腸菌 DH5 aを形質転換した。得られた形質転換体 を大量培養し、ヒト FN3KRPの cDNAを含む発現プラスミドベクター、 hFN3KRP/ pcDNA3. l ( + ) neoを得た。
(実施例 9)ヒト FN3K発現ベクターの構築
ゲートウェイテクノロジー（インビトロジェン社）を用いて、 GeneCopoeia社より購入し たヒト FN3Kの cDNAクローン（カタログ No. GC-W1392)から、哺乳類細胞用の発現 プラスミドベクター、 pcDNA3. 2— DESTに cDNAを移し替えた。反応後の DNA溶 液を用いて大腸菌 DH5 aを形質転換した。得られた形質転換体を大量培養し、ヒト FN3Kの cDNAを含む発現プラスミドベクター、 hFN3K/pcDNA3. 2— DESTを 得た。
[0115]
(実施例 10)ヒト FN3KRP/FN3K発現ベクターの遺伝子導入及び一過的発現細 胞からの細胞質画分の調製
ヒト FN3KRP及びヒト FN3Kが実際に化合物 1のリン酸化活性を有するか確認する 為、両遺伝子の発現ベクターを培養細胞に導入して一過的に発現させ、その細胞質 画分を調製した。
[0116] 75cm2培養フラスコ 3枚に HEK293細胞を播種し、 80%コンフルェントとなるまで 培養した。リポフエクタミンプラス試薬 (インビトロジェン社)を用いて、フラスコごとにプ ラスミド DNAなし、または の hFN3KRP/pcDNA3.1 ( + ) neo、または の hF N3K/pcDNA3. 2— DESTで遺伝子導入し、約 27時間培養した。細胞を PBSで 洗浄した後、 2. 5mLの細胞溶解液（l OOmM HEPES , pH7. 4、 80% (v/v) CelLytic— M (シグマ社）、 ImM ジチオスレィトール、 50mL当り 1個のプロテア一 ゼ阻害剤カクテル（コンプリート EDTA— free、ロシュ社））を添加し、細胞が全て剥 がれるまで 4°Cで強く振盪した。剥がれた細胞及び上清を回収し、 20, 000 X g、 15 分間、 4°Cで超遠心分離した。上清を回収し、 200 ^ Lずつ小分けして液体窒素中で 凍結し、使用時まで— 80°Cで保存した。また上清の一部を取り蛋白質濃度を測定し た。
[0117]
(実施例 1 1 )細胞質画分の化合物 1をリン酸化する活性の測定
1. 5mL容ポリプロピレンチューブに、以下の終濃度となるように各成分を添加し、 総量を 250 しとして氷上に静置した（l OOmM HEPES , pH 7. 4、 5mM 塩 化マグネシウム、 ImM ATP、 ImM ジチオスレイト一ノレ、 0. 5% CHAPS , 100 μ g mL· 化合物 1、実施例 10で得た各々の細胞質画分： 18. 2、 54. 6、 163. 8 g相当量または無添加）。これを 37°Cの湯浴中で 3時間インキュベーションした後、 氷上に移した。各チューブに 0. 5mLのメタノールを加えて混合後、 HPLC測定時ま で— 20°Cで保存した。
[0118] 実施例 2に従って化合物 1のリン酸エステルの生成量を測定した結果、図 3に示し たように、ヒト FN3KRPまたはヒト FN3Kを発現させた細胞質画分を用いた場合のみ 化合物 1のリン酸エステルの生成が見られた。以上の結果より、ヒト FN3KRP及びヒト FN3Kが実際に化合物 1をリン酸化する活性を有することが明らかとなった。
(実施例 12) FTY720及びスフインゴシンに対するリン酸化能の確認
スフインゴシンキナーゼ 1及び 2は、生体内においてスフインゴシンをスフインゴシン 1 リン酸（S 1P)に変換する酵素である力 S、 FTY720をリン酸化して FTY720リン 酸エステルを生成することが知られてレ、る
[0119] [化 13]
Figure imgf000055_0001
FTY720
[0120] [化 14]
Figure imgf000056_0001
FTY720リン酸エステル
(J Biol Chem. (2003) vol. 278, p. 47408— 47415) (FEBS Lett. ( 2003) vol. 554, p. 189— 193)。そこで逆に、ヒト FN3KRP及びヒト FN3K力 TY720またはスフインゴシンをリン酸化するか否かを検討した。
[0121] 1. 5mL容ポリプロピレンチューブを 18本用意し、それぞれに以下の終濃度となる ように各成分を添加し、総量を 250 しとして氷上に静置した（lOOmM HEPES, pH 7. 4、 5mM 塩化マグネシウム、 5mM ATP、 ImM ジチオスレイト一ノレ、 0. 5% CHAPS, ΙΟ , Μ FTY720またはスフインゴシン、実施例 10で得た各々の細 胞質画分： 91 g相当量)。これを 37°Cの湯浴中で 3時間インキュベーションした後、 氷上に移した。各チューブに 0. 5mLのメタノールを加えて混合後、 LC/MS/MS 測定時まで 20°Cで保存した。
[0122] FTY720リン酸エステルまたは S1Pの生成量を下記の LC/MS/MSシステムで 分析した。
[0123] LCシステム：
HPLC装置名：アジレント 1100シリーズ（アジレント テクノロジーズ社） オートサンプラー名： HTC PAL (CTC アナリテイクス社）
MS/MSシステム：
装置名： API4000 (アプライド バイオシステムズ/ MDS Sciex社） その結果、ヒト FN3KRP及びヒト FN3Kの両者共、 FTY720をわずかにリン酸化す る力 スフインゴシンに対するリン酸化能は有さないことが明らかとなった（図 4)。よつ てヒト FN3KRP及びヒト FN3Kは、化合物 1及び FTY720をリン酸化する酵素である ことが明らかになった。
[0124] (実施例 13)ヒト FN3KRP発現細胞質画分による化合物 1及び化合物 1の類縁体 のリン酸化反応
実施例 10で調製したヒト FN3KRP発現細胞質画分を用レ、て、以下の化合物のリン 酸化反応を行った。
(2R)—2 アミノー 2 メチノレ一 4— [5— (5 フエ二ノレペンタノィノレ）チォフェン一 2 ィル]ブタン 1 オール（化合物 1)、
2 -アミノー 2— [4— (3 ベンジルォキシフエ二ルチオ） 2—クロ口フエニル]プロピ ノレ 1 , 3—プロパンジオール（ROX— 2127)、
(2R)— 2 ァミノ一 2 メチル 4— [ 1—メチル 5— ( 5—フエ二ルペンタノィノレ）ピ ロール 2—ィル]ブタン 1 オール（化合物 2)、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル一 4一 { 1一メチル一 5— [4一 （4一メチルフエ二ノレ）ブタ ノィル]ピロ一ルー 2—ィル }ブタン 1 オール（化合物 3)、
(2R) 2 アミノー 2 メチルー 4 { 3 メチルー 5— [4一（3, 4 ジメチルフエ二 ル）ブタノィル]チォフェン 2—ィル }ブタン 1 オール（化合物 4)、
(2R)— 2 ァミノ一 2 メチル 4— { 3 メチル 5— [4— (3, 4 ジメトキシフエ二 ル）ブタノィル]チォフェン 2—ィル }ブタン 1 オール（化合物 5)、
(2R) 2 アミノー 2 メチルー 4 { 1ーメチルー 5—[4一（3, 4 ジメチルフエニル
)ブタノィル]ピロ一ノレ 2—ィル }ブタン 1ーォーノレ（化合物 6 )、
(2R)—2 ァミノ一 2 メチノレ一 4— { 3 クロ口一 5— [4— (3, 4 ジメチルフエニル
)ブタノィル]チォフェン 2 ィル }ブタン 1 オール（化合物 7)、
(2R)— 2 ァミノ一 2 メチノレ一 4— { 1 , 3 ジメチル一 5— [4— (3, 4 ジメチルフ ェニル）ブタノィル]ピロ一ノレ 2—ィル }ブタン 1ーォーノレ（化合物 8 )、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル 4— { 1—メチル 3 クロ口一 5— [4— (3, 4 ジメ トキシフエニル）ブタノィル]ピロ一ノレ 2 ィル }ブタン 1ーォーノレ（化合物 9 )、
(2R)— 2 ァミノ一 2 メチノレ一 4— { 1 , 3 ジメチル一 5— [4— (3, 4 ジメトキシフ ェニル）ブタノィル]ピロ一ノレ一 2—ィル }ブタン一 1—ォーノレ（化合物 10)、
2 -アミノー 2—メチノレー 3— (4—ヘプタノィルフエノキシ）プロパン一 1—ォーノレ（化 合物 11)、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル一 5— { 1一メチル一 5— [4一 （4一メチルフエ二ノレ）ブ タノィル]ピロ一ノレ 2—ィル }ペンタン 1 オール（化合物 12)、
(2R)— 2 アミノー 2 メチル 5— { 5— [4一（4 メチルフエニル）ブタノィル]チォ フェン 2 イノレ}ペンタン 1ーォーノレ（化合物 13)、
2 -アミノー 2 メチノレー 3— { 4— [4— (4 メチルフエ二ノレ）ブタノィノレ]フエ二ルメト キシ }プロパン 1 オール（化合物 14)、
2 アミノー 2 メチルー3—{ 2 クロロー 4 [4ー（4 メチルフエ二ノレ）ブタノィル] フエニルメトキシ}プロパン 1 オール（化合物 15)、
2一アミノー 2 メチルー 3— { 5— [4一（3, 4 ジメチルフエニル）ブタノィル]チオフ ェン一 2 ィルメトキシ}プロパン一 1—オール（化合物 16)
反応溶液： lOOmM HEPES, ρΗ 7· 4、 5mM 塩化マグネシウム、 5mM ATP、 ImM ジチオスレイト一ノレ、 0. 5% CHAPS, 0. 328mg/mL ヒト FN3K RP発現細胞質画分
反応容量： 100 し
反応基質： 100
反応条件: 37°C、3時間
反応終了後、メタノール 200 Lを加えて攪拌し、遠心分離（16, OOO X g、 10分間 、 4°C)を行い、上清 20 Lを HPLCに供して以下に示す条件で分析を行った。
HPLC装置： HP1100 (アジレント 'テクノロジーズ社）
カラム： YMC— pack ODS A— 312
カラム温度： 40°C
流速： lmL/分
移動相： 30% ァセトニトリル（0. 1 % トリフルォロ酢酸）→
90% ァセトニトリル（0· 1 % トリフルォロ酢酸）
溶出方法：グラジェント溶出を実施。初期ァセトニトリル濃度及びグラジェント勾配 は化合物により変更した。典型的な方法は、
30% ァセトニトリル（0· 1 % トリフルォロ酢酸）→
90% ァセトニトリル（0. 1 % トリフルォロ酢酸）、
グラジェント勾配： 2%ァセトニトリル/分 検出波長： 295nm 又は 254nm 又は 230nm
各化合物のリン酸化効率は、以下の式に示すようにリン酸エステル及び未反応基 質のピーク面積を用いて算出した。
[0126] リン酸化効率（％) =リン酸エステルのピーク面積/ (リン酸エステルのピーク面積 +未反応基質のピーク面積） X 100
以上の測定の結果、ヒト FN3KRPが種々の化合物をリン酸化する酵素であることが 確認された（表 3)。
[0127] (表 3) 表 3 ヒト FN3KRP によるリン酸化効率
Figure imgf000059_0001
[0128] (実施例 14)ヒト FN3K発現細胞質画分による、化合物 1及び化合物 1の類縁体のリ ン酸化反応 実施例 10で調製したヒト FN3K発現細胞質画分を用いて、以下に示す条件で実 施例 13と同じ化合物 1及び化合物 1の類縁体のリン酸化反応を行った。
[0129] 反応溶液： lOOmM HEPES, pH 7. 4、 5mM 塩化マグネシウム、
5mM ATP、 ImM ジチオスレイト一ノレ、 0. 5% CHAPS,
0. 3mg/mL ヒト FN3K発現細胞質画分
反応容量： 100 し
反応基質： 100
反応条件: 37°C、3時間
反応終了後、メタノール 200 Lを加えて攪拌し、遠心分離（16, OOO X g、 10分間 、 4°C)を行い、上清 20 しを HPLCに供して、実施例 13に示した条件で分析を行つ た。各類縁体のリン酸化効率は実施例 13に示した式を用いて算出した。
[0130] その結果、ヒト FN3Kは化合物 1及び化合物 1の類縁体をリン酸化する酵素である ことが確認された (表 4)。
[0131] (表 4)
表 4 ヒト FN3K によるリン酸化効率
Figure imgf000061_0001
[0132] (実施例 15)ラット赤血球による化合物 1及び化合物 1の類縁体のリン酸化反応
Wistar— Imamichiラット（財団法人動物繁殖研究所より購入）から実施例 1と同様 にして赤血球を調製し、以下に示す条件で実施例 13と同じ化合物 1及び化合物 1の 類縁体のリン酸化反応を行った。
[0133] 反応溶液:ラット赤血球
反応容量： 500 し
反応基質：
Figure imgf000061_0002
反応条件: 37°C、 3時間
反応終了後、メタノール lmLを加えて攪拌し、遠心分離（16, OOO X g、 5分間、 4 °C)を行った。上清を再度遠心分離し（16, OOO X g、 10分間、 4°C)、改めて得た上 清 20 しを HPLCに供して、実施例 13に示した条件で分析を行った。各類縁体のリ ン酸化効率は実施例 13に示した式を用いて算出した。
[0134] その結果、ラット赤血球は化合物 1及びその類縁体をリン酸化することが明らかにな つた (表 5)。
[0135] (表 5) 表 5 ラット赤血球によるリン酸化効率
Figure imgf000062_0001
[0136] 以上、実施例 1から実施例 15までの一連の実験により、ヒト赤血球中にはヒト FN3K RP及びヒト FN3Kが存在すること、またそれらが化合物 1、化合物 1の類縁体及び F TY720をリン酸化する酵素であることが示された。
産業上の利用可能性
[0137] 本発明により、例えば、（2R)— 2—ァミノ一 2—メチル一4— [5— (5—フエ二ルペン タノィル）チォフェン一 2—ィル]ブタン一 1一オールのような化合物を生体内でリン酸 化する酵素を明らかにすることができ、該酵素を用いた該化合物のリン酸化方法を提 供すること力 Sできた。更にまた、該酵素によってリン酸化される物質のスクリーニング 方法を提供することができた。更に、被験者の被験化合物のリン酸化能を判定する 方法を提供することができた。また、本酵素のリン酸化能を指標にして被験者の薬物 代謝能を判定する方法を提供した。

Claims

請求の範囲
[1] 下記の工程 1)乃至 3)を含む、ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kによってリン酸 化される物質のスクリーニング方法：
1)以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリペプチドと被験物質を接触させるェ 程；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2)被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
3)被験物質を上記 a)乃至 c)から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定 された、被験物質のリン酸エステルの量と上記 2)で測定されたリン酸エステルの生成 量を比較する工程。
[2] 下記の工程 1)乃至 4)を含む、ヒト FN3KRP及び/又はヒト FN3Kによってリン酸 化される物質のスクリーニング方法：
1)以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリペプチドと被験物質を接触させる 工程；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2)被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
3)被験物質を上記 a)乃至 c)から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定 された、被験物質のリン酸エステルの量と上記 2)で測定されたリン酸エステルの生成 量を比較する工程；
4)被験物質を上記 a)乃至 c)から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定 された、リン酸エステルの量と比較して、上記 2)で測定されたリン酸エステルの量が 多い場合に被験物質がリン酸化されたと判定する工程。
[3] 下記の工程 1)乃至 3)を含む、免疫抑制活性を有する物質のスクリーニング方法
1)以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリペプチドと被験物質を接触させるェ 程；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2)被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
3)被験物質を上記 a)乃至 c)から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定 された、被験物質のリン酸エステルの量と上記 2)で測定されたリン酸エステルの生成 量を比較する工程。
[4] 下記の工程 1)乃至 4)を含む、免疫抑制活性を有する物質のスクリーニング方法
1)以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリペプチドと被験物質を接触させるェ 程； a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2)被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
3)被験物質を上記 a)乃至 c)から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定 された、被験物質のリン酸エステルの量と上記 2)で測定されたリン酸エステルの生成 量を比較する工程。
4)被験物質を上記 a)乃至 c)から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定 された、リン酸エステルの量と比較して、上記 2)で測定されたリン酸エステルの量が 多い場合に被験物質が免疫抑制活性を有すると判定する工程。
被験物質が、下記一般式 (I) (式中、 R1及び R2は、水素原子である。 R3は、 C1 -C 6アルキル基又はヒドロキシメチル基である。 R4は、水素原子、ハロゲン原子又は C1 —C6アルキル基である。 R5は、水素原子、ハロゲン原子、シァノ基、 CI— C6アルキ ル基、 CI— C6アルコキシ基、 C3— C6シクロアルキル基、ハロゲノ CI— C6アルキ ル基、フエニル基及びべンジルォキシ基からなる群より選択される基で 1乃至 3個置 換されたフエニル基、ハロゲン原子又は水素原子であり、 Xは、ビニレン基（CH = C H基）、酸素原子、硫黄原子又はメチルァミノ基である。 Yは、単結合、酸素原子、硫 黄原子又はカルボニル基である。 Zは、単結合又は CI— C8アルキレン基である。 n は、 2又は 3である。）で表される化合物であることを特徴とする、請求項 1乃至 4のい ずれ力、 1項に記載のスクリーニング方法。
[化 1]
Figure imgf000067_0001
[6] 以下の工程 1)及び 2)を含む、リン酸エステルの製造方法
1)一般式 (I)を有する化合物と以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリぺプチ ドとを接触させる工程；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2) 1)における反応溶液から一般式 (I)を有する化合物のリン酸エステルを取得する 工程。
[7] 下記の工程 1)乃至 3)を含む、被験者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸エス テルを生成する能力を判定する方法
1)被験者より採取した検体より全 RNAを抽出する工程；
2)全 RNAにおける、下記の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリヌクレオチドの発 現量を測定する工程；
a)配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 6乃至 935に示されるヌクレオチド配列を 含むことからなるポリヌクレオチド
b)配列表の配列番号 3のヌクレオチド番号 27から 956に示されるヌクレオチド配列を 含むことからなるポリヌクレオチド
c)上記 a)又は b)に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリ ヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、一般式 (I)を有する化合物 を生体内でリン酸化する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； 3) 2)で測定されたポリヌクレオチドの発現量と一般式 (I)を有する化合物を生体内で リン酸化する能力を有することが確認されている検体における、該ポリヌクレオチドの 発現量を比較し、被験者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸化能を検定する工程
[8] 下記の工程 1)及び 2)を含む、患者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸エステ ルを生成する能力を判定する方法
1)被験者より採取した検体における、下記の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリ ペプチドの発現量を測定する工程；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2) 1 )で測定されたポリペプチドの発現量と一般式 (I)を有する化合物を生体内でリン 酸化する能力を有することが確認されている検体における、該ポリペプチドの発現量 を比較し、被験者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸化能を検定する工程。
[9] 下記の工程 1)及び 2)を含む、患者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸エステ ルを生成する能力を判定する方法
1)被験者より採取した検体における、下記の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリ ペプチドの酵素活性を測定する工程；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（2R)— 2— アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィノレ）チォフェン 2 ィノレ]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
2) 1 )で測定されたポリペプチドの酵素活性と一般式 (I)を有する化合物を生体内で リン酸化する能力を有することが確認されている検体における、該ポリペプチドの酵 素活性を比較し、被験者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸化能を検定する工程
[10] 下記の工程 1)乃至 3)を含む、被験者の一般式 (I)を有する化合物のリン酸エス テルを生成する能力を判定する方法
1)被験者より採取した検体における以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリヌ クレオチドのヌクレオチド配列を調べる工程；
a)配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 1乃至 1466に示されるヌクレオチド配列 を含むことからなるポリヌクレオチド
b)配列表の配列番号 3のヌクレオチド番号 1から 1781に示されるヌクレオチド配列を 含むことからなるポリヌクレオチド
c)上記 a)又は b)に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリ ヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、一般式 (I)を有する化合物 を生体内でリン酸化する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
2) 上記ポリヌクレオチドにおける酵素活性に影響のあるヌクレオチド配列の変異の 有無を調べる工程；
3)該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのリン酸化活性を低下させるヌクレオ チド配列の変異がある被験者は一般式 (I)を有する化合物のリン酸化能が低いと判 定し、該ポリペプチドのリン酸化活性を低下させるヌクレオチド配列の変異がな!/、被 験者は一般式 (I)を有する化合物のリン酸化能を有すると判定する工程。
[11] 下記の工程 1)乃至 3)を含む、以下の a)乃至 c)からなる群から選択されるポリヌク レオチドがコードするポリペプチドのリン酸化活性に影響のあるヌクレオチド配列の変 異を同定する方法。
a)配列表の配列番号 1のヌクレオチド番号 1乃至 1466に示されるヌクレオチド配列 を含むことからなるポリヌクレオチド
b)配列表の配列番号 3のヌクレオチド番号 1から 1781に示されるヌクレオチド配列を 含むことからなるポリヌクレオチド
c)上記 a)又は b)に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリ ヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、一般式 (I)を有する化合物 を生体内でリン酸化する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
1)被験者より採取した検体における上記 a)乃至 c)からなる群から選択されるポリヌク レオチドのヌクレオチド配列を調べる工程；
2)上記ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列の変異の有無を調べる工程；
3)該ポリヌクレオチド配列の変異と該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのリン 酸化活性の関連を調べ、リン酸化活性に影響のある、ポリヌクレオチド配列の変異を 同定する工程。
[12] 検体が、末梢血であることを特徴とする、請求項 7乃至 11のいずれ力、 1項に記載の 方法。
[13] 下記の 1)乃至 5)力、らなる群力 選択される少なくとも 1以上を含む薬物代謝能診断 用キット
1)配列表の配列番号 1または 3に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの 一部乃至全部を特異的に増幅するための 15から 30塩基長の連続したオリゴヌタレ ォチドプライマ一；
2)配列表の配列番号 1または 3に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、該ポリヌクレオチドを検出するための 15 ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
3)上記 1 )に記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたは上記 2)に記載のポリヌクレオ チドプローブのいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料；
4)下記の a)乃至 c)から選択されるポリペプチドに特異的に結合し、該タンパク質を検 出するための抗体；
a)配列表の配列番号 2のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド b)配列表の配列番号 4のアミノ酸番号 1乃至 309に示されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチド
c)上記 a)又は b)力 選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配歹リからなり、かつ、（2R) - 2 - アミノー 2 メチル 4 [ 5—（ 5 フエ二ルペンタノィル）チォフェン 2 ィル]ブタ ンー 1 オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
5)上記 4)に記載の抗体に結合する二次抗体。
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