WO2007026960A1 - Use of mocs3 gene for therapeutic or diagnostic purposes - Google Patents

Use of mocs3 gene for therapeutic or diagnostic purposes Download PDF

Info

Publication number
WO2007026960A1
WO2007026960A1 PCT/JP2006/317705 JP2006317705W WO2007026960A1 WO 2007026960 A1 WO2007026960 A1 WO 2007026960A1 JP 2006317705 W JP2006317705 W JP 2006317705W WO 2007026960 A1 WO2007026960 A1 WO 2007026960A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
gene
protein
antibody
moc
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/317705
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Shinichirou Niwa
Yasutaka Makino
Tomoki Ikuta
Kazuya Arai
Takayuki Shindou
Hiromichi Ogura
Original Assignee
Link Genomics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Link Genomics, Inc. filed Critical Link Genomics, Inc.
Priority to JP2007533382A priority Critical patent/JPWO2007026960A1/en
Publication of WO2007026960A1 publication Critical patent/WO2007026960A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to the MCS3 gene, which is a gene specifically amplified in cancer, and its therapeutic or diagnostic use.
  • Cancers Malignant tumors (cancers) are characterized by lethality due to generalization through proliferation, invasion, and metastasis.
  • Local therapies such as surgical resection or radiotherapy cannot adequately address metastatic recurrent cancer, and the development of systemic pharmacotherapy is expected to improve the outcome of cancer treatment in the future.
  • Chemotherapy which is the current center of cancer drug therapy, often uses cell killing agents that act directly on the DNA and / or RNA of cancer cells and cause cell death. For example, bone marrow cells, germ cells, hair matrix cells, and gastrointestinal epithelial cells also acted on normal cells with many divisions, resulting in strong side effects.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • tyrosine kinase inhibitor ylessa gene: gefitinib
  • Herceptin gene: trastuzumab
  • HE R-2 human epidermal growth factor receptor 2
  • the present inventors have found that the gene that is frequently amplified in cancer (eg, colorectal cancer) is the MOC S 3 gene. I found it.
  • the present inventors have further found that cancer cell proliferation can be suppressed by inhibiting the expression of MOCS 3 protein in colorectal cancer cell lines and cervical cancer cell lines, thereby completing the present invention. It came to. That is, the present invention provides the following cancer therapeutic agents, screening methods for candidate substances having a cancer-suppressing activity, cancer diagnostic agents, cancer diagnostic kits, cancer diagnostic methods, and the like.
  • a therapeutic agent for cancer comprising an OC S 3 gene expression inhibitor as an active ingredient.
  • the cancer therapeutic agent according to (1) above comprising a substance selected from the group consisting of
  • a cancer therapeutic agent comprising a MOC S 3 protein activity inhibitor as an active ingredient.
  • the cancer therapeutic agent according to (3) above comprising a substance selected from the group consisting of
  • a screening method comprising a step of selecting a compound to be reduced.
  • a screening method comprising a step of selecting a compound that binds to the MOCS 3 protein.
  • a cancer therapeutic agent comprising the antibody according to (9) above.
  • a cancer diagnostic agent comprising the antibody according to (9) above.
  • a cancer diagnostic agent comprising a nucleotide sequence that can be hyper-predated under stringent hyper-precipitation conditions in the base sequence of the MOC S 3 gene or a part thereof.
  • a kit for cancer diagnosis containing a polynucleotide comprising a base sequence that can be hyperpredified under high-precipitation conditions that are stringent to the base sequence of the MO C S 3 gene or a part thereof.
  • a method for treating cancer comprising a step of administering a MOC S 3 gene expression inhibitor to a patient.
  • a method for treating cancer comprising the step of administering a MO CS 3 protein activity inhibitor to a patient.
  • a MOC S 3 gene expression inhibitor for the manufacture of a medicament for treating cancer.
  • the present invention provides novel drugs, kits and methods useful for the treatment and Z or diagnosis of cancer, particularly colorectal cancer, and a screening method for candidate compounds having cancer suppressive action.
  • FIG. 1 is a histogram showing the frequency of the MO C S 3 gene relative to the degree of gene amplification in 20 samples from colon cancer patients.
  • Fig. 2 is an optical micrograph (phase contrast image) showing the results of RNA i analysis when siRNA of the MCS3 gene was transfected into the colon cancer cell line RKOE6.
  • Fig. 3 is a graph showing the results of quantitative evaluation of RNA i effect by RT-PCR when sciRNA of MOC S3 gene was transfected into colorectal cancer cell line RKOE6.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of evaluating the RNA i effect by measuring the number of viable cells when the siC of the MOC S 3 gene was transfected into the colon cancer cell line RKOE 6.
  • Fig. 5 is a photograph showing the results of verifying the RNA i effect with an optical microscope when siRNA of the MO CS 3 gene was transfected into a cell line CCD 18 Co derived from normal colon tissue. Phase difference image).
  • Figure 6 is a graph showing the results of quantitative RT-PCR evaluation of RNA i effects when MO CS 3 gene siRNA was transfected into cell line CCD 18 Co derived from normal colon tissue. is there.
  • Fig. 7 is a graph showing the results of verifying the RNA i effect by measuring the number of viable cells when transfecting siRNA of the MO CS 3 gene into the cell line C CD 1 8 Co derived from normal colon tissue .
  • Fig. 8 is a photograph showing the results of Northern hybridization performed using various normal organ tissues.
  • Fig. 9 is an optical micrograph (fluorescence image) of a portion (6 cells) of cancer cells in a sample tissue derived from a colon cancer patient analyzed by the FISH method.
  • FIG. 10 is an optical micrograph (bright field image) showing the results of evaluation by immunohistostaining that the M0CS3 gene protein is expressed in cancer cells of the specimen tissue.
  • Fig. 11 is a graph showing the results of verifying the RNAi effect by measuring the number of viable cells when transfection of the MO C S3 gene siRNA into the cervical cancer cell line HeLa cell line.
  • Fig. 12 is an optical micrograph (differential interference image) showing the results of taking a detailed observation of the behavior of the experiment in Fig. 11 taken in a time-series under a microscope.
  • Figures 13A and B are graphs showing the results of (A) serum derived from a colon cancer patient and (B) serum derived from a healthy subject analyzed by mass spectrometry, respectively.
  • FIGS. 14A to C show the correspondence between the peak and amino acid (or amino acid sequence) shown in FIG. 13 determined by MS / MS analysis.
  • Fig. 1 5 _ 1 and Fig. 1 5-2 are the organs analyzed by immunohistochemical staining, where expression was observed in the stomach (A: stomach), colon (B: colon), rectum (C: rectum), Retina (D: epiploon), lungs (E, F, G ⁇ lung), nest (I, J: ovary), prostate (L: prostate), lymph node (M: Lymp node), bone tissue (0: bone), mediastinum (R: mediastinum), and weakly expressed milk (H: breast), spleen (K: spleen), throat (P: throat), and adipose tissue (Q: fatty tissue) ) An optical micrograph (bright field image) of the sample from origin.
  • the present inventors verified a gene amplified by the array CGH method using a sample derived from a colorectal cancer patient, and identified a gene amplification region specific for colorectal cancer. It was. We found that human MOC S 3 (Molybdenum cofactorsynthesis 3) gene is frequently found in colorectal cancer patients among the regions where amplification occurs frequently in the samples.
  • human MOC S 3 Molybdenum cofactorsynthesis 3
  • the human MCS3 gene found by the present inventors is involved in the synthesis system of oxidoreductases containing molybdenum.
  • Molybdenum is a trace element contained in many foods such as legumes, dairy products, and meat, and is known to play an important role in vivo. Molybdenum combines with Molybdopterin (MTP) to form M o 1 ynden um cofactor (M oco. Mo co consists of xanthine oxidase (XO), aldehyde oxidase (AO), and sulfite oxidase ( It is essential for the activity of the three enzymes SO) XO is involved in the metabolism of purine derivatives, AO catalyzes the oxidation of aldehydes to strong sulfonic acids, and SO is required for the metabolism of sulfur-containing amino acids. An enzyme that oxidizes sulfite to sulfuric acid.
  • MTP Molybdopterin
  • Mo co consists of xanthine oxidase (XO), aldehyde oxidase (AO), and sulfite
  • Molybdenum deficiency has been reported in patients who have clinical signs such as increased heartbeat, headache, psychiatric disorder, and coma and are receiving long-term parenteral nutrition. Symptoms of this molybdenum deficiency include very low uric acid levels in serum and urine due to low XO activity, and low urinary sulfuric acid levels in urine due to low soo activity. Molybdenum cofactor deficiency due to congenital anomalies that show symptoms such as severe brain damage and ocular vitreous dislocation is known (Sardesai, VM (1 9 9 3) Nu tr C lin P ract. 8 (6 ), 2 7 7-8 1).
  • Molybdenum cofactor deficiency has been reported to involve two mutations in Mo 1 ybden um cofactor synthesisl (MOC S l) and 2 (MOC S 2) (Reiss, J. eta 1. (1 9 9 8) Am. J. Hum. G enet. 1 0 3, 6 3 9-644; Reiss, J. Eta 1. (1 9 9 9) Am. J. Hum. G enet. 64, 7 0 6-7 1 1 ) c
  • MO CS 3 is homologous to Moe B on the N-terminal side, but homologous to Rhodanese (thiosu 1 fate: cyanidesulfurtransferase, EC 2. 8. 1. 1) on the C-terminal side ( M endel, R. R. & S chwa rz, G. (2 0 0 2) M et. Ions Biol. Syst. 3 9, 3 1 7— 3 6 8).
  • MOC S 3 transfers sulfur to MO C S 2 and activates M OC S 2 in the MTP synthesis system.
  • Activated MOC S 2 converts Precursor Z synthesized from GTP by MOC S 1 into MTP (Matthies, A. eta 1. (2 0 04) PNA S 1 0 1 (1 6), 5 946-5 9 5 1; Mathesies, A. eta 1. (2 0 0 5) B ioch em. 44, 7 9 1 2— 7 9 2 0).
  • MTP synthesized in this way combines with molybdenum and becomes Mo co.
  • M o co is essential for the activity of three enzymes: xanthine oxidase (X O), aldehyde oxidase (AO), and sulfite oxidase (S O).
  • the present inventors have also confirmed that the growth of cancer cells can be suppressed by suppressing the expression of the MO C S 3 gene by RNA i (RNA interference). Therefore, it is possible to treat cancer by suppressing the expression of the MCS3 gene. It is also possible to diagnose cancer by measuring the expression level of the MOC S 3 gene.
  • RNA i RNA interference
  • the present invention provides (1) a substance that inhibits expression of MO CS 3 gene as an active ingredient And (2) a cancer therapeutic agent containing, as an active ingredient, a MCS3 protein activity inhibitor.
  • MOC S 3 gene refers to a human MO CS 3 gene consisting of 24 5 8 bases registered in the Accession No .: NM_ 0 1 4 48 4 in the NC BI nucleotide database ( SEQ ID NO: 1) means, but not limited thereto, for example, a variant that has been altered by having one or more base substitutions, deletions, additions, or insertions in the base sequence of the gene.
  • a gene consisting of a polynucleotide comprising a base sequence that can be hybridized under high-precipitation conditions that are stringent to the base sequence of the gene or its complementary sequence is also referred to as “MOC S 3 gene”. It shall be included.
  • Hypridization is a known method or a method similar thereto, for example, molecular cloning (Molecu 1 r Cloning Third E dition, J. S amb rooketa 1., C old S pr ing Harbor L ab. Press . 2 0 0 1) and the like.
  • the “stringent condition” may be a low stringent condition, a moderate stringent condition, or a high stringent condition.
  • “Low stringent conditions” are, for example, 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C.
  • “Medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, it affects the stringency of the hybridization. Multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered, and those skilled in the art can select similar factors to achieve the same stringency. It can be realized.
  • polynucleotide that can be hybridized the base sequence of SEQ ID NO: 1, for example, 70% or more, when calculated using the default parameter—by homology search software such as FAS TA, BLAST, etc. 7 5% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 9 1% or more, 9 2% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, Examples include polynucleotides having 9 7% or more, 98% or more, and 99% or more identity.
  • inhibition of gene expression means any event in a series of events from gene to protein production (for example, transcription (production of mRNA), translation (production of protein)) By inhibiting the production of the protein encoded by the gene.
  • MOC S 3 protein consists of 460 amino acid residues registered under Accession No .: NP— 0-5 5 2 9 9 on the basis of NC BI protein data. Retains the human MO CS 3 protein (SEQ ID NO: 2) and substantially the same activity as this protein (for example, one or more activities selected from enzyme activities such as Rhodanese activity and Tiocarboxylation activity). A mutant protein consisting of an amino acid sequence in which deletion, substitution, insertion, and addition or deletion of one to a plurality of amino acid residues has occurred in the amino acid sequence.
  • the amino acid mutation site and number in the above mutant protein are not particularly limited as long as the mutant protein retains substantially the same activity as the original protein, but the number of mutations is, for example, 1 to 50. 1 to 40 pieces, 1 to 30 pieces, 1 to 25 pieces, 1 to 20 pieces, 1 to 15 pieces, 1 to 10 pieces, 1 to 9 pieces, 1-8 pieces, 1-7 pieces! ⁇ 6 pieces (1 ⁇ several pieces), 1 ⁇ 5 pieces, 1 ⁇ 4 pieces, 1 ⁇ 3 pieces, 1-2 pieces, 1 piece. In general, the smaller the number of mutations, the better.
  • such a mutant protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 9 1% or more, 9 2% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more amino acid sequences having 9% or more identity
  • a protein having substantially the same activity as the original protein In general, the larger the homology value, the better.
  • the MO CS 3 protein includes “partial peptides” of the MO CS 3 protein.
  • the partial peptide of the MO CS 3 protein is a partial peptide consisting of a partial amino acid sequence of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the M 0 CS 3 protein. Any substance may be used as long as it has an activity similar to that of protein.
  • SEQ ID NO: 2 at least 20, preferably at least 50, more preferably at least 70, more preferably at least 100, most preferably at least Examples thereof include a polypeptide having an amino acid sequence consisting of at least 200 amino acid residues.
  • these polypeptides contain an amino acid sequence corresponding to the portion involved in the activity of MOCS 3 protein.
  • the partial peptide used in the present invention is one or more of the above-mentioned polypeptides in the amino acid sequence (for example, about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, still more preferably 1 to 5 amino acid residues) may be changed by deletion, addition, substitution, or insertion.
  • the MO CS 3 protein used in the present invention can be prepared from cells or tissues expressing the protein. Further, these proteins can be synthesized by a known peptide synthesizer, or can be prepared by a recombinant method using an appropriate host cell selected from prokaryotic organisms or eukaryotic organisms.
  • the MO CS 3 protein used in the present invention is although it may be derived from these species, it is preferably derived from a human.
  • Substantially the same activity indicates that these activities are qualitatively equivalent. Accordingly, enzyme activities (such as Rhodanese activity and Tiocarboxylation activity) are equivalent (for example, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2). However, quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different. Enzyme activity is measured according to known methods described in literature such as Maties, A. eta 1. (2 0 0 4) P NAS 1 0 1 (1 6), 5 9 4 6-5 9 5 1, etc. For example, it can be measured according to the screening method described later.
  • B LAS TN and B LAS TX Programs called B LAS TN and B LAS TX based on the BL AS T algorithm have been developed (A 1 tschu 1 SF, eta 1: J Mol B iol 2 1 5: 4 0 3, 1 9 9 0 )
  • amino acid sequences using B LAS TX no.
  • B LAS T and Gap p e d B LAS T programs use the default parameters of each program.
  • cancer therapeutic agent includes anticancer agents, cancer metastasis inhibitors, cancer cell apoptosis inducers, cancer cell proliferation inhibitors, cancer cell infiltration inhibitors, cancer preventive agents, and the like. Used in meaning.
  • cancer (or cancer) and “tumor” are used as terms having the same meaning.
  • the present invention provides a cancer treatment agent containing, as an active ingredient, an expression inhibitor of MCS3 gene. To do.
  • MOC S 3 gene expression inhibitor is not limited as long as it inhibits the expression of the MOC S 3 gene.
  • MOCS 3 gene to MO CS 3 mRNA and a substance that inhibits translation from MOC S 3 mRNA to MOC S 3 protein.
  • Examples of substances that inhibit transcription from the MO C S 3 gene to MO C S 3 mR N A include
  • Examples of substances that block translation from MOC S 3 mRN A to MO C S 3 protein include
  • RNAI action on M0 C S 3 m RN A or a part thereof e.g, si RNA
  • nucleic acid means RNA or DNA.
  • nucleic acid here contains not only purine and pyrimidine bases, but also modifications. It may include those with other heterocyclic bases decorated. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleosides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or ethers, amines, etc. It may be converted to a functional group.
  • RNA i is a phenomenon in which the expression of a foreign gene and a target endogenous gene are both inhibited when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as the target gene sequence is introduced into the cell.
  • the RNA used here is, for example, 19 to 30 bases in length; double-stranded RNA that causes RNA interference, such as ds RNA (doublestrand RNA), siRNA (smallinterfering RNA) or sh RNA (shorthairpin RNA).
  • RNA can be locally delivered to a desired site by a delivery system such as ribosome, and it can be expressed locally using a vector that produces the above-mentioned double-stranded RNA.
  • ds RNA, si RNA or sh RNA double-stranded RNA
  • the preparation method and use method of such double-stranded RNA are known from many literatures (Special Table 2 0 0 2-5 1 6 0 6 2; US) Publication No. 2 0 0 2Z0 8 6 3 5 6 A; Nature Genetics, 2 4 (2), F e b., 1 80-1 8 3; Genesis, 2 6 (4), Ap ril , 24 0-2 44; Nature, S pe.
  • the length of the double-stranded RNA exhibiting the RNA i effect used in the present invention is usually 19 to 30 bases, preferably 20 to 27 bases, more preferably 21 to 25 bases, most preferably Is 2 1 to 2 3 bases.
  • siRNA used in Example 3 can be used.
  • the term “antisense nucleic acid” or “antisense polynucleotide” has a polynucleotide that is complementary to at least a part of a DNA region of interest, and the polynucleotide is a small part of the region.
  • the term refers to a nucleic acid that can be hybridized with a part.
  • the antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • the antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, and those that are resistant to the degradation of oligonucleotides. is not.
  • the antisense nucleic acid to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
  • the nucleic acid thus prepared can be transformed into a desired animal using a known method.
  • the sequence of the antisense nucleic acid is preferably a sequence complementary to the endogenous gene of the animal to be transformed or a part thereof, but is completely complementary as long as the gene expression can be effectively suppressed. It doesn't have to be.
  • a complementary antisense sequence in the untranslated region near the 5 'end of the mRNA of the MO C S 3 gene is effective in inhibiting gene translation.
  • a sequence complementary to the coding region or 3 ′ untranslated region can also be used.
  • Antisense nucleic acid effective for inhibiting gene translation is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 9% or more of the transcript of the target gene. 5% or more complementarity.
  • the length of the antisense nucleic acid is at least about 10 bases (for example, about 10 to 40), preferably about 15 bases or more More preferably about 100 bases or more, and still more preferably about 500 bases or more.
  • Antisense nucleic acids can be designed with reference to known literature (for example, Hirashima and Inoue, New Chemistry Experiment Course 2 Nucleic acid IV gene replication and expression, Japan Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin, 1 9 9 3, p. 3 1 9-34 7), J. Kawakamieta 1., P harmtech J apa n. V ol. 8, p. 24 7, 1 9 9 2; V o 1. 8, p. 3 9 5, 1 9 9 2; S. T. C rookeeta 1., ed., An tisense R esearchand Ap plications , CR CP ress, 1 9 9 3 etc.).
  • a nucleic acid having a lipozyme activity that specifically cleaves a transcript of the MCS3 gene can be used as an active ingredient.
  • liposome activity refers to a nucleic acid that specifically cleaves mRNA, which is a transcription product of a target gene. Some liposomes are larger than 400 nucleotides, such as group I introns and MRNA contained in RNase P, but about 40 nucleotides called hammerheads and hepins. Some have the active domain of (protein nucleic acid enzyme, 1990, 35, p. 2 191). For example, FEBSL ett, 1 9 8 8, 2 2 8, p.
  • a compound other than a nucleic acid that inhibits the transcriptional activity of the MOC S3 gene can be used as an active ingredient.
  • a compound is, for example, a compound that binds to a factor involved in the expression / transcription of the MOCS3 gene.
  • a compound may be a natural product or a synthetic compound.
  • Such a compound can be obtained by the screening method described below.
  • Cancer therapeutic agent containing an activity inhibitor of MOC S 3 protein in another embodiment, the present invention also provides activity of MO CS 3 protein.
  • a cancer therapeutic agent containing an inhibitor is provided.
  • MO C S 3 protein activity inhibitor includes, for example,
  • antibody means an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein. There is no particular limitation on the form of the antibody of the present invention.
  • anti-MOC S 3 antibodies can be prepared by methods known to those skilled in the art. Details of the anti-MO C S 3 antibody will be described later. '
  • MO CS 3 protein mutant having a dominant negative property relative to MO CS 3 protein refers to an endogenous wild type MO CS 3 protein expressed by expressing a gene encoding the same. This refers to a protein having a function of eliminating or reducing the quality activity (see Kunihiro Tsuchida, Gene Activity Inhibition Experiment, edited by Yoshikazu Tahira, Yodosha (2 0 1) 2 6-3 2).
  • a compound other than the above antibody or mutant that binds to MOCS3 protein can be used as an active ingredient.
  • a compound is, for example, a compound that binds to MO CS 3 protein and inhibits its activity.
  • Such a compound may be a natural product or a synthetic compound. Such compounds should be obtained by screening methods described below. Is possible.
  • the substance capable of inhibiting the activity of the above-described MCS3 protein of the present invention can be used as a cancer therapeutic agent. 2. Screening method for substances that inhibit the activity or expression of MO C S 3 protein
  • the present invention also provides a method for screening a candidate compound having a cancer suppressing action.
  • One preferred embodiment is a method using as an index the binding between the MOCS 3 protein and the test compound.
  • a compound that binds to MCS3 protein is expected to have an effect of inhibiting the activity of MOCS3 protein.
  • the compound preferably binds to the active site of the MOCS3 protein.
  • the MOC S 3 protein is contacted with a test compound.
  • the MOCS 3 protein can be used, for example, in a purified form of the MOCS3 protein, in a form expressed intracellularly or extracellularly, or affinity, depending on the indicator for detecting binding to the test compound. It can be in the form bound to a column.
  • the test compound used in this method can be appropriately labeled as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label.
  • test compound used for this method.
  • natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides, etc. as well as compound libraries, gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, oceans
  • compound libraries include, but are not limited to, biological extracts and plant extracts.
  • the binding between the M CS3 protein and the test compound can be detected by, for example, a label attached to the test compound bound to the MOCS3 protein.
  • the binding activity between a protein and a test compound can be measured by a known method (for example, measurement of Nitratereductase activity or Sulfurtransferase activity (Matthies, A. eta 1. (2 0 04) PNAS 1 0 1 (Refer to (16), 594 6-5 9 5 1)). In this method, a test compound that binds to the MOCS3 protein and inhibits its activity is then selected.
  • the compound isolated by this method is expected to have a cancer suppressing action and is useful as a cancer therapeutic agent.
  • Another embodiment of the screening method of the present invention is a method using the expression of the MOCS3 gene as an index.
  • a test compound is brought into contact with a cell expressing the MCS3 gene.
  • a cell expressing the MCS3 gene examples include cells derived from pets, livestock, etc., such as humans, mice, cats, cats, dogs, eagle, birds, but not limited to these.
  • Cells that express the MCS3 gene include cells that express the endogenous MOCS3 gene, or cells that have had the exogenous MOCS3 gene introduced and expressed. can do.
  • a cell in which an exogenous MOC S 3 gene is expressed can usually be produced by introducing an expression vector into which a MOC S 3 gene has been inserted into a host cell.
  • the expression vector can be prepared by general genetic engineering techniques.
  • test compound used in this method is not particularly limited.
  • a natural compound, an organic compound, an inorganic compound, a single compound such as a protein, a peptide, etc., and a compound library, an expression product of a gene library, Cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, etc. are used.
  • the “contact” of the test compound to the cell expressing the MOC S 3 gene usually involves adding the test compound to the culture medium of the cell expressing the MOC S 3 gene. However, it is not limited to this method.
  • “contact” can be performed by introducing a DNA vector expressing the protein into the cell.
  • the expression level of the MOCS 3 gene is then measured.
  • expression of a gene includes both transcription and translation.
  • the expression level of a gene can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA is extracted from cells expressing the MO CS 3 gene according to a conventional method, and the transcription level of the gene is obtained by carrying out the Northern hypridase-chasion method or RT-PCR method using this mRNA as a cocoon. Can be measured.
  • the promoter region of the MOC S 3 gene can be isolated according to a conventional method and detected downstream of the labeled gene (eg, luminescence, fluorescence, coloration, etc.
  • the transcription level of the gene can also be measured by linking the gene (including but not limited to) and observing the activity of the marker gene.
  • protein fractions are collected from cells that express the MO CS 3 gene, and the expression level of the MO CS 3 protein is detected by electrophoresis such as SDS-PAGE to measure the translation level of the gene. Can also be done.
  • the antibody used for detecting the MOCS3 protein is not particularly limited as long as it is a detectable antibody. For example, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.
  • the present invention also provides an anti-MOCS 3 antibody, a cancer therapeutic agent containing this antibody, and the like.
  • the cancer therapeutic agent is used for cancer targeted therapy or targeted drug delivery.
  • anti-MOC S 3 antibody includes an antibody that specifically binds to MCS3 protein (including fragments (partial peptides) or salts thereof).
  • the anti-MOCS3 antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in view of ease of purification.
  • antibody is used to mean any antibody fragment or derivative.
  • the antibody of the present invention can be produced by a known method. Methods for producing such antibodies are well known in the art (eg, Har 1 ow E. & Lane D., Antibody, Old Spr «ing Harbor Laboratory Pres (1 9 8 8)). See).
  • the protein used as the sensitizing antigen is usually MOCS 3 protein or a salt thereof.
  • the MO CS 3 protein also includes a partial peptide thereof, which is not limited to, for example, a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 20 or more, A partial peptide having 40 or more, 60 or more, 80 or more, 100 or more consecutive amino acid sequence portions.
  • a partial peptide having 40 or more, 60 or more, 80 or more, 100 or more consecutive amino acid sequence portions For example, an amino (N) terminal fragment or a carboxy (C) terminal fragment is used.
  • the partial peptide used in the present invention one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 6)) amino acid residues in the above amino acid sequence are deleted. , Substitutions, insertions and Z or additions.
  • salts of MO CS 3 protein or partial peptides used herein include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid), and salts with organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid). Is used.
  • the M0 CS3 protein of the present invention used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal such as a mouse or human, and particularly a human-derived protein. Is preferred.
  • M0 CS 3 protein The above-described MOC S 3 protein, a partial peptide thereof or a salt thereof (in the present specification, these are collectively referred to as “M0 CS 3 protein”) as an antigen, and a mammal such as a rat , Mouse, and rabbit.
  • the dose of antigen per animal is 0.1 to 100 mg when adjuvant is not used, and 1 to 100 zg when adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the interval between immunizations is not particularly limited, and immunization is carried out 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 5 weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days after the last immunization day, preferably 1 to 14 days later.
  • antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells and the like, and spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • (ii) Cell fusion Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed in order to obtain a hybridoma.
  • a myeloma cell to be fused with an antibody-producing cell a generally available cell line of an animal such as a mouse can be used.
  • the cell line to be used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. It is preferable to have Examples of myeoma cells include mouse myeoma cells such as X 6 3 A g. 8. 65 3, NS I / 1—Ag 4-1, NS 0 Z 1, and rat myeloma such as YB 2Z0. Cell lines.
  • Cell fusion consists of 1 X 10 s to 1 X 10 7 Zm 1 antibody-producing cells and 2 X 1 0 5 in animal cell culture media such as serum-free DMEM, RPMI — 1 6 40 medium, etc.
  • animal cell culture media such as serum-free DMEM, RPMI — 1 6 40 medium, etc.
  • ⁇ 2 X 1 0 6 cells / m 1 of the Mie port Ichima cells were mixed (antibody producing cells and myeloma port Ichima cells and cell ratio of 2: 1 to 3: 1 is preferred)
  • cells fusion promoter Perform fusion reaction in the presence.
  • the cell fusion promoter polyethylene glycol having an average molecular weight of 100 to 60,000 daltons can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device using an electric stimulus (for example, electoral position).
  • the cell suspension is appropriately diluted with, for example, RPM 1-1640 medium containing fetal bovine serum, and then plated on a microtiter plate at about 3 ⁇ 10 5 cells / wel1. Add the selective medium to each well, and then change the selected medium appropriately. As a result, cells that grow 14 days before or after the start of culture in the selective medium can be obtained as a hybridoma.
  • screening is performed to determine whether antibodies that react with the MOC S protein are present in the culture supernatant of the growing hybridoma. The screening of hypridoromas can be carried out in accordance with usual methods, and is particularly limited. It is not a thing.
  • a portion of the culture supernatant contained in a well grown as a hybrid can be collected and screened by enzyme immunoassay, radioimmunoassay, or the like. Cloning of fused cells is performed by limiting dilution. Finally, a hybridoma that is a cell producing a monoclonal antibody that reacts with the MOCS protein is established.
  • a normal cell culture method As a method for collecting a monoclonal antibody from the hybridoma obtained as described above, a normal cell culture method, ascites formation method, or the like can be employed.
  • hypridoma containing 10% urchin fetal serum in RPMI-1 640 medium, MEM medium, or serum-free medium or other animal cell culture medium (for example, 37 ° C, and incubated 5% C_ ⁇ 7-1 4 days at 2 concentrations), to obtain the culture supernatant antibody.
  • the hive re dormer about 1 X 1 0 7 cells were administered intraperitoneally to the mammal of the same species as the animal from which the myeloma cells are derived, is a large amount proliferating High Priestess de one Ma. Ascites is collected after 1-2 weeks.
  • a known method such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, etc. is appropriately selected, or It can be purified by combining these.
  • the above-mentioned antigen is administered to mammals such as rabbits, mice, and rabbits.
  • the dose of antigen per animal is 0.1 to LOO mg when no adjuvant is used, and 10 to 100 g when adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the immunity interval is There is no particular limitation, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks.
  • enzyme immunoassay enzyme immunoassay (ELISA (enzyme -1 unosorbentassy) or EIA (enzyme unoassay)
  • radioimmunoassay RIA ( radioi mmu noassay)
  • Etc. blood is collected on the day when the maximum antibody titer is shown to obtain antiserum.
  • an antibody (column adsorbed fraction) that reacts with the MO C S 3 protein is collected by applying the polyclonal antibody in the antiserum to an affinity column fixed with the MO C S 3 protein.
  • the reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum against the MOC S 3 protein can be measured by the ELISA method or the like.
  • 2 fragment For example, pepsin or papain
  • Humanized antibodies are described, for example, by Riec hma nn et al. (Riec hma nn J o 1 Biol. Oct 5; 2 0 3 (3): 8 2 5—8, 1 9 8 8), and J ones et al. J ones et al. Nature 3 2 1: 5 2 2-5 2 5, 1 986)).
  • Chimeric antibodies include, for example, “Experimental Medicine (Special issue), V o 1. 1.6, No. 1 0, 1 9 8 8”, Japanese Patent Publication No. 3-7 3 2 8 , Humanized antibodies include, for example, “Nature Genetics, Vol. 15, p. 1 4 6-1 5 6, 1 997”, “Nature Genetics, Vol. 7, p. 1 ⁇ 3-2 1, 1 9 94 '', JP 4-5 0 4 3 6 5 gazette, International application publication WO 9 4-2 5 5 8 5 gazette, etc., ⁇ Nikkei Science, June issue, Pp. 40 to 50, 1 995 "," Nature, Vol. 3 6 8, p. 8 5 6-8 5 9, 1 9 94 " Each can be produced with reference to No.
  • the antibody that binds to the MOCS 3 protein of the present invention can be used for the purpose of, for example, suppressing the growth or metastasis of cancer cells.
  • a human antibody or a human-type antibody is preferred in order to reduce immunogenicity.
  • the antibody When used as a diagnostic agent, the antibody may be labeled with a labeling substance for monitoring or the like (for example, a radioisotope, a fluorescent substance, etc.). If necessary, it can be labeled with radioactive substances, fluorescent compounds, etc. Among the most commonly used fluorescent labeling compounds are fluorescein sothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin and fluorescein. Similarly, the antibody MOCS3 antibody can be labeled using a bioluminescent compound. The presence of a bioluminescent protein is measured by detecting the presence of fluorescence. Important bioluminescent compounds for this purpose are luciferin, luciferase and aequorin.
  • a labeling substance for monitoring or the like for example, a radioisotope, a fluorescent substance, etc.
  • fluorescent labeling compounds are fluorescein sothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin and fluorescein.
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting MCS3 protein or the like present in a sample such as a body fluid or tissue.
  • production of antibody columns used to purify MOCS 3 protein, etc., detection of MOCS 3 protein, etc. in each fraction during purification, analysis of the behavior of MOCS 3 protein in the test cells Can be used for such as.
  • the anti-MOCS 3 antibody used in the present invention may be an agent having neutral activity that attenuates the activity of the antigen in the therapeutic agent or diagnostic agent of the present invention. Depending on the condition, it can be used in combination with other drugs for producing a therapeutic effect. Therefore, in another aspect, the present invention provides a combination of an anti-MOCS 3 antibody and another drug for use in targeted therapy or targeted imaging of cancer (eg, colorectal cancer). Body, composition containing such a complex Etc. are also provided. According to such an embodiment, the anti-MOC S 3 antibody used in the present invention is used to target other drugs having a therapeutic effect or a labeling agent for diagnosis, etc., to highly express the MO CS 3 protein. Can be delivered to.
  • Examples of the “other drug” used in the present invention include a viral vector or a non-viral vector for introducing a gene into a target, such as a radioisotope, a therapeutic protein, or a small molecule drug. .
  • examples of the “radioisotope” include radioactive halogen elements such as fluorine-18, iodine-1225 ( 125I ), and iodine-1313. These radioactive halogen elements can also be widely used as radiotherapeutic agents or radiodiagnostic agents by labeling them with antibodies or peptides in the same manner as the above-mentioned radioactive metal elements. For example, odorization with 125 I or 131 I can be bound to an antibody or antibody fragment by a known method such as the chloramine T method.
  • technetium one 9 9 m for the diagnosis indium one 1 1 1 and gallium one 6 7 (6 7 G a) such,
  • rhenium one 1 8 6 1 S 6 R e
  • rhenium 1 8 8 1 88 Re
  • a metal chelator is usually used.
  • metal chelating agents include EDTA, DTPA, diaminodithio compound, cyclam, and DOTA. These chelating agents may be pre-bonded to the antibody and then labeled with a radioactive metal, or may be labeled with the antibody after forming a radioactive metal chelate.
  • a site force-in that activates cells responsible for immunity is suitable.
  • human interleukin 2 human granulocyte-macrophage colony stimulating factor , Macrophage colony stimulating factor, human interleukin 12 and the like.
  • ricin, diphtheria toxin, etc. are used to directly kill colon cancer cells.
  • the toxins can be used.
  • a fusion antibody with a therapeutic protein a cDNA that encodes the therapeutic protein is linked to a cDNA that encodes the antibody or antibody fragment, and a DNA that encodes the fusion antibody is constructed.
  • a fusion antibody can be produced by inserting the expression vector into an expression vector for organisms or eukaryotes and introducing the expression vector into a prokaryote or eukaryote.
  • “Small molecule drug” is used herein to mean a diagnostic or therapeutic compound other than “radioisotope” or “therapeutic protein”.
  • small molecule drugs include alkylating agents such as nitrogen mustard and cyclophosphamide, antimetabolites such as 5-fluorouracil and methotrexate, daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin, Anticancer agents such as antibiotics such as doxorubicin, plant algaide like vincristine, vinblastine, vindesine, hormonal agents such as evening moxifen, dexamethasone (Clinical Oncology (Japan Clinical Oncology Society 1 9 9 6 Cancer and Chemotherapy company))), or steroids such as cortisone hyde, prednisone, non-sterols such as aspirin and indomethacin, immunomodulators such as gold zomarate and penicillamine, cyclophosphamide , Immunosuppression such
  • daunomycin and antibody can be bound by binding between daunomycin and the amino group of the antibody via dartal aldehyde, or binding of the amino acid group of daunomycin and the antibody's loxyl group via water-soluble calpositimide. For example, the method of combining them.
  • a viral vector modified so as to be able to bind to the anti-MOCS 3 antibody of the present invention can be used (for example, an adenovirus vector (Wang, P., eta 1. (1 9 9 5) Soma tic Celland Mo 1 ec. 2 1, 4 2 9— 44 1), retroviral vectors (N aviaux RK, eta 1. (1 9 9 6) J. Virol 7 0, 5 7 0 1-5 7 0 5), lentiviral vectors ( N aldini, L. (1 9 9 8) Curr. Opin. B iotechnol. 9, 45 7- 46 3)).
  • an adenovirus vector Wang, P., eta 1. (1 9 9 5) Soma tic Celland Mo 1 ec. 2 1, 4 2 9— 44 1
  • retroviral vectors N aviaux RK, eta 1. (1 9 9 6) J. Virol 7 0, 5 7 0 1-5 7 0 5
  • lentiviral vectors
  • Such viral vectors have therapeutic effects such as inducing apoptosis of cancer cells at target sites (eg, colon cancer) such as cell proliferation-related genes, apoptosis-related genes, immune control genes, etc.
  • target sites eg, colon cancer
  • the gene to be played (therapeutic gene) is incorporated.
  • Anti-MOCS3 antibody-binding viral vector when administered to patients in need of gene therapy together with anti-MOCS3 antibody, antigen recognized by anti-MOCS3 antibody (ie MOCS3) Can be targeted to the site where is present.
  • the anti-MOC S 3 antibody and the other drug can be combined chemically or genetically.
  • “chemical bond” includes ionic bond, hydrogen bond, covalent bond, bond by intermolecular force, bond by hydrophobic interaction, etc.
  • “gene engineering bond” For example, it includes the binding mode between an antibody and a therapeutic protein when a fusion protein comprising an antibody and a therapeutic protein is produced using a technique such as genetic recombination.
  • a cancer therapeutic agent containing the MOC S 3 gene expression inhibitor of the present invention a cancer therapeutic agent containing a M OC S 3 protein activity inhibitor, a therapeutic agent containing the anti-MOC S 3 antibody of the present invention
  • the anti-M OC S3 antibody used in the present invention is one of a viral vector or a non-viral vector carrying a radioisotope, a therapeutic protein, a small molecule drug, and a therapeutic gene, or any of these
  • a therapeutic agent that is chemically or genetically engineered with the combination can be formulated based on a known method.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be added as necessary according to a conventional method.
  • surfactants for example, surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters,
  • examples include corrigents, but are not limited to these, and other conventional carriers can be used as appropriate.
  • Specific examples include light anhydrous carboxylic acid, lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinyl alcohol, decylaminoacetate, polyvinyl Examples include pyrrolidone, gelatin, medium-chain fatty acid tridallylide, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, and inorganic salts.
  • Examples of the dosage form of the therapeutic agent of the present invention include tablets, powders, pills, powders, granules, fine granules, soft and hard capsules, film coating agents, and pellets as oral agents. , Sublinguals, pastes, etc. As parenterals, injections, suppositories, transdermal agents, ointments, plasters, liquids for external use, etc. can be mentioned.
  • the dosage form can be selected.
  • the active substance M0 C S 3 protein activity (or MO C S 3 gene expression) inhibitor may be contained in the preparation in an amount of 0.1 to 99.9% by weight.
  • the dose of the active ingredient of the drug of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc.
  • oral administration for example, generally for patients (as 6 O k) About 0.1 mg to l, OO Omg, preferably about 1.0 to; I 0 0 mg, more preferably about 1.0 to 50 mg per day.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organs, symptoms, administration method, etc.
  • patients (for 60 kg) About 0.1 to 3 O mg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg is conveniently administered by intravenous injection.
  • the final decision can be made as appropriate based on the judgment of a doctor or veterinarian in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptoms, and the like.
  • the preparation thus obtained can be administered to, for example, humans and other mammals (eg, rat, rabbit, hidge, buyu, ushi, cat, inu, monkey, etc.). In the case of animals other than humans, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • mammals eg, rat, rabbit, hidge, buyu, ushi, cat, inu, monkey, etc.
  • the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the therapeutic agent of the present invention is cancer (for example, colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder).
  • cancer for example, colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder.
  • Prevention / treatment of uterine cancer eg cervical cancer, endometrial cancer
  • testicular cancer eg cervical cancer, endometrial cancer
  • thyroid cancer spleen cancer
  • ovarian cancer brain tumor, blood tumor, etc.
  • the drug of the present invention contains a MCS3 protein activity inhibitor or MCS3 gene expression inhibitor as an active ingredient, it can be used as an anticancer agent, a cancer metastasis inhibitor, a cancer cell apoptosis inducer, or the like. Can be used.
  • the target cell, tissue, organ, or cancer type is not limited to a specific type.
  • the agent of the present invention is both a MOCS 3 protein activity inhibitor and a MOCS 3 gene expression inhibitor. May be included.
  • an antisense nucleic acid When an antisense nucleic acid is used in the therapeutic agent of the present invention, the antisense nucleic acid is inserted alone or into an appropriate vector such as a retroviral vector, an adenoviral vector, an adenoviral association virus vector, Administration can be according to known means.
  • Antisense nucleic acids can be formulated alone or with a physiologically acceptable carrier and administered via a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.
  • a virus vector such as a recombinant adenovirus particle and an anti-MOCS 3 antibody
  • these may be used alone, but in general, pharmaceuticals are used.
  • an acceptable carrier include those already described above.
  • Body and aqueous isotonic solutions such as water, saline, glucose, human albumin are preferred.
  • additives, preservatives, preservatives, balance, etc. that are usually used in pharmaceutics can also be added.
  • the pharmaceutical composition thus prepared can be administered by an appropriate administration form and administration route depending on the disease to be treated.
  • administration forms include emulsions, syrups, force capsules, tablets, granules, injections, ointments and the like.
  • administering usually from 10 3 to 10 15 virus particles are administered once per adult. However, it may be changed depending on the disease state and the nature of the target cell / tissue.
  • the administration frequency may be once to several times a day, the administration period may be from 1 day to several months or more, and one set is set to 1 to several times, and many sets are administered intermittently over a long period of time. May be.
  • viral vector particles or viral vector nucleic acid molecules used in the present invention can be used for detection of specific cells and / or tissues, or diagnosis of disease states.
  • viral vector particles obtained by incorporating a detectable marker gene into a viral vector nucleic acid molecule and transfecting it into an appropriate host cell can be combined with an anti-MOCS 3 antibody to detect and diagnose tumor cells.
  • an anti-MOCS 3 antibody can be combined with an anti-MOCS 3 antibody to detect and diagnose tumor cells.
  • it can be used for Alternatively, it can be used to detect and diagnose tumor cells by binding a detectable label to the anti-MCS3 antibody.
  • the present invention also provides a diagnostic agent for cancer.
  • the diagnostic agent for cancer of the present invention comprises (a) an antibody against the MOCS 3 protein, or (b) a condition under high hydration conditions stringent to the base sequence of the MOCS 3 gene or a part thereof. It contains a polynucleotide having a base sequence that can be hyperprimed in. Diagnostic agent and diagnostic method using antibody MOCS 3 antibody Since antibodies against MCS CS protein can specifically recognize MOCS 3 protein, etc., MOCS 3 protein in the test solution can be quantified.
  • the diagnostic method using the anti-MOCS 3 antibody of the present invention includes, for example, (a) a step of bringing a subject-derived biological sample into contact with an antibody against the MOCS 3 protein, and (b) the sample.
  • the labeled anti-MOCS 3 antibody is used to detect and Z or quantitate the binding of MCS3 protein or a fragment thereof to the anti-MOCS 3 antibody. .
  • subject-derived biological sample refers to a subject-derived tissue, cell, or body fluid (eg, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.), urine, lymph fluid, saliva, sweat, semen Etc.)
  • a “subject” is usually a human subject who has or is expected to undergo a cancer screening, such as a human subject who has or is suspected of having cancer. included .
  • cancers are colon cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterus.
  • cervical cancer endometrial cancer
  • testicular cancer thyroid cancer, knee cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc. preferable.
  • Immunoassays for detecting the expression of MOCS 3 in a biological sample derived from a subject as described above are based on the ability to suspect cancer (eg, colorectal cancer), and from a subject who is at risk for cancer.
  • the method includes contacting the collected biological sample with an anti-MOCS 3 antibody under conditions that cause binding of a specific antigen and an antibody, and then measuring the amount of immunospecific binding by the antibody. Using such antibody binding, the presence and Z or increased expression of the MOCS 3 protein is detected. In this case, detection of increased MOCS 3 protein expression is an indicator of disease state. If necessary, compare the level of MOCS 3 protein in the biological sample with that of healthy individuals without cancer. Also good.
  • a biological sample such as a serum sample is contacted with a solid support or carrier such as nitrocellulose for the purpose of immobilizing all proteins present in the sample.
  • the support is then washed with buffer and subsequently treated with detectably labeled anti-MOCS 3 antibody.
  • the solid support is then washed twice with buffer to remove unbound antibody.
  • the amount of bound antibody on the solid support is measured according to well-known methods.
  • the detection conditions suitable for each measurement can be appropriately determined by those skilled in the art using conventional test methods.
  • the antibody is conjugated to an enzyme, such as that used in the enzyme immunoassay (EIA) [Voi 1 er, “The Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” (ELISA), 1 9 7 8, Diagnostic Holyzons, 2: 1 ⁇ 7, M icrobiological A ssociates Quarterly Pub 1 ication, Walkersvi 1 1 e.MD; V. oi 1 er, A. by J. Clin. Pathol., 3 1: 5 0 7-5 2 0, 1 9 7 8: B Utier, J. E. by Me t.
  • EIA enzyme immunoassay
  • Enzymes that bind to antibodies can be visualized by, for example, spectrophotometric measurements.
  • an appropriate substrate, preferably chromogenic Enzymes that can be used to attach detectable labels to antibodies include, but are not limited to, peroxidase and alkaline phosphatase. This can be achieved by a colorimetric method using a chromogenic substrate.
  • radioimmunoassay RIA
  • sandwich immunoassay immunometric method
  • FIA fluorescence immunoassay
  • T RFIA time-resolved fluorescence immunoassay
  • EIA enzyme immunoassay
  • LIA luminescence immunoassay
  • ELIA electrochemiluminescence immunoassay
  • latex agglutination method immunoprecipitation Atssey, sedimentation reaction method, gel diffusion sedimentation reaction method, immunology Examples include a diffusion assay, an agglutination assay, a complement binding assay, an immunoradiometric assay, a fluorescence immunoassay, and an immunoassay selected from the group consisting of a protein A immunoassay (WO 0 0/1 42 2 7 gazette page 3 9 line 25 to page 4 2 line 8 line EP 1 1 1 1 1 04 7 A 2 paragraph [0 1 1 5] page 1 9 page 3 Line 5 to page 20, line 47
  • various diseases associated with MO CS 3 protein dysfunction can be diagnosed by using the in vivo MOCS 3 protein quantification method using the antibody of the present invention.
  • an increase in the concentration of MOC S 3 protein is detected, it may be caused by, for example, a disease caused by overexpression of MO CS 3 protein (eg, cancer (eg, colorectal cancer)).
  • a disease caused by overexpression of MO CS 3 protein eg, cancer (eg, colorectal cancer)
  • the anti-MCS3 antibody of the present invention can also be used for diagnosis by i n v i v o.
  • the preparation and use of antibody preparations that can be used herein are well known in the art.
  • antibody-chelating agents are described in Nuc 1. Med. Biol. 1 9 9 0 1 7: 2 47-2 54.
  • An antibody having a paramagnetic ion as a label used in magnetic resonance imaging is described in, for example, MagnneticReso nance Medi medine 1 9 9 1 2 2: 3 39 9-342. 5.2 Diagnostic agents and diagnostic methods using polynucleotide (eg, DNA) probes
  • a probe or primer designed based on the nucleotide sequence of the MCS3 gene can be used.
  • a diagnostic method includes, for example, (a) a biological sample derived from a subject, Contacting the nucleotide sequence of the MOCS 3 gene or a fragment thereof with a polynucleotide (probe) having a base sequence capable of being pre-primed under stringent high-prediction conditions; and (b) in the sample And a step of detecting and / or quantifying the hybridization of the polynucleotide with MOCS 3 gene or a fragment thereof.
  • the DNA of MO C S 3 gene (or a gene fragment thereof) in a biological sample derived from a subject is detected and Z or quantified using the probe.
  • the length of the base sequence used as a probe is, for example, 12 bases or more, 15 bases or more, 18 bases or more, 21 bases or more, 24 bases or more, 27 bases or more, 30 bases or more, or even longer It may be a polynucleotide fragment of length.
  • the low, medium or high stringency conditions described above may be used.
  • the “base sequence capable of hybridizing under hybridization conditions stringent to the base sequence of the MOCS 3 gene or a fragment thereof” includes the base sequence of the MCS3 gene or a fragment thereof.
  • a target sequence can be detected or quantified using a known method using a specific polynucleotide probe or primer for the MCS3 gene.
  • known methods include Southern hybridization, Northern hybridization, RT-PCR method, PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, 8 7 4-8 7 9 (1 9 8 9)), Proceedingsofthe National A cad emy of Sciencesofthe Un ited Statesof Am erica, Vol. 86, 2 7 6 6-2 7 70 (1 9 8 9)), FI SH method, DNA chip or array C GH (Comparative Genetic Hybridization) method, etc. Can be used. Quantitative detection can be performed by quantitative RT-PCR.
  • the array C GH method is an application of the chromosomal C GH method (Ka 1 1 ioniemi, A. eta 1. (1 9 9 2) Science 2 5 8, 8 1 8— 8 2 1).
  • a DNA chip on which genomic DNA fragments (BAC, PAC, YAC, etc.) covering the chromosomal region are spotted at high density slide the cancer-derived DNA labeled with different dyes and normal DNA. It is a method to detect the DNA copy number abnormality in cancer with high resolution by simultaneously performing hybridization on the above genomic DNA fragment and detecting its binding state (Pinke 1, D. eta 1. (1 9 9 8) N at. G enet. 2 0, 2 0 7-2 1 1).
  • the mRNA level of MC S3 in the cell is determined based on the standard gene (housekeeping gene (for example, Shaper, NL et al., J. Mammary, G land B iol. N eop 1 asia 3 (1 9 9 8) 3 1 5-3 24; Wu, YY and Rees, J. L., A cta D e rm. V enereol. 8 0 (2 0 0 0) 2-3) mRNA levels can be compared, preferably by RT-PCR.
  • the standard gene housekeeping gene (for example, Shaper, NL et al., J. Mammary, G land B iol. N eop 1 asia 3 (1 9 9 8) 3 1 5-3 24; Wu, YY and Rees, J. L., A cta D e rm. V enereol. 8 0 (2 0 0 0) 2-3) mRNA levels can be compared,
  • the target sequence (DNA, mRNA, etc.) is detected and quantified by the above-mentioned method and overexpression of the MOC S 3 gene is confirmed, for example, a disease caused by overexpression of MOC S 3 (for example, (Eg, colorectal cancer, cervical cancer)) or is likely to be affected in the future.
  • a disease caused by overexpression of MOC S 3 for example, (Eg, colorectal cancer, cervical cancer)
  • the present invention also provides a kit for detecting and / or quantifying a MOCS 3 protein or a fragment thereof in a body fluid sample of a subject containing an anti-MOCS 3 antibody as a cancer marker. Furthermore, the MOCS 3 gene or a fragment thereof in a biological sample derived from a subject, which contains a base sequence that can be hybridized under stringent high prehybridization conditions to the MOCS 3 gene or a part of the base sequence thereof, is cancerated. It also provides kits for detection and Z or quantification as markers. These kits are used to detect cancer cancer by the above-described immunological technique or hybridization method.
  • cancers examples include colon cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterus.
  • Cancer eg cervical cancer, endometrial cancer
  • testicular cancer thyroid cancer, knee cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc. preferable.
  • cancer marker refers to a subject's body fluid (eg, blood, urine, lymph fluid, saliva, sweat, semen, etc.) or cells or tissues that are not derived from normal tissue, or A molecule that is selectively upregulated in cancer cells or tissues, and that the presence of the molecule in the body fluid or cells or tissues of a subject indicates or indicates the presence of cancer.
  • body fluid eg, blood, urine, lymph fluid, saliva, sweat, semen, etc.
  • a molecule that is selectively upregulated in cancer cells or tissues indicates or indicates the presence of cancer.
  • the kit according to the first aspect contains a component for detecting and / or quantifying the M O C S 3 antigen (including M O C S 3 protein and its partial peptide) in a body fluid sample from a subject.
  • a component for detecting and / or quantifying the M O C S 3 antigen including M O C S 3 protein and its partial peptide
  • MOCS 3 protein is detected and Z or quantified by ELISA
  • Such components detect and Z or quantitate the level of MOCS 3 in, for example, tissue sections or body fluid samples such as blood and urine Can be used for.
  • Such antibodies may be labeled with radioactivity, fluorescence, colorimetry, or enzyme labeling.
  • the kit of the present invention may contain a labeled secondary antibody.
  • the kit according to the second aspect is a hybridizer under high-precipitation conditions stringent to the MOCS 3 gene or a part of its nucleotide sequence.
  • a polynucleotide comprising a base sequence that can be synthesized is contained.
  • the kit of the present invention may contain the above polynucleotide immobilized on a DNA chip.
  • the kit of the present invention is typically a container in addition to an anti-MOC S 3 antibody, MCS3 gene or a part of the base sequence that can be hybridized under stringent high-precipitation conditions. And label.
  • the label on or with the container may indicate that the drug is used to detect a colorectal cancer marker.
  • other items such as instructions for use, labeled secondary antibodies, and the like may be further included.
  • Example 1 Identification of colon cancer specific amplification gene by array C GH method
  • sample preparation of 200 colorectal cancer specimens and verification based on the array CGH method were performed.
  • Fig. 1 is a histogram showing the frequency of the MCS3 gene relative to the degree of amplification in 200 colorectal cancer patients.
  • Table 2 shows the degree of amplification (GZR value) and frequency of 200 samples of colon cancer patients with MOC S 3 gene. The average value is the average value for samples with a GZR value of 1.2 or higher. is doing.
  • Example 2 Verification of the degree of gene amplification in a colon-derived cultured cell line
  • the degree of amplification in a colon cancer-derived cultured cell line was verified for a high-frequency gene region in colon cancer patients.
  • the cultured cell line used was RKOE 6, Caco 2, which is a colorectal cancer-derived cell line.
  • Genomic DNA was extracted from the cultured cells according to the protocol attached to the kit using Blood & Cel lCu lure DNA Kit (QIAGEN).
  • Table 3 shows the degree of amplification (GZ R value) of the MCS3 gene in a cell line derived from colorectal cancer. As shown, in the colon cancer-derived cell line, it was found that amplification occurred in the MCS3 gene located in BAC Clone RP 1 1-3 79 D 4. (Table 3)
  • Quantitative PCR was performed to confirm the amplification of the MOCS3 gene region. Quantitative PCR was performed using S YB RG reen RT—PCRR eaents Applied B iosys terns) according to the attached protocol. ied Biosyst ern s). Primers were synthesized using the following sequences (commissioned to OPERON).
  • Table 4 shows the degree of amplification of the MO CS 3 gene in a colon cancer-derived cell line. Values are relative to control DNA (normal). As shown, in the colon cancer-derived cell line, it was found that amplification occurred in the MOCS 3 gene region. (Table 4)
  • the MO C S 3 gene which was frequently amplified in 200 colorectal cancer patients, is a colorectal cancer-derived cell line, and
  • RNAi analysis was performed and the phenotype was observed.
  • the cell line was purchased from ATCC and cultured according to the attached protocol.
  • siRNA we selected specific 21mer in the gene and synthesized siRNA targeting the sequence (commissioned to QIAGEN).
  • siRNA introduction into RKOE 6 cells Oligofectamine (Invitrogen) was used, and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ si RNA was introduced into the cells according to the attached protocol. N egative control RNA (QI AGEN) was used as a control. The cells were observed under an inverted microscope for 4 days after introduction into the cells.
  • cDNA was synthesized according to the attached protocol by using Su pe r s c r i p t I I I F i r s t—S t r a n d S y n t h e s i S S y s t em f o r RT—P C R (I n v i t ro g e n).
  • Quantitative RT-PCRR was performed using this cDNA as a saddle. Quantitative PCR was performed using S YB RG reen RT— PCRR eaents (A p ⁇ 1 ied B iosys t ern s), according to the attached protocol. 7 5 0 0 R eal — T i me PCRS yst ern ( (Applied Biosys terns)). Primer 1 synthesized the following sequence (consigned to O P ERON) and used it.
  • GAPDH G lyceraldehyde— 3—phosphatedehydrogenas e
  • Control Reagents Ap plied B ios yst em s was used to determine the expression level of GAPDH and the relative ratio was calculated
  • si RN A The number of viable cells after introduction of A 1 Amar Blue (Biosource) and Wa 1 1 ac 1 4 2 0 Mu ltilabel / L um inescence Coutor ARVO (P erkin E l me r). Result
  • RNAi analysis of the MOC S 3 gene was performed using RKO E 6 which is a cell line derived from colorectal cancer.
  • Fig. 3 shows the results of quantitative RT-PCRR after 24 hours of siRNA of the MOCS3 gene in RK o E6 cells and harvesting the cells 24 hours later.
  • the relative amount of N C was shown using the relative ratio of GAP DH.
  • the effect of RNA level was confirmed by quantitative RT-PCR.
  • the expression level of all three types of siRNA was significantly reduced (Fig. 3).
  • Fig. 4 shows the results of measuring the number of viable cells with the measurement reagent using the cells on the 4th day after Transfection of MO CS 3 gene siRNA to RKO E6 cells.
  • the graph shows the relative amount to NC.
  • the number of viable cells was measured, and as with the phenotype, the number of cells was significantly reduced compared to N egative Control (NC) ( ( Figure 4)
  • All three siRNAs (a, b, c) of the MOC S 3 gene were significant (p ⁇ 0. 0 1) in the t-test.
  • Example 4 Functional analysis by RNAI analysis using a colon-derived normal cell line
  • the RNAI analysis was performed using a cell line derived from a normal tissue of the large intestine. Has been verified to be cancer specific.
  • the cell line used was C CD 1 8 CO 2 purchased from AT C. The culture conditions were in accordance with the attached protocol. The a sequence of Example 3 was used as the siRNA used.
  • L i p o f e c t a min e 20 00 (Inv i t r o g e n) was used, and 25 n M of siRNA was introduced into the cells according to the attached protocol.
  • N at i v e C o n t r o ls i RNA Q I AG E N
  • the cells were observed under an inverted microscope for 5 days after introduction.
  • RNA i The effects of RNA i on the MO C S 3 gene in the cell line C CD 18 C o derived from normal colon tissue are as follows.
  • FIG. 5 shows an observation image obtained on the 5th day after Transfection of MOC S3 gene siRNA on CD 18 Co cells (upper: X 40; lower: X 2 200).
  • a, b, and c are the si RNs of the MOC S 3 gene A 3 types, NC indicates negative control. As shown, phenotypic observations were almost the same as NC, and no effect was observed (Figure 5).
  • Figure 6 shows the results of quantitative RT-PCR after cells were collected 24 hours after transcription of siCNA3 of McCS3 gene to CCD18CO cells.
  • the relative amount to NC was shown using the contrast of GAPDH.
  • Figure 7 shows that after the transfection of the siRNA of the MOC S 3 gene in CCD18 CO cells.
  • Fig. 5 shows the results of measuring the number of viable cells with the measurement reagent using the cells on day 5.
  • the graph shows the relative amount with respect to NC, and as in the phenotype, it is almost the same as that of Negative Control (NC). No effect was observed (Fig. 7).
  • the organ-specific expression of the M0CS3 gene in normal tissues was performed by the Northern hyperprecipitation method known in the art.
  • Fig. 8 is a photograph showing the results of Northern high pri- dialysis performed using various normal organ tissues. As shown in the figure, a band was observed around 2.5 kb in the testis, and the expression level of other organs was confirmed to be small. The expression level is small in normal tissues and testis-specific, so it can be estimated that the effects of drugs targeting this gene are small on normal tissues.
  • Example 6 Evaluation of gene amplification
  • the FISH method was used to evaluate the occurrence of gene amplification in the M0CS3 gene region in cancer cells of the specimen tissue. result
  • Figure 9 is an optical micrograph (fluorescence image) of a portion of the observed cancer cells (for 6 cells). As shown, more than 3 spots of signal were found in cancer cells. It was confirmed that the M0CS 3 gene region was amplified in 10 specimens whose gene amplification degree (G / R) was 1.2 or more by the array CGH method. It was also shown that gene amplification occurred from the early stage to the late stage of the disease state. This indicates that the M0CS3 gene region can be applied not only as a molecular target for cancer therapeutics, but also for cancer diagnosis by the FISH method.
  • Example 7 Evaluation of cancer specificity
  • the M0CS 3 gene was expressed in cancer specimen tissues by immunostaining methods known in the art.
  • FIG. 10 shows the results of immunohistochemical evaluation of the expression of M0C S 3 gene protein in cancer cells of the specimen tissue. As shown in the figure, it was confirmed that it was expressed specifically in the cancerous part. Staining was observed in epithelial cells with irregularly-structured overlapping nuclei in poorly differentiated glandular cancer. On the other hand, there was no staining in the lamina intestinal gland where the cells were well-ordered.
  • the M0CS3 gene knockdown showed a growth-inhibiting effect.
  • the effect of the cervical cancer cell line was evaluated by the RNAi analysis method described above.
  • RNAi analysis was carried out in the same manner as described in Example 3 using the above three siRNAs (Example 3: Table 5).
  • siRNA Oligofeminte (Invitrogen) was used, and siRNA of ⁇ was introduced into the cells according to the attached protocol.
  • siRNA negative RNA Co nt r o 1 si RNA (Q I AGEN) was used. Result
  • Fig. 11 shows the results of measuring the number of viable cells with the measuring reagent using the cells on the 4th day after Transfectioion of MCS3 gene siRNA on HeLa cells.
  • the graph shows the relative amount to NC.
  • siRNAs (a, b, c) of MCS3 gene 15% of siRNA b and 25% of siRNA c were inhibited. Significant in 0.01 t test).
  • Serum specimens of colorectal cancer patients 10 L and healthy subject serum specimens 10 / xL were diluted with 500 L of diluted buffer solution (lOmM Tris HC1 ph 7.4 + 150 mM NaCl), then ProteomeLab IgY-12 SC Proteome partitioning kit (BECKMAN COULTER: A24618) was used to remove serum abundant proteins such as albumin and globulin. Dithiothreitol (Wako: 049_08972) was added to the obtained fraction to a final concentration of 10 mM, and the reduction reaction was performed at 60 ° C for 30 minutes.
  • odoacetamide SIGMA: 144-48-9
  • SIGMA 144-48-9
  • the alkylation reaction was carried out at room temperature for 30 minutes in the light-shielded state.
  • add 4 times the volume of cold acetone Wako: 014-08681, -20 ° C
  • the recovered protein was dissolved in 80 zL of 2M urea + lOOmM ammonium bicarbonate solution. After dissolution, a portion was subjected to protein concentration measurement by the BCA method. Trypsin (Promega: V511C) was added to the sample protein at 1/50 (w / w), and digestion was performed at 37 ° C for 16 hours.
  • the sample separated by Nano-HPLC is PicoTip (New Object: FS360-20- 10-D-20) and introduced continuously into an ion trap mass spectrometer directly connected.
  • HCT Plus Bruker Dal tonics
  • the sample was ionized under the conditions of a capillary voltage of 1500 V, an end plate offset value of 500 V, a dry gas flow rate of 12 L / min, and a dry gas temperature of 250 ° C.
  • the ion trap was set to capture 2 Da before and after the target m / z, and MS / MS analysis was performed in MRM mode.
  • Figures 13 A and B show the results of analysis of the above methods for (A) serum from colon cancer patients and (B) serum from healthy subjects, respectively.
  • Figures 14A to C show the correspondence between the peaks shown in Figure 13 and amino acids (or amino acid sequences) determined by MS / MS analysis.
  • an ion peak corresponding to the fragment ion of the target molecule was clearly observed in the serum from colon cancer patients. That is, as shown in FIG. 14B, a partial sequence called EPSL LQ is determined at least from the C-terminal side. Since it corresponds to the amino acid sequence at position 3, the target peptide fragment (SEQ ID NO: 1 3) at amino acid sequences 3 2 6 to 3 3 5 was identified. Such an ion peak corresponding to the partial sequence was not found in the analysis using the serum of healthy subjects (see Fig. 14C). Therefore, it is strongly suggested that this target molecule (ie, MO CS 3 protein) may have increased cancer abundance specifically in cancer.
  • Example 10 Evaluation of specificity in various cancer types
  • Whether the M0CS3 gene was expressed in organ cancers other than colorectal cancer was determined by an immunostaining method known in the art.
  • Immunohistochemical staining was performed with anti-M0CS3 gene polyclonal antibody using Multiple organ cancer tissue microarray for testing tumor tissue specificity of therapeutic antibodies (US Bioma), in which 96 samples of cancer tissues from 35 organs were placed. .
  • the immunohistochemical staining method was revised to YamasMta S & Okada Y. (2005) J Histochem Cytochem. Nov; 53 (11): 1421-32 for the activation method, and Watanabe / Nakano enzyme antibody method was revised for the staining method. According to the 4th edition (interdisciplinary planning). Usagi IgG was used as a negative control. MM.
  • Fig. 15-1 and Fig. 15-2 show the expression of the stomach (A: stomach), colon (B: colon), rectum (C: rectum), retina (D: epiploon). ), Lung (E, F, G: lung), ovary (I, J: ovary), prostate (L: prostate), lymph node (M: Lymp node), bone tissue (O: bone), and mediastinum ( R: mediastinum).
  • H milk
  • spleen K: spleen
  • throat P
  • Q adipose tissue
  • M0CS3 is upregulated in a wide range of cancer types. This suggests that M0CS3 has shown cancer specificity as a molecular target for cancer therapeutics, and can be applied to a wide range of cancer types, not just colorectal cancer. It was. This also applies to cancer diagnosis, suggesting the significant effectiveness of M0CS3.
  • the present invention provides a therapeutic agent for cancer, a diagnostic agent, a diagnostic method, a therapeutic method, and a kit used therefor. Therefore, the present invention is useful in fields such as cancer diagnosis or targeted therapy.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

A therapeutic agent for cancer comprising an inhibitor of the expression or activation of MOCS3 protein; a method for screening a compound that can be used as an active ingredient of the therapeutic agent; an antibody directed against MOCS3 protein; an agent or method for diagnosis of cancer using the antibody or the like; and others.

Description

明細書  Specification
MO C S 3遺伝子の治療的又は診断的用途 技術分野 Therapeutic or diagnostic use of MO C S 3 gene
本発明は、 がんにおいて特異的に増幅している遺伝子である M〇 C S 3遺伝子、 その治療的又ほ診断的用途などに関する。 背景技術  The present invention relates to the MCS3 gene, which is a gene specifically amplified in cancer, and its therapeutic or diagnostic use. Background art
悪性腫瘍 （がん） の特徴として、 増殖 ·浸潤 ·転移を経て全身化する ことによる致死があげられる。 外科的な切除または放射線治療のような 局所療法では、 転移性再発がんに対して十分な対処はできず、 全身療法 である薬物療法の発展が、 今後のがん治療成績の向上に期待されている がん薬物療法の現在の中心である化学療法は、 直接がん細胞の DNA および/または RN Aに作用し、 細胞を死に至らせる殺細胞薬剤を用い る場合が多いが、 がん細胞以外の、 例えば、 骨髄細胞、 生殖細胞、 毛母 細胞、 消化管上皮細胞など分裂がさかんな正常細胞に対しても作用し、 強い副作用をもたらしていた。 一方、 近年の分子細胞生物学の進歩によ り、 がん細胞の浸潤 ·増殖 ·転移などにかかわるメカニズムが解明され 、 そのがん細胞の特定メカニズムに特異的に作用する分子標的薬の開発 が注目されている。 代表例として、 非小細胞肺がんの治療に効果のある 、 E GF R (上皮成長因子 受容体） チロシンキナーゼ阻害剤であるィ レッサ （一般名 ：ゲフイチニブ） （WO 9 6/ 3 3 9 8 0) 、 乳がんの 治療に効果のある、 HE R— 2 (ヒト上皮成長因子受容体 2) のヒト化 モノクローナル抗体のハーセプチン （一般名 ： トラスッズマブ） （W〇 94/0 0 1 3 6) などがあげられる。 しかしながら、 現状では未だ有 効な分子標的薬は少なく、 今後更なる各がん種に対する有効な分子標的 薬の開発が望まれている。 日本人の大腸がんは年々増加の傾向にあり、 死亡数は、 肺がん、 胃が んに次いで 3位になっている。 年齢別では 6 0歳代が一番多く、 次いで 5 0歳代、 7 0歳代の順である。 大腸がんの増加の原因には、 遺伝的要 因、 環境的要因などが考えられるが、 食生活の西欧化、 特に動物性脂肪 の取りすぎが原因ではないかと指摘されている。 大腸がんの有効な分子 標的薬の開発が待たれている。 また、 診断に用いられている腫瘍マーカ 一 （C EA， C A 1 9 - 9) は、 進行大腸がんであっても約半数が陽性 を示すのみで、 臓器特異性も無く、 より高性能な診断薬の開発が望まれ ている。 発明の開示 Malignant tumors (cancers) are characterized by lethality due to generalization through proliferation, invasion, and metastasis. Local therapies such as surgical resection or radiotherapy cannot adequately address metastatic recurrent cancer, and the development of systemic pharmacotherapy is expected to improve the outcome of cancer treatment in the future. Chemotherapy, which is the current center of cancer drug therapy, often uses cell killing agents that act directly on the DNA and / or RNA of cancer cells and cause cell death. For example, bone marrow cells, germ cells, hair matrix cells, and gastrointestinal epithelial cells also acted on normal cells with many divisions, resulting in strong side effects. On the other hand, recent advances in molecular cell biology have elucidated the mechanisms involved in cancer cell invasion, proliferation, and metastasis, and the development of molecular targeted drugs that specifically act on the specific mechanism of cancer cells. Attention has been paid. As a representative example, EGFR (epidermal growth factor receptor) tyrosine kinase inhibitor ylessa (generic name: gefitinib) effective in the treatment of non-small cell lung cancer (WO 9 6/3 3 9 80) Herceptin (generic name: trastuzumab) (W〇94 / 0 0 1 3 6), a humanized monoclonal antibody of HE R-2 (human epidermal growth factor receptor 2), which is effective in the treatment of breast cancer . However, there are still few effective molecular targeted drugs at present, and further development of effective molecular targeted drugs for each cancer type is desired in the future. Japanese colorectal cancer is increasing year by year, and the number of deaths is third after lung cancer and gastric cancer. By age, 60s is the most common, followed by 50s and 70s. The cause of the increase in colorectal cancer may be due to genetic factors or environmental factors, but it has been pointed out that it may be due to westernization of the diet, especially excessive consumption of animal fat. Development of an effective molecular target drug for colorectal cancer is awaited. In addition, about half of the tumor markers used for diagnosis (C EA, CA 19-9) are positive even in advanced colorectal cancer, with no organ specificity, and higher performance diagnosis. Drug development is desired. Disclosure of the invention
上記のような状況下で、 がんを治療および/"または診断するための新 たな薬剤または方法が求められている。  Under such circumstances, there is a need for new drugs or methods for treating and / or diagnosing cancer.
特に、 がんに対して特異性の高い治療薬および/または診断薬が求め られている。  In particular, there is a need for therapeutic and / or diagnostic agents that are highly specific for cancer.
上記のような状況に鑑み、 本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 が ん （例えば、 大腸がん） において高頻度に増幅が起きている遺伝子が、 MOC S 3遺伝子であることを見出した。 本発明者らはさらに、 大腸が ん細胞株ならびに子宮頸がん細胞株において MO C S 3タンパク質の発 現を阻害することによって、 癌細胞の増殖を抑制し得ることを見出し、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明は、 以下に記載するがん 治療剤、 がん抑制作用を有する候補物質のスクリーニング方法、 がん診 断剤、 がん診断用キッ ト、 がんの診断方法などを提供する。  In view of the above situation, as a result of intensive studies, the present inventors have found that the gene that is frequently amplified in cancer (eg, colorectal cancer) is the MOC S 3 gene. I found it. The present inventors have further found that cancer cell proliferation can be suppressed by inhibiting the expression of MOCS 3 protein in colorectal cancer cell lines and cervical cancer cell lines, thereby completing the present invention. It came to. That is, the present invention provides the following cancer therapeutic agents, screening methods for candidate substances having a cancer-suppressing activity, cancer diagnostic agents, cancer diagnostic kits, cancer diagnostic methods, and the like.
( 1 ) OC S 3遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん 治療剤。  (1) A therapeutic agent for cancer comprising an OC S 3 gene expression inhibitor as an active ingredient.
(2) 上記 MOC S 3遺伝子の発現阻害物質が、  (2) The MOC S 3 gene expression inhibitor is
(a) MOC S 3遺伝子の発現を RN A i効果により阻害する作用を 有する核酸、  (a) a nucleic acid having an action of inhibiting the expression of the MOC S 3 gene by the RN Ai effect,
(b) MOC S 3遺伝子もしくはその一部、 またはその転写産物に対 するアンチセンス核酸、 (b) For the MOC S 3 gene or part of it, or its transcript Antisense nucleic acid,
( c ) MOC S 3遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、  (c) a decoy nucleic acid for the MOC S 3 gene or part thereof,
(d) MO C S 3遺伝子またはその一部に対してドミナントネガティ ブに作用する MOC S 3遺伝子変異体  (d) MOC S 3 gene mutant that acts dominantly on the MO C S 3 gene or a part thereof.
(e) MOC S 3遺伝子の転写産物を特異的に切断するリポザィム活 性を有する核酸、  (e) a nucleic acid having a liposomal activity that specifically cleaves the transcript of the MOC S 3 gene;
および and
( f ) MO C S 3遺伝子の転写または M〇 C S 3 mRNAの翻訳を 阻害する化合物 （上記核酸を除く）  (f) Compounds that inhibit transcription of MO C S 3 gene or translation of M〇 C S 3 mRNA (excluding nucleic acids above)
からなる群から選択される物質を含む、 上記 （ 1 ) に記載のがん治療剤 The cancer therapeutic agent according to (1) above, comprising a substance selected from the group consisting of
(3) MOC S 3タンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有する がん治療剤。 (3) A cancer therapeutic agent comprising a MOC S 3 protein activity inhibitor as an active ingredient.
(4) 上記 MOC S 3タンパク質の活性阻害物質が、  (4) The MOC S 3 protein activity inhibitor is
( a) 該 MO C S 3タンパク質に対する抗体、  (a) an antibody against the MO C S 3 protein,
(b) 該 M〇 C S 3タンパク質に対してドミナントネガティブの性質 を有する MO C S 3タンパク質変異体、 および、  (b) a MO C S 3 protein variant having a dominant negative property with respect to the M0 C S 3 protein, and
(c ) 該 MOC S 3タンパク質に結合する化合物 （上記抗体および変 異体を除く）  (c) Compound that binds to the MOC S 3 protein (excluding the above-mentioned antibodies and variants)
からなる群から選択される物質を含む、 上記 （ 3) に記載のがん治療剤 The cancer therapeutic agent according to (3) above, comprising a substance selected from the group consisting of
( 5) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 上記 （ 1 ) 〜 （ 4) のいずれかに記載のがん治療剤。 (5) The cancer therapeutic agent according to any one of (1) to (4) above, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.
(6) MOC S 3遺伝子の発現阻害物質をスクリーニングする方法であ つて、  (6) A method for screening for an MOC S 3 gene expression inhibitor,
(a) MOC S 3遺伝子を発現する細胞に、 被検化合物を接触させる 工程、  (a) a step of contacting a test compound with a cell expressing the MOC S 3 gene,
(b) 該 MOC S 3遺伝子の発現レベルを測定する工程、 および (b) measuring the expression level of the MOC S 3 gene; and
(c ) 被検化合物を接触させない場合と比較して、 該発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程を包含する、 スクリ一二ング方法。(c) Compared with the case where the test compound is not contacted, the expression level is low. A screening method comprising a step of selecting a compound to be reduced.
( 7 ) M〇 C S 3夕ンパク質の活性阻害物質をスクリ一二ングする方法 であって、 (7) A method for screening a substance that inhibits the activity of MOO C S 3 protein,
(a) MO C S 3夕ンパク質と被検化合物とを接触させる工程、 (b) 該 MOC S 3タンパク質と被検化合物との結合活性を測定する 工程、 および  (a) contacting the MO C S 3 protein with a test compound; (b) measuring the binding activity between the MOC S 3 protein and the test compound; and
( c ) 該 MO C S 3夕ンパク質と結合する化合物を選択する工程を包 含する、 スクリーニング方法。  (c) A screening method comprising a step of selecting a compound that binds to the MOCS 3 protein.
(8) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 上記 （6) また は （7 ) に記載の方法。  (8) The method according to (6) or (7) above, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.
( 9) MO C S 3タンパク質に対する抗体。  (9) An antibody against the MO C S 3 protein.
( 1 0 ) 上記 （ 9 ) に記載の抗体を含有するがん治療剤。  (10) A cancer therapeutic agent comprising the antibody according to (9) above.
( 1 1 ) 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低分子の薬剤、 または治療 遺伝子を担持したベクターをさらに含有する、 上記 （1 0) に記載のが ん治療剤。  (11) The cancer treatment agent according to (10), further comprising a vector carrying a radioisotope, a therapeutic protein, a small molecule drug, or a therapeutic gene.
( 1 2) 上記がんが、 大腸がんまたは子宮頸がんである、 上記 （ 1 0) または （ 1 1 ) に記載のがん治療剤。  (1 2) The cancer therapeutic agent according to (1 0) or (1 1) above, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.
( 1 3 ) 上記 （9 ) に記載の抗体を含有するがん診断剤。  (1 3) A cancer diagnostic agent comprising the antibody according to (9) above.
( 1 ) MOC S 3遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェン 卜なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列を 含有するがん診断剤。  (1) A cancer diagnostic agent comprising a nucleotide sequence that can be hyper-predated under stringent hyper-precipitation conditions in the base sequence of the MOC S 3 gene or a part thereof.
( 1 5) 上記がんが、 大腸がんである、 上記 （ 1 3 ) または （ 1 4) に 記載のがん診断剤。  (15) The cancer diagnostic agent according to (13) or (14), wherein the cancer is colorectal cancer.
( 1 6) 上記 （9) に記載の抗体を含有するがん診断用キット。  (16) A cancer diagnostic kit containing the antibody according to (9) above.
( 1 7) MO C S 3遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェン 卜なハイプリダイゼ一ション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列か らなるポリヌクレオチドを含有するがん診断用キット。  (17) A kit for cancer diagnosis containing a polynucleotide comprising a base sequence that can be hyperpredified under high-precipitation conditions that are stringent to the base sequence of the MO C S 3 gene or a part thereof.
( 1 8) 上記がんが、 大腸がんである、 上記 （ 1 6 ) または （ 1 7) に 記載のがん診断用キット。 (1 9 ) 被験者由来の生体試料中の MO C S 3タンパク質または M〇C S 3遺伝子をがんマーカーとして検出および/または定量する方法。(18) The cancer diagnostic kit according to (16) or (17), wherein the cancer is colorectal cancer. (1 9) A method for detecting and / or quantifying MOCS3 protein or M0CS3 gene in a biological sample derived from a subject as a cancer marker.
(2 0 ) 前記生体試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 上記 （ 1 9 ) に記載の方法。 (2 0) The method according to (19) above, wherein the biological sample is whole blood, serum, or plasma.
(2 1 ) 質量分析装置を用いて、 M〇 C S 3タンパク質を検出および Z または定量する、 上記 （ 1 9) または （ 2 0) に記載の方法。  (2 1) The method according to (19) or (20) above, wherein MO C S 3 protein is detected and Z or quantified using a mass spectrometer.
(2 2 ) 抗 MO C S 3抗体を用いて、 M〇 C S 3タンパク質を検出およ び Zまたは定量する、 上記 （ 1 9) 〜 （2 1 ) のいずれかに記載の方法 (2 3) (a) 被験者由来の生体試料と、 MO C S 3タンパク質に対す る抗体とを接触させる工程、 および  (2 2) The method according to any one of (19) to (2 1) above, wherein M0 CS3 protein is detected and Z or quantified using an anti-MOCS3 antibody (2 3) ( a) contacting a biological sample derived from a subject with an antibody against MO CS 3 protein; and
(b ) 上記試料中での上記抗体と、 M〇 C S 3タンパク質との結合を 検出および/または定量する工程、  (b) detecting and / or quantifying the binding between the antibody in the sample and the M 0 C S 3 protein;
を包含する、 上記 （2 2) に記載の診断方法。 The diagnostic method according to (2 2) above, comprising:
(24) (a) 被験者由来の生体試料と、 MOC S 3遺伝子またはその 断片の塩基配列にストリンジェントなハイプリダイゼーション条件下で ハイブリダィズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを接触させ る工程、 および  (24) (a) contacting a biological sample derived from a subject with a polynucleotide having a base sequence capable of hybridizing under stringent high prehybridization conditions to the base sequence of the MOC S3 gene or a fragment thereof; and
(b ) 上記試料中での上記ポリヌクレオチドと、 MO C S 3遺伝子ま たはその断片とのハイプリダイゼーションを検出および Zまたは定量す る工程、  (b) a step of detecting and Z or quantifying the hybridization between the polynucleotide in the sample and the MO C S 3 gene or a fragment thereof,
を包含する、 上記 （ 1 9) または （2 0 ) に記載の方法。 The method according to (19) or (20) above, comprising:
(2 5) がんの診断に用いるための上記 （ 1 9 ) 〜 （24) のいずれか に記載の方法。  (2 5) The method according to any one of (19) to (24) for use in diagnosis of cancer.
( 2 6 ) 前記がんが、 大腸がんである、 上記 （ 2 5 ) に記載の方法。 (26) The method according to (25), wherein the cancer is colorectal cancer.
(2 7 ) MOC S 3遺伝子の発現阻害物質を患者に投与する工程を包含 する、 がん治療方法。 (2 7) A method for treating cancer, comprising a step of administering a MOC S 3 gene expression inhibitor to a patient.
(2 8 ) MO C S 3タンパク質の活性阻害物質を患者に投与する工程を 包含する、 がん治療方法。 (3 0 ) がんを治療するための医薬の製造のための、 MOC S 3遺伝子 の発現阻害物質の使用。 (2 8) A method for treating cancer comprising the step of administering a MO CS 3 protein activity inhibitor to a patient. (30) Use of a MOC S 3 gene expression inhibitor for the manufacture of a medicament for treating cancer.
(3 1 ) がんを治療するための医薬の製造のための、 MOC S 3タンパ ク質の活性阻害物質の使用。  (3 1) Use of a MOC S 3 protein activity inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
本発明により、 がん、 特に大腸がんの治療および Zまたは診断に有用 な新規な薬剤、 キットおよび方法、 ならびにがん抑制作用を有する候補 化合物のスクリ一二ング方法が提供される。 図面の簡単な説明  The present invention provides novel drugs, kits and methods useful for the treatment and Z or diagnosis of cancer, particularly colorectal cancer, and a screening method for candidate compounds having cancer suppressive action. Brief Description of Drawings
図 1は、 MO C S 3遺伝子の大腸がん患者由来の 2 0 0検体における 遺伝子増幅度に対する頻度を示すヒストグラムである。  FIG. 1 is a histogram showing the frequency of the MO C S 3 gene relative to the degree of gene amplification in 20 samples from colon cancer patients.
図 2は、 大腸がん細胞株 RKOE 6に、 M〇 C S 3遺伝子の s i RN Aをトランスフエク 卜した場合の、 RNA i解析の結果を示す光学顕微 鏡写真（位相差像）である。  Fig. 2 is an optical micrograph (phase contrast image) showing the results of RNA i analysis when siRNA of the MCS3 gene was transfected into the colon cancer cell line RKOE6.
図 3は、 大腸がん細胞株 RKOE 6に MOC S 3遺伝子の s i RNA をトランスフエクトした場合の、 RNA i効果を定量的 RT— P CRに より評価した結果を示すグラフである。  Fig. 3 is a graph showing the results of quantitative evaluation of RNA i effect by RT-PCR when sciRNA of MOC S3 gene was transfected into colorectal cancer cell line RKOE6.
図 4は、 大腸がん細胞株 RKOE 6に MOC S 3遺伝子の s i RNA をトランスフエクトした場合の、 生細胞数測定による RNA i効果を評 価した結果を示すグラフである。  FIG. 4 is a graph showing the results of evaluating the RNA i effect by measuring the number of viable cells when the siC of the MOC S 3 gene was transfected into the colon cancer cell line RKOE 6.
図 5は、 大腸正常組織由来の細胞株 C CD 1 8 C oに MO C S 3遺伝 子の s i RNAをトランスフエクトした場合の、 RNA i効果を光学顕 微鏡により検証した結果を示す写真（位相差像）である。  Fig. 5 is a photograph showing the results of verifying the RNA i effect with an optical microscope when siRNA of the MO CS 3 gene was transfected into a cell line CCD 18 Co derived from normal colon tissue. Phase difference image).
図 6は、 大腸正常組織由来の細胞株 C CD 1 8 C oに MO C S 3遺伝 子の s i RNAをトランスフエクトした場合の、 RNA i効果を定量的 RT- P C Rにより評価した結果を示すグラフである。  Figure 6 is a graph showing the results of quantitative RT-PCR evaluation of RNA i effects when MO CS 3 gene siRNA was transfected into cell line CCD 18 Co derived from normal colon tissue. is there.
図 7は、 大腸正常組織由来の細胞株 C CD 1 8 C oに MO C S 3遺伝 子の s i RNAをトランスフエクトした場合の、 RNA i効果を生細胞 数測定により検証した結果を示すグラフである。 図 8は、 正常な種々の臓器組織を用いて行ったノーザンハイプリダイ ゼーションの結果を示す写真である。 Fig. 7 is a graph showing the results of verifying the RNA i effect by measuring the number of viable cells when transfecting siRNA of the MO CS 3 gene into the cell line C CD 1 8 Co derived from normal colon tissue . Fig. 8 is a photograph showing the results of Northern hybridization performed using various normal organ tissues.
図 9は、 FISH 法で解析した大腸癌患者由来の検体組織のがん細胞の 一部 （6細胞分） の光学顕微鏡写真（蛍光像）である。  Fig. 9 is an optical micrograph (fluorescence image) of a portion (6 cells) of cancer cells in a sample tissue derived from a colon cancer patient analyzed by the FISH method.
図 1 0は、 検体組織のがん細胞において M0CS3遺伝子のタンパク質が 発現していることを免疫組織染色法で評価した結果を示す光学顕微鏡写 真（明視野像）である。  FIG. 10 is an optical micrograph (bright field image) showing the results of evaluation by immunohistostaining that the M0CS3 gene protein is expressed in cancer cells of the specimen tissue.
図 1 1は、 子宮頸癌細胞株 HeLa 細胞株に MO C S 3遺伝子の s i R NA をトランスフエクトした場合の、 RNA i効果を生細胞数測定に より検証した結果を示すグラフである。  Fig. 11 is a graph showing the results of verifying the RNAi effect by measuring the number of viable cells when transfection of the MO C S3 gene siRNA into the cervical cancer cell line HeLa cell line.
図 1 2は、 図 1 1の実験を時系列に従い、 顕微鏡下で撮影し、 その動 態を詳細に観察した結果を示す光学顕微鏡写真（微分干渉像）である。 図 1 3Aおよび Bは、 質量分析により解析した （A) 大腸がん患者由 来の血清および （B) 健常者由来の血清についての結果をそれぞれ示す グラフである。  Fig. 12 is an optical micrograph (differential interference image) showing the results of taking a detailed observation of the behavior of the experiment in Fig. 11 taken in a time-series under a microscope. Figures 13A and B are graphs showing the results of (A) serum derived from a colon cancer patient and (B) serum derived from a healthy subject analyzed by mass spectrometry, respectively.
図 14 A〜Cは、 MS /MS解析によって決定された、 図 1 3に示す ピークとアミノ酸 （またはアミノ酸配列） との対応関係を示す。  FIGS. 14A to C show the correspondence between the peak and amino acid (or amino acid sequence) shown in FIG. 13 determined by MS / MS analysis.
図 1 5 _ 1および図 1 5— 2は、 免疫組織染色法により解析した臓器 の内、 発現が認められた胃 （A： stomach) 、 結腸 （B ： colon) 、 直腸 (C ： rectum) 、 網膜 （D ： epiploon) 、 肺 （E、 F、 G ·· lung) 、 卵 巣 （ I、 J ： ovary) 、 前立腺 （L ： prostate) 、 リンパ節 （M： Lymp node) 、 骨組織 （0 ： bone) 、 および縦隔 （R ： mediastinum) 、 なら びに弱いながら発現が認められた乳 （H： breast) 、 脾臓 （K： spleen ) 、 咽喉 （P ： throat) 、 および脂肪組織 （Q ： fatty tissue) 由来の サンプルの光学顕微鏡写真（明視野像）である。 発明を実施するための最良の形態  Fig. 1 5 _ 1 and Fig. 1 5-2 are the organs analyzed by immunohistochemical staining, where expression was observed in the stomach (A: stomach), colon (B: colon), rectum (C: rectum), Retina (D: epiploon), lungs (E, F, G · lung), nest (I, J: ovary), prostate (L: prostate), lymph node (M: Lymp node), bone tissue (0: bone), mediastinum (R: mediastinum), and weakly expressed milk (H: breast), spleen (K: spleen), throat (P: throat), and adipose tissue (Q: fatty tissue) ) An optical micrograph (bright field image) of the sample from origin. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明者らは、 大腸がん患者由来の検体を用いてアレイ C GH法によ る増幅遺伝子の検証を行い、 大腸がん特異的な遺伝子増幅領域を特定し た。 検体において高頻度に増幅が起きている領域のうち、 ヒト MOC S 3 (M o l y b d e n um c o f a c t o r s y n t h e s i s 3 ) 遺伝子が大腸がん患者由来の検体において高頻度であることを見出 した。 The present inventors verified a gene amplified by the array CGH method using a sample derived from a colorectal cancer patient, and identified a gene amplification region specific for colorectal cancer. It was. We found that human MOC S 3 (Molybdenum cofactorsynthesis 3) gene is frequently found in colorectal cancer patients among the regions where amplification occurs frequently in the samples.
本発明者らの見出したヒト M〇C S 3遺伝子は、 モリブデンを含む酸 化還元酵素群の合成系に関与する。  The human MCS3 gene found by the present inventors is involved in the synthesis system of oxidoreductases containing molybdenum.
モリブデンはマメ科植物、 乳製品、 食肉など、 多くの食品に含まれる 微量元素であり、 生体内で重要な役割を担っていることが知られている 。 モリブデンは、 M o l y b d o p t e r i n (MTP) と結合して M o 1 y n d e n um c o f a c t o r (M o c o となる。 Mo c oは、 キサンチンォキシダーゼ （XO) 、 アルデヒドォキシダ一ゼ （A O) 、 および亜硫酸ォキシダ一ゼ （S O) の 3つの酵素の活性に必須で ある。 XOはプリン誘導体の代謝に関与し、 AOはアルデヒドの力ルポ ン酸への酸化を触媒し、 S Oは含硫黄アミノ酸の代謝に必要とされる亜 硫酸塩を硫酸に酸化する酵素である。  Molybdenum is a trace element contained in many foods such as legumes, dairy products, and meat, and is known to play an important role in vivo. Molybdenum combines with Molybdopterin (MTP) to form M o 1 ynden um cofactor (M oco. Mo co consists of xanthine oxidase (XO), aldehyde oxidase (AO), and sulfite oxidase ( It is essential for the activity of the three enzymes SO) XO is involved in the metabolism of purine derivatives, AO catalyzes the oxidation of aldehydes to strong sulfonic acids, and SO is required for the metabolism of sulfur-containing amino acids. An enzyme that oxidizes sulfite to sulfuric acid.
モリブデンの欠乏は、 心悸亢進、 頭痛、 精神障害、 昏睡状態などの臨 床徴候があり、 長期の完全非経口栄養を受けている患者において報告が ある。 このモリブデン不足がもたらす症状は、 低い XO活性による血清 中と尿中の非常に低い尿酸値、 また、 低い s o活性による尿中の低い無 機硫酸値などである。 重篤な脳障害や眼硝子体脱臼などの症状を示す、 先天的異常によるモリブデン補因子欠乏症が知られている （S a r d e s a i , V. M. ( 1 9 9 3 ) Nu t r C l i n P r a c t . 8 ( 6 ) , 2 7 7 - 8 1 ) 。  Molybdenum deficiency has been reported in patients who have clinical signs such as increased heartbeat, headache, psychiatric disorder, and coma and are receiving long-term parenteral nutrition. Symptoms of this molybdenum deficiency include very low uric acid levels in serum and urine due to low XO activity, and low urinary sulfuric acid levels in urine due to low soo activity. Molybdenum cofactor deficiency due to congenital anomalies that show symptoms such as severe brain damage and ocular vitreous dislocation is known (Sardesai, VM (1 9 9 3) Nu tr C lin P ract. 8 (6 ), 2 7 7-8 1).
モリブデン補因子欠乏症は、 2つの M o 1 y b d e n um c o f a c t o r s y n t h e s i s l (MOC S l ) および 2 (MOC S 2 ) の変異が関与していることが報告されている （R e i s s， J . e t a 1. ( 1 9 9 8 ) Am. J . Hum. G e n e t . 1 0 3， 6 3 9 - 644 ； R e i s s , J . e t a 1. ( 1 9 9 9 ) Am. J . Hum. G e n e t . 64, 7 0 6 - 7 1 1 ) c Molybdenum cofactor deficiency has been reported to involve two mutations in Mo 1 ybden um cofactor synthesisl (MOC S l) and 2 (MOC S 2) (Reiss, J. eta 1. (1 9 9 8) Am. J. Hum. G enet. 1 0 3, 6 3 9-644; Reiss, J. Eta 1. (1 9 9 9) Am. J. Hum. G enet. 64, 7 0 6-7 1 1 ) c
大腸菌の MT P合成関連酵素の M o e B遺伝子 （L a k e , M. W . e t a 1 - ( 2 0 0 1 ) N a t u r e 4 1 4, 3 2 5 - 3 2 9) のヒト相同性遺伝子として同定された MO C S 3は、 N末端側は M o e Bと相同性があるが、 C末端側は R h o d a n e s e ( t h i o s u 1 f a t e ： c y a n i d e s u l f u r t r a n s f e r a s e , E. C. 2. 8. 1. 1 ) と相同性がある （M e n d e l , R . R. & S c hwa r z , G. ( 2 0 0 2 ) M e t . I o n s B i o l . S y s t . 3 9 , 3 1 7— 3 6 8) 。  Identified as a human homologous gene of M oe B gene (Lake, M. W. Eta 1-(2 0 0 1) Nature 4 1 4, 3 2 5-3 2 9) MO CS 3 is homologous to Moe B on the N-terminal side, but homologous to Rhodanese (thiosu 1 fate: cyanidesulfurtransferase, EC 2. 8. 1. 1) on the C-terminal side ( M endel, R. R. & S chwa rz, G. (2 0 0 2) M et. Ions Biol. Syst. 3 9, 3 1 7— 3 6 8).
MOC S 3は， MTP合成系において、 硫黄を MO C S 2に転移し M OC S 2を活性化する。 活性化した MOC S 2は、 MOC S 1により G T Pより合成された P r e c u r s o r Zを MTPに変換する （Ma t t h i e s , A. e t a 1. (2 0 04) PNA S 1 0 1 ( 1 6) ， 5 946 - 5 9 5 1 ; Ma t t h i e s , A. e t a 1 . (2 0 0 5) B i o c h em. 44, 7 9 1 2— 7 9 2 0 ) 。 こ のように合成された MT Pはモリブデンと結合し、 Mo c oとなる。 M o c oは、 キサンチンォキシダーゼ (X O) 、 アルデヒドォキシダーゼ (AO) 、 および亜硫酸ォキシダ一ゼ （S O) の 3つの酵素の活性に必 須である。  MOC S 3 transfers sulfur to MO C S 2 and activates M OC S 2 in the MTP synthesis system. Activated MOC S 2 converts Precursor Z synthesized from GTP by MOC S 1 into MTP (Matthies, A. eta 1. (2 0 04) PNA S 1 0 1 (1 6), 5 946-5 9 5 1; Mathesies, A. eta 1. (2 0 0 5) B ioch em. 44, 7 9 1 2— 7 9 2 0). MTP synthesized in this way combines with molybdenum and becomes Mo co. M o co is essential for the activity of three enzymes: xanthine oxidase (X O), aldehyde oxidase (AO), and sulfite oxidase (S O).
本発明者らは、 MO C S 3遺伝子の発現を RNA i (RNA干渉） に よって抑制することによってがん細胞の増殖を抑制できることも確認し た。 したがって、 M〇C S 3遺伝子の発現を抑制することによって、 が んを治療することが可能となる。 また、 MOC S 3遺伝子の発現量を測 定することによってがんの診断を行うことも可能となる。  The present inventors have also confirmed that the growth of cancer cells can be suppressed by suppressing the expression of the MO C S 3 gene by RNA i (RNA interference). Therefore, it is possible to treat cancer by suppressing the expression of the MCS3 gene. It is also possible to diagnose cancer by measuring the expression level of the MOC S 3 gene.
以下、 本発明のがん治療剤、 スクリーニング方法、 診断剤などについ て詳細に説明する。  Hereinafter, the cancer therapeutic agent, screening method, diagnostic agent and the like of the present invention will be described in detail.
. がん抑制作用を有する薬剤 . Drugs that suppress cancer
まず、 本発明は、 （ 1 ) MO C S 3遺伝子の発現阻害物質を有効成分 として含有するがん治療剤、 及び （ 2) M〇C S 3タンパク質の活性阻 害物質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。 First, the present invention provides (1) a substance that inhibits expression of MO CS 3 gene as an active ingredient And (2) a cancer therapeutic agent containing, as an active ingredient, a MCS3 protein activity inhibitor.
本明細書中、 「MOC S 3遺伝子」 という場合、 NC B Iヌクレオチ ドデータベースにおいて、 A c c e s s i o n N o. ： NM_ 0 1 4 48 4で登録されている 24 5 8塩基からなるヒト MO C S 3遺伝子 （ 配列番号 1 ) を意味するが、 これに限定されず、 例えば、 当該遺伝子の 塩基配列において 1つ以上の塩基の置換、 欠失、 付加、 または挿入など を有することによって変化している変異体のような、 当該遺伝子の塩基 配列またはその相補配列にストリンジェントなハイプリダイゼ一ション 条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドから なる遺伝子も本明細書中で使用する 「MOC S 3遺伝子」 に含まれるも のとする。  In this specification, the term “MOC S 3 gene” refers to a human MO CS 3 gene consisting of 24 5 8 bases registered in the Accession No .: NM_ 0 1 4 48 4 in the NC BI nucleotide database ( SEQ ID NO: 1) means, but not limited thereto, for example, a variant that has been altered by having one or more base substitutions, deletions, additions, or insertions in the base sequence of the gene. Such a gene consisting of a polynucleotide comprising a base sequence that can be hybridized under high-precipitation conditions that are stringent to the base sequence of the gene or its complementary sequence is also referred to as “MOC S 3 gene”. It shall be included.
ハイプリダイゼーションは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ' クローニング （Mo l e c u 1 r C l o n i n g T h i r d E d i t i o n , J . S amb r o o k e t a 1. , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b. P r e s s . 2 0 0 1 ) に記載の方法などに従って行うことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に 従って行うことができる。 ここで、 「ストリンジェントな条件」 は、 低 ストリンジェントな条件、 中ストリンジェントな条件及び高ストリンジ ェントな条件のいずれでもよい。 「低ストリンジエンドな条件」 は、 例 えば、 5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5 % S D S、 5 0 %ホル ムアミ ド、 3 2 °Cの条件である。 また、 「中ストリンジェントな条件」 は、 例えば、 5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5 % S D S、 5 0 %ホルムアミ ド、 42°Cの条件である。 「高ストリンジェン卜な条件」 は、 例えば、 5 X S S C、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5 % S D S、 5 0 %ホルムアミ ド、 5 0 の条件である。 これらの条件において、 温度を 上げるほど高い相同性を有する DNAが効率的に得られることが期待で きる。 ただし、 ハイブリダィゼ一シヨンのストリンジエンシーに影響す る要素としては温度、 プローブ濃度、 プローブの長さ、 イオン強度、 時 間、 塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を適 宜選択することで同様のストリンジエンシーを実現することが可能であ る。 Hypridization is a known method or a method similar thereto, for example, molecular cloning (Molecu 1 r Cloning Third E dition, J. S amb rooketa 1., C old S pr ing Harbor L ab. Press . 2 0 0 1) and the like. When using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Here, the “stringent condition” may be a low stringent condition, a moderate stringent condition, or a high stringent condition. “Low stringent conditions” are, for example, 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C. “Medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 XSSC, 5 X Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, it affects the stringency of the hybridization. Multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered, and those skilled in the art can select similar factors to achieve the same stringency. It can be realized.
ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとしては、 FAS TA、 B L A S Tなどの相同性検索ソフトウエアにより、 デフォルトのパラメ一夕 —を用いて計算したときに、 配列番号 1の塩基配列と、 例えば、 7 0 % 以上、 7 5 %以上、 8 0 %以上、 8 5 %以上、 9 0 %以上、 9 1 %以上 、 9 2 %以上、 9 3 %以上、 9 4 %以上、 9 5 %以上、 9 6 %以上、 9 7 %以上、 9 8 %以上、 9 9 %以上の同一性を有するポリヌクレオチド をあげることができる。  As a polynucleotide that can be hybridized, the base sequence of SEQ ID NO: 1, for example, 70% or more, when calculated using the default parameter—by homology search software such as FAS TA, BLAST, etc. 7 5% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 9 1% or more, 9 2% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, Examples include polynucleotides having 9 7% or more, 98% or more, and 99% or more identity.
本明細書中、 「遺伝子の発現阻害」 とは、 遺伝子からタンパク質生成 までの一連の事象 （例えば、 転写 （mRNAの生成） 、 翻訳 （タンパク 質の生成） を含む） のうちのいずれかの事象を阻害することによってそ の遺伝子によってコードされるタンパク質の生成を阻害することを意味 するものとする。  In the present specification, “inhibition of gene expression” means any event in a series of events from gene to protein production (for example, transcription (production of mRNA), translation (production of protein)) By inhibiting the production of the protein encoded by the gene.
本明細書中、 「MOC S 3タンパク質」 という場合、 NC B Iタンパ ク質デ一夕ベースにおいて、 A c c e s s i o n No. : NP— 0 5 5 2 9 9で登録されている 46 0アミノ酸残基からなるヒト MO C S 3 タンパク質 （配列番号 2) およびこのタンパク質と実質的に同質の活性 (例えば、 R h o d a n e s e活性や T i o c a r b o x y l a t i o n活性などの酵素活性から選択される一種以上の活性） を保持し、 この タンパク質のアミノ酸配列に対して 1〜複数個のアミノ酸残基の欠失、 置換、 挿入、 及びノまたは付加が生じたアミノ酸配列からなる変異タン パク質をいう。  In the present specification, the term “MOC S 3 protein” consists of 460 amino acid residues registered under Accession No .: NP— 0-5 5 2 9 9 on the basis of NC BI protein data. Retains the human MO CS 3 protein (SEQ ID NO: 2) and substantially the same activity as this protein (for example, one or more activities selected from enzyme activities such as Rhodanese activity and Tiocarboxylation activity). A mutant protein consisting of an amino acid sequence in which deletion, substitution, insertion, and addition or deletion of one to a plurality of amino acid residues has occurred in the amino acid sequence.
上記変異タンパク質における、 アミノ酸の変異部位および個数は、 変 異タンパク質が元のタンパク質と実質的に同質の活性を保持している限 り特に制限はないが、 変異個数は、 例えば、 1〜 5 0個、 1〜4 0個、 1〜 3 0個、 1〜 2 5個、 1〜 2 0個、 1〜 1 5個、 1〜 1 0個、 1〜 9個、 1〜 8個、 1〜 7個、 ：！〜 6個 （ 1〜数個） 、 1〜 5個、 1 ~4 個、 1〜 3個、 1〜 2個、 1個である。 変異個数は一般的に少ない程好 ましい。 また、 このような変異タンパク質は、 配列番号 ： 2のアミノ酸 配列と約 7 0 %以上、 7 5 %以上、 8 0 %以上、 8 5 %以上、 9 0 %以 上、 9 1 %以上、 9 2 %以上、 9 3 %以上、 9 4 %以上、 9 5 %以上、 9 6 %以上、 9 7 %以上、 9 8 %以上、 9 9 %以上の同一性を有するァ ミノ酸配列を有し、 かつ元のタンパク質と実質的に同質の活性を有する タンパク質を含む。 上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。 上記 MO C S 3タンパク質には、 MO C S 3タンパク質の 「部分ぺプ チド」 も含まれる。 MO C S 3タンパク質の部分ペプチドとしては、 M 〇 C S 3タンパク質のアミノ酸配列 （配列番号 2) の一部の連続するァ ミノ酸の配列からなる部分ペプチドであって、 好ましくは、 前述の M〇 C S 3夕ンパク質の活性と同様の活性を有するものであればいずれのも のでも良い。 例えば、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 少 なくとも 2 0個、 好ましくは少なくとも 5 0個、 さらに好ましくは少な くとも 7 0個、 より好ましくは少なくとも 1 0 0個、 最も好ましくは少 なくとも 2 0 0個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するポリべ プチドなどが挙げられる。 好ましくは、 これらのポリペプチドは、 MO C S 3タンパク質の活性に関与する部分に対応するアミノ酸配列を含有 する。 また、 本発明で使用される部分ペプチドは、 上記のポリペプチド において、 そのアミノ酸配列中の 1または複数個 （例えば、 1〜 2 0個 程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらにより好ましくは 1〜 5個 程度） のアミノ酸残基が欠失、 付加、 置換、 または挿入により変更され ているものでもよい。 The amino acid mutation site and number in the above mutant protein are not particularly limited as long as the mutant protein retains substantially the same activity as the original protein, but the number of mutations is, for example, 1 to 50. 1 to 40 pieces, 1 to 30 pieces, 1 to 25 pieces, 1 to 20 pieces, 1 to 15 pieces, 1 to 10 pieces, 1 to 9 pieces, 1-8 pieces, 1-7 pieces! ~ 6 pieces (1 ~ several pieces), 1 ~ 5 pieces, 1 ~ 4 pieces, 1 ~ 3 pieces, 1-2 pieces, 1 piece. In general, the smaller the number of mutations, the better. In addition, such a mutant protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and about 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 9 1% or more, 9 2% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more amino acid sequences having 9% or more identity And a protein having substantially the same activity as the original protein. In general, the larger the homology value, the better. The MO CS 3 protein includes “partial peptides” of the MO CS 3 protein. The partial peptide of the MO CS 3 protein is a partial peptide consisting of a partial amino acid sequence of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the M 0 CS 3 protein. Any substance may be used as long as it has an activity similar to that of protein. For example, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, at least 20, preferably at least 50, more preferably at least 70, more preferably at least 100, most preferably at least Examples thereof include a polypeptide having an amino acid sequence consisting of at least 200 amino acid residues. Preferably, these polypeptides contain an amino acid sequence corresponding to the portion involved in the activity of MOCS 3 protein. Further, the partial peptide used in the present invention is one or more of the above-mentioned polypeptides in the amino acid sequence (for example, about 1 to 20 pieces, more preferably about 1 to 10 pieces, still more preferably 1 to 5 amino acid residues) may be changed by deletion, addition, substitution, or insertion.
本発明で用いる MO C S 3タンパク質は、 そのタンパク質を発現して いる細胞や組織から調製することができる。 また、 これらのタンパク質 は、 公知のペプチド合成機によっても合成できるし、 原核生物あるいは 真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても 調製することができる。 本発明で用いる MO C S 3タンパク質は、 いず れの種由来のものでもよいが、 好ましくはヒト由来である。 The MO CS 3 protein used in the present invention can be prepared from cells or tissues expressing the protein. Further, these proteins can be synthesized by a known peptide synthesizer, or can be prepared by a recombinant method using an appropriate host cell selected from prokaryotic organisms or eukaryotic organisms. The MO CS 3 protein used in the present invention is Although it may be derived from these species, it is preferably derived from a human.
「実質的に同質の活性」 とは、 それらの活性が性質的に同等であるこ とを示す。 したがって、 酵素活性 （R h o d a n e s e活性や T i o c a r b o x y l a t i o n活性など） が同等 （例えば、 約 0. 0 1〜 1 0 0倍、 好ましくは約 0. 5〜 2 0倍、 より好ましくは約 0. 5〜 2倍 ) であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク質の分子量 などの量的要素は異なっていてもよい。 酵素活性の測定は、 Ma t t h i e s， A. e t a 1. ( 2 0 0 4) P NAS 1 0 1 ( 1 6) ， 5 9 4 6— 5 9 5 1などの文献に記載の公知の方法に準じて行うこ とができるが、 例えば、 後に記載するスクリーニング方法に従って測定 することができる。  “Substantially the same activity” indicates that these activities are qualitatively equivalent. Accordingly, enzyme activities (such as Rhodanese activity and Tiocarboxylation activity) are equivalent (for example, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2). However, quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different. Enzyme activity is measured according to known methods described in literature such as Maties, A. eta 1. (2 0 0 4) P NAS 1 0 1 (1 6), 5 9 4 6-5 9 5 1, etc. For example, it can be measured according to the screening method described later.
なお、 アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 カーリンおよびアルチュ ールによるアルゴリズム B LA S T (p r o c . N a t 1. A c a d. S c i . U SA 8 7 2 2 64 - 2 2 6 8 , 1 9 9 0 ; p r o c . N a t l . A c a d. S c i US A 9 0 : 5 8 7 3 , 1 9 9 3 ) を用いて決定できる。 B L AS Tのアルゴリズムに基づいた B LAS T Nや B LAS TXと呼ばれるプログラムが開発されている （A 1 t s c h u 1 S F , e t a 1 ： J Mo l B i o l 2 1 5 : 4 0 3 , 1 9 9 0 ) 。 B LAS TNを用いて塩基配列を解析する場合は、 パラメ一夕一は、 例えば s c o r e = 1 0 0、 wo r d l e n g t h = 1 2とする。 また、 B LAS TXを用いてアミノ酸配列を解析する場合 は、 ノ、。ラメ一ターは、 例えば s c o r e = 5 0、 wo r d l e n g t h = 3とする。 B LAS Tと G a p p e d B LAS Tプログラムを用い る場合は、 各プログラムのデフォルトパラメ一夕一を用いる。  The identity of the amino acid sequence and base sequence is determined by the algorithm by Carlin and Arthur. B LA ST (proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 8 7 2 2 64-2 2 6 8, 1 9 9 0; proc. Natl. A cad. S ci US A 9 0: 5 8 7 3, 1 9 9 3). Programs called B LAS TN and B LAS TX based on the BL AS T algorithm have been developed (A 1 tschu 1 SF, eta 1: J Mol B iol 2 1 5: 4 0 3, 1 9 9 0 ) When analyzing the base sequence using B LAS TN, the parameters are set to, for example, s c o re e = 1 0 0 and w o d d e n g t h = 1 2. When analyzing amino acid sequences using B LAS TX, no. The parameters are, for example, s c o r e = 50 and wor d l e n g t h = 3. When using B LAS T and Gap p e d B LAS T programs, use the default parameters of each program.
本明細書中、 「がん治療剤」 という用語は、 抗癌剤、 癌転移阻害剤、 癌細胞のアポトーシス誘導剤、 癌細胞の増殖抑制剤、 癌細胞の浸潤抑制 剤、 がん予防剤等を含む意味で使用される。 なお、 本願明細書中、 用語 「癌 （または、 がん） 」 と 「腫瘍」 とは同じ意味を有する用語として使 用される。 1. 1 MOC S 3遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療剤 本発明は、 1つの実施形態において、 M〇 C S 3遺伝子の発現阻害物 質を有効成分として含有するがん治療剤を提供する。 In the present specification, the term “cancer therapeutic agent” includes anticancer agents, cancer metastasis inhibitors, cancer cell apoptosis inducers, cancer cell proliferation inhibitors, cancer cell infiltration inhibitors, cancer preventive agents, and the like. Used in meaning. In the present specification, the terms “cancer (or cancer)” and “tumor” are used as terms having the same meaning. 1. 1 Cancer Treatment Agent Containing Substance Inhibiting Expression of MOC S 3 Gene In one embodiment, the present invention provides a cancer treatment agent containing, as an active ingredient, an expression inhibitor of MCS3 gene. To do.
本明細書中、 「MOC S 3遺伝子の発現阻害物質」 には、 MOC S 3 遺伝子の発現を阻害するものであれば制限はないが、 例えば、 （ i ) M O C S 3遺伝子から MO C S 3 mRN Aへの転写を阻害する物質、 お よび （ i i ) MOC S 3 mRNAから MOC S 3夕ンパク質への翻訳 を阻害する物質が含まれる。  In the present specification, the “MOC S 3 gene expression inhibitor” is not limited as long as it inhibits the expression of the MOC S 3 gene. For example, (i) MOCS 3 gene to MO CS 3 mRNA And (ii) a substance that inhibits translation from MOC S 3 mRNA to MOC S 3 protein.
MO C S 3遺伝子から MO C S 3 mR N Aへの転写を阻害する物質 の例としては、  Examples of substances that inhibit transcription from the MO C S 3 gene to MO C S 3 mR N A include
(a) MO C S 3遺伝子またはその一部に対するアンチセンス核酸、 (a) an antisense nucleic acid against the MO C S 3 gene or a part thereof,
(b) MO C S 3遺伝子またはその一部に対するデコイ核酸、 (b) a decoy nucleic acid for the MO C S 3 gene or a part thereof,
( c ) MO C S 3遺伝子またはその一部に対してドミナントネガティブ に作用する MO C S 3遺伝子変異体、 あるいは  (c) a MO C S 3 gene variant that acts dominantly on the MO C S 3 gene or a part thereof, or
(d) その他の転写阻害化合物  (d) Other transcription inhibitor compounds
などが含まれる。 Etc. are included.
また、 MOC S 3 mRN Aから MO C S 3タンパク質への翻訳を阻 害する物質の例としては、  Examples of substances that block translation from MOC S 3 mRN A to MO C S 3 protein include
(e) M〇 C S 3 m R N Aまたはその一部に対して R N A i作用を有 するポリヌクレオチド （例えば、 s i RNA) 、  (e) a polynucleotide having an RNAI action on M0 C S 3 m RN A or a part thereof (eg, si RNA),
( f ) MO C S 3 mRN Aまたはその一部に対するアンチセンスポリ ヌクレオチド、  (f) an antisense polynucleotide to MO C S 3 mRNA or a part thereof,
( ) MO C D 3 mRNAまたはその一部に対してリポザィム活性を 有するポリヌクレオチド、 あるいは  () A polynucleotide having liposomal activity against MO C D 3 mRNA or a part thereof, or
(h) その他の翻訳阻害化合物  (h) Other translation inhibitor compounds
などが含まれる。 Etc. are included.
本明細書中、 「核酸」 とは RNAまたは DN Aを意味する。 ここでい う 「核酸」 は、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修 飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化 されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジ ン、 あるいはその他の複素環を含むものであって良い。 修飾されたヌク レオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた、 糖部分が修飾されてい て良く、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置 換されているか、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換されて いてよい。 In the present specification, “nucleic acid” means RNA or DNA. The term “nucleic acid” here contains not only purine and pyrimidine bases, but also modifications. It may include those with other heterocyclic bases decorated. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleosides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, for example, one or more hydroxyl groups are replaced by halogens, aliphatic groups, etc., or ethers, amines, etc. It may be converted to a functional group.
本発明のがん治療剤においては、 M〇 C S 3遺伝子の発現を RNA i 効果により阻害する作用を有する核酸を有効成分として用いることがで きる。 RNA i とは、 標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有 する二重鎖 RN Aを細胞内に導入すると、 導入した外来遺伝子および標 的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のことをいう。 ここで 用いられる RN Aとしては、 例えば、 1 9〜 3 0塩基長の； RNA干渉を 生ずる二重鎖 RNA、 例えば、 d s RNA (d o u b l e s t r a n d RNA) , s i RNA ( s ma l l i n t e r f e r i n g R NA) 又は s h RNA ( s h o r t h a i r p i n RNA) が挙げ られる。 このような RNAは、 リボソームなどの送達システムにより所 望の部位に局所送達させることも可能であり、 また上記二重鎖 RN Aが 生成されるようなべクタ一を用いてこれを局所発現させることができる 。 このような二重鎖 RNA (d s RNA、 s i RNAまたは s h RNA ) の調製方法、 使用方法などは、 多くの文献から公知である （特表 2 0 0 2— 5 1 6 0 6 2号； 米国公開許第 2 0 0 2Z0 8 6 3 5 6 A号； N a t u r e G e n e t i c s , 2 4 (2) ， F e b. , 1 8 0 - 1 8 3 ； G e n e s i s , 2 6 (4) ， Ap r i l , 24 0 - 2 44 ； N a t u r e , S p e . 2 1 , 40 7 ： 6 8 0 2 , 3 1 9— 2 0 ; G e n e s & D e v . , V o l . 1 6 , ( 8 ) ， Ap r . 1 6， 94 8 - 9 5 8 ； P r o c . N a t l . A c a d. S c i . U S A. ， 9 9 (8) , 1 6 Ap r . , 5 5 1 5 - 5 5 2 0 ; S c i e n c e , 2 9 6 ( 5 5 6 7 ) , 1 9 A r . , 5 5 0 - 5 5 3 ； P r o c N a t l . A c a d. S c i . U S A, Ap r . 3 0 , 9 9 : 9 , 6 047 - 6 0 5 2 ； N a t u r e B i o t e c h n o l o g y, V o l . 2 0 ( 5) , M a y , 4 9 7— 5 0 0 ; N a t u r e B i o t e c h n o l o g y, V o l . 2 0 (5) , M a y, 5 0 0 - 5 0 8 ; Nu c l e i c A c i d s R e s . , Ma y 1 5など） 。 In the cancer therapeutic agent of the present invention, a nucleic acid having the action of inhibiting the expression of MCS3 gene by the RNA i effect can be used as an active ingredient. RNA i is a phenomenon in which the expression of a foreign gene and a target endogenous gene are both inhibited when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as the target gene sequence is introduced into the cell. Say. The RNA used here is, for example, 19 to 30 bases in length; double-stranded RNA that causes RNA interference, such as ds RNA (doublestrand RNA), siRNA (smallinterfering RNA) or sh RNA (shorthairpin RNA). Such RNA can be locally delivered to a desired site by a delivery system such as ribosome, and it can be expressed locally using a vector that produces the above-mentioned double-stranded RNA. Is possible. The preparation method and use method of such double-stranded RNA (ds RNA, si RNA or sh RNA) are known from many literatures (Special Table 2 0 0 2-5 1 6 0 6 2; US) Publication No. 2 0 0 2Z0 8 6 3 5 6 A; Nature Genetics, 2 4 (2), F e b., 1 80-1 8 3; Genesis, 2 6 (4), Ap ril , 24 0-2 44; Nature, S pe. 2 1, 40 7: 6 8 0 2, 3 1 9— 2 0; Genes & D ev., V ol. 1 6, (8), Ap r 1 6, 94 8-9 5 8; P roc. Natl. A cad. S ci. US A., 9 9 (8), 1 6 Ap r., 5 5 1 5-5 5 2 0; S cience, 2 9 6 (5 5 6 7), 1 9 A r., 5 5 0-5 5 3; Proc N atl. A cad. S ci. USA, Ap r. 3 0, 9 9: 9, 6 047-6 0 5 2; Nature B iotechnology, V ol. 2 0 (5), May, 4 9 7-5 0 0; Nature B iotechnology, V ol. 2 0 (5 ), May, 5 0 0-5 0 8; Nucleic Acids R es., May 15, etc.).
本発明で用いられる RNA i効果を奏する二重鎖 RNAの長さは、 通 常、 1 9〜 3 0塩基、 好ましくは 2 0〜 2 7塩基、 より好ましくは 2 1 〜 2 5塩基、 最も好ましくは 2 1〜 2 3塩基である。 本発明においては 、 具体的には、 下記 s i RNA (実施例 3で使用） を用いることができ る。  The length of the double-stranded RNA exhibiting the RNA i effect used in the present invention is usually 19 to 30 bases, preferably 20 to 27 bases, more preferably 21 to 25 bases, most preferably Is 2 1 to 2 3 bases. In the present invention, specifically, the following siRNA (used in Example 3) can be used.
(表 1 )  (table 1 )
Figure imgf000017_0001
本明細書中、 「アンチセンス核酸」 、 または 「アンチセンスポリヌク レオチド」 とは、 ある対象となる DNA領域の少なくとも一部に相補的 なポリヌクレオチドを有し、 そのポリヌクレオチドが当該領域の少なく とも一部とハイプリダイズすることができる核酸のことをいう。 本発明 のアンチセンス核酸は、 RNA、 DNA、 あるいは修飾された核酸 （R NA、 DNA) である。 本発明のアンチセンス核酸は、 RNA、 DNA 、 あるいは修飾された核酸 （RNA、 DNA) である。 それらは二本鎖 DNA、 一本鎖 DNA、 二本鎖 RNA、 一本鎖 RNA、 さらに DNA : RNAハイプリッドであってもよい。 修飾された核酸の具体例としては 、 核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 さらにはポリヌクレオ チドアミ ドゃオリゴヌクレオチドアミ ドの分解に抵抗性を有するものな どが挙げられるが、 それらに限定されるものではない。
Figure imgf000017_0001
In the present specification, the term “antisense nucleic acid” or “antisense polynucleotide” has a polynucleotide that is complementary to at least a part of a DNA region of interest, and the polynucleotide is a small part of the region. The term refers to a nucleic acid that can be hybridized with a part. The antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA). The antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA or a modified nucleic acid (RNA, DNA). They are double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and DNA: It may be an RNA hybrid. Specific examples of modified nucleic acids include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, and those that are resistant to the degradation of oligonucleotides. is not.
使用されるアンチセンス核酸は、 適当なプロモーターの下流に連結さ れ、 好ましくは 3 ' 側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。 こ のようにして調製された核酸は、 公知の方法を用いることで、 所望の動 物へ形質転換できる。 アンチセンス核酸の配列は、 形質転換される動物 が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好まし いが、 遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、 完全に相補的で なくてもよい。  The antisense nucleic acid to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side. The nucleic acid thus prepared can be transformed into a desired animal using a known method. The sequence of the antisense nucleic acid is preferably a sequence complementary to the endogenous gene of the animal to be transformed or a part thereof, but is completely complementary as long as the gene expression can be effectively suppressed. It doesn't have to be.
例えば、 MO C S 3遺伝子の mRNAの 5 ' 端近傍の非翻訳領域に相 補的なアンチセンス配列を設計すれば、 遺伝子の翻訳阻害に効果的であ る。 コード領域もしくは 3 ' 側の非翻訳領域に相補的な配列も使用する ことができる。 遺伝子の翻訳阻害に効果的なアンチセンス核酸は、 標的 遺伝子の転写産物に対して約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 よ り好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相補性を有 する。  For example, designing a complementary antisense sequence in the untranslated region near the 5 'end of the mRNA of the MO C S 3 gene is effective in inhibiting gene translation. A sequence complementary to the coding region or 3 ′ untranslated region can also be used. Antisense nucleic acid effective for inhibiting gene translation is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 9% or more of the transcript of the target gene. 5% or more complementarity.
アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには 、 アンチセンス核酸の長さは少なくとも約 1 0塩基以上 （例えば、 1 0 〜40個程度） 、 好ましくは約 1 5塩基以上であり、 より好ましくは約 1 0 0塩基以上であり、 さらに好ましくは約 5 0 0塩基以上である。 ァ ンチセンス核酸は公知の文献を参照して設計することができる （例えば 、 平島および井上、 新生化学実験講座 2 核酸 I V遺伝子の複製と発現 、 日本生化学会編、 東京化学同人、 1 9 9 3、 p. 3 1 9 - 34 7 ) 、 J . K a w a k a m i e t a 1. ， P h a r m T e c h J a p a n. V o l . 8 , p. 24 7 , 1 9 9 2 ； V o 1. 8 , p. 3 9 5 , 1 9 9 2 ; S . T. C r o o k e e t a 1. , e d . , An t i s e n s e R e s e a r c h a n d Ap p l i c a t i o n s ， CR C P r e s s , 1 9 9 3など参照） 。 In order to effectively suppress the expression of a target gene using an antisense nucleic acid, the length of the antisense nucleic acid is at least about 10 bases (for example, about 10 to 40), preferably about 15 bases or more More preferably about 100 bases or more, and still more preferably about 500 bases or more. Antisense nucleic acids can be designed with reference to known literature (for example, Hirashima and Inoue, New Chemistry Experiment Course 2 Nucleic acid IV gene replication and expression, Japan Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin, 1 9 9 3, p. 3 1 9-34 7), J. Kawakamieta 1., P harmtech J apa n. V ol. 8, p. 24 7, 1 9 9 2; V o 1. 8, p. 3 9 5, 1 9 9 2; S. T. C rookeeta 1., ed., An tisense R esearchand Ap plications , CR CP ress, 1 9 9 3 etc.).
また、 本発明のがん治療剤においては、 M〇 C S 3遺伝子の転写産物 を特異的に切断するリポザィム活性を有する核酸を有効成分として用い ることができる。 ここでいう 「リポザィム活性」 とは、 ターゲットとす る遺伝子の転写産物である mRN Aを部位特異的に切断する核酸のこと をいう。 リポザィムには、 グループ Iイントロン型や R N a s e Pに含 まれる M l RNAのように 40 0ヌクレオチド以上の大きさのものも あるが、 ハンマーへッド型やへァピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程 度の活性ドメインを有するものもある （タンパク質核酸酵素、 1 9 9 0 、 3 5、 p . 2 1 9 1 ) 。 ハンマ一ヘッ ド型リポザィムについては、 例 えば、 F E B S L e t t , 1 9 8 8 , 2 2 8 , p . 2 2 8 ； F E B S L e t t , 1 9 8 8 , 2 3 9 , p. 2 8 5 ； タンパク質核酸酵素， 1 9 9 0， 3 5， p . 2 1 9 1 ; N u c 1 A c i d s R e s , 1 9 8 9 , 1 7， p . 7 0 5 9などを参照することができる。 また、 ヘアピン型 リポザィムについては、 例えば、 N a t u r e , 1 9 8 6 , 3 2 3 , p . 34 9 ； N u c 1 A c i d s R e s , 1 9 9 1 , 1 9， p . 6 7 5 1 ； 菊池洋， 化学と生物， 1 9 9 2, 3 0， p. 1 1 2などを参照す ることができる。 このようなリポザィムを用いて本発明における M〇 C S 3遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、 該遺伝子の発現を阻 害することができる。  In the cancer therapeutic agent of the present invention, a nucleic acid having a lipozyme activity that specifically cleaves a transcript of the MCS3 gene can be used as an active ingredient. As used herein, “liposome activity” refers to a nucleic acid that specifically cleaves mRNA, which is a transcription product of a target gene. Some liposomes are larger than 400 nucleotides, such as group I introns and MRNA contained in RNase P, but about 40 nucleotides called hammerheads and hepins. Some have the active domain of (protein nucleic acid enzyme, 1990, 35, p. 2 191). For example, FEBSL ett, 1 9 8 8, 2 2 8, p. 2 2 8; FEBSL ett, 1 9 8 8, 2 3 9, p. 2 8 5; protein nucleic acid Enzymes, 1 9 90, 3 5, p. 2 1 9 1; Nuc 1 A cids R es, 1 9 8 9, 1 7, p. For hairpin type liposomes, for example, Nature, 1 986, 3 2 3, p. 34 9; Nuc 1 A cids Res, 1 9 9 1, 1 9, p. 6 7 5 1; You can refer to Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology, 1 9 9 2, 3 0, p. By specifically cleaving the transcript of the MCS3 gene in the present invention using such a lipozyme, the expression of the gene can be inhibited.
さらに、 本発明は、 MOC S 3遺伝子の転写活性を阻害する核酸以外 の化合物を有効成分として用いることができる。 そのような化合物は、 例えば、 MOC S 3遺伝子の発現 ·転写に関与する因子に結合する化合 物である。 このような化合物は、 天然物でも合成化合物でもよい。 この ような化合物は、 後述のスクリーニング方法によって、 取得することが 可能である。  Furthermore, in the present invention, a compound other than a nucleic acid that inhibits the transcriptional activity of the MOC S3 gene can be used as an active ingredient. Such a compound is, for example, a compound that binds to a factor involved in the expression / transcription of the MOCS3 gene. Such a compound may be a natural product or a synthetic compound. Such a compound can be obtained by the screening method described below.
1. 2 MOC S 3タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤 本発明はまた、 別の実施形態において、 MO C S 3タンパク質の活性 阻害物質を含有するがん治療剤を提供する。 1. 2 Cancer therapeutic agent containing an activity inhibitor of MOC S 3 protein In another embodiment, the present invention also provides activity of MO CS 3 protein. Provided is a cancer therapeutic agent containing an inhibitor.
本明細書中、 「MO C S 3タンパク質の活性阻害物質」 には、 例えば  In the present specification, “MO C S 3 protein activity inhibitor” includes, for example,
(a) MOC S 3タンパク質に結合する抗体、 (a) an antibody that binds to the MOC S 3 protein,
( b ) M O C S 3タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を 有する MOC S 3タンパク質変異体、 あるいは  (b) a MOC S 3 protein variant having a dominant negative property with respect to the M O C S 3 protein, or
(c ) MOC S 3タンパク質に結合する化合物 （上記抗体および変異 体を除く）  (c) Compound that binds to MOC S 3 protein (excluding the above-mentioned antibodies and variants)
などが含まれる。 Etc. are included.
本明細書における 「抗体」 とはタンパク質の全長又は断片に反応する 抗体を意味する。 本発明の抗体の形態には、 特に制限はなく、 本発明の As used herein, “antibody” means an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein. There is no particular limitation on the form of the antibody of the present invention.
M〇 C S 3タンパク質に結合する限り、 上記ポリクローナル抗体、 モノ クロ一ナル抗体のほかに、 ヒト抗体、 遺伝子組み換えによるヒト型化抗 体、 さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。 MO C S 3タンパク 質に結合する抗体 （抗 MOC S 3抗体） は、 当業者に公知の方法により 調製することが可能である。 なお、 抗 MO C S 3抗体の詳細については 後述する。' As long as it binds to the MCS3 protein, it includes human antibodies, humanized antibodies by genetic recombination, as well as antibody fragments and modified antibodies, in addition to the above-mentioned polyclonal and monoclonal antibodies. Antibodies that bind to MO C S 3 protein (anti-MOC S 3 antibodies) can be prepared by methods known to those skilled in the art. Details of the anti-MO C S 3 antibody will be described later. '
本明細書における 「MO C S 3タンパク質に対してドミナントネガテ イブの性質を有する MO C S 3タンパク質変異体」 とは、 それをコード する遺伝子を発現させることによって、 内在性の野生型 MO C S 3タン パク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す (土田邦博著、 遺伝子の活'性阻害実験法 多比良和誠編、 羊土社 （2 0 0 1 ) 2 6— 3 2など参照） 。  In this specification, “MO CS 3 protein mutant having a dominant negative property relative to MO CS 3 protein” refers to an endogenous wild type MO CS 3 protein expressed by expressing a gene encoding the same. This refers to a protein having a function of eliminating or reducing the quality activity (see Kunihiro Tsuchida, Gene Activity Inhibition Experiment, edited by Yoshikazu Tahira, Yodosha (2 0 1) 2 6-3 2).
さらに、 本発明においては、 MO C S 3タンパク質の活性を阻害し得 る物質として、 MO C S 3タンパク質に結合する、 上記抗体または変異 体以外の化合物を有効成分として用いることができる。 そのような化合 物は、 例えば、 MO C S 3タンパク質に結合し、 その活性を阻害する化 合物である。 このような化合物は、 天然物でも合成化合物でもよい。 こ のような化合物は、 後述のスクリーニング方法によって、 取得すること が可能である。 Furthermore, in the present invention, as a substance capable of inhibiting the activity of MOCS3 protein, a compound other than the above antibody or mutant that binds to MOCS3 protein can be used as an active ingredient. Such a compound is, for example, a compound that binds to MO CS 3 protein and inhibits its activity. Such a compound may be a natural product or a synthetic compound. Such compounds should be obtained by screening methods described below. Is possible.
上記した本発明の M〇 C S 3タンパク質の活性を阻害し得る物質は、 がん治療剤として使用することができる。 2. MO C S 3タンパク質の活性もしくは発現を阻害する物質のスク リーニング方法  The substance capable of inhibiting the activity of the above-described MCS3 protein of the present invention can be used as a cancer therapeutic agent. 2. Screening method for substances that inhibit the activity or expression of MO C S 3 protein
本発明は、 がん抑制作用を有する候補化合物のスクリ一二ング方法を も提供する。  The present invention also provides a method for screening a candidate compound having a cancer suppressing action.
一つの好ましい態様は、 MO C S 3夕ンパク質と被検化合物との結合 を指標とする方法である。 通常、 M〇 C S 3タンパク質と結合する化合 物は、 MO C S 3タンパク質の活性を阻害する効果を有することが期待 される。 ここで、 該化合物は、 MO C S 3タンパク質の活性部位に結合 することが好ましい。 本方法においては、 まず、 MOC S 3タンパク質 と被検化合物とを接触させる。 MO C S 3タンパク質は、 被検化合物と の結合を検出するための指標に応じて、 例えば、 MOC S 3タンパク質 の精製された形態、 細胞内または細胞外に発現した形態、 あるいはァフ ィ二ティーカラムに結合した形態であり得る。 この方法に用いる被検化 合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。 標識としては、 例えば、 放射標識、 蛍光標識等を挙げることができる。  One preferred embodiment is a method using as an index the binding between the MOCS 3 protein and the test compound. In general, a compound that binds to MCS3 protein is expected to have an effect of inhibiting the activity of MOCS3 protein. Here, the compound preferably binds to the active site of the MOCS3 protein. In this method, first, the MOC S 3 protein is contacted with a test compound. The MOCS 3 protein can be used, for example, in a purified form of the MOCS3 protein, in a form expressed intracellularly or extracellularly, or affinity, depending on the indicator for detecting binding to the test compound. It can be in the form bound to a column. The test compound used in this method can be appropriately labeled as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label.
本方法においては、 次いで、 M〇 C S 3タンパク質と被検化合物との 結合を検出する。  Next, in this method, the binding between the MCS3 protein and the test compound is detected.
本方法に用いる被検化合物としては、 特に制限はない。 例えば、 天然 化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプチドなどの単一化 合物、 並びに、 化合物ライブラリ一、 遺伝子ライブラリーの発現産物、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物 抽出物等が挙げられるが、 これらに限定されない。  There is no restriction | limiting in particular as a test compound used for this method. For example, natural compounds, organic compounds, inorganic compounds, proteins, peptides, etc., as well as compound libraries, gene library expression products, cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, oceans Examples include, but are not limited to, biological extracts and plant extracts.
M〇 C S 3タンパク質と被検化合物との結合は、 例えば、 MO C S 3 タンパク質に結合した被検化合物に付された標識によって検出すること ができる。 また、 細胞内または細胞外に発現している M〇 C S 3タンパ ク質への被検化合物の結合により生じる MO C S 3タンパク質の活性の 変化を指標として検出することもできる。 タンパク質と被検化合物との 結合活性は、 公知の手法によって測定することができる （例えば、 N i t r a t e r e d u c t a s e活性や S u l f u r t r a n s f e r a s e 活性の測定 （M a t t h i e s , A. e t a 1. ( 2 0 04) P N A S 1 0 1 ( 1 6 ) ， 5 94 6 - 5 9 5 1参照） ） 。 本方法においては、 次いで、 MO C S 3タンパク質と結合し、 その活 性を阻害する被検化合物を選択する。 The binding between the M CS3 protein and the test compound can be detected by, for example, a label attached to the test compound bound to the MOCS3 protein. In addition, M〇 CS 3 tamper expressed inside or outside the cell. Changes in the activity of the MO CS 3 protein caused by the binding of the test compound to the protein can also be detected as an index. The binding activity between a protein and a test compound can be measured by a known method (for example, measurement of Nitratereductase activity or Sulfurtransferase activity (Matthies, A. eta 1. (2 0 04) PNAS 1 0 1 (Refer to (16), 594 6-5 9 5 1)). In this method, a test compound that binds to the MOCS3 protein and inhibits its activity is then selected.
本方法により単離される化合物は、 がん抑制作用を有することが期待 され、 がん治療剤として有用である。  The compound isolated by this method is expected to have a cancer suppressing action and is useful as a cancer therapeutic agent.
本発明のスクリ一ニング方法の他の態様は、 MO C S 3遺伝子の発現 を指標とする方法である。  Another embodiment of the screening method of the present invention is a method using the expression of the MOCS3 gene as an index.
本方法においては、 まず、 M〇C S 3遺伝子を発現する細胞に、 被検 化合物を接触させる。 用いられる 「細胞」 の由来としては、 ヒト、 マウ ス、 ネコ、 ィヌ、 ゥシ、 ヒッジ、 トリなど、 ペット、 家畜等に由来する 細胞が挙げられるが、 これら由来に制限されない。 「M〇C S 3遺伝子 を発現する細胞」 としては、 内因性の MO C S 3遺伝子を発現している 細胞、 または外因性の MOC S 3遺伝子が導入され、 該遺伝子が発現し ている細胞を利用することができる。 外因性の MOC S 3遺伝子が発現 した細胞は、 通常、 それぞれ MOC S 3遺伝子が挿入された発現べクタ —を宿主細胞へ導入することにより作製することができる。 該発現べク 夕一は、 一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。  In this method, first, a test compound is brought into contact with a cell expressing the MCS3 gene. Examples of the origin of the “cell” used include cells derived from pets, livestock, etc., such as humans, mice, cats, cats, dogs, eagle, birds, but not limited to these. “Cells that express the MCS3 gene” include cells that express the endogenous MOCS3 gene, or cells that have had the exogenous MOCS3 gene introduced and expressed. can do. A cell in which an exogenous MOC S 3 gene is expressed can usually be produced by introducing an expression vector into which a MOC S 3 gene has been inserted into a host cell. The expression vector can be prepared by general genetic engineering techniques.
本方法に用いる被検化合物としては、 特に制限はないが、 例えば、 天 然化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプチドなどの単一 化合物、 並びに、 化合物ライブラリー、 遺伝子ライブラリーの発現産物 、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海洋生物抽出物、 植 物抽出物等が用いられる。  The test compound used in this method is not particularly limited. For example, a natural compound, an organic compound, an inorganic compound, a single compound such as a protein, a peptide, etc., and a compound library, an expression product of a gene library, Cell extracts, cell culture supernatants, fermented microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, etc. are used.
MOC S 3遺伝子を発現する細胞への被検化合物の 「接触」 は、 通常 、 それぞれ MOC S 3遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添 加することによって行うが、 この方法に限定されない。 被検化合物が夕 ンパク質等の場合には、 該タンパク質を発現する DNAベクタ一を、 該 細胞へ導入することにより、 「接触」 を行うことができる。 The “contact” of the test compound to the cell expressing the MOC S 3 gene usually involves adding the test compound to the culture medium of the cell expressing the MOC S 3 gene. However, it is not limited to this method. When the test compound is a protein or the like, “contact” can be performed by introducing a DNA vector expressing the protein into the cell.
本方法においては、 次いで、 該 MOC S 3遺伝子の発現レベルを測定 する。 ここで 「遺伝子の発現」 には、 転写および翻訳の双方が含まれる 。 遺伝子の発現レベルの測定は、 当業者に公知の方法によって行うこと ができる。 例えば、 MO C S 3遺伝子を発現する細胞から mRNAを常 法に従って抽出し、 この mRN Aを铸型としたノーザンハイプリダイゼ —シヨン法または RT— P C R法を実施することによって該遺伝子の転 写レベルの測定を行うことができる。 あるいは、 MOC S 3遺伝子のプ ロモ一夕一領域を常法に従って単離し、 その下流に標識遺伝子 （例えば 、 ルシフェラーゼ、 GF P、 ガラク トシダーゼ等の発光、 蛍光、 発色な どを指標に検出可能な遺伝子が挙げられるが、 これらに限定されない） をつなげ、 その標識遺伝子の活性を見ることによっても該遺伝子の転写 レベルの測定を行うことができる。 また、 MO C S 3遺伝子を発現する 細胞からタンパク質画分を回収し、 それぞれ MO C S 3夕ンパク質の発 現を S D S— P AGE等の電気泳動法で検出することにより、 遺伝子の 翻訳レベルの測定を行うこともできる。 さらに、 MOC S 3タンパク質 に対する抗体を用いて、 ウエスタンプロッティング法を実施することに より該タンパク質の発現を検出することにより、 遺伝子の翻訳レベルの 測定を行うことも可能である。 MO C S 3タンパク質の検出に用いる抗 体としては、 検出可能な抗体であれば、 特に制限はないが、 例えばモノ クローナル抗体、 またはポリクロ一ナル抗体の両方を利用することがで さる。  In this method, the expression level of the MOCS 3 gene is then measured. Here, “expression of a gene” includes both transcription and translation. The expression level of a gene can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, mRNA is extracted from cells expressing the MO CS 3 gene according to a conventional method, and the transcription level of the gene is obtained by carrying out the Northern hypridase-chasion method or RT-PCR method using this mRNA as a cocoon. Can be measured. Alternatively, the promoter region of the MOC S 3 gene can be isolated according to a conventional method and detected downstream of the labeled gene (eg, luminescence, fluorescence, coloration, etc. of luciferase, GFP, galactosidase, etc.) The transcription level of the gene can also be measured by linking the gene (including but not limited to) and observing the activity of the marker gene. In addition, protein fractions are collected from cells that express the MO CS 3 gene, and the expression level of the MO CS 3 protein is detected by electrophoresis such as SDS-PAGE to measure the translation level of the gene. Can also be done. Furthermore, it is also possible to measure the translation level of a gene by detecting the expression of the protein by performing a Western plotting method using an antibody against the MOC S 3 protein. The antibody used for detecting the MOCS3 protein is not particularly limited as long as it is a detectable antibody. For example, both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used.
本方法においては、 次いで、 被検化合物を接触させない場合 （コント ロール） と比較して、 該発現レベルを低下させる化合物を選択する。 こ のようにして選択された化合物は、 がん治療剤のための候補化合物とな る。 3. 抗 MO C S 3抗体及ぴこの抗体を含有する治療 _剤、 複合体および 組成物 In this method, a compound that decreases the expression level is then selected as compared with the case where the test compound is not contacted (control). Compounds selected in this way become candidate compounds for cancer therapeutics. 3. Anti-MO CS 3 antibody and therapeutic agent containing this antibody_complex, complex and composition
本発明はまた、 抗 MO C S 3抗体、 この抗体を含有するがん治療剤な どを提供する。 本発明の 1つの好ましい態様では、 上記がん治療剤は、 がんの標的化療法または標的化薬物送達のために使用される。  The present invention also provides an anti-MOCS 3 antibody, a cancer therapeutic agent containing this antibody, and the like. In one preferred embodiment of the present invention, the cancer therapeutic agent is used for cancer targeted therapy or targeted drug delivery.
3. 1 抗 MO C S 3抗体  3.1 Anti-MO C S 3 antibody
本明細書中、 「抗 MOC S 3抗体」 には、 M〇C S 3タンパク質 （そ の断片 （部分ペプチド） もしくはその塩を含む） に特異的に結合する抗 体が含まれる。 本発明において使用する抗 MO C S 3抗体は、 ポリクロ ーナル抗体であってもよいし、 モノクローナル抗体であってもよい。 抗 体のクラスは、 特に限定されず、 I g G、 I gM、 I g A、 I g D、 ま たは I g E等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。 好ま しくは、 I g Gまたは I gMであり、 精製の容易性等を考慮すると、 よ り好ましくは I g Gである。 また、 ここでいう 「抗体」 という用語は、 任意の抗体断片または誘導体を含む意味で用いられ、 例えば、 F a b、 F a b ' 2、 CDR、 ヒト化抗体、 多機能抗体、 単鎖抗体 （S c F v) などを含む。 本発明の抗体は、 公知の方法で製造することができる。 こ のような抗体の製造法は当該分野で周知である （例えば H a r 1 o w E . & L a n e D. , An t i b o d y, C o l d S p r « i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 9 8 8 ) を参照） 。 In the present specification, “anti-MOC S 3 antibody” includes an antibody that specifically binds to MCS3 protein (including fragments (partial peptides) or salts thereof). The anti-MOCS3 antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in view of ease of purification. The term “antibody” is used to mean any antibody fragment or derivative. For example, F ab, F ab ' 2 , CDR, humanized antibody, multifunctional antibody, single chain antibody (S c F v) etc. The antibody of the present invention can be produced by a known method. Methods for producing such antibodies are well known in the art (eg, Har 1 ow E. & Lane D., Antibody, Old Spr «ing Harbor Laboratory Pres (1 9 8 8)). See).
( 1 ) 抗原の調製 (1) Preparation of antigen
本発明において、 感作抗原として使用されるタンパク質は、 通常、 M O C S 3タンパク質またはその塩である。 上記 MO C S 3タンパク質に は、 その部分ペプチドも含まれ、 これは、 限定されることはないが、 例 えば、 配列番号： 2のアミノ酸配列の断片であって、 例えば、 2 0個以 上、 4 0個以上、 6 0個以上、 8 0個以上、 1 0 0個以上の、 連続する アミノ酸配列部分を有する部分べプチドである。 これらの断片として、 例えば、 ァミノ （N) 末端断片やカルポキシ （C) 末端断片が用いられ る。 本発明で用いられる部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1また は 2個以上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1 〜 6個） ) のアミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入及び Z又は付加されたも のであってもよい。 ここで用いられる MO C S 3タンパク質またはその 部分ペプチドの塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 硫酸） と の塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸） との塩な どが用いられる。 抗体取得の感作抗原として使用される本発明の M〇 C S 3タンパク質は、 その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、 例えばマウス、 ヒト由来のタンパク質が好ましく、 特にヒト由来のタン パク質が好ましい。 In the present invention, the protein used as the sensitizing antigen is usually MOCS 3 protein or a salt thereof. The MO CS 3 protein also includes a partial peptide thereof, which is not limited to, for example, a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, 20 or more, A partial peptide having 40 or more, 60 or more, 80 or more, 100 or more consecutive amino acid sequence portions. As these fragments, For example, an amino (N) terminal fragment or a carboxy (C) terminal fragment is used. In the partial peptide used in the present invention, one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 6)) amino acid residues in the above amino acid sequence are deleted. , Substitutions, insertions and Z or additions. Examples of salts of MO CS 3 protein or partial peptides used herein include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid), and salts with organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid). Is used. The M0 CS3 protein of the present invention used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal such as a mouse or human, and particularly a human-derived protein. Is preferred.
( 2 ) MO C S 3夕ンパク質に対するモノクローナル抗体の作製 (2) Production of monoclonal antibody against MO C S 3 protein
( i ) 抗体産生細胞の採取  (i) Collection of antibody-producing cells
上記のような MOC S 3タンパク質、 その部分ペプチド又はその塩 （ 本明細書中、 抗体に関する説明では、 これらをまとめて、 「M〇 C S 3 タンパク質」 という。 ） を抗原として、 哺乳動物、 例えばラット、 マウ ス、 ゥサギなどに投与する。 抗原の動物 1匹当たりの投与量は、 アジュ バントを用いないときは 0. l〜 1 0 0 mgであり、 アジュバントを用 いるときは l〜 1 0 0 z gである。 アジュバントとしては、 フロイント 完全アジュバント. （F C A) 、 フロイン卜不完全アジュバント （F I A ) 、 水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。 免疫は、 主とし て静脈内、 皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。 また、 免 疫の間隔は特に限定されず、 数日から数週間間隔、 好ましくは 2〜 5週 間間隔で、 1〜 1 0回、 好ましくは 2〜 5回免疫を行う。 そして、 最終 の免疫日から 1〜6 0 日後、 好ましくは 1〜 1 4日後に抗体産生細胞を 採集する。 抗体産生細胞としては、 脾臓細胞、 リンパ節細胞、 末梢血細 胞等が挙げられるが、 脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。  The above-described MOC S 3 protein, a partial peptide thereof or a salt thereof (in the present specification, these are collectively referred to as “M0 CS 3 protein”) as an antigen, and a mammal such as a rat , Mouse, and rabbit. The dose of antigen per animal is 0.1 to 100 mg when adjuvant is not used, and 1 to 100 zg when adjuvant is used. Examples of adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. The interval between immunizations is not particularly limited, and immunization is carried out 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 5 weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days after the last immunization day, preferably 1 to 14 days later. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells and the like, and spleen cells or local lymph node cells are preferred.
( i i ) 細胞融合 ハイプリ ドーマを得るため、 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞 融合を行う。 抗体産生細胞と融合させるミエ口一マ細胞として、 マウス などの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。 使用 する細胞株としては、 薬剤選択性を有し、 未融合の状態では HAT選択 培地 （ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジンを含む） で生存でき ず、 抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが 好ましい。 ミエ口一マ細胞としては、 例えば X 6 3 A g. 8. 6 5 3 、 NS I / 1— Ag 4— 1、 N S 0 Z 1などのマウスミエ口一マ細胞株 、 YB 2Z0などのラッ トミエローマ細胞株が挙げられる。 (ii) Cell fusion Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed in order to obtain a hybridoma. As a myeloma cell to be fused with an antibody-producing cell, a generally available cell line of an animal such as a mouse can be used. The cell line to be used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. It is preferable to have Examples of myeoma cells include mouse myeoma cells such as X 6 3 A g. 8. 65 3, NS I / 1—Ag 4-1, NS 0 Z 1, and rat myeloma such as YB 2Z0. Cell lines.
次に、 上記ミエ口一マ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。 細胞 融合は、 血清を含まない DMEM、 R P M I — 1 6 40培地などの動物 細胞培養用培地中で、 1 X 1 0 s〜 1 X 1 07個 Zm 1 の抗体産生細胞 と 2 X 1 05〜 2 X 1 06個/ m 1 のミエ口一マ細胞とを混合し （抗体 産生細胞とミエ口一マ細胞との細胞比 2 ： 1〜 3 ： 1が好ましい） 、 細 胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。 細胞融合促進剤として、 平 均分子量 1 0 0 0〜 6 0 0 0ダルトンのポリエチレングリコ一ル等を使 用することができる。 また、 電気剌激 （例えばエレクト口ポレーシヨン ) を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細 胞とを融合させることもできる。 Next, the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused. Cell fusion consists of 1 X 10 s to 1 X 10 7 Zm 1 antibody-producing cells and 2 X 1 0 5 in animal cell culture media such as serum-free DMEM, RPMI — 1 6 40 medium, etc. ~ 2 X 1 0 6 cells / m 1 of the Mie port Ichima cells were mixed (antibody producing cells and myeloma port Ichima cells and cell ratio of 2: 1 to 3: 1 is preferred), cells fusion promoter Perform fusion reaction in the presence. As the cell fusion promoter, polyethylene glycol having an average molecular weight of 100 to 60,000 daltons can be used. In addition, antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device using an electric stimulus (for example, electoral position).
( i i i ) ハイプリ ドーマの選別及びクロ一ニング  (i i i) Selection and cloning of high-prix dormers
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリ ドーマを選別する。 そ の方法として、 細胞懸濁液を例えばゥシ胎児血清含有 R PM 1 - 1 64 0培地などで適当に希釈後、 マイクロ夕イタ一プレート上に 3 X 1 05 個/ we l 1程度まき、 各ゥエルに選択培地を加え、 以後適当に選択培 地を交換して培養を行う。 その結果、 選択培地で培養開始後、 1 4日前 後から生育してくる細胞をハイプリ ドーマとして得ることができる。 次に、 増殖してきたハイプリ ドーマの培養上清中に、 MOC Sタンパ ク質に反応する抗体が存在するか否かをスクリ一二ングする。 ハイプリ ドーマのスクリーニングは、 通常の方法に従えばよく、 特に限定される ものではない。 例えば、 ハイブリ ド一マとして生育したゥエルに含まれ る培養上清の一部を採集し、 酵素免疫測定法、 放射性免疫測定法等によ つてスクリーニングすることができる。 融合細胞のクロ一ニングは、 限 界希釈法等により行う。 そして、 最終的に、 MOC Sタンパク質と反応 するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイプリ ドーマを樹立す る。 Select the desired hybridoma from the cells after cell fusion treatment. As a method for this, the cell suspension is appropriately diluted with, for example, RPM 1-1640 medium containing fetal bovine serum, and then plated on a microtiter plate at about 3 × 10 5 cells / wel1. Add the selective medium to each well, and then change the selected medium appropriately. As a result, cells that grow 14 days before or after the start of culture in the selective medium can be obtained as a hybridoma. Next, screening is performed to determine whether antibodies that react with the MOC S protein are present in the culture supernatant of the growing hybridoma. The screening of hypridoromas can be carried out in accordance with usual methods, and is particularly limited. It is not a thing. For example, a portion of the culture supernatant contained in a well grown as a hybrid can be collected and screened by enzyme immunoassay, radioimmunoassay, or the like. Cloning of fused cells is performed by limiting dilution. Finally, a hybridoma that is a cell producing a monoclonal antibody that reacts with the MOCS protein is established.
( i v) モノクローナル抗体の採取  (i v) Monoclonal antibody collection
上記のようにして得たハイプリ ドーマからモノクローナル抗体を採取 する方法として、 通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することが できる。 細胞培養法においては、 ハイプリ ドーマを 1 0 %ゥシ胎児血清 含有 R PM I— 1 6 40培地、 MEM培地又は無血清培地等の動物細胞 培養培地中で、 通常の培養条件 （例えば 3 7°C、 5 % C〇2濃度） で 7〜 1 4日間培養し、 その培養上清から抗体を取得する。 腹水形成法の 場合は、 ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブ リ ドーマを約 1 X 1 07個投与し、 ハイプリ ド一マを大量に増殖させる 。 そして、 1〜 2週間後に腹水を採取する。 上記抗体の採取方法におい て抗体の精製が必要とされる場合は、 硫安塩析法、 イオン交換クロマト グラフィ一、 ゲル濾過、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどの公知 の方法を適宜選択して、 又はこれらを組み合わせることにより精製する ことができる。 As a method for collecting a monoclonal antibody from the hybridoma obtained as described above, a normal cell culture method, ascites formation method, or the like can be employed. In the cell culture method, hypridoma containing 10% urchin fetal serum in RPMI-1 640 medium, MEM medium, or serum-free medium or other animal cell culture medium (for example, 37 ° C, and incubated 5% C_〇 7-1 4 days at 2 concentrations), to obtain the culture supernatant antibody. For ascites formation method, the hive re dormer about 1 X 1 0 7 cells were administered intraperitoneally to the mammal of the same species as the animal from which the myeloma cells are derived, is a large amount proliferating High Priestess de one Ma. Ascites is collected after 1-2 weeks. When antibody purification is required in the antibody collection method, a known method such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, etc. is appropriately selected, or It can be purified by combining these.
( 3 ) MO C S 3タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製 まず、 上記した抗原を哺乳動物、 例えばラッ 卜、 マウス、 ゥサギなど に投与する。 抗原の動物 1匹当たりの投与量は、 アジュバントを用いな いときは 0. 1〜： L O O mgであり、 アジュバントを用いるときは 1 0 〜 1 0 0 0 gである。 アジュバントとしては、 フロイント完全アジュ バント （F CA) 、 フロイント不完全アジュバント （F I A) 、 水酸化 アルミニウムアジュバント等が挙げられる。 免疫は、 主として静脈内、 皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。 また、 免疫の間隔は 特に限定されず、 数日から数週間間隔、 好ましくは 2〜 5週間間隔で、 1〜 1 0回、 好ましくは 2〜 5回免疫を行う。 そして、 最終の免疫日か ら 6〜 6 0 日後に、 酵素免疫測定法 （E L I S A ( e n z urn e - 1 i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s y) 又は E I A ( e n z y m e i mm u n o a s s a y) ) 、 放射性免疫測定法 （R I A ； r a d i o i mmu n o a s s a y) 等で抗体価を測定し、 最大の 抗体価を示した日に採血し、 抗血清を得る。 (3) Preparation of polyclonal antibody against MOCS 3 protein First, the above-mentioned antigen is administered to mammals such as rabbits, mice, and rabbits. The dose of antigen per animal is 0.1 to LOO mg when no adjuvant is used, and 10 to 100 g when adjuvant is used. Examples of adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally. Also, the immunity interval is There is no particular limitation, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks. 6 to 60 days after the last immunization, enzyme immunoassay (ELISA (enzyme -1 unosorbentassy) or EIA (enzyme unoassay)), radioimmunoassay (RIA; radioi mmu noassay) ), Etc., and blood is collected on the day when the maximum antibody titer is shown to obtain antiserum.
次いで、 例えば、 抗血清中のポリクロ一ナル抗体を、 MO C S 3タン パク質で固定されたァフィ二ティ一カラムにかけて MO C S 3タンパク 質と反応する抗体 （カラム吸着画分） を採取する。 MOC S 3タンパク 質に対する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性は、 E L I S A法な どで測定することができる。  Next, for example, an antibody (column adsorbed fraction) that reacts with the MO C S 3 protein is collected by applying the polyclonal antibody in the antiserum to an affinity column fixed with the MO C S 3 protein. The reactivity of the polyclonal antibody in the antiserum against the MOC S 3 protein can be measured by the ELISA method or the like.
(4) 抗体の断片など(4) Antibody fragments
& 13または 313， 2断片は、 従来の方法によるプロテア一ゼ （例 えば、 ペプシンまたはパパイン） を用いた消化により作製することがで きる。 ヒト化抗体は、 例えば R i e c hma n nら （R i e c hma n n J o 1 B i o l . O c t 5 ; 2 0 3 (3 ) : 8 2 5— 8 , 1 9 8 8 ) 、 および J o n e s ら （ J o n e s ら N a t u r e 3 2 1 ： 5 2 2 - 5 2 5 , 1 9 8 6 ) に記載のような方法の 1つにより調 製することができる。 & 13 or 313, 2 fragment (For example, pepsin or papain) Protea Ichize by conventional methods as possible out be produced by digestion with. Humanized antibodies are described, for example, by Riec hma nn et al. (Riec hma nn J o 1 Biol. Oct 5; 2 0 3 (3): 8 2 5—8, 1 9 8 8), and J ones et al. J ones et al. Nature 3 2 1: 5 2 2-5 2 5, 1 986)).
また、 キメラ抗体は、 例えば、 「実験医学 （臨時増刊号） 、 V o 1. 1. 6， N o . 1 0， 1 9 8 8」 、 特公平 3— 7 3 2 8 0号公報等を、 ヒト化抗体は、 例えば、 「N a t u r e G e n e t i c s , V o l . 1 5 , p . 1 4 6 - 1 5 6 , 1 9 9 7」 、 「 N a t u r e G e n e t i c s , V o l . 7 , p . 1 3 - 2 1 , 1 9 9 4」 、 特表平 4 - 5 0 4 3 6 5号公報、 国際出願公開 WO 9 4 - 2 5 5 8 5号公報等、 「日経サ ィエンス、 6月号、 第 4 0〜第 5 0頁、 1 9 9 5年」 、 「N a t u r e , Vo l . 3 6 8 , p. 8 5 6 - 8 5 9 , 1 9 9 4」 、 特表平 6— 5 0 0 2 3 3号公報等を参考にそれぞれ製造することができる。 本発明の M O C S 3タンパク質に結合する抗体は、 例えば、 癌細胞の増殖もしくは 転移の抑制等を目的とレた使用が考えられる。 得られた抗体を人体に投 与する目的 （抗体治療） で使用する場合には、 免疫原性を低下させるた め、 ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。 Chimeric antibodies include, for example, “Experimental Medicine (Special issue), V o 1. 1.6, No. 1 0, 1 9 8 8”, Japanese Patent Publication No. 3-7 3 2 8 , Humanized antibodies include, for example, “Nature Genetics, Vol. 15, p. 1 4 6-1 5 6, 1 997”, “Nature Genetics, Vol. 7, p. 1 `` 3-2 1, 1 9 94 '', JP 4-5 0 4 3 6 5 gazette, International application publication WO 9 4-2 5 5 8 5 gazette, etc., `` Nikkei Science, June issue, Pp. 40 to 50, 1 995 "," Nature, Vol. 3 6 8, p. 8 5 6-8 5 9, 1 9 94 " Each can be produced with reference to No. 0 2 3 3 and the like. The antibody that binds to the MOCS 3 protein of the present invention can be used for the purpose of, for example, suppressing the growth or metastasis of cancer cells. When the obtained antibody is used for the purpose of administering it to the human body (antibody therapy), a human antibody or a human-type antibody is preferred in order to reduce immunogenicity.
抗体は、 診断剤として用いる場合は、 モニタリング等のための標識物 質 （例えば、 放射性同位元素、 蛍光物質など） で標識されていてもよい 。 必要に応じて、 放射性物質、 蛍光化合物などにより標識することがで きる。 最も慣用の蛍光標識化合物の中には、 フルォレセィンィソチオシ ァネート、 ローダミン、 フィコエリ トリンおよびフルォレス力ミンがぁ る。 同様に、 生体発光性化合物を用いて、 抗体 M O C S 3抗体を標識す ることもできる。 生体発光性タンパク質の存在は、 蛍光の存在を検出す ることによって測定される。 この標識目的に重要な生体発光性化合物は 、 ルシフェリン、 ルシフェラ一ゼおよびイエクオリンである。  When used as a diagnostic agent, the antibody may be labeled with a labeling substance for monitoring or the like (for example, a radioisotope, a fluorescent substance, etc.). If necessary, it can be labeled with radioactive substances, fluorescent compounds, etc. Among the most commonly used fluorescent labeling compounds are fluorescein sothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin and fluorescein. Similarly, the antibody MOCS3 antibody can be labeled using a bioluminescent compound. The presence of a bioluminescent protein is measured by detecting the presence of fluorescence. Important bioluminescent compounds for this purpose are luciferin, luciferase and aequorin.
なお、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する M〇 C S 3タンパク質等を特異的に検出するために使用することができる。 ま た、 M O C S 3タンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作 製、 精製時の各分画中の M O C S 3タンパク質等の検出、 被検細胞内に おける M O C S 3夕ンパク質の挙動の分析などのために使用することが できる。  The antibody of the present invention can be used for specifically detecting MCS3 protein or the like present in a sample such as a body fluid or tissue. In addition, production of antibody columns used to purify MOCS 3 protein, etc., detection of MOCS 3 protein, etc. in each fraction during purification, analysis of the behavior of MOCS 3 protein in the test cells Can be used for such as.
3 . 2 抗 M O C S 3抗体を含有する複合体など 3.2 Complexes containing anti-MOCS 3 antibody, etc.
また、 本発明において使用する抗 M O C S 3抗体は、 本発明の治療剤 または診断剤において、 それ自体が、 抗原の活性を減弱させるような中 和活性を有する薬剤 （a g e n t ) であり得るが、 必要に応じて、 治療 効果を奏するための他の薬剤と組み合わせて用いることができる。 した がって、 本発明は、 もう一つの態様において、 がん （例えば、 大腸がん ) の標的化療法または標的化イメージング等に使用するための、 抗 M O C S 3抗体と他の薬剤との複合体、 そのような複合体を含有する組成物 などをも提供する。 このような態様によれば、 本発明において使用する 抗 MOC S 3抗体を用いて、 治療効果を奏する他の薬剤または診断のた めの標識剤などを、 MO C S 3タンパク質を高発現する標的部位へ送達 することができる。 In addition, the anti-MOCS 3 antibody used in the present invention may be an agent having neutral activity that attenuates the activity of the antigen in the therapeutic agent or diagnostic agent of the present invention. Depending on the condition, it can be used in combination with other drugs for producing a therapeutic effect. Therefore, in another aspect, the present invention provides a combination of an anti-MOCS 3 antibody and another drug for use in targeted therapy or targeted imaging of cancer (eg, colorectal cancer). Body, composition containing such a complex Etc. are also provided. According to such an embodiment, the anti-MOC S 3 antibody used in the present invention is used to target other drugs having a therapeutic effect or a labeling agent for diagnosis, etc., to highly express the MO CS 3 protein. Can be delivered to.
本発明において用いられる 「その他の薬剤」 としては、 例えば、 放射 性同位元素、 治療タンパク質、 または低分子の薬剤など、 標的への遺伝 子導入のためのウィルスベクターもしくは非ウィルスベクターなどが例 示される。  Examples of the “other drug” used in the present invention include a viral vector or a non-viral vector for introducing a gene into a target, such as a radioisotope, a therapeutic protein, or a small molecule drug. .
本発明において、 「放射性同位元素」 の例としては、 フッ素— 1 8、 ヨウ素— 1 2 5 (125 I ) 、 およびヨウ素一 1 3 1などの放射性ハロゲ ン元素が挙げられる。 これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属 元素と同様に抗体やべプチドに標識して、 放射性治治療剤あるいは放射 性診断剤として広く利用し得る。 例えば、 125 Iまたは131 Iでのョー ド化は、 クロラミン T法等の公知の方法により、 抗体または抗体断片に 結合させることができる。 さらに、 診断用としてはテクネチウム一 9 9 m、 インジウム一 1 1 1およびガリウム一 6 7 ( 6 7 G a ) など、 また 治療用としてはイッ トリウム— 9 0 ( 9 0 Y) 、 レニウム一 1 8 6 (1 S 6 R e ) またはレニウム一 1 8 8 ( 1 88 R e ) などが使用され得る。 放 射性同位元素を用いて抗体に標識する場合には、 通常、 金属キレート剤 が用いられる。 金属キレート剤としては、 EDTA、 DTPA、 ジアミ ノジチォ化合物、 サイクラム、 および D OT Aなどが知られている。 こ れらのキレート剤は抗体に予め結合しておき、 その後放射性金属で標識 する場合と、 放射性金属キレートを形成後、 抗体に結合して標識する方 法がある。 In the present invention, examples of the “radioisotope” include radioactive halogen elements such as fluorine-18, iodine-1225 ( 125I ), and iodine-1313. These radioactive halogen elements can also be widely used as radiotherapeutic agents or radiodiagnostic agents by labeling them with antibodies or peptides in the same manner as the above-mentioned radioactive metal elements. For example, odorization with 125 I or 131 I can be bound to an antibody or antibody fragment by a known method such as the chloramine T method. Furthermore, technetium one 9 9 m for the diagnosis, indium one 1 1 1 and gallium one 6 7 (6 7 G a) such, As the therapeutic acme thorium - 9 0 (9 0 Y) , rhenium one 1 8 6 ( 1 S 6 R e) or rhenium 1 8 8 ( 1 88 Re) can be used. When labeling an antibody with a radioactive isotope, a metal chelator is usually used. Known metal chelating agents include EDTA, DTPA, diaminodithio compound, cyclam, and DOTA. These chelating agents may be pre-bonded to the antibody and then labeled with a radioactive metal, or may be labeled with the antibody after forming a radioactive metal chelate.
本発明において、 「治療タンパク質」 の例としては、 免疫を担う細胞 を活性化するサイ ト力インが好適であり、 例えば、 ヒトインターロイキ ン 2、 ヒト顆粒球—マクロファージーコロニ一剌激因子、 ヒ卜マクロフ ァ一ジコロニー刺激因子、 ヒトインターロイキン 1 2等が挙げられる。 また、 大腸がん細胞を直接殺傷するため、 リシンやジフテリア毒素など の毒素を用いることができる。 例えば、 治療タンパク質との融合抗体に ついては、 抗体または抗体断片をコードする c DN Aに治療タンパク質 をコードする c DN Aを連結させ、 融合抗体をコードする DN Aを構築 し、 この DN Aを原核生物または真核生物用の発現ベクターに挿入し、 この発現べクタ一を原核生物または真核生物へ導入することにより発現 させ、 融合抗体を製造することができる。 In the present invention, as an example of the “therapeutic protein”, a site force-in that activates cells responsible for immunity is suitable. For example, human interleukin 2, human granulocyte-macrophage colony stimulating factor , Macrophage colony stimulating factor, human interleukin 12 and the like. In addition, ricin, diphtheria toxin, etc. are used to directly kill colon cancer cells. The toxins can be used. For example, for a fusion antibody with a therapeutic protein, a cDNA that encodes the therapeutic protein is linked to a cDNA that encodes the antibody or antibody fragment, and a DNA that encodes the fusion antibody is constructed. A fusion antibody can be produced by inserting the expression vector into an expression vector for organisms or eukaryotes and introducing the expression vector into a prokaryote or eukaryote.
「低分子の薬剤」 は、 本明細書中で 「放射性同位元素」 や 「治療タン パク質」 等以外の診断または治療用化合物を意味するものとして用いら れる。 「低分子の薬剤」 の例としては、 ナイ トロジェン ·マスタード、 サイクロファスフアミ ドなどのアルキル化剤、 5—フルォロウラシル、 メソトレキセ一トなどの代謝拮抗剤、 ダウノマイシン、 ブレオマイシン 、 マイ トマイシン C, ダウノルビシン、 ドキソルビシンなどの抗生物質 、 ビンクリスチン、 ビンブラスチン、 ビンデシンのような植物アル力口 イ ド、 夕モキシフェン、 デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤 （ 臨床腫瘍学 （日本臨床腫瘍研究会編 1 9 9 6年 癌と化学療法社） ) 、 またはハイ ド口コーチゾン、 プレドニゾンなどのステロイ ド剤、 ァス ピリン、 インドメ夕シンなどの非ステロイ ド剤、 金チォマレート、 ぺニ シラミンなどの免疫調節剤、 サイクロフォスフアミ ド、 ァザチォプリン などの免疫抑制剤、 マレイン酸クロルフエ二ラミン、 クレマシチンのよ うな抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤 （炎症と抗炎症療法 昭和 5 7年 医 歯薬出版株式会社） などがあげられる。 例えば、 ダウノマイシンと抗体 を結合させる方法としては、 ダルタールアルデヒドを介してダウノマイ シンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、 水溶性カルポジイミ ドを介 してダウノマイシンのァミノ基と抗体の力ルポキシル基を結合させる方 法等があげられる。  “Small molecule drug” is used herein to mean a diagnostic or therapeutic compound other than “radioisotope” or “therapeutic protein”. Examples of “small molecule drugs” include alkylating agents such as nitrogen mustard and cyclophosphamide, antimetabolites such as 5-fluorouracil and methotrexate, daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin, Anticancer agents such as antibiotics such as doxorubicin, plant algaide like vincristine, vinblastine, vindesine, hormonal agents such as evening moxifen, dexamethasone (Clinical Oncology (Japan Clinical Oncology Society 1 9 9 6 Cancer and Chemotherapy company))), or steroids such as cortisone hyde, prednisone, non-sterols such as aspirin and indomethacin, immunomodulators such as gold zomarate and penicillamine, cyclophosphamide , Immunosuppression such as azathioprine , Maleic acid Kurorufue two Ramin, such as anti-inflammatory agents such as good Una antihistamines Kuremashichin (inflammation and anti-inflammatory therapy in 1982 years of Biomedical drug Publishing Co., Ltd.) and the like. For example, daunomycin and antibody can be bound by binding between daunomycin and the amino group of the antibody via dartal aldehyde, or binding of the amino acid group of daunomycin and the antibody's loxyl group via water-soluble calpositimide. For example, the method of combining them.
「ウィルスベクター」 の例としては、 本発明の抗 MO C S 3抗体に結 合し得るように改変されたウィルスベクタ一が使用し得る （例えば、 ァ デノウィルスべクタ一 （Wa n g, P. , e t a 1. ( 1 9 9 5 ) S oma t i c C e l l a n d Mo 1 e c . G e n e t . 2 1， 4 2 9— 44 1 ) 、 レトロウィルスベクター （N a v i a u x R. K. , e t a 1 . ( 1 9 9 6 ) J . V i r o l 7 0 , 5 7 0 1 - 5 7 0 5 ) 、 レンチウィルスベクター （N a l d i n i , L . ( 1 9 9 8 ) C u r r . O p i n. B i o t e c h n o l . 9 , 45 7— 46 3 ) などが挙げられる） 。 このようなウィルス ベクターには、 細胞増殖関連遺伝子、 アポトーシス関連遺伝子、 免疫制 御遺伝子等の、 標的部位 （例えば、 大腸がん） において、 例えば、 癌細 胞のアポトーシスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子 （治療遺伝 子） が組み込まれる。 抗 M〇C S 3抗体に結合するウィルスベクターは 、 抗 M〇 C S 3抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与された場 合、 抗 MO C S 3抗体が認識する抗原 （すなわち、 MO C S 3) が存在 する部位に標的化することができる。 As an example of a “viral vector”, a viral vector modified so as to be able to bind to the anti-MOCS 3 antibody of the present invention can be used (for example, an adenovirus vector (Wang, P., eta 1. (1 9 9 5) Soma tic Celland Mo 1 ec. 2 1, 4 2 9— 44 1), retroviral vectors (N aviaux RK, eta 1. (1 9 9 6) J. Virol 7 0, 5 7 0 1-5 7 0 5), lentiviral vectors ( N aldini, L. (1 9 9 8) Curr. Opin. B iotechnol. 9, 45 7- 46 3)). Such viral vectors have therapeutic effects such as inducing apoptosis of cancer cells at target sites (eg, colon cancer) such as cell proliferation-related genes, apoptosis-related genes, immune control genes, etc. The gene to be played (therapeutic gene) is incorporated. Anti-MOCS3 antibody-binding viral vector, when administered to patients in need of gene therapy together with anti-MOCS3 antibody, antigen recognized by anti-MOCS3 antibody (ie MOCS3) Can be targeted to the site where is present.
抗 MOC S 3抗体と上記他の薬剤とは、 化学的または遺伝子工学的に 結合され得る。 ここで、 「化学的な結合」 には、 イオン結合、 水素結合 、 共有結合、 分子間力による結合、 疎水性相互作用による結合などが含 まれるものとし、 「遺伝子工学的な結合」 には、 例えば、 抗体と治療夕 ンパク質とからなる融合タンパク質を遺伝子組換えなどの技術を用いて 作製した場合の、 抗体と治療夕ンパク質との間の結合様式などが含まれ るものとする。  The anti-MOC S 3 antibody and the other drug can be combined chemically or genetically. Here, “chemical bond” includes ionic bond, hydrogen bond, covalent bond, bond by intermolecular force, bond by hydrophobic interaction, etc., and “gene engineering bond” For example, it includes the binding mode between an antibody and a therapeutic protein when a fusion protein comprising an antibody and a therapeutic protein is produced using a technique such as genetic recombination.
4. 製剤化および製剤の投与方法 4. Formulation and administration method
本発明の MOC S 3遺伝子の発現阻害物質を含有するがん治療剤、 M OC S 3タンパク質の活性阻害物質を含有するがん治療剤、 本発明の抗 MOC S 3抗体を含有する治療剤、 または本発明において使用する抗 M OC S 3抗体が、 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低分子の薬剤、 お よび治療遺伝子を担持したウィルスベクターもしくは非ウィルスベクタ 一のうちのいずれか、 またはこれらの任意の組み合わせと化学的または 遺伝子工学的に結合されている治療剤は、 公知の手法に基づいて製剤化 することができる。 本発明の治療剤の製剤化にあたっては、 常法に従い、 必要に応じて薬 学的に許容される担体を添加することができる。 例えば、 界面活性剤、 賦形剤、 着色料、 着香料、 保存料、 安定剤、 緩衝剤、 懸濁.剤、 等張化剤 、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 流動性促進剤、 矯味剤等が挙げられるが、 これらに制限されず、 その他常用の担体を適宜使用することができる。 具体的には、 軽質無水ケィ酸、 乳糖、 結晶セルロース、 マンニトール、 デンプン、 カルメロースカルシウム、 カルメロ一スナトリウム、 ヒドロ キシプロピルセルロース、 ヒドロキシプロピルメチルセルロース、 ポリ ビニルァセ夕一ルジェチルアミノァセテ一ト、 ポリビニルピロリ ドン、 ゼラチン、 中鎖脂肪酸トリダリセライ ド、 ポリオキシエチレン硬化ヒマ シ油 6 0、 白糖、 カルボキシメチルセルロース、 コーンスターチ、 無機 塩類等を挙げることができる。 A cancer therapeutic agent containing the MOC S 3 gene expression inhibitor of the present invention, a cancer therapeutic agent containing a M OC S 3 protein activity inhibitor, a therapeutic agent containing the anti-MOC S 3 antibody of the present invention, Alternatively, the anti-M OC S3 antibody used in the present invention is one of a viral vector or a non-viral vector carrying a radioisotope, a therapeutic protein, a small molecule drug, and a therapeutic gene, or any of these A therapeutic agent that is chemically or genetically engineered with the combination can be formulated based on a known method. In formulating the therapeutic agent of the present invention, a pharmaceutically acceptable carrier can be added as necessary according to a conventional method. For example, surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters, Examples include corrigents, but are not limited to these, and other conventional carriers can be used as appropriate. Specific examples include light anhydrous carboxylic acid, lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinyl alcohol, decylaminoacetate, polyvinyl Examples include pyrrolidone, gelatin, medium-chain fatty acid tridallylide, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, and inorganic salts.
本発明の治療剤の剤型の種類としては、 例えば、 経口剤として錠剤、 粉末剤、 丸剤、 散剤、 顆粒剤、 細粒剤、 軟，硬カプセル剤、 フィルムコ —ティング剤、 ペレッ ト剤、 舌下剤、 ペースト剤等、 非経口剤として注 射剤、 坐剤、 経皮剤、 軟膏剤、 硬膏剤、 外用液剤等が挙げられ、 当業者 においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができ る。 有効成分としての M〇 C S 3タンパク質の活性 （または MO C S 3 遺伝子の発現） 阻害物質は、 製剤中 0. 1から 9 9. 9重量％含有する ことができる。  Examples of the dosage form of the therapeutic agent of the present invention include tablets, powders, pills, powders, granules, fine granules, soft and hard capsules, film coating agents, and pellets as oral agents. , Sublinguals, pastes, etc. As parenterals, injections, suppositories, transdermal agents, ointments, plasters, liquids for external use, etc. can be mentioned. The dosage form can be selected. The active substance M0 C S 3 protein activity (or MO C S 3 gene expression) inhibitor may be contained in the preparation in an amount of 0.1 to 99.9% by weight.
本発明の薬剤の有効成分の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投 与方法などにより差はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 患者 (6 O k として） に対して一日につき約 0. l mg〜 l， O O Omg 、 好ましくは約 1. 0〜； I 0 0mg、 より好ましくは約 1. 0〜 5 0m gである。 非経口的に投与する場合は、 その一回投与量は投与対象、 対 象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形 では通常例えば、 患者 （6 0 k gに対して） 、 一日につき約 0. 0 1か ら 3 O mg程度、 好ましくは約 0. 1から 2 Omg程度、 より好ましく は約 0. 1〜 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である 。 しかしながら、 最終的には、 剤型の種類、 投与方法、 患者の年齢や体 重、 患者の症状等を考慮して、 医師または獣医師の判断により適宜決定 することができる。 The dose of the active ingredient of the drug of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method, etc. In the case of oral administration, for example, generally for patients (as 6 O k) About 0.1 mg to l, OO Omg, preferably about 1.0 to; I 0 0 mg, more preferably about 1.0 to 50 mg per day. When administered parenterally, the single dose varies depending on the subject of administration, target organs, symptoms, administration method, etc. For example, in the form of injections, for example, patients (for 60 kg) About 0.1 to 3 O mg per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg is conveniently administered by intravenous injection. . However, the final decision can be made as appropriate based on the judgment of a doctor or veterinarian in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptoms, and the like.
このようにして得られる製剤は、 例えば、 ヒトやその他の哺乳動物 （ 例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど ) に対して投与することができる。 ヒト以外の動物の場合も、 上記の 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。  The preparation thus obtained can be administered to, for example, humans and other mammals (eg, rat, rabbit, hidge, buyu, ushi, cat, inu, monkey, etc.). In the case of animals other than humans, the amount converted per 60 kg can be administered.
本発明の治療剤は、 がん （例えば、 大腸がん、 胃がん、 肺がん、 乳が ん、 前立腺がん、 食道がん、 肝臓がん、 胆道がん、 脾臓がん、 腎がん、 膀胱がん、 子宮がん （例 ：子宮頸がん、 子宮体がん） 、 精巣がん、 甲状 腺がん、 滕臓がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、 血液腫瘍など） の予防 ·治療、 好ましくは、 大腸がんの予防，治療に用いられる。  The therapeutic agent of the present invention is cancer (for example, colorectal cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder). Prevention / treatment of uterine cancer (eg cervical cancer, endometrial cancer), testicular cancer, thyroid cancer, spleen cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc., preferably Used for the prevention and treatment of colorectal cancer.
本発明の薬剤は、 M〇 C S 3タンパク質の活性阻害物質または M〇C S 3遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有しているため、 抗癌剤 、 癌転移阻害剤、 癌細胞のアポトーシス誘導剤等として使用し得る。 対 象となる細胞、 組織、 臓器、 または癌の種類は特定のものに限定されな レ また、 本発明の薬剤は、 M O C S 3タンパク質の活性阻害物質およ び M O C S 3遺伝子の発現阻害物質の両方を含んでいても良い。  Since the drug of the present invention contains a MCS3 protein activity inhibitor or MCS3 gene expression inhibitor as an active ingredient, it can be used as an anticancer agent, a cancer metastasis inhibitor, a cancer cell apoptosis inducer, or the like. Can be used. The target cell, tissue, organ, or cancer type is not limited to a specific type. In addition, the agent of the present invention is both a MOCS 3 protein activity inhibitor and a MOCS 3 gene expression inhibitor. May be included.
本発明の治療剤において、 アンチセンス核酸を用いる場合、 該アンチ センス核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスべ クタ一、 アデノウイルスァソシエーテツ ドウィルスベクターなどの適当 なベクターに挿入した後、 公知の手段に従って投与することができる。 アンチセンス核酸は、 単独で、 あるいは生理学的に認められる担体とと もに製剤化し、 遺伝子銃やハイ ドロゲルカテーテルのようなカテーテル によって投与することができる。  When an antisense nucleic acid is used in the therapeutic agent of the present invention, the antisense nucleic acid is inserted alone or into an appropriate vector such as a retroviral vector, an adenoviral vector, an adenoviral association virus vector, Administration can be according to known means. Antisense nucleic acids can be formulated alone or with a physiologically acceptable carrier and administered via a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter.
また、 本発明において組換えアデノウイルス粒子のようなウィルスべ クタ一と抗 M O C S 3抗体との組み合わせを癌治療のために使用する場 合は、 これら単独で使用してもよいが、 一般には製薬的に許容できる担 体と共に使用される。 そのような担体としては、 既に上記したような担 体、 ならびに水、 生理食塩水、 グルコース、 ヒトアルブミン等の水性等 張溶液が好ましい。 更に、 製薬的に通常使用される添加剤、 保存剤、 防 腐剤、 衡量等を添加することもできる。 そのように調製した医薬組成物 は、 治療すべき疾病に依存して適切な投与形態、 投与経路によって投与 することができる。 投与形態としては、 例えば、 乳剤、 シロップ剤、 力 プセル、 錠剤、 顆粒剤、 注射剤、 軟膏等が挙げられる。 本発明の抗 M O C S 3抗体一ウィルスベクター粒子またはこれを含む医薬組成物を治療 のために投与する場合は、 通常成人一人当たり 1回に 1 0 3〜1 0 1 5個 のウィルス粒子を投与するのが好ましいが、 疾病の状態や標的細胞 ·組 織の性質によって変更してよい。 投与回数は、 1 日 1回〜数回でよく、 投与期間は 1 日〜数ケ月以上にわたってもよく、 1〜数回の投入を 1セ ットとして、 長期にわたって断続的に多数セッ トを投与してもよい。 ま た、 本発明において使用されるウィルスベクター粒子またはウィルスべ クタ一核酸分子は、 特定の細胞および/または組織の検出、 または疾病 状態の診断に使用することができる。 例えば、 ウィルスベクターの核酸 分子に検出可能なマーカー遺伝子を組込み、 これを適切な宿主細胞にト ランスフエクションして得られたウィルスベクター粒子は、 抗 M O C S 3抗体と組み合わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用することがで きる。 あるいは、 抗 M〇 C S 3抗体に検出可能な標識を結合させて腫瘍 細胞を検出診断するために使用することができる。 In the present invention, when a combination of a virus vector such as a recombinant adenovirus particle and an anti-MOCS 3 antibody is used for cancer treatment, these may be used alone, but in general, pharmaceuticals are used. Used with an acceptable carrier. Such carriers include those already described above. Body and aqueous isotonic solutions such as water, saline, glucose, human albumin are preferred. Furthermore, additives, preservatives, preservatives, balance, etc. that are usually used in pharmaceutics can also be added. The pharmaceutical composition thus prepared can be administered by an appropriate administration form and administration route depending on the disease to be treated. Examples of administration forms include emulsions, syrups, force capsules, tablets, granules, injections, ointments and the like. When administering the anti-MOCS 3 antibody-one virus vector particle of the present invention or a pharmaceutical composition containing the same for treatment, usually from 10 3 to 10 15 virus particles are administered once per adult. However, it may be changed depending on the disease state and the nature of the target cell / tissue. The administration frequency may be once to several times a day, the administration period may be from 1 day to several months or more, and one set is set to 1 to several times, and many sets are administered intermittently over a long period of time. May be. In addition, the viral vector particles or viral vector nucleic acid molecules used in the present invention can be used for detection of specific cells and / or tissues, or diagnosis of disease states. For example, viral vector particles obtained by incorporating a detectable marker gene into a viral vector nucleic acid molecule and transfecting it into an appropriate host cell can be combined with an anti-MOCS 3 antibody to detect and diagnose tumor cells. Can be used for Alternatively, it can be used to detect and diagnose tumor cells by binding a detectable label to the anti-MCS3 antibody.
5 . がんの診断剤及び診断方法 5. Cancer diagnostic agents and methods
本発明はまた、 がんの診断剤を提供する。 1つの好ましい態様におい て、 本発明のがんの診断剤は、 （a ) M O C S 3タンパク質に対する抗 体、 又は （b ) M O C S 3遺伝子またはその一部の塩基配列にストリン ジェントなハイプリダイゼ一ション条件下でハイプリダイズ可能な塩基 配列からなるポリヌクレオチドを含有する。 抗体 M O C S 3抗体を用いる診断剤及び診断方法 M〇 C S 3夕ンパク質に対する抗体は、 M O C S 3夕ンパク質等を特 異的に認識することができるので、 被検液中の M O C S 3タンパク質を 定量することができる。 具体的には、 本発明の抗 M O C S 3抗体を用い る診断方法は、 例えば、 （a ) 被験者由来の生体試料と、 M O C S 3夕 ンパク質に対する抗体とを接触させる工程、 および （b ) 前記試料中で の前記抗体と、 M O C S 3タンパク質もしくはその部分ペプチドまたは その塩との結合を検出および/または定量する工程を包含する。 好まし くは、 上記検出および Zまたは定量する工程において、 標識された抗 M O C S 3抗体を用いて、 M〇 C S 3タンパク質またはその断片と抗 M O C S 3抗体との結合が検出および Zまたは定量される。 The present invention also provides a diagnostic agent for cancer. In one preferred embodiment, the diagnostic agent for cancer of the present invention comprises (a) an antibody against the MOCS 3 protein, or (b) a condition under high hydration conditions stringent to the base sequence of the MOCS 3 gene or a part thereof. It contains a polynucleotide having a base sequence that can be hyperprimed in. Diagnostic agent and diagnostic method using antibody MOCS 3 antibody Since antibodies against MCS CS protein can specifically recognize MOCS 3 protein, etc., MOCS 3 protein in the test solution can be quantified. Specifically, the diagnostic method using the anti-MOCS 3 antibody of the present invention includes, for example, (a) a step of bringing a subject-derived biological sample into contact with an antibody against the MOCS 3 protein, and (b) the sample. A step of detecting and / or quantifying the binding of the antibody to the MOCS 3 protein or a partial peptide thereof or a salt thereof. Preferably, in the above detection and Z or quantification step, the labeled anti-MOCS 3 antibody is used to detect and Z or quantitate the binding of MCS3 protein or a fragment thereof to the anti-MOCS 3 antibody. .
本明細書中、 「被験者由来の生体試料」 は、 被験者由来の組織、 細胞 、 または体液 （例えば、 血液 （全血、 血漿、 血清等を含む） 、 尿、 リン パ液、 唾液、 汗、 精液等） を含む。 また、 「被験者」 は、 通常、 がん検 診を受ける、 または受けることが望まれるヒト被験体であり、 がんに罹 患しているか、 または罹患していると疑われるヒト被験体等が含まれる 。 このようながんの例としては、 大腸がん、 胃がん、 肺がん、 乳がん、 前立腺がん、 食道がん、 肝臓がん、 胆道がん、 脾臓がん、 腎がん、 膀胱 がん、 子宮がん （例 ：子宮頸がん、 子宮体がん） 、 精巣がん、 甲状腺が ん、 膝臓がん、 卵巣がん、 脳腫瘍、 血液腫瘍などが含まれるが、 とりわ け、 大腸がんが好ましい。  In the present specification, “subject-derived biological sample” refers to a subject-derived tissue, cell, or body fluid (eg, blood (including whole blood, plasma, serum, etc.), urine, lymph fluid, saliva, sweat, semen Etc.) A “subject” is usually a human subject who has or is expected to undergo a cancer screening, such as a human subject who has or is suspected of having cancer. included . Examples of such cancers are colon cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterus. (Eg, cervical cancer, endometrial cancer), testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc. preferable.
上記のような被験者由来の生体試料における M O C S 3の発現を検出 するための免疫測定は、 がん （例えば、 大腸がん） を有すると疑われる 力、、 がんの危険性を有する被験体から採取した生体試料を、 特異的抗原 一抗体結合を生じさせる条件下で抗 M O C S 3抗体と接触させ、 次いで 、 抗体による免疫特異的結合量を測定することを包含する。 このような 抗体の結合を使用して、 M O C S 3タンパク質の存在および Zまたは増 大した発現が検出される。 この場合、 増大した M O C S 3タンパク質発 現の検出が疾病状態の指標となる。 必要に応じて、 生体試料中の M O C S 3タンパク質のレベルを、 がんを有しない健常者のレベルと比較して もよい。 Immunoassays for detecting the expression of MOCS 3 in a biological sample derived from a subject as described above are based on the ability to suspect cancer (eg, colorectal cancer), and from a subject who is at risk for cancer. The method includes contacting the collected biological sample with an anti-MOCS 3 antibody under conditions that cause binding of a specific antigen and an antibody, and then measuring the amount of immunospecific binding by the antibody. Using such antibody binding, the presence and Z or increased expression of the MOCS 3 protein is detected. In this case, detection of increased MOCS 3 protein expression is an indicator of disease state. If necessary, compare the level of MOCS 3 protein in the biological sample with that of healthy individuals without cancer. Also good.
上記免疫測定法の 1つの態様では、 例えば、 血清試料などの生体試料 を、 試料中に存在する全部のタンパク質を固定する目的で、 ニトロセル ロースなどの固相支持体または担体と接触させる。 次いで、 この支持体 を緩衝液で洗浄し、 続いて検出可能に標識した抗 MO C S 3抗体により 処理する。 次いで、 この固相支持体を緩衝液で 2回洗浄し、 未結合抗体 を除去する。 固相支持体上の結合した抗体の量を、 周知の方法に従って 測定する。 各測定に適する検出条件は、 慣用的な試験方法を使用して当 業者により適宜決定され得る。  In one embodiment of the immunoassay, for example, a biological sample such as a serum sample is contacted with a solid support or carrier such as nitrocellulose for the purpose of immobilizing all proteins present in the sample. The support is then washed with buffer and subsequently treated with detectably labeled anti-MOCS 3 antibody. The solid support is then washed twice with buffer to remove unbound antibody. The amount of bound antibody on the solid support is measured according to well-known methods. The detection conditions suitable for each measurement can be appropriately determined by those skilled in the art using conventional test methods.
抗 M〇 C S 3抗体を検出可能に標識する方法の 1つにおいて、 当該抗 体を、 酵素、 例えば、 酵素ィムノアッセィ （E I A) に使用されるもの のような酵素に結合させる [V o i 1 e r , A. による 「酵素標識した 免疫吸着アツセィ」 （ "Th e E n z yme L i n k e d I mm u n o s o r b e n t A s s a y) (E L I S A) , 1 9 7 8 , D i a g n o s t i c Ho r i z o n s , 2 : l ~ 7 , M i c r o b i o l o g i c a l A s s o c i a t e s Qu a r t e r l y P u b 1 i c a t i o n, Wa l k e r s v i 1 1 e . MD ； V o i 1 e r , A. による J . C l i n. P a t h o l . ， 3 1 : 5 0 7〜 5 2 0， 1 9 7 8 ： B u t i e r , J . E . による Me t h. E n z ymo l . , 7 3 : 4 8 2〜 5 2 3 , 1 9 8 1 ] 。 抗体に結合する酵素を、 例えば 分光光度測定により、 可視手段による蛍光測定により検出することがで きる化学分子が生成されるような方法で、 適当な基質、 好ましくは色素 原性基質と反応させる。 抗体に検出可能な標識を付けるために使用する ことができる酵素は、 ペルォキシダーゼおよびアル力リ性ホスファタ一 ゼを包含するが、 これらに限定されない。 この検出はまた、 酵素に対す る色素原性基質を用いる比色法により達成することができる。  In one method of detectably labeling an anti-MCS3 antibody, the antibody is conjugated to an enzyme, such as that used in the enzyme immunoassay (EIA) [Voi 1 er, “The Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” (ELISA), 1 9 7 8, Diagnostic Holyzons, 2: 1 ~ 7, M icrobiological A ssociates Quarterly Pub 1 ication, Walkersvi 1 1 e.MD; V. oi 1 er, A. by J. Clin. Pathol., 3 1: 5 0 7-5 2 0, 1 9 7 8: B Utier, J. E. by Me t. E nz ymol., 7 3: 4 8 2 ~ 5 2 3, 1 9 8 1] Enzymes that bind to antibodies can be visualized by, for example, spectrophotometric measurements. In a way that generates chemical molecules that can be detected by fluorescence measurement, an appropriate substrate, preferably chromogenic Enzymes that can be used to attach detectable labels to antibodies include, but are not limited to, peroxidase and alkaline phosphatase. This can be achieved by a colorimetric method using a chromogenic substrate.
その他の本発明において使用し得る方法としては、 ラジオィムノアツ セィ （R I A) 、 サンドイッチ免疫測定法、 ィムノメトリック法、 ネフ ロメトリー、 蛍光免疫測定法 （F I A) 、 時間分解蛍光免疫測定法 （T R F I A) 、 酵素免疫測定法 （E I A) 、 発光免疫測定法 （L I A) 、 電気化学発光免疫測定法 （E C L I A) 、 ラテックス凝集法、 免疫沈降 アツセィ、 沈降素反応法、 ゲル拡散沈降素反応法、 免疫拡散検定法、 凝 集素検定法、 補体結合検定法、 免疫放射分析検定法、 蛍光免疫検定法、 およびプロティン A免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法な どが挙げられる （WO 0 0 / 1 42 2 7号公報第 3 9頁第 2 5行〜第 4 2頁第 8行、 E P 1 1 1 1 04 7 A 2号公報段落 [0 1 1 5] 第 1 9頁 第 3 5行〜第 2 0頁第 4 7行など参照） 。 Other methods that can be used in the present invention include radioimmunoassay (RIA), sandwich immunoassay, immunometric method, nephrometry, fluorescence immunoassay (FIA), time-resolved fluorescence immunoassay (T RFIA), enzyme immunoassay (EIA), luminescence immunoassay (LIA), electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), latex agglutination method, immunoprecipitation Atssey, sedimentation reaction method, gel diffusion sedimentation reaction method, immunology Examples include a diffusion assay, an agglutination assay, a complement binding assay, an immunoradiometric assay, a fluorescence immunoassay, and an immunoassay selected from the group consisting of a protein A immunoassay (WO 0 0/1 42 2 7 gazette page 3 9 line 25 to page 4 2 line 8 line EP 1 1 1 1 04 7 A 2 paragraph [0 1 1 5] page 1 9 page 3 Line 5 to page 20, line 47, etc.).
以上のように、 本発明の抗体を用いる、 生体内での MO C S 3タンパ ク質の定量法を利用することにより、 MO C S 3タンパク質の機能不全 に関連する各種疾患の診断をすることができる。 例えば、 MOC S 3夕 ンパク質の濃度増加が検出された場合は、 例えば、 MO C S 3タンパク 質の過剰発現に起因する疾患 （例えば、 がん （例 ： 大腸がん） ） である 可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる 。  As described above, various diseases associated with MO CS 3 protein dysfunction can be diagnosed by using the in vivo MOCS 3 protein quantification method using the antibody of the present invention. . For example, if an increase in the concentration of MOC S 3 protein is detected, it may be caused by, for example, a disease caused by overexpression of MO CS 3 protein (eg, cancer (eg, colorectal cancer)). Can be diagnosed as being high or likely to be affected in the future.
なお、 本発明の抗 M〇 C S 3抗体は、 i n v i v oでの診断に用い ることもできる。 ここで使用し得る抗体調製物の調製および使用方法は 当該分野でよく知られている。 例えば、 抗体ーキレート剤について、 N u c 1. Me d. B i o l . 1 9 9 0 1 7 : 2 47— 2 54に 記載されている。 また、 磁気共鳴イメージングで用いる標識としての常 磁性イオンを有する抗体については、 例えば、 Ma g n e t i c R e s o n a n c e i n Me d i c i n e 1 9 9 1 2 2 ： 3 3 9— 342に記載されている。 5. 2 ポリヌクレオチド （例えば、 DNA) プローブを用いる診 断剤及び診断方法  The anti-MCS3 antibody of the present invention can also be used for diagnosis by i n v i v o. The preparation and use of antibody preparations that can be used herein are well known in the art. For example, antibody-chelating agents are described in Nuc 1. Med. Biol. 1 9 9 0 1 7: 2 47-2 54. An antibody having a paramagnetic ion as a label used in magnetic resonance imaging is described in, for example, MagnneticReso nance Medi medine 1 9 9 1 2 2: 3 39 9-342. 5.2 Diagnostic agents and diagnostic methods using polynucleotide (eg, DNA) probes
本発明の診断方法においては、 M〇 C S 3遺伝子の塩基配列に基づい て設計されるプローブ又はプライマーを用いることができる。 具体的に は、 そのような診断方法は、 例えば、 （ a) 被験者由来の生体試料と、 MO C S 3遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェン卜なハイ プリダイゼーション条件下で八ィプリダイズ可能な塩基配列からなるポ リヌクレオチド （プローブ） とを接触させる工程、 および （b) 前記試 料中での前記ポリヌクレオチドと、 MOC S 3遺伝子またはその断片と のハイプリダイゼ一ションを検出および/または定量する工程を包含す る。 In the diagnostic method of the present invention, a probe or primer designed based on the nucleotide sequence of the MCS3 gene can be used. Specifically, such a diagnostic method includes, for example, (a) a biological sample derived from a subject, Contacting the nucleotide sequence of the MOCS 3 gene or a fragment thereof with a polynucleotide (probe) having a base sequence capable of being pre-primed under stringent high-prediction conditions; and (b) in the sample And a step of detecting and / or quantifying the hybridization of the polynucleotide with MOCS 3 gene or a fragment thereof.
上記本発明の方法では、 被験者由来の生体試料中の MO C S 3遺伝子 の DNA (またはその遺伝子断片） を、 上記プローブを使用して検出お よび Zまたは定量する。 プローブとして用いる塩基配列の長さは、 例え ば、 1 2塩基以上、 1 5塩基以上、 1 8塩基以上、 2 1塩基以上、 24 塩基以上、 2 7塩基以上、 3 0塩基以上、 またはさらに長い長さのポリ ヌクレオチド断片であり得る。 ハイブリダィゼーシヨンには、 上記した 低、 中又は高ストリンジェントな条件を使用し得る。 なお、 本明細書中 、 「MO C S 3遺伝子またはその断片の塩基配列にストリンジェントな ハイブリダィゼーシヨン条件下でハイブリダィズ可能な塩基配列」 には 、 M〇C S 3遺伝子またはその断片の塩基配列に相補的な塩基配列 （ァ ンチセンスポリヌクレオチド） も含まれるものとする。 プローブおよび 核酸のハイプリダイゼーションの方法は当業者に知られており、 例えば 国際公開公報第 8 9 Z 0 6 6 9 8号、 E P— A 0 2 0 0 3 6 2、 米国特 許第 2 , 9 1 5， 0 8 2号、 E P— A 0 0 6 3 8 7 9、 E P - A 0 1 7 3 2 5 1、 E P— A 0 1 2 8 0 1 8に記載されている。  In the method of the present invention, the DNA of MO C S 3 gene (or a gene fragment thereof) in a biological sample derived from a subject is detected and Z or quantified using the probe. The length of the base sequence used as a probe is, for example, 12 bases or more, 15 bases or more, 18 bases or more, 21 bases or more, 24 bases or more, 27 bases or more, 30 bases or more, or even longer It may be a polynucleotide fragment of length. For hybridization, the low, medium or high stringency conditions described above may be used. In the present specification, the “base sequence capable of hybridizing under hybridization conditions stringent to the base sequence of the MOCS 3 gene or a fragment thereof” includes the base sequence of the MCS3 gene or a fragment thereof. It also includes a complementary base sequence (antisense polynucleotide). Methods of probe and nucleic acid hydridization are known to those skilled in the art, for example, International Publication No. 8 9 Z 0 6 6 98, EP—A 0 2 0 0 3 6 2, US Patent No. 2, 9 1 5, 0 8 2, EP—A 0 0 6 3 8 7 9, EP-A 0 1 7 3 2 5 1, and EP—A 0 1 2 8 0 1 8.
本発明の診断方法においては、 M〇 C S 3遺伝子に対する特異的ポリ ヌクレオチドプロ一ブまたはプライマーを用いて、 公知の手法を用いて 標的配列を検出または定量することができる。 そのような公知の手法と して、 例えば、 サザンハイブリダィゼ一シヨン、 ノーザンハイブリダィ ゼーション、 RT— P C R法、 P C R— S S C P法 （G e n om i c s ， 第 5巻， 8 7 4〜 8 7 9頁 （ 1 9 8 9年） ） 、 P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d emy o f S c i e n c e s o f t h e Un i t e d S t a t e s o f Am e r i c a, 第 8 6巻， 2 7 6 6〜 2 7 7 0頁 （ 1 9 8 9年） ） 、 F I SH法、 DNAチップあるいはアレイ C GH (C omp a r a t i v e G e n om i c Hy b r i d i z a t i o n) 法などを用いることが できる。 定量的な検出は、 定量 RT— P C Rによって実施可能である。 アレイ C GH法は、 染色体 C GH法 （K a 1 1 i o n i e m i， A . e t a 1. ( 1 9 9 2) S c i e n c e 2 5 8 , 8 1 8— 8 2 1 ) を応用した方法で、 スライ ド上に染色体領域をカバーするゲノム DNA断片 （BAC， P AC, YACなど） を高密度にスポッ トした D N Aチップを用いて、 別々の色素で標識したがん由来 D N Aと正常 DN Aを、 スライ ド上のゲノム DNA断片に対して同時にハイブリダィゼー シヨンを行い、 その結合状態を検出することにより、 がんにおける DN Aコピー数異常を高解像度に検出する方法である （P i n k e 1 , D. e t a 1. ( 1 9 9 8 ) N a t . G e n e t . 2 0 , 2 0 7 - 2 1 1 ) 。 In the diagnostic method of the present invention, a target sequence can be detected or quantified using a known method using a specific polynucleotide probe or primer for the MCS3 gene. Examples of such known methods include Southern hybridization, Northern hybridization, RT-PCR method, PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, 8 7 4-8 7 9 (1 9 8 9)), Proceedingsofthe National A cad emy of Sciencesofthe Un ited Statesof Am erica, Vol. 86, 2 7 6 6-2 7 70 (1 9 8 9)), FI SH method, DNA chip or array C GH (Comparative Genetic Hybridization) method, etc. Can be used. Quantitative detection can be performed by quantitative RT-PCR. The array C GH method is an application of the chromosomal C GH method (Ka 1 1 ioniemi, A. eta 1. (1 9 9 2) Science 2 5 8, 8 1 8— 8 2 1). Using a DNA chip on which genomic DNA fragments (BAC, PAC, YAC, etc.) covering the chromosomal region are spotted at high density, slide the cancer-derived DNA labeled with different dyes and normal DNA. It is a method to detect the DNA copy number abnormality in cancer with high resolution by simultaneously performing hybridization on the above genomic DNA fragment and detecting its binding state (Pinke 1, D. eta 1. (1 9 9 8) N at. G enet. 2 0, 2 0 7-2 1 1).
なお、 本発明においては、 MC〇 S 3遺伝子の発現が上方制御される か否かを検出するために、 細胞の MC〇 S 3の mRN Aレベルを標準遺 伝子 （ハウスキーピング遺伝子 （例えば、 S h a p e r , N. L. ら 、 J . M amma r y, G l a n d B i o l . N e o p 1 a s i a 3 ( 1 9 9 8) 3 1 5 - 3 24 ; Wu, Y. Y. および R e e s , J . L . , A c t a D e rm. V e n e r e o l . 8 0 (2 0 0 0 ) 2— 3 ) の mRN Aレベルと、 好ましくは RT— P C Rによつ て比較することもできる。  In the present invention, in order to detect whether or not the expression of MC S3 gene is up-regulated, the mRNA level of MC S3 in the cell is determined based on the standard gene (housekeeping gene (for example, Shaper, NL et al., J. Mammary, G land B iol. N eop 1 asia 3 (1 9 9 8) 3 1 5-3 24; Wu, YY and Rees, J. L., A cta D e rm. V enereol. 8 0 (2 0 0 0) 2-3) mRNA levels can be compared, preferably by RT-PCR.
上記のような手法によって標的配列 （DNA、 mRNAなど） を検出 •定量し、 MOC S 3遺伝子の発現過多が確認された場合は、 例えば、 MOC S 3の過剰発現に起因する疾患 （例えば、 がん （例：大腸がん、 子宮頸がん） ） である可能性が高い、 あるいは将来罹患する可能性が高 いと診断することができる。  If the target sequence (DNA, mRNA, etc.) is detected and quantified by the above-mentioned method and overexpression of the MOC S 3 gene is confirmed, for example, a disease caused by overexpression of MOC S 3 (for example, (Eg, colorectal cancer, cervical cancer)) or is likely to be affected in the future.
3診断用キット 本発明はまた、 抗 M O C S 3抗体を含有する、 被験者の体液試料中の M O C S 3夕ンパク質またはその断片をがんマーカーとして検出および /または定量するためのキットを提供する。 さらに、 M O C S 3遺伝子 またはその一部の塩基配列にストリンジェントなハイプリダイゼーショ ン条件下でハイブリダィズ可能な塩基配列を含有する、 被験者由来の生 体試料中の M O C S 3遺伝子またはその断片をがんマーカーとして検出 および Zまたは定量するためのキッ トをも提供する。 これらのキットは 、 上述の免疫学的手法またはハイブリダィゼーシヨン法等により、 がん マ一力一を検出するために用いられる。 このようながんとしては、 例え ば、 大腸がん、 胃がん、 肺がん、 乳がん、 前立腺がん、 食道がん、 肝臓 がん、 胆道がん、 脾臓がん、 腎がん、 膀胱がん、 子宮がん （例 ：子宮頸 がん、 子宮体がん） 、 精巣がん、 甲状腺がん、 膝臓がん、 卵巣がん、 脳 腫瘍、 血液腫瘍などが含まれるが、 とりわけ、 大腸がんが好ましい。 本明細書中、 「がんマーカー」 とは、 被験者の体液 （例えば、 血液、 尿、 リンパ液、 唾液、 汗、 精液等） または細胞もしくは組織中における 、 正常組織に由来していないか、 あるいはがん細胞または組織において 選択的に発現の亢進している分子のことをいい、 被験者の体液または細 胞もしくは組織中における当該分子の存在ががんの存在を示すかまたは 示唆するものをいう。 3 Diagnostic kit The present invention also provides a kit for detecting and / or quantifying a MOCS 3 protein or a fragment thereof in a body fluid sample of a subject containing an anti-MOCS 3 antibody as a cancer marker. Furthermore, the MOCS 3 gene or a fragment thereof in a biological sample derived from a subject, which contains a base sequence that can be hybridized under stringent high prehybridization conditions to the MOCS 3 gene or a part of the base sequence thereof, is cancerated. It also provides kits for detection and Z or quantification as markers. These kits are used to detect cancer cancer by the above-described immunological technique or hybridization method. Examples of such cancers are colon cancer, stomach cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, esophageal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterus. Cancer (eg cervical cancer, endometrial cancer), testicular cancer, thyroid cancer, knee cancer, ovarian cancer, brain tumor, blood tumor, etc. preferable. In the present specification, the term “cancer marker” refers to a subject's body fluid (eg, blood, urine, lymph fluid, saliva, sweat, semen, etc.) or cells or tissues that are not derived from normal tissue, or A molecule that is selectively upregulated in cancer cells or tissues, and that the presence of the molecule in the body fluid or cells or tissues of a subject indicates or indicates the presence of cancer.
上記第一の態様のキッ トは、 被験者からの体液試料中の M O C S 3抗 原 （M O C S 3タンパク質およびその部分ペプチドを含む） を検出およ び/または定量する成分を含有する。 例えば、 M O C S 3タンパク質が E L I S Aで検出および Zまたは定量される場合、 このような成分は、 例えば、 組織切片、 または血液や尿のような体液試料中の M O C S 3の レベルを検出および Zまたは定量するために使用され得る。 このような 抗体は放射能、 蛍光、 比色、 または酵素標識で標識されていてもよい。 本発明のキットは、 標識された二次抗体を含有していてもよい。  The kit according to the first aspect contains a component for detecting and / or quantifying the M O C S 3 antigen (including M O C S 3 protein and its partial peptide) in a body fluid sample from a subject. For example, if MOCS 3 protein is detected and Z or quantified by ELISA, such components detect and Z or quantitate the level of MOCS 3 in, for example, tissue sections or body fluid samples such as blood and urine Can be used for. Such antibodies may be labeled with radioactivity, fluorescence, colorimetry, or enzyme labeling. The kit of the present invention may contain a labeled secondary antibody.
上記第二の態様のキッ トは、 M O C S 3遺伝子またはその一部の塩基 配列にストリンジェン卜なハイプリダイゼーション条件下でハイブリダ ィズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。 例えば、 本 発明のキットは、 DNAチップ上に固定された上記ポリヌクレオチドを 含有し得る。 The kit according to the second aspect is a hybridizer under high-precipitation conditions stringent to the MOCS 3 gene or a part of its nucleotide sequence. A polynucleotide comprising a base sequence that can be synthesized is contained. For example, the kit of the present invention may contain the above polynucleotide immobilized on a DNA chip.
本発明のキットは、 抗 MOC S 3抗体、 M〇 C S 3遺伝子またはその 一部の塩基配列にストリンジェントなハイプリダイゼ一ション条件下で ハイブリダィズ可能な塩基配列等の他に、 代表的には、 容器およびラベ ルを含んでいる。 容器上のまたは容器に伴うラベルには、 薬剤が大腸が んマーカ一の検出に使用されることが示されていてもよい。 また、 他の アイテム、 例えば、 使用説明書、 標識二次抗体等がさらに含まれていて もよい。  The kit of the present invention is typically a container in addition to an anti-MOC S 3 antibody, MCS3 gene or a part of the base sequence that can be hybridized under stringent high-precipitation conditions. And label. The label on or with the container may indicate that the drug is used to detect a colorectal cancer marker. In addition, other items such as instructions for use, labeled secondary antibodies, and the like may be further included.
以下、 本発明を実施例を用いてより具体的に説明するが、 本発明の範 囲は、 これらの実施例によって限定されない。 実施例  Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited by these examples. Example
実施例 1 ： アレイ C GH法による大腸がん特異的増幅遺伝子の同定 Example 1: Identification of colon cancer specific amplification gene by array C GH method
本実施例では、 大腸がん特異的な遺伝子増幅領域を特定するために、 大腸がん検体 2 0 0症例のサンプル調製およびアレイ C GH法に基づく 検証を実施した。  In this example, in order to identify a gene amplification region specific to colorectal cancer, sample preparation of 200 colorectal cancer specimens and verification based on the array CGH method were performed.
その結果、 大腸がん検体において高頻度に増幅が起きている領域の内 、 公共 D Bでの遺伝子情報 （N C B I ： h t t p ： //www. n c b i . n 1 m. n i h. g o v/) を利用し、 精査した結果、 使用した B AC C l o n e RP 1 1 - 3 7 9 D 4に位置している、 MO C S 3 (Mo l y b d e n um c o f a c t o r s y n t h e s i s 3 ) (NC B I A c c e s s i o n N o. ： NM_0 1 448 4) 遺 伝子が大腸がん患者において高頻度で高値であることを見出した （図 1 , 表 2 ) 。 図 1は、 M〇 C S 3遺伝子の大腸がん患者 2 0 0検体での増 幅度に対する頻度を示すヒストグラムである。 また、 下記の表 2は、 M OC S 3遺伝子の大腸がん患者 2 0 0検体での増幅度 （GZR値） およ び頻度を示す。 平均値は、 GZR値が 1. 2以上の検体での平均値を示 している。 As a result, the gene information in the public DB (NCBI: http: //www.ncbi.n1m.nih.gov/) is used in the region where amplification occurs frequently in colorectal cancer specimens. As a result of close examination, we used MO CS 3 (Molybdenum cofactorsynthesis 3) (NC BIA ccession No .: NM_0 1 448 4) We found that the gene was high in colorectal cancer patients with high frequency (Figure 1 and Table 2). Fig. 1 is a histogram showing the frequency of the MCS3 gene relative to the degree of amplification in 200 colorectal cancer patients. Table 2 below shows the degree of amplification (GZR value) and frequency of 200 samples of colon cancer patients with MOC S 3 gene. The average value is the average value for samples with a GZR value of 1.2 or higher. is doing.
表 2に示されるように、 MO C S 3遺伝子は、 2 0 0検体の大腸がん 患者の 6 8. 5 %において増幅が認められ、 その増幅度の平均値は、 1 . 7 3であった。 最大値は 3. 0 9であり、 非常に高頻度で顕著な増幅 が起こっていた。  As shown in Table 2, amplification of MO CS 3 gene was observed in 68.5% of 200 colorectal cancer patients, and the average value of amplification was 1.7 3 . The maximum value was 3.09, and remarkable amplification occurred very frequently.
(表 2 ) (Table 2)
Figure imgf000043_0001
実施例 2 ：大腸由来培養細胞株での遺伝子増幅度の検証
Figure imgf000043_0001
Example 2: Verification of the degree of gene amplification in a colon-derived cultured cell line
本実施例では、 大腸がん患者において高頻度で高値な遺伝子領域につ いて、 大腸がん由来培養細胞株での増幅度を検証した。  In this example, the degree of amplification in a colon cancer-derived cultured cell line was verified for a high-frequency gene region in colon cancer patients.
<サンプル調製 >  <Sample preparation>
培養細胞株は、 大腸がん由来の細胞株である RKOE 6 , C a c o 2 を使用した。 培養細胞より B l o o d & C e l l C u l t u r e DNA K i t (Q I AGEN) を使用して、 キット添付のプロトコ一 ルに従い、 ゲノム DNAを抽出した。  The cultured cell line used was RKOE 6, Caco 2, which is a colorectal cancer-derived cell line. Genomic DNA was extracted from the cultured cells according to the protocol attached to the kit using Blood & Cel lCu lure DNA Kit (QIAGEN).
ぐアレイ C GH>  Array C GH>
遺伝子領域の増幅を確認するために、 アレイ C GHを実施した。 方法 の詳細は実施例 1 と同様に実施した。 結果  Array C GH was performed to confirm gene region amplification. The details of the method were the same as in Example 1. Result
表 3に、 M〇 C S 3遺伝子の大腸がん由来の細胞株での増幅度 （GZ R値） を示した。 示されるように、 大腸がん由来細胞株においても、 B AC C l o n e R P 1 1 - 3 7 9 D 4に位置している、 M〇 C S 3 遺伝子で増幅が起きていることを見出した。 (表 3 ) Table 3 shows the degree of amplification (GZ R value) of the MCS3 gene in a cell line derived from colorectal cancer. As shown, in the colon cancer-derived cell line, it was found that amplification occurred in the MCS3 gene located in BAC Clone RP 1 1-3 79 D 4. (Table 3)
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0001
<定量的 P C R> <Quantitative P C R>
MO C S 3遺伝子領域の増幅を確認するために、 定量的 P C Rを実施 した。 定量的 P CRは、 S YB R G r e e n RT— P C R R e a e n t s Ap p l i e d B i o s y s t ern s ) を使用して、 添 付のプロトコールに従い、 7 5 0 0 R e a l -T i me P C R S y s t em (A ρ p 1 i e d B i o s y s t ern s ) を用いて実施し た。 プライマーは、 以下の配列を合成し （O P E RONに合成委託） 使. 用した。  Quantitative PCR was performed to confirm the amplification of the MOCS3 gene region. Quantitative PCR was performed using S YB RG reen RT—PCRR eaents Applied B iosys terns) according to the attached protocol. ied Biosyst ern s). Primers were synthesized using the following sequences (commissioned to OPERON).
プライマ一配列： Primer sequence:
5 ' - C C TC TTACAGTGGCAGCTTGTTG- 3 ' (配列 番号 3 )  5 '-C C TC TTACAGTGGCAGCTTGTTG-3' (SEQ ID NO: 3)
5 ' - GAAGGC TTCATAGTC CAGCAGATC - 3 ' (配 列番号 4) 結果 5 '-GAAGGC TTCATAGTC CAGCAGATC-3' (sequence number 4) result
表 4に、 MO C S 3遺伝子の大腸がん由来の細胞株での増幅度を示し た。 値は対照 DNA (正常） との相対値を示している。 示されるように 、 大腸がん由来細胞株においても、 MO C S 3遺伝子領域に増幅が起き ていることを見出した。 (表 4) Table 4 shows the degree of amplification of the MO CS 3 gene in a colon cancer-derived cell line. Values are relative to control DNA (normal). As shown, in the colon cancer-derived cell line, it was found that amplification occurred in the MOCS 3 gene region. (Table 4)
Figure imgf000045_0001
これらの結果により、 大腸がん由来の細胞株 （R KO E 6 , C a c o 2 ) においても、 MO C S 3遺伝子が増幅していることが確認された。 よって、 がんにおける MOC S 3遺伝子の機能解析に使用可能な培養細 胞が選択された。 実施例 3 ：大腸がん細胞株を用いた RNA i解析による機能解析
Figure imgf000045_0001
From these results, it was confirmed that the MO CS 3 gene was also amplified in the colorectal cancer-derived cell line (R KO E 6, Caco 2). Therefore, cultured cells that could be used for functional analysis of the MOC S3 gene in cancer were selected. Example 3: Functional analysis by RNA i analysis using colorectal cancer cell lines
本実施例では、 大腸がん患者 2 0 0検体において高頻度に増幅が認め られた MO C S 3遺伝子について、 大腸がん由来の細胞株であり、 且つ In this example, the MO C S 3 gene, which was frequently amplified in 200 colorectal cancer patients, is a colorectal cancer-derived cell line, and
、 ゲノムレベルで遺伝子の増幅が認められた細胞株 （RKOE 6 ) を用 いて、 RNA i解析を行い、 その表現型を観察した。 Using a cell line (RKOE 6) in which gene amplification was observed at the genome level, RNAi analysis was performed and the phenotype was observed.
ぐ RNA i解析〉  RNA i analysis>
細胞株は AT C Cより購入し、 添付のプロトコールに従い培養を行つ た。 s i RNAは遺伝子内の特異的な 2 1 me rを選択しその配列を標 的とする s i RNAを合成した （Q I AGENに合成委託） 。  The cell line was purchased from ATCC and cultured according to the attached protocol. For siRNA, we selected specific 21mer in the gene and synthesized siRNA targeting the sequence (commissioned to QIAGEN).
(表 5 ) (Table 5)
Figure imgf000045_0002
s i RNAの RKOE 6細胞内への導入は、 O l i g o f e c t am i n e ( I n v i t r o g e n) を使用し、 Ι Ο Ο ηΜの s i RNAを 添付のプロトコ一ルに従い細胞に導入した。 対照には N e g a t i v e C o n t r o l s i RNA (Q I AGEN) を使用した。 細胞に導入 後 4日間、 倒立顕微鏡下で観察した。
Figure imgf000045_0002
For siRNA introduction into RKOE 6 cells, Oligofectamine (Invitrogen) was used, and Ι Ι Μ ηΜ si RNA was introduced into the cells according to the attached protocol. N egative control RNA (QI AGEN) was used as a control. The cells were observed under an inverted microscope for 4 days after introduction into the cells.
<定量的 RT— P C R解析 >  <Quantitative RT—PCR analysis>
定量的 R T— P C R法を用いて、 s i RNAの効果を mRNAレベル で検証した。 s i RNA導入後 24時間の細胞から、 M i c r o— t o —M i d i T o t a l RNA P u r i f i c a t i o n S y s t e m ( I n v i t r o g e n) を使用して、 添付のプロトコ一ルに 従い、 全 RNAを抽出した。 その後、 S u p e r s c r i p t I I I F i r s t— S t r a n d S y n t h e s i s S y s t em f o r RT— P C R ( I n v i t r o g e n) を使用して、 添付のプロト コールに従い、 c DNAを合成した。  The effect of siRNA was verified at the mRNA level using a quantitative RT-PCR method. Total RNA was extracted from cells 24 hours after introduction of si RNA using M i c ro -t o -M i d T o t a l RNA P u r i f i c a t i on S y s te tem (I n v i t r o g e n) according to the attached protocol. Subsequently, cDNA was synthesized according to the attached protocol by using Su pe r s c r i p t I I I F i r s t—S t r a n d S y n t h e s i S S y s t em f o r RT—P C R (I n v i t ro g e n).
この c DNAを銬型にして、 定量的 R T— P C Rを実施した。 定量的 P C Rは、 S YB R G r e e n RT— P C R R e a e n t s ( A p ρ 1 i e d B i o s y s t ern s ) を使用して、 添付のプロトコ —ルに従い、 7 5 0 0 R e a l — T i me P C R S y s t ern ( Ap p l i e d B i o s y s t ern s ) を用いて実施した。 プライマ 一は、 以下の配列を合成し （O P ERONに合成委託） 使用した。  Quantitative RT-PCRR was performed using this cDNA as a saddle. Quantitative PCR was performed using S YB RG reen RT— PCRR eaents (A p ρ 1 ied B iosys t ern s), according to the attached protocol. 7 5 0 0 R eal — T i me PCRS yst ern ( (Applied Biosys terns)). Primer 1 synthesized the following sequence (consigned to O P ERON) and used it.
プライマー配列 ：  Primer sequence:
5 ' 一 C C TC TTACAGTGGCAGCTTGTTG— 3 ' (配列 番号 1 1 )  5 'One C C TC TTACAGTGGCAGCTTGTTG— 3' (SEQ ID NO: 1 1)
5 ' 一 GAAGGCTT CATAGTC CAGCAGATC - 3 ' (配 列番号 1 2 ) 5 '1 GAAGGCTT CATAGTC CAGCAGATC-3' (sequence number 1 2)
相対比を算出するための標準遺伝子には G l y c e r a l d e h y d e— 3— p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( G A P D H) C o n t r o l R e a g e n t s (Ap p l i e d B i o s y s t em s ) を用いて G A P D Hの発現量を求め、 相対比を算出した The standard gene for calculating the relative ratio is G lyceraldehyde— 3—phosphatedehydrogenas e (GAPDH) Control Reagents (Ap plied B ios yst em s) was used to determine the expression level of GAPDH and the relative ratio was calculated
<生細胞数の測定 > <Measurement of the number of living cells>
s i RN A導入後の生細胞数を A 1 a m a r B l u e (B i o s o u r c e) を用いて、 添付のプロトコ一ルに従い、 Wa 1 1 a c 1 4 2 0 Mu l t i l a b e l /L um i n e s c e n c e C o u n t e r ARVO (P e r k i n E l me r ) により測定した。 結果  si RN A The number of viable cells after introduction of A 1 Amar Blue (Biosource) and Wa 1 1 ac 1 4 2 0 Mu ltilabel / L um inescence Coutor ARVO (P erkin E l me r). Result
大腸がん由来の細胞株である RKO E 6を用いて、 MOC S 3遺伝子 の RNA i解析を実施した。  RNAi analysis of the MOC S 3 gene was performed using RKO E 6 which is a cell line derived from colorectal cancer.
図 2に、 1^1：0£ 6細胞に¥〇。 3 3遺伝子の s i RNAを T r a n s f e c t i o n後、 4日目の観察像を示す （上段： X 4 0 ；下段 ： X 2 0 0 ) 。 a , b , および cは、 それぞれ M〇 C S 3遺伝子の s i RN A 3種であり、 N Cはネガティブコントロールを示す。 示されるように 、 表現型の観察では、 a、 b、 および c 3種類の s i RNA共に N e g a t i v e C o n t r o l ( N C ) と比較して顕著に細胞数が減少し ていた （図 2 ) 。 '  In Figure 2, 1 ^ 1: 0 £ 6 to 6 cells. The observation image of the 4th day is shown after the siRNA of 3 3 genes Transfectioon (upper part: X40; lower part: X2200). a, b, and c are s i RN A 3 species of the M C S 3 gene, and N C represents a negative control. As shown, in the phenotypic observation, the number of cells was markedly reduced compared to NegativeCorntrol (NC) for all three types of siRNA, a, b, and c (Fig. 2). '
図 3には、 R K〇 E 6細胞に M O C S 3遺伝子の s i RNAを T r a n s f e c t i o nして 24時間後に細胞を回収し、 定量的 R T— P C Rを行った結果を示す。 内在性コントロールとして、 GAP DHの相対 比を用いて、 N Cに対する相対量を示した。 示されるように、 RNAレ ベルでの効果を定量的 R T— P C Rで確認した結果、 三種類の s i RN A共に顕著に発現量が減少していた （図 3) 。  Fig. 3 shows the results of quantitative RT-PCRR after 24 hours of siRNA of the MOCS3 gene in RK o E6 cells and harvesting the cells 24 hours later. As an endogenous control, the relative amount of N C was shown using the relative ratio of GAP DH. As shown, the effect of RNA level was confirmed by quantitative RT-PCR. As a result, the expression level of all three types of siRNA was significantly reduced (Fig. 3).
図 4には、 R KO E 6細胞に MO C S 3遺伝子の s i RNAを T r a n s f e c t i o n後、 4日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数 を測定した結果を示す。 グラフは NCに対する相対量を示した。 示され るように、 生細胞数の測定を行った結果、 表現型同様、 N e g a t i v e C o n t r o l (N C ) と比較して顕著に細胞数が減少していた （ 図 4) 。 MOC S 3遺伝子の s i RNA 3種 （a, b , c ) 全てについ て、 t検定において有意 （ p < 0. 0 1 ) であった。 Fig. 4 shows the results of measuring the number of viable cells with the measurement reagent using the cells on the 4th day after Transfection of MO CS 3 gene siRNA to RKO E6 cells. The graph shows the relative amount to NC. As shown, the number of viable cells was measured, and as with the phenotype, the number of cells was significantly reduced compared to N egative Control (NC) ( (Figure 4) All three siRNAs (a, b, c) of the MOC S 3 gene were significant (p <0. 0 1) in the t-test.
よって、 RNA i効果により MO C S 3遺伝子の発現が抑制された結 果、 RKOE 6において、 顕著にがん細胞の増殖が抑制されることが見 出された。 実施例 4 ： 大腸由来正常細胞株を用いた RN A i解析による機能解析 本実施例では、 大腸の正常組織由来の細胞株を用いて RN A i解析を 実施することにより、 標的遺伝子の抑制効果ががん特異的であることを 検証した。  Therefore, as a result of suppressing the expression of the MOCS3 gene by the RNAi effect, it was found that the growth of cancer cells was remarkably suppressed in RKOE 6. Example 4: Functional analysis by RNAI analysis using a colon-derived normal cell line In this example, the RNAI analysis was performed using a cell line derived from a normal tissue of the large intestine. Has been verified to be cancer specific.
ぐ RNA i解析 >  RNA i analysis>
細胞株は AT Cじより購入した C CD 1 8 C Oを使用した。 培養条件 は、 添付のプロ卜コールに従った。 使用した s i RNAは、 実施例 3の a配列を使用した。 s i RNAの細胞内への導入は、 L i p o f e c t am i n e 2 0 0 0 ( I n v i t r o g e n) を使用し、 2 5 n Mの s i RNAを添付のプロトコールに従い細胞に導入した。 対照には N e a t i v e C o n t r o l s i RNA (Q I AG E N) を使用し た。 導入後 5日間、 倒立顕微鏡下で観察した。  The cell line used was C CD 1 8 CO 2 purchased from AT C. The culture conditions were in accordance with the attached protocol. The a sequence of Example 3 was used as the siRNA used. For introduction of si RNA into the cells, L i p o f e c t a min e 20 00 (Inv i t r o g e n) was used, and 25 n M of siRNA was introduced into the cells according to the attached protocol. As a control, N at i v e C o n t r o ls i RNA (Q I AG E N) was used. The cells were observed under an inverted microscope for 5 days after introduction.
ぐ定量的 RT— P C R解析 >  Quantitative RT—PCR analysis>
実施例 3の記載方法と同様に実施した。  The same procedure as described in Example 3 was performed.
<生細胞数の測定 >  <Measurement of the number of living cells>
実施例 3の記載方法と同様に実施した。 糸口 ¾  The same procedure as described in Example 3 was performed. Clue ¾
MO C S 3遺伝子の、 大腸正常組織由来の細胞株 C C D 1 8 C oでの RNA iの効果は以下の通りである。  The effects of RNA i on the MO C S 3 gene in the cell line C CD 18 C o derived from normal colon tissue are as follows.
図 5に、 C CD 1 8 C o細胞に MOC S 3遺伝子の s i RNAを T r a n s f e c t i o n後、 5 日目に得た観察像を示す （上段： X 40 ； 下段 ： X 2 0 0) 。 a， b , および cは、 MOC S 3遺伝子の s i RN A 3種であり、 N Cはネガティブコントロールを示す。 示されるように 、 表現型の観察では、 NCとほぼ同様で、 効果は認められなかった （図 5) 。 FIG. 5 shows an observation image obtained on the 5th day after Transfection of MOC S3 gene siRNA on CD 18 Co cells (upper: X 40; lower: X 2 200). a, b, and c are the si RNs of the MOC S 3 gene A 3 types, NC indicates negative control. As shown, phenotypic observations were almost the same as NC, and no effect was observed (Figure 5).
図 6に、 C CD 1 8 C O細胞に M〇 C S 3遺伝子の s i R N Aを T r a n s f e c t i o nして 24時間後に細胞を回収し、 定量的 R T - P CRを行った結果を示す。 内在性コントロールとして、 GAPDHの相 対比を用いて、 NCに対する相対量を示した。 RNAレベルでの効果を 定量的 RT— P CRで確認した結果、 発現量の低下が認められた （図 6 図 7に、 C CD 1 8 C O細胞に MOC S 3遺伝子の s i R N Aを T r a n s f e c t i o n後、 5日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞 数を測定した結果を示す。 グラフは NCに対する相対量を示す。 その結 果、 表現型同様、 N e g a t i v e C o n t r o l (NC) とほぼ同 様で、 効果は認められなかった （図 7 ) 。  Figure 6 shows the results of quantitative RT-PCR after cells were collected 24 hours after transcription of siCNA3 of McCS3 gene to CCD18CO cells. As an endogenous control, the relative amount to NC was shown using the contrast of GAPDH. As a result of quantitative RT-PCR confirming the effect at the RNA level, a decrease in the expression level was observed (Figure 6 Figure 7 shows that after the transfection of the siRNA of the MOC S 3 gene in CCD18 CO cells. Fig. 5 shows the results of measuring the number of viable cells with the measurement reagent using the cells on day 5. The graph shows the relative amount with respect to NC, and as in the phenotype, it is almost the same as that of Negative Control (NC). No effect was observed (Fig. 7).
このことにより、 大腸がん由来の細胞株である RK〇 E 6では、 RN A i効果により MO C S 3遺伝子の発現が抑制された結果、 顕著にがん 細胞の増殖が抑制されたが、 大腸正常組織由来の細胞株 C C D 1 8 C o では影響が無いことが見出された。 よって、 MOC S 3遺伝子が、 正常 細胞には影響が少ないことより、 がん特異的な創薬標的遺伝子となりう ることを見出した。 実施例 5 ： 臓器特異性の評価  As a result, in RK〇 E6, a cell line derived from colorectal cancer, the expression of the MOCS 3 gene was suppressed by the RNAI effect, and as a result, the proliferation of cancer cells was remarkably suppressed. The normal tissue cell line CCD 18 Co was found to have no effect. Therefore, we found that the MOC S 3 gene can be a cancer-specific drug discovery target gene because it has little effect on normal cells. Example 5: Evaluation of organ specificity
M0CS3 遺伝子が正常組織でどのような臓器特異的な発現がされている のか、 当該技術分野で公知のノーザンハイプリダイゼ一ション法により 、 実施した。  The organ-specific expression of the M0CS3 gene in normal tissues was performed by the Northern hyperprecipitation method known in the art.
MTN Multiple Tissue Northern Blots (Clontech)を用いて、 添付の プロトコールに従い、 106bp (匪_014484 ： 35-140)の DNA Probe でハイ プリダイゼーションを実施した。 結果 Using MTN Multiple Tissue Northern Blots (Clontech), according to the attached protocol, hybridization was performed with a 106 bp (匪 _014484: 35-140) DNA Probe. result
' 正常な各臓器組織での MA レベルの発現分布について、 23種の臓器（ 心臓 （Heart) 、 脳 （Brain) 、 胎盤 （Placenta) 、 肺 （Lung) 、 肝臓 （ Liver) 、 骨格筋 （ Skeletal Muscle) 、 腎臓 （Kidney) 、 膝臓 （ Pancreas) 、 脾臓 （Spleen) 、 胸腺 （Thymus) 、 前立腺 （Prostate) 、 睾丸 （Testis) 、 卵巣 （Ovary) 、 小腸 （Small Intestine) 、 結腸 （ Colon) 、 末梢血白血球 （Peripheral Blood Leukocyte) 、 胃 （Stomach ) 、 甲状腺 （Thyroid) 、 脊髄 （Spinal Cord) 、 リンパ節 （Lymph Node ) 、 気管 （Trachea) 、 副腎 （Adrenal Gland) 、 骨髄 （Bone Marrow)) についてノーザンハイブリダィゼーシヨン法により、 解析した。 なお、 前述の と お り 、 M O C S 3 の遺伝子配列は、 NCBI (http:// www.ncbi.nlm.nili. gov) に、 Accession No. NM_014484 で 2, 458 bp の 配列が inRNAとして登録されている。  'MA level expression distribution in each normal organ tissue, 23 organs (Heart, Brain, Placenta, Lung, Liver, Skeletal Muscle) ), Kidney (Kidney), knee (Pancreas), spleen (Spleen), thymus (Thymus), prostate (Prostate), testis, ovary (Ovary), small intestine, colon (Colon), peripheral Northern About Peripheral Blood Leukocyte, Stomach, Thyroid, Spinal Cord, Lymph Node, Trachea, Adrenal Gland, Bone Marrow Analysis was performed by the hybridization method. As mentioned above, the gene sequence of MOCS 3 is registered in NCBI (http://www.ncbi.nlm.nili.gov) as Accession No. NM_014484 and the 2,458 bp sequence is registered as inRNA. Yes.
図 8は、 正常な種々の臓器組織を用いて行ったノーザンハイプリダイ ゼ一シヨンの結果を示す写真である。 図に示すように、 精巣において約 2.5kb 付近にバンドが認められ、 他の臓器については、 発現量が少ない ことが確認された。 正常組織において発現量が少なく、 精巣特異的であ ることは、 この遺伝子を標的にした薬剤の影響が正常組織に対して少な いことが推定できる。 実施例 6 ：遺伝子増幅の評価  Fig. 8 is a photograph showing the results of Northern high pri- dialysis performed using various normal organ tissues. As shown in the figure, a band was observed around 2.5 kb in the testis, and the expression level of other organs was confirmed to be small. The expression level is small in normal tissues and testis-specific, so it can be estimated that the effects of drugs targeting this gene are small on normal tissues. Example 6: Evaluation of gene amplification
M0CS3 遺伝子が検体組織内のがん細胞で遺伝子増幅が起きていること を 、 当 該 技 術 分 野 で 公 知 の FISH ( fluorescence in situ hybridization) 法により実施した。  The fact that gene amplification of the M0CS3 gene occurred in cancer cells in the specimen tissue was carried out by a known FISH (fluorescence in situ hybridization) method in this technical field.
アレイ CGH法により、 遺伝子増幅度（G/R)が 1.2以上であった検体組 織 （大腸癌患者由来） を用いて、 M0CS3 遺伝子が位置する BAC Clone RP11-379D4の DNA Probeでハイプリダイゼーションを実施した。  Using a sample tissue (derived from colorectal cancer patients) with a gene amplification degree (G / R) of 1.2 or higher by array CGH method, high-hybridization is performed with the DNA probe of BAC Clone RP11-379D4 where the M0CS3 gene is located. Carried out.
検体組織のがん細胞において M0CS3遺伝子領域で遺伝子増幅がおきて いることを FISH法により評価した。 結果 The FISH method was used to evaluate the occurrence of gene amplification in the M0CS3 gene region in cancer cells of the specimen tissue. result
図 9は、 観察したがん細胞の一部（6 細胞分）の光学顕微鏡写真（蛍光 像）である。 示されるように、 がん細胞においてシグナルが 3 スポッ ト 以上見出された。 アレイ C GH法により遺伝子増幅度（G/R)が 1. 2以上で あった 10 検体において、 M0CS 3 遺伝子領域が増幅していることが確認 された。 また、 病態ステージの初期から後期にわたり遺伝子増幅が起き ていることが示された。 このことは、 M0CS3 遺伝子領域が、 がん治療薬 の分子標的としてだけでなく、 F I SH 法によるがん診断に応用できるこ とを示している。 実施例 7 ： がん特異性の評価  Figure 9 is an optical micrograph (fluorescence image) of a portion of the observed cancer cells (for 6 cells). As shown, more than 3 spots of signal were found in cancer cells. It was confirmed that the M0CS 3 gene region was amplified in 10 specimens whose gene amplification degree (G / R) was 1.2 or more by the array CGH method. It was also shown that gene amplification occurred from the early stage to the late stage of the disease state. This indicates that the M0CS3 gene region can be applied not only as a molecular target for cancer therapeutics, but also for cancer diagnosis by the FISH method. Example 7: Evaluation of cancer specificity
M0CS 3 遺伝子が、 がん検体組織で発現していることを、 当該技術分野 で公知の免疫染色法により実施した。  The M0CS 3 gene was expressed in cancer specimen tissues by immunostaining methods known in the art.
アレイ CGH法により、 遺伝子増幅度（G/R)が 1. 2以上であった検体組 織 （大腸癌患者由来） を用いて、 抗 M0C S 3遺伝子ポリクロ一ナル抗体で 免疫組織染色法を実施した。 結果  Using an array CGH method, immunohistochemical staining was performed with an anti-M0C S 3 gene polyclonal antibody using a sample tissue (derived from a colon cancer patient) that had a gene amplification degree (G / R) of 1.2 or higher. did. Result
図 1 0は、 検体組織のがん細胞において M0C S 3遺伝子のタンパク質が 発現していることを免疫組織染色法で評価した結果を示す。 図に示され るように、 がん部特異的に発現していることが確認された。 低分化腺が ん部の、 複数の核が重なり構造が不規則な上皮細胞で染色が認められた 。 一方、 細胞が秩序良く整列した、 粘膜固有層や正常な腸腺部での染色 は、 認められなかった。  FIG. 10 shows the results of immunohistochemical evaluation of the expression of M0C S 3 gene protein in cancer cells of the specimen tissue. As shown in the figure, it was confirmed that it was expressed specifically in the cancerous part. Staining was observed in epithelial cells with irregularly-structured overlapping nuclei in poorly differentiated glandular cancer. On the other hand, there was no staining in the lamina propria or normal intestinal gland where the cells were well-ordered.
アレイ CGH法により遺伝子増幅度（G/R)が 1. 2以上であった 10検体の 内、 1 0 検体のがん部で M0CS3 遺伝子の発現が確認され、 遺伝子増幅が 起きている検体において、 高頻度に発現が亢進していることが示された また、 病態ステージの初期から後期にわたり発現が亢進していること が示された。 このことは、 M0CS3 遺伝子領域が、 がん治療薬の分子標的 としてだけでなく、 がん診断に応用できることを示している。 実施例 8 ：子宮頸がん細胞株 HeLa細胞株での RNAi効果の評価 Of the 10 specimens whose gene amplification degree (G / R) was 1.2 or more by the array CGH method, expression of M0CS3 gene was confirmed in 10 cancerous parts, and in the specimen where gene amplification occurred, It was shown that expression was increased frequently It was also shown that expression was increased from the early stage to the late stage of the disease state. This indicates that the M0CS3 gene region can be applied not only as a molecular target for cancer therapeutics but also in cancer diagnosis. Example 8: Evaluation of RNAi effect in cervical cancer cell line HeLa cell line
大腸がん細胞株では M0CS3遺伝子のノックダウンにより、 増殖抑制効 果が認められたが、 子宮頸がん細胞株においてどのような効果が認めら れるのか、 前述の RNAi解析法により、 評価した。  In the colon cancer cell line, the M0CS3 gene knockdown showed a growth-inhibiting effect. The effect of the cervical cancer cell line was evaluated by the RNAi analysis method described above.
子宮頸がん細胞である HeLa細胞株を用いて、 前出の 3種の siRNA (実 施例 3 ：表 5)を用いて実施例 3の記載方法と同様に RNAi解析を実施し た。 s i RNAの細胞内への導入は、 O l i g o f e c t am i n e ( I n v i t r o g e n) を使用し、 Ι Ο Ο ηΜの s i R N Aを添付の プロトコールに従い細胞に導入した。 対照には Ne g a t i v e C o n t r o 1 s i RNA (Q I AGEN) を使用した。 結果  Using the HeLa cell line, which is a cervical cancer cell, RNAi analysis was carried out in the same manner as described in Example 3 using the above three siRNAs (Example 3: Table 5). For introduction of siRNA into cells, Oligofeminte (Invitrogen) was used, and siRNA of ΙΙΟηΜ was introduced into the cells according to the attached protocol. As a control, negative RNA Co nt r o 1 si RNA (Q I AGEN) was used. Result
図 1 1は、 HeLa 細胞に M〇 C S 3遺伝子の s i RNAを T r a n s f e c t i o n後、 4日目の細胞を用いて測定試薬により生細胞数を測 定した結果を示す。 グラフは NCに対する相対量を示した。 図に示され るように、 M〇 C S 3遺伝子の s i RNA 3種 （ a , b , c ) の内、 siRNA bにおいて 15%、 siRNA cにおいて 25%の増殖抑制効果が認められ た（Pく 0.01の t検定において有意）。  Fig. 11 shows the results of measuring the number of viable cells with the measuring reagent using the cells on the 4th day after Transfectioion of MCS3 gene siRNA on HeLa cells. The graph shows the relative amount to NC. As shown in the figure, among the 3 types of siRNAs (a, b, c) of MCS3 gene, 15% of siRNA b and 25% of siRNA c were inhibited. Significant in 0.01 t test).
さらに、 時系列に従い、 顕微鏡下で微分干渉像を撮影し、 その動態を 詳細に観察した。 その結果を、 図 1 2に示す。 図中、 a、 b、 および c はそれぞれ、 図 1 1の s i RNA a、 s i RNAb、 および s i RNA cに対応する。 図 1 2に示されるように、 増殖抑制が認められた ！)、, c において細胞死の誘導が認められた。 （3日後の b、 cにおいて、 死細胞 を赤点で示した。 ）  Furthermore, according to the time series, differential interference images were taken under a microscope, and their dynamics were observed in detail. The results are shown in Figure 12. In the figure, a, b, and c correspond to siRNA a, siRNAb, and siRNA c in FIG. As shown in Figure 1 2, growth inhibition was observed! ),, C induced cell death. (Dead cells are indicated by red dots in b and c after 3 days.)
この結果より MO C S 3遺伝子機能の阻害が大腸がんだけでなく、 子 宮頸がんにおいても抗腫瘍性効果を示すことが示唆された。 実施例 9 ： 質量分析による血中 MOC S 3タンパク質の検出 From this result, inhibition of MO CS 3 gene function was not only observed in colorectal cancer, but also It was suggested that cervical cancer also has an antitumor effect. Example 9: Detection of blood MOC S 3 protein by mass spectrometry
1 ) 血液検体の前処理  1) Pretreatment of blood sample
大腸癌患者の血清検体 10 L及び健常者血清検体 10/xLを、 希釈バッ ファ溶液 （lOmM Tris HC1 ph 7.4+150mM NaCl) 500 L で希釈後、 ProteomeLab IgY-12 SC プロテオームパーティ ショニングキッ ト （ BECKMAN COULTER： A24618) を用いてアルブミン、 グロブリン等の血清 中多量蛋白質を除去した。 得られた画分に終濃度 10mM となるようにジ チオスレィ トール （Wako:049_08972) を加え、 還元反応を 60°Cで 30分 間行った。 反応終了後、 終濃度 lOmM となるようにョードアセトアミ ド (SIGMA: 144-48-9) を加え、 アルキル化反応を室温で 30 分間、 遮光状 態で行った。 反応終了後、 反応液の 4 倍量の冷アセトン （Wako:014 - 08681, - 20°C) を加え、 一 80°Cに 1 時間静置した後に 15, 000 x g で 30 分間遠心してタンパク質を沈殿として回収した。 回収したタンパク 質は 80 zL の 2M尿素 + lOOmM重炭酸アンモニゥム溶液に溶解した。 溶 解後に一部を BCA法によるタンパク質濃度測定に供した。 試料タンパク 質と 1/50 (w/w)となるようにトリプシン （Promega： V511C) を加え、 37°Cで 16時間消化反応を行った。  Serum specimens of colorectal cancer patients 10 L and healthy subject serum specimens 10 / xL were diluted with 500 L of diluted buffer solution (lOmM Tris HC1 ph 7.4 + 150 mM NaCl), then ProteomeLab IgY-12 SC Proteome partitioning kit (BECKMAN COULTER: A24618) was used to remove serum abundant proteins such as albumin and globulin. Dithiothreitol (Wako: 049_08972) was added to the obtained fraction to a final concentration of 10 mM, and the reduction reaction was performed at 60 ° C for 30 minutes. After completion of the reaction, odoacetamide (SIGMA: 144-48-9) was added to a final concentration of lOmM, and the alkylation reaction was carried out at room temperature for 30 minutes in the light-shielded state. After completion of the reaction, add 4 times the volume of cold acetone (Wako: 014-08681, -20 ° C) to the reaction solution, let stand at 80 ° C for 1 hour, centrifuge at 15,000 xg for 30 minutes, and remove protein. Collected as a precipitate. The recovered protein was dissolved in 80 zL of 2M urea + lOOmM ammonium bicarbonate solution. After dissolution, a portion was subjected to protein concentration measurement by the BCA method. Trypsin (Promega: V511C) was added to the sample protein at 1/50 (w / w), and digestion was performed at 37 ° C for 16 hours.
2 ) Nano-HPLC直結質量分析装置による解析 2) Analysis using Nano-HPLC direct mass spectrometer
ペプチド断片 0. 量を Precolumn cartridge (C18 PepMap300, 5 im, 300A, 300 ΠΙ i. d. x 5 匪 LC PACKINGS : 163589)と直結させた ナノカ ラム （C18 PepMap 3 a m, 100 A , 75 m i. d. x 150 龍 LC PACKINGS:160321) により分離した。 HPLC 装置は Ultimate Plus (LC PACKINGS)を用いた。 流速は 200nL/min、 0.1%ギ酸 (Wako： 062-02901) 含有 2%ァセトニトリル （MERCK: 1287229) と 0.1%ギ酸含有 90%ァセトニ トリルの濃度勾配が 0.57¾/minの直線グラジェントを設定して解析を行 つた。 Nano- HPLCで分離した試料は PicoTip (New Obj ect ive :FS360-20- 10-D-20) を通して直結したイオントラップ型質量分析装置に連続的に 導入した。 質量分析装置は HCT Plus (Bruker Dal tonics)を用いた。 試 料のイオン化はキヤピラリー電圧 1500V、 エンドプレートオフセット値 500V、 ドライガス流量 12 L/min、 ドライガス温度 250°Cの条件で行った 。 イオントラップの設定は標的 m/z の前後 2 Da の取り込みとし、 MRM モードでの MS/MS解析を行った。 Peptide fragment 0. Nanocolumn (C18 PepMap 3 am, 100 A, 75 m id x 150 dragon LC) directly coupled with Precolumn cartridge (C18 PepMap300, 5 im, 300A, 300 ΠΙ id x 5 匪 LC PACKINGS: 163589) PACKINGS: 160321). As the HPLC apparatus, Ultimate Plus (LC PACKINGS) was used. The flow rate is 200nL / min, and a linear gradient with a concentration gradient of 0.57¾ / min between 2% acetonitrile (MERCK: 1287229) containing 0.1% formic acid (Wako: 062-02901) and 90% acetonitrile containing 0.1% formic acid is set. Analysis was performed. The sample separated by Nano-HPLC is PicoTip (New Object: FS360-20- 10-D-20) and introduced continuously into an ion trap mass spectrometer directly connected. As the mass spectrometer, HCT Plus (Bruker Dal tonics) was used. The sample was ionized under the conditions of a capillary voltage of 1500 V, an end plate offset value of 500 V, a dry gas flow rate of 12 L / min, and a dry gas temperature of 250 ° C. The ion trap was set to capture 2 Da before and after the target m / z, and MS / MS analysis was performed in MRM mode.
3) データ解析 3) Data analysis
質量分析装置から得た全分析デ一夕は Data Analysisソフトウェア （ Bruker Daltonics) を介して出力した。 出力した全データ中から標的分 子の分析デ一夕のみを抽出した。 抽出したデ一夕の中から各分析時間に おける MS/MSデータを精査し、 標的分子のフラグメントイオンに相当す る質量を持つイオンピークの有無を解析した。 .  All analysis data obtained from the mass spectrometer was output via Data Analysis software (Bruker Daltonics). Only the target molecule analysis data was extracted from all the output data. From the extracted data, we examined the MS / MS data at each analysis time and analyzed the presence or absence of an ion peak with a mass corresponding to the fragment ion of the target molecule. .
図 1 3 Aおよび Bは、 （A) 大腸がん患者由来の血清および （B) 健 常者由来の血清について、 上記の方法で解析した結果をそれぞれ示す。  Figures 13 A and B show the results of analysis of the above methods for (A) serum from colon cancer patients and (B) serum from healthy subjects, respectively.
'図 1 4 A〜Cは、 MS/MS 解析によって決定された、 図 1 3に示すピ一 クとアミノ酸 （またはアミノ酸配列） との対応関係を示す。  'Figures 14A to C show the correspondence between the peaks shown in Figure 13 and amino acids (or amino acid sequences) determined by MS / MS analysis.
図 1 3および 1 4に示されるように、 標的分子のフラグメントイオン に相当するイオンピークが、 大腸がん患者由来の血清中に明確に認めら れた。 すなわち、 図 1 4 Bに示すように、 少なくとも C末端側から E P S L LQという部分配列が決定され、 これは、 MO C S 3タンパク質の アミノ酸配列 （配列番号 2) 中の、 3 2 8位〜 3 3 3位のアミノ酸配列 に相当することから、 アミノ酸配列 3 2 6位〜 3 3 5位の標的ペプチド フラグメント （配列番号 1 3) が同定された。 このような部分配列に対 応するイオンピークは健常者血清を用いた解析では認められなかった （ 図 1 4 Cを参照） 。 よって、 この標的分子 （すなわち、 MO C S 3タン パク質） は癌特異的に血中存在量が増加している可能性が強く示唆され た 実施例 1 0 ：種々のがん種における特異性の評価 As shown in Figures 13 and 14, an ion peak corresponding to the fragment ion of the target molecule was clearly observed in the serum from colon cancer patients. That is, as shown in FIG. 14B, a partial sequence called EPSL LQ is determined at least from the C-terminal side. Since it corresponds to the amino acid sequence at position 3, the target peptide fragment (SEQ ID NO: 1 3) at amino acid sequences 3 2 6 to 3 3 5 was identified. Such an ion peak corresponding to the partial sequence was not found in the analysis using the serum of healthy subjects (see Fig. 14C). Therefore, it is strongly suggested that this target molecule (ie, MO CS 3 protein) may have increased cancer abundance specifically in cancer. Example 10: Evaluation of specificity in various cancer types
M0CS3 遺伝子が、 大腸がん以外の臓器癌で発現しているかどうかにつ いて、 当該技術分野で公知の免疫染色法により実施した。  Whether the M0CS3 gene was expressed in organ cancers other than colorectal cancer was determined by an immunostaining method known in the art.
35 種類の臓器の癌組織が 96 サンプル配置された、 Multiple organ cancer tissue microarray for testing tumor tissue specificity of therapeutic antibodies (US Bioma 社）を用いて、 抗 M0CS3 遺伝子ポ リクローナル抗体で免疫組織染色法を実施した。  Immunohistochemical staining was performed with anti-M0CS3 gene polyclonal antibody using Multiple organ cancer tissue microarray for testing tumor tissue specificity of therapeutic antibodies (US Bioma), in which 96 samples of cancer tissues from 35 organs were placed. .
免疫組織染色法は、 賦活化方法については YamasMta S & Okada Y. (2005) J Histochem Cytochem. Nov;53 (11) :1421-32 に、 染色方法につ いては、 渡辺 · 中野 酵素抗体法 改訂四版 （学際企画） に準じた。 ネガティブコントロールにゥサギ IgGを使用した。 MM.  The immunohistochemical staining method was revised to YamasMta S & Okada Y. (2005) J Histochem Cytochem. Nov; 53 (11): 1421-32 for the activation method, and Watanabe / Nakano enzyme antibody method was revised for the staining method. According to the 4th edition (interdisciplinary planning). Usagi IgG was used as a negative control. MM.
35 種類の臓器（脳、 食道、 胃、 肝、 小腸、 結腸、 直腸、 膝、 網膜、 肺 、 子宮頸部、 子宮、 乳、 卵巣、 脾、 前立腺、 精巣、 腎、 膀胱、 リンパ節 、 縦隔、 腸間膜、 骨組織、 喉頭軟骨、 頰、 唇、 鼻、 咽喉、 喉頭、 咽頭、 舌、 脂肪組織、 線維組織、 甲状腺、 皮膚）のがん組織について M0CS3 夕 ンパク質の発現を免疫組織染色法で解析し、 いくつかのがん種において 特異的な発現が認められた。 その結果を図 1 5 - 1および図 1 5— 2に 示す。  35 organs (brain, esophagus, stomach, liver, small intestine, colon, rectum, knee, retina, lung, cervix, uterus, breast, ovary, spleen, prostate, testis, kidney, bladder, lymph node, mediastinum , Mesentery, bone tissue, laryngeal cartilage, sputum, lips, nose, throat, larynx, pharynx, tongue, adipose tissue, fibrous tissue, thyroid, skin) M0CS3 protein expression in immunohistochemistry Analysis, and specific expression was observed in several cancer types. The results are shown in Fig. 15-1 and Fig. 15-2.
図 1 5— 1および図 1 5— 2は、 解析した臓器の内、 発現が認められ た胃 （A ： stomach) 、 結腸 （B ： colon) 、 直腸 （C ： rectum) 、 網膜 (D ： epiploon) 、 肺 （E、 F、 G ： lung) 、 卵巣 （ I、 J ： ovary) 、 前立腺 （L ： prostate) 、 リンパ節 （M ： Lymp node) 、 骨組織 （O ： bone) 、 および縦隔 （R ： mediastinum) における結果を示す。 また 、 弱いながらも、 乳 （H ： breast) 、 脾臓 （K ： spleen) 、 咽喉 （P ： throat) 、 および脂肪組織 （Q ： fatty tissue) においても発現が認め られた。 Fig. 15-1 and Fig. 15-2 show the expression of the stomach (A: stomach), colon (B: colon), rectum (C: rectum), retina (D: epiploon). ), Lung (E, F, G: lung), ovary (I, J: ovary), prostate (L: prostate), lymph node (M: Lymp node), bone tissue (O: bone), and mediastinum ( R: mediastinum). In addition, although it is weak, expression is also observed in milk (H), spleen (K: spleen), throat (P: throat), and adipose tissue (Q: fatty tissue). It was.
傾向としてリンパ腫において比較的顕著な発現が認められた（図 1 5 _ 1 B、 図 1 5— 2 K、 Μ、 Ν、 および R)。 また、 M0CS3は腺腫において発 現が認められた（図 1 5— 1 A、 C、 D、 I、 J、 および図 1 5— 2 L)。  The trend was relatively marked in lymphoma (Figure 15 _ 1 B, Figure 15 5-2 K, Μ, Ν, and R). M0CS3 was also expressed in adenomas (Fig. 15-1 A, C, D, I, J, and Fig. 15-2 L).
これにより、 M0CS3 が幅広いがん種で発現が亢進していることが示さ れた。 このことは、 M0CS3 が、 がん治療薬の分子標的としてのがん特異 性が示されたと同時に、 大腸がんだけではなく、 幅広いがん種に対して の適用が可能であることが示唆された。 これは、 がん診断への応用にお いても同様であり、 M0CS3の重大な有効性を示唆している。 産業上の利用可能性  This showed that M0CS3 is upregulated in a wide range of cancer types. This suggests that M0CS3 has shown cancer specificity as a molecular target for cancer therapeutics, and can be applied to a wide range of cancer types, not just colorectal cancer. It was. This also applies to cancer diagnosis, suggesting the significant effectiveness of M0CS3. Industrial applicability
本発明は、 がんの治療剤、 診断剤、 診断方法、 治療方法、 ならびにそ れに使用するキットなどを提供する。 したがって、 本発明は、 がんの診 断、 または標的治療等の分野において有用である。  The present invention provides a therapeutic agent for cancer, a diagnostic agent, a diagnostic method, a therapeutic method, and a kit used therefor. Therefore, the present invention is useful in fields such as cancer diagnosis or targeted therapy.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1. MOC S 3遺伝子の発現阻害物質を有効成分として含有するがん治 療剤。 1. A cancer treatment containing an MOC S 3 gene expression inhibitor as an active ingredient.
2. 前記 MOC S 3遺伝子の発現阻害物質が、  2. The MOC S 3 gene expression inhibitor is
( a ) MOC S 3遺伝子の発現を RN A i効果により阻害する作用を 有する核酸、  (a) a nucleic acid having an action of inhibiting the expression of the MOC S 3 gene by the RN Ai effect,
(b) MO C S 3遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセ ンス核酸、  (b) an antisense nucleic acid for a transcript of the MO C S 3 gene or a part thereof,
および and
(c ) MOC S 3遺伝子の転写産物を特異的に切断するリポザィム活 性を有する核酸、  (c) a nucleic acid having a liposomal activity that specifically cleaves the transcript of the MOC S 3 gene;
からなる群から選択される物質を含む、 請求項 1に記載のがん治療剤。The cancer therapeutic agent according to claim 1, comprising a substance selected from the group consisting of:
3. M〇 C S 3夕ンパク質の活性阻害物質を有効成分として含有するが ん治療剤。 3. A therapeutic agent for cancer that contains an active ingredient of M ○ C S 3 protein activity inhibitor.
4. 前記 MOC S 3タンパク質の活性阻害物質が、  4. The MOC S 3 protein activity inhibitor is
該 MO C S 3夕ンパク質に対する抗体、  An antibody against the MO C S 3 protein,
を含む、 請求項 3に記載のがん治療剤。 The cancer therapeutic agent of Claim 3 containing this.
5. 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求項 1〜4のいず れかに記載のがん治療剤。  5. The cancer therapeutic agent according to any one of claims 1 to 4, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.
6. MO C S 3遺伝子の発現阻害物質をスクリ一二ングする方法であつ て、  6. A method of screening for a substance that inhibits the expression of the MO C S 3 gene,
(a) MOC S 3遺伝子を発現する細胞に、 被検化合物を接触させる 工程、  (a) a step of contacting a test compound with a cell expressing the MOC S 3 gene,
(b) 該 MOC S 3遺伝子の発現レベルを測定する工程、 および (b) measuring the expression level of the MOC S 3 gene; and
(c ) 被検化合物を接触させない場合と比較して、 該発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程を包含する、 スクリ一二ング方法。 (c) A screening method comprising a step of selecting a compound that lowers the expression level as compared with a case where a test compound is not contacted.
7. M〇 C S 3夕ンパク質の活性阻害物質をスクリ一二ングする方法で あって、 (a) MO C S 3夕ンパク質と被検化合物とを接触させる工程、7. A method for screening for substances that inhibit the activity of M CS 3 protein, (a) contacting the MO CS protein with a test compound;
(b) 該 MOC S 3タンパク質と被検化合物との結合活性を測定する 工程、 および (b) measuring the binding activity between the MOC S 3 protein and a test compound; and
(c ) 該 MOC S 3タンパク質と結合する化合物を選択する工程を包 含する、 スクリーニング方法。  (c) A screening method comprising a step of selecting a compound that binds to the MOC S 3 protein.
8. 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求項 6または 7に 記載の方法。  8. The method according to claim 6 or 7, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.
9. MO C S 3タンパク質に対する抗体。  9. Antibodies against MO C S 3 protein.
1 0. 請求項 9に記載の抗体を含有するがん治療剤。  1 0. A cancer therapeutic agent comprising the antibody according to claim 9.
1 1. 放射性同位元素、 治療タンパク質、 低分子の薬剤、 または治療遺 伝子を担持したベクターをさらに含有する、 請求項 1 0に記載のがん治 療剤。  1 1. The cancer therapeutic agent according to claim 10, further comprising a vector carrying a radioisotope, a therapeutic protein, a small molecule drug, or a therapeutic gene.
1 2. 前記がんが大腸がんまたは子宮頸がんである、 請求項 1 0または 1 1に記載のがん治療剤。  1 2. The cancer therapeutic agent according to claim 10 or 11, wherein the cancer is colorectal cancer or cervical cancer.
1 3. 請求項 9に記載の抗体を含有するがん診断剤。  1 3. A cancer diagnostic agent comprising the antibody according to claim 9.
1 4. MO C S 3遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェント なハイプリダイゼーション条件下でハイプリダイズ可能な塩基配列を含 有するがん診断剤。  1 4. A cancer diagnostic agent comprising a base sequence that can be hyper-predated under stringent hyper-precipitation conditions in the base sequence of the MO C S 3 gene or a part thereof.
1 5. 前記がんが大腸がんである、 請求項 1 3または 1 4に記載のがん 診断剤。  1 5. The cancer diagnostic agent according to claim 13 or 14, wherein the cancer is colorectal cancer.
1 6. 請求項 9に記載の抗体を含有するがん診断用キッ ト。  1 6. A cancer diagnostic kit comprising the antibody according to claim 9.
1 7. MO C S 3遺伝子またはその一部の塩基配列にストリンジェント なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列から なるポリヌクレオチドを含有するがん診断用キット。  1 7. A cancer diagnostic kit comprising a polynucleotide comprising a base sequence capable of hybridizing under stringent hybridization conditions to the MOCS3 gene or a part of the base sequence.
1 8. 前記がんが大腸がんである、 請求項 1 6または 1 7に記載のがん 診断用キット。  1 8. The cancer diagnostic kit according to claim 16 or 17, wherein the cancer is colon cancer.
1 9. 被験者由来の生体試料中の M〇 C S 3タンパク質または M〇 C S 1 9. M ○ C S 3 protein or M ○ C S in biological samples derived from subjects
3遺伝子をがんマーカーとして検出および または定量する方法。 A method to detect and / or quantify 3 genes as cancer markers.
2 0. 前記生体試料が、 全血、 血清、 または血漿である、 請求項 1 9に 記載の方法。 2 0. In claim 19, wherein the biological sample is whole blood, serum, or plasma The method described.
2 1. 質量分析装置を用いて、 M〇 C S 3タンパク質を検出および/ま たは定量する、 請求項 1 9または 2 0に記載の方法。  2 1. The method according to claim 19 or 20, wherein the M0CS3 protein is detected and / or quantified using a mass spectrometer.
2 2. 抗 M〇 C S 3抗体を用いて、 M〇 C S 3タンパク質を検出および Zまたは定量する、 請求項 1 9〜 2 1のいずれかに記載の方法。 2 2. The method according to any one of claims 19 to 21, wherein the M 0 C S 3 protein is detected and Z or quantified using an anti-M C S 3 antibody.
2 3. (a) 被験者由来の生体試料と、 MOC S 3タンパク質に対する 抗体とを接触させる工程、 および  2 3. (a) contacting a biological sample derived from the subject with an antibody against the MOC S 3 protein; and
(b) 前記試料中での前記抗体と、 MO C S 3タンパク質との結合を 検出および Zまたは定量する工程、  (b) detecting and Z or quantifying the binding between the antibody and the MO C S 3 protein in the sample;
を包含する、 請求項 2 2に記載の方法。 The method of claim 22, comprising:
24. (a) 被験者由来の生体試料と、 MOC S 3遺伝子またはその断 片の塩基配列にストリンジェン卜なハイプリダイゼーション条件下でハ イブリダイズ可能な塩基配列からなるポリヌクレオチドとを接触させる 工程、 および  24. (a) a step of bringing a biological sample derived from a subject into contact with a polynucleotide having a base sequence capable of hybridizing under stringent high-prediction conditions to the base sequence of the MOC S 3 gene or a fragment thereof; and
(b) 前記試料中での前記ポリヌクレオチドと、 MO C S 3遺伝子ま たはその断片とのハイプリダイゼーションを検出および Zまたは定量す る工程、  (b) detecting and Z or quantifying the hybridization between the polynucleotide in the sample and the MO C S 3 gene or a fragment thereof,
を包含する、 請求項 1 9または 2 0に記載の方法。 The method according to claim 19 or 20, comprising:
2 5. がんの診断に用いるための請求項 1 9〜 24のいずれかに記載の 方法。  2 5. The method according to any one of claims 19 to 24 for use in diagnosis of cancer.
2 6. 前記がんが、 大腸がんである、 請求項 2 5に記載の方法。  2 6. The method according to claim 25, wherein the cancer is colorectal cancer.
PCT/JP2006/317705 2005-08-31 2006-08-31 Use of mocs3 gene for therapeutic or diagnostic purposes WO2007026960A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007533382A JPWO2007026960A1 (en) 2005-08-31 2006-08-31 Therapeutic or diagnostic use of MOCS3 gene

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005252304 2005-08-31
JP2005-252304 2005-08-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007026960A1 true WO2007026960A1 (en) 2007-03-08

Family

ID=37809034

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/317705 WO2007026960A1 (en) 2005-08-31 2006-08-31 Use of mocs3 gene for therapeutic or diagnostic purposes

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2007026960A1 (en)
WO (1) WO2007026960A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2955235A3 (en) * 2009-01-30 2016-03-02 Koninklijke Philips N.V. Methods for the subclassification of breast tumours

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005054461A2 (en) * 2003-11-26 2005-06-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Transcriptional regulators and methods thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005054461A2 (en) * 2003-11-26 2005-06-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Transcriptional regulators and methods thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CANNELLA C. ET AL.: "Polyclonal antibodies to bovine rhodanese", ITALIAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 37, no. 4, 1988, pages 235A - 236A, XP003003875 *
MATTHIES A. ET AL.: "Molybdenum Cofactor Biosynthesis in Humans: Identification of a Persulfide Group in the Rhodanese-like Domain of MOCS3 by Mass Spectrometry", BIOCHEMISTRY, vol. 44, no. 21, 2005, pages 7912 - 7920, XP003003876 *
MERRILL G.A. ET AL.: "Detection of timer-dependent and oxidatively induced antigens of bovine liver rhodanese with monoclonal antibodies", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 263, no. 36, 1988, pages 19324 - 19330, XP003003874 *
PALLINI R. ET AL.: "A role for the mitochondrial tiosulfate sulfurtransferase (rhodanese) in tumor cells", ACTA MEDICA ROMANA, vol. 30, no. 3-4, 1992, pages 225 - 228, XP003003877 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2955235A3 (en) * 2009-01-30 2016-03-02 Koninklijke Philips N.V. Methods for the subclassification of breast tumours

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2007026960A1 (en) 2009-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20060110397A1 (en) AIMP2-DX2 and its uses
CA3020650C (en) Ros kinase in lung cancer
JP2008517590A (en) Methods of using slag genes or their replication, transcription or expression products in identifying, diagnosing, preventing or treating the occurrence of cancer expansion and / or metastasis
EP2452948B1 (en) New tumor marker
KR101374667B1 (en) Identification of non-small cell lung carcinoma (nsclc) tumors expressing pdgfr-alpha
KR101928618B1 (en) Therapeutic effect prediction method for colorectal cancer patient in whom expression of tk1 protein has increased
WO2011129427A1 (en) Diagnostic agent and therapeutic agent for cancer
SG187674A1 (en) Bard1 isoforms in lung and colorectal cancer and use thereof
US9789159B2 (en) Diagnosis and treatment of prostate cancer
US8389684B2 (en) Tumor biomarker
JP5354634B2 (en) Human ABH8 protein, gene encoding it, and therapeutic or diagnostic uses thereof
WO2007026960A1 (en) Use of mocs3 gene for therapeutic or diagnostic purposes
WO2007037538A9 (en) Therapeutic or diagnostic application of spo11 gene
JP6312861B2 (en) Use of NKX6.3 as a predictor of cancer development, early diagnosis, and treatment
JPWO2014042148A1 (en) Cancer markers and their uses
JPWO2007037560A1 (en) Therapeutic or diagnostic use of SGK2 gene
WO2007037532A1 (en) Therapeutic or diagnostic application of srms gene
WO2007037533A9 (en) Therapeutic or diagnostic application of ppp1r3d gene
AU2014203702B2 (en) New tumor marker
WO2007037555A9 (en) Therapeutic or diagnostic application of dusp15 gene
WO2007037550A9 (en) Therapeutic or diagnostic application of tsta3 gene
JPWO2005021739A1 (en) Antibody against Nox1 polypeptide, cancer diagnostic method using Nox1 gene, and screening method for cancer growth inhibitory substance
JP2010166873A (en) Curative or diagnostic application of pomp gene and psma7 gene
Chiriboga et al. Stromal Cell–Derived Factor-1A and CXCR4 Expression in Hemangioblastoma and Clear Cell-Renal Cell Carcinoma: von Hippel-Lindau Loss-of-Function Induces Expression of a Ligand and Its Receptor

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2007533382

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06797581

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1