WO2007100154A1 - アレルギー疾患に対する制御性樹状細胞を用いた免疫細胞療法 - Google Patents

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Yasuyuki Ishii
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    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]

Definitions

  • the present invention relates to immune cell therapy for allergic diseases using regulatory dendritic cells, particularly intractable allergic diseases such as intractable asthma and topical dermatitis.
  • T H 1 immune responses are autoimmune diseases and rejection of transplantation
  • T H 2 immune responses are It is known to be involved in allergic diseases. These immune responses are important as host defense responses, and the strength of these immune responses is regulated by cytokines produced by T H 1 and T H 2 cells. This immune balance is called the T H 1 / T H 2 balance.
  • T H 1 / T H 2 balance is usually, in the immune response of a living body, a well-balanced response regulation of T H 1 and T H 2 is made.
  • T H 1 organ-specific autoimmune diseases such as multiple sclerosis (autoimmune encephalomyelitis) and rheumatoid arthritis are thought to develop.
  • T H 2 immediate allergies develop.
  • antiallergic drugs chemical transmitter release inhibitors, histamine antagonists, thromboxane synthase inhibitors, thromboxane antagonists, leukotrien antagonists, T H 2 site force-in inhibitors
  • antihistamines Coping therapy with drugs, corticosteroids, bronchodilators, and immunosuppressants (Takuguchi Limus Hydrate)
  • corticosteroids corticosteroids
  • bronchodilators bronchodilators
  • immunosuppressants Takuguchi Limus Hydrate
  • intractable asthma and atopic dermatitis which are not sufficiently effective with these allergic drugs, are a problem. For these reasons, there is an urgent need to establish a highly effective antigen-specific allergic treatment with reduced side effects.
  • CD8 cT myeloid dendritic cells have the ability to induce T H 2 cell differentiation and CD8 + lymphocyte dendritic cells have the ability to induce T H 1 cell differentiation.
  • CD8 cT Mieroi de type dendritic cells inhibit induced T H 1 immune response by CD8 a + lymphoid dendritic cells
  • CD8 a + lymphoid dendritic cells CD8 Fei - it can not be suppressed induced T H 2 immune response by myeloid ⁇ cells has been reported.
  • CD8 H ++ lymphocyte progenitor dendritic cells obtained from mice administered antigen and killed Listeria monocytogenes induce regulatory T (regulatory T; T R ) cells, and in a mouse experimental asthma model It has been reported to show a preventive effect.
  • DCs Dendritic cells
  • Immature DCs are present in peripheral tissues and have high antigen uptake capacity but low T cell stimulation ability. When immature DCs receive infection and inflammatory stimuli, they acquire high T cell stimulating ability with increased expression of co-stimulatory molecules such as CD40, CD80, and CD86 and migrate to peripheral lymphoid tissues. An immune response is induced by activating antigen-specific T cells (see Non-Patent Document 2; for dendritic cells, see Non-Patent Documents 3 to 10, etc.).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-298181
  • Non-Patent Document 1 Blood 90, 3245-3278 (1997)
  • Non-Patent Document 2 Annu. Rev, Immunol. 18, 767-811 (2000)
  • Non-patent literature 3 Proc. Natl. Acad, Sci, USA. 99, 351-358 (2002) Non-patent literature 4 Immunol. Rev. 196, 125-146 (2003)
  • Non-Patent Document 5 Immunity 18, 367-379 (2003)
  • Non-Patent Document 7 Immunity 18, 605-617 (2003)
  • Non Patent Literature 1 0 J. Immunol. 175, 1516-1522 (2005) Disclosure of the invention
  • the object of the present invention is to provide a therapeutic agent for allergic diseases comprising regulatory dendritic cells.
  • the purpose of the present invention is to provide a therapeutic agent that suppresses antigen-specific IgE production, which is a T H 2 type immune reaction, based on the induction effect of antigen-specific T-cells and regulatory T (T R ) cells.
  • the inventor suppresses antigen-specific IgE production, which is important for the development of allergic diseases, and suppresses airway hypersensitivity by using immunoregulatory cells (regulatory DCs; DC reg ) It was clarified that the onset of the disease was inhibited. Furthermore, it was found inhibitory effects via the induction of antigen-specific Anaji one T cell or T R cells as their mechanism of action. Previously, it was known that this regulatory dendritic cell has a therapeutic effect against T H 1 type immune disease, but it is also markedly accompanied by suppression of IgE production against asthma, which is a T H 2 type immune disease. It is surprising to show symptom suppression.
  • the present invention is as follows.
  • Regulatory dendritic cells prepared by culturing animal dendritic cells or their progenitor cells in vitro in the presence of at least IL-10, TGF-
  • IgE containing regulatory rod cells of [1] prepared by further culturing animal rod cells or their precursor cells in vitro in the presence of at least GM-CSF or GM-CSF and IL-4 Production inhibitor.
  • Regulatory dendritic cells of [1] or [2] prepared by culturing animal rod cells or their progenitor cells in vitro in the presence of LPS and / or TNF-ct. IgE production inhibitor containing. '
  • Animal dendritic cells or their progenitor cells are cultured in vitro in the presence of GM-CSF or GM-CSF and IL-4, IL-10 and TGF-] 31, [3] The IgE production inhibitor comprising regulatory dendritic cells prepared by culturing in the presence of a continuous antigen and then culturing in the presence of one or both of LPS and TNF-spleen.
  • the IgE production inhibitor of [6] which suppresses IgE production specific to the antigen used in the culture.
  • a pharmaceutical composition for treating allergic diseases comprising the IgE production inhibitor of any one of [1] to [7].
  • Dendritic cells collected from animals or their progenitor cells should be cultured in vitro in the presence of at least IL-10, TGF-] 3 and the antigen associated with allergic disease to be treated.
  • a method for producing a controllable dendritic cell for treating allergic diseases should be produced.
  • [1 3] The method for producing a regulatory dendritic cell for treating allergic disease according to any one of [9] to [12], wherein the animal dendritic cell or its precursor cell is a monocyte-derived rod-shaped cell. .
  • the dendritic cell or its precursor cell is a human dendritic cell or its precursor cell, [9 :! The method for producing a controllable dendritic cell for treating allergic disease according to any one of [1 3].
  • FIG. 1A is a diagram showing the results of Fenotype analysis by FACS of iDCs, pDC reg , mDCs, and DC res .
  • FIG. 1B is a diagram showing the ability of DC reg to produce cyto force.
  • FIG. 1C shows the ability of DC ⁇ to activate antigen-specific CD4 + T cells.
  • FIG. 1D shows the ability of DC reg to induce antigen-specific CD4 + T cell anergy.
  • FIG. 2A-1 is a graph showing the preventive effect on primary antibody response and secondary antibody response in mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 2A-2 is a graph showing the preventive effect on the primary antibody response and the secondary antibody response in the mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 2A-3 is a graph showing the preventive effect on the primary antibody response and secondary antibody response in the mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 2B-1 is a graph showing the preventive effect on secondary antibody response in a mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 2B-2 shows the preventive effect on the secondary antibody response in the mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 2B-3 is a graph showing the preventive effect on the secondary antibody response in the mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 3A shows the results of induction of anergy CD4 + T cells by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 3B is a graph showing the results of induction of antigen-specific analogy CD4 + T cells by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model.
  • Fig. 3 C-1 shows the site force in of anergy CD4 + T cells induced by DC reg administration in mouse antigen-specific Ig production model (IFN- ⁇ , IL-2, IL-4, IL-10) It is a figure which shows productivity. .
  • Fig. 3 C-2 shows the site force-in (IFN-T /, IL-2, IL-4, IL-10) of anergy CD4 + T cells induced by DC plausible g administration in a mouse antigen-specific Ig production model. ) Is a diagram showing the production ability.
  • FIG. 3D is a graph showing the IL-21 production ability of CD4 + T cells by administration of mDCs in a mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 3E shows the results of CD4 + T cell subset analysis in a mouse antigen-specific Ig production model.
  • Figure 4A is induced by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model. It is a figure which shows the control ability of CD4 + T cell.
  • FIG. 4B is a diagram showing suppression of IgE production of CD4 + T cells induced by DC administration in a mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 4C is a graph showing the suppressive effect of CD4 + T cells on the activation of antigen-specific CD4 + T cells induced by DC res administration in a mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 4D is a diagram showing the control ability of CD4 + CD25 + T cells and CD4 + CD25 ⁇ T cells induced by DC ⁇ administration in a mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 4E is a graph showing the concentration dependence of the regulatory ability of CD4 + CD25 + T cells and CD4 + CD25-T cells induced by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 4F shows the antigen specificity of the regulatory ability of CD4 + CD25 + T cells and CD4 + CD25 ⁇ T cells induced by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model.
  • FIG. 4G shows IL-10 dependence of CD4 + CD 25+ T cell and CD4 + CD25- T cell control ability induced by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model .
  • FIG. 5A shows the results of pathological evaluation in a mouse AHR prevention model.
  • FIG. 5B shows the results of BALF cell analysis in a mouse AHR prevention model.
  • Figure 5C shows the results of an analysis of airway resistance in a mouse AHR prevention model.
  • FIG. 6A shows the results of pathological evaluation in a mouse AHR treatment model.
  • Fig. 6 shows the results of BALF cell analysis in a mouse AHR treatment model.
  • Figure 6C shows the results of analysis of airway resistance in a mouse AHR treatment model.
  • Regulatory rods used in the present invention are obtained by stimulation with at least IL-10, TGF- and an antigen associated with the allergic disease to be treated, and induce antigen unresponsiveness to T cells. And suppresses reactivation of activated T cells, and is used as an antigen-specific IgE production inhibitor or a pharmaceutical composition for treating allergic diseases associated with IgE production. be able to.
  • the regulatory dendritic cells (regulatory DCs; DC reg ) of the present invention are intended to treat rodent cells (DCs) or their progenitor cells with cytokines containing at least IL-10 and TGF-; 3 and to treat them. It can be prepared by culturing in the presence of an antigen associated with allergic diseases. As site force-in, IL-4 and GM-CSF can be used in addition to IL-10 and TGF-] 3.
  • Examples of the progenitor cells of the rod cells include monocytes.
  • Monocytes may be derived from peripheral blood, bone marrow, spleen cells, or umbilical cord blood.
  • dendritic cells from these tissues and organs can be isolated by using FACS (Fluorescent activated cell sorter) or a flow cytometer, etc., with the expression of DC-specific surface antigens such as CDla as an index.
  • FACS Fluorescent activated cell sorter
  • a flow cytometer etc.
  • monocyte-derived dendritic cells Bwatrice Thurner, Gerold Schuler et al, J. Exp. Med. 1999 190 (11): 1669-1678, Axel Heiser, Eli Gilboa el al, "J. Clin. Invest.
  • peripheral blood-derived dendritic cells (Small EJ., L Clin Oncol. 2000 18 (23): 3894-3903) and CD34-positive dendritic cells (Caux C, Jacques Banchereau et al Blood 1997 90 (4); 1458-1470)
  • the origin of the dendritic cells is not limited, and mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, cats, dogs, hidges, pigs, Mammals such as rabbits, horses, goats, monkeys, humans, etc.
  • human regulatory dendritic cells are also mouse regulatory dendritic cells. Have the same functions, and can be used to treat allergic diseases equally regardless of animal species.
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • flow cytometer for example, FACS vantage (manufactured by Becton Dickinson), FACS Calibur (manufactured by Betaton Dickinson) and the like can be used.
  • bone marrow cells may be cultured in the presence of cytokines containing at least IL-10 and TGF-.
  • monocytes are cultured in vitro in the presence of GM-CSF or GM-CSF and IL-4 to differentiate monocytes into dendritic cells, and the cells are further differentiated into IL-10 and TGF- It becomes a regulatory dendritic cell precursor cell by culturing under.
  • monocytes were first stimulated with GM-CSF or GM-CSF and IL-4 and differentiated into dendritic cells. Stimulation with IL-10 and TGF- ⁇ or simultaneous stimulation with GM-CSF or GM-CSF and IL-4, IL-10 and TGF-1 may be used.
  • Monocytes stimulated with the above cytokines are further subjected to inflammatory stimulation with TNF- ⁇ and sputum or LPS, resulting in mature regulatory dendritic cells.
  • the regulatory dendritic cells of the present invention are used for the treatment of allergic diseases such as contact hypersensitivity, allergic rhinitis, food allergies, and asthma. Therefore, the regulatory dendritic cells are cultured together with antigens that cause allergic diseases, It is necessary to prey on the antigen.
  • the stimulation with the antigen may be performed simultaneously with the stimulation with the site force ins, or may be stimulated with the antigen after the stimulation with the site force ins.
  • stimulation with antigen may be performed before, simultaneously with, or after inflammatory stimulation with TNF-o! And / or LPS.
  • stimulation with a site force-in is followed by stimulation with an antigen, followed by inflammatory stimulation with TNF- ⁇ and sputum or LPS.
  • Antigens that cause allergic diseases include egg white, egg yolk, milk, lactoa norebumin, j3 rata small globulin, casein, cheese, monored cheese, pork, beef, chicken, lamb, riki, shrimp, salmon, tuna, Cod, mussels, lobster, sapa, squid, horse mackerel, octopus, sardine, flounder, rice, wheat, buckwheat, soya beans, millet, millet, corn, peanuts, rye, barley, oats, endo, ingen, Wild Flea, Prasino Reno, Almond, coconut, Chestnut, Pecan Nuts, Jaguar, Tomato, Carrot, Orange, Strawberry, Nineta, Onion, Ringo, Kiwi, Celery, Parsley, Melon, Mango, 'Grape Funolek , Banana, power kao, pear, peach, avocado, Food-derived allergens such as celery, parsley, lettuce, bamboo shoot,
  • allergens such as enterotoxin-8 and B. Which antigen to use can be determined by measuring allergens to which allergic patients react by patch testing or RAST. A plurality of these allergens may be used at once.
  • the antigen is added and cultured to prey on the antigen, followed by TNF- a and ⁇ or Stimulate with LPS.
  • TNF- a and ⁇ or Stimulate with LPS When culturing together with an antigen, if the antigen is a hapten having a molecular weight of about 10,000 or less, it is preferable to use the antigen after being conjugated with a carrier protein.
  • carrier proteins used in this case include ovalbumin, keyhole limpet hemocyanin, and albumin.
  • Monocytes and dendritic cells can be cultured by well-known human lymphoid cell culture techniques.
  • a known basic medium of RPMI1640 or EM may be used. What is necessary is just to culture by adding an appropriate antibiotic, animal serum, etc. to these basic media. Or antibiotics suitable for serum-free media such as X-VIVO 15, X-VIVO 10, and CellGro DC What is necessary is just to add and culture
  • the culture vessel is not limited, and commercially available plates, dishes, and flasks can be appropriately selected and used depending on the culture scale.
  • the concentrations of GM-CSF, IL-4, IL-10, TGF-; 31, TNF- ⁇ , LPS used for the culture are from 1 ng / mL for GM-CSF, IL-4, IL-10 and TGF- 1000 ng / mL, preferably 10 ng / mL to 100 ng / mL, and TNF-a and LPS are 10 ng / mL to 10 ⁇ g / mL, preferably 100 ng / mL to 10 ⁇ g / mL.
  • the concentration of the antigen associated with the allergic disease, that is, the allergen is 1 to 1000 g / ml, preferably 10 to ⁇ ⁇ g / ml in the case of a protein antigen.
  • the number of culture days required for stimulation is not limited.
  • monocytes are cultured with GM-CSF, IL-10 and TGF-j31 for several days to about 10 days, and allergens are added as necessary. It may be fed for several hours to several days, and then cultured with TNF- ⁇ and / or LPS for several hours to several days.
  • TNF- ⁇ and / or LPS for several hours to several days.
  • IL-10 and TGF-J3 may be further added, and when culturing with LPS, TNF-ct may be contained. Good. These may be added simultaneously.
  • regulatory dendritic cells that are further stimulated by an inflammatory stimulus such as TNF- ⁇ or LPS
  • stimulation is preferably performed simultaneously with or before the inflammatory stimulus using an antigen.
  • the culture period during which cells of the desired degree of differentiation can be appropriately determined.
  • Conditions such as GM-CSF, IL-4, IL-10, TGF-j31, TNF-a LPS, antigen concentration related to allergic disease, stimulation period, etc. used for stimulation are the cell type, characteristics and Conditions can be determined using the function as an index.
  • the regulatory dendritic cells used in the present invention have the following characteristics and functions. ,
  • Regulatory dendritic cells express less CDllc, CD40, CD80 and CD86 than immature dendritic cells.
  • regulatory dendritic cells have decreased IL-12p40 production ability and increased IL-10 production ability when stimulated with LPS.
  • Regulatory dendritic cells induce antigen-specific anergy on antigen-specific CD4 + T cells.
  • control dendritic cells inhibit antigen-specific IgE, I g Gl, the production of IgG2a.
  • Regulatory dendritic cells induce IL-10 producing CD4 + cells and CD4 + CD25 + C152 + Foxp3 + T cells.
  • Whether or not a cell has these characteristics can be determined by the method described in the Examples below.
  • the regulatory dendritic cells used in the present invention can suppress the production of antigen-specific IgE, and can be used for the treatment of various allergic diseases involving IgE. That is, the regulatory dendritic cells of the present invention can be used for immune cell therapy against allergic diseases.
  • the regulatory dendritic cells used in the present invention include mature and immature cells. Whether a rod cell is mature or immature can be determined by, for example, examining whether or not CD83 is expressed on the surface of the dendritic cell, and CD83 is expressed on the surface of the mature dendritic cell.
  • the present invention is a pharmaceutical composition comprising the above-described regulatory dendritic cells, and the pharmaceutical composition is used for antigen-specific allergic diseases such as contact hypersensitivity involving IgE, allergic rhinitis, food allergy, and asthma.
  • a therapeutic pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition for the treatment of intractable allergic diseases such as intractable asthma and atopic dermatitis.
  • the regulatory rod cells of the present invention are prepared by stimulating rod cell precursor cells or dendritic cells collected from a patient with an allergic disease to which the regulatory rod cells are to be administered, and are administered to the patient Is preferred.
  • the pharmaceutical composition containing the regulatory dendritic cells of the present invention is used for treatment, 0.5 x' 10 s ⁇ : 10 9 in terms of the rod cell fraction of each rod cell is intravenously or Administration may be performed subcutaneously or intradermally (preferably intravenously).
  • Administration to a patient may be performed at any time (preferably during remission).
  • the administration timing and dosage of the control rod cells of the present invention can be appropriately determined according to the type of disease, the severity of the disease, the condition of the patient, and the like.
  • the present invention also includes the use of the regulatory dendritic cells for the treatment of allergic diseases and the production of therapeutic agents for allergic diseases, including administering the regulatory dendritic cells of the present invention.
  • Examples illustrating specific embodiments and effects of the present invention will be described below. However, the technology of the present invention is not limited to these examples.
  • focusing on the establishment of immune cells and therapies using regulatory dendritic cells (regulatory DCs; DC reg ) whose target disease is refractory allergic disease (refractory asthma. Atopic dermatitis)
  • DC reg regulatory dendritic cells whose target disease is refractory allergic disease (refractory asthma. Atopic dermatitis)
  • Balb / c mice (5-8 weeks old) in 2,4-dinitrophenol (DNP) -conjugated ovalbumin (OVA) (DNP-OVA; LSL, Tokyo, Japan; 10 ⁇ g / one fish) / Alum (2 mg Immunize intraperitoneally (DNP-OVA immunized mice), collect blood on day 14 after immunization, and measure the production of DNP-specific total IgE, IgG1, and IgG2a to assess primary antibody response did. Furthermore, blood was collected on day 42 after the first immunization, and then DNP-OVA / Alum was immunized intraperitoneally. On day 49, blood was collected and antibody production was measured to evaluate the secondary antibody response. Similarly, Balb / c mice were treated with DNP-keyhole limpet mosyanin (KLH; LSL; 10/1 fish). 1) was immunized intraperitoneally (DNP-KLH immunized mice).
  • KLH DNP-keyhole limp
  • Unheated dendritic fistula U thigh ature DCs transform bone ft (BM) into granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF; Wako Pure Chemical Industries, Osaka,
  • LPS lipopolysaccharide
  • BM-GM-CSF (20ng / ml)
  • IL-10 Wako Pure Chemical Industries
  • TGF transforming growth factor
  • DNP-0VA 10 g / ml
  • iDCs and pDC regs 3 hours
  • LPS LPS for 24 hours
  • DNP-OVA presentation DC reg (DNP-0VA / DC res ) was prepared. 24-well flat bottom plate
  • iDCs (5 xlO 5 / wenore), DC reg (5 xlO 5 / well) unstimulated or LPS-stimulated (1 ⁇ g / ml), and cultured for 24 hours Production of cytokines (IL-12p40, IL-10) in the serum was measured by enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) 3 ⁇ 4 (BioSource, International, Camarillo, CA).
  • ELISA enzyme-linked immunoabsorbent assay
  • Therapeutic effect evaluation model DNP-OVA / mDCs in mice (10 6/1 fish) or DNP - 0VA / DC reg (10 6/1 fish) after the first immunization 21 days administration, 28 days, was performed after 35 days .
  • Unsensitized CD4 + T cells DNP-OVA sensitized CD4 + T cells, DNP-KLH sensitized CD4 + T cells were normal mice, and spleen CD4 + T cells were prepared from mice 7 days after the first immunization ( mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set-DM, BD Bioscience, San Diego, CA). e et al. prepared CD4 + CD25 + cells and CD4 + CD25 ⁇ cells from CD4 + T cells using FACS Vantage (Becton Dickinson Inunocytometry Systems, San Jose, Calif.).
  • RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the cells were cultured for 3 days in the presence or absence of DNP-0VA (0-50 zg / ml) (96-well flat bottom plate; Becton Dickinson).
  • DNP-OVA / mDCs 2.5xl0 3 to 2 xlO 4 / well
  • DNP-0VA / DC reg 2.5xl0 3 to 2 xl0 4 / well
  • Final culture at 16:00 Shortly before, [ 3 H] thymidine (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ) was added (1 Ci / well), and T cell proliferation ability ([] thymidine uptake ability) was measured.
  • DNP-0VA-sensitized CD4 + T cells co-cultured with DNP-OVA / mDCs or DNP-0VA / DC reg and DNP-OVA / mDCs were treated with IL-2 (Wako Pure Chemical Industries; lOOOU / mlya anti-CD3 antibody (10 (g / ml; BD Bioscience) 'Secondary culture was performed in the presence or absence of anti-CD28 antibody (10 g / ml; BD Bioscience) for 3 days, and the proliferation ability was measured.
  • IL-2 Wired Chemical Industries
  • lOOOU / mlya anti-CD3 antibody 10 (g / ml; BD Bioscience) 'Secondary culture was performed in the presence or absence of anti-CD28 antibody (10 g / ml; BD Bioscience) for 3 days, and the proliferation ability was measured.
  • CD4 + T cells, CD4 + CD25 + cells or CD4 + CD25- cells for co-culture of DNP-0VA sensitized CD4 + T cells (10 5 / well) and DNP-0VA / spleen APC (2 xlO 5 / well) ( 3. Carry out 125xl0 3 to 10 5 / venore) and control against Ig (10 g / ml; Chemicon International, Temecula, CA) anti-IL-10 antibody (lO g / ml; R & D Systems, Minneapolis, MN) Cultivation was performed for 3 days in the presence or absence of and the proliferation ability was measured. Similarly, DNP-KLH-sensitized CD4 + T cells and DNP-KLH / spleen cell APCs were used. ⁇ '
  • CD4 + T cells obtained from each experimental group (10 6/1 fish) was transferred into mice. Two hours later, DNP-OVA / Alum was immunized. On day 14 after immunization, antibody production was measured and splenic CD4 + T cell responses were measured.
  • Airway resistance to cell counts (bronchioalveolar lavage fluid: BALF) (eosinophils, neutrophils, lymphocytes, macrophages), acetylcholine (Ach; 0-10 mg / ml) Antimicrobial measurements were taken to evaluate airway hypersensitivity.
  • BALF bronchioalveolar lavage fluid
  • Ach acetylcholine
  • mice were immunized intraperitoneally on days 0 and 42 with DNP-OVA / Alum. OVA inhalation was performed for 49-56 days. From day 57, as described above, pathological pulmonary tissue was prepared, the number of cells in BALF was measured, and airway resistance to Ach (0 to 10 mg / ml) was measured to evaluate airway hypersensitivity.
  • Fig. 1A shows the results of phenotype analysis using iDCs, pDC reg , mDCs, DC reg ⁇ D FACS (methods shown in (2) and (4) above).
  • FIG. 1B shows the ability of DC reg to produce cyto force in (the method is shown in (2) above). Compared to iDCs, P DC reg significantly reduced IL-12 P 40 production ability by LPS stimulation, but enhanced IL-10 production ability.
  • Fig. 1C shows the ability of DC reg to activate antigen-specific CD4 T cells (methods shown in (1), (2), (3) and (6) above).
  • the left figure of FIG. 1C shows the results when the DNP-0VA concentrations are 0 g / ml and 50 mg / ml, and the CD4 + T cell: DCs ratio is 80: 1 to 10: 1.
  • the ability of mDCs to show high activation ability against syngeneic CD4 + T cells was significantly reduced in the activation ability of DC reg .
  • DNP-OVA / mDCs showed a higher activation ability against DNP-0VA-sensitized CD4 + T cells, but DNP-0VA / DC render g significantly reduced its activation ability.
  • FIG. 1C shows the results when the DNP-OVA concentration is 0 ig / ml and 50 ⁇ g / ml, and the CD4 + T cell: DCs ratio is 10: 1. showing high mitotic inducing ability in syngeneic CD4 + T cells in mDCs but, DC "g Then, its activation ability was remarkably attenuated. Furthermore, DNP-OVA / mDCs showed a higher mitogenic capacity for DNP-0VA-sensitized CD4 + T cells, whereas DNP_0VA / DC res had a markedly diminished mitogenic capacity.
  • Fig. 1D shows the ability of DC reg to induce antigen-specific CD4 + T cell anergy (methods shown in (1), (2), (3), (6) and (7) above), DNP-
  • OVA concentrations are O 2 / zg / ml and 50 ⁇ g / ml
  • the CD4 + T cell: DCs ratio is 10: 1.
  • mDCs showed a high activation ability against syngeneic CD4 + T cells, but DC reg showed a marked decrease in activation ability.
  • DNP-OVA / mDCs showed a higher activation ability against DNP-0VA-sensitized CD4 + T cells, whereas DNP-0VA / DC reg had a markedly reduced activation ability.
  • DNP-0VA-sensitized CD4 + T cells co-cultured with DNP-OVA / mDCs in the secondary co-culture showed enhanced proliferation ability against DNP-OVA / mDCs. It was.
  • DNP-0VA-sensitized CD4 + T cells co-cultured with DNP-0VA / DC reg showed a marked decrease in the proliferation ability against DNP-OVA / mDCs, and IL-2 and anti-CD3 / anti-CD28 antibodies. The recovery of the growth ability was partially recognized by the addition.
  • FIG. 2 A-1 to 2 A-3 of a-3 show the preventive effect on primary antibody response and secondary antibody response in mouse antigen-specific Ig production model (methods (1) and (2 )).
  • Fig. 2 B-1 to 2 B-3 a to f show the preventive effect on the secondary antibody response in the mouse antigen-specific Ig production model (the method is shown in (1) and (2) above).
  • the primary antibody response and secondary antibody response of DNP-specific IgE and the secondary antibody response of total IgE were suppressed as compared with the untreated group, but total I and DNP-specific I Increased production of g Gl and IgG2a was observed.
  • mice In the DNP-OVA / mDCs administration group, 60 to 80% of mice died within 3 hours after the third administration (adverse events). From these results, mDCs were antigen-specifically expressed. Ability to suppress the production of specific IgE Increases the production of antigen-specific IgGl and IgG2a. On the other hand, DC reg was found to suppress antigen-specific production of IgE, IgGl and IgG2a in an antigen-specific manner.
  • Fig. 3A shows the results of induction of anergy CD4 + T cells by DC ⁇ administration in a mouse antigen-specific Ig production model (methods shown in (1), (2), (3) and (6) above) ).
  • Fig. 3B shows the results of induction of antigen-specific CD4 + T cells by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model (methods described in (1), (2), (3), ( 6) and (shown in (7)).
  • CD4 + T cells obtained from the DNP-OVA / mDCs-administered experimental group showed enhanced antigen-specific proliferation ability against DNP-OVA / APCs.
  • CD4 + T cells obtained from the DNP-0VA / DC res- administered experimental group showed a marked decrease in antigen-specific proliferation ability and increased proliferation ability by adding IL-2 anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody. Partial recovery was observed.
  • Fig. 3 C-1 and 3 C-2 show the cyto force-in (IFN- ⁇ , IL-2, IL_4, IFN- ⁇ , IL-4, T4 cells induced by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model. IL-10) shows productivity
  • DNP-OVA concentration is 0, 50 g / ml
  • CD4 + T cell APCs ratio is 1: 1.
  • CD4 + T cells obtained from the DNP-OVA / mDCs-administered experimental group Compared with CQ4 + T cells obtained from the untreated group, antigen-specific cytokines (IFN- ⁇ , IL-2, IL-) were obtained in the CD4 + T cells obtained from the DNP-OVA / mDCs-administered experimental group. 4. Enhanced IL-10) production was observed. On the other hand, CD4 + T cells obtained from the DNP-0VA / DC reg administration experimental group showed a marked decrease in antigen-specific production of IFN- ⁇ , IL-2, and IL-. Increased productivity was observed.
  • IFN- ⁇ , IL-2, and IL- antigen-specific cytokines
  • Fig. 3D shows the IL-21 production ability of CD4 + T cells by mDCs administration in a mouse antigen-specific Ig production model (the method is described in (1), (2), (3) and (5) above). Show).
  • IL-21 mRNA expression was observed only in the DNP-OVA / mDCs administration experimental group.
  • Fig. 3E shows the results of CD4 + T cell subset analysis in a mouse antigen-specific Ig production model (methods are shown in (1), (2), (3) and (4) above).
  • CD4 + T cells obtained from the untreated group showed an increase in the CD25, CD69, GITR, PD-1, CD152, and Foxp3 expression subsets. Furthermore, compared to CD4 + T cells obtained from the untreated group, an increase in CD25, CD69 and PD-1 expression subsets was observed in CM + T cells obtained from the DNP-OVA / mDCs-treated experimental group. However, CD4 + T cells obtained from the DNP-0VA / DC reg administration experimental group showed an increase in CD25, CD152, and Foxp3 expression subsets.
  • DC reg is IL-10 producing CD4 + cells and CD4 + CD25. + CD152 oxp3 + T cells were found to be induced.
  • Figure 4 shows the regulatory ability of CD4 + T cells induced by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model (methods are (1), (2), (3), (6) and (Shown in (8)).
  • CD4 + T cells obtained from the untreated group or the DNP-OVA / mDCs-administered group increased the antigen-specific proliferation ability of DNP-0VA-sensitized CD4 + T cells, but DNP-0VA / DC reg CD4 + T cells obtained from the experimental group suppressed the antigen-specific proliferation ability of DNP-0VA-sensitized CD4 + T cells (control ability). From this result, it was revealed that CD4 + T cells obtained from the DNP-0VA / DC res administration experimental group have regulatory activity.
  • Fig. 4B shows suppression of IgE production of CD4 + T cells induced by DC reE administration in a mouse antigen-specific Ig production model (methods are (1), (2), (3) and (9 ).
  • the total and DNP-specific IgE production was enhanced in the experimental group transfected with CD4 + T cells obtained from the untreated group.
  • the experimental group transferred with CD4 + T cells obtained from the DNP-0VA / DC detergent g- administered experimental group was compared with the experimental group transferred with CD4 + T cells obtained from the DNP-OVA / mDCs-administered experimental group.
  • a stronger decrease in the production of total and DNP-specific IgE was observed.
  • CD4 + T cells obtained from the DNP-0VA / DC ⁇ -administered experimental group suppress the production of antigen-specific IgE.
  • FIG. 4C shows the effect of suppressing the activation of antigen-specific CD4 + T cells by CD4 + T cells induced by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model (the method is the above (1),
  • the DNP-OVA-sensitized CD4 + T cell antigen-specific proliferation ability was higher in the experimental group transfected with the CD4 + T cell obtained from the untreated group or the DNP-OVA / mDCs-administered experimental group. An increase was observed.
  • the experimental group in which CD4 + T cells obtained from the DNP-0VA / DC reg administration experimental group were transferred the antigen-specific proliferation ability of DNP-OVA-sensitized CD4 + T cells was attenuated. As a result, it was revealed that CD4 + T cells obtained from the DNP-0VA / DC reg administration experimental group suppressed the activation of antigen-specific CD4 + T cells.
  • Fig. 4D shows the regulatory ability of CD4 + CD25 + T cells and CD4 + CD25- T cells induced by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model (methods described in (1), (2) above) ,
  • CD4 + CD25- T cells obtained from the untreated group and the DNP-OVA / mDCs-administered experimental group show antigen-specific proliferation ability, but CD4 + CD25-T obtained from the DNP-0VA / DC reg- administered experimental group The cells showed a marked decrease in antigen-specific proliferation ability. On the other hand, for CD4 + CD25 + T cells, The test group showed a marked decrease in antigen-specific proliferation ability.
  • CD4 + CD25 + T cells obtained from normal mice, untreated group, DNP-OVA / mDCs administration experiment group, DNP-0VA / DC reg administration experiment group are antigen-specific for DNP-OVA-sensitized CD4 + T cells The proliferative ability was shown to be controllable, and the effect was observed in the order of DNP-OVA / DC ⁇ administration group> untreated group, DNP-OVA / mDCs administration experiment group> normal mice. Furthermore, CD4 + CD25-T cells obtained from the DNP-0VA / DC reg administration experimental group were also found to have regulatory ability.
  • Fig. 4E shows the concentration dependence of the regulatory ability of CD4 + CD25 + T cells and CD4 + CD25- T cells induced by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model (see (1) above). , (2), (3), (6) and (8)).
  • CD4 + CD25 + T cells and CD4 + CD25—T cells obtained from the DNP-0VA / DC plausible s administration experiment group were sensitized with DNP-OVA.
  • CD4 + T cells showed a stronger concentration-dependent control ability for antigen-specific proliferation ability.
  • Figure 4F shows the antigen specificity of CD4 + CD25 + T cell and CD4 + CD25- T cell regulatory ability induced by DC reg administration in a mouse antigen-specific Ig production model (see (1) above). (Shown in (2), (3), (6) and (8)).
  • CD4 + CD25 + T cells obtained from normal mice are almost equivalent to the antigen-specific proliferation capacity of DNP-OVA-sensitized CD4 + T cells and that of DNP-KLH-sensitized CD4 + T cells CD4 + CD25 + T cells and CD4 + CD25 one T cells obtained from the DNP-0VA / DC res administration experiment group are more potent than the antigen-specific proliferation ability of DNP-KLH-sensitized CD4 + T cells.
  • DNP-OVA-sensitized CD4 + T cells showed a stronger ability to control antigen-specific proliferation.
  • CD4 + CD25 + T cells obtained from the DNP-0VA / DC reg administration experiment group and
  • Fig. 4 G is induced by administration of DCschreib g in a mouse antigen-specific Ig production model.
  • IL-10-dependent control of CD4 + CD 2 5+ T cells and CD4 + CD25— T cells (methods (1), (2), (3), (6) and ( 8)).
  • Anti-IL-10 antibody affects the ability of CD4 + CD25 + T cells obtained from normal mice and DNP-0VA / DC reg- administered experimental groups to control the antigen-specific proliferation of DNP-OVA-sensitized CD4 + T cells not subject but, DNP - 0VA / DC reg controllability for antigen-specific proliferative capacity of DNP-0VA sensitized CD4 + T cells CD4 + CD25_T cells obtained from administration experimental group significantly inhibition by anti-IL- 10 antibody It was done.
  • CD4 + CD25 ⁇ T cells obtained from the DNP_0VA / DC reg administration experimental group are Trl cells exhibiting IL-10-mediated control ability.
  • FIG. 5A shows the results of pathological evaluation in a mouse AHR prevention model (methods shown in (1), (2) and (10) above).
  • FIG. 5B shows the results of BALF cell analysis in a mouse AHR prevention model (methods shown in (1), (2) and (10) above).
  • an increase in the number of cells in BALF mainly eosinophils and macrophages
  • a further increase in the number of cells in BALF was observed compared to the untreated group
  • a further increase in the number of cells in BALF was observed compared to the untreated group
  • a DNP-0VA / DC reg- administered experimental group there was a significant increase in the number of cells in BALF. I was not able to admit.
  • Figure 5C shows the results of airway resistance analysis in a mouse AHR prevention model (methods are shown in (1), (2) and (10) above).
  • FIG. 6A shows the results of pathological evaluation in a mouse AHR treatment model. Compared with normal mice, pulmonary pathological inflammation was induced by inhalation of OVA in the untreated group. On the other hand, in the DNP-OVA / mDCs-administered experimental group, the inflammation of the pulmonary histopathology was exacerbated compared to the untreated group, but in the DNP-0VA / DC ⁇ -administered experimental group, the pulmonary histopathological inflammation image Improvement was observed.
  • Figure 6B shows the results of BALF cell analysis in a mouse AHR treatment model.
  • FIG. 6C shows the results of airway resistance analysis in a mouse AHR treatment model.
  • mDCs inhibits antigen-specific IgE production by inducing antigen-specific T H 1 cells, but does not show an inhibitory effect on AHR.
  • DC "g by a child induce antigen-specific Anaji one T cell and T R cells, inhibit antigen-specific IgE production. To further suppress AHR. 'INDUSTRIAL APPLICABILITY
  • immune cell therapy using regulatory dendritic cells suppresses the production of antigen-specific IgE, which is important for the development of allergic diseases, as well as airway hypersensitivity. It was revealed that the onset was inhibited. Furthermore, it was found inhibitory effects via the induction of antigen-specific Anaji one T cell or T R cells as their mechanism of action.

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Abstract

　制御性樹状細胞を含むアレルギー疾患治療用医薬組成物の提供。　動物樹状細胞またはその前駆細胞をin vitroでGM-CSFまたはGM-CSFおよびIL-4、IL-10ならびにTGF-β1の存在下で培養し、次いでアレルギー疾患と関連する抗原の存在下で培養し、次いで、LPSおよびTNF-αのいずれかまたは両方の存在下で培養して調製した制御性樹状細胞を含む抗原特異的IgE産生抑制剤を含むアレルギー疾患治療用組成物。

Description

アレルギー疾患に対する制御性樹状細胞を用いた免疫細胞療法 技術分野
本発明は制御性樹状細胞を用いたアレルギー疾患、 特に難治性喘息およびァト ピー性皮膚炎等の難治性アレルギー疾患の免疫細胞治療に関する。 背景技術 明
免疫応答は type-1 helper (TH1)細胞による細胞性免疫と TH2細胞による体液性 免疫からなり、 TH1免疫応答は自己免疫疾患や書移植拒絶反応、 TH2免疫応答はァレ ルギー疾患に関与することが知られている。 これらの免疫反応は生体防御反応と して重要であり、 TH1および TH2細胞の産生するサイトカインによってこれらの免 疫反応は反応の強さが調節されている。 この免疫バランスを TH1/TH2 バランスと よぶ。 通常、 生体の免疫応答においては TH1、 TH2のパランスの取れた応答調節が なされている。 一方、 このバランスが崩れて TH1が優位となると、 多発性硬化症 (自己免疫性脳脊髄炎） や関節リゥマチなどの臓器特異的自己免疫疾患が発症す ると考えられている。 反対に TH2が優位となると、 即時型アレルギーなどが発症 する。 ·
アレルギー疾患の治療では、 抗アレルギー薬 （化学伝達物質遊離抑制薬、 ヒス タミン拮抗薬、 トロンポキサン合成酵素阻害薬、 トロンボキサン拮抗薬、 ロイコ トリェン拮抗薬、 TH2サイト力イン阻害薬）、 抗ヒスタミン薬、 副腎皮質ステロイ ド薬、 気管支拡張薬、 免疫抑制薬 （タク口リムス水和物） を用いた対処療法が行 われているが、 奏効性や副作用の克服が課題となっている。 さらに、 これらのァ レルギ一治療薬では治療効果が十分に得られない難治性の喘息 ·ァトピー性皮膚 炎が問題となっている。 これらのことから、 現在、 副作用の軽減した奏効性の高 い抗原特異的なアレルギー疾患治療法の確立が切望されている。
現在までに、 TH1- TH2 パランスの制御に基づくアレルギー疾患の免疫療法の可 能性が検討されているが、 マウスアレルギー疾患モデルでの TH1細胞を用いた養 子免疫療法では十分な効果が得られないことが報告されている。
ナイーブ CD4+T細胞から <p TH1細胞や TH2細胞の分化誘導機構には最も強力な抗 原提示細胞 （antigen- presenting cells ; APC) である樹状細胞が重要な役割を担 つていることが示されている。 ヒ トでは炎症性刺激を受けたミエロイ ド系樹状細 胞が TH1細胞分化誘導能を示すが、 プロスタグランジン（PGE) 2や胸腺間質性リン パ球新生因子 (thymic stromal lymphopoietin : TSLP)の刺激を受けたミエロイド 系樹状細胞ゃリンパ球系樹状細胞である形質細胞様樹状細胞が TH2細胞分化誘導 能を示すことが報告されている。 しかしながら、 現在までにヒ ト樹状細胞による TH2免疫応答の制御についての知見は得られていないのが現状である。 一方、 マ ウスでは CD8 cTミエロイド系樹状細胞が TH2細胞分化誘導能を示し、 CD8 +リン パ球系樹状細胞が TH1細胞分化誘導能を示すことが知られている。 これまでに、 CD8 cTミエロイ ド系樹状細胞は CD8 a +リンパ球系樹状細胞により誘導された TH1 免疫応答を抑制するが、 CD8 a +リンパ球.系樹状細胞は CD8ひ—ミエロイド系榭状細 胞により誘導された TH2免疫応答を抑制できないことが報告されている。 さらに、 抗原と Listeria monocytogenes死菌を投与したマウスから得られた CD8ひ +リン パ球系成熟樹状細胞が制御性 T (regulatory T ; TR)細胞を誘導して、 マウス実験 的喘息モデルでの予防効果を示すことが報告されている。
近年、 ヒ トゃマウスにおいて、 未熟樹状細胞や免疫寛容誘導性樹状細胞による 抗原特異的ァナジ一 T細胞や TR細胞の誘導を介する免疫応答制御についての多く の知見が得られており、 これらを用いた免疫細胞療法の自己免疫疾患、 移植拒絶 反応、 アレルギー疾患に対する臨床応用の可能性が期待されている。 その一例と して、 マウスでは CDl lclOTCD45RBhigh未熟樹状細胞が免疫寛容誘導性樹状細胞とし て作用し、 interleukin (IL) - 10産生 TR細胞を誘導して免疫寛容を誘導すること が報告されている。 しかしながら、 これら樹状細胞は炎症環境では成熟し、 T 細 胞制御機能を喪失することが予想されることから免疫疾患の治療には不向きであ ることが示唆されている。
樹状細皡 (Dendritic cell : DC) は生体内で最も強力な抗原提示細胞であり、 T 細胞に抗原を提示することにより免疫応答を誘導する事が知られている。 また、
DCは T細胞のみでなく B細胞、 NK細胞、 NKT細胞などとも直接作用し、 免疫反応 における中枢的役割を担う細胞である事が明らかとなっている （非特許文献 1参 照）。 未成熟 DCは末梢組織に存在し、 抗原取り込み能が高い反面 T細胞刺激能が 低い。 未成熟 DCは感染や炎症性の刺激を受けることによって、 CD40， CD80, CD86 などの共刺激分子の発現上昇を伴い高い T細胞刺激能を獲 すると共に末梢リン パ組織に移行して、 取り込んだ抗原に特異的な T細胞を活性化することによって 免疫応答を誘導する （非特許文献 2参照、 樹状細胞については、 その他非特許文 献 3〜1 0等を参照）。 in vitroでの DC誘導法が確立されつつあること、 および 癌特異的な抗原が次々と同定された事などにより、 DCの強い免疫誘導能を癌治療 に応用していこうとする研究が大きな広がりをみせている。 このような新しい細 胞医療は、 次世代医療として注目されており、 その発展が期待されている。
本発明者は先に免疫疾患に対する樹状細胞を用いた新規免疫細胞療法の確立を 目的として、 炎症条件下においても比類無い T細胞制御機能を有するヒ トとマウ スの制御性樹状細胞を作製した （特許文.献 1参照）。 さらに、 マウス制御性樹状細 胞を用いた免疫細胞療法が抗原特異的ァナジ一 T細胞や TR細胞の誘導を介して、 異系骨髄移植モデルでの急性移植片対宿主病、 コラーゲン誘発関節炎、 自己免疫 性脳脊髄炎などの TH1優位な免疫疾患に対する治療効果を示すことを明らかにし ている。
特許文献 1 特開 2004-298181号公報
非特許文献 1 Blood 90, 3245-3278 (1997)
非特許文献 2 Annu. Rev, Immunol. 18， 767-811 (2000)
非特許文献 3 Proc. Natl. Acad, Sci, USA. 99， 351-358 (2002) 非特許文献 4 Immunol. Rev. 196, 125-146 (2003)
非特許文献 5 Immunity 18， 367-379 (2003)
非特許文献 6 Blood 101， 3581-3589 (2003)
非特許文献 7 Immunity 18, 605-617 (2003)
非特許文献 8 Nat, Immunol. 5, 1149-1156 (2004)
非特 If文献 9 J. Immunol, 174, 1325 - 1331 (2005)
非特許文献 1 0 J. Immunol. 175, 1516-1522 (2005) 発明の開示
本発明は制御性樹状細胞を含むァレルギ一疾患治療剤の提供を目的とする。 特
Jこ、 抗原特異的ァナジ一 T細胞や制御性 T (TR) 細胞の誘導効果に基づき、 TH2型 免疫反応である抗原特異的 IgE産生を抑制する治療剤の提供を目的とする。
本発明者は、 マウス実験的ァレルギ一モデルにおいて制御性榭状細胞 (regulatory DCs ; DCreg)を用いた免疫細胞療法がアレルギー疾患の発症に重要な 抗原特異的 IgE産生を抑制するとともに気道性過敏症の発症を阻害することを明 らカにした。 さらに、 その作用機序として抗原特異的ァナジ一 T細胞や TR細胞の 誘導を介する抑制効果を見出した。 従来、 この制御性樹状細胞が TH1型免疫病に 対して治療効果を示すことが知られていたが、 TH2 型免疫病である喘息に対して も IgE産生抑制を伴う顕著な症状抑制を示すことは驚くべきことである。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
[ 1 ] 動物樹状細胞またはその前駆細胞を in vitroで少なくとも IL-10、 TGF - |3 および治療しようとするアレルギー疾患と関連する抗原の存在下で培養して調製 した制御性樹状細胞を含む IgE産生抑制剤。
[ 2 ] 動物榭状細胞またはその前駆細胞を' in vitroでさらに少なくとも GM- CSF または GM-CSFおよび IL- 4の存在下で培養して調製した [ 1 ]の制御性榭状細胞を 含む IgE産生抑制剤。
[ 3 ] 動物榭状細胞またはその前駆細胞を in vitroでさらに LPSおよび' TNF- ct のいずれかまたは両方の存在下で培養して調製した [ 1 ]または [ 2 ]の制御性樹状 細胞を含む IgE産生抑制剤。 '
C 4 ] 動物樹状細胞またはその前駆細胞を in vitroで GM- CSFまたは GM-CSFおよ ぴ IL- 4、 IL - 10ならびに TGF- ]3 1の存在下で培養し、 次いでアレルギー疾患と関 連する抗原の存在下で培養し、 次いで、 LPSおよび TNF-ひのいずれかまたは両方 の存在下で培養して調製した制御性樹状細胞を含む [ 3 ]の IgE産生抑制剤。
[ 5 ] 動物樹状細胞またはその前駆細胞が単球由来榭状細胞である、 [ 1 ]〜 [ 4 ] のいずれかの IgE産生抑制剤。
[ 6 ] 動物樹状細胞またはその前駆細胞がヒ ト樹状細胞またはその前駆細胞であ る、 [ 1 ]〜[ 5 ]のいずれかの IgE産生抑制剤。 . [ 7 ] 培養に用いた抗原に特異的な IgE産生を抑制する [ 6 ]の IgE産生抑制剤。
[8] [ 1 ]〜 [ 7 ]のいずれかの IgE産生抑制剤を含むァレルギ一疾患治療用医薬 組成物。
[9] 動物から採取した樹状細胞またはその前駆細胞を、 in vitroで少なくとも IL - 10、TGF - ]3およぴ治療しょうとするァレルギ一疾患と関連する抗原の存在下で 培養することを含む、 ァレルギ一疾患治療用制御性榭状細胞を製造する方法。
[ 1 0] 動物樹状細胞またはその前駆細胞を in vitro でさらに少なく とも GM - CSFまたは GM- CSFおよび IL- 4の存在下で培養することを含む、 [ 9 ]のァレル ギー疾患治療用制御性樹状細胞を製造する方法。
[1 1] 動物樹状細胞またはその前駆細胞を in vitroでさらに LPSおよび TNF- ひのいずれかまたは両方の存在下で培養することを含む、 [9]または[1 0]のァ レルギ一疾患治療用制御性榭状細胞を製造する方法。
[1 2] 動物樹状細胞またはその前駆細.胞を in vitroで GM- CSFまたは GM- CSF および IL- 4、 IL - 10ならびに TGF -) 31の存在下で培養し、 次いでァレルギ一疾患 と関連する抗原の存在下で培養し、 次いで、 LPSおよび TNF- のいずれかまたは 両方の存在下で培養することを含む [9 ]〜[ 1 1 ]のいずれかのァレルギ一疾患治 療用制御性榭状細胞を製造する'方法。
[1 3] 動物樹状細胞またはその前駆細胞が単球由来榭状細胞である、 [9 ]〜[1 2]のいずれかのアレルギー疾患治療用制御性樹状細胞を製造する方法。 .
[1 4] »物樹状細胞またはその前駆細胞がヒ ト樹状細胞またはその前駆細胞で ある、 [9：！〜 [1 3]のいずれかのアレルギー疾患治療用制御性樹状細胞を製造す る方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2006-058240 号、 2006- 219454号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1 Aは、 iDCs、 pDCreg、 mDCs、 DCresの FACSによるフエノタイプ解析の結果を 示す図である。
図 1 Bは、 DCregのサイト力イン産生能を示す図である。 ' 図 1 Cは、 DC ^の抗原特異的 CD4+T細胞活性化能を示す図である。 図 1 Dは、 DCregの抗原特異的 CD4+T細胞アナジー誘導能を示す図である。 . 図 2 A— 1は、マウス抗原特異的 Ig産生モデルでの一次抗体応答おょぴ二次抗 体応答における予防効果を示す図である。
図 2 A— 2は、マウス抗原特異的 Ig産生モデルでの一次抗体応答および二次抗 体応答における予防効果を示す図である。
図 2 A— 3は、マウス抗原特異的 Ig産生モデルでの一次抗体応答おょぴ二次抗 体応答における予防効果を示す図である。
図 2 B— 1は、マウス抗原特異的 Ig産生モデルでの二次抗体応答における予防 効果を示す図である。
図 2 B— 2は、マウス抗原特異的 Ig産生モデルでの二次抗体応答における予防 効果を示す図である。
図 2 B— 3は、マウス抗原特異的 Ig ¾生モデルでの二次抗体応答における予防 効果を示す図である。
図 3 Aは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与によるアナジー CD4+T細胞の誘導の結果を示す図である。
図 3 Bは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与による抗原特異 的ァナジ一 CD4+T細胞の誘導の結果を示す図である。
図 3 C— 1は、 マウス抗原特異的 I- g産生モデルにおける DCreg投与により誘導 されたアナジー CD4+T細胞のサイト力イン（IFN- γ、 IL- 2、 IL- 4、 IL-10)産生能を 示す図である。 .
図 3 C— 2は、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DC„g投与により誘導 されたアナジー CD4+T細胞のサイ ト力イン（IFN- T/、 IL- 2、 IL- 4、 IL- 10)産生能を 示す図である。
図 3 Dは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける mDCs投与による CD4+T細 胞の IL- 21産生能を示す図である。
図 3 Eは、マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける CD4+T細胞のサブセット解 析の結果を示す図である。
図 4 Aは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与により誘導され た CD4+T細胞の制御能を示す図である。
図 4 Bは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DC 投与により誘導され た CD4+T細胞の IgE産生抑制を示す図である。
図 4 Cは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCres投与により誘導され た CD4+T細胞の抗原特異的 CD4+T細胞の活性化抑制効果を示す図である。
図 4 Dは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DC^投与により誘導され た CD4+CD25+T細胞と CD4+CD25— T細胞の制御能を示す図である。
図 4 Eは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与により誘導され た CD4+CD25+T細胞と CD4+CD25—T細胞の制御能の濃度依存性を示す図である。 図 4 Fは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与により誘導され た CD4+CD25+T細胞と CD4+CD25—T細胞の制御能の抗原特異性を示す図である。
図 4 Gは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与により誘導され た CD4+CD25+T細胞と CD4+CD25— T細胞の制.御能の IL- 10依存性を示す図である。 図 5 Aは、マウス AHR予防モデルにおける病理学的評価の結果を示す図である。 図 5 Bは、マウス AHR予防モデルにおける BALF細胞の解析の結果を示す図であ る。
図 5 Cは、 マウス AHR予防モデルにおける気道抵抗性の解析の結果を示す図で める。
図 6 Aは、マウス AHR治療モデルにおける病理学的評価の結果を示す図である。 図 6 Β ίま、マウス AHR治療モデルにおける BALF細胞の解析の結果を示す図であ る。
図 6 Cは、 マウス AHR治療モデルにおける気道抵抗性の解析の結果を示す図で める。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いる制御性榭状細胞は、 少なくとも IL-10、 TGF- および治療しよ うとするァ.レルギ一疾患と関連する抗原で刺激することにより得られ、 T細胞に 抗原不応答性を誘導し、かつ活性化 T細胞の再活性化を抑制し、抗原特異的な IgE 産生抑制剤または IgE産生を伴うァレルギ一疾患治療用医薬組成物として用いる ことができる。
本発明の制御性樹状細胞 .(regulatory DCs ; DCreg)は、 榭状細胞 （DC) またはそ の前駆細胞を少なく とも IL- 10および TGF- ;3を含むサイ トカイン類および治療し ようとするアレルギー疾患と関連する抗原の存在下で培養することにより調製す ることができる。 サイ ト力インとしては、 IL - 10および TGF- ]3に加えて、 IL - 4、 GM-CSFを用いることもできる。
榭状細胞の前駆細胞としては、 例えば単球が挙げられる。 単球は末梢血由来で も、 骨髄由来でも、 脾臓細胞由来でも、 臍帯血由来でもよい。 さらに、 これらの 組織、 器官から樹状細胞を FACS (Fluorescent activated cell sorter) または フローサイ トメータ一等により CDla等の DC特異的な表面抗原の発現を指標に単 離することもできる。 例えば、 単球由来樹状細胞（Bwatrice Thurner, Gerold Schuler et al, J. Exp. Med. 1999 190 (11) : 1669-1678， Axel Heiser, Eli Gilboa el al," J. Clin. Invest. 2002 109 (3) 409-417)、 末梢血由来樹状細胞（Small EJ. , L Clin Oncol. 2000 18 (23) : 3894- 3903)および CD34陽性細胞由来樹状細胞（Caux C， Jacques Banchereau et al Blood 1997 90 (4) ; 1458 - 1470)が挙げられる。 樹状細 胞の由来動物種は限定されず、 マウス、 ラット、 モルモッ ト、 ハムスタ一、 ゥサ ギ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ャギ、 サル、 ヒ ト等の哺乳動物を 用いることができる。 特開 2004- 298181号公報に示すように、 ヒ ト制御性樹状細 胞もマウス制御性樹状細胞も同等の機能を有しており、 動物種に拘わらず同等に アレルギー疾患治療に用いることができる。
FACSによる特定の細胞集団の単離は公知の方法により行なえばよい。 FACS, フ ローサイ 卜メータ一としては例えば FACS vantage (べク トン ·ディツキンソン社 製）、 FACS Cal ibur (ベタ トン 'ディッキンソン社製）等を用いることができる。 ま た、骨髄細胞を少なく とも IL- 10および TGF- を含むサイ トカイン類の存在下で 培養してもよい。
例えば、 単球を GM- CSFまたは GM- CSFおよび IL- 4の存在下で in vitroで培養 すること より単球は樹状細胞に分化し、 さらに榭状細胞を IL - 10および TGF - の存在下で培養することにより制御性樹状細胞前駆細胞になる。 この際、 単球を 最初に GM-CSF または GM-CSF および IL- 4 で刺激し樹状細胞に分化させた後に IL-10およぴ TGF- βで刺激してもよいし、 GM- CSFまたは GM- CSFおよぴ IL-4、 IL-10 ならびに TGF- 1で同時に刺激してもよい。 上記サイ トカイン類で刺激した単球 をさらに、 TNF- αおよび Ζまたは LPSにより炎症性刺激を与えることにより、 成 熟した制御性樹状細胞となる。 また、 本発明の制御性樹状細胞は、 接触過敏症、 アレルギー性鼻炎、 食物アレルギー、 喘息等のアレルギー性疾患の治療に用いら れるため、 アレルギー性疾患の原因となる抗原とともに培養し、 該抗原を捕食さ せる必要がある。 抗原による刺激は、 サイ ト力イン類による刺激と同時でもよい し、 サイ ト力イン類による刺激の後に抗原で刺激してもよい。 また、 抗原による 刺激は、 TNF- o!および/または LPSによる炎症性刺激の前でも、 同時でも後でも よい。 好ましくは、 サイ ト力インで刺激した後に、 抗原で刺激し、 さらにその後 に TNF- αおよび Ζまたは LPSにより炎症性刺激を与える。
アレルギー性疾患の原因となる抗原として、 卵白、 卵黄、 ミルク、 ラク トァ ノレブミン、 j3ラタ小グロプリン、 カゼイン、 チーズ、 モーノレドチーズ、 豚肉、 牛 肉、 鶏肉、 羊肉、 力二、 ェビ、 サケ、 マグロ、 タラ、 ムラサキガイ、 ロブスター、 サパ、 イカ、 アジ、 タコ、 イワシ、 カレイ、 米、 小麦、 そば、 大豆、 ァヮ、 ヒェ、 キビ、 トウモロコシ、 ピーナッツ、 ライ麦、 大麦、 オート麦、 エンドゥ、 インゲ ン、 ノヽシノ ミ、 プラジノレナッツ、 アーモンド、 ココナッツ、 クリ、 ぺカンナッツ、 ジャガ-ィモ、 トマト、 ニンジン、 オレンジ、 イチゴ、 ニンエタ、 タマネギ、 リン ゴ、 キウイ、 セロリ、 パセリ、 メロン、 マンゴ、' グレープフノレーッ、 バナナ、 力 カオ、 洋ナシ、 モモ、 アボカ ド、 セロリ、 パセリ、 レタス、 タケノコ、 サッマイ モ、 ホウレンソゥ、 カボチヤ、 ゴマ、 ビール酵母、 グルテン、 マスタード、 麦芽、 チョコレート等の食物由来ァレルゲン； スギ、 ヒノキ、 力ェデ、 シラカンバ、 ャ ナギ、 マツ、 ハンノキ、 コナラ、 ニレ、 ぺカン、 クヮ、 ノヽシノ ミ、 ブナ、 ビヤク シン、 ォリーブ、 タルミ、 カェデバスズカケノキ、 ハコャナギ、 トネリコ、 ユー カリ、 ァカシャ、 メタキート、 カュプテ、 ホソィ トスギ、 モクマオゥ、 ォォバヤ シブナ等の樹木花粉アレルゲン；ハルガヤ、 カモガヤ、 ギヨウギシバ、 ヒロハウ シノケダサ、 ホソ麦、 ォオアヮガエリ、 ァシ、 ナガハグサ、 コヌカグサ、 セィバ ンモロコシ、 コスズメノチヤヒキ、 ライ麦、 シラゲガヤ、 オート麦、 小麦、 ォォ スズメノテツポゥ、 スズメノヒェ等のイネ科植物花粉アレルゲン；ブタクサ、 ョ モギ、 ニガョモギ、 ブタクサモドキ、 ォォブタクサ、 二セブタクサ、 フランスギ ク、 タンポポ、 ヘラォォパコ、 シロザ、 ォカヒジキ、 アキノキリンソゥ、 ォナモ ミ、 ァォゲイ トウ、 ハマァカザ、 イソホウキ、 ヒメスィバ、 ヒカゲミズ、 イラク サ、 カナムダラ、 ニヮトコ等の雑草花粉アレルゲン；犬、 猫、 豚、 牛、 馬、 ャギ、 羊、 うさぎ、 ハムスター、 ラット、 マウス、 モノレモット、 -ヮトリ、 ァヒノレ、 は と、ガチヨゥ、セキセイインコ等の動物上皮、羽毛由来アレルゲン；スズメパチ、 ミツパチ、 ァシナガパチ、 ュスリカ、 ャブ力、 ガ、 ゴキブリ、 カイチュウ、 ホウ チュウ、 ァニサキス等の昆虫、 寄生虫由来アレルゲン；ぺニシリウム、 クラドス ポリ ゥム、 ァスペルギルス、 ムコール、 カンジダ、 アルテルナリア、 ボトリチス、 ヘルミントスポリゥム、 フザリウム、 ステムフイリゥム、 リゾプス、 オーレォパ シジゥム、 フォーマ、 ェピコッカム、 トリコデルマ、 カーブラリア、 ピティロス ポリゥム、 トリコフィ トン、 マラセチア、 セファロスポリゥム等の力ビ由来ァレ ノレゲン；その他、 ハウスダスト、 ャケヒヨウヒダニ、 コナヒヨウヒダニ、 ァシプ トコナダニ、 サャァシニクダニ、 ケナガコナダニ、 イエニクダニ、 絹、 綿、 綿花、 ォォバコ種子、 イソシァネート、 エチレンオキサイ ド、 無水フタル酸、 ラテック ス、 ホルマリン、 ゼラチン、 ヒ トインシュリン、 黄色ブドウ球菌ェンテロ トキシ ン八、 同 B等のアレルゲンが挙げられる。 どの抗原を用いるかは、 アレルギー患 者が反応するアレルゲンをパッチテストや RAST により測定することにより決定 できる。 これらのアレルゲンの複数を一度に用いてもよい。
好ましくは、 GM- CSFまたは GM- CSFおよび IL- 4、 IL-10ならびに TGF- β 1で刺 激した後に、 抗原を添加して培養し、 抗原を捕食させ、 その後に TNF- aおよび Ζ または LPSで刺激する。 抗原とともに培養する際、 抗原が分子量約 1万以下のハ プテンである場合、 抗原をキヤリアタンパク質とコンジユゲートし用いることが 好ましい。 この際に用いるキャリアタンパク質として、 ォバルブミン、 キーホー ルリンぺッ トへモシァニン、 アルブミン等が挙げら る。
単球、 樹状細胞の培養は、 周知のヒ トリンパ系細胞の培養技術により行なうこ とができる。 培養液としては例えば RPMI1640ゃ丽 EMの公知の基本培地を用いれ ばよい。 これらの基本培地に適当な抗生物質や動物血清等を添加して培養すれば よい。 あるいは X- VIVO 15、 X- VIVO 10、 CellGro DC等の無血清培地に適当な抗生 物質を添加して培養すればよい。 培養容器は限定されず、 培養規模に応じて市販 のプレート、 ディッシュ、 フラスコを適宜選択して用いることができる。
培養に用いる GM - CSF、 IL- 4、 IL- 10、 TGF- ;3 1、 TNF- α、 LPSの濃度は、 GM- CSF、 IL - 4、 IL-10および TGF- が 1 ng/mL〜1000ng/mL、 好ましくは 10ng/mL〜100ng/ mLであり、 TNF- a、 LPSが 10ng/mL〜10 μ g/mL、好ましくは 100ng/mL〜10 μ g/mL である。 アレルギー疾患に関違した抗原、 すなわちアレルゲンの濃度は、 蛋白抗 原の場合、 1〜1000 g/ml、 好ましくは 10〜： ΙΟΟ μ g/mlである。
刺激に必要な培養日数は、 限定されないが、 例えば単球を GM- CSF、 IL- 10およ び TGF - j3 1と共に数日から 10日間程度培養し、必要に応じてアレルギー抗原を添 加し数時間から数日捕食させ、 その後、 TNF - αおよび/または LPSと共に数時間 から数日程度培養すればよい。 この際、 GM- CSF、 IL-10および TGF- J3と共に培養 する際には、 さらに IL - 4を添加してもよく、 また、 LPS と共に培養する場合は、 TNF- ctが含まれていてもよい。また、 これらは同時に添加してもよい。また、 TNF- αや LPS等の炎症性刺激によって更に刺激した制御性樹状細胞を用いる場合は、 好ましくは炎症性刺激と同時或いは刺激前に抗原を用いて刺激する。
単球または樹状細胞の表面抗原の発現を FACS等で調べることにより、目的の分 化程度の細胞が得られる培養期間を適宜決定することができる。 刺激に用いる GM - CSF、 IL- 4、 IL- 10、 TGF- j3 1、 TNF- a LPS, アレルギー疾患に関連する抗原の 濃度、 刺激期間等の条件は、 細胞の表? ¾型、 特性および機能を指標として条件を 決定できる。
本発明で用いる制御性樹状細胞は以下の特性およぴ機能を有する。 ，
( 1 ) 制御性樹状細胞は、 未成熟樹状細胞と比較して、 CDl lc、 CD40、 CD80 およ び CD86の発現が少ない。
( 2 ) 制御性樹状細胞は、 未成熟樹状細胞と比較して、 LPS で刺激した場合の IL-12p40産生能が低下し、 IL- 10産生能が亢進している。
( 3 ) 制御性樹状細胞は、 抗原特異的 CD4+T細胞活性化能が成熟樹状細胞と比較 して著しく減弱している。
( 4 ) 制御性樹状細胞は、 抗原特異的 CD4+T細胞に対して抗原特異的アナジーを 誘導する。 ( 5 ) 制御性樹状細胞は、 抗原特異的 IgE、 IgGl、 IgG2aの産生を抑制する。
( 6 ) 制御性樹状細胞は、 IL - 10産生 CD4+細胞と CD4+CD25+C152+Foxp3+T細胞を誘 導する。
細胞がこれらの特徴を有しているか否かは後記の実施例に記載の方法により決 定することができる。
上記のように、 本発明で用いる制御性樹状細胞は、 特に抗原特異的な IgEの産 生を抑制することが可能であり、 IgE が関与する種々のアレルギー疾患の治療に 用いることができる。 すなわち、 本発明の制御性樹状細胞は、 アレルギー疾患に 対する免疫細胞療法に用いることができる。
本発明で用いる制御性樹状細胞には成熟したものも未成熟のものも含まれる。 榭状細胞が成熟しているか未成熟かは、例えば樹状細胞表面に CD83が発現してい るか否かを調べることによりわかり、成熟樹状細胞表面には CD83が発現している。 本発明は上記の制御性樹状細胞を含む 薬組成物であり、 該医薬組成物は IgE が関与する接触過敏症、 アレルギー性鼻炎、 食物アレルギー、 喘息のような抗原 特異的なアレルギー性疾患の治療用医薬組成物である。 特に難治性喘息、 アトピ 一性皮膚炎等の難治性アレルギー疾患の治療用医薬組成物である。
本発明の制御性榭状細胞は、 該制御性榭状細胞を投与しょうとする、 アレルギ 一疾患患者から採取した榭状細胞前駆細胞または樹状細胞を刺激して作製し、 該 患者に投与するのが好ましい。 . ' 本発明の制御性樹状細胞を含む医薬組成物を治療に用いる場合、 それぞれの榭 状細胞の榭状細胞画分換算で 0. 5 x ' 10s〜： 109を、 静脈内あるいは皮下、 皮内 （好 ましくは静脈内） で投与すればよい。
また、 患者への投与は、 随時 （好ましくは寛解期） に行えばよい。 本発明の制 御性榭状細胞の投与時期、 投与量は、 疾患の種類、 疾患の重篤度、 患者の状態等 に応じて適宜決定することができる。
本発明は、 本発明の制御性樹状細胞を投与することを含むァレルギ一疾患の治 療法、ァレルギ一疾患治療剤の製造のための制御性榭状細胞の使用をも包含する。 以下に本発明の具体的態様と効果を例示した実施例を記載する。 但し、 本発明 はこれら実施例にその技術が限定されるものではない。 以下の実施例において、 対象疾患を難治性アレルギー疾患 （難治性喘息 .アト ピー性皮膚炎） とした制御性樹状細胞（regulatory DCs ; DCreg)を用いた免疫細胞 ,療法の確立を主眼としてマウス実験的アレルギーモデルにおける DCregを用いた 免疫細胞療法の評価を行った。
( 1 ) マウス抗原特異的 Ig産生モデルの作製
Balb/cマウス （5 〜 8週令） に 2， 4 -ジニトロフエノール（DNP)結合ォバルブミ ン（OVA) (DNP - OVA; LSL, Tokyo, Japan ； 10 μ g/ 1尾）/ Alum ( 2 mg/ 1尾）を腹腔内 に免疫し（DNP- OVA免疫マウス）、 免疫後、 14日目に採血し DNP特異的おょぴトー タル IgE、 IgGl、 IgG2a産生を測定して一次抗体応答を評価した。 さらに初回免疫 後 42日目に採血した後、 DNP- OVA/Alumを腹腔内に免疫し、 49日目に採血して抗 体産生を測定し二次抗体応答を評価した。 同様に、 Balb/cマウスに DNP-キーホー ルリンぺッ トへモシァニン（KLH ； LSL ； 10 / 1尾）
Figure imgf000014_0001
1尾）を腹腔内に 免疫した（DNP- KLH免疫マウス）。
( 2 ) DCsの調製と投与プロトコール
未熱樹状糸田胞 U腿 ature DCs ; iDCs)は骨 ft (BM)を granulocyte—macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF; Wako Pure Chemical Industries, Osaka,
Japan ; 20ng/ml)にて 8日間培養して作製した。さらに、 lipopolysaccharide (LPS ;
Sigma, St. Louis, M0 ; 1 g/ml)で 24 時間培養することにより成熟樹状細胞
(mature DCs ; mDCs)を作製した。制御性樹状細胞前駆細胞（precursor DCreg； pDCreg) は BMを GM - CSF (20ng/ml)、 IL - 10 (Wako Pure Chemical Industries ; 20ng/ml)、 transforming growth factor (TGF) - β 1 (Wako Pure Chemical Industries；
20ng/ml)にて 8日間培養して作製した。 さらに、 LPSで 24時間培養することによ り DCregを作製した。 あるいは、 iDCs、 pDCregに DNP- 0VA (10 g/ml)を 3時間捕食 させた後、 LPSで 24時間培養することにより DNP - 0VA提示 mDCs (DNP-OVA/mDCs)、
DNP- OVA 提示 DCreg (DNP- 0VA/DCres)を作製した。 また、 24-ゥエル平底プレート
(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)にて、 iDCs ( 5 xlO5/ウエノレ）、 DCreg ( 5 xlO5/ゥエル）を未刺激あるいは LPS刺激（1 ^ g/ml)し、 24時間後に培養上清中の サ トカイ ン （IL— 12p40 、 IL— 10)産生を enzyme - linked immunoabsorbent assay (ELISA) ¾ (BioSource, International, Camarillo, CA)にて測定した。 予防効果評価モデルではマウスに mDCs、DNP- 0VA/mDCs、DCres、DNP- 0VA/DCreg (106/ 1尾）の投与を初回免疫 7 日前に行った。 治療効果評価モデルではマウスに DNP-OVA/mDCs (106/ 1尾）あるいは DNP - 0VA/DCreg (106/ 1尾）の投与を初回免疫後 21 日、 28日、 35日後に行った。
( 3 ) T細胞の調製
未感作 CD4+T細胞、 DNP- OVA感作 CD4+T細胞、 DNP-KLH感作 CD4+T細胞は正常マ ウス、 初回免疫後 7日目のマウスから脾臓 CD4+T 細胞を調製した（mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM， BD Bioscience, San Diego, CA)。 eらに、 FACS Vantage (Becton Dickinson Inununocytometry Systems, San Jose, CA )を用いて CD4+T細胞から CD4+CD25+細胞と CD4+CD25—細胞を調製した。
( 4 ) フローサイ トメ トリーによる分析
フルォレセインイソチアシネート（FITC)、 フィコエリ トリン（PE)標識したモノ クローナル抗体（mAb) [CDl lc (BD Bioscience)、 CD25 (Caltag Laboratories, Burlingame, CA)、 CD40 (BD Bioscience)、 CD69 (BD Bioscience)、 CD80 (BD Bioscience)、 CD86 (BD Bioscience)、 CD152 (BD Bioscience)、 H - 2Kd (BD Bioscience)、 I- A/I- E (BD Bioscience)、 GITR (eBioscience, San Diego, CA) 、 PD-1 (eBioscience) 、 Foxp3 (eBioscience) ] に て 細 胞 を 染 色 し 、 FACSCal ibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems)を用いて解析した。
( 5 ) Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT- PCR)による分 祈
細胞より RNAを抽出し （TRIzol ; 'Life Technologies, Gaithersburg, MD)、 cDNA を作製した（Superscript kit， Life Technologies)。 さらに、 これを鎳型として、 IL-21 特異的プライマー（5' - cccttgtctgtctggtagtcatc- 3' (配列番号 1 )、 5' -atcacaggaagggcatttagc-3 ' (酉 S列番号 2 ) )を用いて、 RT- PCRを行った。
( 6 ) 抗原提示試験
DNP-0VA感作 CD4+T 細胞（ 2 lO5/ゥヱル）と脾細胞 APC ( 2 xlO5/ゥヱル）、 を
DNP-0VAの存在下または非存在下（0〜50 z g/ml)にて 3日間培養した（96ゥヱル平 底プレート； Becton Dickinson)。 また、 APCとして、 DNP- OVA/mDCs (2. 5xl03〜 2 xlO4/ゥヱル）、 DNP- 0VA/DCreg (2. 5xl03〜 2 xl04/ゥェル）を用いた。 最終培養 16時 間前に [3H]チミジン（Amersham Biosciences Corp. , Piscataway, NJ)を添カ卩し（1 Ci/ゥエル）、 T細胞増殖能（[ ]チミジン取り込み能）を測定した。 細胞分裂実 験では、 カルボキシフルォレセィンジアセテート、 サクシ二ミジルエステル (carboxyf luorescein diacetate-succinimidyl ester (CFSiiノ ； Molecular Probes, Eugene, OR)標識 DNP- OVA感作 CD4+T細胞を用いて、 FACSCaliburにて解析した。 さらに、上述の培養上清中のサイ トカイン（ィンターフェロン [IFN] - γ、IL-2、IL - 4、 IL - 10)産生 ELISA法 (BioSource)により測定した。
( 7 ) T細胞アナジー試験
DNP-OVA/mDCsあるいは DNP- 0VA/DCregと共培養した DNP-0VA感作 CD4+T細胞と DNP-OVA/mDCsを IL- 2 (Wako Pure Chemical Industries ; lOOOU/mlゃ抗 CD3抗体 (10 g/ml ; BD Bioscience) '抗 CD28抗体（10 g/ml ; BD Bioscience)の存在下ま たは非存在下にて 3日間二次培養を行い、 増殖能を測定した。
( 8 ) TR細胞試験 -
DNP-0VA感作 CD4+T細胞（105/ゥエル）と DNP- 0VA/脾細胞 APC ( 2 xlO5/ゥエル）の 共培養に CD4+T細胞、 CD4+CD25+細胞あるいは CD4+CD25-細胞（3. 125xl03〜105/ゥェ ノレ）をカロえ、对照 Ig (10 g/ml ; Chemicon International, Temecula, CA)ゃ抗 IL— 10 抗体（lO g/ml ; R&D Systems, Minneapolis, MN)の存在下または非存在下にて 3 日間培養を行い、 増殖能を測定した。 同様に DNP- KLH感作 CD4+T細胞と DNP-KLH/ 脾細胞 APCを用いて検討した。 · '
( 9 ) T細胞移入試験
各実験群から得られた CD4+T細胞（106/ 1尾）をマウスへ移入した。 さらに、 2 時間後に DNP-OVA/Alumを免疫した。 免疫後、 14 日目に抗体産生を測定するとと もに脾臓 CD4+T細胞応答を測定した。
( 1 0 ) マウス気道性過敏症 (airway hyperreactivity : AHR) モデル マウス実験的アレルギー性喘息実験モデルとして、 AHR を評価した。 予防効果 評価モデルではマウスに DNP- OVA/Alumを 0日目に腹腔内に免疫した。 0VA吸入は
21〜28 日.間行った。 29 日 目より肺病理組織の作製、 気管支肺胞洗浄液
(bronchioalveolar lavage fluid : BALF)中の細胞数の計測 （好酸球、 好中球、 リンパ球、 マクロファージ）、 アセチルコリン（Ach; 0〜10mg/ml)に対する気道抵 抗性の測定を行い、 気道性過敏症を評価した。
治療効果評価モデルではマウスに DNP- OVA/Alumを 0日目と 42日目に腹腔内に -免疫した。 OVA吸入は 49〜56日間行った。 57日目より上述のように肺病理組織の 作製、 BALF中の細胞数の計測、 Ach (0〜10mg/ml) に対する気道抵抗性の測定を 行い、 気道性過敏症を評価した。
結果の解析に当たり、 統計学的検定は Student' s paired t test を用いた （有 意差は *; P values 〈0.01 )。
以下に結果を示す。
図 1Aは、 iDCs、 pDCreg、 mDCs, DCreg <D FACSによるフエノタイプ解析の結果を 示す （方法は、 上記 （2) および （4) に示す）。
iDCsと比較して pDCregは CDllc、 CD40、 CD80、 CD86の発現細胞と発現強度が減 弱しているが、 H- 2Kd、 I-A/I-Eについては顕著な差異は認められなかった。一方、 DCsと比較して DC„gは CDllc、 CD40、 CD80, CD86の発現細胞と発現強度が減弱し ている。 さらに、 H - 2Kdについては顕著な差異は認められないが、 I-A/I- Eについ てはやや減弱が認められた。
図 1Bは、 DCregのサイト力イン産生能を示す （方法は、 上記 （2) に示す）。 iDCs と比較して PDCregは LPS刺激による IL-12P40産生能は著しく減弱してい たが、 IL- 10産生能は増強していた。
これらの結果より、 DCregは IL-12p40産生能の低下と IL-10産生能の亢進を示 すことが明らかになった。
図 1 Cは、 DCregの抗原特異的 CD4 T細胞活性化能を示す （方法は、 上記 （1)、 ( 2)、 ( 3) および （6) に示す）。
図 1 C左図は、 DNP-0VA濃度が 0 g/ml と 50mg/ml、 CD4+T細胞： DCs比が 80:1 〜10:1の結果を示す。 mDCsでは同系 CD4+T細胞に対する高い活性化能を示す力 DCregではその活性化能が著しく減弱していた。 さらに、 DNP-OVA/mDCsは DNP-0VA 感作 CD4+T細胞に対するより高い活性化能を示すが、 DNP-0VA/DC„gではその活性 化能が著しく減弱していた。
図 1 C右図は、 DNP- OVA濃度が 0 i g/ml と 50μ g/ml、 CD4+T細胞: DCs比が 10: 1 の結果を示す。 mDCsでは同系 CD4+T細胞に対する高い分裂誘導能を示すが、 DC„g ではその活性化能が著しく減弱していた。 さらに、 DNP-OVA/mDCsは DNP-0VA感作 CD4+T 細胞に対するより高い分裂誘導能を示すが、 DNP_0VA/DCresではその分裂誘 導能が著しく減弱していた。
これらの結果より、 DCresは抗原特異的 CD4+T細胞活性化能が mDCs と比較して、 著しく減弱していることが明らかになった。
図 1 Dは、 DCregの抗原特異的 CD4+T細胞アナジー誘導能を示し （方法は、 上記 ( 1 )、 （2 )、 （3 )、 ( 6 ) および （7 ) に示す）、 DNP- OVA濃度が O /z g/ml と 50 μ g/ml, CD4+T細胞： DCs比が 10 : 1の結果を示す。
図 1 D左図に示すように、 mDCsでは同系 CD4+T細胞に対する高い活性化能を示 すが、 DCregで その活性化能が著しく減弱していた。 さらに、 DNP - OVA/mDCs は DNP-0VA感作 CD4+T細胞に対するより高い活性化能を示すが、 DNP- 0VA/DCregでは その活性化能が著しく減弱していた。
また、 図 1 D右図に示すように、 2次共培養において、 DNP - OVA/mDCsと共培養 した DNP-0VA感作 CD4+T細胞では、 DNP - OVA/mDCsに対する増殖能の増強が認めら れた。一方、 DNP- 0VA/DCregと共培養した DNP- 0VA感作 CD4+T細胞では DNP- OVA/mDCs に対する増殖能の著しい低下が認められるとともに、 IL - 2ゃ抗 CD3抗体/抗 CD28 抗体の添加により増殖能の回復が部分的に認められた。
これらの結果より、 DC ^は抗原特異的 CD4+T細胞に対して抗原特異的ァナジ一 を誘導することが明らかになった。 ' 図 2 A-1〜 2 A- 3の a〜f は、マウス抗原特異的 Ig産生モデルでの一次抗体応答 および二次抗体応答における予防効果を示す （方法は、 上記 （1 ) および （2 ) に示す)。
DNP-OVA/mDCs投与実験群では未処置群と比較して、 DNP特異的およびトータル IgEの産生減少が認められたが、 トータルおよび DNP特異的 IgGl、 IgG2aの産生 については増強が認められた。 一方、 DNP- 0VA/DCreg投与実験群ではトータルおよ ぴ DNP特異的 IgGl、 IgG2aの産生減少が認められた。 しかしながら、 mDCs投与実 験群や DCr 投与実験群では上述の効果が認められなかった。
図 2 B- 1〜2 B- 3の a〜f は、マウス抗原特異的 Ig産生モデルでの二次抗体応答 における予防効果を示す （方法は、 上記 （1 ) および （2 ) に示す）。 DNP-OVA/mDCs投与実験群では未処置群と比較して、 DNP特異的 IgEの一次抗体 応答および二次抗体応答と，トータル IgEの二次抗体応答を抑制するがトータルぉ よび DNP 特異的 IgGl、 IgG2a の産生については増強が認められた。 一方、 DNP- 0VA/DCreg投与実験群ではトータルおよび DNP特異的 IgE、トータル IgGl、IgG2a の一次抗体応答および二次抗体応答を抑制した。 尚、 DNP- OVA/mDCs投与実験群で は 3回目の投与後 3時間以内に 6〜 8割のマウスの死亡が認められた（有害事象）, これらの結果より、 mDCsは抗原特異的に抗原特異的 IgEの産生を抑制する力 抗原特異的 IgGl と IgG2aの産生を増強する。 一方、 DCregは抗原特異的に抗原特 異的 IgE、 IgGl, IgG2aの産生を抑制することが明らかになった。
図 3 Aは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DC ^投与によるアナジー CD4+T 細胞の誘導の結果を示す （方法は、 上記 （1 )、 （2 )、 ( 3 ) および （6 ) に示す)。
DNP-0VA濃度が 0〜50 μ g/ml、 CD4+T細.胞： APCs比が 1 : 1の結果を示す。
未処置群から得られた CD4+T細胞と比較して、 DNP - OVA/mDCs投与実験群から得 られた CD4+T 細胞では DNP - OVA/APCs に対する増殖能の増強が認められたが、
DNP-0VA/DCr。s投与実験群から得られた CD4+T細胞では DNP- OVA/APCsに対する増殖 能の著しい減弱が認められた。
図 3 Bは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与による抗原特異 的ァナジ一 CD4+T細胞の誘導の結果を示す（方法は、上記（1 )、 （2 )、 （3 )、 （6 ) および（（7 ) に示す）。
DNP- OVA濃度が 50 g/ml、 CD4+T細胞： APCs比が 1 : 1の結果を示す。
未処置群から得られた CD4+T細胞と比較して、 DNP-OVA/mDCs投与実験群から得 られた CD4+T細胞では DNP-OVA/APCsに対する抗原特異的増殖能の増強が認められ たが、 DNP-0VA/DCres投与実験群から得られた CD4+T細胞では抗原特異的増殖能の 著しい減弱が認められるとともに、 IL-2ゃ抗 CD3抗体/抗 CD28抗体の添加により 増殖能の回復が部分的に認められた。
図 3 C-1及び 3 C- 2は、マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与によ り誘導されたァナジ一 CD4+T細胞のサイト力イン（IFN- γ、 IL-2, IL_4、 IL- 10)産 生能を示す . - DNP-OVA濃度が 0、 50 g/ml、 CD4+T細胞： APCs比が 1： 1の結果を示す。
未処置群から得られた CQ4+T細胞と比較して、 DNP- OVA/mDCs投与実験群から得 られた CD4+T細胞では抗原特異的なサイ トカイン（IFN- γ、 IL- 2、 IL- 4、 IL- 10) 産生の増強が認められた。 一方、 DNP - 0VA/DCreg投与実験群から得られた CD4+T細 胞では IFN- γ、 IL- 2、 IL- について抗原特異的な産生能の著しい減弱が認められ たが、 IL- 10産生能については増強が認められた。
図 3 Dは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける mDCs投与による CD4+T細 胞の IL- 21産生能を示す（方法は、上記（1 )、 （2 )、 ( 3 ) および（5 ) に示す）。
DNP-OVA/mDCs投与実験群でのみ IL- 21mRNAの発現が認められた。
図 3 Eは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける CD4+T細胞のサブセット解 析の結果を示す （方法は、 上記 （1 )、 （2 )、 ( 3 ) および （4 ) に示す）。
正常マウスから得られた CD4+T細胞と比較して、 未処置群から得られた CD4+T 細胞では CD25、 CD69、 GITR、 PD- 1、 CD152, Foxp3発現サブセットの增加が認めら れた。 さらに、 未処置群から得られた CD4+T細胞と比較して、 DNP - OVA/mDCs投与 実験群から得られた CM+T細胞では CD25、 CD69、 PD- 1発現サブセットの增加が認 められたが、 DNP - 0VA/DCreg投与実験群から得られた CD4+T細胞では CD25、 CD152、 Foxp3発現サブセットの増加が認められた。
これらの結果より、mDCsは IFN- γと IL-21産生 TH1細胞とともに IL-4と IL- 10 産生 TH2細胞を誘導する力 DCregは IL- 10産生 CD4+細胞と CD4+CD25+CD152 oxp3+T 細胞を誘導することが明らかになった。
図 4 Αは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与により誘導され た CD4+T細胞の制御能を示す（方法は、上記 （ 1 )、 （ 2 )、 （ 3 )、 （ 6 ) および（ 8 ) に示す)。
DNP- 0VA濃度が 50 i g/ml, CD4+T細胞： APCs比が 1 : 2、 CD4+T細胞： CD4+TR細胞比 力 S 1 : 1の結果を示す。
未処置群や DNP - OVA/mDCs投与実験群から得られた CD4+T細胞は DNP- 0VA感作 CD4+T細胞の抗原特異的増殖能を加算的に増加するが、 DNP-0VA/DCreg投与実験群 から得られた CD4+T細胞は DNP-0VA感作 CD4+T細胞の抗原特異的増殖能を抑制し た （制御能)。 この結果より、 DNP - 0VA/DCres投与実験群から得られた CD4+T細胞は制御活性を 有することが明らかになつ.た。
図 4 Bは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreE投与により誘導され た CD4+T細胞の Ig E産生抑制を示す（方法は、上記（1 )、 （2 )、 ( 3 )および（9 ) に示す）。
未処置群と比較して、 未処置群から得られた CD4+T細胞を移入した実験群では トータルおよび DNP特異的 IgEの産生増強が認められた。 一方、 DNP-0VA/DC„g投 与実験群から得られた CD4+T細胞を移入した実験群では DNP - OVA/mDCs投与実験群 から得られた CD4+T細胞を移入した実験群と比較して、 トータルおよび DNP特異 的 IgEの産生のより強い減少が認められた。
この結果より、 DNP-0VA/DC ^投与実験群から得られた CD4+T細胞は抗原特異的 IgEの産生を抑制することが明らかになった。
図 4 Cは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与により誘導され た CD4+T細胞の抗原特異的 CD4+T細胞の活性化抑制効果を示す（方法は、上記（ 1 )、
( 2 )、 ( 3 ) および （6 ) に示す）。
未処置群と比較して、 未処置群や DNP-OVA/mDCs投与実験群から得られた CD4+T 細胞を移入した実験群では DNP- OVA感作 CD4+T細胞の抗原特異的増殖能の増強が 認められた。 一方、 DNP - 0VA/DCreg投与実験群から得られた CD4+T細胞を移入した 実験群では DNP- OVA感作 CD4+T細胞の抗原特異的増殖能の減弱が認められ'た。 この結舉ょり、 DNP-0VA/DCreg投与実験群から得られた CD4+T細胞は抗原特異的 CD4+T細胞の活性化を抑制することが明らかになつた。
図 4 Dは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与により誘導され た CD4+CD25+T細胞と CD4+CD25- T細胞の制御能を示す（方法は、 上記（ 1 )、 （ 2 )、
( 3 )、 ( 6 ) および （8 ) に示す）。
DNP-0VA濃度が 50 μ g/ml、 CD4+T細胞： APCs比が 1 : 2、 CD4+T細胞： CD4+TK細胞比 が 1 : 1の結果を示す。 ·
未処置群や DNP - OVA/mDCs投与実験群から得られた CD4+CD25— T細胞は抗原特異 的増殖能を示すが、 DNP-0VA/DCreg投与実験群から得られた CD4+CD25— T細胞は抗原 特異的増殖能の著しい低下を示した。 一方、 CD4+CD25+T細胞については全ての実 験群で抗原特異的増殖能の著しい低下を示した。
正常マウス、 未処置群、 DNP- OVA/mDCs投与実験群、 DNP- 0VA/DCreg投与実験群か ら得られた CD4+CD25+T細胞は DNP- OVA感作 CD4+T細胞の抗原特異的増殖能に対し て制御能を示し、 その効果は DNP- OVA/DC^投与実験群〉未処置群、 DNP-OVA/mDCs 投与実験群〉正常マウスの順で認められた。 さらに、 DNP-0VA/DCreg投与実験群か ら得られた CD4+CD25—T細胞でも制御能が認められた。
この結果より、 DNP- 0VA/DC„s投与実験群から得られた CM+CD25+T 細胞と CD4+CD25— T細胞は制御活性を有することが明らかになつた。
図 4 Eは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与により誘導され た CD4+CD25+T細胞と CD4+CD25— T細胞の制御能の濃度依存性を示す （方法は、 上記 ( 1 )、 （2 )、 （3 )、 ( 6 ) および （8 ) に示す）。
DNP-0VA濃度が 50 / g/ml、 CD4+T細胞： APCs比が 1 : 2、 CD4+T細胞： CD4+TR細胞比 が 32 : 1〜1 : 1の結果を示す。
正常マウスから得られた CM+CD25+T細胞と比較して、 DNP- 0VA/DC„s投与実験群 から得られた CD4+CD25+T細胞と CD4+CD25—T細胞は DNP - OVA感作 CD4+T細胞の抗原 特異的増殖能に対して濃度依存的により強力な制御能を示した。
図 4 Fは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DCreg投与により誘導され た CD4+CD25+T細胞と CD4+CD25— T細胞の制御能の抗原特異性を示す （方法は、 上記 ( 1 )、 （2 )、 （3 )、 ( 6 ) および （8 ) に示す)。
DNP- 0VA、 DNP- KLH濃度が 5:0 μ g/ml、 CD4+T細胞： APCs比が 1： 2、 CD4+T細胞： CD4+TR 細胞比が 1 : 1の結果を示す。 ·
正常マゥスから得られた CD4+CD25+T細胞は DNP - OVA感作 CD4+T細胞の抗原特異 的増殖能と DNP-KLH感作 CD4+T細胞の抗原特異的増殖能に対してほぼ同等の制御 能を示すが、 DNP- 0VA/DCres投与実験群から得られた CD4+CD25+T細胞や CD4+CD25一 T 細胞は DNP- KLH感作 CD4+T細胞の抗原特異的増殖能よりも DNP- OVA感作 CD4+T細 胞の抗原特異的増殖能に対してより強力な制御能を示した。
この結舉より、 DNP - 0VA/DCreg投与実験群から得られた CD4+CD25+T 細胞と
CD4+CD25 細胞の制御活性の一部は抗原特異性を示すことが明らかになった。 図 4 Gは、 マウス抗原特異的 Ig産生モデルにおける DC„g投与により誘導され た CD4+CD25+T細胞と CD4+CD25— T細胞の制御能の IL- 10依存性を示す （方法は、 上 記 （1)、 （2)、 （3)、 (6) および （8) に示す)。
DNP-0VA濃度が 50 μ g/ml、 CD4+T細胞： APCs比が 1： 2、 CD4+T細胞： CD4+TR細胞比 が 1:1の結果を示す。
正常マウスや DNP- 0VA/DCreg投与実験群から得られた CD4+CD25+T細胞の DNP- OVA 感作 CD4+T細胞の抗原特異的増殖能に対する制御能は抗 IL- 10抗体により影響を 受けないが、 DNP - 0VA/DCreg投与実験群から得られた CD4+CD25_T細胞の DNP-0VA感 作 CD4+T細胞の抗原特異的増殖能に対する制御能は抗 IL- 10抗体により著しく阻 害された。
この結果より、 DNP_0VA/DCreg投与実験群から得られた CD4+CD25— T細胞は IL - 10 を介した制御能を示す Trl細胞であることが明らかになった。
図 5 Aは、マウス AHR予防モデルにおける病理学的評価の結果を示す（方法は、 上記 （1)、 (2) および ( 1 0) に示す）。
正常マウスと比較して未処置群では OVA吸入による肺病理組織の炎症像が誘導 された。一方、未処置群と比較して DNP- OVA/mDCs投与実験群では肺病理組織の炎 症像の増悪が認められるが、 DNP- OVA/DC^投与実験群では肺病理組織の炎症像の 改善が認められた。
図 5Bは、 マウス AHR予防モデルにおける BALF細胞の解析の結果を示す （方法 は、 上記 （1)、 （2) および （1 0) に示す）。 + ' 正常マ スと比較して未処置群では 0VA吸入による BALF中の細胞数（主に好酸 球、 とマクロファージ） の増加が誘導された。 一方、 未処置群と比較して DNP-OVA/mDCs投与実験群では BALF中の細胞数のさらなる増加が認められるが、 DNP- 0VA/DCreg投与実験群では BALF中の細胞数の著しい増加は認められなかった。 図 5Cは、 マウス AHR予防モデルにおける気道抵抗性の 析の結果を示す （方 法は、 上記 （1)、 (2) および ( 1 0) に示す）。
正常マウスと比較して未処置群と DNP - OVA/mDCs投与実験群では 0VA吸入による 気道抵抗† の上昇が誘導された。 一方、 DNP- 0VA/DCreg投与実験群では気道抵抗性 の上昇は認められなかった。
図 6Aは、 マウス AHR治療モデルにおける病理的評価の結果を示す。 正常マウスと比較して未処置群では OVA吸入による肺病理組織の炎症像が誘導 された。一方、未処置群と ¾較して DNP- OVA/mDCs投与実験群では肺病理組織の炎 症像の増悪が認められるが、 DNP- 0VA/DC ^投与実験群では肺病理組織の炎症像の 改善が認められた。 図 6 Bは、 マウス AHR治療モデルにおける BALF細胞の解析の 結果を示す。
正常マウスと比較して未処置群では OVA吸入による BALF中の細胞数（主に好酸 球、 とマクロファージ) の增加が誘導された。 一方、 未処置群と比較して DNP-OVA/mDCs投与実験群では BALF中の細胞数のさらなる増加が認められるが、 DNP- 0VA/DCres投与実験群では BALF中の細胞数の著しい増加は認められなかった。 図 6 Cは、 マウス AHR治療モデルにおける気道抵抗性の解析の結果を示す。 正常マウスと比較して未処置群と DNP - OVA/mDCs投与実験群では OVA吸入による 気道抵抗性の上昇が誘導された。 一方、 DNP- 0VA/DCreg投与実験群では気道抵抗性 の顕著な上昇は認められなかった。
この結果より、マウス実験的アレルギー性喘息実験モデルにおいて、 DCregは AHR を抑制することが明らかになつた。
以上のように、マウス実験的アレルギーモデルにおいて、 mDCsは抗原特異的 TH1 細胞を誘導することにより抗原特異的 IgE産生を阻害するが AHRに対しては抑制 効果を示さない。 一方、 DC„gは抗原特異的ァナジ一 T細胞と TR細胞を誘導するこ とにより、 抗原特異的 IgE産生を阻害.し、 さらに AHRを抑制する。 ' 産業上の利用可能性
実施例に示すように、 マウス実験的アレルギーモデルにおいて、 制御性樹状細 胞を用いた免疫細胞療法がァレルギ一疾患の発症に重要な抗原特異的 IgE産生を 抑制するとともに、気道性過敏症の発症を阻害することを明らかにした。さらに、 その作用機序として抗原特異的ァナジ一 T細胞や TR細胞の誘導を介する抑制効果 を見出した。
現在までに、 本発明に示すような抗原特異的ァナジ一 T細胞や TK細胞の誘導効 果に基づいた IgE産生を起因とするアレルギー疾患の免疫療法 （予防 ·治療） の 知見は皆無である。 さらにヒ ト制御性榭状細胞もマウス制御性樹状細胞とほぼ同 等の T細胞機能制御効果を示すことをすでに明らかにしている。 従って、 制御性 樹状細胞を用いた免疫細胞療法は従来のアレルギー疾患治療法とは作用機序が異 なり、 安全性の高い顕著な奏効性が得られると考えられる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許おょぴ特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 動物樹状細胞またはその前駆細胞を in vitroで少なくとも IL- 10、 TGF - /3および治療しょうとするァレルギ一疾患と関連する抗原の存在下で培養して調 製した制御性樹状細胞を含む IgE産生抑制剤。
2 . 動物樹状細胞またはその前駆細胞を in vitroでさらに少なくとも GM-CSF または GM- CSFおよび IL- 4の存在下で培養して調製した請求項 1記載の制御性樹 状細胞を含む IgE産生抑制剤。
3 . 動物樹状細胞またはその前駆細胞を in vitroでさらに LPSおよび TNF - αのいずれかまたは両方の存在下で培養して調製した請求項 1または 2に記載の 制御性樹状細胞を含む IgE産生抑制剤。
4 . 動物樹状細胞またはその前駆細胞を in vitroで GM-CSFまたは GM-CSF および IL- 4、 IL- 10ならびに TGF- ]3 1の存在下で培養し、 次いでアレルギー疾患 と関連する抗原の存在下で培養し、 次いで、 LPSおよび TNF- αのいずれかまたは 両方の存在下で培養して調製した制御性樹状細胞を含む請求項 3記載の IgE産生 抑制剤。
5 . 動物榭状細胞またはその前駆細胞が単球由来樹状細胞である、 請求項 1 〜 4のいずれか 1項に記載の IgE産生抑制剤。
6 . 動物樹状細胞またはその前駆細胞がヒ ト樹状細胞またはその前駆'細胞で ある、 請 項 1〜 5のいずれか 1項に記載の IgE産生抑制剤。
7 . 培養に用いた抗原に特異的な IgE産生を抑制する請求項 6記載の IgE産 生抑制剤。
8 . 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の IgE産生抑制剤を含むァレルギ一 疾患治療用医薬組成物。
9 . 動物から採取した樹状細胞またはその前駆細胞を、 in vitroで少なくと も IL- 10、 TGF - j3および治療しょうとするアレルギー疾患と関連する抗原の存在 下で培養することを含む、ァレルギ一疾患治療用制御性樹状細胞を製造する方法。
1 0 . 動物榭状細胞またはその前駆細胞を in vitro でさらに少なく とも
GM-CSFまたは GM- CSFおよぴ IL - 4の存在下で培養することを含む、請求項 9記載 のアレルギー疾患治療用制御性樹状細胞を製造する方法。
1 1 . 動物樹状細胞またはその前駆細胞を in vitroでさらに LPSおよび TNF- αのいずれかまたは両方の存在下で培養することを含む、 請求項 9または 1 0に 記載のアレルギー疾患治療用制御性樹状細胞を製造する方法。
1 2 . 動物樹状細胞またはその前駆細胞を in vitroで GM- CSFまたは GM- CSF および： CL- 4、 IL- 10ならびに TGF- j3 1の存在下で培養し、 次いでアレルギー疾患 と関連する抗原の存在下で培養し、 次いで、 LPSおよび TNF- αのいずれかまたは 両方の存在下で培養することを含む請求項 9〜 1 1のいずれか 1項に記載のァレ ルギー疾患治療用制御性樹状細胞を製造する方法。
1 3 . 動物榭状細胞またはその前駆細胞が単球由来樹状細胞である、 請求項 9〜 1 2のいずれか 1項に記載のァレルギ一疾患治療用制御性樹状細胞を製造す る方法。
1 4 . 動物樹状細胞またはその前駆細胞がヒ ト樹状細胞またはその前駆細胞 である、 請求項 9〜1 3のいずれか 1項に記載のアレルギー疾患治療用制御性樹 状細胞を製造する方法。
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