WO2007037550A1 - Therapeutic or diagnostic application of tsta3 gene - Google Patents

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WO2007037550A1
WO2007037550A1 PCT/JP2006/320035 JP2006320035W WO2007037550A1 WO 2007037550 A1 WO2007037550 A1 WO 2007037550A1 JP 2006320035 W JP2006320035 W JP 2006320035W WO 2007037550 A1 WO2007037550 A1 WO 2007037550A1
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tsta
protein
tsta3
antibody
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Shinichirou Niwa
Yasutaka Makino
Tomoki Ikuta
Kazuya Arai
Takayuki Shindou
Hiromichi Ogura
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Link Genomics, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a gene which is specifically amplified in cans T and its therapeutic or diagnostic use.
  • a characteristic feature of sexual tumors is the growth, invasion, and metastasis of the body through which it can be killed. Sufficient coping with local recurrence such as surgical resection or radiation therapy. Drugs with systemic therapy. Expected to improve future treatment results.
  • Chemotherapy uses cell killing agents that directly act on the cells or RNA and lead to cell death.
  • bone marrow cells germ cells hair matrix cells digestion division Acting on cells and causing strong side effects
  • EGFR epimal growth factor receptor
  • Tyronon kinase inhibitor generic name: Kehuitinif
  • HER-2 human epidermal growth factor receptor 2
  • the present inventors have found that a gene that is frequently amplified or TST in a large intestine canal (which has been extensively studied).
  • the present invention was completed by inhibiting the growth of cancer cells by inhibiting the expression of quality. That is, the present invention provides a screening method for a candidate substance having an inhibitory action on a drug preparation, and a diagnostic method for a diagnostic quinotocan.
  • a screening method comprising a step of selecting the expression regenerative compound as compared with the case where the test compound is not contacted.
  • Radioactive ft isotope Therapeutic protein ⁇ is a low molecular weight drug or a supported hectare as described in (1 0) above.
  • the above or the large intestine is the above (1 3) or (14 diagnostic agent.
  • a quinoto for diagnosis that contains a phototap from a base sequence that can be hyfletized under string-free conditions in the TSTA3 gene or a part of the base sequence.
  • the above or the large intestine is the above (1 6) or (1 7 diagnostic mushrooms.
  • TANA 3 protein activity inhibitor is administered to the subject
  • An anti-rapeutic agent comprising a horincleito having the TSTA 3 gene expression inhibitor as an active ingredient, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: A brief description of the 0 side
  • 01 is a histogram showing the frequency of the TSTA 3 gene in 200 specimens from colonic epilepsy.
  • 02 is a photomicrograph (phase contrast image) showing the results of the analysis of STA1 gene s 1 RNA in (A) colorectal cell line RKO and (B) colorectal cancer.
  • Fig. 3 shows the results of (A) large intestine cancellous cell line RKO and (B) large intestine cancer, respectively, s 1 RNA of the TSTA3 gene, transferred 1 RNA, and quantitative RT-PCR results.
  • 06 is an optical micrograph (fluorescence image) of each specimen's tissue (A ⁇ part (6 cells)) derived from colorectal cancer patients analyzed by FISH method.
  • Ayohi B was analyzed by mass spectrometry (A) Colorectal illness Yohi (B) Class A A (: was determined by MS / MS analysis 07 shows the correspondence with noo acid (or amino acid sequence).
  • TSTA3 T issue specific tr an sp on an tigen P 35B was known as NADP (H) — Bonder FX (Morelli, A eta 1 rch B ioc hem Biop s 179 698 re 1 1 l A eta 1 (1977) FEBS L et 4) Research on mice Tissue-specific tr an spla an from the fact that obesity astocyt oma cellline) having a mutation in this gene was transplanted into mice and did not become settled by rejection. ti ge n P 35B).
  • FX is now an enzyme involved in the synthesis of GDP— (D) monomannos (L) — fucose. Fucose is the terminal of many cell surface and secreted N-lycans. (Sm 1 th, PL et 2) J Cell B iol 158 801—815) Serine ectln) (Lowe JB) 1 15-126 Carl ow DA, eta 1 (20 6841-6848).
  • FX plays an important role in the final stage of the fucose synthesis system (D) — GDP synthesized from Mannose by GDP—Mannose 4 6—Techret dratase) (GMD) — 4—Kenoichi (D) — FX converts mannose into GDP— 4—keto 6—theol course (3, 5—Echimerase) and NADP DP—4—keto 6—theokine (L) —converts galactose to GDP (4—Le (Sulliv an F 1 (1 998) JB iol Ch em 273 81 93- y ama C eta 1 (1998) JB iol Ch e 4582- 14587)
  • FX nocout mice have leuk dh esi on deficiency (LAD) t yp e silylated congenital disease—lie (Con genitaldiso (I z um l, Y eta 1 (1995) 216 215 lrah ama, T eta I (1993) C an cer 9-1 334 Th urin U, eta 1 (2002 Hy br ⁇ d om ⁇ cs 21 1 1 1— 1 16) FX has an important role in the biosynthesis of selectin licant involved in cell adhesion (E s he l R eta 1 (2000) JB m 275 1 2833-12840 E s he l R et 2) Int J Can cer 98 803-810).
  • the present inventors treat mandarin by suppressing the expression of TSTA3 gene, which has also been confirmed to suppress the proliferation of spermatogonia by suppressing RNA 1 expression of TSTA3 gene. It is also possible to measure the expression level of the TSTA3 gene.
  • TSTA3 gene refers to the human TSTA3 gene consisting of 1312 bases, which is Accession No NM—0033 in NCB I nuclease (SEQ ID NO: 1). Also included in this specification is a gene consisting of ⁇ ⁇ which consists of a nucleotide sequence that can be deflated under the conditions of a stringer or a complementary sequence in the base sequence of the gene or its complementary sequence that may be altered by having a deletion addition or insertion. It is called “TSTA3 gene” to be used.
  • the hyphenation is carried out according to a known method or according to a molecular clinching numb (Molecular Clon id Ed iti on JS amb ro ok eta 1 Ci ng Har bo lab Labs 2001). Come over. You can also use a commercially available life rally according to the method described in the instruction manual.
  • “severe conditions” may be low stringent conditions, medium stringent conditions, or stringent conditions.
  • “Low stringency is 5XSSC 5 X Tenhard solution 0 5% SDS 50 32 ° C.
  • “ Medium stringent condition ” is SC 5X Tenhard solution 0 5% SDS 50% formamide.
  • “Stringent conditions” is, for example, 5 XS Slt solution 0 5% SDS 50% formamide 50
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is, for example, 70% or more ⁇ 5 or more 85% or more 90% or more 91% or more 92% or more 93 or more 95% or more 96% or more 97% or more 98% or more 99 I can open it.
  • inhibition of gene expression refers to a tan-haku inherited from a gene by inhibiting any of the events (eg, transcription (mRNA generation), translation (tan-haku-mu)). It shall mean to inhibit the production of quality.
  • TSTA3 protein refers to human TSTA3 protein consisting of 321 amino acid residues that are accessi on No NP—003 in NCB I evening hose and substantially similar to this protein.
  • Activity for example, 3 5 (ep ime rase)
  • Activity 4 Reyu cact (Re duc an FX eta 1 (1998) J hem 273 8193-8202 Oh yama C et 98) JB iol Ch em 273 14582 -1458 K eta 1 (2003) Can cer Res 63 89)), and the deletion of one or more amino acid residues from this sequence.
  • a mutant protein consisting of an amino acid sequence.
  • Amino acid mutation site and number in the above-mentioned mutant protein As long as the protein has substantially the same activity as the original protein, the number of mutations is, for example, 1-50, 1-40, 1-30 Pieces And having substantially the same quality of activity as the original protein, the larger the homology value, the better.
  • TSTA3 protein contains “TSTA3 protein”.
  • the partial amino acid sequence of TS amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) is preferably used.
  • Any of the TSTA3 proteins of any of the following may be used, such as at least 20 amino acids in the sequence amino acid sequence, preferably at least 70, more preferably at least 10 or at least 200 amino acids.
  • An amino acid sequence consisting of residues. are preferably listed.
  • These polymorphs contain an amino acid sequence corresponding to the portion involved in the activity of the protein. 1 or more in the row (e.g., about 1 to 20 is more preferable, even more preferably 1 to 5) Or Te that has been modified by amino acid residues or deletion or insertion of degrees).
  • the TSTA 3 protein used in the present invention can be prepared from the original weave. These seeds can also be synthesized by a synthesizer, prokaryotic or eukaryotic, or prepared by a recombinant method using appropriate Shuo cells. Is it okay?
  • Can c res les 63, 6282 Can it be done in accordance with the method such as 6289? For example, it can be measured in accordance with the screen described later.
  • cancer treatment agent is used to mean an anti-cancer agent, a cancer metastasis inhibitor, a phacosinos inducer, a cancer cell growth inhibitor, a cancer cell invasion inhibitor, and the term “cancer”.
  • tumor is used as a term having the same meaning.
  • nucleic acid means an acid meaning RNA or DNA, which may contain not only furin and hiriminone bases but also those having modified heterocyclic bases. These fluorinated furin and hiliminone.
  • the acylated furin and furanized furin and hiriminone or other complex. Refers to a phenomenon in which a foreign gene and an inherently endogenous ft gene are harmed by double introduction having the same or similar sequence as the target gene sequence.
  • the RNA used here is a double-stranded RNA that produces a 30-base long RNA, such as dsR1 estr and RNA) s ⁇ RNA (sma1 1 ⁇ ngng RNA) or sRNA (shorthairpin).
  • RNA can also be localized to the target system of the rephosome, and can also be expressed locally using the above double-stranded RNA or hectare, such as (ds RNA sl RNA or s hRNA) Preparation Methods Known from various literatures (Special Table 2002- 516062)
  • the term “antisense nucleic acid” or “antisense nucleic acid” refers to a nucleic acid having a complementary chito in at least a part of a DNA region of interest and at least one of the region. I mean.
  • the nucleic acid may be RNA DNA or modified nucleic acid (RN). They may be double-stranded DNA—double-stranded DNA—and DNA RNA hyphenated.
  • the modified nucleus is a nucleic acid sulfur derivative. Thiophosphate derivatives Furthermore, it is not limited to force that has resistance ft to the degradation of foliate and oriconucleocytoamis.
  • the antisense nucleic acid used is linked to a sequence containing a transcription termination signal downstream or on the appropriate side of the appropriate promoter.
  • This nucleic acid can be transformed into a desired animal using known methods. Sequence is the endogenous gene of the animal to be transformed More preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more and about 95% or more complementarity. ,
  • the length of the sense nucleic acid is at least about 10 bases or more (for example, 10 is preferably about 15 bases or more, more preferably about 100 salts or more, preferably There are about 500 bases or more.
  • Antisense nucleic acid can be designed as follows (for example, Hirashima and Inoue Neonatal acid IV gene replication and expression The Japan Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin 1 19-347) JK a wa k am ⁇ eta 1 P ha J ap an Vo l 8 p 247 1 992 Vo l 8
  • the therapeutic agent for cans of the present invention uses, as an active ingredient, a nucleic acid having a refosym activity that cleaves into the TSTA 3 gene.
  • rehosym activity refers to a nucleic acid that specifically cleaves the mRNA of a gene used as a kenot. I mean. Is there a rehosym I intron type or Ml RN A contained in RNa se P, or is it larger than a chito? Some have a hammer type or hea hin 0 active nucleotides (Tanha 1990) 35 p 2 1 9 1). Hammerhead Rehosaime FEBS L ett 1988 228 p 228 F t 1988 239, p 285 Protein Nucleic Acid Enzyme 19 Come to harm
  • the present invention can use as an active ingredient an inhibitor of the transcriptional activity of the TSTA 3 gene.
  • a compound is a compound that binds to a factor involved in the expression and transcription of the 3 gene.
  • the product may be a natural product or a synthetic compound. Such compounds can be obtained by the link method.
  • Cancer containing 1 2 T S T A 3 protein activity inhibitory substance provides a therapeutic agent for cannula containing TSTA 3 protein.
  • TSTA3 protein activity inhibitor TSTA3 protein activity inhibitor
  • antibody refers to the entire length or fragment of a protein.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, so long as it binds to the T protein of the present invention, the above monoclonal antibody monoclonal human antibody humanized antibody by gene recombination and the antibody product thereof are also included.
  • Antibodies that bind to TSTA 3 protein may be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • the TSTA3 protein activity ft can be used as the above-mentioned antibody or mutant active ingredient that binds to the TSTA3 protein.
  • Such compounds are examples of compounds that bind to proteins and inhibit their activity, which may be natural or synthetic. Such compounds can be obtained by the method described below.
  • the present invention relates to screening of candidate compounds having an anti-cane action.
  • One preferred embodiment is a method using TSTA 3 protein and a test compound. It is expected to have an effect of inhibiting the activity of the compound protein that normally binds to TSTA 3 protein. This is preferably binding to the active site of TSTA3 protein.
  • the TSTA3 protein is brought into contact with the test compound. The protein responds to the finger to detect the binding with the test compound.
  • Purified form of protein It can be expressed intracellularly or extracellularly or bound to an affinity column. This method can be used by appropriately labeling the compound as necessary, and as a knowledge, radiolabel, fluorescence knowledge, etc. can be mentioned. Not determined.
  • the binding of the TSTA3 protein to the test compound is detected by, for example, the knowledge attached to the test compound bound to the T protein.
  • the change in TSTA 3 protein activity can be used as an indicator.
  • the binding activity between the protein and the test compound can be determined by known methods (eg Sulliv an FX, e 998) JB iol Ch em 273 81 93 Ohyama C eta 1 (1 998) JB em 273 14582-14587 No daa 1 (2003) Cancer Res 63 63).
  • Another embodiment of the screening method of the present invention is a method for TSTA3 inheritance.
  • the cells are further brought into contact with cells expressing the TSTA 3 gene.
  • the origin of the “cells” used is human mouse urchin hysson chicken and henoto cells that are not derived from livestock, etc. Cells or exogenous tt T ST Compound life rally Gene life rally expression product Cell extraction Fermentation microorganism product Marine organism extract Plant extract etc.
  • test compound or protein A method of introducing a DNA hector expressing a protein into the cell.
  • the expression level of the TSTA 3 gene “gene expression” includes both transcription and translation.
  • Hell can be measured by methods known to those skilled in the art. It is possible to measure the transcriptional reherence of the A3 gene by extracting the mRNA from cells expressing the A3 gene according to a conventional method, and using the Norse hybri-isen method or RT-PC. Disclose the floor motor region of TA 3 gene according to the conventional method.
  • the transcription level of the gene can also be determined by looking at the TSTA3 gene expression from the cells expressing the TSTA3 gene and detecting the expression of the TSTA3 protein by SDS-PAGE. It is also possible to measure the residue by detecting the expression of the protein by Western Frono using an antibody against TSTA 3 protein Detection of T STA 3 protein 3 Anti-TSTA3 antibody and therapeutic agent containing this antibody, complex
  • the present invention also contains an anti-TSTA3 antibody. In one preferred embodiment of the present invention, the above therapeutic agents are used or for enthusiastic drug delivery.
  • the “anti-TSTA3 antibody” is an anti-TSTA3 antibody that specifically binds to TS TA3 Tanja (including partial hechito) or a salt thereof).
  • the anti-TSTA3 antibody used in the present invention is a monoclonal antibody or monoclonal antibody. May be.
  • the antibody class also includes any antibody, such as IgG IgM Ig Ig gD or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in consideration of the above.
  • the term used here is meant to include any antibody fragment or derivative.
  • the antibody of the present invention can be produced by a known method. This method is well known in the art (see, for example, Har 1 ow E & Antibody, Cold Spring Harborory Pres (1 988)).
  • the protein used as the sensitizing antigen in the present invention is a protein or a salt thereof.
  • the above TSTA3 protein contains chito, isn't it limited? Good.
  • the TSTA protein used here or its part is used, for example, as a salt with a mechanical acid (eg, hydrochloric acid or sulfuric acid) or a salt with acetic acid, oxalic acid or fluoric acid).
  • the TSTA 3 protein of the present invention to be used for the antibody is preferably derived from a mammal, for example, a mouse derived from a human or a mouse.
  • Dust STA 3 protein as described above
  • TSTA3 Ranoto mouse Usaki antigen per animal
  • FCA Freund Hunt
  • F IA Freund Hunt
  • aluminum hydroxide etc.
  • the interval between administrations is particularly limited. Several days to several weeks, preferably 2 to 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times. After 0 days from immunization, antibody-producing cells are preferably collected after 1 to 14.
  • Anti-spleen cells Linha node cells Peripheral blood cells can be listed Where Linha node cells are preferable
  • Antibody-producing cells and myeloma cells The cell line YB 2Z0 and the Rano myeloma cell line. Next, the above-mentioned myeloma cells and antibody-producing cells are fused. Serum-free DMEM RPM I—1640 medium animal 1 X 1 0 6 ⁇ 1 X 10 7 cells Zm 1 antibody-producing cells and 2 X 10 Zml myeloma cells are mixed (antibody-producing cells and myelo 2 1-31 are preferred) Melt in the presence of cell fusion promoter It is possible to use an average molecular weight of 1000 to 6000 tarton recall as a cell fusion promoter. It is also possible to fuse antibody-producing cells with commercially available cell fusion devices that use electrical stimulation (eg Noyon).
  • electrical stimulation eg Noyon
  • Hyfuri-Nink is well following normal methods. Especially limited is part of the culture supernatant contained in wells grown as hyfritoma Immunoassay Radiation I Screening cells by radioimmunoassay etc. Cloning is performed by the limiting dilution method. And most Earth MEM medium or through e Te animal cell culture media in to serum medium such as 37 ° C 5% C_ ⁇ 2 concentration) Te cultured for 7 to 14 days to get that.
  • the antibody titer was measured by enzyme immunoassay (ELISA (enz ume lmmuno sorbentassy) or EIA (enzynoassay)) radio tt immunoassay (RIA rad ⁇ o ⁇ ss ay), etc. Search on the day of showing the antibody titer.
  • enzyme immunoassay enzyme immunoassay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA rad ⁇ o ⁇ ss ay radio tt immunoassay
  • the anti-blood clot polyclonal antibody For example, R lec hmann et al. (Riec hmann J Oct 5 203 (3) 825-8 1988) and Jone es et al. Nature 321 522-525 1986 can be prepared by one of the methods.
  • Antibodies that bind to TA 3 protein which can be produced by referring to“ Naturture Vol 368 p 856—859 199-500233 ”, are used for the purpose of cancer cell growth, etc.?
  • a human antibody it is preferable to use a human antibody to reduce the immunogen ft.
  • the antibody When used as a diagnostic agent, the antibody may be labeled as a radioisotope or a fluorescent substance for monitor links. Radioactive materials The most common compounds that can be identified are fluorescent compounds such as fluorescein isothionoa, rotamitrin and fluorescamine. Similarly, the bioluminescent compound TSTA3 antibody can be labeled. Bioluminescence ft tan haku Measured by detecting the presence of light. Heavy for this knowledge purpose 3 2 Complex containing anti-TSTA 3 antibody
  • the anti-TSTA 3 antibody used in the present invention itself be a neutralizing agent (agent) that weakens the activity of the antigen in the blocking agent of the present invention or combined with an agent that exhibits a therapeutic effect as necessary You can use it. Therefore, the present invention also provides a complex containing an anti-TSTA 3 antibody and another drug for use in targeting therapy or desensitization in humans (eg, large intestine). . According to such an embodiment, the anti-TSTA 3 antibody to be used can be used as an intelligent site for highly expressing TSTA 3 protein, as well as other agents that have therapeutic effects.
  • Examples of the “other leaf agent” used in the present invention include an elemental therapeutic protein, a low molecular weight drug, and a genetically-targeted non-viral hector.
  • examples of the “radioisotope” include radioactive halokens such as fluorinone 125 ( 125 I) and iodine-131. These radiohalogen elements are also known in the same way as the above-mentioned radiometal elements, and are widely used as radiotherapeutic agents or radio14 diagnostic agents.
  • 125 I or 131 I can be sterilized by chloramine T method, etc. It can be conjugated to an antibody fragment.
  • therapeutic proteins in the present invention are preferably immunity to the site of immunity, for example, human interleukin—macrofern colony stimulating factor human macrofernolo human interleukin 1 2 and the like.
  • toxins such as ricin and nophtheria toxin for colon colonization.
  • the fusion antibody with protein the antibody or antibody fragment is co-coated with the DNA coated with the protein. It is possible to construct an antibody by constructing A and introducing this DNA into a prokaryotic or eukaryotic expression hex.
  • Low molecular drug is used in this specification to mean “radiation ft isotope” or “drugs other than metallurgy or diagnostic compounds”.
  • a gene that exerts a therapeutic effect when it does not induce nose in a spurious part of a cell growth-related gene such as a gene related to cell proliferation (eg, large intestine) (therapeutic gene), a viral hector that binds to an anti-TSTA3 antibody When administered to a person in need of anti-TSTA3 child therapy, anti-TSTA 3 antibody (i.e., TSTA3) or activating to the existing site Get the gene.
  • “chemical bond” includes ionic bond, hydrogen bond, bond by interfacial force, and bond by hydrophobic interaction.
  • Engineerering bond includes, for example, an antibody and a therapeutic protein. This includes the mode of binding between the antibody and the treatment when produced using any technology. 4 Formulation and administration method
  • Therapeutic treatment containing the TSTA 3 gene expression inhibitor of the present invention The therapeutic agent containing the activity inhibitory substance of porphyry activity Anti-T-containing therapeutic agent of the present invention or the anti-TSTA 3 anti-antibody used in the present invention Flavoring W Storage Stabilizer Buffering Agent Suspending Agent Tonicity Agent Binder Fluidity Accelerating Agent Can it be used as a flavoring agent?
  • Examples of the dosage form of the blacksmithing agent of the present invention are, for example, as an oral agent, pill, powder, granule, fine granule, soft hard cuff cell agent, film coret, sublingual agent, first agent, etc. parenteral, injection, suppository, suppository Cement plaster External liquids etc. are mentioned. Those skilled in the art can select the optimal dosage form according to the administration route. TST activity (or expression of TSTA 3 gene) inhibitor as an active ingredient can be included in the preparation at 09% by weight.
  • Oral administration is generally about 0 lmg to 1 OO Omg per day. 10 Omg, more preferably about 10-50 mg.
  • Target organ Symptom Administration method for example, the form of injection is usually normal (for example, 6 O kg) About 0 01 to 3 Omg, preferably about 0 1 to 2 I will come. In the case of animals other than humans, the above dose of 60 kg can be administered.
  • the therapeutic agent of the present invention is a can (eg, large intestine, stomach, lung, gland, esophagus, liver, biliary tract, spleen, kidney, bladder) Is preferably used in the large intestine
  • the leaf preparation of the present invention contains a substance that inhibits the activity of T STA 3 protein or a substance that inhibits the expression of a child as an active ingredient, it can be used as an anti-cancer agent, a photonos inducer of cancer cells, and the like.
  • the target type of cancer or cancer is not limited to a specific type.
  • expression of the leaf 3 protein activity inhibitory substance Ayohi T S T A 3 gene of the present invention may be inhibited.
  • an antisense nucleic acid when used in the therapeutic agent of the present invention, the acid may be administered according to a known method such as a single virus or a suitable virus such as a retrovirus, a virus, a virus, a virus, a virus, a virus, and a virus.
  • Antisense nucleic acids can be formulated with physiologically acceptable carriers and administered via a gene gun or catheter such as a hash.
  • an anti-TSTA 3 antibody such as a recombinant atenovirus particle may be used for cancer therapy.
  • a pharmaceutically acceptable carrier As such a carrier, it is already aquatic Ordinarily, 10 3 to 10 15 viruses at a time per adult is preferable? Disease state ⁇ w cells Depending on the nature of the tissue, the dose may be once to several times a day. One to several injections over several months may be given intermittently over a long period of time as one senot.
  • the viral hectare hectare nucleic acid molecule used in the present invention can be used for diagnosis of the state of specific cells and tissues.
  • a virus-hector particle obtained by incorporating a marker gene that can be detected into a virus into a suitable host cell can be used to detect and diagnose anti-TSTA3 antibodies and cells.
  • a suitable host cell can be used to detect and diagnose tumor cells by combining anti-detectable knowledge.
  • the present invention also provides a diagnostic agent.
  • a clear can diagnostic agent has (a) an antibody against TSTA 3 protein S T A 3 gene or a part of its base sequence having a holinus consisting of a base sequence that can be hyfitized under stringent conditions.
  • the antibody against TSTA 3 protein can be identified.
  • TSTA 3 protein is determined in the test solution. Bind or detect STA3 antibody binding or / or quantified.
  • subject-derived biological sample includes a subject-derived fluid (eg, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.) urine, phosphorus, semen, etc.). “Subjects” also include human subjects who are usually or are suspected of undergoing canine screening, and who are suspected of being affected. Examples of such cans: stomach, lung, milk, prostate, esophageal, liver, kidney, bladder, uterus (eg, cervical, uterine or thyroid, knee, ovary, tumor, blood tumor, etc. It is preferable.
  • a subject-derived fluid eg, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.) urine, phosphorus, semen, etc.
  • Subjects also include human subjects who are usually or are suspected of undergoing canine screening, and who are suspected of being affected. Examples of such cans: stomach, lung, milk, prostate, esophageal, liver, kidney, bladder, uterus (eg, cervical, uterine or thyroid, knee, ovary, tumor, blood tumor, etc. It is prefer
  • One embodiment of the immunoassay is contacted with a nitrocellulosic support or carrier for the purpose of immobilizing all proteins present in the life such as serum samples.
  • the support is then treated with a buffered anti-TSTA3 antibody that is detectable.
  • antibody-chelating agents are described in Nuclo 1 1 9 9 0 1 7 247-2 54.
  • an antibody having a paramagnetic 14 ion as a label used as a Menonique is described in Ma gnetic Resonance in Me dici 2 2 33 9-342
  • a flow or flyer having the base sequence of the T S T A 3 gene can be used. Specifically, for example, (a) a biological sample derived from a subject and a base sequence of a TSTA3 fragment, a stringentene-like high-rise loop, and a reflowable base sequence (flow) process and (b) ) Detecting and / or detecting the presence of the polynucleotide and T or a fragment thereof in the test W.
  • TSTA 3 (or a gene fragment thereof) in a biological test derived from a subject is detected using the above-mentioned flow.
  • the length of the base sequence used as the flow is, for example, 1 2 or more bases 1 8 bases or more 2 1 bases or more 24 bases or more 2 7 bases or more No. 98 EP— A0200362 US Pat. No. 2,915 08
  • the quantification can be carried out using a known technique using a cytochrome or flymer for the T S T A 3 gene.
  • a known method for example, Furi Seisenyon Nosan Haifuri Yusei Noyon RT— R— SS CP method (Genomics 5th 874-87)) Proceeding ng soft he Na ti on e my of Science he Un itedof Ame rica 86 ⁇ 2766 ⁇ 2770 (19
  • the array CGH method is a chromosomal CGH method (Ka 1 1 1 on 1 em 1 a 1 (1992) Science 258 818-821 method). There is a method to detect high-resolution DNA coherency in high resolution by detecting the binding state of the DNA derived from normal DNA and normal DNA using Shonoto's DNA chinoff and performing the high-speed detection when the chemome DNA on the slite. eta 1 (1 998) Na t Ge net 20
  • TSTA 3 gene is overexpressed by the above-described method (eg, DNA mRNA), it is possible that there is a disease caused by TS (eg, cane (eg, large intestine)) It is possible to diagnose that it is possible to be affected in the future.
  • TS eg, cane (eg, large intestine)
  • the presence of a fragment of a target protein in a test sample is identified using a mass spectrometer (MS).
  • MS mass spectrometer
  • the determination of the non-acid sequence can be used to determine whether or not the T protein exists in the biological test derived from the subject + the mass.
  • the mass of the trial +4 can be identified from the results of the mass analysis to identify the individual amino acids of the protein and heptagon.
  • Ionization can be used in various ways, such as Matrix Astheno Tracer Teethofushi (MALD I) Elect Mouth Souffle Ionization (ESI) Qi) Field Desorption (FD) Ion Ionization
  • MALD I Matrix Astheno Tracer Teethofushi
  • ESI Elect Mouth Souffle Ionization
  • FD Field Desorption Ionization
  • MALD I Matrix Astheno Tracer Teethofushi
  • ESI Elect Mouth Souffle Ionization
  • FD Field Desorption
  • MAL time-of-flight (t ime offli gh t TF) mass spectrometry mass spectrometry
  • QMS quadrupole type
  • ion tranov type magnetic field type
  • the TSTA 3 gene or the TSTA 3 gene in a biological test derived from a subject containing a hyfuri group sequence under stringent-enhanced hyphenation conditions is detected and Z or quantified as a marker.
  • Kinoto These mushrooms are used to detect the markers described above for immunological techniques or hyphenation.
  • can marker refers to a molecule that is not present in a subject's body fluid (eg, saliva, saliva, sweat, semen, etc.) Good Indicates or indicates the presence of presence in the body fluid or cells or tissues of the subject
  • the quinoto contains components that detect and detect TSTTA 3 protein in body fluid samples from subjects and its parts, for example, TSTA 3 protein or ELISA or quantification.
  • Such components can be used, for example, tissue sections.
  • Such antibodies may be radiofluorimetric colorimetric or fermented.
  • the quinoto of the present invention contains a labeled secondary antibody In addition to a functional base sequence, etc., it may contain a container. The laher associated with the container may be used to detect drugs or large intestine cankers. Other items such as instructions for use may also be provided.
  • Example 1 Array C GH method of colonic cannabis-specific amplified gene This example identifies colonic canal-specific gene amplification region Sample 200 samples of sampled sample Ayohi Array CGH-based test Results BSTA C l 1 -661A1 used TSTA 3 located in BAC C l 1 -661A1 2 Using gene information (NC BI http // www ncbih go vZ) (T issuectranspl antation an tigen P 35 Accession on No NM_00331 3) It was found that the gene was large and frequently high (01 Table 2). Indicates frequency. In addition, Table 2 below shows the mean value of 20 degrees (G / R value) and frequency of TSTA 3 gene colonic persecutor and GZR value or 1 2 average value.
  • TSTA3 gene is a large sample of 200 samples. (Table 2)
  • the amplification degree of a gene cell line derived from a high-frequency gene intestinal canal was verified in those who suffered from large intestine.
  • the cultured cell lines were RKO and RK, which are cell lines derived from the large intestine. Extracted from cultured cells using B 1 o d & C e l l Cu l t ure (Q I AGEN) according to Frotocol with Kinoto
  • Table 3 shows the degree of amplification of the TSTA 3 gene in cell lines derived from large intestine. As shown, it was found that the TSTA 3 gene located in BARP 1 1 -661 A 12 also increased in the colon canal cell line.
  • AREA CGH Quantitative PCR was performed using SYBR Green RT-PCR Re-agplied Biosyst ems) and Froto 7500 Real-Time PCR System (Ap posyst erns). Framer used the following PE RON for synthesis).
  • Table 4 shows the relative values of TS TA 3 gene amplification in large intestine-derived cell lines versus B DNA (normal). As shown, amplification is occurring in the T S T A 3 gene region even in cell lines (Table 4).
  • the cell line was cleared from ATCC, and cultured according to the Frotocol marked with ⁇
  • the RNA selected a specific 2 lmer in the gene and synthesized its sequence A (commissioned to Q I AGEN)
  • s 1 RNA was introduced into RK0 cells using L ipofect am (Invitrogen), and 50 nM siRNA was introduced into the cells according to the standard.
  • s 1 RNA was introduced into RKOE 6 cells FECT (QI AGEN) Then, 100 ⁇ of sl RNA was introduced into the cells according to the rules. Ne gatlve C on RNA (QI AGEN) was used for anti-Akira. Inverted for 4 days after introduction into cells
  • Quantitative RT quantitative RT—PCR method was used to determine the effect of s 1 RNA from cells 24 hours after introduction of s 1 RN
  • the number of viable cells after introduction of s 1 RNA was measured using Wa ll ac 14 ll abe l / Lumi nes sc ce Coun ter A ki n l mel) using A 1 mar Blue (B e) according to the Flotocol attached. . Result
  • RNA 1 analysis of genes was performed using RKO and RKOE 6, which are cell lines derived from the large intestine.
  • 04 A and 04 B show the results of measuring the number of viable cells with the measuring reagent for s 1 RNA of RKO cells and RKO TA3 gene 4 days after T ran sfection. . Results of measurement of viable cell count as shown Remarkable cell counts (04A and B) compared to the expression a ti V e C o n t r o l (NC). Two types of siRNA of TSTA3 gene (a and t test were significant (p ⁇ 0 0 1).
  • RNA 1 is used in a cell line derived from the normal tissue of the large intestine to confirm that it is specific for the suppression effect of epilepsy genes ⁇ RNA i analysis>
  • the cell line used is CCD 1 8 Co purchased from ATCC.
  • CCD 1 8 Co purchased from ATCC.
  • Following the cultivated Frotocol. Use the siRNA used in Example 3a. Introducing s 1 RNA into cells Carry out in the same way as described in Example 3.
  • TSTA3 gene is an organ-specific expression such as a normal tissue or the like.
  • RNA probe was hone according to the rules.
  • RNA rehering in each normal organ tissue was determined by organ (Heart M (Brain) placenta (Placenta) lung (Liver) skeletal muscle (Skeletal Muscle) kidney (Kidney) knee spleen (Spleen) ) Thymus Prostate Prostate Testicular Intestine Colon Peripheral Blood Leukocyte Stomach Thyroid T (Spinal Cord) Lymph node Trachea ) Gland) Bone Marrow was analyzed by Northan High Fritai, Inc. As mentioned above, it was registered as Accession No NM-003313 sequence or mRNA in the inheritance of TS TA 3 (http // www ncbi nlm nih gov). Results
  • Ultimate Plus LC PACKINGS
  • Stream 0 2% acetonitrile (Wako 062-02901) containing 90% acetonitrile with MERCK 128 acid or 0 57% / nun linear gradient was analyzed.
  • 07 A and 07 B are: (A) Serum and This is the amino acid sequence of the TSTA3 protein (corresponding to the amino acid sequence of positions 10 to 18. Therefore, the fractofragment (SEQ ID NO. In normal hematopoiesis, no ion hekes were found in the corresponding partial sequence (see 08C), so this target molecule TA 3 protein may have increased in cancer-specific blood abundance.
  • SEQ ID NO. In normal hematopoiesis, no ion hekes were found in the corresponding partial sequence (see 08C), so this target molecule TA 3 protein may have increased in cancer-specific blood abundance.
  • RNAi analysis was performed.
  • the introduction of s1 RNA into the cells was carried out by using o 1 imine (Inv trologen) and following the flow of 100 nM s.
  • Nega tlv o 1 si RNA (Q I AGEN) was used.
  • the present invention provides a therapeutic agent for cans, a diagnostic agent, a diagnostic method and a therapeutic method. Therefore, the present invention is useful in the fields of can diagnosis and the like.

Abstract

It is intended to provide a therapeutic agent for cancer containing an expression inhibitor or activity inhibitor of TSTA3 protein; a method for screening a compound which can be used as an active ingredient of such a therapeutic agent; an antibody against the TSTA3 protein; a diagnostic agent for cancer/a diagnostic method for cancer using the antibody and the like.

Description

明細  Details
TSTA3遺伝子の治療的又は診断的用途 技術分野 Therapeutic or diagnostic use of TSTA3 gene
本発明は かんにあいて特異的に増幅している遺伝子てある T その冶療的又は診断的用途なとに関する。 背景技術  The present invention relates to a gene which is specifically amplified in cans T and its therapeutic or diagnostic use. Background art
性腫瘍 （かん） の特徴として 増殖 浸潤 転移を経て全身 る致死かあけられる。 外科的な切除または放射線治療のような局 移性再発かんに対して十分な対処はてきす 全身療法てある薬物 今後のかん治療成績の向上に期待されている。  A characteristic feature of sexual tumors is the growth, invasion, and metastasis of the body through which it can be killed. Sufficient coping with local recurrence such as surgical resection or radiation therapy. Drugs with systemic therapy. Expected to improve future treatment results.
かん薬物療法の現在の中心てある化学療法は 直接^ん細胞の または RNAに作用し 細胞を死に至らせる殺細胞薬剤を用いる かん細胞以外の 例えは 骨髄細胞 生殖細胞 毛母細胞 消化 分裂かさかんな正常細胞に対しても作用し 強い副作用をもたら 近年の分子細胞生物学の進歩により かん細胞の浸潤 増殖 転 るメカニスムか解明され そのかん細胞の特定メカニスムに特異 子檸的薬の開発か注目されている。 代表例として 非小細胞肺か のある EGFR (上皮成長因子受容体） チロノンキナーセ阻害 サ （一般名 ケフイチニフ） （WO96Z33980) 乳かん ある HER— 2 (ヒト上皮成長因子受容体 2) のヒト化モノクロ られるか 食生活の西欧化 特に動物性脂肪の取りすきか原因 されている。 大腸かんの有効な分子標的薬の開発か待たれている 用いられている腫瘍マーカー （CEA， CA19-9) は 進 ても約半数か陽性を示すのみて 臓器特異性も く より高性 か望まれている。 発明の開示 Chemotherapy, the current core of canine drug therapy, uses cell killing agents that directly act on the cells or RNA and lead to cell death. For example, bone marrow cells germ cells hair matrix cells digestion division Acting on cells and causing strong side effects Recent advances in molecular cell biology have elucidated whether the invasion, proliferation, and transition mechanism of canine cells is specific to the specific mechanism of canine cells. Yes. As a representative example, EGFR (epidermal growth factor receptor) with non-small cell lung Tyronon kinase inhibitor (generic name: Kehuitinif) (WO96Z33980) Humanized monochrome of HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2) Is it possible for Western diets to be eaten? The development of an effective molecular target drug for colorectal cancer is awaited. About half of the tumor markers (CEA, CA19-9) used are positive at the same time. It is rare. Disclosure of the invention
上記のような状况下て かんを冶療およひ Zまたは診断するた または方法か *められている。  It is recommended to treat and / or diagnose a mandibular state as described above.
特に かんに対して特異性の高い治療 ¾およひ または診断薬 る  In particular, treatments with high specificity for cans or diagnostic agents
上記のような状况に鑑み 本発明者らは 鋭意研究を重ねた結 大腸かん） において高頻度に増幅か起きている遺伝子か TST ることを見出した 本発明者らはさらに 大腸かん細胞株におい ンハク質の発現を阻害することによって 癌細胞の増殖を抑制し し 本発明を完成するに至った。 すなわち 本発明は 以下に記 剤 かん抑制作用を有する候補物質のスクリーニンク方法 かん 断用キノト かんの診断方法なとを提供する  In view of the situation as described above, the present inventors have found that a gene that is frequently amplified or TST in a large intestine canal (which has been extensively studied). The present invention was completed by inhibiting the growth of cancer cells by inhibiting the expression of quality. That is, the present invention provides a screening method for a candidate substance having an inhibitory action on a drug preparation, and a diagnostic method for a diagnostic quinotocan.
( 1 ) TSTA3遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有す (2) 上記 TSTA 3遺伝子の発現阻害物質か  (1) Contains a TSTA3 gene expression inhibitor as an active ingredient (2) Is it a TSTA 3 gene expression inhibitor?
(a) TSTA3遺伝子の発現をRNA ι効果により阻害する 酸  (a) Acid that inhibits TSTA3 gene expression by RNA ι effect
(b) TSTA 3遺伝子もしくはその一部 またはその転写産 およひ (b) TSTA 3 gene or a part thereof or transcription thereof And
(f ) TSTA3遺伝子の転写または TSTA3 mRNAの 化合物 （上記核酸を除く）  (f) TSTA3 gene transcription or TSTA3 mRNA compound (excluding the above nucleic acids)
からなる群から選択される物質を含む 上記 （1) に記載のかん (3) TSTA 3タンハク質の活性阻害物質を有 ¾成分として含 剤。 A substance selected from the group consisting of: (3) A TSTA 3 protein inhibitor that inhibits activity of TSTA 3 protein as an active ingredient.
(4) 上記 TSTA3タンハク質の活 ft阻害物質か  (4) Is it an active ft inhibitor of the above TSTA3 protein?
(a) 該 TSTA3タンハク質に対する抗体  (a) an antibody against the TSTA3 protein
(b) 該 TSTA 3タンハク質に対してトミナント不カティフ TSTA3タンハク質変異体 およひ  (b) Tominant non-catiful TSTA3 protein variants and TSTA3 protein variants
(c) 該 TSTA 3タンハク質に結合する化合物 （上記抗体お (c) a compound that binds to the TSTA 3 protein (the above antibody antibody)
<) <)
からなる群から選択される物質を含む 上記 （3) に記載のかんIncluding the substance selected from the group consisting of:
(5) 上記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある 上記 （1 すれかに記載のかん冶療剤。 (5) The above-mentioned pelvis or cervical tract.
(6) TSTA 3遺伝子の発現阻害物質をスクリーニンクする方 (6) Those who screen for TSTA 3 gene expression inhibitor
(a) TSTA 3遺伝子を発現する細胞に 被検化合物を接触(a) Contacting a test compound with cells expressing the TSTA 3 gene
(b) 該 TSTA 3遺伝子の発現レヘルを測定する工程 およ(b) measuring the expression level of the TSTA 3 gene;
(c) 被検化合物を接触させない場合と比較して 該発現レヘ 化合物を選択する工程を包含する スクリーニンク方法。 (c) A screening method comprising a step of selecting the expression regenerative compound as compared with the case where the test compound is not contacted.
(7) TSTA 3タンハク質の活性阻害物質をスクリーニンクす (7) Screening for TSTA 3 protein inhibitors
(a) TSTA3タンハク質と被検化合物とを接触させる工程(a) Step of contacting TSTA3 protein with test compound
(b) 該 TSTA 3タンハク質と被検化合物との結合活性を測 (1 0) 上記 （9) に記載の抗体を含有するかん冶療剤。 (b) Measure the binding activity between the TSTA 3 protein and the test compound. (1 0) A cannula agent containing the antibody according to (9) above.
(1 1) 放射 ft同位元素 治療タンハク質ヽ低分子の薬剤 ま 担持したヘクターをさらに含有する 上記 （1 0) に記載のかん (1 1) Radioactive ft isotope Therapeutic protein ヽ is a low molecular weight drug or a supported hectare as described in (1 0) above.
(1 2) 上記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある 上記 (1 1) に記載のかん治療剤。 (1 2) The above-mentioned epilepsy or cervical epilepsy The epilepsy therapeutic agent according to (1 1) above.
(1 3) 上記 （9) に記載の抗体を含有するかん診断剤  (1 3) Diagnostic agent containing the antibody according to (9) above
(1 4) TSTA 3遺伝子またはその一部の塩基配列にストリ フリ夕イセーンョン条件下てハイフリ夕イス可能な塩基配列を 剤  (1 4) A base sequence that can be used under the conditions of a free-of-charge condition on the TSTA 3 gene or a part of the base sequence.
(1 5) 上記かんか大腸かんてある 上記 （1 3) または （14 診断剤。  (1 5) The above or the large intestine is the above (1 3) or (14 diagnostic agent.
(1 6) 上記 （9) に記載の抗体を含有するかん診断用キノ ト。 (16) A can diagnostic kit containing the antibody according to (9) above.
(1 7) TSTA3遺伝子またはその一部の塩基配列にストリン フリ夕イセーンョン条件下てハイフリタイス可能な塩基配列から ォチトを含有するかん診断用キノト (1 7) A quinoto for diagnosis that contains a phototap from a base sequence that can be hyfletized under string-free conditions in the TSTA3 gene or a part of the base sequence.
(1 8) 上記かんか大腸かんてある 上記 （ 1 6) または （1 7 診断用キノ卜。  (1 8) The above or the large intestine is the above (1 6) or (1 7 diagnostic mushrooms.
(1 9) 被験者由来の生体試料中の TSTA3タンハク質または 子をかんマーカーとして検出およひ Zまたは定量する方法  (1 9) Method of detecting and Z or quantifying TSTA3 protein or pups in a biological sample from a subject as a marker
(20) 前記生体試料か 全血 血清 または血漿てある 上記 の方法。  (20) The method as described above, wherein the biological sample is whole blood serum or plasma.
(2 1) 質量分析装置を用いて TS TA3タンハク質を検出お 量する 上記 （1 9) または （20) に記載の方法。 を包含する 上記 （22) に記載の方法。 (2 1) The method according to (19) or (20) above, wherein TS TA3 protein is detected and weighed using a mass spectrometer. The method according to (22) above, comprising:
(24) (a) 被験者由来の生体試 と TSTA 3遺伝子また 基配列にストリンノエン卜なハイフリタイセーンョン条件下てハ 能な塩基配列からなるホリヌクレオチトとを接触させる工程 お (b) 上記試料中ての上記ホリヌクレオチトと TSTA3遺 断片とのハイフリ夕イセーシヨンを検出およひ Zまたは定量する を包含する 上記 （1 9) または （20) に記載の方法。  (24) (a) A step in which a test sample derived from a subject is contacted with a holin nucleotide that has a base sequence that is capable of functioning under the conditions of stringency-enhancing hyalintheneon the TSTA 3 gene or base sequence. The method according to the above (19) or (20), comprising detecting and Z or quantifying the hyphenation activity between the above-mentioned holy nucleotide and the TSTA3 residue in a sample.
(25) かんの診断に用いるための上記 （1 9) 〜 （24) のい 方法。  (25) The method described in (19) to (24) above for use in the diagnosis of cans.
(26) 前記かんか 大腸かんてある 上記 （25) に記載の方 (26) The person who described above (25)
(27) TSTA 3遺伝子の発現阻害物質を砉者に投与する工程 ん治療方法 (27) Process of administering TSTA 3 gene expression inhibitor to the subject
(28) TSTA 3タンハク質の活性阻害物質を崈者に投与する かん冶療方法  (28) TANA 3 protein activity inhibitor is administered to the subject
(29) かんを治療するための医薬の製造のための TSTA3 害物質の使用  (29) Use of TSTA3 hazardous substances for the manufacture of a medicament to treat cans
(30) かんを治療するための医薬の製造のための TSTA3 性阻害物質の使用  (30) Use of a TSTA3 inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment of cane
(3 1) 配列番号 5 配列番号 6 配列番号 7 または配列番号 有する ホリヌクレオチト。  (3 1) SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO:
(32) TSTA 3遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有 てあつて 配列番号 5 配列番号 6 配列番号 7 または配列番 を有するホリヌクレオチトを含有する かん冶療剤。 、 0面の簡単な説明 (32) An anti-rapeutic agent comprising a horincleito having the TSTA 3 gene expression inhibitor as an active ingredient, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: A brief description of the 0 side
01は TSTA 3遺伝子の大腸かん砉者由来の 200検体に 幅度に対する頻度を示すヒストクラムてある。  01 is a histogram showing the frequency of the TSTA 3 gene in 200 specimens from colonic epilepsy.
02は （A) 大腸かん細胞株 RKO およひ （B) 大腸癌 に それそれ TSTA3遺伝子の s 1 RNAをトランスフエク RN A 1解析の結果を示す光学顕微鏡写真 (位相差像)てある  02 is a photomicrograph (phase contrast image) showing the results of the analysis of STA1 gene s 1 RNA in (A) colorectal cell line RKO and (B) colorectal cancer.
03は （A) 大腸かん細胞株 RKO およひ （B) 大腸癌細 に それそれ TSTA3遺伝子の s 1 RNAをトランスフエク RNA 1 ¾果を定量的 RT— PC Rにより評価した結果を示すク Fig. 3 shows the results of (A) large intestine cancellous cell line RKO and (B) large intestine cancer, respectively, s 1 RNA of the TSTA3 gene, transferred 1 RNA, and quantitative RT-PCR results.
04は （A) 大腸かん細胞株 RK〇 およひ （B) 大腸癌細 に それそれ TSTA3遺伝子の s 1 RNAをトランスフエク 生細胞数 ^定による RNA 1効果を評価した結果を示すクラフて04 shows (A) colorectal cancellous cell line RK0 and (B) colorectal cancer cells, and s 1 RNA of TSTA3 gene is transferred.
05は 正常な種々の臓器組織を用いて行ったノ一サンハイフ ンの結果を示す写真てある。 05 is a photograph showing the results of Nosan san hyphen using various normal organ tissues.
06は FISH法て解析した大腸癌患者由来の各検体祖織 (A〜 一部 （6細胞分） の光学顕微鏡写真 (蛍光像）てある。  06 is an optical micrograph (fluorescence image) of each specimen's tissue (A ~ part (6 cells)) derived from colorectal cancer patients analyzed by FISH method.
07 Aあよひ Bは 質量分析により解析した （A) 大腸かん患 よひ （B) 健常者由来の血清についての結果をそれそれ示すクラ 08 A〜(：は MS/MS解析によって決定された 07に示 ノ酸 （またはアミノ酸配列） との対応関係を示す。  07 A Ayohi B was analyzed by mass spectrometry (A) Colorectal illness Yohi (B) Class A A (: was determined by MS / MS analysis 07 shows the correspondence with noo acid (or amino acid sequence).
09は 子宮頸癌細胞株 HeLa細胞株に TSTA3遺伝子の s ンスフェクトした場合の RNA 1効果を 時系列に従い 顕微鏡 c l f l c t r an s p l an t a t i on an t i g en 伝子か大腸かん患者由来の検体において高頻度てあることを見出09 shows chronologically the RNA 1 effect of the uterine cervical cancer cell line HeLa cell line when transfected with the TSTA3 gene. clflctr an spl an tati on an tig en found frequently in specimens from gene patients or colonic patients
TSTA3 (T i s s u e s p e c i f i c t r an s p on an t i g e n P 35B) は NADP (H) —結合タ FXとして知られていた （Mo r e l l i , A e t a 1 r c h B i o c hem B i ophy s 179 698 r e 1 1 l A e t a 1 ( 1977) FEBS L e t 4) マウスての研究て この遺伝子に突 変異を有する肥満 a s t o c y t oma c e l l l i n e) をマウスに移植し 拒絶反応により定着てきず かん形成されないことより 組織 35 B (T i s s u e s p e c i f i c t r an s p l a an t i ge n P 35B) と名つけられた。 その後 ヒト FX Bの相同遺伝子てあることか明らかとなり （Cama r de l l a 1 ( 1995) B l o od 85 264— 267) TS u e s p e c i f i c t r an s p l an t a t i on a の名か残っている。 TSTA3 (T issue specific tr an sp on an tigen P 35B) was known as NADP (H) — Bonder FX (Morelli, A eta 1 rch B ioc hem Biop s 179 698 re 1 1 l A eta 1 (1977) FEBS L et 4) Research on mice Tissue-specific tr an spla an from the fact that obesity astocyt oma cellline) having a mutation in this gene was transplanted into mice and did not become settled by rejection. ti ge n P 35B). Later, it became clear that it was a homologous gene of human FX B (Cama r de l la 1 (1995) Blood 85 264—267) TSu e sp i c i fi t c t r a n s p l ant i on a remains.
FXは現在ては GDP— (D) 一マンノース （mann o s ― (L) —フコース （f u c o s e) の合成に関与する酵素てあ ている フコースは 多くの細胞表面や分泌タンハク質の N— リカンの末端なとに修飾され （Sm 1 t h， P L e t 2) J Ce l l B i o l 158 801— 815) セレ e c t l n) の認識に関与している （Lowe J B ( The Mo l e c u l a r B a s i s o f B l oo d 1 15- 126 C a r l ow D A ， e t a 1 (20 6841— 6848) 。 また ノノチ （No t c h) ンクナル n e r K ， e t a I (2000) Na t u r e 406 5 Mo l o n e y D J e t a 1 (2000) Na t 369— 375) や C r l p t oノクナル伝達 （Ya n Y 02) Mo 1 C e l l B i o l 22 4439— 444 on E D e t a 1 (2002) J C e l l P hy 0 267— 278) にも関与している （Ha 1 t l wa n g e (2002) Cu r r O p ι n S t r u c t B i o l 1 98) 。 FX is now an enzyme involved in the synthesis of GDP— (D) monomannos (L) — fucose. Fucose is the terminal of many cell surface and secreted N-lycans. (Sm 1 th, PL et 2) J Cell B iol 158 801—815) Serine ectln) (Lowe JB) 1 15-126 Carl ow DA, eta 1 (20 6841-6848). In addition, No tch nkunar ner K, eta I (2000) Nature 406 5 Moloney DJ eta 1 (2000) Na t 369—375) and Crlpto noctal transmission (Yan Y 02) Mo 1 Cell B iol 22 4439—444 on ED eta 1 (2002) JC ell Ph 0 267—278) (Ha 1 tl wa nge (2002) Cu rr Op nt S truct B iol 1 98).
フコース合成系の最終段階には FXか重要な役割を担って (D) —マンノースから GDP—マンノース 4 6—テヒトラ夕 d r a t a s e) (GMD) により合成された GDP— 4—ケ ノ一 （D) —マンノースを FXは GDP— 4—ケト 6—テオキ ルコースに変換し （3， 5—ェヒメラーセ） さらに NADP DP— 4—ケト 6—テオキン一 （L) —カラクトースを GDP ースに変換する （4—レ夕ク夕ーセ） （S u l l i v an F 1 (1 998) J B i o l Ch em 273 81 93- y ama C e t a 1 (1998) J B i o l Ch e 4582- 14587)  FX plays an important role in the final stage of the fucose synthesis system (D) — GDP synthesized from Mannose by GDP—Mannose 4 6—Techret dratase) (GMD) — 4—Kenoichi (D) — FX converts mannose into GDP— 4—keto 6—theol course (3, 5—Echimerase) and NADP DP—4—keto 6—theokine (L) —converts galactose to GDP (4—Le (Sulliv an F 1 (1 998) JB iol Ch em 273 81 93- y ama C eta 1 (1998) JB iol Ch e 4582- 14587)
FXノノクアウトマウスは 白血球接着欠損型 I I ( l e u c dh e s i on d e f i c i e n c y (LAD) t yp e シル化の先天 疾崈— l i e (Con g e n i t a l d i s o ( I z um l , Y e t a 1 (1995) 216 215 l r a h ama, T e t a I (1993) C an c e r 9 - 1 334 Th u r i n U , e t a 1 (2002 Hy b r ι d om ι c s 21 1 1 1— 1 16) 。 FXは 胞の接着に関係するセレクチンリカントの生合成に重要な役割 報告かある （E s he l R e t a 1 (2000) J B m 275 1 2833- 12840 E s he l R e t 2) I n t J Can c e r 98 803— 810) 。 さら 発現させた大腸かん細胞株は 上皮細胞との接着能力か増大し ゥンした場合は セレクチンリカントの発現か減少し 上皮細 减少するとの報告かあり FXかかん細胞の血管外遊出や転移の ると考えられている （Z 1 p 1 n A e t a 1 (2004 Re s 64, 6571 -6578) また ヒト結腸かん細胞 一 Aて発現しているとの報告かあり （特表 2002— 53405 特異的な遺伝子として見出された 1 556遺伝子 （W〇0 1 1788遺伝子 （W〇 02/12328) 223遺伝子 （特表 3082) に含まれる。 FX nocout mice have leuk dh esi on deficiency (LAD) t yp e silylated congenital disease—lie (Con genitaldiso (I z um l, Y eta 1 (1995) 216 215 lrah ama, T eta I (1993) C an cer 9-1 334 Th urin U, eta 1 (2002 Hy br ι d om ι cs 21 1 1 1— 1 16) FX has an important role in the biosynthesis of selectin licant involved in cell adhesion (E s he l R eta 1 (2000) JB m 275 1 2833-12840 E s he l R et 2) Int J Can cer 98 803-810). Furthermore, it has been reported that when the expressed colorectal cell line increases the ability to adhere to epithelial cells, the expression of selectin licant decreases when epithelial cells are reduced, and epithelial depletion is reported. (Z 1 p 1 n A eta 1 (2004 Res 64, 6571 -6578) There is also a report that it is expressed in human colon peritoneal cell 1 A (special table 2002-53405 specific gene 1 556 genes found as (W 0 1 1788 gene (W 02/12328) 223 genes (special table 3082) are included.
本発明者らは TSTA3遺伝子の発現を RNA 1 (RNA干 制することによつてかん細胞の増殖を抑制てきることも確認した TSTA 3遺伝子の発現を抑制することによって かんを治療す なる。 また TSTA3遺伝子の発現量を測定することによって うことも可能となる。  The present inventors treat mandarin by suppressing the expression of TSTA3 gene, which has also been confirmed to suppress the proliferation of spermatogonia by suppressing RNA 1 expression of TSTA3 gene. It is also possible to measure the expression level of the TSTA3 gene.
以下 本発明のかん冶療剤 スクリーニンク方法 診断剤なと
Figure imgf000010_0001
本明細書中 「TSTA3遺伝子」 という場合 NCB Iヌク へースにおいて Ac c e s s i on No NM—0033 ている 1312塩基からなるヒト TSTA3遺伝子 （配列番号 1 これに限定されす 例えは 当該遺伝子の塩基配列において 1つ 換 欠失 付加 または挿入なとを有することによって変化して うな 当該遺伝子の塩基配列またはその相補配列にストリンンェ 夕イセーノョン条件下てハィフリ夕イス可能な塩基配列からなる 卜からなる遺伝子も本明細書中て使用する 「TSTA3遺伝子」 とする。 Hereinafter, the canning agent of the present invention, screening method, diagnostic agent,
Figure imgf000010_0001
In this specification, the term “TSTA3 gene” refers to the human TSTA3 gene consisting of 1312 bases, which is Accession No NM—0033 in NCB I nuclease (SEQ ID NO: 1). Also included in this specification is a gene consisting of 可能 な which consists of a nucleotide sequence that can be deflated under the conditions of a stringer or a complementary sequence in the base sequence of the gene or its complementary sequence that may be altered by having a deletion addition or insertion. It is called “TSTA3 gene” to be used.
ハイフリ夕イセーシヨンは 公知の方法あるいはそれに準しる モレキュラー ク口一ニンク (Mo l e c u l a r C l on i d Ed i t i on J S amb r o ok e t a 1 C i ng Ha r bo r L ab P r e s s 2001) に に従って行うことかてきる。 また 市販のライフラリーを使用す 使用説明書に記載の方法に従って行うことかてきる。 ここて 「 卜な条件」 は 低ストリンンェン卜な条件 中ストリンノエン卜 トリンンェン卜な条件のいすれてもよい。 「低ストリンノエン卜 えは 5XSSC 5 Xテンハルト溶液 0 5%SDS 50 32°Cの条件てある。 また 「中ストリンシェントな条件」 は SC 5Xテンハルト溶液 0 5%SDS 50%ホルムァミ 件てある 「高ストリンンェン卜な条件」 は 例えは 5XS S ルト溶液 0 5%SDS 50%ホルムアミ卜 50での条件 の条件にあいて 温度を上けるほと高い相同性を有する DN Aか たときに 配列番号 1の塩基配列と 例えは 70 %以上 Ί 5 以上 85%以上 90%以上 91 %以上 92%以上 93 以上 95%以上 96%以上 97%以上 98%以上 99 を有するホリヌクレオチ卜をあけることかてきる。 The hyphenation is carried out according to a known method or according to a molecular clinching numb (Molecular Clon id Ed iti on JS amb ro ok eta 1 Ci ng Har bo lab Labs 2001). Come over. You can also use a commercially available life rally according to the method described in the instruction manual. Here, “severe conditions” may be low stringent conditions, medium stringent conditions, or stringent conditions. “Low stringency is 5XSSC 5 X Tenhard solution 0 5% SDS 50 32 ° C. Also,“ Medium stringent condition ”is SC 5X Tenhard solution 0 5% SDS 50% formamide. “Stringent conditions” is, for example, 5 XS Slt solution 0 5% SDS 50% formamide 50 The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is, for example, 70% or more Ί 5 or more 85% or more 90% or more 91% or more 92% or more 93 or more 95% or more 96% or more 97% or more 98% or more 99 I can open it.
本明細書中 「遺伝子の発現阻害」 とは 遺伝子からタンハク 連の事象 （例えは 転写 （mRNAの生成） 翻訳 （タンハク む） のうちのいすれかの事象を阻害することによってその遺伝 されるタンハク質の生成を阻害することを意味するものとする。  In this specification, “inhibition of gene expression” refers to a tan-haku inherited from a gene by inhibiting any of the events (eg, transcription (mRNA generation), translation (tan-haku-mu)). It shall mean to inhibit the production of quality.
本明細書中 「TSTA3夕ンハク質」 という場合 NCB I 夕へースにおいて Ac c e s s i on No N P— 003 れている 321アミノ酸残基からなるヒト TSTA3タンハク質 およひこのタンハク質と実質的に同質の活 （例えは 3 5 (e p ime r a s e) 活性 4—レ夕クターセ （r e du c (Su l l i v an F X e t a 1 (1998) J hem 273 8193-8202 Oh y ama C e t 98) J B i o l Ch em 273 14582-1458 K e t a 1 (2003) Can c e r Re s 63 89) から選択される一種以上の活性） を保持し このタンハク 列に対して 1〜複数個のアミノ酸残基の欠失 置換 挿入 及ひ 生したアミノ酸配列からなる変異タンハク質をいう。  In this specification, the term “TSTA3 protein” refers to human TSTA3 protein consisting of 321 amino acid residues that are accessi on No NP—003 in NCB I evening hose and substantially similar to this protein. Activity (for example, 3 5 (ep ime rase) Activity 4—Reyu cact (Re duc an FX eta 1 (1998) J hem 273 8193-8202 Oh yama C et 98) JB iol Ch em 273 14582 -1458 K eta 1 (2003) Can cer Res 63 89)), and the deletion of one or more amino acid residues from this sequence. A mutant protein consisting of an amino acid sequence.
上記変異タンハク質における アミノ酸の変異部位およひ個数 ク質か元のタンハク質と実質的に同質の活性を保持している限り か 変異個数は 例えは 1〜50個 1〜40個 1〜30個 を有し かつ元のタンハク質と実質的に同質の活性を有するタ 上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。 Amino acid mutation site and number in the above-mentioned mutant protein As long as the protein has substantially the same activity as the original protein, the number of mutations is, for example, 1-50, 1-40, 1-30 Pieces And having substantially the same quality of activity as the original protein, the larger the homology value, the better.
上記 TSTA3タンハク質には TSTA3タンハク質の 「 含まれる。 TS TA3タンハク質の部分へフチトとしては TS 質のアミノ酸配列 （配列番号 2) の一部の連続するアミノ酸の へフチトてあつて 好ましくは 前述の TSTA3タンハク質の 性を有するものてあれはいすれのものても良い。 例えは 配列 アミノ酸配列において 少なくとも 20個 好ましくは少なくと に好ましくは少なくとも 70個 より好ましくは少なくとも 10 しくは少なくとも 200個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列 フチトなとか挙けられる 好ましくは これらのホリへフチトは ンハク質の活性に関与する部分に対応するアミノ酸配列を含有す 明て使用される部分へフチトは 上記のホリへフチトにおいて 列中の 1または複数個 （例えは 1〜20個程度 より好ましく 度 さらにより好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸残基か欠失 または挿入により変更されているものてもよい。  The above-mentioned TSTA3 protein contains “TSTA3 protein”. As a part of TS TA3 protein, the partial amino acid sequence of TS amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) is preferably used. Any of the TSTA3 proteins of any of the following may be used, such as at least 20 amino acids in the sequence amino acid sequence, preferably at least 70, more preferably at least 10 or at least 200 amino acids. An amino acid sequence consisting of residues. These are preferably listed. These polymorphs contain an amino acid sequence corresponding to the portion involved in the activity of the protein. 1 or more in the row (e.g., about 1 to 20 is more preferable, even more preferably 1 to 5) Or Te that has been modified by amino acid residues or deletion or insertion of degrees).
本発明て用いる TSTA 3タンハク質は そのタンハク質を発 ゃ祖織から調製することかてきる。 また これらのタンハク質は ト合成機によっても合成てきるし 原核生物あるいは真核生物か 当な宿王細胞を用いた組換え方法によっても調製することかてき いる TSTA3タンハク質は いずれの種由来のものてもよいか ト由来てある。  The TSTA 3 protein used in the present invention can be prepared from the original weave. These seeds can also be synthesized by a synthesizer, prokaryotic or eukaryotic, or prepared by a recombinant method using appropriate Shuo cells. Is it okay?
「実質的に同質の活性」 とは それらの活性か性質的に同等て e t a 1 ( 1998) J B i o l Ch em 582 - 14587 No d a K、 e t a 1“Substantially the same quality of activity” means that their activities or properties are equivalent. eta 1 (1998) JB iol Ch em 582-14587 No da K, eta 1
Can c e r Re s 63， 6282— 6289なとの の方法に準して行うことかてきるか 例えは 後に記載するスク に従って測定することかてきる。 Can c res les 63, 6282 — Can it be done in accordance with the method such as 6289? For example, it can be measured in accordance with the screen described later.
なお アミノ酸配列や塩基配列の同一性は カーリンおよひア るアルコリスム BL AS T (p r o c a t l Ac a d 872264-2268 1990 p r o c Na t l A USA 90 5873 1993 ) を用いて決定てきる。 ルコリスムに基ついた BL AS TNや B LAS TXと呼はれるフ されている （A 1 t s c h u 1 S F e t a 1 J M 21 5 403， 1990) 。 BLASTNを用いて塩基配列 は ハラメ一夕一は 例ぇは5 じ 0 6 =100 wo r d l e とする。 また BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場 夕一は 例えは s c o r e = 50 w o r d 1 e n g t h = 3と Tと Gapp e d B LA S Tフロクラムを用いる場合は 各フ オルト八ラメ一夕一を用いる。  The identity of the amino acid sequence and the base sequence is determined using Carlin and the alcoholic BLAST (proc ACT Acd 872264-2268 1990 proc Natl A USA 90 5873 1993). It can be called BL AS TN or B LAS TX based on Lucolism (A 1 ts c hu 1 S F eta 1 J M 21 5 403, 1990). Using BLASTN, the base sequence is set to 5 1 0 6 = 100 wo rd l e. In addition, when analyzing amino acid sequences using BLASTX, for example, s corre = 50 wor d 1 en gt h = 3, T, and Gapp e d B LA S T.
本明細書中 「かん治療剤」 という用語は 抗癌剤 癌転移阻 ァホ卜一ノス誘導剤 癌細胞の増殖抑制剤 癌細胞の浸潤抑制剤 を含む意味て使用される なお 本願明細書中 用語 「癌 （また 「腫瘍」 とは同し意味を有する用語として使用される。  In the present specification, the term “cane treatment agent” is used to mean an anti-cancer agent, a cancer metastasis inhibitor, a phacosinos inducer, a cancer cell growth inhibitor, a cancer cell invasion inhibitor, and the term “cancer”. (In addition, “tumor” is used as a term having the same meaning.
1 1 TSTA 3遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療剤 TSTA3遺伝子から T S T A 3 mR Ν Αへの転写を阻害 ては 、 1 1 Cancer treatment containing TSTA 3 gene expression inhibitor Inhibiting transcription from TSTA3 gene to TSTA 3 mR Ν 、
(a) TS TA 3遺伝子またはその一部に対するアンチセンス核 (a) Antisense nucleus for TS TA 3 gene or part thereof
(b) TSTA 3遺伝子またはその一部に対するテコィ核酸 (c) TSTA 3遺伝子またはその一部に対してトミナント不カ る T S T A 3遺伝子変異体 あるいは (b) Tecoic nucleic acid for TSTA 3 gene or part thereof (c) T S T A 3 gene variant that is dominant to TSTA 3 gene or part thereof or
(d) その他の転写阻害化合物  (d) Other transcription inhibitor compounds
なとか含まれる。 Somehow included.
また TSTA 3 mRN Aから TSTA 3タンハク質への翻 質の例としては  An example of transformation from TSTA 3 mRN A to TSTA 3
(e) TSTA3 mRNAまたはその一部に対して RNA 1作 ヌクレオチ卜 （例えは s 1 RNA)  (e) 1 RNA for TSTA3 mRNA or part of it (eg s 1 RNA)
(f ) TSTA3 mRNAまたはその一部に対するアンチセン チト  (f) Anticentite against TSTA3 mRNA or part thereof
(g) TSTA3 mRNAまたはその一部に対してリホサイム リヌクレオチ卜 あるいは  (g) For TSTA3 mRNA or a part thereof,
(h) その他の翻訳阻害化合物  (h) Other translation inhibitor compounds
なとか含まれる。 Somehow included.
本明細書中 「核酸」 とは RNAまたは DNAを意味する 酸」 は フリンおよひヒリミノン塩基を含有するのみてなく 修 の複素環型塩基をもつようなものを含んていてもよい。 こうした ル化されたフリンおよひヒリミノン ァシル化されたフリンおよ ァノル化されたフリンおよひヒリミノン あるいはその他の複素 は 標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重 に導入すると 導入した外来遺伝子およひ椁的内在 ft遺伝子の 害される現象のことをいう。 ここて用いられる RNAとしては 30塩基長の RNA干涉を生ずる二重鎖 RNA 例えは d s R 1 e s t r and RNA) s ι RNA ( s ma 1 1 ι n ng RNA) 又は s hRNA (s h o r t h a i r p i n られる。 このような RNAは リホソームなとの迗達システムに に局所迗達させることも可能てあり また上記二重鎖 R N Aか ヘクターを用いてこれを局所発現させることかてきる。 このよう (d s RNA s l RNAまたは s hRNA) の調製方法 使用 くの文献から公知てある （特表 2002— 516062号 In the present specification, “nucleic acid” means an acid meaning RNA or DNA, which may contain not only furin and hiriminone bases but also those having modified heterocyclic bases. These fluorinated furin and hiliminone. The acylated furin and furanized furin and hiriminone or other complex. Refers to a phenomenon in which a foreign gene and an inherently endogenous ft gene are harmed by double introduction having the same or similar sequence as the target gene sequence. The RNA used here is a double-stranded RNA that produces a 30-base long RNA, such as dsR1 estr and RNA) sιRNA (sma1 1ιngng RNA) or sRNA (shorthairpin). The RNA can also be localized to the target system of the rephosome, and can also be expressed locally using the above double-stranded RNA or hectare, such as (ds RNA sl RNA or s hRNA) Preparation Methods Known from various literatures (Special Table 2002- 516062)
02/086356 A号 Na t u r e Ge n e t i c s Fe b ， 180 - 183 Ge n e s i s 26 (4) 240-244 Na t u r e S p e 21 407 68 20 Gen e s & De v Vo l 16， (8) 948-958 P r o c a t l Ac ad S c i U (8) 16 Ap r ， 5515-5520 S c i e n (5567) 19 Ap r 550 - 553 P r o 02/086356 No. A Na ture Ge netics Fe b, 180-183 Genesis 26 (4) 240-244 Na ture S pe 21 407 68 20 Gen es & De v Vo l 16, (8) 948-958 Procatl Ac ad S ci U (8) 16 Ap r, 5515-5520 S cien (5567) 19 Ap r 550-553 P ro
Ac ad S c l USA Ap r 30 99 9 52 a t u r e B i o t e c hno l o gy, Vo l May 497—500 Na t u r e B i o t e c hno o 1 20 (5) , May 500— 508 Nuc l e s Re s May 15なと） (表 1) Ac ad S cl USA Ap r 30 99 9 52 ature B iotec hno lo gy, Vo l May 497—500 Na ture B iotec hno o 1 20 (5), May 500— 508 Nuc les Re s May 15 (table 1)
s l RNA配列  s l RNA sequence
Figure imgf000017_0001
本明細書中 「アンチセンス核酸」 または 「アンチセンス ト」 とは ある対象となる DNA領域の少なくとも一部に相補 チトを有し そのホリヌクレオチトか当該領域の少なくとも一 スすることかてきる核酸のことをいう。 本発明のアンチセンス DNA あるいは修飾された核酸 （RNA DNA) てある。 ンス核酸は RNA DNA あるいは修飾された核酸 （RN る。 それらは二本鎖 DNA —本鎖 DNA 二本鎖 RNA — に DNA RNAハイフリ ノ卜てあってもよい 修飾された核 は 核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体 さらにはホリ ミトゃオリコヌクレオチトアミ卜の分解に抵抗 ftを有するものな 力、 それらに限定されるものてはない。
Figure imgf000017_0001
In the present specification, the term “antisense nucleic acid” or “antisense nucleic acid” refers to a nucleic acid having a complementary chito in at least a part of a DNA region of interest and at least one of the region. I mean. The antisense DNA or modified nucleic acid (RNA DNA) of the present invention. The nucleic acid may be RNA DNA or modified nucleic acid (RN). They may be double-stranded DNA—double-stranded DNA—and DNA RNA hyphenated. The modified nucleus is a nucleic acid sulfur derivative. Thiophosphate derivatives Furthermore, it is not limited to force that has resistance ft to the degradation of foliate and oriconucleocytoamis.
使用されるアンチセンス核酸は 適当なフロモーターの下流に しくは 3 側に転写終結シグナルを含む配列か連結される この された核酸は 公知の方法を用いることて 所望の動物へ形質転 チセンス核酸の配列は 形質転換される動物か持つ内在性遺伝子 以上 好ましくは約 80%以上 より好ましくは約 90%以上 約 95%以上の相補性を有する。 、 The antisense nucleic acid used is linked to a sequence containing a transcription termination signal downstream or on the appropriate side of the appropriate promoter. This nucleic acid can be transformed into a desired animal using known methods. Sequence is the endogenous gene of the animal to be transformed More preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more and about 95% or more complementarity. ,
アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制 センス核酸の長さは少なくとも約 10塩基以上 （例えは 1 0 好ましくは約 1 5塩基以上てあり より好ましくは約 100塩 らに好ましくは約 500塩基以上てある。 アンチセンス核酸は して設計することかてきる （例えは 平島およひ井上 新生化 酸 I V遺伝子の複製と発現 日本生化学会編 東京化学同人 1 19 - 347) J K a wa k am ι e t a 1 P h a J a p an Vo l 8 p 247 1 992 Vo l 8 Effectively suppress target gene expression using antisense nucleic acid The length of the sense nucleic acid is at least about 10 bases or more (for example, 10 is preferably about 15 bases or more, more preferably about 100 salts or more, preferably There are about 500 bases or more.Antisense nucleic acid can be designed as follows (for example, Hirashima and Inoue Neonatal acid IV gene replication and expression The Japan Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin 1 19-347) JK a wa k am ι eta 1 P ha J ap an Vo l 8 p 247 1 992 Vo l 8
1 992 S T C r o o k e e t a 1 e d A e Re s e a r c h a nd Ap p l i c a t i o n s C s 1993なと参昭） 。 1 992 S T C r o o k e eta a e dA e Re c e a r c a n a c ap a i c a t i io t ns C s 1993 Naoto).
また 本発明のかん治療剤においては TSTA 3遺伝子の転 に切断するリホサイム活性を有する核酸を有効成分として用いる ここていう 「リホサイム活性」 とは 夕ーケノトとする遺伝子の mRNAを部位特異的に切断する核酸のことをいう。 リホサイム Iイントロン型や RNa s e Pに含まれる Ml RN Aのように チト以上の大きさのものもあるか ハンマ一へノ卜型やへァヒン 0ヌクレオチト程度の活性トメインを有するものもある （タンハ 1990 35 p 2 1 9 1) 。 ハンマーへノト型リホサイム えは FEBS L e t t 1988 228 p 228 F t 1988 239, p 285 タンハク質核酸酵素 19 害することかてきる In addition, the therapeutic agent for cans of the present invention uses, as an active ingredient, a nucleic acid having a refosym activity that cleaves into the TSTA 3 gene. The term “rehosym activity” refers to a nucleic acid that specifically cleaves the mRNA of a gene used as a kenot. I mean. Is there a rehosym I intron type or Ml RN A contained in RNa se P, or is it larger than a chito? Some have a hammer type or hea hin 0 active nucleotides (Tanha 1990) 35 p 2 1 9 1). Hammerhead Rehosaime FEBS L ett 1988 228 p 228 F t 1988 239, p 285 Protein Nucleic Acid Enzyme 19 Come to harm
さらに 本発明は TSTA 3遺伝子の転写活性を阻害する を有効成分として用いることかてきる そのような化合物は 3遺伝子の発現 転写に関与する因子に結合する化合物てある。 物は 天然物ても合成化合物てもよい。 このような化合物は ンク方法によって 取得することか可能てある。  Furthermore, the present invention can use as an active ingredient an inhibitor of the transcriptional activity of the TSTA 3 gene. Such a compound is a compound that binds to a factor involved in the expression and transcription of the 3 gene. The product may be a natural product or a synthetic compound. Such compounds can be obtained by the link method.
1 2 T S T A 3夕ンハク質の活性阻害物質を含有するがん 本発明はまた 別の実施形態において TSTA 3タンハク を含有するかん治療剤を提供する。 Cancer containing 1 2 T S T A 3 protein activity inhibitory substance In another embodiment, the present invention provides a therapeutic agent for cannula containing TSTA 3 protein.
本明細書中 「TSTA3タンハク質の活性阻害物質」 には In this specification, “TSTA3 protein activity inhibitor”
(a) TSTA3タンハク質に結合する抗体 (a) Antibody binding to TSTA3 protein
(b) TSTA 3タンハク質に対してトミナント不カティフの S T A 3夕ンハク質変異体 あるいは  (b) Tomatoant non-catific S T A 3 protein variants against TSTA 3 protein or
(c) TSTA 3タンハク質に結合する化合物 （上記抗体お (c) Compound that binds to TSTA 3 protein
<) <)
なとか含まれる Somehow included
本明細書における 「抗体」 とはタンハク質の全長又は断片に反 味する。 本発明の抗体の形態には 特に制限はなく 本発明の T ク質に結合する限り 上記ホリクローナル抗体 モノクローナル ヒト抗体 遺伝子組み換えによるヒト型化抗体 さらにその抗体 物も含まれる。 TSTA 3タンハク質に結合する抗体 （抗 TST 当業者に公知の方法により調製することか可能てある なお 抗 さらに 本発明においては TSTA3タンハク質の活 ftを して T S T A 3夕ンハク質に結合する 上記抗体または変異 有効成分として用いることかてきる。 そのような化合物は 例 タンハク質に結合し その活性を阻害する化合物てある この 天然物ても合成化合物てもよい。 このような化合物は 後述の 法によって 取得することか可能てある。 As used herein, “antibody” refers to the entire length or fragment of a protein. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, so long as it binds to the T protein of the present invention, the above monoclonal antibody monoclonal human antibody humanized antibody by gene recombination and the antibody product thereof are also included. Antibodies that bind to TSTA 3 protein (anti-TST may be prepared by methods known to those skilled in the art. Furthermore, in the present invention, the TSTA3 protein activity ft can be used as the above-mentioned antibody or mutant active ingredient that binds to the TSTA3 protein. Such compounds are examples of compounds that bind to proteins and inhibit their activity, which may be natural or synthetic. Such compounds can be obtained by the method described below.
上記した本発明の T S T A 3タンハク質の活性を阻害し得る 剤として使用することかてきる。 2 TSTA 3タンハク質の活性もしくは発現を阻害する物質 方法  It can be used as an agent capable of inhibiting the activity of the above-mentioned TSTA3 protein of the present invention. 2 Substances that inhibit the activity or expression of TSTA 3 protein
本発明は かん抑制作用を有する候補化合物のスクリーニンク る  The present invention relates to screening of candidate compounds having an anti-cane action.
一つの好ましい態様は T S T A 3タンハク質と被検化合物と する方法てある。 通常 TSTA 3タンハク質と結合する化合 タンハク質の活性を阻害する効果を有することか期待される。 こ は TSTA3タンハク質の活性部位に結合することか好ましい ては まず TSTA3タンハク質と被検化合物とを接触させる ンハク質は 被検化合物との結合を検出するための指檸に応して TA 3タンハク質の精製された形態 細胞内または細胞外に発現 いはァフィ二ティーカラムに結合した形態てあり得る。 この方法 合物は必要に応して適宜標識して用いることかてきる 檸識とし 放射標識 蛍光檸識等を挙げることかてきる。 定されない。 One preferred embodiment is a method using TSTA 3 protein and a test compound. It is expected to have an effect of inhibiting the activity of the compound protein that normally binds to TSTA 3 protein. This is preferably binding to the active site of TSTA3 protein. First, the TSTA3 protein is brought into contact with the test compound. The protein responds to the finger to detect the binding with the test compound. Purified form of protein. It can be expressed intracellularly or extracellularly or bound to an affinity column. This method can be used by appropriately labeling the compound as necessary, and as a knowledge, radiolabel, fluorescence knowledge, etc. can be mentioned. Not determined.
TSTA3タンハク質と被検化合物との結合は 例えは T 質に結合した被検化合物に付された檸識によって検出すること 細胞内または細胞外に発現している T S T A 3夕ンハク質への により生しる TSTA 3タンハク質の活性の変化を指標として きる。 タンハク質と被検化合物との結合活性は 公知の手法に とかてきる （例えは Su l l i v an F X ， e 998) J B i o l Ch em 273 81 93 Ohyama C e t a 1 ( 1 998) J B em 273 14582 - 14587 No d a a 1 (2003) C an c e r Re s 63 62 参昭） 。  The binding of the TSTA3 protein to the test compound is detected by, for example, the knowledge attached to the test compound bound to the T protein. The change in TSTA 3 protein activity can be used as an indicator. The binding activity between the protein and the test compound can be determined by known methods (eg Sulliv an FX, e 998) JB iol Ch em 273 81 93 Ohyama C eta 1 (1 998) JB em 273 14582-14587 No daa 1 (2003) Cancer Res 63 63).
本方法にあいては 次いて TSTA3タンハク質と結合し する被検化合物を選択する。  Next, select the test compound that binds to the TSTA3 protein.
本方法により卓離される化合物は かん抑制作用を有すること ん冶療剤として有用てある  Compounds separated by this method are useful as anti-therapeutic agents with anti-cane action
本発明のスクリーニンク方法の他の態様は TSTA3遺伝 する方法てある。  Another embodiment of the screening method of the present invention is a method for TSTA3 inheritance.
本方法においては ます TSTA 3遺伝子を発現する細胞に 接触させる。 用いられる 「細胞」 の由来としては ヒト マウス ウノ ヒソン トリなと へノト 家畜等に由未する細胞か挙け ら由来に制限されない 「TSTA3遺伝子を発現する細胞」 と の T S T A 3遺伝子を発現している細胞 または外因 ttの T ST 合物ライフラリー 遺伝子ライフラリーの発現産物 細胞抽出 発酵微生物産生物 海洋生物抽出物 植物抽出物等か用いられるIn this method, the cells are further brought into contact with cells expressing the TSTA 3 gene. The origin of the “cells” used is human mouse urchin hysson chicken and henoto cells that are not derived from livestock, etc. Cells or exogenous tt T ST Compound life rally Gene life rally expression product Cell extraction Fermentation microorganism product Marine organism extract Plant extract etc.
TSTA 3遺伝子を発現する細胞への被検化合物の 「接触」 れ T S T A 3遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を て行うか この方法に限定されない。 被検化合物かタンハク質 タンハク質を発現する DN Aヘクターを 該細胞へ導入するこ 触」 を行うことかてきる。 Whether the test compound is “contacted” with the cell expressing the TSTA 3 gene and the test compound is used in the culture medium of the cell expressing the T S T A 3 gene, is not limited to this method. Test compound or protein A method of introducing a DNA hector expressing a protein into the cell.
本方法においては 次いて 該 TSTA 3遺伝子の発現レヘ こて 「遺伝子の発現」 には 転写およひ翻訳の双方か含まれる。 ヘルの測定は 当業者に公知の方法によって行うことかてきる。 A 3遺伝子を発現する細胞から mRNAを常法に従って抽出し 铸型としたノーサンハイフリ夕イセーノヨン法または RT— PC ことによって該遺伝子の転写レヘルの測定を行うことかてきる。 T A 3遺伝子のフロモーター領域を常法に従って卓離し その (例えは ルノフエラーセ GFP カラクトノ夕ーセ等の発 とを指檸に検出可能な遺伝子か挙けられるか これらに限定さ その檸識遺伝子の活 を見ることによっても該遺伝子の転写レヘ ことかてきる。 また TSTA3遺伝子を発現する細胞からタン 収し それそれ T S T A 3タンハク質の発現を S D S一 PAGE て検出することにより 遺伝子の翻訳レヘルの冽定を行うことも TSTA 3タンハク質に対する抗体を用いて ウエスタンフロノ 施することにより該夕ンハク質の発現を検出することにより 遺 ルの測定を行うことも可能てある T STA 3タンハク質の検出 3 抗 TSTA 3抗体及ぴこの抗体を含有する治療剤、 複合体 本発明はまた 抗 TSTA3抗体 この抗体を含有するかん する。 本発明の 1つの好ましい態様ては 上記かん治療剤は または檸的化薬物送達のために使用される。 Next, in this method, the expression level of the TSTA 3 gene “gene expression” includes both transcription and translation. Hell can be measured by methods known to those skilled in the art. It is possible to measure the transcriptional reherence of the A3 gene by extracting the mRNA from cells expressing the A3 gene according to a conventional method, and using the Norse hybri-isen method or RT-PC. Disclose the floor motor region of TA 3 gene according to the conventional method. (For example, can you list genes that can be detected using fingertips such as Renofellase GFP, Caractonouse, etc.?) The transcription level of the gene can also be determined by looking at the TSTA3 gene expression from the cells expressing the TSTA3 gene and detecting the expression of the TSTA3 protein by SDS-PAGE. It is also possible to measure the residue by detecting the expression of the protein by Western Frono using an antibody against TSTA 3 protein Detection of T STA 3 protein 3 Anti-TSTA3 antibody and therapeutic agent containing this antibody, complex The present invention also contains an anti-TSTA3 antibody. In one preferred embodiment of the present invention, the above therapeutic agents are used or for enthusiastic drug delivery.
3 1 抗 TSTA3抗体 3 1 Anti-TSTA3 antibody
本明細書中 「抗 TSTA3抗体」 には TS TA3タンハ (部分へフチト） もしくはその塩を含む） に特異的に結合する抗 本発明において使用する抗 T STA3抗体は ホリク口一ナル抗 いし モノクローナル抗体てあってもよい。 抗体のクラスは 特 I gG I gM I g A I gD または I gE等のいすれのァ する抗体をも包含する。 好ましくは I gGまたは I gMてあり 等を考慮すると より好ましくは I gGてある。 また ここてい う用語は 任意の抗体断片または誘導体を含む意味て用いられ F a b 2 CDR ヒト化抗体 多機能抗体 単鎖抗体 （S c む。 本発明の抗体は 公知の方法て製造することかてきる。 この 造法は当該分野て周知てある （例えは Ha r 1 ow E & An t i b o dy, Co l d S p r i n g Ha r b o r o r y P r e s s (1 988) を参昭） 。 In the present specification, the “anti-TSTA3 antibody” is an anti-TSTA3 antibody that specifically binds to TS TA3 Tanja (including partial hechito) or a salt thereof). The anti-TSTA3 antibody used in the present invention is a monoclonal antibody or monoclonal antibody. May be. The antibody class also includes any antibody, such as IgG IgM Ig Ig gD or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in consideration of the above. The term used here is meant to include any antibody fragment or derivative. Fab 2 CDR humanized antibody Multifunctional antibody Single-chain antibody (Sc) The antibody of the present invention can be produced by a known method. This method is well known in the art (see, for example, Har 1 ow E & Antibody, Cold Spring Harborory Pres (1 988)).
(1) 抗原の調製  (1) Preparation of antigen
本発明において 感作抗原として使用されるタンハク質は 通 タンハク質またはその塩てある。 上記 TSTA3タンハク質には チトも含まれ これは 限定されることはないか 例えは 配列 よい。 ここて用いられる T S T A 3夕ンハク質またはその部分 ては 例えは 《機酸 （例えは 塩酸 硫酸） との塩 あるい 酢酸 キ酸 フロヒオン酸） との塩なとか用いられる。 抗体取 て使用される本発明の TSTA 3タンハク質は その由来となる れないか哺乳動物 例えばマウス ヒト由来のタンハク質か好ま 由来のタンハク質か好ましい。 The protein used as the sensitizing antigen in the present invention is a protein or a salt thereof. The above TSTA3 protein contains chito, isn't it limited? Good. The TSTA protein used here or its part is used, for example, as a salt with a mechanical acid (eg, hydrochloric acid or sulfuric acid) or a salt with acetic acid, oxalic acid or fluoric acid). The TSTA 3 protein of the present invention to be used for the antibody is preferably derived from a mammal, for example, a mouse derived from a human or a mouse.
(2) T S T A 3夕ンハク質に対するモノクローナル抗体の作製 (2) Production of monoclonal antibodies against T S T A 3 protein
( I ) 抗体産生細胞の採取 (I) Collection of antibody-producing cells
上記のような丁 STA 3タンハク質 その部分へフチト又はそ 中 抗体に関する説明ては これらをまとめて 「TSTA3タ う。 ） を抗原として 哺乳動物 例えはラノ ト マウス ゥサキ 抗原の動物 1匹当たりの投与量は ァノュハントを用いないとき ◦ mgてあり ァノュハントを用いるときは 1〜100 /gてあ トとしては フロイント完全ァノュハント （FCA) フロイン ハント （F IA) 水酸化アルミニウムァノュハント等か挙けら 王として静脈内 皮下又は腹腔内等に/王入することにより行われ の間隔は特に限定されす 数日から数週間間隔 好ましくは 2〜 1〜10回 好ましくは 2〜5回免疫を行う。 そして 最終の免 0日後 好ましくは 1〜14日後に抗体産生細胞を採集する。 抗 ては 脾臓細胞 リンハ節細胞 末梢血細胞等か挙けられるか 所リンハ節細胞か好ましい  Dust STA 3 protein as described above For the description of the antibody to the part or the antibody in the part, put these together and use “TSTA3”) as an antigen Mammal, for example, Ranoto mouse Usaki antigen per animal The amount is 1 mg / kg when no anohunt is used, and 1 to 100 / g when anohunt is used. As a king, Freund Hunt (FCA), Freund Hunt (F IA), aluminum hydroxide, etc. Intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, etc. The interval between administrations is particularly limited. Several days to several weeks, preferably 2 to 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times. After 0 days from immunization, antibody-producing cells are preferably collected after 1 to 14. Anti-spleen cells Linha node cells Peripheral blood cells can be listed Where Linha node cells are preferable
( I I ) 細胞融合  (I I) Cell fusion
ハイフリ トーマを得るため 抗体産生細胞とミエローマ細胞と マ細胞株 YB 2Z0なとのラノ卜ミエローマ細胞株か挙けら 次に 上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる 血清を含まない DMEM RPM I— 1640培地なとの動物 て 1 X 1 06〜 1 X 1 07個 Zm 1の抗体産生細胞と 2 X 1 0 Zmlのミエローマ細胞とを混合し （抗体産生細胞とミエロー 2 1〜3 1か好ましい） 細胞融合促進剤存在のもとて融 胞融合促進剤として 平均分子量 1000〜6000タルトン リコール等を使用することかてきる。 また 電気刺激 （例えは ノヨン） を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と とを融合させることもてきる。 Antibody-producing cells and myeloma cells The cell line YB 2Z0 and the Rano myeloma cell line. Next, the above-mentioned myeloma cells and antibody-producing cells are fused. Serum-free DMEM RPM I—1640 medium animal 1 X 1 0 6 ~ 1 X 10 7 cells Zm 1 antibody-producing cells and 2 X 10 Zml myeloma cells are mixed (antibody-producing cells and myelo 2 1-31 are preferred) Melt in the presence of cell fusion promoter It is possible to use an average molecular weight of 1000 to 6000 tarton recall as a cell fusion promoter. It is also possible to fuse antibody-producing cells with commercially available cell fusion devices that use electrical stimulation (eg Noyon).
(i l l) ハイフリ ] ^一マの選別及ひクローニンク  (i l l) high]
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイフリ トーマを選別 して 細胞懸濁液を例えはゥシ胎児血清含有 RPM I - 1640 に希釈後 マイクロタイ夕ーフレート上に 3 X 105個 Zwe 1 ゥエルに選択培地を加え 以後適当に選択培地を交換して培養を 選択培地て培養開始後 14日前後から生育してくる細胞をハイ て得ることかてきる。 Select the desired hybridoma from the cells after cell fusion treatment, and dilute the cell suspension, for example, with RPMI-1640 containing urine fetal serum, then 3 x 10 5 on Zwe 1 well After adding the selective medium, replace the selective medium appropriately, and then cultivate. Select the selective medium to obtain high cells that grow from about 14 days after the start of the culture.
次に 増殖してきたハイフリ トーマの培養上凊中に TSTA 反応する抗体か存在するか否かをスクリーニンクする。 ハイフリ —ニンクは 通常の方法に従えはよく 特に限定されるものては ハイフリ トーマとして生育したゥエルに含まれる培養上清の一部 免疫測定法 放射 I生免疫測定法等によってスクリーニンクするこ 合細胞のクローニンクは 限界希釈法等により行う。 そして 最 地 MEM培地又は to血清培地等の動物細胞培養培地中て 通 えは 37°C 5% C〇2濃度） て 7〜14日間培養し その を取得する。 腹水形成法の場合は ミエローマ細胞由来の哺乳 の腹腔内にハイフリ トーマを約 1 X 107個投与し ハイフリ 殖させる そして 1〜 2週間後に腹水を採取する 上記抗体 て抗体の精製か必要とされる場合は 硫安塩析法 イオン交換 一 ゲル濾過 ァフィ二ティークロマトクラフィ一なとの公知 して 又はこれらを組み合わせることにより精製することかてNext, screen for the presence or absence of antibodies that react with TSTA in the culture supernatant of the proliferating hyphritoma. Hyfuri-Nink is well following normal methods. Especially limited is part of the culture supernatant contained in wells grown as hyfritoma Immunoassay Radiation I Screening cells by radioimmunoassay etc. Cloning is performed by the limiting dilution method. And most Earth MEM medium or through e Te animal cell culture media in to serum medium such as 37 ° C 5% C_〇 2 concentration) Te cultured for 7 to 14 days to get that. In the case of ascites formation, administer approximately 1 X 10 7 hyfritomas into the abdominal cavity of mammals derived from myeloma cells, and perform hyfuri breeding, and collect ascites after 1 to 2 weeks. In the case of ammonium sulfate salting-out method, ion exchange, gel filtration, affinity chromatography, etc.
(3) T S T A 3夕ンハク質に対するホリクローナル抗体の作 まず 上記した抗原を哺乳動物 例えはラノ ト マウス ゥ る 抗原の動物 1匹当たりの投与量は ァノュハントを用いな l O Omgてあり アンュハントを用いるときは 10〜； L 00 O ノュハントとしては フロイント完全ァノュハント （FCA) 全ァノュハント （F IA) 水酸化アルミニウムアンュハント 免疫は 王として静脈内 皮下又は腹腔内等に/王入することに た 免疫の間隔は特に限定されす 数日から数週間間隔 好ま 間隔て 1〜10回 好ましくは 2〜5回免疫を行う。 そして ら 6〜60日後に 酵素免疫測定法 （EL I S A (e n z ume l mm uno s o r b e n t a s s y) 又は E I A (e n z y n o a s s a y) ) 放射 tt免疫測定法 （R I A r a d ι o ι s s ay) 等て抗体価を測定し 最大の抗体価を示した日に探 。 (3) Production of monoclonal antibodies against TSTA protein First, mammals such as Lanoto mouse, etc. The antigen dose per animal is 1 O Omg without ananhunt, and an unhunt is used. When 10 ~; L 00 O As a nuhunt Freund complete hunting (FCA) All hunting hunting (F IA) Aluminum hydroxide hunting immunity was to be intravenously subcutaneously or intraperitoneally as a king The interval is not particularly limited. Several days to several weeks. Intervals are preferably performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times. 6 to 60 days later, the antibody titer was measured by enzyme immunoassay (ELISA (enz ume lmmuno sorbentassy) or EIA (enzynoassay)) radio tt immunoassay (RIA rad ι o ι ss ay), etc. Search on the day of showing the antibody titer.
次いて 例えは 抗血凊中のホリクロ一ナル抗体を TSTA は 例えは R l e c hmannら (R i e c hmann J Oc t 5 203 (3) 825 - 8 1988) およひ J on e sら Na t u r e 321 522-525 1986 な方法の 1つにより調 することかできる。 Next, for example, the anti-blood clot polyclonal antibody For example, R lec hmann et al. (Riec hmann J Oct 5 203 (3) 825-8 1988) and Jone es et al. Nature 321 522-525 1986 can be prepared by one of the methods.
また キメラ抗体は 例えは 「実験医学 （臨時増刊号） No 10 1988」 特公平 3— 73280号公報等を ヒ えば 「Na t u r e Ge n e t i c s Vo l 1 5 p 1997」 「Na t u r e Ge n e t i c s Vo l 7, 1994」 特表平 4— 504365号公報 国際出願公開 W〇 5号公報等 「日経サイエンス 6月号 第 40〜第 50頁 Chimeric antibodies, for example, “Experimental Medicine (Special Issue) No 10 1988”, Japanese Patent Publication No. 3-73280, etc., can be found in “Nature Genetics VoI 15 p 1997” “Nature Genetics VoI 7, 1994 ”Special Publication No. Hei 4-504365 Gazette International Application Publication W05 Gazette, etc.“ Nikkei Science June issue, pages 40 to 50 ”
「Na t u r e Vo l 368 p 856— 859 199 - 500233号公報等を参考にそれそれ製造することかてきる TA 3タンハク質に結合する抗体は 例えは 癌細胞の増殖もし 等を目的とした使用か考えられる。 得られた抗体を人体に投与 療） て使用する場合には 免疫原 ftを低下させるため ヒト抗体 好ましい “Antibodies that bind to TA 3 protein, which can be produced by referring to“ Naturture Vol 368 p 856—859 199-500233 ”, are used for the purpose of cancer cell growth, etc.? When the obtained antibody is used for administration to the human body, it is preferable to use a human antibody to reduce the immunogen ft.
抗体は 診断剤として用いる場合は モニタリンク等のための は 放射性同位元素 蛍光物質なと） て標識されていてもよい。 放射 物質 蛍光化合物なとにより桴識することかてきる 最も 化合物の中には フルォレセインイソチォノア不一ト ロータミ トリンおよひフルォレスカミンかある。 同様に 生体発光性化合 体 TSTA3抗体を標識することもてきる。 生体発光 ftタンハク 光の存在を検出することによって測定される。 この檸識目的に重 3 2 抗 TSTA 3抗体を含有する複合体なと When used as a diagnostic agent, the antibody may be labeled as a radioisotope or a fluorescent substance for monitor links. Radioactive materials The most common compounds that can be identified are fluorescent compounds such as fluorescein isothionoa, rotamitrin and fluorescamine. Similarly, the bioluminescent compound TSTA3 antibody can be labeled. Bioluminescence ft tan haku Measured by detecting the presence of light. Heavy for this knowledge purpose 3 2 Complex containing anti-TSTA 3 antibody
また 本発明において使用する抗 TSTA 3抗体は 本発明の 断剤において それ自体か 抗原の活 を减弱させるような中和 剤 （a g e n t ) てあり得るか 必要に応して 治療効果を奏す 剤と組み合わせて用いることかてきる。 したかって 本発明は において かん （例えは 大腸かん） の標的化療法または檸的化 に使用するための 抗 TSTA 3抗体と他の薬剤との複合体 そ を含有する組成物なとをも提供する。 このような態様によれは 使用する抗 TSTA 3抗体を用いて 治療効果を奏する他の薬剤 めの檸識剤なとを T S T A 3タンハク質を高発現する檸的部位 かてきる。  Also, can the anti-TSTA 3 antibody used in the present invention itself be a neutralizing agent (agent) that weakens the activity of the antigen in the blocking agent of the present invention or combined with an agent that exhibits a therapeutic effect as necessary You can use it. Therefore, the present invention also provides a complex containing an anti-TSTA 3 antibody and another drug for use in targeting therapy or desensitization in humans (eg, large intestine). . According to such an embodiment, the anti-TSTA 3 antibody to be used can be used as an intelligent site for highly expressing TSTA 3 protein, as well as other agents that have therapeutic effects.
本発明にあいて用いられる 「その他の葉剤」 としては 例えは 素 治療タンハク質 または低分子の薬剤なと 檸的への遺伝子 ィルスへクタ一もしくは非ウィルスヘクターなとか例示される。  Examples of the “other leaf agent” used in the present invention include an elemental therapeutic protein, a low molecular weight drug, and a genetically-targeted non-viral hector.
本発明において 「放射性同位元素」 の例としては フノ素一 125 (125 I) およひヨウ素— 131なとの放射性ハロケン る。 これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属元素と同様 卜に檸識して 放射性治治療剤あるいは放射 14診断剤として広く えは 125 Iまたは131 Iてのョート化は クロラミン T法等の り 抗体または抗体断片に結合させることかてきる。 さらに 診 ク不チウム一 99 m インンゥム一 1 1 1およひカリウム一 6 と また冶療用としてはイノトリウム一 90 (90 Y) レニウム 本発明において 「治療タンハク質」 の例としては 免疫を するサイト力インか好適てあり 例えは ヒトインターロイキ —マクロファーン一コロニー刺激因子 ヒトマクロファーンコロ ヒトインターロイキン 1 2等か挙けられる。 また 大腸かん細 ため リシンゃノフテリア毒素なとの毒素を用いることかてきる タンハク質との融合抗体については 抗体または抗体断片をコ に冶療夕ンハク質をコートする c D N Aを連結させ 融合抗体を Aを構築し この D N Aを原核生物または真核生物用の発現ヘク この発現ヘクターを原核生物または真核生物へ導入することによ 合抗体を製造することかてきる。 In the present invention, examples of the “radioisotope” include radioactive halokens such as fluorinone 125 ( 125 I) and iodine-131. These radiohalogen elements are also known in the same way as the above-mentioned radiometal elements, and are widely used as radiotherapeutic agents or radio14 diagnostic agents. For example, 125 I or 131 I can be sterilized by chloramine T method, etc. It can be conjugated to an antibody fragment. In addition, inspecting copper indium 99 m indium 1 1 1 and potassium 1 6 and also for inotorium 90 ( 90 Y) rhenium Examples of “therapeutic proteins” in the present invention are preferably immunity to the site of immunity, for example, human interleukin—macrofern colony stimulating factor human macrofernolo human interleukin 1 2 and the like. In addition, it is possible to use toxins such as ricin and nophtheria toxin for colon colonization. For the fusion antibody with protein, the antibody or antibody fragment is co-coated with the DNA coated with the protein. It is possible to construct an antibody by constructing A and introducing this DNA into a prokaryotic or eukaryotic expression hex.
「低分子の薬剤」 は 本明細書中て 「放射 ft同位元素」 や 「冶 等以外の診断または冶療用化合物を意味するものとして用いられ 薬剤」 の例としては ナイ トロンェン マスタート サイクロフ とのアルキル化剤 5—フルォロウランル メソトレキセートな 夕ウノマイノン フレオマイノン マイトマイノン C 夕ウノル ルヒノンなとの抗生物質 ヒンクリスチン ヒンフラスチン ヒ な植物アル力ロイト 夕モキノフェン テキサメ夕ソンなとのホ 癌剤 （臨床腫瘍学 （日本臨床腫瘍研究会編 1 9 9 6年 癌と化 またはハイト口コーチソン フレトニソンなとのステロイ ト剤 ントメ夕ノンなとの非ステロイト剤 金チォマレート へニノラ 調節剤 サイクロフォスファミト アサチォフリンなとの免疫抑 酸クロルフエ二ラミン クレマンチンのような抗ヒスタミン剤等 症と抗炎症療法 昭和 5 7年 医歯薬出版株式会社） なとかあけ 夕一 （Wang, P e t a 1 ( 1995) S o 1 1 and Mo l e c Ge n e t 21， 429 ロウィルスヘクター （N a v l a u x R K e t a 1“Low molecular drug” is used in this specification to mean “radiation ft isotope” or “drugs other than metallurgy or diagnostic compounds”. Alkylating agent 5-Fluorouranlu methotrexate evening unomainon flemainon mitmainone C evening unolu ruhinone antibiotics hinkristin hinfrastin hi plant alto reuters evening mokinofen texame methasone cancer drug (clinical oncology (Japanese clinical oncology research) 1 9 9 6 Years Cancer and conversion or height mouth cortisone Fretonison's sterolite agent Non-sterolite agent's non-sterolite agent Gold zomarate Heninola Modulator Cyclophosphamito Immunosuppressant of acetylcholine Chlorpheniramine Antihistamine like clemantine Symptom and anti-inflammatory therapy Showa 5 7 Ishiyaku Shuppan Publishing Co., Ltd.) Yuichi (Wang, Peta 1 (1995) So 1 1 and Mo lec Ge net 21, 429 Rovirus Hector (N avlaux RK eta 1
J V i r o l 70 , 5701 - 5705) レンチウ (N a 1 d l n l L ( 1998) Cu r r Op i e c hno l 9 457 -463) なとか挙けられる） 。 ルスヘクターには 細胞増殖関連遺伝子 ァホトーンス関連遺 伝子等の 檸的部位 （例えは 大腸かん） において 例えは ノスを誘導するなとの治療効果を奏する遺伝子 （治療遺伝子） 抗 TSTA3抗体に結合するウィルスヘクターは 抗 TSTA3 子治療を必要とする崈者に投与された場合 抗 TSTA 3抗体 (すなわち TSTA3) か存在する部位に椁的化することかて 抗 T S T A 3抗体と上記他の薬剤とは 化学的または遺伝子 得る。 ここて 「化学的な結合」 には イオン結合 水素結合 間力による結合 疎水性相互作用による結合なとか含まれるもの 工学的な結合」 には 例えは 抗体と冶療タンパク質とからなる を遺伝子組換えなとの技術を用いて作製した場合の 抗体と治療 間の結合様式なとか含まれるものとする。 4 製剤化および製剤の投与方法 J V i r o l 70, 5701-5705) Wrench (N a 1 d l n l L (1998) C r r Op i e c h l l 9 457 -463). For example, a gene that exerts a therapeutic effect when it does not induce nose in a spurious part of a cell growth-related gene, such as a gene related to cell proliferation (eg, large intestine) (therapeutic gene), a viral hector that binds to an anti-TSTA3 antibody When administered to a person in need of anti-TSTA3 child therapy, anti-TSTA 3 antibody (i.e., TSTA3) or activating to the existing site Get the gene. Here, “chemical bond” includes ionic bond, hydrogen bond, bond by interfacial force, and bond by hydrophobic interaction. “Engineering bond” includes, for example, an antibody and a therapeutic protein. This includes the mode of binding between the antibody and the treatment when produced using any technology. 4 Formulation and administration method
本発明の T S T A 3遺伝子の発現阻害物質を含有するかん治療 夕ンハク質の活性阻害物質を含有するかん治療剤 本発明の抗 T 含有する冶療剤 または本発明において使用する抗 TSTA 3抗 着香 W 保存 安定剤 緩衝剤 懸濁剤 等張化剤 結合剤 流動性促進剤 矯味剤等か挙けられるか これらに制限されず 体を適宜使用することかてきる。 具体的には 軽質 水ケィ酸 ロース マンニトール テンフン カルメロースカルンゥム カ リウム ヒトロキノフロヒルセルロース ヒ卜ロキノフロヒルメ ホリヒ二ルァセ夕一ルシェチルァミノアセテート ホリヒニルヒ チン 中鎖脂肪酸トリクリセライト ホリオキノエチレン硬化ヒ 糖 カルホキノメチルセルロース コーンスターチ 挺機塩類等 てきる。 Therapeutic treatment containing the TSTA 3 gene expression inhibitor of the present invention The therapeutic agent containing the activity inhibitory substance of porphyry activity Anti-T-containing therapeutic agent of the present invention or the anti-TSTA 3 anti-antibody used in the present invention Flavoring W Storage Stabilizer Buffering Agent Suspending Agent Tonicity Agent Binder Fluidity Accelerating Agent Can it be used as a flavoring agent? Specifically, light water silicate, mannitol, tenfune, carmellose, calumum, humanroquinofuroylcellulose, 卜 roquinofurilme, holinoylase, luciferyl acetate, holhinyl chin, medium chain fatty acid, trichrycelite, holioquinoethylene, hardened saccharide Hokinomethylcellulose Corn starch 挺 MACHINE salt etc.
本発明の冶瘁剤の剤型の種類としては 例えは 経口剤として 丸剤 散剤 顆粒剤 細粒剤 軟 硬カフセル剤 フィルムコー レノト剤 舌下剤 へ一スト剤等 非経口剤として注射剤 坐剤 剤 硬膏剤 外用液剤等か挙げられ 当業者においては投与経路 応した最適の剤型を選ふことかてきる。 有効成分としての T S T の活性 （または TSTA 3遺伝子の発現） 阻害物質は 製剤中 0 9重量％含有することかてきる。  Examples of the dosage form of the blacksmithing agent of the present invention are, for example, as an oral agent, pill, powder, granule, fine granule, soft hard cuff cell agent, film coret, sublingual agent, first agent, etc. parenteral, injection, suppository, suppository Cement plaster External liquids etc. are mentioned. Those skilled in the art can select the optimal dosage form according to the administration route. TST activity (or expression of TSTA 3 gene) inhibitor as an active ingredient can be included in the preparation at 09% by weight.
本発明の薬剤の有効成分の投与量は 投与対象 対象臓器 症 とにより差はあるか 経口投与の場合 一般的に例えは 害者 て） に対して一日につき約 0 lmg〜l O O Omg 好まし 10 Omg より好ましくは約 1 0〜50mgてある 非経口 合は その一回投与量は投与対象 対象臓器 症状 投与方法な なるか 例えは 注射剤の形ては通常例えは 砉者 （6 O k gに にっき約 0 01から 3 Omg程度 好ましくは約 0 1から 2 ることかてきる。 ヒト以外の動物の場合も 上記の 6 0 k g当た を投与することかてきる。 Is the dose of the active ingredient of the drug of the present invention different depending on the administration target organ disease? Oral administration is generally about 0 lmg to 1 OO Omg per day. 10 Omg, more preferably about 10-50 mg. When parenteral, the single dose is subject to administration Target organ Symptom Administration method, for example, the form of injection is usually normal (for example, 6 O kg) About 0 01 to 3 Omg, preferably about 0 1 to 2 I will come. In the case of animals other than humans, the above dose of 60 kg can be administered.
本発明の冶療剤は かん （例えは 大腸かん 胃かん 肺かん 腺かん 食道かん 肝臓かん 胆道かん 脾臓かん 腎かん 膀 ん （例 子宮頸かん 子宮体かん） 精巣かん 甲状腺かん 膝 ん 腫瘍 血液腫瘍なと） の予防 治療 好ましくは 大腸か に用いられる  The therapeutic agent of the present invention is a can (eg, large intestine, stomach, lung, gland, esophagus, liver, biliary tract, spleen, kidney, bladder) Is preferably used in the large intestine
本発明の葉剤は T S T A 3夕ンハク質の活性阻害物質または 子の発現阻害物質を有効成分として含有しているため 抗癌剤 癌細胞のァホトーノス誘導剤等として使用し得る。 対象となる細 または癌の種類は特定のものに限定されない。 また 本発明の葉 3タンハク質の活性阻害物質あよひ T S T A 3遺伝子の発現阻害 んていても良い。  Since the leaf preparation of the present invention contains a substance that inhibits the activity of T STA 3 protein or a substance that inhibits the expression of a child as an active ingredient, it can be used as an anti-cancer agent, a photonos inducer of cancer cells, and the like. The target type of cancer or cancer is not limited to a specific type. In addition, expression of the leaf 3 protein activity inhibitory substance Ayohi T S T A 3 gene of the present invention may be inhibited.
本発明の冶療剤において アンチセンス核酸を用いる場合 該 酸を単独あるいはレトロウイルスヘクター ァテノウィルスヘク ィルスァソシエーテノ卜ウィルスヘクターなとの適当なヘクター 公知の手段に従って投与することかてきる。 アンチセンス核酸は いは生理学的に認められる担体とともに製剤化し 遺伝子銃やハ 一テルのようなカテーテルによって投与することかてきる。  When an antisense nucleic acid is used in the therapeutic agent of the present invention, the acid may be administered according to a known method such as a single virus or a suitable virus such as a retrovirus, a virus, a virus, a virus, a virus, a virus, and a virus. Antisense nucleic acids can be formulated with physiologically acceptable carriers and administered via a gene gun or catheter such as a hash.
また 本発明において組換えァテノウィルス粒子のようなウィ 抗 T S T A 3抗体との祖み合わせを癌冶療のために使用する場合 て使用してもよいか 一般には製薬的に許容てきる担体と共に使 ような担体としては 既に上記したような担体 ならひに水 生 場合は 通常成人一人当たり 1回に 103〜1 015個のウィルス のか好ましいか 疾病の状態ゃ桴 w細胞 組織の性質によって 与回数は 1日 1回〜数回てよく 投与期間は 1日〜数ケ月以 く 1〜数回の投入を 1セノトとして 長期にわたって断続的 与してもよい。 また 本発明において使用されるウィルスヘクタ ィルスヘクター核酸分子は 特定の細胞およひ または組織の 状態の診断に使用することかてきる。 例えは ウィルスへクタ一 出可能なマーカ一遺伝子を組込み これを適切な宿主細胞にトラ ンして得られたウィルスへクタ一粒子は 抗 TSTA3抗体と 細胞を検出診断するために使用することかてきる。 あるいは 抗 に検出可能な檸識を結合させて腫瘍細胞を検出診断するために使 きる。 Also, in the present invention, an anti-TSTA 3 antibody such as a recombinant atenovirus particle may be used for cancer therapy. Generally, it may be used together with a pharmaceutically acceptable carrier. As such a carrier, it is already aquatic Ordinarily, 10 3 to 10 15 viruses at a time per adult is preferable? Disease state 細胞 w cells Depending on the nature of the tissue, the dose may be once to several times a day. One to several injections over several months may be given intermittently over a long period of time as one senot. Also, the viral hectare hectare nucleic acid molecule used in the present invention can be used for diagnosis of the state of specific cells and tissues. For example, a virus-hector particle obtained by incorporating a marker gene that can be detected into a virus into a suitable host cell can be used to detect and diagnose anti-TSTA3 antibodies and cells. The Alternatively, it can be used to detect and diagnose tumor cells by combining anti-detectable knowledge.
5 かんの診断剤及び診断方法 5 Diagnostic agents and diagnostic methods for cans
本発明はまた かんの診断剤を提供する。 1つの好ましい態様 明のかんの診断剤は （a) TSTA 3タンハク質に対する抗体 S T A 3遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンンェン卜な ーノョン条件下てハイフリタイス可能な塩基配列からなるホリヌ 有する  The present invention also provides a diagnostic agent. One preferred embodiment A clear can diagnostic agent has (a) an antibody against TSTA 3 protein S T A 3 gene or a part of its base sequence having a holinus consisting of a base sequence that can be hyfitized under stringent conditions.
5 1 抗 TSTA 3抗体を用いる診断剤及ひ診断方法 5 1 Diagnostic agents and diagnostic methods using anti-TSTA 3 antibodies
T S T A 3夕ンハク質に対する抗体は TSTA 3タンハク質 識することかてきるのて 被検液中の TSTA 3タンハク質を定 STA3抗体との結合か検出あよひ/または定量される。 The antibody against TSTA 3 protein can be identified. TSTA 3 protein is determined in the test solution. Bind or detect STA3 antibody binding or / or quantified.
本明細書中 「被験者由来の生体試料」 は 被験者由来の組 体液 （例えは 血液 （全血 血漿 血清等を含む） 尿 リン 精液等） を含む。 また 「被験者」 は 通常 かん検診を受け ことか望まれるヒト被験体てあり かんに罹害しているか ま と疑われるヒト被験体等か含まれる。 このようなかんの例とし 胃かん 肺かん 乳かん 前立腺かん 食道かん 肝臓かん ん 腎かん 膀胱かん 子宮かん （例 子宮頸かん 子宮体か 甲状腺かん 膝臓かん 卵巣かん 腫瘍 血液腫瘍なとか含ま け 大腸かんか好ましい。  In this specification, “subject-derived biological sample” includes a subject-derived fluid (eg, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.) urine, phosphorus, semen, etc.). “Subjects” also include human subjects who are usually or are suspected of undergoing canine screening, and who are suspected of being affected. Examples of such cans: stomach, lung, milk, prostate, esophageal, liver, kidney, bladder, uterus (eg, cervical, uterine or thyroid, knee, ovary, tumor, blood tumor, etc. It is preferable.
上記のような被験者由来の生体試枓における T S TA3の発 の免疫冽定は かん （例えは 大腸かん） を有すると疑われるか を有する被験体から採取した生体試 を 特異 W抗原一抗体結合 件下て抗 TSTA 3抗体と接触させ 次いて 抗体による免疫特 定することを包含する このような抗体の結合を使用して TS 質の存在およひ Zまたは増大した発現か検出される。 この場合 A 3タンハク質発現の検出か疾病状態の指椁となる。 必要に応し の TSTA 3タンハク質のレヘルを かんを有しない健常者のレ もよい。  A biological test taken from a subject who is suspected of having an immunoassay for TS TA3 in a biological test derived from a subject as described above (for example, a large intestine). Subsequent contact with an anti-TSTA 3 antibody, followed by immunization with the antibody, such antibody binding is used to detect the presence and / or increased expression of TS quality. In this case, detection of A3 protein expression or disease state indication. A healthy person who does not have a canister of TSTA 3 tandem reher if necessary.
上記免疫測定法の 1つの態様ては 例えは 血清試料なとの生 中に存在する全部のタンハク質を固定する目的て ニトロセルロ 支持体または担体と接触させる。 次いて この支持体を緩衝液て 検出可能に檸識した抗 TSTA3抗体により処理する。 次いて h e En z yme L i n k e d I mm un o s o r b e y ) (EL I SA) 1978 D i a gn o s t i c Ho 2 1〜7， M i c r ob i o l og i c a l As s o c i a r t e r 1 y P u b l i c a t i o n Wa l k e r s v i Vo l 1 e r A による J C l i n P a t ho l 3 1 0 1978 Bu t l e r J E による Me t h En z 3 482〜 523 1981] 抗体に結合する酵素を 例 により 可視手段による蛍光測定により検出することかてきる れるような方法て 適当な基質 好ましくは色素原性基質と反 検出可能な檸識を付けるために使用することかてきる酵素は およひアルカリ性ホスファターセを包含するか これらに限定さ 出はまた 酵素に対する色素原性基質を用いる比色法により達 る。 One embodiment of the immunoassay is contacted with a nitrocellulosic support or carrier for the purpose of immobilizing all proteins present in the life such as serum samples. The support is then treated with a buffered anti-TSTA3 antibody that is detectable. Next he En z yme L inked I mm un osorbey) (EL I SA) 1978 D ia gn ostic Ho 2 1-7, Micr ob iol og ical As sociarter 1 y P ublication Wa lkersvi Vo l 1 er A by JC lin P at ho l 3 1 0 1978 by Butler JE Me th En z 3 482-523 1981] An appropriate substrate is preferred by a method such as detecting the enzyme binding to the antibody by fluorescence measurement by visual means. Is the enzyme that can be used to provide anti-detectable insights with chromogenic substrates and includes alkaline phosphatases? Limited to these are also colorimetric using chromogenic substrates for enzymes Reached by law.
その他の本発明にあいて使用し得る方法としては ランオイム I A) サントイノチ免疫測定法 ィムノメトリ ノク法 ネフロ 免疫冽定法 （F I A) 時間分解蛍光免疫測定法 (TRF I A) 法 （E I A) 発光免疫測定法 （L I A) 電気化学発光免疫測 A) ラテノクス凝集法 免疫沈降ァノセィ 沈降素反応法 ケ 応法 免疫拡散検定法 凝集素検定法 補体結合検定法 免疫放 蛍光免疫検定法 およひフロティン A免疫検定法からなる群から 測定法なとか挙けられる （WO 00/ 14227号公報第 39頁 2頁第 8行 EP 1 1 1 1047 A2号公報段落 [ 01 15 ] 第 〜第 20頁第 47行なと参^) なお 本発明の抗 TSTA3抗体は i n V 1 V oての診 てきる。 ここて使用し得る抗体調製物の調製およひ使用方法は られている。 例えは 抗体—キレート剤について Nu c l o 1 1 9 9 0 1 7 247— 2 54に記載されている。 ま メーノンクて用いる標識としての常磁 14イオンを有する抗体につ Ma g n e t i c R e s o n a n c e i n Me d i c i 2 2 33 9 - 342に記載されている Other methods that can be used in the present invention are: Ranome IA) Santoinochi immunoassay Imunometry Nok Nephro immunoassay (FIA) Time-resolved fluorescence immunoassay (TRF IA) (EIA) Luminescent immunoassay (LIA) ) Electrochemiluminescence immunoassay A) Latenox agglutination method Immunoprecipitation annotase Precipitin reaction method K reaction method Immunodiffusion assay Agglutinin assay Complement binding assay Immunorelease Fluorescence immunoassay and Flotin A immunoassay From the group, the measurement method is mentioned (WO 00/14227, page 39, page 2, line 8, EP 1 1 1 1047 A2, paragraph [01 15], page 20 to line 47, line 47) The anti-TSTA3 antibody of the present invention is diagnosed in V 1 V o. Methods for preparing and using antibody preparations that can be used are described. For example, antibody-chelating agents are described in Nuclo 1 1 9 9 0 1 7 247-2 54. In addition, an antibody having a paramagnetic 14 ion as a label used as a Menonique is described in Ma gnetic Resonance in Me dici 2 2 33 9-342
5 2 ホリヌクレオチド （例えば DNA) プローブを用い 断方法 5 2 Cleavage method using a polynucleotide (eg DNA) probe
本発明の診断方法においては T S T A 3遺伝子の塩基配列に れるフローフ又はフライマーを用いることかてきる。 具体的には 断方法は 例えは （a) 被験者由来の生体試料と TSTA3 の断片の塩基配列にストリンノエン卜なハイフリ夕イセーンョン リタイス可能な塩基配列からなるホリヌクレオチ卜 （フローフ） 工程 およひ （b) 前記試 W中ての前記ホリヌクレオチトと T またはその断片とのハイフリ夕イセ一ノヨンを検出およひ また を包含する。  In the diagnostic method of the present invention, a flow or flyer having the base sequence of the T S T A 3 gene can be used. Specifically, for example, (a) a biological sample derived from a subject and a base sequence of a TSTA3 fragment, a stringentene-like high-rise loop, and a reflowable base sequence (flow) process and (b) ) Detecting and / or detecting the presence of the polynucleotide and T or a fragment thereof in the test W.
上記本発明の方法ては 被験者由来の生体試 中の T S T A 3 (またはその遺伝子断片） を 上記フローフを使用して検出おょ する フローフとして用いる塩基配列の長さは 例えは 1 2塩 基以上 1 8塩基以上 2 1塩基以上 24塩基以上 2 7塩基 以上 またはさらに長い長さのホリヌクレオチト断片てあり得る 98号 EP— A0200362 米国特許第 2， 915 08According to the method of the present invention, TSTA 3 (or a gene fragment thereof) in a biological test derived from a subject is detected using the above-mentioned flow. The length of the base sequence used as the flow is, for example, 1 2 or more bases 1 8 bases or more 2 1 bases or more 24 bases or more 2 7 bases or more No. 98 EP— A0200362 US Pat. No. 2,915 08
0063879 EP— A 0173251 、 E P— A 01280 ている 0063879 EP— A 0173251, E P— A 01280
本発明の診断方法においては T S T A 3遺伝子に対する特 チトフローフまたはフライマーを用いて 公知の手法を用いて たは定量することかてきる。 そのような公知の手法として 例え フリ夕イセーシヨン ノーサンハイフリ夕イセーノヨン RT— R— S S CP法 （Ge n om i c s 第 5卷 874〜 87 年) ) P r o c e e d i ng s o f t he Na t i on e my o f S c i e n c e s o f t he Un i t e d o f Ame r i c a 第 86卷 2766〜 2770頁 （ 19 In the diagnostic method of the present invention, the quantification can be carried out using a known technique using a cytochrome or flymer for the T S T A 3 gene. As such a known method, for example, Furi Seisenyon Nosan Haifuri Yusei Noyon RT— R— SS CP method (Genomics 5th 874-87)) Proceeding ng soft he Na ti on e my of Science he Un itedof Ame rica 86 ~ 2766〜 2770 (19
1 SH法 DNAチノフあるいはアレイ CGH (Comp a r a nomi c Hyb r i d i z a t i on) 法なとを用いること 的な検出は 定量 RT— PC Rによって実施可能てある。 1 SH method Detection using DNA chinoff or array CGH (Comparanomic Hydrangeon) method can be performed by quantitative RT-PCR.
アレイ CGH法は 染色体 CGH法 （Ka 1 1 1 o n 1 em 1 a 1 (1992) S c i e n c e 258 818 - 821 法て スライト上に染色体領域を力ハーするケノム DNA断片 （ YACなと） を高密度にスホノトした DNAチノフを用いて 別 したかん由来 DNAと正常 DNAを スライト上のケノム DNA 時にハイフリ夕イセーノヨンを行い その結合状態を検出するこ における DNAコヒー数異常を高解像度に検出する方法てある （ D e t a 1 ( 1 998) Na t Ge n e t 20 The array CGH method is a chromosomal CGH method (Ka 1 1 1 on 1 em 1 a 1 (1992) Science 258 818-821 method). There is a method to detect high-resolution DNA coherency in high resolution by detecting the binding state of the DNA derived from normal DNA and normal DNA using Shonoto's DNA chinoff and performing the high-speed detection when the chemome DNA on the slite. eta 1 (1 998) Na t Ge net 20
1 ) o RT— PC Rによって比較することもてきる。 1) o RT—compared by PC R.
上記のような手法によって檸的配列 （DNA mRNAなと） TSTA 3遺伝子の発現過多か確認された場合は 例えは TS 現に起因する疾崈 （例えは かん （例 大腸かん） ） てある可 いは将来罹害する可能 ftか高いと診断することかてきる  If it is confirmed that the TSTA 3 gene is overexpressed by the above-described method (eg, DNA mRNA), it is possible that there is a disease caused by TS (eg, cane (eg, large intestine)) It is possible to diagnose that it is possible to be affected in the future.
5 3 質量分析装置を用いる診断方法 5 3 Diagnosis method using mass spectrometer
本発明の診断方法の別の実施形態ては 被検試料中の椁的タ の断片の存在を 質量分析装置 （MS) を用いて同定すること ち 質量分析装置を用いることによって 檸的タンハク質また ノ酸配列の決定を行うことかてき 被験者由来の生体試+斗中に T ク質か存在するか否かを判定することかてきる 質量分析法は ンハク質やへフチトのような試抖をイオン化し 得られた質量 Z に従って分離し その強度を測定することにより 試 +4の質量を ある その質量分析の結果から タンハク質やへフチ卜のアミノ る個々のアミノ酸を同定することかてきる。  In another embodiment of the diagnostic method of the present invention, the presence of a fragment of a target protein in a test sample is identified using a mass spectrometer (MS). The determination of the non-acid sequence can be used to determine whether or not the T protein exists in the biological test derived from the subject + the mass. By separating the ionized mass according to the obtained mass Z and measuring its intensity, the mass of the trial +4 can be identified from the results of the mass analysis to identify the individual amino acids of the protein and heptagon.
イオン化には マトリクスアシステノ トレーサーテソーフシ (MALD I) エレクト口スフレ一イオン化法 （E S I ) 気 I) 電界脱離 （FD) 法なと種々の方法か使用され得る イオ オン化法と相性のよいイオン分離法か用いられ 例えは MAL 飛行時間型 （t ime o f f l i gh t T〇F) 質量分析 合には 四重極型 （QMS) イオントラノフ型 磁場型なとの れそれ用いられる 質量分析装置は タンテムて用いられること 3タンハク質またはその断片をかんマーカーとして検出およひ Z ためのキノトを提供する。 さらに T S T A 3遺伝子またはその にストリンノエントなハイフリタイセーノョン条件下てハイフリ 基配列を含有する 被験者由来の生体試^中の T S T A 3遺伝子 をかんマーカーとして検出およひ Zまたは定量するためのキノト これらのキノ卜は 上述の免疫学的手法またはハイフリ夕イセ一 り かんマーカーを検出するために用いられる。 このようなかん は 大腸かん 胃かん 肺かん 乳かん 前立腺かん 食道かん 道かん 脾臓かん 腎かん 膀胱かん 子宮かん （例 子宮頸 ん） 精巣かん 甲状腺かん 膝臓かん 卯巣かん 脳腫瘍 血 まれるか とりわけ、 大腸かんか好ましい Ionization can be used in various ways, such as Matrix Astheno Tracer Teethofushi (MALD I) Elect Mouth Souffle Ionization (ESI) Qi) Field Desorption (FD) Ion Ionization For example, MAL time-of-flight (t ime offli gh t TF) mass spectrometry, quadrupole type (QMS), ion tranov type, magnetic field type, and mass spectrometer used for tandem Used Provide quinoto for detection and Z as a marker of 3 protein or its fragments. Furthermore, the TSTA 3 gene or the TSTA 3 gene in a biological test derived from a subject containing a hyfuri group sequence under stringent-enhanced hyphenation conditions is detected and Z or quantified as a marker. Kinoto These mushrooms are used to detect the markers described above for immunological techniques or hyphenation. Such as large intestine, stomach, lung, milk, prostate, esophageal, spleen, kidney, bladder, uterine (eg, cervix), testicular, thyroid, knee, cervical, brain tumor, blood, Large intestine is preferred
本明細書中 「かんマーカー」 とは 被験者の体液 （例えは ハ液 唾液 汗 精液等） または細胞もしくは祖織中における していないか あるいはかん細胞または祖織において選択的に発 る分子のことをいい 被験者の体液または細胞もしくは組織中に の存在かかんの存在を示すかまたは示唆するものをいう  As used herein, “can marker” refers to a molecule that is not present in a subject's body fluid (eg, saliva, saliva, sweat, semen, etc.) Good Indicates or indicates the presence of presence in the body fluid or cells or tissues of the subject
上記第一の態様のキノトは 被験者からの体液試料中の T S T T A 3タンハク質およひその部分へフチトを含む） を検出およひ る成分を含有する 例えは T S T A 3夕ンハク質かE L I S A または定量される場合 このような成分は 例えは 組織切片 使用され得る このような抗体は放射能 蛍光 比色 または酵 れていてもよい。 本発明のキノトは 標識された二次抗体を含有 能な塩基配列等の他に 容器おょひラヘルを含んていてもよい。 容器に伴うラヘルには 薬剤か大腸かんママカーの検出に使用さ れていてもよい。 また 他のアイテム 例えは 使用説明書等 いてもよい。 In the first embodiment, the quinoto contains components that detect and detect TSTTA 3 protein in body fluid samples from subjects and its parts, for example, TSTA 3 protein or ELISA or quantification. Such components can be used, for example, tissue sections. Such antibodies may be radiofluorimetric colorimetric or fermented. The quinoto of the present invention contains a labeled secondary antibody In addition to a functional base sequence, etc., it may contain a container. The laher associated with the container may be used to detect drugs or large intestine cankers. Other items such as instructions for use may also be provided.
以下 本発明を実施例を用いてより具体的に説明するか 本 れらの実施例によって限定されない 実施例  Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. Examples are not limited to these examples.
実施例 1 アレイ C GH法による大腸かん特異的増幅遺伝子の同 本実施例ては 大腸かん特異的な遺伝子増幅領域を特定する 検体 200症例のサンフル調製あよひアレイ CGH法に基つく検 その結果 大腸かん検体において高頻度に増幅か起きている Bての遺伝子情報 （NC B I h t t p //www n c b i h go vZ) を利用し 精査した結果 使用した BAC C l 1 -661A1 2に位置している TSTA 3 (T i s s u e c t r a n s p l an t a t i o n an t i g e n P 35 Ac c e s s i on No NM_00331 3) 遺伝子か大 いて高頻度て高値てあることを見出した （01 表 2) 01は 伝子の大腸かん患者 200検体ての増幅度に対する頻度を示すヒ る。 また 下記の表 2は TSTA 3遺伝子の大腸かん害者 20 度 （G/R値） およひ頻度を示す 平均値は GZR値か 1 2 平均値を示している。 Example 1 Array C GH method of colonic cannabis-specific amplified gene This example identifies colonic canal-specific gene amplification region Sample 200 samples of sampled sample Ayohi Array CGH-based test Results BSTA C l 1 -661A1 used TSTA 3 located in BAC C l 1 -661A1 2 Using gene information (NC BI http // www ncbih go vZ) (T issuectranspl antation an tigen P 35 Accession on No NM_00331 3) It was found that the gene was large and frequently high (01 Table 2). Indicates frequency. In addition, Table 2 below shows the mean value of 20 degrees (G / R value) and frequency of TSTA 3 gene colonic persecutor and GZR value or 1 2 average value.
表 2に示されるように TSTA3遺伝子は 200検体の大 (表 2) As shown in Table 2, TSTA3 gene is a large sample of 200 samples. (Table 2)
Figure imgf000041_0001
実施例 2 大腸由来培養細胞株ての遺伝子増幅度の検証
Figure imgf000041_0001
Example 2 Verification of gene amplification in a colon cell culture
本実施例ては 大腸かん害者において高頻度て高値な遺伝子 腸かん由来培養細胞株ての増幅度を検証した。  In the present example, the amplification degree of a gene cell line derived from a high-frequency gene intestinal canal was verified in those who suffered from large intestine.
<サンフル調製 >  <Sanflu preparation>
培養細胞株は 大腸かん由来の細胞株てある RKOおよひ RK た。 培養細胞より B 1 o o d & C e l l Cu l t u r e (Q I AGEN) を使用して キノト 付のフロトコールに従い を抽出した  The cultured cell lines were RKO and RK, which are cell lines derived from the large intestine. Extracted from cultured cells using B 1 o d & C e l l Cu l t ure (Q I AGEN) according to Frotocol with Kinoto
<アレイ CGH>  <Array CGH>
遺伝子領域の増幅を確認するために アレイ CGHを実施した 実施例 1と同様に実施した。  This was carried out in the same manner as in Example 1 in which array CGH was performed to confirm amplification of the gene region.
結果  Result
表 3に TSTA 3遺伝子の大腸かん由来の細胞株ての増幅度 示した。 示されるように 大腸かん由来細胞株においても BA RP 1 1 - 661 A 12に位置している T S T A 3遺伝子て増 ことを見出した。  Table 3 shows the degree of amplification of the TSTA 3 gene in cell lines derived from large intestine. As shown, it was found that the TSTA 3 gene located in BARP 1 1 -661 A 12 also increased in the colon canal cell line.
(表 3)  (Table 3)
ァレイ CGH 量的 PCRは SYBR Gr e e n RT-P CR Re a g p l i e d B i o s y s t ems) を使用して ^付のフロト 7500 Re a l -T i me PCR Sy s t em (Ap p o s y s t erns) を用いて実施した。 フライマーは 以下の PE RONに合成委託） 使用した。 AREA CGH Quantitative PCR was performed using SYBR Green RT-PCR Re-agplied Biosyst ems) and Froto 7500 Real-Time PCR System (Ap posyst erns). Framer used the following PE RON for synthesis).
フライマー配列  Framer array
5 ' 一 TGCTTACTCTTCCAGAC C ACCTTAG— 4) 結果 5 'One TGCTTACTCTTCCAGAC C ACCTTAG— 4) Results
表 4に TS TA 3遺伝子の大腸かん由来の細胞株ての増幅 対 B DNA (正常） との相対値を示している。 示されるように 胞株にあいても T S T A 3遺伝子領域に増幅か起きていること (表 4)  Table 4 shows the relative values of TS TA 3 gene amplification in large intestine-derived cell lines versus B DNA (normal). As shown, amplification is occurring in the T S T A 3 gene region even in cell lines (Table 4).
Figure imgf000042_0001
これらの結果により 大腸かん由来の細胞株 （RK〇， RKO も TSTA3遺伝子か増幅していることか確認された。 よって T S TA 3遺伝子の機能解析に使用可能な培養細胞か選択された <RNA l解析 >
Figure imgf000042_0001
Based on these results, it was confirmed that the cell lines derived from the large intestine (RK〇 and RKO were also amplified in the TSTA3 gene. Therefore, the cultured cells that can be used for the functional analysis of the TSTA3 gene were selected. <RNA analysis>
細胞株は ATCCより晴入し ^付のフロトコールに従い培 RNAは遺伝子内の特異的な 2 lme rを選択しその配列を標 Aを合成した （Q I AGENに合成委託）  The cell line was cleared from ATCC, and cultured according to the Frotocol marked with ^ The RNA selected a specific 2 lmer in the gene and synthesized its sequence A (commissioned to Q I AGEN)
(表 5)  (Table 5)
s 1 RNA配列  s 1 RNA sequence
Figure imgf000043_0001
s 1 RNAの RK〇細胞内への導入は L i p o f e c t am ( I n v i t r o g e n) を使用し 50 nMの s i RNAを ルに従い細胞に導入した s 1 RNAの RKOE 6細胞内への導 FECT (Q I AGEN) を使用し 1 00 ηλίの s l RNAを ールに従い細胞に導入した。 対昭には Ne g a t l v e C o n RNA (Q I AGEN) を使用した。 細胞に導入後 4日間 倒立 した
Figure imgf000043_0001
s 1 RNA was introduced into RK0 cells using L ipofect am (Invitrogen), and 50 nM siRNA was introduced into the cells according to the standard. s 1 RNA was introduced into RKOE 6 cells FECT (QI AGEN) Then, 100 ηλί of sl RNA was introduced into the cells according to the rules. Ne gatlve C on RNA (QI AGEN) was used for anti-Akira. Inverted for 4 days after introduction into cells
く定量的 RT— PC R解析〉  Quantitative RT—PC R analysis>
定量的 RT—PCR法を用いて s 1 RNAの効果を mRNA た s 1 RN A導入後 24時間の細胞から M i c r o— t o— t a 1 RNA P u r i f i c a t i o n S y s t em 、丄 l o s y s t ems) を使用して 付のフロトコールに従い a l— T ime PCR Sy s t em (App l i e d B i s) を用いて実施した。 フライマーは 以下の配列を合成し （ 成委託） 使用した。 Quantitative RT—PCR method was used to determine the effect of s 1 RNA from cells 24 hours after introduction of s 1 RN A Micro-to-ta 1 RNA Purification System, 丄 losyst ems) was performed using al-Time PCR System (Applied Bis) according to the Flotocol attached. Framer synthesized the following sequences (consignment) and used them.
フライマ一配列 号 9) 相対比を算出するための標準遺伝子には G l yc e r a l d e pho s pha t e de hyd r o ge n a s e (GAP D o 1 Re ag e n t s (App l i e d B i o s y s t e APDHの発現量を求め 相対比を算出した。  (Frimer sequence No. 9) The standard gene for calculating the relative ratio is G l y ceralde pho s pha te de hyd ro ge nase (GAP Do 1 Re ag ents (Applied B iosyste APDH) The ratio was calculated.
<生細胞数の測定 >  <Measurement of the number of living cells>
s 1 RNA導入後の生細胞数を A 1 ma r B l u e (B e) を用いて 付のフロトコールに従い Wa l l ac 14 l l abe l/Lumi n e s c en c e Coun t e r A k i nE lme r) により測定した。 結果  The number of viable cells after introduction of s 1 RNA was measured using Wa ll ac 14 ll abe l / Lumi nes sc ce Coun ter A ki n l mel) using A 1 mar Blue (B e) according to the Flotocol attached. . Result
大腸かん由来の細胞株てある RKOおよひ RKOE 6を用いて 伝子の RNA 1解析を実施した。  RNA 1 analysis of genes was performed using RKO and RKOE 6, which are cell lines derived from the large intestine.
02 Aおよひ 02 Bにそれそれ RKO細胞およひ RKOE 6 3遺伝子の s i RNAを T r an s f e c t i o n後 4日目 TA3遺伝子の s l RNAを T r an s f e c t i o nして 24 回収し 定量的 RT— PCRを行った結果を示す。 内在性コント GAPDHの相対比を用いて NCに対する相対量を示した RNAレヘルての効果を定量的 RT— PCRて確認した結果 A共に顕著に発現量か減少していた （03八ぁょひ8) 02 A and 02 B respectively RKO cells and RKOE 6 3 gene siRNA 4 days after Tran sfection The results of quantitative RT-PCR of TA 3 gene sl RNA recovered by Tran sfection are shown. Quantitative RT-PCR confirmed the effect of RNA rehering, which showed a relative amount relative to NC using the relative ratio of endogenous control GAPDH. )
04 Aおよひ 04 Bには それそれ RKO細胞およひ RKO TA3遺伝子の s 1 RNAを T r an s f e c t i o n後 4日 て測定試薬により生細胞数を測定した結果を示す クラフは NC を示した。 示されるように 生細胞数の測定を行った結果 表現 a t i v e C o n t r o l (NC) と比較して顕著に細胞数 (04Aおよひ B) 。 TSTA3遺伝子の s i RNA2種 （a て t検定において有意 （p<0 0 1) てあつた。  04 A and 04 B show the results of measuring the number of viable cells with the measuring reagent for s 1 RNA of RKO cells and RKO TA3 gene 4 days after T ran sfection. . Results of measurement of viable cell count as shown Remarkable cell counts (04A and B) compared to the expression a ti V e C o n t r o l (NC). Two types of siRNA of TSTA3 gene (a and t test were significant (p <0 0 1).
よって RNA 1効果により TSTA 3遺伝子の発現か抑制さ 〇細胞およひ RKOE 6細胞の両方において 顕著にかん細胞の ることか見出された。 実施例 4 大腸由来正常細胞株を用いた RN A 1解析による機能 本実施例ては 大腸の正常組織由来の細胞株を用いて RNA 1 ことにより 檸的遺伝子の抑制効果かかん特異的てあることを検 <RNA i解析〉  Thus, it was found that the expression of TSTA 3 gene was suppressed by the RNA 1 effect. Example 4 Functions by RN A 1 analysis using normal cell lines derived from the large intestine In this example, RNA 1 is used in a cell line derived from the normal tissue of the large intestine to confirm that it is specific for the suppression effect of epilepsy genes <RNA i analysis>
細胞株は ATCCより購入した CCD 1 8 Coを使用する。 培 のフロトコールに従う 使用する s i RNAは 実施例 3の a 使用する。 s 1 RNAの細胞内への導入は L i p o f e c t a 実施例 3の記載方法と同様に実施する。 実施例 5 臓器特異 I生の評価 The cell line used is CCD 1 8 Co purchased from ATCC. Follow the cultivated Frotocol. Use the siRNA used in Example 3a. Introducing s 1 RNA into cells Carry out in the same way as described in Example 3. Example 5 Evaluation of organ-specific I life
TSTA3遺伝子か正常組織てとのような臓器特異的な発現か 当該技術分野て公知のノ一サンハイフリ夕イセーンヨン法により Whether the TSTA3 gene is an organ-specific expression such as a normal tissue or the like.
MTN Multiple Tissue Northern Blots (Clontech)を用いて ールに従い 983nt (NM_003313 47— 1012)の RNA Probeてハイ ヨンを実施した。 Using MTN Multiple Tissue Northern Blots (Clontech), a 983 nt (NM_003313 47-1012) RNA probe was hone according to the rules.
具体的には 正常な各臓器組織ての RNA レヘルの発現分布に 臓器（心臓 （Heart) M (Brain) 胎盤 （Placenta) 肺 (Liver) 骨格筋 （Skeletal Muscle) 腎臓 （Kidney) 膝臓 脾臓 （Spleen) 胸腺 （Thymus) 前立腺 （Prostate) 睾丸 （ (Ovary) 小腸 （Small Intestine) 結腸 （Colon) (Peripheral Blood Leukocyte) 胃 （Stomach) 甲状腺 （T (Spinal Cord) リンハ節 （Ly即 h Node) 気管 （Trachea) Gland) 骨髄 （Bone Marrow) )についてノーサンハイフリタイ より 解析した。 なお 前述の通り T S TA 3の遺伝 (http //www ncbi nlm nih gov) に Accession No NM— 003313 配列か mRNAとして登録されている 結果  Specifically, the expression distribution of RNA rehering in each normal organ tissue was determined by organ (Heart M (Brain) placenta (Placenta) lung (Liver) skeletal muscle (Skeletal Muscle) kidney (Kidney) knee spleen (Spleen) ) Thymus Prostate Prostate Testicular Intestine Colon Peripheral Blood Leukocyte Stomach Thyroid T (Spinal Cord) Lymph node Trachea ) Gland) Bone Marrow was analyzed by Northan High Fritai, Inc. As mentioned above, it was registered as Accession No NM-003313 sequence or mRNA in the inheritance of TS TA 3 (http // www ncbi nlm nih gov). Results
05は その結果を示す。 0に示されるように 精巣において ハントか認められ 顕著な発現か確認された。 また 他の全ての アレイ CGH法により 遺伝子増幅度 (G/R)か 1 1 以上てあっ 癌害者由来） を用いて TSTA3遺伝子か位置する BAC Clone DNA Probeてハイフリ夕イセーノヨンを実施した。 ¾ 05 shows the result. As shown in 0, a hunt was observed in the testis, confirming the remarkable expression. And all other Using the array CGH method, a gene amplification degree (G / R) of 11 or more and derived from a cancer victim) was used to perform a high-speed detection using the BAC Clone DNA Probe in which the TSTA3 gene was located. ¾
06は 各検体組織 (A〜： 0て観察したかん細胞の一部 (6 細胞 写真 （蛍光像） を示す。 示されるように かん細胞においてンク ト以上見出された アレイ CGH法により遺伝子増幅度か 1 2以 体において TSTA3 遺伝子領域か増幅していることか確認された テーシの初期から後期にわたり遺伝子増幅か起きていることか示 とは TSTA3遺伝子領域か かん冶療薬の分子標的としてた 法によるかん診断に応用てきることを示している。 実施例 7 質量分析による血中 T S T A 3夕ンハク質の検出  06 shows a part of the peritoneal cells (A ~: 0) (6 cell photograph (fluorescence image). As shown, more than a few points were found in the pericytes. The degree of gene amplification by the CGH method It is confirmed whether the TSTA3 gene region is amplified in the two or more. Example 7 Detection of blood TSTA 3 protein by mass spectrometry
1) 血液検体の前処理  1) Pretreatment of blood sample
大腸癌砉者の血清検体 10 L及ひ健常者血清検体 10 Lを 希 (10mM Tris HC1 ph 7 4Η50πιΜ NaCl) 500 L て希釈後 Prot SC フロテオームハーティンョニンクキノ ト （BECKMAN COULTER てアルフミン クロフリン等の血清中多量蛋白質を除去した。 得 濃度 lOmM となるようにンチオスレィトール （Wako 049-08972) 応を 60°Cて 30分間行った 反応終了後 終濃度 lOmMとなるよ 卜ァミト （SIGMA 144-48- 9) を加え アルキル化反応を室温て 3 態て行った。 反応終了後 反応液の 4 倍量の冷アセトン （Wako 2) Nano-HPLC直結質量分析装置による解析 Serum specimens from colorectal cancer patients 10 L and normal serum specimens 10 L diluted (10 mM Tris HC1 ph 7 4Η50πιΜ NaCl) 500 L and then diluted with Prot SC Furoteomartininkinoto A large amount of protein was removed from serum Serum threitol (Wako 049-08972) was reacted at 60 ° C for 30 minutes to obtain a final concentration of lOmM. 48-9) was added, and the alkylation reaction was carried out at room temperature in three states: After completion of the reaction, 4 times the amount of cold acetone (Wako) 2) Analysis using a Nano-HPLC direct mass spectrometer
へフチ卜断片 0 7 g 量を - Precolumn cartridge (C18 Pe 300A 300MDI i d x 5 腿 LC PACKINGS 163589)と直結させた PepMap 3 ΠΙ IOOA 75 DI i d x 150 mm LC PACKINGS 16032 た。 HPLC 装置は Ultimate Plus (LC PACKINGS)を用いた。 流 0 1%キ酸 (Wako 062-02901) 含有 2%ァセトニトリル (MERCK 128 酸含有 90%ァセトニトリルの濃度勾配か 0 57%/nunの直線クラ て解析を行った。 Nano-HPLC て分離した試料は PicoTip (New O 20-10-D-20) を通して直結したイオントラノフ型質量分析装置 た。 質量分析装置は HCT Plus(Bruker Daltonics)を用いた。 試 キヤヒラリー電圧 1500V ェントフレートオフセノト値 500V 12 L/inin トライカス温度 250°Cの条件て行った イオントラノ m/zの前後 2 Daの取り込みとし MRMモートての MS/MS解析を行 3) テ一夕解析  PepMap 3 ΠΙ IOOA 75 DI id x 150 mm LC PACKINGS 16032 was directly connected to a precolumn cartridge (C18 Pe 300A 300MDI id x 5 thigh LC PACKINGS 163589). As the HPLC apparatus, Ultimate Plus (LC PACKINGS) was used. Stream 0 2% acetonitrile (Wako 062-02901) containing 90% acetonitrile with MERCK 128 acid or 0 57% / nun linear gradient was analyzed. Ion-Tranoff-type mass spectrometer directly connected through PicoTip (New O 20-10-D-20) HCT Plus (Bruker Daltonics) was used as the mass spectrometer. MS / MS analysis using MRM mode with 2 Da before and after ion trano m / z performed under conditions of tricus temperature 250 ° C 3)
質量分析装置から得た全分析テ一夕は Data Analysis ソフト Daltonics) を介して出力した。 出力した全テ一夕中から檸的分 のみを抽出した 抽出したテ一夕の中から各分析時間における M 査し 檸的分子のフラクメントイオンに相当する質量を持つイオ を解析した。 結果  All analysis data obtained from the mass spectrometer was output via Data Analysis software (Daltonics). Only the target was extracted from all the output data. From the extracted data, the ions with the mass corresponding to the fragment ion of the target molecule were analyzed at each analysis time. Result
07 Aおよひ 07 Bは （A) 大腸かん崈者由来の血清 およ か决定され これは TSTA3タンハク質のアミノ酸配列 （ 10位〜 18位のアミノ酸配列に相当する。 よって 08Aに ノ酸配列 10位〜 21位の標的へフヂトフラクメント （配列番 れた。 このような部分配列に対応するイオンヒークは健常者血 は認められなかった （08Cを参^) 。 よって この標的分子 TA 3タンハク質） は癌特異的に血中存在量か増加している可 れた。 実施例 8 子宮頸かん由来株 HeLa細胞株ての RNAi効果の評価 大腸かん細胞株ては TSTA 3遺伝子のノノクタウンにより か認められたか 子宮頸かん細胞株においてとのような効果か 前述の RNAi解析法により 評価した。 07 A and 07 B are: (A) Serum and This is the amino acid sequence of the TSTA3 protein (corresponding to the amino acid sequence of positions 10 to 18. Therefore, the fractofragment (SEQ ID NO. In normal hematopoiesis, no ion hekes were found in the corresponding partial sequence (see 08C), so this target molecule TA 3 protein may have increased in cancer-specific blood abundance. Example 8 Evaluation of RNAi effect in uterine cervix-derived strain HeLa cell line Was the colon cane cell line recognized by TNO3 gene Noctown? It was evaluated by.
子宮頸かん由来細胞の HeLa細胞株を用いて 前出の 1種の Using the HeLa cell line of cervical canine-derived cells,
RNAi 解析を実施した。 s 1 RNAの細胞内への導入は 〇 1 i mi ne ( I n v ι t r o g e n) を使用し 100 nMの s のフロ卜コールに従い細胞に導入した。 対昭には Ne ga t l v o 1 s i RNA (Q I AGEN) を使用した。 ロ果 RNAi analysis was performed. The introduction of s1 RNA into the cells was carried out by using o 1 imine (Inv trologen) and following the flow of 100 nM s. In contrast, Nega tlv o 1 si RNA (Q I AGEN) was used. Fruit
時系列に従い 顕微鏡下て微分干涉像を撮影し その動態を詳 HeLa細胞に siRNA (a c)をトランスフエクノヨン後 1 3 の微分干涉像を観察した。 その結果を 9に示す。 NC は Ne siRNA(Qiagen社製）を使用した。 NCと比較して フレヒンクを起 産業上の利用可能 ft According to the time series, differential drought images were photographed under a microscope, and their dynamics were examined. After differential transfer of siRNA (ac) to HeLa cells, 1 3 differential drought images were observed. The results are shown in 9. NC used Ne siRNA (Qiagen). Compared to NC. Industrial available ft
本発明は かんの治療剤 診断剤 診断方法 治療方法 な するキノトなとを提供する。 したかって 本発明は かんの診 療等の分野において有用てある。  The present invention provides a therapeutic agent for cans, a diagnostic agent, a diagnostic method and a therapeutic method. Therefore, the present invention is useful in the fields of can diagnosis and the like.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1 TSTA3遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有す 2 前記 T STA3遺伝子の発現阻害物質か 1 Contains a TSTA3 gene expression inhibitor as an active ingredient 2 Is it a TSTA3 gene expression inhibitor?
(a) TSTA3遺伝子の発現を RNA 1効果により阻害す  (a) Inhibits TSTA3 gene expression by RNA 1 effect
( b ) TSTA3遺伝子の転写産物またはその一部に対する およひ (b) Transcription of TSTA3 gene transcript or part thereof
( c ) TSTA3遺伝子の転写産物を特異的に切断するリホ る核酸  (c) A nucleic acid that specifically cleaves the transcript of the TSTA3 gene
からなる群から選択される物質を含む 請求項 1に記載のかん 3 T S T A 3タンハク質の活 I生阻害物質を有効成分として含 4 前記 T S T A 3夕ン八ク質の活性阻害物質か The substance according to claim 1 comprising a substance selected from the group consisting of: 3 T S T A 3
該 T S T A 3夕ンハク質に対する抗体  Antibodies against the T S T A 3 protein
を含む 請求項 3に記載のかん治療剤。 The agent for treatment of epilepsy according to claim 3.
5 前記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある 請求項 1 記載のかん冶療剤  5. The canister according to claim 1, wherein the canister is a large intestine or a cervix.
6 TSTA 3遺伝子の発現阻害物質をスクリーニングする方 (a) TSTA 3遺伝子を発現する細胞に 被検化合物を接触 (b) 該 TSTA 3遺伝子の発現レヘルを冽定する工程 あよ (6) Screening for TSTA 3 gene expression inhibitor (a) Contacting test compound with cells expressing TSTA 3 gene (b) Step of determining expression level of TSTA 3 gene
(c) 被検化合物を接触させない場合と比較して 該発現レ 化合物を選択する工程を包含する スクリーニンク方法。 (c) A screening method comprising the step of selecting the expression-reduced compound as compared with the case where the test compound is not contacted.
7 TSTA 3タンハク質の活性阻害物質をスクリ一ニンクする 方法 7 Screening of TSTA 3 protein inhibitors Method
9 T S T A 3夕ンハク質に対する抗体。  Antibody against 9 T S T A 3 protein.
1 0 請 *項 9に記載の抗体を含有するかん治療剤。  1 0 contract * Therapeutic agent comprising the antibody according to item 9.
1 1 放射性同位元素 治療タンハク質 低分子の薬剤 また 持したヘクターをさらに含有する 請求項 1 0に記載のかん治療 1 1 Radioisotope Therapeutic Tancaku A low-molecular-weight drug or a further hectare
1 2 前記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある 請求項 1 記載のかん治療剤 1 2. The agent for treating epilepsy according to claim 1, wherein the epilepsy is an intestine or a cervix.
1 3 請求項 9に記載の抗体を含有するかん診断剤。  1 3 A can diagnostic agent comprising the antibody according to claim 9.
1 4 T S T A 3遺伝子またはその一部の塩基配列にストリン リタイセーンョン条件下てハイフリ夕イス可能な塩基配列を含 1 5 前記かんか大腸かんてある 請求項 1 3または 1 4に記載 1 6 請 *項 9に記載の抗体を含有するかん診断用キノ卜  1 4 The TSTA 3 gene or a part of the base sequence includes a nucleotide sequence that can be hyphenated under string retirement conditions. 1 5 Kino mushroom for can diagnosis comprising the antibody according to 9
1 7 T S T A 3遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンノ リタイセーノョン条件下てハイフリ夕イス可能な塩基配列からな チトを含有するかん診断用キノト。  1 7 T S T A 3 gene or a part of its base sequence contains a cytochrome from a base sequence that can be hyphenated under stringent reiteration conditions.
1 8 前記かんか大腸かんてある 請 *項 1 6または 1 7に記載 ノ 卜。  1 8 The above-mentioned canal or large intestine.
1 9 被験者由来の生体試抖中の T S T A 3夕ンハク質または T をかんマーカーとして検出おょひ または定量する方法。  1 9 A method to detect or quantify T S T A 3 protein or T as a marker in a biological test derived from a subject.
2 0 前記生体試 ^か 全血 血清 または血漿てある 請求項 法。  20. The method according to claim 1, wherein the biological test is whole blood serum or plasma.
2 1 質量分析装置を用いて T S T A 3タンハク質を検出およ する 請求項 1 9または 2 0に記載の方法。 を包含する 請 *項 22に記載の方法。 21. The method according to claim 19 or 20, wherein the TSTA 3 protein is detected using a mass spectrometer. The method according to item 22 above.
24 (a) 被験者由来の生体試^と TSTA 3遺伝子また 配列にストリンノエン卜なハイフリ夕イセーノョン条件下てハイ な塩基配列からなるホリヌクレオチトとを接触させる工程 およ 24 (a) A step of contacting a biological test ^ derived from a subject with a holin nucleotide having a high nucleotide sequence under high-risk conditions under a stringent-enzymatic TSTA 3 gene or sequence.
(b) 前記試枓中ての前記ホリヌクレオチトと TSTA3 断片とのハイフリ夕イセーンョンを検出およひノまたは定量する を包含する 請 *項 19または 20に記載の方法。 (b) The method according to claim 19 or 20, comprising: detecting and determining or quantifying the hyphenation activity between the horinucleocyto and the TSTA3 fragment during the test.
25 かんの診断に用いるための請 *項 1 9〜 24のいずれかに 26 前記かんか 大腸かんてある 請 *項 25に記載の方法。 27 配列番号 5 配列番号 6 配列番号 7 または配列番号 8 する ホリヌクレオチ卜  25. A contract for use in diagnosis of cans * Item 1 to any one of 24 to 24 26. 27 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8
28 TSTA 3遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有 あって 配列番号 5 配列番号 6 配列番号 7 または配列番 有するホリヌクレオチトを含有する かん治療剤。  28 A therapeutic agent containing a TSTA 3 gene expression inhibitor as an active ingredient and comprising folinucleotide having SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO:
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