WO2007037555A1 - Therapeutic or diagnostic application of dusp15 gene - Google Patents
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- WO2007037555A1 WO2007037555A1 PCT/JP2006/320043 JP2006320043W WO2007037555A1 WO 2007037555 A1 WO2007037555 A1 WO 2007037555A1 JP 2006320043 W JP2006320043 W JP 2006320043W WO 2007037555 A1 WO2007037555 A1 WO 2007037555A1
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Definitions
- the present invention relates to the gene 15 gene specifically amplified in cannabis and its therapeutic or diagnostic use.
- non-small cell pulmonary canal GFR epidermal growth factor receptor
- tyrosine kinase inhibitor generic name: Kehuitinif
- WO 9 6 Z 3 3 9 8 0 tyrosine kinase inhibitor
- the present inventors have found that there is a U S P 15 gene that has been intensively studied (especially the large intestine) and is frequently amplified.
- the present inventors have been able to suppress the growth of cancer cells by inhibiting the expression of D US P 15 in cancer cell lines, particularly cervical cancellous cell lines, and have completed the present invention. That is, the present invention provides a screening method for a screening agent, a quinotocan for diagnosis of a candidate substance having an inhibitory action on a therapeutic agent.
- a substance that inhibits the expression of DU SP 15 gene as an active ingredient (c) Te to DU SP 15 gene or a part thereof (d) DU SP 15 gene variant acting in a tiff manner on DU SP 15 gene or part thereof
- a therapeutic agent that effectively comprises a DU S P 15 protein inhibitory substance comprising a substance selected from the group consisting of:
- a therapeutic agent for epilepsy comprising the antibody according to (9) above.
- Radioisotope Therapeutic protein A low-molecular-weight drug The above-mentioned (10 therapeutic agent further comprising a hector carrying a gene.
- a can diagnosis agent comprising the antibody according to (9) above.
- DU SP 15 gene expression inhibitor is an active ingredient SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10
- a canine therapeutic agent containing a chito having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 According to the present invention, a novel drug useful for the treatment of cans (eg, colon cane) If it is a quinoto and method, a method of screening a candidate compound is provided.
- 01 is a histogram showing the frequency of the DU S P 15 gene with respect to the degree of amplification of two genes derived from colonic epilepsy.
- 02 is an optical micrograph (phase contrast image) showing the results when s 1 RNA of the large intestine cane cell line Caco 2 and RKO E 65 gene is transfected.
- 03 is a graph showing the results of quantitative evaluation of the RNA 1 effect when DU S P 15 residue A was transfected into the large intestinal cane cell line C a c o 2.
- Figure 7 is a photograph showing the results of a no-sense experiment performed using various normal organ tissues.
- 09 A and 09 B are the krafts of sera derived from (A) and (B) sera from healthy subjects analyzed by mass spectrometry.
- 01 1 is a graph showing the results of verifying the RNA i effect when D US P 1 RNA was transfected into the cervical cancer cell line HeLa cell line.
- 01 2 is an optical micrograph showing the results of detailed observation of the experiment of 01 1 according to the time series under a microscope (differential varieties, best mode for carrying out the invention). Specimen amplification was performed using specimens, and the number of genes specific to the large intestine was increased 15% (Dualspecificitypnosplike 1 5) of the regions where amplification occurred frequently in the specimen It was found that the sample was. Therefore, it is called dual specificity phosphatase (Dualsptyphosphatase (DSP)). Frotin phosphatase (P roteinphose) is divided into serine threonine specific phosphatase (P and) and thyronphosphatase (PTP) containing nostin residues. NK & N eel ⁇ G (1 9 9 6) C e 1 1 8
- P T P is P T 1 B (C ha r b o n n e t a 1 (1 9 8 9) P r C N at l A c a d
- DSP MAP kinasephose (MK P), which is dephosphorylated and inactivated from erogen activated protein Erk J nkp 3 8 (S axena, M & n T (2 0 0 0) Semin I mmu nol 1 2 9 6 A lonso A eta 1 (2 0 0 3) r Genet 5 3 3 3— 3 5 8).
- MK P MAP kinasephose
- MKP kinase targeting mo ti roof.
- VH 1 derived from vaccinia virus (V accinis) or DSP (Guan KL (1 9 9 1) N ature 3 5 0, 3 5 9-3 6 2) ⁇ DU SP 3 (VHR) (I shibashi T
- DU S P 1 5 (VH Y) is characterized by testis in normal anorexia. Detailed analysis shows that it is expressed in spermatocytes. In addition, it is localized to the membrane at the acid or binding site (clean residue) or at the N-terminus and is localized in the cell. Not directly related to DU S P 15
- the present inventors can suppress the expression of the DU S P 15 gene by suppressing the expression of the DU S P 15 gene by suppressing the expression of the DU S P 15 gene by inhibiting RNA l. It is also possible to make a diagnosis of can by measuring DU S P 15, which will be described in detail below.
- the present invention provides (1) a cannula therapeutic agent containing DU SP 15 gene expression inhibitor and (2) a cane therapeutic agent containing a DU SP 15 tft inhibitor as an active ingredient.
- Middle “DU SP 1 5 gene” means that it means a human DU element (SEQ ID NO: 1) consisting of 1 3 8 3 bases registered as Accession No 0 6 1 1 in NC Chitote (A lonso A
- the “DU SP 15 gene” to be used in the middle and the high-rise chain are known methods or examples such as molecular cloning (Molecullng T hird E dition JS a mb ra 1 C old S pr ing Harbor L as 2 0 0 1) According to the method described in the above or according to the instruction manual attached when using a commercially available life rally.
- stringent conditions can be any of moderate conditions and conditions can be selected.“ Low stringent conditions are 5 XSSC 5 X Tenhard solution 0 5% SDS murmite 3 The condition is 2 ° C. Also, “medium string is 5 XSSC 5 X Tenhard ⁇ liquid 0 5 0% formamide ⁇ 4 2 ° C.“ High string condition ”is 5 XSSC 5 X Tenhard solution 0
- inhibitor of gene expression refers to a gene that inhibits any one of a series of events (including transcription (mRNA generation) quality generation) from the gene. Inhibits the production of coated hazelnut.
- DUS P 1 5 protein refers to P 1 5 protein (SEQ ID NO: 2) from 2 3 5 amino acid residues registered in Aceticion N 542 1 7 8 ) And the activity of the tannins (for example, the flothiin mouth non-phosphatase activity 14 selected from the threonine-specific phosphatase activity) and 1 amino acid residue relative to this amino acid sequence. Deletion, substitution, insertion, insertion, or addition / lifetime mutant protein.
- such a mutant protein is composed of two rows of SEQ ID NO: about 70% or more 75% or more 80% or more 85% or more 9 1% or more 9 2% or more 9 3% or more 9 4% or more 9
- Any portion having the same activity as the activity ft of the DUSP 15 protein described above may be used for the site consisting of the amino acid sequence that follows.
- SEQ ID NO: 2 it consists of at least 20 amino acids residues, preferably at least 50 or at least 70, more preferably at least 1 or at least 200 amino acids.
- this contains an acid sequence in the part involved in the activity of DUSP 15 protein.
- the amino acid residue in the amino acid sequence used in the present invention is 1 or about 1 to 20 in the amino acid sequence, more preferably about 1 to 10 or about 1 to 5). Or deletion, addition, substitution, or modification.
- the DUSP 15 protein used in the present invention can be prepared from the cells and tissues.
- this material can be synthesized by a known hematopoietic synthesizer, or can be prepared by reversion using an appropriate host cell selected from eukaryotes.
- DUSP 15 used in the present invention may be derived from either species. Preferably, it is derived from human. “Substantially the same quality of active life” indicates their activity or property.
- the enzyme activity (flotinthyronone activity tt and serine threonine-specific phosphatase activity (for example, about 0 0 1 to 100 0 times preferably about 0 5 1) Whether it should be performed in accordance with the known method described in the document “Nanato” is measured according to the screening method described later.
- the identity of the amino acid sequence and the base sequence is determined by the alcoholic B LAST T (proc N atl S ci U SA 8 7 2 2 64-2 2 6 8 1 9 9 0 at 1 A cad S ci USA 9 0 5 8 7 3 Determined based on B LAS T alcoholism
- a fukuro crumb called BLASTX has been developed hu 1 SF, eta 1 J Mol Biol 0 3 1 9 9 0).
- cancer treatment agent is used as an anticancer agent, a cancer cell aphotonos inducer, a cancer cell growth inhibitor, a cancer agent, an antiepileptic agent Used to mean including the like.
- cancer and “tumor” in this application have the same meaning.
- DUS ⁇ 1 5 containing an expression inhibitor of the gene The present invention is, in one embodiment, DUS ⁇ 1 5 Examples of substances from DU SP 15 gene to DU SP 15 mRNA
- nucleic acid means RNA or DNA.
- Nucleic acid includes such modifications as those having other heterocyclic bases decorated with furin and hydrin bases. The product consists of methylated and / or liminated furin and / or lyminylated and furanized furin. 1 Nucleic acids that have an inhibitory effect are used as active ingredients. What is RNA i? When a double-stranded RNA that is the same as or has the target gene sequence is introduced into a cell, the introduced external endogenous I gene is inhibited.
- Double-stranded RNA that generates 9 to 30 bases
- ds RNA double-stranded RNA
- siRNA small inter RNA
- sh RNA shorthairpin
- SAAP r 3 0 9 9 9, 6 04 7-6 0 5 2 ⁇ 25 bases Most preferably 2 1-2 bases.
- SAAP r 3 0 9 9 9, 6 04 7-6 0 5 2 ⁇ 25 bases Most preferably 2 1-2 bases.
- antisense nucleic acid or “anti-leocyto” refers to having at least a small number of horinucleotide in a target DNA region, and having a high frequency with the horinucleotide or part of it.
- the antisense nucleic acid which is a nucleic acid, is RNA DNA or modified NADA)
- the antisense nucleic acid of the present invention is alternatively a modified nucleic acid (RNA DNA).
- NA Single-stranded DNA Double-stranded RNA Double-stranded RNA may be NA hyphenated.
- Modified nucleic acid ingredients Sulfur derivatives of nucleic acids thiophosphite derivatives It does not need to be a sequence complementary to the endogenous gene or a part of it, as long as it effectively suppresses the expression of the gene.
- design of a complementary antisense sequence near the 5 'end of mRNA of DU S P 15 gene is gene translation.
- the length of antisense nucleic acid is at least about 10 bases (about 40), preferably 15 bases or more, more preferably 0 bases or more. Is it possible to design a nucleic acid with a length of about 500 bases or less by referring to the publicly known literature? Hirashima and Inoue New Chemistry Laboratory 2 Nucleic acid IV gene Japanese Biochemical Society Tokyo Chemical Dojin 1 9 9 3 p 3 1 9 K awakam 1 eta 1 P harm T ech V ol 8 p 2 4 7 1 9 9 2 V ol 8 p 3 2 STC rookeeta 1 edse Research and Ap plicatio Press 1 9 9 3
- DU SP 15 Some have active domains (tankaku nucleus 0 3 5 p 2 1 9 1). Note: Reversing note type FEBSL ett, 1 9 8 8, 2 2 8, p SL ett 1 9 8 8 2 3 9 p 2 8 5 Tanha 1 9 9 0 3 5 p 2 1 9 1 N ⁇ c 1 A cids 8 9 1 7 p 7 0 5 9 For example, N type 1 p 3 4 9 Nuc 1 A cids R es 1 9 9 1 7 5 1 Hiroshi Kikuchi Chemistry and Biology 1 9 9 2 3 0 p 1 Using such a rehothyme, it is possible to specifically inhibit the transcript of the original SP 15 gene.
- the present invention can use the transcription activity of the DU S P 15 gene as an active ingredient. For example, it is a factor involved in the expression and transcription of the DUS P 15 gene.
- a compound is a natural product, but a compound such as a synthetic compound can be obtained by the screening method described later.
- 1 2 DU S P 1 5 Contains protein inhibitor of protein activity M
- the present invention provides a therapeutic agent for epilepsy comprising a DU SP 15 inhibitory substance Excluding foreign bodies)
- antibody means the full length of a protein or an antibody.
- the form of the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it binds to DU S P 15 protein, but also includes a human antibody, a recombinant antibody, an antibody fragment, and an antibody modification product in addition to the above-mentioned monoclonal antibody.
- Antibodies that bind to D protein can be prepared by those skilled in the art. Anti-DU S P 15 will be described later.
- DUS P 1 5 protein mutant with Tiff properties against DUS P 1 5 protein By expressing a glanced gene, the activity of endogenous ft field 5 protein is lost or reduced. (Kunihiro Tsuchida, Gene Activity Inhibition Experiment Method Tahira (2 0 0 1) 2 6-3 2 Natto).
- a compound other than a mutant that binds to DU SP 1 5 protein can be used as an active ingredient as a substance to obtain DU SP 1 5 protein.
- a compound that binds to Such compounds may be natural products. Such compounds can be obtained by the screening method described later.
- One preferred embodiment is a method using DU S P 15 protein and exposure as indicators.
- DU S P 15 tantalum compounds are expected to be effective in inhibiting the activity of DU S P 15 protein.
- the compound is preferably bound to the DU S P 15 position.
- the protein is further brought into contact with the test compound.
- DU SP 1 5 In response to an indicator for detecting binding to a test compound
- Example 1 5 Purified form of protein Intracellular or extracellular or bound to an affinity column For example, radiation knowledge, fluorescence knowledge, etc. can be given as necessary for the knowledge of compounds used as needed. In this method, the binding of DU SP 15 protein is detected next.
- DU SP 1 5 protein The binding of DU SP 1 5 protein to the test compound depends on the knowledge attached to the test compound bound to Example 1 5 protein.
- DU SP 1 is generated by the binding of the test compound to the protein that is expressed intracellularly or extracellularly. Select a test compound that inhibits activity.
- the compounds separated by this method have an anti-epileptic effect and are useful as therapeutic agents.
- the screen linking method is based on D U S P current.
- the DUSP 15 gene is first expressed and contacted with a test compound. It is not limited to the origin of the “cell” used, whether it is a cell that can be used as a source of the cell.
- a “cell expressing a gene” a cell having an endogenous DUSP 15 or a cell expressing or expressing an exogenous DUSP 15 gene can be used.
- Cells expressing an exogenous gene are usually prepared by introducing the expression vector left in D U S P 15 into the Sukuo cells.
- the expression vector can be produced by general genetic engineering techniques.
- Natural or compounds organic compounds to motor Compound Tanhaku compound off compound Namihi to quality life Larry Gene Raifurari cell extract Cell culture ⁇ products of fermenting microorganisms marine raw extract or the like is not particularly limited test compounds to be used in the process Used.
- Test compound in cells expressing DUSP 15 gene Normal culture of cells expressing DUSP 15 gene I will come.
- the antibodies used for DU SP 15 may be detectable antibodies, specifically monoclonal antibodies or polyclonal antibodies.
- the compound selected as a compound that decreases the expression level compared to a roll that is not contacted with a test compound is 3 1 Anti-DUS P 1 5 antibody
- anti-DU SP 15 antibody includes antibodies that are DU SP 1 (including fragments (partial edge) or salts thereof).
- the anti-DU SP 1 reclonal antibody used in the present invention may be a monoclonal antibody.
- the class of the antibody is not particularly limited, and anti-preferably having IgA type such as IgGIgMD or IgE is preferably IgG or IgM, and more easily IgG, more preferably IgG.
- antibody used herein is meant to include any antibody fragment or derivative, and includes, for example, Fab 2 CDR-humanized antibody, multifunctional antibody, and single-chain antibody.
- Antibody production methods of the present invention are well known in the art, such as the production of antibodies by known methods (see, for example, E & Lane Danantibody Collaborative Laboratory Laboratory 8). .
- the tanned USP 15 used as a sensitizing anti-IT or a salt thereof also includes a margin in its part. This is limited. For example, it is a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, eg, 40 or more 60 or more 80 or more 100 or more amino acids
- the part has a sequence part.
- these Salt or organic acid for example, acetic acid, quinic acid, flohy, etc.
- SP 15 Used as a sensitizing antigen for antibody acquisition, SP 15 is restricted to the animal species from which it is derived. Tanja or preferred Tancho or preferred.
- the above-mentioned DUPSP 15 protein is administered to a mammal mouse as an antigen using the portion of the protein (in this specification, these are collectively referred to as 15 protein) as an antigen.
- 15 protein the portion of the protein (in this specification, these are collectively referred to as 15 protein) as an antigen.
- 15 protein the portion of the protein (in this specification, these are collectively referred to as 15 protein) as an antigen.
- 15 protein is administered to a mammal mouse as an antigen using the portion of the protein (in this specification, these are collectively referred to as 15 protein) as an antigen.
- 15 protein When no hunt is used per animal of antigen, 0 1 to 10 Omg is used, and when using no hunt, 1 to 100 ⁇ g is used.
- Quantum immunity is limited by insertion into the subcutaneous or intraperitoneal cavity as an example of aluminum hydroxide cultivated. Not every few days to several weeks Good weekly intervals 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times Immunization 1 to
- Antibody-producing cells and myelo to obtain hyphenoma NS I / 1 -A g 4-1 S 0/1 and mouse mye YB 2 0 and myroma myeloma cell line are listed Next, cell fusion between the above myeloma cells and antibody producing cells Serum-free DMEM R PM I — 1 6 40 1 1 0 6 to 1 1 0 7 cells 111 1 and 2 X 1 0 5 to 2 X 1 0 6 cells and production of Zm l myeloma cells Cell ratio of cells to myeloma cells 2 1 to 3 1 Carry out fusion reaction in the presence of a cell fusion promoter Cell fusion promotion Average molecular weight 1 0 0 0 to 6 0 0 0 . It is also possible to fuse antibody-producing cells using commercially available cell fusion devices that utilize electrical stimulation (eg, electon).
- electrical stimulation eg, electon
- PM I-16 40 medium containing hyphritoma 10 medium culture medium or seeking culture medium culture medium for example, 3 7 ° C 5% 7 to 14 days
- ascitic fluid is taken approximately 1 X 1 0 7 or administered Haifuri Tomah re Thoma mammalian the same species animal-derived myeloma cells to atmospheric and 1 after 2 weeks Collecting the above-mentioned antibodies If purification of the antibody is required, the ammonium sulfate salting-out method, ion raffi-el filtration, affinity chromatography method can be selected as appropriate, or these can be combined.
- F ab or F ab 2 fragments can be prepared by digestion using conventional methods.
- Humanized antibodies are described, for example, by Riec hma nn et al. (R in J Mol Biol Oct 5 20 3 (3) 1 9 8 8) and J ones et al. (J ones et al. Nat 1 5 2 2- 5 2 5 1 9 8 6) It is possible to use one of the methods described in 1).
- Chimeric antibodies are, for example, “Experimental Medicine (Special issue 16, No 1 0 1 9 8 8”). Equity 3— 7 3 2 8 0 Human antibodies are, for example, “Nature Genetic 1 5, p 1 ⁇ 4 6-1 5 6 1 9 9 7 '' ⁇ Naturelcs Vol 7 p 1 3-2 1 1 9 9 4 '' Special 3 6 5 Gazette International Application Publication W 0 9 4 2 5 5 8 5 G Monthly Nos. 40 to 50, 1 9 9 5 "V ol 3 6 8, p 8 5 6-8 5 9, 1 9 9 4" An antibody that binds to SP 15 protein may be used for the purpose of suppressing cancer cell metastasis, etc.
- the antibody DU SP 15 can be obtained using bioluminescent compounds as well as phycoerythrin and fluoride.
- the presence of bioluminescent protein is measured by fluorescence. This knowledge is important for the biologically generated renoferrin, linofelase, and aequorin.
- the antibody of the present invention is used to specifically detect P 15 protein etc. in a sample of body fluid. Used and also used to purify DU SP 1 5 protein etc. DU SP 1 5 protein in each fraction during purification Analyzes the behavior of DUS P 1 5 protein in cells I will come.
- Anti-DUS P 15 antibody complex or anti-DU SP 15 antibody used in the present invention is an agent or a diagnostic agent itself or an agent having a neutralizing activity. Therefore, the present invention is used in another embodiment for use as an addictive therapy or addictive drug in the US. Complexes of P 15 antibody and other glazes are also provided. According to such an embodiment, the anti-DU SP 15 antibody of the present invention is used as a labeling agent for the determination of the therapeutic effect. Iodine-1 2 5 C 1 25 I) and iodine-1 3 1 As with the above elements, these radiohalogen elements can be widely used as diagnostic agents for radiation therapy and knowledge of antibodies and hefty. For example, 1 25 I or 1 can be conjugated to an antibody by a known method such as the chloramine T method.
- tech m indium 1 1 1 and potassium 1 6 7 6 7 Ga for treatment use indium 1 90 ( 9 0 Y) rhenium 6 R e) or rhenium 1 1 8 8 ( 1 88 R e)
- the metal chelating agent EDTA D nonionic compound cyclam and DOTA or other known chelating agents can be bound to the antibody in advance and then released, or the radioactive metal chelate can be formed and then bound to the antibody.
- cytokine that activates is preferable. It is possible to use linonyanph toxin to directly kill colonic canal cells. For example, for therapeutic proteins, coat the antibody or antibody fragment. C. Coat the DNA. C. Connect the DNA to coat the fusion antibody.
- Cyclophosphine alkylating agent 5 Flul meso trexase Antimetabolic agent Yunomainon Mitomycin C Yunolhinone Toxorhinone Hinkristin Hinfrastin Hintesin-like hormone agent Bed oncology (Japan Clinical Oncology Research Group 1 9 9 6 Years Cancer and / or Height Mouth Cochisson Fretonison's Steroline Intome Yunon's Non-Steroit Agent Gold Tiolamin's Immunomodulator Cyclophos Anti-inflammatory agents such as chlorfenilamine maleate, antihistamines, etc.
- virus hector a virus hector modified so as to be capable of binding to anti-DU of the present invention is used.
- Watenovirus hector Wang P et 5
- Retrovirus Hector RK eta 1 (1 9 9 6) JV ir
- Anti-DU SP 15 antibodies can be recognized as antigens (ie, D).
- the anti-DUS P 15 antibody and the other drug can be conjugated to chemical W or.
- chemical bonds include ionic bonds, covalent bonds, intermolecular forces, and hydrophobic interactions
- genetic engineering bonds include, for example, a fusion protein consisting of a milk protein.
- the antibody and the therapeutic protein will be bound.
- a chemically acceptable carrier can be added according to a conventional method.
- excipient coloring +4 flavor storage +4 stabilizer buffer f Latin Medium-chain fatty acid trichryslate Horio kinoechi
- Examples of the dosage form of the therapeutic agent of the present invention are oral powders, pills, powders, condylar agents, fine granules, soft cuffs, tans, helenotes, sublinguals, stings, etc.
- Plasters For liquids for external use, etc. use the optimal dosage form according to the route of administration and the subject of administration.
- the activity of DUS P 15 protein as an active ingredient (15 gene expression) Inhibitors can be determined from 0 1 to 9 9 in the drug product.
- the dosage of the active ingredient of the drug of the present invention varies depending on the subject of administration Subject administration method Oral administration In general (as 60 kg) More preferably, it is about 1 to 100 mg.
- the single dose varies depending on the organ symptoms, administration method, etc.
- the normal person for example, 6 kg
- About 30 mg per day preferably about 0 About 1 to 20 mg
- About 0 1 to 1 Omg should be administered by intravenous vaginal discharge
- the type of dosage form Administration method ⁇ Considering the symptoms of the deaf, etc. It will come out.
- Bladder canister Uterine canister eg cervical canine uterine canopy
- the leaf preparation of the present invention contains a DUSP 15 protein activity inhibitor SP 15 gene expression inhibitor as an active ingredient. Cancer agent Cancer metastasis inhibitor Cancer cell phohotosin inducer, etc. The type of cancer is not specific.
- the drug of the present invention contains both a DUSP 15 protein and a substance that inhibits the expression of the DUSP 15 gene.
- the sense nucleic acid is used as a monochromic or retrovirus vector. After insertion into a viral hector, it should be administered according to known means.Antisense nucleic acid should be administered alone or physiologically, and administered via a gene-like catheter Come.
- a combination of a combination of a recombinant fatenovirus particle and an anti-DUSP 15 antibody may be used independently in the treatment of cancer.
- a pharmaceutical carrier As such a carrier, water, physiological saline, krucose-hytoalf isotonic solution or the like is preferably used as a carrier.
- water, physiological saline, krucose-hytoalf isotonic solution or the like is preferably used as a carrier.
- the number of administrations is 1 and the administration period may be 1 day to several months or more.
- the viral hectare nucleic acid molecule used in the present invention can be used for diagnosis of a specific cell and / or disease state.
- a detectable marker gene into the nucleic acid molecule of C, it is possible to detect and diagnose tumor cells by combining with the virus Hector USP 15 antibody obtained by transfecting cells or anti-DUSP 1 5 Can be used to detect and diagnose tumor cells by allowing detection by antibodies
- the present invention also provides a diagnostic agent.
- One preferred diagnostic agent of the present invention is (a) a DUSP 15 antibody or (b) a DUSP 15 gene or a part of it. Diagnostic agents and diagnostics using 5 1 anti-DUSP 15 antibody containing
- subject-derived biological test includes subject-related or body fluid (for example, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.), liquid, saliva, perspiration, elliptical fluid, etc.).
- a “subject” is a human subject who is or is suspected of receiving or desired to receive a human subject. Examples of such cans include large intestine, stomach, and lungs. Gland or esophageal or liver or biliary or splenic or uterine canal (eg cervical or uterine canal) testis or spleen or urinary canal tumor Tumor or blood tumor is preferred.
- the immunoassay for issuing DUSP 1 in a subject's unexplained biological test as described above is based on the binding of a single antibody from a biological sample collected from a subject with a risk of kan (eg, large intestine).
- Antibody binding including measuring anti-DUSP 15 antibody and the amount of immunospecific binding by the antibody, under conditions to detect whether DUSP 15 protein or increased expression is detected. In this case, detection of increased D halite expression or disease state indications. If necessary, you can compare the DUSP 15 tanned reher to that without a cane.
- One embodiment of the above immunoassay is, for example, a blood clot test +4 It can be determined appropriately by those skilled in the art.
- One method of detectably labeling anti-DUS P 15 antibodies is to bind the antibody to an enzyme such as the enzyme Imnoanose (EIA) [Vo 1 1 er, immunoadsorbent by A] ('The E nz yme Li mu nosorbent A ssay) (ELISA) lagnostlc Horizons 2 1-7 JC lin Pathol 3 1 1 9 7 8 B utler by ological A ssociates Quartblication, Wa lkersvi 1 le MD r A Meth E 7 3 4 8 2 to 5 2 3 1 9 8 1] by JE. Fermentation with antibody Appropriate substrate Fluorophotometry is used to produce a chemical molecule that can be detected by fluorescence measurement with visible means.
- IA Imnoanose
- ELISA E nz yme Li mu nosorbent A ssay
- Enzymes that can be used to provide detectable knowledge to antibodies include, but are not limited to, herokinase and alkaline properties. This detection can also be achieved by a colorimetric method using a chromogenic substrate. Other methods that can be used in the present invention include the race (RIA) Santoi immunoassay method, the immunometric method, the immunofluorescence assay method ( FIA) Time-resolved fluorescence RFIA) Enzyme immunoassay (EIA) Luminescence immunoassay Electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) Latinox As described above, it is possible to diagnose various diseases related to DUS P 15 dysfunction by utilizing the in vivo D-quantitative method using the antibody of the present invention. Example 1 If an increase in the concentration of brown sea urchin is detected, whether it is likely due to overexpression of the brown sea urchin (for example, kan) or is likely to be affected in the future? The
- the anti-DU S P 15 antibody of the present invention may be i n v i v.
- the preparation of antibody preparations that can be used here is well known in the art.
- the antibody—Kireet NuclMedb Biol 1 9 9 0 1 7 2 is described.
- An example of an antibody having a paramagnetic ion used for magnetic resonance is described in, for example, M ag e e s e a n c e e n Me c i c e e e 1 9 9 1 -342.
- whether the DUS P 15 gene or the flow designed for the DUS P 15 gene is used is, for example, (a) the subject-based DUS P 15 gene or its fragment base A salt that can be swallowed up under the conditions of a streaky sunset in the array. And z or quantify.
- the base sequence used as the flow can be 12 bases or more 15 bases or more 18 bases or more 2 14 bases or more 2 7 bases or more 30 bases or more, or even a nucleotide fragment. High and low stringent conditions may be used. Included in the base sequence of DU SP 15 gene or its fragment is also included in the base sequence of DU SP 15 gene or its fragment. For example, international publication number 8 9 Z0 6 6 9 8 EP—A 0 2 US Pat. No. 2 9 1 5 0 8 EP—A 0 0 6 3 8 7
- the DU SP 1 5 gene is publicly detected by using a nucleocytofluorine or a flymer. Or come to quantify.
- the mR quasigene of the cellular DU SP 15 (housekeeping gene (for example, Shape et al., JM mmary G land B iol N la 3 (1 9 9 8) 3 1 5-3 2 4 Wu YY s JLA cta der venere (2 0 0 0) 2-3) mRNA reherence, preferably by R, can also be compared.
- Another embodiment of the diagnostic method of the present invention is a sputum during the test. By determining the intensity of the sample, it is possible to identify the individual amino acids of the protein and hemiform from the results of mass spectrometry.
- ionization there are various types of ionization, such as matrix antheno tracer tetherization (MAL D I), electrosfray ionization, phase (E I C I) and field desorption (FD).
- MAL D I matrix antheno tracer tetherization
- E I C I phase
- FD field desorption
- MAL DI matrix antheno tracer tetherization
- E I C I electrosfray ionization
- FD field desorption
- ion fraction compatible with ionization method For example MAL DI, time-of-flight type (ti me ght ToF) Mass spectrometer
- ESI quadruple ion trough type Magnetic type mass
- An analyzer or a quantity analyzer may be used in tandem.
- M S MALD I — T ⁇ It is also possible to determine the amino acid sequence by another method for determining amino acid sequence, for example, one (eg,
- the present invention also provides a quinoto for quantifying or quantifying a subject DU SP 15 protein or fragment thereof containing an anti-DU SP 15 antibody.
- the base sequence of the gene or a part of it contains a base sequence that can be hyfitized under stringent conditions.
- the term “can marker” refers to a subject's body fluid (such as urine phosphorus eight fluids, saliva, sweat, semen, etc.) or a cell that is not derived from cells or normal tissues, or is a molecule that is alternatively enhanced in expression. This suggests the presence of the molecule in the subject or in the tissue.
- the quinoto of the first embodiment contains antigens (DUSP 15 protein and its components and edge or Z or components to be quantified in the body fluid test from the subject.
- antigens DUSP 15 protein and its components and edge or Z or components to be quantified in the body fluid test from the subject.
- DUS or ELISA tissue sections or body fluids such as blood or urine, such as blood or urine, are used to detect and Z or quantify antibodies such as radioactivity, fluorescence ratio
- the quinoto of the present invention contains a labeled secondary antibody
- the quinoto of the above second embodiment is a stringent high hyphenation sequence in the DUSP 15 gene or base sequence.
- Article containing holynucleocytos having a base sequence that can be used as a chair.
- the quinoto of the present invention may contain the above-mentioned holy fixed on DNA chinofu.
- the quinoto of the present invention is a highly efficient anti-DUSP 15 antibody DUSP 15 having a stringent base sequence.
- Example 1 Colonic Canine Specific Amplification by Array C GH Method
- a colonic specimen specific gene amplification region was prepared in a sample of 20 samples of large intestine cannula and array C verification was performed.
- DU S P 1 5 gene was found to be amplified in 5 60% of 2 0 0 individuals.
- the frequency of the colon cane S was high and the amplification degree of the colon cane-derived cultured cell line was verified.
- the cultured cell line used was Caco 2 E 6 which is a cell line derived from the large intestine.
- Kenome DNA was extracted from the cultured cells according to the key phrase using BLOOD & CELLEDENAQ (Q IAGEN).
- Table 3 shows the DU S P15 gene colony cell line ZR value). As shown, it was found that colonic undifferentiated cells BAC Clone R P 1 1-2 4 3 J 16 located in P 1 5 gene was amplified.
- Table 4 shows the cell lines of DU S P15 gene with large intestine. The values are relative to the DNA of Akira (normal). In addition, we found that DUS P 15 inheritance was also observed in the colon cell line (Table 4).
- RNA i analysis using KOE 6 was also amplified in the colon colony cell line (C aco 6), so that the cells were selected for functional analysis of the DUS P 15 gene in the canine.
- RNA i analysis using KOE 6 was also amplified in the colon colony cell line (C aco 6) and its phenotype RNA 1 analysis>
- s 1 RN A synthesized s l RNA that selectively selects specific 21 mer within the gene (Q I AGEN
- RNA i FE CT QI AGEN
- the number of viable cells was measured by measuring leaf counts using the Cranco2 cells and cells with sl RNA of DUS P 15 gene T ransfec on the 4th day. Relative amounts are shown. As a result of the determination, it was found that in Caco 2 cells, 1 type of DU SP 1 l RNA (c) was found in all 3 types of s 1 RNA of 15 genes (ab, c) in RKOE 6 cells N Compared to egative control (NC), it was a little less (04 AB). It was observed whether the number of cells was low. All the sl RNAs of the SP 15 gene were subjected to t test. By carrying out this study, we verified the specific effects of the suppressive effect of epilepsy genes.
- the cell line used was CCD 18 Co, which was cleared from AT CC.
- the s 1 RNA c sequence used was used.
- L1 am ine 2200 (Invitrogen) was used.
- the slRNA was introduced into the cell according to the attached protocol. g atl v e C o n t r o ls ⁇ RNA (Q I AG). After introduction, the cells were observed under an inverted microscope for 5 days.
- RNA 1 of cell line C derived from normal large intestine of the large intestine of DU S ⁇ 15 gene is as follows.
- DU SP 15 c indicates one type of DU SP 15 RNA (c sequence of Example 3), and NC indicates no call. As shown, no NC effect was observed by phenotypic observation (05).
- ⁇ E 6 is DUSP 15 gene due to RNA i effect. Is the proliferation or suppression of the peritoneal cell markedly suppressed? Large intestinal vesicle strain C CD 1 8 It has been found that it can be a pharmacological gene with little effect on normal cells.
- DUS P 15 gene is an organ such as a normal tissue or not was evaluated by the North Sun-Hifuri known in the art.
- the gene amplification degree (G / R) or more than 1 or 2 tissue according to the FISH method known in the art using the array CGH method.
- the heftito fragment 0 1 was separated by a -Precolumn cartridge (C 5 ⁇ 300 ⁇ 300 ⁇ id ⁇ 5 mm LC PACKINGS 163589) Nano column (C18 PepMap 3 m 100 A 75 mid PACKINGS 160321).
- the HPLC apparatus was Ultim PACKINGS.
- the flow rate is 200nL / min. 0 1% Chinoic acid (Wak containing 2% Acetonitrile (MERCK 1287229) and 0 1% Chitol containing concentration gradient or 0 57% / min linear clone is installed. A complete MS / MS analysis was performed. 3) Analysis
- 01 0 A ⁇ indicates the correspondence between 09 determined by MS / MS analysis and amino acid (or amino acid sequence).
- 01 1 shows the results of BiJ assay (MTT assay) in HeLa cells using cells on day 4 after sl RN fectlon of D US P 15 gene.
- NC Neg siRNA (Qiagen)
- 3 types of siRNA (abc) of DUSP 15 gene shown in 0 (abc) showed 26% growth-inhibiting effect (p ⁇ 0 01 t, further time-sequentially observed differential icing images under microscope) Specifically, HeLa cells were subjected to siRNA (13,4 days after ab fuc- noon), and the results were shown in 01 2.
- the growth rate of NC is higher than that of NC using Negative control s lRNA. (Indicated by the sign of inhibition and cell death).
- the present invention provides a therapeutic agent for cans, a diagnostic agent, a diagnostic method, and a kinoto used for treatment. Therefore, it is useful in fields such as the present invention or acupuncture.
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Abstract
It is intended to provide a therapeutic agent for cancer containing an expression inhibitor or activity inhibitor of DUSP15 protein; a method for screening a compound which can be used as an active ingredient of such a therapeutic agent; an antibody against the DUSP15 protein; a diagnostic agent for cancer/a diagnostic method for cancer using the antibody and the like.
Description
明細書 Specification
D U S P 1 5遺伝子の治療的又は診断的用 技術分野 Technical field for therapeutic or diagnostic use of D U S P 15 gene
本発明は かんにおいて特異的に増幅している遺伝子 1 5遺伝子 その治療的又は診断的用途なとに関する。 背景技術 The present invention relates to the gene 15 gene specifically amplified in cannabis and its therapeutic or diagnostic use. Background art
悪性腫瘍 (かん) の特徴として 増殖 浸潤 転移を ことによる致死かあけられる。 外科的な切除または放射 局所療法ては 転移性再発かんに対して十分な対処はて てある葉物療法の発展か 今後のかん治療成績の向上に かん薬物療法の現在の中心てある化学療法は 直接か およひ または R N Aに作用し 細胞を死に至らせる殺 る場合か多いか かん細胞以外の 例えは 骨髄細胞 細胞 消化管上皮細胞なと分裂かさかんな正常細胞に対 強い副作用をもたらしていた。 一方 近年の分子細胞生 り かん細胞の浸潤 増殖 転移なとにかかわるメカニ そのかん細胞の特定メカニスムに特異的に作用する分子 汪目されている。 代表例として 非小細胞肺かんの治療 G F R (上皮成長因子受容体) チロシンキナーセ阻害 サ (一般名 ケフイチニフ) (W O 9 6 Z 3 3 9 8 0 )
んに次いて 3位になっている。 年齢別ては 6 0歳代か一 5 0歳代 7 0歳代の順てある。 大腸かんの増加の原因 因 環境的要因なとか考えられるか 食生活の西欧化 の取りすきか原因てはないかと指摘されている。 大腸か 檸的葉の開発か待たれている。 また 診断に用いられて 一 (C EA, CA 1 9— 9) は 進行大腸かんてあつて を示すのみて 臓器特異性も無く より高 ft能な診断薬 ている。 発明の開示 As a characteristic of malignant tumors, growth, invasion and metastasis can be killed. Surgical excision or radiation Is local therapy sufficient for the treatment of metastatic recurrence? Development of phytotherapy that has been adequately addressed? To improve future treatment outcomes. It was killed by direct and / or RNA action leading to cell death. Many other examples, such as bone marrow cells, gastrointestinal epithelial cells and dividing normal cells, had strong side effects. On the other hand, the mechanism of molecular cell invasion, proliferation, and metastasis of molecular cells in recent years has been regarded as a molecule that acts specifically on the specific mechanism of the canine cells. As a representative example, treatment of non-small cell pulmonary canal GFR (epidermal growth factor receptor) tyrosine kinase inhibitor (generic name: Kehuitinif) (WO 9 6 Z 3 3 9 8 0) Next to third place. By age group, they are in the order of 60's or 1's. Cause of increase in large intestine Can it be considered as an environmental factor? It has been pointed out that it may be a cause for the westernization of dietary habits. The development of the large intestine or cocoon leaves is awaited. One used for diagnosis (CEA, CA 19-9) is a diagnostic agent with a higher ft ability that shows advanced colorectal disease and has no organ specificity. Disclosure of the invention
上記のような状況下て かんを治療あよひ Zまたは診 たな薬剤または方法か *められている。 It is recommended to treat or treat mandarin under the above conditions.
特に かんに対して特異性の高い治療薬およひ Zまた られている Especially for drugs with high specificity for cans and Z
上記のような状况に鑑み 本発明者らは 鋭意研究を ん (特に 大腸かん) にあいて高頻度に増幅か起きてい U S P 1 5遺伝子てあることを見出した。 本発明者らは ん細胞株ならひに子宮頸かん細胞株において D US P 1 5 発現を阻害することによって 癌細胞の増殖を抑制し得 本発明を完成するに至った。 すなわち 本発明は 以下 治療剤 かん抑制作用を有する候補物質のスク リーニン 断剤 かん診断用キノ ト かんの診断方法なとを提供す In view of the situation as described above, the present inventors have found that there is a U S P 15 gene that has been intensively studied (especially the large intestine) and is frequently amplified. The present inventors have been able to suppress the growth of cancer cells by inhibiting the expression of D US P 15 in cancer cell lines, particularly cervical cancellous cell lines, and have completed the present invention. That is, the present invention provides a screening method for a screening agent, a quinotocan for diagnosis of a candidate substance having an inhibitory action on a therapeutic agent.
( 1 ) DU S P 1 5遺伝子の発現阻害物質を有効成分と
(c ) DU S P 1 5遺伝子またはその一部に対するテ (d) DU S P 1 5遺伝子またはその一部に対してト ィフに作用する DU S P 1 5遺伝子変異体 (1) A substance that inhibits the expression of DU SP 15 gene as an active ingredient (c) Te to DU SP 15 gene or a part thereof (d) DU SP 15 gene variant acting in a tiff manner on DU SP 15 gene or part thereof
( e ) DUS P 1 5遺伝子の転写産物を特異的に切断 活性を有する核酸 (e) Nucleic acid that specifically cleaves the transcript of the DUS P 15 gene
およひ And
( f ) DUS P 1 5遺伝子の転写または DUS P 1 5 訳を阻害する化合物 (上記核酸を除く) (f) Compounds that inhibit DUS P 15 gene transcription or DUS P 15 translation (excluding nucleic acids above)
からなる群から選択される物質を含む 上記 ( 1 ) に記 ( 3 ) DU S P 1 5タンハク質の活性阻害物質を有効成 るかん治療剤。 (3) A therapeutic agent that effectively comprises a DU S P 15 protein inhibitory substance, comprising a substance selected from the group consisting of:
(4) 上記 DU S P 1 5夕ンハク質の活 ft阻害物質か (a) 該 DU S P 1 5夕ンハク質に対する抗体 (4) Is the above DU S P 1 5 protein active ft inhibitor (a) Antibody against the DU S P 1 5 protein
(b ) 該 DU S P 1 5タンハク質に対してトミナント 質を有する DU S P 1 5タンハク質変異体 およひ (b) a DU S P 1 5 protein variant having a dominant quality relative to the DU S P 15 protein;
(c ) 該 DU S P 1 5タンハク質に結合する化合物 ( 変異体を除く) (c) Compounds that bind to the DU S P 15 protein (excluding mutants)
からなる群から選択される物質を含む 上記 ( 3) に記Including a substance selected from the group consisting of
( 5 ) 上記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある (4) のいすれかに記載のかん冶療剤。 (5) The above-mentioned cannula agent according to any one of (4), which is a large intestine or cervical epilepsy.
(6) DU S P 1 5遺伝子の発現阻害物質をスクリーニ あって、 (6) A screening agent for the expression inhibitor of DU S P 15 gene,
(a) DUS P 1 5遺伝子を発現する細胞に 被検化
(a) DU S P 1 5タンハク質と被検化合物とを接触(a) Test on cells expressing DUS P 15 gene (a) Contact between DU SP 1 5 protein and test compound
(b) 該 DUS P 1 5タンハク質と被検化合物との結 る工程 およひ (b) the process of binding the DUS P 15 protein to the test compound and
( c ) 該 DU S P 1 5タンハク質と結合する化合物を 包含する スクリーニンク方法。 (c) A screening method comprising a compound that binds to the DU S P 15 protein.
(8) 上記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある は ( 7 ) に記載の方法。 (8) The method described in (7) above.
(9) DU S P 1 5タンハク質に対する抗体。 (9) Antibody against DU S P 15 protein.
( 1 0) 上記 (9 ) に記載の抗体を含有するかん治療剤。 ( 1 1 ) 放射性同位元素 治療タンハク質 低分子の薬 遺伝子を担持したヘクターをさらに含有する 上記 ( 1 0 ん治療剤。 (10) A therapeutic agent for epilepsy comprising the antibody according to (9) above. (1 1) Radioisotope Therapeutic protein A low-molecular-weight drug The above-mentioned (10 therapeutic agent further comprising a hector carrying a gene.
( 1 2 ) 上記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある または ( 1 1 ) に記載のかん治療剤。 (1 2) The above-mentioned epilepsy or cervical epilepsy or (1 1)
( 1 3) 上記 (9 ) に記載の抗体を含有するかん診断剤。 (1 3) A can diagnosis agent comprising the antibody according to (9) above.
( 1 4) DUS P 1 5遺伝子またはその一部の塩基配列 ン卜な八ィフリ夕イセーンョ ン条件下てハイフリタイス を含有するかん診断剤 (1 4) DUS P 15 gene or a part of the nucleotide sequence Candidate diagnostic agent containing high fritase under unfavorable conditions
( 1 5 ) 上記かんか大腸かんてある 上記 ( 1 3) また 載のかん診断剤。 (1 5) The above-mentioned canine or large intestine can also be used.
( 1 6 ) 上記 (9 ) に記載の抗体を含有するかん診断用 (16) for can diagnosis comprising the antibody described in (9) above
( 1 7 ) D U S P 1 5遺伝子またはその一部の塩基配列 ントなハイフリ夕イセーンョン条件下てハイフリタイス
9) に記載の方法。 (17) DUSP 15 gene or a part of its base sequence The method described in 9).
(2 1 ) 質量分析装置を用いて DU S P 1 5タンハク または定量する 上記 ( 1 9 ) または (2 0 ) に記載 (2 1) DU S P 15 tan haku or quantified using mass spectrometer Described in (1 9) or (2 0) above
(2 2) 抗 DU S P 1 5抗体を用いて DU S P 1 5タ およひ Zまたは定量する 上記 ( 1 9) 〜 (2 1 ) のい 方法。 (2 2) The method according to (19) to (2 1) above, wherein the anti-DUSP 15 antibody is used to perform DUSP 15 or Z or quantitative determination.
(2 3) ( a) 被験者由来の生体試料と DU S P 1 5 する抗体とを接触させる工程 およひ (2 3) (a) A step of contacting a biological sample derived from a subject with a DU S P 15 antibody
(b) 上記試 中ての上記抗体と DUS P 1 5タン を検出おょひ または定量する工程 (b) Step of detecting or quantifying the antibody and DUS P 15 tank in the above test
を包含する 上記 (2 2) に記載の方法。 The method described in (2 2) above.
(24) ( a) 被験者由来の生体試 と DU S P 1 5 の断片の塩基配列にス ト リ ンノエントなハイフリタイセ てハイフリタイス可能な塩基配列からなるホリヌクレオ せる工程 およひ (24) (a) A biological test derived from a test subject and a step of generating a nucleonuclease consisting of a base sequence of a stringent high-flip tyre and a high-fly tyre to the base sequence of a DU S P 15 fragment.
(b) 上記試 中ての上記ホリヌクレオチトと DU S またはその断片とのハイフリ夕イセーノョ ンを検出およ する工程 (b) A step of detecting a high-frequency event between the above-mentioned hollow nucleotide and DU S or a fragment thereof during the above test.
を包含する 上記 ( 1 9) または (2 0 ) に記載の方法。 The method according to (19) or (20) above.
( 2 5 ) かんの診断に用いるための上記 ( 1 9 ) 〜 (2 4 に記載の方法。 (25) The method described in (19) to (24) above for use in diagnosis of cans.
(2 6 ) 前記かんか 大腸かんてある 上記 ( 2 5 ) に (2 6)
(2 7 ) DUS P 1 5遺伝子の発現阻害物質を崈者に投
ハク質の活性阻害物質の使用。 (2 7) DUS P 15 gene expression inhibitor Use of cassava activity inhibitors.
( 3 1 ) 配列番号 5 配列番号 6 、配列番号 7 配列番 9 または配列番号 1 0の塩基配列を有する ホリヌク ( 3 2 ) DU S P 1 5遺伝子の発現阻害物質を有効成分 かん治療剤てあって 配列番号 5 配列番号 6 配列番 8 配列番号 9 または配列番号 1 0の塩基配列を有す チトを含有する かん治療剤 本発明により かん (例えは 大腸かん) の治療およ に有用な新規な薬剤 キノ トおよひ方法 ならひにかん る候補化合物のスク リ一ニンク方法か提供される。 (3 1) Holinuku having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 (3 2) DU SP 15 gene expression inhibitor is an active ingredient SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 A canine therapeutic agent containing a chito having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 According to the present invention, a novel drug useful for the treatment of cans (eg, colon cane) If it is a quinoto and method, a method of screening a candidate compound is provided.
0面の簡単な説明 Brief description of the 0 side
01は DU S P 1 5遺伝子の大腸かん崈者由来の 2 る遺伝子増幅度に対する頻度を示すヒス トクラムてある。 01 is a histogram showing the frequency of the DU S P 15 gene with respect to the degree of amplification of two genes derived from colonic epilepsy.
02は 大腸かん細胞株 C a c o 2およひ R KO E 6 5遺伝子の s 1 RNAを トランスフエク トした場合の 結果を示す光学顕微鏡写真(位相差像)てある。 02 is an optical micrograph (phase contrast image) showing the results when s 1 RNA of the large intestine cane cell line Caco 2 and RKO E 65 gene is transfected.
03は 大腸かん細胞株 C a c o 2に DU S P 1 5遺 Aを トランスフエク トした場合の RNA 1効果を定量 により評価した結果を示すクラフてある。 03 is a graph showing the results of quantitative evaluation of the RNA 1 effect when DU S P 15 residue A was transfected into the large intestinal cane cell line C a c o 2.
04は 大腸かん細胞株 C a c o 2およひ RKO E 6 遺伝子の s 1 RNAを トランスフエク ト した場合の 生
胞数冽定により検証した結果を示すクラフてある。 04 shows the results of transfection of the s1 RNA of the large intestinal cancell lines Caco 2 and RKO E 6 genes. The graph shows the results verified by cell count determination.
図 7は 正常な種々の臓器組織を用いて行ったノーサ セーノョ ンの結果を示す写真てある。 Figure 7 is a photograph showing the results of a no-sense experiment performed using various normal organ tissues.
08は FISH 法て解析した大腸癌崈者由来の各検体 ん細胞の一部 (6細胞分) の光学顕微鏡写真(蛍光像)て 08 shows optical micrographs (fluorescence images) of some of the specimen cells (six cells) from colorectal cancer patients analyzed by the FISH method.
09 Aおよひ 09 Bは 質量分析により解析した (A) 由来の血清およひ (B) 健常者由来の血清についての結 すクラフてある。 09 A and 09 B are the krafts of sera derived from (A) and (B) sera from healthy subjects analyzed by mass spectrometry.
01 0 A〜Cは MS /MS解析によって決定された ークとアミノ酸 (またはアミノ酸配列) との対応関係を 01 0 A to C show the correspondence between the amino acids (or amino acid sequences) determined by MS / MS analysis
01 1は 子宮頸癌細胞株 HeLa 細胞株に D US P 1 RNAを トランスフエク トした場合の RNA i効果を より検証した結果を示すクラフてある。 01 1 is a graph showing the results of verifying the RNA i effect when D US P 1 RNA was transfected into the cervical cancer cell line HeLa cell line.
01 2は 01 1の実験を時系列に従い 顕微鏡下て 態を詳細に観察した結果を示す光学顕微鏡写真(微分干涉 発明を実施するための最良の形態 本発明者らは 大腸かん崈者由未の検体を用いてアレ る増幅遺伝子の検証を行い 大腸かん特異的な遺伝子増 た。 検体において高頻度に増幅か起きている領域のうち 1 5 (D u a l s p e c i f i c i t y p n o s p l i k e 1 5 ) 遺伝子か大腸かん崈者由来の検体にお ることを見出した。
そのため 二重特異性ホスファターセ (D u a l s p t y p h o s p h a t a s e (D S P) ) と呼はれる。 フロティンホスファタ一セ (P r o t e i n p h o s e ) は セリ ン スレオニン特異的ホスファターセ (P と) とノスティン残基を含むチロンンホスファ夕ーセ ( e p h o s p h a t a s e) (P T P) とに分けられ N K &N e e l Β G ( 1 9 9 6 ) C e 1 1 801 2 is an optical micrograph showing the results of detailed observation of the experiment of 01 1 according to the time series under a microscope (differential varieties, best mode for carrying out the invention). Specimen amplification was performed using specimens, and the number of genes specific to the large intestine was increased 15% (Dualspecificitypnosplike 1 5) of the regions where amplification occurred frequently in the specimen It was found that the sample was. Therefore, it is called dual specificity phosphatase (Dualsptyphosphatase (DSP)). Frotin phosphatase (P roteinphose) is divided into serine threonine specific phosphatase (P and) and thyronphosphatase (PTP) containing nostin residues. NK & N eel Β G (1 9 9 6) C e 1 1 8
3 6 8 M u s t e 1 l n , T e t a 1 ( 2 0 0 t B i o s c i 7 8 5 - 14 2 M u s t e 1 ι a 1 ( 2 0 0 3 ) I mm u n o l R e v 1 9 2, 7 ) 。 最近てはさらに ァスハラキン酸を含む金属イオ P (T o o t 1 e T L t a 1 ( 2 0 0 3 )3 6 8 M u s t e 1 l n, T e t a 1 (2 0 0 t B i o s c i 7 8 5-14 2 M u s t e 1 ι a 1 (2 0 0 3) I mm u nol R e v 1 9 2, 7). Recently, metal io-P (T o o t 1 e T L t a 1 (2 0 0 3))
42 6 2 9 9 - 3 0 2 R a a p u r e d d l J (2 0 0 3 ) N a t u r e 4 6, 2 9 5 - 2 9 8 t a 1 (2 0 0 3) N a t r e 4 2 6 2 4 7 つかっている。 P T Pは P T 1 B ( C h a r b o n n e t a 1 ( 1 9 8 9 ) P r C N a t l A c a d42 6 2 9 9-3 0 2 R a a p u r e d d l J (2 0 0 3) N at u r e 4 6, 2 9 5-2 9 8 t a 1 (2 0 0 3) N at r e 4 2 6 2 4 7 P T P is P T 1 B (C ha r b o n n e t a 1 (1 9 8 9) P r C N at l A c a d
5 A 8 6 5 2 5 2 - 5 2 6 ) に代表される非受 5 (H e r m i s t o n M L e t a 1 ( 2 0 0 R e v I mmu n o l 2 1 1 0 7 - 1 3 7 ) に代 型に加え フロテイ ンチロノンホスファ夕ーセ活性おょ ォニン特異的ホスファ夕一セ活性の両方を有する非受容5 A 8 6 5 2 5 2-5 2 6), and 5 (Hermiston ML eta 1 (2 0 0 R ev I mmu nol 2 1 1 0 7-1 3 7) Flotine Tyronon Phosphate activity and non-receptive with both onion-specific phosphatide activity
(Yu v a n 1 y ama J e t a 1 ( 1 9 9 6
1 8 6 - 1 9 2 My e r s , M P e t a 1 r o c N a t l A c a d S c i U S A 9 9 0 5 7 ) に分類される。 ヒ トケノム上の P T Pは 9 6 在し その内 非受容体型は 2 6種 受容体型は 2 9種 ついては 4 1種類あるとの報告かある (B h a d u r i d h am i n i R ( 2 0 0 3 ) P r o t e i n E 8 1 - 8 8 8 ) 。 (Yu van 1 y ama J eta 1 (1 9 9 6 1 8 6-1 9 2 My ers, MP eta 1 roc Natl A cad S ci USA 9 9 0 5 7) There are 9 6 PTPs on the human genus, of which 26 are non-receptor types and 4 are 1 type of receptor type. (B haduridh am ini R (2 0 0 3) P rotein E 8 1-8 8 8).
D S Pの代表例として マイ トノエン活性化フロティ l t o g e n— a c t i v a t e d p r o t e i n てある E r k J n k p 3 8より脱リ ン酸化し不活性 ナ一セホスファターセ (MAP k i n a s e p h o s e (MK P ) ) か知られている (S a x e n a , M & n T ( 2 0 0 0 ) S e m i n I mmu n o l 1 2 9 6 A l o n s o A e t a 1 ( 2 0 0 3 ) r G e n e t 5 3 3 3— 3 5 8 ) 。 A representative example of DSP is MAP kinasephose (MK P), which is dephosphorylated and inactivated from erogen activated protein Erk J nkp 3 8 (S axena, M & n T (2 0 0 0) Semin I mmu nol 1 2 9 6 A lonso A eta 1 (2 0 0 3) r Genet 5 3 3 3— 3 5 8).
MKPの様な典型的な D S Pの他に MKPキナーセ (MK P k i n a s e — t a r g e t i n g mo t i ルーフか存在する。 ワクシニアウィルス (V a c c i n i s ) 由来の VH 1か D S Pてある (G u a n K L ( 1 9 9 1 ) N a t u r e 3 5 0 , 3 5 9 - 3 6 2 ) 耒 DU S P 3 (VHR) ( I s h i b a s h i T In addition to typical DSPs such as MKP, there is a MKP kinase (MK P kinase — targeting mo ti roof. VH 1 derived from vaccinia virus (V accinis) or DSP (Guan KL (1 9 9 1) N ature 3 5 0, 3 5 9-3 6 2) 耒 DU SP 3 (VHR) (I shibashi T
( 1 9 9 2 ) P r o c N a t l A c a d S c i 9 1 2 1 7 0 - 1 2 1 7 4) DU S P 2 2 (VHX)
と見つかつている。 (1 9 9 2) P roc Natl A cad S ci 9 1 2 1 7 0-1 2 1 7 4) DU SP 2 2 (VHX) I am confused.
DU S P 1 5 (VH Y) は 正常祖織において精巣特 られ 詳細な解析ては 减数分裂の第一分裂中期てある 糸期) 精母細胞に発現か見られる。 また 膜への局在に ン酸か結合部位 (クリ ンン残基) か N末端にあり 細胞 局在する。 DU S P 1 5のかんとの直接的な関連につい ていない。 DU S P 1 5 (VH Y) is characterized by testis in normal anorexia. Detailed analysis shows that it is expressed in spermatocytes. In addition, it is localized to the membrane at the acid or binding site (clean residue) or at the N-terminus and is localized in the cell. Not directly related to DU S P 15
本発明者らは DU S P 1 5遺伝子の発現を RNA l によって抑制することによってかん細胞の増殖を抑制て した したかって DU S P 1 5遺伝子の発現を抑制する かんを治療することか可能となる。 また DU S P 1 5 を測定することによってかんの診断を行う ことも可能と 以下 本発明のかん冶療剤 スク リーニンク方法 診 て詳細に説明する。 The present inventors can suppress the expression of the DU S P 15 gene by suppressing the expression of the DU S P 15 gene by suppressing the expression of the DU S P 15 gene by inhibiting RNA l. It is also possible to make a diagnosis of can by measuring DU S P 15, which will be described in detail below.
1 かん抑制作用を有する薬剤 1 Drug with anti-cane action
まず 本発明は ( 1 ) DU S P 1 5遺伝子の発現阻 分として含有するかん冶療剤 及ひ ( 2 ) DU S P 1 5タ ft阻害物質を有効成分として含有するかん治療剤を提供す 本明細書中 「DU S P 1 5遺伝子」 という場合 N C チトテ一夕へースにおいて A c c e s s i o n N o 0 6 1 1て登録されている 1 3 8 3塩基からなるヒ ト DU 子 (配列番号 1 ) を意味するか (A l o n s o A
中て使用する 「DU S P 1 5遺伝子」 に含まれるものと ハイフリ夕イセーンヨ ンは 公知の方法あるいはそれ 例えば モレキュラー クローニンク (M o l e c u l l n g T h i r d E d i t i o n J S a mb r a 1 C o l d S p r i n g H a r b o r L a s 2 0 0 1 ) に記載の方法なとに従って行うことか 市販のライフラリーを使用する場合 付の使用説明書 従って行う ことかてきる。 ここて 「ス トリ ンノエン卜 ス トリ ンンェン 卜な条件 中ス トリ ンンェン卜な条件及 ェントな条件のいずれてもよい 「低ス トリ ンノエン卜 えは 5 X S S C 5 Xテンハルト溶液 0 5 % S D S ムァミ ト 3 2 °Cの条件てある。 また 「中ス トリ ンン は 例えは 5 X S S C 5 Xテンハルト^液 0 5 0 %ホルムアミ 卜 4 2 °Cの条件てある。 「高ス ト リ ン 件」 は 例えば 5 X S S C 5 Xテンハルト溶液 0First, the present invention provides (1) a cannula therapeutic agent containing DU SP 15 gene expression inhibitor and (2) a cane therapeutic agent containing a DU SP 15 tft inhibitor as an active ingredient. Middle “DU SP 1 5 gene” means that it means a human DU element (SEQ ID NO: 1) consisting of 1 3 8 3 bases registered as Accession No 0 6 1 1 in NC Chitote (A lonso A The “DU SP 15 gene” to be used in the middle and the high-rise chain are known methods or examples such as molecular cloning (Molecullng T hird E dition JS a mb ra 1 C old S pr ing Harbor L as 2 0 0 1) According to the method described in the above or according to the instruction manual attached when using a commercially available life rally. Here, “stringent conditions can be any of moderate conditions and conditions can be selected.“ Low stringent conditions are 5 XSSC 5 X Tenhard solution 0 5% SDS murmite 3 The condition is 2 ° C. Also, “medium string is 5 XSSC 5 X Tenhard ^ liquid 0 5 0% formamide 卜 4 2 ° C.“ High string condition ”is 5 XSSC 5 X Tenhard solution 0
5 0 %ホルムァミ ト 5 0での条件てある。 これらの条 度を上けるほと高い相同性を有する DN Aか効率的に得 待てきる。 たたし ハイフリ夕イセーノヨ ンのス トリ ン 響する要素としては温度 フローフ濃度 フローフの長 時間 塩濃度なと複数の要素か考えられ 当業者てあれ 適宜選択することて同様のス トリ ンンェンノーを実現す ある There is a condition at 5 0% formamide. We can efficiently obtain a DNA having a high degree of homology with these conditions. However, it is possible that there are multiple factors, such as temperature, flow concentration, flow time, salt concentration, and other factors. is there
ハイフリ夕イス可能なホリヌクレオチトとしては F
本明細書中 「遺伝子の発現阻害」 とは 遺伝子から まての一連の事象 (例えは 転写 (mRNAの生成) 質の生成) を含む) のうちのいすれかの事象を阻害する の遺伝子によってコー卜されるタンハク質の生成を阻害 するものとする。 F In this specification, “inhibition of gene expression” refers to a gene that inhibits any one of a series of events (including transcription (mRNA generation) quality generation) from the gene. Inhibits the production of coated hazelnut.
本明細書中 「DUS P 1 5タンハク質」 という場合 ハク質テ一夕へースにおいて A c c e s s i o n N 542 1 7 8て登録されている 2 3 5アミノ酸残基から P 1 5タンハク質 (配列番号 2 ) およひこのタンハク質 の活 I生 (例えは フロテインチ口ノンホスファターセ活 スレオニン特異的ホスファターセ活性から選択される 14) を保持し このタンハク質のアミノ酸配列に対して 1 ミノ酸残基の欠失 置換 挿入 及ひ または付加か生 列からなる変異夕ンハク質をいう。 In the present specification, “DUS P 1 5 protein” refers to P 1 5 protein (SEQ ID NO: 2) from 2 3 5 amino acid residues registered in Aceticion N 542 1 7 8 ) And the activity of the tannins (for example, the flothiin mouth non-phosphatase activity 14 selected from the threonine-specific phosphatase activity) and 1 amino acid residue relative to this amino acid sequence. Deletion, substitution, insertion, insertion, or addition / lifetime mutant protein.
上記変異タンハク質における アミノ酸の変異部位お 異夕ンハク質か元のタンハク質と実質的に同質の活性を り特に制限はないか 変異個数は 例えは 1〜 5 0個 1〜 3 0個 1〜 2 5個 1〜 2 0個 1〜 1 5個 1 9個 1〜 8個 1〜 7個 1〜 6個 ( 1〜数個) 1 個 1〜 3個 1〜 2個 1個てある。 変異個数は一般 ましい。 また このような変異タンハク質は 配列番号 2 列と約 7 0 %以上 7 5 %以上 8 0 %以上 8 5 %以 9 1 %以上 9 2 %以上 9 3 %以上 9 4 %以上 9
続するアミノ酸の配列からなる部分へフチトてあつて 述の D U S P 1 5タンハク質の活 ftと同様の活性を有す いずれのものても良い。 例えは 配列番号 2て表される おいて 少なく とも 2 0個 好ましくは少なく とも 5 0 しくは少なく とも 7 0個 より好ましくは少なく とも 1 ましくは少なく とも 2 0 0個のアミノ酸残基からなるア するホリへフチトなとか挙けられる。 好ましくは これ トは D U S P 1 5タンハク質の活 に関与する部分に 酸配列を含有する。 また 本発明て使用される部分へフ ホリへフチトにおいて そのアミノ酸配列中の 1 または 1〜 2 0個程度 より好ましくは 1〜 1 0個程度 さら は 1〜 5個程度) のアミ ノ酸残基か欠失 付加 置換 り変更されているものてもよい。 Is the amino acid mutation site in the above-mentioned mutant tanned habitous or substantially the same quality as that of the original tanned habitat, with no particular restrictions? Number of mutations, for example 1 to 50 0 1 to 3 0 1 to 2 5 1 to 2 0 1 to 1 5 1 9 9 1 to 8 1 to 7 1 to 6 (1 to several) 1 1 to 3 1 to 2 1 The number of mutations is generally good. In addition, such a mutant protein is composed of two rows of SEQ ID NO: about 70% or more 75% or more 80% or more 85% or more 9 1% or more 9 2% or more 9 3% or more 9 4% or more 9 Any portion having the same activity as the activity ft of the DUSP 15 protein described above may be used for the site consisting of the amino acid sequence that follows. For example, as represented by SEQ ID NO: 2, it consists of at least 20 amino acids residues, preferably at least 50 or at least 70, more preferably at least 1 or at least 200 amino acids. A. Preferably this contains an acid sequence in the part involved in the activity of DUSP 15 protein. In addition, the amino acid residue in the amino acid sequence used in the present invention is 1 or about 1 to 20 in the amino acid sequence, more preferably about 1 to 10 or about 1 to 5). Or deletion, addition, substitution, or modification.
本発明て用いる D U S P 1 5タンハク質は そのタン ている細胞や組織から調製することかてきる。 また こ 質は 公知のへフチ卜合成機によっても合成てきるし は真核生物から選択される適当な宿王細胞を用いた祖換 も調製することかてきる。 本発明て用いる D U S P 1 5 いすれの種由来のものてもよいか 好ましくはヒ ト由来 「実質的に同質の活 I生」 とは それらの活性か性質的 とを示す。 したかって 酵素活性 (フロティンチロノン 活 ttおよひセリ ン スレオニン特異的ホスファターセ活 (例えば 約 0 0 1〜 1 0 0倍 好ましくは約 0 5
1 ) なとの文献に記載の公知の方法に準して行うことか は 後に記載するスク リーニンク方法に従って測定する なお アミノ酸配列や塩基配列の同一性は カーリ ン ールによるアルコリスム B LAS T (p r o c N a t l S c i U SA 8 7 2 2 64 - 2 2 6 8 1 9 9 0 a t 1 A c a d S c i U S A 9 0 5 8 7 3 を用いて決定てきる。 B LAS Tのアルコリスムに基つ Nや B L A S T Xと呼はれるフ口クラムか開発されてい h u 1 S F, e t a 1 J Mo l B i o l 0 3 1 9 9 0 ) 。 B LAS T Nを用いて塩基配列を解 ノ、ラメ一夕一は 例えは s c o r e = 1 0 0 wo r d l 1 2とする。 また B L AS TXを用いてアミ ノ酸配列 は ハラメーターは 例えは s c o r e = 5 0 wo r d = 3とする。 B LAS Tと G a p p e d B L A S Tフロ る場合は 各フロクラムのテフオルトハラメーターを用 本明細書中 「かん治療剤」 という用語は 抗癌剤 癌細胞のァホトーノス誘導剤 癌細胞の増殖抑制剤 癌 剤 かん予防剤等を含む意味て使用される。 なお 本願 「癌 (または かん) 」 と 「腫瘍」 とは同し意味を有する 用される。 The DUSP 15 protein used in the present invention can be prepared from the cells and tissues. In addition, this material can be synthesized by a known hematopoietic synthesizer, or can be prepared by reversion using an appropriate host cell selected from eukaryotes. DUSP 15 used in the present invention may be derived from either species. Preferably, it is derived from human. “Substantially the same quality of active life” indicates their activity or property. Therefore, the enzyme activity (flotinthyronone activity tt and serine threonine-specific phosphatase activity (for example, about 0 0 1 to 100 0 times preferably about 0 5 1) Whether it should be performed in accordance with the known method described in the document “Nanato” is measured according to the screening method described later. The identity of the amino acid sequence and the base sequence is determined by the alcoholic B LAST T (proc N atl S ci U SA 8 7 2 2 64-2 2 6 8 1 9 9 0 at 1 A cad S ci USA 9 0 5 8 7 3 Determined based on B LAS T alcoholism A fukuro crumb called BLASTX has been developed hu 1 SF, eta 1 J Mol Biol 0 3 1 9 9 0). The base sequence is resolved using B LAS TN. For example, score = 1 0 0 wordl 1 2 is used. Also, using BL AS TX, the amino acid sequence is halometer, for example, score = 50 wo rd = 3. B LAST and G apped BLAST When using the tephortohalameter of each flocrum In this specification, the term “cane treatment agent” is used as an anticancer agent, a cancer cell aphotonos inducer, a cancer cell growth inhibitor, a cancer agent, an antiepileptic agent Used to mean including the like. Note that the terms “cancer” and “tumor” in this application have the same meaning.
1 1 DUS Ρ 1 5遺伝子の発現阻害物質を含有する 本発明は 1つの実施形態において DUS Ρ 1 5遺
DU S P 1 5遺伝子から DU S P 1 5 m R N Aへの 物質の例としては 1 1 DUS Ρ 1 5 containing an expression inhibitor of the gene The present invention is, in one embodiment, DUS Ρ 1 5 Examples of substances from DU SP 15 gene to DU SP 15 mRNA
(a) DU S P 1 5遺伝子またはその一部に対するアン (a) An DU S P 15 gene or part of it
(b) DU S P 1 5遺伝子またはその一部に対するテコ ( c ) DU S P 1 5遺伝子またはその一部に対してトミ フに作用する DU S P 1 5遺伝子変異体 あるいは (b) leverage for DU S P 15 gene or part thereof (c) DU S P 15 gene variant that acts as a mimic for DU S P 15 gene or part thereof or
(d) その他の転写阻害化合物 (d) Other transcription inhibitor compounds
なとか含まれる。 Somehow included.
また DUS P 1 5 mRNAから DUS P 1 5タン を阻害する物質の例としては Examples of substances that inhibit DUS P 1 5 tan from DUS P 1 5 mRNA
( e ) DU S P 1 5 mRNAまたはその一部に対して 有するホリヌクレオチ 卜 (例えは s 1 RNA) (e) Horinucleo 卜 possessed by DU S P 15 mRNA or a part thereof (eg s 1 RNA)
( f ) DU S P 1 5 mRNAまたはその一部に対する リヌクレオチ卜 (f) Renucleotide for DU S P 15 mRNA or a part thereof
(g) DU S P 1 5 mRNAまたはその一部に対してリ を有するホリヌクレオチ卜 あるいは (g) Horinucleotipox having L for DU S P 15 mRNA or a part thereof or
(h) その他の翻訳阻害化合物 (h) Other translation inhibitor compounds
なとか含まれる。 Somehow included.
本明細書中 「核酸」 とは RNAまたは DNAを意味 う 「核酸」 は フリ ンおよひヒリ ミ ンン塩基を含有する 飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含ん こう した修飾物は メチル化されたフリ ンおよひヒリミ されたフリ ンおよひヒリ ミンン ァノル化されたフリンお
1 効果により阻害する作用を有する核酸を有効成分とし てきる。 RNA i とは 標的遺伝子配列と同一もしくは 有する二重鎖 R N Aを細胞内に導入すると 導入した外 檸的内在 I生遺伝子の発現かいずれも阻害される現象のこ て用いられる RNAとしては 例えは 1 9〜 3 0塩基 を生ずる二重鎖 RN A 例えは d s RNA (d o u b l n d R A) s i RNA ( s m a l l i n t e r RNA) 又は s h RNA ( s h o r t h a i r p i n けられる。 このような RNAは リホソームなとの迗達 所望の部位に局所送達させることも可能てあり また上 か生成されるようなヘクターを用いてこれを局所発現さ る。 このような二重鎖 RN A (d s RNA s i RNA A) の調製方法 使用方法なとは 多くの文献から公知 In the present specification, “nucleic acid” means RNA or DNA. “Nucleic acid” includes such modifications as those having other heterocyclic bases decorated with furin and hydrin bases. The product consists of methylated and / or liminated furin and / or lyminylated and furanized furin. 1 Nucleic acids that have an inhibitory effect are used as active ingredients. What is RNA i? When a double-stranded RNA that is the same as or has the target gene sequence is introduced into a cell, the introduced external endogenous I gene is inhibited. Double-stranded RNA that generates 9 to 30 bases For example, ds RNA (doublnd RA) siRNA (small inter RNA) or sh RNA (shorthairpin). Such RNA is localized to the desired site. It can also be delivered and expressed locally using a hector that is generated above How to prepare such a double-stranded RNA (dsRNA siRNA A) Known from
0 0 2 r-0 0 2 r-
― Ο 1 6 0 6 2号 米囯公開許第 2 0 0 2. / 0 口 Ν a t u r e G e n e t i c s 2 4 ( 2 ) , ― Ο 1 6 0 6 2 US 囯 Open Permit 2 0 0 2. / 0 Ν a tur ge gen tic s 2 4 (2),
1 8 0一 1 8 3 G e n e s ι s 2 6 ( 4 ) 1 8 0 1 1 8 3 G e ne s ι s 2 6 (4)
2 4 0一 2 4 4 N a t u r e S p e 2 1 4 0 7 2 4 0 1 2 4 4 N at u r e S p e 2 1 4 0 7
3 1 9一 2 0 G e n e s & D e v V o 1 3 1 9 1 2 0 G e n e s & D e v V o 1
A p r 1 6 94 8 - 9 5 8 P r o c N a t 1 A p r 1 6 94 8-9 5 8 P r o c N at 1
S c 1 U S A 9 9 (8 ) 1 6 Ap r 5 S c 1 U S A 9 9 (8) 1 6 Ap r 5
2 0 S C l e n c e , 2 9 6 ( 5 5 6 7 ) , 1 9 2 0 S C l e n c e, 2 9 6 (5 5 6 7), 1 9
5 5 0 - 5 5 3 P r o c N a t 1 A c a d 5 5 0-5 5 3 P r o c N at 1 A c a d
S A A P r 3 0 9 9 9, 6 04 7 - 6 0 5 2
〜 2 5塩基 最も好ましくは 2 1〜 2 3塩基てある。 本 具体的には 下記 s 1 RNA (実施例 3て使用) を用い SAAP r 3 0 9 9 9, 6 04 7-6 0 5 2 ˜25 bases Most preferably 2 1-2 bases. Specifically, using the following s 1 RNA (used in Example 3)
(表 1 ) (table 1 )
s 1 R N A配列 s 1 R N A sequence
本明細書中 「アンチセンス核酸」 または 「アンチ レオチト」 とは ある対象となる DNA領域の少なく と なホリヌクレオチトを有し そのホリヌクレオチトか当 とも一部とハイフリ夕イスすることかてきる核酸のこと のアンチセンス核酸は RNA DNA あるいは修飾 N A D A) てある 本発明のアンチセンス核酸は あるいは修飾された核酸 (RNA DN A) てある。 そ N A 一本鎖 DNA 二本鎖 RNA —本鎖 RNA さ NAハイフリ ノ トてあってもよい。 修飾された核酸の具 核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一 ト誘導体 さらには
か持つ内在 遺伝子またはその一部と相補的な配列てあ いか 遺伝子の発現を有効に抑制てきる限りにおいて なくてもよい In this specification, “antisense nucleic acid” or “anti-leocyto” refers to having at least a small number of horinucleotide in a target DNA region, and having a high frequency with the horinucleotide or part of it. The antisense nucleic acid, which is a nucleic acid, is RNA DNA or modified NADA) The antisense nucleic acid of the present invention is alternatively a modified nucleic acid (RNA DNA). NA Single-stranded DNA Double-stranded RNA — Double-stranded RNA may be NA hyphenated. Modified nucleic acid ingredients Sulfur derivatives of nucleic acids thiophosphite derivatives It does not need to be a sequence complementary to the endogenous gene or a part of it, as long as it effectively suppresses the expression of the gene.
例えは DU S P 1 5遺伝子の mRN Aの 5 ' 端近傍 相補的なアンチセンス配列を設計すれは 遺伝子の翻訳 ある。 コー ト領域もしくは 3 ' 側の非翻訳領域に相補的 ることかてきる。 遺伝子の翻訳阻害に効果的なアンチセ 的遺伝子の転写産物に対して約 7 0 %以上 好ましくは より好ましくは約 9 0 %以上 最も好ましくは約 9 5 % 有する。 For example, design of a complementary antisense sequence near the 5 'end of mRNA of DU S P 15 gene is gene translation. Complement to the coat region or 3 'untranslated region. About 70% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more of the transcript of the antisense gene effective for inhibiting gene translation.
アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的 アンチセンス核酸の長さは少なく とも約 1 0塩基以上 ( 40個程度) 好ましくは杓 1 5塩基以上てあり より 0 0塩基以上てあり さらに好ましくは約 5 0 0塩基以 チセンス核酸は公知の文献を参昭して設計することかて 平島およひ井上 新生化学実験講座 2 核酸 I V遺伝子 日本生化学会編 東京化学同人 1 9 9 3 p 3 1 9 K a w a k a m 1 e t a 1 P h a r m T e c h V o l 8 p 2 4 7 1 9 9 2 V o l 8 p 3 2 S T C r o o k e e t a 1 e d s e R e s e a r c h a n d Ap p l i c a t i o P r e s s 1 9 9 3なと参^) 。 Effective expression of target gene using antisense nucleic acid The length of antisense nucleic acid is at least about 10 bases (about 40), preferably 15 bases or more, more preferably 0 bases or more. Is it possible to design a nucleic acid with a length of about 500 bases or less by referring to the publicly known literature? Hirashima and Inoue New Chemistry Laboratory 2 Nucleic acid IV gene Japanese Biochemical Society Tokyo Chemical Dojin 1 9 9 3 p 3 1 9 K awakam 1 eta 1 P harm T ech V ol 8 p 2 4 7 1 9 9 2 V ol 8 p 3 2 STC rookeeta 1 edse Research and Ap plicatio Press 1 9 9 3
また 本発明のかん冶療剤においては DU S P 1 5
程度の活 トメインを有するものもある (タンハク質核 0 3 5 p 2 1 9 1 ) 。 ノ、ンマーへ ノ ト型リホサイ 例えは F E B S L e t t , 1 9 8 8 , 2 2 8 , p S L e t t 1 9 8 8 2 3 9 p 2 8 5 タンハ 1 9 9 0 3 5 p 2 1 9 1 N υ c 1 A c i d s 8 9 1 7 p 7 0 5 9なとを参昭することかてきる ン型リホサイムについては 例えば N a t u r e 1 p 3 4 9 N u c 1 A c i d s R e s 1 9 9 1 7 5 1 菊池洋 化学と生物 1 9 9 2 3 0 p 1 することかそきる。 このようなリホサイムを用いて本発 S P 1 5遺伝子の転写産物を特異的に切断することて を阻害することかてきる。 In addition, in the cane remedy of the present invention, DU SP 15 Some have active domains (tankaku nucleus 0 3 5 p 2 1 9 1). Note: Reversing note type FEBSL ett, 1 9 8 8, 2 2 8, p SL ett 1 9 8 8 2 3 9 p 2 8 5 Tanha 1 9 9 0 3 5 p 2 1 9 1 N υ c 1 A cids 8 9 1 7 p 7 0 5 9 For example, N type 1 p 3 4 9 Nuc 1 A cids R es 1 9 9 1 7 5 1 Hiroshi Kikuchi Chemistry and Biology 1 9 9 2 3 0 p 1 Using such a rehothyme, it is possible to specifically inhibit the transcript of the original SP 15 gene.
さらに 本発明は DU S P 1 5遺伝子の転写活 を 外の化合物を有効成分として用いることかてきる その 例えは DUS P 1 5遺伝子の発現 転写に関与する因 合物てある。 このような化合物は 天然物ても合成化合 のような化合物は 後述のスク リーニンク方法によって か可能てある。 1 2 DU S P 1 5タンハク質の活性阻害物質を含有 M Furthermore, the present invention can use the transcription activity of the DU S P 15 gene as an active ingredient. For example, it is a factor involved in the expression and transcription of the DUS P 15 gene. Such a compound is a natural product, but a compound such as a synthetic compound can be obtained by the screening method described later. 1 2 DU S P 1 5 Contains protein inhibitor of protein activity M
本発明はまた 別の実施形態において DU S P 1 5 性阻害物質を含有するかん治療剤を提供する
異体を除く) In another embodiment, the present invention provides a therapeutic agent for epilepsy comprising a DU SP 15 inhibitory substance Excluding foreign bodies)
なとか含まれる。 Somehow included.
本明細書における 「抗体」 とはタンハク質の全長又は 抗体を意味する。 本発明の抗体の形態には 特に制限は DU S P 1 5タンハク質に結合する限り 上記ホリ クロ ノクローナル抗体のほかに ヒ ト抗体 遺伝子組み換え 抗体 さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。 D ハク質に結合する抗体 (抗 DU S P 1 5抗体) は 当業 により調製することか可能てある。 なお 抗 DU S P 1 5 ついては後述する。 As used herein, “antibody” means the full length of a protein or an antibody. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it binds to DU S P 15 protein, but also includes a human antibody, a recombinant antibody, an antibody fragment, and an antibody modification product in addition to the above-mentioned monoclonal antibody. Antibodies that bind to D protein (anti-DU S P 15 antibody) can be prepared by those skilled in the art. Anti-DU S P 15 will be described later.
本明細書における 「DUS P 1 5タンハク質に対して ティフの性質を有する DUS P 1 5タンハク質変異体」 一卜する遺伝子を発現させることによって 内在 ftの野 5タンハク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有 を指す (土田邦博著 遺伝子の活性阻害実験法 多比良 ( 2 0 0 1 ) 2 6 - 3 2なと参昭) 。 In this specification, “DUS P 1 5 protein mutant with Tiff properties against DUS P 1 5 protein” By expressing a glanced gene, the activity of endogenous ft field 5 protein is lost or reduced. (Kunihiro Tsuchida, Gene Activity Inhibition Experiment Method Tahira (2 0 0 1) 2 6-3 2 Natto).
さらに 本発明においては DU S P 1 5夕ン八ク質 得る物質として DU S P 1 5タンハク質に結合する 変異体以外の化合物を有効成分として用いることかてきる 化合物は 例えは DU S P 1 5タンハク質に結合し する化合物てある。 このような化合物は 天然物ても合 い このような化合物は 後述のスクリーニンク方法によ ることか可能てある。 Further, in the present invention, a compound other than a mutant that binds to DU SP 1 5 protein can be used as an active ingredient as a substance to obtain DU SP 1 5 protein. Is a compound that binds to Such compounds may be natural products. Such compounds can be obtained by the screening method described later.
一つの好ましい態様は DU S P 1 5タンハク質と被 合を指標とする方法てある。 通常 DU S P 1 5タンハ 化合物は DU S P 1 5タンハク質の活性を阻害する効 か期待される。 ここて 該化合物は DU S P 1 5タン 位に結合することか好ましい 本方法においては ます タンハク質と被検化合物とを接触させる。 DU S P 1 5 被検化合物との結合を検出するための指標に応して 例 1 5タンハク質の精製された形態 細胞内または細胞外 あるいはァフィ二ティーカラムに結合した形態てあり得 用いる被検化合物は必要に応して適宜檸識して用いるこ 識としては 例えば 放射檸識 蛍光檸識等を挙けるこ 本方法においては 次いて DU S P 1 5夕ンハク質 の結合を検出する。 One preferred embodiment is a method using DU S P 15 protein and exposure as indicators. In general, DU S P 15 tantalum compounds are expected to be effective in inhibiting the activity of DU S P 15 protein. Here, the compound is preferably bound to the DU S P 15 position. In this method, the protein is further brought into contact with the test compound. DU SP 1 5 In response to an indicator for detecting binding to a test compound Example 1 5 Purified form of protein Intracellular or extracellular or bound to an affinity column For example, radiation knowledge, fluorescence knowledge, etc. can be given as necessary for the knowledge of compounds used as needed. In this method, the binding of DU SP 15 protein is detected next.
本方法に用いる被検化合物としては 特に制限はない。 化合物 有機化合物 無機化合物 タンハク質 へフチ 合物 並ひに 化合物ライフラリー 遺伝子ライフラリ 細胞抽出物 細胞培養上/青 発酵微生物産生物 海/羊生 抽出物等か挙けられるか これらに限定されない。 There is no restriction | limiting in particular as a test compound used for this method. Compound Organic compound Inorganic compound Tanhaku Hefti Compound As well as Compound life rally Gene library Cell extract On cell culture / blue Fermentation microbial product Sea / sheep extract Extracts etc. are not limited to these.
DU S P 1 5タンハク質と被検化合物との結合は 例 1 5夕ンハク質に結合した被検化合物に付された椁識に ことかてきる。 また 細胞内または細胞外に発現してい タンハク質への被検化合物の結合により生しる DU S P 1
活 ttを阻害する被検化合物を選択する。 The binding of DU SP 1 5 protein to the test compound depends on the knowledge attached to the test compound bound to Example 1 5 protein. In addition, DU SP 1 is generated by the binding of the test compound to the protein that is expressed intracellularly or extracellularly. Select a test compound that inhibits activity.
本方法により卓離される化合物は かん抑制作用を有 され かん治療剤として有用てある。 The compounds separated by this method have an anti-epileptic effect and are useful as therapeutic agents.
本発明のスク リ一ニンク方法の他の態様は D U S P 現を指檸とする方法てある In another aspect of the present invention, the screen linking method is based on D U S P current.
本方法においては まず D U S P 1 5遺伝子を発現 検化合物を接触させる。 用いられる 「細胞」 の由来とし ウス 不コ ィヌ ウノ ヒソン トリなと へノ ト る細胞か挙けられるか これら由来に制限されない。 「 伝子を発現する細胞」 としては 内因性の D U S P 1 5 ている細胞 または外因 の D U S P 1 5遺伝子か導入 か発現している細胞を利用することかてきる。 外因性の 伝子か発現した細胞は 通常 それそれ D U S P 1 5遺 た発現ヘクターを宿王細胞へ導入することにより作製す 該発現へクタ一は 一般的な遺伝子工学技術によって作 きる。 In this method, the DUSP 15 gene is first expressed and contacted with a test compound. It is not limited to the origin of the “cell” used, whether it is a cell that can be used as a source of the cell. As a “cell expressing a gene”, a cell having an endogenous DUSP 15 or a cell expressing or expressing an exogenous DUSP 15 gene can be used. Cells expressing an exogenous gene are usually prepared by introducing the expression vector left in D U S P 15 into the Sukuo cells. The expression vector can be produced by general genetic engineering techniques.
本方法に用いる被検化合物としては 特に制限はない 然化合物 有機化合物 to機化合物 タンハク質 へフ 化合物 並ひに 化合物ライフラリー 遺伝子ライフラリ 細胞抽出物 細胞培養上凊 発酵微生物産生物 海洋生 抽出物等か用いられる。 Natural or compounds organic compounds to motor Compound Tanhaku compound off compound Namihi to quality life Larry Gene Raifurari cell extract Cell culture凊products of fermenting microorganisms marine raw extract or the like is not particularly limited test compounds to be used in the process Used.
D U S P 1 5遺伝子を発現する細胞への被検化合物の 常 それそれ D U S P 1 5遺伝子を発現する細胞の培養
とかてきる。 例えは DUS P 1 5遺伝子を発現する細 を常法に従って抽出し この mRN Aを铸型としたノー イセーノヨ ン法または RT_ P C R法を実施することに の転写レヘルの測定を行うことかてきる。 あるいは D 子のフロモーター領域を常法に従って卓離し その下 (例えば ルンフェラーセ G F P カラク トン夕ーセ 発色なとを指標に検出可能な遺伝子か挙けられるか こ ない) をつなけ その桴識遺伝子の活性を見ることによ の転写レヘルの測定を行う ことかてきる。 また DUS 発現する細胞からタンハク質画分を回収し それそれ D ハク質の発現を S D S— P AG E等の電気冰動法て検出 遺伝子の翻訳レヘルの測定を行うこともてきる。 さ らに タンハク質に対する抗体を用いて ウエスタンフロ ノティ することにより該夕ンハク質の発現を検出することによ 訳レヘルの測定を行う ことも可能てある。 DU S P 1 5 出に用いる抗体としては 検出可能な抗体てあれは 特 例えはモノクローナル抗体 またはホリクローナル抗体 ることかてきる。 Test compound in cells expressing DUSP 15 gene Normal culture of cells expressing DUSP 15 gene I will come. For example, it is possible to extract the cells expressing DUS P 15 gene according to a conventional method, and measure transcriptional reherence by carrying out the Noisen-Yon method or RT_PCR method using this mRNA as a cocoon. Or, separate the D motor's floor motor region according to the usual method, and connect it below (for example, a gene that can be detected using Lunferase, GFP, and other colors as an indicator). It is possible to measure transcriptional rehering by observing the activity. It is also possible to collect the protein fraction from DUS-expressing cells and to measure the expression of D-molecules by electro-peristalsis such as SDS-PAGE. Furthermore, it is also possible to measure the translational reher by detecting the expression of the porphyra by Western blotting using an antibody against the porphyra. The antibodies used for DU SP 15 may be detectable antibodies, specifically monoclonal antibodies or polyclonal antibodies.
本方法においては 次いて 被検化合物を接触させな ロール) と比較して 該発現レヘルを低下させる化合物 のようにして選択された化合物は かん治療剤のための
3 1 抗 DUS P 1 5抗体 In this method, the compound selected as a compound that decreases the expression level compared to a roll that is not contacted with a test compound is 3 1 Anti-DUS P 1 5 antibody
本明細書中 「抗 DU S P 1 5抗体」 には DU S P 1 (その断片 (部分へフチ卜) もしくはその塩を含む) に る抗体か含まれる。 本発明において使用する抗 DU S P 1 リクローナル抗体てあってもよいし モノクローナル抗 レ 。 抗体のクラスは 特に限定されず I g G I gM D または I g E等のいすれのァイソタイフを有する抗 好ましくは I g Gまたは I gMてあり 精製の容易性 より好ましくは I g Gてある。 また ここていう 「抗体」 任意の抗体断片または誘導体を含む意味て用いられ 例 F a b 2 CDR ヒ ト化抗体 多機能抗体 単鎖抗 なとを含む。 本発明の抗体は 公知の方法て製造するこ のような抗体の製造法は当該分野て周知てある (例えは E & L a n e D An t i b o d y C o l n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e 8) を参昭) 。 As used herein, “anti-DU SP 15 antibody” includes antibodies that are DU SP 1 (including fragments (partial edge) or salts thereof). The anti-DU SP 1 reclonal antibody used in the present invention may be a monoclonal antibody. The class of the antibody is not particularly limited, and anti-preferably having IgA type such as IgGIgMD or IgE is preferably IgG or IgM, and more easily IgG, more preferably IgG. The term “antibody” used herein is meant to include any antibody fragment or derivative, and includes, for example, Fab 2 CDR-humanized antibody, multifunctional antibody, and single-chain antibody. Antibody production methods of the present invention are well known in the art, such as the production of antibodies by known methods (see, for example, E & Lane Danantibody Collaborative Laboratory Laboratory 8). .
( 1 ) 抗原の調製 (1) Preparation of antigen
本発明にあいて 感作抗 ITとして使用されるタンハク U S P 1 5夕ンハク質またはその塩てある。 上記 D U S P 質には その部分へフチトも含まれ これは 限定される 例えは 配列番号 2のアミノ酸配列の断片てあって 例 上 4 0個以上 6 0個以上 8 0個以上 1 0 0個以 アミノ酸配列部分を有する部分へフチトてある。 これら
との塩 あるいは有機酸 (例えは 酢酸 キ酸 フロヒ なとか用いられる。 抗体取得の感作抗原として使用され S P 1 5タンハク質は その由来となる動物種に制限さ 物 例えはマウス ヒ ト由来のタンハク質か好ましく タンハク質か好ましい。 In the present invention, the tanned USP 15 used as a sensitizing anti-IT or a salt thereof. The above DUSP quality also includes a margin in its part. This is limited. For example, it is a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, eg, 40 or more 60 or more 80 or more 100 or more amino acids The part has a sequence part. these Salt or organic acid (for example, acetic acid, quinic acid, flohy, etc.) Used as a sensitizing antigen for antibody acquisition, SP 15 is restricted to the animal species from which it is derived. Tanja or preferred Tancho or preferred.
( 2 ) DU S P 1 5夕ンハク質に対するモノクローナル (2) DU S P 1 5 Monoclonal protein
( I ) 抗体産生細胞の採取 (I) Collection of antibody-producing cells
上記のような D U S P 1 5タンハク質 その部分へフ (本明細書中 抗体に関する説明ては これらをまとめ 1 5タン八 質」 という ) を抗原として 哺乳動物 マウス ゥサキなとに投与する。 抗原の動物 1匹当たり ノュハントを用いないときは 0 1〜 1 0 Omgてあり を用いるときは 1〜 1 0 0 ^ gてある。 ァノュハン 卜と ント完全ァ ノュハン ト (F CA) フロイント不完全ア I A) 水酸化アルミニウムァノュハン ト等か挙けられ として静脈内 皮下又は腹腔内等に汪入することにより 免疫の間隔は特に限定されず 数日から数週間間隔 好 週間間隔て 1〜 1 0回 好ましくは 2〜 5回免疫を行 終の免疫日から 1〜 6 0 日後 好ましくは 1〜 1 4日後 を採集する。 抗体産生細胞としては 脾臓細胞 リ ンハ 細胞等か挙けられるか 脾臓細胞又は局所リ ンハ節細胞 The above-mentioned DUPSP 15 protein is administered to a mammal mouse as an antigen using the portion of the protein (in this specification, these are collectively referred to as 15 protein) as an antigen. When no hunt is used per animal of antigen, 0 1 to 10 Omg is used, and when using no hunt, 1 to 100 ^ g is used. Quantum immunity is limited by insertion into the subcutaneous or intraperitoneal cavity as an example of aluminum hydroxide cultivated. Not every few days to several weeks Good weekly intervals 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times Immunization 1 to 60 days after the last immunization day, preferably 1 to 14 days after is collected. Can spleen cells or lymph cells be listed as antibody-producing cells? Spleen cells or local lymph node cells
( I I ) 細胞融合 (I I) Cell fusion
ハイフリ トーマを得るため 抗体産生細胞とミエロー
NS I / 1 -A g 4 - 1 S 0 / 1なとのマウスミエ YB 2 0なとのラ ノ トミエロ一マ細胞株か挙けられ 次に 上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融 融合は 血清を含まない DMEM R PM I — 1 6 40 細胞培養用培地中て 1 1 06〜 1 1 07個 111 1 と 2 X 1 0 5〜 2 X 1 0 6個 Zm lのミエローマ細胞と 産生細胞とミエローマ細胞との細胞比 2 1〜 3 1か 胞融合促進剤存在のもとて融合反応を行う 細胞融合促 均分子量 1 0 0 0〜 6 0 0 0タルトンのホリエチレンク 用することかてきる。 また 電気刺激 (例えはエレク ト ン) を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細 細胞とを融合させることもてきる。 Antibody-producing cells and myelo to obtain hyphenoma NS I / 1 -A g 4-1 S 0/1 and mouse mye YB 2 0 and myroma myeloma cell line are listed Next, cell fusion between the above myeloma cells and antibody producing cells Serum-free DMEM R PM I — 1 6 40 1 1 0 6 to 1 1 0 7 cells 111 1 and 2 X 1 0 5 to 2 X 1 0 6 cells and production of Zm l myeloma cells Cell ratio of cells to myeloma cells 2 1 to 3 1 Carry out fusion reaction in the presence of a cell fusion promoter Cell fusion promotion Average molecular weight 1 0 0 0 to 6 0 0 0 . It is also possible to fuse antibody-producing cells using commercially available cell fusion devices that utilize electrical stimulation (eg, electon).
( i l l ) ハイフリ トーマの選別及ひクローニンク 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイフリ トーマ の方法として 細胞11濁液を例えはゥシ胎児血凊含有 R 0培地なとて適当に希釈後 マイクロタイ夕ーフレー ト 個ノ we 1 1程度まき 各ゥエルに選択培地を加え 以 地を交換して培養を行う。 その結果 選択培地て培養開 後から生育してく る細胞をハイフリ トーマとして得るこ 次に 増殖してきたハイフリ トーマの培養上凊中に ンハク質に反応する抗体か存在するか否かをスクリーニ フリ トーマのスクリ一ニンクは 通常の方法に従えはよく れるものてはない。 例えは ハイフリ トーマとして生育
上記のようにして得たハイフ リ トーマからモノクロー する方法として 通常の細胞培養法又は腹水形成法等を てきる。 細胞培養法においては ハイフリ トーマを 1 0 含有 PM I - 1 6 4 0培地 ME M培地又は魅血凊培 培養培地中て 通常の培養条件 (例えは 3 7 °C 5 % 7〜 1 4日間培養し その培養上清から抗体を取得する。 場合は ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の リ トーマを約 1 X 1 07個投与し ハイフリ トーマを大 そして 1〜 2週間後に腹水を採取する。 上記抗体の採 抗体の精製か必要とされる場合は 硫安塩析法 イオン ラフィ一 ケル濾過 ァフィ二ティークロマトクラフィ 方法を適宜選択して 又はこれらを祖み合わせることに とかてきる。 (ill) Selection of hybridomas and clones As a method of target hybridomas from cells after cell fusion treatment, cells 1 1 Suspension, for example, R 0 medium containing urchin fetal clot After appropriate dilution Micro Thailand evening frame Individual we 1 We fire about 1 1 Add selective medium to each well and change the ground to culture. As a result, the cells that grow after the start of culture in the selective medium are obtained as hyphritoma. Next, whether or not antibodies that react with the protein are present in the culture medium of the proliferated hyphritoma. Screening ning is not good following normal methods. For example, it grows as a hyphenoma A normal cell culture method or ascites formation method or the like is used as a method for monochromating from the thus obtained hy- toroma. In the cell culture method, PM I-16 40 medium containing hyphritoma 10 medium culture medium or charming culture medium culture medium (for example, 3 7 ° C 5% 7 to 14 days) to be obtained from the culture supernatant antibody. If ascitic fluid is taken approximately 1 X 1 0 7 or administered Haifuri Tomah re Thoma mammalian the same species animal-derived myeloma cells to atmospheric and 1 after 2 weeks Collecting the above-mentioned antibodies If purification of the antibody is required, the ammonium sulfate salting-out method, ion raffi-el filtration, affinity chromatography method can be selected as appropriate, or these can be combined.
( 3 ) DU S P 1 5夕ンハク質に対するホリクローナル まず 上記した抗原を哺乳動物 例えはラ ノ ト マウ に投与する。 抗原の動物 1匹当たりの投与量は ァシュ いときは 0 l〜 1 0 0 mgてあり ァノュハントを用 〜 1 0 0 0 gてある。 ァノュハントとしては フロイ ハント (F CA) フロイン卜不完全ァノュハント (F I アルミニウムァノュハン ト等か挙けられる。 免疫は 王 皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。 また 特に限定されす 数日から数週間間隔 好ましくは 2〜 1〜 1 0回 好ましくは 2〜 5回免疫を行う そして
ンハク質て固定されたァフィ二ティーカラムにかけて D ハク質と反応する抗体 (カラム吸着画分) を採取する。 ンハク質に対する抗血凊中のホリクロ一ナル抗体の反応 A法なとて測定することかてきる。 (3) Horizon for DU SP 15 matrix First, the above antigens are administered to mammals, such as Rantoumau. The dose of the antigen per animal is 0 l to 100 mg when used, and 10 g is used for ananhunt. Freund Hunt (F CA) Freund 卜 Incomplete Hanu Hunt (FI Aluminum Hanu Hunt, etc.) can be listed as an immun hunt. Immunization is performed by injection into the king skin or intraperitoneal cavity. Every few weeks, preferably 2 to 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times and Collect the antibody that reacts with D protein (column adsorbed fraction) on an affinity column that is fixed with protein. Reaction of polyclonal antibody in anti-blood clots to algae.
(4) 抗体の断片なと (4) Antibody fragments
F a bまたは F a b, 2断片は 従来の方法によるフ えは へフンンまたはハハイン) を用いた消化により作 きる。 ヒ ト化抗体は 例えば R i e c hma n nら (R i n J Mo l B i o l O c t 5 2 0 3 (3 ) 1 9 8 8 ) およひ J o n e s ら ( J o n e s ら N a t 1 5 2 2 - 5 2 5 1 9 8 6 ) に記載のような方法の 1 することかてきる。 F ab or F ab, 2 fragments can be prepared by digestion using conventional methods. Humanized antibodies are described, for example, by Riec hma nn et al. (R in J Mol Biol Oct 5 20 3 (3) 1 9 8 8) and J ones et al. (J ones et al. Nat 1 5 2 2- 5 2 5 1 9 8 6) It is possible to use one of the methods described in 1).
また キメラ抗体は 例えは 「実験医学 (臨時増刊 1 6, N o 1 0 1 9 8 8」 特公平 3— 7 3 2 8 0 ヒ ト化抗体は 例えは 「 N a t u r e G e n e t i c 1 5 , p 1 4 6 - 1 5 6 1 9 9 7」 「 N a t u r e l c s V o l 7 p 1 3 - 2 1 1 9 9 4」 特 3 6 5号公報 国際出願公開 W〇 9 4 2 5 5 8 5号公 ィエンス 6月号 第 4 0〜第 5 0頁 1 9 9 5年」 V o l 3 6 8, p 8 5 6 - 8 5 9 , 1 9 9 4」 特 2 3 3号公報等を参考にそれそれ製造することかてきる。 S P 1 5タンハク質に結合する抗体は 例えは 癌細胞 転移の抑制等を目的とした使用か考えられる。 得られた
不一ト ロー夕ミン フィコエリ トリ ンおよひフルォレ 同様に 生体発光性化合物を用いて 抗体 DU S P 1 5 こともてきる。 生体発光性タンハク質の存在は 蛍光の ことによって測定される。 この檸識目 «に重要な生体発 ルノフエリ ン ルノフエラーセおよひイエクオリンてあ なお 本発明の抗体は 体液ゃ祖織なとの被検体中に P 1 5タンハク質等を特異的に検出するために使用する また DU S P 1 5夕ンハク質等を精製するために使用 の作製 精製時の各分画中の DU S P 1 5タンハク質等 胞内における DUS P 1 5タンハク質の挙動の分析なと ることかてきる。 Chimeric antibodies are, for example, “Experimental Medicine (Special issue 16, No 1 0 1 9 8 8”). Equity 3— 7 3 2 8 0 Human antibodies are, for example, “Nature Genetic 1 5, p 1 `` 4 6-1 5 6 1 9 9 7 '' `` Naturelcs Vol 7 p 1 3-2 1 1 9 9 4 '' Special 3 6 5 Gazette International Application Publication W 0 9 4 2 5 5 8 5 G Monthly Nos. 40 to 50, 1 9 9 5 "V ol 3 6 8, p 8 5 6-8 5 9, 1 9 9 4" An antibody that binds to SP 15 protein may be used for the purpose of suppressing cancer cell metastasis, etc. In the same way, the antibody DU SP 15 can be obtained using bioluminescent compounds as well as phycoerythrin and fluoride. The presence of bioluminescent protein is measured by fluorescence. This knowledge is important for the biologically generated renoferrin, linofelase, and aequorin. The antibody of the present invention is used to specifically detect P 15 protein etc. in a sample of body fluid. Used and also used to purify DU SP 1 5 protein etc. DU SP 1 5 protein in each fraction during purification Analyzes the behavior of DUS P 1 5 protein in cells I will come.
3 2 抗 DUS P 1 5抗体を含有する複合体なと また 本発明において使用する抗 DU S P 1 5抗体は 剤または診断剤において それ自体か 抗原の活性を减 中和活性を有する薬剤 (a g e n t ) てあり得るか 必 療¾果を奏するための他の葉剤と組み合わせて用いること たかって 本発明は もう一つの態様において かん ( ん) の檸的化療法または檸的化ィメーンンク等に使用する US P 1 5抗体と他の某剤との複合体 そのような複合 成物なとをも提供する。 このような態様によれば 本発 する抗 DU S P 1 5抗体を用いて 治療効果を奏する他 断のための標識剤なとを DU S P 1 5タンハク質を高
ヨウ素— 1 2 5 C1 25 I ) およひヨウ素— 1 3 1なと ン元素か挙けられる。 これらの放射性ハロゲン元素も上 元素と同様に抗体やへフチトに檸識して 放射 ft治治療 tt診断剤として広く利用し得る。 例えは 1 25 I または1 ト化は クロラミン T法等の公知の方法により 抗体ま 結合させることかてきる。 さらに 診断用としてはテク m イ ンンゥム一 1 1 1およひカリ ウム一 6 7 (6 7 G a 治療用としてはイ ノ トリ ウム一 9 0 ( 9 0 Y) レニウム 6 R e ) またはレニウム一 1 8 8 (1 88R e ) なとか使用 射性同位元 を用いて抗体に標識する場合には 通常 か用いられる。 金属キレート剤としては EDTA D ノ ンチォ化合物 サイクラム およひ DOTAなとか知 れらのキレート剤は抗体に予め結合しておき その後放 する場合と 放射性金属キレートを形成後 抗体に結合 法かある。 3 2 Anti-DUS P 15 antibody complex or anti-DU SP 15 antibody used in the present invention is an agent or a diagnostic agent itself or an agent having a neutralizing activity. Therefore, the present invention is used in another embodiment for use as an addictive therapy or addictive drug in the US. Complexes of P 15 antibody and other glazes are also provided. According to such an embodiment, the anti-DU SP 15 antibody of the present invention is used as a labeling agent for the determination of the therapeutic effect. Iodine-1 2 5 C 1 25 I) and iodine-1 3 1 As with the above elements, these radiohalogen elements can be widely used as diagnostic agents for radiation therapy and knowledge of antibodies and hefty. For example, 1 25 I or 1 can be conjugated to an antibody by a known method such as the chloramine T method. In addition, for diagnostic purposes, tech m indium 1 1 1 and potassium 1 6 7 ( 6 7 Ga for treatment use indium 1 90 ( 9 0 Y) rhenium 6 R e) or rhenium 1 1 8 8 ( 1 88 R e) Something used Ordinarily when antibodies are labeled using radioactive isotopes. As the metal chelating agent, EDTA D nonionic compound cyclam and DOTA or other known chelating agents can be bound to the antibody in advance and then released, or the radioactive metal chelate can be formed and then bound to the antibody.
本発明において 「治療タンハク質」 の例としては を活性化するサイ トカインか好適てあり 例えば ヒ トイ ン 2 ヒ ト顆拉球一マクロファーシーコロニー刺激因子 ァーンコロニー刺激因子 ヒ トインターロイキン 1 2等 また 大腸かん細胞を直接殺傷するため リ ノンゃンフ の毒素を用いることかてきる。 例えは 治療タンハク質 ついては 抗体または抗体断片をコー卜する c DNAに をコー トする c DN Aを連結させ 融合抗体をコー 卜す
サイクロファスフアミ トなとのアルキル化剤 5—フル メソ トレキセー 卜なとの代謝拮抗剤 夕ウノマイノン マイ トマイシン C 夕ウノルヒノン トキソルヒノンな ヒンク リスチン ヒンフラスチン ヒンテシンのような ト 夕モキシフェン テキサメ夕ソンなとのホルモン剤 床腫瘍学 (日本臨床腫瘍研究会編 1 9 9 6年 癌と化 またはハイ ト口コーチソン フレトニソンなとのステロ リン イントメ夕ノンなとの非ステロイ ト剤 金チォマ ラミンなとの免疫調節剤 サイクロフォスファミ ト ア との免疫抑制剤 マレイン酸クロルフエ二ラミン クレ な抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤 (炎症と抗炎症療法 昭 薬出版株式会社) なとかあけられる。 例えは 夕ウノマ 結合させる方法としては クルタールアルテヒ 卜を介し ンと抗体のアミノ基間を結合させる方法 水溶 カルホ て夕ウノマイノンのアミノ基と抗体のカルホキンル棊を 等かあけられる。 In the present invention, as an example of “therapeutic protein”, a cytokine that activates is preferable. It is possible to use linonyanph toxin to directly kill colonic canal cells. For example, for therapeutic proteins, coat the antibody or antibody fragment. C. Coat the DNA. C. Connect the DNA to coat the fusion antibody. Cyclophosphine alkylating agent 5—Full meso trexase Antimetabolic agent Yunomainon Mitomycin C Yunolhinone Toxorhinone Hinkristin Hinfrastin Hintesin-like hormone agent Bed oncology (Japan Clinical Oncology Research Group 1 9 9 6 Years Cancer and / or Height Mouth Cochisson Fretonison's Steroline Intome Yunon's Non-Steroit Agent Gold Tiolamin's Immunomodulator Cyclophos Anti-inflammatory agents such as chlorfenilamine maleate, antihistamines, etc. (Inflammation and anti-inflammatory therapy, Shoyaku Shuppan Co., Ltd.) For example, as a method of binding unomata Kurtar al Bond between amino acid of antibody and antibody through Law water Karuho like or be opened Karuhokinru 棊 amino and antibodies of evening Unomainon Te.
「ウィルスヘクター」 の例としては 本発明の抗 DU 結合し得るように改変されたウィルスヘクターか使用し ァテノウィルスヘクター (Wa n g P e t 5 ) S oma t i c C e l l a n d Mo l e c 2 1, 4 2 9 - 44 1 ) レ トロウイルスヘクター ( R K e t a 1 ( 1 9 9 6 ) J V i r As an example of “virus hector”, a virus hector modified so as to be capable of binding to anti-DU of the present invention is used. Watenovirus hector (Wang P et 5) Somatic Celland Molec 2 1, 4 2 9- 44 1) Retrovirus Hector (RK eta 1 (1 9 9 6) JV ir
5 7 0 1 - 5 7 0 5 ) レンチウィルスヘクター (N a
抗 DU S P 1 5抗体と共に遺伝子治療を必要とする崈者 合 抗 DU S P 1 5抗体か認識する抗原 (すなわち D 存在する部位に檸的化することかてきる。 5 7 0 1-5 7 0 5) Lentiviral Hector (N a For those who need gene therapy together with anti-DU SP 15 antibodies Anti-DU SP 15 antibodies can be recognized as antigens (ie, D).
抗 DUS P 1 5抗体と上記他の薬剤とは 化学 Wまた に結合され得る。 ここて 「化学的な結合」 には イオ 合 共有結合 分子間力による結合 疎水性相互作用に 含まれるものとし 「遺伝子工学的な結合」 には 例え 夕ンハク質とからなる融合タンハク質を遺伝子祖換えな て作製した場合の 抗体と治療タンハク質との間の結合 れるものとする。 The anti-DUS P 15 antibody and the other drug can be conjugated to chemical W or. Here, “chemical bonds” include ionic bonds, covalent bonds, intermolecular forces, and hydrophobic interactions, and “genetic engineering bonds” include, for example, a fusion protein consisting of a milk protein. In the alternative, the antibody and the therapeutic protein will be bound.
4 製剤化および製剤の投与方法 4 Formulation and administration method
本発明の DU S P 1 5遺伝子の発現阻害物質を含有す DU S P 1 5夕ンハク質の活 [4阻害物質を含有するかん の抗 DUS P 1 5抗体を含有する冶療剤 または本発明 る抗 DUS P 1 5抗体か 放射 同位元素 治療タンハ 薬剤 およひ治療遺伝子を担持したウィルスヘクターも スヘクターのうちのいすれか またはこれらの任意の祖 的または遺伝子工学的に結合されている冶療剤は 公知 て製剤化することかてきる。 Activity of DU SP 1 5 proteins containing the DU SP 15 gene expression inhibitor of the present invention [4 Anti-DUS containing anti-DUS P 15 antibody containing the inhibitor or anti-DUS of the present invention P 15 antibody or radioisotope therapy Tancha drug and virus hector carrying a therapeutic gene or any of these, or any of these native or genetically engineered therapeutic agents are known It can be formulated.
本発明の治療剤の製剤化にあたっては 常法に従い 学的に許容される担体を^加することかてきる。 例えは 賦形剤 着色 +4 着香 保存 +4 安定剤 緩衝剤 f
ラチン 中鎖脂肪酸トリクリセライ ト ホリオキノエチIn formulating the therapeutic agent of the present invention, a chemically acceptable carrier can be added according to a conventional method. For example, excipient coloring +4 flavor storage +4 stabilizer buffer f Latin Medium-chain fatty acid trichryslate Horio kinoechi
/由 6 0 白糖 カルホキンメチルセルロース コーンス 類等を挙げることかてきる。 / Ya 6 0 Saccharose Calhoquine methylcellulose Cones
本発明の治療剤の剤型の種類としては 例えは 経口 粉末剤 丸剤 散剤 顆拉剤 細粒剤 軟 硬カフセル ーテイ ンク剤 ヘレノ ト剤 舌下剤 へ一ス ト剤等 非 射剤 坐剤 経皮剤 軟膏剤 硬膏剤 外用液剤等か挙 においては投与経路や投与対象等に応した最適の剤型を る。 有効成分としての DUS P 1 5タンハク質の活性 ( 1 5遺伝子の発現) 阻害物質は 製剤中 0 1から 9 9 することかてきる。 Examples of the dosage form of the therapeutic agent of the present invention are oral powders, pills, powders, condylar agents, fine granules, soft cuffs, tans, helenotes, sublinguals, stings, etc. Non-propellant suppositories, transdermal Agents Ointments Plasters For liquids for external use, etc., use the optimal dosage form according to the route of administration and the subject of administration. The activity of DUS P 15 protein as an active ingredient (15 gene expression) Inhibitors can be determined from 0 1 to 9 9 in the drug product.
本発明の薬剤の有効成分の投与量は 投与対象 対象 与方法なとにより差はあるか 経口投与の場合 一般的 (6 0 k gとして) に対して一日につき約 0 l mg〜 l 好ましくは約 1 0〜 1 0 0mg より好ましくは約 1 てある。 非経口的に投与する場合は その一回投与量は 臓器 症状 投与方法なとによっても異なるか 例えは は通常例えは 崈者 (6 O k gに対して) 一日につき 3 0mg程度 好ましくは約 0 1から 2 0mg程度 約 0 1〜 1 Omg程度を静脈汪射により投与するのか しかしなから 最終的には 剤型の種類 投与方法 崈 崈者の症状等を考慮して 医師または獣医師の利断により ことかてきる。
膀胱かん 子宮かん (例 子宮頸かん 子宮体かん) 腺かん 膝臓かん 卯巣かん 脳腫瘍 血液腫瘍なと) 好ましくは 大腸かんの予防 治療に用いられる。 The dosage of the active ingredient of the drug of the present invention varies depending on the subject of administration Subject administration method Oral administration In general (as 60 kg) More preferably, it is about 1 to 100 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the organ symptoms, administration method, etc. For example, the normal person (for example, 6 kg) About 30 mg per day, preferably about 0 About 1 to 20 mg About 0 1 to 1 Omg should be administered by intravenous vaginal discharge However, ultimately, the type of dosage form Administration method 崈 Considering the symptoms of the deaf, etc. It will come out. Bladder canister Uterine canister (eg cervical canine uterine canopy) Glandular pancreas Knee canopy Brain tumor Blood tumor etc. Preferably used for the prevention and treatment of large intestine.
本発明の葉剤は D U S P 1 5タンハク質の活 阻害 S P 1 5遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有し 癌剤 癌転移阻害剤 癌細胞のァホトーノス誘導剤等と 対象となる細胞 祖織 臓器 または癌の種類は特定の ない。 また 本発明の薬剤は D U S P 1 5タンハク質 およひ D U S P 1 5遺伝子の発現阻害物質の両方を含ん 本発明の冶療剤において アンチセンス核酸を用いる センス核酸を卓独あるいはレトロウィルスヘクター ァ クタ一 ァテノウィルスァソノエーテノ トウィルスヘクタ なヘクターに挿入した後 公知の手段に従って投与するこ アンチセンス核酸は 単独て あるいは生理学的に認めら もに製剤化し 遺伝子铳ゃハイ トロケルカテーテルのよう によって投与することかてきる。 The leaf preparation of the present invention contains a DUSP 15 protein activity inhibitor SP 15 gene expression inhibitor as an active ingredient. Cancer agent Cancer metastasis inhibitor Cancer cell phohotosin inducer, etc. The type of cancer is not specific. The drug of the present invention contains both a DUSP 15 protein and a substance that inhibits the expression of the DUSP 15 gene. In the therapeutic agent of the present invention, the sense nucleic acid is used as a monochromic or retrovirus vector. After insertion into a viral hector, it should be administered according to known means.Antisense nucleic acid should be administered alone or physiologically, and administered via a gene-like catheter Come.
また 本発明において組換えァテノウィルス粒子のよう クタ一と抗 D U S P 1 5抗体との組み合わせを癌治療の 場合は これら卓独て使用してもよいか 一般には製薬 担体と共に使用される。 そのような担体としては 既に 担体 ならひに水 生理食塩水 クルコース ヒ トアルフ 等張溶液か好ましい 更に 製薬的に通常使用される 加 防腐剤 衡量等を 加することもてきる。 そのように調
胞 組織の性質によって変更してよい。 投与回数は 1 よく 投与期間は 1 日〜数ケ月以上にわたってもよく を 1セノ 卜として 長期にわたって断続的に多数セノ ト レ 。 また 本発明において使用されるウィルスヘクター ルスヘクター核酸分子は 特定の細胞およひ または組 は疾病状態の診断に使用することかてきる。 例えは ウ の核酸分子に検出可能なマーカー遺伝子を組込み これ 胞に トランスフエク ノョ ンして得られたウィルスヘクタ U S P 1 5抗体と祖み合わせて腫瘍細胞を検出診断する ことかてきる あるいは 抗 D U S P 1 5抗体に検出可 させて腫瘍細胞を検出診断するために使用することかて In the present invention, a combination of a combination of a recombinant fatenovirus particle and an anti-DUSP 15 antibody may be used independently in the treatment of cancer. Generally, it is used together with a pharmaceutical carrier. As such a carrier, water, physiological saline, krucose-hytoalf isotonic solution or the like is preferably used as a carrier. Like that It may vary depending on the nature of the cell tissue. The number of administrations is 1 and the administration period may be 1 day to several months or more. In addition, the viral hectare nucleic acid molecule used in the present invention can be used for diagnosis of a specific cell and / or disease state. For example, by incorporating a detectable marker gene into the nucleic acid molecule of C, it is possible to detect and diagnose tumor cells by combining with the virus Hector USP 15 antibody obtained by transfecting cells or anti-DUSP 1 5 Can be used to detect and diagnose tumor cells by allowing detection by antibodies
5 がんの診断剤及ひ診断方法 5 Diagnostic agents and diagnostic methods for cancer
本発明はまた かんの診断剤を提供する。 1 つの好ま て 本発明のかんの診断剤は ( a ) D U S P 1 5タン 抗体 又は (b ) D U S P 1 5遺伝子またはその一部の リ ンンェン 卜なハイフリ夕イセーンョン条件下てハイフリ 塩基配列からなるホリヌクレオチトを含有する 5 1 抗 D U S P 1 5抗体を用いる診断剤及び診断 The present invention also provides a diagnostic agent. One preferred diagnostic agent of the present invention is (a) a DUSP 15 antibody or (b) a DUSP 15 gene or a part of it. Diagnostic agents and diagnostics using 5 1 anti-DUSP 15 antibody containing
D U S P 1 5夕ンハク質に対する抗体は D U S P 1 5 を特異的に認識することかてきるのて 被検液中の D U S ク質を定量することかてきる。 具体的には 本発明の抗
その断片と抗 D U S P 1 5抗体との結合か検出おょひノ ο Since antibodies against DUSP 15 proteins can specifically recognize DUSP 15, it is possible to quantify DUS proteins in the test solution. Specifically, the anti-antibody of the present invention Detection of binding between the fragment and anti-DUSP 15 antibody
本明細書中 「被験者由来の生体試 」 は 被験者由 または体液 (例えは 血液 (全血 血漿 血清等を含む) 液 唾液 汗 楕液等) を含む。 また 「被験者」 は を受ける または受けることか望まれるヒ ト被験体てあ しているか または罹崈していると疑われるヒ ト被験体 このようなかんの例としては 大腸かん 胃かん 肺か 立腺かん 食道かん 肝臓かん 胆道かん 脾臓かん ん 子宮かん (例 子宮頸かん 子宮体かん) 精巣か 縢臓かん 卯巣かん 腫瘍 血液腫瘍なとか含まれる 大腸かんか好ましい。 In the present specification, “subject-derived biological test” includes subject-related or body fluid (for example, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.), liquid, saliva, perspiration, elliptical fluid, etc.). A “subject” is a human subject who is or is suspected of receiving or desired to receive a human subject. Examples of such cans include large intestine, stomach, and lungs. Gland or esophageal or liver or biliary or splenic or uterine canal (eg cervical or uterine canal) testis or spleen or urinary canal tumor Tumor or blood tumor is preferred.
上記のような被験者由未の生体試 における D U S P 1 出するための免疫測定は かん (例えは 大腸かん) を るか かんの危険 ftを有する被験体から採取した生体試 原一抗体結合を生しさせる条件下て抗 D U S P 1 5抗体 いて 抗体による免疫特異的結合量を測定することを包 うな抗体の結合を使用して D U S P 1 5タンハク質の たは増大した発現か検出される。 この場合 増大した D ハク質発現の検出か疾病状態の指檸となる。 必要に応し の D U S P 1 5タンハク質のレヘルを かんを有しない と比較してもよい。 The immunoassay for issuing DUSP 1 in a subject's unexplained biological test as described above is based on the binding of a single antibody from a biological sample collected from a subject with a risk of kan (eg, large intestine). Antibody binding, including measuring anti-DUSP 15 antibody and the amount of immunospecific binding by the antibody, under conditions to detect whether DUSP 15 protein or increased expression is detected. In this case, detection of increased D halite expression or disease state indications. If necessary, you can compare the DUSP 15 tanned reher to that without a cane.
上記免疫測定法の 1つの態様ては 例えは 血凊試 +4
当業者により適宜決定され得る。 One embodiment of the above immunoassay is, for example, a blood clot test +4 It can be determined appropriately by those skilled in the art.
抗 DUS P 1 5抗体を検出可能に標識する方法の 1つ 抗体を 酵素 例えは 酵素ィムノアノセィ (E I A) ののような酵素に結合させる [V o 1 1 e r, A によ た免疫吸着ァ ノセィ」 ( 'Th e E n z yme L i mu n o s o r b e n t A s s a y) (E L I S A) l a g n o s t l c H o r i z o n s 2 1〜 7 o l o g i c a l A s s o c i a t e s Q u a r t b l i c a t i o n, Wa l k e r s v i 1 l e MD r A による J C l i n P a t h o l 3 1 1 9 7 8 B u t l e r J E による M e t h E 7 3 4 8 2〜 5 2 3 1 9 8 1 ] 。 抗体に結合する酵 光光度測定により 可視手段による蛍光測定により検出 る化学分子か生成されるような方法て 適当な基質 好 性基質と反応させる。 抗体に検出可能な檸識を付けるた とかてきる酵素は ヘルォキノ夕ーセおよひアルカ リ 性 を包含するか これらに限定されない。 この検出はまた 色素原性基質を用いる比色法により達成することかてき その他の本発明において使用し得る方法としては ラ セィ (R I A) サントイ ノチ免疫測定法 ィムノメ ト ロメ ト リー 蛍光免疫測定法 (F I A) 時間分解蛍光 R F I A) 酵素免疫測定法 (E I A) 発光免疫冽定 電気化学発光免疫冽定法 (E C L I A) ラテノクス凝
以上のように 本発明の抗体を用いる 生体内ての D ハク質の定量法を利用することにより DUS P 1 5タ 不全に関連する各種疾崈の診断をすることかてきる。 例 1 5夕ンハク質の濃度増加か検出された場合は 例えは タンハク質の過剰発現に起因する疾崈 (例えは かん ん) ) てある可能性か高いまたは将来罹砉する可能 か ことかてきる。 One method of detectably labeling anti-DUS P 15 antibodies is to bind the antibody to an enzyme such as the enzyme Imnoanose (EIA) [Vo 1 1 er, immunoadsorbent by A] ('The E nz yme Li mu nosorbent A ssay) (ELISA) lagnostlc Horizons 2 1-7 JC lin Pathol 3 1 1 9 7 8 B utler by ological A ssociates Quartblication, Wa lkersvi 1 le MD r A Meth E 7 3 4 8 2 to 5 2 3 1 9 8 1] by JE. Fermentation with antibody Appropriate substrate Fluorophotometry is used to produce a chemical molecule that can be detected by fluorescence measurement with visible means. Enzymes that can be used to provide detectable knowledge to antibodies include, but are not limited to, herokinase and alkaline properties. This detection can also be achieved by a colorimetric method using a chromogenic substrate. Other methods that can be used in the present invention include the race (RIA) Santoi immunoassay method, the immunometric method, the immunofluorescence assay method ( FIA) Time-resolved fluorescence RFIA) Enzyme immunoassay (EIA) Luminescence immunoassay Electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) Latinox As described above, it is possible to diagnose various diseases related to DUS P 15 dysfunction by utilizing the in vivo D-quantitative method using the antibody of the present invention. Example 1 If an increase in the concentration of brown sea urchin is detected, whether it is likely due to overexpression of the brown sea urchin (for example, kan) or is likely to be affected in the future? The
なお 本発明の抗 DU S P 1 5抗体は i n v i v いることもてきる。 ここて使用し得る抗体調製物の調製 は当該分野そよく知られている。 例えは 抗体—キレー Nu c l M e d B i o l 1 9 9 0 1 7 2 に記載されている。 また 磁気共呜ィメーンンクて用い 常磁性イオンを有する抗体については 例えは M a g n e s o n a n c e i n M e d i c i n e 1 9 9 1 - 34 2に記載されている。 It should be noted that the anti-DU S P 15 antibody of the present invention may be i n v i v. The preparation of antibody preparations that can be used here is well known in the art. For example, the antibody—Kireet NuclMedb Biol 1 9 9 0 1 7 2 is described. An example of an antibody having a paramagnetic ion used for magnetic resonance is described in, for example, M ag e e s e a n c e e n Me c i c e e e 1 9 9 1 -342.
5 2 ホリヌクレオチト (例えば、 DNA) プロー 断剤及び診断方法 5 2 Horinucleocyto (eg DNA) pro-blocking and diagnostic methods
本発明の診断方法においては DUS P 1 5遺伝子の いて設計されるフローフ又はフライマ一を用いることか には そのような診断方法は 例えは (a) 被験者由 DUS P 1 5遺伝子またはその断片の塩基配列にス トリ ィフリ夕イセーンョ ン条件下てハイフリ夕イス可能な塩
およひ zまたは定量する。 フローフとして用いる塩基配 えは 1 2塩基以上 1 5塩基以上 1 8塩基以上 2 1 4塩基以上 2 7塩基以上 3 0塩基以上 またはさら リヌクレオチト断片てあり得る。 ハイフリ夕イセーノヨ た低 中又は高ス ト リンノエン トな条件を使用し得る。 中 「DU S P 1 5遺伝子またはその断片の塩基配列に トなハイフリ夕イセーション条件下てハイフリ夕イス可 には DU S P 1 5遺伝子またはその断片の塩基配列に 列 (アンチセンスホリヌクレオチト) も含まれるものと およひ核酸のハイフ リタイセーンョ ンの方法は当業者に 例えは国際公開公報第 8 9 Z0 6 6 9 8号 E P— A 0 2 米国特許第 2 9 1 5 0 8 2号 E P— A 0 0 6 3 8 7In the diagnostic method of the present invention, whether the DUS P 15 gene or the flow designed for the DUS P 15 gene is used is, for example, (a) the subject-based DUS P 15 gene or its fragment base A salt that can be swallowed up under the conditions of a streaky sunset in the array. And z or quantify. The base sequence used as the flow can be 12 bases or more 15 bases or more 18 bases or more 2 14 bases or more 2 7 bases or more 30 bases or more, or even a nucleotide fragment. High and low stringent conditions may be used. Included in the base sequence of DU SP 15 gene or its fragment is also included in the base sequence of DU SP 15 gene or its fragment. For example, international publication number 8 9 Z0 6 6 9 8 EP—A 0 2 US Pat. No. 2 9 1 5 0 8 EP—A 0 0 6 3 8 7
0 1 7 3 2 5 1 E P— A 0 1 2 8 0 1 8に記載されて 本発明の診断方法においては DU S P 1 5遺伝子に リヌクレオチトフローフまたはフライマーを用いて 公 て檸的配列を検出または定量することかてきる。 そのよう として 例えは ササンハイフリ夕イセーンヨ ン ノ一 イセ一ノヨ ン RT— P C R法 P C R— S S C P法 (G s 第 5巻 8 7 4〜 8 7 9頁 ( 1 9 8 9年) ) P r o g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e my l e n c e s o f t h e Un i t e d S t a t e m e r l c a 第 8 6巻 2 7 6 6〜 2 7 7 0頁 ( 1 9 80 1 7 3 2 5 1 EP— described in A 0 1 2 8 0 1 8 In the diagnostic method of the present invention, the DU SP 1 5 gene is publicly detected by using a nucleocytofluorine or a flymer. Or come to quantify. As an example, Sasan Hai Furi Yusen Noun No Isei No Yoon RT—PCR method PCR—SSCP method (G s Vol. 5 8 7 4-8 7 9 (1 9 8 9)) P rogsofthe National A cade my lencesofthe Un ited Statemerlca Volume 8 6 2 7 6 6〜 2 7 7 0 (1 9 8
1 S H法 DNAチノフあるいはアレイ C GH (C omp
NA断片 (BAC, P A C YACなと) を高密度にス Aチノフを用いて 別々の色素て檸識したかん由来 DN を スライ ト上のケノム DNA断片に対して同時にハイ ヨンを行い その結合状態を検出することにより かん コヒー数異常を高解像度に検出する方法てある (P 1 n e t a 1 ( 1 9 9 8 ) N a t G e n e t 2 01 SH method DNA Chinov or Array C GH (C omp Hang the NA fragment (BAC, PAC YAC, etc.) at high density with a separate dye using S Achinov, and simultaneously perform hyonation on the chemome DNA fragment on the slide to determine its binding state. There is a method to detect anomalous cohesion number with high resolution by detecting (P 1 neta 1 (1 9 9 8)
1 ) o 1) o
なお 本発明においては DUS P 1 5遺伝子の発現 るか否かを検出するために 細胞の DU S P 1 5の mR 準遺伝子 (ハウスキーヒンク遺伝子 (例えは S h a p e ら J M a mm a r y G l a n d B i o l N l a 3 ( 1 9 9 8 ) 3 1 5 - 3 2 4 Wu Y Y s J L A c t a D e r m V e n e r e ( 2 0 0 0 ) 2— 3 ) の mRNAレヘルと 好ましくは R よって比較することもてきる。 In the present invention, in order to detect whether or not the DUS P 15 gene is expressed, the mR quasigene of the cellular DU SP 15 (housekeeping gene (for example, Shape et al., JM mmary G land B iol N la 3 (1 9 9 8) 3 1 5-3 2 4 Wu YY s JLA cta der venere (2 0 0 0) 2-3) mRNA reherence, preferably by R, can also be compared.
上記のような手法によって標的配列 (DNA mRN 出 定量し D U S P 1 5遺伝子の発現過多か確認された は DUS P 1 5の過剰発現に起因する疾崈 (例えは か かん) ) てある可能性か高い あるいは^耒權崈する可能 断することかてきる。 Is it possible that the target sequence (duration of DNA mRN was confirmed by overexpression of DUSP 15 gene by the above-mentioned method is a disease caused by overexpression of DUS P 15 (for example)? High or possible to be jealous.
5 3 質量分析装置を用いる診断方法 5 3 Diagnosis method using mass spectrometer
本発明の診断方法の別の実施形態ては 被検試 中の檸
その強度を測定することにより 試料の質量を決定する の質量分析の結果から タンハク質やへフチ卜のアミノ る個々のアミノ酸を同定することかてきる。 Another embodiment of the diagnostic method of the present invention is a sputum during the test. By determining the intensity of the sample, it is possible to identify the individual amino acids of the protein and hemiform from the results of mass spectrometry.
イオン化には マ トリ クスアンステノ トレーサーテソ ン化法 (MAL D I ) エレク トロスフレーイオン化法 相法 (E I C I ) 電界脱離 (FD) 法なと種々の方 る。 イオン分離には イオン化法と相性のよいイオン分 例えは MAL D Iの場合には 飛行時間型 ( t i me g h t T〇F) 質量分析計 E S Iの場合には 四重 イオントラ ノフ型 磁場型なとの質量分析計かそれそれ 量分析装置は タンテムて用いられることもある。 例え I M S /M S Q - T O F M S MALD I — T〇 けられる。 なお その他のアミノ酸配列決定法 例えは 一 (例 気相ンークェンサ一) によるアミノ酸配列决定 もよい。 There are various types of ionization, such as matrix antheno tracer tetherization (MAL D I), electrosfray ionization, phase (E I C I) and field desorption (FD). For ion separation, ion fraction compatible with ionization method For example MAL DI, time-of-flight type (ti me ght TºF) Mass spectrometer For ESI, quadruple ion trough type Magnetic type mass An analyzer or a quantity analyzer may be used in tandem. For example, I M S / M S Q-T O F M S MALD I — T〇 It is also possible to determine the amino acid sequence by another method for determining amino acid sequence, for example, one (eg, gas phase sequencer).
5 4 診断用キノ ト 5 4 Diagnostic kinoto
本発明はまた 抗 DU S P 1 5抗体を含有する 被験 の DU S P 1 5タンハク質またはその断片をかんマーカ ょひ または定量するためのキノ トを提供する。 さらに 遺伝子またはその一部の塩基配列にス ト リンンェン 卜な ーノョ ン条件下てハイフリタイス可能な塩基配列を含有 未の生体試料中の D US P 1 5遺伝子またはその断片を
卵巣かん 脳腫瘍 血液腫瘍なとか含まれるか とりわ 好ましい。 The present invention also provides a quinoto for quantifying or quantifying a subject DU SP 15 protein or fragment thereof containing an anti-DU SP 15 antibody. In addition, the base sequence of the gene or a part of it contains a base sequence that can be hyfitized under stringent conditions. The D US P 15 gene or a fragment thereof in an unexamined biological sample. Ovarian can brain tumor or blood tumor is included.
本明細書中 「かんマーカー」 とは 被験者の体液 ( 尿 リ ン八液 唾液 汗 精液等) または細胞もしくは 正常組織に由来していないか あるいはかん細胞または 択的に発現の亢進している分子のことをいい 被験者の もしくは祖織中における当該分子の存在かかんの存在を 唆するものをいう。 In the present specification, the term “can marker” refers to a subject's body fluid (such as urine phosphorus eight fluids, saliva, sweat, semen, etc.) or a cell that is not derived from cells or normal tissues, or is a molecule that is alternatively enhanced in expression. This suggests the presence of the molecule in the subject or in the tissue.
上記第一の態様のキノ トは 被験者からの体液試 中 抗原 (D U S P 1 5夕ンハク質およひその部分へフチ卜 およひ Zまたは定量する成分を含有する。 例えは D U S ク質か E L I S Aて検出おょひ または定量される場合 分は 例えは 組織切片 または血液や尿のような体液 P 1 5のレヘルを検出およひ Zまたは定量するために使 のような抗体は放射能 蛍光 比色 または酵素檸識て もよい。 本発明のキノ トは 標識された二次抗体を含有 上記第二の態様のキノ トは D U S P 1 5遺伝子また 基配列にス トリ ンノエン卜なハイフリタイセーショ ン条 夕イス可能な塩基配列からなるホリヌクレオチトを含有 本発明のキノ トは D N Aチノフ上に固定された上記ホリ を含有し得る。 The quinoto of the first embodiment contains antigens (DUSP 15 protein and its components and edge or Z or components to be quantified in the body fluid test from the subject. For example, DUS or ELISA. For example, tissue sections or body fluids such as blood or urine, such as blood or urine, are used to detect and Z or quantify antibodies such as radioactivity, fluorescence ratio The quinoto of the present invention contains a labeled secondary antibody The quinoto of the above second embodiment is a stringent high hyphenation sequence in the DUSP 15 gene or base sequence. Article containing holynucleocytos having a base sequence that can be used as a chair. The quinoto of the present invention may contain the above-mentioned holy fixed on DNA chinofu.
本発明のキノ トは 抗 D U S P 1 5抗体 D U S P 1 5 その一部の塩基配列にス トリ ンンェン卜なハイフリ夕イ
実施例 The quinoto of the present invention is a highly efficient anti-DUSP 15 antibody DUSP 15 having a stringent base sequence. Example
実施例 1 アレイ C GH法による大腸かん特異的増幅遺 本実施例ては 大腸かん特異的な遺伝子増幅領域を特 大腸かん検体 2 0 0症例のサンフル調製およひアレイ C 検証を実施した。 Example 1 Colonic Canine Specific Amplification by Array C GH Method In this example, a colonic specimen specific gene amplification region was prepared in a sample of 20 samples of large intestine cannula and array C verification was performed.
その結果 大腸かん検体において高頻度に増幅か起き 公共 D Bての遺伝子情報 (NC B I h t t p //w n 1 m n ι h g o vZ) を利用し 精査した結果 C l o n e R P 1 1 — 2 4 3 J 1 6 に位置している (D u a l s p e c i f i c i t y p h o s p h a t k e 1 5 ) (N C B I A c c e s s i o n N o 6 1 1 ) 遺伝子か大腸かん崈者において高頻度て高値て した (01 表 2 ) 。 01は DU S P 1 5遺伝子の大 0検体ての増幅度に対する頻度を示すヒス トクラムてある の表 2は DU S P 1 5遺伝子の大腸かん砉者 2 0 0検 (GZR値) およひ頻度を示す。 平均値は GZR値か 1 体ての平均値を示している。 As a result, it was frequently amplified in large intestine specimens. As a result of scrutiny using public DB gene information (NC BI http // wn 1 mn ι hgo vZ), C lone RP 1 1 — 2 4 3 J 1 6 (Dualspecificityphosphatke 1 5) (NCBIA ccession No 6 1 1) genes or colon colonists were frequently elevated (01 Table 2). 01 is a histogram showing the frequency of amplification of the DU SP 15 gene for large samples. Table 2 shows the frequency of DU SP 15 gene colonic epilepsy (GZR value) and frequency. Show. The average value is the GZR value or the average value of one individual.
表 2に示されるように DU S P 1 5遺伝子は 2 0 0 ん崈者の 5 6 0 %において増幅か認められ その増幅 As shown in Table 2, DU S P 1 5 gene was found to be amplified in 5 60% of 2 0 0 individuals.
1 7てあつた 最大値は 2 4てあり 非常に高頻度 起こっていた。 1 7 The maximum value was 2 4 and it happened very frequently.
(表 2 ) (Table 2)
本実施例ては 大腸かん S者において高頻度て高値な いて 大腸かん由来培養細胞株ての増幅度を検証した。 In this example, the frequency of the colon cane S was high and the amplification degree of the colon cane-derived cultured cell line was verified.
<サンフル調製 > <Sanflu preparation>
培養細胞株は 大腸かん由来の細胞株てある C a c o 2 E 6を使用した。 培養細胞より B l o o d & C e l l r e D N A K ι t (Q I AGE N) を使用して キ 卜コールに従い ケノム DNAを抽出した。 The cultured cell line used was Caco 2 E 6 which is a cell line derived from the large intestine. Kenome DNA was extracted from the cultured cells according to the key phrase using BLOOD & CELLEDENAQ (Q IAGEN).
ぐアレイ C GH> Array C GH>
遺伝子領域の増幅を確認するために アレイ C GHを の詳細は実施例 1 と同様に実施した。 結果 In order to confirm the amplification of the gene region, the details of the array GH were carried out in the same manner as in Example 1. Result
表 3に DU S P 1 5遺伝子の大腸かん由耒の細胞株 ZR値) を示した。 示されるように 大腸かん由未細胞 BAC C l o n e R P 1 1— 2 4 3 J 1 6に位置し P 1 5遺伝子て増幅か起きていることを見出した。 Table 3 shows the DU S P15 gene colony cell line ZR value). As shown, it was found that colonic undifferentiated cells BAC Clone R P 1 1-2 4 3 J 16 located in P 1 5 gene was amplified.
(表 3 ) (Table 3)
<定量的 P C R〉
した。 フライマーは 以下の配列を合成し (〇 P E RO 使用した <Quantitative PCR> did. Framer synthesized the following sequence (○ PE RO used
フライマー配列 Framer array
5 - C C GCAC TGATC TAAAGGCATTC 号 3 ) 5-C C GCAC TGATC TAAAGGCATTC No. 3)
5, — GGTC TCAAAC T CATGGC C TTTG 号 4) 結果 5, — GGTC TCAAAC T CATGGC C TTTG No. 4) Results
表 4に DU S P 1 5遺伝子の大腸かん由耒の細胞株 した。 値は対昭 DNA (正常) との相対値を示している。 に 大腸かん由未細胞株においても DUS P 1 5遺伝 起きていることを見出した (表 4) Table 4 shows the cell lines of DU S P15 gene with large intestine. The values are relative to the DNA of Akira (normal). In addition, we found that DUS P 15 inheritance was also observed in the colon cell line (Table 4).
これらの結果により 大腸かん由未の細胞株 (C a c o 6) においても DUS P 1 5遺伝子か増幅しているこ よって かんにおける DUS P 1 5遺伝子の機能解析に 細胞か選択された。
KOE 6) を用いて RNA i解析を行い その表現型 く RNA 1解析〉 Based on these results, the DUS P 15 gene was also amplified in the colon colony cell line (C aco 6), so that the cells were selected for functional analysis of the DUS P 15 gene in the canine. RNA i analysis using KOE 6) and its phenotype RNA 1 analysis>
細胞株は AT C Cより購入し 付のフロ トコ一ルに た。 s 1 RN Aは遺伝子内の特異的な 2 1 me rを選択 的とする s l RNAを合成した (Q I AGENに合成委 Cell lines were purchased from ATCC and attached to the front collage. s 1 RN A synthesized s l RNA that selectively selects specific 21 mer within the gene (Q I AGEN
(表 5 ) (Table 5)
s 1 R N A配列 s 1 R N A sequence
s 1 RNAの C a c o 2細胞内への導入は 〇 1 i g o l n e ( I n v l t r o g e n) を使用し Ι Ο Ο ηΜ ^付のフロ トコールに従い細胞に導入した。 s l RNA 胞内への導入は RNA i F E CT (Q I AGEN) を nMの s 1 RN Aを^付のフロ トコールに従い細胞に導 は N e g a t i v e C o n t r o l s i RNA (Q I 使用した 細胞に導入後 4日間 倒立顕微鏡下て観察した
F i r s t - S t r a n d S y n t h e s i s S y r R T - P C R ( I n v i t r o g e n ) を使用して コールに従い c D N Aを合成した。 The introduction of s 1 RNA into Caco 2 cells was performed using ○ 1 igolne (Invltrogen) and introduced into the cells according to the protocol with Ι Ο Μ ηΜ ^. For introduction into the sl RNA vesicle, RNA i FE CT (QI AGEN) was introduced into the cells following the flow of the nM s 1 RN A ^ Observed under a microscope CDNA was synthesized according to the call using First-Strand Synthesis SyrRT-PCR (Invitrogen).
この c D NAを铸型にして 定量的 R T— P C Rを実 P C Rは S Y B R G r e e n R T— P C R R e (A p p l i e d B i o s y s t e m s ) を使用して コールに従い 7 5 0 0 R e a l - T i m e P C R ( A p p 1 l e d B i o s y s t e m s ) を用いて実 マーは 以下の配列を合成し (O P E R ONに合成委託) フライマー配列 Quantitative RT-PCR using this cDNA as a saddle type Real PCR is performed using SYBRG reen RT-PCRRe (Applied Biosystems). led biosystems), the realmer synthesized the following sequence (consigned to OPER ON)
5 ' — AC C A C GAT T GT GA C A G C G TAT G 号 1 1 ) 5 '-AC C A C GAT T GT GA C A G C G TAT G No. 1 1)
5 -AA C T C T T C AAG C T G C T G C C TAA 列番号 1 2 ) 5 -AA C T C T T C AAG C T G C T G C C TAA Column No. 1 2)
相対比を算出するための檸準遺伝子には G l y c e r e — 3 — p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s H ) C o n t r o l R e a g e n t s (A p p l i e y s t e m s ) を用いて G A P D Hの発現量を求め 相 <生細胞数の測定 > For the canonical gene for calculating the relative ratio, G l y c e r e — 3 — p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s H)
s 1 R N A導入後の生細胞数を A 1 a m a r B l u e u r c e) を用いて 付のフロ トコールに従い W a l 2 0 Mu l t l l a b e l / L um i n e s c e n c e e r AR VO (P e r k i n E l m e r ) により測定
4 日 目の観察像を示す (各 0にあいて 上段 X 4 0 0 ) 。 a, b およひ cは それそれ DU S P 1 5遺伝 3種てあり NCは不カティフコン トロールを示す 示 表現型の観察ては a b およひ c 3種類の s l R N t l v e C o n t r o l ( N C ) と比較して顕著に細 いた (02 A, B) 。 s 1 Number of viable cells after introduction of RNA using A 1 amar bluerce) according to the attached protocol, Wal 20 Multllabel / Luminescence AR VO (Perkin Elmer) The observation image on the 4th day is shown (in each 0, the upper row X 4 0 0). a, b and c have 3 DU SP 15 inheritances, respectively, NC shows inactivity control, and the phenotypes are the ab and c 3 types of sl RN tlve control trol (NC). It was noticeably finer (02 A, B).
03には C a c o 2細胞に D U S P 1 5遺伝子の s l a n s f e c t i o nして 2 4時間後に細胞を回収し C Rを行った結果を示す。 内在 14コントロールとして 対比を用いて NCに対する相対量を示した。 示される レヘルての効果を定量的 RT— P C Rて確認した結果 NA共に顕著に発現量か減少していた (03) 。 03 shows the result of performing CR after carrying out slan sfefe t tion of DU S P15 gene to Caco2 cell and collecting the cell 24 hours later. The relative amount to NC was shown using contrast as the intrinsic 14 control. As a result of confirming the effect of rehel shown by quantitative RT—PCR, the expression level of NA was significantly reduced (03).
4Aおよひ Bには それそれ C a c o 2細胞およ 胞に DUS P 1 5遺伝子の s l RNAを T r a n s f e c 4日目の細胞を用いて測定試葉により生細胞数を測定し クラフは NCに対する相対量を示した。 示されるように 定を行った結果 C a c o 2細胞については DU S P 1 l RNAの 1種 (c ) において RKOE 6細胞につい 1 5遺伝子の s 1 RNAの 3種 (a b, c ) 全てにおい 様 N e g a t i v e C o n t r o l (NC) と比較し 数か减少していた (04 A B) 。 細胞数の减少か観察さ S P 1 5遺伝子の s l RNA全てについて t検定におい 0 0 1 ) てあつた。
実施することにより 檸的遺伝子の抑制効果かかん特異 検証した。 For 4A and B, the number of viable cells was measured by measuring leaf counts using the Cranco2 cells and cells with sl RNA of DUS P 15 gene T ransfec on the 4th day. Relative amounts are shown. As a result of the determination, it was found that in Caco 2 cells, 1 type of DU SP 1 l RNA (c) was found in all 3 types of s 1 RNA of 15 genes (ab, c) in RKOE 6 cells N Compared to egative control (NC), it was a little less (04 AB). It was observed whether the number of cells was low. All the sl RNAs of the SP 15 gene were subjected to t test. By carrying out this study, we verified the specific effects of the suppressive effect of epilepsy genes.
く RNA 1解析〉 RNA 1 analysis
細胞株は AT C Cより晴入した C CD 1 8 C oを使用 は 付のフロ トコールに従った。 使用した s 1 RNA c配列を使用した。 s 1 RNAの細胞内への導入は L 1 am i n e 2 0 0 0 ( I n v i t r o g e n) を使用 s l RNAを 付のフロ トコールに従い細胞に導入した。 g a t l v e C o n t r o l s ι RNA (Q I AG た。 導入後 5日間 倒立顕微鏡下て観察した。 The cell line used was CCD 18 Co, which was cleared from AT CC. The s 1 RNA c sequence used was used. For introduction of s1 RNA into the cell, L1 am ine 2200 (Invitrogen) was used. The slRNA was introduced into the cell according to the attached protocol. g atl v e C o n t r o ls ι RNA (Q I AG). After introduction, the cells were observed under an inverted microscope for 5 days.
<定量的 RT— P C R解析〉 <Quantitative RT—PCR analysis>
実施例 3の記載方法と同様に実施した。 The same procedure as described in Example 3 was performed.
<生細胞数の測定 > <Measurement of the number of living cells>
実施例 3の記載方法と同様に実施した。 The same procedure as described in Example 3 was performed.
ϋ. ϋ.
DU S Ρ 1 5遺伝子の 大腸正常祖織由来の細胞株 C の RNA 1 の効果は以下の通りてある。 The effect of RNA 1 of cell line C derived from normal large intestine of the large intestine of DU S Ρ 15 gene is as follows.
05に C CD 1 8 C o細胞に DUS P 1 5遺伝子の s r a n s f e c t i o n後 5 日 目に得た観察像を示す 0 下段 X 2 0 0 ) 。 DU S P 1 5 cは DU S P 1 5 RNAの 1種 (実施例 3の c配列) を示し NCは不カ ールを示す。 示されるように 表現型の観察ては NC 効果は認められなかった (05) 。
55 05 shows the observed image obtained on day 5 after sransfection of the DUS P 15 gene in C CD 1 8 Co cells (lower 0 X 2 0 0). DU SP 15 c indicates one type of DU SP 15 RNA (c sequence of Example 3), and NC indicates no call. As shown, no NC effect was observed by phenotypic observation (05). 55
〇E 6ては RNA i効果により D U S P 1 5遺伝子 た結果 顕著にかん細胞の増殖か抑制されたか 大腸 胞株 C CD 1 8 C oては影響か無いことか見出された P 1 5遺伝子か 正常細胞には影響か少ないことより 薬檸的遺伝子となり うることを見出した。 実施例 5 臓器特異性の評価 〇E 6 is DUSP 15 gene due to RNA i effect. Is the proliferation or suppression of the peritoneal cell markedly suppressed? Large intestinal vesicle strain C CD 1 8 It has been found that it can be a pharmacological gene with little effect on normal cells. Example 5 Evaluation of organ specificity
DUS P 1 5遺伝子か正常組織てとのような臓器特 ているのか 当該技術分野て公知のノーサンハイフリ により評価した。 Whether the DUS P 15 gene is an organ such as a normal tissue or not was evaluated by the North Sun-Hifuri known in the art.
MTN Multiple Tissue Northern Blots (Clontech) フロ 卜コー レに従レ 25mer (5 -cagacaccgggggagg 列番号 1 3 ) )の Oil go DNA Probe てハイフリ夕イセ o MTN Multiple Tissue Northern Blots (Clontech) according to the flow 25m (5 -cagacaccgggggagg column number 1 3)) Oil go DNA Probe
具体的には 正常な各臓器組織ての RNAレヘルの発 23 種の臓器 (心臓 (HearO M (Brain) 胎盤 ( Lung) 肝臓 ( Liver) 骨格筋 ( Skeletal (Kidney) 膝臓 (Pancreas) 脾臓 (Spleen) 胸 立腺 (Prostate) 睾丸 (Testis) 卯巣 (Ovary Intestine ) 結腸 ( Colon) 末梢血白血球 ( P Leukocyte) 胃 ( Stomach) 甲状腺 (Thyroid) Cord) リ ンハ節 (Lymph Node) 気管 (Trachea) Gland) 骨髄 (Bone Marrow) )についてノーサンハ
et al (2004) J Biol Chem 279 (31) 32586-32591) に 精巣にあいて約 1 5kb付近にハントか認められ 精 な発現か確認された。 また 今回の解析て新たに 心臓 て約 1 3kb付近にハントか認められ オル夕ナティ フス リアン卜の発現か示唆された。 他の臓器については 発 とか確認された。 精巣ての特異な発現及ひ 発現する臓 されることは この遺伝子を椁的にした薬剤の影響か正 限定的てある可能性か高いと考えられる。 実施例 6 遺伝子増幅の評価 Specifically, 23 types of organs (Heart (HearO M (Brain) Placenta (Lung) Liver (Liver) Skeletal muscle (Skeletal (Kidney)) Knee (Pancreas) Spleen (Spleen) ) Thoracic Gland (Prostate) Testis Ovary Intestine Colon Colon Peripheral Blood Leukocyte Stomach Thyroid Cord Lymph Node Trachea Gland ) About Bone Marrow et al (2004) J Biol Chem 279 (31) 32586-32591) was found to be a hunt in the vicinity of about 15 kb in the testis, confirming its precise expression. In this analysis, a new hunt was found around 13 kb in the heart, suggesting the occurrence of Olfactory Futhrian sputum. Other organs were confirmed to have developed. It is highly possible that the specific expression of the testis and the visceral expression of the testis are due to the influence of the drug that made this gene anxious or limited. Example 6 Evaluation of gene amplification
検体組織内のかん細胞において DU S P 1 5遺伝子領 か起きていることを 当該技術分野て公知の FISH法によ アレイ CGH法により 遺伝子増幅度(G/R)か 1 2 以上 織 (大腸癌患者由来) を用いて D U S P 1 5遺伝子か Clone RP11-243J16 の DNA Probe てハイフリ夕イセーノョ 結果 The gene amplification degree (G / R) or more than 1 or 2 tissue according to the FISH method known in the art using the array CGH method. DUSP 15 gene or Clone RP11-243J16 DNA probe
08は 各検体組織(A〜J)て観察したかん細胞の一部( 学顕微鏡写真 (蛍光像) を示す。 示されるように かん クナルか 3スホノ ト以上見出された。 アレイ CGH法により か 1 2 以上てあった 10検体において DU S P 1 5遺 していることか確認された。 また 病態ステーシの初期 り遺伝子増幅か起きていることか示された。 このことは 08 shows a part of the canine cells observed in each specimen tissue (A to J) (Analytical photomicrograph (fluorescence image). As shown, it was found that more than 3 horns were found. 1 2 It was confirmed that DU SP 1 5 remains in 10 specimens, and it was shown that gene amplification occurred in the early stage of the disease state stasis.
フ ァ溶液 ( 10mM Tns HC1 ph 7 4+150mM NaCl ) 500 ProteomeLab IgY-12 SC フ ロテオ一ムハーティ ノ ョ (BECKMAN COULTER A24618) を用いてアルフミ ン クロ 凊中多量蛋白質を除去した。 得られた画分に終濃度 10mM ノチオスレィ トール (Wako 049-08972) を加え 還元反 分間行った。 反応終了後 終濃度 10mM となるようにョ 卜 (SIGMA 144-48-9) を加え アルキル化反応を室温て 状態て行った。 反応終了後 反応液の 4 倍量の冷アセト 08681 - 20°C) を加え _80°Cに 1 時間静置した後に 30 分間遠心してタンハク質を沈殿として回収した。 回 質は 80 xL の 2M尿素 +100mM重炭酸アンモニゥム溶液 解後に一部を BCA法によるタンハク質濃度測定に供した。 質と 1/50 (w/w)となるように ト リ フンン (Promega V51 37°Cて 16時間消化反応を行った。 A large amount of protein was removed from the alpha-chromium using a fur solution (10 mM Tns HC1 ph 74 4 + 150 mM NaCl) 500 ProteomeLab IgY-12 SC Fronto-Hearty Noyo (BECKMAN COULTER A24618). To the obtained fraction, final concentration of 10 mM nothiothreitol (Wako 049-08972) was added, and reduction reaction was performed. After the reaction was completed, the alkylation reaction was carried out at room temperature by adding ョ (SIGMA 144-48-9) to a final concentration of 10 mM. After completion of the reaction, 4 times the volume of the reaction solution was added, and the mixture was allowed to stand at _80 ° C for 1 hour, and then centrifuged for 30 minutes to collect the protein. A part of the regenerated material was dissolved in 80 x L 2M urea + 100 mM ammonium bicarbonate solution, and a part of it was used for the measurement of the concentration of tanchus by the BCA method. The digestion reaction was carried out for 16 hours at 37 ° C (Promega V51) so that the quality was 1/50 (w / w).
2 ) Nano-HPLC直結質量分析装置による解析 2) Analysis using Nano-HPLC direct mass spectrometer
へフチト断片 0 1 量を -Precolumn cartridge (C 5 ΠΙ 300Α 300 ΠΙ i d χ 5 mm LC PACKINGS 163589) ナ ノ カ ラ ム (C18 PepMap 3 m 100 A 75 m i d PACKINGS 160321) によ り分離した。 HPLC 装置は Ultim PACKINGS)を用いた。 流速は 200nL/min 0 1%キ酸 (Wak 含有 2%ァセトニトリル (MERCK 1287229) と 0 1%キ酸含 トリルの濃度勾配か 0 57%/minの直線クランェントを設
一卜ての MS/MS解析を行った。 3) テ一夕解析 The heftito fragment 0 1 was separated by a -Precolumn cartridge (C 5 ΠΙ 300 ΠΙ 300 ΠΙ id χ 5 mm LC PACKINGS 163589) Nano column (C18 PepMap 3 m 100 A 75 mid PACKINGS 160321). The HPLC apparatus was Ultim PACKINGS. The flow rate is 200nL / min. 0 1% Chinoic acid (Wak containing 2% Acetonitrile (MERCK 1287229) and 0 1% Chitol containing concentration gradient or 0 57% / min linear clone is installed. A complete MS / MS analysis was performed. 3) Analysis
質量分析装置から得た全分析テ一夕は Data Analysis (Bruker Daltonics) を介して出力した。 出力した全テ 分子の分析テ一夕のみを抽出した 抽出したテ一夕の中 における MS/MSテ一夕を精査し 檸的分子のフラクメン する質量を持つイオンヒークの有 を解析した 9 Aおよひ 09 Bは (A) 大腸かん崈者由来の (B) 健常者由来の血清について 上記の方法て解析し れ示す。 All analysis data obtained from the mass spectrometer was output via Data Analysis (Bruker Daltonics). Analyzes of all the output molecules were extracted only for the analysis of MS / MS data in the extracted events, and analyzed for the presence of ion hekes with masses of fractional molecules 9 A and 09 B shows (A) serum derived from a person with large intestine and (B) serum derived from a healthy subject, analyzed and analyzed as described above.
01 0 A〜(:は MS/MS 解析によって决定された 09 とアミノ酸 (またはアミノ酸配列) との対応関係を示す。 01 0 A ~ (: indicates the correspondence between 09 determined by MS / MS analysis and amino acid (or amino acid sequence).
09あよひ 01 0に示されるように 標的分子のフラク に相当するイオンヒークか 大腸かん崈者由来の血凊中 れた。 すなわち 01 0 Bに示すように 少なく とも C WGF EEという部分配列か决定され これは DUS P 質のアミノ酸配列 (配列番号 2) 中の 1 36位〜 1 42 列に相当する。 よって 01 O Aに示すように アミノ 〜 145位の桴的へフチトフラクメント (配列番号 14) このような部分配列に対応する有意なイオンヒークは健
殖抑制効果か認められたか 子宮頸かん細胞株において か認められるのか 前述の RNAi解析法により 評価した 子宮頸かん由来細胞の HeLa細胞株を用いて 前出の 3 用いて RNAi 解析を実施した。 s 1 RNAの細胞内への g o f e c t am i n e ( I n v i t r o g e n) を nMの s 1 RNAを 付のフロ トコールに従い細胞に導 は Ne g a t i v e C o n t r o l s i RNA (Q I 使用した。 |ϋ 09 Ayohi 01 As shown in 0 0, Ion heeks corresponding to the target molecule fracts or blood clots derived from colonic epilepsy. That is, at least a partial sequence called C WGF EE is determined as shown in 0 0 B, and this corresponds to columns 136 to 142 in the amino acid sequence of DUS P (SEQ ID NO: 2). Thus, as shown in 01 OA, the amino-to-145 positional heftofragment (SEQ ID NO: 14) Was the growth-suppressing effect observed? Is it confirmed in the cervical cane cell line? RNAi analysis was performed using the above-mentioned 3 using the HeLa cell line of cervical cane-derived cells evaluated by the RNAi analysis method described above. Introducing gofect amine (Invitrogen) into the cells according to the float call with nM s1 RNA, we used negative control RNA (QI).
01 1は HeLa 細胞に D US P 1 5遺伝子の s l RN s f e c t l o n後 4日目の細胞を用いて測定試某に BiJ定 (MTT assay) した結果を示す。 クラフは N C (Neg siRNA(Qiagen 社製))に対する相対量を示した。 0に示さ D U S P 1 5遺伝子の s i RNA 3種 (a b c) そ において 26%の増殖抑制効果か認められた (p〈0 01の t さらに 時系列に従い 顕微鏡下て微分干涉像を撮影 詳細に観察した。 具体的には HeLa細胞に siRNA (a b フエク ノヨ ン後 1 3 4 日後の同視野の微分干涉像 その結果を 01 2に示す。 NCは Negative control s lRNA を使用した NC と比較して増殖速度の抑制と 細胞死の 印て示す)か確認された。 0中 a b およひ cはそれ
本発明は かんの治療剤 診断剤 診断方法 治療方 れに使用するキノ トなとを提供する。 したかって 本発 断 または檸的治療等の分野において有用てある。 01 1 shows the results of BiJ assay (MTT assay) in HeLa cells using cells on day 4 after sl RN fectlon of D US P 15 gene. The craft indicated relative amounts to NC (Neg siRNA (Qiagen)). 3 types of siRNA (abc) of DUSP 15 gene shown in 0 (abc) showed 26% growth-inhibiting effect (p <0 01 t, further time-sequentially observed differential icing images under microscope) Specifically, HeLa cells were subjected to siRNA (13,4 days after ab fuc- noon), and the results were shown in 01 2. The growth rate of NC is higher than that of NC using Negative control s lRNA. (Indicated by the sign of inhibition and cell death). The present invention provides a therapeutic agent for cans, a diagnostic agent, a diagnostic method, and a kinoto used for treatment. Therefore, it is useful in fields such as the present invention or acupuncture.
Claims
請求の範囲 The scope of the claims
1 DU S P 1 5遺伝子の発現阻害物質を有効成分とし 治療剤。 1 DU S P 1 5 Therapeutic agent containing an inhibitor of gene expression as an active ingredient.
2 前記 DUS P 1 5遺伝子の発現阻害物質か 2 Is it a substance that inhibits the expression of the DUS P 15 gene?
(a) DUS P 1 5遺伝子の発現を RN A ι効果によ を有する核酸 (a) Nucleic acid having the RNA effect on the expression of the DUS P 15 gene
(b) DUS P 1 5遺伝子の転写産物またはその一部 センス核酸 (b) DUS P 15 gene transcript or part thereof sense nucleic acid
およひ And
( c ) DU S P 1 5遺伝子の転写産物を特異的に切断 活性を有する核酸 (c) Nucleic acid that specifically cleaves the transcript of DU S P15 gene
からなる群から選択される物質を含む 請求項 1に記載 3 DU S P 1 5夕ンハク質の活性阻害物質を有効成分 かん治療剤。 A substance selected from the group consisting of: 3 DU S P 1 5
4 前記 DUS P 1 5タンハク質の活性阻害物質か 4 DUS P 1 5
該 DUS P 1 5タンハク質に対する抗体 Antibody to the DUS P 15 protein
を含む 請求項 3に記載のかん治療剤。 The agent for treatment of epilepsy according to claim 3.
5 前記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある 請 すれかに記載のかん冶療剤。 5 The above-mentioned cannula or the cervical canal.
6 DU S P 1 5遺伝子の発現阻害物質をスク リーニン つて 6 Screening for DU S P 15 gene expression inhibitor
(a) DUS P 1 5遺伝子を発現する細胞に 被検化
( a ) D U S P 1 5タンハク質と被検化合物とを接触(a) Test on cells expressing DUS P 15 gene (a) Contact DUSP 15 protein with test compound
(b ) 該 DU S P 1 5タンハク質と被検化合物との結 る工程 およひ (b) The process of connecting the DU S P 15 protein to the test compound
( C ) 該 DU S P 1 5タンハク質と結合する化合物を 包含する スクリーニンク方法。 (C) A screening method comprising a compound that binds to the DU S P 15 protein.
8 前記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある 請 に記載の方法。 8. The method according to claim 1, wherein the colorectal or cervical canal is used.
9 DU S P 1 5タンハク質に対する抗体。 Antibody against 9 DU S P 1 5 protein.
1 0 請 *項 9に記載の抗体を含有するかん治療剤。 1 0 contract * Therapeutic agent comprising the antibody according to item 9.
1 1 放射性同位元素 治療タンハク質 低分子の薬剤 伝子を担持したヘクターをさらに含有する 請 *項 1 0 療剤。 1 1 Radioisotope Therapeutic protein Low-molecular-weight drug Drug further containing a hectare carrying a gene.
1 2 前記かんか 大腸かんまたは子宮頸かんてある は 1 1 に記載のかん治療剤。 1 2 The agent for treating epilepsy according to 1 1 above, wherein the epilepsy or cervical epilepsy is.
1 3 請求項 9に記載の抗体を含有するかん診断剤。 1 3 A can diagnostic agent comprising the antibody according to claim 9.
1 4 DU S P 1 5遺伝子またはその一部の塩基配列にス 卜なハイフリ夕イセーショ ン条件下てハイフリ夕イス可 含有するかん診断剤。 1 4 DU S P 15 A diagnostic agent that contains a high-definition chair under a high-definition condition under a gene or a part of its base sequence.
1 5 前記かんか大腸かんてある 請求項 1 3 または 1 4 診断剤。 1 5 The aforementioned canine or large intestine can be detected. Claims 1 3 or 1 4 Diagnostic agent.
1 6 請求項 9に記載の抗体を含有するかん診断用キノ ト 1 7 DU S P 1 5遺伝子またはその一部の塩基配列にス 卜なハイフリ夕イセーンョ ン条件下てハイフリ夕イス可
記載の方法。 1 6 Canine diagnosis kit containing the antibody of claim 9 1 7 DU SP 1 5 gene or a part of its nucleotide sequence can be used under high hyphenation conditions The method described.
2 1 質量分析装置を用いて DU S Ρ 1 5タンハク質 または定量する 請求項 1 9または 2 0に記載の方法。 2 2 抗 DU S Ρ 1 5抗体を用いて DU S P 1 5タン よひ/または定量する 請 *項 1 9〜 2 1のいずれかに 2 3 (a) 被験者由来の生体試枓と DU S P 1 5タ る抗体とを接触させる工程 およひ 21. The method according to claim 19 or 20, wherein DU S Ρ 1 5 protein or quantitative determination is performed using a mass spectrometer. 2 2 Anti-DU S タ ン 1 5 DU SP 1 5 Quantify and / or quantitate ** SP 1 1 Any of 9 to 2 1 2 3 (a) Subject-derived biological test and DU SP 1 A step of contacting with 5 antibodies.
(b) 前記試 中ての前記抗体と DU S P 1 5タン を検出あよひ Zまたは定量する工程 (b) Detecting or quantifying the antibody and DU S P 15 tan in the test
を包含する 請求項 2 2に記載の方法。 The method according to claim 22.
2 4 ( a ) 被験者由来の生体試 4と DU S P 1 5遺 断片の塩基配列にス トリ ンンェン卜なハイフリ夕イセー ハイフ リタイス可能な塩基配列からなるホリヌクレオチ る工程 およひ 2 4 (a) Subject-derived biological test 4 and DU S P 1 5
(b ) 前記試 4中ての前記ホリヌクレオチトと DU またはその断片とのハイフリ夕イセーノョ ンを検出およ する工程 (b) a step of detecting a high-frequency event between the hollow nucleotide and DU or a fragment thereof during the test 4;
を包含する 請求項 1 9または 2 0に記載の方法。 The method according to claim 19 or 20.
2 5 かんの診断に用いるための請求項 1 9〜 2 4のい 方法。 25. A method according to claims 19 to 24 for use in the diagnosis of cans.
2 6 前記かんか 大腸かんてある 請 *項 2 5に記載 2 7 配列番号 5 配列番号 6 配列番号 7 配列番号 または配列番号 1 0の塩基配列を有する ホリヌクレオ
2 6 The aforementioned large intestine. * Indicated in item 25. 2 7 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 10
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