WO2007096534A1 - Plantes presentant une resistance accrue aux stress biotiques et abiotiques - Google Patents

Plantes presentant une resistance accrue aux stress biotiques et abiotiques Download PDF

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Nawroz Abdulrazzak Tahir
Thierry Heitz
Vincent Compagnon
Danièle Werck
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    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)

Definitions

  • the present invention relates to plants or plant parts having increased resistance to environmental, biotic and abiotic stresses, as well as methods for obtaining such plants or parts thereof.
  • Cytochromes P450 are membrane proteins involved in many hydroxylation reactions in plants.
  • the complete sequencing of the genome of Arabidopsis thaliana has made it possible to highlight the existence of 273 genes encoding cytochromes P450 distributed in 45 families and subfamilies. The function of many of these genes remains unknown.
  • the CYP98 family which appears to be involved in the lignification process (Franke et al (2002) Plant J. 30: 47, Abdulrazzak et al (2006) Plant Physiol 140: 30), consists of three members, CYP98A3, CYP98A8 and CYP98A9.
  • CYP98A8 and CYP98A9 have 69% identity with each other and 52% identity with CYP98A3.
  • CYP98A3 encodes p-coumaroyl 3'-ester-hydroxylase (Schoch et al., (2001) J. Biol Chem 276), however, the function of CYP98A8 and CYP98A9 remains unknown to date.
  • the present invention results from the demonstration by the inventors that the expression of the CYP98A9 gene was increased in Arabidopsis thaliana when it is subjected to a stress of a biotic nature, such as a microbial or abiotic infection, such as a stress. water, oxidative stress, or heat stress, and that plants with increased expression of this gene exhibited increased resistance to said stress.
  • a stress of a biotic nature such as a microbial or abiotic infection
  • a stress. water, oxidative stress, or heat stress such as oxidative stress, or heat stress
  • the present invention therefore relates to the use of a nucleic acid comprising or consisting of: a) a sequence encoding a CYP98A9 protein represented by SEQ ID NO: 2, or b) a sequence encoding a CYP98A9 homologous protein having at least 60 % identity with SEQ ID NO: 2, provided that said homologous protein exhibits activity similar to that of CYP98A9, or c) a sequence hybridizing under stringent conditions to the sequence coding for the CYP98A9 protein or its complementary sequence Subject said hybridizing sequence encodes a protein exhibiting activity similar to that of CYP98A9, for the production of plants, or parts of plants, having increased resistance to environmental stresses relative to corresponding plants or parts of plants which do not were not produced using said nucleic acid.
  • the nucleic acid defined above is included in an expression cassette in which said nucleic acid is operably linked to at least one regulatory sequence, in particular a promoter sequence, and / or at least one terminator sequence.
  • the promoter sequence of the above expression cassette is a plant constitutive promoter.
  • the present invention also relates to an expression cassette as defined above.
  • the expression cassette comprises a nucleic acid as defined above operably linked to at least one regulatory sequence, in particular a promoter sequence, and / or at least one terminator sequence.
  • the present invention also relates to an expression vector comprising an expression cassette as defined above.
  • the invention relates to an expression vector represented by SEQ ID NO: 7.
  • the invention also relates to a cell comprising an expression cassette as defined above or an expression vector as defined above.
  • the cell can be of any origin. In particular, it may be of bacterial or plant origin.
  • the invention also relates to a plant, or part of a plant, whose genome comprises at least one nucleic acid as defined above, provided that said nucleic acid is heterologous with respect to said plant, or plant part, that is to say that in the natural or wild state the genome of said plant, or part of plant does not include said nucleic acid.
  • the plant, or part of the plant, according to the invention will comprise at least one copy of the nucleic acid. as defined above.
  • the plant, or part of the plant, in the natural or wild state has one or more copies of a nucleic acid as defined above (for example, in Arabidopsis thaliana it is naturally exists a nucleic acid encoding CYP98A9)
  • the plant or plant part according to the invention comprises at least one additional copy of said nucleic acid.
  • the invention also relates to a plant, or part of a plant, whose genome comprises at least one expression cassette as defined above or an expression vector as defined above.
  • the present invention also relates to a method for producing modified plants, or modified plant parts, having an increased resistance to environmental stresses relative to corresponding unmodified plants or parts of plants, of expressing at least one nucleic acid as defined above in modified plants, or parts of modified plants, or to increase the expression of said nucleic acid in modified plants, or parts of modified plants, relative to corresponding unmodified plants or parts of plants .
  • the above method comprises a step of regenerating modified plants, or modified plant parts, from plants, or parts of plants, such as a plant cell, transformed by a plant.
  • nucleic acid as defined above, an expression cassette as defined above, or a vector as defined above.
  • the present invention also relates to a modified plant, or modified plant part, obtainable according to the process defined above.
  • the present invention also relates to a plant, or part of a plant, transformed with a nucleic acid as defined above.
  • the CYP98A9 protein is a 487 amino acid protein represented by SEQ ID NO: 2 isolated from Arabidopsis thaliana, it is notably referenced by AAG52373 in the GenBank database. This protein may in particular be encoded by SEQ ID NO: 1.
  • CYP98A9 written in italics, represents the coding nucleotide sequence of CYP98A9.
  • homologue any protein whose sequence has at least 60%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90% identity with SEQ ID NO: 2. These homologous sequences are especially obtained by deletion, insertion or substitution of at least one amino acid of SEQ ID NO: 2.
  • the percentage identity of a sequence with respect to SEQ ID NO: 2 is calculated by counting the number of identical amino acids between said sequence and SEQ ID NO: 2 for all the positions of an optimal sequence alignment. between said sequence and SEQ ID NO: 2 and dividing this number by the total number of amino acids of said sequence.
  • Sequence alignment can be performed manually, possibly by introducing gaps between the amino acids, or using sequence alignment software well known to those skilled in the art, such as BLAST software (Altschul et al. (1997) NucleicAcids Res 25: 3389-402).
  • stringent conditions selective hybridization conditions. Stringent hybridization conditions with respect to a particular nucleic acid sequence may be routinely developed by those skilled in the art. By way of example of stringent conditions according to the invention, mention may be made of a hybridization temperature of 65 ° C., in a 20xSCC buffer, and a washing temperature of 5 ° to 10 ° C. under the hybridization temperature in a 2x to 0.2x SCC buffer.
  • a protein exhibits "activity similar to that of CYP98A9” when it catalyzes the same enzymatic reaction and / or occurs in the same step of a metabolic pathway as CYP98A9. This similar activity may be assessed in particular in a plant, or plant part, through the expression of I 1 messenger RNA (mRNA) encoding this protein.
  • mRNA I 1 messenger RNA
  • a protein exhibits "CYP98A9-like activity" when a plant that expresses the messenger mRNA encoding that protein or protein in itself at a given level exhibits equivalent resistance to the environmental stresses to which it is subjected in relation to to a plant that expresses the mRNA of the CYP98A9 protein or the CYP98A9 protein at the same level.
  • the relative levels of mRNA expression in a plant can be measured by PCR (polymerase chain reaction) as described in Example 1. Equivalent resistance to environmental stresses can be evaluated as indicated in FIGS. Examples 3 to 5.
  • the plants, or parts of plants, expressing the mRNA of the protein having an activity similar to that of CYP98A9 must have a phenotypic appearance similar to the plants, or parts of plants, expressing CYP98A9, after exposing said plants to stress under the same conditions; when the measurement results of the stress resistance can be quantified numerically, the results obtained for the plant expressing I 1 mRNA of the protein having an activity similar to that of CYP98A9 are of the same order of magnitude as those obtained for the plant expressing CYP98A9, in particular these results are in a range of about ⁇ 10 to 20% compared to those obtained for the plant expressing CYP98A9.
  • the plants expressing the protein having an activity similar to that of CYP98A9 do not present more than 20%, especially 10%, of colonies. in addition to plants expressing CYP98A9 on average.
  • the plants expressing the protein having an activity similar to that of CYP98A9 do not have a diameter of infection greater than 20%, especially by more than 10%, than plants expressing CYP98A9 on average.
  • a protein that exhibits activity similar to CYP98A9 can be detected by immunodetection using antibodies against CYP98A9.
  • RNA in particular an mRNA and / or a protein from the genetic information carried by said nucleic acid.
  • the nucleic acid is expressed in modified plants, or parts of modified plants, which do not comprise said nucleic acid in the unmodified state, in particular in the natural or wild state .
  • the term "plant” designates any plant, in particular any plant of the gymnosperm type or angiosperm monocotyledonous or dicotyledonous.
  • the plants according to the invention are preferably selected from the group consisting of crucifers, solanaceae, cucurbitaceae, compounds, umbelliferae, violaceous, malvaceae, rosaceae and capparales, and among the monocotyledons, the plants according to the invention are preferentially selected from the group consisting of grasses and liliaceae.
  • the plant is selected from cereals such as corn, wheat or rice, or from oilseed crops such as rapeseed or sunflower.
  • part of plant is meant any fragment of a plant containing at least one plant cell, for example a plant organ (such as a leaf, a bud, a flower, a root, a fruit, or a seed ), a plant tissue (such as a meristem), a plant callus or a plant cell.
  • a plant organ such as a leaf, a bud, a flower, a root, a fruit, or a seed
  • plant tissue such as a meristem
  • plant callus or a plant cell.
  • plant production, or parts of plant is meant any human activity of preparation, modification or selection of a plant or part of a plant.
  • corresponding plants or parts of plants which have not been produced using said nucleic acid are meant plants, or parts of plants which are genetically identical to plants, or parts of plants, of invention before the implementation of the use according to the invention; it is therefore “natural” or “wild” plants.
  • Arabidopsis thaliana contains only one locus for the CYP98A9 gene in its genome (Schoch et al., (2001) J. Biol Chem 276: 36566- 36574; http: //www.p450 .kvl.dk / 7p450.shtml), that is to say that it contains two nucleic acids essentially represented by SEQ ID NO: 1 in its genome considered in the diploid state.
  • diploid genome means that for a given genome, which may be haploid, diploid, or polyploid, homologous chromosomes are considered in pairs.
  • the plants produced according to the use or the method of the invention are such that they exhibit an increased expression of the CYP98A9 protein relative to the corresponding non-produced plants according to the invention.
  • the inventors have shown that increased expression of CYP98A9 was related to increased expression of camalexin, an indole derivative involved in the defense of plants against many stressors, including pathogens (Thomma et al (1999) Plant J. 19: 163-171, Denby et al (2005) Plant J. 41: 673-684).
  • Environmental stress By “environmental stress”, or environmental stressors, is meant all the factors outside a plant likely to affect the normal metabolism of this plant and to induce in it an adaptation and / or defense reaction. .
  • Environmental stresses can come from living beings, it is about biotic stress, or other factors, one speaks then of abiotic stress.
  • Biotic stresses include all microbial pathogens, such as fungal, bacterial or viral pathogens, and the infections for which they are responsible.
  • Abiotic stress includes all stresses of a physical or chemical nature, including oxidative or climatic stress; these include water stress, such as lack of water, or heat stress, such as cold or heat.
  • Oxidative stress includes all the stresses resulting in the increase of the concentration of oxidizing agents in a plant or part of a plant.
  • operably linked means that the expression of the nucleic acid is under the control of a regulatory sequence, including a promoter sequence, and / or a terminator sequence.
  • the promoter and / or terminator sequences according to the invention are plant promoter and / or terminator sequences, in particular derived from plants.
  • promoter sequences and / or plant terminators are meant promoters and / or functional terminators within plant tissues.
  • promoter sequences derived from plants are meant promoters and / or functional terminators within plant tissues and likely to be found naturally in plants.
  • Promoter sequences are well known to those skilled in the art. These are sequences that control the level of transcription of the nucleotide sequences that are under their control.
  • the promoter sequences according to the invention include both the promoters as such and the enhancer-type sequences (enhance ⁇ ) .
  • the promoter sequences according to the invention can be inducible by certain factors, as well as specific to a tissue, or constitutive. .
  • inducible or tissue-specific promoters only induce the expression of nucleic acids under their control under certain conditions environmental, or in some target tissues, such as stems, leaves, seeds, roots, or flowers.
  • inducible promoters according to the invention include promoters inducible by environmental stress as defined above.
  • the inducible promoters according to the invention include promoters inducible by water stress or by a fungal, viral or bacterial agent. Prominers inducible by water stress are well known to those skilled in the art. By way of example, mention may be made of the promoters described by Kasuga et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 287-291.
  • tissue-specific promoters include the Chlorella virus promoter regulating the expression of the adenine methyltransferase gene, the cassava mosaic virus promoter which is expressed mainly in green tissues, the elements regulators of the tomato gene2A11 promoter, which allow specific expression in fruits, or root promoters described in WO 02/46439 and WO 03/040322.
  • HMGW High Molecular Weight Glutenin
  • constitutive plant promoter means that this promoter drives the unconditional expression of genes that are under its control in a plant cell.
  • the constitutive promoters are not tissue-specific and induce the expression of the nucleic acids under their control regardless of the conditions to which the host cell is subjected.
  • the CYP98A9 gene is not under the control of a constitutive plant promoter; in particular CYP98A9 is mainly expressed in the bud (see Example 1).
  • Terminator sequences are also well known to those skilled in the art. Terminator sequences bring about the stop of the transcription of nucleotide sequences which are upstream and promote the synthesis of more stable messenger mRNAs, in particular by adding a polyA tail.
  • the 3 'Nos terminator terminator of the nopaline synthase, which corresponds to the 3' non-coding region of the nopaline synthase gene originating from the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid with nopaline strain.
  • the expression vector according to the invention is suitable for the transformation of cells, in particular bacterial or plant cells.
  • Cell transformation methods are well known to those skilled in the art.
  • bacteria for example, the method described by McCormac et al. (1998) Mol. Biotechnol. 9: 155-159.
  • the expression vector according to the invention may comprise one or more selection genes, such as a herbicide resistance gene (for example glufosinate (Basta®), glyphosate (Roundup®), asulam, or bromoxynil), such as the Streptomyces hygroscopicus bard gene (GenBank X17220) which encodes a phosphinotricin acetyltransferase and confers resistance to glufosinate (phosphinotricin); and / or an antibiotic (eg hygromycin (Herrera-Estrella et al (1983) EMBO J. 2: 987-995), kanamycin, bleomycin or streptomycin). It may also include an origin of bacterial and / or plant replication.
  • the expression vector according to the invention may in particular be in plasmid form.
  • the process for producing modified plants, or modified plant parts, having increased resistance to environmental stresses relative to the corresponding unmodified plants or parts of plants, comprising increasing the expression of a nucleic acid as defined above in the modified plants, or parts of plants modified with respect to the plants, or parts of plants, not modified corresponding comprises a) a step of transforming a plant or part of a plant, such as a cell, with a nucleic acid as defined above, an expression cassette as defined above, or a vector as defined above, and b) a step of regenerating modified plants, or modified plant parts, from the plants, or parts of plants, obtained in step a).
  • Plant cell transformation methods are well known to those skilled in the art, for example the method described by Clough and Bent (1998) Plant J. 16: 735-743.
  • Guis et al. Stemo Horticulturae 84: 91-99, 2000
  • Hamza and Chupeau J. Exp Bot 44: 1837-1845, 1993
  • for tomato by Shoemaker et al.
  • Plant CeII Rep. 3: 178-181, 1986 or Trolinder and Goodin (Plant CeII Rep. 6: 231-234, 1987) for cotton, by Van der Mark et al. (J.
  • Example 2 provides an illustration of such a method.
  • Figure 1 represents the relative expression of the CYP98A9 gene (ordinate axis) in root, stem, leaf, bud, flower and silique tissues in Arabidopsis thaliana.
  • Figure 2 represents the relative expression of the CYP98A9 gene (ordinate axis) in tissues of wild-type A thaliana plants (WT1, WT2, WT3) and transgenic A thaliana plants comprising an expression vector expressing CYP98A9 (A to I).
  • Figure 3 shows the relative expression of CYP98A9 gene (y-axis) in plant tissues of A. thaliana wild (WT1, WT2) h 0 (1 st in column from the left), 24 hours (2nd column starting from the left), 48 h (3rd column from the left) and 72 h (4 th column from the left) after infection with Pseudomonas syringae avrRpmi.
  • Figure 4 represents the phenotype of representative leaves from wild A thaliana plants (left) and overexpressing CYP98A9 (right) 72 hours after infection with P. syringae avrRpmi.
  • Figure 5 represents the number of bacterial colonies on the surface of leaves infected with P. syringae avrRpmi (y-axis, log cfu (colony-forming units) / area of leaf disc removed (cm 2 )) immediately after infection (white columns , TO) or 3 days after infection (hatched column, T3) for two wild A thaliana plants (WT1, WT2) or overexpressing CYP98A9 (A, E).
  • Figures 6A-6B show the relative expression of CYP98A9 gene (y-axis) in plant tissues of A. thaliana wild (WT1, WT2) h 0 (1 st column from the left), 24 h (2 th column from the left), 48 h (3rd column from the left), 72 h (4 th column from the left) and 96 h (5 th column from the left) after infection by Xanthomonas campestris 147 (XCC 147) ( Figure 6A) and Xanthomonas campestris 568 (XCC 168) ( Figure 6B).
  • Figures 7A-7B show the phenotype of representative leaves from Wild thaliana plants (left) and overexpressing CYP98A9 (right) 72 hours after infection with X. campestris 147 (XCC147) ( Figure 7A) and X. campestris 568 (XCC168) ( Figure 7B).
  • Figures 7C and 7D represent the number of bacterial colonies on the leaf surface infected with X. campestris 147 (XCC147) ( Figure 7C) and X. campestris 568 (XCC168) ( Figure 7D) (ordinate axis, log cfu (units colony forming) / surface of leaf disc removed (cm 2 )) immediately after infection (white columns, TO) or 3 days after infection (hatched column, T3) for two wild A. thaliana plants (WT1, WT2) or overexpressing CYP98A9 (A, E).
  • Figure 8 shows the relative expression of CYP98A9 gene (y-axis) in A. thaliana wild plant tissue (WT1, WT2) h 0 (1 st in column from the left), 24 hours (2nd column starting from the left), 48 h (3rd column from the left) and 72 h (4 th column from the left) after infection with Botrytis cinerea.
  • Figure 9 represents the phenotype of representative leaves from wild A thaliana plants (left) and overexpressing CYP98A9 (right) 72 hours after infection with B. cinerea.
  • Figure 10 shows the diameter (y-axis, in mm) of the infection zone of wild-type A thaliana (WT1, WT2) and overexpressing CYP98A9 (A, E) leaves infected with B. cinerea.
  • Figure 11 shows the relative expression of CYP98A9 gene (y-axis) in A. thaliana wild plant tissue (WT1, WT2) h 0 (1 st column starting from the left), 24 hours (2nd column starting from the left), 48 h (3rd column from the left), 72 h (4 th column from the left) and 96 h (5 th column from the left) after contacting with a solution of Rose Bengal.
  • WT1, WT2 wild plant tissue
  • Figure 12 represents the phenotype of representative leaves from wild plants (left) and expressing RNAi directed against CYP98A9 (right) 72 hours after contact with a solution of Rose Bengal.
  • Figures 13A-13D show the amount of camalexin present in leaf discs (y-axis, in ⁇ g / disc area (cm 2 )) of wild A. thaliana plants (WT1, WT2) and overexpressing CYP98A9 (A, E ) infected with P. sy ⁇ ngae avrRpmi (Figure 13A), B. cinerea ( Figure 13B), or Alternaria brassicicola (Figure 13C) or subjected to oxidative stress by Rose Bengal treatment ( Figure 13D).
  • Figure 14 shows the relative expression of CYP98A9 gene (y-axis) in A. thaliana wild plant tissue (WT1, WT2) h 0 (1 st in column from the left), 48 hours (2nd column starting from the left), 72 h (3rd column from the left) and 96 h (4 th column from the left) plants after cold exposure.
  • Figure 15 shows the relative expression of CYP98A9 gene (y-axis) in A. thaliana wild plant tissue (WT1, WT2) h 0 (1 st column starting from the left), 48 hours (2nd column starting from the left), and 72 h (3rd column from the left) after exposure of the plants to water stress.
  • the localization of the expression of the CYP98A9 gene in various organs of A. thaliana CoI-O is obtained by quantitative PCR from the retrotranscription product of total RNAs extracted from leaves, stems, roots, buds, flowers and pods.
  • RNAs are prepared as follows. About 2.5 ⁇ g of RNA from each sample is first retro-transcribed into cDNA. The RNA is mixed with 0.5 ⁇ g of oligo (dT) primers, the dNTPs (0.83 mM final), all supplemented to 12 ⁇ l with water (DEPC treated) sterile. The mixture is incubated at 65 ° C for 5 min, to destroy the secondary structures and to allow hybridization of the primers and then kept in ice. We then add the first strand buffer (Invitrogen) of the DTT (10 mM final), then complete to 19 .mu.l with sterile water, before adding 1 .mu.l of reverse transcriptase SuperscriptII (Invitrogen) 200 ml.
  • the reaction is incubated for 50 minutes at 42 ° C., then 15 minutes at 70 ° C. to inactivate the enzyme.
  • the cDNA thus obtained is used for the quantitative PCR performed on an Applied Biosystems GeneAmp 5700 Sequence Detection System.
  • Specific primer pairs of the genes studied are designed from the coding sequences described in the data banks, and according to the following criteria: a size of about 20-30 nt, a Tm of about 60 ° C. and a amplicon of about 50-200 nt.
  • the primers used are selected by the Primer Express software (Applied Biosystems).
  • PCR For each quantitative PCR reaction, 5 ⁇ l of a 1/5 dilution of the cDNA are mixed with 0.3 ⁇ M (final) of primers, and 13 ⁇ l of SYBR Green mix (Sigma). The volume is made up to 25 ⁇ l with water, and the mixture is kept in the ice.
  • the PCR is initiated at hot start ("hot start"), in order to avoid aspecific amplifications, such as primer dimers, and at a 95-minute step of 10 minutes allowing denaturation, followed by 40 cycles of 15 minutes. seconds at 95 ° C, 1 minute at 60 ° C.
  • a first step of standardization of the samples by quantitative PCR on a constitutive expression gene is necessary to adjust the amount of cDNA between the different samples.
  • the reference gene used is that of actin II.
  • the adjusted cDNAs can then be used in quantitative PCR to determine expression of the genes of interest. Quantification for each sample is repeated three times.
  • the primers used have the following sequences: A9q1 (sense) CACCGTTTGGCTTAAACGTCTT (SEQ ID NO: 3) A9q2 (antisense) CCGAGCCATGTGCTTCAT (SEQ ID NO: 4) The results obtained are shown in Figure 1. It appears that the CYP98A9 gene is significantly expressed only in the buds.
  • L 1 cDNA of CYP98A9 (SEQ ID NO: 1) is amplified using 1 HIFI DNA polymerase (Boehringer) from the following primers: Attb7 (sense):
  • Attb ⁇ antisense
  • the CYP98A9 cDNA is then introduced into a GATEWAY pDNOR201 input vector (Invitrogen). After selecting a clone lacking amplification error by sequencing, the cDNA is transferred into the GATEWAY overexpression vector pB7WG2 (Karimi et al. (2002) Plant Sci. 7: 193-195) downstream of the constitutive promoter. CaMV 35S to give the CYP98A9 GATEWAY pB7WG2 expression vector (SEQ ID NO: 7) which contains a Basta® herbicide resistance gene (AgroEvo) and a spectinomycin resistance gene.
  • the vector obtained was then used to transform A. thaliana CoI-O via Agrobacterium tumefaciens and the so-called "floral dip" technique. Briefly, a overnight culture at 28 ° C is carried out in YEB medium (Van Larebeke et al., (1977) Nature 265: 561-563) containing the appropriate antibiotic from a preculture of Agrobacteria transformed to using the GATEWAY vector pB7WG2 CYP98A9 (SEQ ID NO: 7) (Clough & Bent (1998) Plant J. 16: 735-743). After centrifugation of this culture, the pellet is gently taken up in a 5% sucrose solution so as to obtain an OD ⁇ fJO of approximately 0.8.
  • Silwet L-77 Surfactant
  • TO inflorescences of the plants to be transformed
  • the inflorescences of the plants to be transformed (TO) are then immersed for 1 min in the solution containing the agrobacteria and the plants are then placed under mini-greenhouses for 2 days in order to maintain high humidity.
  • watering is stopped so that they dry out gradually until the seeds are harvested (Clough & Bent (1998) Plant J. 16: 735-743).
  • the seeds are then harvested and sown in trays (25x50 cm) at a density of 1500 plants per tray.
  • the plants obtained (T1) are sprayed with 250 mg / L of Basta (AgroEvo) 5 days, 2 weeks, 3 weeks after germination.
  • Transgenic plants resistant to the herbicide are transferred to individual pots.
  • the seeds of T1 plants are harvested and sown on MS medium supplemented with 0.8% Pastagar, 1% sucrose, 10 ⁇ g / ml phosphinotricin, and 500 ⁇ g / ml carbenicillin.
  • the expression of the CYP98A9 gene in the selected transgenic plants was measured by quantitative PCR as in Example 1. The results obtained are shown in FIG. 2. They show that the overexpression leads to a relative increase in the quantities of transcripts detected in transformants which varies between 3 and 7 times the expression detected in the wild. The highest expression is detected in lines A and E which have been used subsequently.
  • RNAs were extracted from the infected leaves at 24 h, 48 h, 72 h and 96 h after infiltration and then retrotranscribed (see Example 1). The relative expression of CYP98A9 was then quantified by quantitative PCR (see Example 1). The results obtained for two distinct wild plants infected with P.
  • syringae avrRpm are shown in Figure 3. The value represents the average of three replicated experiments (8 plants / replicates, 3 leaves / plants). Expression of CYP98A9 is observed to increase in response to infection. Similar results were obtained with P. syringae vir.
  • Figure 4 shows the phenotype of representative leaves from wild plants and overexpressing CYP98A9 72 hours after infection with P. syringae avrRpmi. Plants overexpressing CYP98A9 are visibly protected from infection compared to wild plants. Similar results were obtained with P. syringae vir.
  • Figure 9 shows the phenotype of representative leaves from wild plants and overexpressing CYP98A9 72 hours after leaf contact and B. cinerea. Plants overexpressing CYP98A9 are visibly protected from infection compared to wild plants. In addition, the diameter of infection was significantly lower for plants overexpressing CYP98A9 compared to wild plants ( Figure 10).
  • Plants expressing CYP98A9 RNAi were prepared as follows. A 105 base pair specific sequence fragment of the CYP98A9 cDNA (SEQ ID NO:
  • the fragment was transferred in repeated inverted orientation into the GATEWAY interfering RNA vector pB7WIWG2 (II) (Karimi et al., 2002) to give the vector of RNA interference GATEWAY pB7WIWG2 (II) CYP98A9 (SEQ ID NO: 11).
  • This vector was introduced into A. thaliana CoI-O and the transformants were selected as previously described.
  • RNAs were extracted from the infected leaves Oh, 24h, 48h, 72h and
  • Figure 12 shows the phenotype of representative leaves from wild plants expressing CYP98A9 RNAi 72 hours after leaf contact and Rose Bengal. Wild plants are visibly more resistant to oxidative stress induced by Rose Bengal than plants that do not express the CYP98A9 gene (plants expressing CYP98A9 RNAi).
  • Wild or overexpressing CYP98A9 plants were infected with P. syringae avrRpmi, B. cinerea or A. brassicicola (see Examples 3 and 4) or subjected to oxidative stress by Rose Bengal treatment (see Example 5).
  • An assay of camalexine, an indole derivative involved in the defense against pathogens, was performed by fluorimetry 48 hours after infection. Briefly, the leaf discs are taken from the infected plants (3 replicates, 6 plants / replicate, 6 disks / plant) and heated at 80-90 ° C. for 20 min in 1 ml of 80% methanol. The solvent is evaporated and the residue taken up in chloroform (v / v), then the chloroform is evaporated in turn.
  • the residue is taken up in 60 ⁇ l of chloroform and then the samples are deposited on silica gel (DC Platten Kieselgel 60 F254, Merck). The samples are migrated in a hexane: ethyl acetate solvent (1: 9). during 1h30 to 2h. The band corresponding to camalexin (blue) is visualized under UV at 366 nm (rf between 0.78-0.81). The blue band is scraped and eluted in 3 ml of 100% methanol. The mixture is well vortexed and filtered. The fluorescence of camalexin is measured by fluorimetry and its concentration determined with respect to a standard curve obtained with the reference camalexin.
  • Wild thaliana CoI-O plants were subjected to cold treatment (6-week plants placed in a growth chamber at 4 ° C).
  • RNAs were extracted from the leaves Oh, 48h, 72h and 96h after the plants were installed in a growth chamber at 40 C.
  • the relative expression of CYP98A9 was then quantified by quantitative PCR.
  • the results obtained for two distinct wild plants are shown in Figure 14. The value represents the average of the three replicated experiments (8 plants / replicate, 3 leaves / plant). It is observed that the cold treatment causes an increase in the expression of CYP98A9.
  • plants of A. thaliana CoI-O or overexpressing the CYP98A9 gene are subject to the above thermal stress. It is observed that plants overexpressing the CYP98A9 gene are more resistant to stress than wild plants.
  • Wild A. thaliana CoI-O plants were subjected to water stress (watering stoppage).
  • RNAs were extracted from Oh, 48h and 72h leaves after stopping watering.
  • the relative expression of CYP98A9 was then quantified by quantitative PCR.
  • the results obtained for two distinct wild plants are presented in Figure 15. The value represents the average of the three experiments replicated (8 plants / replicate, 3 leaves / plant). It is observed that water stress causes an increase in the expression of CYP98A9.
  • plants of A. thaliana CoI-O or overexpressing the CYP98A9 gene are subject to water stress above. It is observed that plants overexpressing the CYP98A9 gene are more resistant to stress than wild plants.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un acide nucléique comprenant : a) une séquence codant une protéine CYP98A9 représentée par SEQ ID NO : 2, ou b) une séquence codant une protéine homologue à CYP98A9 présentant au moins 60 % d'identité avec SEQ ID NO : 2, sous réserve que ladite protéine homologue présente une activité similaire à celle de CYP98A9, ou c) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à la séquence codant la protéine CYP98A9 ou à sa séquence complémentaire, sous réserve que ladite séquence hybridante code une protéine présentant une activité similaire à celle de CYP98A9, pour la production de plantes, ou de parties de plantes, présentant une résistance accrue à au moins un stress environnemental par rapport aux plantes, ou parties de plantes, correspondantes qui n'ont pas été produites à l'aide dudit acide nucléique.

Description

PLANTES PRESENTANT UNE RESISTANCE ACCRUE AUX STRESS
BIOTIQUES ET ABIOTIQUES
La présente invention concerne des plantes ou des parties de plantes présentant une résistance accrue aux stress environnementaux, biotiques et abiotiques, ainsi que des procédés pour obtenir de telles plantes ou parties de plantes.
Les cytochromes P450 sont des protéines membranaires impliquées dans de nombreuses réactions d'hydroxylation chez les plantes. Le séquençage complet du génome d'Arabidopsis thaliana a permis de mettre en évidence l'existence de 273 gènes codant des cytochromes P450 répartis en 45 familles et sous familles. La fonction d'un grand nombre de ces gènes reste inconnue. Parmi ces gènes, la famille CYP98, qui semble être impliquée dans le processus de lignification (Franke et al. (2002) Plant J. 30 : 47; Abdulrazzak et al. (2006) Plant Physiol. 140 : 30), est constituée de trois membres, CYP98A3, CYP98A8 et CYP98A9. CYP98A8 et CYP98A9 présentent 69% d'identité entre elles et 52% d'identité avec CYP98A3. CYP98A3 code la p-coumaroyl 3' ester-hydroxylase (Schoch et al. (2001) J. Biol. Chem. 276), cependant, la fonction de CYP98A8 et de CYP98A9 reste inconnue à ce jour.
La présente invention découle de la mise en évidence, par les Inventeurs, que l'expression du gène CYP98A9 était augmentée chez Arabidopsis thaliana lorsque celle-ci est soumise à un stress de nature biotique, comme une infection microbienne, ou abiotique, comme un stress hydrique, un stress oxydant, ou un stress thermique, et que des plantes ayant une expression accrue de ce gène présentaient une résistance accrue auxdits stress.
La présente invention concerne donc l'utilisation d'un acide nucléique comprenant ou étant constitué par : a) une séquence codant une protéine CYP98A9 représentée par SEQ ID NO : 2, ou b) une séquence codant une protéine homologue à CYP98A9 présentant au moins 60 % d'identité avec SEQ ID NO : 2, sous réserve que ladite protéine homologue présente une activité similaire à celle de CYP98A9, ou c) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à la séquence codant la protéine CYP98A9 ou à sa séquence complémentaire, sous réserve que ladite séquence hybridante code une protéine présentant une activité similaire à celle de CYP98A9, pour la production de plantes, ou de parties de plantes, présentant une résistance accrue à des stress environnementaux par rapport aux plantes, ou parties de plantes, correspondantes qui n'ont pas été produites à l'aide dudit acide nucléique.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'acide nucléique défini ci-dessus est compris dans une cassette d'expression au sein de laquelle ledit acide nucléique est lié de façon opérationnelle à au moins une séquence régulatrice, notamment promotrice, et/ou au moins une séquence terminatrice.
Dans un mode de réalisation plus particulier, la séquence promotrice de la cassette d'expression ci-dessus est un promoteur constitutif de plante.
La présente invention concerne également une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
De préférence, la cassette d'expression comprend un acide nucléique tel que défini ci-dessus lié de façon opérationnelle à au moins une séquence régulatrice, notamment promotrice, et/ou au moins une séquence terminatrice.
La présente invention concerne également un vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
En particulier, l'invention concerne un vecteur d'expression représenté par SEQ ID NO : 7.
L'invention concerne également une cellule comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus ou un vecteur d'expression tel que défini ci- dessus. La cellule peut être de toute origine. En particulier, elle peut être d'origine bactérienne ou végétale.
L'invention concerne également une plante, ou partie de plante, dont le génome comprend au moins un acide nucléique tel que défini ci-dessus, sous réserve que ledit acide nucléique soit hétérologue par rapport à ladite plante, ou partie de plante, c'est-à-dire qu'à l'état naturel ou sauvage le génome de ladite plante, ou partie de plante ne comprend pas ledit acide nucléique. Autrement dit, si la plante à l'état naturel ou sauvage, ne possède pas un acide nucléique tel que défini ci-dessus, la plante, ou partie de plante, selon l'invention, comprendra au moins un exemplaire de l'acide nucléique tel que défini ci-dessus. Par ailleurs, si la plante, ou partie de plante, à l'état naturel ou sauvage possède une ou plusieurs copies d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus (par exemple, chez Arabidopsis thaliana, il existe naturellement un acide nucléique codant pour CYP98A9), la plante ou partie de plante selon l'invention comprend au moins une copie supplémentaire dudit acide nucléique.
L'invention concerne également une plante, ou partie de plante, dont le génome comprend au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus ou un vecteur d'expression tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé de production de plantes modifiées, ou de parties de plantes modifiées, présentant une résistance accrue à des stress environnementaux par rapport aux plantes, ou parties de plantes, non modifiées correspondantes, consistant à exprimer au moins un acide nucléique tel que défini ci-dessus dans les plantes modifiées, ou parties de plantes modifiées, ou à augmenter l'expression dudit acide nucléique dans les plantes modifiées, ou parties de plantes modifiées, par rapport aux plantes, ou parties de plantes, non modifiées correspondantes.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé ci-dessus comprend une étape de régénération de plantes modifiées, ou de parties de plantes modifiées, à partir de plantes, ou de parties de plantes, telle qu'une cellule de plante, transformées par un acide nucléique tel que défini ci-dessus, une cassette d'expression telle que définie ci-dessus, ou un vecteur tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également une plante modifiée, ou partie de plante modifiée, susceptible d'être obtenue selon le procédé défini ci-dessus.
La présente invention concerne également une plante, ou une partie de plante, transformée par un acide nucléique tel que défini ci-dessus.
CYP98A9 et homologues
La protéine CYP98A9 est une protéine de 487 acides aminés représentée par SEQ ID NO : 2 isolée chez Arabidopsis thaliana, elle est notamment référencée par AAG52373 dans la base de donnée GenBank. Cette protéine peut en particulier être codée par SEQ ID NO : 1. Dans la suite, CYP98A9, écrit en italique, représente la séquence nucléotidique codante de CYP98A9.
Par « homologue » on entend toute protéine dont la séquence présente au moins 60%, de préférence au moins 70%, plus préférentiellement au moins 80%, encore plus préférentiellement au moins 90% d'identité avec SEQ ID NO : 2. Ces séquences homologues sont notamment obtenues par délation, insertion ou substitution d'au moins un acide aminé de SEQ ID NO : 2.
Le pourcentage d'identité d'une séquence par rapport à SEQ ID NO : 2 est calculé en dénombrant le nombre d'acides aminés identiques entre ladite séquence et SEQ ID NO : 2 pour l'ensemble des positions d'un alignement de séquence optimal entre ladite séquence et SEQ ID NO : 2 et en divisant ce nombre par le nombre total d'acides aminés de ladite séquence.
L'alignement de séquences peut être réalisé manuellement, éventuellement en introduisant des espaces entre les acides aminés, ou à l'aide de logiciels d'alignement de séquences bien connus de l'homme du métier, tel que le logiciel BLAST (Altschul et al. (1997) NucleicAcids Res 25 : 3389-402).
Par « conditions stringentes », on entend des conditions d'hybridation sélectives. Des conditions d'hybridation stringentes vis-à-vis d'une séquence d'acide nucléique particulière peuvent être mise au point de façon routinière par l'homme du métier. A titre d'exemple de conditions stringentes selon l'invention, on peut citer une température d'hybridation de 650C, dans un tampon 2OxSCC, et une température de lavage de 5 à 100C sous la température d'hybridation dans un tampon 2x à 0,2x SCC.
Une protéine présente « une activité similaire à celle de CYP98A9 » lorsqu'elle catalyse une même réaction enzymatique et/ou qu'elle intervient dans une même étape d'une voie métabolique que CYP98A9. Cette activité similaire peut, en particulier être évaluée dans une plante, ou partie de plante, à travers l'expression de I1ARN messager (ARNm) codant cette protéine. Ainsi, une protéine présente « une activité similaire à celle de CYP98A9 » lorsque une plante qui exprime l'ARNm messager codant cette protéine ou cette protéine en elle-même à un niveau donné présente une résistance équivalente aux stress environnementaux auxquels elle est soumise par rapport à une plante qui exprime l'ARNm de la protéine CYP98A9 ou la protéine CYP98A9 au même niveau. Les niveaux relatifs d'expression d'un ARNm dans une plante peuvent être mesurés par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) comme cela est décrit dans l'Exemple 1. Une résistance équivalente aux stress environnementaux peut être évaluée comme cela est indiqué dans les Exemples 3 à 5. En particulier, les plantes, ou parties de plantes, exprimant l'ARNm de la protéine ayant une activité similaire à celle de CYP98A9 doivent présenter un aspect phénotypique semblable aux plantes, ou parties de plantes, exprimant CYP98A9, après exposition desdites plantes aux stress dans les mêmes conditions ; lorsque les résultats de mesure de la résistance aux stress sont quantifiables numériquement, les résultats obtenus pour la plante exprimant I1ARNm de la protéine ayant une activité similaire à celle de CYP98A9 sont du même ordre de grandeur que ceux obtenus pour la plante exprimant CYP98A9, en particulier ces résultats sont compris dans une gamme d'environ ± 10 à 20% par rapport à ceux obtenus pour la plante exprimant CYP98A9. Plus particulièrement, dans le test de dénombrement de colonies bactériennes à la surface de feuilles décrit dans l'Exemple 3, les plantes exprimant la protéine ayant une activité similaire à celle de CYP98A9 ne présentent pas plus de 20%, notamment 10%, de colonies en plus que les plantes exprimant CYP98A9 en moyenne. De même, dans le test de mesure du diamètre des zones d'infection fongique à la surface d'une feuille donné dans l'Exemple 4, les plantes exprimant la protéine ayant une activité similaire à celle de CYP98A9 ne présentent pas un diamètre d'infection supérieur de plus de 20%, notamment de plus de 10%, à celui des plantes exprimant CYP98A9 en moyenne.
Alternativement, une protéine qui présente une activité similaire à CYP98A9 peut être détectée par immunodétection à l'aide d'anticorps dirigés contre CYP98A9.
On désigne par « expression d'un acide nucléique » la synthèse d'un ARN, notamment d'un ARNm et/ou d'une protéine à partir de l'information génétique portée par ledit acide nucléique.
En particulier, dans le procédé défini ci-dessus, l'acide nucléique est exprimé dans des plantes modifiées, ou parties de plantes modifiées, qui ne comprennent pas ledit acide nucléique à l'état non modifié, notamment à l'état naturel ou sauvage.
Plante ou partie de plante
Selon l'invention, le terme « plante » désigne tout végétal, en particulier tout végétal de type gymnosperme ou angiosperme monocotylédone ou dicotylédone. En particulier, parmi les dicotylédones, les plantes selon l'invention sont préférentiellement sélectionnées dans le groupe constitué des crucifères, des solanacées, des cucurbitacées, des composées, des ombellifères, des violacées, des malvacées, des rosacées et des capparales, et parmi les monocotylédones, les plantes selon l'invention sont préférentiellement sélectionnées dans le groupe constitué des graminées et les liliacées. De manière préférentielle, la plante est choisie parmi les céréales telles que le maïs, le blé ou le riz, ou parmi les oléoprotéagineux tels que le colza ou le tournesol.
Par « partie de plante » on entend tout fragment d'une plante contenant au moins une cellule de plante, par exemple un organe de plante (tel qu'une feuille, un bourgeon, une fleur, une racine, un fruit, ou une graine), un tissu de plante (tel qu'un méristème), un cal végétal ou encore une cellule de plante.
Par « production de plantes, ou de parties de plante » on désigne toute activité humaine de préparation, de modification ou de sélection d'une plante ou d'une partie de plante.
Par « plantes, ou parties de plantes, correspondantes qui n'ont pas été produites à l'aide dudit acide nucléique » on désigne des plantes, ou des parties de plantes qui sont génétiquement identiques aux plantes, ou parties de plantes, de l'invention avant la mise en œuvre de l'utilisation selon l'invention ; il s'agit donc de plantes « naturelles » ou « sauvages ».
A l'état sauvage, Arabidopsis thaliana ne contient qu'un seul locus pour le gène CYP98A9 dans son génome, (Schoch et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 : 36566- 36574 ; http://www.p450.kvl.dk/7p450. shtml), c'est-à-dire qu'elle contient deux acides nucléiques essentiellement représentés par SEQ ID NO : 1 dans son génome considéré à l'état diploïde.
L'expression « génome, considéré à l'état diploïde » signifie que pour un génome donné, qui peut être haploïde, diploïde, ou polyploïde, on considère les chromosomes homologues en paires.
De préférence, les plantes produites selon l'utilisation ou le procédé de l'invention sont telles qu'elles présentent une expression accrue de la protéine CYP98A9 par rapport aux plantes correspondantes non produites selon l'invention. Ceci a pour conséquence que les plantes produites selon l'invention présentent une résistance accrue aux divers stress environnementaux définis ci-dessus. Les Inventeurs ont montré que l'expression accrue de CYP98A9 était liée à une expression accrue de camalexine, un dérivé indolique impliqué dans la défense des plantes contre de nombreux agents stressant, notamment des agents pathogènes (Thomma et al. (1999) Plant J. 19 : 163-171. ; Denby et al. (2005) Plant J. 41 : 673- 684).
Stress environnementaux Par « stress environnementaux », ou agents stressants environnementaux, on désigne l'ensemble des facteurs extérieurs à une plante susceptibles d'affecter le métabolisme normal de cette plante et d'induire chez celle-ci une réaction d'adaptation et/ou de défense. Les stress environnementaux, peuvent provenir d'êtres vivants, il s'agit de stress biotiques, ou de facteurs autres, on parle alors de stress abiotiques. Les stress biotiques regroupent notamment l'ensemble des agents pathogènes microbiens, tels que les agents pathogènes fongiques, bactériens ou viraux, et les infections dont ils sont responsables. Les stress abiotiques regroupent l'ensemble des stress de nature physique ou chimique et notamment les stress oxydatifs ou climatiques ; il s'agit notamment des stress hydriques, comme le manque d'eau, ou les stress thermiques, comme le froid ou la chaleur. Les stress oxydatifs regroupent l'ensemble des stress aboutissant à l'augmentation de la concentration d'agents oxydant dans une plante ou une partie de plante.
Cassette d'expression et vecteur d'expression
L'expression « lié de façon opérationnelle » signifie que l'expression de l'acide nucléique est sous le contrôle d'une séquence régulatrice, notamment promotrice, et/ou d'une séquence terminatrice.
De préférence, les séquences promotrices et/ou terminatrices selon l'invention sont des séquences promotrices et/ou terminatrices de plante, notamment issues de plantes. Par « séquences promotrices et/ou terminatrices de plante » on désigne des promoteurs et/ou des terminateurs fonctionnels au sein de tissus de plante. Par « séquences promotrices issues de plantes » on désigne des promoteurs et/ou des terminateurs fonctionnels au sein de tissus de plantes et susceptibles d'être trouvés à l'état naturel au sein de plantes.
Les séquences promotrices sont bien connues de l'homme du métier. Il s'agit de séquences qui contrôlent le niveau de transcription des séquences nucléotidiques qui sont placées sous leur dépendance. Les séquences promotrices selon l'invention regroupent aussi bien les promoteurs en tant que tels que les séquences de type amplificateur (enhanceή. Les séquences promotrices selon l'invention peuvent être aussi bien inductibles par certains facteurs, que spécifiques d'un tissu, ou constitutives.
Les promoteurs inductibles ou spécifiques d'un tissu n'induisent l'expression des acides nucléiques sous leur contrôle que dans certaines conditions environnementales, ou dans certains tissus-cibles, comme par exemple, les tiges, les feuilles, les graines, les racines, ou les fleurs. A titre de promoteurs inductibles selon l'invention on peut citer les promoteurs inductibles par un stress environnemental tel que défini ci-dessus. De préférence, les promoteurs inductibles selon l'invention regroupent les promoteurs inductibles par un stress hydrique ou par un agent fongique, viral ou bactérien. Les promoteurs inductibles par un stress hydrique sont bien connus de l'homme du métier. A titre d'exemple on peut ainsi citer les promoteurs décrits par Kasuga et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:287-291. Les promoteurs inductibles par un agent fongique, viral ou bactérien, sont notamment sensibles à des molécules dérivées de ces organismes et sont également bien connus de l'homme du métier. Des exemples de promoteurs spécifiques d'un tissu incluent le promoteur du virus de la Chlorelle régulant l'expression du gène de l'adénine méthyltransférase, le promoteur du virus de la mosaïque du manioc qui s'expriment principalement dans les tissus verts, les éléments régulateurs du promoteur du gène2A11 de la tomate, qui permettent une expression spécifique dans les fruits, ou les promoteurs racinaires décrits dans les demandes WO 02/46439 et WO 03/040322. On peut également citer le promoteur High Molecular Weight Glutenin (HMGW) de blé (Blechl et Anderson (1996) Nat Biotechnol. 14:875- 879) ou encore le promoteur PEPC du gène de la phosphoénolpyruvate carboxylase de sorgho (Crétin et al. (1991) Gène 99:87-94), qui permettent respectivement une expression dans les graines et les feuilles.
L'expression « promoteur constitutif de plante » signifie que ce promoteur entraîne l'expression inconditionnelle des gènes qui sont placés sous son contrôle dans une cellule de plante. En particulier, les promoteurs constitutifs ne sont pas spécifiques d'un tissu et induisent l'expression des acides nucléiques placés sous leur contrôle indépendamment des conditions auxquelles la cellule qui les abrite est soumise. Dans les plantes Arabidopsis thaliana de type sauvage, le gène CYP98A9 n'est pas placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif de plante ; en particulier CYP98A9 s'exprime essentiellement dans le bourgeon (voir l'Exemple 1).
De nombreux promoteurs constitutifs de plantes sont connus de l'homme du métier. A titre d'exemple on peut citer le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) (Kay et al. (1987) Science 236 : 4805), ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) (WO 97/48819), le promoteur de l'ubiquitine ou le promoteur « Actine-lntron-actine », du riz (McEIroy et al. (1991) Mol. Gen. Genêt. 231 : 150 ; GenBank S44221).
Les séquences terminatrices sont également bien connues de l'homme du métier. Les séquences terminatrices entraînent l'arrêt de la transcription de séquences nucléotidiques qui se trouvent en amont et favorisent la synthèse d'ARNm messagers plus stables, notamment par adjonction d'une queue polyA. A titre d'exemple on peut citer le terminateur 3' Nos, terminateur de la nopaline synthase qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase provenant du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline.
Avantageusement, le vecteur d'expression selon l'invention est adapté à la transformation de cellules, notamment bactériennes ou de plantes. Les procédés de transformation de cellules sont bien connus de l'homme du métier. Pour les bactéries, on peut par exemple citer le procédé décrit par McCormac et al. (1998) Mol. Biotechnol. 9 : 155-159.
Avantageusement, le vecteur d'expression selon l'invention peut comprendre, un ou plusieurs gènes de sélection, tel qu'un gène de résistance à un herbicide (par exemple le glufosinate (Basta®), le glyphosate (Roundup®), l'asulam, ou le bromoxynil), comme le gène barde Streptomyces hygroscopicus (GenBank X17220) qui code une phosphinotricine acétyltransférase et confère la résistance au glufosinate (phosphinotricine) ; et/ou à un antibiotique (par exemple l'hygromycine (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-995), la kanamycine, la bléomycine ou la streptomycine). Il peut également comprendre une origine de réplication bactérienne et/ou de plante. Le vecteur d'expression selon l'invention peut notamment être sous forme plasmidique.
Procédé de production de plantes modifiées
Dans un mode de réalisation de l'invention, le procédé de production de plantes modifiées, ou de parties de plantes modifiées, présentant une résistance accrue à des stress environnementaux par rapport aux plantes, ou parties de plantes, non modifiées correspondantes, consistant à augmenter l'expression d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus dans les plantes modifiées, ou parties de plantes modifiées par rapport aux plantes, ou parties de plantes, non modifiées correspondantes, comprend a) une étape de transformation d'une plante ou d'une partie de plante, telle qu'une cellule, par un acide nucléique tel que défini ci-dessus, une cassette d'expression telle que définie ci-dessus, ou un vecteur tel que défini ci-dessus, et b) une étape de régénération de plantes modifiées, ou de parties de plantes modifiées, à partir des plantes, ou parties de plantes, obtenues à l'étape a).
Les procédés de transformation de cellules de plante sont bien connus de l'homme du métier, on peut par exemple citer le procédé décrit Clough et Bent (1998) Plant J. 16: 735-743. A titre d'autres exemples non limitatifs de méthodes utilisables dans le cas des plantes mentionnées ci-dessus, il est également possible de citer les protocoles décrits par Guis et al. (Scientia Horticulturae 84 : 91-99, 2000) pour le melon, par Hamza et Chupeau (J. Exp. Bot 44 : 1837-1845, 1993) pour la tomate, par Shoemaker et al. (Plant CeII Rep. 3 : 178-181 , 1986), ou Trolinder et Goodin (Plant CeII Rep. 6 : 231-234, 1987) pour le cotonnier, par Van der Mark et al. (J. Genêt Breeding 44 : 263-268, 1990) ou par Marchant et al. (Ann. Bot. 81 : 109- 114, 1998) pour les rosiers. Dans le cas des plantes monocotylédones, on peut citer par exemple les protocoles décrits par Hiei et al. (The Plant Journal 6 : 271-282, 1994) ou Ishida et al. (Nature biotechnology 14 : 745-750, 1996) pour le maïs, ou par Rasco-Gaunt et al. (J. Exp. Bot. 52 : 865-874, 2001) pour le blé.
Les procédés de régénération de plante à partir de cellules transformées sont bien connus de l'homme du métier. L'Exemple 2 fournit une illustration d'un tel procédé.
Description des figures
Figure 1
La Figure 1 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans les tissus de racine, de tige, de feuille, de bourgeon, de fleur et de silique chez Arabidopsis thaliana.
Figure 2
La Figure 2 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2, WT3) et de plants d'A thaliana transgéniques comprenant un vecteur d'expression exprimant CYP98A9 (A à I).
Figure 3
La Figure 3 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) 0 h (1ere colonne en partant de la gauche), 24 h (2ème colonne en partant de la gauche), 48 h (3eme colonne en partant de la gauche) et 72 h (4eme colonne en partant de la gauche) après une infection par Pseudomonas syringae avrRpmi.
Figure 4
La Figure 4 représente le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes d'A thaliana sauvages (à gauche) et surexprimant CYP98A9 (à droite) 72 heures après l'infection par P. syringae avrRpmi.
Figure 5
La Figure 5 représente le nombre de colonies bactériennes à la surface de feuilles infectées par P. syringae avrRpmi (axe des ordonnées, log cfu (unités formant colonies) / surface du disque de feuille prélevé (cm2)) immédiatement après infection (colonnes blanches, TO) ou 3 jours après l'infection (colonne hachurée, T3) pour deux plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) ou surexprimant CYP98A9 (A, E).
Figure 6A et figure 6B
Les Figures 6A-6B représentent l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) 0 h (1ere colonne en partant de la gauche), 24 h (2eme colonne en partant de la gauche), 48 h (3eme colonne en partant de la gauche), 72 h (4ème colonne en partant de la gauche) et 96 h (5eme colonne en partant de la gauche) après une infection par Xanthomonas campestris 147 (XCC 147) (Figure 6A) et Xanthomonas campestris 568 (XCC 168) (Figure 6B).
Figure 7A, Figure 7B, Figure 7C et Figure 7D
Les Figures 7A-7B représentent le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes d'A thaliana sauvages (à gauche) et surexprimant CYP98A9 (à droite) 72 heures après l'infection par X. campestris 147 (XCC147) (Figure 7A) et X. campestris 568 (XCC168) (Figure 7B).
Les Figures 7C et 7D représentent le nombre de colonies bactériennes à la surface de feuilles infectées par X. campestris 147 (XCC147) (Figure 7C) et X. campestris 568 (XCC168) (Figure 7D) (axe des ordonnées, log cfu (unités formant colonies) / surface du disque de feuille prélevé (cm2)) immédiatement après infection (colonnes blanches, TO) ou 3 jours après l'infection (colonne hachurée, T3) pour deux plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) ou surexprimant CYP98A9 (A, E).
Figure 8
La Figure 8 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) 0 h (1ere colonne en partant de la gauche), 24 h (2ème colonne en partant de la gauche), 48 h (3ème colonne en partant de la gauche) et 72 h (4eme colonne en partant de la gauche) après une infection par Botrytis cinerea.
Figure 9
La Figure 9 représente le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes d'A thaliana sauvages (à gauche) et surexprimant CYP98A9 (à droite) 72 heures après l'infection par B. cinerea.
Figure 10
La Figure 10 représente le diamètre (axe des ordonnées, en mm) de la zone d'infection de feuilles de plantes d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) et surexprimant CYP98A9 (A, E) infectées par B. cinerea.
Figure 11
La Figure 11 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) 0 h (1ère colonne en partant de la gauche), 24 h (2ème colonne en partant de la gauche), 48 h (3ème colonne en partant de la gauche), 72 h (4eme colonne en partant de la gauche) et 96 h (5eme colonne en partant de la gauche) après mise en contact avec une solution de Rosé Bengale. Figure 12
La Figure 12 représente le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes sauvages (à gauche) et exprimant un ARNi dirigé contre CYP98A9 (à droite) 72 heures après mise en contact avec une solution de Rosé Bengale.
Figure 13A, Figure 13B, Figure 13C et Figure 13D
Les Figures 13A-13D représentent la quantité de camalexine présente dans des disques foliaires (axes des ordonnées, en μg /surface de disque (cm2)) de plantes d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) et surexprimant CYP98A9 (A, E) infectées par P. syήngae avrRpmi (Figure 13A), B. cinerea (Figure 13B), ou Alternaria brassicicola (Figure 13C) ou soumises à un stress oxydatif par traitement au Rosé Bengale (Figure 13D).
Figure 14
La Figure 14 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) 0 h (1ere colonne en partant de la gauche), 48 h (2ème colonne en partant de la gauche), 72 h (3ème colonne en partant de la gauche) et 96 h (4eme colonne en partant de la gauche) après une exposition des plantes au froid.
Figure 15
La Figure 15 représente l'expression relative du gène CYP98A9 (axe des ordonnées) dans des tissus de plants d'A thaliana sauvages (WT1 , WT2) 0 h (1ère colonne en partant de la gauche), 48 h (2ème colonne en partant de la gauche), et 72 h (3ème colonne en partant de la gauche) après exposition des plantes à un stress hydrique.
Exemples
Exemple 1
Détermination de la localisation de l'expression du gène CYP98A9 chez
Arabidopsis thaliana
La localisation de l'expression du gène CYP98A9 dans différents organes d'A. thaliana CoI-O (Nottingham Stock Centre) est obtenue par PCR quantitative à partir du produit de rétrotranscription des ARN totaux extraits des feuilles, des tiges, des racines, des bourgeons, des fleurs et des siliques.
Les ARN sont préparés comme suit. Environ 2,5 μg d'ARN de chaque échantillon sont tout d'abord rétro-transcrits en ADNc. L'ARN est mélangé avec 0,5 μg d'amorces oligo(dT), les dNTPs (0,83 mM final), le tout complété à 12 μl avec de l'eau (traitée au DEPC) stérile. Le mélange est incubé à 65°C pendant 5 min, afin de détruire les structures secondaires et de permettre l'hybridation des amorces, puis maintenu dans la glace. On rajoute ensuite, le tampon « first strand buffer » (Invitrogen) du DTT (10 mM final), puis on complète à 19 μl avec de l'eau stérile, avant d'ajouter 1 μl de transcriptase reverse Superscriptll (Invitrogen) 200 u/μl. La réaction est incubée 50 min à 42°C, puis 15 min à 700C pour inactiver l'enzyme. L'ADNc ainsi obtenu est utilisé pour la PCR quantitative réalisée sur un appareil Applied Biosystems GeneAmp 5700 Séquence Détection System. Des couples d'amorces spécifiques des gènes étudiés sont conçus à partir des séquences codantes décrites dans les banques de données, et selon les critères suivants : une taille d'environ 20-30nt, un Tm d'environ 6O0C et un amplicon d'environ 50-200 nt. Les amorces utilisées sont sélectionnées par le logiciel Primer Express (Applied Biosystems). Pour chaque réaction de PCR quantitative, 5 μl d'une dilution 1/5 de l'ADNc sont mélangés avec 0,3 μM (final) d'amorces, et 13 μl de SYBR Green mix (Sigma). Le volume est complété à 25 μl par de l'eau, et le mélange est maintenu dans la glace. La PCR est initiée en démarrage à chaud (« hot start »), afin d'éviter les amplifications aspécifiques comme les dimères d'amorces, et par une étape à 95°C de 10 minutes permettant la dénaturation, suivie de 40 cycles de 15 secondes à 95°C, 1 minute à 600C. Une première étape de standardisation des échantillons par PCR quantitative sur un gène d'expression constitutive est nécessaire pour ajuster la quantité d'ADNc entre les différents échantillons. Le gène de référence utilisé est celui de l'actine II. Les ADNcs ajustés peuvent ensuite être utilisés en PCR quantitative pour déterminer l'expression des gènes d'intérêt. La quantification pour chaque échantillon est répétée trois fois. Les amorces utilisées ont les séquences suivantes : A9q1 (sens) CACCGTTTGGCTTAAACGTCTT (SEQ ID NO : 3) A9q2 (antisens) CCGAGCCATGTGCTTCAT (SEQ ID NO : 4) Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 1. Il apparaît que le gène CYP98A9 n'est exprimé de manière significative que dans les bourgeons.
Exemple 2
Préparation de plantes surexprimant le gène CYP98A9
L1ADNc de CYP98A9 (SEQ ID NO : 1) est amplifié à l'aide de I1ADN polymérase HIFI (Boehringer) à partir des amorces suivantes : Attb7 (sens) :
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGATTTATTACTCATATCCTTAAC CACTATCATAATCGCCGCC (SEQ ID NO : 5), et Attbδ (antisens) :
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAAGGTATAACTCTTGTGGCAGC CTGGACGAAGCTAGAGCCTGC (SEQ ID NO : 6).
L'ADNc de CYP98A9 est ensuite introduit dans un vecteur d'entrée GATEWAY pDNOR201 (Invitrogen). Après sélection d'un clone dépourvu d'erreur d'amplification par séquençage, l'ADNc est transféré dans le vecteur de surexpression GATEWAY pB7WG2 (Karimi et al. (2002) Plant Sci. 7 : 193-195) en aval du promoteur constitutif CaMV 35S pour donner le vecteur d'expression GATEWAY pB7WG2 CYP98A9 (SEQ ID NO : 7) qui contient un gène de résistance à l'herbicide Basta® (AgroEvo) et un gène de résistance à la spectinomycine.
Le vecteur obtenu a ensuite été utilisé pour transformer A. thaliana CoI-O via Agrobacterium tumefaciens et par la technique dite du « floral dip ». Brièvement, une culture d'une nuit à 28°C est réalisée dans du milieu YEB (Van Larebeke et al. (1977) Nature 265 : 561-563) contenant l'antibiotique approprié à partir d'une préculture d'agrobactéries transformées à l'aide du vecteur GATEWAY pB7WG2 CYP98A9 (SEQ ID NO : 7) (Clough & Bent (1998) Plant J. 16: 735-743). Après centrifugation de cette culture, le culot est repris délicatement dans une solution de saccharose 5% de façon à obtenir une DOβfJO d'environ 0,8. Avant le traitement, 0,025% de Silwet L-77 (surfactant) est ajouté à la suspension d'agrobactéries. Les inflorescences des plantes à transformer (TO) sont ensuite immergées pendant 1 min dans la solution contenant les agrobactéries et les plantes sont ensuite placées sous mini-serres pendant 2 jours afin de maintenir une forte humidité. Lorsque les plantes arrivent à maturité, l'arrosage est arrêté pour qu'elles se dessèchent progressivement jusqu'à la récolte des graines (Clough & Bent (1998) Plant J. 16: 735-743). Les graines sont alors récoltées et semées dans des barquettes (25x50 cm), à une densité de 1500 plantes par barquette. Les plantes obtenues (T1) sont aspergées avec 250 mg/L de Basta (AgroEvo) 5 jours, 2 semaines, 3 semaines après germination. Les plantes transgéniques résistantes à l'herbicide sont transférées dans des pots individuels. Pour une sélection in vitro, les graines des plantes T1 sont récoltées et semées sur le milieu MS supplémenté avec 0,8% de Pastagar, 1% de saccharose, 10 μg/ml de phosphinotricine, et 500 μg/ml de carbénicilline.
L'expression du gène CYP98A9 dans les plants transgéniques sélectionnés a été mesurée par PCR quantitative comme dans l'Exemple 1. Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 2. Ils montrent que la surexpression conduit à une augmentation relative des quantités de transcrits détectés chez les transformants qui varie entre 3 et 7 fois l'expression détectée chez le sauvage. L'expression la plus élevée est détectée dans les lignées A et E qui ont été utilisées par la suite.
Exemple 3
Résistance des plantes surexprimant le gène CYP98A9 aux infections bactériennes
Des feuilles d'A. thaliana CoI-O sauvages ou surexprimant le gène CYP98A9 (voir Exemple 2) âgées de 6 semaines ont été infiltrées dans l'espace intercellulaire (de chaque coté de nervure centrale) par une solution de Pseudomonas syringae avrRpmi ou Pseudomonas syringae vira 10? cfu (unités formant colonie)/ml. Les ARN totaux ont été extraits à partir des feuilles infectées Oh, 24h, 48h, 72h et 96h après l'infiltration puis rétrotranscrits (voir Exemple 1). L'expression relative de CYP98A9 a ensuite été quantifiée par PCR quantitative (voir Exemple 1). Les résultats obtenus pour deux plantes sauvages distinctes infectées par P. syringae avrRpmisont présentés dans la Figure 3. La valeur représente la moyenne de trois expériences répliquées (8 plants/replicats ; 3 feuilles/plantes). On observe que l'expression de CYP98A9 augmente en réponse à l'infection. Des résultats similaires ont été obtenus avec P. syringae vir. La Figure 4 présente le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes sauvages et surexprimant CYP98A9 72 heures après l'infection par P. syringae avrRpmi. Les plantes surexprimant CYP98A9 sont visiblement protégées de l'infection par rapport aux plantes sauvages. Des résultats similaires ont été obtenus avec P. syringae vir.
En outre, un comptage bactérien a été effectué sur les feuilles infectées, immédiatement (TO) et 3 jours (T3) après l'inoculation. Les résultats sont présentés dans la Figure 5. La valeur représente la moyenne de trois expériences répliquées (8 plants/replicats ; 3 feuilles/plantes) ± l'erreur standard sur la moyenne de trois réplicats. On compte significativement moins de colonies bactériennes pour les plantes surexprimant CYP98A9 que pour les plantes sauvages.
Des expériences similaires d'infection ont été réalisées avec des solutions à 10*7 cfu/ml de Xanthomonas campestris 147 (XCC147) et Xanthomonas campestris 568 (XCC 168).
Les résultats présentés dans les Figures 6A et 6B indiquent que l'expression de CYP98A9 augmente en réponse à l'infection. Par ailleurs, on observe également dans les Figures 7A-7D que les plantes surexprimant CYP98A9 sont visiblement protégées de l'infection par rapport aux plantes sauvages.
Exemple 4
Résistance des plantes surexprimant le gène CYP98A9 aux infections fongiques
Une goutte de 5 μl de spores de Botrytis cinerea ou d'Alternaria brassicicola à 5
1fj6 spores/ml a été déposée sur des feuilles d'A. thaliana CoI-O sauvages ou surexprimant CYP98A9 (voir Exemple 2) âgées de 6 semaines. Les ARN totaux ont été extraits à partir des feuilles infectées Oh, 24h, 48h, 72h et 96h après l'infiltration et rétrotranscrits (voir Exemple 1). L'expression relative de CYP98A9 a ensuite été quantifiée par PCR quantitative (voir Exemple 1). Les résultats obtenus pour deux plantes sauvages distinctes infectées par β. cinerea sont présentés dans la Figure 8. La valeur représente la moyenne de trois expériences répliquées (8 plants/réplicats ; 3 feuilles/plantes) ± l'erreur standard sur la moyenne des trois réplicats. Des résultats similaires ont été obtenus avec A brassicicola.
La Figure 9 présente le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes sauvages et surexprimant CYP98A9 72 heures après la mise en présence des feuilles et de B. cinerea. Les plantes surexprimant CYP98A9 sont visiblement protégées de l'infection par rapport aux plantes sauvages. En outre, le diamètre de l'infection est significativement inférieur pour les plantes surexprimant CYP98A9 par rapport aux plantes sauvages (Figure 10).
Exemple 5
Résistance au stress oxydatif liée au gène CYP98A9
Des feuilles d'A. thaliana CoI-O sauvages ou exprimant un ARNi CYP98A9 âgées de
6 semaines ont été traitées au Rosé Bengale (2OmM), un colorant oxydant, par dépôt de 5 μl de la solution de Rosé Bengale.
Les plantes exprimant l'ARNi CYP98A9 ont été préparées comme suit. Un fragment de séquence spécifique de 105 paires de bases de l'ADNc de CYP98A9 (SEQ ID
NO : 8) amplifié à l'aide de l'ADN polymérase HIFI (Boehringer), a été introduit dans un vecteur d'entrée GATEWAY pDNOR201 (Invitrogen) à partir des amorces AttbiO et AttbH .
Attb11 (sens) :
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTTCGTCATGGTTCACTAGC (SEQ
ID NO : 9)
AttbiO (antisens)
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGG TGATCTCTTCCTCCATATA (SEQ ID
NO : 10)
Après sélection d'un clone dépourvu d'erreur d'amplification par séquençage, le fragment a été transféré en orientation inversée répétée dans le vecteur d'ARN interférence GATEWAY pB7WIWG2(ll) (Karimi et al., 2002) pour donner le vecteur d'ARN interférence GATEWAY pB7WIWG2(ll) CYP98A9 (SEQ ID NO :11). Ce vecteur a été introduit dans A. thaliana CoI-O et les transformants ont été sélectionnés comme décrit précédemment.
Les ARN totaux ont été extraits à partir des feuilles infectées Oh, 24h, 48h, 72h et
96h après le traitement puis rétrotranscrits (voir Exemple 1). L'expression relative de CYP98A9 a ensuite été quantifiée par PCR quantitative. Les résultats obtenus pour deux plantes sauvages distinctes sont présentés dans la Figure 11. La valeur représente la moyenne des trois expériences répliquées (8 plants/replicats ; 3 feuilles/plantes). On observe que le Rosé Bengale induit une augmentation de l'expression de CYP98A9.
La Figure 12 présente le phénotype de feuilles représentatives issues de plantes sauvages et exprimant l'ARNi CYP98A9 72 heures après la mise en présence des feuilles et du Rosé Bengale. Les plantes sauvages résistent visiblement mieux au stress oxydant induit par le Rosé Bengale que les plantes n'exprimant pas le gène CYP98A9 (Le. les plantes exprimant l'ARNi CYP98A9).
Exemple 6
Induction de la synthèse de camalexine
Des plantes sauvages ou surexprimant CYP98A9 ont été infectées par P. syringae avrRpmi, B. cinerea ou A. brassicicola (voir Exemples 3 et 4) ou soumises à un stress oxydatif par traitement au Rosé Bengale (voir Exemple 5). Un dosage de la camalexine, un dérivé indolique impliqué dans la défense contre les pathogènes, a été réalisé par fluorimétrie 48h après l'infection. Brièvement, les disques foliaires sont prélevés sur les plantes infectées (3 réplicats, 6 plantes/réplicat, 6 disques/plante) et chauffés à 80-900C pendant 20 min dans 1 ml de méthanol 80%. Le solvant est évaporé et le résidu repris dans le chloroforme (v/v), puis le chloroforme est évaporé à son tour. Le résidu est repris dans 60 μl de chloroforme et puis les échantillons sont déposés sur un gel de silice (DC Platten Kieselgel 60 F254, Merck) La migration des échantillons s'effectue dans un solvant hexane : acétate d'éthyle (1 : 9) pendant 1h30 à 2h. La bande correspondant à la camalexine (bleue) est visualisée sous UV à 366 nm (rf entre 0,78-0,81). La bande bleue est grattée et éluée dans 3 ml de méthanol 100%. Le mélange est bien vortexé et filtré. La fluorescence de la camalexine est mesurée par la fluorimétrie et sa concentration déterminée par rapport à une courbe de standard obtenue avec la camalexine de référence.
Les résultats obtenus sont présentés dans les Figures 13A-13D. La valeur représente la moyenne des trois expériences répliquées (8 plants/replicats ; 3 feuilles/plantes) ± l'erreur standard sur la moyenne de trois réplicats. En réponse au divers stress auxquels elles ont été soumises, les plantes surexprimant CYP98A9 présentent une production significativement plus élevée de camalexine que les plantes sauvages.
Exemple 7
Induction de la synthèse de CYP98A9 par le froid
Des plantes A thaliana CoI-O sauvages ont été soumises à un traitement par le froid (plantes de 6 semaines placées en chambre de croissance à 4°C).
Les ARN totaux ont été extraits à partir des feuilles Oh, 48h, 72h et 96h après l'installation des plantes en chambre de croissance à 40C. L'expression relative de CYP98A9 a ensuite été quantifiée par PCR quantitative. Les résultats obtenus pour deux plantes sauvages distinctes sont présentés dans la Figure 14. La valeur représente la moyenne des trois expériences répliquées (8 plantes/ réplicat ; 3 feuilles/ plante). On observe que le traitement par le froid provoque une augmentation de l'expression de CYP98A9.
Par ailleurs, des plants d'A. thaliana CoI-O sauvages ou surexprimant le gène CYP98A9 (voir Exemple 2) sont soumis au stress thermique ci-dessus. On observe que les plants surexprimant le gène CYP98A9 résistent mieux au stress que les plants sauvages.
Exemple 8
Induction de la synthèse de CYP98A9 par le stress hydrique
Des plantes A. thaliana CoI-O sauvages ont été soumises à un stress hydrique (arrêt de l'arrosage).
Les ARN totaux ont été extraits à partir des feuilles Oh, 48h et 72h après l'arrêt de l'arrosage. L'expression relative de CYP98A9 a ensuite été quantifiée par PCR quantitative. Les résultats obtenus pour deux plantes sauvages distinctes sont présentés dans la Figure 15. La valeur représente la moyenne des trois expériences répliquées (8 plantes/ réplicat ; 3 feuilles/ plante). On observe que le stress hydrique provoque une augmentation de l'expression de CYP98A9.
Par ailleurs, des plants d'A. thaliana CoI-O sauvages ou surexprimant le gène CYP98A9 (voir Exemple 2) sont soumis au stress hydrique ci-dessus. On observe que les plants surexprimant le gène CYP98A9 résistent mieux au stress que les plants sauvages.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un acide nucléique comprenant : a) une séquence codant une protéine CYP98A9 représentée par SEQ ID NO : 2, ou b) une séquence codant une protéine homologue à CYP98A9 présentant au moins 60 % d'identité avec SEQ ID NO : 2, sous réserve que ladite protéine homologue présente une activité similaire à celle de CYP98A9, ou c) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à la séquence codant la protéine CYP98A9 ou à sa séquence complémentaire, sous réserve que ladite séquence hybridante code une protéine présentant une activité similaire à celle de CYP98A9, pour la production de plantes, ou de parties de plantes, présentant une résistance accrue à au moins un stress environnemental par rapport aux plantes, ou parties de plantes, correspondantes qui n'ont pas été produites à l'aide dudit acide nucléique.
2. Utilisation selon la revendication 1 , dans laquelle la séquence codant la protéine CYP98A9 est représentée par SEQ ID NO : 1.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle l'acide nucléique est compris dans une cassette d'expression au sein de laquelle ledit acide nucléique est lié de façon opérationnelle à au moins une séquence promotrice et/ou au moins une séquence terminatrice.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle le stress environnemental est un stress abiotique.
5. Utilisation selon la revendication 4, dans laquelle le stress abiotique est un stress oxydatif, thermique ou hydrique.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle le stress environnemental est un stress biotique.
7. Utilisation selon la revendication 6, dans laquelle le stress biotique est une infection fongique ou bactérienne.
8. Utilisation selon l'une des revendications 3 à 7, dans laquelle la séquence promotrice de la cassette d'expression est un promoteur constitutif de plante.
9. Utilisation selon l'une des revendications 3 à 5, dans laquelle la séquence promotrice de la cassette d'expression est un promoteur inductible par un stress hydrique.
10. Utilisation selon l'une des revendications 3, 6 et 7, dans laquelle la séquence promotrice de la cassette d'expression est un promoteur inductible par un stress biotique choisi parmi le groupe constitué d'une infection fongique et d'une infection bactérienne.
11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle les plantes sont sélectionnées dans le groupe constitué des crucifères, des solanacées, des cucurbitacées, des composées, des ombellifères, des violacées, des malvacées, des rosacées, des graminées et des capparales.
12. Cassette d'expression comprenant un acide nucléique tel que défini dans la revendication 1 ou 2 lié de façon opérationnelle à au moins une séquence promotrice de plante et/ou au moins une séquence terminatrice de plante.
13. Vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression selon la revendication 12.
14. Cellule comprenant une cassette d'expression selon la revendication 10 ou un vecteur d'expression selon la revendication 13.
15. Plante, ou partie de plante, dont le génome comprend au moins un acide nucléique tel que défini dans la revendication 1 ou 2, sous réserve que ledit acide nucléique soit hétérologue par rapport à ladite plante, ou partie de plante.
16. Partie de plante selon la revendication 15, dans laquelle la partie de plante est une cellule de plante.
17. Procédé de production de plantes modifiées, ou de parties de plantes modifiées, présentant une résistance accrue à des stress environnementaux par rapport aux plantes, ou parties de plantes, non modifiées correspondantes, consistant à exprimer au moins un acide nucléique tel que défini dans la revendication 1 ou 2 dans les plantes modifiées, ou parties de plantes modifiées, ou à augmenter l'expression dudit acide nucléique dans les plantes modifiées, ou parties de plantes modifiées, par rapport aux plantes, ou parties de plantes, non modifiées correspondantes.
18. Procédé de production de plantes modifiées, ou de parties de plantes modifiées, selon la revendication 17, comprenant une étape de régénération de plantes modifiées, ou de parties de plantes modifiées, à partir de plantes, ou de parties de plantes, transformées par un acide nucléique tel que défini dans la revendication 1 ou 2, une cassette d'expression selon la revendication 12, ou un vecteur selon la revendication 13.
19. Plante modifiée, ou partie de plante modifiée, susceptible d'être obtenue selon le procédé de la revendication 17 ou 18.
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