WO2007042553A1 - Verfahren zur detektion von konturen in bildern biologischer zellen - Google Patents

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WO2007042553A1
WO2007042553A1 PCT/EP2006/067332 EP2006067332W WO2007042553A1 WO 2007042553 A1 WO2007042553 A1 WO 2007042553A1 EP 2006067332 W EP2006067332 W EP 2006067332W WO 2007042553 A1 WO2007042553 A1 WO 2007042553A1
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cell
line segments
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membrane
cells
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PCT/EP2006/067332
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French (fr)
Inventor
Fritz Jetzek
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Evotec Technologies Gmbh
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1429—Signal processing
    • G01N15/1433—Signal processing using image recognition

Definitions

  • the segmentation problem is complex because cells have a very heterogeneous morphology that is difficult to model. Furthermore, difficulties arise through occlusion as well as by cases of coalesced neighboring cells, the connecting area of which can hardly be clearly assigned.
  • Threshold methods are particularly suitable for detecting nuclei (Härder, Nathalie, Neumann, Beate, Held, Michael, Liebel, Urban, Erfle, Holger, Ellenberg, Jan, EiIs, Roland, Rohr, Karl: Automated Analysis of Mitotic Phenotypes in Fluorescence Microscopy Images of Human Cells, In: Schmyak für der Kunststoff 2006, 2006, pp. 374-378) (Härder, Nathalie, Neumann, Beate, Held, Michael; Liebel, Urban; Erfle, Holger; Ellenberg, Jan; EiIs, Roland ; Rohr, Karl; Automated Recognition of Micotic Patterns in Fluorescence Microscopy Images of Human Cells. In: Pr oc. IEEE Internat.
  • Voronoigraphs and their related watershed transformations (Roerdink, Jos BTM, Meijster, Arnold: The Water Shed Transform: Definitions, Algorithms and Parallelization Strategies, In: Fundamenta Informaticae 41 (2001), pp. 187-228) (Cong, Ge; Vaisberg, Eugeni A .: Extracting Shape Information Contained in Cell Images, Pending Patent Application, August 2002.
  • the algorithms are typically initialized with information about the location of the cell nuclei and then approximate the cell contours using the local intensity distribution in the cytoplasm (Bengtsson, Wählby, C.; Lindblad, J .: Robust Cell Image Segmentation Methods.) In: Patt. Recog Analysis 4 (2004), No. 2, pp. 157-167) (Cong, Ge; Vaisberg, Eugeni A .: Extracting Shape Information Contained in Cell Images, Pending Patent Application, August 2002.
  • Recent methods extend the approach of region-based methods by the use of active contours (snakes), which even with highly noisy material still achieve good results (Rahn, CD; Stiehl, HS: Semiautomatic segmentation of individual cells in laser scanning microscopy images of human Skin: In: Procs BVM, 2005, pp. 153-158).
  • An alternative approach by Ronneberger (Ronneberger, O. Fehr, J .; Burkhardt, H .: Voxel-Wise Gray Scale Invariants for Simultaneous Segmentation and Classification, In: Procs DAGM, Springer, 2005, pp.
  • the segmentation of cells can be seen as an example of an image processing task where the data is in such a consistent form that a part can be used to train a classifier.
  • neuronal networks there is a concept that requires such data, and that empathizes with human reasoning through training and automated backprogagation (Duda, Richard O, Hart, Peter E, Stork, David G: Pattern Classification John WiUy & Sons, 2001) (Pal, Nikhil R .; Pal, Sankar K .: A Review on Image Segmentation Techniques, In: Pattern Recognition 26 (1993), No. 9, pp. 1277-1794).
  • Von Nattkemper (Nattkemper, Tim W .; Wersing, Heiko; Schubert, Walter; Ritter, Helge: A Neural Network Architecture for Automatic Segmentation o / Fluorescence Micrographs.
  • Procs ESANN, 2000, pp. 177-182 discloses an approach for the detection of predominantly convex and compact lymphocytes, in which in a two-phase process first a neural classifier for the determination of cell coordinates is trained and then the contours are determined from these coordinates.
  • the reference to the irregular 2D shape omits any morphological modeling of the cell.
  • the object of the present invention is to provide a reliable method for the detection of contours in images, in particular for the detection of cell contours.
  • the invention relates to a method for determining membrane contours in images of biological cells, comprising the following steps:
  • Detecting a substructure of a biological cell the substructure serving to localize the biological cell in the image, Detecting a plurality of landmarks taking into account the spatial
  • the determination of the line segments is based on physical-biological findings with regard to the cell statics.
  • the cells are preferably displayed using a physical model of the cytoskeleton.
  • Adherent cells connect to their subsurface via discrete points. Within the cell, these points correspond to parts of individual fibers of the cytoskeleton, but in particular to endpoints of such fibers.
  • the cytoskeleton is a complex mechanical entity with the nucleus as a reference.
  • the cell membrane is stretched by the fibers, and the typical shape of cells in preferably confocal 2D images results from the interaction of elastic fibers and their forces on the one hand and the membrane on the other hand.
  • the graphs used as models are, in particular, aligned in accordance with the present invention such that an equilibrium of forces arises at each node, and finally validated against recordings of adhesion points in comparison cells (e.g., HeLa cells).
  • prior knowledge of cell growth is used to model the contour of cells.
  • the components of the cytoskeleton namely microtubules, intermediate filaments and microfilaments.
  • Insights into the tensegrity model Ingber, Donald E .: Opposing views on tensegrity as a structural framework for understanding cell mechanics, In: J. Appl Physiol 89 (2000), pp. 1663-1678; Huang, Sui; Ingber, Donald E. In: Nature Cell Biology 1 (1999), September, pp. El 31-E 138) used to define the geometric properties of the contour.
  • the shape of the object is derived from the skeleton which is stabilized by tensions between its constituents by coming to equilibrium (Wang, Ning, Tolic-Norrelykke, Iva M, Chen, Jianxin, Mijailovich, Srboljub M. ; Butler, James P., Fredberg, Jeffrey J., Stamenovic, Dimitrije: Cell Prestress I. Stiffness and prestress are dose Iy associated in adherent contractile cel ⁇ s. In: Am J Physiol Cell Physiol (2002), p. C606-C616).
  • the approach is used, according to which the shape of the cell results from two classes of discrete elements: the longitudinally compressible struts and the tensile elements.
  • the focal point of the consideration are the growth axes of the cell defined on the basis of the cytoskeleton, whose target points are found on the contour as curvature extremes.
  • the sections lying between these points can be represented by second-order concave curves. The approach thus offers the possibility of determining cell contours in the subpixel range.
  • This methodology is particularly closely aligned with the biological reality, so that the basis for much more robust segmentation procedures is formed here.
  • the problem of segmentation is reduced to the recognition of landmarks that correspond to the endpoints of growth axes.
  • growth axes local vectors are understood in particular to the membrane contour, which characterize the orientation of the contour at this point.
  • the real fibers are abstracted because the local orientation of the membrane contour can well come about through the interaction of several components of the cytoskeleton, such as fibers.
  • Focus of the application of the method according to the invention is in particular the description of cell contours.
  • Physical models such as Bezier splines are preferred for explaining the continuous concavity of contour sections with respect to the nucleus.
  • the growth axes can be used directly as a parameterization of the splines.
  • the approach of the present invention is superior to non-modeling methods in that it incorporates physico-biological insight into cell growth. Despite the heterogeneous morphology of cells, there are meaningful general properties that must necessarily be included for segmentation.
  • the well-known properties of the cytoskeleton apply in a comparable form also to cells in which one can not speak of pronounced growth axes.
  • the approach according to the invention can be extended to cells in different environments, eg. B. on tight epithelial tissue.
  • Another possibility is the inclusion of further constraints, such as the relation between the orientation of the cell nucleus and the orientation of the entire cell.
  • the inventive method is particularly applicable in the context of automated image processing, preferably by automatic recognition of landmarks and their assignment to cells.
  • FIGS. 1 and 2 illustrate the collection of landmarks in cellular tissue images.
  • the two left images each show a cell whose nucleus is close to the center of the image.
  • the detection of the kernel is easy to accomplish with conventional methods of image analysis.
  • landmarks curvature extremes on the cell membrane are identified.
  • the growth axes (each right image) are now defined as connections of such a mark with the closest point on the border of the nucleus.
  • FIGS. 3 and 4 again show the core border and the growth axes (right-hand image, respectively) as well as Bezier splines whose position is determined directly by the axes.
  • FIG. 5 shows a picture of bone marrow cancer tissue (U2OS cells) in which the cytoplasm was highlighted by appropriate staining (see Example 3).
  • FIG. 6 nuclear line and growth axes are entered in the same picture.
  • FIG. 7 again shows the result of a membrane approximation with splines, the approximated membrane contour having been produced with differently scaled direction vectors.
  • Figures 8 and 9 show two further results obtained in this way.
  • FIG. 10 shows the principle of contour modeling (for further explanations see also exemplary embodiment 1).
  • FIG. 11 shows a membrane approximation by means of splines (for further explanations see also exemplary embodiment 1).
  • FIG. 12 illustrates the hierarchical clustering of landmarks (for further explanations, see also exemplary embodiment 2).
  • FIG. 13 shows, by way of example, an adjacency matrix of a tree considered in depth first order (for further explanations, see also exemplary embodiment T).
  • FIG. 14 shows images of HeLa cells in three different spectral channels with staining of the nuclei, of the cytoplasm and of the adhesion points (for further explanation see also exemplary embodiment 2).
  • Figure 15 shows the result of localization and segmentation.
  • the recordings concern cells in three different spectral channels with staining of the cell nuclei, the cytoplasm and the adhesion points.
  • FIG. 16 shows examples of cytoskeleton graphs (for further explanations see also exemplary embodiment 2).
  • FIG. 17 shows a flow chart of the method according to the invention in a preferred embodiment.
  • the model for an adherent cell presented here focuses on the calculation of the membrane, which means a line because of the data present in the second dimension. At the same time, a simple internal structure for cell construction is proposed.
  • the shape of the cell essentially results from the cytoskeleton, a composite of cell-internal fibers on the one hand, and the membrane, a boundary surface surrounding the cell, on the other hand.
  • the skeleton consists of a skeleton of fibers connected at discrete points. End points of the fibers penetrate the membrane and by means of receptors are a connection to the surrounding tissue or to the substrate.
  • the terms of the inner and outer adhesion points used in the present exemplary embodiment denote the adhesion points of the fibers with one another or the connection points of the fibers with materials surrounding the cell. Fibers having an outer adhesion point can often be considered as growth axes because they roughly match the direction of cell growth or movement in that direction.
  • adhesions are surfaces which, because of their small size of about 1 ⁇ , are referred to as dots relative to the cell volume (Sackmann, Erich: Liability for Cells.) In: Physik Journal 5 (2006), No. 8/9 , Pp. 27-34). Furthermore, it is relevant to recognize that the adhesion of the cell to its environment occurs exclusively via these adhesion points; both in cell-line adhesion and in the adhesion of the cell to a substrate, there are a large number of discrete adhesive points; a laminar connection does not exist.
  • the tensegridity model expressly identifies the components of the cytoskeleton different mechanical functions for the internal stability of the cell: the fibers of the skeleton are classified as microtubules, intermediate filaments and microfilaments (Alberts, Bruce, Bray, Dennis, Lewis, Julian, Raff, Martin, Roberts, Keith, Watson, James D. : Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, 1983).
  • the focal point of the consideration are the growth axes of the cell defined on the basis of the cytoskeleton, whose target points are found on the contour as curvature extremes. The sections between these points can be represented by second-order curves.
  • the membrane of the cell consists of a network of spectral fibers arranged in a hexagonal lattice (Liu, Shih-Chun; Derick, Lauro H. Palek, Jiri: Visualization of the Hexagonal Lattice in the Erythrocyte Membrane Skeleton.) In: The Journal of Cell Biology (1987), March, pp. 527-536).
  • a hexagonal lattice Liu, Shih-Chun; Derick, Lauro H. Palek, Jiri: Visualization of the Hexagonal Lattice in the Erythrocyte Membrane Skeleton.
  • the first integral here describes the membrane curvature
  • K is a modulus of elasticity
  • ⁇ - I and * - '2 are the main curvatures
  • ⁇ - 0 the spontaneous curvature of the membrane.
  • ⁇ 1 and ⁇ 2 are Lagrange multipliers for the maintenance of cell volume and surface area and can be interpreted as surface tension, as phenomena of the amphipatic structure of the membrane or as osmotic pressure.
  • an Eq. 2 used functionalized as a cell model that minimizes the projection area of the cell (in 3D the volume) and the contour length square (in 3D the square of the surface) under given boundary conditions.
  • the surface curvature is no longer explicitly provided.
  • an elastic cell membrane is described. The cell is partitioned into / V triangular segments ⁇ i, one corner of which is located in the center of the nucleus. The other two vertices lie on the cell contour on end points (landmarks) Pt of neighboring cell axes (cf the cytoskeleton).
  • the (in the considered cells mostly concave)
  • the first integral minimizes the contour length square and the second term minimizes the area.
  • the ⁇ T control the relative importance of the respective area.
  • Constants C ⁇ and ⁇ l are determined; that's how we get for example
  • the contour of a cell can be measured piecemeal by low-level polynomials
  • the membrane line should be determined from sections of different lengths -J * V-) with a more or less curved course.
  • the nucleus was detected in advance.
  • fluorescence microscopy e.g. Multichannel images are prepared using specially colored cores, from which single nuclei can be extracted by simple threshold analysis and connected component labeling (Davies, E.R., Machine Vision, Academic Press, 1997).
  • the closest point Pi is calculated on the core contour.
  • the method described takes into account the shape of adherent cells as the result of a membrane spanned between adjacent points. Once the landmarks are available as estimates of these points, the model of segmental approximation of the cell contour using Bezier splines can provide an acceptable approximation. This is especially true for landmarks that are far apart, resulting in wide contoured contour segments.
  • the adhesion points are interconnected by actin fibers (Wang, Ning, Naruse, Keiji, Stamenovic, Dimitrije, Fredberg, Jeffrey J, Mijailovich, Srboljub M, Tolic-Norrelykke, Iva M, Polte, Thomas, Mannix, Robert Ingber, Donald E .: Mechanical Behavior in Living Cells Consistent with the Tensegrity Model In: Proc Natl Acad Sci USA (2001), Juy, No. 14, pp. 7765-7770); they form the endpoints of these fibers.
  • the compounds are subject to mechanical forces (Wang, Ning, Tolic-Norrerykke, Iva M .; Chen, Jianxin, Mijailovich, Srboljub M .; Butler, James P. Fredberg, Jeffrey J, Stamenovic, Dimitrije: Cell Prestress, I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells., In: JPhysiol Cell Physiol (2002), pp.
  • the point of attack at equilibrium therefore corresponds to the geometric center of gravity of the forces involved.
  • the balance of forces should be balanced when the skeleton is at rest at each adhesion point.
  • a model is presented that contains both outer and inner adhesion points and specifies a structure for their organization in a skeleton.
  • the model is based on a tree-shaped graph (n-ary) whose leaf nodes correspond to outer nodes and whose inner nodes correspond to inner adhesion points (see below). Then, a method is presented by which such a tree can be oriented such that the balance of forces from the above equation is satisfied at each point.
  • the construction of a tree as a model of the cytoskeleton is initially based on already known outer adhesion points as well as on the cell nucleus. It is believed that adhesion points can not readily be directly related to the core area, such as when they form a cluster whose elements are close to each other but remote from the nucleus. As before, the vectors should ultimately be used for the parameterization of membrane splines. It is preferred to use unsupervised hierarchical clustering (Duda, Richard O, Hart, Peter E, Stork, David G: Pattern Classification, John Wiley & Sons, 2001). It is a divisive (also: top-down) method, in which an initially known amount of samples is divided into complementary quantities.
  • Equation 13 is now applied again to the elements of the current cluster and the edges thus defined are subjected to Connected Component clustering.
  • FIG. 12d shows the newly formed subsets. Again, weights are calculated and using Equation 14
  • the parameter Hin equation 13 has a significant influence on the
  • Shape of the tree and can be used to differentiate the shape of the graph
  • Equation 13 corresponds to the triangular inequality of Il 1 (Bronstein, I. N., Semendjajew, K. A, Musiol, G, Mühlig, H .: Paperback of Mathematics, Harri Deutsch, 2005)
  • Figure 12f shows the complete dendrogram (Duda, Richard O, Hart, Peter E, Stork, David G .: Pattern Classification, John Wiley & Sons, 2001) of this classification method as a representation of the nested clusters.
  • Equation 11 Wang, Ning; Tolic-Norrelykke, Iva M .; Chen, Jianxin; Mijailovich, Srboljub M .; Butler, James P. Fredberg, Jeffrey J. Stamenovic, Dimitrije: Cell prestress, L Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells In: Am J Physiol Cell Physiol (2002), pp. C606-C616). To include this property in the model, the coordinates of the internal nodes are recalculated after clustering.
  • Initial vector '0 is the vector of all nodes, ie already known coordinates of the leaf nodes and the unknown inner nodes.
  • - ⁇ O equals the root node of the passed matrix; for the initial call set, since in this case none of
  • the vector / involves exactly those nodes of the graph which are connected to the point to be currently calculated by a direct edge.
  • the model described above is converted to confocal recordings by way of example.
  • images of HeLa cells in three different spectral channels with staining of the nuclei, the cytoplasm and the adhesion points are used (FIG. 14); Such staining methods are described in detail in the literature.
  • the adhesion points are located and classified according to their location with respect to the cytoplasmic segmentation into inner and outer points.
  • the respective outer adhesion points are used to construct the model presented above.
  • the knots of the skeletal trees are considered as predictions of the actual location of the internal adhesion points, as determined by the analysis of the images. The verification of the model thus consists in a comparison of the prediction of these points with the actual locations.
  • the measured data are available as 8-bit grayscale images in a resolution of 1,345 x 991 in PNG format.
  • Internal adhesion points are colored exclusively by connections between fiber endpoints and cell exterior, but not connections between fibers within the cell.
  • the object detection described below was carried out with the software "Acapella" from the company Evotec Technologies GmbH For reasons of efficiency, the images are first scaled to a quarter of the original resolution, whereby the median of each of four neighboring pixels is selected A simple global threshold analysis is performed on the image of the cell nuclei, and the resulting binary map (English, map or mask) is converted into a stencil by means of Connected-Component-Labeling, taking 8-neighborhoods into account In order to prevent multiple nearby nuclei from being recognized as a single nucleus, a heuristic for separating objects is introduced, and the previously known objects become internal equidistant zones with the interval
  • the intensity values of the image function i / V * * f are multiplied by a zone function ⁇ / which yields the value iV of the zone containing .f f.
  • intensity maxima are generated which approximately correspond to the actual centers of the nuclei.
  • these are located and used as initial points of a watershed transformation in the area of the previously created binary map (Roerdink, Jos BTM, Meijster, Arnold: The Watershed Transform: Definitions, Algorithms and Parallelization Strategies, in: Fundamenta Informaticae 41 (2001 ), Pp. 187-228).
  • the objects resulting from this transformation largely correspond to the nuclei to be recognized and also treat cores tangent to one another as separate particles.
  • the kernel detection concludes with a filtering of the objects depending on their size. At the given resolution a satisfactory result was achieved with a minimum size of 100 pixels.
  • an analysis of artifacts was first undertaken in order to eliminate existing overexposed areas. These can occur as impurities of cell culture and interfere with the segmentation process.
  • the method described for the nucleus detection is repeated on the cytoplasmic space and the result compared with the already known nuclei;
  • the artifact defines those objects that have no overlap with the nuclei.
  • a new threshold analysis again results in a binary map from which the artefact areas are subtracted.
  • the result is used as a spatial boundary for a subsequent application of the water sheath transformation.
  • This is initialized with the nuclei located at the beginning, so that objects are obtained whose number corresponds to the number of nuclei and which each correspond to a nucleus. Because of the strongly heterogeneous intensity distribution of the cytoplasm, the simple application of the transformation is not sufficient to completely fill in the stencil given as the limit. Therefore, a simple smoothing is performed with
  • the localization of the adhesion points was performed on the third spectral channel in the form of a Maximasuche.
  • the area to be analyzed is similar to the image area defined by the cytoplasmic detection.
  • points are regarded as maxima if they have a maximum brightness within a radius of three pixels.
  • the area considered in this image is at least 0.2, and as a minimum quotient
  • the method on which the invention is based has been used in the investigation of bone marrow cancer tissue (U2OS cells).
  • U2OS cells bone marrow cancer tissue
  • landmarks are meant to designate those points on the cell membrane line that embody curvature extremes; This follows from the observation that the membrane line is made up of sections of different lengths with a more or less pronounced concave curve. The concavity thus depends directly on the local density of landmarks. In the case of the cells considered in the present example, landmarks were thus first detected.
  • the closest point on the core line was determined. Together, these two dots form a local vector - the so-called growth axis - which roughly indicates the orientation of the cytoplasm in this direction.
  • the set of these vectors can then be sorted by the order of their bases on the core line; the sorting of vectors with identical base points was carried out by means of an analysis of the local position of the vectors with respect to the core line.
  • FIG. 5 shows a picture of bone marrow cancer tissue (U2OS cells) in which the cytoplasm was highlighted by appropriate staining.
  • FIG. 6 nuclear line and growth axes are entered in the same picture.
  • Figures 8 and 9 show two further results obtained in this way.
  • the landmarks described above were again used for the parameterization of splines by means of direction vectors (growth axes). In the case of the cells considered, the landmarks could no longer be sorted in the order of their position on the membrane contour in some circumstances;
  • the present example further demonstrates that for cells with extensive expansion of the cytoplasm, a more independent position of the growth axes, ie a local orientation, is advantageous and can be determined by the method underlying the invention.
  • the two orthogonal orientation axes of the present cell nucleus were determined. Thereafter, the set of landmarks was divided into two subsets A and B such that A contained those marks lying in the first of the two half-planes formed by the smaller core axis. The amount B contained analogously the marks of the second half-plane.
  • the graph constructed by the repeated calculation of discriminants now allowed easy sorting of landmarks.
  • a tree traversal was carried out for the two graphs, which each lie in the first half planes.
  • the two graphs could be characterized more closely than trees, and an order of the landmarks - which lie on the leaf nodes of the tree - could be established by a preorder passage of the tree (I. Bronstein, K. Semendjajew, G. Musiol, H. Mühlig : Taschenbuch der Mathematik, published by Harri Deutsch, 2005).
  • the membrane line was now constructed by a parameterization of spline segments, which was given by adjacent growth axes. Also analogous to the above example, the axes optionally scaled with the paired scalar products to match the nature of the particular cell type considered.
  • the method on which the invention is based was used in another example in order to detect the landmarks in the first place.
  • the distribution of image intensities in the vicinity of the core line was considered. It is the nature of many recording techniques and experimental devices that the intensity around the core reaches a maximum and decreases in the direction of the membrane line to all sides. This decrease is uneven in that there are different distances to the membrane line in all directions, and the scanned dye is also not distributed absolutely evenly.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Ermittlung von Membrankonturen in Bildern biologischer Zellen beschrieben, das die folgenden Schritte umfasst: - Detektieren einer Substruktur einer biologischen Zelle, wobei die Substruktur zur Lokalisierung der biologischen Zelle im Bild dient, - Detektieren einer Mehrzahl von Landmarken unter Berücksichtigung der räumlichen Lage der Substruktur, - Bestimmen von Liniensegmenten zwischen Paaren räumlich benachbarter Landmarken, und Zusammensetzen der Liniensegmente zu einer Membrankontur. Insbesondere werden physikalisch-biologische Erkenntnisse hinsichtlich der Zellstatik zugrunde gelegt, um die Limensegmente zu bestimmen.

Description

Verfahren zur Detektion von Konturen in Bildern biologischer Zellen
Die automatische Segmentierung von Zellen in Mikroskopaufnahmen gehört zu den wichtigsten Aufgaben der Bildanalyse im Bereich der Biologie und pharmazeutischen Forschung.
Zur Bearbeitung biologischer Fragestellungen werden Strukturen von Zellen, z.B. Rezeptoren oder Zytoskelettbestandteile, mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. In Reaktion auf äußere Reize reagieren diese Strukturen dann etwa mit einer Umlagerung. Um solche Beobachtungen quantifizieren zu können, ist es notwendig, einzelne Zellen innerhalb einer Aufnahme zu segmentieren. Für Hochdurchsatzanwendungen liegt das Interesse dabei auf vollständig automatischen Verfahren.
Das Segmentierungsproblem ist komplex, da Zellen eine sehr heterogene Morphologie besitzen, die schwierig zu modellieren ist. Ferner ergeben sich Schwierigkeiten durch Okklusion sowie durch Fälle von zusammengewachsenen Nachbarzellen, deren verbindende Fläche kaum eindeutig zuzuordnen ist.
Die wissenschaftliche Disziplin der Zellerkennung in digitalen Aufnahmen hat im Laufe der Jahrzehnte zahlreiche spezialisierte Ansätze hervorgebracht, die jeweils ein bestimmtes Paradigma der Bildverarbeitung implementieren.
Im Folgenden werden die wichtigsten Forschungsbereiche skizziert und auf ihre Möglichkeiten und Grenzen hingewiesen.
Schwellwertverfahren bieten sich vor allem bei der Erkennung von Zellkernen an (Härder, Nathalie; Neumann, Beate; Held, Michael; Liebel, Urban; Erfle, Holger; Ellenberg, Jan; EiIs, Roland; Rohr, Karl: Automated Analysis ofMitotic Phenotypes in Fluorescence Microscopy Images of Human Cells. In: Bildverarbeitung für die Medizin 2006, 2006, S. 374-378 ) (Härder, Nathalie; Neumann, Beate; Held, Michael; Liebel, Urban; Erfle, Holger; Ellenberg, Jan; EiIs, Roland; Rohr, Karl; Automated Recognition ofMitotic Patterns in Fluorescence Microscopy Images of Human Cells. In: Pr oc. IEEE Internat. Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro (ISBF2006)}, 2006, S. 1016-1019) (Wirjadi, Oliver; Breuel, Thomas M.; Feiden, Wolfgang; Kim, Yoo-Jim: Automated Feature Selectionfor the Classification of Meningioma CW/ Nuclei. In: Bildverarbeitung für die Medizin 2006, 2006, S. 76—80), weil die zu erkennenden Objekte i.d.R. räumlich separat im Bildraum liegen und sich durch ihre Intensitätsverteilung deutlich vom Hintergrund abheben. Sie besitzen zudem eine kompakte, häufig runde Morphologie, die eine aufwendige Formulierung adäquater Modelle überflüssig macht.
Voronoigraphen und die ihnen verwandte Wasserscheidentransformation (Roerdink, Jos B. T. M.; Meijster, Arnold: The Water shed Transform: Definitions, Algorithms and Parallelization Strategies. In: Fundamenta Informaticae 41 (2001), S. 187-228) (Cong, Ge; Vaisberg, Eugeni A.: Extracting Shape Information Contained in Cell Images. Pending Patent Application, August 2002.
— WO 02/067195 A2 ) bilden die klassische Grundlage der heute verbreiteten Segmentations- verfahren für die Zellbiologie. Bei diesen fließt insofern biologisches Hintergrundwissen in den Detektionsprozeß ein, als dass die tatsächliche Verteilung des Farbstoffs zur Zellmembran hin abnimmt; die den Wasserscheiden zugrunde liegenden Annahmen über Objekt grenzen als Grate im Intensitätsgebirge werden also zu einem groben Modell der Zellstruktur.
Die Algorithmen werden typischerweise mit Informationen über die Lage der Zellkerne initialisiert und approximieren dann unter Verwendung der lokalen Intensitätsverteilung im Zytoplasma die Zellkonturen (Bengtsson; Wählby, C. ; Lindblad, J.: Robust Cell Image Segmentation Methods. In: Patt. Recog. Image Analysis 4 (2004), Nr. 2, S. 157-167) (Cong, Ge ; Vaisberg, Eugeni A.: Extracting Shape Information Contained in Cell Images. Pending Patent Application, August 2002.
— WO 02/067195 A2); mit Hilfe der Wasserscheidentransformation wurden allerdings auch ohne eine vorherige Kernerkennung Ergebnisse erzielt, die etwa 90% der Qualität einer manuellen Segmentation erreichen (Wählby, Carolina; Lindblad, Joakim; Vondrus, Mikael; Bengtsson, Ewert; BJörkesten, Lennart: Algorithms for cy toplas m segmentation of fluorescence labelled cells. In: Analytical Cellular Pathology 24 (2002), S. 101-111). Speziell für die Segmentation von ungefärbten Zellen in Hellfeldaufnahmen wurden Verfahren entwickelt, die mittels globaler Schwellwertverfahren zunächst die grobe Lokation der Zellen ermitteln und anschließend anhand der Intensitätsvarianz die gefundenen Zellformen differenzieren (Wu, Kenong; Gauthier, David; Levine, Martin D.: Live cell image segmentation. In: IEEE Trans BiomedEng 42 (1995), S. 1—12 ).
Neuere Verfahren erweitern den Ansatz der regionenbasierten Verfahren durch die Verwendung von aktiven Konturen (Snakes), die auch bei stark verrauschtem Material noch gute Ergebnisse erzielen (Rahn, CD.; Stiehl, H.S.: Semiautomatische Segmentierung individueller Zellen in Laser- Scanning-Microscopy Aufnahmen humaner Haut. In: Procs BVM, 2005, S. 153—158). Ein alternativer Ansatz von Ronneberger (Ronneberger, O.; Fehr, J.; Burkhardt, H.: Voxel-Wise Gray Scale Invariants for Simultaneous Segmentalion and Classification, In: Procs DAGM, Springer, 2005, S. 85—92) verzichtet ausdrücklich auf eine Modellierung von Zellen; vielmehr werden Pixel bzw. Voxel aufgrund von Eigenschaften der Intensitäten in der lokalen Nachbarschaft geclustert. Hier setzt man stattdessen auf die pixel- bzw. voxelweise Generierung von Merkmalen, die für Punkte ähnlicher Zellen ähnliche Werte liefern. Nachfolgendes Clustering von gleichartig klassifizierten Bildelementen führt dann zur Ergebnismenge erkannter Zellobjekte.
Die Segmentierung von Zellen kann als Beispiel für eine Bild Verarbeitungsaufgabe gesehen werden, bei der die Daten in derart konsistenter Form vorliegen, dass ein Teil zum Training eines Klassifikators benutzt werden kann. Mit den neuronalen Netzen liegt ein Konzept vor, das eine solche Datenlage voraussetzt, und das durch Training und mit automatisiertem Lernen (Backprogagation) menschliches Schlußfolgern nachempfindet (Duda, Richard O.; Hart, Peter E.; Stork, David G.: Pattern Classification. John WiUy & Sons, 2001) (Pal, Nikhil R.; Pal, Sankar K.: A Review on Image Segmentation Techniques. In: Pattern Recognition 26 (1993), Nr. 9, S. 1277— 1794 ).
Von Nattkemper (Nattkemper, Tim W.; Wersing, Heiko; Schubert, Walter; Ritter, Helge: A Neural Network Architecture for Automatic Segmentation o/Fluorescence Micrographs. In: Procs ESANN, 2000, S. 177--182) stammt ein Ansatz zur Erkennung von überwiegend konvexen und kompakten Lymphozyten, bei dem in einem zwei-Phasen-Prozeß zunächst ein Neuronaler Klassifikator zur Bestimmung von Zellkoordinaten trainiert wird und ausgehend von diesen Koordinaten sodann die Konturen bestimmt werden. Hier wird mit dem Hinweis auf die unregelmäßige 2D-Gestalt ebenfalls auf eine morphologische Modellierung der Zelle verzichtet.
Die Anwendung des genetischen Paradigmas auf das Problem der Zellerkennung vereint zwei Aspekte der Modellierung. Zum einen lehnt sich diese Methodik der automatisierten Verbesserung von Algorithmen bzw. Klassifikatoren an die Biologie der Populationsentwicklung an (Duda, Richard O.; Hart, Peter E.; Stork, David G.: Pattern Classification. John Wiley & Sons, 2001 ) . Zum anderen wird zur Messung der Relevanz einzelner Bildpunkte (engl. Fitness) ein Modell zur Charakterisierung der zu findenden Objekte benötigt.
Für die Analyse einfacherer Morphologien wurde eine Modellierung mittels Ellipsen
Figure imgf000004_0001
vorgeschlagen (Yang, Faguo; Jiang, Tianzi: Cell Image Segmentaiion with Kernel-Based Dynamic Clustering and an Ellipsoidal Cell Shape Model. In: Journal of Biomedical Informatics 34 (2001),
S. 67—73), deren Hauptachsen O, und fi sowie Orientierung t/ und Zentrum \*- O i '/OJ mit dem ebenfalls elliptischen Gauß-Kern zur Messung von Bildpunktzugehörigkeiten in Verbindung gebracht.
Dieses sehr kompakte Verfahren eignet sich für einen eng definierten Kreis von Zelltypen. In der Durchführung (Yang, Faguo; Jiang, Tianzi: Cell Image Segmentalion with Kernel-Based Dynamic Clustering and an Ellipsoidal Cell Shape Model. In: Journal of Biomedical Informatics 34 (2001), S. 67—73) wurde eine hohe Unanfälligkeit gegenüber Rauschen festgestellt. Sie eignet sich eher für die Erkennung, weniger für die eigentliche Segmentierung von Zellen, weil unmittelbar zusammenhängende Objekte nicht getrennt werden.
Eines der ältesten Konzepte zur Objekterkennung findet sich im Template-Matching, dessen Grundlagen in der Radon- und der davon abgeleiteten Hough-Transformation liegen. Das Prinzip der allgemeinen Hough-Transformation wurde von Garrido und Perez de Ia Bianca auf die Zellerkennung angewendet (Garrido, A. ; Bianca, N. P. L: Applying deformable templates for cell image segmentation. In: Pattern Recognition 33 (2000), S. 821—832). Für die Transformation in einen Houghraum entwickelten die Autoren ein zweidimensionales elliptisches Konturmodell. Die durch eine Analyse des Parameterraums gewonnenen Lokalitäten der abgebildeten Zellen wurden nachfolgend benutzt, um durch Energieoptimierung der lokalen Intensitätsverteilung die tatsächlichen Objektkonturen zu finden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein verlässliches Verfahren zur Detektion von Konturen in Bildern, insbesondere zur Detektion von Zellkonturen bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren gemäß Anspruch 1. Die weiteren Ansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfmdungsgemäßen Verfahrens.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung von Membrankonturen in Bildern biologischer Zellen, das die folgenden Schritte umfasst:
- Detektieren einer Substruktur einer biologischen Zelle, wobei die Substruktur zur Lokalisierung der biologischen Zelle im Bild dient, Detektieren einer Mehrzahl von Landmarken unter Berücksichtigung der räumlichen
Lage der Substruktur, - Bestimmen von Liniensegmenten zwischen Paaren räumlich benachbarter
Landmarken, und
Zusammensetzen der Liniensegmente zu einer Membrankontur.
Vorzugsweise werden zur Bestimmung der Liniensegmente physikalisch-biologische Erkenntnisse bezüglich der Zell Statik zugrunde gelegt.
Als Grundlage für die Segmentierung von Zellen in mikroskopischen Aufnahmen werden die Zellen bevorzugt unter Verwendung eines physikalischen Modells des Zytoskeletts dargestellt. Adhärente Zellen verbinden sich mit ihrem Untergrund über diskrete Punkte. Innerhalb der Zelle korrespondieren diese Punkte mit Teilen einzelner Fasern des Zytoskeletts, insbesondere jedoch mit Endpunkten derartiger Fasern. Das Zytoskelett stellt ein komplexes mechanisches Gebilde dar mit dem Nukleus als Bezugspunkt. Die Zellmembran wird von den Fasern aufgespannt, und die typische Gestalt von Zellen in vorzugsweise konfokalen 2D-Aufnahmen ergibt sich aus der Wechselwirkung elastischer Fasern und ihrer Kräfte einerseits und der Membran andererseits. Die als Modelle verwendeten Graphen werden gemäß der vorliegenden Erfindung insbesondere so ausgerichtet, dass an jedem Knoten ein Kräftegleichgewicht entsteht, und schließlich gegen Aufnahmen von Adhäsionspunkten in Vergleichszellen (z.B. HeLa-Zellen) validiert.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Vorwissen über das Zell Wachstum verwendet, um die Kontur von Zellen zu modellieren. Von Bedeutung sind dabei insbesondere die Bestandteile des Zytoskeletts, namentlich Mikrotubuli, intermediäre Filamente und Mikrofilamente. Es werden Erkenntnisse des Tensegritätsmodells (Ingber, Donald E.: Opposing views on tensegrity as a structural frameworkfor understanding cell mechanics. In: J. Appl Physiol 89 (2000), S. 1663—1678; Huang, Sui; Ingber, Donald E.: The structural and mechanical complexity of cell-growth control. In: Nature Cell Biology 1 (1999), September, S. El 31- E 138) benutzt, um die geometrischen Eigenschaften der Kontur definieren. Nach der Tensegritätshypothese ergibt sich die Gestalt des Objekts aus dem Skelett, das durch Spannungen zwischen seinen Bestandteilen stabilisiert wird, indem es zu einem Gleichgewicht kommt (Wang, Ning; Tolic-Norrelykke, Iva M.; Chen, Jianxin; Mijailovich, Srboljub M.; Butler, James P.; Fredberg, Jeffrey J.; Stamenovic, Dimitrije: Cell prestress. I. Stiffness and prestress are dose Iy associated in adherent contractile celϊs. In: Am J Physiol Cell Physiol (2002), S. C606—C616). Insbesondere wird der Ansatz verwendet, nach dem sich die Form der Zelle aus zwei Klassen von diskreten Elementen ergibt: den der Länge nach komprimierbaren Fasern (engl, struts) und den Spannungselementen (engl, tensile elements). Den Mittelpunkt der Betrachtung bilden die in Anlehnung an das Zytoskelett definierten Wachstumsachsen der Zelle, deren Zielpunkte sich auf der Kontur als Krümmungsextrema wieder finden. Insbesondere können die zwischen diesen Punkten liegenden Abschnitte durch konkave Kurven zweiter Ordnung dargestellt werden. Der Ansatz birgt damit die Möglichkeit, Zellkonturen im Subpixelbereich zu ermitteln.
Diese Methodik ist besonders eng an der biologischen Wirklichkeit orientiert, so dass hier die Grundlage für wesentlich robustere Segmentierungsverfahren gebildet wird. Das Problem der Segmentierung wird reduziert auf die Erkennung von Landmarken, die mit den Endpunkten von Wachstumsachsen korrespondieren. Als Wachstumsachsen werden insbesondere zur Membrankontur lokale Vektoren verstanden, die die Orientierung der Kontur an dieser Stelle charakterisieren. Vorzugsweise wird von den realen Fasern abstrahiert, weil die lokale Ausrichtung der Membrankontur durchaus durch das Zusammenspiel mehrerer Bestandteile des Zytoskeletts, wie Fasern, zustande kommen kann.
Schwerpunkt der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist insbesondere die Beschreibung von Zellkonturen. Physikalische Modelle wie Bezier- Splines finden bevorzugt Anwendung, um die kontinuierliche Konkavität von Konturabschnitten bezüglich des Zellkerns zu erklären. Dabei können die Wachstumsachsen direkt als Parametrϊsierung der Splines eingesetzt werden.
Des Weiteren ist es bevorzugt, den Zusammenhang der lokalen Häufung von Wachstumsachsen mit der Gestalt der dazwischen liegenden Konturabschnitte zu berücksichtigen.
Der beschriebene Ansatz wurde am Beispiel adhärenten Zellgewebes erprobt. Liegen die Landmarken einmal vor, kann durch ein Modell der abschnittsweisen Approximation mittels Bezier-Splines ein akzeptables Ergebnis erzielt werden. Dies gilt insbesondere für weit auseinander liegende Landmarken, die in weiträumig aufgespannte Kontursegmente resultieren. Viel versprechende Resultate ergeben sich aber auch in diffusen Bereichen des Zytoplasmas, die insgesamt sogar konvex erscheinen. Hier lässt sich zeigen, dass eine engere Bündelung der Achsen und eine einhergehende Verflachung der Splines ebenfalls eine erfolgreiche Abgrenzung der Zelle gegen ihre Umgebung bewirkt.
Insgesamt wird deutlich, dass durch den Schwerpunkt auf biologischen Gegebenheiten eine bessere Erkennung möglich wird, als sie durch Betrachtung der Intensitätsverteilung allein überhaupt denkbar wäre.
Der erfindungsgemäße Ansatz ist nicht-modellierenden Verfahren durch die intensive Einbeziehung physikalisch-biologischer Erkenntnisse bezüglich des Zellwachstums überlegen. Trotz der heterogenen Morphologie von Zellen existieren aussagekräftige generelle Eigenschaften, die für eine Segmentierung unbedingt einbezogen werden müssen.
Die bekannten Eigenschaften des Zytoskeletts gelten in vergleichbarer Form auch für Zellen, bei denen nicht von ausgeprägten Wachstumsachsen gesprochen werden kann. So lässt sich der erfindungsgemäße Ansatz auf Zellen in unterschiedlichen Umgebungen ausdehnen, z. B. auf enge Epithelzellgewebe. In Frage kommt dabei auch die Hinzunahme weiterer Constraints, etwa die Relation von der Orientierung des Zellnukleus im Verhältnis zu der Orientierung der gesamten Zelle.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere im Rahmen der automatisierten Bildverarbeitung anwendbar, vorzugsweise durch automatisches Erkennen von Landmarken und ihrer Zuordnung zu Zellen.
Figuren 1 und 2 veranschaulichen die Gewinnung von Landmarken in Aufnahmen von Zellgewebe. Die beiden linken Bilder zeigen jeweils eine Zelle, deren Kern nahe der Bildmitte liegt. Die Erkennung des Kerns ist mit herkömmlichen Methoden der Bildanalyse einfach zu bewerkstelligen. Als Landmarken werden Krümmungsextrema auf der Zellmembran identifiziert. Die Wachstumsachsen (jeweils rechtes Bild) werden nun als Verbindungen einer solchen Marke mit dem am nächsten liegenden Punkt auf der Umrandung des Zellkerns definiert. Figuren 3 und 4 zeigen wiederum Kernumrandung und Wachstumsachsen (jeweils rechtes Bild) sowie Bezier-Splines, deren Lage direkt durch die Achsen bestimmt wird.
Figur 5 zeigt eine Aufnahme von Knochenmarkskrebsgewebe (U2OS-Zellen), bei der das Zytoplasma durch entsprechende Färbung hervorgehoben wurde (siehe Ausführungsbeispiel 3). In Figur 6 sind in der gleichen Aufnahme Zellkernlinie und Wachstumsachsen eingetragen. Figur 7 wiederum zeigt das Ergebnis einer Membranapproximation mit Splines, wobei die approximierte Membrankontur mit unterschiedlich skalierten Richtungsvektoren hergestellt wurde. Die Figuren 8 und 9 zeigen zwei weitere Ergebnisse, die auf diese Weise erzielt wurden.
Figur 10 zeigt das Prinzip der Konturmodellierung (weitere Erläuterungen hierzu siehe auch Ausführungsbeispiel 1).
Figur 11 zeigt eine Membranapproximation mittels Verwendung von Splines (weitere Erläuterungen hierzu siehe auch Ausführungsbeispiel 1).
Figur 12 verdeutlicht das hierarchische Clustering von Landmarken (weitere Erläuterungen hierzu siehe auch Ausführungsbeispiel 2).
Figur 13 zeigt beispielhaft eine Adjazenzmatrix eines in Depth-First-Ordnung betrachteten Baumes (weitere Erläuterungen hierzu siehe auch Ausführungsbeispiel T).
Figur 14 zeigt Aufnahmen von HeLa-Zellen in drei unterschiedlichen spektralen Kanälen mit Färbungen der Kerne, des Zytoplasmas und der Adhäsionspunkte (weitere Erläuterungen hierzu siehe auch Ausführungsbeispiel 2).
Figur 15 zeigt das Ergebnis der Lokalisation und Segmentation. Die Aufnahmen betreffen Zellen in drei unterschiedlichen spektralen Kanälen mit Färbungen der Zellkerne, des Zytoplasmas sowie der Adhäsionspunkte .
Figur 16 zeigt Beispiele für Zytoskelettgraphen (weitere Erläuterungen hierzu siehe auch Ausführungsbeispiel 2). Figur 17 zeigt ein Ablaufschema des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer bevorzugten Ausfuhrungsform.
Die Erfindung wird nachstehend näher an Ausfuhrungsbeispielen erörtert.
Ausführungsbeispiel 1
Das hier vorgestellte Modell für eine adhärente Zelle legt einen Schwerpunkt auf die Berechnung der Membran, womit wegen der in der zweiten Dimension vorliegenden Daten eine Linie gemeint ist. Gleichzeitig wird eine einfache innere Struktur für die Zellkonstruktion vorgeschlagen.
Morphologie der Zelle
Die Form der Zelle resultiert im Wesentlichen aus dem Zytoskelett, einem Verbund von zellinternen Fasern einerseits, und der Membran, einer die Zelle umgebenden Begrenzungsfläche, andererseits. Das Skelett besteht aus einem Gerüst von Fasern, die an diskreten Punkten verbunden sind. Endpunkte der Fasern durchdringen die Membran und stellen mittels Rezeptoren eine Verbindung zum umgebenden Gewebe bzw. zum Substrat dar. Die im vorliegenden Ausfuhrungsbeispiel verwendeten Begriffe der inneren und äußeren Adhäsionspunkte bezeichnen die Adhäsionspunkte der Fasern untereinander bzw. die Verbindungspunkte der Fasern mit die Zelle umgebenden Materialien. Fasern, die einen äußeren Adhäsionspunkt besitzen, können häufig als Wachstumsachsen betrachtet werden, da sie grob mit der Richtung des Wachstums der Zelle oder auch mit ihrer Bewegung in diese Richtung übereinstimmen. Tatsächlich handelt es sich bei Adhäsionen um Flächen, die wegen ihrer geringen Größe von ca. 1 μ gegenüber dem Zellvolumen aber als Punkte bezeichnet werden (Sackmann, Erich: Haftung für Zellen. In: Physik Journal 5 (2006), Nr. 8/9, S. 27—34). Relevant ist weiterhin die Erkenntnis, dass die Anhaftung der Zelle an ihrer Umgebung ausschließlich über diese Adhäsionspunkte zustande kommt; es handelt sich sowohl bei Zeil-Zeil- Adhäsion als auch bei der Adhäsion der Zelle an einem Substrat um eine Menge von diskreten Haftpunkten, eine flächige Verbindung existiert nicht.
Saliente Bildpunkte als Grundlage der Membranbeschreibung
Die Modellierung der Form einer Zelle baut auf Erkenntnissen über das Zellwachstum und interne Zellstruktur auf. Das Tensegritätsmodell weist den Bestandteilen des Zytoskeletts ausdrücklich unterschiedliche mechanische Funktionen für die interne Stabilität der Zelle zu: die Fasern des Skeletts sind als Mikrotubuli, intermediäre Filamente und Mikrofilamente eingeteilt (Alberts, Bruce; Bray, Dennis ; Lewis, Julian ; Raff, Martin ; Roberts, Keith ; Watson, James D.: Molecular Biology ofthe Cell. Garland Publishing, 1983 ). Den Mittelpunkt der Betrachtung bilden die in Anlehnung an das Zytoskelett definierten Wachstumsachsen der Zelle, deren Zielpunkte sich auf der Kontur als Krümmungsextrema wieder finden. Die zwischen diesen Punkten liegenden Abschnitte können durch Kurven zweiter Ordnung dargestellt werden. Der Ansatz bietet damit die Möglichkeit, Zellkonturen im Subpixelbereich zu ermitteln. Diese Methodik ist eng an biologischen Erkenntnissen orientiert, so dass hier die Grundlage für robuste Segmentierungsverfahren gelegt wird. Das Problem der Segmentierung wird reduziert auf die Erkennung von Landmarken (auch „saliente Punkte" genannt), die mit den Endpunkten von Wachstumsachsen korrespondieren.
Physikalische Zellmodellierung
Die Membran der Zelle besteht aus einem Netz von Spektrinfasern, die sich in einem hexagonalen Gitter anordnen (Liu, Shih-Chun; Derick, Lauro H.; Palek, Jiri: Visualization ofthe Hexagonal Lattice in the Erythrocyte Membrane Skeleton. In: The Journal ofCell Biology (1987), March, S. 527—536). Im Nanometerbereich bieten sich daher zur formellen Beschreibung diskrete Paradigmen an. Die vorliegenden Aufnahmen gestatten wegen ihrer wesentlich geringeren Auflösung (Mikrometer- statt Nanometerskala) allerdings nur eine vergröberte Betrachtung, so dass für die Membran selbst im Folgenden nur kontinuierliche Berechnungen durchgeführt werden. Diese gründen auf der Erkenntnis, nach der die Membran sich dynamisch der Form der Zelle anpasst; das Phänomen ist mit dem Verhalten einer Folie vergleichbar, die unter Luftentzug einem unregelmäßig geformten Körper angepasst wird (engl, shrink-wrap) (Heidemann, Steven R.; Wirtz, Denis: Towards a regional approach to cell mechanics. In: TRENDS in Cell Biology (2004), April, Nr. 4, S, 160-166 ). In Einklang mit dieser Beobachtung hat Helfrich (Helfrich, W.: Elastic properiies oflipidbilayers. Theory andpossible experiments. In: Z Naturforschung C 28 (1973), S. 11—12) folgendes Energiefunktional als Modell einer Zellmembran vorgeschlagen:
Figure imgf000011_0001
Das erste Integral beschreibt hier die Membrankrümmung, K ist ein Elastizitätsmodul, ^- I und *--' 2 sind die Hauptkrümmungen und ^- 0 die spontane Krümmung der Membran. ^1 und ^2 sind Lagrange-Multiplikatoren zur Erhaltung von Zellvolumen und -Oberfläche und können als Oberflächenspannung, als Phänomene der amphipati sehen Struktur der Membran oder auch als osmotischer Druck interpretiert werden.
Für eine effiziente Segmentierung von Bilddaten ist es jedoch bevorzugt, die durchaus komplexe Struktur vieler Zelltypen zu berücksichtigen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird hinsichtlich einer 2D-Segmentierung adhärenter, sternförmiger Zellen ein an Gl. 2 angeleimtes Funktional als Zellmodell verwendet, das die Projektionsfläche der Zelle (in 3D das Volumen) sowie das Konturlängenquadrat (in 3D das Quadrat der Oberfläche) unter gegebenen Randbedingungen minimiert. Die Oberflächenkrümmung ist nicht mehr explizit vorgesehen. Durch die Verwendung des Konturlängenquadrats wird eine elastische Zellmembran beschrieben. Die Zelle wird in /V dreieckige Segmente ^i partitioniert, von denen je eine Ecke im Zentrum des Nukleus liegt. Die beiden anderen Ecken liegen auf der Zellkontur auf Endpunkten (Landmarken) Pt von benachbarten Zellachsen (vgl. das Zytoskelett). Der (bei den betrachteten Zellen zumeist konkave)
Konturteil in ^i zwischen den Landmarken Vi und Pi + 1 werde in einem lokalen
Koordinatensystem als -J1 v* ^bezeichnet (siehe Figur 10). Für jedes Segment *~5f sieht das Funktional dann folgendermaßen aus:
Figure imgf000012_0002
Das erste Integral minimiert das Konturlängenquadrat und der zweite Term den Flächeninhalt. Die ^T steuern die relative Bedeutung des jeweiligen Flächeninhalts.
Das Integral in Gl. 3 folgt als
Figure imgf000012_0001
dem Schema
Figure imgf000013_0003
und lässt sich mit
Figure imgf000013_0004
zur Euler-Lagrange-Gleichung
Figure imgf000013_0001
entwickeln (Ansorge, Rainer; Oberle, Hans J.: Mathematik für Ingenieure, Band 2. Akademie,
1994) . Somit ergibt sich eine mit Aj parametrisierte, quadratische Funktion für
Figure imgf000013_0008
Figure imgf000013_0002
Mithilfe zweier Koordinaten
Figure imgf000013_0006
und
Figure imgf000013_0007
als Randbedingungen können die
Konstanten C ϊ und ^l ermittelt werden; so erhalten wir beispielsweise für
Figure imgf000013_0009
Figure imgf000013_0005
Ein Beispiel für -V v* /mit variierendem Λ ist in Figur 10 c gegeben.
Somit kann nach diesem Modell die Kontur einer Zelle stückweise durch Polynome mit niedrigem
Grad beschrieben werden.
Um die Randbedingungen für jedes Kontur stück iJi symmetrisch angeben zu können, werden kubische Spline-Kurven verwendet. Die Krümmungsparameter A/ werden durch den Zelltypus und die jeweiligen Wachstumsachsen bestimmt.
Implementation
Für die Umsetzung des Modells zur Untersuchung von Bildern von Zellen aus menschlichem Knochenmarkskrebsgewebe (U-2OS) wird von gegebenen Landmarken Pr ausgegangen. Sie markieren Krümmungsextrema der Membranlinie. Durch ihre Lage zueinander sowie zum Kern
soll die Membranlinie aus verschieden langen Abschnitten -J * V- ) mit mehr oder weniger stark gekrümmten Verlauf bestimmt werden.
Der Zellkern wurde vorab detektiert. Im konkreten Fall der Fluoreszenzmikroskopie können z.B. Mehrkanalaufnahmen mit speziell gefärbten Kernen hergestellt werden, aus denen sich dann mittels einfacher Schwellwertanalyse und Connected-Component-Labelling (Davies, E. R.: Machine Vision. Academic Press, 1997) die einzelnen Kerne extrahieren lassen.
Für jede Landmarke Pi wird der nächstgelegene Punkt Pi auf der Kernkontur berechnet. Beide
P. ~ «. „ *j' Punkte zusammen bilden einen lokalen Richtungsvektor J t lJt vi (die Wachstumsachse), der grob die Orientierung des Zytoplasmas in dieser Richtung angibt. Die Menge dieser Vektoren
kann dann nach der Reihenfolge ihrer Fußpunkte r rfi auf der Kernlinie sortiert werden; dabei auftretende Teilprobleme wie etwa der Sortierung von Vektoren mit identischen Fußpunkten wurden mittels einer Analyse der lokalen Lage der Vektoren bezüglich der Kemkontur gelöst. Diese Sortiermethode ist für kompakte sternförmige Zellen eindeutig. Die Wachstumsachsen werden zur Parametrisierung der jeweils zwischen benachbarten Vektoren
aufgespannten Konturabschnitte Η v* ) benutzt.
Die Betrachtungen zur Minimierung von Fläche und Bogenlänge lassen sich umsetzen unter Verwendung der Länge und der Spannweite jeweils benachbarter Achsen, Um für die letztere ein Maß zu erhalten, werden zunächst sämtliche Achsen normiert zu
Figure imgf000015_0002
und sodann für die jeweils benachbarten Achsen das Skalarprodukt
Figure imgf000015_0003
berechnet.
Dessen Wertebereich ist bei den vorliegenden Konturen durch
Figure imgf000015_0004
gegeben, wobei — i J für
den maximalen Winkel von 1 80 steht. Der Bereich wird abgebildet auf I
Figure imgf000015_0005
um höhere Werte für größere Spannweiten zu erhalten. Schließlich skalieren wir di
Figure imgf000015_0007
mit den j eweils
gebildeten Werten. Zur Modellierung von Membranlinienabschnitte
Figure imgf000015_0006
mittels einer kubischen Spline werden die so entstandenen Paare dann direkt zur Parametrisierung ^i) eingesetzt (siehe Figur 11).
Das beschriebene Verfahren berücksichtigt die Form adhärenter Zellen als das Resultat einer zwischen benachbarten Punkten aufgespannten Membran. Liegen die Landmarken als Schätzungen dieser Punkte einmal vor, kann durch das Modell der segmentweisen Approximation der Zellkontur mittels Bezier-Splines eine akzeptable Annäherung erreicht werden. Dies gilt insbesondere für weit auseinander liegende Landmarken, die in weiträumig aufgespannten Kontursegmenten resultieren.
Gute Resultate ergeben sich aber auch in diffusen Bereichen des Zytoplasmas, die insgesamt eher konvex erscheinen. Eine engere Bündelung der Achsen und eine einhergehende Verflachung der Splines bewirkt in vorteilhafter Weise eine erfolgreiche Abgrenzung der Zelle gegen ihre Umgebung.
In der Praxis bietet sich insbesondere die Verwendung von kubischen Bezierkurven
Figure imgf000015_0001
mit den Bernsteinpolynomen
Figure imgf000016_0001
an. Mit dieser Methode lässt sich zweckmäßig eine Kurve
Figure imgf000016_0002
definieren, die durch die Punkte Pl und P3 verläuft, und deren Lage durch die Vektoren PO-Pl bzw. P3-P2 angegeben wird, ohne dass die Kurve durch diese beiden Punkte PO und P2 verlaufen würde. Ein große Entfernung || Pj-Pkjj hat dabei eine tiefe Ausbuchtung der Kurve entlang dieses Vektors zur Folge. Die Anwendung dieser Methode ist vorteilhaft, weil die durch die vier Punkte definierte Kurve stets innerhalb der konvexen Hülle des korrespondierenden Polygons verläuft. Nach dem vorgestellten physikalisch-biologischen Modell stehen die die Kurve flankierenden Vektoren für benachbarte Fasern bzw. Achsen im Zytoskelettmodell; sie können von der Membran seitlich nicht überschritten werden,
Ausführungsbeispiel 2
In weniger dichten Monolayern wachsen Zellen mit einem relativ großen Freiheitsgrad, so dass das Zytoplasma mit der umgebenden Membran unregelmäßige Formen annimmt. Der Kern einer Zelle liegt dann oftmals dezentral, und die Spannungen zwischen äußeren Adhäsionspunkten und dem Zellinneren lassen sich nicht mehr als ein kreisförmiges, kernbezogenes Bündel von Vektoren beschreiben. Ein in diesem Sinne realistisches Modell sollte also neben äußeren Adhäsionspunkten auch innere Adhäsionspunkte enthalten.
Innerhalb einer Zelle sind die Adhäsionspunkte miteinander durch Aktinfasern verbunden (Wang, Ning; Naruse, Keiji; Stamenovic, Dimitrije; Fredberg, Jeffrey J.; Mijailovich, Srboljub M.; Tolic- Norrelykke, Iva M.; Polte, Thomas; Mannix, Robert; Ingber, Donald E.: Mechanical behaviour in livϊng cells consistent with the tensegrity model. In: Proc NatlAcadSci USA (2001), JuIy, Nr. 14, S. 7765—7770); sie bilden die Endpunkte dieser Fasern. Die Verbindungen unterliegen mechanischen Kräften (Wang, Ning; Tolic-Norrerykke, Iva M.; Chen, Jianxin; Mijailovich, Srboljub M.; Butler, James P.; Fredberg, Jeffrey J.; Stamenovic, Dimitrije: Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. In: Am JPhysiol Cell Physiol (2002), S. C606-C616) (Wang, Ning; Naruse, Keiji; Stamenovic, Dimitrije; Fredberg, Jeffrey J.; Mijailovich, Srboljub M.; Tolic-Norrelykke, Iva M.; Polte, Thomas; Mannix, Robert; Ingber, Donald E.: Mechanical behaviour in living cells consistent with the tensegrity model. In: Proc Natl Acad Sei USA (2001), JuIy, Nr. 14, S. 7765-7770) (Wendung, S.; Planuns, E.; Laurent, V.M.; Barbe, L.; Mary, A.; Oddou, C; Isabey, D.: RoIe ofcellular tone and microenvironmental conditions on cytoskeleton stiffness assessed by tensegrity model. In: Eur. Phys. J. 9 (2000), S. 51- 62 ); man spricht von interner Spannung einer Zelle oder vom Tonus (engl, tone (Wendung, S.; Planuns, E.; Laurent, V.M.; Barbe, L.; Mary, A.; Oddou, C; Isabey, D.: RoIe ofcellular tone and microenvironmental conditions on cytoskeleton stiffness assessed by tensegrity model. In: Eur. Phys, J. 9 (2000), S. 51-62) (Kuchling, Horst: Taschenbuch der Physik. Harri Deutsch, 1985):
Figure imgf000017_0001
Zur Berechnung des Angriffspunktes bei gegebenen globalen Koordinaten der Kraftvektoren und nicht existierender Resultierenden wird Gl. 11 einer Translation unterworfen (Fellner, Wolf- Dietrich: Computergrafik. BI-Wissenschaftsverlag, 1992 ) :
Figure imgf000017_0002
Der Angriffspunkt bei Kräftegleichgewicht entspricht also dem geometrischen Schwerpunkt der beteiligten Kräfte.
Folgende Hypothese wird formuliert: Die Kräftebilanz sollte bei Ruhelage des Skeletts an jedem Adhäsionspunkt ausgeglichen sein. Im Folgenden wird ein Modell vorgestellt, das sowohl äußere als auch innere Adhäsionspunkte enthält und eine Struktur für deren Organisation in einem Skelett angibt. Grundlage des Modells bildet ein Graph in Baumform (n-är), dessen Blattknoten mit äußeren und dessen innere Knoten mit inneren Adäsionspunkten korrespondieren (siehe unten). Sodann wird ein Verfahren vorgestellt, durch welches ein solcher Baum derart ausgerichtet werden kann, dass die Kräftebilanz aus obiger Gleichung in jedem Punkt erfüllt ist.
Clustering
Für die Konstruktion eines Baumes als Modell des Zytoskeletts wird zunächst von bereits bekannten äußeren Adhäsionspunkten sowie dem Zellkern ausgegangen. Es sei angenommen, dass Adhäsionspunkte nicht ohne weiteres direkt mit dem Kernareal in Bezug gesetzt werden können, etwa wenn sie ein Cluster bilden, dessen Elemente nahe beieinander aber fern vom Nukleus liegen. Wie zuvor sollen die Vektoren letztlich für die Parametrisierung von Membransplines benutzt werden. Vorzugsweise wird ein unüberwachtes hierarchisches Clustering verwendet (Duda, Richard O.; Hart, Peter E.; Stork, David G.: Pattern Classification. John Wiley & Sons, 2001). Es handelt sich um eine divisive (auch: top-down) Methode, bei der eine eingangs bekannte Menge von Proben in komplementäre Mengen eingeteilt wird. Die Strategie, innere Adhäsionspunkte aus der Lage der äußeren zu berechnen, korreliert mit der Erkenntnis, dass erstere eine wesentlich schwächere Bindung an das Substrat besitzen und sich durch skelettale Spannungen auch leichter verschieben (Wehrle-Haller, Bernhard; Imhof, Beat A.: The inner lives offocal adhesions. In: TRENDS in Cell Biology (2002), August, Nr. 8, S. 382-389).
Gegeben sei eine Punktmenge von Landmarken, die die äußeren Adhäsionspunkte einer adhärenten Zelle symbolisieren (Figur 12 a). Der Kern sei ebenfalls bekannt, und sein Zentrum ( , sei Bestandteil der Menge. Im ersten Schritt wird die Distanzmatrix LJ erstellt. Gilt für zwei beliebige Landmarken A und H
Figure imgf000018_0001
so wird eine Kante ( i -* 4 * n * R■? ) j. definiert. Der Vergleich wird fiir sämtliche Kombinationen von Landmarken durchgeführt.
Auf der entstehenden Kantenmenge wird ein Connected Component Clustering (Aho, Alfred V.;
Ullman, Jeffrey D.: Foundations of Computer Science. W. H. Freeman and Company, 1995) durchgeführt, um alle Punkte in Teilmengen zusammenzufassen. Diese sind in Figur 12 b dargestellt.
Für ein einzelnes Cluster wird nun eine neuer Bezugspunkt definiert. Der Schwerpunkt des Clusters
( wird berechnet und in Richtung des übergeordneten Bezugspunktes ( verschoben. Als heuristischen Ansatz für die Verschiebung wird eine Skalierung der Distanz beider Punkte abhängig von der gegenwärtigen Tiefe (I des Baumes gewählt:
Figure imgf000019_0001
Gleichung 13 wird nun erneut auf die Elemente des gegenwärtigen Clusters angewendet und die so definierten Kanten einem Connected-Component- Clustering unterworfen. Figur 12 d zeigt die neu entstandenden Teilmengen. Wiederum werden Schwerpunkte berechnet und mittels Gleichung 14
(t/'=3) in Richtung des übergeordneten Bezugspunktes verschoben.
Bei der nächsten Wiederholung des Clusterings kommt es zur Bildung von Singleton-Clustern
(Figur 12 e); ihr jeweiliges Element wird dann direkt mit dem Bezugspunkt verbunden. Ebenso verfährt man, wenn beim Clustering nur ein einziges neues Cluster entsteht, das dem alten entspricht.
Der Parameter Hin Gleichung 13 hat bei dieser Methode einen wesentlichen Einfluss auf die
Gestalt des Baumes und kann benutzt werden, um die Gestalt des Graphen unterschiedlichen
Zelltypen anzupassen. Für
Figure imgf000019_0002
6nIen bereits in der ersten Iteration alle Elemente zu einem einzigen Cluster zusammengefasst; es ergibt sich ein Graph, dessen Kantenmenge den Wurzelknoten direkt mit allen Punkten verbindet.
Mit Il 1 entspricht Gleichung 13 der Dreiecksungleichung (Bronstein, I. N.; Semendjajew, K. A.; Musiol, G.; Mühlig, H.: Taschenbuch der Mathematik. Harri Deutsch, 2005 )
Figure imgf000019_0003
Erst für Werte H ^> Iwerden echte Teilmengen eines Cluster gebildet.
Figur 12 f zeigt das komplette Dendrogramm (Duda, Richard O.; Hart, Peter E.; Stork, David G.: Pattern Classification. John Wiley & Sons, 2001 ) dieses Klassifizierungsverfahrens als Darstellung der ineinander verschachtelten Cluster.
Ausgleichen der Kräftebilanzen
An jedem Verbindungsknoten zellinterner Fasern liegt ein Gleichgewicht der angreifenden Kräfte wie in Gleichung 11 vor (Wang, Ning; Tolic-Norrelykke, Iva M.; Chen, Jianxin; Mijailovich, Srboljub M.; Butler, James P.; Fredberg, Jeffrey J.; Stamenovic, Dimitrije: Cell prestress. L Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. In: Am J Physiol Cell Physiol (2002), S. C606—C616 ). Um diese Eigenschaft in das Modell aufzunehmen, werden die Koordinaten der internen Knoten nach dem Clustering neu berechnet. Dies ist über ein lineares Gleichungssystem durchzuführen, das auf der Grundlage von Adjazenzmatrizen (Bronstein, I. N.; Semendjajew, K. A.; Musiol, G.; Mühlig, H.: Taschenbuch der Mathematik. Harri Deutsch, 2005) formuliert wird.
Vor der Kodierung des gerichteten Baumes werden dessen Knoten zunächst in Depth-First- Reihenfolge sortiert (Pavlidis, T.: Structural Pattern Recognition. Springer, 1977) und erhält so eine Dreiecksmatrix, deren Struktur die Unterteilung des Baumes in Teilbäume wiedergibt. Ein Beispiel für eine solche Matrix findet sich in Figur 13. Die dort mit einem Rechteck gekennzeichneten Bereiche der Matrix werden im vorliegenden Text als Teilmatrizen bezeichnet und korrespondieren mit den Teilbäumen.
Gesucht ist der Lösungsvektor
Figure imgf000020_0001
er Adjazenzmatrix
Figure imgf000020_0002
dessen Elemente die Koordinaten aller Baumknoten in der vorstehend angegebenen Reihenfolge enthält. Als
Anfangsvektor ' 0 dient der Vektor aller Knoten, also bereits bekannter Koordinaten der Blattknoten sowie den unbekannten inneren Knoten. -^ O gleicht dem Wurzelknoten der übergebenen Matrix; für den Anfangsaufruf wird
Figure imgf000020_0003
gesetzt, da in diesem Falle kein der
Matrix übergeordneter Knoten existiert. J \ ..'wird rekursiv mit einer Fallunterscheidung definiert:
Figure imgf000021_0001
Für den Fall Jl - Iwird tnur eine einzelne zweidimensionale Knotenkoordinate enthalten. Andernfalls berechnet man einen Vektor, dessen erste Komponente den Angriffspunkt der Kraftvektoren angibt (vgl. Gleichung 12); für X -- 6 wird allerdings stattdessen berechnet
Figure imgf000021_0002
weil in diesem Fall kein übergeordneter Wurzelknoten Λ Vorliegt. Das Skalarprodukt des ersten
Zeilenvektors
Figure imgf000021_0003
on j!4_mit dem Vektor /involviert wegen der in Figur 13 angedeuteten Struktur der Matrix genau die Knoten des Graphen, die mit dem aktuell zu berechnenden Punkt durch eine direkte Kante verbunden sind. Das erste Element ^iϊder
Valenzmatrix
Figure imgf000021_0005
Bronstein, I. N.; Semendjajew, K. A.; Musiol, G.; Mühlig, H.:
Taschenbuch der Mathematik. Harri Deutsch, 2005 ) enthält deren Anzahl.
Die verbleibenden Komponenten des Ergebnisvektors von Gl. 16 werden durch eine zweite
Funktion fJ \ /zum Zerteilen der Matrix jAdefiniert:
Figure imgf000021_0004
Die Funktionen
Figure imgf000022_0001
und
Figure imgf000022_0004
extrahieren die /-te Teilmatrix von ./lund den korrespondierenden Teilvektor von £unter Zuhilfenahme von
Figure imgf000022_0002
und
Figure imgf000022_0005
Für Twerden also die Spuren der Teilmatrizen der Valenzmatrix bis zur ϊ-ten Teilmatrix aufsummiert. Auf die Valenzmatrix .Oangewendet, ergeben sich so die vertikalen Koordinaten der gesuchten Teilmatrix in A. Folgende Funktionen werden dabei verwendet:
Figure imgf000022_0003
zur Berechnung eines Matrizenindex aus der Ordinalzahl einer Teilmatrix, also die Angabe, an welcher Stelle der Me direkte Teilbaum der aktuell betrachteten Wurzel in fliegt,
Figure imgf000022_0006
zur Ermittlung der Anzahl Verbindungen des Teilbaumes, dessen Wurzel an
Figure imgf000022_0007
wird dabei die Valenzmatrix xϊϊerwartet, sowie
Figure imgf000023_0001
mit
Figure imgf000023_0002
für die Summe der Spuren aller auf die gleiche Wurzel direkt bezogenen Teilmatrizen.
Man erhält auf diese Weise einen Vektor
Figure imgf000023_0003
durch dessen Komponenten ein lineares Gleichungssystem bestimmt wird. Für deren systematische Auflösung wird ein Einsetzungsverfahren vorgeschlagen, das dem gleichen rekursiven Schema der Gleichungen 16 und 18 folgt.
Experimentelle Umsetzung
Das oben beschriebene Modell wird beispielhaft an konfokalen Aufnahmen umgesetzt. Dazu werden Aufnahmen von HeLa-Zellen in drei unterschiedlichen spektralen Kanälen mit Färbungen der Kerne, des Zytoplasmas und der Adhäsionspunkte verwendet (Figur 14); derartige Färbemethoden sind in der Literatur ausführlich beschrieben.
Auf den entsprechenden Kanälen wird zunächst eine Erkennung der Nuklei sowie davon ausgehend eine Segmentation des Zytoplasmas durchgeführt; ferner werden die Adhäsionspunkte lokalisiert und anhand ihrer Lage bezüglich der Zytoplasma-Segmentation in innere und äußere Punkte klassifiziert. Für die Menge der im Segmentationsschritt erkannten Zellen werden die jeweiligen äußeren Adhäsionspunkte benutzt, um das oben vorgestellte Modell zu konstruieren. Die Knoten der Skelettbäume werden dabei als Vorhersagen für die tatsächliche Lage der internen Adhäsionspunkte betrachtet, wie sie durch die Analyse der Aufnahmen bestimmt wurden. Die Verifikation des Modells besteht also in einem Vergleich der Vorhersage dieser Punkte mit den tatsächlichen Lokationen.
Die gemessenen Daten liegen als 8-Bit-Graustufenbilder in einer Auflösung vonl345 x 991 im PNG-Format vor. Gefärbt werden als innere Adhäsionspunkte ausschließlich solche Verbindungen, die zwischen Faserendpunkten und Zelϊäußerem besteht, nicht aber Verbindungen zwischen Fasern innerhalb der Zelle.
Die nachfolgend beschriebene Objekterkennung wurde mit der Software „Acapella" der Firma Evotec Technologies GmbH durchgeführt. Aus Gründen der Effizienz werden die Aufnahmen zunächst auf ein Viertel der originären Auflösung skaliert; dabei wird von jeweils vier benachbarten Bildpunkten der Median ihrer Intensität gewählt. Sodann wird auf dem Bild der Zellkerne eine einfache globale Schwellwertanalyse durchgeführt; die entstehende binäre Karte (engl, map oder mask) wird mittels Connected-Component-Labelling unter Berücksichtigung von 8- Nachbarschaften zu einer Schablone (engl, stencil) konvertiert, deren Objekte bereits weitgehend den zu detektierenden Nuclei entsprechen. Um zu verhindern, dass mehrere nahe beieinander liegende Zellkerne als ein einziger Kern erkannt werden, wird eine Heuristik zur Trennung von Objekten eingeführt. Die bisher bekannten Objekte werden in innere äquidistante Zonen mit dem Intervall
Figure imgf000024_0001
aufgeteilt, so dass Δöder Zonenbreite entspricht (Kirsch, Achim; Ollikainen, Olavi: Methodfor Analyzing Chemical and/or Biological Samples by Means of Particle Images}. WO 03/088123 AJ).
Die Intensitätswerte der Bildfunktion i/ V** f werden mit einer Zonenfunktion \ /multipliziert, die den Wert iVderjenigen Zone liefert, die .fenthält. Auf diese Weise werden Intensitätsmaxima herbeigeführt, die annähernd den tatsächlichen Zentren der Nuklei entsprechen. Mit einer Extremwertanalyse werden diese geortet und als Initialisierungspunkte einer Wasserscheidentransformation auf dem Gebiet der vorher erstellten binären Karte eingesetzt (Roerdink, Jos B. T. M.; Meijster, Arnold: The Watershed Transform: Definitions, Algorithms and Paralleli∑ation Strategies. In: Fundamenta Informaticae 41 (2001), S. 187—228 ). Die bei dieser Transformation entstehenden Objekte korrespondieren weitgehend mit den zu erkennenden Nuklei und behandeln auch einander tangierende Kerne als separate Partikel. Die Kernerkennung schließt ab mit einer Filterung der Objekte in Abhängigkeit ihrer Größe. Bei der gegebenen Auflösung wurde mit einer Mindestgröße von 100 Bildpunkten ein zufrieden stellendes Ergebnis erzielt. Für die Erkennung des Zytoplasmas im zweiten spektralen Kanal wurde zunächst eine Analyse nach Artefakten unternommen, um stellenweise existierende überbelichtete Bereiche zu eliminieren. Diese können als Verunreinigungen der Zellkultur auftreten und stören den Segmentationsprozeß. Hierzu wird das für die Nukleidetektion beschriebene Verfahren auf der Zytoplasmaaumahme wiederholt und das Ergebnis mit den bereits bekannten Nuclei verglichen; als Artefakt werden jene Objekte definiert, die mit den Kernen keinerlei Überlappung aufweisen. Eine erneute Schwellwertanalyse ergibt wiederum eine binäre Karte, von der die Artefaktfiächen abgezogen werden. Das Ergebnis wird als räumliche Begrenzung für eine nachfolgende Anwendung der Wasser Scheidentransformation benutzt. Diese wird mit den eingangs georteten Nuklei initialisiert, so dass Objekte erhalten werden, deren Anzahl mit der Zahl der Nuklei übereinstimmen und die jeweils mit einem Nukleus korrespondieren. Wegen der stark heterogenen Intensitätsverteilung des Zytoplasmas genügt die einfache Anwendung der Transformation nicht, um den durch als Begrenzung vorgegebenen Stencil komplett auszufüllen. Daher wird eine einfache Glättung durchgeführt mit
Figure imgf000025_0001
und erneut transformiert. Hierbei wird nun bei jedem für das Regionenwachstum betrachteten Bildpunkt abweichend von der klassischen Wasserscheidentransformation nicht allein die Intensität des einzelnen Nachbarpixels eines Objektes betrachtet, sondern die Intensität aller benachbarten Pixel. Durch dieses Vorgehen wird eine wesentlich weitergehende Abdeckung der als Begrenzung vorgesehenen Zytoplasmafläche erreicht.
Für die anvisierte Verifikation ist es vorteilhaft, nur vollständig abgebildete Zellen zu berücksichtigen; von den lokalisierten Objekten sollten also diejenigen entfernt werden, die über den Bildrand hinaus ragen. Ein striktes Löschen aller Objekte, die mindestens einen Punkt mit den äußersten Bildkoordinaten gemein haben, wäre ein zu strenges Vorgehen, bei dem viele Zellen unberücksichtigt blieben, die durchaus komplett abgebildet sind. Vorteilhaft ist daher eine Selektion, bei der nur Objekte mit mehr als 20 solchen Punkten weggenommen werden. Die Zytoplasmadetektion endet mit einem automatischen Schließen aller innerhalb von Objekten auftretenden Löcher. Außerdem werden Objekte gelöscht, die eine geringere Fläche als 500 Bildpunkte besitzen und damit zu klein sind, als dass sie mit einer realen Zelle korrespondieren können.
Die Lokalisierung der Adhäsionspunkte wurde auf dem dritten spektralen Kanal in Form einer Maximasuche durchgeführt. Die zu analysierende Fläche gleicht dem durch die Zytoplasmadetektion definierten Bildbereich. Dabei wird Punkte als Maxima angesehen, wenn diese innerhalb eines Radius von drei Bildpunkten eine maximale Helligkeit besitzen. Ferner sollte der Kontrast von Maximum * Pt α&und geringster Intensität * Rcfcrcncc
Figure imgf000026_0002
der jeweils betrachteten Fläche auf diesem Bild mindestens 0.2 betragen, und als minimaler Quotient
Figure imgf000026_0001
wurde ein Wert von 1,1 ermittelt; dieser letzte Parameter verwendet 'Cell als mittlere Intensität der jeweiligen Zellfläche. Aus den so berechneten salienten Flächen (engl. Spots) wird das jeweilige Maximum als Koordinate eines Adhäsionspunktes extrahiert.
Die oben beschriebene Segmentation wird durchgeführt. Mittels der oben näher erläuterten Clustering-Methode werden aus den extrahierten Adhäsionspunkten Graphen für die Modelle der Zytoskelette konstruiert und ausbalanciert. Einige Beispiele für diese Graphen finden sich in Figur 16. Auf Basis der so bestimmten Landmarken (auch saliente Punkte oder Blattknoten genannt) sowie der diese mit ihrem zugehörigen Vaterknoten (engl. Parent) verbindenden Vektoren werden - wie schon in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben - vorzugsweise Splines verwendet, um den Verlauf der Zellmembran abschnittsweise zu rekonstruieren. Ausführungsbeispiel 3
Beispielhaft wurde das der Erfindung zugrunde liegende Verfahren bei der Untersuchung von Knochenmarkkrebsgewebe (U2OS-Zellen) angewendet. Für die Umsetzung des Erfindungsgedankens zur Untersuchung von Zellen in menschlichem Knochenmarkkrebsgewebe (U2OS) wird zunächst von der Existenz von Landmarken ausgegangen. Sie sollen diejenigen Punkte auf der Zellmembranlinie bezeichnen, die Krümmungsextrema verkörpern; dies folgt aus der Beobachtung, nach der die Membranlinie sich aus verschieden langen Abschnitten mit mehr oder weniger stark ausgeprägtem konkaven Verlauf zusammensetzt. Die Konkavität hängt also direkt von der lokalen Dichte von Landmarken ab. Bei den im vorliegenden Beispiel betrachteten Zellen wurden somit zunächst Landmarken detektiert. Es wurde außerdem eine zweite Messung mit gefärbten Kernen durchgeführt aus deren Ergebnissen sich mittels einer einfachen Schwellwertanalyse und Connected-Component-Labelling (T. Pavlidis: Structural Pattern Recognition. Springer 1977) die Kerne extrahieren lassen. Somit wurde eine Kernrandlinie detektiert, die den Grenzbereich zwischen Kern und Zytoplasma in einer 2-D-Darstellung angibt.
Für jede Landmarke wurde der nächstgelegene Punkt auf der Kernlinie bestimmt. Beide Punkte zusammen bilden einen lokalen Vektor - die sogenannte Wachstumsachse - der grob die Orientierung des Zytoplasmas in dieser Richtung angibt. Die Menge dieser Vektoren kann dann nach der Reihenfolge ihrer Fußpunkte auf der Kernlinie sortiert werden; die Sortierung von Vektoren mit identischen Fußpunkten wurde mittels einer Analyse der lokalen Lage der Vektoren bezüglich der Kernlinie durchgeführt.
Diese lokalen Richtungsvektoren wurden genutzt, um die jeweils zwischen benachbarten Vektoren aufgespannten Konturabschnitte zu parametrisieren. Zur Modellierung mittels kubischer Splines wurden dabei neben der Orientierung der flankierenden Vektoren deren Längen benutzt. Um die Konkavitäten der Splines adäquat zu modellieren, wurde das Skalarprodukt jeweils benachbarter Richtungsvektoren als lokales Maß eingesetzt. Dazu wurden zunächst alle Vektoren normiert und anschließend die Produkte berechnet. Der Wertebereich liegt zwischen 1 und -1, wobei ein Produkt nahe 1 für sehr eng beieinander liegende Vektoren steht und -1 die bei dieser Art von Vektoren maximal mögliche Spannweite angibt. Der Wertebereich wird von [-1..1] auf [1..0] abgebildet. Schließlich wird jedes Vektorpaar mit dem so gebildeten Produkt skaliert. In dieser Form werden die Paare dann direkt zur Parametrisierung von Membranlimenabschnitten eingesetzt. Figur 5 zeigt eine Aufnahme von Knochenmarkskrebsgewebe (U2OS-Zellen), bei der das Zytoplasma durch entsprechende Färbung hervorgehoben wurde. In Figur 6 sind in der gleichen Aufnahme Zellkernlinie und Wachstumsachsen eingetragen. Figur 7 wiederum zeigt das Ergebnis einer Membranapproximation mit Splines, wobei die approximierte Membrankontur mit unterschiedlich skalierten Richtungsvektoren hergestellt wurde entsprechend des vorstehend beschriebenen Anwendungsbeispiels. Die Figuren 8 und 9 zeigen zwei weitere Ergebnisse, die auf diese Weise erzielt wurden.
Ausführungsbeispiel 4
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde eine Untersuchung an weiteren Zelltypen angewendet. Im konkreten Fall handelte es sich ebenfalls um Zellen im Knochenmarkskrebsgewebe, jedoch mit größeren Abständen zwischen benachbarten Zellen im Vergleich zu den vorhergehenden Figuren. Die größeren Abstände bedingen im Zellgewebe eine freiere Ausbildung der Zellkontur bei der einzelnen Zelle. Die vorstehend beschriebenen Landmarken wurden wiederum für die Parametrisierung von Splines mittels Richtungsvektoren (Wachstumsachsen) herangezogen. Bei den betrachteten Zellen konnten die Landmarken unter manchen Umständen nicht mehr in der Reihenfolge ihrer Lage auf der Membrankontur sortiert werden; das vorliegende Beispiel demonstriert ferner, dass für Zellen mit weiträumiger Ausdehnung des Zytoplasmas eine vom Kern unabhängigere Lage der Wachstumsachsen — also eine lokale Orientierung — vorteilhaft ist und mit dem der Erfindung zugrundeliegenden Verfahren bestimmt werden kann.
Hierzu wurden zunächst wurden die beiden orthogonal aufeinander stehenden Orientierungsachsen des vorliegenden Zellkerns bestimmt. Danach wurde die Menge der Landmarken aufgeteilt in zwei Teilmengen A und B, so dass A diejenigen Marken enthielt, die in der ersten der beiden Halbebenen liegen, welche von der kleineren Kernachse gebildet werden. Die Menge B enthielt analog die Marken der zweiten Halbebene.
Für jede der beiden Mengen A und B wurde nun folgendes Verfahren durchgeführt:
Es wurde eine Strecke g eingetragen, deren Anfangspunkt auf dem Schnittpunkt s der beiden
Kernachsen lag. Die Richtung von g wurde so bestimmt, dass die Entfernung aller Landmarken in dieser Halbebene zu g minimal wurde. Für dieses Minimierungsproblem ließ sich etwa die Diskriminantenanalyse einsetzen (R. Duda, P. Hart, D. Stork: Pattern Classification. Wiley- Interscience, 2001). Als Endpunkt von g wurde sodann derjenige Punkt p bestimmt, für den galt: p liegt möglichst nah an s, und jenseits der Orthogonale zu g durch p liegen keine Landmarken mehr.
Die Menge der Marken in der betrachteten Halbebene wurde nun erneut in zwei Mengen aufgeteilt, so dass diese jeweils die Marken beiderseits der berechneten Strecke enthielten.
Der Vorgang wurde rekursiv wiederholt, wobei nun als Halbebenen die Räume beiderseits von g betrachtet wurden. Anstelle des Schnittpunktes s zur Bestimmung des neuen Di skriminantenur Sprunges wurde nun der Mittelpunkt der Strecke g benutzt. Eine neue Diskriminante g' wurde anschließend so berechnet, dass die verbleibenden Landmarken der betrachteten Halbebene in disj unkte Mengen separiert werden konnten.
Die beschriebenen parallelen Vorgänge endeten jeweils, sobald eine Halbebene nur noch eine einzelne Landmarke enthielt. In diesem Fall wurde als Endpunkt der zu bestimmenden Diskriminanten die Position dieser Marke gewählt. Alle Diskriminanten, die auf diese Weise entstanden, dienten nun als Wachstumsachsen und wurden als lokale Orientierungen der Zellmembranlinie angesehen.
Der durch die wiederholte Berechnung von Diskriminanten konstruierte Graph erlaubte nun eine einfache Sortierung der Landmarken. Hierzu wurde für die beiden Graphen, die jeweils in den zuerst bestimmten Halbebenen liegen, ein Tree-Traversal durchgeführt. Die beiden Graphen ließen sich näher charakterisieren als Bäume, und eine Ordnung der Landmarken — die auf den Blattknoten des Baumes liegen — konnte durch einen Preorder-Durchlauf des Baumes errichtet werden (I. Bronstein, K. Semendjajew, G. Musiol, H. Mühlig: Taschenbuch der Mathematik. Verlag Harri Deutsch, 2005).
Analog zu dem zuvor angegebenen Anwendungsbeispiel wurde nun die Membranlinie konstruiert durch eine Parametrisierung von Splinesegmenten, die durch jeweils benachbarte Wachstumsachsen gegeben wurde. Ebenfalls analog zum vorgenannten Beispiel wurden die Achsen optional mit den paarweise bestimmten Skalarprodukten skaliert, um der Natur des jeweils betrachteten Zelltyps gerecht zu werden.
Ausführungsbeispiel 5
Das der Erfindung zugrundeliegende Verfahren wurde in einem weiteren Beispiel angewendet, um die Landmarken überhaupt erst zu erkennen. Hierzu wurde zunächst die Verteilung der Bildintensitäten in der Nachbarschaft der Kernlinie betrachtet. Es entspricht der Natur vieler Aufnahmetechniken und Experimentvorrichtungen, dass die Intensität um den Kern ein Maximum erreicht und in Richtung der Membranlinie nach allen Seiten abnimmt. Diese Abnahme ist ungleichmäßig insofern als in alle Richtungen unterschiedlich große Entfernungen zur Membranlinie bestehen und der abgelichtete Farbstoff außerdem nicht absolut gleichmäßig verteilt ist.
Ausgehend von den Punkten auf der Kernlinie wurde nach den Wasserscheiden gesucht, also denjenigen ~ nicht notwendigerweise geraden — Linien, die jeweils den Grat der lokalen Intensitätsverteilung angeben (H. Meine, U. Köthe: Image Segmentation with the Exact Watershed Transform. In: Proceedings of the Fifth IASTED International Conference on Visualization, Imaging, and Image Processing, September 2005, S.400-405).
Die gängigen Verfahren zur Wasserscheidentransformation berücksichtigen bereits eine Gabelung der Linien an Scheidepunkten, so dass auf diese Weise wiederum eine graphenähnliche Struktur entsteht. In einem Zwischenschritt wurde diese Struktur von zyklischen Kanten befreit — also von Kanten, die parallel verlaufende Teile des Graphen verbinden. Ferner galt es, diejenigen Kanten zu löschen, die Scheidepunkte eines zu einem bestimmten Kern gehörenden Graphen mit den Scheidepunkten des Graphen eines benachbarten Kerns verbanden. Auf diese Weise wurden auch die endgültigen Endpunkte der Graphen gebildet. Trafen Wasserscheiden benachbarter Zellgraphen direkt aufeinander, wurden sie an einem in diesem Bereich liegenden Intensitätsminimum getrennt. Vergleichbare Methoden wurden auf die Abgrenzung von Hintergrundbereichen angewendet, wobei der Charakter der Aufnahme maßgebend für die jeweils durchgeführte Optimierung des Graphen maßgebend war. Aus den Blättern und den äußersten Knoten der Graphen wurden Wachstumsachsen bestimmt, die dann wie in den vorstehenden Beispielen zur Parametrisierung abschnittsweiser Membranlinien- segmente mittels Spline-Approximation herangezogen wurden.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Ermittlung von Membrankonturen in Bildern biologischer Zellen, das die folgenden Schritte umfasst:
- Detektieren einer Sub struktur einer biologischen Zelle, wobei die Substruktur zur Lokalisierung der biologischen Zelle im Bild dient,
- Detektieren einer Mehrzahl von Landmarken unter Berücksichtigung der räumlichen Lage der Sub struktur,
Bestimmen von Liniensegmenten zwischen Paaren räumlich benachbarter
Landmarken, und
Zusammensetzen der Liniensegmente zu einer Membrankontur, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Liniensegmente physikalisch-biologische Erkenntnisse bezüglich der Zellstatik zugrunde gelegt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Substruktur der biologischen Zelle eine Zellorganelle, vorzugsweise der Zellkern, ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Landmarken äußere Begrenzungspunkte des Zytoskeletts darstellen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Liniensegmente das Zytoskelett oder Bestandteile hiervon rekonstruiert werden, wobei die Rekonstruktion insbesondere unter Nutzung des Wissens über die Lage von Substruktur und/oder Landmarken erfolgt, und vorzugsweise Länge, Ausrichtung und/oder Verzweigungsmuster des Zytoskeletts oder seiner Bestandteile ermittelt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Liniensegmente ein Modell zugrunde gelegt wird, bei dem die Zellmorphologie, insbesondere die Membrankontur, als Funktion der Geometrie des Zytoskeletts oder seiner Bestandteile, wie z.B. Mikrotubuli, intermediäre Filamente, Mikrofilamente, beschrieben wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Liniensegmente ein Energiefunktional minimiert wird, welches von einer oder mehreren der folgenden Größen abhängt: mechanische Spannung der Membran, Krümmung der Membran, Grenzflächenenergie, Zelloberfläche, Zellvolumen, osmotischer Druck.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Liniensegmente Polynome oder Splines, insbesondere Bezier- Splines, verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Liniensegmente konkave Kurven zweiter oder dritter Ordnung darstellen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Kontur die die Zelle begrenzende Zellmembran ermittelt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Konturen in einem Bild eines biologischen Gewebes, insbesondere eines Gewebeschnittes oder einer konfluenten Zelllage, ermittelt werden,
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Konturen in einem Bild einer oder mehrerer sich in Suspension befindlichen Zellen ermittelt werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass Konturen in einem Bild einer oder mehrerer sedimentierter oder adhärenter Zellen ermittelt werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass Informationen über die Lage und/oder Ausrichtung der Substruktur bei der Detektion der Landmarken und/oder der Bestimmung der Liniensegmente berücksichtigt werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass Informationen über die räumliche Dichte der Landmarken zur Bestimmung der Liniensegmente berücksichtigt werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine hohe räumliche Dichte von Landmarken derart berücksichtigt wird, dass flache Liniensegmente entstehen.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass Erkenntnisse des Tensigritätsmodells zur Bestimmung der Liniensegmente herangezogen werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass (i) mindestens eine Achse definiert wird als Verbindung zwischen einer Landmarke und einem auf der Substruktur liegenden Punkt und (ii) Länge und/oder Orientierung der Achse zur Bestimmung der Liniensegmente herangezogen wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Achsen definiert werden und der Winkel zwischen diesen zwei vorzugsweise benachbarten Achsen zur Bestimmung der Liniensegmente herangezogen wird.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Liniensegmente Splines, vorzugsweise Bezier-Splines, verwendet werden, deren Parameter von Länge und/oder Orientierung der Achse(n) und/oder Winkel zwischen zwei vorzugsweise benachbarten Achsen abhängig sind.
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