WO2007037538A9 - Therapeutic or diagnostic application of spo11 gene - Google Patents

Therapeutic or diagnostic application of spo11 gene

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WO2007037538A9
WO2007037538A9 PCT/JP2006/320017 JP2006320017W WO2007037538A9 WO 2007037538 A9 WO2007037538 A9 WO 2007037538A9 JP 2006320017 W JP2006320017 W JP 2006320017W WO 2007037538 A9 WO2007037538 A9 WO 2007037538A9
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Shinichirou Niwa
Yasutaka Makino
Tomoki Ikuta
Kazuya Arai
Takayuki Shindou
Hiromichi Ogura
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Link Genomics Inc
Shinichirou Niwa
Yasutaka Makino
Tomoki Ikuta
Kazuya Arai
Takayuki Shindou
Hiromichi Ogura
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites

Definitions

  • the present invention relates to a S P O 1 1 gene that is a gene specifically amplified in cancer, its therapeutic or diagnostic use, and the like.
  • Cancers Malignant tumors (cancers) are characterized by lethality due to generalization through proliferation, invasion, and metastasis. Local therapies such as surgical resection or radiation therapy cannot adequately address metastatic recurrent cancer, and the development of systemic pharmacotherapy is expected to improve the outcome of cancer treatment in the future. Yes.
  • Chemotherapy which is the current center of cancer drug therapy, often uses cell killing agents that directly act on the DNA and / or RNA of cancer cells and cause the cells to die. It also acted on normal cells such as bone marrow cells, germ cells, hair matrix cells, and gastrointestinal epithelial cells, and had strong side effects.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • tyrosine kinase inhibitor iletsa gene: gefitinib
  • Herceptin gene: trastuzumab
  • HER-2 human epidermal growth factor receptor 2
  • Japanese colon cancer tends to increase year by year, and the number of deaths is lung cancer and stomach It is in 3rd place. By age, 60s is the most common, followed by 50s and 70s.
  • the cause of the increase in colorectal cancer may be genetic factors or environmental factors, but it has been pointed out that Western diets, especially excessive consumption of animal fat, may be the cause.
  • Development of an effective molecular target drug for colorectal cancer is awaited.
  • about half of the tumor markers used for diagnosis (CEA, CA 19-9) are positive even in advanced colorectal cancer, with no organ specificity, and higher performance diagnostic agents. Development is desired. Disclosure of the invention
  • the present inventors have determined that the gene that is frequently amplified in cancer (especially colorectal cancer) is the SPO l 1 gene. I found it.
  • the present inventors have further found that cancer cell growth can be suppressed by inhibiting the expression of SPO11 protein in colorectal cancer cell lines and cervical cancer cell lines, and to complete the present invention. It came. That is, the present invention provides the following cancer therapeutic agents, screening methods for candidate substances having a cancer suppressive action, cancer diagnostic agents, cancer diagnostic kits, cancer diagnostic methods, and the like.
  • a cancer therapeutic agent comprising a substance that inhibits the expression of the SPO1 gene as an active ingredient.
  • the cancer therapeutic agent according to (1) above comprising a substance selected from the group consisting of: (3) A cancer therapeutic agent comprising an S P O 1 1 protein activity inhibitor as an active ingredient.
  • the cancer therapeutic agent according to (3) above comprising a substance selected from the group consisting of:
  • a screening method comprising a step of selecting a compound that reduces the expression level as compared with a case where a test compound is not contacted.
  • a method of screening for an activity inhibitor of SPO11 protein comprising: (a) contacting the SPO l 1 protein with a test compound;
  • a screening method comprising a step of selecting a compound that binds to the SPO1 1 protein.
  • a cancer therapeutic agent comprising the antibody according to (9) above.
  • a cancer diagnostic agent comprising the antibody according to (9) above.
  • a diagnostic agent for cancer comprising a base sequence that can be hypridated under stringent high-prediction conditions in the SPO11 gene or a part of the base sequence thereof.
  • kits for cancer diagnosis containing a polynucleotide comprising a base sequence that can be hyper-predated under stringent high-precipitation conditions.
  • the biological sample is whole blood, serum, or plasma, (1 9) Method described in the above.
  • the diagnostic method according to (2 2) comprising:
  • a method for treating cancer comprising a step of administering an expression inhibitor of SPO11 gene to a patient.
  • a method for treating cancer comprising a step of administering a S P O 11 protein activity inhibitor to a patient. .
  • (3 0) Use of a SP 0 11 protein activity inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
  • a cancer therapeutic agent containing an SPO 11 gene expression inhibitor as an active ingredient which is SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 1.
  • a cancer therapeutic agent comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence of 0.
  • the present invention provides novel drugs, kits and methods useful for the treatment and / or diagnosis of cancer (for example, colorectal cancer), and a screening method for candidate compounds having cancer suppressive activity.
  • cancer for example, colorectal cancer
  • screening method for candidate compounds having cancer suppressive activity for example, cancer suppressive activity.
  • Fig. 1 is a histogram showing the frequency of gene amplification in 20 samples from patients with colorectal cancer of the SP 0 11 gene.
  • Fig. 2 is an optical micrograph (phase contrast image) showing the results of RNAI analysis when s siRNA of the SPO1 1 gene was transferred to the colon cancer cell line RKO.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of evaluating the R N Ai effect by measuring the number of viable cells when the SPO11 gene siRNA was transfected into the colorectal cancer cell line RKO.
  • Fig. 4 is a photograph showing the results of verifying the RNAi effect using an optical microscope when the SPO l 1 gene siRNA was transfected into a cell line CCD 18 Co derived from normal colon tissue. (Phase contrast image).
  • Fig. 5 is a graph showing the results of verifying the RNA i effect by measuring the number of viable cells when the SPO l 1 gene si RNA was transfected into the cell line CCD 18 Co derived from normal colon tissue. is there.
  • Fig. 6 is a photograph showing the results of Northern hybridization performed using various normal organ tissues.
  • FIG. 7 is an optical micrograph (fluorescence image) of a portion (6 cells) of cancer cells in a sample tissue derived from a colon cancer patient analyzed by the FISH method.
  • FIG. 8A and FIG. 8B are graphs showing the results of (A) serum derived from a colon cancer patient and (B) serum derived from a healthy subject analyzed by mass spectrometry, respectively.
  • 9A to 9C show the correspondence between the peak shown in FIG. 8 and amino acids (or amino acid sequences) determined by MS / MS analysis.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of verifying the R N Ai effect by measuring the number of living cells when s i R N A of the SPO 11 gene was transfected into a cervical cancer cell line HeLa cell line.
  • Fig. 11 is an optical micrograph (differential interference image) showing the result of observing the behavior of the experiment of Fig. 10 in time series under a microscope and in detail.
  • the inventors of the present invention verified a gene amplified by the array CGH method using a sample derived from a colon cancer patient, and identified a gene amplification region specific to colorectal cancer. Of the regions where amplification occurs frequently in the specimen, the human SPO l 1 (SPO 1 1 meioticroteincova 1 ent 1 yboundto DSB—like (S. cerevisiae)) gene is frequently encountered in specimens from colon cancer patients. I found out.
  • SPO 1 1 SPOl 1 meiotic protein covalently bound to DSB-like (S. cere 'e)
  • DSBs DNA double-strand breaks
  • Meiosis is a special type of cell division that occurs in the process of germ cells becoming haploid gametes in living organisms.
  • meiosis homologous chromosomes pair after DNA replication, diploid through the first division, and haploid at the second division. Therefore, 4 gametes are generated from 1 germ cell.
  • homologous chromosome pairing is under precise control. Occurs and recombination is a characteristic of sexual reproduction.
  • the first half of the first division is due to chromosomal morphological changes, depending on the morphological changes of the leptoten (filament), zygoten (combined), pakiten (thick), diproten (double), diakine (moving) ).
  • SC Synaptonemal Complex
  • the DNAs that are paired with the SC are aligned in the middle, chromosome pairing begins in the zygotene phase, and the pakiten phase is the period during which the SC is formed.
  • SC has a protein structure called Central element (CE) in the center and lateral element (LE) on the side.
  • CE Central element
  • L lateral element
  • Scp3 (Dobson, M. J., et al. (1994) J. Cell Sci. 107, 2749-2760) is known as a component of LE.
  • LE is formed in the leptotene period, and it is paired with the Zygoten period (Zickler, D., & Kleckner, N. (1998) Annu. Rev. Genet. 32, 619-697). It is formed by bridging LEs with fi laments (TFs),. It is formed during the Pakiten period until the Diproten period (Schmekel, K., et al. (1998) Chromosome Res. 6, 155-159).
  • SP 0 11 is homologous to the subunit of Topoisomerase VI (T0P6A), which is Type II topoi somerase. It has been reported that site-directed mutagenesis prevents homologous recombination during meiosis if a conserved tyrosine residue is mutated (Y135F) and Type II topoisomerase activity is lost (Bergerat, A , et al. (1997) Nature 386, 414-417).
  • SPO 11 acts directly with DSBs during meiosis (Neale, MJ et al. (2005) Nature 436, 1053-1057).
  • DSBs formation has been considered an important step in the early stages of canceration of cells. Abnormal stimulation of cell growth promotion can lead to stress during DNA replication and, in some cases, replication errors and DSBs. They are subject to repair by DNA damage checkpoints and growth inhibition by apoptosis.
  • canceration is promoted when checkpoint ⁇ does not function, such as when P53 is a mutant.
  • the formation of DSBs causes the destabilization of chromosomes, become and contribute to this in the promotion of cancerous (Gorgoul is, VG, et, al. (2005) Nature 434, 907-913) at 0 cancer
  • the expression of SPO11 may play an important role in cancer. '
  • Camptothecin Topicoi somerase I inhibitor
  • Doxorubicin Topico i somerase H inhibitor
  • SPO 11 is classified as DNA Topoi some rase, which is the same as Topoi some rase I and ⁇ , but has a different conformation (Gadelle, D. et al. (2003), BioEssays 25, 232-242).
  • l Low molecular weight compounds that inhibit the activity of 1 are promising as new anticancer agents.
  • the present inventors have also confirmed that the growth of cancer cells can be suppressed by suppressing the expression of the SP 0 11 gene by RNAi (RNA interference). Therefore, cancer can be treated by suppressing the expression of the SPO1 1 gene. It is also possible to diagnose cancer by measuring the expression level of the SPO1 1 gene.
  • RNAi RNA interference
  • the present invention comprises (1) an SPO 11 gene expression inhibitor as an active ingredient And (2) a cancer therapeutic agent containing an SPO 1 1 protein activity inhibitor as an active ingredient.
  • SP 0 1 1 gene refers to 1 8 2 6 bases registered under A ccession No .: NM— 0 1 2 4 4 4 on an NC BI nucleotide base. (Bergerat, A., et al. (1997) Nature 386, 414-417), but is not limited thereto, for example, in the nucleotide sequence of the gene.
  • High stringency conditions that are stringent to the base sequence of the gene or its complementary sequence, such as a variant that is altered by having one or more base substitutions, deletions, additions, or insertions
  • the gene consisting of a polynucleotide having a base sequence that can be hybridized below is also included in the “SP011 gene” as used herein.
  • Hypridization is a known method or a method similar thereto, for example, 'Molecular' Cloning (M o 1 ecu 1 ar C 1 oning T hird E dition, J. S a mb rooketa 1., C old S pring H arbor L ab. Press. 2 0 0 1).
  • stringent conditions may be any of low stringency conditions, medium stringency conditions and high stringency conditions.
  • Low stringency conditions are, for example, conditions at 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32.
  • the “medium stringent conditions” are, for example, the conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, ⁇ 0% formamide, and 42.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, it does not affect the stringency of the hybridization. There are multiple factors that affect the temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, salt concentration, etc., and those skilled in the art can select similar factors to achieve the same stringency. It can be realized.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 for example, 70% or more, when calculated using the default parameters of homology search software such as FA SSTA, BLAST, etc. 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more , 9 7% or more, 98% or more, 99% or more of the polynucleotide having identity.
  • inhibition of gene expression means any event in a series of events from gene to protein production (for example, transcription (production of mRNA), translation (production of protein)) By inhibiting the production of the protein encoded by the gene.
  • SP0 1 1 protein refers to NC BI Yuno, °, 3 9 6 amino acids registered in the database as A ccession No .: N P — 0 3 6 5 7 6
  • a human SPO 1 1 protein consisting of residues (SEQ ID NO: 2) and substantially the same activity as this protein (for example, one or more activities selected from Type II topoisomerase activity)
  • a mutant protein consisting of an amino acid sequence in which deletion, substitution, insertion, and / or addition of one or more amino acid residues has occurred in the sequence.
  • the amino acid mutation site and number in the above mutant protein are not particularly limited as long as the mutant protein retains substantially the same activity as the original protein, but the number of mutations is, for example, 1 to 50. 1 to 40 pieces, 1 to 30 pieces,! ⁇ 2 5! ⁇ 2 0 ,! ⁇ 1 5 pcs! ⁇ 10 pieces, :! ⁇ Nine, :! ⁇ 8, 1-7, 1-6 (1 ⁇ several) ⁇ 5 pcs! ⁇ Four One, three, one, two, one. In general, the smaller the number of mutations, the better.
  • such a mutant protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 9 2 % Or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more of amino acid sequences having identity
  • a protein having substantially the same activity as the original protein In general, the larger the homology value, the better.
  • the above-mentioned S P O 1 1 protein includes a “partial peptide” of S P O 1 1 protein.
  • the partial peptide of the SPO 1 1 protein is a partial peptide consisting of a partial amino acid sequence of the amino acid sequence of the SPO 1 1 protein (SEQ ID NO: 2), preferably the aforementioned SPO 1 1 protein Any one having the same activity as that of the protein may be used.
  • SEQ ID NO: 2 at least 20, preferably at least 50, more preferably at least 70, more preferably at least 100, most preferably Examples include polypeptides having an amino acid sequence consisting of at least 200 amino acid residues.
  • these polypeptides contain an amino acid sequence corresponding to the portion involved in the activity of the S P .O iI protein.
  • the partial peptide used in the present invention is one or more of the above-mentioned polypeptides in the amino acid sequence (for example, about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, still more preferably 1 to 5 amino acid residues) may be changed by deletion, addition, substitution, or insertion.
  • the SP011 protein used in the present invention can be prepared from cells or tissues expressing the protein. Further, these proteins can be synthesized by a known peptide synthesizer, or can be prepared by a recombinant method using an appropriate host cell selected from prokaryotic organisms or eukaryotic organisms.
  • the SPO 11 protein used in the present invention may be derived from any species, but is preferably derived from rabbit. “Substantially the same activity” indicates that these activities are qualitatively equivalent.
  • the activity (such as Type II topoisomerase activity) is the same (for example, about 0.01 to; 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times)
  • quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different. These activities can be measured according to known methods described in literatures such as Bergerat, A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 27663-27669. It can be measured according to the screening method described later.
  • cancer therapeutic agent includes anticancer agents, cancer metastasis inhibitors, cancer cell apoptosis inducers, cancer cell proliferation inhibitors, cancer cell infiltration inhibitors, cancer preventive agents, and the like. Used in meaning.
  • cancer (or cancer) and “tumor” are used as terms having the same meaning.
  • a cancer therapeutic agent containing an inhibitor of 1 S PO l 1 gene expression in one embodiment, the present invention provides a cancer therapeutic agent containing an SPO 11 gene expression inhibitory substance as an active ingredient.
  • SPO 11 gene expression inhibitor is not limited as long as it inhibits the expression of SPO ll gene.
  • SPO ll gene For example, (i) SP 01 1 gene to SPO 11 mRNA And (ii) a substance that inhibits translation from SPOl 1 mRNA to SP011 protein.
  • Examples of substances that inhibit transcription from S P O 1 1 gene to S P O 1 1 mRNA include
  • Examples of substances that inhibit translation from S P O l l mR N A to S P O 1 1 protein include
  • RNA i action on S P O l l mRNA or a part thereof for example, siRNA
  • nucleic acid means RNA or DNA.
  • nucleic acid may contain not only purine and pyrimidine bases but also those having other heterocyclic bases that have been modified. These modifications are methylated purines and pyrimidines, acylated Purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleosides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or ethers, amines, etc. It may be converted to a functional group.
  • RNA i is a phenomenon in which the expression of a foreign gene and a target endogenous gene are both inhibited when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as the target gene sequence is introduced into the cell.
  • Examples of RNA used here include double-stranded RNA that causes RNA interference with a length of 19 to 30 bases, such as ds RNA (doublestrand RNA), si RNA (small interfering RNA). Or sh RNA ( shorthairpin RNA).
  • RNA can be locally delivered to a desired site by a delivery system such as ribosome, and can be locally expressed using the above-mentioned vector that generates double-stranded RNA force.
  • ds RNA, si RNA or sh RNA double-stranded RNA
  • the methods for preparing and using such double-stranded RNA are known from many literatures (Special Table 2 0 2-5 1 6 0 6 2; US Permission No. 2 0 0 2 Z 0 8 6 3 5 6 A; Nature Genetics, 2 4 (2), F e., 1 80-1 8 3; Genesis, 2 6 (4), Ap ril, 24 0-2 44; Nature, S pe. 2 1, 40 7: 6 8 0 2, 3 1 9-2 0; Genes.
  • the length of the double-stranded RNA exhibiting the RNA i effect used in the present invention is usually 19 to 30 bases, preferably 20 to 27 bases, more preferably 21 to 25 bases, most preferably Is 2 1 to 2 3 bases.
  • the following si R N A (used in Example 3) can be used.
  • the term “antisense nucleic acid” or “antisense polynucleotide” has a polynucleotide that is complementary to at least a part of a DNA region of interest, and the polynucleotide is a small part of the region.
  • the term refers to a nucleic acid that can hybridize with a part.
  • the antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • the antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, and polynucleotide amides that are resistant to degradation of oligonucleotides. However, it is not limited to them.
  • the antisense nucleic acid to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
  • the nucleic acid thus prepared can be transformed into a desired animal using a known method.
  • the sequence of the antisense nucleic acid is preferably a sequence complementary to the endogenous gene of the animal to be transformed or a part thereof, but is completely complementary as long as the gene expression can be effectively suppressed. It doesn't have to be.
  • a complementary antisense sequence in the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of SPO 1 1 gene is effective in inhibiting translation of the gene.
  • a sequence complementary to the coding region or 3 ′ untranslated region can also be used.
  • Antisense nucleic acid effective for inhibiting gene translation is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 9% or more of the transcript of the target gene. 5% or more complementarity. .
  • the length of the antisense nucleic acid is at least about 10 bases (for example, about 10 to 40), preferably about 15 More than base, more preferably about 100 bases or more, and still more preferably about 500 bases or more.
  • Antisense nucleic acids can be designed with reference to known literature (for example, Hirashima and Inoue, Shinsei Chemistry Laboratory 2 Nucleic acid IV gene replication and expression, Japan Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin, 1 9 9 3, 3 1 9-3 4 7), J. Kawakamieta 1., P harm T ech Japan. V ol. 8, p. 2 4 7, 1 9 9 2; V o 1. 8, p. 3 9 5, 1 9 9 2; see S. T. Crookeetal., Ed., Antisense Research and Applications, CRCP ress, 1 9 93 etc.).
  • a nucleic acid having a liposomal activity that specifically cleaves the transcript of the SP 0 11 gene is used as an active ingredient.
  • ribozyme activity refers to a nucleic acid that specifically cleaves mRNA, which is a transcription product of a target gene. Some ribozymes have a size of more than 400 nucleotides, such as group I intron type and Ml RNA contained in RNase P, but they have an activity of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type. Some have domains (Protein Nucleic Acid Enzymes, 1990, 35, p. 2 1 9 1).
  • FEBSL ett 1 9 8 8, 2 2 8, p. 2 2 8
  • FEBSL ett 1 9 8 8, 2 3 9, p. 2 8 5
  • protein nucleic acid Enzymes 1 9 90, 3 5, p-2 1 9 1
  • the hairpin type ribosome for example, Nature, 1 986, 3 2 3, p. 349; Nuc 1 A cids Res, 1 9 9 1, 1 9, p. 6 7 5 1; You can refer to Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology, 1 992, 30, p.
  • a compound other than a nucleic acid that inhibits the transcriptional activity of the SP 0 11 gene can be used as an active ingredient.
  • a compound is, for example, a compound that binds to a factor involved in the expression / transcription of the SPO11 gene.
  • Such a compound may be a natural product or a synthetic compound.
  • Such a compound can be obtained by the screening method described below. 1. Cancer treatments that contain inhibitors of protein activity
  • the present invention also provides a cancer therapeutic agent containing a substance that inhibits the activity of S P O l 1 protein.
  • S PO 1 1 protein activity inhibitor includes, for example, (a) an antibody that binds to the SPO 1 1 protein,
  • antibody means an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, as long as it binds to the SPO11 protein of the present invention, in addition to the polyclonal antibody and the monoclonal antibody, a human antibody, a human form by gene recombination.
  • antibody fragments, antibody fragments and modified antibodies thereof are also included.
  • Antibodies that bind to the SP011 protein can be prepared by methods known to those skilled in the art. Details of the anti-S PO 11 antibody will be described later.
  • SP 0 1 1 protein mutant having a dominant negative property with respect to S PO 1 1 protein means that an endogenous wild-type SP 0 1 is expressed by expressing a gene encoding the same. 1 Refers to proteins that have the function of eliminating or reducing protein activity
  • a compound other than the antibody or the mutant that binds to the SPO1 1 protein can be used as an active ingredient.
  • a compound is, for example, a compound that binds to the SPO11 protein and inhibits its activity.
  • a compound may be a natural product or a synthetic compound.
  • Such a compound can be obtained by the screening method described below.
  • the above-mentioned substance that can inhibit the activity of the SP 0 11 protein of the present invention can be used as a cancer therapeutic agent. 2. Screening method for substances that inhibit the activity or expression of SPO l 1 protein
  • the present invention also provides a method for screening a candidate compound having a cancer suppressing action.
  • One preferred embodiment is a method using as an index the binding between the SPO1 1 protein and the test compound.
  • a compound that binds to the SPO11 protein is expected to have an effect of inhibiting the activity of the SPO11 protein.
  • the compound preferably binds to the active site of the SPO11 protein.
  • the S.P011 protein is contacted with a test compound.
  • the SPO 11 protein can be used, for example, in a purified form of the SPO ll protein, in a form expressed intracellularly or extracellularly, or on an affinity column. It can be in a combined form.
  • the test compound used in this method can be appropriately labeled as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label.
  • the binding between the SP011 protein and the test compound is then detected.
  • test compound used for this method.
  • natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides, etc. as well as compound libraries, gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, oceans
  • compound libraries include, but are not limited to, biological extracts and plant extracts.
  • the binding between the SPO 1 1 protein and the test compound can be detected by, for example, a label attached to the test compound bound to the SP 0 1 1 protein.
  • a change in the activity of the SPO 11 protein caused by the binding of the test compound to the SPO 11 protein expressed intracellularly or extracellularly can also be detected as an indicator.
  • the binding activity between the protein and the test compound can be measured by a known method (for example, Type II Measurement of topoisomerase activity (Bergerat, A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 27663-27669.)).
  • test compound that binds to the SPO1 1 protein and inhibits its activity is then selected.
  • the compound isolated by this method is expected to have a cancer suppressing action and is useful as a cancer therapeutic agent.
  • Another embodiment of the screening method of the present invention is a method using the expression of S P O l 1 gene as an index.
  • a test compound is brought into contact with cells expressing the SPO1 1 gene.
  • cells expressing the SPO1 1 gene examples include cells derived from pets, livestock, etc., including but not limited to humans, mice, cats, dogs, sushi, hidges, and birds.
  • Cells that express the SPOII gene include cells that express the endogenous SPO11 gene, or cells that have the exogenous SP011 gene introduced and the gene is expressed. Can do.
  • a cell in which an exogenous SPO11 gene is expressed can usually be prepared by introducing an expression vector into which the SPO11 gene has been inserted into a host cell.
  • the expression vector, Yuichi can be prepared by general genetic engineering techniques.
  • test compound used in this method is not particularly limited.
  • natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, single compounds such as proteins and peptides, compound libraries, expression products of gene libraries, Cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, etc. are used.
  • Contact of a test compound to a cell expressing the SPO 11 gene is usually performed by adding the test compound to the culture medium of each cell expressing the S PO 11 gene.
  • the test compound is a protein or the like
  • “contact” can be performed by introducing a DNA vector expressing the protein into the cell.
  • the expression level of the SP011 gene is then measured.
  • gene expression includes both transcription and translation.
  • the gene expression level can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA can be extracted from cells expressing the SPO 11 gene according to a conventional method, and the transcription level of the gene can be reduced by performing Northern hybridization or RT-PCR using this mRNA as a saddle. Measurements can be made.
  • the promoter region of the SPO 11 gene is isolated according to a conventional method, and a gene that can be detected downstream using a labeled gene (for example, luminescence, fluorescence, color development, etc.
  • the transcription level of the gene can also be measured by observing the activity of the marker gene.
  • the protein fraction is collected from cells expressing the SPO 11 gene, and the level of gene translation is measured by detecting the expression of each SPO 11 protein by electrophoresis such as SDS-PAGE. You can also.
  • the antibody used for detecting the S PO 11 protein is not particularly limited as long as it is a detectable antibody. For example, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.
  • a compound that decreases the expression level is then selected as compared with the case where the test compound is not contacted (control).
  • Compounds selected in this way become candidate compounds for cancer therapeutics.
  • the present invention also provides an anti-SPOll antibody, a cancer therapeutic agent containing this antibody, and the like.
  • the cancer therapeutic agent is Used for cancer targeted therapy or targeted drug delivery.
  • anti-SPO 11 antibody includes an antibody that specifically binds to S PO 11 protein (including fragments (partial peptides) or salts thereof).
  • the anti-SPO11 antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in view of ease of purification.
  • the term “antibody” here is used to include any antibody fragment or derivative.
  • Fab, Fab ′ 2 , CDR humanized antibody
  • multifunctional antibody multifunctional antibody
  • single chain antibody S c F v
  • the antibody of the present invention can be produced by a known method. Methods for producing such antibodies are well known in the art (see, for example, Har 1 ow E. & Lane D., Antibody, Old Spring Laboratory Pres (1 9 8, 8)). See).
  • the protein used as the sensitizing antigen is usually SPO 11 protein or a salt thereof.
  • the SPO 11 protein includes a partial peptide thereof, which is not limited to, for example, a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 20 or more, 40
  • the above is a partial peptide having 60 or more, 80 or more, 100 or more consecutive amino acid sequence portions.
  • these fragments for example, amino (N) terminal fragment and carboxy (C) terminal fragment are used.
  • one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 6)) amino acid residues in the above amino acid sequence are deleted. , Substitutions, insertions and / or additions There may be.
  • SP ⁇ 1 1 protein or its partial peptide salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid). Salt is used.
  • the SP011 protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal such as a mouse or human, particularly from human. The protein is preferred.
  • SP01 protein (In the present specification, in the description of antibodies, these are collectively referred to as “SP01 protein”) and administered as an antigen to mammals such as rabbits, mice, and rabbits.
  • Dosage of antigen per animal is 0.1 ⁇ : when adjuvant is not used! O O mg, and l to 100 zg when an adjuvant is used.
  • the adjuvant include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Immunization is mainly performed by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is carried out 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 5 weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days after the last immunization day, preferably 1 to 14 days later.
  • antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells and the like, and spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • myeloma cells to be fused with antibody-producing cells generally available cell lines of animals such as mice can be used.
  • the cell line used has drug selectivity and can survive in HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state.
  • HAT selection medium including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine
  • myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as X 6 3 A g. 8. 65 3, NSIZ 1-A g 4-1, NSOZ l, and rat myeloma cell lines such as YB 2/0.
  • Cell fusion consists of 1 X 10 6 to 1 X 10 7 ml of antibody-producing cells and 2 X 1 0 5 to 1 in animal cell culture media such as serum-free DMEM, RPMI — 1 6 40 2 X 1 0 6 cells ml of the myeloma cells were mixed (the antibody producing cells with myeloma cells and cell ratio of 2: 1 to 3: 1 is preferred), the fusion reaction in the presence cells fusion promoter .
  • the cell fusion promoter polyethylene dalycol having an average molecular weight of 1000 to 600,000 Dalton can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (eg, electrical mouth population).
  • the cell suspension is appropriately diluted with, for example, RPMI-1 64, 0 medium containing urchin fetal serum, and then plated on a microtiter plate about 3 ⁇ 10 5 Zwe 1 1 Add selective medium to each well, and then change the selected medium appropriately.
  • RPMI-1 64 0 medium containing urchin fetal serum
  • Zwe 1 1 Add selective medium to each well, and then change the selected medium appropriately.
  • Hybridoma screening may be performed in accordance with a normal method, and is not particularly limited. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected and screened by an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, or the like. Cloning of fused cells is performed by limiting dilution. Finally, a hybridoma, a cell that produces a monoclonal antibody that reacts with the SPO 11 protein, was constructed. Stand up.
  • a normal cell culture method or ascites formation method can be employed.
  • the hive re dormer about 1 X 1 0 7 cells were administered intraperitoneally to the mammal of the same species as the animal from which the myeloma cells are derived, thereby High Priestess dormer. The large quantities grown.
  • antibody purification is required in the antibody collection method, known methods such as ammonium sulfate salting-out, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, etc. are appropriately selected or combined. Can be purified.
  • the antigen described above is administered to mammals such as rats, mice, and rabbits.
  • the dose of antigen per animal is from 0.1 to LOO mg when no adjuvant is used, and from 10 to 100; ug when adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. Further, the immunization interval is not particularly limited, and immunization is carried out 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • an antibody (column adsorbed fraction) that reacts with the SPO1 1 protein is collected by subjecting the polyclonal antibody in the antiserum to an affinity ram fixed with the SPO1l protein.
  • the reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum to the SPO1 protein can be measured by the ELISA method or the like.
  • the F ab or F ab ' 2 fragment can be prepared by digestion with a conventional protease (eg, pepsin or papain).
  • a conventional protease eg, pepsin or papain.
  • Humanized antibodies are described, for example, by Riec hma nn et al. (Riechmann JM o 1 B iol. Oct 5; 2 0 3 (3): 8 2 5-8, 1 9 8 8), Jones et al. Nature 3 2 1: 5 2 2-5 2 5, 1 9 8 6) —can be prepared by one of the methods—
  • Chimeric antibodies include, for example, “Experimental Medicine (Special Issue), Vol. 1. 6, No. 10, 1 9 8 8”, Japanese Patent Publication No. 3-7 3 2 80, etc.
  • human antibodies such as “Nature Genetics, Vol., 15, p. 1 4 6-1 5 6, 1 9 9 7”, “Nature Genet”
  • the antibody that binds to the SPO1 1 protein of the present invention can be used for the purpose of, for example, inhibiting the growth or migration of cancer cells.
  • a human antibody is preferably a human antibody in order to reduce immunogenicity.
  • an antibody When used as a diagnostic agent, an antibody may be labeled with a labeling substance (eg, a radioisotope or fluorescent substance) for monitoring. If necessary, it can be labeled with radioactive substances, fluorescent compounds, etc. Among the most commonly used fluorescent labeling compounds are fluorescein isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin and fluorescamine. Similarly, the antibody SP011 antibody can be labeled using a bioluminescent compound. The presence of a bioluminescent protein is measured by detecting the presence of fluorescence. Important bioluminescent compounds for this purpose are luciferin, luciferase and aequorin.
  • a labeling substance eg, a radioisotope or fluorescent substance
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting Spo1 1 protein and the like present in a subject such as a body fluid or tissue.
  • production of antibody columns used to purify SPO 1 1 protein, detection of SP 0 1 1 protein in each fraction during purification, SPO 1 1 protein in test cells It can be used to analyze the behavior of 3.2 Complexes containing anti-S P O 1 1 antibody, etc.
  • the anti-SPO11 antibody used in the present invention is an agent that can be an agent having a neutral activity that attenuates the activity of the antigen in the therapeutic agent or diagnostic agent of the present invention. ⁇ If necessary, it can be used in combination with other drugs to produce a therapeutic effect. Therefore, in another embodiment, the present invention provides an anti-SPO 1 1 antibody and another drug for use in targeted therapy or targeted imaging of cancer (eg, colon cancer). Also provided are composites, compositions containing such composites, and the like. According to such an embodiment, the anti-SPO 11 antibody used in the present invention is used to express other drugs that exhibit therapeutic effects or labeling agents for diagnosis, etc. Can be delivered to the target site.
  • Examples of the “other drug” used in the present invention include a viral vector or a non-viral vector for introducing a gene into a target, such as a radioisotope, a therapeutic protein, or a small molecule drug. Indicated.
  • examples of the “radioisotope” include radioactive halogen elements such as fluorine 1 18, iodine 1 1 2 5 ( 1 2 5 I), and iodine 1 3 1.
  • radioactive halogen elements can also be widely used as radiotherapeutic agents or radiodiagnostic agents by labeling antibodies and peptides in the same manner as the above-mentioned radioactive metal elements.
  • odorization with 1 2 5 I or 1 3 1 I can be bound to an antibody or antibody fragment by a known method such as the chloramine T method.
  • technetium one 9 9 m for the diagnosis indium one 1 1 1 and gallium - 6 7 (6 7 G a ) such, As the therapeutic Lee Tsu thorium one 9 0 (9 ° Y), rhenium one 1 8 6 ( 1 8 6 R e) or rhenium— 1 8 8 ( 1 8 8 Re) can be used.
  • a metal chelator is usually used.
  • Known metal chelating agents include EDTA, DTPA, diaminodithio compound, cyclam, and DOTA. These chelating agents may be pre-bonded to the antibody and then labeled with a radioactive metal, or may be labeled with the antibody after forming a radioactive metal chelate.
  • site force-in that activates cells responsible for immunity is suitable.
  • human interleukin 2 human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor And human macrophage colony stimulating factor, human interleukin 12 and the like.
  • toxins such as ricin and diphtheria toxin can be used to directly kill colon cancer cells.
  • a cDNA encoding the fusion protein is constructed by linking the cDNA encoding the therapeutic protein to the cDNA encoding the antibody or antibody fragment, and this DNA is either prokaryotic or eukaryotic.
  • a fusion antibody can be produced by inserting the expression vector into a biological expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • small molecule drug is used herein to mean “radioisotope” or “therapeutic tongue”. It is used to mean a diagnostic or therapeutic compound other than “protein”.
  • small molecule drugs include alkylating agents such as naylogen mustard and cyclofasphamide, antimetabolites such as 5-fluorouracil and mesotrexe, daunomycin, bleomycin, mitomycin C, Antitumor agents such as antibiotics such as daunorubicin and doxorubicin, plant alcohols such as vincristine, vinblastine, and vindesine, and hormones such as evening moxifen and dexamethasone (Clinical Oncology (Japan Clinical Oncology) 1 9 9 6 Cancer and Chemotherapy))), or Steroids such as Hyde mouth cortisone and Prednisone, Non-Steroidal agents such as aspirin and Indomethacin, Immune chimerale, Penicillamine and other immunomodulators
  • daunomycin and antibody can be bound by binding between daunomycin and the amino group of the antibody via dartal aldehyde, or by binding the amino group of daunomycin and the carboxyl group of the antibody via water-soluble carpositimide. And the like.
  • a viral vector modified so as to be capable of binding to the anti-SPO11 antibody of the present invention can be used (for example, an adenovirus vector (Wang, P., eta 1 (1 9 9 5) Somatic Celland Molec. Genet. 2 1, 4 2 9-44 1), retroviral vector (N aviaux RK, eta 1. (1 9 9 6) J. V irol 7 0, 5 7 0 1-5 7 0 5), lentiviral vector (N a I dini, L. (1 9 9 8) C urr. O pin. B iotechno 1. 9, 4 5 7-46 3))).
  • an adenovirus vector Wang, P., eta 1 (1 9 9 5) Somatic Celland Molec. Genet. 2 1, 4 2 9-44 1
  • retroviral vector N aviaux RK, eta 1. (1 9 9 6) J. V irol 7 0, 5 7 0 1-5 7 0 5
  • lentiviral vector N
  • virus vectors include cell proliferation-related genes, apoptosis-related genes, immune regulatory genes, and other target sites (eg, colon cancer), for example, cancer cells
  • a gene (therapeutic gene) that has a therapeutic effect such as inducing apoptosis is incorporated.
  • the virus vector that binds to the anti-SP011 antibody when administered to a patient in need of gene therapy with the anti-SP011 antibody, recognizes the antigen recognized by the anti-SPO11 antibody (ie, SPO11). Can be targeted to existing sites.
  • the anti-SPO1 1 antibody and the other drug can be combined chemically or genetically.
  • “chemical bond” includes ionic bond, hydrogen bond, covalent bond, bond by intermolecular force, bond by hydrophobic interaction, etc.
  • “genetic engineering bond” For example, the binding mode between an antibody and a therapeutic protein when a fusion protein consisting of an antibody and a therapeutic protein is produced using any technique such as genetic recombination is included.
  • a cancer therapeutic agent containing the S P O 1 1 gene expression inhibitor of the present invention a cancer therapeutic agent containing a S P O l 1 protein activity inhibitor,
  • PO l 1 antibody is either a viral or non-viral vector carrying a radioisotope, therapeutic protein, small molecule drug, and therapeutic gene, or any combination of these and chemical or genetic engineering Therapeutically bound therapeutic agents can be formulated based on known techniques.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be added as necessary according to a conventional method.
  • surfactants for example, surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters, taste masking
  • the present invention is not limited to these, and other commonly used carriers can be appropriately used.
  • Examples of the dosage form of the therapeutic agent of the present invention include tablets, powders, pills, powders, granules, fine granules, soft and hard capsules, film coating agents, and pellets as oral agents.
  • Agents, sublingual agents, pastes, etc., parenteral agents include injections, suppositories, transdermal agents, ointments, plasters, liquids for external use, etc.
  • the optimum dosage form can be selected.
  • An inhibitor of the activity of the S PO 11 protein (or the expression of the S PO 11 gene) as an active ingredient can be contained in the preparation in an amount of 0.1 to 99.9% by weight.
  • the dose of the active ingredient of the drug of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, generally for patients (as 60 kg) From about 0.1 mg / day to: I, 0,000 mg, preferably from about 1.0 to: 100 mg, more preferably from about 1.0 to 50 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptom, administration method, etc.
  • patient for 60 kg About 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 O mg per day is conveniently administered by intravenous injection. .
  • the final decision can be made as appropriate based on the judgment of a doctor or veterinarian in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptoms, and the like.
  • the preparation thus obtained can be administered, for example, to humans and other mammals (eg rat, rabbit, hidge, buyu, ushi, cat, inu, monkey, etc.). it can. In the case of animals other than humans, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the therapeutic agent of the present invention is cancer (for example, colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder).
  • Prevention, treatment of uterine cancer eg cervical cancer, endometrial cancer
  • testicular cancer thyroid cancer
  • knee cancer ovarian cancer
  • brain tumor blood tumor, etc.
  • the agent of the present invention contains an SP 0 1 1 protein activity inhibitor or SPO 1 1 gene expression inhibitor as an active ingredient, it is used as an anticancer agent, cancer metastasis inhibitor, cancer cell apoptosis inducer, etc. Can do.
  • the target cell, tissue, organ, or cancer type is not limited to a specific type.
  • the agent of the present invention is both an SPO 1 1 protein activity inhibitor and an SP 0 1 1 gene expression inhibitor. May be included.
  • the antisense nucleic acid when used, the antisense nucleic acid is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus virus vector, etc. Thereafter, it can be administered according to known means.
  • Antisense nucleic acids can be formulated alone or with a physiologically acceptable carrier and administered via a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.
  • a combination of a virus vector such as a recombinant adenovirus particle and an anti-SPO11 antibody when used for cancer treatment, these may be used alone, but in general, Used with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a carrier a carrier as described above and an aqueous isotonic solution such as water, physiological saline, glucose, and human albumin are preferable.
  • additives, preservatives, preservatives, balance, etc. that are usually used in pharmaceutics can also be added.
  • the pharmaceutical composition thus prepared can be administered by an appropriate administration form and administration route depending on the disease to be treated.
  • administration forms include emulsions, syrups, force capsules, tablets, granules, injections, ointments and the like.
  • Treatment of the anti-SP 0 1 1 antibody-one virus vector particle of the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same In general, it is preferable to administer 10 3 to 10 15 virus particles at a time per adult, but this may vary depending on the disease state and the nature of the target cell / organization. Good.
  • the number of administrations may be from once to several times a day, the administration period may be from one day to several months or more, and one set is set as one to several injections, and many sets are administered intermittently over a long period of time. May be.
  • virus vector single particle or virus vector single nucleic acid molecule used in the present invention can be used for detection of specific cells and / or tissues, or diagnosis of disease states.
  • a viral vector obtained by incorporating a detectable marker gene into a nucleic acid molecule of a viral vector and transfecting it into an appropriate host cell.
  • a detectable marker gene obtained by incorporating a detectable marker gene into a nucleic acid molecule of a viral vector and transfecting it into an appropriate host cell.
  • it can be used for detecting and diagnosing tumor cells by binding a detectable label to the anti-SP011 antibody. 5.
  • the present invention also provides a diagnostic agent for cancer.
  • the diagnostic agent for cancer of the present invention comprises (a) an antibody against SPO 11 protein, or (b) a stringent sequence in the SPO 11 gene or a part of its nucleotide sequence. It contains a polynucleotide consisting of a base sequence that can be hyperpredable under high predation conditions.
  • the diagnostic method using the anti-SPO11 antibody of the present invention includes, for example, (a) a step of bringing a subject-derived biological sample into contact with an antibody against the SPOll protein, and (b) Detecting and Z or quantifying the binding of the antibody to the SPO11 protein or a partial peptide thereof or a salt thereof in the sample.
  • the labeled anti-SPO 1 1 antibody is used to detect and z or quantitate the binding between the SPO 11 protein or a fragment thereof and the anti-SP 0 11 antibody.
  • subject-derived biological sample refers to a subject-derived tissue, cell, or body fluid (for example, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.), urine, lymph, saliva, sweat, semen, etc. ) including.
  • a “subject” is usually a human subject who is or is expected to undergo a cancer screening, such as a human subject who has or is suspected of having cancer. included. Examples of such cancers are colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer. , Uterine cancer (eg, cervical cancer, endometrial cancer), testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc. Is preferred.
  • Immunoassays to detect the expression of SPO 11 in biological samples derived from subjects as described above are collected from subjects who are suspected of having cancer (eg, colorectal cancer) and at risk for cancer. And subjecting the biological sample to contact with an anti-SPO11 antibody under conditions that produce specific antigen-antibody binding, and then measuring the amount of immunospecific binding by the antibody. Such antibody binding is used to detect the presence and / or increased expression of the SP 0 11 protein. In this case, detection of increased SPO1 1 protein expression is an indicator of disease state. If necessary, the level of S P O l 1 protein in the biological sample may be compared to the level of healthy individuals who do not have cancer.
  • a biological sample such as a serum sample is contacted with a solid support or carrier such as nitrocellulose for the purpose of immobilizing all proteins present in the sample.
  • the support is then washed with buffer and subsequently treated with detectably labeled anti-SP011 antibody.
  • the solid support is then washed twice with buffer to remove unbound antibody.
  • the amount of bound antibody on the solid support is determined according to well-known methods taking measurement. The detection conditions suitable for each measurement can be appropriately determined by those skilled in the art using conventional test methods.
  • the antibody is conjugated to an enzyme, such as that used in the enzyme immunoassay (EIA) [Voi 1 er, A By “Enzyme-linked immunosorbent assay” (ELISA), 1 9 7 8, Diagnostic Horizons, 2: 1-7, Microbiological A ssociates Qu arterly Pub 1 ication, Wa lkersvi 1 le. M'D; V oi 1 er, A. by J. C li n. Pathol., 3 1: 5 0 7-5 2 0, 1 9 7 8: B utier, J. E., Me th h.
  • EIA enzyme immunoassay
  • Enzymes that bind to antibodies can be visualized, for example, by spectrophotometry.
  • an appropriate substrate preferably a chromogen.
  • Enzymes that can be used to label the antibody with a detectable label include, but are not limited to, peroxidase and alkaline phosphatase. This can be achieved by a colorimetric method using a chromogenic substrate for the enzyme.
  • RIA radioimmunoassay
  • sandwich immunoassay immunometric method
  • FIA fluorescence immunoassay
  • TRFIA time-resolved fluorescence immunoassay
  • EIA enzyme Immunoassay
  • LIA Luminescent immunoassay
  • ELIA Electrochemiluminescence immunoassay
  • Latex agglutination Immunoprecipitation Atssey, Precipitation reaction, Gel diffusion precipitation reaction, Immunodiffusion assay
  • Examples include an agglutination assay, a complement binding assay, an immunoradiometric assay, a fluorescence immunoassay, and an immunoassay selected from the group consisting of a protein A immunoassay (WO 0 1) No. 4 2 27 No. 3 page 9 9 line 25 to page 4 2 line 8 EP 1 1 1 1 1 04 7 A No. 2 paragraph [0 1 1 5] page 19 Lines 35 to 20 (see page
  • diagnosis of various diseases associated with dysfunction of S PO 11 protein can be performed by utilizing the in vivo SP 0 1 protein quantification method using the antibody of the present invention.
  • Can do For example, if an increase in the concentration of SP protein is detected, it may be caused by, for example, a disease caused by overexpression of SPO ll protein (eg, cancer (eg, colorectal cancer)). It can be diagnosed as high or likely to be affected in the future.
  • the anti-SP011 antibody of the present invention can also be used for diagnosis by i n v i v o.
  • the preparation and use of antibody preparations that can be used here are well known in the art. For example, an antibody-chelate glaze agent is described in Nuc 1. Med. Biol.
  • a probe or primer designed based on the base sequence of the SPO11 gene can be used.
  • a diagnostic method can, for example, (a) be capable of hyperpredation under high-precipitation conditions stringent to a biological sample derived from a subject and the base sequence of the SPO 11 gene or a fragment thereof.
  • a step of quantifying is a step of quantifying.
  • the DNA of the SPO 11 gene (or gene fragment thereof) in a biological sample derived from a subject is detected using the probe. And / or quantify.
  • the length of the base sequence used as a probe is, for example, 12 bases or more, 15 bases or more, 18 bases or more, 21 bases or more, 24 bases or more, 27 bases or more, 30 bases or more, or even longer It may be a polynucleotide fragment of length.
  • the low, medium or high stringency conditions described above may be used.
  • a base sequence (antisense polynucleotide) complementary to the base sequence of the SPO11 gene or a fragment thereof is also included.
  • Methods of hybridization of probes and nucleic acids are known to those skilled in the art, such as International Publication No. 8 9 0 6 6 9 8, EP—A 0 2 0 0 3 6 2, US Patent No. 2, 9 1 5, 0 8 2, EP_A 0 0 6 3 8 7 9, EP-A 0 1 7 3 2 5 1, EP—A 0 1 2 8 0 1 8
  • a target sequence can be detected or quantified using a known method using a specific polynucleotide probe or primer for the SP 0 11 gene.
  • known methods include Southern hybridization, Northern hybridization, RT-PCR method, PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, 8 7 4 Pp. 8 7 9 (1 9 8 9)), Proceedingsofthe National Academy of Sciences of United States of America, Vol. 8 6, 2 7 6 6-2 7 7 0 (1 9 8 9 years))), FISH method, DNA chip or array GH (Com parative Genomic Hybridization) method can be used. Quantitative detection can be performed by quantitative RT-PCR.
  • the array C GH method is an application of the chromosomal C GH method (K allioni em i, A. eta 1. (1 9 9 2) Science 2 5 8, 8 1 8-8 2 1). DN with high density spotted genomic DNA fragments (BAC, PAC, YAC, etc.) covering the chromosomal region
  • BAC high density spotted genomic DNA fragments
  • YAC YAC
  • This is a method to detect abnormal DNA copy number in cancer with high resolution (Pinke 1, D. eta 1. (1 9 9 8) N at. G enet.
  • the mRNA level of the SPO11 of the cell is measured using a standard gene (housekeeping gene (eg, Shaper, N. L. et al., J. Mammary G land B iol. Neoplasia 3 (1 9 9 8) 3 1 5-3 2 4; Wu, Y. Y. and Rees, J. L.. It can also be compared with the mRNA level of rm. V enereo 1.80 (2 0 0 0) 2—3), preferably by RT-PCR.
  • a standard gene housekeeping gene (eg, Shaper, N. L. et al., J. Mammary G land B iol. Neoplasia 3 (1 9 9 8) 3 1 5-3 2 4; Wu, Y. Y. and Rees, J. L.. It can also be compared with the mRNA level of rm. V enereo 1.80 (2 0 0 0) 2—3), preferably by RT-PCR.
  • the target sequence (DNA, mRNA, etc.) is detected and quantified by the above-mentioned method and overexpression of the SP ⁇ 1 1 gene is confirmed, for example, a disease caused by overexpression of SPO1 1 (for example, it can be diagnosed that the cancer is likely to be cancer (eg, colorectal cancer)) or is likely to be affected in the future.
  • a disease caused by overexpression of SPO1 1 for example, it can be diagnosed that the cancer is likely to be cancer (eg, colorectal cancer)) or is likely to be affected in the future.
  • the presence of a target protein or a fragment thereof in a test sample can be identified using a mass spectrometer (MS). That is, by using a mass spectrometer, it is possible to determine the amisoacid sequence of the target protein or a fragment thereof, and determine whether or not the SPO 11 protein is present in the biological sample derived from the subject. be able to.
  • mass spectrometry a sample such as protein or peptide is ionized using MS, separated according to the obtained mass Z charge (m / z), and the intensity of the sample is measured to determine the mass of the sample. It is. So From the results of mass spectrometry, individual amino acids constituting the amino acid sequence of proteins and peptides can be identified.
  • ionization various methods such as matrix assisted laser desorption (MAL DI), electrospray ionization (ESI), gas phase (EI, CI), field desorption (FD), etc.
  • MAL DI matrix assisted laser desorption
  • ESI electrospray ionization
  • EI gas phase
  • FD field desorption
  • an ion separation method compatible with the ionization method is used.
  • a time-of-flight type timeoff 1 ight: TO F
  • ESI a quadrupole Mass spectrometers such as type (QMS), ion trap type, and magnetic field type are used.
  • Mass spectrometers are sometimes used in tandem.
  • sequencing using a sequencer eg, gas phase sequencer
  • sequencing using a sequencer eg, gas phase sequencer
  • the present invention also provides a kit for detecting and / or quantifying the SP0 ⁇ 1 protein or a fragment thereof in a body fluid sample of a subject containing an anti-SPO11 antibody as a cancer marker.
  • the SPOll gene or a fragment thereof in a biological sample derived from a subject which contains a base sequence that can be highly prehybridized under stringent high prehybridization conditions in the SPOll gene or a part of the base sequence.
  • kits for detecting and / or quantifying as a cancer marker are used to detect the best of cancer by the above-described immunological technique or the hyperpredation method.
  • cancers examples include colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, and uterus.
  • cervical cancer, endometrial cancer testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc.
  • colorectal cancer is particularly preferable.
  • cancer marker refers to a subject's body fluid (eg, blood, urine, lymph, saliva, sweat, semen, etc.) or cells or tissues that are not derived from normal tissues, or This refers to a molecule that is selectively upregulated in cancer cells or tissues, and the presence of the molecule in the body fluid or cells or tissues of a subject indicates or suggests the presence of cancer.
  • the kit of the first embodiment contains a component for detecting and / or quantifying SPO1 1 antigen (including SPO1 1 protein and its partial peptide) in a body fluid sample from a subject.
  • a component for detecting and / or quantifying SPO1 1 antigen including SPO1 1 protein and its partial peptide
  • SPO 1 1 protein is detected and Z or quantified by ELISA
  • such a component can detect and / or detect the level of SP 0 1 1 in, for example, a tissue section or a body fluid sample such as blood or urine.
  • Such antibodies may be labeled with radioactivity, fluorescence, colorimetry, or enzyme labeling.
  • the kit of the present invention may contain a labeled secondary antibody.
  • the kit according to the second embodiment contains a polynucleotide having a base sequence that can be hybridized under high hybridization conditions stringent to the SPO11 gene or a partial base sequence thereof.
  • the kit of the present invention may contain the above-mentioned polynucleotide immobilized on a DNA chip.
  • the kit of the present invention comprises, in addition to a base sequence that can be highly pre-polymerized under anti-SPO11 antibody, SP011 gene or a part of its base sequence under high-precipitation conditions, a container and It may contain a label.
  • the label on or with the container may indicate that the drug is used to detect colorectal cancer markers.
  • other items such as instructions for use may be further included.
  • Example 1 Identification of colon cancer specific amplification gene by array C GH method
  • sample preparation of 200 colorectal cancer specimens and verification based on the array CGH method were performed.
  • NC BI Genetic Information
  • SPACC 11 SPO ll me iotic proteincovalently bound to DSB— 1 ike (S. Cerevisiae)
  • the gene was found to be frequently and highly elevated in colorectal cancer patients ( Figure 1 and Table 2).
  • Example 2 Verification of gene amplification in a colon-derived cultured cell line
  • the amplification in a colon cancer-derived cultured cell line was verified for a high-frequency gene region in colon cancer patients. did.
  • the cultured cell lines used were Caco 2 and RKO, which are cell lines derived from colorectal cancer.
  • Genomic DNA was extracted from the cultured cells according to the protocol attached to the kit using BLOOD & CELCUlTureDNAKit (QIAGEN).
  • Table 3 shows the degree of amplification (GZ R value) of the S P O l 1 gene in a cell line derived from colorectal cancer. As shown, in the colon cancer-derived cell line, it was found that amplification occurred in the SP 0 1 1 gene located in B AC Clone RP 1 1 — 6 71 P 16.
  • Quantitative PCR was performed to confirm the amplification of the SPO11 gene region. Quantitative PCR can be performed using S YB RG reen RT-PCRR eagents (A pp 1 ied B iosys te rn s) according to the attached protocol. A pp 1 ied B iosyst ern s) It was. The following sequences were synthesized (outsourced to OPER ON) and used as primers.
  • Table 4 shows the degree of amplification of the SPO1 gene in a colon cancer-derived cell line. Values are relative to control DNA (normal). As shown in the figure, it was found that also in the colon cancer-derived cell line, amplification occurred in the SPO11 gene region.
  • the SPO l 1 gene which was frequently amplified in 200 colorectal cancer patients, was a colon cancer-derived cell line, and gene amplification was observed at the genomic level.
  • RNA i analysis was performed and the phenotype was observed.
  • the cell line was purchased from ATCC and cultured according to the attached protocol.
  • s i RN A a specific 21 mer within the gene was selected and s 1 RNA was synthesized with the sequence as the target (commissioned to QIAGEN).
  • the guide of siRNA into RK0 cells was Lipofectamine (Invitrogen), and 5 OnM siRNA was introduced into the cells according to the attached protocol call.
  • 5 OnM siRNA was introduced into the cells according to the attached protocol call.
  • N egative Control 1 siRNA QI AGE N was used. The cells were observed under an inverted microscope for 4 days after introduction into the cells.
  • siRNA is verified at the mRNA level using the quantitative RT-PCR method. From the cells 24 hours after introduction of siRNA, total RNA is extracted according to the attached protocol using Micro-t o -Mid iT o ltR N APu r if i c i t i o n S y s t ern (I nv i t ro g e n).
  • Quantitative PCR is performed using SYBRG reen RT—PCRR eagents Use (A pplied B iosyste rn s) and follow the attached protocol 7 7 500 0 Real -Time PCRS ystem
  • G lyceraldehyde — 3 phosphatedehydrogenase (GA PDH) Control Reagents (A pplied Biosyste rn s) as the standard gene for calculating the relative ratio, and calculate the relative ratio of GA PDH. . Measurement of viable cell count>
  • RNAi analysis of the SPO11 gene was performed using RKO, a cell line derived from colorectal cancer.
  • Fig. 2 shows the observed images on day 4 after Transfection of the SPOll gene siRNA in RKO cells (upper: X40; lower: X2200).
  • a, b, and c are 3 types of siRNA of the SPO 11 gene, respectively, and NC indicates a negative control.
  • NC N egative Control
  • Fig. 3 shows the results of measuring the number of viable cells using the measurement reagent on the 4th day after Transfection of SPO 11 gene siRNA to RK0 cells. The graph shows the relative amount to NC.
  • N egative Control 1 NC
  • Example 4 Functional analysis by RN Ai analysis using normal colon-derived cell lines
  • RN A 1 analysis was performed using cell lines derived from normal tissue of the large intestine, thereby suppressing the target gene. Has been verified to be cancer specific.
  • CCD18Co purchased from ATC was used. The culture conditions were in accordance with the attached protocol. The c sequence of Example 3 was used as the s 1 RNA used.
  • Lipofect iNe2200 Invitrogen was used, and 25 nM of siRNA was introduced into the cells according to the attached protocol.
  • N ega tiv e C o n t r o l s i RNA Q I AG EN was used. The cells were observed under an inverted microscope for 5 days after introduction.
  • RNA 1 in the SP ⁇ 1 1 gene a cell line CCD 1 8 Co derived from normal colon tissue, are as follows.
  • FIG. 4 shows an observation image obtained on the 5th day after siRNA of the SPO11 gene was transformed into CCD18Co cells (upper: X40; lower: X2200).
  • S P O l l c is a s i R N A 1 species of the S P O l l gene (c sequence of Example 3), and N C represents a negative control.
  • phenotypic observations were similar to NC and no effect was observed (Figure 4).
  • FIG. 5 shows the results of measuring the number of viable cells with the measurement reagent using the cells on the 5th day after the S rRNA of the SPO11 gene was transformed into CCD18Co cells by Transfection.
  • the graph shows the relative amount with respect to NC.
  • NC N ega tiv corn ol
  • the organ-specific expression of the SP011 gene in normal tissues was evaluated by the Northern hyperprecipitation method known in the art.
  • RNA Probe Using MTN Multiple Tissue Northern Blots (Clontech), hybridization was performed with 1,190 nt (NM_012444: 94–1284) RNA Probe according to the attached protocol.
  • RNA level expression in normal organ tissues 23 organs (Heart, Brain, Placenta, Lung) (Lung), Liver, Skeletal Muscle, Kidney, Pancreas, Spleen, Thymus, Prostate, Testis, Ovary (Ovary), Small Intestine, Colon, Peripheral Blood Leukocyte, Stomach, Thyroid, Spinal Cord, Lymph Node, Trachea ( Trachea), adrenal gland, and bone marrow were analyzed by the Northern hybridization method. As described above, the SPO ll gene sequence is registered in NCBI (http://www.ncbi.nlni.nih.gov) as Accession No.
  • Fig. 7 shows optical micrographs (fluorescence images) of some of the cancer cells (for 6 cells) observed in each specimen tissue (J). As shown, more than 3 spots were found in cancer cells. It was confirmed that the SPO11 gene region was amplified in 10 specimens whose gene amplification degree (G / R) was 1.2 or more by the array CGH method. It was also shown that gene amplification occurred from the early stage to the late stage of the disease state. This indicates that the SPOll gene region can be applied not only as a molecular target for cancer therapeutics but also in cancer diagnosis by FISH.
  • Example 7 Detection of SP 0 11 protein in blood by mass spectrometry
  • Serum specimen of colorectal cancer patient 10L and healthy subject serum specimen lO ⁇ L are diluted with 500L of diluted buffer solution (10mM Tris HC1 h 7.4 + 150mM NaCl), then ProteomeLab IgY-12 SC proteome partitioning kit (BECKMAN COULTER: A24618) was used to remove albumin, globulin, and other blood and serum proteins. Dithiothreitol (Wako: 049-08972) was added to the obtained fraction to a final concentration of 10 mM, and the reduction reaction was performed at 60 for 30 minutes.
  • diluted buffer solution 10mM Tris HC1 h 7.4 + 150mM NaCl
  • ProteomeLab IgY-12 SC proteome partitioning kit (BECKMAN COULTER: A24618) was used to remove albumin, globulin, and other blood and serum proteins. Dithiothreitol (Wako: 049-08972) was added to the obtained fraction to a final concentration of 10
  • Fig. 8A and Fig. 8B show the results of analysis of (A) serum derived from colorectal cancer patients and (B) serum derived from healthy subjects by the methods described above.
  • FIGS. 9A to C show the correspondence between the peak shown in FIG. 8 and amino acids (or amino acid sequences) determined by MS / MS analysis.
  • an ion peak corresponding to the fragment ion of the target molecule was clearly observed in the serum from colorectal cancer patients. That is, as shown in FIG. 9B, a partial sequence called IT FA PAE was determined at least from the C-terminal side, which was determined from positions 6 6 to 7 2 in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the S PO ll protein. It corresponds to the amino acid sequence of the position. Therefore, as shown in FIG. 9A, a target peptide fragment (SEQ ID NO: 13) having amino acid sequences 66 to 75 was identified.
  • SPO 11 gene knockdown showed a growth-inhibiting effect, but the effect of cervical cancer cell lines was evaluated using the RNAi analysis method described above. .
  • RNAi analysis was performed using the above three siRNAs.
  • O 1 igofe tame ine (Invitrogen) was used, and 100 nM of siRNA was introduced into the cells according to the attached protocol.
  • Nega tiv corn ol s si RNA (Q I AGE N) was used. Clue 3 ⁇ 4
  • Fig. 10 shows the results of measuring the number of viable cells (MTT assay) using the reagent on the 4th day after Transfection of SPO11 gene siRNA to HeLa cells.
  • the graph shows the relative amount with respect to NC (Negative control siRNA (Qiagen)).
  • NC Negative control siRNA (Qiagen)
  • the present invention provides cancer therapeutic agents, diagnostic agents, diagnostic methods, therapeutic methods, kits used therefor, and the like. Therefore, the present invention is useful in fields such as cancer diagnosis or targeted therapy.

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Abstract

It is intended to provide a therapeutic agent for cancer containing an expression inhibitor or activity inhibitor of SPO11 protein; a method for screening a compound which can be used as an active ingredient of such a therapeutic agent; an antibody against the SPO11 protein; a diagnostic agent for cancer/a diagnostic method for cancer using the antibody and the like.

Description

明細書  Specification
S P O l 1遺伝子の治療的又は診断的用途 技術分野 Therapeutic or diagnostic use of S P O l 1 gene
本発明は、 がんにおいて特異的に増幅している遺伝子である S P O 1 1遺伝子、 その治療的又は診断的用途などに関する。 背景技術  The present invention relates to a S P O 1 1 gene that is a gene specifically amplified in cancer, its therapeutic or diagnostic use, and the like. Background art
悪性腫瘍 （がん） の特徴として、 増殖 · 浸潤 · 転移を経て全身化する ことによる致死があげられる。 外科的な切除または放射線治療のような 局所療法では、 転移性再発がんに対して十分な対処はできず、 全身療法 である薬物療法の発展が、 今後のがん治療成績の向上に期待されている。 がん薬物療法の現在の中心である化学療法は、 直接がん細胞の D N A および または R N Aに作用し、 細胞を死に至らせる殺細胞薬剤を用い る場合が多いが、 がん細胞以外の、 例えば、 骨髄細胞、 生殖細胞、 毛母 細胞、 消化管上皮細胞など分裂がさかんな正常細胞に対しても作用し、 強い副作用をもたらしていた。 一方、 近年の分子細胞生物学の進歩によ り、 がん細胞の浸潤 · 増殖 · 転移などにかかわるメカニズムが解明され、 そのがん細胞の特定メカニズムに特異的に作用する分子標的薬の開発が 注目されている。 代表例として、 非小細胞肺がんの治療に効果のある E G F R (上皮成長因子受容体） 、 チロシンキナーゼ阻害剤であるィ レツ サ （一般名 ： ゲフイチニブ） （W〇 9 6 3 3 9 8 0 ) 、 乳がんの治療 に効果のある H E R— 2 (ヒ ト上皮成長因子受容体 2 ) のヒ ト化モノク ローナル抗体のハーセプチン （一般名 ： トラスッズマブ） （W 0 9 4ノ 0 0 1 3 6 ) などがあげられる。 しかしながら、 現状では未だ有効な分 子標的薬は少なく、 今後更なる各がん種に対する有効な分子標的薬の開 発が望まれている。  Malignant tumors (cancers) are characterized by lethality due to generalization through proliferation, invasion, and metastasis. Local therapies such as surgical resection or radiation therapy cannot adequately address metastatic recurrent cancer, and the development of systemic pharmacotherapy is expected to improve the outcome of cancer treatment in the future. Yes. Chemotherapy, which is the current center of cancer drug therapy, often uses cell killing agents that directly act on the DNA and / or RNA of cancer cells and cause the cells to die. It also acted on normal cells such as bone marrow cells, germ cells, hair matrix cells, and gastrointestinal epithelial cells, and had strong side effects. On the other hand, recent advances in molecular cell biology have elucidated the mechanisms involved in cancer cell invasion, proliferation, and metastasis, and the development of molecular targeted drugs that specifically act on the specific mechanisms of cancer cells. Attention has been paid. Representative examples are EGFR (epidermal growth factor receptor) effective for the treatment of non-small cell lung cancer, tyrosine kinase inhibitor iletsa (generic name: gefitinib) (W 9 6 3 3 9 8 0), Herceptin (generic name: trastuzumab), a humanized monoclonal antibody to HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2), which is effective in the treatment of breast cancer It is done. However, there are still few effective molecular targeted drugs at present, and further development of effective molecular targeted drugs for each cancer type is desired in the future.
日本人の大腸がんは年々増加の傾向にあり、 死亡数は、 肺がん、 胃が んに次いで 3位になっている。 年齢別では 6 0歳代が一番多く、 次いで 5 0歳代、 7 0歳代の順である。 大腸がんの増加の原因には、 遺伝的要 因、 環境的要因などが考えられるが、 .食生活の西欧化、 特に動物性脂肪 の取りすぎが原因ではないかと指摘されている。 大腸がんの有効な分子 標的薬の開発が待たれている。 また、 診断に用いられている腫瘍マーカ 一 （C E A， C A 1 9 - 9 ) は、 進行大腸がんであっても約半数が陽性 を示すのみで、 臓器特異性も無く、 より高性能な診断薬の開発が望まれ ている。 発明の開示 Japanese colon cancer tends to increase year by year, and the number of deaths is lung cancer and stomach It is in 3rd place. By age, 60s is the most common, followed by 50s and 70s. The cause of the increase in colorectal cancer may be genetic factors or environmental factors, but it has been pointed out that Western diets, especially excessive consumption of animal fat, may be the cause. Development of an effective molecular target drug for colorectal cancer is awaited. In addition, about half of the tumor markers used for diagnosis (CEA, CA 19-9) are positive even in advanced colorectal cancer, with no organ specificity, and higher performance diagnostic agents. Development is desired. Disclosure of the invention
上記のような状況下で、 がんを治療および または診断するための新 たな薬剤または方法が求められている。  Under these circumstances, new drugs or methods are needed to treat and / or diagnose cancer.
特に、 がんに対して特異性の高い治療薬および Zまたは診断薬が求め られている。 ―  In particular, there is a need for highly specific therapeutic agents and Z or diagnostic agents for cancer. -
上記のような状況に鑑み、 本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 が ん （特に、 大腸がん） において高頻度に増幅が起きている遺伝子が、 S P O l 1遺伝子であることを見出した。 本発明者らはさらに、 大腸がん 細胞株ならびに子宮頸がん細胞株において S P O 1 1タンパク質の発現 を阻害することによって、 癌細胞の増殖を抑制し得ることを見出し、 本 発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、 以下に記載するがん治 療剤、 がん抑制作用を有する候補物質のスクリーニング方法、 がん診断 剤、 がん診断用キッ ト、 がんの診断方法などを提供する。  In view of the above situation, as a result of intensive studies, the present inventors have determined that the gene that is frequently amplified in cancer (especially colorectal cancer) is the SPO l 1 gene. I found it. The present inventors have further found that cancer cell growth can be suppressed by inhibiting the expression of SPO11 protein in colorectal cancer cell lines and cervical cancer cell lines, and to complete the present invention. It came. That is, the present invention provides the following cancer therapeutic agents, screening methods for candidate substances having a cancer suppressive action, cancer diagnostic agents, cancer diagnostic kits, cancer diagnostic methods, and the like.
( 1 ) S P O l 1遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん 治療剤。  (1) A cancer therapeutic agent comprising a substance that inhibits the expression of the SPO1 gene as an active ingredient.
( 2 ) 上記 S P O 1 1遺伝子の発現阻害物質が、  (2) The S P O 11 gene expression inhibitor is
( a ) S P〇 1 1遺伝子の発現を R N A i効果により阻害する作用を 有する核酸、  (a) a nucleic acid having an action of inhibiting the expression of the SP 0 11 gene by the R N Ai effect,
( b ) S P〇 1 1遺伝子もしくはその一部、 またはその転写産物に対 するアンチセンス核酸、 ( c ) S P〇 1 1遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、 (b) SP〇1 1 gene or a part thereof, or an antisense nucleic acid for the transcript, (c) Decoy nucleic acid for SP〇1 1 gene or a part thereof,
( d ) S P O 1 1遺伝子またはその一部に対してドミナントネガティ ブに作用する S P〇 1 1遺伝子変異体  (d) SPO1 1 gene mutant that acts dominantly on S P O 1 1 gene or part thereof
( e ) S P〇 1 1遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザィム活 性を有する核酸、  (e) a nucleic acid having a ribozyme activity that specifically cleaves the transcript of the SP 0 11 gene;
および and
( f ) S P〇 1 1遺伝子の転写または S P O 1 1 mRNAの翻訳を 阻害する化合物 （上記核酸を除く）  (f) Compounds that inhibit the transcription of SPO1 1 gene or translation of SPO1 1 mRNA (excluding the above nucleic acids)
からなる群から選択される物質を含む、 上記 （ 1 ) に記載のがん治療剤。 ( 3 ) S P O 1 1タンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有する がん治療剤。 The cancer therapeutic agent according to (1) above, comprising a substance selected from the group consisting of: (3) A cancer therapeutic agent comprising an S P O 1 1 protein activity inhibitor as an active ingredient.
(4) 上記 S P〇 1 1タンパク質の活性阻害物質が、 '  (4) The above S P 0 1 1 protein activity inhibitor is
(a) 該 S P〇 1 1タンパク質に対する抗体、  (a) an antibody against the SP0 1 1 protein,
( b ) 該 S P σ 1 1タンパク質に対してドミナントネガティブの性質 を有する S Ρ〇 1 1タンパク質変異体、 および、  (b) an S 1 1 1 protein variant having a dominant negative property with respect to the S P σ 1 1 protein, and
( c ) 該 S P O l 1タンパク質に結合する化合物 （上記抗体および変 異体を除く）  (c) Compound that binds to the SPO1 protein (excluding the above-mentioned antibodies and variants)
からなる群から選択される物質を含む、 上記 （ 3) に記載のがん治療剤。The cancer therapeutic agent according to (3) above, comprising a substance selected from the group consisting of:
( 5 ) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 上記 （ 1 ) 〜 (4) のいずれかに記載のがん治療剤。 (5) The cancer therapeutic agent according to any one of (1) to (4) above, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.
(6 ) S P O l 1遺伝子の発現阻害物質をスクリーニングする方法であ つて、  (6) A method for screening a substance that inhibits the expression of S P O l 1 gene,
( a ) S P O 1 1遺伝子を発現する細胞に、 被検化合物を接触させる 工程、  (a) a step of bringing a test compound into contact with a cell expressing the SPO1 1 gene,
(b) 該 S PO 1 1遺伝子の発現レベルを測定する工程、 および (b) measuring the expression level of the S PO 1 1 gene; and
(c ) 被検化合物を接触させない場合と比較して、 該発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程を包含する、 スクリーニング方法。 (c) A screening method comprising a step of selecting a compound that reduces the expression level as compared with a case where a test compound is not contacted.
( 7 ) S P O 1 1タンパク質の活性阻害物質をスクリーニングする方法 であって、 (a) S P O l 1タンパク質と被検化合物とを接触させる工程、(7) A method of screening for an activity inhibitor of SPO11 protein, comprising: (a) contacting the SPO l 1 protein with a test compound;
(b) 該 S P O l 1タンパク質と被検化合物との結合活性を測定する 工程、 および (b) measuring the binding activity between the S P O l 1 protein and the test compound; and
( c ) 該 S P O l 1タンパク質と結合する化合物を選択する工程を包 含する、 スクリーニング方法。  (c) A screening method comprising a step of selecting a compound that binds to the SPO1 1 protein.
(8 ) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 上記 （ 6 ) また は （ 7 ) に記載の方法。  (8) The method according to (6) or (7) above, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.
( 9) S P O 1 1タンパク質に対する抗体。  (9) An antibody against S P O 1 1 protein.
( 1 0 ) 上記 （9 ) に記載の抗体を含有するがん治療剤。  (10) A cancer therapeutic agent comprising the antibody according to (9) above.
( 1 1 ) 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低分子の薬剤、 または治療 遺伝子を担持したベクターをさらに含有する、 上記 （ 1 0 ) に記載のが ん治療剤。 ' (11) The cancer treatment agent according to (10), further comprising a vector carrying a radioisotope, a therapeutic protein, a low molecular drug, or a therapeutic gene. '
( 1 2 ) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 上記 （ 1 0 ) または （ 1 1 ) に記載のがん治療剤。 (1 2) The cancer therapeutic agent according to (1 0) or (1 1) above, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.
( 1 3 ) 上記 （9 ) に記載の抗体を含有するがん診断剤。  (1 3) A cancer diagnostic agent comprising the antibody according to (9) above.
( 1 4) S P O 1 1遺伝子またはその一部の塩基配列にス トリンジェン 卜なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列を 含有するがん診断剤。  (14) A diagnostic agent for cancer, comprising a base sequence that can be hypridated under stringent high-prediction conditions in the SPO11 gene or a part of the base sequence thereof.
( 1 5 ) 上記がんが大腸がんである、 上記 （ 1 3 ) または （ 1 4) に記 載のがん診断剤。  (15) The cancer diagnostic agent according to (13) or (14), wherein the cancer is colorectal cancer.
( 1 6 ) 上記 （9 ) に記載の抗体を含有するがん診断用キッ ト。  (16) A cancer diagnostic kit containing the antibody according to (9) above.
( 1 7 ) S P O 1 1遺伝子またはその一部の塩基配列にス トリンジェン 卜なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列か らなるポリヌクレオチドを含有するがん診断用キッ ト。  (17) A kit for cancer diagnosis containing a polynucleotide comprising a base sequence that can be hyper-predated under stringent high-precipitation conditions.
( 1 8 ) 上記がんが大腸がんである、 上記 （ 1 6 ) または （ 1 7 ) に記 載のがん診断用キッ ト。  (18) The cancer diagnostic kit as described in (16) or (17) above, wherein the cancer is colon cancer.
( 1 9 ) 被験者由来の生体試料中の S P O 1 1タンパク質または S P〇 1 1遺伝子をがんマーカーとして検出および/または定量する方法。 (19) A method for detecting and / or quantifying SPO1 1 protein or SPO1 1 gene in a biological sample derived from a subject as a cancer marker.
( 2 0 ) 前記生体試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 上記 （ 1 9 ) に記載の方法。 (20) The biological sample is whole blood, serum, or plasma, (1 9) Method described in the above.
( 2 1 ) 質量分析装置を用いて、 S P〇 1 1タンパク質を検出およびノ または定量する、 上記 （ 1 9) または （ 2 0) に記載の方法。  (2 1) The method according to (19) or (20) above, wherein the SP 0 1 1 protein is detected and determined or quantified using a mass spectrometer.
( 2 2 ) 抗 S P O 1 1抗体を用いて、 S P O l 1タンパク質を検出およ び または定量する、 上記 （ 1 9 ) 〜 （ 2 1 ) のいずれかに記載の方法。 ( 2 3 ) ( a) 被験者由来の生体試料と、 S P O 1 1夕ンパク質に対す る抗体とを接触させる工程、 および  (2 2) The method according to any one of (19) to (21) above, wherein the SPO1 protein is detected and quantified using an anti-SPO1 1 antibody. (2 3) (a) a step of contacting a biological sample derived from a subject with an antibody against SPO1 1 protein; and
(b) 上記試料中での上記抗体と、 S P O l 1タンパク質との結合を 検出および Zまたは定量する工程、  (b) detecting and Z or quantifying the binding between the antibody in the sample and the S P O l 1 protein,
を包含する、 上記 （2 2 ) に記載の診断方法。 The diagnostic method according to (2 2), comprising:
( 24 ) ( a) 被験者由来の生体試料と、 S P〇 1 1遺伝子またはその 断片の塩基配列にス トリ ンジェン卜なハイプリダイゼーション条件下で ハイプリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを接触させ る工程、 および  (24) (a) A biological sample derived from a subject is brought into contact with a polynucleotide having a base sequence that can be hybridized to a base sequence of the SP011 gene or a fragment thereof under stringent high-prediction conditions. And
(b) 上記試料中での上記ポリヌクレオチドと、 S P O l l遺伝子ま たはその断片とのハイプリダイゼーションを検出および/または定量す る工程、 ， を包含する、 上記 （ 1 9 ) または （ 2 0 ) に記載の方法。  (b) detecting and / or quantifying the hybridization between the polynucleotide in the sample and the SPO ll gene or a fragment thereof, comprising the above (19) or (20 ) Method.
( 2 5 ) がんの診断に用いるための上記 （ 1 9 ) 〜 （ 2 4) のいずれか に記載の方法。  (25) The method according to any one of (19) to (24) for use in diagnosis of cancer.
( 2 6 ) 前記がんが、 大腸がんである、 上記 （ 2 5 ) に記載の方法。 (26) The method according to (25), wherein the cancer is colorectal cancer.
( 2 7 ) S PO 1 1遺伝子の発現阻害物質を患者に投与する工程を包含 する、 がん治療方法。 (2 7) A method for treating cancer, comprising a step of administering an expression inhibitor of SPO11 gene to a patient.
( 2 8 ) S P O 1 1タンパク質の活性阻害物質を患者に投与する工程を 包含する、 がん治療方法。 .  (2 8) A method for treating cancer, comprising a step of administering a S P O 11 protein activity inhibitor to a patient. .
( 2 9 ) がんを治療するための医薬の製造のための、 S P O l l遺伝子 の発現阻害物質の使用。  (29) Use of a substance that inhibits the expression of S P O l l gene for the manufacture of a medicament for treating cancer.
( 3 0 ) がんを治療するための医薬の製造のための、 S P〇 1 1タンパ ク質の活性阻害物質の使用。 ( 3 1 ) 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 配列番号 8、 配列番号 9、 または配列番号 1 0の塩基配列を有する、 ポリヌクレオチド。 (3 0) Use of a SP 0 11 protein activity inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer. (3 1) A polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 10.
( 3 2 ) S P O 1 1遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するが ん治療剤であって、 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 配列番号 8、 配列番号 9、 または配列番号 1 0の塩基配列を有するポリヌクレオチド を含有する、 がん治療剤。  (3 2) A cancer therapeutic agent containing an SPO 11 gene expression inhibitor as an active ingredient, which is SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 1. A cancer therapeutic agent comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence of 0.
本発明により、 がん （例えば、 大腸がん） の治療および または診断 に有用な新規な薬剤、 キッ トおよび方法、 ならびにがん抑制作用を有す る候補化合物のスクリ一二ング方法が提供される。 図面の簡単な説明  INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides novel drugs, kits and methods useful for the treatment and / or diagnosis of cancer (for example, colorectal cancer), and a screening method for candidate compounds having cancer suppressive activity. The Brief Description of Drawings
図 1 は、 S P〇 1 1遺伝子の大腸がん患者由来の 2 0 0検体【こおける 遺伝子増幅度に対する頻度を示すヒス 卜グラムである。  Fig. 1 is a histogram showing the frequency of gene amplification in 20 samples from patients with colorectal cancer of the SP 0 11 gene.
図 2は、 大腸がん細胞株 R K Oに、 S P O 1 1遺伝子の s i R N Aを トランスフエク 卜した場合の、 RN A i解析の結果を示す光学顕微鏡写 真（位相差像）である。  Fig. 2 is an optical micrograph (phase contrast image) showing the results of RNAI analysis when s siRNA of the SPO1 1 gene was transferred to the colon cancer cell line RKO.
図 3は、 大腸がん細胞株 RKOに S P O 1 1遺伝子の s i RNAをト ランスフエク トした場合の、 生細胞数測定による R N A i効果を評価し た結果を示すグラフである。  FIG. 3 is a graph showing the results of evaluating the R N Ai effect by measuring the number of viable cells when the SPO11 gene siRNA was transfected into the colorectal cancer cell line RKO.
図 4は、 大腸正常組織由来の細胞株 C C D 1 8 C oに S P O l 1遺伝 子の s i R NAをトランスフエク 卜した場合の、 R NA i効果を光学顕 微鏡により検証した結果を示す写真（位相差像）である。  Fig. 4 is a photograph showing the results of verifying the RNAi effect using an optical microscope when the SPO l 1 gene siRNA was transfected into a cell line CCD 18 Co derived from normal colon tissue. (Phase contrast image).
図 5は、 大腸正常組織由来の細胞株 C C D 1 8 C oに S P O l 1遺伝 子の s i R N Aをトランスフエタ トした場合の、 RNA i効果を生細胞 数測定により検証した結果.を示すグラフである。  Fig. 5 is a graph showing the results of verifying the RNA i effect by measuring the number of viable cells when the SPO l 1 gene si RNA was transfected into the cell line CCD 18 Co derived from normal colon tissue. is there.
図 6は、 正常な種々の臓器組織を用いて行ったノーザンハイブリダィ ゼ一ションの結果を示す写真である。  Fig. 6 is a photograph showing the results of Northern hybridization performed using various normal organ tissues.
図 7 は、 FISH 法で解析した大腸癌患者由来の検体組織のがん細胞の 一部 （ 6細胞分） の光学顕微鏡写真（蛍光像）である。 図 8 Aおよび図 8 Bは、 質量分析により解析した （A) 大腸がん患者 由来の血清および （B) 健常者由来の血清についての結果をそれぞれ示 すグラフである。 Fig. 7 is an optical micrograph (fluorescence image) of a portion (6 cells) of cancer cells in a sample tissue derived from a colon cancer patient analyzed by the FISH method. FIG. 8A and FIG. 8B are graphs showing the results of (A) serum derived from a colon cancer patient and (B) serum derived from a healthy subject analyzed by mass spectrometry, respectively.
図 9 A〜Cは、 M S/M S解析によって決定された、 図 8に示すピー クとアミノ酸 （またはアミノ酸配列） との対応関係を示す。  9A to 9C show the correspondence between the peak shown in FIG. 8 and amino acids (or amino acid sequences) determined by MS / MS analysis.
図 1 0は、 子宮頸癌細胞株 HeLa 細胞株に S P O 1 1遺伝子の s i R N A を トランスフエク トした場合の、 R N A i効果を生細胞数測定に より検証した結果を示すグラフである。  FIG. 10 is a graph showing the results of verifying the R N Ai effect by measuring the number of living cells when s i R N A of the SPO 11 gene was transfected into a cervical cancer cell line HeLa cell line.
図 1 1は、 図 1 0の実験を時系列に従い、 顕微鏡下で撮影し、 その動 態を詳細に観察した結果を示す光学顕微鏡写真（微分干渉像）である。 発明を実施するための最良の形態  Fig. 11 is an optical micrograph (differential interference image) showing the result of observing the behavior of the experiment of Fig. 10 in time series under a microscope and in detail. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明者らは、 大腸がん患者由来の検体を用いてアレイ C GH法によ る増幅遺伝子の検証を行い、 大腸がん特異的な遺伝子増幅領域を特定し た。 検体において高頻度に増幅が起きている領域のうち、 ヒ ト S P O l 1 ( S P O 1 1 m e i o t i c r o t e i n c o v a 1 e n t 1 y b o u n d t o D S B— l i k e ( S . c e r e v i s i a e ) ) 遺伝子が大腸がん患者由来の検体において高頻度であること を見出した。  The inventors of the present invention verified a gene amplified by the array CGH method using a sample derived from a colon cancer patient, and identified a gene amplification region specific to colorectal cancer. Of the regions where amplification occurs frequently in the specimen, the human SPO l 1 (SPO 1 1 meioticroteincova 1 ent 1 yboundto DSB—like (S. cerevisiae)) gene is frequently encountered in specimens from colon cancer patients. I found out.
S P O 1 1 (SPOl 1 meiotic protein covalent ly bound to DSB- like (S. cere ' e) )は、 減数分裂時の DNA double-strand breaks (DSBs) の形成や染色体の対合に関与する （Romanienko, P. J. & Camerini- Otero, R. D. (1999) Genomics 61, 156- 169 ； Shannon, M. , et a J. (1999) FEBS Lett. 462, 329-334 )。  SPO 1 1 (SPOl 1 meiotic protein covalently bound to DSB-like (S. cere 'e)) is involved in the formation of DNA double-strand breaks (DSBs) during meiosis and chromosome pairing (Romanienko, PJ & Camerini- Otero, RD (1999) Genomics 61, 156-169; Shannon, M., et a J. (1999) FEBS Lett. 462, 329-334).
減数分裂は、 有性生殖である生物において生殖細胞が一倍体の配偶子 になる過程で行われている、 特殊な細胞分裂である。 減数分裂では、 DNA 複製後相同染色体が対合し、 第一分裂を経て二倍体になり、 第二分 裂で一倍体になる。 よって、 生殖細胞 1個から 4個の配偶子が生成され る。 第一分裂前の分裂前期では、 相同染色体の対合が精緻な制御の元に 行われ、 有性生殖の特色である組み換えが生じる。 Meiosis is a special type of cell division that occurs in the process of germ cells becoming haploid gametes in living organisms. In meiosis, homologous chromosomes pair after DNA replication, diploid through the first division, and haploid at the second division. Therefore, 4 gametes are generated from 1 germ cell. In the early division before the first division, homologous chromosome pairing is under precise control. Occurs and recombination is a characteristic of sexual reproduction.
第一分裂の前期は染色体の形態変化によって、 レプトテン期（細糸期）、 ザィゴテン期（合糸期）、 パキテン期（太糸期）、 ディプロテン期（複糸期）、 ディアキネシス期（移動期）の 5段階に分けられる。 相同染色体の対合時 には Synaptonemal Complex(SC)と呼ばれる構造体が生じる （Heytin, C. (1996) Curr. Opin. Cell Biol. 8， 389-396· )。 レプトテン期は SC で 対合する DNAが中央部に整列され、 ザィゴテン期より染色体の対合が開 始され、 パキテン期は SC が形成されている期間である。 ディプロテン 期で SC は消失し、 染色体は脱凝縮して転写が活発になる。 さらに中期 への移行期であるディアキネシス期で染色体は再凝.縮して、 転写は抑制 される。  The first half of the first division is due to chromosomal morphological changes, depending on the morphological changes of the leptoten (filament), zygoten (combined), pakiten (thick), diproten (double), diakine (moving) ). When homologous chromosomes are paired, a structure called Synaptonemal Complex (SC) is formed (Heytin, C. (1996) Curr. Opin. Cell Biol. 8, 389-396). In the leptoten phase, the DNAs that are paired with the SC are aligned in the middle, chromosome pairing begins in the zygotene phase, and the pakiten phase is the period during which the SC is formed. In the diproten phase, SC disappears, chromosomes decondense and transcription becomes active. Furthermore, in the diakinesis phase, the transition phase to the middle phase, the chromosomes reaggregate and condense, and transcription is repressed.
S C は、 中央 に Central element (CE) 、 そ の側方 に lateral element (LE)と呼ばれるタンパク質の構造を持つ。 LE の構成因子として Scp3 (Dobson, M. J. , et al. (1994) J. Cell Sci. 107, 2749- 2760)が 知られている。 レプトテン期に LE は形成され、 ザィゴテン期に対合す る （Zickler, D.， & Kleckner, N. (1998) Annu. Rev. Genet. 32, 619- 697) CE はザィゴテン期より Scpl を含む Transverse fi laments (TFs) , により LE 間を架橋し、 形成される。 ディプロテン期までパキテン期の 間、 形成されている （Schmekel, K.， et al. (1998) Chromosome Res. 6, 155-159)。  SC has a protein structure called Central element (CE) in the center and lateral element (LE) on the side. Scp3 (Dobson, M. J., et al. (1994) J. Cell Sci. 107, 2749-2760) is known as a component of LE. LE is formed in the leptotene period, and it is paired with the Zygoten period (Zickler, D., & Kleckner, N. (1998) Annu. Rev. Genet. 32, 619-697). It is formed by bridging LEs with fi laments (TFs),. It is formed during the Pakiten period until the Diproten period (Schmekel, K., et al. (1998) Chromosome Res. 6, 155-159).
減数分裂時の相同組み換えに関与する遺伝子は、 生物種間で高く保存 されていると考えられている （Walker, M. Y. & Hawley, R. S. (2000) Chroraosoma 109, 3-9)。 酵母での研究により見出された、 DSBs を形成 し、 相同組み換えに関与する SP011 (Keeney, S. , et al. (1997) Cell 88, 375-384 ； Cervantes,. . D. , et al. (2000) Mol. Cell 5, 883- 888) は、 その後の研究に よ り 、 他の生物の シ ョ ウ ジ ヨ ウバエ (Drosophila) (McKim, K. S. , et al. (1998) Science 279, 876-878) , C. elegans (Dernburg, A. F.， et al. (1998) Cell 94, 387-398) 、 Coprinus cinereus (Celerin, M. (2000) EMB0 J. 19, 2739-2750. ) ¾ マウス （mouse) (Keeney, .、 et al. (1999) Genomics 61, 170-182 ； Romanienko, P. J. & Camerinト Otero, R. D. (1999) Genomics 61, 156-169 ； Shannon, M.， et al. (1999) FEBS Lett. 462, 329-334 ； Metzler-Guilleman, & de Massy, B. (2000) Chromosoma 109, 133-138)、 ヒ 卜 （human) (Romanienko, P. J. & Camerini-Otero, R. D. (1999) Genomics 61, 156- 169 ； Shannon, M. , et al. (1999) FEBS Lett. 462, 329-334 ) において相同遺伝子が存在することが証明され、 減数分裂時の相同組み換えが生物種間共通のシステムにより構成されて いることの実例となっている。 Genes involved in homologous recombination during meiosis are thought to be highly conserved among species (Walker, MY & Hawley, RS (2000) Chroraosoma 109, 3-9). SP011 (Keeney, S., et al. (1997) Cell 88, 375-384; Cervantes, .. D., et al., Which forms DSBs and is involved in homologous recombination, found by studies in yeast. (2000) Mol. Cell 5, 883- 888) is a study of other organisms, Drosophila (McKim, KS, et al. (1998) Science 279, 876- 878), C. elegans (Dernburg, AF, et al. (1998) Cell 94, 387-398), Coprinus cinereus (Celerin, M. (2000) EMB0 J. 19, 2739-2750.) ¾ Mouse (Keeney,., Et al. (1999) Genomics 61, 170-182; Romanienko, PJ & Camerin Otero, RD (1999) Genomics 61, 156-169; Shannon, M., et al. ( 1999) FEBS Lett. 462, 329-334; Metzler-Guilleman, & de Massy, B. (2000) Chromosoma 109, 133-138), human (Romanienko, PJ & Camerini-Otero, RD (1999) Genomics 61, 156-169; Shannon, M., et al. (1999) FEBS Lett. 462, 329-334) proved the existence of homologous genes, and homologous recombination during meiosis is common among species. It is an example of what is configured by the system.
S P〇 1 1 は、 Type II topoi somerase である Topoisomerase VI (T0P6A)のサブュニッ 卜と相同性がある。 Si te- directed mutagenesis により、 保存されているチロシン残基に変異（Y135F)を入れ、 Type II topoisomerase 活性を無くすと、 減数分裂時に相同組み換えがおこらな く なることが報告されている （Bergerat, A. , et al. (1997) Nature 386, 414 - 417)。  SP 0 11 is homologous to the subunit of Topoisomerase VI (T0P6A), which is Type II topoi somerase. It has been reported that site-directed mutagenesis prevents homologous recombination during meiosis if a conserved tyrosine residue is mutated (Y135F) and Type II topoisomerase activity is lost (Bergerat, A , et al. (1997) Nature 386, 414-417).
S P O l lは、 ヒ ト正常組織において精巣特異的に発現が認められる (Romanienko, P. J. & Camerinト Otero, R. D. (1999) Genomics 61, , 156- 169 ； Shannon, M. , et al. (1999) FEBS Lett. 462, 329—334 )。 精巣特異的に発現が認められる分子は、 近年 Cancer-Testis antigens (CTA) と呼ばれ、 がん特異的な抗原の候補と して注目 されている (Scanl an J. M. et al. (2004) Cancer Immunity 4， 1-15 ； Kal ej s, M. & Erenpreisa, J. (2005) Cancer Cell International 5 (4)， 1- 11 ) 。 大腸がんの血清抗原 と し て従来よ り 利用 さ れて い る Carcinoembryonic antigen (CEA) (Gold, P. & Freedman, S. 0. (1965) J. Exp. Med. 122, 467-481)にかわる抗原として CTA が精力的に研究され ており、 大腸がんでの新たな CTA として、 NY-ES0-1, LAGE-1, MAGE-4 などが見つかってきている （Li, M. et al. (2005) Clinical Cancer Res. 11, 1809-1814)。 SP011 についても CTA としての可能性が論じら れ、 メラノ一マでの発現が報告されている。 （Koslowski, M. et al. (2002) Cancer Res. 62, 6750-6755) SPO ll is expressed specifically in testis in normal human tissues (Romanienko, PJ & Camerin Otero, RD (1999) Genomics 61,, 156-169; Shannon, M., et al. (1999) FEBS Lett. 462, 329—334). Molecules that are expressed specifically in the testis are recently called Cancer-Testis antigens (CTA) and are attracting attention as candidates for cancer-specific antigens (Scanl an JM et al. (2004) Cancer Immunity 4, 1-15; Kalejs, M. & Erenpreisa, J. (2005) Cancer Cell International 5 (4), 1-11). Carcinoembryonic antigen (CEA) (Gold, P. & Freedman, S. 0. (1965) J. Exp. Med. 122, 467-481) conventionally used as a serum antigen for colorectal cancer CTA has been energetically studied as an alternative antigen, and NY-ES0-1, LAGE-1, MAGE-4, etc. have been found as new CTA in colorectal cancer (Li, M. et al. (2005) Clinical Cancer Res. 11, 1809-1814). The possibility of CTA as SP011 is also discussed, and its expression in melanoma has been reported. (Koslowski, M. et al. (2002) Cancer Res. 62, 6750-6755)
S P O 1 1は減数分裂時に直接 DSBs と作用する （Neale, M. J. et al. (2005) Nature 436, 1053-1057)。 近年 DSBs 形成は細胞のがん化の初期 において重要なステツプであると考えられている。 細胞への増殖促進の 異常な刺激が DNA複製時のストレスとなり、 場合によっては、 複製エラ 一や DSBs が生じる。 それらは、 DNA ダメージのチェックポイントによ る修復やアポトーシスによる増殖抑制を受ける。 しかし、 P53 が変異体 である場合などチェックポイン卜が機能しない時は、 がん化が促進され る。 また、 DSBs の形成は染色体の不安定化を引き起こし、 がん化の促 進に寄与する こ とになる （Gorgoul is, V. G. , et, al. (2005) Nature 434, 907-913) 0 がんでの S P O 1 1の発現は、 がんにおいて重要な役 割を担っている可能性が考えられる。 ' SPO 11 acts directly with DSBs during meiosis (Neale, MJ et al. (2005) Nature 436, 1053-1057). In recent years, DSBs formation has been considered an important step in the early stages of canceration of cells. Abnormal stimulation of cell growth promotion can lead to stress during DNA replication and, in some cases, replication errors and DSBs. They are subject to repair by DNA damage checkpoints and growth inhibition by apoptosis. However, canceration is promoted when checkpoint 卜 does not function, such as when P53 is a mutant. In addition, the formation of DSBs causes the destabilization of chromosomes, become and contribute to this in the promotion of cancerous (Gorgoul is, VG, et, al. (2005) Nature 434, 907-913) at 0 cancer The expression of SPO11 may play an important role in cancer. '
ま た 、 代 表 的 な 抗 が ん 剤 と し て 知 ら れ る 、 Camptothecin (Topoi somerase I 阻害剤)や Doxorubicin (Topo i somerase H 阻告剤) は、 卜ポイソメラーゼ活性の阻害により、 がん細胞の増殖を阻害してい る。 S P O 1 1は、 Topoi some rase Iや Πと同じ DNA Topoi some rase に 分類さ れる が、 立体構造が異な る （Gadelle, D. et al. (2003) , BioEssays 25, 232-242) ので、 S P O l 1の活性を阻害する低分子化 合物は、 新たな抗がん剤として有望である。  In addition, Camptothecin (Topoi somerase I inhibitor) and Doxorubicin (Topo i somerase H inhibitor), which are known as typical anti-cancer drugs, inhibit cancer 卜 poisomerase activity. Inhibits cell growth. SPO 11 is classified as DNA Topoi some rase, which is the same as Topoi some rase I and Π, but has a different conformation (Gadelle, D. et al. (2003), BioEssays 25, 232-242). l Low molecular weight compounds that inhibit the activity of 1 are promising as new anticancer agents.
本発明者らは、 S P〇 1 1遺伝子の発現を R N A i (RNA干渉） に よって抑制することによってがん細胞の増殖を抑制できることも確認し た。 したがって、 S P O 1 1遺伝子の発現を抑制することによって、 が んを治療することが可能となる。 また、 S P O 1 1遺伝子の発現量を測 定することによってがんの診断を行うことも可能となる。  The present inventors have also confirmed that the growth of cancer cells can be suppressed by suppressing the expression of the SP 0 11 gene by RNAi (RNA interference). Therefore, cancer can be treated by suppressing the expression of the SPO1 1 gene. It is also possible to diagnose cancer by measuring the expression level of the SPO1 1 gene.
以下、 本発明のがん治療.剤、 スクリーニング方法、 診断剤などについ て詳細に説明する。  Hereinafter, the cancer therapeutic agent, screening method, diagnostic agent and the like of the present invention will be described in detail.
. がん抑制作用を有する薬剤 . Drugs that suppress cancer
まず、 本発明は、 （ 1 ) S P O 1 1遺伝子の発現阻害物質を有効成分 として含有するがん治療剤、 及び （ 2 ) S P O 1 1 タンパク質の活性阻 害物質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。 First, the present invention comprises (1) an SPO 11 gene expression inhibitor as an active ingredient And (2) a cancer therapeutic agent containing an SPO 1 1 protein activity inhibitor as an active ingredient.
本明細書中、 「 S P〇 1 1遺伝子」 という場合、 NC B I ヌクレオチ ドデ一夕ベースにおいて、 A c c e s s i o n N o. ： NM— 0 1 2 4 4 4で登録されている 1 8 2 6塩基からなるヒ ト S P O l 1遺伝子 (配列番号 1 ) を意味する (Bergerat, A. , et al. (1997) Nature 386, 414-417)が、 これに限定されず、 例えば、 当該遺伝子の塩基配列におい て 1つ以上の塩基の置換、 欠失、 付加、 または挿入などを有することに よって変化している変異体のような、 当該遺伝子の塩基配列またはその 相補配列にス トリンジェン卜なハイプリダイゼーション条件下でハイブ リダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子も本 明細書中で使用する 「 S P〇 1 1遺伝子」 に含まれるものとする。  In this specification, the term “SP 0 1 1 gene” refers to 1 8 2 6 bases registered under A ccession No .: NM— 0 1 2 4 4 4 on an NC BI nucleotide base. (Bergerat, A., et al. (1997) Nature 386, 414-417), but is not limited thereto, for example, in the nucleotide sequence of the gene. High stringency conditions that are stringent to the base sequence of the gene or its complementary sequence, such as a variant that is altered by having one or more base substitutions, deletions, additions, or insertions The gene consisting of a polynucleotide having a base sequence that can be hybridized below is also included in the “SP011 gene” as used herein.
ハイプリダイゼーションは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば'、 モレキュ—ラー ' クローニンク (M o 1 e c u 1 a r C 1 o n i n g T h i r d E d i t i o n , J . S a mb r o o k e t a 1 . , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b. P r e s s . 2 0 0 1 ) に記載の方法などに従って行うことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に 従って行うことができる。 ここで、 「ス トリンジェン卜な条件」 は、 低 ス トリンジェン卜な条件、 中ス トリンジェン卜な条件及び高ス トリンジ ェントな条件のいずれでもよい。 「低ス トリンジェン卜な条件」 は、 例 えば、 5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5 % S D S、 5 0 %ホル ムアミ ド、 3 2での条件である。 また、 「中ス トリ ンジェン卜な条件」 は、 例えば、 5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5 % S D S、 δ 0 %ホルムアミ ド、 4 2 の条件である。 「高ス トリ ンジェントな条 件」 は、 例えば、 5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5 % S D S、 5 0 %ホルムアミ ド、 5 0°Cの条件である。 これらの条件において、 温 度を上げるほど高い相同性を有する DN Aが効率的に得られることが期 待できる。 ただし、 ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーに影 響する要素としては温度、 プローブ濃度、 プローブの長さ、 イオン強度、 時間、 塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を 適宜選択することで同様のス トリンジエンシーを実現することが可能で ある。 Hypridization is a known method or a method similar thereto, for example, 'Molecular' Cloning (M o 1 ecu 1 ar C 1 oning T hird E dition, J. S a mb rooketa 1., C old S pring H arbor L ab. Press. 2 0 0 1). When using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Here, the “stringent conditions” may be any of low stringency conditions, medium stringency conditions and high stringency conditions. “Low stringency conditions” are, for example, conditions at 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32. The “medium stringent conditions” are, for example, the conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, δ 0% formamide, and 42. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, it does not affect the stringency of the hybridization. There are multiple factors that affect the temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, salt concentration, etc., and those skilled in the art can select similar factors to achieve the same stringency. It can be realized.
ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとしては、 FA S TA、 B L A S Tなどの相同性検索ソフ トウエアにより、 デフォルトのパラメ一夕 —を用いて計算したときに、 配列番号 1の塩基配列と、 例えば、 7 0 % 以上、 7 5 %以上、 8 0 %以上、 8 5 %以上、 9 0 %以上、 9 1 %以上、 9 2 %以上、 9 3 %以上、 9 4 %以上、 9 5 %以上、 9 6 %以上、 9 7 %以上、 9 8 %以上、 9 9 %以上の同一性を有するポリヌクレオチド をあげることができる。  As a hybridizable polynucleotide, the base sequence of SEQ ID NO: 1, for example, 70% or more, when calculated using the default parameters of homology search software such as FA SSTA, BLAST, etc. 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more , 9 7% or more, 98% or more, 99% or more of the polynucleotide having identity.
本明細書中、 「遺伝子の発現阻害」 とは、 遺伝子からタンパク質生成 までの一連の事象 （例えば、 転写 （mRNAの生成） 、 翻訳 （タンパク 質の生成） を含む） のうちのいずれかの事象を阻害することによってそ の遺伝子によってコードされる夕ンパク質の生成を阻害することを意味 するものとする。  In the present specification, “inhibition of gene expression” means any event in a series of events from gene to protein production (for example, transcription (production of mRNA), translation (production of protein)) By inhibiting the production of the protein encoded by the gene.
本明細書中、 「S P〇 1 1タンパク質」 という場合、 NC B I 夕ンノ、 °, ク質データベースにおいて、 A c c e s s i o n N o. ： N P_ 0 3 6 5 7 6で登録されている 3 9 6アミノ酸残基からなるヒ ト S P O 1 1 タンパク質 （配列番号 2 ) およびこのタンパク質と実質的に同質の活性 (例えば、 Type II topoisomerase 活性から選択される一種以上の活 性） を保持し、 このタンパク質のアミノ酸配列に対して 1〜複数個のァ ミノ酸残基の欠失、 置換、 挿入、 及び または付加が生じたアミノ酸配 列からなる変異タンパク質をいう。  In this specification, the term “SP0 1 1 protein” refers to NC BI Yuno, °, 3 9 6 amino acids registered in the database as A ccession No .: N P — 0 3 6 5 7 6 A human SPO 1 1 protein consisting of residues (SEQ ID NO: 2) and substantially the same activity as this protein (for example, one or more activities selected from Type II topoisomerase activity) A mutant protein consisting of an amino acid sequence in which deletion, substitution, insertion, and / or addition of one or more amino acid residues has occurred in the sequence.
上記変異タンパク質における、 アミノ酸の変異部位および個数は、 変 異タンパク質が元のタンパク質と実質的に同質の活性を保持している限 り特に制限はないが、 変異個数は、 例えば、 1〜 5 0個、 1〜4 0個、 1〜 3 0個、 ：！〜 2 5個、 ：！〜 2 0個、 ：！〜 1 5個、 ：！〜 1 0個、 ：！〜 9個、 ：！〜 8個、 1〜 7個、 1〜 6個 （ 1〜数個） 、 ：！〜 5個、 ：！〜 4 個、 1〜 3個、 1〜 2個、 1個である。 変異個数は一般的に少ない程好 ましい。 また、 このような変異タンパク質は、 配列番号 2のアミノ酸配 列と約 7 0 %以上、 7 5 %以上、 8 0 %以上、 8 5 %以上、 9 0 %以上、 9 1 %以上、 9 2 %以上、 9 3 %以上、 9 4 %以上、 9 5 %以上、 9 6 %以上、 9 7 %以上、 9 8 %以上、 9 9 %以上の同一性を有するアミ ノ酸配列を有し、 かつ元のタンパク質と実質的に同質の活性を有する夕 ンパク質を含む。 上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。 The amino acid mutation site and number in the above mutant protein are not particularly limited as long as the mutant protein retains substantially the same activity as the original protein, but the number of mutations is, for example, 1 to 50. 1 to 40 pieces, 1 to 30 pieces,! ~ 2 5! ~ 2 0 ,! ~ 1 5 pcs! ~ 10 pieces, :! ~ Nine, :! ~ 8, 1-7, 1-6 (1 ~ several) ~ 5 pcs! ~ Four One, three, one, two, one. In general, the smaller the number of mutations, the better. In addition, such a mutant protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 9 2 % Or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more of amino acid sequences having identity And a protein having substantially the same activity as the original protein. In general, the larger the homology value, the better.
上記 S P O 1 1タンパク質には、 S P O 1 1タンパク質の 「部分ぺプ チド」 も含まれる。 S P O 1 1タンパク質の部分ペプチドとしては、 S P O 1 1タンパク質のアミノ酸配列 （配列番号 2 ) .の一部の連続するァ ミノ酸の配列からなる部分ペプチドであって、 好ましくは、 前述の S P O 1 1タンパク質の活性と同様の活性を有するものであればいずれのも のでも良い。 例えば、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 少 なくとも 2 0個、 好ましくは少なく とも 5 0個、 さらに好ましくは少な くとも 7 0個、 より好ましくは少なくとも 1 0 0個、 最も好ましくは少 なくとも 2 0 0個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するポリべ プチドなどが挙げられる。 好ましくは、 これらのポリペプチドは、 S P . O i lタンパク質の活性に関与する部分に対応するアミノ酸配列を含有 する。 また、 本発明で使用される部分ペプチドは、 上記のポリペプチド において、 そのアミノ酸配列中の 1 または複数個 （例えば、 1〜 2 0個 程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらにより好ましくは 1〜 5個 程度） のアミノ酸残基が欠失、 付加、 置換、 または挿入により変更され ているものでもよい。  The above-mentioned S P O 1 1 protein includes a “partial peptide” of S P O 1 1 protein. The partial peptide of the SPO 1 1 protein is a partial peptide consisting of a partial amino acid sequence of the amino acid sequence of the SPO 1 1 protein (SEQ ID NO: 2), preferably the aforementioned SPO 1 1 protein Any one having the same activity as that of the protein may be used. For example, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, at least 20, preferably at least 50, more preferably at least 70, more preferably at least 100, most preferably Examples include polypeptides having an amino acid sequence consisting of at least 200 amino acid residues. Preferably, these polypeptides contain an amino acid sequence corresponding to the portion involved in the activity of the S P .O iI protein. Further, the partial peptide used in the present invention is one or more of the above-mentioned polypeptides in the amino acid sequence (for example, about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, still more preferably 1 to 5 amino acid residues) may be changed by deletion, addition, substitution, or insertion.
本発明で用いる S P〇 1 1タンパク質は、 そのタンパク質を発現して いる細胞や組織から調製することができる。 また、 これらのタンパク質 は、 公知のペプチド合成機によっても合成できるし、 原核生物あるいは 真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても 調製することができる。 本発明で用いる S P O 1 1タンパク質は、 いず れの種由来のものでもよいが、 好ましくはヒ 卜由来である。 「実質的に同質の活性」 とは、 それらの活性が性質的に同等であるこ とを示す。 したがって、 活性 （Type II topoisomerase 活性など） が同 等 （例えば、 約 0. 0 1〜； 1 0 0倍、 好ましくは約 0. 5〜 2 0倍、 よ り好ましくは約 0. 5〜 2倍） であることが好ましいが、 これらの活性 の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 こ れらの活性の測定は、 Bergerat, A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 27663-27669.などの文献に記載の公知の方法に準じて行う ことが できるが、 例えば、 後に記載するスクリーニング方法に従って測定する ことができる。 The SP011 protein used in the present invention can be prepared from cells or tissues expressing the protein. Further, these proteins can be synthesized by a known peptide synthesizer, or can be prepared by a recombinant method using an appropriate host cell selected from prokaryotic organisms or eukaryotic organisms. The SPO 11 protein used in the present invention may be derived from any species, but is preferably derived from rabbit. “Substantially the same activity” indicates that these activities are qualitatively equivalent. Therefore, the activity (such as Type II topoisomerase activity) is the same (for example, about 0.01 to; 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times) However, quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different. These activities can be measured according to known methods described in literatures such as Bergerat, A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 27663-27669. It can be measured according to the screening method described later.
なお、 アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 力一リンおよびアルチュ ールによるアルゴリズム B LA S T ( p r o c . N a t に A c a d. S c i . U S A 8 7 2 2 6 4 - 2 2 6 8 , 1 9 9 0 ; p r o c . N a t l . A c a d . S c i U S A 9 0 : 5 8 7 3， 1 9 9 3 ) を用いて決定できる。 B L A S Tのアルゴリズムに基づいた B L A S T Nや B LA S TXと呼ばれるプログラムが開発されている （A 1 t s c h u 1 S F， e t a 1 ： J M o 1 B i o l 2 1 5 : 4 0 3， 1 9 9 0 ) 。 B L A S T Nを用いて塩基配列を解析する場合は、 パラメ一夕一は、 例えば s c o r e = 1 0 0、 wo r d l e n g t h = 1 2とする。 また、 B L A S T Xを用いてアミノ酸配列を解析する場合 は、 ノヽ。ラメ一夕一は、 例えば s c o r e = 5 0、 w o r d 1 e n g t h = 3とする。 B LA S Tと G a p p e d B LA S Tプログラムを用い る場合は、 各プログラムのデフォルトパラメ一夕一を用いる。  The identity of the amino acid sequence and base sequence is determined by the algorithm B LA ST (Proc. Nat by Acad. Sci. USA 8 7 2 2 6 4-2 2 6 8, 1 9 9 0; proc. Natl. A cad. Sci USA 9 0: 5 8 7 3, 1 9 9 3). Programs called BLASTN and BLAST TX based on the BLAST algorithm have been developed (A1tschu1SF, eta1: JMo1 Biol2 1 5: 4 0 3, 1 9 90). When analyzing the base sequence using B L A S T N, the parameters are set to, for example, s corre = 100 and wor d lengh t = 12. When analyzing amino acid sequences using B L A S T X, no. For example, s c o r e = 50 and w o r d 1 e n g t h = 3 for lame. When using BLAST and Gappe d BLAST programs, the default parameters for each program are used.
本明細書中、 「がん治療剤」 という用語は、 抗癌剤、 癌転移阻害剤、 癌細胞のアポトーシス誘導剤、 癌細胞の増殖抑制剤、 癌細胞の浸潤抑制 剤、 がん予防剤等を含む意味で使用される。 なお、 本願明細書中、 用語 「癌 （または、 がん） 」 と 「腫瘍」 とは同じ意味を有する用語として使 用される。  In the present specification, the term “cancer therapeutic agent” includes anticancer agents, cancer metastasis inhibitors, cancer cell apoptosis inducers, cancer cell proliferation inhibitors, cancer cell infiltration inhibitors, cancer preventive agents, and the like. Used in meaning. In the present specification, the terms “cancer (or cancer)” and “tumor” are used as terms having the same meaning.
1. 1 S PO l 1遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療剤 本発明は、 1つの実施形態において、 S P O 1 1遺伝子の発現阻害物 質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。 1. A cancer therapeutic agent containing an inhibitor of 1 S PO l 1 gene expression In one embodiment, the present invention provides a cancer therapeutic agent containing an SPO 11 gene expression inhibitory substance as an active ingredient.
本明細書中、 「S PO 1 1遺伝子の発現阻害物質」 には、 S P O l l 遺伝子の発現を阻害するものであれば制限はないが、 例えば、 （ i ) S P 01 1遺伝子から S P O 1 1 mRNAへの転写を阻害する物質、 お よび （ i i ) S PO l 1 mRNAから S P〇 1 1タンパク質への翻訳 を阻害する物質が含まれる。  In the present specification, “SPO 11 gene expression inhibitor” is not limited as long as it inhibits the expression of SPO ll gene. For example, (i) SP 01 1 gene to SPO 11 mRNA And (ii) a substance that inhibits translation from SPOl 1 mRNA to SP011 protein.
S P O 1 1遺伝子から S P O 1 1 mRNAへの転写を阻害する物質 の例としては、  Examples of substances that inhibit transcription from S P O 1 1 gene to S P O 1 1 mRNA include
( a) S P O 1 1遺伝子またはその一部に対するアンチセンス核酸、 (a) an antisense nucleic acid for the S P O 1 1 gene or a part thereof,
(b) S P〇 1 1遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、 (b) a decoy nucleic acid for the SP011 gene or a part thereof,
( c ) S P O 1 1遺伝子またはその一部に対してドミナントネガティブ に作用する S P O 1 1遺伝子変異体、 あるいは  (c) a S P O 1 1 gene variant that acts dominant negatively on the S P O 1 1 gene or a part thereof, or
(d) その他の転写阻害化合物  (d) Other transcription inhibitor compounds
などが含まれる。 Etc. are included.
また、 S P O l l mR N Aから S P O 1 1タンパク質への翻訳を阻 害する物質の例としては、  Examples of substances that inhibit translation from S P O l l mR N A to S P O 1 1 protein include
( e ) S P O l l mRNAまたはその一部に対して RNA i作用を有 するポリヌクレオチド （例えば、 s i R N A) 、  (e) a polynucleotide having an RNA i action on S P O l l mRNA or a part thereof (for example, siRNA),
( f ) S P O l l mRNAまたはその一部に対するアンチセンスポリ ヌクレオチド、  (f) an antisense polynucleotide against S P O l l mRNA or a part thereof,
( g ) S P O l l mR N Aまたはその一部に対してリボザィム活性を 有するポリヌクレオチド、 あるいは  (g) a polynucleotide having ribozyme activity against S P O l l mR N A or a part thereof, or
(h) その他の翻訳阻害化合物  (h) Other translation inhibitor compounds
などが含まれる。 Etc. are included.
本明細書中、 「核酸」 とは R N Aまたは DN Aを意味する。 ここでい う 「核酸」 は、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修 飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリ ンおよびピリミジン、 ァシル化 されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジ ン、 あるいはその他の複素環を含むものであって良い。 修飾されたヌク レオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた、 糖部分が修飾されてい て良く、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置 換されているか、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されて いてよい。 In the present specification, “nucleic acid” means RNA or DNA. As used herein, “nucleic acid” may contain not only purine and pyrimidine bases but also those having other heterocyclic bases that have been modified. These modifications are methylated purines and pyrimidines, acylated Purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleosides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or ethers, amines, etc. It may be converted to a functional group.
本発明のがん治療剤においては、 S P O 1 1遺伝子の発現を R N A i 効果により阻害する作用を有する核酸を有効成分として用いることがで きる。 RNA i とは、 標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有 する二重鎖 RNAを細胞内に導入すると、 導入した外来遺伝子および標 的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のことをいう。 ここで 用いられる R N Aとしては、 例えば、 1 9〜 3 0塩基長の R N A干渉を 生ずる二重鎖 RNA、 例えば、 d s RNA (d o u b l e s t r a n d RNA) , s i RNA ( s ma l l i n t e r f e r i n g R NA). 又は s h RNA ( s h o r t h a i r p i n RNA) が挙げ られる。 このような RNAは、 リボソームなどの送達システムにより所 望の部位に局所送達させることも可能であり、 また上記二重鎖 R N A力 生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。 このような二重鎖 RNA (d s RNA、 s i R N Aまたは s h R N A ) の調製方法、 使用方法などは、 多くの文献から公知である （特表 2 0 0 2— 5 1 6 0 6 2号 ； 米国公開許第 2 0 0 2 Z 0 8 6 3 5 6 A号 ； N a t u r e G e n e t i c s , 2 4 ( 2 ) ， F e b. , 1 8 0 - 1 8 3 ; G e n e s i s , 2 6 (4) ， Ap r i l , 24 0 - 2 44 ； N a t u r e , S p e . 2 1， 40 7 : 6 8 0 2 , 3 1 9 - 2 0 ; G e n e s . & D e v . , V o l . 1 6 , ( 8 ) ， A r . 1 6 , 94 8 - 9 5 8 ； P r o c . N a t l . A c a d. S c i . U S A. , 9 9 (8 ) ， 1 6 A r . , 5 5 1 5— 5 5 2 0 ; S c i e n c e , 2 9 6 ( 5 5 6 7 ) , 1 9 A r . , 5 5 0 - 5 5 3 ； P r o c N a t l . A c a d. S c i . U S A, A r . 3 0 , 9 9 : 9 , 6 0 4 7— 6 0 5 2 ; N a t u r e B i o t e c h n o l o g y, V o l . 2 0 ( 5 ) , M a y , 4 9 7 - 5 0 0 ； N a t u r e B i o t e c h n o l o g y, V o l . 2 0 ( 5 ) ， M a y, 5 0 0— 5 0 8 ; N u c l e i c A c i d s R e s . , M a y 1 5など） 。 In the cancer therapeutic agent of the present invention, a nucleic acid having an action of inhibiting the expression of the SPO 11 gene by the RNA i effect can be used as an active ingredient. RNA i is a phenomenon in which the expression of a foreign gene and a target endogenous gene are both inhibited when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as the target gene sequence is introduced into the cell. Say. Examples of RNA used here include double-stranded RNA that causes RNA interference with a length of 19 to 30 bases, such as ds RNA (doublestrand RNA), si RNA (small interfering RNA). Or sh RNA ( shorthairpin RNA). Such RNA can be locally delivered to a desired site by a delivery system such as ribosome, and can be locally expressed using the above-mentioned vector that generates double-stranded RNA force. . The methods for preparing and using such double-stranded RNA (ds RNA, si RNA or sh RNA) are known from many literatures (Special Table 2 0 2-5 1 6 0 6 2; US Permission No. 2 0 0 2 Z 0 8 6 3 5 6 A; Nature Genetics, 2 4 (2), F e., 1 80-1 8 3; Genesis, 2 6 (4), Ap ril, 24 0-2 44; Nature, S pe. 2 1, 40 7: 6 8 0 2, 3 1 9-2 0; Genes. & Dev, V ol. 1 6, (8) , A r. 1 6, 94 8-9 5 8; Proc. Natl. A cad. S ci. US A., 9 9 (8), 1 6 A r., 5 5 1 5-5 5 2 0; S cience, 2 9 6 (5 5 6 7), 1 9 A r., 5 5 0-5 5 3; Proc N atl. A cad. S ci. U SA, A r. 3 0, 9 9: 9, 6 0 4 7— 6 0 5 2; Nature Biotechnology, Vol. 2 0 (5), May, 4 9 7-5 0 0; B iotechnology, V ol. 20 (5), May, 50000—5008; Nucleic Acids Res., May 15 etc.).
本発明で用いられる R N A i効果を奏する二重鎖 R N Aの長さは、 通 常、 1 9〜 3 0塩基、 好ましくは 2 0〜2 7塩基、 より好ましくは 2 1 〜 2 5塩基、 最も好ましくは 2 1〜2 3塩基である。 本発明においては、 具体的には、 下記 s i R N A (実施例 3で使用） を用いることができる。  The length of the double-stranded RNA exhibiting the RNA i effect used in the present invention is usually 19 to 30 bases, preferably 20 to 27 bases, more preferably 21 to 25 bases, most preferably Is 2 1 to 2 3 bases. In the present invention, specifically, the following si R N A (used in Example 3) can be used.
(表 1 )  (table 1 )
Figure imgf000018_0001
本明細書中、 「アンチセンス核酸」 、 または 「アンチセンスポリヌク レオチド」 とは、 ある対象となる D N A領域の少なくとも一部に相補的 なポリヌクレオチドを有し、 そのポリヌクレオチドが当該領域の少なく とも一部とハイブリダィズすることができる核酸のことをいう。 本発明 のアンチセンス核酸は、 RNA、 DNA、 あるいは修飾された核酸 （R NA、 DNA) である。 本発明のアンチセンス核酸は、 RNA、 DNA、 あるいは修飾された核酸 （RNA、 DNA) である。 それらは二本鎖 D NA、 一本鎖 DNA、 二本鎖 RNA、 一本鎖 RNA、 さらに DNA : R NAハイブリッ ドであってもよい。 修飾された核酸の具体例としては、 核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフエ一ト誘導体、 さらにはポリヌクレオチ ドアミ ドゃオリゴヌクレオチドアミ ドの分解に抵抗性を有するものなど が挙げられるが、 それらに限定されるものではない。
Figure imgf000018_0001
In the present specification, the term “antisense nucleic acid” or “antisense polynucleotide” has a polynucleotide that is complementary to at least a part of a DNA region of interest, and the polynucleotide is a small part of the region. The term refers to a nucleic acid that can hybridize with a part. The antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). The antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). They may be double stranded DNA, single stranded DNA, double stranded RNA, single stranded RNA, or even a DNA: RNA hybrid. Specific examples of modified nucleic acids include nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, and polynucleotide amides that are resistant to degradation of oligonucleotides. However, it is not limited to them.
使用されるアンチセンス核酸は、 適当なプロモーターの下流に連結さ れ、 好ましくは 3 ' 側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。 こ のようにして調製された核酸は、 公知の方法を用いることで、 所望の動 物へ形質転換できる。 アンチセンス核酸の配列は、 形質転換される動物 が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好まし いが、 遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、 完全に相補的で なくてもよい。  The antisense nucleic acid to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side. The nucleic acid thus prepared can be transformed into a desired animal using a known method. The sequence of the antisense nucleic acid is preferably a sequence complementary to the endogenous gene of the animal to be transformed or a part thereof, but is completely complementary as long as the gene expression can be effectively suppressed. It doesn't have to be.
例えば、 S P O 1 1遺伝子の mR N Aの 5 ' 端近傍の非翻訳領域に相 補的なアンチセンス配列を設計すれば、 遺伝子の翻.訳阻害に効果的であ る。 コード領域もしくは 3 ' 側の非翻訳領域に相補的な配列も使用する ことができる。 遺伝子の翻訳阻害に効果的なアンチセンス核酸は、 標的 遺伝子の転写産物に対して約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 よ り好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相補性を有 する。.  For example, designing a complementary antisense sequence in the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of SPO 1 1 gene is effective in inhibiting translation of the gene. A sequence complementary to the coding region or 3 ′ untranslated region can also be used. Antisense nucleic acid effective for inhibiting gene translation is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 9% or more of the transcript of the target gene. 5% or more complementarity. .
アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、 アンチセンス核酸の長さは少なく とも約 1 0塩基以上 （例えば、 1 0〜， 40個程度） 、 好ましくは約 1 5塩基以上であり、 より好ましくは約 1 0 0塩基以上であり、 さらに好ましくは約 5 0 0塩基以上である。 アン チセンス核酸は公知の文献を参照して設計することができる （例えば、 平島および井上、 新生化学実験講座 2 核酸 I V遺伝子の複製と発現、 日本生化学会編、 東京化学同人、 1 9 9 3、 p . 3 1 9 - 3 4 7 ) 、 J . K a w a k a m i e t a 1. ， P h a r m T e c h J a p a n . V o l . 8 , p . 2 4 7 , 1 9 9 2 ； V o 1. 8， p. 3 9 5 , 1 9 9 2 ; S . T . C r o o k e e t a l . , e d. , An t i s e n s e R e s e a r c h a n d Ap p l i c a t i o n s , C R C P r e s s , 1 9 9 3など参照） 。  In order to effectively suppress the expression of a target gene using an antisense nucleic acid, the length of the antisense nucleic acid is at least about 10 bases (for example, about 10 to 40), preferably about 15 More than base, more preferably about 100 bases or more, and still more preferably about 500 bases or more. Antisense nucleic acids can be designed with reference to known literature (for example, Hirashima and Inoue, Shinsei Chemistry Laboratory 2 Nucleic acid IV gene replication and expression, Japan Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin, 1 9 9 3, 3 1 9-3 4 7), J. Kawakamieta 1., P harm T ech Japan. V ol. 8, p. 2 4 7, 1 9 9 2; V o 1. 8, p. 3 9 5, 1 9 9 2; see S. T. Crookeetal., Ed., Antisense Research and Applications, CRCP ress, 1 9 93 etc.).
また、 本発明のがん治療剤においては、 S P〇 1 1遺伝子の転写産物 を特異的に切断するリポザィム活性を有する核酸を有効成分として用い ることができる。 ここでいう 「リボザィム活性」 とは、 ターゲッ トとす る遺伝子の転写産物である mR N Aを部位特異的に切断する核酸のこと をいう。 リボザィムには、 グループ Iイントロン型や R N a s e Pに含 まれる M l RNAのように 4 0 0ヌクレオチド以上の大きさのものも あるが、 ハンマーヘッ ド型やヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程 度の活性ドメインを有するものもある （タンパク質核酸酵素、 1 9 9 0、 3 5、 p. 2 1 9 1 ) 。 ノ、ンマーヘッ ド型リボザィムについては、 例え ば、 F E B S L e t t , 1 9 8 8， 2 2 8 , p . 2 2 8 ； F E B S L e t t , 1 9 8 8， 2 3 9 , p. 2 8 5 ； タンパク質核酸酵素， 1 9 9 0， 3 5 , p - 2 1 9 1 ； N u c 1 A c i d s. R e s , 1 9 8 9 , 1 7， p. 7 0 5 9などを参照することができる。 また、 ヘアピン型リ ボザィムについては、 例えば、 N a t u r e , 1 9 8 6 , 3 2 3 , p . 349 ； N u c 1 A c i d s R e s , 1 9 9 1 , 1 9 , p . 6 7 5 1 ; 菊池洋， 化学と生物， 1 9 9 2， 3 0 , p . 1 1 2などを参照する ことができる。 このようなリボザィムを用いて本発明における S P O 1 1遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、 該遺伝子の発現を阻害 することができる。 In the cancer therapeutic agent of the present invention, a nucleic acid having a liposomal activity that specifically cleaves the transcript of the SP 0 11 gene is used as an active ingredient. Can. As used herein, “ribozyme activity” refers to a nucleic acid that specifically cleaves mRNA, which is a transcription product of a target gene. Some ribozymes have a size of more than 400 nucleotides, such as group I intron type and Ml RNA contained in RNase P, but they have an activity of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type. Some have domains (Protein Nucleic Acid Enzymes, 1990, 35, p. 2 1 9 1). For example, FEBSL ett, 1 9 8 8, 2 2 8, p. 2 2 8; FEBSL ett, 1 9 8 8, 2 3 9, p. 2 8 5; protein nucleic acid Enzymes, 1 9 90, 3 5, p-2 1 9 1; Nuc 1 A cid s. Res, 1 9 8 9, 1 7, p. As for the hairpin type ribosome, for example, Nature, 1 986, 3 2 3, p. 349; Nuc 1 A cids Res, 1 9 9 1, 1 9, p. 6 7 5 1; You can refer to Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology, 1 992, 30, p. By specifically cleaving the transcript of the SPO11 gene in the present invention using such a ribozyme, the expression of the gene can be inhibited.
さらに、 本発明は、 S P〇 1 1遺伝子の転写活性を阻害する核酸以外 の化合物を有効成分として用いることができる。 そのような化合物は、 例えば、 S P〇 1 1遺伝子の発現 · 転写に関与する因子に結合する化合 物である。 このような化合物は、 天然物でも合成化合物でもよい。 この ような化合物は、 後述のスクリーニング方法によって、 取得することが 可能である。 1. 2 S P〇 1 1タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療 Furthermore, in the present invention, a compound other than a nucleic acid that inhibits the transcriptional activity of the SP 0 11 gene can be used as an active ingredient. Such a compound is, for example, a compound that binds to a factor involved in the expression / transcription of the SPO11 gene. Such a compound may be a natural product or a synthetic compound. Such a compound can be obtained by the screening method described below. 1. Cancer treatments that contain inhibitors of protein activity
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本発明はまた、 別の実施形態において、 S P O l 1タンパク質の活性 阻害物質を含有するがん治療剤を提供する。  In another embodiment, the present invention also provides a cancer therapeutic agent containing a substance that inhibits the activity of S P O l 1 protein.
本明細書中、 「S PO 1 1タンパク質の活性阻害物質」 には、 例えば、 ( a) S P O 1 1タンパク質に結合する抗体、 In the present specification, “S PO 1 1 protein activity inhibitor” includes, for example, (a) an antibody that binds to the SPO 1 1 protein,
(b) S PO 1 1タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を 有する S P O 1 1タンパク質変異体、 あるいは  (b) a SPO1 1 protein variant having a dominant negative property to the SPO1 1 protein, or
(c ) S P O 1 1タンパク質に結合する化合物 （上記抗体および変異 体を除く）  (c) Compound that binds to S P O 1 1 protein (excluding antibodies and variants)
などが含まれる。 Etc. are included.
本明細書における 「抗体」 とはタンパク質の全長又は断片に反応する 抗体を意味する。 本発明の抗体の形態には、 特に制限はなく、 本発明の S P O 1 1タンパク質に結合する限り、 上記ポリクローナル抗体、 モノ クローナル抗体のほかに、 ヒ ト抗体、 遺伝子組み換.えによるヒ ト型化抗 体、 さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。 S P 01 1タンパク 質に結合する抗体 （抗 S P〇 1 1抗体） は、 当業者に公知の方法により 調製することが可能である。 なお、 抗 S PO l 1抗体の詳細については 後述する。  As used herein, “antibody” means an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, as long as it binds to the SPO11 protein of the present invention, in addition to the polyclonal antibody and the monoclonal antibody, a human antibody, a human form by gene recombination. In addition, antibody fragments, antibody fragments and modified antibodies thereof are also included. Antibodies that bind to the SP011 protein (anti-SP0111 antibodies) can be prepared by methods known to those skilled in the art. Details of the anti-S PO 11 antibody will be described later.
本明細書における 「S PO 1 1タンパク質に対してドミナントネガテ イブの性質を有する S P〇 1 1タンパク質変異体」 とは、 それをコード する遺伝子を発現させることによって、 内在性の野生型 S P〇 1 1タン パク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す In the present specification, “SP 0 1 1 protein mutant having a dominant negative property with respect to S PO 1 1 protein” means that an endogenous wild-type SP 0 1 is expressed by expressing a gene encoding the same. 1 Refers to proteins that have the function of eliminating or reducing protein activity
(土田邦博著、 遺伝子の活性阻害実験法 多比良和誠編、 羊土社 （ 2 0 0 1 ) 2 6— 3 2など参照） 。 (See Kunihiro Tsuchida, Gene Activity Inhibition Experiment, edited by Kazumasa Tahira, Yodosha (2 0 0 1) 2 6-3 2).
さらに、 本発明においては、 S P O 1 1タンパク質の活性を阻害し得 る物質として、 S P O 1 1タンパク質に結合する、 上記抗体または変異 体以外の化合物を有効成分として用いることができる。 そのような化合 物は、 例えば、 S P〇 1 1タンパク質に結合し、 その活性を阻害する化 合物である。 このような化合物は、 天然物でも合成化合物でもよい。 こ のような化合物は、 後述のスクリーニング方法によって、 取得すること が可能である。  Furthermore, in the present invention, as a substance capable of inhibiting the activity of the SPO1 1 protein, a compound other than the antibody or the mutant that binds to the SPO1 1 protein can be used as an active ingredient. Such a compound is, for example, a compound that binds to the SPO11 protein and inhibits its activity. Such a compound may be a natural product or a synthetic compound. Such a compound can be obtained by the screening method described below.
上記した本発明の S P〇 1 1タンパク質の活性を阻害し得る物質は、 がん治療剤として使用することができる。 2 . S P O l 1 タンパク質の活性もしくは発現を阻害する物質のスク リーニング方法 The above-mentioned substance that can inhibit the activity of the SP 0 11 protein of the present invention can be used as a cancer therapeutic agent. 2. Screening method for substances that inhibit the activity or expression of SPO l 1 protein
本発明は、 がん抑制作用を有する候補化合物のスクリ一二ング方法を も提供する。  The present invention also provides a method for screening a candidate compound having a cancer suppressing action.
一つの好ましい態様は、 S P O 1 1タンパク質と被検化合物との結合 を指標とする方法である。 通常、 S P〇 1 1タンパク質と結合する化合 物は、 S P O l 1タンパク質の活性を阻害する効果を有することが期待 される。 ここで、 該化合物は、 S P O 1 1タンパク質の活性部位に結合 することが好ましい。 本方法においては、 まず、 S. P〇 1 1タンパク質 と被検化合物とを接触させる。 S P O l 1タンパク質は、 被検化合物と の結合を検出するための指標に応じて、 例えば、 S P O l lタンパク質 の精製された形態、 細胞内または細胞外に発現した形態、 あるいはァフ ィニティーカラムに結合した形態であり得る。 この方法に用いる被検化 合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。 標識としては、 例えば、 放射標識、 蛍光標識等を挙げることができる。  One preferred embodiment is a method using as an index the binding between the SPO1 1 protein and the test compound. In general, a compound that binds to the SPO11 protein is expected to have an effect of inhibiting the activity of the SPO11 protein. Here, the compound preferably binds to the active site of the SPO11 protein. In this method, first, the S.P011 protein is contacted with a test compound. Depending on the indicator for detecting binding to the test compound, the SPO 11 protein can be used, for example, in a purified form of the SPO ll protein, in a form expressed intracellularly or extracellularly, or on an affinity column. It can be in a combined form. The test compound used in this method can be appropriately labeled as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label.
本方法においては、 次いで、 S P〇 1 1タンパク質と被検化合物との 結合を検出する。  In this method, the binding between the SP011 protein and the test compound is then detected.
本方法に用いる被検化合物としては、 特に制限はない。 例えば、 天然 化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプチドなどの単一化 合物、 並びに、 化合物ライブラリー、 遺伝子ライブラリーの発現産物、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物 抽出物等が挙げられるが、 これらに限定されない。  There is no restriction | limiting in particular as a test compound used for this method. For example, natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides, etc., as well as compound libraries, gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, oceans Examples include, but are not limited to, biological extracts and plant extracts.
S P O 1 1 夕ンパク質と被検化合物との結合は、 例えば、 S P 0 1 1 夕ンパク質に結合した被検化合物に付された標識によって検出すること ができる。 また、 細胞内または細胞外に発現している S P O 1 1 タンパ ク質への被検化合物の結合により生じる S P O l 1 タンパク質の活性の 変化を指標として検出することもできる。 タンパク質と被検化合物との 結合活性は、 公知の手法によって測定することができる （例えば、 Type II topoisomerase 活性などの測定 （Bergerat, A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 27663-27669. ) ) 。 The binding between the SPO 1 1 protein and the test compound can be detected by, for example, a label attached to the test compound bound to the SP 0 1 1 protein. In addition, a change in the activity of the SPO 11 protein caused by the binding of the test compound to the SPO 11 protein expressed intracellularly or extracellularly can also be detected as an indicator. The binding activity between the protein and the test compound can be measured by a known method (for example, Type II Measurement of topoisomerase activity (Bergerat, A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 27663-27669.)).
本方法においては、 次いで、 S P O l 1タンパク質と結合し、 その活 性を阻害する被検化合物を選択する。  In this method, a test compound that binds to the SPO1 1 protein and inhibits its activity is then selected.
本方法により単離される化合物は、 がん抑制作用を有することが期待 され、 がん治療剤として有用である。  The compound isolated by this method is expected to have a cancer suppressing action and is useful as a cancer therapeutic agent.
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、 S P O l 1遺伝子の発現 を指標とする方法である。  Another embodiment of the screening method of the present invention is a method using the expression of S P O l 1 gene as an index.
本方法においては、 まず、 S P O 1 1遺伝子を発現する細胞に、 被検 化合物を接触させる。 用いられる 「細胞」 の由来としては、 ヒ ト、 マウ ス、 ネコ、 ィヌ、 ゥシ、 ヒッジ、 トリなど、 ペッ ト、 家畜等に由来する 細胞が挙げられるが、 これら由来に制限されない。 「S P O I I遺伝子 を発現する細胞」 としては、 内因性の S P O 1 1遺伝子を発現している 細胞、 または外因性の S P〇 1 1遺伝子が導入され、 該遺伝子が発現し ている細胞を利用することができる。 外因性の S P O l 1遺伝子が発現 した細胞は、 通常、 それぞれ S PO l 1遺伝子が挿入された発現べクタ 一を宿主細胞へ導入することにより作製することができる。 該発現べク, 夕一は、 一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。  In this method, first, a test compound is brought into contact with cells expressing the SPO1 1 gene. Examples of the origin of the “cell” used include cells derived from pets, livestock, etc., including but not limited to humans, mice, cats, dogs, sushi, hidges, and birds. “Cells that express the SPOII gene” include cells that express the endogenous SPO11 gene, or cells that have the exogenous SP011 gene introduced and the gene is expressed. Can do. A cell in which an exogenous SPO11 gene is expressed can usually be prepared by introducing an expression vector into which the SPO11 gene has been inserted into a host cell. The expression vector, Yuichi, can be prepared by general genetic engineering techniques.
本方法に用いる被検化合物としては、 特に制限はないが、 例えば、 天 然化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプチドなどの単一 化合物、 並びに、 化合物ライブラリー、 遺伝子ライブラリーの発現産物、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物 抽出物等が用いられる。  The test compound used in this method is not particularly limited. For example, natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, single compounds such as proteins and peptides, compound libraries, expression products of gene libraries, Cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, etc. are used.
S P O 1 1遺伝子を発現する細胞への被検化合物の 「接触」 は、 通常、 それぞれ S PO l 1遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加 することによって行う力 この方法に限定されない。 被検化合物がタン パク質等の場合には、 該タンパク質を発現する DNAベクターを、 該細 胞へ導入することにより、 「接触」 を行うことができる。  “Contact” of a test compound to a cell expressing the SPO 11 gene is usually performed by adding the test compound to the culture medium of each cell expressing the S PO 11 gene. . When the test compound is a protein or the like, “contact” can be performed by introducing a DNA vector expressing the protein into the cell.
本方法においては、 次いで、 該 S P〇 1 1遺伝子の発現レベルを測定 する。 ここで 「遺伝子の発現」 には、 転写および翻訳の双方が含まれる。 遺伝子の発現レベルの測定は、 当業者に公知の方法によって行うことが できる。 例えば、 S P O 1 1遺伝子を発現する細胞から mR N Aを常法 に従って抽出し、 この mRN Aを铸型としたノーザンハイプリダイゼー シヨン法または RT— P C R法を実施することによって該遺伝子の転写 レベルの測定を行うことができる。 あるいは、 S P O l 1遺伝子のプロ モーター領域を常法に従って単離し、 その下流に標識遺伝子 （例えば、 ルシフェラ一ゼ、 G F P、 ガラク トシダーゼ等の発光、 蛍光、 発色など を指標に検出可能な遺伝子が挙げられるが、 これらに限定されない） を つなげ、 その標識遺伝子の活性を見ることによっても該遺伝子の転写レ ベルの測定を行うことができる。 また、 S P O 1 1遺伝子を発現する細 胞からタンパク質画分を回収し、 それぞれ S P O l 1タンパク質の発現 を S D S— P A G E等の電気泳動法で検出することにより、 遺伝子の翻 訳レベルの測定を行うこともできる。 さらに、 S P O l lタンパク質に 対する抗体を用いて、 ウエスタンブロッテイング法を実施することによ り該タンパク質の発現を検出することにより、 遺伝子の翻訳レベルの測 定を行うことも可能である。 S PO 1 1タンパク質の検出に用いる抗体.. としては、 検出可能な抗体であれば、 特に制限はないが、 例えばモノク 口一ナル抗体、 またはポリクローナル抗体の両方を利用することができ る。 In this method, the expression level of the SP011 gene is then measured. To do. Here, “gene expression” includes both transcription and translation. The gene expression level can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA can be extracted from cells expressing the SPO 11 gene according to a conventional method, and the transcription level of the gene can be reduced by performing Northern hybridization or RT-PCR using this mRNA as a saddle. Measurements can be made. Alternatively, the promoter region of the SPO 11 gene is isolated according to a conventional method, and a gene that can be detected downstream using a labeled gene (for example, luminescence, fluorescence, color development, etc. of luciferase, GFP, galactosidase, etc.) However, the transcription level of the gene can also be measured by observing the activity of the marker gene. In addition, the protein fraction is collected from cells expressing the SPO 11 gene, and the level of gene translation is measured by detecting the expression of each SPO 11 protein by electrophoresis such as SDS-PAGE. You can also. Furthermore, it is also possible to measure the translation level of a gene by detecting the expression of the protein by performing Western blotting using an antibody against the SPOll protein. The antibody used for detecting the S PO 11 protein is not particularly limited as long as it is a detectable antibody. For example, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.
本方法においては、 次いで、 被検化合物を接触させない場合 （コント ロール） と比較して、 該発現レベルを低下させる化合物を選択する。 こ のようにして選択された化合物は、 がん治療剤のための候補化合物とな る。  In this method, a compound that decreases the expression level is then selected as compared with the case where the test compound is not contacted (control). Compounds selected in this way become candidate compounds for cancer therapeutics.
3. 抗 S P O l 1抗体及びこの抗体を含有する治療剤、 複合体および 組成物 3. Anti-SPO1 antibody and therapeutic agent, complex and composition containing this antibody
本発明はまた、 抗 S P O l l抗体、 この抗体を含有するがん治療剤な どを提供する。 本発明の 1つの好ましい態様では、 上記がん治療剤は、 がんの標的化療法または標的化薬物送達のために使用される。 The present invention also provides an anti-SPOll antibody, a cancer therapeutic agent containing this antibody, and the like. In one preferred embodiment of the present invention, the cancer therapeutic agent is Used for cancer targeted therapy or targeted drug delivery.
3. 1 抗 S PO 1 1抗体 3.1 Anti-S PO 1 1 antibody
本明細書中、 「抗 S P O 1 1抗体」 には、 S PO 1 1タンパク質 （そ の断片 （部分ペプチド） もしくはその塩を含む） に特異的に結合する抗 体が含まれる。 本発明において使用する抗 S P O 1 1抗体は、 ポリクロ ーナル抗体であってもよいし、 モノクローナル抗体であってもよい。 抗 体のクラスは、 特に限定されず、 I g G、 I gM、 I g A、 I g D、 ま たは I g E等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。 好ま しくは、 I g Gまたは I gMであり、 精製の容易性等を考慮すると、 よ り好ましくは I g Gである。 また、 ここでいう 「抗体」 という用語は、 任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、 例えば、 F a b、 F a b ' 2、 CDR、 ヒ ト化抗体、 多機能抗体、 単鎖抗体 （S c F v) などを含む。 本発明の抗体は、 公知の方法で製造することができる。 こ のような抗体の製造法は当該分野で周知である （例えば H a r 1 o w E . & L a n e D. ， An t i b o d y, C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8, 8) を参照） 。 In the present specification, “anti-SPO 11 antibody” includes an antibody that specifically binds to S PO 11 protein (including fragments (partial peptides) or salts thereof). The anti-SPO11 antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in view of ease of purification. In addition, the term “antibody” here is used to include any antibody fragment or derivative. For example, Fab, Fab ′ 2 , CDR, humanized antibody, multifunctional antibody, single chain antibody ( S c F v) etc. The antibody of the present invention can be produced by a known method. Methods for producing such antibodies are well known in the art (see, for example, Har 1 ow E. & Lane D., Antibody, Old Spring Laboratory Pres (1 9 8, 8)). See).
( 1 ) 抗原の調製  (1) Preparation of antigen
本発明において、 感作抗原として使用されるタンパク質は、 通常、 S P O 1 1夕ンパク質またはその塩である。 上記 S P O 1 1タンパク質に は、 その部分ペプチドも含まれ、 これは、 限定されることはないが、 例 えば、 配列番号 2のアミノ酸配列の断片であって、 例えば、 2 0個以上、 40個以上、 6 0個以上、 8 0個以上、 1 0 0個以上の、 連続するアミ ノ酸配列部分を有する部分ペプチドである。 これらの断片として、 例え ば、 ァミノ （N) 末端断片やカルボキシ （C) 末端断片が用いられる。 本発明で用いられる部分べプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1または 2 個以上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 6 個） ） のアミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入及び/又は付加されたもので あってもよい。 ここで用いられる S P〇 1 1 夕ンパク質またはその部分 ペプチドの塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸） との塩などが用 いられる。 抗体取得の感作抗原として使用される本発明の S P〇 1 1夕 ンパク質は、 その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、 例えば マウス、 ヒ ト由来のタンパク質が好ましく、 特にヒ ト由来のタンパク質 が好ましい。 In the present invention, the protein used as the sensitizing antigen is usually SPO 11 protein or a salt thereof. The SPO 11 protein includes a partial peptide thereof, which is not limited to, for example, a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 20 or more, 40 The above is a partial peptide having 60 or more, 80 or more, 100 or more consecutive amino acid sequence portions. As these fragments, for example, amino (N) terminal fragment and carboxy (C) terminal fragment are used. In the partial peptide used in the present invention, one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 6)) amino acid residues in the above amino acid sequence are deleted. , Substitutions, insertions and / or additions There may be. As used herein, SP ○ 1 1 protein or its partial peptide salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid). Salt is used. The SP011 protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal such as a mouse or human, particularly from human. The protein is preferred.
( 2 ) S P O 1 1夕ンパク質に対するモノクローナル抗体の作製  (2) Production of monoclonal antibodies against SPO1 protein
( i ) 抗体産生細胞の採取  (i) Collection of antibody-producing cells
上記のような S P O 1 1 タンパク質、 その部分ペプチド又はその塩 S P O 1 1 protein as described above, partial peptide thereof or salt thereof
(本明細書中、 抗体に関する説明では、 これらをまとめて、 「S P〇 1 1タンパク質」 という。 ） を抗原として、 哺乳動物、 例えばラッ 卜、 マ ウス、 ゥサギなどに投与する。 抗原の動物 1匹当たりの投与量は、 アジ ュバントを用いないときは 0 . 1〜：！ O O m gであり、 アジュバントを 用いるときは l〜 1 0 0 z gである。 アジュバントとしては、 フロイン ト完全アジュバント （F C A ) 、 フロイント不完全アジュバント （F I A ) 、 水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。 免疫は、 主と, して静脈内、 皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。 また、 免疫の間隔は特に限定されず、 数日から数週間間隔、 好ましくは 2〜 5 週間間隔で、 1〜 1 0回、 好ましくは 2〜 5回免疫を行う。 そして、 最 終の免疫日から 1〜 6 0 日後、 好ましくは 1〜 1 4 日後に抗体産生細胞 を採集する。 抗体産生細胞としては、 脾臓細胞、 リンパ節細胞、 末梢血 細胞等が挙げられるが、 脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。 (In the present specification, in the description of antibodies, these are collectively referred to as “SP01 protein”) and administered as an antigen to mammals such as rabbits, mice, and rabbits. Dosage of antigen per animal is 0.1 ~: when adjuvant is not used! O O mg, and l to 100 zg when an adjuvant is used. Examples of the adjuvant include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is mainly performed by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. Further, the immunization interval is not particularly limited, and immunization is carried out 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 5 weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days after the last immunization day, preferably 1 to 14 days later. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells and the like, and spleen cells or local lymph node cells are preferred.
( i i ) 細胞融合  (i i) Cell fusion
ハイプリ ドーマを得るため、 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞 融合を行う。 抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、 マウス などの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。 使用 する細胞株としては、 薬剤選択性を有し、 未融合の状態では H A T選択 培地 （ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジンを含む） で生存でき ず、 抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが 好ましい。 ミエローマ細胞としては、 例えば X 6 3 A g. 8. 6 5 3、 N S I Z 1— A g 4— 1、 N S O Z lなどのマウスミエローマ細胞株、 Y B 2 / 0などのラッ トミエローマ細胞株が挙げられる。 Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed in order to obtain a hybridoma. As myeloma cells to be fused with antibody-producing cells, generally available cell lines of animals such as mice can be used. The cell line used has drug selectivity and can survive in HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state. In particular, those having the property of being able to survive only in a state fused with antibody-producing cells are preferable. Examples of myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as X 6 3 A g. 8. 65 3, NSIZ 1-A g 4-1, NSOZ l, and rat myeloma cell lines such as YB 2/0.
次に、 上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。 細胞 融合は、 血清を含まない DMEM、 R P M I — 1 6 40培地などの動物 細胞培養用培地中で、 1 X 1 0 6〜 1 X 1 0 7個 m l の抗体産生細胞 と 2 X 1 0 5〜2 X 1 0 6個 m l のミエローマ細胞とを混合し （抗体 産生細胞とミエローマ細胞との細胞比 2 ： 1〜 3 ： 1が好ましい） 、 細 胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。 細胞融合促進剤として、 平 均分子量 1 0 0 0〜 6 0 0 0ダルトンのポリエチレンダリコール等を使 用することができる。 また、 電気刺激 （例えばエレク ト口ポレーショ ン） を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ 細胞とを融合させること'もできる。 Next, the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused. Cell fusion consists of 1 X 10 6 to 1 X 10 7 ml of antibody-producing cells and 2 X 1 0 5 to 1 in animal cell culture media such as serum-free DMEM, RPMI — 1 6 40 2 X 1 0 6 cells ml of the myeloma cells were mixed (the antibody producing cells with myeloma cells and cell ratio of 2: 1 to 3: 1 is preferred), the fusion reaction in the presence cells fusion promoter . As the cell fusion promoter, polyethylene dalycol having an average molecular weight of 1000 to 600,000 Dalton can be used. In addition, antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (eg, electrical mouth population).
( i l l ) ハイプリ ドーマの選別及びクローニング  (i l l) Selection and cloning of high-pridoma
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリ ドーマを選別する。 そ の方法として、 細胞懸濁液を例えばゥシ胎児血清含有 R P M I - 1 64, 0培地などで適当に希釈後、 マイクロタイ夕一プレート上に 3 X 1 05 個 Zw e 1 1程度まき、 各ゥエルに選択培地を加え、 以後適当に選択培 地を交換して培養を行う。 その結果、 選択培地で培養開始後、 1 4日前 後から生育してくる細胞をハイプリ ドーマとして得ることができる。 Select the desired hybridoma from the cells after cell fusion treatment. As a method, the cell suspension is appropriately diluted with, for example, RPMI-1 64, 0 medium containing urchin fetal serum, and then plated on a microtiter plate about 3 × 10 5 Zwe 1 1 Add selective medium to each well, and then change the selected medium appropriately. As a result, cells that grow 14 days before or after the start of culture in the selective medium can be obtained as a hybridoma.
次に、 増殖してきたハイプリ ドーマの培養上清中に、 S P 01 1タン パク質に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。 ハイブ リ ドーマのスクリーニングは、 通常の方法に従えばよく、 特に限定され るものではない。 例えば、 .ノ、イブリ ドーマとして生育したゥエルに含ま れる培養上清の一部を採集し、 酵素免疫測定法、 放射性免疫測定法等に よってスクリーニングすることができる。 融合細胞のクローニングは、 限界希釈法等により行う。 そして、 最終的に、 S P O l 1タンパク質と 反応するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイプリ ドーマを樹 立する。 Next, the culture supernatant of the growing hybridoma is screened for the presence of antibodies that react with the SP 01 1 protein. Hybridoma screening may be performed in accordance with a normal method, and is not particularly limited. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma can be collected and screened by an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, or the like. Cloning of fused cells is performed by limiting dilution. Finally, a hybridoma, a cell that produces a monoclonal antibody that reacts with the SPO 11 protein, was constructed. Stand up.
( i v ) モノクローナル抗体の採取  (i v) Monoclonal antibody collection
上記のようにして得たハイプリ ドーマからモノク口一ナル抗体を採取 する方法として、 通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することが できる。 細胞培養法においては、 ハイプリ ドーマを 1 0 %ゥシ胎児血清 含有 R PM I — 1 6 4 0培地、 M E M培地又は無血清培地等の動物細胞 培養培地中で、 通常の培養条件 （例えば 3 7 °C、 5 % C 02濃度) で 7〜 1 4 日間培養し、 その培養上清から抗体を取得する。 腹水形成法の 場合は、 ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブ リ ドーマを約 1 X 1 07個投与し、 ハイプリ ドーマ.を大量に増殖させる。 そして、 1〜 2週間後に腹水を採取する。 上記抗体の採取方法において 抗体の精製が必要とされる場合は、 硫安塩析法、 イオン交換クロマトグ ラフィー、 ゲル濾過、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの公知の 方法を適宜選択じて、 又はこれらを組み合わせることにより精製するこ とができる。 As a method for collecting monoclonal antibody from the hybridoma obtained as described above, a normal cell culture method or ascites formation method can be employed. In cell culture methods, hybridoma containing 10% urine fetal serum R PM I — 16 40 medium, animal cell culture medium such as MEM medium or serum-free medium, etc. ° C, 5% C 0 2 concentration) 7 and cultured for 4 days in and obtained from the culture supernatant antibody. For ascites formation method, the hive re dormer about 1 X 1 0 7 cells were administered intraperitoneally to the mammal of the same species as the animal from which the myeloma cells are derived, thereby High Priestess dormer. The large quantities grown. Ascites is collected after 1-2 weeks. If antibody purification is required in the antibody collection method, known methods such as ammonium sulfate salting-out, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, etc. are appropriately selected or combined. Can be purified.
( 3 ) S P O 1 1 タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製 まず、 上記した抗原を哺乳動物、 例えばラッ ト、 マウス、 ゥサギなど. に投与する。 抗原の動物 1匹当たりの投与量は、 アジュバントを用いな いときは 0. 1〜； L O O mgであり、 アジュバントを用いるときは 1 0 〜 1 0 0 0 ;u gである。 アジュバントとしては、 フロイント完全アジュ ノ ント （F C A) 、 フロイント不完全アジュバント （F I A) 、 水酸化 アルミニウムアジュバント等が挙げられる。 免疫は、 主として静脈内、 皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。 また、 免疫の間隔は 特に限定されず、 数日から数週間間隔、 好ましくは 2〜 5週間間隔で、 1〜 1 0回、 好ましくは 2.〜 5回免疫を行う。 そして、 最終の免疫日か ら 6〜 6 0 日後に、 酵素免疫測定法 （E L I S A ( e n z ume— 1 1 n k e d i mmu n o s o r b e n t a s s y) 又は E I A { e n z ym e i mm u n o a s s a y ) ) 、 放射性免疫測定法 （R I A ； r a d i o ! mmu n o a s s a y) 等で抗体価を測定し、 最大 の抗体価を示した日に採血し、 抗血清を得る。 (3) Preparation of polyclonal antibody against SPO 1 1 protein First, the antigen described above is administered to mammals such as rats, mice, and rabbits. The dose of antigen per animal is from 0.1 to LOO mg when no adjuvant is used, and from 10 to 100; ug when adjuvant is used. Examples of adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. Further, the immunization interval is not particularly limited, and immunization is carried out 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks. 6 to 60 days after the last immunization, enzyme immunoassay (ELISA (enz ume— 1 1 nkedi mmu nosorbentassy) or EIA (enz ym ei mm unoassay)), radioimmunoassay (RIA; radio mmu noassay) etc. Blood is collected on the day when the antibody titer is shown to obtain antiserum.
次いで、 例えば、 抗血清中のポリクローナル抗体を、 S P O l lタン パク質で固定されたァフィ二ティ一力ラムにかけて S P O 1 1タンパク 質と反応する抗体 （カラム吸着画分） を採取する。 S P O l 1タンパク 質に対する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性は、 E L I S A法な どで測定することができる。  Next, for example, an antibody (column adsorbed fraction) that reacts with the SPO1 1 protein is collected by subjecting the polyclonal antibody in the antiserum to an affinity ram fixed with the SPO1l protein. The reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum to the SPO1 protein can be measured by the ELISA method or the like.
(4) 抗体の断片など  (4) Antibody fragments
F a bまたは F a b ' 2断片は、 従来の方法によるプロテア一ゼ （例 えば、 ペプシンまたはパパイン） を用いた消化により作製することがで きる。 ヒ ト化抗体は、 例えば R i e c hma n nら. （R i e c h m a n n J M o 1 B i o l . O c t 5 ; 2 0 3 ( 3 ) : 8 2 5 - 8 , 1 9 8 8 ) 、 および J o n e s ら （ J o n e s ら N a t u r e 3 2 1 ： 5 2 2 - 5 2 5 , 1 9 8 6 ) に記載のような方法の 1つにより調製 することができる—。 The F ab or F ab ' 2 fragment can be prepared by digestion with a conventional protease (eg, pepsin or papain). Humanized antibodies are described, for example, by Riec hma nn et al. (Riechmann JM o 1 B iol. Oct 5; 2 0 3 (3): 8 2 5-8, 1 9 8 8), Jones et al. Nature 3 2 1: 5 2 2-5 2 5, 1 9 8 6) —can be prepared by one of the methods—
また、 キメラ抗体は、 例えば、 「実験医学 （臨時増刊号） 、 V o l . 1. 6， N o. 1 0 , 1 9 8 8」 、 特公平 3— 7 3 2 8 0号公報等を、 ヒ 卜化抗体は、 例えば、 「N a t u r e G e n e t i c s , V o l . , 1 5， p . 1 4 6 - 1 5 6 , 1 9 9 7」 、 「 N a t u r e G e n e t Chimeric antibodies include, for example, “Experimental Medicine (Special Issue), Vol. 1. 6, No. 10, 1 9 8 8”, Japanese Patent Publication No. 3-7 3 2 80, etc. For example, human antibodies such as “Nature Genetics, Vol., 15, p. 1 4 6-1 5 6, 1 9 9 7”, “Nature Genet”
1 c s , V o 1.. 7 , p . 1 3 - 2 1 , 1 9 94」 、 特表平 4— 5 04 3 6 5号公報、 国際出願公開 W〇 9 4 · 2 5 5 8 5号公報等、 「日経サ ィエンス、 6月号、 第 4 0〜第 5 0頁、 1 9 9 5年」 、 「N a t u r e， V o l . 3 6 8 , p . 8 5 6 - 8 5 9 , 1 9 94」 、 特表平 6— 5 0 01 cs, V o 1 .. 7, p. 1 3-2 1, 1 994 '', Special Publication No. Hei 4-4 04 3 6 5, International Application Publication W094 · 2 5 5 8 5 Publications, etc., “Nikkei Science, June issue, pages 40 to 50, 1 995”, “Nature, Vol. 3 6 8, p. 8 5 6-8 5 9, 1 9 94 ”
2 3 3号公報等を参考にそれぞれ製造することができる。 本発明の S P O 1 1タンパク質に結合する抗体は、 例えば、 癌細胞の増殖もしくは転 移の抑制等を目的とした使用が考えられる。 得られた抗体を人体に投与 する目的 （抗体治療） で使用する場合には、 免疫原性を低下させるため、 ヒ ト抗体ゃヒ 卜型抗体が好ましい。 Each can be manufactured with reference to No. 2 3 No. 3, etc. The antibody that binds to the SPO1 1 protein of the present invention can be used for the purpose of, for example, inhibiting the growth or migration of cancer cells. When the obtained antibody is used for the purpose of administering it to the human body (antibody therapy), a human antibody is preferably a human antibody in order to reduce immunogenicity.
抗体は、 診断剤として用いる場合は、 モニタリング等のための標識物 質 （例えば、 放射性同位元素、 蛍光物質など） で標識されていてもょレ 必要に応じて、 放射性物質、 蛍光化合物などにより標識することができ る。 最も慣用の蛍光標識化合物の中には、 フルォレセインイソチオシァ ネート、 ローダミン、 フィコエリ トリンおよびフルォレスカミンがある。 同様に、 生体発光性化合物を用いて、 抗体 S P〇 1 1抗体を標識するこ ともできる。 生体発光性タンパク質の存在は、 蛍光の存在を検出するこ とによって測定される。 この標識目的に重要な生体発光性化合物は、 ル シフェリン、 ルシフェラ一ゼぉよびイエクオリンである。 When used as a diagnostic agent, an antibody may be labeled with a labeling substance (eg, a radioisotope or fluorescent substance) for monitoring. If necessary, it can be labeled with radioactive substances, fluorescent compounds, etc. Among the most commonly used fluorescent labeling compounds are fluorescein isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin and fluorescamine. Similarly, the antibody SP011 antibody can be labeled using a bioluminescent compound. The presence of a bioluminescent protein is measured by detecting the presence of fluorescence. Important bioluminescent compounds for this purpose are luciferin, luciferase and aequorin.
なお、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する S P o 1 1タンパク質等を特異的に検出するために使用することができる。 ま た、 S P O 1 1タンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作 製、 精製時の各分画中の S P 0 1 1 タンパク質等の検出、 被検細胞内に おける S P O 1 1 夕ンパク質の挙動の分析などのために使用することが できる。 3 . 2 抗 S P O 1 1抗体を含有する複合体など  The antibody of the present invention can be used for specifically detecting Spo1 1 protein and the like present in a subject such as a body fluid or tissue. In addition, production of antibody columns used to purify SPO 1 1 protein, detection of SP 0 1 1 protein in each fraction during purification, SPO 1 1 protein in test cells It can be used to analyze the behavior of 3.2 Complexes containing anti-S P O 1 1 antibody, etc.
また、 本発明において使用する抗 S P O 1 1抗体は、 本発明の治療剤 または診断剤において、 それ自体が、 抗原の活性を減弱させるような中' 和活性を有する薬剤 （ a g e n t ) であり得る力^ 必要に応じて、 治療 効果を奏するための他の薬剤と組み合わせて用いることができる。 した がって、 本発明は、 もう一つの態様において、 がん （例えば、 大腸が ん） の標的化療法または標的化イメージング等に使用するための、 抗 S P O 1 1抗体と他の薬剤との複合体、 そのような複合体を含有する組成 物などをも提供する。 このような態様によれば、 本発明において使用す る抗 S P O l 1抗体を用いて、 治療効果を奏する他の薬剤または診断の ための標識剤などを、 S P. O 1 1タンパク質を高発現する標的部位へ送 達することができる。  In addition, the anti-SPO11 antibody used in the present invention is an agent that can be an agent having a neutral activity that attenuates the activity of the antigen in the therapeutic agent or diagnostic agent of the present invention. ^ If necessary, it can be used in combination with other drugs to produce a therapeutic effect. Therefore, in another embodiment, the present invention provides an anti-SPO 1 1 antibody and another drug for use in targeted therapy or targeted imaging of cancer (eg, colon cancer). Also provided are composites, compositions containing such composites, and the like. According to such an embodiment, the anti-SPO 11 antibody used in the present invention is used to express other drugs that exhibit therapeutic effects or labeling agents for diagnosis, etc. Can be delivered to the target site.
本発明において用いられる 「その他の薬剤」 としては、 例えば、 放射 性同位元素、 治療タンパク質、 または低分子の薬剤など、 標的への遺伝 子導入のためのウィルスベクターもしくは非ウィルスベクターなどが例 示される。 Examples of the “other drug” used in the present invention include a viral vector or a non-viral vector for introducing a gene into a target, such as a radioisotope, a therapeutic protein, or a small molecule drug. Indicated.
本発明において、 「放射性同位元素」 の例としては、 フッ素一 1 8 、 ヨウ素一 1 2 5 ( 1 2 5 I ) 、 およびヨウ素— 1 3 1などの放射性ハロゲ ン元素が挙げられる。 これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属 元素と同様に抗体やペプチドに標識して、 放射性治治療剤あるいは放射 性診断剤として広く利用し得る。 例えば、 1 2 5 I または1 3 1 I でのョー ド化は、 クロラミン T法等の公知の方法により、 抗体または抗体断片に 結合させることができる。 さらに、 診断用としてはテクネチウム一 9 9 m、 インジウム一 1 1 1およびガリウム— 6 7 ( 6 7 G a ) など、 また 治療用としてはイ ッ トリウム一 9 0 ( 9 ° Y ) 、 レニウム一 1 8 6 ( 1 8 6 R e ) またはレニウム— 1 8 8 ( 1 8 8 R e ) などが使用され得る。 放 射性同位元素を用いて抗体に標識する場合には、 通常、 金属キレート剤 が用いられる。 金属キレート剤としては、 E D T A、 D T P A、 ジアミ ノジチォ化合物、 サイクラム、 および D O T Aなどが知られている。 こ れらのキレート剤は抗体に予め結合しておき、 その後放射性金属で標識 する場合と、 放射性金属キレートを形成後、 抗体に結合して標識する方 法がある。 In the present invention, examples of the “radioisotope” include radioactive halogen elements such as fluorine 1 18, iodine 1 1 2 5 ( 1 2 5 I), and iodine 1 3 1. These radioactive halogen elements can also be widely used as radiotherapeutic agents or radiodiagnostic agents by labeling antibodies and peptides in the same manner as the above-mentioned radioactive metal elements. For example, odorization with 1 2 5 I or 1 3 1 I can be bound to an antibody or antibody fragment by a known method such as the chloramine T method. Furthermore, technetium one 9 9 m for the diagnosis, indium one 1 1 1 and gallium - 6 7 (6 7 G a ) such, As the therapeutic Lee Tsu thorium one 9 0 (9 ° Y), rhenium one 1 8 6 ( 1 8 6 R e) or rhenium— 1 8 8 ( 1 8 8 Re) can be used. When labeling an antibody with a radioactive isotope, a metal chelator is usually used. Known metal chelating agents include EDTA, DTPA, diaminodithio compound, cyclam, and DOTA. These chelating agents may be pre-bonded to the antibody and then labeled with a radioactive metal, or may be labeled with the antibody after forming a radioactive metal chelate.
本発明において、 「治療タンパク質」 の例としては、 免疫を担う細胞 を活性化するサイ ト力インが好適であり、 例えば、 ヒ トインターロイキ ン 2、 ヒ ト顆粒球一マクロファージーコロニー刺激因子、 ヒ トマクロフ ァージコロニー刺激因子、 ヒ トインターロイキン 1 2等が挙げられる。 また、 大腸がん細胞を直接殺傷するため、 リシンやジフテリア毒素など の毒素を用いることができる。 例えば、 治療タンパク質との融合抗体に ついては、 抗体または抗体断片をコードする c D N Aに治療タンパク質 をコードする c D N Aを連結させ、 融合抗体をコードする D N Aを構築 し、 この D N Aを原核生物または真核生物用の発現ベクターに挿入し、 この発現べクタ一を原核生物または真核生物へ導入することにより発現 させ、 融合抗体を製造することができる。  In the present invention, as an example of the “therapeutic protein”, site force-in that activates cells responsible for immunity is suitable. For example, human interleukin 2, human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor And human macrophage colony stimulating factor, human interleukin 12 and the like. In addition, toxins such as ricin and diphtheria toxin can be used to directly kill colon cancer cells. For example, for a fusion antibody with a therapeutic protein, a cDNA encoding the fusion protein is constructed by linking the cDNA encoding the therapeutic protein to the cDNA encoding the antibody or antibody fragment, and this DNA is either prokaryotic or eukaryotic. A fusion antibody can be produced by inserting the expression vector into a biological expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
「低分子の薬剤」 は、 本明細書中で 「放射性同位元素」 や 「治療タン パク質」 等以外の診断または治療用化合物を意味するものとして用いら れる。 「低分子の薬剤」 の例としては、 ナイ 卜ロジェン · マスタード、 サイクロファスフアミ ドなどのアルキル化剤、 5—フルォロウラシル、 メソ トレキセ一卜などの代謝拮抗剤、 ダウノマイシン、 ブレオマイシン、 マイ トマイシン C, ダウノルビシン、 ドキソルビシンなどの抗生物質、 ビンクリスチン、 ビンブラスチン、 ビンデシンのような植物アル力ロイ ド、 夕モキシフェン、 デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤 （臨 床腫瘍学 （日本臨床腫瘍研究会編 1 9 9 6年 癌と化学療法社） ） 、 またはハイ ド口コーチゾン、 プレドニゾンなどのステロイ ド剤、 ァスピ リン、 インドメ夕シンなどの非ステロイ ド剤、 金チォマレ一卜、 ぺニシ ラミンなどの免疫調節剤、 サイクロフォスフアミ ド、 ァザチォプリンな どの免疫抑制剤、 マレイン酸クロルフエ二ラミン、 クレマシチンのよう な抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤 （炎症と抗炎症療法 昭和 5 7年 医歯 薬出版株式会社） などがあげられる。 例えば、 ダウノマイシンと抗体を 結合させる方法としては、 ダルタールアルデヒ ドを介してダウノマイシ ンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、 水溶性カルポジイミ ドを介し てダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法 , 等があげられる。 The term “small molecule drug” is used herein to mean “radioisotope” or “therapeutic tongue”. It is used to mean a diagnostic or therapeutic compound other than “protein”. Examples of “small molecule drugs” include alkylating agents such as naylogen mustard and cyclofasphamide, antimetabolites such as 5-fluorouracil and mesotrexe, daunomycin, bleomycin, mitomycin C, Antitumor agents such as antibiotics such as daunorubicin and doxorubicin, plant alcohols such as vincristine, vinblastine, and vindesine, and hormones such as evening moxifen and dexamethasone (Clinical Oncology (Japan Clinical Oncology) 1 9 9 6 Cancer and Chemotherapy))), or Steroids such as Hyde mouth cortisone and Prednisone, Non-Steroidal agents such as aspirin and Indomethacin, Immune chimerale, Penicillamine and other immunomodulators, Cyclophos Immunosuppression such as famide and azathioprine , Maleic acid Kurorufue two Ramin, such as anti-inflammatory agents, antihistamines, such as such as Kuremashichin (inflammation and anti-inflammatory therapy in 1982 years Biomedical drug Publishing Co., Ltd.) and the like. For example, daunomycin and antibody can be bound by binding between daunomycin and the amino group of the antibody via dartal aldehyde, or by binding the amino group of daunomycin and the carboxyl group of the antibody via water-soluble carpositimide. And the like.
「ウィルスベクター」 の例としては、 本発明の抗 S P O 1 1抗体に結 合し得るように改変されたウィルスベクタ一が使用し得る （例えば、 ァ デノウィルスべクタ一 （W a n g , P. ， e t a 1 . ( 1 9 9 5 ) S o ma t i c C e l l a n d M o l e c . G e n e t . 2 1， 4 2 9 - 44 1 ) 、 レトロウイルスベクター （N a v i a u x R. K. , e t a 1 . ( 1 9 9 6 ) J . V i r o l 7 0， 5 7 0 1 - 5 7 0 5 ) 、 レンチウィルスベクター （N a I d i n i , L . ( 1 9 9 8 ) C u r r . O p i n . B i o t e c h n o 1 . 9， 4 5 7 - 46 3 ) などが挙げられる） 。 このようなウィルスべク 夕一には、 細胞増殖関連遺伝子、 アポトーシス関連遺伝子、 免疫制御遺 伝子等の、 標的部位 （例えば、 大腸がん） において、 例えば、 癌細胞の アポトーシスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子 （治療遺伝子） が組み込まれる。 抗 S P〇 1 1抗体に結合するウィルスベクターは、 抗 S P〇 1 1抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与された場合、 抗 S P O 1 1抗体が認識する抗原 （すなわち、 S P O 1 1 ) が存在する 部位に標的化することができる。 As an example of a “viral vector”, a viral vector modified so as to be capable of binding to the anti-SPO11 antibody of the present invention can be used (for example, an adenovirus vector (Wang, P., eta 1 (1 9 9 5) Somatic Celland Molec. Genet. 2 1, 4 2 9-44 1), retroviral vector (N aviaux RK, eta 1. (1 9 9 6) J. V irol 7 0, 5 7 0 1-5 7 0 5), lentiviral vector (N a I dini, L. (1 9 9 8) C urr. O pin. B iotechno 1. 9, 4 5 7-46 3))). Such virus vectors include cell proliferation-related genes, apoptosis-related genes, immune regulatory genes, and other target sites (eg, colon cancer), for example, cancer cells A gene (therapeutic gene) that has a therapeutic effect such as inducing apoptosis is incorporated. The virus vector that binds to the anti-SP011 antibody, when administered to a patient in need of gene therapy with the anti-SP011 antibody, recognizes the antigen recognized by the anti-SPO11 antibody (ie, SPO11). Can be targeted to existing sites.
抗 S P O 1 1抗体と上記他の薬剤とは、 化学的または遺伝子工学的に 結合され得る。 ここで、 「化学的な結合」 には、 イオン結合、 水素結合、 共有結合、 分子間力による結合、 疎水性相互作用による結合などが含ま れるものとし、 「遺伝子工学的な結合」 には、 例えば、 抗体と治療タン パク質とからなる融合夕ンパク質を遺伝子組換えな.どの技術を用いて作 製した場合の、 抗体と治療タンパク質との間の結合様式などが含まれる ものとする。  The anti-SPO1 1 antibody and the other drug can be combined chemically or genetically. Here, “chemical bond” includes ionic bond, hydrogen bond, covalent bond, bond by intermolecular force, bond by hydrophobic interaction, etc., and “genetic engineering bond” For example, the binding mode between an antibody and a therapeutic protein when a fusion protein consisting of an antibody and a therapeutic protein is produced using any technique such as genetic recombination is included.
4 . 製剤化および製剤の投与方法 4. Formulation and administration method
本発明の S P O 1 1遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療剤、 S P O l 1タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤、 本発明の抗 A cancer therapeutic agent containing the S P O 1 1 gene expression inhibitor of the present invention, a cancer therapeutic agent containing a S P O l 1 protein activity inhibitor,
S P O l 1抗体を含有する治療剤、 または本発明において使用する抗 sA therapeutic agent containing an S P O l 1 antibody, or an anti-s used in the present invention
P O l 1抗体が、 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低分子の薬剤、 お よび治療遺伝子を担持したウィルスベクターもしくは非ウィルスベクタ 一のうちのいずれか、 またはこれらの任意の組み合わせと化学的または 遺伝子工学的に結合されている治療剤は、 公知の手法に基づいて製剤化 することができる。 PO l 1 antibody is either a viral or non-viral vector carrying a radioisotope, therapeutic protein, small molecule drug, and therapeutic gene, or any combination of these and chemical or genetic engineering Therapeutically bound therapeutic agents can be formulated based on known techniques.
本発明の治療剤の製剤化にあたっては、 常法に従い、 必要に応じて薬 学的に許容される担体を添加することができる。 例えば、 界面活性剤、 賦形剤、 着色料、 着香料、 保存料、 安定剤、 緩衝剤、 懸濁剤、 等張化剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 流動性促進剤、 矯味剤等が挙げられるが、 こ れらに制限されず、 その他常用の担体を適宜使用することができる。 具 体的には、 軽質無水ケィ酸、 乳糖、 結晶セルロース、 マンニトール、 デ ンプン、 カルメロ一スカルシウム、 カルメロースナトリウム、 ヒ ドロキ シプロピルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルメチルセルロース、 ポリビ 二ルァセ夕一ルジェチルァミノアセテート、 ポリ ビニルピロリ ドン、 ゼ ラチン、 中鎖脂肪酸トリダリセライ ド、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ 油 6 0、 白糖、 カルボキシメチルセルロース、 コーンスターチ、 無機塩 類等を挙げることができる。 In formulating the therapeutic agent of the present invention, a pharmaceutically acceptable carrier can be added as necessary according to a conventional method. For example, surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters, taste masking However, the present invention is not limited to these, and other commonly used carriers can be appropriately used. Specifically, light anhydrous key acid, lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxide Cypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinyl alcohol, Ruzetilamino acetate, Polyvinylpyrrolidone, Gelatin, Medium chain fatty acid tridalise, Polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, White sugar, Carboxymethylcellulose, Corn starch, Examples thereof include inorganic salts.
本発明の治療剤の剤型の種類としては、 例えば、 経口剤として錠剤、 粉末剤、 丸剤、 散剤、 顆粒剤、 細粒剤、 軟 '硬カプセル剤、 フィルムコ 一ティ ング剤、 ペレッ ト剤、 舌下剤、 ペース ト剤等、 非経口剤として注 射剤、 坐剤、 経皮剤、 軟膏剤、 硬膏剤、 外用液剤等が挙げられ、 当業者 においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができ る。 有効成分としての S PO l 1タンパク質の活性 （または S P O l 1 遺伝子の発現） 阻害物質は、 製剤中 0. 1から 9 9. 9重量％含有する ことができる。  Examples of the dosage form of the therapeutic agent of the present invention include tablets, powders, pills, powders, granules, fine granules, soft and hard capsules, film coating agents, and pellets as oral agents. Agents, sublingual agents, pastes, etc., parenteral agents include injections, suppositories, transdermal agents, ointments, plasters, liquids for external use, etc. The optimum dosage form can be selected. An inhibitor of the activity of the S PO 11 protein (or the expression of the S PO 11 gene) as an active ingredient can be contained in the preparation in an amount of 0.1 to 99.9% by weight.
本発明の薬剤の有効成分の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法などにより差はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 患者 (6 0 k gとして） に対して一日につき約 0. l mg〜： I , 0 0 0 mg、 好ましくは約 1. 0〜： 1 0 0 mg、 より好ましくは約 1. 0〜5 0mg, である。 非経口的に投与する場合は、 その一回投与量は投与対象、 対象 臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形で は通常例えば、 患者 （6 0 k gに対して） 、 一日につき約 0. 0 1から 3 0 mg程度、 好ましくは約 0. 1から 2 0mg程度、 より好ましくは 約 0. 1〜 1 O mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 しかしながら、 最終的には、 剤型の種類、 投与方法、 患者の年齢や体重、 患者の症状等を考慮して、 医師または獣医師の判断により適宜決定する ことができる。  The dose of the active ingredient of the drug of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc., but in the case of oral administration, for example, generally for patients (as 60 kg) From about 0.1 mg / day to: I, 0,000 mg, preferably from about 1.0 to: 100 mg, more preferably from about 1.0 to 50 mg. When administered parenterally, the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptom, administration method, etc. For example, in the form of injection, for example, patient (for 60 kg About 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 O mg per day is conveniently administered by intravenous injection. . However, the final decision can be made as appropriate based on the judgment of a doctor or veterinarian in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptoms, and the like.
このようにして得られる製剤は、 例えば、 ヒ トやその他の哺乳動物 (例えば、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して投与することができる。 ヒ ト以外の動物の場合も、 上記の 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。 本発明の治療剤は、 がん （例えば、 大腸がん、 胃がん、 肺がん、 乳が ん、 前立腺がん、 食道がん、 肝臓がん、 胆道がん、 脾臓がん、 腎がん、 膀胱がん、 子宮がん （例 ： 子宮頸がん、 子宮体がん） 、 精巣がん、 甲状 腺がん、 膝臓がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ， 治療、 好ましくは、 大腸がんの予防 · 治療に用いられる。 The preparation thus obtained can be administered, for example, to humans and other mammals (eg rat, rabbit, hidge, buyu, ushi, cat, inu, monkey, etc.). it can. In the case of animals other than humans, the amount converted per 60 kg can be administered. The therapeutic agent of the present invention is cancer (for example, colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder). Prevention, treatment of uterine cancer (eg cervical cancer, endometrial cancer), testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc., preferably Used for the prevention and treatment of colorectal cancer.
本発明の薬剤は、 S P〇 1 1 タンパク質の活性阻害物質または S P O 1 1遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有しているため、 抗癌剤、 癌転移阻害剤、 癌細胞のアポトーシス誘導剤等として使用し得る。 対象 となる細胞、 組織、 臓器、 または癌の種類は特定のものに限定されなレ また、 本発明の薬剤は、 S P O 1 1 タンパク質の活性阻害物質および S P 0 1 1遺伝子の発現阻害物質の両方を含んでいても良い。  Since the agent of the present invention contains an SP 0 1 1 protein activity inhibitor or SPO 1 1 gene expression inhibitor as an active ingredient, it is used as an anticancer agent, cancer metastasis inhibitor, cancer cell apoptosis inducer, etc. Can do. The target cell, tissue, organ, or cancer type is not limited to a specific type. The agent of the present invention is both an SPO 1 1 protein activity inhibitor and an SP 0 1 1 gene expression inhibitor. May be included.
本発明の治療剤において、 アンチセンス核酸を用いる場合、 該アンチ センス核酸を単独あるいはレトロウィルスベクタ一、 アデノウイルスべ クタ一、 アデノヴィルスァソシエーテツ ドウィルスベクタ一などの適当 なベクターに挿入した後、 公知の手段に従って投与することができる。 アンチセンス核酸は、 単独で、 あるいは生理学的に認められる担体とと もに製剤化し、 遺伝子銃やハイ ドロゲルカテーテルのようなカテーテル. によって投与することができる。  In the therapeutic agent of the present invention, when an antisense nucleic acid is used, the antisense nucleic acid is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus virus vector, etc. Thereafter, it can be administered according to known means. Antisense nucleic acids can be formulated alone or with a physiologically acceptable carrier and administered via a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.
また、 本発明において組換えアデノウイルス粒子のようなウィルスべ クタ一と抗 S P O l 1抗体との組み合わせを癌治療のために使用する場 合は、 これら単独で使用してもよいが、 一般には製薬的に許容できる担 体と共に使用される。 そのような担体としては、 既に上記したような担 体、 ならびに水、 生理食塩水、 グルコース、 ヒ トアルブミン等の水性等 張溶液が好ましい。 更に、 製薬的に通常使用される添加剤、 保存剤、 防 腐剤、 衡量等を添加することもできる。 そのように調製した医薬組成物 は、 治療すべき疾病に依存して適切な投与形態、 投与経路によって投与 することができる。 投与形態としては、 例えば、 乳剤、 シロップ剤、 力 プセル、 錠剤、 顆粒剤、 注射剤、 軟膏等が挙げられる。 本発明の抗 S P 0 1 1抗体一ウィルスベクター粒子またはこれを含む医薬組成物を治療 のために投与する場合は、 通常成人一人当たり 1回に 1 03〜 1 0 1 5個 のウィルス粒子を投与するのが好ましいが、 疾病の状態や標的細胞 · 組 織の性質によって変更してよい。 投与回数は、 1 日 1回〜数回でよく、 投与期間は 1 日〜数ケ月以上にわたってもよく、 1〜数回の投入を 1セ ッ トとして、 長期にわたって断続的に多数セッ トを投与してもよい。 ま た、 本発明において使用されるウィルスベクタ一粒子またはウィルスべ クタ一核酸分子は、 特定の細胞および/または組織の検出、 または疾病 状態の診断に使用することができる。 例えば、 ウィルスベクターの核酸 分子に検出可能なマーカー遺伝子を組込み、 これを適切な宿主細胞にト ランスフエクシヨンして得られたウィルスベクター.粒子は、 抗 S P〇 1 1抗体と組み合わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用することがで きる。 あるいは、 抗 S P〇 1 1抗体に検出可能な標識を結合させて腫瘍 細胞を検出診断するために使用することができる。 5. がんの診断剤及び診断方法 In the present invention, when a combination of a virus vector such as a recombinant adenovirus particle and an anti-SPO11 antibody is used for cancer treatment, these may be used alone, but in general, Used with a pharmaceutically acceptable carrier. As such a carrier, a carrier as described above and an aqueous isotonic solution such as water, physiological saline, glucose, and human albumin are preferable. Furthermore, additives, preservatives, preservatives, balance, etc. that are usually used in pharmaceutics can also be added. The pharmaceutical composition thus prepared can be administered by an appropriate administration form and administration route depending on the disease to be treated. Examples of administration forms include emulsions, syrups, force capsules, tablets, granules, injections, ointments and the like. Treatment of the anti-SP 0 1 1 antibody-one virus vector particle of the present invention or a pharmaceutical composition comprising the same In general, it is preferable to administer 10 3 to 10 15 virus particles at a time per adult, but this may vary depending on the disease state and the nature of the target cell / organization. Good. The number of administrations may be from once to several times a day, the administration period may be from one day to several months or more, and one set is set as one to several injections, and many sets are administered intermittently over a long period of time. May be. Moreover, the virus vector single particle or virus vector single nucleic acid molecule used in the present invention can be used for detection of specific cells and / or tissues, or diagnosis of disease states. For example, a viral vector obtained by incorporating a detectable marker gene into a nucleic acid molecule of a viral vector and transfecting it into an appropriate host cell. Can be used to detect and diagnose Alternatively, it can be used for detecting and diagnosing tumor cells by binding a detectable label to the anti-SP011 antibody. 5. Cancer diagnostic agents and diagnostic methods
本発明はまた、 がんの診断剤を提供する。 1つの好ましい態様におい て、 本発明のがんの診断剤は、 （a) S P O 1 1タンパク質に対する抗. 体、 又は （b) S P O 1 1遺伝子またはその一部の塩基配列にス トリン ジェン卜なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基 配列からなるポリヌクレオチドを含有する。  The present invention also provides a diagnostic agent for cancer. In one preferred embodiment, the diagnostic agent for cancer of the present invention comprises (a) an antibody against SPO 11 protein, or (b) a stringent sequence in the SPO 11 gene or a part of its nucleotide sequence. It contains a polynucleotide consisting of a base sequence that can be hyperpredable under high predation conditions.
5. 1 抗 S PO 1 1抗体を用いる診断剤及び診断方法 5.1 Diagnostic agent and diagnostic method using anti-S PO 1 1 antibody
S P O l 1タンパク質に対する抗体は、 S P O l 1タンパク質等を特 異的に認識することができるので、 被検液中の S P O l 1タンパク質を 定畺することができる。 具体的には、 本発明の抗 S P O 1 1抗体を用い る診断方法は、 例えば、 （ a) 被験者由来の生体試料と、 S PO l l夕 ンパク質に対する抗体とを接触させる工程、 および （b) 前記試料中で の前記抗体と、 S P O l 1タンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩との結合を検出および Zまたは定量する工程を包含する。 好まし くは、 上記検出および または定量する工程において、 標識された抗 S P O 1 1抗体を用いて、 S P O l 1 タンパク質またはその断片と抗 S P 0 1 1抗体との結合が検出および zまたは定量される。 Since the antibody against SPO l 1 protein can specifically recognize SPO l 1 protein and the like, SPO l 1 protein in the test solution can be determined. Specifically, the diagnostic method using the anti-SPO11 antibody of the present invention includes, for example, (a) a step of bringing a subject-derived biological sample into contact with an antibody against the SPOll protein, and (b) Detecting and Z or quantifying the binding of the antibody to the SPO11 protein or a partial peptide thereof or a salt thereof in the sample. Like Alternatively, in the above-described detection and / or quantification step, the labeled anti-SPO 1 1 antibody is used to detect and z or quantitate the binding between the SPO 11 protein or a fragment thereof and the anti-SP 0 11 antibody.
本明細書中、 「被験者由来の生体試料」 は、 被験者由来の組織、 細胞、 または体液 （例えば、 血液 （全血、 血漿、 血清等を含む） 、 尿、 リンパ 液、 唾液、 汗、 精液等） を含む。 また、 「被験者」 は、 通常、 がん検診 を受ける、 または受けることが望まれるヒ ト被験体であり、 がんに罹患 しているか、 または罹患していると疑われるヒ ト被験体等が含まれる。 このようながんの例としては、 大腸がん、 胃がん、 肺がん、 乳がん、 前 立腺がん、 食道がん、 肝臓がん、 胆道がん、 脾臓がん、. 腎がん、 膀胱が ん、 子宮がん （例 ： 子宮頸がん、 子宮体がん） 、 精巣がん、 甲状腺がん、 陴臓がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、 血液腫瘍などが含まれるが、 とりわけ、 大腸がんが好ましい。  In the present specification, “subject-derived biological sample” refers to a subject-derived tissue, cell, or body fluid (for example, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.), urine, lymph, saliva, sweat, semen, etc. ) including. A “subject” is usually a human subject who is or is expected to undergo a cancer screening, such as a human subject who has or is suspected of having cancer. included. Examples of such cancers are colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer. , Uterine cancer (eg, cervical cancer, endometrial cancer), testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc. Is preferred.
上記のような被験者由来の生体試料における S P O 1 1の発現を検出 するための免疫測定は、 がん （例えば、 大腸がん） を有すると疑われる 力 がんの危険性を有する被験体から採取した生体試料を、 特異的抗原 一抗体結合を生じさせる条件下で抗 S P O 1 1抗体と接触させ、 次いで,、 抗体による免疫特異的結合量を測定することを包含する。 このような抗 体の結合を使用して、 S P〇 1 1タンパク質の存在および または増大 した発現が検出される。 この場合、 増大した S P〇 1 1 タンパク質発現 の検出が疾病状態の指標となる。 必要に応じて、 生体試料中の S P O l 1 タンパク質のレベルを、 がんを有しない健常者のレベルと比較しても よい。  Immunoassays to detect the expression of SPO 11 in biological samples derived from subjects as described above are collected from subjects who are suspected of having cancer (eg, colorectal cancer) and at risk for cancer. And subjecting the biological sample to contact with an anti-SPO11 antibody under conditions that produce specific antigen-antibody binding, and then measuring the amount of immunospecific binding by the antibody. Such antibody binding is used to detect the presence and / or increased expression of the SP 0 11 protein. In this case, detection of increased SPO1 1 protein expression is an indicator of disease state. If necessary, the level of S P O l 1 protein in the biological sample may be compared to the level of healthy individuals who do not have cancer.
上記免疫測定法の 1つの態様では、 例えば、 血清試料などの生体試料 を、 試料中に存在する全部のタンパク質を固定する目的で、 ニトロセル ロースなどの固相支持体または担体と接触させる。 次いで、 この支持体 を緩衝液で洗浄し、 続いて検出可能に標識した抗 S P〇 1 1抗体により 処理する。 次いで、 この固相支持体を緩衝液で 2回洗浄し、 未結合抗体 を除去する。 固相支持体上の結合した抗体の量を、 周知の方法に従って 測定する。 各測定に適する検出条件は、 慣用的な試験方法を使用して当 業者により適宜決定され得る。 In one embodiment of the immunoassay, for example, a biological sample such as a serum sample is contacted with a solid support or carrier such as nitrocellulose for the purpose of immobilizing all proteins present in the sample. The support is then washed with buffer and subsequently treated with detectably labeled anti-SP011 antibody. The solid support is then washed twice with buffer to remove unbound antibody. The amount of bound antibody on the solid support is determined according to well-known methods taking measurement. The detection conditions suitable for each measurement can be appropriately determined by those skilled in the art using conventional test methods.
抗 S P O 1 1抗体を検出可能に標識する方法の 1つにおいて、 当該抗 体を、 酵素、 例えば、 酵素ィムノアッセィ （E I A) に使用されるもの のような酵素に結合させる [V o i 1 e r , A. による 「酵素標識した 免疫吸着アツセィ」 （ "T h e E n z yme L i n k e d I mm u n o s o r b e n t A s s a y) (E L I S A) , 1 9 7 8 , D i a g n o s t i c H o r i z o n s , 2 : 1 ~ 7 , M i c r o b i o l o g i c a l A s s o c i a t e s Qu a r t e r l y P u b 1 i c a t i o n , Wa l k e r s v i 1 l e . M'D ； V o i 1 e r , A. による J . C l i n. P a t h o l . ， 3 1 : 5 0 7〜 5 2 0， 1 9 7 8 ： B u t i e r , J . E . による Me t h. E n z ymo l . ， 7 3 : 48 2〜 5 2 3， 1 9 8 1 ] 。 抗体に結合する酵素を、 例えば分 光光度測定により、 可視手段による蛍光測定により検出することができ る化学分子が生成されるような方法で、 適当な基質、 好ましくは色素原 性基質と反応させる。 抗体に検出可能な標識を付けるために使用するこ とができる酵素は、 ペルォキシダーゼおよびアル力リ性ホスファ夕一ゼ. を包含するが、 これらに限定されない。 この検出はまた、 酵素に対する 色素原性基質を用いる比色法により達成することができる。  In one method of detectably labeling an anti-SPO 1 1 antibody, the antibody is conjugated to an enzyme, such as that used in the enzyme immunoassay (EIA) [Voi 1 er, A By "Enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA), 1 9 7 8, Diagnostic Horizons, 2: 1-7, Microbiological A ssociates Qu arterly Pub 1 ication, Wa lkersvi 1 le. M'D; V oi 1 er, A. by J. C li n. Pathol., 3 1: 5 0 7-5 2 0, 1 9 7 8: B utier, J. E., Me th h. Enzym., 7 3: 48 2 ~ 5 2 3, 1 9 8 1] Enzymes that bind to antibodies can be visualized, for example, by spectrophotometry. In a way that a chemical molecule is generated that can be detected by fluorescence measurement, an appropriate substrate, preferably a chromogen. Enzymes that can be used to label the antibody with a detectable label include, but are not limited to, peroxidase and alkaline phosphatase. This can be achieved by a colorimetric method using a chromogenic substrate for the enzyme.
その他の本発明において使用し得る方法としては、 ラジオィムノアツ セィ （R I A) 、 サンドイッチ免疫測定法、 ィムノメ トリック法、 ネフ ロメ トリー、 蛍光免疫測定法 （F I A) 、 時間分解蛍光免疫測定法 （T R F I A) 、 酵素免疫測定法 （E I A) 、 発光免疫測定法 （L I A) 、 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A) 、 ラテックス凝集法、 免疫沈降 アツセィ、 沈降素反応法、 ゲル拡散沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝 集素検定法、 補体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 およびプロティン A免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法な どが挙げられる （WO 0 0ノ 1 4 2 2 7号公報第 3 9頁第 2 5行〜第 4 2頁第 8行、 E P 1 1 1 1 04 7 A 2号公報段落 [0 1 1 5 ] 第 1 9頁 第 3 5行〜第 2 0頁第 4 7行など参照） 。 Other methods that can be used in the present invention include radioimmunoassay (RIA), sandwich immunoassay, immunometric method, nephrometry, fluorescence immunoassay (FIA), time-resolved fluorescence immunoassay (TRFIA), enzyme Immunoassay (EIA), Luminescent immunoassay (LIA), Electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), Latex agglutination, Immunoprecipitation Atssey, Precipitation reaction, Gel diffusion precipitation reaction, Immunodiffusion assay, Examples include an agglutination assay, a complement binding assay, an immunoradiometric assay, a fluorescence immunoassay, and an immunoassay selected from the group consisting of a protein A immunoassay (WO 0 1) No. 4 2 27 No. 3 page 9 9 line 25 to page 4 2 line 8 EP 1 1 1 1 04 7 A No. 2 paragraph [0 1 1 5] page 19 Lines 35 to 20 (see page 47, line 47, etc.)).
以上のように、 本発明の抗体を用いる、 生体内での S P〇 1 1タンパ ク質の定量法を利用することにより、 S PO l 1タンパク質の機能不全 に関連する各種疾患の診断をすることができる。 例えば、 S P〇 1 1夕 ンパク質の濃度増加が検出された場合は、 例えば、 S P O l lタンパク 質の過剰発現に起因する疾患 （例えば、 がん （例 ： 大腸がん） ） である 可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 なお、 本発明の抗 S P〇 1 1抗体は、 i n v i v oでの診断に用い ることもできる。 ここで使用し得る抗体調製物の調製および使用方法は 当該分野でよく知られている.。 例えば、 抗体ーキレー卜剤について、 N u c 1. M e d. B i o l . 1 9 9 0 1 7 : 2 4 7— 2 54に 記載されている。 また、 磁気共鳴イメージングで用いる標識としての常 磁性ィオンを有する抗体については、 例えば、 M a g n e t i c R e s o n a n c e i n M e d i c i n e 1 9 9 1 2 2 ： 3 3 9— 34 2に記載されている。  As described above, diagnosis of various diseases associated with dysfunction of S PO 11 protein can be performed by utilizing the in vivo SP 0 1 protein quantification method using the antibody of the present invention. Can do. For example, if an increase in the concentration of SP protein is detected, it may be caused by, for example, a disease caused by overexpression of SPO ll protein (eg, cancer (eg, colorectal cancer)). It can be diagnosed as high or likely to be affected in the future. The anti-SP011 antibody of the present invention can also be used for diagnosis by i n v i v o. The preparation and use of antibody preparations that can be used here are well known in the art. For example, an antibody-chelate glaze agent is described in Nuc 1. Med. Biol. 1 9 9 0 1 7: 2 4 7- 2 54. An antibody having a paramagnetic ion as a label used in magnetic resonance imaging is described in, for example, Magnnetic ReSonic NanoMedicine 1 9 9 1 2 2: 3 3 9-342.
5. 2 ポリヌクレオチド （例えば、 DNA) プローブを用いる診- 断剤及び診断方法 5.2 Diagnostics and diagnostic methods using polynucleotide (eg, DNA) probes
本発明の診断方法においては、 S P O l 1遺伝子の塩基配列に基づい て設計されるプローブ又はプライマーを用いることができる。 具体的に は、 そのような診断方法は、 例えば、 （ a) 被験者由来の生体試料と、 S P O 1 1遺伝子またはその断片の塩基配列にス トリンジェン卜なハイ プリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列からなるポ リヌクレオチド （プローブ） とを接触させる工程、 および （b) 前記試 料中での前記ポリヌクレオチドと、 S P〇 1 1遺伝子またはその断片と のハイプリダイゼーショ ンを検出および/または定量する工程を包含す る。  In the diagnostic method of the present invention, a probe or primer designed based on the base sequence of the SPO11 gene can be used. Specifically, such a diagnostic method can, for example, (a) be capable of hyperpredation under high-precipitation conditions stringent to a biological sample derived from a subject and the base sequence of the SPO 11 gene or a fragment thereof. A step of contacting a polynucleotide (probe) comprising a base sequence, and (b) detecting and / or detecting hyper-precipitation between the polynucleotide in the sample and the SP 0 11 gene or a fragment thereof. Or a step of quantifying.
上記本発明の方法では、 被験者由来の生体試料中の S P O 1 1遺伝子 の DNA (またはその遺伝子断片） を、 上記プローブを使用して検出お よび または定量する。 プローブとして用いる塩基配列の長さは、 例え ば、 1 2塩基以上、 1 5塩基以上、 1 8塩基以上、 2 1塩基以上、 24 塩基以上、 2 7塩基以上、 3 0塩基以上、 またはさらに長い長さのポリ ヌクレオチド断片であり得る。 ハイブリダィゼーシヨンには、 上記した 低、 中又は高ス トリンジェン卜な条件を使用し得る。 なお、 本明細書中、 「 S P〇 1 1遺伝子またはその断片の塩基配列にス トリンジェン 卜なハ ィプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列」 には、In the method of the present invention described above, the DNA of the SPO 11 gene (or gene fragment thereof) in a biological sample derived from a subject is detected using the probe. And / or quantify. The length of the base sequence used as a probe is, for example, 12 bases or more, 15 bases or more, 18 bases or more, 21 bases or more, 24 bases or more, 27 bases or more, 30 bases or more, or even longer It may be a polynucleotide fragment of length. For hybridization, the low, medium or high stringency conditions described above may be used. In the present specification, “a base sequence that can be hyperpredified under a hybridization condition that is stringent to the base sequence of the SP011 gene or a fragment thereof”
S P O l 1遺伝子またはその断片の塩基配列に相補的な塩基配列 （アン チセンスポリヌクレオチド） も含まれるものとする。 プローブおよび核 酸のハイブリダィゼーシヨンの方法は当業者に知られており、 例えば国 際公開公報第 8 9ノ 0 6 6 9 8号、 E P— A 0 2 0 0 3 6 2、 米国特許 第 2， 9 1 5， 0 8 2号、 E P _A 0 0 6 3 8 7 9、 E P - A 0 1 7 3 2 5 1、 E P— A 0 1 2 8 0 1 8に記載されている。 A base sequence (antisense polynucleotide) complementary to the base sequence of the SPO11 gene or a fragment thereof is also included. Methods of hybridization of probes and nucleic acids are known to those skilled in the art, such as International Publication No. 8 9 0 6 6 9 8, EP—A 0 2 0 0 3 6 2, US Patent No. 2, 9 1 5, 0 8 2, EP_A 0 0 6 3 8 7 9, EP-A 0 1 7 3 2 5 1, EP—A 0 1 2 8 0 1 8
本発明の診断方法においては、 S P〇 1 1遺伝子に対する特異的ポリ ヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて、 公知の手法を用いて 標的配列を検出または定量することができる。 そのような公知の手法と して、 例えば、 サザンハイブリダィゼーシヨン、 ノーザンハイブリダィ . ゼ一シヨン、 R T— P C R法、 P C R— S S C P法 （G e n om i c s , 第 5巻， 8 7 4〜 8 7 9頁 （ 1 9 8 9年） ） 、 P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e my o f S c i e n c e s o f t h e Un i t e d S t a t e s o f A m e r i c a, 第 8 6巻， 2 7 6 6〜 2 7 7 0頁 （ 1 9 8 9年） ） 、 F I S H 法、 DNAチップあるいはアレイ C GH (C om p a r a t i v e G e n om i c H y b r i d i z a t i o n) 法などを用いることがで きる。 定量的な検出は、 定量 R T— P C Rによって実施可能である。  In the diagnostic method of the present invention, a target sequence can be detected or quantified using a known method using a specific polynucleotide probe or primer for the SP 0 11 gene. Examples of such known methods include Southern hybridization, Northern hybridization, RT-PCR method, PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, 8 7 4 Pp. 8 7 9 (1 9 8 9)), Proceedingsofthe National Academy of Sciences of United States of America, Vol. 8 6, 2 7 6 6-2 7 7 0 (1 9 8 9 years))), FISH method, DNA chip or array GH (Com parative Genomic Hybridization) method can be used. Quantitative detection can be performed by quantitative RT-PCR.
アレイ C GH法は、 染色体 C GH法 （K a l l i o n i em i , A. e t a 1 . ( 1 9 9 2 ) S c i e n c e 2 5 8 , 8 1 8 - 8 2 1 ) を応用した方法で、 スライ ド上に染色体領域をカバーするゲノム D NA断片 （BAC， PAC, YACなど） を高密度にスポッ トした D N Aチップを用いて、 別々の色素で標識したがん由来 DNAと正常 DNA を、 スライ ド上のゲノム DNA断片に対して同時にハイブリダィゼーシ ヨンを行い、 その結合状態を検出することにより、 がんにおける DNA コピー数異常を高解像度に検出する方法である （P i n k e 1 , D. e t a 1 . ( 1 9 9 8 ) N a t . G e n e t . 2 0 , 2 0 7 - 2 1 なお、 本発明においては、 S P O 1 1遺伝子の発現が上方制御される か否かを検出するために、 細胞の S P O l 1の mR N Aレベルを標準遺 伝子 （ハウスキーピング遺伝子 （例えば、 S h a p e r , N. L . ら、 J . M amma r y G l a n d B i o l . N e o p l a s i a 3 ( 1 9 9 8 ) 3 1 5 - 3 2 4 ; Wu , Y . Y . および R e e s , J . L . . A c t a D e rm. V e n e r e o 1. 8 0 ( 2 0 0 0) 2— 3 ) の mRNAレベルと、 好ましくは RT— P C Rによって比 較することもできる。 The array C GH method is an application of the chromosomal C GH method (K allioni em i, A. eta 1. (1 9 9 2) Science 2 5 8, 8 1 8-8 2 1). DN with high density spotted genomic DNA fragments (BAC, PAC, YAC, etc.) covering the chromosomal region By using the A chip to simultaneously hybridize cancer-derived DNA labeled with different dyes and normal DNA to genomic DNA fragments on the slide and detect their binding state, This is a method to detect abnormal DNA copy number in cancer with high resolution (Pinke 1, D. eta 1. (1 9 9 8) N at. G enet. 2 0, 2 0 7-2 1 In the present invention, in order to detect whether the expression of the SPO11 gene is up-regulated, the mRNA level of the SPO11 of the cell is measured using a standard gene (housekeeping gene (eg, Shaper, N. L. et al., J. Mammary G land B iol. Neoplasia 3 (1 9 9 8) 3 1 5-3 2 4; Wu, Y. Y. and Rees, J. L.. It can also be compared with the mRNA level of rm. V enereo 1.80 (2 0 0 0) 2—3), preferably by RT-PCR.
上記のような手法によって標的配列 （DNA、 mR NAなど） を検 出 '定量し、 S P〇 1 1遺伝子の発現過多が確認ざれた場合は、 例えば、 S P O 1 1 の過剰発現に起因する疾患 （例えば、 がん （例 ： 大腸力 ん） ） である可能性が高い、 あるいは将来罹患する可能性が高いと診断 することができる。  If the target sequence (DNA, mRNA, etc.) is detected and quantified by the above-mentioned method and overexpression of the SP〇1 1 gene is confirmed, for example, a disease caused by overexpression of SPO1 1 ( For example, it can be diagnosed that the cancer is likely to be cancer (eg, colorectal cancer)) or is likely to be affected in the future.
5. 3 質量分析装置を用いる診断方法 5.3 Diagnosis method using mass spectrometer
本発明の診断方法の別の実施形態では、 被検試料中の標的タンパク質 またはその断片の存在を、 質量分析装置 （MS ) を用いて同定すること ができる。 すなわち、 質量分析装置を用いることによって、 標的タンパ ク質またはその断片のアミソ酸配列の決定を行うことができ、 被験者由 来の生体試料中に S P O 1 1タンパク質が存在するか否かを判定するこ とができる。 質量分析法は、 M Sを用いてタンパク質やペプチドのよう な試料をイオン化し、 得られた質量 Z電荷 （m/z ) に従って分離し、 その強度を測定することにより、 試料の質量を決定する方法である。 そ の質量分析の結果から、 タンパク質やべプチドのアミノ酸配列を構成す る個々のアミノ酸を同定することができる。 In another embodiment of the diagnostic method of the present invention, the presence of a target protein or a fragment thereof in a test sample can be identified using a mass spectrometer (MS). That is, by using a mass spectrometer, it is possible to determine the amisoacid sequence of the target protein or a fragment thereof, and determine whether or not the SPO 11 protein is present in the biological sample derived from the subject. be able to. In mass spectrometry, a sample such as protein or peptide is ionized using MS, separated according to the obtained mass Z charge (m / z), and the intensity of the sample is measured to determine the mass of the sample. It is. So From the results of mass spectrometry, individual amino acids constituting the amino acid sequence of proteins and peptides can be identified.
イオン化には、 マトリクスアシステツ ドレーザーデソープションィォ ン化法 （MAL D I ) 、 エレク 卜ロスプレーイオン化法 （E S I ) 、 気 相法 （E I， C I ) 、 電界脱離 （FD) 法など種々の方法が使用され得 る。 イオン分離には、 イオン化法と相性のよいイオン分離法が用いられ、 例えば、 M A L D Iの場合には、 飛行時間型 （ t i m e o f f 1 i g h t ： TO F) 質量分析計、 E S Iの場合には、 四重極型 （QMS) 、 イオントラップ型、 磁場型などの質量分析計がそれぞれ用いられる。 質 量分析装置は、 タンデムで用いられることもある。 .例えば、 L C— E S I MS/MS、 Q—TOF MS, MALD I -TO F M S等が挙 げられる。 なお、 その他のアミノ酸配列決定法、 例えば、 シークェンサ 一 （例 ： 気相シークェンサ一） によるアミノ酸配列決定法が利用されて もよい。  For ionization, various methods such as matrix assisted laser desorption (MAL DI), electrospray ionization (ESI), gas phase (EI, CI), field desorption (FD), etc. The method can be used. For ion separation, an ion separation method compatible with the ionization method is used. For example, in the case of MALDI, a time-of-flight type (timeoff 1 ight: TO F) mass spectrometer, in the case of ESI, a quadrupole Mass spectrometers such as type (QMS), ion trap type, and magnetic field type are used. Mass spectrometers are sometimes used in tandem. For example, LC—ES IMS / MS, Q—TOF MS, MALD I-TO FM, etc. It should be noted that other amino acid sequencing methods, for example, sequencing using a sequencer (eg, gas phase sequencer) may be used.
5. 4 診断用キッ ト 5.4 Diagnostic kit
本発明はまた、 抗 S P O l 1抗体を含有する、 被験者の体液試料中の. S P〇 Γ 1タンパク質またはその断片をがんマーカーとして検出および または定量するためのキッ トを提供する。 さらに、 S P O l l遺伝子 またはその一部の塩基配列にス トリンジェン卜なハイプリダイゼーショ ン条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列を含有する、 被験者由来の生 体試料中の S P O 1 1遺伝子またはその断片をがんマーカーとして検出 および または定量するためのキッ トをも提供する。 これらのキッ トは、 上述の免疫学的手法またはハイプリダイゼーション法等により、 がんマ 一力一を検出するために用いられる。 このようながんとしては、 例えば、 大腸がん、 胃がん、 肺がん、 乳がん、 前立腺がん、 食道がん、 肝臓がん、 胆道がん、 脾臓がん、 腎がん、 膀胱がん、 子宮がん （例 ： 子宮頸がん、 子宮体がん） 、 精巣がん、 甲状腺がん、 臈臓がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、 血液腫瘍などが含まれるが、 とりわけ、 大腸がんが好ましい。 本明細書中、 「がんマーカー」 とは、 被験者の体液 （例えば、 血液、 尿、 リンパ液、 唾液、 汗、 精液等） または細胞もしくは組織中における、 正常組織に由来していないか、 あるいはがん細胞または組織において選 択的に発現の亢進している分子のことをいい、 被験者の体液または細胞 もしくは組織中における当該分子の存在ががんの存在を示すかまたは示 唆するものをいう。 The present invention also provides a kit for detecting and / or quantifying the SP0Γ1 protein or a fragment thereof in a body fluid sample of a subject containing an anti-SPO11 antibody as a cancer marker. In addition, the SPOll gene or a fragment thereof in a biological sample derived from a subject, which contains a base sequence that can be highly prehybridized under stringent high prehybridization conditions in the SPOll gene or a part of the base sequence. Also provides kits for detecting and / or quantifying as a cancer marker. These kits are used to detect the best of cancer by the above-described immunological technique or the hyperpredation method. Examples of such cancers are colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, and uterus. (Example: cervical cancer, endometrial cancer), testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc. Among them, colorectal cancer is particularly preferable. In the present specification, the term “cancer marker” refers to a subject's body fluid (eg, blood, urine, lymph, saliva, sweat, semen, etc.) or cells or tissues that are not derived from normal tissues, or This refers to a molecule that is selectively upregulated in cancer cells or tissues, and the presence of the molecule in the body fluid or cells or tissues of a subject indicates or suggests the presence of cancer.
上記第一の態様のキッ トは、 被験者からの体液試料中の S P O 1 1抗 原 （S P〇 1 1 タンパク質およびその部分べプチドを含む） を検出およ び または定量する成分を含有する。 例えば、 S P O l 1タンパク質が E L I S Aで検出および Zまたは定量される場合、 このような成分は、 例えば、 組織切片、 または血液や尿のような体液試料中の S P〇 1 1の レベルを検出および または定量するために使用され得る。 このような 抗体は放射能、 蛍光、 比色、 または酵素標識で標識されていてもよい。 本発明のキッ 卜は—、 標識された二次抗体を含有していてもよい。  The kit of the first embodiment contains a component for detecting and / or quantifying SPO1 1 antigen (including SPO1 1 protein and its partial peptide) in a body fluid sample from a subject. For example, if SPO 1 protein is detected and Z or quantified by ELISA, such a component can detect and / or detect the level of SP 0 1 1 in, for example, a tissue section or a body fluid sample such as blood or urine. Can be used to quantify. Such antibodies may be labeled with radioactivity, fluorescence, colorimetry, or enzyme labeling. The kit of the present invention may contain a labeled secondary antibody.
上記第二の態様のキッ トは、 S P O 1 1遺伝子またはその一部の塩基 配列にストリンジェン卜なハイプリダイゼーシヨン条件下でハイブリダ ィズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。 例えば、 本 発明のキッ 卜は、 D N Aチップ上に固定された上記ポリヌクレオチドを 含有し得る。  The kit according to the second embodiment contains a polynucleotide having a base sequence that can be hybridized under high hybridization conditions stringent to the SPO11 gene or a partial base sequence thereof. For example, the kit of the present invention may contain the above-mentioned polynucleotide immobilized on a DNA chip.
本発明のキッ トは、 抗 S P O 1 1抗体、 S P〇 1 1遺伝子またはその 一部の塩基配列にス卜リンジェントなハイプリダイゼ一ション条件下で ハイプリダイズ可能な塩基配列等の他に、 容器およびラベルを含んでい てもよい。 容器上のまたは容器に伴うラベルには、 薬剤が大腸がんマー カーの検出に使用されることが示されていてもよい。 また、 他のアイテ ム、 例えば、 使用説明書等がさらに含まれていてもよい。  The kit of the present invention comprises, in addition to a base sequence that can be highly pre-polymerized under anti-SPO11 antibody, SP011 gene or a part of its base sequence under high-precipitation conditions, a container and It may contain a label. The label on or with the container may indicate that the drug is used to detect colorectal cancer markers. In addition, other items such as instructions for use may be further included.
以下、 本発明を実施例を用いてより具体的に説明するが、 本発明の範 囲は、 これらの実施例によって限定されない。 実施例 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited by these examples. Example
実施例 1 ： アレイ C GH法による大腸がん特異的増幅遺伝子の同定 Example 1: Identification of colon cancer specific amplification gene by array C GH method
本実施例では、 大腸がん特異的な遺伝子増幅領域を特定するために、 大腸がん検体 2 0 0症例のサンプル調製およびアレイ C GH法に基づく 検証を実施した。  In this example, in order to identify a gene amplification region specific to colorectal cancer, sample preparation of 200 colorectal cancer specimens and verification based on the array CGH method were performed.
その結果、 大腸がん検体において高頻度に増幅が起きている領域の内、 公共 D Bでの遺伝子情報 （NC B I ： h t t p ： //www. n c b に n 1 m. n i h . g o v/) を利用し、 精査した結果、 使用した B A C C l o n e R P 1 1— 6 7 1 P 1 6に位置している、 S P〇 1 1 ( S P O l l me i o t i c p r o t e i n c o v a l e n t l y b o u n d t o D S B— 1 i k e ( S . c e r e v i s i a e ) ) (N C B I A c c e s s i o n N o . ： NM_0 1 2 4 4 4 ) 遺伝子が大腸-がん患者において高頻度で高値であることを見出した (図 1 , 表 2 ) 。 図 1は、 S P〇 1 1遺伝子の大腸がん患者 2 0 0検体 での増幅度に対する頻度を示すヒス トグラムである。 また、 下記の表 2 は、 S P〇 1 1遺伝子の大腸がん患者 2 0 0検体での増幅度 （GZR, 値） および頻度を示す。 平均値は、 GZR値が 1. 2以上の検体での平 均値を示している。  As a result, we used genetic information (NC BI: http: // www. Ncb n 1 m. Nih. Gov /) in the public DB in the region where amplification occurs frequently in colorectal cancer specimens. As a result of close examination, SPACC 11 (SPO ll me iotic proteincovalently bound to DSB— 1 ike (S. Cerevisiae)) (NCBIA ccession No o located in BACC lone RP 1 1— 6 7 1 P 16 used : NM_0 1 2 4 4 4) The gene was found to be frequently and highly elevated in colorectal cancer patients (Figure 1 and Table 2). Fig. 1 is a histogram showing the frequency of the SP 0 11 gene relative to the degree of amplification in 200 specimens of colorectal cancer patients. Table 2 below shows the degree of amplification (GZR, value) and frequency in 200 samples of colorectal cancer patients with SP011 gene. The average value shows the average value for samples with a GZR value of 1.2 or higher.
表 2に示されるように、 S P O l l遺伝子は、 2 0 0検体の大腸がん 患者の 6 5. 0 %において増幅が認められ、 その増幅度の平均値は、 1. 7であった。 最大値は 2. 6であり、 非常に高頻度で顕著な増幅が起こ つていた。  As shown in Table 2, amplification of S P O l l gene was observed in 65.0% of 20 0 colon cancer patients, and the average value of the amplification was 1.7. The maximum value was 2.6, and remarkable amplification occurred very frequently.
(表 2 )  (Table 2)
Figure imgf000044_0001
実施例 2 ： 大腸由来培養細胞株での遺伝子増幅度の検証 本実施例では、 大腸がん患者において高頻度で高値な遺伝子領域につ いて、 大腸がん由来培養細胞株での増幅度を検証した。
Figure imgf000044_0001
Example 2: Verification of gene amplification in a colon-derived cultured cell line In this example, the amplification in a colon cancer-derived cultured cell line was verified for a high-frequency gene region in colon cancer patients. did.
ぐサンプル調製 >  Sample preparation>
培養細胞株は、 大腸がん由来の細胞株である C a c o 2および RKO を使用した。 培養細胞より B l o o d & C e l l C u l t u r e D N A K i t (Q I A G E N) を使用して、 キッ ト添付のプロ トコ一 ルに従い、 ゲノム DNAを抽出した。  The cultured cell lines used were Caco 2 and RKO, which are cell lines derived from colorectal cancer. Genomic DNA was extracted from the cultured cells according to the protocol attached to the kit using BLOOD & CELCUlTureDNAKit (QIAGEN).
<ァレイ C GH>  <Alay C GH>
遺伝子領域の増幅を確認するために、 アレイ C GHを実施した。 方法 の詳細は実施例 1 と同様に実施した。 糸口  Array C GH was performed to confirm gene region amplification. The details of the method were the same as in Example 1. Clue
表 3に、 S P O l 1遺伝子の大腸がん由来の細胞株での増幅度 （GZ R値） を示した。 示されるように、 大腸がん由来細胞株においても、 B AC C l o n e R P 1 1 _ 6 7 1 P 1 6に位置している、 S P〇 1 1遺伝子で増幅が起きていることを見出した。  Table 3 shows the degree of amplification (GZ R value) of the S P O l 1 gene in a cell line derived from colorectal cancer. As shown, in the colon cancer-derived cell line, it was found that amplification occurred in the SP 0 1 1 gene located in B AC Clone RP 1 1 — 6 71 P 16.
(表 3 )  (Table 3)
Figure imgf000045_0001
く定量的 P C R〉
Figure imgf000045_0001
<Quantitative PCR>
S P O l 1遺伝子領域の増幅を確認するために、 定量的 P C Rを実施 した。 定量的 P C Rは、 S YB R G r e e n R T - P C R R e a g e n t s ( A p p 1 i e d B i o s y s t e rn s ) を使用して、 添 付のプロ 卜コールに従い、 7 5 0 0 R e a l -T i me P C R S V s t em ( A p p 1 i e d B i o s y s t ern s ) を用いて実施し た。 プライマーは、 以下の配列を合成し （O P E R ONに合成委託） 使 用した。 Quantitative PCR was performed to confirm the amplification of the SPO11 gene region. Quantitative PCR can be performed using S YB RG reen RT-PCRR eagents (A pp 1 ied B iosys te rn s) according to the attached protocol. A pp 1 ied B iosyst ern s) It was. The following sequences were synthesized (outsourced to OPER ON) and used as primers.
プライマー配列 ： Primer sequence:
5， - T T T G C AG C T GAT GG C T T G T G - 3 ' (配列番号 3 )  5,-T T T G C AG C T GAT GG C T T G T G-3 '(SEQ ID NO: 3)
5 ' -AAC GGTTGAC TTGGCAGC TATTAC - 3 ' (配 列番号 4)  5 '-AAC GGTTGAC TTGGCAGC TATTAC-3' (sequence number 4)
表 4に、 S P O l 1遺伝子の大腸がん由来の細胞株での増幅度を示し た。 値は対照 DNA (正常） との相対値を示している。 示されるように、 大腸がん由来細胞株においても、 S PO l 1遺伝子領域に増幅が起きて いることを見出した。 Table 4 shows the degree of amplification of the SPO1 gene in a colon cancer-derived cell line. Values are relative to control DNA (normal). As shown in the figure, it was found that also in the colon cancer-derived cell line, amplification occurred in the SPO11 gene region.
(表 4)  (Table 4)
Figure imgf000046_0001
これらの結果により、 大腸がん由来の細胞株 （C a c o 2、 RKO) においても、 S P O 1 1遺伝子が増幅していることが確認された。 よつ て、 がんにおける S P O l 1遺伝子の機能解析に使用可能な培養細胞が 選択された。 実施例 3 ： 大腸がん細胞株を用いた RNA 1解析による機能解析
Figure imgf000046_0001
From these results, it was confirmed that the SPO 11 gene was also amplified in the colon cancer-derived cell lines (C aco 2 and RKO). Therefore, cultured cells that can be used for functional analysis of the SPO 11 gene in cancer were selected. Example 3: Functional analysis by RNA 1 analysis using colorectal cancer cell lines
本実施例では、 大腸がん患者 2 0 0検体において高頻度に増幅が認め られた S P O l 1遺伝子について、 大腸がん由来の細胞株であり、 且つ、 ゲノムレベルで遺伝子の増幅が認められた細胞株 （RKO) を用いて、 RNA i解析を行い、 その表現型を観察した。 <RNA i解析〉 In this example, the SPO l 1 gene, which was frequently amplified in 200 colorectal cancer patients, was a colon cancer-derived cell line, and gene amplification was observed at the genomic level. Using a cell line (RKO), RNA i analysis was performed and the phenotype was observed. <RNA i analysis>
細胞株は AT C Cより購入し、 添付のプロ トコールに従い培養を行つ た。 s i R N Aは遺伝子内の特異的な 2 1 me rを選択しその配列を標 的とする s 1 RNAを合成した （Q I A G E Nに合成委託） 。  The cell line was purchased from ATCC and cultured according to the attached protocol. For s i RN A, a specific 21 mer within the gene was selected and s 1 RNA was synthesized with the sequence as the target (commissioned to QIAGEN).
(表 5)  (Table 5)
Figure imgf000047_0001
s i R N Aの R K〇細胞内への導人は、 L i p o f e c t am i n e ( I n v i t r o g e n ) を使用し、 5 O nMの s i RNAを添付のプ 口 卜コールに従い細胞に導入した。 対照には N e g a t i v e C o n t r o 1 s i RNA (Q I AGE N) を使用した。 細胞に導入後 4日. 間、 倒立顕微鏡下で観察した。
Figure imgf000047_0001
The guide of siRNA into RK0 cells was Lipofectamine (Invitrogen), and 5 OnM siRNA was introduced into the cells according to the attached protocol call. As a control, N egative Control 1 siRNA (QI AGE N) was used. The cells were observed under an inverted microscope for 4 days after introduction into the cells.
<定量的 RT— P C R解析〉  <Quantitative RT—PCR analysis>
定量的 R T— P C R法を用いて、 s i R N Aの効果を mR N Aレベル で検証する。 s i RNA導入後 2 4時間の細胞から、 M i c r o - t o —M i d i T o t a l R N A P u r i f i c a t i o n S y s t ern ( I n v i t r o g e n ) を使用して、 添付のプロ トコールに 従い、 全 RNAを抽出する。 その後、 S u p e r s c r i p t I I I F i r s t — S t r a n d S y n t h e s i s S y s t em f o r R T- P C R ( I n v i t r o g e n) を使用して、 添付のプロ ト コールに従い、 c DNAを合成する  The effect of siRNA is verified at the mRNA level using the quantitative RT-PCR method. From the cells 24 hours after introduction of siRNA, total RNA is extracted according to the attached protocol using Micro-t o -Mid iT o ltR N APu r if i c i t i o n S y s t ern (I nv i t ro g e n). Then, use S u p e r s c r i p t I I I F i r s t — S t r a n d S y n t h e s i s S y s t em f o r R T- P C R (I n v i t r o g e n) according to the attached protocol
この c D N Aを铸型にして、 定量的 R T— P C Rを実施する。 定量的 P C Rは、 S Y B R G r e e n R T— P C R R e a g e n t s (A p p l i e d B i o s y s t e rn s ) を使用して、 添付のプロ 卜 コールに従い、 7 5 0 0 R e a l - T i m e P C R S y s t e mPerform quantitative RT-PCR using this cDNA as a saddle. Quantitative PCR is performed using SYBRG reen RT—PCRR eagents Use (A pplied B iosyste rn s) and follow the attached protocol 7 7 500 0 Real -Time PCRS ystem
(A p p l i e d B i o s y s t e rn s ) を用いて実施する。 プライ マーは、 以下の配列を合成し （O P E R ONに合成委託） 使用する。 プライマー配列 ： (A p p l i e d B i o s y s t e rn s) is used. The primer synthesizes the following sequences (consigned to O P E R ON) and uses them. Primer sequence:
5 ' - G G C C T C C A G T T C T GA G G T T C T T - 3 ' (配列番 号 1 1 )  5 '-G G C C T C C A G T T C T GA G G T T C T T-3' (SEQ ID NO: 1 1)
5 ' - T T C C C A G C T T G A T C T G T T G T C T A T C - 3 ' (配列番号 1 2 )  5 '-T T C C C A G C T T G A T C T G T T G T C T A T C-3' (SEQ ID NO: 1 2)
相対比を算出するための標準遺伝子には G l y c e r a l d e h y d e — 3 — p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e (GA P D H ) C o n t r o l R e a g e n t s (A p p l i e d B i o s y s t e rn s ) を用いて GA P D Hの発現量を求め、 相対比を算出する。 く生細胞数の測定 >  Use G lyceraldehyde — 3 — phosphatedehydrogenase (GA PDH) Control Reagents (A pplied Biosyste rn s) as the standard gene for calculating the relative ratio, and calculate the relative ratio of GA PDH. . Measurement of viable cell count>
s i R N A導入後の生細胞数を A 1 a m a r B l u e (B i o s o u r c e ) を用いて、 添付のプロ トコールに従い、 W a 1 1 a c 1 4 2 0 M u l t i l b e l / L u m i n e s c e n c e C o u n t , e r AR VO ( P e r k i n E l m e r ) により測定した。 ¾  Using the A 1 amar Blue (B iosource), the number of viable cells after siRNA transfer was determined according to the attached protocol.W a 1 1 ac 1 4 2 0 M ultilbel / Luminescence Count, er AR VO (P erkin Elmer). ¾
大腸がん由来の細胞株である R KOを用いて、 S P O l 1遺伝子の R N A i解析を実施した。  An RNAi analysis of the SPO11 gene was performed using RKO, a cell line derived from colorectal cancer.
図 2に、 R K O細胞に S P O l l遺伝子の s i R NAを T r a n s f e c t i o n後、 4 日目の観察像を示す （上段 ： X 4 0 ； 下段 ： X 2 0 0 ) 。 a、 b、 および cは、 それぞれ S P O 1 1遺伝子の s i R N A 3 種であり、 N Cはネガティブコントロールを示す。 示されるように、 表 現型の観察では、 a、 b、 および c 3種類の s i R NA共に N e g a t i v e C o n t r o l ( N C ) と比較して顕著に細胞数が減少してい た （図 2 ) 。 図 3には、 R K〇細胞に S P O 1 1遺伝子の s i RNAを T r a n s f e c t i o n後、 4日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測 定した結果を示す。 グラフは NCに対する相対量を示した。 示されるよ うに、 生細胞数の測定を行った結果、 表現型同様、 N e g a t i v e C o n t r o 1 (NC) と比較して顕著に細胞数が減少していた （図 3) 。 S P O l 1遺伝子の s 1 RNA 3種 （a , b， c ) 全てについて、 t検定において有意 （ p< 0. 0 1 ) であった。 Fig. 2 shows the observed images on day 4 after Transfection of the SPOll gene siRNA in RKO cells (upper: X40; lower: X2200). a, b, and c are 3 types of siRNA of the SPO 11 gene, respectively, and NC indicates a negative control. As shown, in the phenotypic observations, the number of cells was significantly reduced in all of the three types of siRNAs compared to N egative Control (NC) (Fig. 2). Fig. 3 shows the results of measuring the number of viable cells using the measurement reagent on the 4th day after Transfection of SPO 11 gene siRNA to RK0 cells. The graph shows the relative amount to NC. As shown, the number of viable cells was measured, and as with the phenotype, the number of cells was significantly reduced compared to N egative Control 1 (NC) (Fig. 3). All three s 1 RNAs (a, b, c) of the SPO l 1 gene were significant (p <0. 0 1) in the t-test.
よって、 RNA i効果により S P O 1 1遺伝子の発現が抑制された結 果、 RKOにおいて、 顕著にがん細胞の増殖が抑制されることが見出さ れた。 実施例 4 ： 大腸由来正常細胞株を用いた RN A i解析による機能解析 本実施例では、 大腸の正常組織由来の細胞株を用いて RN A 1解析を 実施することにより、 標的遺伝子の抑制効果ががん特異的であることを 検証した。  Therefore, as a result of suppressing the expression of the SPO11 gene by the RNAi effect, it was found that the growth of cancer cells was remarkably suppressed in RKO. Example 4: Functional analysis by RN Ai analysis using normal colon-derived cell lines In this example, RN A 1 analysis was performed using cell lines derived from normal tissue of the large intestine, thereby suppressing the target gene. Has been verified to be cancer specific.
<R N A 1解析〉  <R N A 1 analysis>
細胞株は AT C より購入した C C D 1 8 C oを使用した。 培養条件. は、 添付のプロ トコールに従った。 使用した s 1 RNAは、 実施例 3の c配列を使用した。 s i R N Aの細胞内への導入は、 L i p o f e c t am i n e 2 0 0 0 ( I n v i t r o g e n) を使用し、 2 5 nMの s i R N Aを添付のプロ トコールに従い細胞に導入した。 対照には N e g a t i v e C o n t r o l s i R NA (Q I AG EN) を使用し た。 導入後 5日間、 倒立顕微鏡下で観察した。  As the cell line, CCD18Co purchased from ATC was used. The culture conditions were in accordance with the attached protocol. The c sequence of Example 3 was used as the s 1 RNA used. For introduction of siRNA into the cells, Lipofect iNe2200 (Invitrogen) was used, and 25 nM of siRNA was introduced into the cells according to the attached protocol. As a control, N ega tiv e C o n t r o l s i RNA (Q I AG EN) was used. The cells were observed under an inverted microscope for 5 days after introduction.
ぐ定量的 RT— P C R解析〉  Quantitative RT—PCR analysis>
実施例 3の記載方法と同様に実施する。  Carry out in the same way as described in Example 3.
ぐ生細胞数の測定 >  Measurement of the number of living cells>
実施例 3の記載方法と同様に実施した。 S P〇 1 1遺伝子の、 大腸正常組織由来の細胞株 C C D 1 8 C oでの RNA 1の効果は以下の通りである。 The same procedure as described in Example 3 was performed. The effects of RNA 1 in the SP〇1 1 gene, a cell line CCD 1 8 Co derived from normal colon tissue, are as follows.
図 4に、 C C D 1 8 C o細胞に S PO 1 1遺伝子の s i RNAを T r a n s f e e t i o n後、 5 日目に得た観察像を示す （上段 ： X 40 ； 下段 ： X 2 0 0 ) 。 S P O l l cは、 S P O l l遺伝子の s i R N A 1 種 （実施例 3の c配列） であり、 N Cはネガティブコントロールを示す。 示されるように、 表現型の観察では、 NCとほぼ同様で、 効果は認めら れなかった （図 4) 。  FIG. 4 shows an observation image obtained on the 5th day after siRNA of the SPO11 gene was transformed into CCD18Co cells (upper: X40; lower: X2200). S P O l l c is a s i R N A 1 species of the S P O l l gene (c sequence of Example 3), and N C represents a negative control. As shown, phenotypic observations were similar to NC and no effect was observed (Figure 4).
図 5に、 C C D 1 8 C o細胞に S P O 1 1遺伝子の s i R N Aを T r a n s f e c t i o n後、 5日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞 数を測定した結果を示す。 グラフは NCに対する相対量を示す。 その結 果、 表現型同様、 N e g a t i v e C o n t r o l (NC) とほぼ同 様で、 効果は認められなかった （図 5 ) 。  FIG. 5 shows the results of measuring the number of viable cells with the measurement reagent using the cells on the 5th day after the S rRNA of the SPO11 gene was transformed into CCD18Co cells by Transfection. The graph shows the relative amount with respect to NC. As a result, similar to the phenotype, it was almost the same as N ega tiv corn ol (NC), and no effect was observed (Fig. 5).
このことにより、 大腸がん由来の細胞株である R KOでは、 RNA i 効果により S P O 1 1遺伝子の発現が抑制された結果、 顕著にがん細胞 の増殖が抑制されたが、 大腸正常組織由来の細胞株 C C D 1 8 C oでは 影響が無いことが見出された。 よって、 S P O l l遺伝子が、 正常細胞 には影響が少ないことより、 がん特異的な創薬標的遺伝子となりうるこ とを見出した。 . 実施例 5 ： 臓器特異性の評価  As a result, in R KO, a cell line derived from colorectal cancer, the expression of the SPO11 gene was repressed by the RNA i effect, and as a result, the proliferation of cancer cells was remarkably suppressed. The cell line CCD 18 Co was found to have no effect. Therefore, it was found that the SPOll gene can be a cancer-specific drug target gene because it has little effect on normal cells. Example 5: Evaluation of organ specificity
S P 01 1遺伝子が正常組織でどのような臓器特異的な発現がされて いるのか、 当該技術分野で公知のノーザンハイプリダイゼーショ ン法に より、 評価した。  The organ-specific expression of the SP011 gene in normal tissues was evaluated by the Northern hyperprecipitation method known in the art.
MTN Multiple Tissue Northern Blots (Clontech)を用いて、 添付の プロ トコールに従い、 1, 190nt (NM_012444 ： 94— 1284)の RNA Probeで ハイブリダィゼーショ ンを実施した。  Using MTN Multiple Tissue Northern Blots (Clontech), hybridization was performed with 1,190 nt (NM_012444: 94–1284) RNA Probe according to the attached protocol.
具体的には、 正常な各臓器組織での RNAレベルの発現分布について、 23 種の臓器（心臓 （Heart) 、 脳 （Brain) 、 胎盤 （Placenta) 、 肺 ( Lung) 、 肝臓 （ Liver ) 、 骨格筋 （ Skeletal Muscle ) 、 腎臓 (Kidney) 、 陴臓 （Pancreas) 、 脾臓 （Spleen) 、 胸腺 （Thymus) 、 前 立腺 （Prostate) 、 睾丸 （Testis) 、 卵巣 （Ovary) 、 小腸 （Small Intestine ) 、 結腸 （ Colon) 、 末梢血白血球 （Peripheral Blood Leukocyte) , 胃 （ Stomach) 、 甲状腺 （ Thyroid) 、 脊髄 （ Spinal Cord) 、 リ ンパ節 （Lymph Node) 、 気管 （Trachea) 、 副腎 （Adrenal Gland) 、 骨髄 （Bone Marrow) )についてノーザンハイブリダィゼ一シ ヨン法により、 解析した。 なお、 前述の通り、 S P O l lの遺伝子配列 は 、 NCBI (http://www. ncbi. nlni. nih. gov) に 、 Accession No. NM_012444で 1, 826 b の配列が mRNA として登録されている。 結果 ' 図 6は、 その結果を示す。 図に示すように、 Shannon M. ら （Shannon M. et al. (1999) FEBS Letters, 462, 329-334) の報告と同様に、 精巣に おいて約 2. Okb付近にバンドが認められた。 今回、 Shannon M. らの報告 した 16 臓器に加えて、 胃 （Stomach) 、 甲状腺 （Thyroid) 、 脊髄 (Spinal Cord) 、 リ ンパ節 （Lymph Node) 、 気管 （Trachea) 、 副腎- (Adrenal Gland) 、 骨髄 （Bone Marrow)の 7 臓器についても解析を行 つたが、 精巣以外の臓器については、 発現量が少ないことが確認された。 正常組織において発現量が少なく、 精巣特異的であることは、 この遺伝 子を標的にした薬剤の影響が正常組織に対して少ない可能性が考えられ る。 実施例 6 ： 遺伝子増幅の評価 Specifically, regarding the distribution of RNA level expression in normal organ tissues, 23 organs (Heart, Brain, Placenta, Lung) (Lung), Liver, Skeletal Muscle, Kidney, Pancreas, Spleen, Thymus, Prostate, Testis, Ovary (Ovary), Small Intestine, Colon, Peripheral Blood Leukocyte, Stomach, Thyroid, Spinal Cord, Lymph Node, Trachea ( Trachea), adrenal gland, and bone marrow were analyzed by the Northern hybridization method. As described above, the SPO ll gene sequence is registered in NCBI (http://www.ncbi.nlni.nih.gov) as Accession No. NM_012444 and 1,826b sequence as mRNA. Results' Figure 6 shows the results. As shown in the figure, as reported by Shannon M. et al. (Shannon M. et al. (1999) FEBS Letters, 462, 329-334), a band was observed in the testis at about 2. Okb. . In addition to the 16 organs reported by Shannon M. et al., Stomach, Thyroid, Spinal Cord, Lymph Node, Trachea, Adrenal Gland Analysis of 7 bone marrow (Bone Marrow) organs was also conducted, but it was confirmed that the expression level was low in organs other than the testis. The expression level is low in normal tissues and testis-specific is considered to have a small effect on drugs that target this gene. Example 6: Evaluation of gene amplification
検体組織のがん細胞において S P〇 1 1遺伝子領域で遺伝子増幅がお きていることを、 当該技術分野で公知の FISH法により評価した。  It was evaluated by the FISH method known in the art that gene amplification was performed in the SP 0 11 gene region in cancer cells of the specimen tissue.
アレイ CGH 法により、 遺伝子増幅度（G/R)が 1.2 以上であった検体組 織 （大腸癌患者由来） を用いて、 S P O 1 1遺伝子が位置する BAC Clone RP11-671P16 の MA Probe でハイブリダイゼ一ショ ンを実施した。 結果 Using a sample tissue (derived from colorectal cancer patients) with a gene amplification degree (G / R) of 1.2 or higher by the array CGH method, hybridization with the MA probe of BAC Clone RP11-671P16 where the SPO 11 gene is located Held the event. result
図 7は、 各検体組織 〜 J)で観察したがん細胞の一部（6 細胞分）の光 学顕微鏡写真 （蛍光像） を示す。 示されるように、 がん細胞においてシ グナルが 3スポッ ト以上見出された。 アレイ CGH法により遺伝子増幅度 (G/R)が 1.2以上であった 10検体において、 S PO 1 1遺伝子領域が増 幅していることが確認された。 また、 病態ステージの初期から後期にわ たり遺伝子増幅が起きていることが示された。 このことは、 S P O l l 遺伝子領域が、 がん治療薬の分子標的としてだけでなく、 FISH 法によ るがん診断に応用できることを示している。 実施例 7 ： 質量分析による血中 S P〇 1 1タンパク質の検出  Fig. 7 shows optical micrographs (fluorescence images) of some of the cancer cells (for 6 cells) observed in each specimen tissue (J). As shown, more than 3 spots were found in cancer cells. It was confirmed that the SPO11 gene region was amplified in 10 specimens whose gene amplification degree (G / R) was 1.2 or more by the array CGH method. It was also shown that gene amplification occurred from the early stage to the late stage of the disease state. This indicates that the SPOll gene region can be applied not only as a molecular target for cancer therapeutics but also in cancer diagnosis by FISH. Example 7: Detection of SP 0 11 protein in blood by mass spectrometry
1 ) 血液検体の前処理  1) Pretreatment of blood sample
大腸癌患者の血清検体 10 L及び健常者血清検体 lO^Lを、 希釈バッ フ ァ溶液 （ 10mM Tris HC1 h 7.4+150mM NaCl ) 500 L で希釈後、 ProteomeLab IgY-12 SC プロテオームパーティ シ ョ ニングキ ッ ト (BECKMAN COULTER： A24618) を用いてアルブミン、 グロブリ ン等の血, 清中多量蛋白質を除去した。 得られた画分に終濃度 10mM となるように ジチオスレィ トール （Wako:049-08972) を加え、 還元反応を 60でで 30 分間行った。 反応終了後、 終濃度 10mM となるようにョ一ドアセトアミ ド （SIGMA: 144-48- 9) を加え、 アルキル化反応を室温で 30 分間、 遮光 状態で行った。 反応終了後、 反応液の 4 倍量の冷アセトン （Wako:014- 08681, - 20 ) を加え、 一 80 に 1 時間静置した後に 15, 000 x g で 30 分間遠心してタンパク質を沈殿として回収した。 回収したタンパク 質は 80 し の 2M尿素 + lOOmM重炭酸アンモニゥム溶液に溶解した。 溶 解後に一部を BCA法によるタンパク質濃度測定に供した。 試料タンパク 質と 1/50 (w/w)となるようにトリプシン （Promega： V511C) を加え、 37でで 16時間消化反応を行った。 2 ) Nano- HPLC直結質量分析装置による解析 Serum specimen of colorectal cancer patient 10L and healthy subject serum specimen lO ^ L are diluted with 500L of diluted buffer solution (10mM Tris HC1 h 7.4 + 150mM NaCl), then ProteomeLab IgY-12 SC proteome partitioning kit (BECKMAN COULTER: A24618) was used to remove albumin, globulin, and other blood and serum proteins. Dithiothreitol (Wako: 049-08972) was added to the obtained fraction to a final concentration of 10 mM, and the reduction reaction was performed at 60 for 30 minutes. After completion of the reaction, sodium acetamide (SIGMA: 144-48-9) was added to a final concentration of 10 mM, and the alkylation reaction was carried out at room temperature for 30 minutes in the dark. After completion of the reaction, add 4 times the volume of cold acetone (Wako: 014-08681,-20) to the reaction solution, let stand for 1 hour at 1 80, and then centrifuge at 15,000 xg for 30 minutes to recover the protein as a precipitate . The recovered protein was dissolved in 80% 2M urea + lOOmM ammonium bicarbonate solution. After dissolution, a portion was subjected to protein concentration measurement by the BCA method. Trypsin (Promega: V511C) was added to the sample protein to 1/50 (w / w), and digestion was performed at 37 for 16 hours. 2) Analysis using a Nano-HPLC direct mass spectrometer
ペプチド断片 0.7//g 量を μ- Precolunm cartridge (C18 PepMap300, 5 DI, 300A, 300 m i. d. x 5 mm LC PACKINGS: 163589) と直結させた ナ ノ カ ラ ム （C18 PepMap 3 m, 100 A , 75 M m i. d. x 150 mm LC PACKINGS:160321) によ り分離した。 HPLC 装置は Ultimate Plus (LC PACKINGS)を用いた。 流速は 200nL/min、 0. 1%ギ酸 (Wako:062-02901 ) 含有 2%ァセトニトリル （MERCK: 1287229) と 0. ギ酸含有 90%ァセトニ トリルの濃度勾配が 0.57¾/minの直線グラジェントを設定して解析を行 つた。 Nano- HPLCで分離した試料は PicoTip (New Object ive :FS360-20- 10-D-20) を通して直結したイオントラップ型質量.分析装置に連続的に 導入した。 質量分析装置は HCT Plus (Bruker Dal tonics)を用いた。 試 料のイオン化はキヤピラリー電圧 1500V、 エンドプレートオフセッ ト値 500V, ドライガス流量 12 L/min、 ドライガス温度 250 の条件で行った。 イオントラップの'設定は標的 m/z の前後 1 Da の取り込みとし、 MRM モ —ドでの MS/MS解析を行った。  Peptide fragment 0.7 // g nano-column (C18 PepMap 3 m, 100 A, C18 PepMap300, 5 DI, 300A, 300 m id x 5 mm LC PACKINGS: 163589) Separated by 75 mm id x 150 mm LC PACKINGS: 160321). As the HPLC apparatus, Ultimate Plus (LC PACKINGS) was used. The flow rate is 200 nL / min, and a linear gradient with a concentration gradient of 0.57¾ / min between 0.1% formic acid (Wako: 062-02901) containing 2% acetonitrile (MERCK: 1287229) and 0. formic acid containing 90% acetonitrile. And analyzed. Samples separated by Nano-HPLC were continuously introduced into an ion trap mass spectrometer directly connected through PicoTip (New Objective: FS360-20-10-D-20). As the mass spectrometer, HCT Plus (Bruker Dal tonics) was used. The sample was ionized under the conditions of a capillary voltage of 1500 V, an end plate offset value of 500 V, a dry gas flow rate of 12 L / min, and a dry gas temperature of 250. The ion trap was set to capture 1 Da before and after the target m / z, and MS / MS analysis was performed in MRM mode.
3 ) データ解析 ， 質量分析装置から得た全分析データは Data Analysis ソフ トウェア3) Data analysis, all analysis data obtained from mass spectrometers is data analysis software.
(Bruker Dalton.ics) を介して出力した。 出力した全データ中から標的 分子の分析データのみを抽出した。 抽出したデータの中から各分析時間 における MS/MSデータを精査し、 標的分子のフラグメントイオンに相当 する質量を持つイオンピークの有無を解析した。 (Bruker Dalton.ics) Only target molecule analysis data was extracted from all the output data. From the extracted data, the MS / MS data at each analysis time was scrutinized, and the presence or absence of an ion peak with a mass corresponding to the fragment ion of the target molecule was analyzed.
？ i、口 ? i, mouth
図 8 Aおよび図 8 Bは、 （A) 大腸がん患者由来の血清、 および (B) 健常者由来の血清について、 上記の方法で解析した結果をそれぞ れ示す。  Fig. 8A and Fig. 8B show the results of analysis of (A) serum derived from colorectal cancer patients and (B) serum derived from healthy subjects by the methods described above.
図 9 A〜Cは、 MS/MS 解析によって決定された、 図 8に示すピークと アミノ酸 （またはアミノ酸配列） との対応関係を示す。 図 8および図 9に示されるように、 標的分子のフラグメントイオンに 相当するイオンピークが、 大腸がん患者由来の血清中に明確に認められ た。 すなわち、 図 9 Bに示すように、 少なくとも C末端側から I T FA P A Eという部分配列が決定され、 これは、 S PO l lタンパク質のァ ミノ酸配列 （配列番号 2 ) 中の 6 6位〜 7 2位のアミノ酸配列に相当す る。 よって、 図 9 Aに示すように、 アミノ酸配列 6 6位〜 7 5位の標的 ペプチドフラグメント （配列番号 1 3 ) が同定された。 このような部分 配列に対応するイオンピークは健常者血清を用いた解析では認められな かった （図 9 Cを参照） 。 よって、 この標的分子 （すなわち、 S P〇 1 1タンパク質） は癌特異的に血中存在量が増加レて.いる可能性が強く示 唆された。 実施例 8 ： 子宮頸がん由来株 HeLa細胞株での RNAi効果の評価 FIGS. 9A to C show the correspondence between the peak shown in FIG. 8 and amino acids (or amino acid sequences) determined by MS / MS analysis. As shown in FIGS. 8 and 9, an ion peak corresponding to the fragment ion of the target molecule was clearly observed in the serum from colorectal cancer patients. That is, as shown in FIG. 9B, a partial sequence called IT FA PAE was determined at least from the C-terminal side, which was determined from positions 6 6 to 7 2 in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the S PO ll protein. It corresponds to the amino acid sequence of the position. Therefore, as shown in FIG. 9A, a target peptide fragment (SEQ ID NO: 13) having amino acid sequences 66 to 75 was identified. Such an ion peak corresponding to the partial sequence was not observed in the analysis using normal serum (see Fig. 9C). Therefore, it was strongly suggested that this target molecule (ie, SP 0 1 1 protein) may have increased cancer abundance specifically in cancer. Example 8: Evaluation of RNAi effect in cervical cancer-derived strain HeLa cell line
大腸がん細胞株では、 S P O 1 1遺伝子のノックダウンにより、 増殖 抑制効果が認められたが、 子宮頸がん細胞株においてどのような効果が 認められるのか、 前述の RNAi解析法により、 評価した。  In colorectal cancer cell lines, SPO 11 gene knockdown showed a growth-inhibiting effect, but the effect of cervical cancer cell lines was evaluated using the RNAi analysis method described above. .
子宮頸がん由来細胞の HeLa細胞株を用いて、 前出の 3種の siRNA を 用いて RNAi 解析を実施した。 s i R N Aの細胞内への導入は、 O 1 i g o f e c t am i n e ( I n v i t r o g e n) を使用し、 1 0 0 nMの s i RN Aを添付のプロ 卜コールに従い細胞に導入した。 対照に は N e g a t i v e C o n t r o l s i RNA (Q I AGE N) を 使用した。 糸口 ¾  Using the HeLa cell line of cervical cancer-derived cells, RNAi analysis was performed using the above three siRNAs. For introduction of siRNA into the cells, O 1 igofe tame ine (Invitrogen) was used, and 100 nM of siRNA was introduced into the cells according to the attached protocol. As a control, Nega tiv corn ol s si RNA (Q I AGE N) was used. Clue ¾
図 1 0は、 HeLa 細胞に S P〇 1 1遺伝子の s i RNAを T r a n s f e c t i o n後、 4日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測 定 （MTT assay) した結果を示す。 グラフは N C (Negat ive control siRNA (Qiagen 社製））に対する相対量を示した。 図に示されるように、 S P O 1 1遺伝子の s i RNA 3種 （a , b， c ) の内、 siRNA b にお いて 13 , siRNA c において 19%の増殖抑制効果が認められた （pく 0.01 の t検定において有意）。 Fig. 10 shows the results of measuring the number of viable cells (MTT assay) using the reagent on the 4th day after Transfection of SPO11 gene siRNA to HeLa cells. The graph shows the relative amount with respect to NC (Negative control siRNA (Qiagen)). As shown in the figure, among the three siRNAs of the SPO 11 gene (a, b, c), siRNA b 13, siRNA c showed a 19% growth inhibitory effect (significant in p-0.01 t test).
さらに、 時系列に従い、 顕微鏡下で微分干渉像を撮影し、 その動態を 詳細に観察した。 HeLa細胞に siRNA (a, b, c)をトランスフエクシヨン 後、 1， 2, 3, 4 日後の同視野の微分干渉像を観察した。 その結果を図 1 1に示す。 NC は Negative control siRNA (Qiagen社製）を使用した。 NC と比較して増殖速度の抑制と、 細胞死の誘導（一部を矢印で示す）が 確認された。 図中、 a、 b、 および cはそれぞれ、 図 1 0の s i RNA a , s i R N A b , および s i RNA cに対応する。 図 1 1に示される ように、 増殖抑制が認められた bにおいて細胞死の誘導が認められた。 また、 s i RNA cでは、 分裂の回数が少なく、 細胞のサイズが大きく なる細胞が認められ、 増殖抑制が分裂阻害によるものであることが示唆 された。  Furthermore, according to the time series, differential interference images were taken under a microscope, and their dynamics were observed in detail. After transfection of HeLa cells with siRNA (a, b, c), differential interference images of the same visual field were observed 1, 2, 3, and 4 days later. The results are shown in Fig. 11. NC used negative control siRNA (Qiagen). Compared with NC, the growth rate was suppressed and cell death was induced (partially indicated by arrows). In the figure, a, b, and c correspond to siRNA a, siRNAB, and siRNAc in FIG. 10, respectively. As shown in Fig. 11, induction of cell death was observed in b where growth inhibition was observed. In addition, in siRNA c, cells with fewer divisions and larger cell sizes were observed, suggesting that growth suppression was due to division inhibition.
この結果より、 S PO 1 1遺伝子機能の阻害が大腸がんだけでなく、 子宮頸がんにおいても抗腫瘍性効果を示すことが示唆された。 産業上の利用可能性  This result suggests that inhibition of the S PO 1 1 gene function shows an antitumor effect not only in colorectal cancer but also in cervical cancer. Industrial applicability
本発明は、 がんの治療剤、 診断剤、 診断方法、 治療方法、 ならびにそ れに使用するキッ トなどを提供する。 したがって、 本発明は、 がんの診 断、 または標的治療等の分野において有用である。  The present invention provides cancer therapeutic agents, diagnostic agents, diagnostic methods, therapeutic methods, kits used therefor, and the like. Therefore, the present invention is useful in fields such as cancer diagnosis or targeted therapy.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1. S PO 1 1遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治 療剤。 1. A cancer treatment containing an SPO 11 gene expression inhibitor as an active ingredient.
2. 前記 S P〇 1 1遺伝子の発現阻害物質が、 2. The SP 0 11 gene expression inhibitor is
(a) S P〇 1 1遺伝子の発現を R N A i効果により阻害する作用を 有する核酸、  (a) a nucleic acid having an action of inhibiting the expression of the SP 0 11 gene by the R N Ai effect,
(b) S P 01 1遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセ ンス核酸、  (b) an antisense nucleic acid for the transcript of the S P 01 1 gene or a part thereof,
および and
( c ) S P O l 1遺伝子の転写産物を特異的に切断するリボザィム活 性を有する核酸、  (c) a nucleic acid having a ribozyme activity that specifically cleaves a transcript of the SPO1 gene,
からなる群から選択される物質を含む、 請求項 1に記載のがん治療剤。The cancer therapeutic agent according to claim 1, comprising a substance selected from the group consisting of:
3. S P O 1 1ダンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有するが ん治療剤。 3. S P O 1 1 Anticancer agent containing a substance activity inhibitor as an active ingredient.
4. 前記 S P O 1 1タンパク質の活性阻害物質が、  4. The S P O 1 1 protein activity inhibitor is
該 S P O 1 1タンパク質に対する抗体、  An antibody against the S P O 1 1 protein,
を含む、 請求項 3に記載のがん治療剤。 The cancer therapeutic agent of Claim 3 containing this.
5. 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求項 1〜4のいず れかに記載のがん治療剤。  5. The cancer therapeutic agent according to any one of claims 1 to 4, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.
6. S PO l 1遺伝子の発現阻害物質をスクリーニングする方法であつ て、  6. A method for screening for a substance that inhibits the expression of S PO l 1 gene,
(a) S PO 1 1遺伝子を発現する細胞に、 被検化合物を接触させる 工程、  (a) a step of contacting a test compound with a cell expressing the S PO 11 gene,
( b ) 該 S P O 1 1遺伝子の発現レベルを測定する工程、 および (b) measuring the expression level of the S P O 1 1 gene; and
(c ) 被検化合物を接触させない場合と比較して、 該発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程を包含する、 スクリーニング方法。 (c) A screening method comprising a step of selecting a compound that reduces the expression level as compared with a case where a test compound is not contacted.
7. S P O 1 1タンパク質の活性阻害物質をスクリーニングする方法で あって、 ( a ) S PO l 1タンパク質と被検化合物とを接触させる工程、7. A method of screening for a substance that inhibits the activity of SPO 11 protein, comprising: (a) contacting the S PO l 1 protein with a test compound;
(b) 該 S P〇 1 1タンパク質と被検化合物との結合活性を測定する 工程、 および (b) a step of measuring the binding activity between the SPO1 1 protein and the test compound; and
(c ) 該 S P O l 1タンパク質と結合する化合物を選択する工程を包 含する、 スクリーニング方法。  (c) A screening method comprising a step of selecting a compound that binds to the SPO1 protein.
8. 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求項 6または 7に 記載の方法。  8. The method according to claim 6 or 7, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.
9. S P O 1 1タンパク質に対する抗体。  9. Antibodies against S P O 1 1 protein.
1 0. 請求項 9に記載の抗体を含有するがん治療剤。  1 0. A cancer therapeutic agent comprising the antibody according to claim 9.
1 1. 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低分子の薬剤、 または治療遺 伝子を担持したベクターをさらに含有する、 請求項 1 0に記載のがん治 療剤。  1 1. The cancer therapeutic agent according to claim 10, further comprising a vector carrying a radioisotope, a therapeutic protein, a small molecule drug, or a therapeutic gene.
1 2. 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求項 1 0または 1 1に記載のがん治療剤。  1 2. The cancer therapeutic agent according to claim 10 or 11, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.
1 3. 請求項 9に記載の抗体を含有するがん診断剤。 1 3. A cancer diagnostic agent comprising the antibody according to claim 9.
1 4. S P〇 1 1遺伝子またはその一部の塩基配列にス トリンジェント なハイプリダイゼ一ショ ン条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列を含 有するがん診断剤。  1 4. SP 0 11 A diagnostic agent for cancer, which contains a base sequence that can be hyper-precipitated under stringent high-pridation conditions in the gene or a part of the base sequence.
1 5. 前記がんが大腸がんである、 請求項 1 3または 1 4に記載のがん 診断剤。  1 5. The cancer diagnostic agent according to claim 13 or 14, wherein the cancer is colorectal cancer.
1 6. 請求項 9に記載の抗体を含有するがん診断用キッ ト。  1 6. A cancer diagnostic kit comprising the antibody according to claim 9.
1 7. S P O 1 1遺伝子またはその一部の塩基配列にス トリンジェント なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列から なるポリヌクレオチドを含有するがん診断用キッ ト。  1 7. A kit for cancer diagnosis containing a polynucleotide comprising a base sequence that can be hybridized under stringent hyperprecipitation conditions to the base sequence of a SPO1 1 gene or a part thereof.
1 8. 前記がんが大腸がんである、 請求項 1 6または 1 7に記載のがん 診断用キッ ト。 1 8. The cancer diagnostic kit according to claim 16 or 17, wherein the cancer is colon cancer.
1 9. 被験者由来の生体試料中の S P〇 1 1タンパク質または S P O 1 1 9. S P 0 1 1 protein or S P O 1 in a biological sample derived from a subject
1遺伝子をがんマーカーとして検出および または定量する方法。 A method to detect and / or quantify a gene as a cancer marker.
2 0. 前記生体試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 請求項 1 9に 記載の方法。 2 0. In claim 19, wherein the biological sample is whole blood, serum, or plasma The method described.
2 1. 質量分析装置を用いて、 S P O 1 1タンパク質を検出およびノま たは定量する、 請求項 1 9または 2 0に記載の方法。  2 1. The method according to claim 19 or 20, wherein the S P O 1 1 protein is detected and quantified using a mass spectrometer.
2 2. 抗 S P O 1 1抗体を用いて、 S P O 1 1タンパク質を検出および /または定量する、 請求項 1 9〜 2 1のいずれかに記載の方法。  2 2. The method according to any one of claims 19 to 21, wherein the anti-SPO1 1 antibody is used to detect and / or quantify the SPO1 1 protein.
2 3. ( a ) 被験者由来の生体試料と、 S P〇 1 1タンパク質に対する 抗体とを接触させる工程、 および  2 3. (a) a step of contacting a biological sample derived from a subject with an antibody against the SP1 1 protein, and
(b ) 前記試料中での前記抗体と、 S P O 1 1タンパク質との結合を 検出および Zまたは定量する工程、  (b) detecting and Z or quantifying the binding between the antibody and the SPO1 1 protein in the sample;
を包含する、 請求項 2 2に記載の方法。 The method according to claim 22, comprising:
24. ( a) 被験者由来の生体試料と、 S P〇 1 1遺伝子またはその断 片の塩基配列にス トリンジェン卜なハイブリダイゼ一ション条件下でハ ィプリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを接触させる 工程、 および  24. (a) A step of bringing a biological sample derived from a subject into contact with a polynucleotide having a base sequence that can be hybridized under hybridization conditions stringent to the base sequence of the SP011 gene or a fragment thereof. , and
(b ) 前記試料中での前記ポリヌクレオチドと、 S P O l l遺伝子ま たはその断片とのハイプリダイゼーションを検出および/または定量す る工程、 ， を包含する、 請求項 1 9または 2 0に記載の方法。  (b) detecting and / or quantifying the hybridization between the polynucleotide in the sample and a SPO ll gene or a fragment thereof, and the method of.
2 5. がんの診断に用いるための請求項 1 9〜 24のいずれかに記載の 方法。  2 5. The method according to any one of claims 19 to 24 for use in diagnosis of cancer.
2 6. 前記がんが、 大腸がんである、 請求項 2 5に記載の方法。  2 6. The method according to claim 25, wherein the cancer is colorectal cancer.
2 7. 配列番号 5、 配列番号 6、 配列番号 7、 配列番号 8、 配列番号 9、 または配列番号 1 0の塩基配列を有する、 ポリヌクレオチド。 2 7. A polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 10.
2 8. S P O 1 1遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん 治療剤であって、 配列番号 .5、 配列番号 6、 配列番号 7、 配列番号 8、 配列番号 9、 または配列番号 1 0の塩基配列を有するポリヌクレオチド を含有する、 がん治療剤。 2 8. A cancer therapeutic agent containing an SPO 11 gene expression inhibitor as an active ingredient, comprising SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 1. A cancer therapeutic agent comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence of 0.
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