WO2007139204A1 - リポ蛋白中のビタミンe類の分析方法及び分析装置 - Google Patents

リポ蛋白中のビタミンe類の分析方法及び分析装置 Download PDF

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lipoprotein
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cholesterol
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Yuji Hirowatari
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Tosoh Corporation
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Definitions

  • the present invention relates to lipoproteins (high-density lipoprotein ZHD L, low-density lipoprotein ZL D L, intermediate-type lipoprotein Z I D L, ultra-low density lipoproteins (high-density lipoprotein ZHD L, low-density lipoprotein ZL D L, intermediate-type lipoprotein Z I D L, ultra-low density lipoproteins (high-density lipoprotein ZHD L, low-density lipoprotein ZL D L, intermediate-type lipoprotein Z I D L, ultra-low density lipo
  • the present invention provides a method for determining various pathological conditions such as diabetes pathology, coronary artery disease risk, and myocardial infarction pathology, using vitamin E in lipoprotein as an index.
  • Oxidized lipoproteins have attracted attention as a risk factor for arteriosclerosis, and many studies have been conducted, but the main antioxidants contained in lipoproteins are vitamin E species (mainly human tocofenol and atcophenolate). ). Therefore, analyzing the amount of vitamin E in each lipoprotein in the blood is considered important for understanding the mechanism of arteriosclerosis. In particular, the following results have been reported in many academic studies on one of the vitamin Es, ⁇ -tocopherol, which is abundant in serum lipoproteins.
  • Vitamin E a and tocopherol
  • Vitamin E is one of the antioxidants of the cell membrane and is transported into the body via lipoproteins.
  • Vitamin E r and alpha tocopherol
  • the tocopherol / "r tocopherol ratio is high.
  • the present invention provides a method for analyzing vitamin Es in lipoproteins that can qualitatively and quantitatively determine vitamin Es by a process that has been simplified to the extent that automatic analysis is possible.
  • the first object is to provide an analyzer that can be implemented.
  • the present inventor By using vitamin E in lipoproteins as an index, we have found that various pathologies such as diabetes, coronary artery risk, and myocardial infarction can be determined.
  • the present invention made for the first object is as follows.
  • a sample containing lipoprotein is subjected to ion exchange chromatography, and the lipoprotein is separated.
  • the separated lipoprotein is reacted with a pretreatment solution containing an organic solvent and a surfactant to release vitamin Es. And then subjecting the liberated vitamin E to a reverse phase chromatograph, a method for analyzing vitamin E in lipoprotein.
  • the pretreatment liquid contains an organic solvent that becomes 10 to 50% and a surfactant that becomes 0.2 to 6.0% at the stage of reaction with lipoproteins separated by ion exchange chromatography.
  • the analysis method characterized by the above-mentioned.
  • the pretreatment liquid further includes force-pick ions that become 50 to 1550 mmo 1 / L in a step of reacting with lipoproteins separated by ion exchange chromatography. 1) or
  • Sample introduction part that collects a certain amount of sample
  • ion exchange column mouthmatograph part equipped with an ion exchange column
  • reagent mixing part that mixes part or all of the eluate from the ion exchange chromatograph part with the reagent
  • a reverse-phase chromatograph unit equipped with a reverse-phase column, a detection unit that detects the eluate from the reverse-phase chromatograph unit, and a sample collected at the sample introduction unit and an eluent for the ion-exchange chromatograph Liquid feeding section, liquid feeding section for feeding reagents, liquid feeding section for feeding liquid that is a mixture of the eluate from the ion exchange chromatography section and the reagent, and elution for reverse phase chromatography
  • An analyzer including a liquid feeding unit for feeding a liquid.
  • VL D L very low density lipoprotein
  • VLDL very low density lipoprotein
  • VL D L very low density lipoprotein
  • the atcopherol / cholesterol level in the ultra-low density lipoprotein (VLDL) is The method according to (7), in which a determination is made that there is a risk of coronary artery disease if it is lower, and a determination that there is no risk of coronary artery disease if it is not lower than the average value of healthy individuals.
  • ⁇ -tocopherol Z cholesterol level in low-density lipoprotein (LDL) is higher than the average value in healthy individuals, it is determined that the disease has a pathological condition of diabetes.
  • VL DL very low density lipoprotein
  • V L D L very low density lipoprotein
  • the a tocopherol Z cholesterol level in the very low density lipoprotein (VLDL) is The method according to (15), wherein if it is lower than the mean value, it is judged that there is a risk of coronary artery disease, and if it is not lower than the average value of healthy individuals, it is judged that there is no risk of coronary artery disease.
  • Atcopherol in blood Value of Za tocopherol ratio S if it is lower than the average value of healthy people, it is determined that it has a pathological condition of diabetes, and if not lower than the average value of healthy persons, the pathological condition of diabetes.
  • the methods (5) to (18) are carried out using any one of the methods (1) to (3) or the apparatus (4).
  • “low compared to the average value of healthy individuals” means, for example, that the measured atocopherol Z cholesterol level is 10% lower, preferably 20% lower, more preferably compared to the average value of healthy individuals. It means 30% lower, more preferably 50% lower.
  • the term “higher than the average value of healthy persons” as used herein means, for example, that the measured ⁇ tocopherol Z cholesterol level is 10% higher, preferably 20% higher than the average value of healthy persons, more preferably Means 30% higher, more preferably 50% higher.
  • the main purpose of the vitamin E concentration in each lipoprotein (a and a tocophenol) and the total vitamin E concentration in all lipoproteins is to see the antioxidant capacity of the lipoprotein. You need to see the amount of vitamin E per lipoprotein particle. We decided to convert the amount of vitamin E per lipoprotein by dividing it by the cholesterol level, which is a relatively large component in lipoproteins. The correction method for dividing by cholesterol is generally used (H aidari M et al. (2 0 0 1) supra; F eki M et al. (2 0 0 0) supra; Y olanda B et al. ) Supra). Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 shows a first example of the analyzer of the present invention.
  • FIG. 2 shows a second example of the analyzer of the present invention.
  • FIG. 3 shows a third example of the analyzer of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the configuration of the ion exchange chromatograph analyzer of Example 1.
  • Figure 5 shows the results of analyzing serum samples by ion exchange chromatography.
  • Figure 6 shows the analysis results of an HD L sample by ion exchange chromatography. Show.
  • Figure 7 shows the analysis results of the L D L sample using the ion exchange matrix.
  • Figure 8 shows the analysis results of the IDL sample using the ion exchange matrix.
  • Figure 9 shows the analysis results of the V L D L sample by ion exchange chromatography.
  • Fig. 10 shows the results of analysis of a CM sample by ion exchange chromatography.
  • FIG. 1 1 is a diagram showing a configuration of a reversed-phase chromatograph analyzer of Example 2.
  • Figure 12 shows the results of analysis of a vitamin E standard sample by reverse-phase chromatography and electrochemical detection.
  • Figure 13 shows the results of analysis of a vitamin E standard sample by reversed-phase matrix and fluorescence detection.
  • Figure 14 shows the analysis results of the HDL sample by reversed-phase matrix and electrochemical detection.
  • Figure 15 shows the analysis results of the HDL sample by reverse-phase matrix and fluorescence detection.
  • Figure 16 shows the analysis results of the L D L sample by reverse-phase chromatography and electrochemical detection.
  • Figure 17 shows the analysis results of the L D L sample by reverse phase chromatography and fluorescence detection.
  • Figure 18 shows the analysis results of the IDL sample by reverse-phase chromatography and electrochemical detection.
  • Figure 19 shows the results of IDL sample analysis by reverse phase chromatography and fluorescence detection.
  • Figure 20 shows the results of analysis of a VLDL sample by reversed-phase matrix and electrochemical detection.
  • Figure 21 shows the results of analysis of a V L D L sample by reverse phase chromatography and fluorescence detection.
  • Figure 22 shows the results of analysis of a CM sample by reverse-phase chromatography and electrochemical detection.
  • Figure 23 shows the results of analysis of a CM sample by reverse-phase chromatography and fluorescence detection.
  • Figure 24 shows the results of analysis of vitamin E in HD L by electrochemical detection.
  • Figure 25 shows the results of analysis of vitamin E in HD L by fluorescence detection.
  • Figure 26 shows the analysis result of biminin E in L D L by electrochemical detection.
  • Figure 27 shows the analysis result of vitamin E in LDL by fluorescence detection.
  • Figure 28 shows the analysis result of biminin E in IDL by electrochemical detection.
  • Figure 29 shows the analysis result of vitamin E in IDL by fluorescence detection.
  • Figure 30 shows the results of analysis of vitamin E in VL D L by electrochemical detection.
  • Figure 31 shows the analysis result of biminin E in V L D L by fluorescence detection.
  • Figure 32 shows the analysis result of vitamin E in CM by electrochemical detection.
  • Figure 33 shows the analysis result of vitamin E in CM by fluorescence detection
  • Figure 34 shows the analysis result of vitamin E in HD L by electrochemical detection.
  • Figure 35 shows the results of vitamin E analysis in HD L by fluorescence detection.
  • Fig. 36 shows the analysis result of vitamin E in L D L by electrochemical detection.
  • Figure 37 shows the analysis result of vitamin E in LDL by fluorescence detection.
  • Figure 38 shows the analysis result of vitamin E in IDL by electrochemical detection.
  • Figure 39 shows the analysis result of vitamin E in IDL by fluorescence detection.
  • Fig. 40 shows the analysis result of biminin E in V L D L by electrochemical detection.
  • Figure 41 shows the analysis result of vitamin E in V L D L by fluorescence detection.
  • Figure 42 shows the results of analysis of vitamin E in CM by electrochemical detection.
  • Fig. 4 3 shows the analysis result of bibutamine E in CM by fluorescence detection
  • Fig. 4 4 shows the photocopherol / cholesterol level in HD L
  • Fig. 4 5 shows the photocopherol / cholesterol level in LDL 4 6 indicates atcopherol / cholesterol level in IDL
  • Figure 47 shows atcopherol / cholesterol levels in VLDL.
  • Figure 48 shows the relationship between atcopherol / cholesterol levels in V L D L and V L D L cholesterol.
  • FIG 49 shows that V L D L cholesterol is not related to the arterial level in V L D L.
  • FIG. 50 shows the attokyl / cholesterol level in CM.
  • Fig. 51 shows the Atkov X-role / cholesterol level in blood.
  • Fig. 5 2 shows the level of cholesterol in HDL
  • Fig. 5 3 shows the level of cholesterol in LDL
  • Fig. 5 4 shows the level of cholesterol in IDL Cholesterol levels
  • Figure 5 5 shows ⁇ h X roll / cholesterol levels in VLDL.
  • Figure 5 6 shows h ⁇ X roll z cholesterol level and V in V L D L
  • Fig. 57 does not indicate that V L D L cholesterol is not related to the tocopheral value in V L D L.
  • Figure 58 shows the 0; Tokov X ⁇ / cholesterol level in CM.
  • Figure 59 shows the tocopherol / cholesterol level in blood.
  • Figure 60 shows a comparison of the artefact X ⁇ levels in blood.
  • Figure 61 shows a comparison of ⁇ -tocopheral levels in blood.
  • Fig. 6 2 shows the key-value X / value in blood.
  • Lipoprotein is contained in blood (serum).
  • the present invention is an analysis method applied to a blood sample, but is not limited to using blood in a narrow sense as a sample.
  • serum, plasma, a lipoprotein fraction obtained from blood or serum, or the fraction For example, it can be applied to a sample containing lipoprotein, such as a suspension obtained by concentrating and suspending in a suitable solution.
  • the vitamin E species to be analyzed in the present invention are mainly human coferol and fat copherol.
  • Both of the two chromatographic steps in the present invention are preferably carried out by packing a separating agent used in each chromatograph into a power ram.
  • the sample is first subjected to an ion exchange chromatograph to separate each lipoprotein.
  • Ion exchange chromatographs have high resolution and can accurately separate various lipoproteins.
  • the separation agent (ion exchanger) used there is superior to the cation exchanger in the separation of lipoproteins.
  • An anion separation agent (anion exchanger) is particularly suitable.
  • ion exchange chromatograph conditions such as the amount of separation agent to be used (ion exchange capacity), the composition of the eluent, the flow rate of the eluent, etc., depend on the type and amount of the sample to be analyzed. The conditions adopted and various preliminary studies will be carried out, so that each lipoprotein can be separated and appropriately determined to be recovered as a different fraction.
  • chaotropic ions As shown in the Examples, it is preferable to add chaotropic ions to the eluent used in the ion exchange chromatograph. Due to the protein denaturing action of chaotropic ions, the higher-order structure of the apoprotein on the surface of the lipoprotein particle is relaxed, and during the reaction with the pretreatment liquid described later, the lipoprotein particle is destroyed by the surfactant and the vitamins E This is because the release efficiency of can be increased.
  • chaotropic ions include perchlorate ions, urea, guanidine, and thiocyanate ions. And iodine ions.
  • the concentration of addition varies depending on the intensity of chaotropic action of each ion, but for perchlorate ions and thiocyanate ions, when mixed with the sample, it is 50 to 150 mmo 1 / L, more preferably 50 mmo 1 This is the concentration that results in ZL. If a high concentration of chaotropic ions (over 300 mmo 1 or more for perchlorate ion thiocionate) is added to the eluent, the higher-order structure of the apoprotein is completely destroyed. As a result, the structure of the lipoprotein is also broken, and there is a possibility that the separation of each lipoprotein by the ion exchange chromatography will be hindered.
  • an eluent with a different salt concentration is applied in steps or gradients, so that each lipoprotein is determined based on the difference in charge.
  • step elution or step elution collect the fraction of the elution solution, for example, for each step.
  • gradient elution for example, fractionate the eluate to a certain volume. Recover.
  • the pretreatment liquid is added at a constant volume ratio to all the collected fractions, or after selecting a fraction containing lipoproteins from the collected fractions, the pretreatment liquid is kept constant for the selected fractions. Add it at a volume ratio and react with lipoproteins.
  • the reaction between the lipoprotein and the pretreatment solution can be carried out simply by mixing the two.
  • the pretreatment liquid contains an organic solvent for dissolving vitamin E and a surfactant for breaking lipoprotein particles to release vitamin E.
  • the pretreatment solution It preferably contains chaotropic ions. Chaotropic substances, together with surfactants, denature the higher-order structure of apoproteins on the surface of lipoprotein particles by its protein denaturing action, increasing the efficiency of lipoprotein particle breakage and being included in the lipoprotein fraction.
  • the amount of pretreatment liquid mixed with the fraction containing lipoproteins may reduce detection sensitivity in the subsequent reverse-phase chromatograph if the lipoprotein fraction eluted from the ion exchange column is too diluted.
  • bubbles may be generated when the amount of the mixture is increased, so it is preferable to use 1/5 to 5 times the amount of the fraction.
  • the amount is 1/2 to 2 times.
  • chaotropic ions examples include perchlorate ions, urea, guanidine, thiocyanate ions, and iodine ions.
  • concentration varies depending on the intensity of the chaotropic action of ions, but perchlorate ions and thiocyanate ions can be reacted with lipoproteins, that is, when mixed with a fraction containing lipoproteins.
  • the concentration is 1 / L, more preferably 50 mmo 1 L.
  • the organic solvent is not particularly limited as long as it can dissolve vitamin Es, but ethanol, acetonitrile, methanol, isopropano One or more selected from the group consisting of alcohol and acetone.
  • the concentration varies depending on the type of organic solvent, but in ethanol, the concentration is 10 to 50%, more preferably 25% when mixed with a fraction containing lipoprotein.
  • the surfactant is not particularly limited as long as it is capable of releasing lipoproteins by releasing lipoproteins alone or together with chaotropic ions, but SDS (sodium dodecyl sulfate), P o 1 y (O xyetnylene) Examples thereof include one or more selected from sorbitanmono aulate (Tween 20), Triton X — 100, Brij 35, or deoxycholate.
  • the concentration varies depending on the type of surfactant, but according to the study of the present inventors, SDS is 6.9 to 20 mmol ZL (in weight%) when mixed with a fraction containing lipoprotein. 0.2 to 6.0%), preferably at a concentration of lOOmmol ZL (2.9% by weight).
  • concentration of organic solvent, surfactant, and preferably contained chaotropic ions in the pretreatment liquid is for reference only, and depends on the type of organic solvent, surfactant and chaotropic ions actually selected. Changes may be necessary. Therefore, when analyzing vitamin E according to the present invention, it is preferable to preliminarily examine the optimum range for the concentration of each component contained in the pretreatment liquid.
  • Vitamin E released from lipoproteins by reaction with the pretreatment liquid is supplied to the reverse phase chromatograph as a mixture of the lipoprotein-containing fraction and the pretreatment liquid.
  • Analysis of vitamin E itself can be performed by gas chromatography, thin layer chromatography, NMR, etc.
  • an eluent containing salt is used. Therefore, the present invention employs a reverse-phase chromatograph that can accurately analyze an analyte containing salts. in front
  • the sample mixed with the pretreatment liquid described above is subjected to reverse phase chromatography using an eluent containing an organic solvent to separate and elute vitamin E, and the eluate is detected by a detector to detect each vitamin.
  • UV absorption detection 3 ⁇ 4ff shellfish amount detection
  • fluorescence detector ante-champ electrochemical detector or quick P electrochemical detector
  • Fluorescence detector, amperometric electrochemical detector or coulometric electrochemical detection is preferred because of its sufficient detection sensitivity and ease of maintenance work such as maintenance. .
  • the sample introduction part consists of an autosampler, 2 and piping
  • the ion exchange chromatography part consists of ion exchange column 1 and piping
  • the eluate from the ion exchange chromatography part is mixed with the reagent.
  • the reagent mixing part is composed of the mixer 10 and the branch pipe 2 2 connected immediately before (upstream side), and the reverse phase chromatograph part is composed of the reverse phase column 1 3 and pipe, and the reverse phase chromatograph part
  • the detection unit that detects the eluate from the fluorescent detectors 14 and 14 It consists of trick detector 15 and piping, and the liquid feed section that feeds eluent for sample and ion exchange chromatograph is composed of eluent mixing device 3, pumps 4 and 5 for feeding, and piping.
  • the liquid feeding part for feeding the reagent is composed of a liquid feeding pump 8, and the liquid feeding part for feeding the eluent for reverse phase chromatography is composed of pumps 16 and 17 and piping.
  • the liquid mixture of the eluate and reagent from the ion exchange chromatograph is reversed by using the hexagonal switching valve 1 1 instead of using a dedicated liquid pump. It is also used as the solution pump 16 6 and Z or 17 for the phase chromatographic lysate (in the example shown in Fig. 2, the two three-way switching valves 20 and 2 1 are used to supply the reagent. Liquid feed pump 8 and eluent feed pump for reverse-phase matrix autographs 1 6 and / or 1 7 and in the example shown in Fig. 3, the hexagonal switching valve 1 1 is used to feed reagents. Liquid pumps 8 and reverse phase chromatograph eluent liquid pumps 1 '6 and Z or 1 7 combined)
  • the sample is carried into the sample introduction section while being separately held in the sample container.
  • the eluent for the ion exchange chromatograph is connected to the pump 4 or 5 through a pipe while being separately held in the eluent containers 6 and 7, and the reagent mixed with the eluate from the ion exchange chromatograph is Connected to the pump 8 while being held in the reagent container 9, and the eluent for the reverse phase chromatograph is separately connected to the pumps 16 or 17 by piping while being held in the eluents 18 and 19
  • the eluate other than that supplied to the reverse-phase chromatograph and the eluate that has been detected by the detector are discarded as a waste in a suitable waste container.
  • the sample introduction unit is not particularly limited as long as it can automatically collect a certain amount of sample from a sample container or the like carried into a predetermined place of the sample introduction unit.
  • a commonly used autosampler such as AS-8200 (trade name, manufactured by Tosohichi Co., Ltd.) can be used.
  • a device for automatically carrying the sample container into the predetermined place may be added to the sample introduction unit.
  • the ion exchange column 1 provided in the ion exchange matrix is not limited as long as it can separate each lipoprotein.
  • DEAE — NPR, DEAE— 5 PW, SP— NPR all are trade names, East Soichi Etc.
  • an anion exchange column for example, D EA E—N PR (trade name, manufactured by Tosohichi Co., Ltd.)
  • the reversed-phase column 13 provided in the reversed-phase chromatograph section is not limited as long as it can separate vitamin Es. Can be used.
  • a certain amount of time is required for one analysis by reversed-phase chromatography. As shown in the examples below, if about 40 minutes are required for a single analysis, the analysis of any lipoprotein eluted by the ion exchange kumatograph on the reverse phase column Before completion of the procedure, other lipoproteins will elute from the ion exchange chromatograph. Therefore, as the reverse phase column, use a column such as a micro column that can shorten the time required for analysis, and sequentially separate each lipoprotein fraction eluted from the ion exchange chromatograph. It is preferable to use it.
  • the reagent mixing unit may be configured so that part or all of the eluate from the ion exchange chromatograph unit can be mixed with the reagent.
  • the reagent is mixed with all of the eluate from the ion exchange chromatography matrix part, and only a part of it is collected with the switching valve 11 and sent to the reverse phase chromatograph part.
  • the reagent is mixed with a part of it.
  • the elution time of each lipoprotein from the ion exchange column can be predicted if the chromatographic conditions are constant. Therefore, the reagent is fed by the pump 8 in accordance with the expected time, and other times. During this time, liquid feeding is stopped.
  • the reagent can be mixed by simply joining the pipe through which the reagent is fed with the pipe through which the eluate from the ion-exchange chromatograph is fed.
  • the pipe B (trade name, manufactured by Tosoh Co., Ltd.) can be mixed using a mixing device, or, for example, the pipe can be passed through a pipe with a large inner diameter after merging, and the flow rate can be reduced to mix the two.
  • a pipe with irregularities on the inner wall or a pipe whose inner diameter changes may be used.
  • the detector is not limited as long as a detector capable of detecting vitamin E is used.
  • a detector capable of detecting vitamin E for example, an ultraviolet absorption detector, a mass detector, a fluorescence detector, an amperometric electrochemical detector, or a coulometric electric detector.
  • Chemical detectors can be exemplified, but the fluorescence detectors used in the above examples are amperometric electrochemical detectors because they have sufficient detection sensitivity and are easy to maintain and maintain.
  • a coulometric electrochemical detector is preferred.
  • the liquid feed section that feeds the eluent for the sample and ion exchange chromatograph uses eluents 6 and 7 with different salt concentrations, and controls the drive of the liquid feed pumps 4 and 5 with a computer etc. If the amount of liquid is controlled, It is possible to apply eluents of different composition (salt concentration) to the on-exchange column 1 in either step or gradient mode.
  • the mixing device 3 is for mixing the eluents 6 and 7.
  • DP _ 800 0 2 (trade name, manufactured by Tosohichi Co., Ltd.) or the like can be used as the liquid feed pumps 4 and 5, and the mixing device 3 is, for example, a static mixer 1C (trade name, Tosoichi Can be used.
  • a pump such as DP-8200 (trade name, manufactured by Tosoh Corporation) is used as the liquid supply part for supplying reagents and the liquid supply part for supplying eluents for reverse-phase throat Matodafura.
  • DP-8200 trade name, manufactured by Tosoh Corporation
  • the hexagonal switching valve 1 1 a solution that mixes the eluate from the ion exchange chromatograph and the reagent and the eluent for reverse phase chromatography is sent.
  • the use of three-way switching valves 20 and 2 1 can be exemplified.
  • step 1 a certain amount of sample collected by the autosampler 2 is pumped together with the eluent for ion exchange chromatography using pumps 4 and / or 5 and then ion exchange column. Use in step 1 to retain the lipoprotein in the sample in the column. Subsequently, after feeding an arbitrary amount of the same eluent, the salt concentration of the eluent supplied to the column is increased by controlling the amount of pump 4 and 5 to separate each lipoprotein retained in the column. To elute. For each eluted lipoprotein fraction, pump (8) feeds reagent (pretreatment solution) 9 and mixes.
  • the lipoprotein fraction eluted from the ion exchange column is too diluted, there is a risk that the detection sensitivity in the subsequent reverse-phase chromatograph will decrease, and the pretreatment liquid 9 will be contained in the pretreatment liquid.
  • increasing the amount of liquid sent may cause bubbles to be generated, leading to poor liquid delivery. Therefore, 15 to 5 times the amount of the eluent sent to the ion exchange column In particular, it should be 1 to 2 times the amount. Vitamin E released from lipoproteins by mixing with the pretreatment solution is then applied to the reverse phase column 13.
  • the lipoprotein fraction mixed with the pretreatment liquid is introduced into the sample loop 12 by the feed pump 8 and further switched to the hexagonal direction.
  • the valve 11 1 and switching the flow path the liquid mixture is supplied to the reverse-phase column by the pumps 16 and / or 17.
  • Sample loop 12 should be the volume of the mixture to be introduced into the reverse phase column. As shown in Fig.
  • the three-way switching valve 2 0 is operated to switch the flow path to introduce the mixture into the reverse phase column 1 3 and the three-way switching valve 2 1 is operated to switch the flow path.
  • the eluents 1 8 and / or 19 may be controlled to be discarded by switching.
  • the hexagonal switching valve 1 1 is switched from the start to the end of elution of the lipoprotein fraction from the ion exchange column. It is sufficient to control so that the mixed liquid is introduced into the reverse phase ram 13. Vitamin E that elutes from the reversed-phase column is detected by a fluorescence detector 14 and an amperometric detector 15 respectively.
  • the analyzer shown in FIGS. 1 to 3 configured as an analyzer for vitamin E class includes an apparatus for automatically carrying a sample container into a sample introduction section at a predetermined location, a computer for controlling each section, etc. If the sample is added, it is possible to automatically analyze vitamin E in the lipoprotein simply by placing the sample in a container and placing it on the loading device.
  • Tocopherol Z cholesterol was used as an index. This makes it possible to determine various pathologies such as diabetes pathology, coronary artery disease risk, and myocardial infarction pathology.
  • Example 1 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention still in detail, an Example shows one form of this invention and does not limit this invention.
  • Example 1 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention still in detail, an Example shows one form of this invention and does not limit this invention.
  • Example 1 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention still in detail, an Example shows one form of this invention and does not limit this invention.
  • Sample introduction part 2 AS — 8 0 2 0 (trade name, manufactured by Tosoh Corp.)
  • Mixing device 3 Suyutei Tsuk mixer C (trade name, manufactured by Tosoichi Co., Ltd.) Feed pumps 4 and 5; DP-8 0 2 0 (product name , Manufactured by Tosoichi Co., Ltd.)
  • Eluent A 6 50 mmo 1 / L Tris + 1 mm o 1 / LED
  • Sample introduction part 2 AS—80 0 2 (trade name, manufactured by Tosohichi Corporation) Detector 1 4; FS— 8 0 2 0 (trade name, fluorescence detector manufactured by Tosoh Corporation), excitation wavelength 2 9 8 nm, fluorescence wavelength 3 2 5 nm
  • Liquid feed pumps 1 6 and 1 7; D P— 8 0 2 0 (trade name, manufactured by Tosohichi Corporation)
  • X-1 100 and Tween 20 were investigated using ethanol, acetonitrile, and methanol as organic solvents.
  • the final concentration of SDS is 25 mm o I / h
  • the final concentration of ethanol is 12 to 5 to 35%
  • acetonitrile is 25%
  • methanol is 25%.
  • a pretreatment solution containing 10 mm o 1 ZL of ascorbic acid and 1% of phosphoric acid was added to the HD L fraction and analyzed using the apparatus, as shown in Table 2.
  • the maximum peak height was obtained under conditions of 25% acetonitrile and 25% methanol for tocopherol. From this, it was found that when SDS is used, 25% acetonitrile is the best organic solvent and 25% methanol is the most suitable organic solvent.
  • the surfactant should be Triton X—100 or Tween 20 instead of SDS, and the final concentration should be 0.5%.
  • ethanol was adjusted to a final concentration of 0% or 25%, as shown in Table 2, the effect of ethanol was not confirmed in atcophenol, but both of ethanol were in ethanol. Stronger peak heights were obtained with the addition of knoll. Therefore, when SDS is used, acetonitrile or methanol is used as the organic solvent, and when analyzing for tocopherol, Triton X—10.0 or Tween 20 is used when ethanol is used. It turns out to be effective.
  • the final concentration of ethanol is 25%
  • the final concentration of SDS is 0 to 50 mm o 1 / L
  • ascorbic acid is added to 1 O mmol ZL and phosphoric acid for the purpose of sample stabilization.
  • SDS was 5 O mmo 1 / L for both atcopherol and dioxin. The maximum peak height was obtained under the conditions.
  • SDS 50 mm The effect of adding ethanol in the case of p 1 / L was confirmed.
  • the HD L fraction contained 1 14 mm o 1 / L of sodium perchlorate derived from the eluent used in the ion exchange chromatograph, confirming the effect of sodium perchlorate. .
  • the above healthy human serum is diluted with the eluent A or B used in the ion exchange chromatograph in the apparatus of Example 1, and the final concentration of SDS is 1 when the final concentration of ethanol is 25% or 0%, respectively.
  • the pretreatment solution was added so that the final concentrations of 25 mmol ZL, ethanol and SDS were 25% and SDS 25 mm o 1 / L, respectively, and the samples were used for analysis.
  • the LDL fraction sample was examined (Table 5). Under conditions where ethanol is at a final concentration of 25%, SDS is 0 to 50 mm o 1 as the final concentration. The final concentration of SDS is 25 mm o 1 ZL, the final concentration of acetonitrile or methanol is 25%, and ascorbic acid is added to stabilize the sample. A pretreatment solution containing 10 mm o 1 ZL and 1% phosphoric acid was added to the LDL fraction and analyzed by using the instrument (LDL samples contain excess eluate derived from the eluent used in the ion exchange chromatography). Contains 1 3 2 mm o 1 / L sodium chlorate).
  • both r-tocopherol and ⁇ -tocopherol have higher SDS concentrations and higher peak heights, as shown in Table 5, when using the HD L fraction.
  • the maximum peak height was obtained under the conditions of acetonitrile of 25% final concentration and SDS of 25 mmo 1 ZL.
  • C M C h y l o m i c r o n
  • Pre-treatment solution (50% ethanol, SDS 250 mm o 1 / L, ascorbic acid 1 O mm o 1 / L, phosphoric acid 1%, ⁇ tocopherol 0. 0 4 ⁇ g / mL) 5 0 0 L was added and mixed, and the mixture was used in the apparatus of Example 2 to analyze atcopherol and ⁇ -tocopherol.
  • the fluorescence detector 14 in the apparatus of Example 2 was connected to an amperometric electrochemical detector (applied voltage 60 0 mV), and chromatograms were obtained with both detectors. The results are shown in Fig. 1 2 to 2 3 (odd numbers are chromatograms for fluorescence detection and even numbers are chromatograms for electrochemical detection).
  • Figures 1 2 and 1 3 show standard samples prepared using a solution obtained by diluting the pretreatment solution with pure water ( ⁇ tocopherol 0. OS / x gZmL atcopherol 0.1 ⁇ g ZmL, ⁇ tocopherol 0.1 As can be clearly seen, the elution of ⁇ 5 tocopherol, atcopherol, and ⁇ -tocopherol in this order gave good analytical results.
  • Figures 14 and 15 are HD L fractions
  • Figures 16 and 17 are LDL fractions
  • Figures 18 and 19 are IDL fractions
  • Figures 20 and 21 are VLDL fractions.
  • Figure 2, 2 and 23 show the chromatogram of the CM fraction.
  • CM fraction two peaks, ⁇ tocopherol and tocopherol, which are internal controls, were detected, and no fatcopherol was detected. In the other fractions, ⁇ ⁇ copherol, All peaks of were detected.
  • Table 6 shows the results of calculating the concentrations of atcopherol and atocopherol in each lipoprotein in the serum from the peak height of the fluorescence detector. For the calculation, the recovery rate in each analysis is calculated using the ⁇ 5 Tokofe Mouth added to the pretreatment liquid as an internal control, the analysis result is corrected, and the fraction is separated and diluted with the pretreatment liquid. Considered. The serum concentrations of atcopherol and hypocopherol are the sum of the concentrations of each lipoprotein fraction.
  • the following apparatus was manufactured as the analyzer of the present invention shown in FIG. 20 z L of serum (total cholesterol level 20 3 mg / d L, triglyceride 2 15 mg / d L) collected by obtaining information consent from a person with hyperlipidemia And prayed for vitamin E.
  • serum total cholesterol level 20 3 mg / d L, triglyceride 2 15 mg / d L
  • bi-amine E in each lipoprotein is not measured by a single sample introduction, but a total of five sample introductions are performed. The analysis of vitamin E in each lipoprotein.
  • Ion-exchange chromatographic column 1 Ion-exchange chromatographic column 1; DE AE— NPR (trade name, manufactured by Tosohichi Co., Ltd.), 4.6 mm IDX 3 5 mm connected in series Sample introduction part 2; AS— 8 0 2 0 (Product name, manufactured by Tosoh Corporation) Mixing device 3; Static mixer C (Product name, manufactured by Tosohichi Co., Ltd.) Feed pumps 4 and 5; DP— 8 0 2 0 (Product name, Tosohichi ( Co., Ltd.) Eluent A 6 ; 50 mmo 1 / L Tris + l mm o 1 / LED
  • Switching timing switching the flow path from OFF to ⁇ N
  • Detector 1 4; F S— 8 0 2 0 (trade name, fluorescence detector manufactured by Tosohichi Co., Ltd.), excitation wavelength 2 98 nm, fluorescence wavelength 3 2 5 nm
  • Liquid feed pumps 1 6 and 1 7; D P— 8 0 2 0 (trade name, manufactured by Tosoh Corporation)
  • Changeover valve 1 1 changes to 0% after elapse of 3 minutes after switching to 1 N
  • FIG. 24 and 25 The analysis results of the HD L elution fraction are shown in Figures 24 and 25.
  • Fig. 26 and 27 show the analysis results of Fig. 26, analysis results of the IDL elution fractions in Figs. 28 and 29, analysis results of the VLDL elution fractions in Figs. 30 and 31, and the CM elution fraction.
  • the analysis results are shown in Figs. In each figure, even numbers are chromatograms for electrochemical detection, and odd numbers are chromatograms for fluorescence detection. As is clear from each figure, atcopherol and ⁇ -tocopherol were well detected in each lipoprotein fraction.
  • Example 6 Example 6
  • the analysis was performed with the same apparatus and method as in Example 5 except that the composition of the pretreatment solution was 50 mm ⁇ 1 sodium perchlorate + 1% Triton X— 1 0 0 + 7 5% ethanol. .
  • the analysis results of the HD L elution fraction are shown in Figs. 34 and 35, the analysis result of the LDL elution fraction is shown in Figs. 36 and 37, and the analysis result of the IDL elution fraction is shown in Figs.
  • the analysis results of the elution fraction are shown in FIGS. 40 and 41, and the analysis results of the CM elution fraction are shown in FIGS. 42 and 43.
  • even numbers are chromatograms for electrochemical detection, and odd numbers are chromatograms for fluorescence detection.
  • atcopherol and tocopherol were well detected in each lipoprotein fraction.
  • Oxidized lipoprotein is attracting attention as a risk factor for arteriosclerosis.
  • the main antioxidant contained in lipoproteins is vitamin E (mainly tocofenol and atcophenol)
  • vitamin E mainly tocofenol and atcophenol
  • the analysis method of the present invention Since it is possible to analyze the amount of vitamin E in each lipoprotein in the blood, it is possible to obtain important knowledge for understanding the mechanism of arteriosclerosis. If the relationship between arteriosclerosis and vitamin E in lipoprotein is clarified, the analysis method of the present invention is suitable for diagnosing arteriosclerosis and monitoring therapeutic effects. It is appropriate.
  • the analyzer of the present invention can automatically analyze vitamin Es and the like in a short time, and therefore, since it is an automatic analysis, it is less likely to cause errors. .
  • the separated lipoproteins are reacted with a pretreatment solution containing an organic solvent and a surfactant to release vitamin Es and then released.
  • the configuration in which vitamin E is provided to the reverse phase chromatograph is that, in the prior art, after separating each lipoprotein, the vitamin E is extracted, concentrated to dryness, re-dissolved, and used for the reverse phase chromatograph.
  • the configuration itself is simple and has a feature that it is less likely to cause an error.
  • the conventional technology has a complicated and error-prone manual process that involves manually extracting vitamin Es for each separated lipoprotein fraction, concentrating to dryness, and re-dissolving. This is because, in the present invention, this step is replaced by a simple step in which a pretreatment liquid prepared in advance is added and mixed and reacted in the present invention.
  • the separation agent used in the ion exchange chromatograph and the reverse-phase kumatograph can be packed into the column, and the extraction of Biminin E can be carried out.
  • the process of mixing the pretreatment liquid with the eluate in the ion exchange chromatograph is automatically performed in the process of supplying the eluate from the ion exchange chromatograph to the reverse-phase chromatograph. It is also possible to do.
  • the analysis method of the present invention provides a sample introduction unit for collecting a certain amount of sample, an ion Ion exchange chromatograph unit with exchange column, reagent mixture unit to mix part or all of the eluate from the ion exchange chromatograph unit with reagent, reverse phase chromatograph unit with reverse phase column, reverse phase chromatograph unit A detection unit that detects the eluate from the sample, a liquid supply unit that supplies the sample collected at the sample introduction unit and the eluent for the ion exchange chromatography, a liquid supply unit that supplies the reagent, and an ion exchange chromatography.
  • An analyzer equipped with a liquid feeding section for feeding a liquid in which the eluate from the graph section and the reagent are mixed, and a liquid feeding section for feeding an eluent for reverse phase chromatography are easily provided. Automation can reduce the time and labor required for analysis.
  • T tocopherol Serum HDL, LDL, IDL, VLDL, Chylomicron in 7 healthy subjects (Healthy), 20 diabetics (Diabetes), 17 myocardial infarction patients (AMI) And T tocopherol were measured by the method described in Example 3. In addition, the cholesterol of each lipoprotein was measured separately by the ion exchange matrix method (Hirowatari Y et al., JL ipid Res, 44, pl 40 4 (2 0 0 3)). The ⁇ and the photocopherol were calculated.
  • the total vitamin ⁇ concentration ( ⁇ and atcopherol concentration) in all lipoproteins in blood was calculated by adding and in all lipoproteins. Separately, the cholesterol of each lipoprotein was measured and summed to calculate cholesterol in blood, and percopherol per cholesterol was calculated. The results are shown in the figure and table. The bars and squares in the figure are the center value (50 percent tile value) according to non-parametric statistics and 2 5-7 Indicates the 5th percentile value (IQR).
  • Atcopherol cholesterol values in HD L are shown in Figure 44 and Table 8.
  • Diabetes (mean value 1.2 3 mm o 1 / mo 1), myocardial infarction (mean value 1.OO mm ol / mol), healthy subjects (mean value 1.20 mm ol / mo 1), equivalent values
  • myocardial infarction 0.5 mm o 1 Zm o 1 or less, which was clearly lower than that of healthy subjects.
  • the lower level of patients compared to healthy individuals may indicate that oxystress has degraded atcopherol in HDL.
  • the criteria for determining whether there is a significant difference are Welch's t-test (t-test for two samples with non-uniform variance) using the values of healthy individuals and the values of each patient, and the p-value is 0. 0 If it was less than 5, it was judged that there was a significant difference, and if it was more than that, it was judged that there was no significant difference (hereinafter the same).
  • VLDL cholesterol The relationship with VLDL cholesterol is shown in FIG.
  • myocardial infarction which is a coronary artery disease
  • the distribution is broader than that of healthy individuals, but the distribution is broader than that of healthy people.
  • the 25th percentile (1.31 mm o 1 / mo 1) of patients with myocardial infarction was low.
  • VL DL cholesterol H ubert HB et al., Am JE pidemiol 1 2 5 p 8 1 2 (1 9 8 7)
  • VLDL DL cholesterol H ubert HB et al., Am JE pidemiol 1 2 5 p 8 1 2 (1 9 8 7)
  • VLDL cholesterol tends to be high, and that not only myocardial infarction patients but also diabetics and healthy individuals, the level of atcopherol Z cholesterol in VL DL decreases sharply.
  • VLDL cholesterol and atcopherol levels in VLDL There was no relationship between VLDL cholesterol and atcopherol levels in VLDL ( Figure 49). Those with a tocopherol cholesterol level of 3 mm o 1 / mo 1 or less in the VLDL of healthy subjects have a high VLDL cholesterol level of 9 mg Zd L or higher, and have a high risk of myocardial infarction. Met. Based on this result, it is speculated that there are some healthy people who are at high risk for myocardial infarction.
  • the level of atcopherol cholesterol in VL DL can accurately determine the risk of coronary artery disease when the level of VLDL cholesterol is relatively low.
  • the measured value in glycouria which is a pathological condition known to be a high risk of arteriosclerotic diseases such as coronary artery disease, was lower than that in healthy subjects, It can be said that the risk of coronary artery disease can be judged by the tocopherol / cholesterol level.
  • Fig. 52 and Table 9 show the tocopherol / cholesterol levels (alpha tocopherol per cholesterol) in HD L.
  • the tocopherol Z cholesterol levels in L D L are shown in FIG. 53 and Table 9.
  • the pathological condition related to oxidative stress of diabetes can be determined by observing the value of 0! Tocopherol cholesterol in LDL.
  • the 25th percentile value of 13.7 mm o 1 / mo 1 in patients with myocardial infarction was lower than the 25 percentile value of 15.7 mmo 1 Z mo 1 in healthy individuals.
  • the 25th percentile value of healthy people is lower than 15.7 mm o 1 / mo 1
  • the value of myocardial infarction patients may have advanced degradation of human copherols in IDL due to oxidative stress.
  • VLDL cholesterol Hubert HB et al. (1 9 8 7) supra
  • VLDL cholesterol has been clarified as a risk factor for coronary artery disease, and the relationship between this VLDL cholesterol and ⁇ -tocopherol Z cholesterol level in VLDL. -Investigate the relationship.
  • VLDL cholesterol tends to be high, it can be seen that not only myocardial infarction patients, but also diabetics and healthy people, the atocopherol / cholesterol level in VLDL is rapidly decreasing. There was no relationship between VL DL cholesterol and ⁇ -tocopherol levels in VLDL (Fig. 57). And if the healthy person has a tocopherol / cholesterol level in VLDL of 7 mm o 1 Zm o 1 or less, the VL DL cholesterol level is as high as 15 mg Z d L or more, and the risk of myocardial infarction is high. It became clear that he was a high person.
  • the tocopherol Z cholesterol level in VLDL can accurately determine the risk of coronary artery disease at a lower level than VL DL cholesterol.
  • the measured value in diabetes a condition known to be a high risk of arteriosclerotic diseases such as coronary artery disease, was lower than that in healthy subjects, alpha in VLDL It can be said that the risk of coronary artery disease can be determined by the tocopherol ⁇ cholesterol level.
  • Atcopherol has a phenomenon that it is susceptible to decomposition by radicals generated by oxidative stress.
  • atcopherol are similarly absorbed from the small intestine and are transported to the liver or part of the peripheral cells via chylomicron, and in the liver, a certain amount of and atcopherol is absorbed by the vitamin ⁇ transport protein. It is known that when contained in VL DL particles and released into the blood, it is transported to peripheral cells in the body. same It is presumed that the ratio of blood and atcopherol absorbed in the small intestine and released from the liver by the same mechanism is almost constant.
  • Atcopherol was calculated as the ratio of ⁇ tocopherol, it was considered to be an excellent index that reflects the pathophysiology related to oxidative stress in diabetes.
  • the results are shown in Fig. 62 and Table 10.

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Abstract

リポ蛋白を含む試料をイオン交換クロマトグラフに供してリポ蛋白を分離し、分離したリポ蛋白を有機溶媒及び界面活性剤を含む前処理液と反応させてビタミンＥ類を遊離させ、次いで遊離したビタミンＥ類を逆相クロマトグラフに供することを特徴とするリポ蛋白中のビタミンＥ類の分析方法、並びにリポ蛋白中のビタミンＥ類を指標とする糖尿病の病態、冠動脈疾患のリスク、心筋梗塞の病態といった各種病態の判定方法。

Description

リポ蛋白中のビ夕ミン E類の分析方法及び分析装置
技術分野 . 本発明は、 試料中に含まれるリポ蛋白 （高比重リポ蛋白 ZHD L 、 低比重リポ蛋白 ZL D L、 中間型リポ蛋白 Z I D L、 超低比重リ 明
ポ蛋白 ZV L D L、 カイロマイクロン/ C Mなど） の中に含まれる a トコフエ口一ルゃァ トコフエロ田ール等のビタミン E類の分析方法 と、 かかる分析に使用することのできる分析装置に関するものであ る。 さ らに本発明は、 リポ蛋白中のビタミン E類を指標とする糖尿 病の病態、 冠動脈疾患のリスク、 心筋梗塞の病態といった各種病態 の判定方法を提供する。
背景技術
動脈硬化の危険因子として、 酸化したリポ蛋白が注目を浴び、 多 くの研究がなされているが、 リポ蛋白に含まれる主要な抗酸化物質 は、 ビタミン E類 （主としてひ トコフエノールとア トコフエノ一ル ) である。 従って、 血液中にある各リポ蛋白中のビタミン E類の量 を分析することは、 動脈硬化のメカニズムを理解するうえで重要で あると考えられる。 特に血清リポ蛋白中に多量に含まれるビタミン E類の一つ、 α トコフエロールについては、 多くの学術研究におい て、 下記の結果が報告されている。
(1) H a i d a r i Mら、 C l i n C h e m、 4 7、 p l 2 3 4 ( 2 0 0 1 ) ； 健常人に比べ冠動脈疾患患者は、 L D L中の a ト コフエロールノコレステロールが低値となる。
(2) F e k i Mら、 C I i n C h e m、 4 6、 p l 4 0 1 ( 2 0 0 0 ) ； 健常人に比べ冠動脈疾患患者は、 L D L中の トコフエ ロールノコレステロールが低値となる。
また、 糖尿病患者の血液中では、 活性酸素 （ラジカル） が多く発 生し、 酸化ストレスが上昇し、 細胞を攻撃することにより種々の合 併症が発生すると考えられている （B e i s s w e n g e r P J ら、 D i a b e t e s , 5 4、 p 3 2 7 4 ( 2 0 0 5 ) ) 。 この酸 化ス トレスは血管の炎症の原因の 1つであり、 動脈硬化進展のメカ 二ズムの 1つでもある （R e n a r d Cら、 D i a b e t e s M e t a b、 3 2、 p 1 5 ( 2 0 0 5 ) ) 。 ビタミン E (ァおよび ひ トコフエロール） は、 細胞膜の持つ抗酸化物質の 1つであり、 体 内にリポ蛋白を介して輸送される。 また、 ビタミン E ( rおよび α トコフエロール） は、 リポ蛋白の持つ重要な抗酸化物質でもある。 血液中の各リポ蛋白に含まれるビタミン Eと疾患に関する知見は 少ないが、 上記以外にも下記の結果が報告されている。
(3) Y o 1 a n d a Bら、 A r t e r i o s c l e r T h r o m b V a s e B i o l 、 1 7、 p 1 2 7 ( 1 9 9 7 ) ； 健常人 に比べ高脂血症患者は、 L D L中の a トコフエロール/コレステロ —ルが高値となる。
また、 血液中のビ夕ミン Eと糖尿病や冠動脈疾患などとに関する 知見も多くはないが、 下記の結果が報告されている。
(4) S a l o n e n J Tら、 BM J、 3 1 1、 p 1 1 2 4 ( 1 9
9 5 ) ； 健常人に比べ糖尿病患者は、 ひ トコフエロール/コレステ ロールが低値となる。
(5) R e u n a n e n Aら、 E u r J C l i n N u t r、 5 2 ( 2 ) 、 p 8 9 ( 1 9 9 8 ) ; α トコフエロールが低下すると 、 糖尿病を発症するリスクが高くなる。
(6) S o b c z a k Aら、 J c h r om a r o g r , 7 3 0、 p 2 6 5 ( 1 9 9 9 ) ； 健常人に比べ糖尿病患者は、 αおよびア ト コフエロールが高くなる。
(7) M a y e r — D a v i s E J ら、 D i a b e t e s C a r e、 2 5、 p 2 1 7 2 ( 2 0 0 2 ) ； 糖尿病患者は糖尿病を呈しな い患者に比べ、 ひ トコフエロールが低値となる。
(8) O h r V a 1 1 Mら、 J I n t e r n . M e d、 2 3 9 、 p i l l ( 1 9 9 6 ) ； 健常人に比べ冠動脈疾患患者は、 ァ トコ フエロールが低値となるが、 α トコフエロールに有意な変化はない
。 また、 トコフエロール/" r トコフエロール比が高値となる。
これ以外のリポ蛋白中のビタミン E類についての報告はまだない 力 S、 他のリポ蛋白にもビタミン E類は含まれていることから、 各リ ポ蛋白のビタミン E類の量を総合的に検討することによって、 動脈 '硬化や糖尿病の原因や対処に関する研究が進展する可能性がある。
リポ蛋白中のビタミン E類の従来の分析は、 各リポ蛋白を分離後 、 ビタミン E類をへキサンで抽出し、 抽出溶液を乾固して濃縮し、 メタノール等により再溶解して逆相クロマトグラフに供する方法が 知られている （H a i d a r i Mら、 C l i n C h e m、 4 7
、 ρ 1 2 3 4 ( 2 0 0 1 ) F e k i Mら、 C l i n C h e m
、 4 6、 ρ 1 4 0 1 ( 2 0 0 0 ) ； Y o 1 a n d a Bら、 A r t e r i o s c l e r o s i s T h r o mb o s i s a n d V a s c u 1 a r B i o 1 o g y 1 7 、 p 1 2 7 ( 1 9 9 7 ) ；
T e i s s i e r E ら、 C 1 i n i c a 1 C h e m i s t r y
4 2、 p 4 3 0 ( 1 9 9 6 ) ) o 各リポ蛋白の分離については、 超遠心分離による方法 (H a i d a r i Mら （ 2 0 0 1 ) 前掲 ；
F e k i Mら （ 2 0 0 0 ) 前掲 ； Y o l a n d a Bら （ 1 9 9
7 ) 前掲 ； T e i s s i e r Eら ( 1 9 9 6 ) 前掲） ） 、 ァクリ ルアミ ド電気泳動による方法、 ゲルろ過クロマトグラフによる方法 、 イオン交換クロマトグラフによる方法 （H i r o w a t a r i Yら， J . L i p i d R e s e a r c h 4 4 , p 1 4 0 4 ( 2 0 0 3 ) ； H i r o w a t a r i Yら， A n a l . B i o c h e m. 3 0 8 , p 3 3 6 ( 2 0 0 2 ) ) が知られている。
各リポ蛋白の分離については、 溶離液の組成や分離条件を変える ことで電荷の僅かな差を利用して各リポ蛋白を良好に分離可能なィ オン交換ク口マトダラフが提案されている （H i r o w a t a r i
Yら （ 2 0 0 3 ) 前掲） 。 しかしながら、 各リポ蛋白中のビタミ ン E類の分析は、 前述のように、 各リポ蛋白を分離した後、 ビタミ ン E類を抽出し、 乾固濃縮し、 再溶解し、 そして逆相クロマトダラ フに供するという複雑な工程を要しており、 誤差を生じやすいうえ にその実施は労力と時間を要するものであった。 また、 酸化ス トレ スとその病態とが密接に関連する糖尿病、 冠動脈疾患などの動脈硬 化性疾患では、 各リポ蛋白中および血液中のビタミン Eの変動を測 定し、 それらの病態の判定方法の 1つとして用いることが重要であ るものの、 各リポ蛋白中のビタミン Eの測定は超遠心分離法を用い る方法しかなく、 高価な装置が必要で操作が煩雑で研究が進んでい ない。 さらに、 血液中全体のビタミン Eについても、 有機溶媒によ る抽出が必要で、 操作が煩雑であり、 糖尿病患者の評価結果が研究 者によって異なっている。 発明の開示
そこで本発明は、 自動分析化が可能な程度にまで簡素化した工程 によってビタミン E類を定性し定量できる、 リポ蛋白中のビタミン E類の分析方法を提供するとともに、 その分析方法を自動的に実施 し得る分析装置を提供することを第一の目的とするものである。 さ らにはそのような分析方法や分析装置を利用した結果、 本発明者は リポ蛋白中のビタミン E類を指標とすることで、 糖尿病の病態、 冠 動脈疾患のリスク、 心筋梗塞の病態といった各種病態を判定できる ことを見出すに至った。
上記第一の目的のためになされた本発明は、 以下のとおりである
( 1 ) リポ蛋白を含む試料をイオン交換ク口マトグラフに供してリ ポ蛋白を分離し、 分離したリポ蛋白を有機溶媒及び界面活性剤を含 む前処理液と反応させてビタミン E類を遊離させ、 次いで遊離した ビタミン E類を逆相クロマトグラフに供することを特徴とするリポ 蛋白中のビタミン E類の分析方法。
( 2 ) 前記前処理液は、 イオン交換クロマトグラフで分離したリポ 蛋白と反応させる段階で 1 0から 5 0 %となる有機溶媒と 0 . 2か ら 6 . 0 %となる界面活性剤を含むものであることを特徴とする （ 1 ) の分析方法。
( 3 ) 前記前処理液は、 更にイオン交換クロマトグラフで分離した リポ蛋白と反応させる段階で 5 0から 1 5 0 m m o 1 / Lとなる力 オト口ピックイオンを含むものであることを特徴とする （ 1 ) 又は
( 2 ) の分析方法。
( 4 ) 一定量の試料を採取する試料導入部、 イオン交換カラムを備 えるイオン交換ク口マトグラフ部、 イオン交換クロマトグラフ部か らの溶出液の一部又は全部を試薬と混合する試薬混合部、 逆相カラ ムを備える逆相クロマ トグラフ部、 逆相クロマトグラフ部からの溶 出液について検出を行う検出部、 及び、 試料導入部で採取した試料 及びイオン交換クロマ トグラフ用の溶離液を送液する送液部、 試薬 を送液する送液部、 イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液と試 薬とが混合された液を送液する送液部、 及び、 逆相クロマトグラフ 用の溶離液を送液する送液部を備える分析装置。 また我々は、 上記分析方法や分析装置を利用し、 酸化ストレスと の関連性が高い疾患である糖尿病 2 0例および心筋梗塞 1 7例、 対 象として健常人 2 0例の血清を測定した結果、 以下のとおりの ト コフエロールノコレステロ一ルを指標とする糖尿病の病態、 冠動脈 疾患のリスク、 心筋梗塞の病態といった各種病態を判定する方法を 見出すに至った。
( 5 ) 超低比重型リポ蛋白 （VL D L) 中のア トコフエロール/コ レステロール値を用いる糖尿病の病態の判定方法。
( 6 ) 超低比重型リポ蛋白 （V L D L) 中の r トコフエロール/コ レステロール値が、 健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態 を有すると判定し、 健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の 病態を有しないと判定する、 （ 5 ) の方法。
( 7 ) 超低比重型リポ蛋白 （VL D L) 中のァ 卜コフエロール/コ レステロール値を用いる冠動脈疾患のリスクの判定方法。
( 8 ) 超低比重型リポ蛋白 （V L D L) コレステロール値が健常人 の平均値に比べ低い場合において、 超低比重型リポ蛋白 （V L D L ) 中のア トコフエロール/コレステロール値が、 健常人の平均値に 比べ低い場合は冠動脈疾患のリスクを有すると判定し、 健常人の平 均値に比べ低くない場合は冠動脈疾患のリスクを有しないと判定す る、 （ 7 ) の方法。
( 9 ) 低比重型リポ蛋白 （L D L) 中のひ トコフエロール/コレス テロール値を用いる糖尿病の病態の判定方法。
( 1 0 ) 低比重型リポ蛋白 （L D L) 中の α トコフエロール Zコレ ステ.ロール値が、 健常人の平均値に比べ高い場合は糖尿病の病態を 有すると判定し、 健常人の平均値に比べ高くない場合は糖尿病の病 態を有しないと判定する、 （ 9 ) の方法。
(1 1 )低比重型リポ蛋白 （L D L) 中の トコフエロール/コレス テロール値を用いる心筋梗塞の病態の判定方法。
(1 2 )低比重型リポ蛋白 （L D L) 中のひ トコフエロール/コレス テロール値が、 健常人の平均値に比べ高い場合は心筋梗塞の病態を 有すると判定し、 健常人の平均値に比べ高くない場合は心筋梗塞の 病態を有しないと判定する、 （1 1 )の方法。
( 1 3 )超低比重型リポ蛋白 （V L D L) 中の トコフェロールノコ レステロール値を用いる糖尿病の病態の判定方法。
( 1 4 )超低比重型リポ蛋白 （VL D L) 中の α トコフエロール コ レステロール値が、 健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態 を有すると判定し、 健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の 病態を有しないと判定する、 （1 3 )の方法。
(1 5 )超低比重型リポ蛋白 （V L D L) 中のひ トコフエロール Zコ レステロール値を用いる冠動脈疾患のリスクの判定方法。
( 1 6 )超低比重型リポ蛋白 （V L D L) コレステロール値が健常人 の平均値に比べ低い場合において、 超低比重型リポ蛋白 （V L D L ) 中の aトコフエロール Zコレステロール値が、 健常人の平均値に 比べ低い場合は冠動脈疾患のリスクを有すると判定し、 健常人の平 均値に比べ低くない場合は冠動脈疾患のリスクを有しないと判定す る、 （1 5 )の方法。
(1 7 )血液中のァ トコフエロール / aトコフエ口一ル比を用いる糖 尿病の病態の判定方法。
(1 8〉血液中のァ トコフエロール Zaトコフエロール比の値力 S、 健 常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有すると判定し、 健 常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の病態を有しないと判定 する、 （1 7 )の方法。
好ましくは、 上記 （ 5 ) 〜 （ 1 8 ) の方法は、 上記 （ 1 ) 〜 （ 3 ) のいずれかの方法又は上記 （ 4) の装置を用い、 行われる。 ここでいう、 「健常人の平均値に比べ低い」 とは、 例えば測定し た aトコフエロール Zコレステロール値が健常人の平均値に比べ、 1 0 %低い、 好ましくは 2 0 %低い、 より好ましくは 3 0 %低い、 尚より好ましくは 5 0 %低いことを意味する。
また、 ここでいう、 「健常人の平均値に比べ高い」 とは、 例えば 測定した《 トコフエロール Zコレステロール値が健常人の平均値に 比べ、 1 0 %高い、 好ましくは 2 0 %高い、 より好ましくは 3 0 % 高い、 尚より好ましくは 5 0 %高いことを意味する。
なお、 各リポ蛋白中のビタミン E濃度 （ァおよび a トコフエノ一 ル） およびすベてのリポ蛋白中の総ビタミン E濃度は、 そのリポ蛋 白の抗酸化能力を見ることが主たる目的であるので、 リポ蛋白の粒 子当りのビタミン Eの量を見る必要がある。 我々は、 リポ蛋白にお ける比較的量の多い含有成分であるコレステロール値により割るこ とで、 リポ蛋白当りのビタミン E量を換算することにした。 なお、 コレステロールにより割る補正方法は、 一般的に用いられている （ H a i d a r i Mら （ 2 0 0 1 ) 前掲 ； F e k i Mら （ 2 0 0 0 ) 前掲 ； Y o l a n d a Bら （ 1 9 9 7 ) 前掲） 。 図面の簡単な説明
図 1 は本発明の分析装置の第一の例を示す。
図 2は本発明の分析装置の第二の例を示す。
図 3は本発明の分析装置の第三の例を示す。
図 4は実施例 1 のイオン交換クロマトグラフの分析装置の構成を 示す図。
図 5はイオン交換クロマトグラフによる血清試料の分析結果を示 す。
図 6はイオン交換クロマトグラフによる HD L試料の分析結果を 示す。
図 7はィオン交換ク口マトグラフによる L D L試料の分析結果を 示す。
図 8はィオン交換ク口マ トグラフによる I D L試料の分析結果を 示す。
図 9はイオン交換クロマトグラフによる V L D L試料の分析結果 を示す。
図 1 0はイオン交換クロマトグラフによる C M試料の分析結果を 示す。
図 1 1 は実施例 2の逆相クロマトグラフの分析装置の構成を示す 図。
図 1 2は逆相クロマトグラフおよび電気化学検出によるビタミン E標準試料の分析結果を示す。
図 1 3は逆相ク口マトグラフおよび蛍光検出によるビタミン E標 準試料の分析結果を示す。 '
図 1 4は逆相ク口マトグラフおよび電気化学検出による H D L試 料の分析結果を示す。
図 1 5は逆相ク口マトグラフおよび蛍光検出による H D L試料の 分析結果を示す。
図 1 6は逆相クロマトグラフおよび電気化学検出による L D L試 料の分析結果を示す。
図 1 7 は逆相クロマトグラフおよび蛍光検出による L D L試料の 分析結果を示す。
図 1 8 は逆相クロマトグラフおよび電気化学検出による I D L試 料の分析結果を示す。
図 1 9 は逆相クロマトグラフおよび蛍光検出による I D L試料の 分析結果を示す。 図 2 0は逆相ク口マトグラフおよび電気化学検出による V L D L 試料の分析結果を示す。
図 2 1は逆相クロマトグラフおよび蛍光検出による V L D L試料 の分析結果を示す。
図 2 2は逆相クロマトグラフおよび電気化学検出による C M試料 の分析結果を示す。
図 2 3は逆相クロマトグラフおよび蛍光検出による C M試料の分 析結果を示す。
図 2 4は電気化学検出による HD Lの中のビタミン Eの分析結果 を示す。
図 2 5は蛍光検出による HD Lの中のビタミン Eの分析結果を示 す。
図 2 6は電気化学検出による L D Lの中のビ夕ミン Eの分析結果 を示す。
図 2 7は蛍光検出による L D Lの中のビタミ ン Eの分析結果を示 す。
図 2 8は電気化学検出による I D Lの中のビ夕ミン Eの分析結果 を示す。
図 2 9は蛍光検出による I D Lの中のビタミ ン Eの分析結果を示 す。
図 3 0は電気化学検出による VL D Lの中のビタミン Eの分析結 果を示す。 - 図 3 1は蛍光検出による V L D Lの中のビ夕ミン Eの分析結果を 示す。
図 3 2は電気化学検出による CMの中のビタミン Eの分析結果を 示す。
図 3 3は蛍光検出による CMの中のビタミン Eの分析結果を示す 図 3 4は電気化学検出による HD Lの中のビタミン Eの分析結果 を示す。
図 3 5は蛍光検出による HD Lの中のビタミン Eの分析結果を示 す。
図 3 6は電気化学検出による L D Lの中のビタミン Eの分析結果 を示す。
図 3 7は蛍光検出による L D Lの中のビタミン Eの分析結果を示 す。
図 3 8は電気化学検出による I D Lの中のビタミン Eの分析結果 を示す。
図 3 9は蛍光検出による I D Lの中のビタミン Eの分析結果を示 す。
図 4 0は電気化学検出による V L D Lの中のビ夕ミン Eの分析結 果を示す。
図 4 1は蛍光検出による V L D Lの中のビタミン Eの分析結果を 示す。
図 4 2は電気化学検出による C Mの中のビタミン Eの分析結果を 示す。
図 4 3は蛍光検出による CMの中のビ夕ミン Eの分析結果を示す 図 4 4は HD L中のァ トコフエロール/コレステロール値を示す 図 4 5は L D L中のァ トコフエロール/コレステロール値を示す 図 4 6は I D L中のァ トコフエロール/コレステロール値を示す 図 4 7は V L D L中のァ トコフエロール/コレステロール値を示 す。
図 4 8は V L D L中のァ トコフエロール/ コレステロール値と V L D Lコレステロールとの関連性を示す。
図 4 9は V L D Lコレステロールと V L D L中のァ トコフエ口一 ル値とが関連性を有しないことを示す。
図 5 0は C M中のァ トコフ Π ル /コレステロール値を示す。 図 5 1 は血液中のァ トコフ X口 ―ル /コレステロール値を示す。 図 5 2は H D L中の 卜 フェ口ール zコレステロール値を示す 図 5 3は L D L中の α ト フェ Dール zコレステロール値を示す 図 5 4は I D L中のひ ト フ X Πール zコレステロール値を示す 図 5 5は V L D L中の α h フ Xロール/コレステロール値を示 す。
図 5 6は V L D L中の h Πフ Xロール zコレステロール値と V
L D L 3レステロールとの関 性を示す。
図 5 7は V L D Lコレステ U ルと V L D L中の トコフエ口一 ル値とが関連性を有しない とを不す。
図 5 8は C M中の 0； トコフ X Π ル /コレステロール値を示す。 図 5 9は血液中の トコフェ D ル /コレステロール値を示す。 図 6 0は血液中のァ トコフ X Π ―ル値の比較を示す。
図 6 1は血液中の α トコフェ口 ル値の比較を示す。
図 6 2は血液中のァ 卜コフ X Π ル /ひ トコフエロール値を示す 発明を実施するための最良の形態
リポ蛋白は血中 （血清中） に含まれる。 本発明は、 血液試料につ いて適用される分析方法であるが、 狭義の血液を試料とすることに 限定されず、 例えば血清、 血漿、 血液や血清から取得したリポ蛋白 画分又は該画分を例えば濃縮等した後に適当な溶液に懸濁した懸濁 溶液など、 リポ蛋白を含む試料に対して適用することができる。 本 発明で分析対象となるビタミン E類は、 主としてひ トコフエロール とァ トコフエロールである。
本発明における 2つのクロマトグラフ工程は、 いずれも、 各クロ マトグラフで使用する分離剤を力ラムに充填して実施することが好 ましい。 本発明では、 試料をまずイオン交換クロマトグラフに供し 、 各リポ蛋白を分離する。 イオン交換クロマトグラフは、 分離能が 高く、 種々のリポ蛋白を精密に分離できるものであるが、 そこで使 用する分離剤 （イオン交換体） は、 リポ蛋白の分離能が陽イオン交 換体に勝る陰イオン用の分離剤 （陰イオン交換体） が特に好適であ る。 イオン交換クロマトグラフにおける、 使用する分離剤の量 （ィ オン交換容量） 、 溶離液の組成、 溶離液の流速等の諸条件は、 分析 に供する試料の種類、 量に応じ、 後述する実施例で採用した条件や 種々の予備検討を実施して、 各リポ蛋白を分離し異なる画分として 回収できるように適宜決定する。
イオン交換クロマトグラフにおいて使用する溶離液には、 実施例 にも示したように、 カオトロピックイオンを加えることが好ましい 。 カオトロピックイオンの蛋白変性作用により、 リポ蛋白粒子表面 にあるアポ蛋白の高次構造を緩ませ、 後述する前処理液との反応の 際に、 界面活性剤によるリポ蛋白粒子の破壊とビタミ ン E類の遊離 の効率を高めることができるからである。 カオトロピックイオンと しては、 過塩素酸イオン、 尿素、 グァニジン、 チォシアン酸イオン 、 ヨウ素イオンなどを例示することができる。 添加濃度は各イオン のカオトロピック作用の強弱により異なるが、 過塩素酸イオンゃチ オシアン酸イオンでは、 試料と混合された場合に 5 0〜 1 5 0 m m o 1 / L、 より好ましくは 5 0 m m o 1 Z Lとなる濃度である。 なお、 高濃度のカオトロピックイオン （過塩素酸イオンゃチオシ アン酸ィオンであれば 3 0 0 m m o 1 以上） が溶離液に添加さ れていると、 アポ蛋白の高次構造が完全に破壌されてしまい、 結果 的にリポ蛋白の構造も壊れるために、 イオン交換ク口マトグラフに よる各リポ蛋白の分離に支障をきたすおそれが生じる。 そこで、 高 濃度のカオトロピックイオンを使用する場合には、 ィオン交換ク口 マトグラフによって各リポ蛋白を分離した後； 各画分に対して高濃 度のカオトロピックイオンを添加して反応させるか、 イオン交換ク 口マトグラフにおける溶離液には低濃度のカオトロピックイオンを 添加しておき、 前記画分に対して追加的にカオトロピックイオンを 添加することが好ましい。
イオン交換ク口マトグラフでは、 試料中のリポ蛋白を分離剤にい つたん吸着させた後、 塩濃度の異なる溶離液をステップ又はグラジ ェントで供することにより、 電荷の差に基づいて各リポ蛋白をステ ップ溶出又はグラジェント溶出させ、 ステップ溶出の場合には、 溶 出液を例えばステップごとに画分を回収し、 グラジェント溶出の場 合には、 例えば溶出液を一定容量毎に画分を回収する。 続いて回収 した全画分に対して前処理液一定の容量比で加えるか、 又は回収し た画分からリポ蛋白を含む画分を選択後、 選択された画分に対して 前処理液を一定の容量比で加え、 リポ蛋白質と反応させる。 リポ蛋 白と前処理液の反応は、 単に両者を混合して放置するのみで良い。 前処理液は、 ビタミン E類を溶解するための有機溶媒と、 リポ蛋 白粒子を壊してビタミン E類を遊離させるための界面活性剤を含む が、 それ以外にも、 ビタミン E類の酸化を防止するためァスコルビ ン酸等の還元剤や、 特にイオン交換ク口マトグラフにおける溶離液 にカオトロピックィオンが添加されていない場合には、 前処理液に カオトロピックイオンを含むことが好ましい。 カオトロピックィォ ンは、 界面活性剤とともに、 その蛋白変性作用により リポ蛋白粒子 表面にあるアポ蛋白の高次構造を変性させて、 リポ蛋白粒子が壊さ れる効率を高めるともに、 リポ蛋白画分に含まれる種々のタンパク 質が有機溶媒と接触して不溶化するのを防止して、 後述する逆相ク 口マトグラフに供する前に遠心分離操作や微細なフィルタ一でろ過 して蛋白質に起因する不溶化物を除去する操作を省くためである。 むろん、 イオン交換クロマトグラフにおける溶離液にカオトロピッ クイオンが添加されている場合であっても、 前処理液へのカオトロ ピックィオンの添加が妨げられることはない。 リポ蛋白を含む画分 に対する前処理液の混合量は、 イオン交換カラムから溶出するリポ 蛋白画分が希釈されすぎると後の逆相クロマトグラフにおける検出 感度が低下するおそれがあり、 また、 前処理液に含まれる界面活性 剤の濃度によっては、 混合量を多くすると気泡が生じるおそれがあ ることから、 画分の量に対して 1 / 5〜 5倍量とすることが好まし く、 より好ましくは 1 / 2〜 2倍量とする。
カオトロピックイオンとしては、 過塩素酸イオン、 尿素、 グァニ ジン、 チォシアン酸イオン、 ヨウ素イオンなどを例示することがで きる。 その濃度はイオンのカオトロピック作用の強弱により異なる が、 過塩素酸イオンゃチオシアン酸イオンでは、 リポ蛋白と反応さ せる段階、 即ちリポ蛋白を含む画分と混合した場合に 5 0〜 1 5 0 m m o 1 / L , より好ましくは 5 0 m m o 1 Lとなる濃度である 。 有機溶媒は、 ビタミン E類を溶解し得るものであれば特に制限は ないが、 エタノール、 ァセトニトリル、 メタノール、 イソプロパノ ール又はアセトンから選ばれる 1種以上を例示することができる。 その濃度は有機溶媒の種類により異なるが、 エタノールではリポ蛋 白を含む画分と混合した場合に 1 0〜 5 0 %、 より好ましくは 2 5 %となる濃度である。 界面活性剤は、 単独で又はカオトロピックィ オンとともにリポ蛋白を壌し、 ビタミン E類を遊離させ得るもので あれば特に制限はないが、 S D S (ドデシル硫酸ナトリウム） 、 P o 1 y (O x y e t n y l e n e ) s o r b i t a n m o n o 丄 a u l a t e (Tw e e n 2 0 ) 、 T r i t o n X_ 1 0 0、 B r i j 3 5又はデォキシコール酸から選ばれる 1種以上を例示 することができる。 その濃度は界面活性剤の種類によって異なるが 、 本発明者の検討によれば、 S D Sでは、 リポ蛋白を含む画分と混 合した場合に 6. 9〜 2 0 8 mm o l ZL (重量％では、 0. 2〜 6. 0 %) 、 好ましくは l O O mm o l ZL (重量％では 2. 9 % ) となる濃度である。 前処理液中の有機溶媒、 界面活性剤、 そして 好ましく含まれるカオトロピックイオンの濃度に関する上記開示は 参考のためのものであり、 実際に選択した有機溶媒、 界面活性剤そ してカオトロピックイオンの種類により変更が必要な場合があり得 る。 従って、 本発明に基づく ビタミン E類の分析に際しては、 前処 理液に含まれる各成分の濃度について最適範囲を予備的に検討して おく ことが好ましい。
前処理液との反応によってリポ蛋白から遊離したビタミン E類を 、 リポ蛋白を含む画分と前処理液の混合液として逆相クロマトダラ フに供する。 ビタミン E類の分析自体はガスクロマトグラフ、 薄層 クロマトグラフ、 NMR等により実施可能であるカ^ イオン交換ク 口マトグラフにより各リポ蛋白画分を分離して溶出させる際、 塩を 含む溶離液を使用することから、 本発明は、 塩類を含む被分析物を 精度良く分析できる逆相クロマトグラフを採用するものである。 前 記の前処理液と混合した試料を有機溶媒が含まれる溶離液を用いて 逆相クロマトグラフに供することにより、 ビタミン E類を分離して 溶出させ、 溶出液を検出器で検出して各ビタミン E類を分析する。 逆相クロマ トグラフにおける、 使用する分離剤の量、 溶離液の組成 、 溶離液の流速等の諸条件は、 分析に供する試料の種類、 量に応じ 、 後述する実施例で採用した条件や種々の予備検討を実施して適宜 決定する。 なお、 イオン交換クロマトグラフの実施後、 逆相クロマ トグラフの実施前までに、 試料にインターナルコントロールとして ビタミン E類の一つである δ トコフエロールを加えることにより、 分析精度を向上することができる。 <5 トコフエ口一ルは、 ビタミン
Ε類の一つであるが、 リポ蛋白中の存在量は α 卜 3フェノ一ルの 1
0 0分の 1程度と非常に少ないため、 ィン夕ーナル ン —ルと して使用することができるものである。
ビタミン Ε類の検出には紫外吸収検出 ¾ff、 貝量検出 、 蛍光検出 器、 アンべ口メ 卜リ ツク電気化学検出器又はク一 Pメ h ック電気 化学検出器等を用いることができるが、 十分な検出感度を有し、 メ ンテナンス等の維持作業の容易さから、 蛍光検出器 、 ァンぺ □メ 卜 リ ック電気化学検出器又はクーロメ 卜リ ック電気化学検出 が好適 である。
次に、 本発明の分析装置について、 図 1から図 3 に基づいて詳細 に説明する。 図 1の装置では、 試料導入部はオートサンプラー, 2 と 配管から構成され、 イオン交換クロマトグラフ部はイオン交換カラ ム 1 と配管から構成され、 イオン交換クロマトグラフ部からの溶出 液を試薬と混合する試薬混合部は混合器 1 0 とその直前 （上流側） に接続された分岐配管 2 2から構成され、 逆相クロマトグラフ部は 逆相カラム 1 3 と配管から構成され、 逆相クロマトグラフ部からの 溶出液について検出を行う検出部は蛍光検出器 1 4及びアンべロメ トリ ック検出器 1 5 と配管から構成され、 試料及びイオン交換クロ マトグラフ用の溶離液を送液する送液部は溶離液の混合装置 3、 送 液用ポンプ 4と 5及び配管から構成され、 試薬を送液する送液部は 送液ポンプ 8で構成され、 逆相クロマトグラフ用の溶離液を送液す る送液部はポンプ 1 6と 1 7及び配管で構成されている。 なおこの 例では、 イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液と試薬とが混合 された液の送液は、 専用の送液ポンプを使用するのではなく、 六方 切り替えバルブ 1 1 を利用することにより逆相クロマトグラフ用溶 離液の送液ポンプ 1 6及び Z又は 1 7で兼用している （図 2の例で は、 2個の三方切り替えバルブ 2 0及び 2 1 を利用することにより 、 試薬送液用の送液ポンプ 8並びに逆相ク口マトグラフ用溶離液の 送液ポンプ 1 6及び/又は 1 7、 そして図 3の例では、 六方切り替 えバルブ 1 1 を利用することにより試薬送液用の送液ポンプ 8並び に逆相クロマトグラフ用溶離液の送液ポンプ 1 ' 6及び Z又は 1 7 と 兼用） Ό
試料は別途試料容器に保持された状態で試料導入部に搬入される 。 一方、 イオン交換クロマトグラフ用の溶離液は別途溶離液容器 6 及び 7に保持された状態で配管によりポンプ 4又は 5 と接続され、 イオン交換ク口マトグラフ部からの溶出液と混合される試薬は試薬 容器 9に保持された状態でポンプ 8 と接続され、 逆相クロマトダラ フ用の溶離液は別途溶離液 1 8及び 1 9に保持された状態で配管に よりポンプ 1 6又は 1 7 と接続される。 ィオン交換ク口マトグラフ 部からの溶出液のうち、 逆相クロマトグラフ部に供されたもの以外 、 及び、 検出部での検出を終えた溶出液は、 廃液として適当な廃液 容器に廃棄される。
試料導入部は、 試料導入部の所定場所に搬入された試料容器等か ら自動的に一定量の試料を採取し得るものであれば特に制限はなく 、 例えば、 A S— 8 0 2 0 (商品名、 東ソ一（株）製） など、 通常使 用されているオートサンプラーを使用することができる。 また試料 導入部には、 試料容器を前記所定場所に自動的に搬入する装置を付 加しても良い。
ィオン交換ク口マトグラフ部が備えるイオン交換カラム 1 は、 各 リポ蛋白質を分離できるものであれば制限はなく、 例えば D E A E — N P R、 D E A E— 5 P W、 S P— N P R (いずれも商品名、 東 ソ一（株）製） などを使用することができる。 上述したように、 特に 陰イオン交換カラム （例えば D E A E— N P R (商品名、 東ソ一（ 株）製） ） を使用することが好ましい。 一方、 逆相クロマトグラフ 部が備える逆相カラム 1 3は、 ビタミン E類を分離できるものであ れば制限はなく、 例えば O D S— 8 0 T s (商品名、 東ソー （株）製 ) などを使用することができる。
逆相クロマトグラフによる一回の分析には、 一定の時間が必要で ある。 後の実施例に示したように、 一回の分析に 4 0分程度を要す る場合には、 ィオン交換ク口マトグラフによって溶出した任意のリ ポ蛋白溶出画分について逆相カラムでの分析が完了する前に、 ィォ ン交換クロマトグラフから他のリポ蛋白が溶出することになる。 従 つて、 逆相カラムとしては、 マイクロカラムのような、 分析に要す る時間を短縮できるカラムを使用し、 イオン交換クロマトグラフか ら溶出する各リポ蛋白画分を、 順次逆相ク口マトグラフに供するよ うにすることが好ましい。 もっとも、 実施例に示したように、 ある リポ蛋白の溶出画分についての逆相カラムでの分析完了をまって、 同一試料を再度ィオン交換ク口マトグラフに供し、 他のリポ蛋白溶 出画分を取得して逆相力ラムに供する、 というシークェンスを繰り 返すことにより、 各リポ蛋白中のビタミン E類を分析することが可 能である。 試薬混合部は、 イオン交換クロマトグラフ部からの溶出液の一部 又は全部を試薬と混合できるように構成すれば良い。 本例では、 ィ オン交換ク口マトグラフ部からの溶出液の全部に対して試薬を混合 し、 その一部のみを切り替えバルブ 1 1で採取して逆相クロマトグ ラフ部に送液するように操作することもできるが、 試薬消費量を節 約するために、 その一部に対して試薬を混合するように構成してい る。 即ち、 イオン交換カラムからの各リポ蛋白の溶出時間は、 クロ マトグラフ条件が一定であれば予想し得るものであるから、 その予 想時間に合わせてポンプ 8による試薬の送液を行い、 それ以外の時 間には送液を停止するようにしている。 試薬の混合は、 例えば、 試 薬が送液される配管をイオン交換クロマドグラフ部からの溶出液が 送液される配管と単に合流させるのみでも良いが、 本例のように、 合流後に例えばスタティ ックミキサー B (商品名、 東ソー（株）製） のような混合装置を用いて混合したり、 また例えば、 合流後に配管 内径が太い配管を通過させ、 ここで流速を低下させて両者の混合が 図れるようにしたり、 また例えば、 内壁に凹凸を形成した配管や内 径が変化する配管を使用する等しても良い。
検出部は、 ビタミン E類の検出が可能な検出器を使用すれば制限 はなく、 例えば紫外吸収検出器、 質量検出器、 蛍光検出器、 アンべ ロメ トリ ック電気化学検出器又はクーロメ トリック電気化学検出器 等を例示することができるが、 十分な検出感度を有し、 メンテナン ス等の維持作業の容易さから、 上記例でも使用した蛍光検出器ゃァ ンぺロメ トリック電気化学検出器、 そしてクーロメ トリ ック電気化 学検出器が好適である。
試料及びイオン交換クロマ卜グラフ用の溶離液を送液する送液部 は、 塩濃度の異なる溶離液 6及び 7 を使用し、 送液ポンプ 4及び 5 の駆動をコンピュータ一等で制御してその送液量を制御すれば、 ィ オン交換カラム 1 に異なる組成 （塩濃度） の溶離液をステップ又は グラジェントのいずれのモードでも供することが可能である。 なお 混合装置 3は、 溶離液 6及び 7 を混合するためのものである。 送液 ポンプ 4及び 5は例えば D P _ 8 0 2 0 (商品名、 東ソ一（株）製） 等を使用することができ、 混合装置 3は例えばスタティ ックミキサ 一 C (商品名、 東ソ一（株）製） を使用することができる。
試薬を送液する送液部や逆相ク口マトダラフ用の溶離液を送液す る送液部は、 例えば D P— 8 0 2 0 (商品名、 東ソー（株）製） のよ うなポンプを使用することができる。 なお本例では、 六方切り替え バルブ 1 1 を使用することにより、 イオン交換クロマトグラフ部か らの溶出液と試薬とが混合された液と逆相クロマトグラフ用溶離液 の送液のための送液部を簡略化したが、 例えば図 2に示したように 、 三方切り替えバルブ 2 0及び 2 1 を使用することも例示できる。
図 1 の装置によるビタミン E類の分析では、 まず、 オートサンプ ラー 2で採取された一定量の試料をイオン交換クロマトグラフ用の 溶離液とともにポンプ 4及び/又は 5で送液してイオン交換カラム 1 に供し、 試料中のリポ蛋白をカラムに保持させる。 引き続き、 同 一の溶離液を任意量送液した後、 ポンプ 4及び 5の送液量を制御し てカラムに供する溶離液の塩濃度を高く し、 カラムに保持された各 リポ蛋白を分離して溶出させる。 溶出した各リポ蛋白の画分に対し ては、 ポンプ 8により試薬 （前処理液） 9を送液して混合する。 前 処理液 9 の送液量は、 イオン交換カラムから溶出するリポ蛋白画分 が希釈されすぎると後の逆相クロマトグラフにおける検出感度が低 下するおそれがあり、 また、 前処理液に含まれる界面活性剤の濃度 によっては、 送液量を多くすると気泡が生じて送液不良となるおそ れがあることから、 イオン交換カラムに対する溶離液の送液量に対 して 1 5〜 5倍量、 特に 1 2〜 2倍量とすると良い。 前処理液との混合により リポ蛋白から遊離したビタミン E類を、 続いて逆相カラム 1 3に供する。 六方流路切り替えバルブ 1 1 を操 作して流路を切り替えることで、 送液ポンプ 8により前処理液と混 合されたリポ蛋白画分をサンプルループ 1 2に導入し、 更に六方切 り替えバルブ 1 1 を操作して流路を切り替えることにより、 送液ポ ンプ 1 6及び/又は 1 7により混合液を逆相カラムに供する。 なお サンプルループ 1 2は、 逆相カラムに導入すべき混合液の容量とす る。 ビタミン E類を逆相カラム 1 3に供するにあたり、 図 2に示し たように、 2つの三方の切り替えバルブ 2 0及び 2 1 を組み合わせ て使用する場合には、 イオン交換力ラムからのリポ蛋白画分の溶出 開始から終了までの間、 三方切り替えバルブ 2 0 を操作して流路を 切り替えることにより混合液を逆相カラム 1 3に導入し、 三方切り 替えバルブ 2 1 を操作して流路を切り替えることにより溶離液 1 8 及び 又は 1 9を廃棄 （W a s t e ) するように制御すれば良い。 図 3のように、 サンプルループを備えない六方切り替えバルブを使 用する場合には、 イオン交換カラムからのリポ蛋白画分の溶出開始 から終了までの間、 六方切り替えバルブ 1 1 を切り替えることによ り混合液が逆相力ラム 1 3に導入されるように制御すれば良い。 逆 相カラムから溶出するビタミン E類は、 それぞれ蛍光検出器 1 4及 びアンべロメ トリ ック検出器 1 5により検出される。
以上に説明したように、 ビタミン E類の分析装置として構成した 図 1乃至 3の分析装置は、 試料導入部に試料容器を所定場所に自動 的に搬入する装置と、 各部を制御するコンピュータ一等を付加すれ ば、 試料を容器に入れて搬入装置に載置等するのみで、 自動的にリ ポ蛋白中のビタミン E類を分析することが可能である。
そして、 以下の実施例により示すとおり、 上記分析方法や分析装 置を利用した結果、 0! トコフエロール Zコレステロールを指標とす ることで、 糖尿病の病態、 冠動脈疾患のリスク、 心筋梗塞の病態と いった各種病態を判定することが可能となった。 実施例
以下、 本発明を実施例により更に詳細に説明するが、 実施例は本 発明の一形態を示すものであり、 本発明を限定するものではない。 実施例 1
以下の構成の分析装置 （図 4 ) を作製した。
ィオン交換ク口マ 卜ダラフ用カラム 1 ； D E A E - N P R (商品 名、 東ソ一（株）製） 、 4. 6 mm I D X 3 5 mmを 2本直列に連結 試料導入部 2 ； A S — 8 0 2 0 (商品名、 東ソー (株）製） 混合装置 3 ； ス夕テイ ツクミキサー C (商品名、 東ソ一（株）製） 送液ポンプ 4及び 5 ； D P - 8 0 2 0 (商品名、 東ソ一（株）製） 溶離液 A 6 ； 5 0 m m o 1 /L トリス + 1 mm o 1 / L E D
T A 2 N a > p H 7 . 5
溶離液 B 7 ； 5 0 mm o 1 /L トリス + 1 mm o 1 /L E D
T A 2 N a +過塩素酸十卜 Uゥム 3 0 0 mm o 1 /L 、 p H 7 . イオン交換クロマトグラフの流速 ； 0. 5m l Zm i n
イオン交換ク口マトグラフの溶出条件
； 0分から 0. 0 5分は溶離液 B 1 0 %、 溶離液 A 9 0 % ； 0. 0 5分から 5分は溶離液 B 3 8 %、 溶離液 A 6 2 % ； 5分から 1 1分は溶離液 B 4 4 %、 溶離液 A 5 6 %
； 1 1分から 1 6分は溶離液 B 4 9 %、 溶離液 A 5 1 %
； 1 6分から 2 1分は溶離液 B 5 6 %, 溶離液 A 4 4 % ； 2 1分から 2 9分は溶離液 B 1 0 0 %、 溶離液 A 0 % ； 2 9分から 4 0分は溶離液 B 1 0 %、 溶離液 A 9 0 % 分離に要した時間 ； 4 5分/検体
上記装置によるリポ蛋白質の分離を試験した。 高脂血症を呈した 者から、 インフォ一ムドコンセントを得て採取した血清 （総コレス テロール値 1 5 9 m g Z d L、 中性脂肪 4 9 2 gZ d L) をィォ ン交換クロマトグラフに供して分離した画分と、 別途同一血清を超 遠心分離法により HD L、 L D L、 I D L、 V L D L、 CMに分離 したリポ蛋白画分に対して、 9 0 mmo l /L トリス + 8 0 mm o 1 ノ L ホウ酸 + 3 mm o l ZL E D T A 2 N a , ρ H 9. 6 の緩衝液に Ρ a r i n a r i c a c i d (疎水的な物に吸着し蛍 光を発する試薬） を 1. 4 n g ZmL濃度となるように添加したラ ベル試薬を流速 0. 1 5 mL/m i nで混合してから F S _ 8 0 2 0 (商品名、 東ソ一（株）製蛍光検出器、 3 2 4 n m、 蛍光波長 4 1 3 n m) で検出した。
血清試料を上記装置で分離したものについての結果を図 5 に、 血 清試料から超遠心分離法により調製したものについての結果を図 6 〜 ： L 0に示す。 HD L、 L D L、 I D L、 V L D L、 CMが良好に 分離されたこと、 及び、 精製品の分析結果 （結果は示していない） との比較からアルブミンや遊離脂肪酸 （ f r e e f a t t y a c i d) は HD Lと同じ位置に溶出していることが確認できた。 実施例 2
以下の構成の分析装置 （図 1 1 ) を作製し、 前処理液の有機溶媒 、 界面活性剤、 カオトロピックイオンについて試験を行った。
逆相クロマトグラフ用カラム 1 3 ； OD S— 8 0 T s (商品名、 東ソー（株）製） 、 4. 6 mm I D x 1 5 0 mm
試料導入部 2 ； A S— 8 0 2 0 (商品名、 東ソ一（株）製） 検出器 1 4 ; F S— 8 0 2 0 (商品名、 東ソー（株）製蛍光検出器 ) 、 励起波長 2 9 8 n m、 蛍光波長 3 2 5 n m
送液ポンプ 1 6及び 1 7 ； D P— 8 0 2 0 (商品名、 東ソ一（株） 製）
溶離液 C 1 8 ; 3 0 % エタノール + 2 5 mm o l ZL 硝酸ァ ンモニゥム
溶離液 D 1 9 ; 8 5 % エタノール + 2 5 mm o 1 Z 1 硝酸ァ ンモニゥム
流速 ； 1. 0 m 1 /m i n
溶出条件 ； 0分から 5分は溶離液 C 0 %、 溶離液 D 1 0 0 %
； 5分から 1 0分は溶離液 C 0 %、 溶離液 D 1 0 0 %から溶離 液 C 1 0 0 %、
溶離液 D 0 %にリニアグラディエント
； 1 0分から 3 3分は溶離液 C 1 0 0 %、 溶離液 D 0 %
； 3 3分から 3 5分は溶離液 C 1 0 0 %、 溶離液 D 0 %から溶 離液 C 0 %、 溶離液 D 1 0 0 %にリニアグラディエント
； 3 5から 4 5分は溶離液 C 0 %、 溶離液 D 1 0 0 %
分離に要した時間 ； 4 5分 Z検体
健常人からイ ンフォームドコンセントを得て採取した血清 （総コ レステロール値 2 1 5 m g / d L , 中性脂肪 9 7 m g /d L) の 2 O Lを実施例 1の装置に供し、 0分から 8分までの分画を H D L 画分として、 8から 1 3分までの分画を L D L画分として取得した 。 この溶出画分を用いて、 界面活性剤として S D S、 T r i t o n
X - 1 0 0、 Tw e e n 2 0 を、 有機溶媒としてエタノール、 ァセトニトリル、 メタノールを用いて検討した。
まず、 HD L画分試料を用いて検討した （表 1〜 3 ) 。 取得した 溶出画分 5 0 0 ； Lに対して前処理液 5 0 0 i Lを加え、 室温下で 3秒間混合後、 その 5 0 0 ^ Lを上記装置に供した。 S D Sを混合 後の濃度 （以下、 終濃度とする） が 1 2. 5〜； L O O mm o 1 /L となるように加え、 その他にリポ蛋白の安定化を目的としてァスコ ルビン酸を 1 0 mm o 1 ZLとリン酸を 1 %加えた前処理液を HD L画分に加え、 装置に供して分析したところ、 表 1 に示したように 、 S D S力 s、 2 5 mm o l /Lのときに、 ア トコフエロールと α トコ フエロールのどちらも最大のピーク高さが得られた。 これにより、 この条件により、 効率よく逆相クロマトグラフ用カラムの表面に、 ビ夕ミン Ε類が回収されたことが分かる。
S D Sが終濃度 2 5 mm o I / hの条件下で、 エタノールを終濃 度として 1 2， 5〜 3 5 %、 ァセトニトリルを 2 5 %、 メタノール を 2 5 %となるようにして、 その他に試料の安定化を目的としてァ スコルビン酸を 1 0 mm o 1 ZLとリン酸を 1 %加えた前処理液を HD L画分に加え、 装置に供して分析したところ、 表 2に示したよ うに、 ァ トコフエロールはァセトニトリルが 2 5 %の条件が、 ト コフエロールはメタノール 2 5 %の条件において最大のピーク高 さが得られた。 このことから、 S D Sを使用する場合には、 有機溶 媒として、 ァ トコフエロールにはァセトニトリル 2 5 %が、 ひ 卜 コフエロールにはメタノール 2 5 %が最適であることが分かった
表 1
Figure imgf000029_0001
表 2
Figure imgf000029_0002
界面活性剤を S D Sの代わりに T r i t o n X— 1 0 0または Tw e e n 2 0 とし、 終濃度として 0. 5 %となるようにして、 エタノールが終濃度として 0 %又は 2 5 %となるようにした場合は 、 表 2に示したように、 ァ トコフエノールにはエタノールの効果は 確認されなかったが、 ひ トコフエロールについては、 どちらもエタ ノールを加えた場合の方が強いピーク高さが得られた。 これらのこ とから、 S D Sを使用する場合には、 有機溶媒としてァセトニトリ ル又はメタノールが、 トコフエロールについて分析する場合に、 T r i t o n X— 1 0.0や Tw e e n 2 0 を使用する場合には 、 エタノールが効果的であることが分かった。
エタノールを終濃度として 2 5 %として、 S D Sを終濃度として 0〜 5 0 mm o 1 /Lになるようにして、 その他に試料の安定化を 目的としてァスコルビン酸を 1 O mm o l ZLとリン酸を 1 %加え た前処理液を HD L画分に加え装置に供して分析したところ、 表 3 に示したように、 ア トコフエロール、 ひ トコフエ口一ルどちらも S D Sが 5 O mmo 1 / Lの条件において最大のピーク高さが得られ た。 また、 S D S 5 0 mm o l /Lでエタノールが 0 %と 2 5 % の場合を比べて見ると、 τ トコフエロールと トコフエロールのど ちらもエタノールがある方が強いピーク高さが得られ、 S D S 5 0 mm p 1 /Lの場合のェタノ一ル添加の効果が確認された。
表 3
Figure imgf000030_0001
次に血清を用いて、 前処理液中に含まれる過塩素酸ナトリウムの 効果を検討した （表 4 ) 。 HD L画分には、 イオン交換クロマトグ ラフで用いた溶離液に由来する過塩素酸ナトリウムが 1 1 4 mm o 1 /L含まれていることから、 過塩素酸ナトリ ウムの効果を確認し た。 上記の健常人血清を、 実施例 1 の装置におけるイオン交換クロ マトグラフに用いた溶離液 A又は Bで希釈し、 エタノールの終濃度 が 2 5 %又は 0 %のそれぞれにおいて、 S D Sの終濃度が 1 2 5 m m o l ZL、 エタノールと S D Sの終濃度がそれぞれ 2 5 %、 S D S 2 5 mm o 1 /Lとなるように前処理液を加え、 装置に供して 分析した。 なお、 試料の安定化を目的としてァスコルビン酸を終濃 度として 5 mm o 1 ZL加えた。 その結果、 表 4に示したように、 すべての条件について、 過塩素酸ナトリウムが含まれた場合の方が 含まれない塲合に比較して強いピーク高さが得られ、 更には、 エタ ノール、 S D S、 過塩素酸ナトリウムのすべてが含まれている場合 、 最大のピーク高さとなった。
表 4
Figure imgf000031_0001
次に、 L D L画分試料を用いて検討した （表 5 ) 。 エタノールが 終濃度 2 5 %の条件下で、 S D Sが終濃度として 0〜 5 0 mm o 1 ZLとなるようにして、 S D Sが終濃度として 2 5 mm o 1 ZLの 条件下で、 ァセトニトリルまたはメタノールが終濃度 2 5 %となる ようにして、 その他に試料の安定化を目的としてァスコルビン酸を 1 0 mm o 1 ZLとリン酸を 1 %加えた前処理液を L D L画分に加 え、 装置に供して分析した （L D L試料には、 イオン交換クロマト グラフに用いている溶離液由来の過塩素酸ナトリウムが 1 3 2 mm o 1 /L含まれている） 。 この結果、 HD L画分を用いたときの検 討結果と同様、 表 5に示したように、 r トコフエロールと α トコフ エロールどちらも、 S D Sの濃度が高くなるとともにピーク高さが 向上し、 そして、 ァセトニトリルが終濃度 2 5 %、 S D Sが 2 5 m m o 1 Z Lの条件において最大のピーク高さが得られた。
表 5
Figure imgf000032_0001
以上の通り、 逆相クロマトグラフに供するリポ蛋白画分を有機溶 媒、 界面活性剤、 カオトロピックイオンを含む前処理液と混合する ことにより、 各画分中のビタミン E類を精度よく安定的に分析可能 であり、 また、 前処理液をリポ蛋白画分とともに逆相クロマトダラ フに供しても、 その分析に影響を与えないことが分かる。 実施例 3
高脂血症を呈した者から、 インフォ一ム ドコンセントを得て採取 した血清 （総コレステロール値 2 4 2 m g Z d L、 中性脂肪 4 2 1 m g / d L ) の 2 0 Lを実施例 1 の装置に供し、 下記のとおり各 リポ蛋白の溶出画分を取得してリポ蛋白質の分離を試験した。
HD L画分 ； 0〜 8分のフラクショ ン
L D L画分 ； 8〜 1 3分のフラクショ ン
I D L画分 ； 1 3〜 1 9分のフラクショ ン
V L D L画分 ； 1 9〜 2 4分のフラクション
C h y l o m i c r o n (以下、 C Mと記す。 ） 画分 ； 2 4〜 3 0分のフラクション
各リポ蛋白溶出画分の 5 0 0 に、 前処理液 （エタノール 5 0 %、 S D S 2 5 0 mm o 1 /L、 ァスコルビン酸 1 O mm o 1 / L 、 リン酸 1 %、 δ トコフエロール 0. 0 4 ^ g /mL) 5 0 0 L を加えて混合し、 実施例 2の装置に供してァ トコフエロールと α ト コフエロールを分析した。 ただし、 実施例 2の装置における蛍光検 出器 1 4のあとに、 アンべロメ トリ ック電気化学検出器 （印加電圧 6 0 0 mV) をつなぎ、 両方の検出器でクロマトグラムを得た。 結 果を図 1 2〜 2 3 (奇数番号は蛍光検出のクロマトグラムを、 偶数 番号は電気化学検出のクロマトグラム） に示す。 図 1 2と 1 3は前 処理液を純水で 2倍希釈した溶液を用いて作成した標準試料 （ δ ト コフエロール 0. O S /x gZmL ア トコフエロール 0. 1 β g ZmL、 α トコフエロール 0. 1 / g /mL) のクロマトグラ ムである力 、 これらから明らかなように、 <5 トコフエロール、 ア ト コフエロール、 α トコフエロールの順に溶出し、 良好な分析結果が 得られた。 図 1 4及び 1 5は HD L画分、 図 1 6及び 1 7は L D L 画分、 図 1 8及び 1 9は I D L画分、 図 2 0及び 2 1 に V L D L画 分、 図 2 2及び 2 3は C M画分のクロマトグラムを示す。 C M画分 では、 インターナルコントロールである δ トコフエロールと ひ トコ フエロールの 2つのピークが検出され、 ァ トコフエロールが検出さ れていないカ 、 その他の画分では、 δ 卜コフエロール、 ァ 卜コフエ ロール、 トコフエロールのすべてのピークが検出された。 蛍光検 出器のピーク高さから、 血清中の各リポ蛋白中のァ トコフエロール 、 a トコフエロールの濃度を算出した結果を表 6に示す。 算出に当 たっては、 前処理液に加えた <5 トコフエ口一ルをインターナルコン トロールとして各分析における回収率を算出し、 分析結果を補正し 、 画分の分離及び前処理液による希釈を考慮してある。 なお、 血清 中のァ トコフエロール、 ひ トコフエロールの濃度は各リポ蛋白画分 の濃度を合計したものである。
表 6
Figure imgf000034_0001
実施例 4
高脂血症を呈した者から、 インフォームドコンセントを得て採取 した血清 （総コレステロール値 2 0 3 m g Z d L、 中性脂肪 2 1 5 m g / d L ) の 2 0 Lを下記の装置 （図 4に示した実施例 1の装 置構成と同じとし、 溶離液組成および溶出条件を変更した） に供し 、 試料導入時から 3 4分まで 2分間ごとに 1 7本の溶出画分を取得 し、 実施例 3の装置及び方法により各リポ蛋白中のァ トコフェロー ル、 Q! トコフエ口一ルを分析した。 また、 それぞれのフラクション のコレステロール濃度をコレステロールエステラーゼ及びコレステ ロールォキシダーゼを含んだ酵素液 （コレステロール Eテス ト、 商 名、 和'光純薬（株）製 ) で測定した。
ィオン交換クロマ卜グラフ用カラム 1 ； D E A E - N P R (商品 名 、 東ソ一（株）製） 、 4 6 mm I D X 3 5 m mを 2本直列に連結 試料導入部 2 ； A S ― 8 0 2 0 (商品名 、 東ソ一（株）製） 混合装置 3 ； ス夕ティ ックミキサー C (商品名、 東ソー（株）製） 送液ポンプ 4及び 5 D P - 8 0 2 0 (商品名、 東ソー（株）製） 溶離液 A ； 5 0 mm o 1 / L 1、リス + 1 mm o 1 / L E D T
A 2 N a + 1 0 0 mm o 1 / L チオシァン酸ナトリウム、 P H 7
. 5
溶離液 B ; 5 0 mm o l /L 卜リス + l mm o l ZL E D T A 2 N a + 1 0 0 mm o 1 / L チォシアン酸ナトリウム + 5 0 0 mm o l /L 硝酸ナトリウム、 p H 7. 5
イオン交換クロマトグラフの流速 ； 0. 5 m l /m i n イオン交換クロマトグラフの溶出条件
； 0分から 2 4分は溶離液 B 1.0 %、 溶離液 A 9 0 %から溶離 液 B 5 0 %、 溶離液 A 5 0 %へのリニアグラディエント
； 2 0分から 2 5分は溶離液 B 5 0 %、 溶離液 A 5 0 % ； 2 5分から 3 0分は溶離液 B 1 0 0 %、 溶離液 A 0 %
； 3 0分から 4 0分は溶離液 B 1 0 %、 溶離液 A 9 0 % 各溶出画分中のア トコフエロール、 α トコフエロール、 コレステ ロールの濃度を表 7に示す。 フラクション 6及び 7が HD Lに、 フ ラクシヨン 8及ぴ 9が L D Lに、 フラクション 1 0及び 1 1が I D Lに、 フラクション 1 2及び 1 3が V L D Lに、 フラクショ ン 1 3 07061143 及び 1 4が C Mに相当する。 このように、 イオン交換クロマトダラ フでリポ蛋白をリニアグラディエント溶出した場合でも、 良好なリ ポ蛋白中ビタミン E類の分析を行うことが可能であった。
表 7
Figure imgf000036_0001
実施例 5
図 1 に示した本発明の分析装置として、 具体的に以下の装置を作 製した。 高脂血症を呈した者からインフォ一ムドコンセントを得て 採取した血清 （総コレステロール値 2 0 3 m g/ d L、 中性脂肪 2 1 5 m g / d L ) の 2 0 z Lをこの装置に供し、 ビタミン E類を分 祈した。 なお、 本例では一回の試料導入により各リポ蛋白中のビ夕 ミン E類を測定するのではなく、 合計 5回の試料導入を行うことに より、 各一つのリポ蛋白中のビタミン E類を分析したものである。 イオン交換クロマトグラフ用カラム 1 ； D E AE— N P R (商品 名、 東ソ一（株）製） 、 4. 6 mm I D X 3 5 mmを 2本直列に連結 試料導入部 2 ； A S— 8 0 2 0 (商品名、 東ソー（株）製） 混合装置 3 ； スタティ ックミキサー C (商品名、 東ソ一（株）製） 送液ポンプ 4及び 5 ； D P— 8 0 2 0 (商品名、 東ソ一（株）製） 溶離液 A 6 ； 5 0 m m o 1 / L トリス + l mm o 1 /L E D
TA 2 N a、 p H 7. 5
溶離液 B 7 ； 5 0 mm o l /L トリス + 1 mm o 1 /L E D
T A 2 N a +過塩素酸ナトリウム 3 0 0 mm o l ZL、 p H 7.
5
イオン交換クロマトグラフの流速 ； 0. 5 m l /m i n
'イオン交換クロマトグラフの溶出条件
； 0分から 0. 0 5分は溶離液 B 1 0 %、 溶離液 A 9 0 % ; 0. 0 5分から 5分は溶離液 B 3 8 %、 溶離液 A 6 2 % ； 5分から 1 1分は溶離液 B 4 4 %、 溶離液 A 5 6 % ； 1 1分から 1 6分は溶離液 B 4 9 %、 溶離液 A 5 1 % ； 1 6分から 2 1分は溶離液 B 5 6 %、 溶離液 A 4 4 % ； 2 1分から 2 9分は溶離液 B 1 0 0 %、 溶離液 A 0 % ； 2 9分から 4 0分は溶離液 B 1 0 %、 溶離液 A 9 0 % 送液ポンプ 8 ； D P— 8 0 2 0 (商品名、 東ソ一（株）製） 前処理液 9 ; 1 0 0 mm o l ZL S D S + 5 0 % エタノール 混合装置 1 0 ； スタティ ックミキサー B (商品名、 東ソ一 （株）製
)
前処理液の流速 ； 0. 2 5 m l /m i n
六方切り替えバルブ 1 1 ； 6方電磁弁
切り替えのタイミング （O F Fから〇Nへの流路の切り替え） ； H D L溶出画分については 7分から 2分間
； L D L溶出画分については 1 1分から 2分間
； I D L溶出画分については 1 7分から 2分間
； V L D L溶出画分については 2 2分から 2分間
； C M溶出画分については 2 7分から 2分間
サンプルループ 1 2の容量 ； 1. 5 m l容量
逆相クロマトグラフ用カラム 1 3 ； OD S— 8 0 T s (商品名、 東ソー（株）製） 、 4. 6 mm I D x 1 5 0 mm
検出器 1 4 ; F S— 8 0 2 0 (商品名、 東ソ一（株）製蛍光検出器 ) 、 励起波長 2 9 8 n m、 蛍光波長 3 2 5 nm
検出器 1 5 ; E C— 8 0 2 0 (商品名、 東ソー（株）製アンべロメ トリ ック電気化学検出器、 印加電圧 6 0 0 mV)
送液ポンプ 1 6及び 1 7 ； D P— 8 0 2 0 (商品名、 東ソー（株） 製）
溶離液 C 1 8 ; 3 0 % エタノール + 2 5 mm o 1 / L 硝酸ァ ンモニゥム
溶離液 D 1 9 ; 8 5 % ェタノ一ル + 2 5 mm o 1 / 1 硝酸ァ ンモニゥム
逆相クロマトグラフの流速 ； 1. O m l Zm i n
逆相クロマトグラフの溶出条件
； 当初は溶離液 C 1 0 0 %、 D 0. %
； 切り替えバルブ 1 1が O Nになってから 5分後に溶離液 C 1 0 0 %、 D 0 %に変更
； 切り替えバルブ 1 1が〇 Nになってから 3 4分後に溶離液 C 0 %、 D 1 0 0 %に変更
分析時間 ； 4 6分/検体
HD L溶出画分の分析結果を図 2 4及び 2 5に、 L D L溶出画分 の分析結果を図 2 6及び 2 7に、 I D L溶出画分の分析結果を図 2 8及び 2 9に、 V L D L溶出画分の分析結果を図 3 0及び 3 1に、 そして CM溶出画分の分析結果を図 3 2及び 3 3に示す。 なお、 各 図は、 偶数番号が電気化学検出のクロマトグラム、 奇数番号が蛍光 検出のクロマトグラムを示す。 各図から明らかなように、 各リポ蛋 白の画分でァ トコフエロールと α トコフエロールが良好に検出され た。 実施例 6
前処理液の組成を 5 0 mm ο 1 過塩素酸ナトリウム + 1 % T r i t o n X— 1 0 0 + 7 5 % エタノールとした以外は、 実施例 5 と同一の装置及び方法にて分析を行った。 HD L溶出画分 の分析結果を図 3 4及び 3 5に、 L D L溶出画分の分析結果を図 3 6及び 3 7に、 I D L溶出画分の分析結果を図 3 8及び 3 9に、 V L D L溶出画分の分析結果を図 4 0及び 4 1 に、 そして CM溶出画 分の分析結果を図 4 2及び 4 3 に示す。 なお、 各図は、 偶数番号が 電気化学検出のクロマトグラム、 奇数番号が蛍光検出のクロマトグ ラムを示す。 各図から明らかなように、 各リポ蛋白の画分でア トコ フエロールと ト コフエロールが良好に検出された。
動脈硬化の危険因子として、 酸化したリポ蛋白が注目を浴びてい る。 リポ蛋白に含まれる主要な抗酸化物質は、 ビタミン E類 （主と して トコフエノールとア トコフエノール） である力 本発明のリ ポ蛋白中のビ夕ミン E類の分析方法によれば、 血液中にある各リポ 蛋白中のビタミン E類の量を分析することができるから、 動脈硬化 のメカニズムを理解するうえで重要な知見を得ることが可能になる 。 動脈硬化とリポ蛋白中のビタミン E類の関係が明らかになれば、 本発明の分析方法は、 動脈硬化の診断や治療効果のモニターにも好 適なものである。
また本発明の分析装置は、 ビタミン E類の分析等を、 自動的に、 従って短時間に行い得るものであり、 しかも自動的な分析であるた めに誤差を生じる可能性が少ないものである。
ィオン交換ク口マトグラフを使用してリポ蛋白を分離した後、 分 離したリポ蛋白を有'機溶媒及び界面活性剤を含む前処理液と反応さ せてビタミン E類を遊離させ、 次いで遊離したビタミン E類を逆相 クロマ トグラフに供するという構成は、 従来技術における、 各リポ 蛋白を分離した後、 ビタミン E類を抽出し、 乾固濃縮し、 再溶解し 、 そして逆相クロマトグラフに供するという構成と比較して、 構成 自体簡便であり、 しかも誤差を生じる可能性が少ないという特徴を 有するものである。 詳しくは、 従来技術では分離した各リポ蛋白画 分のそれぞれについて、 手作業でビタミン E類を抽出し、 乾固濃縮 し、 そして再溶解する、 という、 複雑で誤差を生じやすい手作業の 工程が必須であつたが、 本発明ではこの工程を、 事前に調製された 前処理液を添加 ' 混合して反応させるという、 単純な工程で置き換 えているからである。
従来の技術では、 ビタミン E類の抽出、 乾固濃縮そして再溶解と いう工程が複雑でしかも手作業で実施せざるを得ないものであった ため、 操作を自動化することは困難であった。 しかし本発明の分析 方法では、 イオン交換クロマトダラフ及び逆相ク口マトグラフで使 用する分離剤をカラムに充填して実施することが可能で、 かつ、 ビ 夕ミン E類の抽出、 乾固濃縮及び再溶解の工程に代わる、 イオン交 換クロマトグラフにおける溶出液に対して前処理液を混合するとい う工程を、 イオン交換ク口マトグラフの溶出液を逆相クロマトダラ フに供する過程で自動的に実施することも可能である。 この結果、 本発明の分析方法は、 一定量の試料を採取する試料導入部、 イオン 交換カラムを備えるイオン交換クロマトグラフ部、 イオン交換クロ マトグラフ部からの溶出液の一部又は全部を試薬と混合する試薬混 合部、 逆相カラムを備える逆相クロマトグラフ部、 逆相クロマトグ ラフ部からの溶出液について検出を行う検出部、 及び、 試料導入部 で採取した試料及びイオン交換クロマトグラフ用の溶離液を送液す る送液部、 試薬を送液する送液部、 イオン交換クロマトグラフ部か らの溶出液と試薬とが混合された液を送液する送液部、 及び、 逆相 クロマトグラフ用の溶離液を送液する送液部を備える分析装置によ り、 容易に自動化し、 分析に要する時間や労力を短縮等することが できる。 実施例 7
1 7例の健常人 （H e a l t h y) 、 2 0例の糖尿病患者 （D i a b e t e s ) 、 1 7例の心筋梗塞患者 （ A M I ) の血清中の H D L、 L D L、 I D L、 V L D L、 C h y l o m i c r o n中の αお よび T トコフエロールを実施例 3に記載した方法で測定した。 また 、 ィオン交換ク口マトグラフィ一法 （H i r o w a t a r i Yら 、 J L i p i d R e s 、 4 4、 p l 4 0 4 ( 2 0 0 3 ) ) によ り、 別に各リポ蛋白のコレステロールを測定し、 コレステロール当 りの αおよびァ トコフエロールを算出した。
また、 すべてのリポ蛋白中の およびァ トコフエロールを加算す ることにより、 血液中のすべてのリポ蛋白中の総ビタミン Ε濃度 （ αおよびア トコフエロール濃度） を算出した。 そして、 別に各リポ 蛋白のコレステロールを測定し、 合計して血液中のコレステロール を算出し、 コレステロール当りの およびァ トコフエロールを算出 した。 結果を図と表に示す。 なお、 図中のバーおよび四角はノンパ ラメ トリ ック統計による中心値 （ 5 0パーセントタイル値） および 2 5〜 7 5パ一センタイル値 （ I Q R) を示す。
HD L中のァ トコフエロール コレステロ一ル値 （コレステロ一 ル当りのア トコフエロール値） を図 4 4と表 8に示した。
表 8
Figure imgf000042_0001
糖尿病 （平均値 1 . 2 3 mm o 1 /m o 1 ) 、 心筋梗塞 （平均値 1 . O O mm o l /m o l ) 、 健常人 （平均値 1. 2 0 mm o l / m o 1 ) と、 同等の値を示したが、 心筋梗塞において、 0. 5 mm o 1 Zm o 1 以下と健常人より明らかに低値の患者が見られた。 心 筋梗塞において、 健常人に比べ低値の患者が見られたのは、 酸化ス トレスにより HD L中のァ トコフエロールが分解されたことを示し ているのであろう。
L D L中のァ トコフエロール/コレステロール値を図 4 5 と表 8 に示した。 糖尿病 （平均値 0. 4 0 mm o 1 / o 1 ) 、 心筋梗塞 (平均値 0. 3 7 mm o l Zm o l ) 、 健常人 （平均値 0. 3 4 m m o l /m o l ) と、 同等の値を示した。 I D L中のァ トコフエロール/コレステロール値を図 4 6 と表 8 に示した。 糖尿病 （平均値 3. 1 7 mm o 1 /m o 1 ) は健常人 （ 平均値 6. 2 5 mm o 1 /m o 1 ) より有意 （ p = 0. 0 0 7 ) に 低く、 糖尿病が有する病態である酸化ス トレスにより I D L中のァ トコフエロールが分解されたことを示している。 また、 心筋梗塞に ついても、 有意差 （ Ρ = 0. 2 1 8 ) はないが、 平均値 4. 8 2 m m o l Zmo l と健常人より低い値を示し、 これも、 原因は酸化ス トレスによるものである。 なお、 有意差の有無の判断基準は、 健常 人の数値と、 各患者の数値とで、 ウエルチの t検定 （非等分散の 2 標本を対象とする t検定） を行い、 p値が 0. 0 5未満であれば有 意差あり とし、 それ以上であれば有意差なしと判定した （以下、 同 様） 。
V L D L中のァ トコフエロール/コレステロール値を図 4 7 と表 8に示した。 糖尿病 （平均値 2. 3 9 mm o 1 /m o 1 ) は健常人 (平均値 5. 0 5 mm o l /m o l ) より有意 （ρ = 0. 0 1 8 ) に低く、 糖尿病が有する病態である酸化ス トレスにより V L D L中 のァ トコフエロールが分解されたことを示している。 このことから 、 V L D L中のァ トコフエロール/コレステロール値を見ることに より糖尿病の酸化ス トレスに関した病態を判定することが出来ると 言える。
また、 V L D Lコレステロールとの関係を図 4 8に示した。 冠動 脈疾患である心筋梗塞患者においては、 全体としては健常人に比べ 低下傾向ではないものの、 その分布は健常人より幅が広く健常人の 2 5パ一センタイル値 （ 1. 9 1 mm o 1 /m o 1 ) より心筋梗塞 患者の 2 5パ一センタイル値 （ 1. 3 1 mm o 1 /m o 1 ) は低値 となった。 どころで、 VL D Lコレステロール （H u b e r t H Bら、 Am J E p i d e m i o l 1 2 5 p 8 1 2 ( 1 9 8 7 ) ) は冠動脈疾患のリスクファクターとして明らかになつている が、 この V L D Lコレステロールと V L D L中のァ トコフエロール コレステロール値との関係を調べた。 V L D Lコレステロールが 高値傾向になるとともに、 心筋梗塞患者だけでなく、 糖尿病患者も 健常人についても、 急激に VL D L中のァ トコフエロール Zコレス テロール値が低下していることがわかる。 なお、 V L D Lコレステ ロールと V L D L中のァ トコフエロール値に関連性はなかった （図 4 9 ) 。 そして、 健常人の V L D L中の r トコフエロール コレス テロール値が 3 mm o 1 /m o 1 以下に該当するものは、 V L D L コレステロール値が 9 m g Zd L以上と高値であり、 心筋梗塞のリ スクの高い人であった。 この結果から考えるに健常人の中にも心筋 梗塞もリスクの高い人が存在しているのであると推測される。 これ らのことから、 VL D L中のァ トコフエロール コレステロール値 は、 V L D Lコレステロールの比較的低いレベルの時の冠動脈疾患 のリスクを正確に判断できるものだと言える。 冠動脈疾患などの動 脈硬化性疾患の高いリスクとなることが知られている病態である糖 尿病での測定値が健常者より低値であったことも合わせて考えるに 、 V L D L中のア トコフエロール/コレステロール値により、 冠動 脈疾患のリスクを判定することができると言える。
C M中のァ トコフエロール/コレステロール値を図 5 0 と表 8に 示した。 糖尿病 （平均値 1 1. 0 4mmo l /m o l ) は健常人 （ 平均値 1 7. 4 2 mm o 1 /m o 1 ) より有意 （ ρ = 0. 0 4-7 ) に低く、 糖尿病が有する病態である酸化ス トレスにより C M中の r トコフエロールが分解されたことを示している。 心筋梗塞について も、 有意差 （ P = 0. 6 3 7 ) は見られなかったものの、 平均値 1 5. 7 1 mm o 1 Zm o 1 と健常人に比べ低く、 これも酸化ス トレ スによる分解が原因であろう。 血液中のァ トコフエロールノコレステロール値を図 5 1 と表 8に 示した。 糖尿病 （平均値 0. 9 0 mm o l Zm o l ) および心筋梗 塞 （平均値 0. 9 7 mm o l Zmo l ) と有意差 （ p = 0. 1 9 9 および p = 0. 5 8 4 ) はないものの、 健常人 （平均値 1. 0 3 m m o 1 Zm o 1 ) より低値を示した。 また、 図 5 1 を見ると、 その 患者数は多くはないものの、 明らかに健常人より値が低値の糖尿病 患者および心筋梗塞患者が確認できる。 これは、 糖尿病および心筋 梗塞が有する病態である酸化ス トレスにより血液中の τトコフエ口 —ルが分解されたことを示している。
HD L中のひ トコフエロール/コレステロール値 （コレステロ一 ル当りの α トコフエ口一ル値） を図 5 2 と表 9に示した。
表 9
Figure imgf000045_0001
糖尿病 （平均値 7. 5 8 mm o 1 /m o 1 ) および心筋梗塞 （平 均値 9. 3 0 mm o 1 /m o 1 ) と健常人 （平均値 6. 0 9 mm o I Zm o l ) を比較した場合に、 有意差 （p = 0. 0 7 2および p = 0. 0 9 5 ) は見られなかったが高値傾向を示し、 これは、 HD Lは脂質代謝の中心的な役割を担う重要なリポ蛋白であるので、 糖 尿病おょぴ心筋梗塞が有する病態である酸化ス トレスによるダメ一 ジの防御として、 HD L中のひ トコフエロールの含量を増加させた のではないかと考えられる。
L D L中の トコフエロール Zコレステロール値を図 5 3 と表 9 に示した。 糖尿病 （平均値 3. 3 3 mm o 1 /mo 1 ) は健常人 （ 平均値 2. 0 1 mm o 1 / o 1 ) より有意 （ p = 0. 0 1 6 ) に 高く、 これは、 L D Lは脂質代謝の中心的な役割を担う重要なリポ 蛋白であるので、 糖尿病が有する病態である酸化ス トレスによるダ メ一ジの防御として、 L D L中の α トコフエロールの含量を増加さ せたのではないかと考えられる。 このように、 L D L中の 0! トコフ エロールノコレステロール値を見ることにより糖尿病の酸化ス 卜レ スに関した病態を判定することが出来ると言える。
心筋梗塞 （平均値 3. 9 4 mm o 1 /m o 1 ) の場合も健常人 （ 平均値 2. O l mm o l Zm o l ) より有意 （ p = 0. 0 0 0 1 ) に高く、 これは、 L D Lは脂質代謝の中心的な役割を担う重要なリ ポ蛋白であるので、 心筋梗塞が有する病態である酸化ストレスによ るダメージの防御として、 L D L中の Q! トコフエロールの含量を増 加させたのではないかと考えられる。 このように、 L D L中の α ト コフエロール /コレステロール値を見ることにより心筋梗塞の酸化 ス トレスに関した病態を判定することが出来ると言える。
I D L中の トコフエロール コレステロール値を図 5 4 と表 9 に示した。 有意差 （Ρ = 0. 1 0 6 ) は低いものの、 糖尿病 （平均 値 1 5. 3 3 mm o 1 /m o 1 ) は健常人 （平均値 2 0. 1 4 mm o 1 /m o 1 ) に比べ明らかに低いことがわかる。 これは、 糖尿病 が有する病態である酸化ス トレスにより I D L中の 0； トコフェロー ルが分解されたことを示している。 心筋梗塞 （平均値 2 4. 3 9 m m o I Zm o 1 ) は健常人 （平均値 2 0. 1 4 mm o 1 /m o 1 ) に比べ高かったが、 心筋梗塞患者の測定値では健常人に比べ、 高い 患者と低い患者のばらつきが大きかった。 実際に、 心筋梗塞患者の 2 5パーセンタイル値 1 3. 7 mm o 1 /m o 1 は健常人の 2 5パ 一センタイル値 1 5. 7 m m o 1 Z m o 1 より低値となった。 健常 人の中にも酸化ス トレスにより I D L中の α トコフエロールが分解 している人もいる可能性を考えると、 健常人の 2 5パ一センタイル 値 1 5. 7 mm o 1 /mo 1 より低値の心筋梗塞患者は酸化ス 卜レ スによる I D L中のひ トコフエロールの分解が進んでいるのであろ う。
V L D L中の トコフエ Π—ル /コレステロール値を図 5 5 と表 9に示した。 有意差 （ p = 0. 3 7 3 ) はないものの、 糖尿病 （平 均値 1 3. 4 6 mm o l /m o l ) は健常人 （平均値 1 7. 5 1 m m o 1 /m o 1 ) より明らかに低く、 糖尿病が有する病態である酸 化ストレスにより VL D L中の u トコフエ口一ルが分解されたこと を示している。 このことから、 VL D L中のひ トコフエロールノコ レステロール値を見ることにより糖尿病の酸化ス トレスに関した病 態を判定することが出来ると言える。
また、 V L D Lコレステロールとの関係を図 5 6に示した。 冠動 脈疾患である心筋梗塞患者においては、 全体としては健常人に比べ 低下傾向ではなかった。 しかしながら、 健常人の中にも心筋梗塞も リスクの高い人が存在しているのであろうと推測されているので、 このような結果になった可能性がある。 次に、 V L D Lコレステロ —ル （H u b e r t HB ら （ 1 9 8 7 ) 前掲） は冠動脈疾患のリ スクファクタ一として明らかになっているが、 この V L D Lコレス テロールと V L D L中の α トコフエロール Zコレステロール値との - 関係を調べた。 V L D Lコレステロールが高値傾向になるとともに 、 心筋梗塞患者だけでなく、 糖尿病患者も健常人についても、 急激 に V L D L中の a トコフエロール/コレステロール値が低下してい ることがわかる。 なお、 VL D Lコレステロールと V L D L中の α トコフエロール値に関連性はなかった （図 5 7 ) 。 そして、 健常人 の V L D L中のひ トコフエロール/コレステロール値が 7 mm o 1 Zm o 1 以下に該当する人は、 VL D Lコレステロール値が 1 5 m g Z d L以上と高値であり、 心筋梗塞のリスクの高い人であること が明らかとなった。 このことから、 V L D L中の トコフエロール Zコレステロール値は、 VL D Lコレステロ一ルめ低いレベルの場 合の冠動脈疾患のリスクを正確に判断できるものだと言える。 冠動 脈疾患などの動脈硬化性疾患の高いリスクとなることが知られてい る病態である糖尿病での測定値が健常者より低値であったことも合 わせて考えるに、 V L D L中の α トコフエロール Ζコレステロール 値により、 冠動脈疾患のリスクを判定することができると言える。
C M中の トコフエロール/コレステロール値を図 5 8 と表 9 に 示した。 有意差 （ P = 0. 1 9 0 ) はないものの、 糖尿病 （平均値 4 5. 3 7 mm o l /mo l ) は健常人 （平均値 6 4. 7 3 mm o 1 /mo 1 ) より低値傾向を示し、 糖尿病が有する病態である酸化 ストレスにより CM中の α トコフエロールが分解されたことを示し ている。 心筋梗塞については、 有意差 P = 0. 5 5 1 と糖尿病より 更に低かったが、 その平均値は 5 5. 3 9 mm o 1 /m o 1 と健常 人の平均値より低く、 これも酸化ス トレスによる分解が原因であろ う。
血液中の α トコフエロール Zコレステロール値を図 5 9 と表 9 に 示した。 有意差は p = 0. 0 0 5と、 心筋梗塞 （平均値 6. 8 3 m m o 1 Zmo 1 ) は健常人 （平均値 4. 7 1 mm o 1 /m o 1 ) に - 比べ明らかに高く、 これは、 血液中の主要なリポ蛋白である L D L や HD Lが、 糖尿病が有する病態である酸化ストレスによるダメー ジの防御として、 ひ ト コフエロールの含量を増加させたのではない かと考えられる。 また、 糖尿病については、 有意差 （ p = 0. 1 3
6 ) はないものの、 やはり健常人 （平均値 4. 7 1 mm o 1 / o
1 ) に比べて高く、 これも、 血液中の主要なリポ蛋白である L D L や H D Lが、 糖尿病が有する病態である酸化ス トレスによるダメー ジの防御として、 トコフエロールの含量を増加させたのではない かと考えられる。
健常人と糖尿病について、 血液中の トコフエロール値とァ トコ フエロール値の比較を行った （図 6 0、 6 1 ) 。 トコフエロール 値は健常人 （平均値 1 0. 7 0 z gZm l ) に比べ糖尿病患者 （平 均値 1 3 , 6 3 / gZm l ) が明らかに高値を示し、 ア トコフエロ —ルの平均値は健常人 （平均値 2. 2 3 g /m 1 ) に比べ糖尿病 患者 （平均値 2. 1 5 g/m 1 ) はやや低いが、 全体の分布を見 ると健常人に比べ糖尿病患者で高値の人が見られ、 中心値はやや高 値を示している （健常人 ； 中心値 2. O Y ^ gZm l、 糖尿病患者
； 中心値 2. 2 6 /m 1 ) 。 これらビタミン Ε ( αおよび r ト コフエロール） が高値となった現象は、 糖尿病患者の体内で発生し ている酸化ス トレスに対する防御機構の 1つだと考えている。
また、 α トコフエロールに比べて、 ア トコフエロールは酸化ス ト レスにより発生するラジカルにより分解を受けやすいという現象が ある。 また、 およびア トコフエ ロ一ルは小腸から同様に吸収され 肝臓また一部分は抹消細胞にカイロマイクロンを介して輸送され、 ' 肝臓内ではビタミン Ε輸送タンパク質により、 ある一定の量の お よびア トコフエロールを VL D L粒子内に含有させて血中に放出す ることにより体内の抹消細胞に輸送されることが知られている。 同 様のメカニズムにより小腸で吸収され肝臓から放出されるひおよび ア トコフエロ一ルの血液中での比率はほぼ一定であると推定される 。 これら現象から、 ア トコフエロールを《 トコフエロールの比とし て算出すれば、 糖尿病の酸化ストレスに関する病態を反映する優れ た指標と考え検討した。 結果を図 6 2 と表 1 0 に示す。 血液中のァ トコフエロール Z トコフエロール比は予想とおり、 健常人 （平均 値 0. 2 2 ) に比べ、 糖尿病 （平均値 0. 1 7 ) と有意 （p = 0. 0 1 3 ) と低く、 糖尿病の酸化ス トレスに関する病態を判定するこ とが出来ると言える。
表 1 0
Figure imgf000050_0001
また、 冠動脈疾患において、 健常人と比べた場合に 0! トコフエ口 ールは有意 （ ρ == 0. 0 6 1 ) ではないがやや高値であり、 ア トコ フエロールは有意 （ p = 0. 0 2 3 ) に低く、 ア トコフエロール// a トコフエロール比は有意 （ P = 0. 0 0 5 ) に低いという結果は 、 O h r v a l l Mら （1 9 9 6 )前掲の内容とほぼ一致した。

Claims

1. 超低比重型リポ蛋白 （VL D L) 中のア トコフエロールノコ レステロール値を用いる糖尿病の病態の判定方法。
2. 超低比重型リポ蛋白 （VL D L) 中のア トコフエロール コ レステロール値が、 健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態 請
を有すると判定し、 健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の 病態を有しないと判定する、 請求項 1記載の方法。
3. 超低比重型リポ蛋白 （V L D L) 中のア トコフエロール コ レステロール値を用いる冠動脈疾患のリスクの判定方法。
4. 超低比重型リポ蛋白 （V L D L) コ囲レステロール値が健常人 の平均値に比べ低い場合において、 超低比重型リポ蛋白 （V L D L ) 中のア トコフエロール /コレステロール値が、 健常人の平均値に 比べ低い場合は冠動脈疾患のリスクを有すると判定し、 健常人の平 均値に比べ低くない場合は冠動脈疾患のリスクを有しないと判定す る、 請求項 3記載の方法。
5. 低比重型リポ蛋白 （L D L) 中の α トコフエロール/コレス テロール値を用いる糖尿病の病態の判定方法。
6. 低比重型リポ蛋白 （L D L) 中の α トコフエロール/コレス テロール値が、 健常人の平均値に比べ高い場合は糖尿病の病態を有 すると判定し、 健常人の平均値に比べ高くない場合は糖尿病の病態 を有しないと判定する、 請求項 5記載の方法。
7. 低比重型リポ蛋白 （L D L) 中のひ トコフエロール/コレス テロール値を用いる心筋梗塞の病態の判定方法。
8. 低比重型リポ蛋白 （L D L ) 中のひ トコフエロール/コレス テロール値が、 健常人の平均値に比べ高い場合は心筋梗塞の病態を 有すると判定し、 健常人の平均値に比べ高くない場合は心筋梗塞の 病態を有しないと判定する、 請求項 7記載の方法。
9. 超低比重型リポ蛋白 （V L D L ) 中の トコフエロール コ レステロール値を用いる糖尿病の病態の判定方法。
1 0. 超低比重型リポ蛋白 （V L D L) 中の トコフエロール / コレステロール値が、 健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病 態を有すると判定し、 健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病 の病態を有しないと判定する、 請求項 9記載の方法。
1 1. 超低比重型リポ蛋白 （V L D L) 中の α トコフエ口一ル Z コレステロール値を用いる冠動脈疾患のリスクの判定方法。
1 2. 超低比重型リポ蛋白 （VL D L) コレステロール値が健常 人の平均値に比べ低い場合において、 超低比重型リポ蛋白 （V L D L ) 中の α トコフエロール Zコレステロール値が、 健常人の平均値 に比べ低い場合は冠動脈疾患のリスクを有すると判定し、 健常人の 平均値に比べ低くない場合は冠動脈疾患のリスクを有しないと判定 する、 請求項 1 1記載の方法。
1 3. 血液中のァ トコフエロール/ a トコフエロール比を用いる 糖尿病の病態の判定方法。
1 4. 血液中のァ トコフエロール /ひ トコフエロール比の値が、 健常人の平均値に比べ低い場合は糖尿病の病態を有すると判定し、 健常人の平均値に比べ低くない場合は糖尿病の病態を有しないと判 定する、 請求項 1 3記載の方法。
1 5. リポ蛋白を含む試料をイオン交換クロマトグラフに供して リポ蛋白を分離し、 分離したリポ蛋白を有機溶媒及び界面活性剤を 含む前処理液と反応させてビタミン Ε類を遊離させ、 次いで遊離し たビタミン Ε類を逆相クロマトグラフに供することを特徴とするリ ポ蛋白中のビタミン Ε類の分析方法。
1 6. 前記前処理液は、 イオン交換クロマトグラフで分離したリ ポ蛋白と反応させる段階で 1 0から 5 0 %となる有機溶媒と 0. 2 から 6. 0 %となる界面活性剤を含むものであることを特徴とする 請求項 1 5の分析方法。
1 7. 前記前処理液は、 更にイオン交換クロマトグラフで分離し たリポ蛋白と反応させる段階で 5 0から 1 5 0 mm o 1 ZLとなる カオトロピックイオンを含むものであることを特徴とする請求項 1 5又は 1 6 の分析方法。
1 8. —定量の試料を採取する試料導入部、 イオン交換カラムを 備えるイオン交換クロマトグラフ部、 イオン交換クロマトグラフ部 からの溶出液の一部又は全部を試薬と混合する試薬混合部、 逆相力 ラムを備える逆相クロマトグラフ部、 逆相クロマトグラフ部からの 溶出液について検出を行う検出部、 及び、 試料導入部で採取した試 料及びイオン交換クロマトグラフ用の溶離液を送液する送液部、 試 薬を送液する送液部、 イオン交換ク口マトグラフ部からの溶出液と 試薬とが混合された液を送液する送液部、 及び、 逆相クロマトダラ フ用の溶離液を送液する送液部を備える分析装置。
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