WO2007072977A1 - アレルギー性疾患用医薬組成物 - Google Patents

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WO2007072977A1
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WO
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synoviolin
pharmaceutical composition
production
disease
expression
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PCT/JP2006/325699
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French (fr)
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Toshihiro Nakajima
Tetsuya Amano
Yuriko Furuya
Naoko Yagishita
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Locomogene, Inc.
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    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02019—Ubiquitin-protein ligase (6.3.2.19), i.e. ubiquitin-conjugating enzyme

Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing or inhibiting IL-4 and / or IgE production by regulating the expression and activity of synoviolin.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a substance that regulates IL-4 and / or IgE production by regulating the expression and activity of synoviolin.
  • Synoviolin is a novel protein discovered as a membrane protein that is overexpressed in synovial cells derived from rheumatic patients (WO 02/052007). Studies using genetically modified animals revealed that Synoviolin is an essential molecule for the development of rheumatoid arthritis.
  • Synoviolin has a RING finger motif. This motif is often found in the enzyme E3 ubiquitin ligase, which plays an important role in protein ubiquitination, but in fact, sioviolin is one of the characteristics of E3 ubiquitin ligase. (WO 02/052007). However, the involvement of Synoviolin and the immune system is not clear. .
  • allergic diseases such as bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopic dermatitis, anaphylaxis shock, hay fever and food allergies have been increasing worldwide in recent years and have become major problems.
  • Conventional anti-allergic agents are inhibitors of the release of chemical mediators from mast cells, receptor inhibitors of released chemical mediators, or inhibitors of allergic inflammatory reactions, all of which are symptomatic. It ’s a therapy, and it ’s not a cure for the fundamental allergic disease.
  • Allergic reactions are caused by type I allergic reactions, A distinction is made between type II allergic reactions, type III allergic reactions and type IV allergic reactions.
  • IgE In type I allergic reaction, IgE is generated by an antigen entering the living body, and this reacts with the antigen by the IgE antibody adhering to the cell membrane of tissue mast cells or basophil cells in the blood. Releases histamine, serotonin, and various other chemical mediators.
  • the chemical messenger causes various tissue reactions such as smooth muscle contraction and increased vascular permeability.
  • IgE antibody production inhibitors that are deeply involved in the development of allergic diseases are considered as therapeutic agents for fundamental allergic diseases.
  • One compound that has an inhibitory effect on IgE production is suplatast tosylate (IPD-1151-T). This has been reported to act on type 2 T cells (Th2 cells) and to suppress the differentiation of B cells into IgE antibody-producing cells by inhibiting IL-4 production (Yanagihara Y et al., Jpn. Pharmacol., (1993) 61: p.31-39).
  • Examples of the compound that directly acts on B cells and suppresses IgE antibody production include DSCG (interl), which is a mast cell degranulation inhibitor, or Negchromylsodium.
  • the present invention regulates IL-4 and IL by regulating the expression and function of synoviolin. It is an object to provide a pharmaceutical composition that regulates IgE production.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems. As a result of detailed analysis of synoviolin hetero knockout ( syn +/-) mice, it was found that IL-4 and IgE production was suppressed compared to the wild type, and the present invention was completed. That is, the present invention is as follows.
  • composition comprising a substance that regulates the production of IL-4 and / or IgE.
  • Substances that regulate the production of IL-4 and / or IgE include those that inhibit or promote the expression and / or function of Synoviolin. Specifically, it is selected from the group consisting of synoviolin or a low molecular weight compound for a gene encoding synoviolin, a peptide, an antibody, a decoy nucleic acid, an antisense nucleic acid, siRNA, and shRNA, with the expression and / or function of synoviolin as an inhibitor. At least one can be illustrated.
  • examples of the substance that promotes the expression and / or function of Synoviolin include at least one selected from the group consisting of Synoviolin promoter activity promoter, Synoviolin polypeptide, and Synoviolin polynucleotide.
  • the gene encoding Synoviolin includes, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • siRNA includes those targeting a partial sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Examples of the pharmaceutical composition of the present invention include a pharmaceutical composition for preventing and / or treating allergic diseases, infectious diseases, autoimmune diseases or leukemia.
  • the allergic disease is, for example, at least one selected from the group consisting of bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopic dermatitis, anaphylactic shock, malignant allergic disease, pollinosis and food allergic disease. Can be illustrated.
  • infectious diseases include infectious diseases derived from parasites, such as Babesia, Cryptosporidiosis, Giardiasis, Helminthiasis, Malaria, Helminthiasis, Schistosomiasis, Tapeworm infection, Toxocariasis, Toxoplasmosis, Trichinosis, Trichuriasis, Scabies, Anisakis And at least one selected from the group consisting of infectious diseases, echinococcosis, foodborne parasitic helminthiasis, lice disease, larva migrans, and sarcoidosis.
  • infectious diseases derived from parasites such as Babesia, Cryptosporidiosis, Giardiasis, Helminthiasis, Malaria, Helminthiasis, Schistosomiasis, Tapeworm infection, Toxocariasis, Toxoplasmosis, Trichinosis, Trichuriasis, Scabies, Anisakis And at least one selected from the
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, Siedalen syndrome, systemic sclerosis, polymyositis, 'Guillain-Barre syndrome, idiopathic ik platelet-reducing purpura, autoimmune hemolytic anemia, bullous genus Group consisting of pemphigus, Graves 'disease (Graves' disease), Hashimoto's thyroiditis, type 1 diabetes, systemic lupus erythematosus, myasthenia gravis, pemphigus, pernicious anemia, collagen disease, hypo-Igemia and agammaglobulinemia At least one selected from can be exemplified.
  • leukemia at least one selected from the group consisting of myelogenesis, multiple myeloma, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia and chronic myelogenous leukemia is exemplified. be able to.
  • a therapeutic agent for allergic diseases, infectious diseases, autoimmune diseases or leukemia comprising the pharmaceutical composition of (1) above as an active ingredient.
  • An allergic disease or infection characterized by administering the pharmaceutical composition of (1) or the therapeutic agent of (2) to a patient with allergic disease, infection, autoimmune disease or leukemia
  • a method for treating autoimmune disease or leukemia A method for treating autoimmune disease or leukemia.
  • Figure 1 shows the expression analysis of Synoviolin in each immune system cell of wild type mice. It is a figure. '
  • FIG. 2 shows antigen-specific antibody production during allergy induction in syno +/ ⁇ mice (DBA / 1J).
  • Fig. 3 shows antibody production (total) during synergy in syno +/- mice (DBA / 1J).
  • FIG. 4 shows antigen-specific antibody production during allergy induction in syno +/ ⁇ mice (C57BL / 6).
  • FIG. 5 shows antibody production (total) during allergy induction in syno +/ ⁇ mice (C57BL / 6).
  • FIG. 6 is a diagram showing site force-in production during allergy induction in syno +/ ⁇ mice (DBA / 1J).
  • FIG. 7 shows IL-4R expression in syno +/ ⁇ mouse spleen cells.
  • FIG. 8 shows the expression of ICOS in syno +/ ⁇ mouse spleen cells.
  • FIG. 9 is a graph showing the proliferative response of syno +/ ⁇ mouse spleen cells to IL-4 stimulation.
  • the present invention is characterized by treating a disease using a pharmaceutical composition comprising a substance that regulates the expression and / or function of Synoviolin.
  • Synoviolin It is characterized in that allergic diseases are treated by inhibiting the expression and Z or function of IL-4 and suppressing the production of IL-4 and NO or IgE.
  • the present invention treats infection, autoimmune disease or leukemia by promoting the expression and / or function of Synoviolin to promote the production of IL-4 and / or IgE.
  • Synoviolin hetero knockout animals were prepared and analyzed in detail.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a substance that regulates IL-4 production and / or IgE production.
  • regulation means that IL-4 production, IgE production or synoviolin expression is promoted or inhibited, and when promoted, it is also referred to as positive regulation, and when it is inhibited, it is also referred to as unregulated regulation.
  • One skilled in the art can adjust to promote or inhibit IL-4 production, IgE production or synoviolin expression depending on the disease to be treated. '
  • a method for inhibiting or promoting the expression and / or function of synoviolin is employed.
  • RNA interference RNA interference
  • Synoviolin or a low molecular weight compound for a gene encoding synoviolin, a peptide, an antibody, a decoy nucleic acid and an antisense nucleic acid may be used as a substance that inhibits the expression and / or function of synoviolin. it can.
  • RNAi is a phenomenon in which dsRNA (double-strand RNA) binds specifically and selectively to a target gene, and efficiently cleaves the target gene by cleaving the target gene. For example, when dsRNA is introduced into a cell, the expression of a gene with a sequence homologous to that RNA is suppressed (knocked down).
  • dsRNA double-strand RNA
  • siRNA can be designed as follows.
  • any given region can be a candidate.
  • any region in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be used as a candidate.
  • any region in the CDV region of synoviolin (403th to 2256th) It is preferable to use these areas as candidates.
  • a sequence starting with AA is selected from the selected region, and the length of the sequence is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases. For example, select a sequence whose GC content is 40-60%.
  • a DNA comprising at least one sequence selected from the following base sequences (i) to (xiv) among the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be used as a target sequence of siRNA. it can. In particular, it is preferable to target DNA comprising the base sequence (i), (ii), (vi), (vii) or (viii).
  • the base sequences (i) to (xiv) are all base sequences in the CDS region of Synoviolin.
  • shRNA is an RNA molecule called short hairpin (RNA), which has a stem-loop structure so that a part of a single strand forms a complementary strand with another region.
  • RNA short hairpin
  • sequence A is a sequence of a partial region of the target Synoviolin gene (SEQ ID NO: 1), and the target region is not particularly limited, and any region can be a candidate.
  • the length of sequence A is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases.
  • Low molecular weight compound means a compound that inhibits the expression and function of Synoviolin, and examples thereof include Synoviolin enzyme activity inhibitors and Synoviolin promoter activity inhibitors. By synthesizing such low molecular weight compounds, Alternatively, it can be obtained by purchasing from a reagent company.
  • “Peptide” is a peptide having an amino acid fermentation sequence similar to the amino acid sequence of synoviolin (SEQ ID NO: 2), and inhibits the function of synoviolin by competitively binding to the synoviolin receptor. Means peptide. Such peptides can be synthesized by ordinary peptide synthesis methods. Examples of peptide synthesis methods include an azide method, an acid chloride method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method, a DCC method, an active ester method, a carboimidazole method, and a redox method. . In addition, the solid phase synthesis method or the liquid phase synthesis method can be applied to the synthesis. A commercially available peptide synthesizer may be used.
  • Antibody means an antibody that inhibits the function of Synoviolin by binding to Synoviolin, whether it is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Antibodies also include Fab fragments, F (ab ′) 2 and Fv fragments.
  • mice In order to produce polyclonal antibodies, animals (eg, rats, mice, and rabbits) were immunized using Synoviolin or a partial fragment thereof as an antigen, and the antibody titer was measured after the final immunization. Blood can be collected on a daily basis to obtain antiserum.
  • the dose of antigen per animal is 1 to 10 mg, and is adjusted as appropriate depending on the presence or absence of an adjuvant.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA) and Freund's incomplete adjuvant (FIA).
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • known methods such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, and affinity chromatography should be appropriately selected or combined. Can be purified.
  • a monoclonal antibody it can be produced by the well-known hybridoma method.
  • antibody-producing cells spleen cells, lymph node cells, etc.
  • myeloma cells eg, P3X63-Ag.8.Ul and NS-I
  • a hybrid that produces the desired monoclonal antibody after cell fusion —You can screen your ma.
  • Cloning of the fused cells is carried out by limiting dilution, etc., and finally, a hybridoma that is a monoclonal antibody-producing cell is established.
  • a normal cell culture method or ascites formation method can be employed.
  • Decoy nucleic acid binds to a transcription factor that binds to the synoviolin promoter and directly binds to the decoy nucleic acid (decoy oligonucleotide) that can suppress the mechanism of synoviolin, or the synoviolin gene, thereby suppressing the function of synoviolin. It is a decoy nucleic acid that can be made.
  • decoy nucleic acids examples include, for example, a nucleic acid that can bind to a transcription factor that binds to the EBS (Ets binding site) of the Synoviolin promoter, and a transcription factor that binds to the promoter (ABS). Nucleic acids that can bind to transcription factors that bind to the SBS (Spl binding site) of the promoter, oligonucleotides containing these complements, variants of these, and nucleic acids containing these in the molecule. Can be mentioned.
  • the decoy nucleic acid can be designed as a single strand or a double strand including its complementary strand based on the sequence of EBS, ABS or SBS.
  • the length is not particularly limited, and is 15 to 60 bases, preferably 20 to 30 bases.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or may include modified nucleic acids and Z or pseudo-nucleic acids within the nucleic acid.
  • these nucleic acids, variants thereof, or nucleic acids containing these in the molecule may be single-stranded or double-stranded, and may be circular or linear.
  • the decoy nucleic acid used in the present invention can be produced using a chemical synthesis method or a biochemical synthesis method known in the art. For example, a nucleic acid synthesis method using a DNA synthesizer generally used as a gene recombination technique can be used.
  • a PCR method or a gene amplification method using a cloning vector can also be used.
  • the nucleic acid obtained by these methods may be cleaved using a restriction enzyme or the like, and bound using DNA ligase to produce the desired nucleic acid.
  • chemical modification such as alkylation or acylation can be added to the base or the like. Creation of decoy nucleic acid variants
  • the method can also be synthesized by methods known in the art, such as site-directed mutagenesis.
  • Site-directed mutagenesis methods are well known in the art, including commercially available kits such as GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), and TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K Mutan'Super Express Km etc. (manufactured by Takara Bio Inc.)) etc. can be used.
  • Antisense nucleic acid means a nucleic acid having a sequence complementary to a Synoviolin gene and capable of inhibiting the Synoviolin gene expression by hybridizing to the gene.
  • Antisense nucleic acids can be prepared by synthetic chemical methods such as a nucleic acid compound complementary to a partial base sequence of a gene encoding synoviolin. In order to evaluate whether the nucleic acid compound efficiently inhibits synoviolin production, a screening test using the gene expression level as an index may be performed. As the antisense nucleic acid compound, for example, synoviolin expression can be suppressed to at least 50% or less as compared with the control.
  • synoviolin expression is not particularly limited.
  • transcription factors and endoplasmic reticulum stress inducers can be used.
  • transcription factor used to promote the expression of synoviolin is a transcription promoter that regulates the transcriptional regulatory region of the synoviolin promoter gene.
  • GABP ⁇ / / 3 GA binding protein ⁇ ⁇ ⁇
  • IRE 1 and ATF6 activating transcription factor 6
  • An ER stress inducer used to promote synoviolin expression is a substance that promotes transcription by activating ERE (ER stress response elements) of the synoviolin promoter gene.
  • ERE ER stress response elements
  • tunicamycin and thapsigargin M. Kaneko et al., FEBS Letters, (2002) 532: p.147 152).
  • the shRNA, siRNA, low molecular weight compound, peptide, antibody, decoy nucleic acid and antisense nucleic acid prepared in the present invention are substances that suppress the expression of Synoviolin and are drugs that suppress the production of IL-4 and / or IgE. It can be used as a composition (in particular, a gene therapy for allergic diseases). Therefore, the present invention provides a therapeutic agent for allergic diseases comprising a pharmaceutical composition that suppresses the production of IL-4 and / or IgE as an active ingredient, and the medicament for producing a drug for treating allergic diseases. Including the use of the composition.
  • the transcription factor and endoplasmic reticulum stress-inducing agent produced in the present invention is a substance that promotes the expression of synoviolin and promotes the production of IL-4 and / or IgE.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for infectious diseases, autoimmune diseases or leukemias comprising a pharmaceutical composition that promotes the production of IL-4 and / or IgE, and infectious diseases, autoimmune diseases or leukemias.
  • Use of the pharmaceutical composition for the manufacture of a medicament for the treatment.
  • the application site is not particularly limited, and tracheal asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, It can be applied to atopic dermatitis, anaphylactic shock, tick allergic disease, hay fever and food allergic disease.
  • the above diseases may be complicated with other diseases.
  • the application site is not limited.
  • infectious diseases include amebiasis, roundworm, babesiosis, cryptosporidiosis, giardiasis, helminthiasis, malaria, helminthiasis, schistosomiasis, Article Insect infection, toxocariasis, toxoplasmosis, trichinosis, Examples include trichuriasis, scabies, anisakiasis, echinococcosis, food-borne parasitic helminthiasis, lice disease, larva migrans, and sarcoidosis.To treat infections, drugs that suppress the expression of Synoviolin Used as a composition.
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, Siedalen syndrome, systemic sclerosis, polymyositis, Guillain-Barre syndrome, idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune hemolytic anemia, bullous pemphigoid, Graves Disease (Graves 'disease), Hashimoto's thyroiditis, type 1 diabetes,' systemic lupus erythematosus (SLE), myasthenia gravis, pemphigus, pernicious anemia, collagen disease, hypo-IgEemia and agammaglobulinemia A substance that suppresses the expression of Synoviolin is used as a pharmaceutical composition.
  • leukemia examples include myelogenesis, multiple myeloma, acute lymphocytic leukemia, acute osteoarterial leukemia, chronic lymphocytic leukemia, and chronic myelogenous leukemia, and 'substances that promote the expression of Synoviolin Used as a pharmaceutical composition.
  • the above diseases may be complicated with other diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be systemically or locally administered orally or parenterally.
  • the medicament of the present invention may be any of tablets, capsules, granules, powders, pills, troches, water for internal use, suspensions, emulsions, syrups, etc. It may be a dry product that is redissolved when used.
  • formulation forms such as intravenous injection (including infusion), intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and suppository can be selected. In the case of a preparation, it is provided in a unit dose ampoule or a multi-dose container.
  • compositions include excipients, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, prevention agents that are commonly used in the formulation.
  • Preservatives, flavoring agents, soothing agents, stabilizers, tonicity agents and the like can be selected as appropriate, and can be produced by conventional methods.
  • the above-mentioned various preparations may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive together.
  • carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, sodium alginate, water-soluble dextran, carboxymethyl starch sodium, pectin, xanthan gum, gum arabic, strength
  • examples include zein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, and lactose.
  • the additive to be used is appropriately or in combination selected from the above depending on the dosage form of the present invention.
  • the dosage of the therapeutic agent of the present invention varies depending on the age of administration subject, administration route, and frequency of administration, and can be varied over a wide range.
  • the effective amount administered as a combination of an effective amount of the peptide of the present invention and an appropriate diluent and a pharmacologically usable carrier is 0.1 / ig to: 100 mg / body, preferably 1 to :
  • the dose can be selected within the range of 10 ⁇ g body.
  • a method of administering a vector incorporating a nucleic acid in addition to a method of directly administering the pharmaceutical composition of the present invention by injection can be mentioned.
  • the vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia vinores vectors, retrovirus vectors, and lentivirus vectors. Efficient administration by using these virus vectors be able to. It is also possible to introduce the pharmaceutical composition of the present invention into a phospholipid vesicle such as a ribosome and administer the vesicle.
  • the endoplasmic reticulum retaining siRNA or shRNA is introduced into a predetermined cell by the lipofusion method. Then, the obtained cells are systemically administered, for example, intravenously or intraarterially. It can also be administered locally to the brain or the like.
  • 'Dose of the pharmaceutical composition of the present invention, age, sex, symptoms, administration route varies depending dose frequency ⁇ beauty dosage forms, for example, the dosage in the case of adenovirus per day Khaya or l 0. 6 to 10 i About 3 and administered at 1-8 week intervals.
  • a commercially available gene transfer kit for example, Adeno Express (Clontech)
  • Adeno Express for example, Adeno Express (Clontech)
  • the present invention includes a method for treating allergic diseases, characterized in that the pharmaceutical composition that suppresses the production of IL-4 and Z or IgE is administered to patients with allergic diseases.
  • the present invention also includes the use of cp, a pharmaceutical composition for inhibiting the production of IL-4 and Z or IgE as described above for treating allergic diseases.
  • the pharmaceutical composition to be administered or used is particularly preferably the gene therapy agent described above.
  • the present invention provides an infectious disease, autoimmune disease or leukemia characterized by administering the pharmaceutical composition that promotes the production of IL-4 and Z or IgE to a patient with an infectious disease, autoimmune disease or leukemia.
  • the present invention also includes the use of a pharmaceutical composition that promotes the production of IL-4 and Z or IgE to treat infectious diseases, autoimmune diseases or leukemia.
  • the dose ratio of the pharmaceutical composition, the number of administrations, the administration period, and the like can be appropriately set according to individual patients.
  • the description in the above section 3 can be similarly applied.
  • the present invention provides foods, beverages, feeds and cosmetics containing substances that regulate the expression and / or function of Synoviolin. These foods, beverages, feeds and cosmetics are used to control the production of site power ins, and when they contain substances that inhibit the expression and Z or function of synoviolin, they are used as antiallergic foods, etc. .
  • site force ins production regulation means that IL-4 production is regulated (promoted or inhibited).
  • IL-4 and the like can be raised as a site force-in subject to production regulation.
  • the content ratio of the substance that regulates the expression and / or function of synoviolin is not particularly limited, and is appropriately set according to various uses (and the types thereof). can do.
  • the food, beverage, The method for obtaining feed and cosmetics is not limited, and a known production method can be employed according to various uses (and the types thereof).
  • the food of the present invention is not limited, but for example, edible breads, biscuits, chocolate, jelly, ice cream and other confectionery, udon, buckwheat, Chinese soba, various pasta and other hamburgers, hamburger, ham Dairy products such as bacon, winner, etc., cheese, milk, etc., health foods, various seasonings and various instant foods. '
  • beverage of the present invention examples include, but are not limited to, coffee, tea, green tea, vegetable juice, fruit juice, and various sports drinks.
  • the feed of the present invention is not limited, but examples thereof include livestock feed and pet food.
  • Examples of the cosmetic of the present invention include, but are not limited to, lotions, emulsions, foundations, essences, creams, sunscreen lotions, and the like.
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • synoviolin expression was analyzed in each immune system cell of wild-type mice.
  • peripheral blood mononuclear cells peripheral blood mononuclear cells
  • liver mononuclear cells liver mononuclear cells
  • spleen cells ⁇ cells and ⁇ ⁇ cells
  • intraperitoneal cells were used.
  • Peripheral blood mononuclear cells were collected by the following method. Specifically, whole blood was collected from a wild-type mouse, and 5 mL of RPMI1640 medium (hereinafter abbreviated as “medium”) containing 10% FCS was added to the whole blood and layered on 5 mL of Lympholyte-M (CEDARLANE). Centrifugation was performed at 500 rpm for 20 minutes. The intermediate layer was recovered, washed twice with medium, and suspended in 1 mL of medium.
  • medium RPMI1640 medium
  • CEDARLANE Lympholyte-M
  • Liver mononuclear cells were prepared by the following method. That is, the liver refluxed with the phosphate buffer was crushed with a mesh and suspended in 5 mL of 45% percoll solution. This suspension was layered on 3 mL of 67.5% Percoll solution and centrifuged at 2,000 rpm for 20 minutes. After centrifugation, the intermediate layer was collected, washed twice with medium, and suspended in 1 mL of medium.
  • Spleen cells were prepared by subdividing an organ using a slide glass and then collecting those that passed through steel mesh and removing the red blood cells and suspending them in the medium.
  • Spleen B cells and T cells were collected by the following method.
  • Piotin-labeled mouse anti-CD45R antibody (RA3-6B2) was added to washed magnetic beads (Dynabeads) 250; uL and incubated at 4 ° C for 30 minutes to prepare a magnetic bead-labeled anti-mouse CD45R antibody.
  • spleen CD45R positive cells were collected using a magnet and used as spleen B cells. The remaining cells from which CD45R positive cells were removed were used as spleen T cells in the following experiments.
  • Syno + / _ mice and wild-type mice male: 5-9 weeks old, syno +/- 4 mice, 2 wild-type mice) with DBA / 1J mice as background ) 4 mg and 10 ⁇ g ovalbumin (OVA) suspended in 0.2 mL of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5) alum-OVA was intraperitoneally administered, and 14 days later, the same amount of alum-OVA was intraperitoneally administered. Re-administered.
  • an autopsy was performed, and whole blood was collected from the heart of each mouse. Serum was collected from the obtained whole blood by centrifugation. Antigen-specific antibody production in serum was detected by ELISA.
  • a 96-well plastic plate (Sumilon) was coated with 25 ng / well of OVA dissolved in V-acid buffer, and each mouse serum collected was added thereto and left at room temperature for 1 hour. After washing each tool, 50/50 HRP-labeled anti-mouse IgGl antibody (LO-MG1-2) was added to each tool, and OVA-specific IgGl was detected. For detection, a TMB substrate solution set (BD Pharmingen) was used, and after the reaction was stopped, measurement was performed at 450 nm using a microplate reader. OVA-specific IgG2a was detected using an HRP-labeled anti-mouse IgG2a antibody (LO-MG2a-7) coated with 100 ng / well of OVA in the same manner as IgGl detection.
  • OVA-specific IgE was performed by the following method. Two-fold diluted serum was added to a 96-well plastic plate coated with 100 ng / well of anti-mouse IgE antibody (LO-ME-3) and left at room temperature for 1 hour. After washing each well, piotin-labeled OVA at a concentration of 5 / ig / mL was added and left at room temperature for 1 hour. Piotin 'labeled OVA was prepared using EZ-LinkSulfo-NHS-Biotin reagent (PIERCE). After washing each tool, 1,000-fold diluted ECL streptavidin HRP (Amacham) was added and left at room temperature for an additional hour. After washing each well, a TMB substrate solution was added, and after stopping the reaction, measurement was performed at 450 nm using a microphone mouthplate reader.
  • PIERCE EZ-LinkSulfo-NHS-Biotin reagent
  • the production of IgE and IgM during induction of allergy in syno +/ ⁇ mice in the DBA / 1J background was examined.
  • the total IgE concentration in serum was measured using the total EIA IgE measurement kit (Yamasa), and the total IgM concentration was measured using the Mouse IgM ELISA Quantitation Kit (BETHYL). After washing each well, TMB substrate solution was added, and after stopping the reaction, measurement was performed at 450 nm using a microplate reader.
  • syno +/- mice and wild-type mice female: 7 to 13 weeks old, syno +/- 4 mice, 3 wild-type mice
  • C57BL / 6 as the background
  • a similar experiment was conducted.
  • Serum OVA-specific IgE, IgGl and IgG2a were measured by the method described in Example 2. The method for measuring OVA-specific IgM in serum is described below.
  • the serum total IgGl concentration was measured by the following method.
  • Purified anti-mouse IgGl antibody (A85-3) was diluted 200-fold, and serially diluted serum was added to the plate, which was allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • Anti-Mauze IgQl antibody (MOPC-31C) was used as a standard. After washing each tool, 50 L each of 0.1 / X g / mL HRP-labeled anti-mouse IgGl antibody was added to each tool and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After washing each well, TMB substrate solution was added, and after stopping the reaction, measurement was performed at 450 nm using a microplate reader.
  • the spleen was extracted from a mouse immunized with alum-OVA according to the schedule described in Example 2, and subdivided using a slide glass and suspended in 5 mL of medium. After erythrocyte removal, cells were pooled for each syno +/ ⁇ group and wild type group, and each was suspended in 5 mL of medium. After measuring the number of cells, the cells were seeded in a 96-well culture plate at 2.5 ⁇ 10 5 cells / well. Each Ueru added to the culture medium only or OVA at a final concentration of 0.1 mg / mL to, C0 2 concentration of 5% was carried out 90 hours of culture under 37 ° C.
  • the culture plate was centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and the culture supernatant was collected in a new plate.
  • concentrations of IFN- ⁇ and IL-4 in the culture supernatant were detected using OptEIA Set Mouse IFN- ⁇ (BD Pharmingen) and OptEIA Set Mouse IL-4 (BD Pharmingen).
  • TMB substrate solution For color development, use TMB substrate solution. The measurement was performed at 450 nm using a single trimmer.
  • Spleens were removed from whole blood samples from syno +/- mice and wild-type mice (female: 9-16 weeks of age, syno + / _: 3 animals, wild-type: 3 animals) with DBA / 1J as background.
  • Spleen cells were prepared by subdividing an organ using a slide glass, collecting the cells passed through a steel mesh, removing the red blood cells, and then suspending them in the medium. The spleen cells were adjusted to IX 10 6 / Chiyubu, as the Bro Kkingu liquid anti-mouse CD16 / CD32 antibody (2.4G2) was added, After incubation for 30 min at 4 ° C, remove excess blocking solution did.
  • ICOS a receptor involved in IL-4 production
  • Syno +/- mouse spleen cells were used for examination.
  • the following experiment was performed using spleen cells of syno +/ ⁇ mice and wild type mice prepared by the method described in Example 7.
  • FITC-labeled anti-mouse TCR j3 antibody H57-597
  • piotin-labeled anti-mouse ICOS antibody 7E.17G9
  • the ICOS expression ratio in splenic T cells was not different between syno +/- mouse cells and wild-type mice (see Fig. 8).
  • Spleen cells were collected from syno + / _ mice and wild type mice (3 females each) and seeded on 96-well plates at 5 ⁇ 10 5 cells / well.
  • Recombinant mouse IL-4 (PeproTech EC) was added at final concentrations of 1 ng / mL and 10 ng / mL, and LPS was added as a positive control to a final concentration of lwg / mL.
  • % C0 2 were cultured in the presence, was measured at 450 nm wavelength using a WST-8 (Dojindo) microplate one loaders after the addition of 20 L 4 hours, as a result, syno + / -There was no significant difference between the group and the wild type group (see Figure 9).
  • a substance that regulates the expression and / or function of Synoviolin is provided.
  • This substance is produced by regulating the expression and / or function of Synoviolin. Since IL-4 and / or IgE production can be regulated (suppressed or promoted), it can be used as a pharmaceutical composition for the treatment of allergic diseases when production is inhibited, or it can be infected when production is promoted. It is extremely useful as a pharmaceutical composition for the treatment of infectious diseases, autoimmune diseases and leukemia.

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Abstract

本発明は、シノビオリンの発現及び機能を調節することによりIL-4及びIgE産生を抑制又は促進する方法、シノビオリンの発現及び活性を調節する物質を含む医薬組成物、並びにシノビオリンの発現及び機能を阻害するアレルギー性疾患、感染症、自己免疫疾患又は白血病の治療剤を提供する。

Description

明 細 書 ァレルギ一性疾患用医薬組成物 技術分野
本発明は、 シノビォリンの発現及び活性を調節することにより、 IL-4及び/ 又は IgE産生を抑制又は阻害する方法に関する。 また、 本発明は、 シノビオリ ンの発現及び活性を調節することにより、 IL-4及び/又は IgE産生を調節する 物質を含む医薬組成物に関する。
' 背景技術 .
シノビオリンは、 リゥマチ患者由来滑膜細胞で過剰発現している膜タンパク 質として発見された新規タンパク質である （WO 02/052007) 。 そして、 遺伝 子改変動物を用いた研究により、 シノビオリンは関節リゥマチの発症に必須の 分子であることが判明した。
タンパク質構造予測システムにより、 シノビオリンは RING fingerモチーフ を有することが示唆されている。 このモチーフはタンパク質のュビキチン化に 重要な役割を果たす E3ュビキチンライゲ一スという酵素に多く見出されてい るが、 実際、 シオビォリ ンが E3ュビキチンライゲースの特徴の一つである自 己ュビキチン化活性を有することが証明されている （WO 02/052007) 。 しか' し、 シノビォリンと免疫系との関与は明らかとなっていない。 .
一方、 気管支喘息、 アレルギー性鼻炎、 アレルギー性結膜炎、 ア トピー性皮 膚炎、 アナフィラキシーショ ック、 花粉症、 食物アレルギー等のアレルギー性 疾患は近年世界的に増加の傾向にあり、 大きな問題となっている。 従来の抗ァ レルギ一剤は、 肥満細胞からの化学伝達物質の遊離抑制剤、 遊離した化学伝達 物質の受容体阻害剤又はァレルギ一性炎症反応の抑制剤等であるが、 これらは いずれも対症療法であり、 根本的なァレルギ一性疾患の治療薬となっていなレ、。 アレルギー反応はその発症の機序、 症状の違いなどにより I型アレルギー反応、 II型ァレルギ一反応、 III型ァレルギ一反応及び I V型ァレルギ一反応に区別 されている。 I型アレルギー反応においては、 生体内に入った抗原により IgE が生起し、 これが組織の肥満細胞又は血中の好塩基性細胞の細胞膜に固着した IgE抗体が抗原と反応することにより、 当該細胞から.ヒスタミン、 セロ トニン、 その他の種々の化学伝達物質を遊離する。 該化学伝達物質は平滑筋の収縮、 血 管透過性の宂進など様々な組織反応を引き起こす。
しかしながら、 化学伝達物質の遊離もしくは生成を特異的に抑制する薬剤又 は.特異的な拮抗薬が知られている化学伝達物質は少なく、 また化学伝達物質は 多種多様であるため、 I型アレルギー反応を抑制するためには、 種々の化学伝 達物質の相互作用の解析が必要とされているのが現状である。
'根本的なアレルギー性疾患の治療薬として、 アレルギー性疾患の発症に深く 関与している IgE抗体の産生抑制剤が考えられている。 IgE産生抑制作用 有 する化合物の一つとしてトシル酸スプラタスト（IPD- 1151-T)がある。 これは タイプ 2の T細胞 （Th2細胞） に作用し、 IL-4の産生を抑制することにより、 B細胞の IgE抗体産生細胞への分化を抑制すると報告されている （Yanagihara Y et al.， Jpn. Pharmacol., (1993) 61： p.31-39) 。 B細胞に直接作用して IgE抗 体産生を抑制する化合物としては、 例えば肥満細胞脱顆粒阻害剤である DSCG (インタール） 又はネグクロミルソディウムがある。 これらは B細胞のクラス スィツチを阻害すると報告されている （J. Exp. Med., (1994) 180: p.663 671 ； J. Allergy, Clin. Immunol., (1996) 97： p.1141- 1150) 。 また、 J. Med. Chem., (1997) 40： p.395.407にも、 B細胞に直接作用して IgE産生を抑制する 化合物が記載されている。 並びに、 サイクロスポリン Aのような非特異的な免 疫抑制剤によって IgE産生を抑制し、 アレルギー性疾患を治療しょうとする試 みも行われているが、 IgE抗体以外の免疫グロプリンを抑制することは好まし くないため、 IgE選択性が高く強力な阻害薬の開発が望まれている。 発明の開示
本発明は、 シノビォリ ンの発現及び機能を調節することにより、 IL-4及び IgE産生を調節する医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するために鋭意研究を行った。 そして、 シノビ ォリンへテロノックアウト （syno+/-) マウスを詳細に解析したところ、 野生 型に比し、 IL-4及び IgE産生が抑制されることを見出し、 本発明を完成するに 至った。 すなわち、 本発明は以下の通りである。
( l ) IL-4及び/又は IgEの産生を調節する物質を含む医薬組成物。
IL-4及び/又は IgEの産生を調節する物質としては、 シノビオリンの発現及 ぴ /又は機能を阻害又は促進するものが挙げられる。 具体的には、 シノビオリ ンの発現及び/又は機能を阻害物質として、 シノビオリン又はシノビオリンを コードする遺伝子に対する低分子化合物、 ペプチド、 抗体、 デコイ核酸、 アン チセンス核酸、 siRNA及び shRNAからなる群から選択される少なく とも 1つ を例示することができる。 また、 シノビォリンの発現及び/又は機能を促進す る物質として、 シノビオリンプロモーター活性促進剤、 シノビオリンポリぺプ チド及びシノビオリンポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも 1つを例示するこ ができる。
ここで、 シノビオリンをコードする遺伝子は、 例えば配列番号 1に示される 塩基配列を含むものである。
本発明において、 siRNAとしては、 配列番号 1に示す塩基配列のうち一部 の配列を標的とするものが挙げられる。
また本発明の医薬組成物としては、 例えばアレルギー性疾患、 感染症、 自己 免疫疾患又は白血病を予防及び/又は治療するための医薬組成物が挙げられる。 上記アレルギー性疾患としては、 例えば気管支喘息、 アレルギー性鼻炎、 ァ レルギ一性結膜炎、 アトピー性皮膚炎、 アナフィラキシーショック、 ダニァレ ルギー疾患、 花粉症及び食物アレルギー疾患からなる群から選ばれる少なく と も 1つを例示することができる。
感染症としては、 寄生虫由来の感染症が挙げられ、 例えばアメーバ症、 虫症、 バべシァ症、 クリプトスポリジゥム症、 ジアルジァ症、 鉤虫症、 マラリア、 蟯 虫症、 住血吸虫症、 条虫感染症、 トキソカラ症、 トキソプラズマ症、 旋毛虫症、 鞭虫痺、 疥癬、 ァニサキス症、 ェキノコックス症、 食品媒介寄生蠕虫症、 シラ ミ症、 幼虫移行症及びサルコィ ドーシスからなる群かあ選択される少なくとも 1つを例示することができる。
自己免疫疾患としては、 例えば関節リウマチ、 シエーダレン症候群、 全身性 硬化症、 多発性筋炎、'ギラン ·バレー症候群、 特発性 ik小板減少性紫斑病、 自 己免疫性溶血性貧血、 水疱性類天疱瘡、 グレーヴス病 （バセドウ病） 、 橋本甲 状腺炎、 1型糖尿病、 全身性エリテマトーデス、 重症筋無力症、 天疱瘡、 悪性 貧血、 膠原病、 低 IgE血症及び無 γグロブリン血症からなる群から選択される 少なく とも 1つを例示することができる。
さらに、 白血病としては、 骨髄形成症、 多発性骨髄腫、 急性リンパ球性白血 病、 急性骨髄性白血病、 慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病からなる 群から選択される少なくとも 1つを例示することができる。
( 2 ) 上記 (1)の医薬組成物を有効成分とする、 アレルギー性疾患、 感染症、 自 己免疫疾患又は白血病の治療剤。
( 3 ) 上記 (1)の医薬組成物又は上記 (2)の治療剤をアレルギー性疾患、 感染症、 自己免疫疾患又は白血病の患者に投与することを特徴とする、 アレルギー性疾 患、 感染症、 自己免疫疾患又は白血病の治療方法。
( 4 ) シノビオリンの発現及びノ又は機能を調節する物質を含有する、 サイ ト ' 力イン類産生調節用の食品、 飲料又は飼料。
( 5 ) シノビォリ ンの発現及びノ又は機能を阻害する物質を含有する、 抗ァレ ルギー用の食品、 飲料又は飼料。
( 6 ) シノビオリンの発現及び/又は機能を調節することを特徴とする IL-4及 び IgEの産生調節方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 野生型マウスの各免疫系細胞におけるシノビオリンの発現解析を示 す図である。 '
図 2は、 syno+/ -マウス （DBA/1J) におけるアレルギー誘導時の抗原特異 的な抗体産生を示す図である。
図 3は、 syno+/-マウス （DBA/1J) におけるァレノレギー誘導時の抗体産生 (total) を示すである。
図 4は、 syno+/ -マウス （C57BL/6) .におけるアレルギー誘導時の抗原特異 的な抗体産生を示す図である。
図 5は、 syno+/-マウス （C57BL/6) におけるアレルギー誘導時の抗体産生 (total) を示す図である。
図 6は、 syno+/-マウス （DBA/1J) におけるアレルギー誘導時のサイ ト力 イン産生を示す図である。 ，
図 7は、 syno+/-マウス脾臓細胞における IL-4Rの発現を示す図である。 図 8は、 syno+/-マウス脾臓細胞における ICOSの発現を示す図である。 図 9は、 syno+/-マウス脾臓細胞の IL-4刺激に対する増殖反応を示す図であ る。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 本発明の範囲はこれらの説明に拘束される ことはなく、 以下の例示以外についても、 本発明の趣旨を損なわない範囲で適 宜変更し実施し得る。
なお、 本明細書は、 本願優先権主張の基礎となる特願 2005-366318号明細 書の全体を包含する。 また、 本明細書において引用された全ての刊行物、 例え ば先行技術文献、 及び公開公報、 特許公報その他の特許文献は'、 参照として本 明細書に組み込まれる。
1 . 本発明の概要
本発明は、 シノ ビオリンの発現及び/又は機能を調節する物質を.含む医薬組 成物を用いて、 疾患を治療することを特徴とする。 具体的には、 シノビオリン の発現及び Z又は機能を阻害して IL-4及びノ又は IgEの産生を抑制することに より、 アレルギー性疾患を治療することを特徴とする。 また、 本発明は、 シノ ビオリンの発現及び/又は機能を促進して IL-4及び/又は IgEの産生を促進す ることにより、 感染症、 自己免疫疾患又は白血病を治.療することを特徴とする。 本発明においては、 シノビォリ ンの発現阻害及び/又は活性阻害をアレルギ —性疾患治療の有効な方法の一つとするため、 シノビオリンの機能に着目した。 そして、 シノビォリンへテロノックアウト動物を作製し、 詳細に解析したとこ ろ、 野生型に比して IL-4及び IgEの産生抑制が観察された。 すなわち、 シノビ オリンの機能を阻害すると、 アレルギー性疾患に深く関与している IL-4及び IgEの産生が抑制され、 シノビォリンの機能阻害がアレルギー性疾患治療につ ながることを見出した。 また、 本発明者は、 シノビオリン遺伝子を遺伝子治療 用ウィルスベクターで感染させることにより過剰発現させたときは、 IL-4及び IgEの産生が促進され、 感染症、 自己免疫疾患、 白血病の治療につながること を見出した。
したがって、 本発明は、 IL-4の産生及び/又は IgEの産生を調節する物質を 含む医薬組成物を提供する。 ここで、 「調節」 とは、 IL-4の産生、 IgEの産生 又はシノビオリンの発現を促進又は抑制することを意味し、 促進するときは正 の調節、 抑制するときは不の調節ともいう。 当業者は、 治療の対象となる疾患 に応じて、 IL-4の産生、 IgEの産生又はシノビォリンの発現を促進又は阻害す るように、 調節することができる。 '
2 . シノピオリン発現及び Z又は活性調節
IL-4及びノ又は IgEの産生を調節するためには、 シノビォリンの発現及び/ 又は機能を阻害又は促進する方法が採用される。
( 1 ) シノビォリ ンの発現阻害
シノビォリ ンの発現阻害には、 特に限定されるものではないが、 例えば RNA干渉 （RNAi) を利用することができる。 シノビオリン遺伝子に対する siRNA (small interfering RNA) を設計及び合成し、 これを細胞内に導入さ せることによって、 RNAiを引き起こすことができる。 また、 本発明において は、 シノビォリ ンの発現及び/又は機能を阻害する物質として、 シノビオリン 又はシノビオリンをコ一ドする遺伝子に対する低分子化合物、 ぺプチド、 抗体、 デコイ核酸及びァンチセンス核酸を使用することもできる。
RNAiとは、 dsRNA (double-strand RNA) が標的遺伝子に特異的かつ選択 的に結合し、 当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害す る現象である。 例えば、 dsRNAを細胞内に導入すると、. その RNAと相同配列 の遺伝子の発現が抑制 （ノックダウン） される。
siRNAの設計は、 以下の通り行うことができる。
(a) シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、 任 ¾の領域を全て候補にすることが可能である。 例えば、 ヒ トの場合は、 配列 番号 1に示される塩基配列中の任意の領域を候補とすることができ、 具体的に は、 シノビォリンの CDS領域 （第 403番目〜第 2256番目） 中の任意の領域を候 補とするこ とが好ま しい。 配列番号 1 に示される塩基配列の情報は、 GenBankに Accession number: AB024690として公表されている。
(b) 選択した領域から、 AAで始まる配列を選択し、 その配列の長さは 19〜 25塩基、 好ましくは 19〜21塩基である。 その配列の GC含量は、 例えば 40〜 60%となるものを選択するとよレ、。 具体的には、 配列番号 1に示される塩基配 列のうち、 以下の (i)〜(xiv)の塩基配列から選ばれる少なく とも 1つの配列を 含む DNAを siRNAの標的配列として使用することができる。 特に、 （i)、 （ii)、 (vi)、 （vii)又は (viii)の塩基配列を含む DNAを標的とすることが好ましい。 なお、 (i)〜(xiv)の塩基配列はいずれもシノビオリンの CDS領域中の塩基配列である。
(0 AA TGTCTGCATCATCTGCCGA GA (配列番号 3 )
(li) AA GCTGTGACAGATGCCATCA TG (配列番号 4 )
(iii) AA AGCTGTGACAGATGCCATC AT (配列番号 5 )
(iv) AA GAAAGCTGTGACAGATGCC AT (配列番号 6 )
(v) AA GGTTCTGCTGTACATGGCC TT (配列番号 7 ) (vi) AA CAAGGCTGTGTACATGCTC TA (配列番号 8 )
(vii) AA ATGTTTCCACTGGCTGGCT GA (配列番号 9 )
(viii) AA GGTGTTCTTTGGGCAACTG AG (配列番号 10)
(ix) AA CATC C AC AC ACTGCTGGAC GC (配列番号 11)
(x) AA CACCCTGTATCCAGATGCC AC (配列番号 12)
(xi) AA GGTGCACACCTTCCCACTC TT (配列番号 13)
(xii) AA TGTTTCCACTGGCTGGCTG AG (配列番号 14)
(xiii) AA GAGACTGCCCTGCAACCAC AT (配列番号 15)
(xiv) AA CGTTCCTGGTACGCCGTCA CA (配列番号 16) siRNAを細胞に導入するには、 in ζ' ひで合成した siRNAをプラスミ ド DNA に連結してこれを細胞に導入する方法、 2本の RNAをァニールする方法など を採用することができる。
また、 本発明は、 RNAi効果をもたらすために shRNAを使用することもでき' る。 shRNAとは、 ショートヘアピン： RNA (short hairpin RNA) と呼ばれ、 一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を 有する RNA分子である。
' shRNAは、 'その一部がステムループ構造を形成するように設計することが できる。 例えば、 ある領域の配列を配列 Aとし、 配列 Aに対する相補鎖を配列 Bとすると、 配列 A、 スぺーサ一、 配列 Bの順になるようにこれらの配列が一 本の RNA鎖に存在するようにし、 全体で 45〜60塩基の長さとなるように設計 する。 配列 Aは、 標的となるシノビオリン遺伝子 （配列番号 1 ) の一部の領域 の配列であり、 標的領域は特に限定されるものではなく、 任意の領域を候補に することが可能である。 そして配列 Aの長さは 19〜25塩基、 好ましくは 19〜 21塩基である。
「低分子化合物」 とは、 シノビォリンの発現及び機能を阻害する化合物を意 味し、 例えばシノビオリン酵素活性阻害剤、 及びシノビオリンプロモーター活 性阻害剤などが挙げられる。 このような低分子化合物は、 合成することにより、 あるいは試薬会社から購入することにより、 得ることができる。
「ペプチド」 とは、 シノビォリ ンのアミノ酸配列 （配列番号 2 ) と類似のァ ミノ酵配列を有するぺプチドであって、 シノビオリン受容体に競合的に結合す ることにより、 シノビォリンの機能を阻害するペプチドを意味する。 このよう なペプチドは、 通常のペプチド合成法によって合成できる。 ペプチド合成法と しては、 例えば、 アジド法、 酸クロライ ド法、 酸無水物法、 混合酸無水物法、 DCC 法、 活性エステ,ル法、 カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げら れる。 また、 その合成は、 固相合成法及び液相合成法のいずれを適用すること もできる。 市販のペプチド合成装置を使用してもよい。
「抗体」 とは、 シノビォリンと結合することにより、 シノビォリンの機能を 阻きする抗体を意味し、 ポリクローナル抗体であるかモノクローナル抗体であ るかは問わない。 また、 抗体には、 Fab断片、 F(ab')2及び Fv断片なども含ま れる。
ポリクローナル抗体を作製するためには、 シノビオリン又はその部分断片を 抗原として用いて動物 （例えばラット、 マウス及びゥサギなど） を免疫し、 最 終免疫後に抗体価を測定し、 最大の抗体価を示した日に採血し、 抗血清を得れ ばよい。 抗原の動物 1匹当たりの投与量は、 例えばゥサギの場合は、 1〜： 10 mgであり、 アジュバントの有無によって適宜調節する。 アジュバントとして は、 フロイント完全アジュバント （FCA) 、 及びフロイン ト不完全アジュバ ント （FIA) 等が挙げられる。 抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、 硫安塩析法、 イオン交換クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 及びァフィ二ティー クロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、 又はこれらを組み合わ せることにより精製することができる。
モノクローナル抗体を作製するには、 当該分野で周知のハイプリ ドーマ法に よって製造することができる。 例えば、 シノビオリン又はその部分断片を抗原 として、 哺乳動物を免疫した後に得られる抗体産生細胞 （脾臓細胞及びリンパ 節細胞等） とミエローマ細胞 （例えば P3X63-Ag.8.Ul及び NS-Iなど） との細 胞融合を行い、 細胞融合後に目的のモノクローナル抗体を産生するハイプリ ド —マをスク リーニングすればよい。 融合細胞のクローニングは、 限界希釈法等 により行い、 最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイプリ ドーマを榭 立する。 樹立したハイプリ ドーマからモノクロ一ナル抗体を採取する方法とし て、 通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。
「デコイ核酸」 とは、 シノ ビォリンのプロモーターに結合する転写因子に結 合し、 シノビォリンの機 を抑制することができるデコイ核酸 （デコイオリゴ ヌクレオチド） 、 あるいはシノビオリン遺伝子に直接結合し、 シノビォリンの 機能を抑制することができるデコイ核酸である。
本発明において使用し得る好ましいデコイ核酸の例は、 例えばシノビオリン プロモーターの EBS (Ets binding site) に結合する転写因子と結合し得る核 酸、 プロモーターの ABS (AML binding site) に結合する転写因子と結合し 得る核酸、 プロモーターの SBS (Sp l binding site)に結合する転写因子と結合 し得る核酸、 これらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、 これらの変異体、 及 びこれら'を分子内に含む核酸などが挙げられる。 デコイ核酸は、 上記 EBS、 ABS又は SBSの配列を元に、 1本鎖、 又はその相補鎖を含む 2本鎖として設計 することができる。 長さは特に限定されるものではなく、 15〜60塩基、 好ま しくは 20〜30塩基である。 核酸は、 DNAでも RNAでもよく、 又はその核酸内 に修飾された核酸及び Z又は擬核酸を含んでいてもよい。 またこれらの核酸、 その変異体、 又はこれらを分子内に含む核酸は、 1本鎖でも 2本鎖でもよく、 また環状でも線状でもよい。 本発明で用いられるデコイ核酸は、 当業界で公知' の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。 例えば、 遺 伝子組換え技術として一般的に用いられる DNA合成装置を用いた核酸合成法 を使用することができる。 また、 铸型となる塩基配列を単離又は合成した後に、 PCR法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を使用することもで きる。 さらに、 これらの方法により得られた核酸を、 制限酵素等を用いて切断 し、 DNAリガーゼを用いて結合することにより所望の核酸を製造してもよレ、。 さらに、 細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、 塩基等にアルキル化又 はァシル化等の化学修飾を付加することができる。 デコイ核酸の変異体の作製 方法は、 当業界で公知の方法、 例えば、 部位特異的突然変異誘発法等によって 合成することもできる。 部位特異的突然変異誘発法は当分野において周知であ り、 市販のキッ ト、 例えば GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System (イ ンビ ト ロ ジェン社製） 、 及び TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K、 Mutan'Super Express Km等 （タカラバイオ社製）. ） 等 を使用することができる。
「アンチセンス核酸」 とは、 シノビオリン遺伝子に相補的な配列を有し、 当 該遺伝子にハイブリダイズすることにより、 シノビォリン遺伝子の発現を阻害 することができる核酸を意味する。 アンチセンス核酸は、 シノビオリンをコ一 ドする遺伝子の部分塩基配列に対して相補的な核酸化合物を合成化学的手法な どにより調製することができる。 当該核酸化合物がシノビオリンの産生を効率' 的に阻害するかどうかを評価するためには、 遺伝子の発現量を指標としたスク リーニング試験を行えばよい。 上記アンチセンス核酸化合物としては、 例えば シノビオリンの発現を、 コントロールと比較して少なく とも 50%以下に抑え ることができるものである。
( 2 ) シノビオリンの発現促進
一方、 シノビォリンの発現促進には、 特に限定されるものではないが、 例え ば転写因子及び小胞体ス トレス誘導剤等を利用することができる。
シノビォリンの発現を促進するために利用される 「転写因子」 とは、 シノ ビ オリンプロモーター遺伝子の転写制御領域を調節する転写促進物質であること： を意味し、 例えば GABP α / /3 ( GA binding protein α ί β ) 、 IRE 1、 及び ATF6 (activating transcription factor 6) 等が挙げられる （WO 05/093067 ； M. Kaneko et al.， FEBS Letters, (2002) 532： p.147- 152) 。 また、 シノビ ォリンの発現を促進するために利用される 「小胞体ス トレス誘導剤」 とは、 シ ノビオリンプロモーター遺伝子の ERSE (ER stress response elements) を活 性化することで転写を促進する物質であることを意味し、 例えばッニカマイシ ン及びタプシガルギンなどが挙げられる （M. Kaneko et al.， FEBS Letters, (2002) 532： p.147 152) 。 3 . 医薬組成物
本発明において作製された shRNA、 siRNA、 低分子化合物、 ペプチド、 抗 体、 デコイ核酸及びアンチセンス核酸は、 シノビォリンの発現を抑制する物質 であり、 IL-4及び/又は IgEの産生を抑制させる医薬組成物 （特に、 アレルギ 一性疾患の遺伝子治療剤） として使用することができる。 よって、 本発明は、 IL-4及び/又は IgEの産生を抑制させる医薬組成物を有効成分とするアレルギ 一性疾患の治療剤、 及び、 アレルギー性疾患を治療する薬剤を製造するための 該医薬組成物の使用を含むものである。
また、' 本発明において作製された転写因子及び小胞体ス トレス誘導剤は、 シ ノビ'オリンの発現を促進する物質であり、 IL-4及び/又は IgEの産生を促進さ' せる医薬組成物 （特に感染症、 自己免疫疾患又は白血病の治療剤） として使用 することができる。 よって、 本発明は、 IL-4及び/又は IgEの産生を促進させ る医薬組成物を有効成分とする感染症、 自己免疫疾患又は白血病の治療剤、 及 び、 感染症、 自己免疫疾患又は白血病を治療する薬剤を製造するための該医薬 組成物の使用を含むものである。
本発明の医薬組成物 （シノ ビォリンの発現を抑制する物質） をアレルギー性 疾患の遺伝子治療剤として使用する場合は、 適用部位は特に限定されず、 気管 支喘息、 アレルギー性鼻炎、 アレルギー性結膜炎、 ア トピー性皮膚炎、 ァナフ イラシーショック、 ダニアレルギー疾患、 花粉症及び食物ァレルギ一性疾患等 ' を対象として適用することができる。
上記疾患は、 他の疾患と併発したものであってもよい。
本発明の医薬組成物 （シノビォリンの発現を促進する物質） を感染症、 自己 免疫疾患又は白血病の治療剤として使用する場合は、 適用部位は限定はされな い。
感染症 （主に寄生虫による感染症） としては、 例えばアメーバ症、 回虫症、 バべシァ症、 クリプトスポリジゥム症、 ジアルジァ症、 鉤虫症、 マラリア、 蟯 虫症、 住血吸虫症、 条虫感染症、 トキソカラ症、 トキソプラズマ症、 旋毛虫症、 鞭虫症、 疥癬、 ァニサキス症、 ェキノコックス症、 食品媒介寄生蠕虫症、 シラ ミ症、 幼虫移行症及びサルコィ ドーシスが挙げられ、 感染症を治療するため には、 シノビオリンの発現を抑制する物質を医薬組成物として使用する。
自己免疫疾患としては、 例えば関節リウマチ、 シエーダレン症候群、 全身性 硬化症、 多発性筋炎、 ギラン ·バレー症候群、 特発性血小板減少性紫斑病、 自 己免疫性溶血性貧血、 水疱性類天疱瘡、 グレーヴス病 （バセドウ病） 、 橋本甲 状腺炎、 1型糖尿病、'全身性エリテマトーデス （SLE) 、 重症筋無力症、 天疱 瘡、 悪性貧血、 膠原病、 低 IgE血症及び無 γグロブリン血症な'どが挙げられ、 シノビオリンの発現を抑制する物質を医薬組成物として使用する。
白血病としては、 骨髄形成症、 多発性骨髄腫、 急性リンパ球性白血病、 急性 骨骨逭性白血病、 慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病などが挙げられ、 ' シノビオリンの発現を促進する物質を医薬組成物として使用する。
上記疾患は、 他の疾患と併発したものであってもよい。
本発明の医薬組成物は、 経口又は非経口的に全身又は局所投与することがで きる。 本発明の医薬を経口投与する場合は、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 丸剤、 トローチ剤、 内用水剤、 懸濁剤、 乳剤及びシロップ剤等のいずれのもの であってもよく、 使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。 また、 本発明の治療剤を非経口投与する場合は、 静脈内注射 （点滴を含む） 、 筋肉内 注射、 腹腔内注射、 皮下注射及び坐剤などの製剤形態を選択することができ、 注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。 これらの各種製剤は、 製剤上通常用いられる賦形剤、 増量剤、..結合剤、 湿潤 剤、 崩壊剤、 潤滑剤、 界面活性剤、 分散剤、 緩衝剤、 保存剤、 溶解補助剤、 防 腐剤、 矯味矯臭剤、 無痛化剤、 安定化剤及び等張化剤等などを適宜選択し、 常 法により製造することができる。
上記各種製剤は、 医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであつ てもよい。 このような担体及び添加物の例として、 水、 医薬的に許容される有 機溶剤、 コラーゲン、 アルギン酸ナトリウム、 水溶性デキストラン、 カルボキ シメチルスターチナトリ ウム、 ぺクチン、 キサンタンガム、 アラビアゴム、 力 ゼイン、 ゼラチン、 寒天、 グリセリン、 プロピレングリコール、 ポリエチレン グリコール、 ワセリ ン、 パラフィン、 ステアリルアルコール、 ステアリ ン酸、 ヒ ト血清アルブミン、 マンニトール、 ソルビトール及びラク トースなどが挙げ られる。 使用される添加物は、 本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組 み合わせて選択される。
本発明の治療剤の投与量は、 投与対象の年齢、 投与経路及び投与回数により 異なり、 広範囲に変えることができる。 本発明のペプチドの有効量と適切な希 釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、 一 回につき 0.1 /i g〜： 100 mg/body, 好ましくは 1〜： 10 μ g bodyの範囲の投与量を 選ぶことができ、 1 日 1回から数回に分けて 1 日以上投与される。
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、 本発明の医薬組' 成物を注射により直接投与する方法のほか、 核酸が組込まれたベクターを投与 する方法が挙げられる。 上記ベクターとしては、 アデノウイルスベクター、 ァ デノ随伴ウィルスベクター、 ヘルぺスウィルスベクター、 ワクシニアウイノレス ベクター、 レトロウイルスベクター及びレンチウィルスベクター等が挙げられ、 これらのウィルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。 また、 本発明の医薬組成物をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、 そ の小胞体を投与することも可能である。 siRNAや shRNAを保持させた小胞体 をリポフエクシヨン法により所定の細胞に導入する。 そして、 得られる細胞を 例えば静脈内又は動脈内等に全身投与する。 脳等に局所投与することもできる。' 本発明の医薬組成物の投与量は、 年齢、 性別、 症状、 投与経路、 投与回数及 び剤型によって異なるが、 例えばアデノウィルスの場合の投与量は 1日 1回あ たり l06〜10i3個程度であり、 1週〜 8週間隔で投与される。
siRNA又は shRNAを目的の組織又は器官に導入するために、 市販の遺伝子 導入キッ ト （例えば、 アデノエクスプレス（クローンテック社)） を用いること もできる。 ァレルギ一性疾患等の治療方法 本発明は、 前記 IL-4及び Z又は IgEの産生を抑制させる医薬組成物をアレル ギー性疾患の患者に投与することを特徴とする、 ァレルギ一性疾患の治療方 法を含むものである。 また本発明は、 アレルギー性疾患を治療するための前 記 IL-4及び Z又は IgEの産生を抑制させる医薬組成物 cp使用も含む。 ここで、 投与又は使用する医薬組成物は、 前述した遺伝子治療剤であることが特に好 ましい。
さらに本発明は、 前記 IL-4及び Z又は IgEの産生を促進させる医薬組成物を 感染症、 自己免疫疾患又は白血病の患者に投与することを特徴とする、 感染 症、 自己免疫疾患又は白血病の治療方法を含むものである。 また本発明は、 感染症、 自己免疫疾患又は白血病を治療するための前記 IL-4及び Z又は IgEの 産生を促進させる医薬組成物の使用も含む。 . ' 本発明の治療方法においては、 医薬組成物の投与量の割合、 投与回数、 及び 投与期間などを、 個々の患者に合わせて適宜設定することができる。 なお、 各 医薬組成物の好ましい投与方法及び投与量等については、 前記 3 .の項での説 明が同様に適用され得る。
5 . サイ ト力イン類産生調節用又は抗アレルギー用の食品、 飲料、 飼料又は化 粧料 ·
本発明は、 シノビオリンの発現及び/又は機能を調節する物質を含有する、 食品、 飲料、 飼料及び化粧料を提供する。 これらの食品、 飲料、 飼料及び化粧 料は、 サイ ト力イン類産生調節用に使用され、 シノビォリンの発現及び Z又は 機能を阻害する物質を含有するときは、 抗アレルギー用食品等として使用され る。 ここで、 「サイ ト力イン類産生調節」 とは、 IL-4の産生を調節 （促進又は 抑制） することを意味する。 また、 産生調節の対象となるサイ ト力インとして は、 IL-4などが举げられる。
本発明の食品、 飲料、 飼料及び化粧料において、 シノビォリンの ¾現及び/ 又は機能を調節する物質の含有割合は特に限定はされず、 各種用途， （さらには その種類） に応じて、 適宜設定することができる。 また、 本発明の食品、 飲料、 飼料及び化粧料を得る方法についても限定されるものではなく、 各種用途 （さ らにはその種類） に応じた公知の製造方法を採用することができる。
本 ¾明の食品としては、 限定はされないが、 例えば、 食用パン類、 ビスケッ ト、 チョコレート、 ゼリー、 アイスク リーム等の菓子類、 うどん、 そば、 中華 そば、 各種パスタ等の麵類、 ハンバーグ、 ハム、 ベーコン、 ウィンナ一等の加 ェ肉、 チーズ、 牛乳等の乳製品、 健康食品、 各種調味料及び各種インスタント 食品等が挙げられる。'
本発明の飲料としては、 限定はされないが、 例えば、 コーヒー、 紅茶、 緑茶、 野菜ジュース、 果物ジュース及び各種スポーツドリンク等が挙げられる。
本発明の飼料としては、 限定はされないが、 例えば、 家畜用の餌、 及びぺッ トフード等が挙げられる。 本発明の化粧料としては、 限定はされないが、 例えば、 化粧水、 乳液、 ファ ンデーシヨン、 エッセンス、 クリーム及び日焼け止めローション等が挙げられ る。 以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれ ら実施例に限定されるものではない。
[実施例 1 ]
本実施例では、 野生型マウスの各免疫系細胞におけるシノビオリンの発現解 析を行った。 各免疫系細胞として、 末梢血単核球、 肝臓単核球、 脾臓細胞 （Β ' 細胞及び Τ細胞） 及び腹腔内細胞を使用した。
末梢血単核球は以下の方法で回収した。 すなわち、 野生型マウスから全血採 血を行い、 全血に 10%FCSを含む RPMI1640培地 （以下、 培地と略す） 5mLを 加え、 Lympholyte-M (CEDARLANE) 5mL上に重層させたものを l,500rpm で 20分間遠心を行った。 中間層を回収して培地で 2回洗浄後 lmLの培地に懸 濁した。
肝臓単核球は、 以下の方法により調製した。 すなわち、 リン酸緩衝液で還流 した肝臓をメッシュでつぶし、 45%パーコール液 5mLに懸濁した。 この懸濁液 を 67.5%パーコール液 3mL上に重層し、 2，000rpmで 20分間遠心を行った。 遠 心後の中間層を回収して培地で 2回洗浄後、 lmLの培地に懸濁した。
脾臓細胞として、 スライ ドグラスを用いて臓器を細分化後、 スチールメッシ ュを通過したものを回収し、 赤血球を除去後に培地に懸濁したものを用意した。 脾臓 B細胞及び T細胞は以下の方法で回収した。 ピオチン標識マウス抗 CD45R抗体 （RA3-6B2) を、 洗浄したマグネッ トビーズ （Dynabeads) 250 ;u Lに加え、 30分間 4 °Cでインキュベートしてマグネッ トビーズ標識抗マ ゥス CD45R抗体を作製した。 脾臓細胞 5 X 107個を加えて 30分間 4 °Cでインキ ュベート後、 マグネッ トを用いて脾臓 CD45R陽性細胞を回収し、 これを脾臓 B 細胞として用いた。 CD45R陽性細胞を除去した残りの細胞を脾臓 T細胞として 以下の実験に用いた。
腹腔内細胞は、 マウスの腹腔内を培地 5mLで洗浄した液を回収し、 lmLの 培地に懸濁しなおしたものを用いた。
単離した各細胞は、 ISOGEN (WAKO) lmLを加えて溶解させ、 定法に従 い総 RNAを抽出した。 DNase l処理及びフエノールクロ口ホルム処理後ェタノ ール沈殿を行って回収した： RNAを DEPC水 lO i Lに溶解した。 総 RNA を シノ ビオリン特異的な TaqManプローブ （ABI) もしくは humanl8S (ABI) 各 0.5 // L、 TaqMan Mixture (ABI) 5 μ L, DEPC水 3.5 Lを含む混合液に 加え、 7500Real-Time PCR System (ABI) のプログラムに従い RT-PCRを行 レ、、 シノビオリン /18Sの比を求めた。 ' その結果、 解析したすべての細胞でシノビォリンの発現が見られたが、 特に、 B細胞で高値を示した （図 1参照） 。
[実施例 2 ]
本実施例では、 シノビオリン遺伝子のヘテロノックアウ トマウス （syno+/ - ) における、 アレルギー誘導時の抗原特異的な抗体産生について検討した。 Syno+/-マウスは、 当業者に周知の技術に従って本発明者らが作製したもの （ WO 02/052007； Genes Dev., 2003, vol. 17, p.2436-49) を使用した。 DBA/1Jマウスをバックグラウンドとする syno+/_マウス及び野生型マウス (雄： 5〜9週齢， syno+/- 4匹、 野生型 2匹） に対して、 1匹当たり水酸化アルミ ニゥムゲル （alum) 4mgと卵白アルブミン （OVA) 10 μ gとを 0.1 Mリン酸緩 衝液 （pH 7.5) 0.2mLに懸濁した alum-OVAを腹腔内投与し、 14日後に同量の alum-OVAを腹腔内へ再投与した。 28日目に剖検を行い、 各マウスの心臓から 全血採血を行った。 得られた全血から遠心分離を行って血清を回収した。 血清 中の抗原特異的な抗体産生は ELISA法により検出した。
Vン酸緩衝液に溶解した OVAを 25ng/ゥエルとなるように 96ゥエルプラステ イツクプレート （スミロン） にコートし、 その上に採取した各マウス血清を加 え、 1時間室温で放置した。 各ゥヱルを洗浄後、 各ゥヱルに 1.0 /i g/mL の HRP標識抗マウス IgGl抗体 （LO-MG1-2) を 50 ずつ加え、 OVA特異的な IgGlを検出した。 検出には TMB基質液セッ ト （BD Pharmingen) を用い、 反応停止後にマイクロプレートリ一ダーを用いて 450nmにて測定を行った。 OVA特異的な IgG2aについては、 IgGlの検出と同様に、 OVAを 100ng/ゥエル でコートし、 HRP標識抗マウス IgG2a抗体 （LO-MG2a-7) を用いて検出を行 つた。
OVA特異的な IgEの測定は以下の方法で行った。 抗マウス IgE抗体 （LO- ME-3) を 100ng/ゥエルずっコ一トした 96ゥエルプラスティックプレ一トに、 2倍段階希釈した血清を加えて 1時間室温で放置した。 各ゥエルを洗浄後、 5 /i g/mLの濃度のピオチン標識 OVAを加え、 1時間室温で放置した。 ピオチン' 標識 OVAは、 EZ-LinkSulfo-NHS-Biotin試薬 （PIERCE) を用いて作製した。 各ゥヱルを洗浄後、 1,000倍希釈した ECLストレプトアビディン HRP (アマシ ャム） を加えてさらに 1時間室温で放置した。 各ゥエルを洗浄後、 TMB基質 液を加え、 反応停止後にマイク口プレートリーダーを用いて 450nmにて測定 を行った。
その結果、 syno+/_では抗原 （OVA) 特異的な IgEの産生が低下していた。 一方、 抗原特異的な IgGl及び IgG2aについては、 差は認められなかった （図 2参照） 。 [実施例 3 ]
本実施例では、 DBA/1Jバックグラウンドの syno+/-マウスにおける、 ァレ ルギー誘導時の IgE及び IgMの産生について検討を行った。 血清'中の総 IgE濃 度の測定は total EIA IgE測定キッ ト （ャマサ） を、 また総 IgM濃度は Mouse IgM ELISA Quantitation Kit (BETHYL) を用いて測定を行った。 各ゥエル を洗浄後、 TMB基質液を加え、 反応停止後にマイクロプレートリーダーを用 いて 450nmにて測定を行った。
その結果、 syno+/_マウスでは総 IgE産生が低下傾向にあった （図 3参照） 。
[^施例 4コ
本実施例では、 C57BL/6をバックグラウンドとした syno+/-マウス及び野生 型マウス （雌： 7〜： 13週齢， syno+/- 4匹、 野生型 3匹） を用いて、 実施例 2と 同様の実験を行った。 血清中の OVA特異的な IgE、 IgGl及び IgG2aの測定は実 施例 2に記載した方法で行った。 血清中の OVA特異的な IgMの測定方法につ いては以下に記載した。
50 ng/ゥヱルの OVAをコートしたプレートに段階希釈した血清を加え 1時 間室温で放置した。 各ゥエルを洗浄後、 20 ng/mLの HRP標識 IgMを加えさら に 1時間室温で放置した。 各ゥエルを洗浄後、 TMB基質液を加え、 反応停止 後にマイクロプレートリーダーを用いて 450 nmにて測定を行った。' ' その結果、 DBA/1Jバックグラウンドの場合と同様に、 C57BL/6ノくックグラ ゥンド syno+/_マウスにおいても、 alum-OVA免疫時の抗原特異的な IgE産生 が有意に低下していた （図 4参照） 。 [実施例 5 ]
本実施例では、 C57BL/6バックグラウンドの syno+/-マウスにおける、 ァレ ルギー誘導時の IgE及び IgMの産生について検討を行った。 血清 Ψの総 IgM濃 度の測定は実施例 3に記載の方法で行った。 血清中の総 IgE濃度の測定は、 抗マウス IgE抗体 （LO-ME-3) を 100 ng/ゥェ ルずつコートした 96ゥエルプラスティックプレート上に血清を加えて 1時間 室温で放置した。 各ゥヱルを洗浄後、 total EIA IgE測定キット （ャマサ） を 用いて測定を行った。 ' ，
また、 血清中の総 IgGl濃度の測定は以下の方法で行った。
精製抗マウス IgGl抗体 （A85-3) を 200倍希釈してコートしたプレートに段 階希釈した血清を加え、 1時間室温で放置した。 スタンダードには抗マウズ IgQl抗体 （MOPC-31C) を用いた。 各ゥヱルを洗浄後、 各ゥヱルに 0.1 /X g/mLの HRP標識抗マウス IgGl抗体を 50 Lずつ加え、 1時間室温で放置した。 各ゥエルを洗浄後、 TMB基質液を加え、 反応停止後にマイクロプレートリー ダーを用いて 450 nmにて測定を行った。 ' その結果、 DBA/1Jバックグラウンドの場合と同様に、 C57BL/6バックダラ ゥンド syno+/-マウスにおいても、 alum-OVA免疫時の総 IgE産生が syno+/-マ ウスにおいて低下傾向を示した （図 5参照） 。
[実施例 6 ] '
本実施例では、 syno+/-マウスにおけるアレルギー誘導時のサイ ト力イン産 生を検討した b
実施例 2に記載のスケジュールで alum-OVA免疫を行ったマウスから脾臓を 摘出し、 スライ ドグラスを用いて細分化後に培地 5mLに懸濁した。 赤血球除' 去後に syno+/-群及び野生型群ごとに細胞をプールし、 各々を培地 5mLに懸濁 した。 細胞数を測定後、 2.5 X 105細胞/ゥエルとなるように 96ゥ-ル培養プレ 一トに細胞を播種した。 各ゥエルには培地のみ若しくは OVAを最終濃度 0.1 mg/mLとなるように加え、 C02濃度 5%、 37°C下で 90時間培養を行った。 培養 終了後、 培養プレートを 1，200 rpmで 5分間遠心し、 培養上清を新しいプレー トに回収した。 培養上清中の IFN- γ及び IL-4の濃度は、 OptEIA Set Mouse IFN- γ (BD Pharmingen) 及び OptEIA Set Mouse IL-4 (BD Pharmingen ) を用いて検出した。 発色は TMB基質液を用い、 反応停止後にマイクロプレ 一トリ一ダーを用いて 450 nmにて測定を行った。
その結果、 alum-OVA免疫時の脾臓細胞に OVA刺激を加えたと ころ、 syno+/_マウス群では低用量の OVA刺激下にて IL-4産生量が低下していた （図 6参照） 。
[実施例 7 ]
本実施例では、 syno+/-マウス脾臓細胞における IL-4.レセプターの発現を検 討.した。
DBA/1Jをバックグラウンドとした syno+/-マウス及び野生型マウス （雌： 9 〜16週齢， syno+/_： 3匹， 野生型： 3匹） から全血採血後に脾臓を摘出した。 脾臓細胞は、 スライ ドグラスを用いて臓器を細分化後、 スチールメッシュを通' 過したものを回収し、 赤血球を除去後に培地に懸濁したものを用意した。 I X 106/チユーブに調整した脾臓細胞に、 ブロ ッキング液と して抗マウス CD16/CD32抗体 （2.4G2) を加え、 4°Cにて 30分間インキュベートを行った後、 余分なブロッキング液を除去した。 そこに T細胞マーカーとして FITC標識抗 マウス TCR /3抗体 （H57-597 ) 、 PE標識抗マウス IL-4レセプタ一抗体 （ mIL4R-Ml) 、 及び B細胞マーカーとしてピオチン標識抗 CD45R抗体を 1 μ g ずつ加え、 4?Cにて 30分間インキュベートした。 染色バッファー （1%BSAを ' 含むリ ン酸バッファー） にて 2回洗浄後に、 ス トレプトアビディン： PerCP- Cy5.5 (BD) を 0.25 x g添カ卩し、 さらに 4°Cにて 30分間インキュベートした。 3' 回洗浄後に lmLの染色バッファーに懸濁したサンプルを、 FACSCaliburTM (BD) (解析ソフトウエア ： CellQuest™ (BD)) を用いて、 脾臓 T細胞及び脾臓 B細胞上に発現している IL-4レセプターの比率について解析を行った。
その結果、 脾臓細胞での IL-4レセプターの発現比率は、 syno+/-マウス細胞 と野生型マウスとの細胞間で差は認められなかった （図 7参照） 。
[実施例 8 ]
本実施例では、 IL-4産生に関わるレセプターである ICOSの発現について syno+/-マウス脾臓細胞を用いて検討した。 実施例 7に記載した方法で調整し た syno+/-マウス及び野生型マウスの脾臓細胞を用いて以下の実験を行った。 フローサイ トメ トリー用に調整した脾臓細胞 I X 106個に対し、 T細胞マーカ 一として FITC標識抗マウス TCR j3抗体 （H57-597) びピオチン標識抗マウ ス ICOS抗体 （7E.17G9) を l ^ gずつ加え、 4°Cにて 30分間インキュベー トし た。 染色バッファー （1%BSAを含むリン酸バッファー） にて 2回洗浄後に、 ストレプトアビディン PerCP-Cy5.5 (BD) を 0.25 // g添加し、 さらに 4°Cにて 30分間ィンキュベートした。 3回洗浄後に lmLの染色バッファーに懸濁したサ ンプルを、 FACSCalibur™ (BD) (解析ソフトウエア ： CellQuest™ (BD)) を 用いて、 脾臓 T細胞上に発現している ICOSの比率について解析を行った。
その結果、 脾臓 T細胞での ICOS発現比率は、 syno+/-マウス細胞と野生型マ ウスとの細胞間で差は認められなかった （図 8参照） 。
[実施例 9 ]
本実施例では、 脾臓細胞に IL-4刺激を加えた際の細胞増殖反応について検討 した。 '
syno+/_マウス及び野生型マウス（各雌 3匹)から脾臓細胞を採取し、 96ゥエル プレートに 5 X 105細胞/ゥエルとなるよう播種した。 リコンビナントマウス IL- 4 (PeproTech EC) を最終濃度 1 ng/mL及び 10 ng/mLの濃度で、 さらにポジ ティブコントロールとして LPSを最終濃度 l w g/mLとなるよう添加し、 24時間 37°C、 5%C02存在下にて培養を行い、 WST-8 (Dojindo) 20 Lを添加して 4 時間後にマイクロプレートリ一ダーを用いて 450 nmの波長にて測定を行った, その結果、 syno+/ -群と野生型群との間に有意な差は認められなかった （図 9参照） 。 産業上の利用可能性
本発明により、 シノビオリンの発現及び/又は機能を調節する物質が提供さ れる。 この物質は、 シノビォリンの発現及び/又は機能を調節することにより IL-4及び/又は IgEの産生を、調節 （抑制又は促進） することができるため、 産 生を抑制する場合はアレルギー性疾患の治療用医薬組成物として、 また、 産生 を促進する場合は感染症、 自己免疫疾患及び白血病の治療用医薬組成物として、 極めて有用なものである。

Claims

• 請 求 の 範 囲
1 . IL-4の産生及び Z又は IgEの産生を調節する物質を含む医薬組成物。
2 . IL-4の産生及び/又は IgEの産生調節物質が、 シノビォリンの発現及び Z 又は機能を阻害又は促進するものである、 請求項 1記載の医薬組成物。
3 . シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害する物質が、 シノビオリン又は シノビオリンをコ Γ"ドする遺伝子に対する低分子化合物、 ペプチド、 抗体、
.デコイ核酸、 アンチセンス核酸、 siRNA及び shRNAからなる群から選択さ れる少なく とも 1つである、 請求項 2記載の医薬組成物。
4 . シノビオリンをコードする遺伝子が、 配列番号 1に示される塩基配列を含 'むものである、 請求項 3記載の医薬組成物。
5 . siRNAが、 配列番号 1に示す塩基配列のうち一部の配列を標的とするも のである、 請求項 3記載の医薬組成物。
6 . IL-4の産生及び/又は IgEの産生を調節する物質を含む、 アレルギー性疾 患、 感染症、 自己免疫疾患又は白血病を予防及び/又は治療するための医 薬組成物。 '
7 . アレルギー性疾患が、 気管支喘息、 アレルギー性鼻炎、 アレルギー性結膜 炎、 ア トピー性皮膚炎、 アナフィラキシーショ ック、 ダニアレルギー疾患、 花粉症及び食物ァレルギ一疾患からなる群から選ばれる少なく とも 1つで ある、 請求項 6記載の医薬組成物。 ，
8 . 感染症が、 アメーバ症、 回虫症、 バべシァ症、 クリプトスポリジゥム症、 ジアルジァ症、 鉤虫症、 マラリア、 蟯虫症、 住血吸虫症、 条虫感染症、 ト キソカラ症、 トキソプラズマ症、 旋毛虫症、 鞭虫症、 疥癬、 ァニサキス症、 ェキノコックス症、 食品媒介寄生蠕虫症、 シラミ症、 幼虫移行症及びサル コィ ドーシスからなる群から選択される少なく とも 1つである、 請求項 6 記載の医薬組成物。
9 . 自己免疫疾患が、 関節リウマチ、 シェ一ダレン症候群、 全身性硬化症、 多 発性筋炎、 ギラン · バレー症候群、 特発性血小板減少性紫斑病、 自己免疫 性溶血性貧血、 水疱性類天疱瘡、 グレーヴス病， （バセドウ病） 、 橋本甲状 腺炎、 1型糖尿病、 全身性エリテマトーデス、 重症筋無力症、 天疱瘡、 悪 性貧血、 膠原病、 低 IgE血症及び無 γグロブリン血症からなる群から選択 される少なくとも 1つである、 請求項 6記載の医 組成物。 '
1 0 . 白血病が、 骨髄形成症、 多発性骨髄腫、 急性リンパ球性白血病、 急性骨 髄性白血病、 慢性リンパ球性白血及び慢性骨髄 ¾白血病からなる群から選 択される少なく とも 1つである、 請求項 6記載の医薬組成物。
1 1 . 請求項 1〜1 0のいずれか 1項に記載の医薬組成物を有効成分とする、 アレルギー性疾患、 感染症、 自己免疫疾患又は白血病の治療剤。
1 2 . 請求項 1〜 1 0のいずれか 1項に記載の医薬組成物又は請求項 1 1記載 の治療剤をアレルギー性疾患、 感染症、 自己免疫疾患又は白血病の患者に' 投与することを特徴とする、 アレルギー性疾患、 感染症、 自己免疫疾患又 は白血病の治療方法。
1 3 . シノビォリンの発現及び Ζ又は機能を調節する物質を含有する、 サイ ト 力イン類産生調節用の食品、 飲料又は飼料。
1 4 . シノビォリンの発現及び/又は機能を阻害する物質を含有する、 抗ァレ • ルギー用の食品、 飲料又は飼料。
1 5 . シノビォリ ンの発現及びノ又は機能を調節することを特徴とする、 IL-4 . 及び IgEの産生調節方法。
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