WO2007132888A1

WO2007132888A1 - 平滑筋収縮抑制剤

Info

Publication number: WO2007132888A1
Application number: PCT/JP2007/060031
Authority: WO
Inventors: Satoru Ohgiya; Naoki Morita; Keiko Hanada; Kahoko Ichise; Toshikatsu Kobayashi; Sei Kobayashi; Hiroko Kishi; Kazuo Miyashita; Masashi Hosokawa
Original assignee: National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology; Yamaguchi University; National University Corporation Hokkaido University
Priority date: 2006-05-16
Filing date: 2007-05-16
Publication date: 2007-11-22
Also published as: JPWO2007132888A1; JP5158715B2

Abstract

【課題】安定して供給でき、カルシウムイオン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えずに、カルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮の抑制剤を提供する。さらに、循環器系疾患治療剤および予防剤、さらにＦｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤を提供する。【解決手段】オクタデカペンタエン酸およびオクタデカテトラエン酸、これらの塩、並びにこれらのエステルからなる群より選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする、平滑筋収縮抑制剤、循環器系疾患治療剤および予防剤、Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤を用いる。また、脂質を含有する平滑筋収縮抑制剤であって、前記脂質の少なくとも１つのアシル鎖が、オクタデカペンタエン酸、オクタデカテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、平滑筋収縮抑制剤、循環器系疾患治療剤および予防剤、Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達系阻害剤を用いる。

Description

明細書

平滑筋収縮抑制剤

技術分野

[0001] 本発明は、平滑筋収縮抑制剤に関する。より詳しくは、平滑筋のカルシウム非依存性異常収縮の抑制剤、循環器系疾患治療剤および予防剤、さらに FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤に関する。

背景技術

[0002] 平滑筋の収縮には、細胞質のカルシウムイオン濃度の上昇に依存した収縮と、これに依存しな、収縮があることが知られて、る。

[0003] 即ち、神経刺激のような細胞膜脱分極の場合には、細胞質のカルシウムイオン濃度を上昇させ、カルシウムイオンカルモジュリン複合体を形成し、この複合体によつてミオシン軽鎖キナーゼが活性ィ匕されてミオシン軽鎖がリン酸ィ匕されて収縮を起こすものと考えられている。このようなカルシウムイオン依存性の平滑筋収縮は、正常な収縮と考えられている。

[0004] 一方、スフインゴシルホスホリルコリン（SPC)等の一部の血管収縮物質は、細胞質の Rhoキナーゼを介してカルシウムイオン感受性が増強され、カルシウムイオン濃度上昇を超える収縮またはカルシウムイオン濃度に依存しない収縮を起こすことが知られている。これらは、カルシウムイオン非依存性の収縮であり、異常な収縮と考えられている。例えば、 SPCは、細胞質のカルシウム濃度を上昇させることなぐ Srcファミリーチロシンキナーゼの 1種である Fynを活性ィ匕し、さらに Rhoキナーゼを活性ィ匕し、ミオシン軽鎖をリン酸ィ匕して、カルシウムイオン非依存的に平滑筋を収縮させると考えられている（麻酔、 47卷、 5号、 530— 540ページ、 1998年）。

[0005] このようなカルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮阻害剤としては、 Rhoキナーゼ阻害剤であるファスジル酸または Y— 27632が知られている（Nature, 389卷、 10 月 30曰号、 990— 994頁、 1997年）。し力しな力 Sら、これらの薬剤 ίま、カノレシクム依存性収縮を抑制する作用も有しているため、副作用のみならず、その治療効果に限界がある。従って、選択的にカルシウム非依存性収縮のみを抑制する作用をもつ薬物が切望されて、るのが現状である。

[0006] また、特開 2001— 261556には、エイコサペンタエン酸（EPA)が、カルシウムィォン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えずに、 Fynの活性ィ匕を阻害することによつて、カルシウムイオン非依存的な異常収縮のみを選択的に抑制することが報告されている。

[0007] し力し、特開 2001— 261556には、エイコサペンタエン酸のナトリウム塩が平滑筋収縮抑制作用を有して、るが、エイコサペンタエン酸のェチルエステルおよびエイコサペンタエン酸のトリグリセリドには、平滑筋収縮抑制作用がないことが記載されている。

[0008] また、エイコサペンタエン酸は、内服のみが可能であり、急性発症した血管病に的確に対応できな、場合がある。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明の課題は、カルシウムイオン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えずに、カルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮の抑制剤および予防剤を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは、特定のァシル基を有する脂質、並びにォクタデカペンタエン酸およびォクタデカテトラェン酸が上記課題を解決することを見出し、本発明を完成させた。

[0011] 即ち、本発明は、ォクタデカペンタエン酸およびォクタデカテトラェン酸、これらの塩、並びにこれらのエステル力なる群より選択される少なくとも 1種を含有することを特徴とする、平滑筋収縮抑制剤である。

[0012] また、本発明は、脂質を含有する平滑筋収縮抑制剤であって、前記脂質の少なくとも 1つのァシル鎖力ォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸およびエイコサペンタエン酸力なる群より選択される少なくとも 1種であることを特徴とする、平滑筋収縮抑制剤である。

[0013] また、本発明は、脂質が、単純脂質または複合脂質である、上記の平滑筋収縮抑制剤である。 [0014] また、本発明は、単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、上記の平滑筋収縮抑制剤である。

[0015] また、本発明は、グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである

、上記の平滑筋収縮抑制剤である。

[0016] また、本発明は、複合脂質が、リン脂質である、上記の平滑筋収縮抑制剤である。

[0017] また、本発明は、リン脂質力ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジォリピン、スフインゴミエリン、およびこれらのリゾ体からなる群より選ばれる少なくとも 1種であることを特徴とする、上記の平滑筋収縮抑制剤である

[0018] また、本発明は、ォクタデカペンタエン酸およびォクタデカテトラェン酸、これらの塩、並びにこれらのエステル力なる群より選択される少なくとも 1種を含有することを特徴とする、循環器系疾患治療剤である。

[0019] また、本発明は、脂質を含有する循環器系疾患治療剤であって、前記脂質の少なくとも 1つのァシル鎖力ォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸およびエイコサペンタエン酸カもなる群より選択される少なくとも 1種であることを特徴とする、循環器系疾患治療剤である。

[0020] また、本発明は、脂質が、単純脂質または複合脂質である、上記の循環器系疾患治療剤である。

[0021] また、本発明は、単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、上記の循環器系疾患治療剤である。

[0022] また、本発明は、グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである

、上記の循環器系疾患治療剤である。

[0023] また、本発明は、複合脂質が、リン脂質である、上記の循環器系疾患治療剤である

[0024] また、本発明は、リン脂質力ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジォリピン、スフインゴミエリン、およびこれらのリゾ体からなる群より選ばれる少なくとも 1種であることを特徴とする、上記の循環器系疾患治療剤である。

[0025] また、本発明は、循環器系疾患が血管攣縮である、上記の治療剤である。

[0026] また、本発明は、血管攣縮が、脳血管攣縮、冠状動脈攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮、および手指血管攣縮からなる群より選択される、上記の治療剤である。

[0027] また、本発明は、ォクタデカペンタエン酸およびォクタデカテトラェン酸、これらの塩

、並びにこれらのエステル力なる群より選択される少なくとも 1種を含有することを特徴とする、循環器系疾患予防剤である。

[0028] また、本発明は、脂質を含有する循環器系疾患予防剤であって、前記脂質の少なくとも 1つのァシル鎖力ォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸およびエイコサペンタエン酸カもなる群より選択される少なくとも 1種であることを特徴とする、循環器系疾患予防剤である。

[0029] また、本発明は、脂質が、単純脂質または複合脂質である、上記の循環器系疾患予防剤である。

[0030] また、本発明は、単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、上記の循環器系疾患予防剤である。

[0031] また、本発明は、グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである

、上記の循環器系疾患予防剤である。

[0032] また、本発明は、複合脂質が、リン脂質である、上記の循環器系疾患予防剤である

[0033] また、本発明は、リン脂質力ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジォリピン、スフインゴミエリン、およびこれらのリゾ体からなる群より選ばれる少なくとも 1種であることを特徴とする、上記の循環器系疾患予防剤である。

[0034] また、本発明は、循環器系疾患が血管攣縮である、上記の予防剤である。

[0035] また、本発明は、血管攣縮が、脳血管攣縮、冠状動脈攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮、および手指血管攣縮からなる群より選択される、上記の予防剤である。 [0036] また、本発明は、ォクタデカペンタエン酸およびォクタデカテトラェン酸、これらの塩、並びにこれらのエステル力なる群より選択される少なくとも 1種を含有することを特徴とする、 FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。

[0037] また、本発明は、脂質を含有する FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤であつて、前記脂質の少なくとも 1つのァシル鎖力ォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸力なる群より選択される少なくとも 1種であることを特徴とする、 FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。

[0038] また、本発明は、脂質が、単純脂質または複合脂質である、上記の FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。

[0039] また、本発明は、単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、上記の FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。

[0040] また、本発明は、グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである

、上記の FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。

[0041] また、本発明は、複合脂質が、リン脂質である、上記の FynZRhoキナーゼシダナル伝達系阻害剤である。

[0042] また、本発明は、リン脂質力ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジォリピン、スフインゴミエリン、およびこれらのリゾ体からなる群より選ばれる少なくとも 1種であることを特徴とする、上記の FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤である。

発明の効果

[0043] 本発明によれば、カルシウムイオン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えずに、カルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮の抑制剤および予防剤を提供することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0044] 本発明が対象とする平滑筋としては、臓器や部位等について特に制限はないが、例えば、血管平滑筋、消化器平滑筋、呼吸器平滑筋、子宮平滑筋等を挙げることができ、特に血管平滑筋を好ま、例として挙げることができる。 [0045] 本発明に用いるォクタデカペンタエン酸としては、特に制限はないが、例えば全一シス 3, 6, 9, 12, 15—ォクタデカペンタエン酸を好ましい例として挙げることができる。

[0046] また、本発明に用いるォクタデカテトラェン酸としては、特に制限はないが、例えば全一シス 6, 9, 12, 15—ォクタデカテトラェン酸を好ましい例として挙げることができる。

[0047] また、本発明に用いるエイコサペンタエン酸としては、特に制限はないが、例えば、全一シス一 5, 8, 11, 14, 17 エイコサペンタエン酸を好ましい例として挙げることができる。

[0048] ォクタデカペンタエン酸およびォクタデカテトラェン酸は、酸の形態のものの他、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニゥム塩の様な塩の形態のものでもよぐ特にナトリウム塩を好ましい塩として挙げることができる。また、オタタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸は、メチルエステル、ェチルエステル、ブチルエステル、グリセリルエステル等のエステルの形態でもよぐまた、ホスファチジルコリン等のリン脂質やその他の複合脂質の形態であってもよい。これらのなかで、特にェチルエステルを好ましいエステルとして挙げることができる。

[0049] 本発明に用いるォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸およびエイコサぺンタエン酸の製造方法としては、特に制限はなぐ化学合成によることや微生物に産生させることの他、海藻等の天然物力抽出することによつても製造することができる

[0050] 本発明に用いる特定のァシル基を有する脂質は、少なくとも 1つのァシル鎖がオタタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸またはエイコサペンタエン酸であれば、特に制限はなぐ単純脂質及び複合脂質を挙げることができる。

[0051] 単純脂質がグリセリドである場合は、ォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸またはエイコサペンタエン酸が結合するグリセロールの位置としては、 α位、 β位、 γ位のいずれであってもよぐ少なくとも 1つのァシル鎖がォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸またはエイコサペンタエン酸であれば良、。ォクタデカペンタェン酸、ォクタデカテトラェン酸またはエイコサペンタエン酸以外のァシル鎖としては、特に制限はなぐ例えば炭素数 1〜30の飽和若しくは不飽和脂肪酸を挙げることができる。また、少なくとも 1つのァシル鎖がォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸であれば、グリセロールに結合して、るァシル鎖は 3 つでも 2つでも 1つでも良い。以下、ァシル鎖がエイコサペンタエン酸であるモノァシルグリセリド及び少なくとも 1つのァシル鎖がエイコサペンタエン酸であるジァシルグリセリドを、それぞれ「EPA—モノグリセリド」、「EPA—ジグリセリド」ということがある。

[0052] 本発明に用いる少なくとも 1つのァシル鎖力ォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸である単純脂質を製造する方法としては、特に制限はないが、例えば、グリセリドの場合は、グリセロールとォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸またはエイコサペンタエン酸をリパーゼ等の酵素によって結合させ、クロマトグラフィー等で分画することにより、製造することができる。さらには、グリセロールとォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸またはエイコサペンタェン酸から化学合成する方法や、天然物力分離する方法を用いることもできる。

[0053] また、単純脂質がセラミドの場合は、スフインゴシンとォクタデカペンタエン酸、オタタデカテトラェン酸またはエイコサペンタエン酸を SCDaseなどの酵素によって結合させ、クロマトグラフィー等で分画することにより、製造することができる。さらには、スフィンゴシンとォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸またはエイコサペンタエン酸力化学合成する方法を用いることもできる。

[0054] 本発明に用いる複合脂質としては、その分子内に炭素原子、酸素原子、水素原子の他、リン原子および Zまたは窒素原子および Zまたは硫黄原子を含むものであれば、特に制限はないが、リン脂質を好ましい例として挙げることができる。

[0055] 本発明に用いるリン脂質としては、リン酸を含む脂質であれば特に制限はないが、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフインゴミエリンおよびそれらのリゾ体を挙げることができる。これらのなかで、特にホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルグリセロールを好ましいリン脂質として挙げることができる。なお、これらのリン脂質は、単独で用いることのほか、 2種以上を組み合わせて用いることもできる。 [0056] 複合脂質がグリセ口リン脂質である場合は、ォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸が結合するグリセロールの位置としては、 α位、 ι8位のいずれであってもよい。そして、グリセ口リン脂質が 2つのァシル鎖を有する場合、もう一方のァシル鎖としては、特に制限はなぐ例えば炭素数 1〜30の飽和若しくは不飽和脂肪酸を挙げることができ、これらのァシル鎖は分枝鎖を有していても良い。また、もう一方のァシル鎖力ォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸またはエイコサペンタエン酸であってもよい。これらのなかで、少なくとも 1つのァシル鎖がォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸またはエイコサペンタエン酸であるホスファチジルコリンを、好ましい例として挙げることができる。以下、少なくとも 1つのァシル鎖がエイコサペンタエン酸であるホスファチジルコリン、ホスファチジルェタノールァミン、ホスファチジルグリセロールを、それぞれ「EPA— PC」、「EPA— PE」、「 EPA—PG」ということがある。

[0057] 本発明に用いる複合脂質を製造する方法としては、特に制限はないが、例えばリン脂質の場合は、リゾリン脂質とォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸またはエイコサペンタエン酸をホスホリパーゼなどの酵素によって結合させ、クロマトグラフィ一等で分画することにより、製造することができる。さらには、リゾリン脂質とォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸またはエイコサペンタエン酸力化学合成する方法や天然物から分離する方法を用いることもできる。

[0058] 本発明が対象とする循環器系疾患としては、特に制限はないが、例えば、脳血管攣縮、冠状動脈攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮、および手指血管攣縮のような血管攣縮を挙げることができる。

[0059] 本発明にお、て、「FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤」とは、 SPC等の刺激により Fynチロシンキナーゼが活性ィ匕され、さらに Rhoキナーゼが活性ィ匕されることにより、タンパク質リン酸ィ匕が亢進する一連の経路の全部またはその一部を阻害するものをいう。

[0060] 本発明の平滑筋抑制剤、循環器系疾患治療剤若しくは予防剤、 FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤の剤形としては特に制限はなぐそれぞれの目的に応じて適宜決定されるが、例えば、錠剤、散剤、カプセル剤等の経口剤、注射剤、点眼剤、点鼻剤、貼付剤等を挙げることができる。

[0061] また、本発明の平滑筋抑制剤、循環器系疾患治療剤若しくは予防剤、 Fyn/Rho キナーゼシグナル伝達系阻害剤には、薬学上許容されるキャリアや他の成分を含むことができる。

[0062] 本発明の平滑筋抑制剤、循環器系疾患治療剤若しくは予防剤、 FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤の投与方法としては特に制限はなぐそれぞれの目的に応じて適宜決定されるが、例えば経口、動脈内、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、経皮、経粘膜などの投与方法を挙げることができる。特に、循環器系疾患治療剤の場合は、動脈や静脈への注射による投与を好ましい例として挙げることができる。

[0063] 本発明の平滑筋抑制剤、循環器系疾患治療剤若しくは予防剤、 FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤の投与量としては、それぞれの目的に応じて適宜決定され、その剤形、投与用法、症状の程度、性別、年齢、体重等により適宜調整されることとなる。例えば、循環器系疾患の治療剤として、動脈内あるいは静脈内への投与する場合は、通常 l〜200mg、好ましくは 5〜： L00mg、より好ましくは 10〜50mgのォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸または脂質を、 1日 1回または複数回に分けて投与される。また、循環器系疾患の治療剤として経口投与する場合は、通常 0. l〜9g、好ましくは 0. 5〜6g、より好ましくは l〜3gのォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラェン酸または脂質を、 1日 1回または複数回に分けて投与される。さらに、循環器系疾患の予防剤として経口投与する場合は、治療剤として投与する場合よりも一般的に少ない投与量となる。

実施例

[0064] < <実施例 1 :n— 3ォクタデカペンタエン酸、 n— 3ォクタデカテトラェン酸の調製 >

>

南極海産のハプト藻 B株を以下の様にして培養した。 500mLのフラスコに 400mL の培地を入れ、ハプト藻 B株を植菌し、 4°Cで 6— 9週間、白色蛍光灯の下 24時間明期条件下で計 16本静置培養した。培地は、人工海水 (マリンアートハイ、千寿製薬（株)） lOOmL当たり ImLの海産微細藻類用ダイゴ 1MK培地（日本製薬 (株)）を添加したものを使用した。 [0065] 培養後、遠心沈降法で細胞を回収し湿重量 1 lgの藻体を得た。常法 (Bligh, EG &Dyer WJ (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37 : 911— 7)に従って藻体より脂質抽出を行い 428mgの脂質を得た。得られた全脂質を、 10%塩ィ匕ァセチルを含むメタノール中で 100°C、 3時間反応させへキサン抽出物を 167mg得た。このへキサン抽出物の脂肪酸組成は、ミリスチン酸 11%、パルミチン酸 5%、 n— 3ォクタデカテトラェン酸 4%、 n— 3ォクタデカペンタエン酸 14%、 n— 3ドコサへキサェン酸 8%でめつに。

[0066] 次に、高度不飽和脂肪酸組成を上げるために薄層クロマトグラフィーを行った。へキサン抽出物をシリカゲル (シリカゲル 60、メルク社）に塗布し、展開溶媒へキサン：ジェチルエーテル = 19： 1を用いて、二重結合を分子内に 3個以上含む高度不飽和脂肪酸メチルエステル画分を 37mg回収した。このメチルエステル混合物の脂肪酸糸且成は、 n— 3ォクタデカテトラェン酸 14%、 n— 3ォクタデカペンタエン酸 36%、 n— 3ドコサへキサェン酸 34%であり、ミリスチン酸、パルミチン酸は殆ど検出されなかつた。

[0067] この高度不飽和脂肪酸メチルエステル混合物中の n— 3ォクタデカペンタエン酸メチルエステル、 n— 3ォクタデカテトラェン酸メチルエステルを液体クロマトグラフィーにより精製した。用いたカラムは ODS逆相カラム (TSK— GEL ODS— 120T、内径 4. 6mm、長さ 250mm、東ソー（株））で、溶媒はァセ卜-トリル：水 =85： 15、 205 nm波長の紫外吸光度計で検出することにより n— 3ォクタデカペンタエン酸メチルェステル、 n— 3ォクタデカテトラェン酸メチルエステルを回収した。回収した n— 3ォクタデカペンタエン酸メチルエステル、 n— 3ォクタデカテトラェン酸メチルエステルはそれぞれ 12mg、 6mgであり、その純度はガスクロマトグラフィー分析により、それぞれ 9 9. 7%、 91. 0%であった。

[0068] 得られた n— 3ォクタデカペンタエン酸メチルエステル、 n— 3ォクタデカテトラェン酸メチルエステルは、 0. 5NHC1を含むァセトニトリル：水 = 9 : 1溶液中で、 100°C、 3時間反応させ、遊離 n— 3ォクタデカペンタエン酸、遊離 n— 3ォクタデカテトラェン酸とした。

[0069] < <実施例 2 :n— 3ォクタデカテトラェン酸結合型セラミドの調製〉 > n— 3ォクタデカテトラェン酸（Cayman Chemical Company) 12. 8 mol、牛脳セレブロシド由来 D—スフインゴシン（SIGMA) 5. 12 μ molと SCDase (タカラバイォ） 80mUを 0. l%Triton X— 100を含む 25mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 0 ) 3. 2mlに分散させ、 37°Cで 40時間合成反応を行った。この酵素合成反応を計 14 本行った後、常法（Bligh, EG&Dyer WJ (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 3 7 : 911 - 7)に従って脂質抽出を行った。

[0070] 得られた脂質画分を調製用シリカゲル TLCプレート（シリカゲル 60、 0. 5mm厚、メルク社）に供し、ジェチルエーテル:酢酸（10 : 0. 1, v/v)にて展開した。合成された n— 3ォクタデカテトラェン酸結合型セラミドのスポットを分画した後、シリカゲルより抽出し 3. 2mgの n— 3ォクタデカテトラェン酸結合型セラミドを得た。

[0071] < <実施例 3 :EPA—PCの調製 > >

エイコサペンタエン酸（EPA) 180mgと卵黄由来のリゾホスファチジルコリン 1 lOmg をグリセロール 5500mg〖こ分散させ，これにブタ脾臓由来ホスホリパーゼ A2 23mg ,フオルムアミド 0. 5ml, CaCl 3 molを添加し、 37。Cの喑所にて 50— 200rpmで

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攪拌しながら 48時間合成反応を行った。反応終了後， Folch法 Ci. Biol. Chem. 1 46, 35—44 (1942) )により脂質画分を回収した。

[0072] 得られた脂質画分を調製用シリカゲル TLCプレート（シリカゲル 60、 0. 5mm厚、メルク社）〖こ供し，クロ口ホルム：メタノール：水（65 : 25 :4, vZvZv)にて展開した。合成された EPA結合型ホスファチジルコリン (EPA— PC)のスポットを分画した後、シリカゲルより抽出し 90 mgの EPA— PCを得た。調製した EPA— PCには、 46. 6 %の EPAが含まれて!/、た。

[0073] < <実施例 4 :EPA— PE、 EPA— PGの調製〉 >

lOOOmLのフラスコに 200mLの培地を入れ、 EPA生産細菌 Shewanella benth ica ATCC43991株を植菌し、 10°Cで 1週間、計 28本振とう培養した。培地は LB +Na培地（1. 0%トリプトン、 0. 5%酵母エキス、 3. 0%塩ィ匕ナトリウム）を用いた。

[0074] 培養後、遠心沈降法で細胞を回収し湿重量 36gの菌体を得た。常法 (Bligh, EG &Dyer WJ (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37 : 911— 7)に従って菌体より全脂質抽出を行ヽ 468mgの脂質を得た。得られた全脂質を薄層クロマトグラフィー（ TLC)プレート（シリカゲル 60、メルク社）に塗布し、展開溶媒クロ口ホルム:メタノール：水 =65 : 25 :4を用いて展開した。 EPAを多く含む PEおよび PGのスポットを搔き取りシリカゲルより各々抽出し、それぞれ 49mg、 27mgの脂質を得た。これら EPAを多く含む PEおよび PGを、各々 EPA—PEおよび EPA—PGとした。 EPA—PEおよび EPA— PGには、それぞれ 38%、 39%の EPAが含まれていた。

[0075] < <実施例 5 :EPA— PSの調製 > >

実施例 2で合成した EPA— PC 30mgを酢酸ェチル 2. 5mlに溶解させた後， 3. 4 Mの L セリンを含む 0. 2M酢酸緩衝液（pH5. 6) lmlを加えた。更に、ホスホリパーゼ D (Streptomyces sp. 由来）を lunit添カ卩して反応を開始した後、 37°Cの喑所にて 300— 400rpmで攪拌しながら 24時間ホスファチジル基転移反応を行った。反応終了後， Folch法 (J. Biol. Chem. 146, 35— 44 (1942) )により脂質画分を回収した。

[0076] 得られた脂質画分を調製用シリカゲル TLCプレート（シリカゲル 60、 0. 5mm厚、メルク社）〖こ供し，クロ口ホルム：メタノール：水（65 : 25 :4, vZvZv)にて展開した。合成された EPA結合型ホスファチジルセリン（EPA— PS)のスポットを分画した後、シリカゲルより抽出し 12mgの EPA— PSを得た。調製した EPA— PSには、 47%の E PAが含まれていた。

[0077] < <実施例 6 :酵素合成 EPA— PGの調製 > >

実施例 2で合成した EPA— PC 50mgを酢酸ェチル 2. 2mlに溶解させた後， 14 mgの牛血清アルブミンを含む 0. 2M酢酸緩衝液（pH5. 6) 1. 2mlをカ卩えた。更に、グリセロール 400 μ 1とホスホリパーゼ D (Streptomyces sp. 由来）を 2. 4units添加して反応を開始した後、 37°Cの暗所にて 300— 400 rpmで攪拌しながら 4時間ホスファチジル基転移反応を行った。反応終了後， Folch法 (J. Biol. Chem. 146, 35—44 (1942) )により脂質画分を回収した。

[0078] 得られた脂質画分を調製用シリカゲル TLCプレート（シリカゲル 60、 0. 5mm厚、メルク社）〖こ供し，クロ口ホルム：メタノール：水（65 : 25 :4, vZvZv)にて展開した。合成された EPA結合型グリセロール (EPA— PG)のスポットを分画した後、シリカゲルより抽出し 20 mgの酵素合成 EPA— PGを得た。調製した酵素合成 EPA— PGには、 50%の EPAが含まれていた。

[0079] < <実施例 7 :EPA モノグリセリド、 EPA—ジグリセリドの調製〉 >

EPA300mgとグリセロール 5gを α トコフエロール 9mg存在下で十分に分散させた後，これに Lipozyme RM IM (Novozymes AZS) 30mgを添カ卩し、 37°Cの暗所にて 300— 400rpmで攪拌しながら 24時間合成反応を行った。反応終了後，ジェチルエーテル：水（1 : 1, vZv)を用いて分配を行い、ジェチルエーテル層より脂質画分を回収した。

[0080] 得られた脂質画分を調製用シリカゲル TLCプレート（シリカゲル 60、 0. 5mm厚、メルク社）に供し， n—へキサン:エーテル（60 :40, v/v)にて展開した。合成された EPA モノグリセリド、 EPA—ジグリセリド（1, 2—EPA—ジグリセリドと 1, 3—EP A—ジグリセリドの混合物として回収）とのスポットを分画した後、シリカゲルより抽出し 80mgの EPA—モノグリセリド、 90mgの EPA—ジグリセリドを得た。

[0081] < <実施例 8 :張力試験 > >

<標本 >

ブタ冠状動脈 (左前下行枝)を主幹分岐部力 lcm遠位で約 3cm切り取り、あらかじめ混合ガス（95%0 , 5%CO )を通気し氷冷した Krebs液（123mM NaCl, 4.

2 2

7mM KC1, 15. 5mM NaHCO , 1. 2mM KH PO , 1. 2mM MgCl , 1.

3 2 4 2

25mM CaCl , 11. 5mM D— glucose)に浸した。以下のサンプノレ調製は、上記

2

Krebs液を 15分おきに交換しながら行った。血管の周りの脂肪を取り除いたあと、外膜を取り除き、綿棒で内皮を除去し、剃刀を用いて平滑筋条片 lmm X 4mmを作製した。

[0082] <試料 >

ォクタデカペンタエン酸は、実施例 1にしたがって得られたものについて、溶媒をェタノールに置換した後、 Krebs液で最終濃度となるように希釈して用いた。 EPA-P Cは、実施例 3にしたがって得られたものを、濃度を調整して用いた。 EPA— PE、 EP A— PGは、実施例 4に従って得られたものを、 EPAの含量を元に、 EPAの濃度として最終濃度になるように調整して用いた。ォクタデカテトラェン酸、ォクタデカペンタェン酸は、実施例 1にしたがって得られたものについて、溶媒をエタノールに置換した後、 Krebs液で最終濃度となるように希釈して用いた。 EPA—モノグリセリド、 EPA ージグリセリドは、実施例 7にしたがって得られたものについて、溶媒をエタノールに置換した後、 Krebs液で最終濃度となるように希釈して用いた。 EPA— PSは、実施例 5に従って得られたものについて、溶媒を窒素ガスで揮発後、少量の Krebs液を加えて超音波処理で懸濁し、これを更に Krebs液で最終濃度となるように希釈して用いた。酵素合成 EPA— PG、ォクタデカテトラェン酸セラミドは実施例 6、実施例 2にしたがって得られたものについて、溶媒をエタノールに置換した後、 Krebs液で最終濃度となるように希釈して用いた。

[0083] <装置 >

標本をつるしたワイヤーをトランスデューサー（FDピックアップ：日本光電）につなぎ、増幅器 (歪圧力用アンプ：日本光電)を通して記録計 (卓上型ペンレコーダー U— 2 28 : Pantos)で張力を検出した。標本は 37°Cに保った 5mLのマグヌス管中にひたし、試験液は 37°Cに保ち混合ガスを負荷したものを用いた。

[0084] <測定方法 >

レファレンス（100%)の収縮として、 118mM高カリウム溶液による脱分極性のカルシゥム依存性収縮を 15分間起こし、その後 Krebs液で 15分間弛緩させる操作を繰り返し、高カリウム脱分極による張力の波形が安定してきたところで、 40mMカリウム溶液を加え、その収縮がプラトーに達したところでブラジキュン 1 Mをカ卩えて、内皮の有無を確認した。ブラジキュンによって平滑筋が弛緩しないことにより、内皮が除去されていると判断した。その後、 Krebs液で 20分弛緩させ、 SPC30 /Z Mで刺激をカロえた。更に、 SPC刺激による張力が最大、かつ、プラトーになったところで、ォクタデカペンタエン酸、 EPA— PC、 EPA (参考例）を最終濃度が 60 Mになるように加えた。 EPA— PE、 EPA— PGは、 EPAの含量を元に、 EPAの最終濃度が 60 μ Μとなるようにカ卩えた。ォクタデカテトラェン酸は最終濃度が 60 Μになるようにカ卩えた。 ΕΡ Α—モノグリセリド、 ΕΡΑ—ジグリセリドは ΕΡΑの含量を元に、 ΕΡΑの最終濃度が 60 μ Μとなるように加えた。 ΕΡΑ— PS、酵素合成 EPA— PGは EPAの含量を元に、 E PAの最終濃度が 60 Mとなるようにカ卩えた。ォクタデカテトラェン酸セラミドは、オタタデカテトラェン酸の含量を元に、ォクタデカテトラェン酸の最終濃度が 60 Mとなるように加えた。

[0085] <結果 >

図 1に EPAによる参考例を、図 2にォクタデカペンタエン酸による実施例を、図 3に EPA— PCによる実施例を、図 4に EPA— PEによる実施例を、図 5に EPA— PGによる実施例を、図 6にォクタデカテトラェン酸による実施例を、図 7に EPA—モノダリセリドによる実施例を、図 8に EPA—ジグリセリドによる実施例を、図 9に EPA— PSによる実施例を、図 10に酵素合成 EPA— PGによる実施例を、図 11にォクタデカテトラエン酸セラミドによる実施例それぞれ示す。

[0086] いずれもブラジキュンによる内皮依存性弛緩反応は観察されな力つたので、内皮細胞は除去されて、る血管であることがわかる。

[0087] 図 1〜： L 1より、ォクタデカペンタエン酸および EPA— PC、 EPA— PE、 EPA— PG 、ォクタデカテトラェン酸、 EPA—モノグリセリド、 EPA—ジグリセリド、 EPA— PS、酵素合成 EPA— PG、ォクタデカテトラェン酸セラミドは、 EPAと同様に SPCによる異常収縮を抑制することがわかる。

産業上の利用可能性

[0088] 本発明によれば、カルシウムイオン依存性の正常な平滑筋収縮に影響を与えずに、カルシウムイオン非依存性の平滑筋収縮の抑制剤および予防剤を提供することができる。

図面の簡単な説明

[0089] [図 1]図 1は、平滑筋組織における SPC刺激に対する EPAによる収縮抑制を示す図である。

[図 2]図 2は、平滑筋組織における SPC刺激に対するォクタデカペンタエン酸による収縮抑制を示す図である。

[図 3]図 3は、平滑筋組織における SPC刺激に対する EPA— PCによる収縮抑制を示す図である。

[図 4]図 4は平滑筋組織における SPC刺激に対する EPA— PEによる収縮抑制を示す図である。

[図 5]図 5は平滑筋組織における SPC刺激に対する EPA— PGによる収縮抑制を示す図である。

[図 6]図 6は平滑筋組織における SPC刺激に対するォクタデカテトラェン酸による収縮抑制を示す図である。

[図 7]図 7は平滑筋組織における SPC刺激に対する EPA—モノグリセリドによる収縮抑制を示す図である。

[図 8]図 8は平滑筋組織における SPC刺激に対する EPA—ジグリセリドによる収縮抑制を示す図である。

[図 9]図 9は平滑筋組織における SPC刺激に対する EPA— PSによる収縮抑制を示す図である。

[図 10]図 10は平滑筋組織における SPC刺激に対する酵素合成 EPA—PGによる収縮抑制を示す図である。

[図 11]図 11は平滑筋組織における SPC刺激に対するォクタデカテトラェン酸セラミドによる収縮抑制を示す図である。

Claims

請求の範囲

[I] ォクタデカペンタエン酸およびォクタデカテトラェン酸、これらの塩、並びにこれらのエステル力もなる群より選択される少なくとも 1種を含有することを特徴とする、平滑筋収縮抑制剤。

[2] 脂質を含有する平滑筋収縮抑制剤であって、

前記脂質の少なくとも 1つのァシル鎖力ォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸力なる群より選択される少なくとも 1種であることを特徴とする、平滑筋収縮抑制剤。

[3] 脂質が、単純脂質または複合脂質である、請求項 2に記載の平滑筋収縮抑制剤。

[4] 単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、請求項 3に記載の平滑筋収縮抑制剤。

[5] グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである、請求項 4に記載の平滑筋収縮抑制剤。

[6] 複合脂質が、リン脂質である、請求項 3に記載の平滑筋収縮抑制剤。

[7] リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、力ルジオリピン、スフインゴミエリン、およびこれらのリゾ体力もなる群より選ばれる少なくとも 1種であることを特徴とする、請求項 6に記載の平滑筋収縮抑制剤。

[8] ォクタデカペンタエン酸およびォクタデカテトラェン酸、これらの塩、並びにこれらのエステルカゝらなる群より選択される少なくとも 1種を含有することを特徴とする、循環器系疾患治療剤。

[9] 脂質を含有する循環器系疾患治療剤であって、

前記脂質の少なくとも 1つのァシル鎖力ォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸力なる群より選択される少なくとも 1種であることを特徴とする、循環器系疾患治療剤。

[10] 脂質が、単純脂質または複合脂質である、請求項 9に記載の循環器系疾患治療剤。

[II] 単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、請求項 10に記載の循環器系疾患治療剤。

[12] グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである、請求項 11に記載の循環器系疾患治療剤。

[13] 複合脂質が、リン脂質である、請求項 10に記載の循環器系疾患治療剤。

[14] リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、力ルジオリピン、スフインゴミエリン、およびこれらのリゾ体力もなる群より選ばれる少なくとも 1種であることを特徴とする、請求項 13に記載の循環器系疾患治療剤。

[15] 循環器系疾患が血管攣縮である、請求項 8〜14のいずれかに記載の治療剤。

[16] 血管攣縮が、脳血管攣縮、冠状動脈攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮、および手指血管攣縮力なる群より選択される、請求項 15に記載の治療剤。

[17] ォクタデカペンタエン酸およびォクタデカテトラェン酸、これらの塩、並びにこれらのエステルカゝらなる群より選択される少なくとも 1種を含有することを特徴とする、循環器系疾患予防剤。

[18] 脂質を含有する循環器系疾患予防剤であって、

前記脂質の少なくとも 1つのァシル鎖力ォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸力なる群より選択される少なくとも 1種であることを特徴とする、循環器系疾患予防剤。

[19] 脂質が、単純脂質または複合脂質である、請求項 18に記載の循環器系疾患予防剤

[20] 単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、請求項 19に記載の循環器系疾患予防剤。

[21] グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである、請求項 20に記載の循環器系疾患予防剤。

[22] 複合脂質が、リン脂質である、請求項 19に記載の循環器系疾患予防剤。

[23] リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、力ルジオリピン、スフインゴミエリン、およびこれらのリゾ体力もなる群より選ばれる少なくとも 1種であることを特徴とする、請求項 22に記載の循環器系疾患予防剤。

[24] 循環器系疾患が血管攣縮である、請求項 17〜23のいずれかに記載の予防剤。

[25] 血管攣縮が、脳血管攣縮、冠状動脈攣縮、肺血管攣縮、腸管膜血管攣縮、および手指血管攣縮カもなる群より選択される、請求項 24に記載の予防剤。

[26] ォクタデカペンタエン酸およびォクタデカテトラェン酸、これらの塩、並びにこれらのエステルカゝらなる群より選択される少なくとも 1種を含有することを特徴とする、 FynZ

Rhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤。

[27] 脂質を含有する FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤であって、

前記脂質の少なくとも 1つのァシル鎖力ォクタデカペンタエン酸、ォクタデカテトラエン酸およびエイコサペンタエン酸力なる群より選択される少なくとも 1種であることを特徴とする、 FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤。

[28] 脂質が、単純脂質または複合脂質である、請求項 27に記載の FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤。

[29] 単純脂質が、セラミドまたはグリセリドである、請求項 28に記載の FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤。

[30] グリセリドが、トリグリセリド、ジグリセリド、またはモノグリセリドである、請求項 29に記載の FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤。

[31] 複合脂質が、リン脂質である、請求項 28に記載の FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤。

[32] リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、力ルジオリピン、スフインゴミエリン、およびこれらのリゾ体力もなる群より選ばれる少なくとも 1種であることを特徴とする、請求項 31に記載の FynZRhoキナーゼシグナル伝達系阻害剤。