WO2007119692A1 - eIF4H発現抑制による癌細胞の増殖阻害方法 - Google Patents

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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]

Definitions

  • the measurement of the expression level of the eIF-4H gene can be quantitative, semi-quantitative, or qualitative depending on the measurement method and principle.
  • suppression of the expression can be detected significantly by qualitative determination.
  • the selection of the substance that suppresses the expression level can be performed by, for example, comparing with the expression level of the eIF_4H gene in the absence of the test substance.
  • Tumor cells LOVO and RKO, and lung fibroblast cell line MRC5 were purchased from RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Ibaraki, Japan).
  • Tumor cells LOVO and RKO, and normal cells MRC5 are 10% fetal bovine serum, lOOU / ml penicillin and 100 g / ml streptomycin, respectively (all purchased from Invitrogen, Carlsbad, CA) Cultivation was carried out at 37 ° C under 5% CO conditions using RPMI-1640 and IMDM.

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Abstract

本は集め意の目的は、癌、特に大腸癌に代表される消化器癌等のより有効で確実な検出・診断・治療を提供すること、及び、このような癌の遺伝子診断システムと遺伝子治療臨床研究システムの開発に利用される各種の生体分子の提供することである。 本発明は、eIF-4Hの発現を抑制することから成る、癌細胞の増殖阻害方法、eIF-4Hに特異的な siRNAを活性成分として含有する医薬組成物、及び、eIF-4Hの発現量に基く、癌細胞増殖阻害活性を有する物質のスクリーニング方法等に関する。  

Description

明 細 書
eIF4H発現抑制による癌細胞の増殖阻害方法
技術分野
[0001] 本発明は、真核生物翻訳開始因子（eucaryotic Initiation Factor 4H: elF- 4H)、特 にヒトの eIF-4H (以降、本明細書において、特に断わりのない限り、「eIF-4H」はヒト由 来の eIF-4Hを意味する）の発現を抑制することから成る、癌細胞の増殖阻害方法、 el F4Hに特異的な siRNAのような eIF4Hの発現を抑制し得る物質を活性成分として含 有する癌細胞増殖阻害剤、及び、 eIF-4Hの発現量に基ぐ癌細胞増殖阻害活性を 有する物質のスクリーニング方法等に関する。
背景技術
[0002] 今までに、二次元電気泳動（2— DE)及び質量分析等の種々のプロテオミクス技術 によって、癌の診断'治療に有用な癌特異的な蛋白質が同定されている。このような 癌特異的な蛋白質に関する研究の多くは、疾患特異的な様式で増加調節又は減少 調節されるものに焦点が当てられてきた。し力しながら、蛋白質の選択的スプライシン グ変異体及び蛋白質の翻訳後修飾に関する報告は余りない。
[0003] ヒト遺伝子の 60%が少なくとも一つの選択的スプライシング変異体 (バリアント）を有 しているといわれており (Black, D丄.（2003). Mechanisms of alternative pre— messeng er RNA splicing. Annu Rev Biochem 72, 291-336)、このような変異体が癌等のヒトの 疾患において重要な役割を担っていることも報告されている（Brinkman, B.M. (2004). Splice variants as cancer biomar ers.し lin Biochem 37, 584-594)。従って、このよつ な選択的スプライシング変異体は有力な診断ツール又は薬剤ターゲットに成る可能 '性があると考えられる。
[0004] 真核生物翻訳開始因子 4H (eucaryotic Initiation Factor 4H: eIF-4H)は最初にゥ サギ赤血球における翻訳を刺激する物質として同定された (Rogers, G.W., Jr., Richt er, N.J., ana Merrick, W.C. (1999). Biochemical and kinetic characterization of the RNA helicase activity of eukaryotic initiation factor 4A. J Biol Chem 274, 12236—12 244) o eIF_4Hは真核生物における翻訳開始因子ファミリーの一員として、 eIF_4F複 合体のサブユニットである eIF_4Aのへリカーゼ活性を促進することによって蛋白質合 成を刺激することが知られている（Richter-Cook, N.J., Dever, T.E., Hensold, J.O., a nd Merrick, W.し. (1998). Purincation and characterization of a new eukaryotic prot ein translation factor. Eukaryotic initiation factor 4H. J Biol Chem 273, 7579—7587; ) o更に、 eIF-4Hは他の幾つかの開始因子の活性を促進して、 4E-BP1による阻害等 の負調節を打ち消している可能性も指摘されている（Lin, T.A., Kong, X., Haystead, T.A., Pause, A., Belsham, G., bonenberg, N., ana Lawrence, J.し., Jr. (1994). PHA S— I as a link between mitogen— activated protein kinase and translation initiation. Sci ence 266, 653-656)。従って、 eIF-4Hは、 eIF-4E又は- 4Gの活性化を通じて直接的 又は間接的に様々な悪性腫瘍 (癌）関連 mRNAの翻訳を変化させることによって、 細胞増殖及び腫瘍形成に関与している可能性がある。
[0005] eIF_4H遺伝子は、 7ql l.23における隣接遺伝子群の欠損が原因である多重人格を 発生する疾患であるウイリアムズ症候群で欠損していることが知られている力 これが 該症候群の発生とどのような関係があるかにっ 、ては未だ解明されて 、な 、。該遺 伝子の選択的スプライシングによって 2つ変異体、即ち、ァイソフォーム 1及びァイソ フォーム 2 (ェクソン 5が欠失したもの）が生じ、これらは夫々、分子量 27kDa及び 25k Daを有する。これら 2つのアイソフォームの特異的な機能は未だ判っていないが、分 子量の小さ!/、ァイソフォーム 2はヒト細胞にお!、てはより多く存在して 、ることが知られ ている（Martindale, D.W., Wilson, M.D., Wang, D., Burke, R.D., Chen, X., Duronio , V., and Koop, B.F. (2000). Comparative genomic sequence analysis of the Williams syndrome region (LIMK1-RFC2) of human chromosome 7ql l.23. Mamm Genome 1 1, 890- 898 :非特許文献 1)。
[0006] 本発明者等は既に、原発大腸癌における蛋白質の発現をァガロース 2— DEを用 いて分析し、腫瘍組織とそれに隣接する正常組織の間で、幾つ力の蛋白質に関する pi及び分子量が異なることを見出し、その一つとして、 eIF_4Hの選択的スプライシン グ変異体であるアイソフォーム 1の発現が殆どの腫瘍組織にぉ 、て増加して 、ること 見出した (Tomonaga, T., Matsushita, K., Yamagucni, Oh- Ishi, M., Kodera, Y., Maeda, T., Shimada, H., Ochiai, T., and Nomura, F. (2004). Identification of altere d protein expression and post— translational modifications in primary colorectal cance r by using agarose two-dimensional gel electrophoresis. Clin Cancer Res 10, 2007—2 014 :非特許文献 2)。
非特許文献 l : Martindale, D.W., Wilson, M.D., Wang, D.， Burke, R.D., Chen, X., Duronio, V., and Koop, B.F. (2000). Comparative genomic sequence analysis of the Williams syndrome region (LIMK1-RFC2) of human chromosome 7ql l.23. Mamm Ge nome 11, 890-898
非特許文献 2 : Tomonaga, T.， Matsushita, K., Yamaguchi, S.， Oh-Ishi, M., Kodera, Y., Maeda, T., bhimada, H., Ochiai, T., and Nomura, F. (2004). Identification of alt ered protein expression and post— translational modifications in primary colorectal ca ncer by using agarose two-dimensional gel electrophoresis. Clin Cancer Res 10, 200 7-2014
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 従って、本発明は、癌、特に大腸癌に代表される消化器癌等のより有効で確実な検 出 '診断'治療を提供すること、及び、このような癌の遺伝子診断システムと遺伝子治 療臨床研究システムの開発に利用される各種の生体分子を提供すること等を目的と する。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者は上記課題を解決すベぐ大腸癌における上記の eIF4Hァイソフォーム 1の 過剰発現が細胞増殖及び腫瘍形成に与える影響を研究した。その結果、 eIF4H発現 を抑制することによって、大腸癌等の癌細胞の増殖が特異的に阻害され、アポトーシ スが誘導されることを見出し、本発明を完成した。
[0009] 即ち、本発明は、以下の各態様を含むものである。
[l] eIF-4Hの発現を抑制することから成る、癌細胞の増殖阻害方法
[2] eIF-4Hの発現を有意に抑制できる物質を活性成分として含有する医薬組成物。
[3] eIF-4Hの発現量に基ぐ癌細胞増殖阻害活性を有する物質のスクリーニング方 法。 発明の効果
[0010] 本発明によって、 eIF-4H、特に、 eIF4Hァイソフォーム 1の発現を抑制することによつ て、癌細胞の増殖を阻害する方法、更に、 eIF-4Hに特異的な siRNAのような eIF-4H 発現を抑制する物質を有効成分として含有する癌細胞に対する特異性が高い優れ た癌細胞増殖阻害剤 (抗癌剤)等が提供される。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]転写レベルにおける eIF-4Hァイソフォーム 1の過剰発現を示すグラフである。
[図 2]siRNAを用いた eIF-4Hの抑制による大腸癌細胞の増殖阻害を示す、ウェスタン プロット分析の結果 (ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真)等である。
[図 3]siRNA用いた eIF-4Hの抑制によっては肺繊維芽細胞株 MRC5の増殖は阻害さ れな 、ことを示す、ウェスタンブロット分析の結果 (ポリアクリルアミドゲル電気泳動の 写真)等である。
[図 4]eIF-4Hァイソフォーム 1の発現抑制によりアポトーシスが誘導されることを示す、 細胞フローサイトメトリー分析である。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明において、癌細胞における eIF-4Hの発現の抑制は、当業者に公知の任意の レベル、即ち、例えば、 eIF-4H遺伝子の転写レベル若しくは eIF-4H蛋白質の産生、 又は eIF_4H蛋白質の活性発現レベルで実施することが可能である。尚、対象となる 癌の種類に特に制限はないが、特に、大腸癌等に代表される消ィ匕器癌が好適である
[0013] 例えば、転写レベルでの抑制には、 eIF-4H遺伝子（DNA又は mRNA)を標的とす る siRNA等の RNA干渉 (RNAi)を誘導する核酸配列（eIF-4H遺伝子の部分塩基配 列に特異的な配列を有する一本鎖 RNA又は二本鎖 RNA)〖こよる遺伝子ノックダウ ン、アンチセンス RNA、又は各種のリボザィム等を用いる方法を挙げることが出来る 。又、 eIF_4H蛋白質の活性発現レベルでは、例えば、抗 eIF_4H抗体を用いる方法を 挙げることが出来る。
[0014] RNA干渉 (RNAi)を誘導する核酸は、 elF- 4Hの塩基配列（NM— 022170 (isoform 1 ), NM 031992 (isoform2)：データベース参照）に基き、当業者であれば、適宜設計 して調製することが出来る。その代表的な例としては、以下に示すいずれかの塩基配 列又はその一部の連続する塩基配列（例えば、 18〜20個の連続する塩基配列）を 含む 15〜30個の塩基力も成るオリゴヌクレオチド及びその相補的オリゴヌクレオチド から成る核酸配列、特に、 21〜23個の塩基力も成る siRNA (二本鎖 RNA)を挙げる ことが出来る。尚、かかる siRNAには、細胞内で上記核酸配列が Dicerにより消化さ れて生成されるものも含まれる。
[0015] (R102) 0 -aacccacagaagaggaaagag-3 ；
(R103) 0 -aatgggtagctctcgagaatc-3 ；
(R104) 0 - aatctagaggtggatgggatt- 3 ' 0
[0016] 特に、癌細胞で過剰発現している eIF4Hァイソフォーム 1に対して特異的に反応する 塩基配列である（103)又は（104)を含むオリゴヌクレオチドが好ましい。
[0017] 従って、本発明の医薬組成物、例えば、癌細胞増殖阻害剤は、上記に示したような el
F-4Hの発現を有意に抑制できる物質を活性成分として含有するものである。
[0018] 更に、上記の活性成分中で、 RNA又は DNAのような核酸分子は適当な発現べク ター等の当業者に公知の任意の各種の運搬ビークル内に組み込まれた状態で使用 することも可會である。
[0019] このような活性成分は当業者に公知の任意の方法、例えば、活性成分力 RNAの ような核酸分子である場合には、形質得転換法に使用される方法、例えば、リン酸力 ルシゥム法又は DOSPA (リポフエクタミン）等により構成される人工リボソームで DNA を包み込むリポフ クシヨン法等に基き対象細胞に取り込まれるようにすることが出来 る。
[0020] 又、上記の医薬組成物には、各種の有効成分と組合せて、薬学上許容できる、当 業者に公知の任意の医薬キャリア一又は希釈剤等のその他の成分を含むことが出 来る。
[0021] 本発明の有効成分の薬学的な有効量及び投与方法又は投与手段は、有効成分 の種類、病状の重さ、治療方針、患者の年齢、体重、性別、全般的な健康状態、及 び患者の (遺伝的)人種的背景に応じて、当業者が適宜選択することができる。例え ば、該有効成分の投与量は 0.1〜100mgZ日 Z成人、より一般的には l〜10mgZ日 z成人である。
[0022] 本発明の医薬組成物は投与方法'投与経路等に応じて当業者に公知の任意の形 状とすることが出来る。それらは適当な方法で投与することが出来る。例えば、形状と しては、液体状、粉末状、及びコロイド状等があり、上記のキャリアー又は希釈剤を伴 つた形で、静脈内、腹腔内、皮下に注射するか、又は、経口投与等が挙げられる。
[0023] 本発明のスクリーニング方法は、例えば、以下の工程で実施することが出来る。
(a)被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞における eIF-4H遺伝子の発現量を測定する工程、及び
(c)発現量を抑制させる物質を選択する工程。
[0024] ここで、工程 (b)における eIF_4H遺伝子の発現量は、当業者に公知の任意のレベル 、即ち、例えば、 eIF-4H遺伝子の転写レベル若しくは eIF-4H蛋白質の産生、又は el F-4H蛋白質の活性発現レベルで測定することが可能である。
[0025] eIF-4H遺伝子の発現量を測定は、測定方法 ·原理に応じて、定量的、半定量的、又 は定性的であり得る。特に、 eIF_4Hァイソフォームは癌細胞で過剰発現しているので 、その発現の抑制は定性的な判定で有意に検出することが可能となる。尚、発現量 を抑制させる物質の選択は、例えば、被検物質の非存在下での eIF_4H遺伝子の発 現量との比較をすることにより実施することが出来る。
[0026] eIF_4H蛋白質の産生量は、当業者に公知の任意の方法で測定することが可能で ある。例えば、適当な抗体を用いたウェスタンプロット等の免疫染色及び EIA等の各 種の免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークェンサ一等 ペプチドのアミノ酸配列分析法、更には、 MALDI— TOFZMS及び ESI Q— TO FZMS法等に代表される質量分析によって検出することが出来る。
[0027] 上記の方法の中でも、 eIF_4Hに特異的な抗体との抗原抗体反応によって該白質の 発現量を測定する検査方法が好適である。尚、ウェスタンプロット法においては、分 子量の違いに基き、ァイソフォーム 1及びアイソフォーム 2の夫々の発現量の変化を 測定することが可能となる。
[0028] 従って、上記抗体は、 eIF_4H又はその適当な部分ポリペプチド (ペプチド断片）又は それらの各種誘導体又は複合体等を抗原物質又は免疫原として用いて、当業者に 公知の適当な方法で調製することが可能である。例えば、ポリクローナル抗体の場合 には、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、 -ヮトリ等の適当な動物に投与し、その抗血清か ら調製することが可能である。或いは、モノクローナル抗体作成法（「単クローン抗体」
、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、 1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Go ding, third edition, Academic Press, 1996)等に記載の公知の細胞融合を用いる方 法でモノクローナル抗体として調製することも可能である。
[0029] 尚、このような抗体は、その元来の抗体活性を失わない限り、遺伝子工学 (DNA組 換え技術）により、例えば、 Fab, F(ab')、 Fv断片等の完全な抗体由来の各種誘導体
2
を含む、当業者に公知の様々な形態に改変された誘導体、組換え体又はフラグメン トであっても良い。
[0030] 更に、 eIF_4Hァイソフォーム 1のみ特異的に反応する抗体を使用して、例えば、 EIA 等の酵素免疫測定法により測定することが可能である。このような抗体には、酵素、 放射性同位体蛍光色素、及び金属原子等の当業者に公知の各種の標識物質で標 識されて!/ヽるちのち含まれる。
[0031] eIF_4Hをコードする cDNA又はそれに対応する mRNAを含む核酸分子又はそれら の一部力 なるオリゴヌクレオチド、又は、 eIF_4Hの各ァイソフォームに特異的な塩基 配列から成る DNAは、例えば、 eIF_4H遺伝子の塩基配列に基づき適宜設計したプ ライマー又はプローブを使用した RT— PCR法、リアルタイム PCR等の各種定量的 P CR法、並びに各種のマイクロアレイ (DNAチップ)法等の当業者に公知の方法で増 幅 ·検出することが出来る。 PCR法で増幅された核酸分子の検出 ·同定は、その塩基 配列を直接決定する方法 (シークェンス法）、又は電気泳動との組み合わせ等、適当 な方法で行うことが出来る。
[0032] 上記のプライマー又はプローブの塩基配列は、铸型との特異的な結合が可能となる ような塩基数、例えば、 15— 40塩基、より具体的には、 15— 25塩基程度を有するこ と力 子ましく、更には、プライマー内でヘアピン構造をとつたり、センス鎖とアンチセン ス鎖とが互いにアニーリングしないような塩基配列とすることも重要である。例えば、 0 ligoTM(National Bioscience Inc.製)のような市販のプライマー設計用のソフトウェアを 使用することも可能である。 [0033] 本発明のスクリーニング方法に使用されるキットは、測定対象又は測定原理等に応じ て、適当な構成をとることが出来る。該キットは、その構成要素として、例えば、抗 elF- 4H抗体、各種の二次抗体 (標識抗体）、上記の mRNA (cDNA)の増幅用プライマ 一及び DNAチップ等で使用するハイブリダィゼーシヨン用のプローブ（例えば、 10 〜 100個程度の連続した塩基配列から成る）を含むことが出来る。更に、上記キット には、その構成 ·使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例え ば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート (容器)等が含まれる。
実施例
[0034] 以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の 実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない 場合には、以下の実施例は、例えば、 Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausu bel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Y ork, N.Y, 1995等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分 子生物学的技術に従い、実施することが出来る。又、本明細書中に引用された文献 の記載内容は本明細書の開示、及び、内容の一部を構成するものである。
[0035] ヒト組織試料の接取
原発性大腸癌患者（ 10名）から術前に文書による同意を得て、術後 1時間以内に癌 部及び癌部から 5〜 10cm以内に位置する非癌組織を採取し、直ちに 80°Cの液 体窒素中で保存した。
[0036] 細朐焙着
2つの大腸癌細胞である LOVO及び RKO、並びに肺繊維芽細胞株 MRC5は RIKEN Cell Bank (日本茨城県つくば巿)から購入した。腫瘍細胞である LOVO及び RKO、並 びに、正常細胞である MRC5は、夫々、 10%牛胎児血清、 lOOU/mlペニシリン及び 1 00 g/mlストレプトマイシン（これらは全て、 Invitrogen, Carlsbad, CA力 購入）添カロ の RPMI- 1640及び IMDMを用いて、 5%CO条件下、 37°C培養した。
2
[0037] リアルタイム定量的 RT -PCR
Total RNAは癌部、非癌部から RNeasy™ Mini Kit (Qiagen)を用いて抽出した。 cDNA は total RNAから 1st strand cDNA Synthesis Kitを用いて合成した（Roche, Mannhei m, Germany)。 LightCycler (Roche, Mannheim, Germany)を用いた elF- 4H cDNA の Realtime quantitative PCRは、 LightCyclerキヤピラリー中の LightCyclere DNA Master ¾ BR reen I (rastStart faqDNA polymerase, deoxynucleotide tnpnosphate , buffer, SYBR Green 1)、 3.0 mM MgC12、及び 0.5 μ Mの各プライマー配列（forward primer:5 '一 TTCCTCTCGGAGCGGAGACG— 3 ' ,
reverse primer： 5 ' - GGAATCCCATCCACCTCTAG- 3 ' )を含有する反応液（20 μ 1) で行った。铸型 cDNAの段階的希釈により PCR産物を直線領域で最適化した。定量 的 PCRの分析は LightCyclerソフトウェア 3.3版を用いて行った。
[0038] siRNAによる遣伝子ノックダウン
eIF-4HRNAを標的とする siRNAを用いて eIF_4Hの発現を抑制した。 siRNAは 化学合成のより作製した (Japan Bio Services 日本、埼玉県）その塩基配列は以下の 通りである（図 2)。尚、カツコ内の数字は eIF_4H遺伝子における塩基配列番号を示 す。
(R102) 5 -aacccacagaagaggaaagag- '； (59b- 616)
(R103) 0 - aatgggtagctctcgagaatc- 3 ； (411-4^1)
(R104) 5，- aatctagaggtggatgggatt- 3，（428-448)。
ここで、 siRNA-102塩基配列は 2つの選択的スプライシング変異体であるアイソフォ ーム 1及びアイソフォーム 2に共通するものであり、一方、 siRNA-103及び siRNA-104 はァイソフォーム 1のみに特異的なものである。 Blast分析（http：〃 www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/)によると該標的配列と他のヒト遺伝子との間に共通する領域は見出せ なかった。各細胞を 6ゥエルプレートで培養し、リポフエクタミン 2000 (Invitrogen, Carls bad, CA)を用いて上記の siRNAをトランスフエクシヨンした。 48時間後に大腸癌及び 正常繊維芽細胞を採取し、以下のウェスタンプロット分析、細胞増殖アツセィ (MTS アツセィ）、及び細胞周期分析に供した。
[0039] ウェスタンブロット分析
各細胞溶解物からの蛋白質 (総 30 μ g)を 10-20%勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳 動（Bio- Rad, Hercules, CA)にかけて分離した。 Tank- transfer装置（Bio- Rad)を用い て蛋白質をポリビ-リデンフルオライド膜 (Milipore, Bedford, MA)に移し、この膜を 5 %スキムミルク含有 PBSでブロックした。ゥサギ抗 elF- 4H抗体 (Japan Bio Services調 製）及びャギ抗 j8 -ァクチン抗体（Cappel, West Chester, PA)を上記ブロッキング緩 衝液中で 1:500に希釈したものを一次抗体として使用した。更に、夫々、ブロッキング 緩衝液中で 3000倍希釈のャギ抗ゥサギ IgG西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識抗体（ Bio-Rad)、及び、ブロッキング緩衝液中で 500倍希釈のゥサギ抗ャギ IgG西洋ヮサビ ペルォキシダーゼ標識抗体（Cappel, West Chester, PA)を二次抗体として使用した 。 |¼上の抗原 白質は ECL detection reagents (Amersham Pharmacia Biothech)で 検出した。
[0040] 細朐増殖アツセィ
翌日に 50%集密（コンフルェント）状態になるように細胞を 96穴ゥエルに播き、 Lipof ectamine 2000試薬を用いて上記の siRNAをトランスフエクシヨンした。細胞を 37°C、 5 %CO条件下で 48時間培養した。試薬製造者の指示に従い、 3 - (4, 5 ジメチル
2
チアゾール—2—ィル）—5— (3—カルボキシメトキシフエ-ル）—2— (4—スルホフ ヱニル） 2H—テトラゾリゥム（MTS)染料の吸収を測定することにより、細胞の増殖 を評価した。吸収は、 Wallac 1420 ARVOsx Multilabel Counter (Perkin- Elmer, Toky o, Japan)を用いて行った。実験は 2回の独立系で、夫々、平行して 8回繰り返した。
[0041] 細胞周期分析
LOVO、 RKO及び MRC5細胞を 6穴ゥエルに播き、翌日、上記のように siRNAをト ランスフエクシヨンし、 48時間培養した。その後、 70%エタノールで固定し、 200 μ g/m 1 Rnase存在下 50 g/mほゥ化プロビジゥム（和光純薬、 日本)含有 PBS溶液で処理 した。次 ヽで、 FAし S し aliber cytometer (Beccton Dickinson, banjose, し A, USA)を用 いて細胞を細胞周期分析した。各試料につき少なくとも 10,000個の細胞を計測し、得 られたデータは Cell Questプログラム（Beccton Dickinson, Sanjose, CA, USA)により 分析した。
[0042] 結果（1)：転写レベルにおける eIF-4Hァイソフォーム 1の渦剰発現
既に記載したように、本発明者が以前に、 eIF-4Hの選択的スプライシング変異体で あるアイソフォーム 1が原発性大腸癌の殆どの腫瘍組織にぉ 、て過剰発現して!/、るこ とを報告して 、る。この eIF-4Hァイソフォーム 1の過剰発現を転写レベルで確認すベ く、上記のようにリアルタイム定量的 RT-PCRを行った。その結果、 elF- 4Hアイソフォ ーム lmRNAレベルは腫瘍組織において有意（P〈0.01)に増加していることが示され、 過剰発現が転写レベルで起こって 、ることが確認された（図 1)。
[0043] 結 (2)： eIF-4Hの抑制による大腸癌細胞の增 阳.害
eIF_4Hァイソフォーム 1が細胞増殖及び腫瘍形成に関与しているカゝ否かを検討すベ く、 RNAi法を用いて eIF-4H発現を抑制した。これに用いた 3種類の siRNAは eIF-4H 読取枠の夫々異なる領域を標的をすべく設計された（図 2A,B)。 2つの大腸癌細胞 である LOVO及び RKOの siRNA処理後 48時間後に、 （R102)は elF- 4Hの 2つのアイソ ファームの両方を抑制した。一方、（R103)及び (R104)は eIF-4Hァイソフォーム 1のみ を抑制した（図 2B, C)。従って、これら 3種類の siRNAを更なる分析に使用した。
[0044] 即ち、 siRNA処理後 48時間後に実施した MTSアツセィの結果によれば、 eIF-4Hの 2 種類のァイソフォームの発現が (R102)により抑制されると、細胞増殖が 50%も顕著に 阻害された。驚くべきことに、（R103)及び (R104)を用いて eIF-4Hァイソフォーム 1のみ を抑制した場合にも、細胞増殖が同様の程度阻害された（図 2D, E)。 尚、（R104)と 比べて、（R103)の方が増殖阻害効果が高ぐこれは eIF_4Hァイソフォーム 1のノックダ ゥンレベルの結果（図 2B, C)とも一致した。これらの結果から、 eIF-4Hァイソフォーム 1が大腸癌細胞の増殖において重要な役割を担っていることが示された。
[0045] 結 (3)： eTF-4Hの ¾制による肺繊維莽細胞株の谐 阳害
eIF_4Hアイソフォーム 1による細胞増殖効果が癌細胞に特異的力、又はより一般的 な特徴力どうかという問題を解決すベぐ正常ヒト肺繊維芽細胞株 MRC5の増殖に対 する eIF-4H抑制による効果を検討した。 siRNA処理 48時間後のウェスタンブロット分 祈の結果によれば、 MRC5における eIF-4Hァイソフォーム 1の発現レベルは大腸癌細 胞株のそれよりも低いにも拘らず、その発現レベルは検出不可能なレベルまで減少 した（図 3A)。し力しながら、大腸癌細胞株の場合と対照的に、 MRC5の細胞増殖に 対する RNAiによる阻害効果は得られな力 た（図 3B)。別の正常ヒト肺繊維芽細胞 株 WI38を用いた実験でも同様な結果が得られた。以上の結果から、 eIF-4Hアイソフ オーム 1の発現抑制により癌細胞の増殖が阻害されるが、正常ヒト肺繊維芽細胞株の 増殖は阻害されないことが判明し、 eIF-4Hアイソフォーム 1は大腸癌の治療剤の標的 として適当である可能性があることが示された。
[0046] 結果 (4)： elF- 4H 1の抑制によるアポトーシスの誘導
eIF_4Hアイソフォーム 1の発現抑制による細胞増殖の阻害効果が細胞周期の停止 によるものである力否かを検討するために、フローサイトメトリー分析を実施した。 siRN A処理した大腸癌細胞の細胞周期分布をコントロールのそれと比較した（図 4)。その 結果、（R103)で処理した細胞はコントロールと比較して、 sub- G1期細胞数が 3倍に増 加し、 S期細胞が減少した。このことは、 RNAiによる細胞増殖阻害がアポトーシスの誘 導に依るものであること示唆している。これについては、 eIF-4Hが低いレベルになつ た為に、 mRNAに対する eIF-4Aの親和性が減少し抗アポトーシス因子の翻訳効率が 低下した為である、という説明が可能である。従って、以上の結果から、 eIF_4Hァイソ フォーム 1はアポトーシス力 癌細胞を保護することによって増殖を刺激していること が示唆された。
産業上の利用可能性
[0047] 本発明によって、癌、特に大腸癌に代表される消ィ匕器癌等のより有効で確実な検出 •診断 '治療を提供すること、及び、このような癌の遺伝子診断システムと遺伝子治療 臨床研究システムの開発に利用される各種の生体分子を提供される。特に、 eIF-4H ァイソフォーム 1は大腸癌等の癌治療において、正常細胞に損傷をあたえず癌細胞 のみに特異的に作用する「magic bulletsj (Khosla, S. (2005). Magic bullets to kill na sty osteoclasts, Endocrinology 146, 3233- 3234)開発のための、有望な標的分子とな る可能性がある。

Claims

請求の範囲
[I] eIF-4Hの発現を抑制することから成る、癌細胞の増殖阻害方法。
[2] elF- 4Hが eIF4Hァイソフォーム 1である、請求項 1記載の方法。
[3] 発現の抑制が転写レベルで行われる、請求項 1又は 2記載の方法。
[4] eIF-4Hに特異的な siRNAによる遺伝子ノックダウンを用いる、請求項 1〜3のいずれ か一項に記載の方法。
[5] siRNAが以下に示す 、ずれかの塩基配列又はその一部の連続する塩基配列を含む
21〜23個の塩基力も成るオリゴヌクレオチド及びその相補的オリゴヌクレオチドから 成る二本鎖 RNAである、請求項 4記載の方法：
(R102) 0 -aacccacagaagaggaaagag-3 ；
(R103) 0 -aatgggtagctctcgagaatc-3 ；
(R104) 5 - aatctagaggtggatgggatt- 3 0
[6] 癌が消ィヒ器癌である、請求項 1〜5のいずれか一項記載の方法。
[7] 癌が大腸癌である、請求項 6記載の方法。
[8] アポトーシスが誘導されることにより癌細胞の増殖が阻害される、請求項 1〜7のいず れか一項記載の方法。
[9] eIF-4Hに特異的な siRNAを活性成分として含有する医薬組成物。
[10] 癌細胞増殖阻害剤である、請求項 9記載の医薬組成物。
[I I] eIF-4Hが eIF-4Hァイソフォーム 1である、請求項 10記載の癌細胞増殖阻害剤。
[12] siRNAが以下に示す 、ずれかの塩基配列又はその一部の連続する塩基配列を含む
21〜23個の塩基力も成るオリゴヌクレオチド及びその相補的オリゴヌクレオチドから 成る二本鎖 RNAである、請求項 10又は 11記載の癌細胞増殖阻害剤：
(R102) 0 -aacccacagaagaggaaagag-3 ；
(R103) 0 -aatgggtagctctcgagaatc-3 ；
(R104) 5 -aatctagaggtggatgggatt- 3 0
[13] 癌が消ィ匕器癌である、請求項 10〜 12のいずれか一項記載の癌細胞増殖阻害剤。
[14] eIF-4Hの発現量に基ぐ癌細胞増殖阻害活性を有する物質のスクリーニング方法。
[15] 請求 14に記載のスクリーニング方法であって、 (a)被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞における eIF-4H遺伝子の発現量を測定する工程、及び
(c)発現量を抑制させる物質を選択する工程、を含む方法。
[16] 工程 (b)における eIF_4H遺伝子の発現量の測定を、 eIF_4Hに対する抗体を使用して eIF_4H蛋白質の産生量の測定にて実施する、請求項 15記載のスクリーニング方法
[17] 工程 (b)における eIF-4H遺伝子の発現量の測定を、 eIF-4Hをコードする mRNA量の 測定にて実施する、請求項 15記載のスクリーニング方法。
[18] 請求項 14〜17のいずれか一項に記載のスクリーニング方法に用いるスクリーニング やット。
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