WO2007066799A1 - Ｐｌｋ１に作用する化合物の評価方法 - Google Patents

Abstract

β−カテニンがPLK1の基質であり、そのリン酸化部位が718番目のSerであることが明らかになった。すなわち、β−カテニン又はβ−カテニンの718番目のセリンを含むペプチドを基質として使用することにより、PLK1を創薬標的とした化合物の評価等（例えば、スクリーニング）を行うことが可能である。

Description

L に作用する化合物の 術 分 野

本 、 L を標的とした化合物の 法に関する。

L ( k n )は、細胞 期に関与するセリン・ オニン ナ ゼで 乳類では L ～ L の4 類が知られている。

リン 化することにより、 中心体の

2) 、 有糸分裂 の ( 3) 、 色分 の ( 4) 、 有 糸分裂の ( 5) 、 細胞質 ( 6) のような 期の進 行に重要な役割を果たして る。 また、 L との 連につ ても報告があり・ えば、 細胞 の 後との間に相関があるとの (

7) や、 上 との 連を示す ( 8) がある。 また、 H 胞に L を導入した場合には形質 換した表現 を示すことも知られて る ( 9

L 中心体の 、 有糸分裂 の 行、 色分 の 細胞質 との 係が明らかになるにつれ 有糸分裂 関与すると考えられる多くのタンパク ( えば p y n n p p「 ng p y 、 u ) が された。 また、 L 体をH L 胞に導入することにより中心体の 不全に陥ることや、 渉により L の 現を阻害することによりダンベル様 の チン 造が現れ、 色分 が完全に分離できなくなる。 すなわち、 L は期のあらゆる時期と場所でタンパタ質のリン 化を介して細胞 期の 行を調節 している。

方、 日 は、 、 カド リン、 アタシン、 ( n u p yp ) L 等 相互 用する多機能なタンパク質である。 これ タンパタ質は 一 の に位置するアル ジ ピ ト 相互 用し、 この 用によって8 が 下の2つの 理機能に重要な役割 を果たして る。 すなわち、 つは 接着 ( h r n jun t n) における 細胞 着の 立と 持であり、 もう つは、 ntによって 介される 性の 持である。 において 一 は の 胞質ドメイ ン チン 格と相互 用する 相互 用する。 って、 一 は、 接着 子及びアクチン 格とリンタして細胞 着と組織の 成を調節する。 、 rやF rのような シンキナ ゼの 性化は

のリン 化を通じて 部からの 離を誘導し、 細胞質 の の をもたらす。 ntシグナルにおいて、細胞質の レベルは厳密に調整 されている。 ntが存在しない条件下では、 一 はアクシン、

及び 相互 用する。 、 3 の r は によってリン 化され、 続 て r r hr が によってリン 化される。 これ らのリン 化により、 キチン プロテ ソ ム 路による の が引き起こされる。 また、 ntシグナルの 性化は 日の阻害を介して細胞質に おいてリン 化を受けて ない 定化を 。 リン 化を受けてい な は転写 子である L ファミリ 相互 用し、 y n や y のような 的遺伝子を誘導する。 また、 一 が 極性の の 立 において重要な役割を果たして ることが報告されて る( ０)

1 ０ 1

2 t

3 1 1

4 、 ０1

5 、 1

6 r t U

7 、 1

8 n r 4

9 h B phy un 3 1

０ h ０ ０ 明 の 示

しかしながら L 異性につ てはまだ不明な点が多く の 的とした セイ系の構 困難であるのが実情であった。

、 上記 術の する課題に みてなされたものであり、 を明らかにし、 を使用した化合物の 価を可能とすることを目的とする。

らは、上記 的を達成す く 究を重ねた結果、 3 が として機能 、 そのリン 化部位が 目の rであることを見出すとと もに、 ニン又は当 リン 化部位を含む を として使用するこ とにより、 的とした化合物の ( えば、 スクリ ニング) を行 うことが可能であることを見出し、 明を完成した。

すなわち、 明の 合物の 、 L に作用する化合物の 法であっ て、 L 、 ニン 合物の 応をさせる 、 応における 性と、 合物 存在 における L の 性とを 較する工程と、 を含むことを特徴とする。

また、 明の 合物の 、 L に作用する化合物の 法であって、 L 、 合物及び のセリン 7 を含み ア ノ 2～ 5０である の の 応をさせる工程と、 応における 性と、 合物 存在 における L の 性とを 較する工程と、 を含むことを特徴とする。

また、 明の 合物の 、 L 作用する化合物の 法であって、 L 、 合物 6又は7に記載のアミノ 列を有する の 応をさせる工程と 応における L の 性と、 合物 存在 における 性とを 較する工程と、を含むことを特徴と する。

また、 明の 合物の 、 L に作用する化合物の 法であって、 L び日一 が発現している細胞に被 合物を接触させる工程と、 のリン 化を検出する工程と、 リン 化のレベル 合物を 接触させなかった細胞における 一 のリン 化のレベルを 較する工程と、 含むことを特徴とする。

また、 明の は、 8 のセリン 7 を含 み アミノ 2～5０であることを特徴とする。

さらに、 明の L は、配列 6又は7に記載のアミノ 列を有する であることを特徴とする。 ここで 明の L

は 配列 6 7に記載のアミノ 列からなる であるこ とが好ましい。

らにより、 な基 として 一 が された。

を用いることにより、 L に作用する化合物の (スクリ ング等 が可能となる。 また、 の を として使用する ことによっても、 L に作用する化合物の 価が可能となる。 さらに、 一 ニ ン又はこの は として使用できることから、

介した細胞 情報伝達 究用のツ ルとしても利用 値がある。

面の 単な説明

( AS A) を用 たP のリン を検討した結 果を示す図である。

2 P の 異体を発現する細胞におけるpg０の 現を検討した結果を示す図 である。

[ 3 胞における同調の pg０の の 化との 係を検討した結果 を示す図である。

[ sR Aを導入してP の 現を抑制した細胞におけるpg０の を検討 した結果を示す図である。

5] 期の 態からP 又はpg０の 現が誘導される時間を 較した 果を示す図である。

[ 6] 5のP pg０の 討に使用した細胞の 期を分析した結果 を示す図である。

7] Pg０を ニン 体及び リン 体で検出した結果を示す図であ る。 [ P K 一 の 用の 無を検証した結果を示す図である。

[ P と3 の 用の 無を検証した結果を示す図である。

[ 0 P が を直接リン 化していることを検証した結果を示す 図である。

L が細胞 で日 を直接リン 化して ることを検証した結 果を示す図である。

2 L による 一 のリン 化部位を同 するために調製した 異 体を示す図である。

3 2に示す 異体を用 て L のリン 化を検出した結果を示す図であ 。

4 リン ( F 体を用いて L によってリン 化される 一 の 位を検証した結果を示す図である。

5 L が細胞 で の r をリン 化して ることを検証 した結果を示す図である。 明を実施するための 良の

下、 本 明の 適な実施 態について詳細に説明する。

、 明にかかる用語について説明する。

明にかかる遺伝子は、 P ヒトの 合、 Accesso o _００5０3０ 2 である。 P 伝子の 来となる生物種は特に限定されず、 例 えば ヒト、 サル、 ウス、 ラット、 イヌ又はウサギが挙げられる。 中でも、 評価 される化合物の 象が であることからヒト 伝子であることが好ましい。 また、 明に係る前記の 伝子には、 伝子と同等の 理機能を有するも のであれば 又は2 上の塩基の 換、 欠 、 付加 入がある遺伝子も含まれ 。 ここで、 伝子としては、 P タンパタ質をコ ドする遺伝子であれば その 列は特に制限されな が、相同性が5０ 上であることが好ましく、 7０ 上であることがより好ましく、 8０ 上であることがさらに好ましく、 9０

9 92 93 94 95 96 97 98 99 ) であることが特に好まし 。 また、 明に係る前記の 伝子には、 伝子とストリンジ ン な条件下 で イブリ する核酸を含む 伝子も含まれる。 ここで、 明において ス トリンジ ン な条件でハイブリ する とは、 二つの 片が oec a Co g A abo ao a a 2 、コ ルドスプ ング ( 989)9479・62 45 6 に記載された イブリダイゼ ション 件下で、 相互に イブリ することを意味する。 より具体的には、 例えば、 45 にて6・ X SCで イブリダイゼ ションを行った後に、 5０C 2・ xSSCで する条件 が挙げられる。 ストリンジ ンシ 択のため、 洗浄 程における 度を、 例え ば ストリンジ ンシ としての 2・ xSSC 5０Cから、 ストリンジ ンシ と しての ０・ SSC 5０でまで選択することができる。 さらに、 洗浄 程の 度を 低ストリンジェンシ 件の 、 22Cから、 ストリンジ ンシ 件の 65 まで上昇させることができる。

また、 明に係るP 伝子の 物であるタンパク質には、 P タン パタ と同等の 理機能を有するものであれば 又は2 上の塩基の 換、 欠 、 入があるものも含まれる。 ここで、 このようなタンパク質の配列は特に 制限されないが、 相同性が5０ 上であることが好ましく、 7０ 上であるこ とがより好ましく、 8０ 上であることがさらに好ましく、 9０ 上 ( えば、 9 92 93 94 95 96 97 98 99 ) であることが特 に好まし 。

また、 明にかかるj ニン (Access o o ００ 9０4 3 4) についても、 遺伝子の 来となる生物種は特に限定されず、 例えば、 ヒト、 サル ウス ラット、 イヌ又はウサギが挙げられる。 中でも 評価される化合物 の 象が であることからヒト 伝子であることが好まし 。

また、 明に係る 一 ニン 伝子には、 伝子と同等の 理機能を有 するものであれば 又は2 上の塩基の 換、 欠 、 付加 入がある遺伝子も 含まれる。 ここで 伝子としては、 かかるタンパタ質をコ ドする遺伝子で あればその 列は特に制限されないが、相同性が5０ 上であることが好ましく、 7０ 上であることがより好ましく、 8０ 上であることがさらに好ましく、 9０ 9 92 93 94 95 96 97 98 99 ) であることが特に好まし 。

また、 明に係る日 ニン 伝子には、 伝子とストリンジ ン な 条件下で イブリ する核酸を含む 伝子も含まれる。

さらに、 明に係る前記の 伝子の 物である ンタンパク質に は、 タンパク と同等の 理機能を有するものであれば 又は2 上の塩基の 換、 欠 、 付加 入があるものも含まれる。 ここで、 タンパク質の配 は特に制限されな が、 相同性が5０ 上であることが好ましく、 7０ 上で あることがより好ましく、 8０ 上であることがさらに好ましく、 9０ 上 ( えば 9 92 93 94 95 96 97 98 99 であるこ とが特に好まし 。

明において、 3 は、 P の として されており、 7 8 目のセリンがP によってリン 化されることを らは見出している。 す なわち、 7 8 目のセリンを含む０ の であればP の として利用することができる。 このような のアミノ 数は特に制限され 、 所望のアミノ を選択することができるが 2アミノ えば、 2～ 5０、 2～3０、 2～2０又は2～ 2) であることが好ましく、 5アミノ 上 ( えば、 5～5０、 5～3０、 5～2０ 5～ 2) であることがより好まし く、 ０アミノ えば、 ０～5０ ～3０ ～2０又は ０～ 2) であることがさらに好まし 。

また、 明にかかる 合物 は、 P を の りとする分子であれ ばその 類は特に制限はなく、 具体的には、 例えば、 天然 合物、 有機化合物、 無 機化合物、 タンパク 、 ペプ 等の単 化合物、 並びに、 化合物ライブラリ 、 遺伝子ライブラリ の 物、 細胞 出物、 細胞 上 発酵 生物産生物、 海洋 出物、 植物 出物、 原 出物、 真 細胞 出物 しくは動物 出物 挙げることができる。 必要に応じて 識して ることができる。 識としては、 例えば、 放射 識、 蛍光 挙げることがで きる。 また、 上記 料に加えて、 これらの 料を 合した 合物も 含まれる。

物の 明の 合物の 法の の 、 P に作用する化合物の 法 であって、 P 、 ニン 合物の 応をさせる工程 と、 応におけるP の 性と、 合物 存在 におけるP の 性とを 較する 、 を含むことを特徴とする。

、 P 、 日一 ニン 合物の 応をさせる。 は を としたP のリン 化反応である。 かかるリン 化反 応の 件としては 反応が進行する条件であれば特に制限はなく、 リン 化反 応の 件として当業者に周知の 件で行うことができるが、 具体的には、 例えば、 としてリン 、 トリス 使用し、 p を 6・０～8・０、 好ま しくは7・０～8・0に調整し、 温度を25～ 。

45C、 好ましくは3０～4０Cに設定し 反応 を進行させればよ 。 また、 反応 中には、 必要に応じて gC 、 メルカプト タノ ル、 GTA等を添加することができ、 これらの 度も適 適な値を選択 すればよ 。 間につ ても 定すればよ が、 例えば、 ０～6０ 間、 好 まし は 2０～4０ 間、 反応を行えばよ 。 また、 リン 化反応の として 中にATPを含むことが必要である。 ATPは検出 能な状態に 識しておくこと によりリン 化反応の 行を容易に検出することが可能となる。 このような 識と して、 例えば、 [ 33 ]ATP [ PATP、 ビオチン又は蛍 素が挙げられる。 射性同位体 識した場合には、 一 に取り込まれた 識をオ トラジオ グラフィ シンチレ ションカウンタ で検出することによりリン 化反応の 出及び 量が可能となる。 また、 ビオチン 識を利用する場合には、 アビジ を使 用した検出 段を採ることにより、 放射性同位体を使用せずにリン 化反応の 量が可能となる。

次に、 応におけるP の 性と、 合物 存在 におけるP の 性とを 較する。

合物がP の 応を阻害する機能を有する場合には、 かかる 較に より 合物 におけるP の 性が相対的に低くなる。 合物 の 性が有意に低 場合には、 合物はP 害活性を有 すると判断できる。 方、 当 性が有意に高 場合には、 合物は P 性を増強する活性を有すると判断できる。 明の 合物の 法の 2の 、 P に作用する化合物の 法 であって、 P 、 合物及び のセリン 7 8を含み アミノ 2～5０である の 応をさせる 程を含む。

ここで、 前記 に代えて、 配列 6又は7に記載のアミノ 列を有す を用いてもよ 。

、 P 、 ペプ 合物の 応をさせる。

日一 のセリン 7 8を含む を としたP のリン 化反応 である。 かかるリン 化反応の 件としては、 反応が進行する条件であれば特 に制限はなく、 リン 化反応の 件として当業者に周知の 件で行うことができる が、 具体的には、 例えば、 としてリン 、 トリス 使用 し、 を6・０～8・0、 好ましくは7・０～8・０に調整し、 温度を25～45 、 好ましくは 3０～4０ に設定し、 反応を進行させればよ 。 また、 反応 中には、 必要に応じて gC 、 メルカプト タノ ル、 EGTA等を添加することができ、 これらの 度も適 適な値を選択すればよ 。 間についても 定すればよ が、 えば、 ０～6０ 間、 好まし は2０～4０ 間、 反応を行えばよい。 また、 リン 化反応の として 溶液中にATPを含むことが必要である。 ATPは検出 能な 状態に 識しておくことによりリン 化反応の 行を容易に検出することが可能と なる。 このような 識として、 例えば、 P]ATP、 ビオチン又は 蛍 素が挙げられる。 射性同位体 識した場合には、 である に 込まれた 識をオ トラジオグラフィ シンチレ ションカウンタ で検出す ることによりリン 化反応の 出及び 量が可能となる。 また、 ビオチン 識を利 用する場合には、 アビジ を使用した検出 段を採ることにより、 放射性同位体を 使用せずにリン 化反応の 出及び 量が可能となる。

次に、 応における P の 性と、 合物 存在 における P の 性とを 較する。

合物がP の 応を阻害する機能を有する場合には、 かかる 較に より 合物 におけるP の 性が相対 に低くなる。 合物 の 性が有意に低 場合には、 合物はP 害活性を有 すると判断できる。 方、 当 性が有意に高い場合には、 合物 P 性を増強する活性を有すると判断できる。

明の 合物の 法の 3の 、 P に作用する化合物の 法 であって、 P び日 が発現している細胞に被 合物を接触させる 工程と、 のリン 化を検出する工程と、 リン 化のレベル

物を接触させなかった細胞における 一 のリン 化のレベルを 較する とを含む。

P が発現している細胞に被 合物を接触させる。 P K び日一 が発現している細胞としては、 P び

が発現していればその 限定されず、 生体 来の であってもよく、 イン された試験用の であってもよい。 また、 P ０ を細胞 学的に強制発現させた細胞であってもよ 。 P を細胞 学 的に強制発現させる方法としては、 当業者に公 の 法を用 ればよ が、 具体的 には、 例えば、 P びに ニン 伝子 はその 部からなる核酸をそれ ぞれ 適なプロモ タ レメントを含む ベクタ にクローニン 、 タロ ニングされた核酸を有するべクタ を 胞に導入することにより 調製する。 ここで、 前記ベクタ としては、 発現ベクタ として利用 能なもので あれば特に限定されな が、例えば、pC VTag pcD A3・ 、pB eBac s2 PC eo pcD A、 P C eo PXT SG5 PE V5 sB PCR2 pET g 又はpCR3・ が挙げられる。

次に、 前記 伝子 はその 部からなる核酸が導入された発現ベクタ を 胞に導入する。 かかる宿主 としては、 遺伝子の 現に通常 用されるものであ れば特に限定されず、 動物 、 、 植物 、 微生物のいずれであっても よく、 具体的には、 例えば C S C S7 C O 3T3 293 Ra CV C 27 RC 5 CPAE e a 293T又はS偲が挙げられる。 また、 発現 タタ を 胞に導入する方法としては、 の 法であれば特に限定されないが、 具 体的には、 例えば、 エレク トロポレ ション リン カルシウム 、 DEAE キス トラン 、 リポ ション 遺伝子 が挙げられる。 また、 入した遺伝子 の 一過性 ( a s e の 現であってもよく、安定的 s abe) 発現であっ てもよい。 上に述 た方法により、 P が発現した細胞を得 ることができる。

次に、 上述した細胞に被 合物を接触させる。

させる方法としては特に制限はなく、 当業者に周知の 法によって行えばよ が、 具体的には、 例えば、 細胞の 養液 しくは緩衝 出液に 合物を添加すること 液中での 触を挙げることができる。 の 件とし ても特に制限はなく、 の 度及び 、 接触 の 条件につ て好適な条 件を選択することができる。

次に、 程の 合物との 触によって生じた 一 のリン 化を検出する。

P は、 リン 化反応の として細胞 ATPを利用して をリ ン 化する。 工程にお ては、 かかるリン 化を検出すればよ 。 出の 法と しては特に限定されず の 法により検出すればよいが、 具体的には、 例えば、 リン 化反応をさせた後の3 を ニン 体で 降させ、 得 られた のリン 化を リン 体で確認する方法が挙げられる。 次に、 程で検出された のリン 化のレベル 、 合物を接 触させなかった細胞における 一 のリン 化のレベルを 較する。 すなわ ち、 合物を作用させた細胞におけるP の 性をコントロ ル 比較をし、 活性の 認定する。

合物がP の 応を阻害する機能を有する場合には、 かかる 較に より 合物 における P の 性がコントロ ル 比較して低くな る。すなわち 合物はP として機能すると判断できる。 方、 当 性が有意に高 場合には、 合物はP 性を増強する活性 を有すると判断できる。

( 2 ) 物の 法によって得られた化合物

述した 明の 合物の 法の ～ 3の 様によって多数の 合物を 評価することにより、 P としての 能を有する化合物をスクリ

、 得ることができる。 こうして得られた化合物も本 明に含まれる。

このような 合物としては、 その 状は特に制限はなく、 例えば、 天然 合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパタ 、 ペプ 等の単 化合物、 抗体、 アンチセ ンス、 s R A又は が挙げられる。

明の 合物の 法で得られた化合物を 他の動物の 薬として使用 する場合には、 これらの 体を直接 者に投与する以外に、 の 的方 法により製剤 して投与を行うことも可能である。 えば、 必要に応じて糖衣を施 した 剤 カプセル エリキシ 、 イクロカプセル として経口 、 ある いは水もしくはそれ以外の 学的に 得る との 、 又は懸 剤の 剤の形で非 に使用できる。 えば、 薬理学上 容される しくは 体、 具体的には、 や生理 塩水、 植物 、 乳化剤、 懸濁 、 、 安 定 香味 、 、 クル、 防腐剤、 結合剤 み合わせて、 一般に められた製薬 施に要求される単位 態で混 することによって製 する ことが考えられる。

剤、 カプセル剤に混 することができる としては、 例えば、 ゼラチン、 コ ンスターチ、 トラガントガム、 アラビア のような結合剤 結晶 セルロ スのような 、 コ ンスタ チ、 ゼラチン、 アルギン酸のような 剤、 ステ アリン グネシウムのような 滑剤、 ショ 、 サッカリンのような甘味 、 ペパ ミント、 アカモノ チ リ のような が用 られる。

態がカプセルである場合には、 上記の 料にさらに のような を含 有することができる。 射のための 注射 のようなべ を 用 て通常の 施に従って処方することができる。

の 溶液としては、 例えば 塩水、 ブドウ やその他の補 を含む 、 例えばDソル ト ル D ンノ ス、 D ン トール、 塩化ナトリウム が挙げられ、 適当な溶解 、 例えばアルコ ル、 具体的には タノ ル・ ポリ アルコ ル、 例えばプロピレングリコ ル、 ポリエチレングリコ ル、 イオン 、 例えば ルベ ト 8０ (T C 5０ 併用してもよ 。 としてはゴマ 、大豆油があげられ、 として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコ ル 併用してもよ 。 また、 例えばリン 、 ナトリウム 、 無痛 剤、 例えば、 塩酸プロカイン、 安定 、 例えば ルアルコ ル、 フ ノ ル、 酸化 合してもよ 。 された注射 通 常、 適当なアンプルに充填させる。 者 の 、 例えば、 動脈 、 静脈 、 皮下 射などのほか 的、 経 管支 、 筋 的、 経 、 または経口 に当業者に公 の 法により行 うる。 、 患者の 年齢、 投与 法などにより変動するが、 当業者で あれば 当な投与 を適 択することが可能である。 また、 合物が D A によりコ ドされうるものであれば、 D Aを 伝子治療 ベクタ に 、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 、 投与 、 患者の 年齢、 状などにより変動するが、 当業者であれば 択することが可能である。

合物の 、 状により はあるが、経口投与の 合、 般的に成人 ( 6０ gとして にお ては、 あたり ０・ から g、 好ましくは ・０ 5０ g、 より好ましくは ・０から 2０ 9であると考えられる。

に投与する場合は、 その 回の投 投与 、 器、 、 法によっても異なるが、 例えば 剤の形では通常 ( 6０k として) においては、 通常、 当り約０・０ から 3０ g、 好ましくは ０・ から 2０ g、 よ り好ましくは ０・ から 9 度を により投与するのが好都合であると えられる。

明に係る化合物の 果が期待される好適な 病の 例として 挙げ られ、 例えば の 形がん等が挙げられる。 ヒトの 形がんとしては、 例えば、 脳がん、 がん、 食道がん、 甲状腺がん、 小細胞がん、 細胞がん、 乳がん、 胃がん、 胆のう・ がん、 肝がん、 膵がん、 結腸がん、 直腸がん、 がん、 上皮がん、 子宮 がん、 子宮 がん、 ・ 管がん、 がん 前立腺がん、 陰茎がん、 丸がん、 がん、 ウイルムスがん、 皮膚がん、 悪性 、 神経 、 骨肉腫、 イング 、 アルツ イ 、 パ キンソン の 患などが挙げられる。

(3) P

明のP を としてP の 性を測定することが できる。 明のP は、 一 のセリン 7 8を含 み、 なくとも2ア ノ酸を有する の である。 ここ で、 アミノ 、 P 性を測定できれば特に制限はな が、 具体的には、 例 えば、 2アミノ えば、 2～5０、 2～3０ 2～2０又は2～ 2 で あることが好ましく、 5アミノ 上 ( えば、 5～5０、 5～3０、 5～2 5～ 2)であることがより好ましく、 ０ア ノ えば、 ０～50 ０～3０ ～2０又は ０～ 2) であることがさらに好ましい。

また 明のP には、 配列 5～7のいずれか に記載のアミノ 列を有する も含まれる。 これらの は、 Cdc25C の部 ( 5) びその 異体 ( 6 AS A 7) であり、 いずれも P によってリン 化されるセリン を有する。 は野生 Cdc25Cの部 5) 比較して アミノ 、 AS Aは同じく 3ア ノ する。 かかる相違により、 P によって受ける 化の 受性が上昇することを、 らは確認して る。

明のP を として使用することにより、 P の 定が可能となり、 P に作用する化合物の 価が可能となる。 また、 を基礎研究 的に使用することも可能であり、 例えば、 P を介した細 胞 情報伝達のメカニズムの 析に有用なツ ルとして使用することができる。 下 実施 に基づいて 明をより具体的に説明するが、 、 以下の に限定されるものではない。

養及び同調 )

2 S ( ) 、 293T (ヒト 、 e aS3 ( ) 、 CT 6 大腸癌) C3A )はD E D becco Smodfed Ea e S ed ) を用いて培養した。 また、 SE ( ) 562 血病) は RP を用いて培養した。 D E RP には ０ BS s ペニシリン ００ ストレプト イシンを して使用した。 G S 期にて同調させるために、 CT 6 胞を 2

doxy ea) 6 養し、 続 て通常の 地に交換した。 また、 期にて同調させるために、 2 S (2００ g 26 )、293T (4００ g 、 )、 e aS3 g 、 8 CT 6 (2００ g 8 SE (2００ g 、 24 )、 562 (2００ 、 2０ ) C3A (2００ g 、 24 )につ てそれぞれ の 度及び 間で ゾ ル ( ocodaz e) 理を行った。 プロテ ソ ムの 害のため2０4 G 32を添加 した。

( 体及び )

験には下記の 体及び 薬を使用した。 すなわち、 P (アップ イトバイオテクノロジ )、日一アタチン( グ )、 リン Se RX(Y )XS モチ フ セルシグナリングテクノロジ ) 、 ニン ( D ランスダクションラボラトリ ズ ) 、 リン Se 33Se 37T 4 ニ ン (セルシグナリングテ ノロジ ) 、 L G ( グ ) 、 c (サンタクルツバイオテクノロジ ) G 32 カルビオケム であ 。

リン 体のスクリ ング

C 2 のS 98を含む オチン されたCdc25Cの部 を合成した。 成した の 以下のとおりである。

( r1 8 L F L

F EL F F F L F

(2０ T s C (p 74、 gC EGTA０5 DTT 5 ATP)中で合成した 5 を P と25Cで5 インキ ベ ト 化反応を進行させた。 応が終了したリン 反応させ て リン をそれぞれDE AS e avd coa edPa e パー キンエル ) の なるウ ルに入れた。 それぞれのウ ルに対し、 セリン・ オニン ナ ゼ スタリーニングキット (セルシグナリングテクノロジ 中の87 類の リン 体のうちの 類を加え、その 、二次 体としてE ウサギ gG はE ウス gG パ キンエル ) を添加した。 次に、 DE FA (パ キンエル ) を添加し、蛍光 度をARVOSX (パ キンエル ) によって 定した。

シグナル ノイズ (S R) は、 リン を使ったウ ルより得られた ングナルを リン を使用したウ ルより得られたシグナルで割った である。

(プラス トランスフェクション)

P 伝子をPCRで増幅した後、 C VTag2 クタ (ストラタジ ン ) にクロ ニングした。 Q ckC a ge S ed ec ed age essk (ストラタジ ン を用 てP の82 目の を オニンに、 2 目の オニンを アスパラギン酸に置換することにより、 P の asedead o K ) と ac ve TD) を構築した。 また、 一 は a Ova a a o Ready cD ABDバイオサイエンス 用いて PCR により増幅し、 C VTag3 GEX6P クタ (ア )にクロ した。 GEX ニン S33AS7 5A S7 8A S72 AをQ ckC a ge S ed ec ed age es sk を用 て構築した後、 C V ニン S33A S7 8Aを構築した。

の 異体である ンデルタ (A ) 、 デルタ 2 A 2 デル タ 3 A 3) を調製するため Ba EcoR EcoR Sa Ba X o の 片をpGEX6Pに導入した。 その 、 クロ されたサンプルの を確認、した。

異体を細胞に一過性に発現させるため、 6 プレ トに 養した 293T 胞に 調製した発現ベクタ を GE E6 a s c o eage を用いて 入し、 48 インキ ベ ト、 又は一昼夜 2０は G 32を加え 7 インキ ベ ト 。

P WT TD を発現 能な 2 S 胞を調製するため、 これら の 伝子を TRE2 yg ロンテツク ) にタロ ニング 、 F GE E6を用 て 2 STe O (クロンテツク )に導入した後、 イグロ イシン(h o c を用 てクロ ンを選択した。 また、 ドキ サイクリン (dox yc e) ０25 2・０ を用いてP の 導を行った。

(sR A)

下の2つのP SR Aを合成した。

P SR Ag０9 5 G C AC C GGC A dTdT ( 6 P SR A 3 9 5 CACGCC CA CC C ACAAdTdT3 7 次に、 O goec a e ge (インビトロジ ン )を用いて 4０ のこれら sR Asを 2 S 胞に導入した。 24 間後 2００ g ゾ ルを用いて25 理した。

( 出液の 、 免疫 降及び ブロッティング)

EBC ys sb e (5０ T s C (p 8０ 2０ aC、０5 P4０を用 て、 出液を調製した。 溶化 の 製のため・ 胞を o o cb㎡

T s C (p 75、 ・5 C ０ C)に懸濁 、 凍結 解を3 行った 後、 9に 間遠心 離を行った。 られた 可溶化 として使用 した。 用する全ての には osp a ase b o Coc a グ ) o ease b o CockaN ライ 添加した。 、 細胞 出液を 。

9の 体と 4Cで 2 インキ ベ ト 、 続いて P o e G又は A aga ose beads( グ )と4 インキ ベ トした。 ビ ズを洗浄した後、 沈降 SDSPAGEにて展開した。

また、 ブロッティン は、次のように行った。すなわち、サンプルをSDSPAGE にて展開し、 展開後の を ob o P e b a e 転写した後、 メンブレンを 体と反応させた。 その 、 o se ads Pe oxdas co ga ed seco daya bod (ア ) 反応させ、 ECU(ア )を用いて検出し た。

GST ルダウン)

グルタチオンセファロ スビ ズ(ア )に結合させたGST

を293T 出液と で2 インキ ベ トした。その ビ ズをEBC s s b で ブロッティン により 析した。

( V o aseassay

オチン された をリン 化するため、 5 ATP 5 C

を含む ナ ゼ 2０ T s C p 74 gC 05d o e o e EGTA)中で当 を P と 3０ で イ ンキ ベ トした。 リン 化反応は 3P 4を反応 添加することにより 止させ た。 のぺ をSA 2bo Ca e e b a e(プロ )を用 て回 収し、 シンチレ ションカウンタ で放射 性を測定した。

のリン 化のために、 ナ ゼ 中で、グルタチオンセファロ スビ ズに結合させたGST 6 を P と3０ で インキ ベ トした。リン 化反応はSDSサンプル を添加することにより 止させた。 られたサンプルは SDSPAGEにて展開し、 オ トラジオグラフィ

ティン により 析した。

製及び A D TO S S)

ゾ ル 理した T 6 胞の 23 9の タンパタ質を o a abb gG グ ) P o e A aga ose bead で レクリア 、 その 、 抗 osp o(Se RX(Y XS mo 体及びP o e A a a ose beadsで 降を 行った。 ビ ズを洗浄 SDSPAGEにて展開した後、 S ve Q es ( トロジ ン を用 て 色し、 g０kDa のタンパタ質を切り出した後、 トリ プシン 理を行った。 トリプシン 理によって生じた を A D O S Sアプライドバイオシステム )にかけ、 スコットサ チを用いてデ タの 行った。

(P 性に依存してリン 化が見られるg０ Daタンパク )

P の たな を見出すため、 P によってリン 化を受ける を 認識する 体が P の たな と交差 (c oss eac ) するとの 定の 、 下記の 験を行った。

ヒト Cdc25CはP によってその 8 目のセリン (Se 98) がリン 化 される。 P のリン 化の 象となるモチ フはDEXST XDE X のアミノ 、 アミノ であることから、 はCdc25CSe 98 辺の アミノ酸を置換した D AS A を合成した。

に示すとおり、 WT (Cdc25CSe 98) 比較して、 P によっ て は2 、AS A は 99倍のリン 化を受けることが確認 できた。 次に、 87種の抗体からリン 化された AS A を認識する 体を 択した。

択した 体がP によってリン 化されたタンパク と反応するかどうかを P T、 TDを導入、 発現した 2 S 胞を用 て確認したところ、 2に示すように、 リン (Se ) RXY )XS 体がTDを導入した細胞で非常に 強く g０ Daのリン タンパタ pg０)を検出した。 これと同じ 、 293T 用 た試験でも確認できた。 また、 P の 性に依存してTD>WT> の順に g０のリン 化が減少していることが確認できた。

(p9０は有糸分裂 リン 化される)

P は主にG2/ 期に機能することから、pg０は ZP の として 化を受けると仮定し、下記の 験を行った。 2 S 293T e aS3 T 6 3A SEK 562の 7つの 胞を ゾ ル 理して同調させ、 細胞 出 液を リン RX(Y )XS 体を用 て ブロッティン に供した。

3に示すとおり 細胞 期が同調している細胞では同調して な 比較 してpg０が強く リン 化されていることが確認できた。 また、 P を強制発現さ せた 2 S 293T 胞にお ても同じ 向が見られた。

次に pg０が内在 P K の 流に位置してリン 化を受けて ることを確認 するため、 sR Aを用いてP の 現を抑制した細胞を用いて 験を行った。す なわち、 P な sR A タランブル sR A ネガティブコントロ ル) を 2 Sに導入し、 続いて ゾ ル 理を行った。 pg０ P の レベルは ティン により確認した。

4に示すとおり、 P な sR Aを導入した細胞では内在 P の 現が顕著に低下し、 それに比例してpg０リン 化も 著に低下した。

g０のリン 化が ゾ ル P の 制発現によるストレスによって生じ て る可能性を否定するため、 イド で細胞の 態を解除するこ とにより同調させた T 6 胞におけるpg０を分析した。

5 6に示すとおり 9０のリン 停止 8～9 間でピ タに達し、 多くの 期にあり P の 現がピ クに達する時間と一致し た。 これらの 果から、 いずれの 胞にお ても、 pg０はP に直接 P の 流でリン 化されることが確認された。

( g０は テニ である)

pg０が新たなP の であることが明らかとなったため、 次に、 pg０の を行った。 リン RX(YF)XS 体が g０を免疫 降させることができること が明らかとなったため、 CT 6 胞を用 て g０の 製を行った。 pg０は、 ゾ ル 理した T 6 胞を免疫 降しSD AGEにて分離した。SDSPAGE から り出したバンドは 色をした後、 トリプシン 理した。 られたサ ンプルを AA D TOF Sにより分析し、 さらに、 AA D TOF Sから られた を a de S A D TOF S S) Zより分析した。 マスコットデ タ ベ スを検索したところ、 pg０は日一 であることが明らかとなった。

また、 ゾ ル 理した CT 6 出液を リン RX(YF)XS

ニン 体で 降したところ、 リン RX(Y )XS 体による に 一 が含まれており、 の 体による pg０ が含まれていた。 この 果を図7に示す。 この 果から、 pg０が日一 であ り、 期にリン 化を受けることが確認できた。

(j はP に直接リン 化される

がP の であり、 B P とが物理的に相互 用しているか否かを検討した。 8に示すとおり、GST aggedB は、293T 胞にお て強制発現した GP を共沈させた。 方、 図9に示すとおり、 L GP は、293T 胞において 共沈した。この 果から、P が日 相互 用していることが確認できた。

次に、 P が日一 をリン 化するか否かにつ て検討した。 GST を 33 ATP で組 P インキ ベ ト 、 SDSPAGE により 開した後、オ トラジオグラフィにて解析した。 ０に示すとおり、GST はP に用量 リン 化されていることが確認できた。 さら に、 リン RX(Y XS 体により、 P によってリン 化を受けたGST を検出した。 これは、 リン RX(Y XS 体が におけ る P Zよってリン 化を受ける部位を認識して ることを示している。

次に、 細胞 で 一 がP K によってリン 化されているか否かについ て検討を行った。 、 yc TD又は Dを含むブラス を293T 胞に 過性に発現させ、 yc 体の リン RX(YF)XS 体 を用いた ティン により 析した。 に示すとおり、 より TD の 合により強いリン 化のバンドが観察された。 すなわち、 P は oに おいても細胞 にお ても をリン 化することができることが明らか となった。 (P ０ のSe 7 8をリン 化する)

にお てP によってリン 化を受ける部分を同 するため、 下 記の 験を行った。 、 2に示した、 GST を付加したA ( 423aa・、 A 2(42378 aa) 3( g０a・a・)の、三つの を調製した。 これらの を基 としてインビ ナ ゼ により P によるリン 化反応を行い、 リン RXYF)XS 体を用いた ブロッティング ( P)ATPの り込 みを確認することにより分析を行った。

3に示すとおり P は全ての リン 化した 方、 抗リン RX(Y )XS A 2のみを検出した。すなわち、 抗体によって認識されるP リン 化部位は日一 のC に存在することが確認された。

次に、 リン 化部位を同 するため、 A 2のセリンをアラニンに置換した GST

S7 5A S7 8A S72 Aの つの 異体を準備した。 これら の 異体と組 P を用 てインビ ナ ゼ を行い、 リン RXY XS 体を用いた ブロッティング ( P)ATPの り込みを確認 することにより分析を行った。

4に示すとおり GST ニンA2 S7 8A 異体を用いた場合のみ、 WT 比較してリン 化が減少した。すなわち リン RX(Y )XS

のSe 7 8をリン 化を検出して ることが確認された。

次に、 細胞 にお て、 P がSe 7 8で生じるリン 化に関与していること を確認するため、 下記の 験を行った。 、 c j ニン WT又はS7 8A をP WT TD と共に293T 胞に導入し 得られた形質 換体の 出液を c 体で 降した後、 抗リン RX(Y )XS 体を用いて ブロッティン を行った。

5に示すとおり、 リン RXY )XS P TDによって リン 化された日一 ニン WTを検出した。 方、 S7 8Aの 異体ではバンド は見られなかった。 すなわち、 P はインビ にお て日一 のSe 7 8をリン 化し、 リン RX(Y )XS のSe 7 8 を検出して ることが確認された。 上の利用 能性

上 明したよ に、 P の な基 として日一 が された。 P び日一 を用いることにより、 P に作用する化合物の (ス タリ ニング等) が可能となる。 また、 一 の を として 用することによっても、P に作用する化合物の 価が可能となる。すなわち、 明により、 P を 的としたスクリ ニングが可能となり、 P が関 与する えば、 ) の 療薬・ の 発が可能となる。

さらに、 はこの はP の として使用できること から、 P やP を介した細胞 情報伝達 究用のツ ルとしても利用 値が ある。

Claims

求 の

( ) L に作用する化合物の 法であって、

L 、 日 ニン 合物の 応をさせる工程と、

応における 性と、 合物 存在 における L 性とを 較する工程と、 を含む、 化合物の 。

(2) L に作用する化合物の 法であって、

L 合物及び０ のセリン 7 を含み アミノ 2 ～5０である の の 応をさせる工程と、 応における L の 性と、 合物 存在 における L の 性とを 較する工程と、 を含む、 化合物の 。

(3) L に作用する化合物の 法であって、

L 、 合物及び 6又は7に記載のアミノ 列を有する の 応をさせる工程と、

応における L の 性と、 合物 存在 における L 性とを 較する工程と、 を含む、 化合物の 。

4 L に作用する化合物の 法であって、

L が発現して る細胞に被 合物を接触させる 、 のリン 化を検出する工程と、

リン 化のレベル 合物を接触させなかった細胞における

のリン 化のレベルを する工程と、 を含む、 化合物の 。

(5 合物が である、 請求 ～4のいずれか に記載の 合 物の 。

(6) のセリン 7 を含み アミノ 2～5０である、 。

(7 6又は7に記載のアミノ 列を有する である、 L

。

(8) 6又は7に記載のアミノ 列からなる である、 L