WO2007099924A1 - 腫瘍選択的蛍光染色剤 - Google Patents

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tumor
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fluorescent
cancer
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Tetsuo Nagano
Yasuteru Urano
Hirotatsu Kojima
Yuuta Fujikawa
Tetsuro Takamatsu
Yoshinori Harada
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The University Of Tokyo
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    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
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    • A61K49/0052—Small organic molecules
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a tumor-selective fluorescent staining agent. More specifically, the present invention relates to a staining agent capable of selectively fluorescently staining tumor cells and tumor tissues and selectively imaging tumor cells and tumor tissues in diagnosis of cancer using an endoscope.
  • Optical diagnosis is close to the surface layer!
  • a power that has recently attracted a great deal of attention is exemplified by cancer diagnosis using a fluorescence endoscope.
  • 5-aminolevulinic acid (5-ALA) and vorphirin are used to stain tumor tissues for endoscopic diagnosis.
  • the methods using these stains have problems such as the time required for the stain to accumulate in the tumor tissue.
  • fluorescein ester derivatives such as FDA (fluorescein diacetate), which is a fluorescein derivative, are known (for example, see Non-patent Document 1). These ester derivatives produce strongly fluorescent fluorescein when the ester is hydrolyzed.
  • ester derivatives such as FDA are liposoluble due to the presence of ester groups, and have the property of easily permeating the cell membrane. On the other hand, they are hydrolyzed by intracellular esterases and produced in cells. Fluorescein, which is a hydrophilic substance, has the property of not passing through the cell membrane and staying in the cell.
  • FDA is incorporated into cells, and fluoresceinca produced by hydrolysis by intracellular esterases is measured to measure intracellular fluorescence.
  • Technology that uses FDA as a esterase probe, or technology for fluorescent staining of cells has been developed (Non-patent Document 2).
  • FDA is used as an esterase probe or as a staining agent for uniformly staining tissues, certain cells such as tumor cells are treated as normal cells. There are no known examples used for selective staining in distinction.
  • FDA is used as a contrast agent in endoscopic diagnosis.
  • Non-patent literature l Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55, 134-141, 1966
  • Non-Patent Document 2 The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 29, pp.503-510, 1
  • An object of the present invention is to provide a staining agent capable of selectively fluorescent staining tumor cells and tumor tissues. More specifically, it is possible to provide a staining agent having the above characteristics and useful as a fluorescent contrast agent for an endoscope for selectively fluorescent staining of a tumor tissue in diagnosis using an endoscope. It is the subject of the present invention.
  • R 1 and R 2 are each independently a C 1 -C alkyl group optionally having a substituent
  • a tumor cell or tumor tissue-selective compound comprising a compound represented by (4) a alkyl group, an aryl group optionally having substituent (s), or a heteroaryl group optionally having substituent (s).
  • a fluorescent stain is provided.
  • R 1 and R 2 are each independently a C to C alkyl group.
  • the above-mentioned fluorescent staining agent which is a C to C alkaryl group, an aryl group, or a heteroaryl group
  • R 1 and R 2 are each independently a C to C alkyl group or a C to C alkenyl group
  • Fluorescent stain of R 1 and R 2 are each independently a C to C alkyl group or C to C alkeni
  • An agent is provided.
  • a diagnostic agent containing the fluorescent stain as an active ingredient and a tumor tissue-selective contrast agent containing the fluorescent stain as an active ingredient are used for cancer diagnosis using an endoscope, particularly a fluorescence endoscope that can irradiate excitation light having an optimum excitation wavelength for fluorescein (e.g., excitation light of about 488 nm) as an endoscope light source.
  • an endoscope particularly a fluorescence endoscope that can irradiate excitation light having an optimum excitation wavelength for fluorescein (e.g., excitation light of about 488 nm) as an endoscope light source.
  • a method for staining a tumor tissue comprising a step of contacting a compound represented by the general formula (I) with a tumor cell or tumor tissue; a method for detecting a tumor cell or tumor tissue, wherein A method comprising a step of contacting a compound represented by formula (0) with a tumor cell or a tumor tissue and then irradiating an excitation light for fluorescein to measure fluorescence generated by the fluorescein; and a method for imaging a tumor tissue.
  • a method comprising a step of contacting a compound represented by the above general formula (I) with a tumor cell or a tumor tissue, and then irradiating an excitation light for fluorescein to measure fluorescence generated by fluorescein.
  • a method for diagnosing cancer wherein the diagnostic site is contacted with the compound represented by the general formula (I), and then the diagnostic site is irradiated with excitation light for fluorescein.
  • a method comprising a step of determining the presence or absence of tumor tissue by measuring the fluorescence produced; a method for diagnosing cancer using an endoscope, wherein the compound represented by the above general formula (I) is present at the diagnosis site
  • a method comprising a step of irradiating the diagnostic site with excitation light for fluorescein by an endoscope light source, and detecting the fluorescence generated by fluorescein with an endoscope to determine the presence or absence of tumor tissue.
  • cyanine is used together with the compound represented by the general formula (I) or in place of the compound represented by the general formula (I).
  • Such a diagnostic agent, contrast agent, and diagnostic method that may use a system compound are also provided by the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram showing the change over time in the fluorescence intensity ratio of each candidate compound in Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the change over time in the fluorescence intensity ratio of an ester derivative of fluorescein.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram of an experimental system using an endoscope.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of observation of rat esophageal cancer under an endoscope.
  • (a) shows the result of the white light image
  • (b) shows the result of the fluorescence image.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of observation of rat colon cancer under an endoscope.
  • FL represents the fluorescence image by blue excitation light
  • WL represents the white light image.
  • the C to C alkyl group is linear, branched, cyclic, or their
  • methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, cyclopropylmethyl group, etc. Can be mentioned.
  • the C to c alkenyl group is linear, branched, cyclic, or a combination thereof.
  • alkenyl group examples include a vinyl group, an n-propenyl group, an isopropenyl group, and an n-butenyl group.
  • C to C alkyl group is linear, branched, cyclic, or
  • any one of these combinations may contain one or two triple bonds, and may contain one triple bond and one double bond.
  • alkynyl group examples include ethynyl group, n-propyl group, n-butynyl group and the like.
  • aryl group a monocyclic or condensed polycyclic aromatic hydrocarbon group can be used, and examples thereof include a phenol group and a naphthyl group.
  • heteroaryl group a monocyclic or condensed polycyclic aromatic group containing one or more heteroatoms as ring-constituting atoms can be used. Hetero atoms include, for example, nitrogen An atom, an oxygen atom, a thio atom, etc. are mentioned, and when two or more heteroatoms are included, they may be the same or different. More specifically, a furyl group, a chenyl group, a pyrrole group, a pyridyl group, an imidazolyl group, a pyrimidyl group, and the like can be given.
  • the type, number, and substitution position of the substituent are particularly limited.
  • the substituent include, for example, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, an oxo group, an alkoxycarbonyl group, or a norologene atom (the halogen atom includes a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom).
  • the power that can be cited is not limited to these.
  • R 1 and R 2 may be the same or different, but R 1 and R 2 are preferably the same from the synthetic viewpoint of the compound.
  • R 1 and R 2 carbyl groups (fluorescein diacetate: FDA), R 1 and R 2 are bur groups compound (Furuoresein Jiatarireto: FDAcr), compound R 1 and R 2 are Echiru group (FDP), compound R 1 and R 2 are n- flop port propyl group (FDB), R 1 and R 2 are n- Examples thereof include a compound having a butyl group (FDC), a compound having R 1 and R 2 as a phenol group (FDBz), and a compound having R 1 and R 2 as a 2_furyl group (FD Fu). Power It is not limited to these.
  • the fluorescent staining agent of the present invention is taken into tumor cells or tumor tissues and hydrolyzed by esterase to produce strongly fluorescent fluorescein.
  • the types of tumor cells or tumor tissues that can be stained with the fluorescent staining agent of the present invention are not particularly limited.
  • cancer cells or cancers such as gastric cancer, esophageal cancer, duodenal cancer, bronchial cancer, lung cancer, colon cancer, and skin cancer. Examples include, but are not limited to, any malignant tumor cell or malignant tumor tissue.
  • the fluorescent stain of the present invention is It is taken up in almost the same way by normal cells and tumor cells, but due to differences in intracellular esterase activity or other metabolic enzyme activities, more fluorescein was produced in tumor cells, and z or produced Fluorescein stays in the tumor cells for a longer time, and as a result, the tumor cells are more strongly fluorescently stained with fluorescein. Therefore, the fluorescent stain of the present invention can be used as a selective stain for tumor cells or tumor tissues. Since tumor cells or tumor tissues stained with the fluorescent stain of the present invention emit fluorescence when irradiated with excitation light for fluorescein, normal cell force can also be easily identified.
  • the type of excitation light for fluorescein is not particularly limited, but it is usually sufficient to use excitation light having a wavelength of about 470-500 nm.
  • the concentration of the fluorescent staining agent to be contacted with tumor cells or tumor tissues is not particularly limited, for example, a concentration of approximately 1 X 10- 4 ⁇ 1 X 10- 2 mg / ml, tumor cells or tumor tissue and the fluorescent staining After contacting the agent, it is usually allowed to stand at a temperature of about 37 ° C for several minutes to several hours, preferably about 10 minutes to 2 hours, more preferably about 30 minutes to 2 hours, and then the hydrolysis proceeds. May be irradiated with excitation light.
  • the diagnostic agent containing the fluorescent stain of the present invention as an active ingredient can be suitably used for the purpose of cancer diagnosis, for example, early cancer diagnosis.
  • the above diagnostic agent is applied to the site to be diagnosed (for example, the skin, oral cavity, esophagus, stomach, duodenum, large intestine, bronchi, lung, etc.).
  • a means such as application, swallowing, spraying, or injection, it takes several minutes to several hours, preferably about 10 minutes to 2 hours, and more preferably about 30 minutes to 2 hours. Irradiate with excitation light and confirm the presence or absence of fluorescently stained tissue macroscopically or microscopically!
  • cancer diagnosis with an endoscope can be performed using the fluorescent staining agent of the present invention as a fluorescent contrast agent.
  • a site to be diagnosed esophagus, stomach, duodenum, large intestine, bronchi, lung, etc.
  • the fluorescent staining agent of the present invention is brought into contact with a site to be diagnosed (esophagus, stomach, duodenum, large intestine, bronchi, lung, etc.) by means of swallowing, spraying, injection, or the like, from a few minutes After several hours, preferably about 10 minutes to 2 hours, more preferably about 30 minutes to 2 hours, the part is irradiated with excitation light by an endoscope light source, and the presence or absence of fluorescently stained tissue is detected. If you check it endoscopically.
  • endoscope It is also possible to record images and videos on a film camera, digital camera, CCD video camera, etc. using an endoscope for diagnosis. wear.
  • the type of endoscope is not particularly limited, but a fluorescence endoscope that can irradiate excitation light for fluorescein as an endoscope light source is preferable.
  • a cyanine compound may be used together with or in place of the above fluorescent stain.
  • the kind of cyanine compound is not particularly limited, and any cyanine compound that can be used by those skilled in the art can be used.
  • commercially available cyanide compounds such as Cy-3 and Cy-7 (both are commercially available from Amersham Biosciences) can be suitably used.
  • use a fluorescence endoscope that can irradiate excitation light for cyanine-based compounds as an endoscope light source, and perform cancer diagnosis using Cy-3 or Cy-7, preferably Cy-7, as a fluorescent contrast agent.
  • the method is a preferred embodiment of the present invention.
  • rat normal gastric mucosal epithelium-derived cell RGM1 and its transformed cell RGK1 were used as model cells for normal cells and cancer cells.
  • DMEM / HA M F12 l: l medium (10% FBS, 0.1% penicillin streptomycin was used.
  • Each cell was loaded with the compound shown below (concentration 0.1M) for 10 minutes. The medium was replaced with a compound-free medium, and the average fluorescence intensity was determined by Flow Cytometry after a certain time, and the effectiveness of each compound was evaluated by the average fluorescence intensity ratio of RGK1 to RGM1. It was revealed that the fluorescence intensity ratio of the derivative FDA (fluorescein diacetate) was the highest, and that the intensity ratio varied with time (Fig. Do).
  • FDA is an esterase-sensitive fluorescent probe. After entering cells by diffusion, it is hydrolyzed by intracellular esterase to produce fluorescent fluorescein and gradually leaks out of the cell. The extracellular leakage of fluorescein occurs very slowly compared to the uptake of FDA by the force that fluorescein is more hydrophilic than FDA. This process Comparison was made between normal cells and cancer cells. When the hydrolase activity of the two cell lysates was compared, RGK1 had a hydrolytic activity approximately twice that of FDA. When comparing the leakage rate of fluorescein, RGK1 was slower than RGM1! From these results, it was considered that the FDA gave a high fluorescence intensity ratio in cancer cells to normal cells due to two factors: high hydrolase activity in cancer cells and low leakage rate.
  • FIG. 2 shows the results of comparison by flow cytometry in the same manner as in Example 1 for each derivative in Table 1 below, in which FDA acetyl ester was converted to various esters. As a result, it was clarified that fluorescein diatalylate (FDAcr) is excellent in the discrimination performance between normal cells and cancer cells.
  • FDAcr fluorescein diatalylate
  • Rats (Oss, 10-week-old) were subcutaneously injected with 1 mg of NMBA, administered 5 times a week in the 15th week, once a week in the 6th and 15th weeks, and used in the experiments after the 16th week. Rats were anesthetized by intraperitoneal administration of Nembutal (1 mL / kg body weight) and secured to a table on their backs to secure the airway. An endoscope was inserted into the esophagus for observation. The experimental system is shown in Fig. 3, and the results are shown in Fig. 4. It was observed that the fluorescence intensity of the esophageal cancer lesion was higher than that of the surrounding normal tissue. From this result, the endoscope Below, it was shown that the use of FDAcr can distinguish cancerous lesions from normal thread and tissue.
  • Cy-7 a cyanine-based near-infrared fluorescent dye.
  • fluorescence was also observed from the part considered to be a non-lesioned part, but Cy-7-derived fluorescence was observed mainly from the aneurysm-like lesion part protruding into the esophagus, and the lesion part was fluorescently stained. He was shown to speak.
  • Colorectal cancer model rats were imaged using FDAcr.
  • a colon cancer model rat was anesthetized with ether, and the inside of the large intestine was washed with a 0.6% acetic acid aqueous solution.
  • the colon was washed 2 to 3 times with PBS maintained at 37 ° C, 15 ml of 100 M FDAcr (PBS solution) was enemaed from the anus, the anus was closed, and the mixture was allowed to stand for 3 minutes. After 3 minutes, the colon was washed 2-3 times with PBS kept at 37 ° C.
  • a fiberscope (BF-3C40) was inserted into the large intestine and the lesion was observed. When feces interfered with observation, the inside of the large intestine was appropriately washed. The results are shown in FIG. Strong fluorescence was observed in the colorectal cancer site (left side, lower right side), and cancer diagnosis was easy.
  • the fluorescent stain of the present invention is useful as a stain for distinguishing tumor cells or tumor tissues from normal cells or normal tissues and performing fluorescence staining. It can be used as an agent.

Description

明 細 書
腫瘍選択的蛍光染色剤
技術分野
[0001] 本発明は、腫瘍選択的蛍光染色剤に関する。より詳しくは、腫瘍細胞や腫瘍組織 を選択的に蛍光染色することができ、内視鏡を用いたがんの診断などにおいて腫瘍 細胞や腫瘍組織を選択的に造影するための染色剤に関する。
背景技術
[0002] 光診断は表層に近!、病変部位を高感度に検出する強力な手法として近年大きな 注目を集めている力 その一例として蛍光内視鏡によるがん診断が挙げられる。現在 、内視鏡診断にぉ ヽて腫瘍組織の染色には 5-アミノレブリン酸 (5-ALA)やボルフイリ ンが用いられている。しカゝしながら、これらの染色剤を用いた方法は染色剤が腫瘍組 織に蓄積するまでに時間を要することなどの問題点があることから、特に内視鏡診断 などにぉ 、て、がんの発見のために腫瘍組織を正常細胞と区別して選択的に染色 する手段の提供が求められている。
[0003] 一方、フルォレセイン誘導体である FDA (フルォレセインジアセテート）などのフルォ レセインエステル誘導体が知られて 、る（例えば非特許文献 1などを参照のこと)。こ れらのエステル誘導体はエステルが加水分解されると強蛍光性のフルォレセインを 生成する。また、 FDAなどのエステル誘導体はエステル基が存在することから脂溶性 であり、細胞膜を容易に透過する性質を有しているが、一方、細胞内のエステラーゼ により加水分解を受けて細胞内で生成するフルォレセインは親水性物質であり、細 胞膜を通過しにくく細胞内に滞留する性質を有している。
[0004] これらの性質を利用して、 FDAを細胞内に取り込ませて、細胞内のエステラーゼに より加水分解を受けて生成するフルォレセインカ 放出される蛍光を測定することに より、細胞内エステラーゼを測定する技術 (FDAをエステラーゼプローブとして利用す る技術)、又は細胞を蛍光染色する技術が開発されている（非特許文献 2)。しかしな がら、上記のように FDAはエステラーゼプローブとして、又は組織を一様に染色する ための染色剤として用いられているものの、腫瘍細胞などの特定の細胞を正常細胞 と区別して選択的に染色するために用いられた例は知られていない。また、 FDAを内 視鏡診断における造影剤として使用した例も知られて ヽな ヽ。
非特許文献 l : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55, 134-141, 1966
非特許文献 2 : The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 29, pp.503- 510, 1
981
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の課題は、腫瘍細胞や腫瘍組織を選択的に蛍光染色することができる染色 剤を提供することにある。より具体的には、上記の特徴を有し、内視鏡を用いた診断 などにおいて腫瘍組織を選択的に蛍光染色するための内視鏡用蛍光造影剤として 有用な染色剤を提供することが本発明の課題である。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、従来、エステラー ゼプローブなどに利用されて 、た FD Aなどのフルォレセインエステル誘導体を用いる と腫瘍細胞や腫瘍組織を選択的に蛍光染色することができ、さらにこれらのエステル 誘導体が内視鏡用の造影剤として極めて優れた性質を有していることを見出した。 本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
[0007] すなわち、本発明により、下記の一般式 (I) :
[化 1]
Figure imgf000004_0001
(式中、 R1及び R2はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい C 1〜Cアルキル基、
4
置換基を有していてもよい c〜cアルケニル基、置換基を有していてもよい 〜
2 4 c 2 cァ
4 ルキ-ル基、置換基を有していてもよいァリール基、又は置換基を有していてもよい ヘテロァリール基を示す)で表される化合物を含む腫瘍細胞又は腫瘍組織選択的な 蛍光染色剤が提供される。
[0008] 上記発明の好まし 、態様によれば、 R1及び R2がそれぞれ独立に C〜Cアルキル基
1 4
、 C〜Cァルケ-ル基、ァリール基、又はへテロアリール基である上記の蛍光染色剤
2 4
； R1及び R2がそれぞれ独立に C〜Cアルキル基又は C〜Cアルケニル基である上記
1 4 2 4
の蛍光染色剤； R1及び R2がそれぞれ独立に C〜Cアルキル基又は C〜Cアルケニ
1 3 2 3 ル基である上記の蛍光染色剤；並びに R1及び R2が- CH=CHである上記の蛍光染色
2
剤が提供される。
[0009] 別の観点からは、上記の蛍光染色剤を有効成分として含む診断薬、及び上記の蛍 光染色剤を有効成分として含む腫瘍組織選択的な造影剤が提供される。上記の造 影剤は内視鏡を用いたがん診断、特に内視鏡光源としてフルォレセインに対する至 適励起波長を有する励起光 (例えば 488 nm程度の励起光)を照射可能な蛍光内視 鏡を用いたがん診断に有用である。
[0010] さらに別の観点からは、本発明により、上記蛍光染色剤、上記診断薬、又は上記造 影剤の製造のための上記一般式 (I)で表される化合物の使用；腫瘍細胞又は腫瘍組 織の染色方法であって、上記一般式 (I)で表される化合物を腫瘍細胞又は腫瘍組織 と接触させる工程を含む方法;腫瘍細胞又は腫瘍組織の検出方法であって、上記一 般式 0)で表される化合物を腫瘍細胞又は腫瘍組織と接触させた後、フルォレセイン に対する励起光を照射し、フルォレセインカ 生じる蛍光を測定する工程を含む方 法;並びに、腫瘍組織の造影方法であって、上記一般式 (I)で表される化合物を腫瘍 細胞又は腫瘍組織と接触させ後、フルォレセインに対する励起光を照射し、フルォレ セインカ 生じる蛍光を測定する工程を含む方法が提供される。
[0011] また、本発明により、がん診断方法であって、診断部位に上記一般式 (I)で表される 化合物を接触させ後、フルォレセインに対する励起光を該診断部位に照射し、フル ォレセインカゝら生じる蛍光を測定して腫瘍組織の有無を判定する工程を含む方法； 内視鏡を用いたがん診断方法であって、診断部位に上記一般式 (I)で表される化合 物を接触させ後、内視鏡光源によりフルォレセインに対する励起光を該診断部位に 照射し、フルォレセインカ 生じる蛍光を内視鏡により検出して腫瘍組織の有無を判 定する工程を含む方法が提供される。 さらに、上記の診断薬、上記の造影剤、及び上記の診断方法において、上記一般 式 (I)で表される化合物とともに、又は上記一般式 (I)で表される化合物に替えて、シァ ニン系化合物を用いてもよぐこのような診断薬、造影剤、及び診断方法も本発明に より提供される。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]例 1における各候補ィ匕合物の蛍光強度比の時間変化を示した図である。
[図 2]フルォレセインのエステル誘導体の蛍光強度比の時間変化を示した図である。
[図 3]内視鏡を用いた実験系の概念図である。
[図 4]ラット食道癌を内視鏡下で観察した結果を示した写真である。図中、（a)は白色 光像、（b)は蛍光像の結果を示す。
[図 5]ラット大腸癌を内視鏡下で観察した結果を示した写真である。図中、 FLは青色 励起光による蛍光像、 WLは白色光像の結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 一般式 (I)において、 C〜Cアルキル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの
1 4
組み合わせのいずれでもよぐ例えば、メチル基、ェチル基、 n-プロピル基、イソプロ ピル基、シクロプロピル基、 n-ブチル基、イソブチル基、 sec-ブチル基、 tert-ブチル 基、シクロプロピルメチル基などを挙げることができる。これらのうち、 C〜Cアルキル
1 3 基が好ましい。 C〜cアルケニル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み
2 4
合わせのいずれでもよぐ 1個又は 2個の二重結合を含むことができる。ァルケ-ル基 としては、例えば、ビニル基、 n-プロぺニル基、イソプロぺニル基、 n-ブテニル基など を挙げることができる。 C〜Cアルキ-ル基は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれら
2 4
の組み合わせのいずれでもよぐ 1個又は 2個の三重結合を含むことができ、 1個の三 重結合と 1個の二重結合を含んでいてもよい。アルキニル基としては、例えば、ェチニ ル基、 n-プロピ-ル基、 n-ブチニル基などを挙げることができる。
[0014] 一般式 (I)において、ァリール基としては単環性又は縮合多環性の芳香族炭化水素 基を用いることができ、例えば、フエ-ル基、ナフチル基などが挙げられる。ヘテロァ リール基としては、環構成原子として 1個又は 2個以上のへテロ原子を含む単環性又 は縮合多環性の芳香族基を用いることができる。ヘテロ原子としては、例えば、窒素 原子、酸素原子、又はィォゥ原子などが挙げられ、 2個以上のへテロ原子を含む場合 には、それらは同一でも異なっていてもよい。より具体的には、フリル基、チェニル基 、ピロール基、ピリジル基、イミダゾリル基、ピリミジル基などを挙げることができる。
[0015] 本明細書にぉ 、てある官能基にっ 、て「置換基を有して 、てもよ 、」 t 、う場合に は、置換基の種類、個数、及び置換位置は特に限定されない。置換基としては、例 えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、ォキソ基、アルコキシカルボ-ル基、又は ノ、ロゲン原子 (ハロゲン原子としてはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素 原子などが挙げられる）などが挙げられる力 これらに限定されることはない。 R1及び R 2は同一でも異なっていてもよいが、化合物の合成的観点からは R1及び R2が同一であ ることが好ましい。
[0016] 一般式 (I)で表される代表的な化合物として、 R1及び R2カ^チル基である化合物 (フ ルォレセインジアセテート： FDA)、 R1及び R2がビュル基である化合物（フルォレセイン ジアタリレート： FDAcr)、 R1及び R2がェチル基である化合物（FDP)、 R1及び R2が n-プ 口ピル基である化合物（FDB)、 R1及び R2が n-ブチル基である化合物（FDC)、 R1及び R2がフエ-ル基である化合物（FDBz)、及び R1及び R2が 2_フリル基である化合物（FD Fu)などを挙げることができる力 これらに限定されることはない。
[0017] 一般式 (I)で表される化合物の代表的な化合物はいずれも公知化合物であり、例え ば、モレキュラープローブス（Molecular Probes)社やアルドリッチ社の試薬カタログに 収載されており、当業者は容易に入手可能である。また、公知化合物の製造方法に 準じて容易に製造することもできる。例えば、 FDAcrをはじめとするフルォレセインジ エステル類は Rotoman, B. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55, 134—141, 1966な どに記載されて 、るので、当業者は容易に入手可能である。
[0018] 本発明の蛍光染色剤は腫瘍細胞又は腫瘍組織に取り込まれてエステラーゼにより 加水分解を受け、強蛍光性のフルォレセインを生成する。本発明の蛍光染色剤で染 色可能な腫瘍細胞又は腫瘍組織の種類は特に限定されず、例えば、胃癌、食道癌 、十二指腸癌、気管支癌、肺癌、大腸癌、皮膚癌などの癌細胞又は癌組織など、任 意の悪性腫瘍細胞又は悪性腫瘍組織を挙げることができるが、これらに限定されるこ とはない。いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の蛍光染色剤は 正常細胞及び腫瘍細胞にほぼ同様に取り込まれるが、細胞内のエステラーゼ活性の 違い、あるいはその他の代謝酵素活性などの違いにより、腫瘍細胞内においてより多 量のフルォレセインが生成し、及び z又は生成したフルォレセインが腫瘍細胞内に おいてより長時間滞留し、その結果、腫瘍細胞内はフルォレセインによりより強く蛍光 染色される。従って、本発明の蛍光染色剤は腫瘍細胞又は腫瘍組織に対して選択 的な染色剤として使用することができる。本発明の蛍光染色剤で染色した腫瘍細胞 又は腫瘍組織は、フルォレセインに対する励起光を照射した場合に蛍光を発するの で、正常細胞力も容易に識別可能である。
[0019] フルォレセインに対する励起光の種類は特に限定されな 、が、通常は、 470-500 n m程度の波長の励起光を用いればよ ヽ。腫瘍細胞又は腫瘍組織に接触させるべき 蛍光染色剤の濃度は特に限定されないが、例えば 1 X 10— 4〜1 X 10— 2 mg/ml程度の 濃度であり、腫瘍細胞又は腫瘍組織と上記蛍光染色剤とを接触させた後、通常は 37 °C程度の温度で数分から数時間、好ましくは 10分〜 2時間程度、さらに好ましくは 30 分〜 2時間程度放置して加水分解を進行させ、その後に励起光を照射すればよい。
[0020] 本発明の蛍光染色剤を有効成分として含む診断薬は、がん診断、例えば早期がん 診断などの目的に好適に使用できる。例えば、腫瘍組織の存在の有無の確認を目 的とした診断においては、診断の対象となる部位 (例えば皮膚、口腔内、食道、胃、 十二指腸、大腸、気管支、肺など）に上記診断薬を塗布、嚥下、噴霧、又は注射など の手段で接触させた後、数分から数時間、好ましくは 10分〜 2時間程度、さらに好ま しくは 30分〜 2時間程度の時間をお 、て該部位に励起光を照射して、蛍光染色され た組織の有無を肉眼的又は顕微鏡的に確認すればよ!ヽ。
[0021] より好ましい態様では、本発明の蛍光染色剤を蛍光造影剤として用いて内視鏡に よるがん診断を行うことができる。例えば、診断の対象となる部位 (食道、胃、十二指 腸、大腸、気管支、肺など）に本発明の蛍光染色剤を嚥下、噴霧、又は注射などの 手段で接触させた後、数分から数時間、好ましくは 10分〜 2時間程度、さらに好ましく は 30分〜 2時間程度の時間をおいて内視鏡光源により励起光を該部位に照射し、蛍 光染色された組織の有無を内視鏡的に確認すればょ 、。内視鏡によりフィルムカメラ やデジタルカメラ、 CCDビデオカメラなどに画像や映像を記録して診断を行うこともで きる。内視鏡の種類は特に限定されないが、内視鏡光源としてフルォレセインのため の励起光を照射できる蛍光内視鏡が好ましい。
[0022] また、上記の診断薬、上記の造影剤、及び上記の診断方法にお!、て、上記の蛍光 染色剤とともに、又は上記染色剤にに替えて、シァニン系化合物を用いてもよい。シ ァニン系化合物の種類は特に限定されず、当業者に利用可能なシァニン系化合物 であれば任意のものを利用できる。例えば、市販されている Cy-3、 Cy-7などのシァ- ン系化合物（いずれも Amersham Biosciencesより市販品を入手可能である）を好適に 用いることができる。特にシァニン系化合物のための励起光を内視鏡光源として照射 可能な蛍光内視鏡を用い、蛍光造影剤として Cy-3又は Cy-7、好ましくは Cy-7を用い てがん診断を行う方法は本発明の好ましい態様である。
実施例
[0023] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の 実施例に限定されることはない。
例 1 :候補化合物の選出
培養細胞系にて候補ィ匕合物の選別をおこなった。培養細胞としては、ラット正常胃 粘膜上皮由来細胞 RGM1、及びそのトランスフォーム細胞である RGK1を正常細胞及 びがん細胞のモデル細胞として使用した。 RGM1及び RGK1の培養には DMEM/HA M F12 = l:l培地（10%FBS, 0.1% penicillin streptomycinを用いた。それぞれの細胞 に下記に示した化合物 (濃度 0.1M)を 10分間ロードした後、培地を化合物非含有培 地に交換し、一定時間後に Flow Cytometryから平均蛍光強度を求めた。各化合物 の有効性は RGM1に対する RGK1の平均蛍光強度比により評価した。この結果、フル ォレセインのエステル誘導体である FDA (フルォレセインジアセテート）の蛍光強度比 が最も高くなり、またその強度比は時間に依存して変化することが明らかとなった（図 D o
[0024] [化 2]
Figure imgf000010_0001
例 2
FDAはエステラーゼ感受性蛍光プローブであり、拡散で細胞に入った後に細胞内 のエステラーゼで加水分解されて蛍光性のフルォレセインを生成し、徐々に細胞外 へと漏出する。フルォレセインの細胞外漏出はフルォレセインが FDAに比べて親水 性であること力も FDAの細胞内取り込みに比べて非常にゆっくりと起きる。この過程を 正常細胞及びがん細胞で比較した。 2種類の細胞溶解液の加水分解酵素活性を比 較したところ、 RGK1が FDAに対して約 2倍高い加水分解活性を有していた。また、フ ルォレセインの漏出速度を比較すると、 RGM1に比べて RGK1の方が遅!、こと力分力、 つた。これらの結果から、がん細胞における高い加水分解酵素活性と低い漏出速度 の 2つの要因によって、 FDAでは正常細胞に対してがん細胞において高い蛍光強度 比を与えたものと考えられた。
[0026] 例 3
FDAのァセチルエステルを各種のエステルに変換した下記表 1の各誘導体につい て例 1と同様にしてフローサイトメトリーにより比較した結果を図 2に示す。その結果、 フルォレセインジアタリレート (FDAcr)が正常細胞とがん細胞との識別性能に極めて 優れていることが明らかになった。
[表 1]
Figure imgf000011_0001
[0027] 例 4
FDAcrを用いて蛍光顕微鏡下でのイメージングを行った。蛍光顕微鏡下 (ォリンパ ス社製 1X71、励起波長 470-490 nm、フィルター 500 nm)で観察したところ、例 3の結 果と同様に、がん細胞において強い蛍光が認められ、がん細胞と正常細胞とを明確 に区別できることが確認された。
[0028] 例 5
FDAcrを用いて食道癌モデルである NMBAラットのイメージングを行なった。ラット（ ォス、 10週齢）に NMBA 1 mgを皮下注射し、第 1 5週は週 5回投与し、第 6 15週は 週 1回投与し、第 16週以降に実験に使用した。ラットをネンブタール腹腔内投与（1 m L/kg体重）により麻酔し、仰向けにして台に固定して気道を確保した。内視鏡を食道 に挿入して観察を行った。実験系を図 3に示し、結果を図 4に示す。食道癌病変部の 蛍光強度が周囲の正常組織に比べて高いことが観察された。この結果から、内視鏡 下で FDAcrを用いることにより癌病変部と正常糸且織を区別できることが示された。
[0029] 例 6
例 5と同様にしてシァニン系の近赤外蛍光色素である Cy-7を用いて蛍光内視鏡像 を得た。 Cy-7では非病変部と思われる部分からも蛍光が観察されたが、主として食 道内に突出している瘤状の病変部から Cy-7由来の蛍光が観察され、病変部が蛍光 染色されて ヽることが示された。
[0030] 例 7
FDAcrを用いて大腸癌モデルラットのイメージングを行なった。大腸癌モデルラット をエーテル麻酔し、大腸内を 0.6%酢酸水溶液で洗浄した。 37°Cに保った PBSで大腸 内を 2〜3回洗浄し、 100 M FDAcr (PBS溶液） 15 mlを肛門より注腸し、肛門を塞い で 3分間静置した。 3分後に 37°Cに保った PBSで 2〜3回大腸内を洗浄した。大腸内に ファイバースコープ (BF-3C40)を挿入して病変部を観察した。糞が観察の邪魔にな る場合には適宜大腸内を洗浄した。結果を図 5に示す。大腸癌部位 (左側面、右下 面）に強い蛍光が認められ、容易に癌診断が可能であった。
産業上の利用可能性
[0031] 本発明の蛍光染色剤は腫瘍細胞又は腫瘍組織を正常細胞又は正常組織と区別し て蛍光染色するための染色剤として有用であり、例えば、内視鏡診断において腫瘍 組織選択的な造影剤として使用することができる。

Claims

請求の範囲 下記の一般式 (I) :
[化 1]
Figure imgf000013_0001
(式中、 R1及び R2はそれぞれ独立に置換基を有していてもよい C〜Cアルキル基、
1 4
置換基を有していてもよい c〜cアルケニル基、置換基を有していてもよい c〜cァ
2 4 2 4 ルキ-ル基、置換基を有していてもよいァリール基、又は置換基を有していてもよい ヘテロァリール基を示す)で表される化合物を含む腫瘍細胞又は腫瘍組織選択的な 蛍光染色剤。
[2] R1及び R2がそれぞれ独立に C〜Cアルキル基、 C〜Cァルケ-ル基、ァリール基、
1 4 2 4
又はへテロアリール基である請求項 1記載の蛍光染色剤。
[3] R1及び R2がそれぞれ独立に C〜Cアルキル基又は C〜Cァルケ-ル基である請求
1 3 2 3
項 1に記載の蛍光染色剤。
[4] R1及び R2が- CH=CHである請求項 1に記載の蛍光染色剤。
2
[5] 請求項 1な!、し 4の 、ずれか 1項に記載の蛍光染色剤を有効成分として含むがん診 断薬。
[6] 早期がん診断に用いる請求項 5に記載の診断薬。
[7] 請求項 1な!、し 4の 、ずれか 1項に記載の蛍光染色剤を有効成分として含む腫瘍組 織選択的な造影剤。
[8] 内視鏡を用いたがん診断に用いる請求項 7に記載の造影剤。
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