WO2007028906A2 - Methode de dosage des amines primaires a tres faible concentration - Google Patents

Methode de dosage des amines primaires a tres faible concentration Download PDF

Info

Publication number
WO2007028906A2
WO2007028906A2 PCT/FR2006/002070 FR2006002070W WO2007028906A2 WO 2007028906 A2 WO2007028906 A2 WO 2007028906A2 FR 2006002070 W FR2006002070 W FR 2006002070W WO 2007028906 A2 WO2007028906 A2 WO 2007028906A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reagent
marking
primary amines
primary
sample
Prior art date
Application number
PCT/FR2006/002070
Other languages
English (en)
Other versions
WO2007028906A3 (fr
Inventor
Marlène LACROIX
Véréna POINSOT
François COUDERC
Original Assignee
Universite Paul Sabatier
Picometrics S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Paul Sabatier, Picometrics S.A. filed Critical Universite Paul Sabatier
Publication of WO2007028906A2 publication Critical patent/WO2007028906A2/fr
Publication of WO2007028906A3 publication Critical patent/WO2007028906A3/fr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • G01N33/6815—Assays for specific amino acids containing sulfur, e.g. cysteine, cystine, methionine, homocysteine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"

Definitions

  • the present invention belongs to the field of high sensitivity chemical analysis of amino molecules present in biological fluids, in particular proteins and peptides.
  • the invention relates to a kit and a method for marking primary amines in complex samples such as samples from biological media.
  • the invention makes it possible to identify and assay amines at very low concentrations in samples of very small size.
  • the invention also makes it possible to detect and quantify primary amines in a simple, fast and precise manner. Thanks to the excellent selectivity of the method on which it is based, the invention makes it possible in particular to distinguish the different primary amines of the same sample, but also to identify the identical primary amines present in different samples.
  • Proteomics is known to study all the proteins present in an organism. It may for example be designed to study gene expression based on the protein profile of a cell or more broadly a biological system. One can also seek to establish a comparison between normal cells and abnormal cells, to find out which proteins vary in proportions between a healthy organism and a sick organism. Such a comparison makes it possible to identify certain proteins as therapeutic targets and to develop new drugs.
  • MS mass spectrometry
  • DIGE DIfferential Gel Electrophoresis
  • Peptidomic is still a stammering discipline, but one that is enjoying increasing success on the fringes of proteomics (Svensson M., Skold K., Svenningsson P., Andren PE, J. Proteome Res., 2003, 2, pp. 213-9). Its purpose is to dose relative and absolute peptides contained in a medium.
  • One of its applications is, for example, in neurochemistry, the measurement in microdialysates of rat brains, of the variation as a function of time of the concentration of different neuropeptides (substance P, neurotensin, angiotensin, etc.).
  • markers characterized by their fluorescence properties such as cyanines are used, the markers being able to be excited respectively at 532 nm and at 633 nm (for example the markers Cy3 and Cy5 marketed by Pharmacia).
  • cyanines for example the markers Cy3 and Cy5 marketed by Pharmacia.
  • a pair of fluorescent (and therefore emitting) fluorescent markers are used at different wavelengths, commonly Cy3 and Cy dyes. 5.
  • the comparison of the intensities of the fluorescence signals gives the relative concentration for the same protein between the healthy organism and the abnormal organism.
  • Fluorometry and laser-induced fluorimetry (LIF) are now well controlled to allow the detection of fluorescent molecules at very low concentrations (Somiari, id).
  • non-radioactive isotopic markers are used, that is to say markers differing only in their mass, their chemical formula remaining identical.
  • n deuterium atoms have taken the place of n hydrogen atoms, the difference in mass between the two markers therefore being equal to n.
  • the same principle can be achieved by replacing C 12 carbon atoms with C 13 heavy carbon.
  • each population is associated with one of the markers.
  • the fragmentation of the molecules leads to the formation of certain ions characteristic of the markers and molecules studied. Peaks corresponding to ions that differ from n mass units are identified and their relative intensity represents the proportion of a given protein in each population. Relative comparisons can be made between protein populations of healthy and abnormal cells or organs. The mass spectrometry data thus make it possible to reconstitute the structure of the molecules.
  • Mass spectrometry can also be used for carrying out quantitative assays, provided that an isotopic internal standard is available, that is to say of the same molecule as that studied, but isotopically labeled with several atoms. deuterium or C 13 .
  • an isotopic internal standard is available, that is to say of the same molecule as that studied, but isotopically labeled with several atoms. deuterium or C 13 .
  • the molecule to be assayed and its internal isotopic standard can be obtained under the same conditions by chemical separation techniques (by co-migration in liquid chromatography or by electrophoretic techniques), and on the other hand on the other hand, they can be identified and distinguished on the mass spectrum, thanks to their difference in molecular weight.
  • this type of marker reacts only on the thiol groups of the cysteines. More generally, another important limitation of mass spectrometry assay methods is that in practice it is not always possible to have an internal isotopic standard since this requires a synthesis with heavy isotopes of the compounds to be made. assayed. Also a method has been proposed, consisting in deriving the compounds with a group containing itself isotopes heavy.
  • patent application US 2003 0054570 proposes to modify the cysteines by compounds containing an arginine group and capable of binding to the thiol function of cysteines by means of a carbon chain containing light or heavy isotopes.
  • the marker may contain different heavy isotopes and has a function having a given biological affinity for selectively isolating the molecules derived on an affinity column.
  • the quantitative assays are carried out either by fluorimetry or by mass spectroscopy, whereas the determination of the structure of the molecules is carried out by mass spectroscopy, these two complementary analysis techniques having to be carried out together in order to have useful data complete.
  • these two complementary analysis techniques have to be carried out together in order to have useful data complete.
  • they are long and complex to implement and nothing exists to conduct this work in routine regime.
  • the use of specific markers, each of which is likely to be detected by a technique further increases the cumbersome preparatory work of the analyzes.
  • NDA 2,3-naphthalene dialdehyde
  • the CN group also has risks related to its toxicity during handling, and is in any case of very limited interest. On the one hand it can not provide an isotopic label because only one carbon atom could be replaced, which is insufficient to obtain interpretable results in mass spectrometry. On the other hand, unlike the markers of the present invention, one can not change its structure by derivation to have two different markers usable in the same analysis, one may for example be used to provide an internal standard.
  • an object of the present invention is to provide molecular marking means for both the quantitative determination and the structural determination of the entities studied.
  • a second objective of the present invention is to have a high chemical reactivity label allowing the analysis of biological substances in micromolar concentration or less.
  • Another object of the present invention is to have a method of high selectivity and sensitivity vis-à-vis the target molecules.
  • An objective of the invention is also to allow the assay of most of the representative molecules of the protein or peptide profile of a medium studied, namely those carrying a primary amine function.
  • Yet another object of the invention is to be able to carry out the simultaneous determination of the primary amines present in two media of different origin, by a single series of measurements carried out on a single sample, to directly compare the protein or peptide profiles of the two media. .
  • the invention relates to a method for labeling entities carrying a primary amine function (N) for quantitative and structural analysis consisting essentially of reacting in one step said primary amines with: - a reagent (F) capable of forming a fluorescent compound with said primary amines, and a reagent (S) capable of substituting the reagent (F) with an ionizable group and of forming a major ion by fragmentation of said compound.
  • N primary amine function
  • S reagent
  • kits comprising at least: a reagent (F) capable of forming a fluorescent compound with the primary amines (N),
  • a reagent (S) capable of substituting the reagent (F) with an ionizable group and of forming a major ion by fragmentation of said compound.
  • the three components namely the primary amine to be analyzed, the dye reagent (F) and the substitution reagent (S) react in one step, with a reaction yield close to 100%.
  • the compounds obtained are fluorescent. They give by ionization a preferential fragmentation resulting in the loss of the side chain provided by the substitution reagent
  • fluorimetric dyes usable as markers of the primary amines in the present invention are already known. However, these fluorescence markers have been used until now only for a quantitative determination of known molecules
  • the emission at the fluorescence wavelength is proportional to the concentration in the sample.
  • This type of reagent is proposed here for the study of both quantitative and structural primary amines, for a complete identification of molecules of interest. This particularly interesting result is obtained in particular by virtue of the derivation of these fluorogenic molecules by ionizable groups, thus making these markers usable for mass spectrometric determination of the very low concentrations of primary amines.
  • a binary marker associated with the target molecule is then obtained, the reaction products being detectable as such by two distinct methods of analysis, even at micromolar or even nanomolar concentrations.
  • the reaction of the primary amines with the binary marker according to the invention has an excellent yield and specificity, all the primary amines and they alone reacting with the labeling reagents.
  • the analytical techniques employed also show exceptional sensitivity to the amines labeled according to the invention, which makes it possible to achieve the desired result. Without attempting to provide a theory explaining the synergistic effect observed, the hypothesis can be formulated that the presence of a reagent providing an ionizable group promotes the combination of the three components primary amine-fluorogenic reagent-reactive substitution. It even seems that the presence of the amine is decisive for the fixation of the ionizable substitution reagent on the fluorogenic reagent.
  • the invention will extend to any entity carrying a primary amine function, that is to say as well to proteins, peptides and amino acids, as to other molecules bearing such a function can exist in a medium, biological or not, to study.
  • the primary amine function is one of the most common functions among biological molecules. This prevalence is exploited by the present invention, which thus relates to a method for determining primary amines, intended for the study of amino species.
  • the reagent (F) corresponds to a molecule capable of forming a fluorescent compound with the primary amines.
  • the reagent (F) is preferably a fluorogenic aromatic dialdehyde, which may be advantageously chosen from aromatic alpha-dialdehydes giving fluorescent derivatives of the family of isoindoles. In a nonlimiting manner, it is chosen from the following reagents: naphthalene 2,3-dialdehyde (NDA), orthophthal-dialdehyde (OPA), anthracene dialdehyde (APA), and their substituted derivatives.
  • NDA naphthalene 2,3-dialdehyde
  • OPA orthophthal-dialdehyde
  • APA anthracene dialdehyde
  • NDA 2,3-naphthalenedialdehyde
  • the reagent (S) corresponds to a molecule capable of substituting the reagent (F) with an ionizable group and of forming a major ion by fragmentation of said compound.
  • the faculty of ionization of the group brought by. the reagent (S) is considered before fixing on the reagent (F).
  • an ionizable group is defined as a group whose pKa is between 2 and 12.
  • the expressions "ionizable group”, “ionizable thiol", ... will refer to the faculty of ionization of said grouping before or after its attachment to the reagent (F).
  • the reagent (S) is preferably capable of substituting the reagent (F) alpha for the primary amine (N). It is advantageously an ionizable thiol, which may be chosen from compounds of formula R - SH, where R is a linear or branched carbon chain carrying a functional group of acidic or basic character other than a primary amine. Such thiols of general formula R - SH are indeed easily ionizable. Used in combination with the aromatic dialdehyde they form, after reaction with the amine to be studied, fluorescent compounds derived by a sulfur group.
  • the reagent (S) is a compound of formula R - SH, where R is a carbon chain of the - (CH 2 ) X - A type, with x> 2, and A is a functional group with an acidic character or basic other than a primary amino group.
  • the functional group A is chosen from the secondary amine, tertiary amine, quaternary amine or guanidinium type groups, or from the acid groups COOH, SO 4 H, SO 3 H 5 BO 3 H.
  • the labeling kit is used for the labeling of amines in different samples, often with a view to making a comparison between the media from which these samples originate, which can for example be taken from two different organisms to compare from the point of view of their protein or peptide profile.
  • This pair of samples may also consist of a sample from a medium to be studied and a standard sample.
  • R-SH substitution reagents are easily synthesized and it is easy to obtain a reagent (S) labeled isotopically either by deuterium atoms or by C 13 atoms (heavy reagent) and keeping the same chromatographic grades as the light reagent.
  • This is particularly the case for aminothiols for example linear aminothiols of formula B 1 B 2 N- (CH 2 ) X -SH, where Bi and B 2 are not hydrogen at the same time
  • carboxythiols by linear carboxythiols of formula HOOC- (CH 2 ) X -SH which make it possible to obtain inexpensive isotopic standards which can be used in fluorimetry, laser-induced fluorimetry and mass spectrometry.
  • the reagent (S) atoms can be replaced by a stable isotope.
  • the corresponding marking kit then comprises i) a first reagent (S) and ii) a second reagent (S ') of the same formula as the first reagent (S) of which at least one atom is replaced by a stable heavy isotope.
  • a stable heavy isotope Preferably, in mass spectrometry, at least four atoms are substituted by their heavy isotope.
  • the corresponding labeling kit comprises i) a first reagent (F) and ii) a second reagent (F ') of the same formula as the first reagent (F) of which at least one atom is replaced by a stable isotope.
  • the term "light reagent” is used to denote the one which does not contain isotope and " heavy reagent "one that contains at least one stable heavy isotope of one of its atoms.
  • the "light compound” will be termed the compound labeled with the light reagent and "heavy compound” that which is labeled with the heavy reagent.
  • the marking kit of entities carrying a primary amine function present in two samples comprises a first reagent (Si) and a second reagent (S 2 ) of the respective formulas R 1 -SH and R 2 - SH, wherein R 1 and R 2 are linear or branched carbon chains carrying a functional group of acidic or basic character other than a primary amine, and wherein R 1 and R 2 have different masses.
  • This embodiment is particularly advantageous because it avoids resorting to the synthesis of a heavy compound used as an internal standard in mass spectrometry.
  • the term "light reagent” is used to refer to the one with the shortest carbon chain, and the “heavy reagent” to the one with the most carbonaceous chain. long.
  • the so-called “light compound” is the compound labeled with the light reagent and “heavy compound” that which is labeled with the heavy reagent.
  • the reagent (S) comprises at least one asymmetric carbon and is optically pure.
  • this reagent forms with a primary amine having an asymmetric carbon a pair of diastereoisomers with certain physical properties are different, including their hydrophobicity. The diastereoisomers, eluted at different speeds, can therefore be separated and analyzed individually.
  • the reagents (F) and (S) can be introduced into a biological sample to mark the entities carrying a primary amine function of said biological sample.
  • the two reagents are capable of selectively reacting with the primary amines, in one step, to give detectable compounds as such, by fluorimetry and by mass spectroscopy.
  • This reaction has the great advantage of maintaining a good yield and a high selectivity towards primary amines even in a complex medium such as a biological medium.
  • the labeled entities, formed with all the primary amines present in said medium can then be separated, identified and quantified by means of the analysis method according to the invention which will be described later.
  • the labeling method and the kit according to the invention described above can be applied to the labeling of primary amines from all kinds of biological media, for example human, animal, plant, microbiological, viral and any type of environment. and samples, healthy organisms, sick or with any abnormality. They are particularly suitable for labeling primary amines in a biological sample.
  • Another subject of the invention is a method for analyzing primary amines present in a sample, implementing the marking method described above.
  • This method of analysis essentially comprises the steps of: a) labeling the primary amines by the labeling method as described above, b) treating the sample with at least one separation technique to obtain fractions, c) subjecting fractions obtained in at least one of the following analytical techniques: fluorimetry, mass spectrometry.
  • the marking kit according to the invention can of course be advantageously used for the implementation of the analysis method above.
  • the analysis method according to the invention also makes it possible to analyze the primary amines present in two samples, by using two substitution reagents or two coloring reagents forming the "light-heavy" pairs described previously noted [(F)). 5 (S)], namely a pair S-S ', Si-S 2 , or F-F'.
  • This process essentially comprises the following steps: a) labeling the primary amines of the two samples by a labeling method as described above, each using a pair of labeling reagents [(F) 5 (S)] different b) treating the samples with at least one separation technique to obtain two series of distinct fractions, c) subjecting the two series of fractions obtained to at least one of the following analytical techniques: fluorimetry, mass spectrometry.
  • the analysis method can be carried out using the primary amine labeling kit described above using different pairs of reagents.
  • the analysis method according to the invention makes it possible to perform the analysis of the primary amines present in two distinct media, in a single series of measurements on a single sample obtained by combining the two media.
  • the process then essentially comprises the following steps: a) labeling the primary amines of the two media with a labeling method as described above, each using a pair of labeling reagents [(F), (S)] (b) combine the two media into a single sample, (c) treat the sample with at least one separation technique to obtain a single series of fractions, (d) subject the fractions obtained to at least one of the following analytical techniques: fluorimetry, mass spectrometry.
  • sample is used to refer to a solution containing known or unknown substances in greater or lesser number, which may come for example from a biological sample, or prepared for experimental purposes, and the sample taken from a medium will be called “sample”. for submission to analysis. Note that in the general case, a given sample is taken from a given medium and the two terms can be synonymous.
  • a single sample is formed from two samples on separate media, to obtain by a single series of measurements qualitative and quantitative information on the two media, which can then be compared directly.
  • This mode of analysis is therefore extremely powerful and is a particularly important result of the present invention.
  • the analysis method according to the invention can be implemented according to various protocols having different advantages, which perfectly allows the method of labeling primary amines claimed.
  • the second sample comprises at least one known primary amine at a concentration known. It can thus constitute an internal standard vis-à-vis the first sample, allowing a quantitative determination.
  • the marking steps are carried out after the separation step.
  • the analysis method according to the invention is particularly applicable to the quantitative and structural analysis of primary amines present in biological samples.
  • the sample can come from different origins. It can be for example human, animal, plant, microbiological, viral. It can come from any type of environment and samples, healthy organisms, sick or with any abnormality.
  • the fluorogenic reagent is NDA.
  • the substitution reagent is N, N-dimethylaminoethylthiol of formula HS-CH 2 -CH 2 -N (Me) 2 .
  • the labeling of a sample of a volume of 1 .mu.l containing peptides or proteins at concentrations of the order of the nM is carried out in one step, at room temperature.
  • the amount of NDA should be at least 3 to 10 times greater than the total amount of primary amines.
  • the concentration of aminothiol should preferably be at least 2 to 3 times greater than that of NDA.
  • the volumes of the NDA and thiol solutions can be increased so that all the molecules containing primary amine functions are labeled, the rest of the manipulations remaining identical.
  • the marked sample is subjected to the known separation techniques before analysis.
  • 1 .mu.l of labeled sample is injected in ⁇ HPLC reverse phase (C18 column, 3 microns, 3 mm internal diameter, 15 cm in length) at a flow rate of 5 .mu.l / min.
  • Another solvent for example a methanol / water solvent with a gradient adapted according to the different molecules to be analyzed can also be used to migrate the different molecules.
  • Any type of chromatographic column may be employed, the reverse phase columns being very commonly chosen for this subject, but ion exchange columns may also be used without difficulty with suitable elution conditions.
  • the separation can also be performed by capillary electrophoresis (CE).
  • the sample is analyzed by fluorimetry and / or by mass spectrometry.
  • a laser-induced fluorescence detector (ZETALIF 2000 TM, model 410 or 442, Picometrics, Ramonville, France) is connected at the output of the chromatographic column to receive the fractions obtained.
  • the excitation of the sample is carried out at a wavelength of 442 nm or 410 nm which are the two wavelengths close to the maximum absorption in the visible of the isoindole compounds.
  • the fluorescent emission is detected above 460 nm or 430 nm.
  • the ESI source of a mass spectrometer ESIQtof, Ultima TM, Micromass Waters
  • a spotter automatic depositor of samples
  • MS mass spectrometry
  • ESI ionization electrospray
  • the purpose is to determine the mass of a given amino acid or peptide contained in a sample, without prior separation.
  • a fluorescence marker (F) and two substitution markers (Sl and S2) are used.
  • the marker (F) is the NDA.
  • Markers S1 and S2 are aminothiols bearing different substituents, namely the light N, Ndimethylaminoethylthiol (Sigma) marker, denoted G1, and the heavy N 5 N diethylaminoethylthiol (Sigma) marker, denoted G2.
  • G1 Ndimethylaminoethylthiol
  • G2 the heavy N 5 N diethylaminoethylthiol
  • a concentration range of the peptide to be assayed is made from a standard commercial preparation.
  • the labeling of the peptide is carried out with NDA + G2 as described in Example 1.
  • the peptide labeled with G1 at a fixed concentration, is also present in each solution.
  • the different solutions are analyzed.
  • each of the molecular ions loses the aminothiol chain.
  • the first loses a mass chain 105
  • From the mass spectrum the peaks are identified and the ratio of the height of the peaks corresponding to the peptide labeled with NDA + G1 and with NDA + G2 is calculated.
  • Solution 1 10 ⁇ l of Gl marker at 2 mmol / l (diluted in H 2 O) 5 ⁇ l of NDA (Sigma) at 0.2 mmol / l, 2 ⁇ l of NEt 3 at 100 mmol / l (Sigma) and 80 ⁇ l of standard leucine-enkephalin (Sigma) at 10 ⁇ mol / l in water.
  • 10 ⁇ l of solution 1 and 10 ⁇ l of solution 2 are introduced into 980 ⁇ l of acetonitrile / water solution (1: 1) with 0.1% of HCOOH.
  • the diluted solution is introduced by infusion into the ESI source of the ESIQtof mass spectrometer (Ultima, Micromass Waters), using a syringe pump.
  • the leucine-enkephalin G2 concentration of the various diluted solutions is therefore between 5 nmol / l and 500 nmol / l and the concentration of leucine-enkephalin G1 is 100 nmol / l in all the diluted solutions.
  • the fragmentation gives an abundant loss of the aminothiol marker makes it possible to characterize with certainty the labeled peptide and not another isobaric ion having the same m / z ratio, but not labeled (molecules not carrying a primary amine function) .
  • an aminothiol marker giving a mass ion 133 it is easy to identify a pair of peaks at a distance of 133 units, corresponding to the molecular ion of a peptide and its marker.
  • the fragmentation of the peptides labeled according to the invention at the aminothiol level being particularly important, the loss of the marker group is clearly visible and easily identifiable, which confers almost total selectivity to the method.
  • G1 and G2 can also be a molecule of the same chemical structure, with G2 containing 6 deuterium atoms, or C13 .
  • G1 and G2 can also be a molecule of the same chemical structure, with G2 containing 6 deuterium atoms, or C13 .
  • the enkephalin assay can also be done in CE / LIF, ⁇ HPLC / fluorescence, or ⁇ HPLC / fluorescence.
  • the labeling is carried out before separation by chromatography. Both liquid chromatography (LC) and capillary electrophoresis (CE) can be used.
  • the LIF detector is connected to the output of the chromatographic column (or on the capillary).
  • the species to be assayed must be identified with certainty before quantitative analysis. Several species can be studied in the same sample.
  • the MS makes it possible to identify the previously separated primary amino species, and in particular new peptides, proteins or labeled amino acids. These peptides or proteins or labeled amino acids are easily identifiable by the neutral loss of the ionizable label (S) (in this example an aminoacylthiol).
  • S ionizable label
  • the LIF detection makes it possible to quantify the corresponding primary amines by virtue of the peak area.
  • the MS also allows the structural determination of the new molecules detected.
  • the injection volume is 5 ⁇ l (or smaller).
  • a capillary on which is fixed the detector LIF (ZETALIF 2000, Picometrics, 410 nm).
  • the capillary is connected to the ESI source of an ESIqTOF mass spectrometer.
  • M + H molecular ion
  • m / z mass / charge ratio
  • the analysis is repeated with the samples at different concentrations of arginine and the standard curve relating the concentration of arginine (expressed in nmol / l) and the surface of the chromatographic peak is established.
  • 1 MS first allows unambiguous identification of arginine by the mass ion (M + H-105) associated with the molecular ion, whereas the fluorescence detected by the detector LIF is used to determine the amino acid identified by the standard curve.
  • the MS spectrum also provides quantitative data, allowing fluorimetric assay confirmation.
  • Example 3 The principle and purpose of the assay are the same as in Example 3, the analysis device is identical (separation column, fluorimeter, MS). On the other hand, one works here with an internal standard (thus without resorting to a standard curve).
  • the compound to be assayed being known (arginine in the present example)
  • the labeling reaction is carried out with a pair of markers (F) + (light S) in the medium to be studied, and a solution containing said compound is prepared at a temperature of defined concentration, the latter being marked with a pair of markers (F) + (heavy S). Both solutions are combined into a single sample that is analyzed.
  • the arginine to be assayed is characterized by the NDA and aminothiol light Gl (N 5 N diméthyl2amino- ethylthiol) according to the principle described in Example 1. in parallel, a solution of standard arginine 100 nmol / 1, labeled with NDA and heavy aminothiol G2 (N, N diethylaminoethylthiol).
  • the two solutions are mixed volume to volume to form a single sample which is subjected to analysis as described in the previous example.
  • the labeled compounds are eluted at different rates depending on the associated label, and give two distinct fluorescent signals proportional to their concentration.
  • the mass spectrum makes it possible to verify the nature of the compound dosed by the mass of the two molecular ions associated with a single son ion, the ratio of peak heights giving the ratio of concentrations of arginine "heavy" (internal standard) and "light” (to be determined). It is thus possible to make a quantitative determination of arginine in any medium.
  • the labeling is carried out before separation by liquid chromatography (LC) or capillary electrophoresis (CE).
  • LC liquid chromatography
  • CE capillary electrophoresis
  • the detector LIF is connected at the output of the LC column or on the CE capillary, then the capillary enters the source of the mass spectrometer.
  • the goal is to provide a tool for comparing complex media, such as biological media, such as microdialysates, one from a healthy organism and one from an abnormal organism (disease or other) . They contain a mixture of peptides which one wants to know the relative proportion in each medium.
  • a fluorescence marker (F) and two substitution markers (S) and (S ') are used here. Markers (S) and (S ') will be chemically identical, but' in (S '), some hydrogen atoms or carbon atoms have been replaced by heavy stable isotope.
  • the first medium (Ml) is treated with the pair of markers (F) + (S) (light)
  • the second medium (M2) is treated with the pair of markers (F) + (S ') (heavy). All the compounds bearing a primary amine function present in the media will be labeled by one or the other couple of markers. After labeling, the media are mixed to form a mixed sample, which is analyzed.
  • the mass spectrum makes it possible to identify the peaks corresponding to the heavy and light compounds associated with the same peptide present in the two media, and to calculate the ratio heavy / light to make a relative assay, based on the difference in intensity of ions whose ratio m / z differs from the number of deuterium or C 13 atoms introduced into the substitution marker (S '). Indeed, as previously explained, each of the labeled compounds is identified by virtue of its specific high yield loss of the substitution marker.
  • the LIF detection makes it possible to quantify in absolute terms the total concentration of the labeled compounds (F) + (S) and (F) + (S ') (heavy + light) which co-migrate.
  • the marker (F) will be the NDA.
  • the elution gradient is 64% of buffer A /
  • To these ions can be associated a single son ion obtained after the loss on the one hand of the NDA + Gl labeled molecule (at M + H-105 for the loss of the light aminothiol Gl) and on the other hand the NDA + GlD labeled molecule (at M + H-6-105 for loss of heavy aminothiol GlD). Again, let us stress that the loss is massive and is selective of the parent ion (M + H) + or (M + 6 + H) + .
  • the different solutions are analyzed in HPLC-LIF according to the same procedure as above.
  • the fluorescence detected by the detector LIF at the peak of the chromatogram corresponding to the test compound is a function of the concentration of enkephalin.
  • the pairs of markers used to prepare the mixed sample of this example being chemically identical, the labeled met-enkephalin molecules comigrate and form a single peak in chromatography, whose fluorescence is proportional to the concentration of met enkephalin.
  • the measured fluorescence value is 0.350 RFU (Relative Fluorescence Unit). It is sufficient to report the intensity of the fluorescence measured at the level of the chromatographic peak on the standard curve to obtain the absolute value of the total met-enkephalin concentration of the mixed sample. It is equal to 600 nmol / 1 taking into account the dilution.
  • the respective concentration in each medium is calculated from the previously obtained 1: 5 ratio.
  • the result of the calculation indicates that the M1 medium contains 500 nmol / l, while the M2 medium contains 100 nmol / l, which is consistent with the concentrations set for the model solutions of this example.
  • the relative determination of MS and absolute fluorescence makes it possible to determine the absolute concentration of the light peptide in the lighter heavy mixture.
  • the MS allows to dose and identify it unambiguously through the mass of ions (M + H-105), and M + H-11 (11).
  • Molecules carrying a primary amine function may be labeled after chromatographic separation.
  • the liquid flow is subjected to the labeling reaction at the output of the chromatographic column, then assayed by LIF detection, and finally enters the source ESI-MS.
  • This method avoids the experimenter to perform the precolumn marking reaction.
  • reaction chip Upchurch
  • two inputs-an output having a mixing chamber.
  • the flow of liquid from the chromatographic column enters entry 1, a mixture NDA (4.3 ⁇ mol) and aminothiol Gl (12.9 ⁇ mol / 1) enters the inlet 2 with a flow rate of 5 ⁇ l / min.
  • the labeling reaction is in the reaction chip.
  • the output of the reaction chip is connected to the fluorescence detector or to the detector LIF and then to the mass spectrometer, to carry out the analysis as previously described.
  • the objective here is to mimic the electrophoresis technique DIGE (Différenciai Gel Electrophoresis) that is to say to use two exchangeable fluorogenic agents at two different wavelengths, but having the same hydrophobicity (Marouga R. David S., E. Hawkins, Bioanal Anal, Chem., 2005, 382, pp. 669-78).
  • DIGE Denérenciai Gel Electrophoresis
  • the DIGE technique it is possible to distinguish by fluorimetry compounds which have been co-eluted.
  • the interesting fraction identified on the gel its recovery for further analysis is problematic.
  • the advantage of the analysis method according to the invention is to obtain labeled compounds co-eluted at the chromatograph outlet, which can be analyzed by fluorimetry and by MS without intermediate treatment.
  • the hydrophobicity of the fluorescent group can be modulated by using dyes bearing more or less branched carbon chains.
  • adducts are obtained which, having the same hydraphobia in reverse phase HPLC, have the same elution time.
  • the output of the HPLC column is connected to the detector LIF, then the capillary enters the source of the mass spectrometer.
  • the operating protocol is similar to that presented in Example 4.
  • the co-eluted compounds have different fluorescence properties, ionization properties in close MS, but different masses. Thus, by fluorescence and associated MS, these compounds are differentiable and identifiable (qualitative analysis). They are quantitatively measurable if internal standard primary amines are available.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Abstract

L'invention se rapporte à un procédé de marquage d'entités portant une fonction aminé primaire consistant essentiellement à faire réagir en une étape lesdites aminés primaires avec : - un réactif (F) capable de former un composé fluorescent avec lesdites aminés primaires, et - un réactif (S) capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé. L'aminé primaire à analyser, le réactif colorant (F) et le réactif de substitution (S) réagissent en une étape, avec un rendement réactionnel proche de 100%. Les composés obtenus sont fluorescents et donnent par ionisation une fragmentation préférentielle facilement identifiable en spectrométrie de masse. L'invention permet aussi bien le dosage quantitatif que la détermination structurale des molécules aminées présentes en faible concentration dans les fluides biologiques, en particulier des protéines et des peptides. Elle permet également de comparer directement les profils protéiques ou peptidiques des deux milieux par le dosage simultané des aminés primaires présentes dans ces deux milieux, en une seule série de mesures sur un échantillon unique. Sont également revendiqués un kit de marquage et un procédé d'analyse des aminés primaires.

Description

MÉTHODE DE DOSAGE DES AMINES PRIMAIRES À TRÈS FAIBLE CONCENTRATION
La présente invention appartient au domaine de l'analyse chimique de haute sensibilité des molécules aminées présentes dans les fluides biologiques, en particulier des protéines et des peptides.
Plus précisément l'invention se rapporte à un kit et une méthode de marquage des aminés primaires dans des échantillons complexes tels que des échantillons issus de milieux biologiques. L'invention permet d'identifier et de doser des aminés à des concentrations très faibles dans des échantillons de très petite taille. L'invention permet aussi de détecter et de quantifier les aminés primaires de façon simple, rapide et précise. Grâce à l'excellente sélectivité de la méthode sur laquelle elle repose, l'invention permet notamment de distinguer les différentes aminés primaires d'un même échantillon, mais aussi d'identifier les aminés primaires identiques présentes dans des échantillons différents.
L'étude des fluides biologiques rend indispensable la séparation et la détection de molécules en très faible concentration, c'est-à-dire à des concentrations micromolaires, nanomolaires voire picomolaires. Les méthodes de séparation de ces molécules sont maintenant bien établies. Elles reposent toutes sur les techniques de chromatographie liquide (ou LC) telles que la chromatographie HPLC, la chromatographie liquide capillaire, la nano-LC, ou sur les techniques d'électrophorèse (électrophorèse capillaire de zone, chromatographie micellaire électro-cinétique, électrochromatographie capillaire, l'électrophorèse sur veine liquide). Par contre, les méthodes de détection et de dosage à ces très faibles concentrations sont beaucoup moins développées, ce qui constitue un limite importante à la progression des connaissances et à la mise au point de nouvelles méthodes thérapeutiques.
On sait que la protéomique étudie l'ensemble des protéines présentes dans un organisme. Elle peut avoir par exemple pour objet d'étudier l'expression génique en se fondant sur le profil protéique d'une cellule ou plus largement d'un système biologique. On peut aussi chercher à établir une comparaison entre cellules normales et de cellules anormales, afin de connaître quelles sont les protéines dont les proportions varient entre un organisme sain et un organisme malade. Une telle comparaison permet d'identifier certaines protéines comme cibles thérapeutiques et d'élaborer de nouveaux médicaments.
Pour ce faire, des méthodes de séparation telles que l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel haute résolution sont employées. Puis, un travail d'identification des protéines est nécessaire ainsi qu'une étude quantitative des protéines identifiées (c'est ce qu'on appelle la protéomique quantitative). A l'heure actuelle on utilise communément deux méthodes d'analyse, à savoir la spectrométrie de masse (MS), et l'électrophorèse sur gel, avec la méthode appelée DIGE pour DIfferential Gel Electrophoresis (Somiari R.I., Somiari S., Russell S., Shriver CD., J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life ScL, 2005; 815, pp. 215-25.), associée à la fluorimétrie classique ou la fluorimétrie induite par laser (LIF).
La peptidomique est quant à elle une discipline encore balbutiante, mais qui connaît un succès grandissant en marge de la protéomique (Svensson M., Skold K., Svenningsson P., Andren P.E., J. Proteome Res., 2003, 2, pp. 213-9). Elle a pour objet de doser de manière relative et absolue les peptides contenus dans un milieu. Une de ses applications est, par exemple, en neurochimie, la mesure dans des microdialysats de cerveaux de rats, de la variation en fonction du temps de la concentration de différents neuropeptides (substance P, neurotensine, angiotensine, ...). Il s'agit là d'analyser un grand nombre d'échantillons de faible volume (de l'ordre du μl) contenant des peptides, connus ou inconnus, ainsi que d'autres aminés telles que des acides aminés et des catécholamines, ces molécules étant présentes à des concentrations nanomolaires. Il faut donc avoir recours à des méthodes de séparation et de détection qualitatives et quantitatives performantes en terme de sélectivité et de sensibilité. Les microtechniques de séparation telles que la μHPLC, la nanoLC, l'électrophorèse capillaire, sont adaptées à ces petits volumes d'échantillons et sont en principe susceptibles d'être associées à la spectrométrie de masse et à la fluorimétrie.
Qu'ils soient dédiés à la protéomique ou à la peptidomique, les dosages quantitatifs peuvent être réalisés soit par fluorimétrie soit par spectrométrie de masse tandis que la détermination de la structure des molécules est réalisée par spectrométrie de masse. Ces deux techniques d'analyse sont donc complémentaires et doivent être réalisées de concert pour disposer de données complètes. Dans les deux cas, les molécules à étudier doivent être marquées avant de pouvoir être détectées.
Dans la technique de DIGE/fluorescence, on utilise des marqueurs caractérisés par leurs propriétés de fluorescence tels que des cyanines, les marqueurs pouvant être excitées respectivement à 532 nm et à 633 nm (par exemple les marqueurs Cy3 et Cy5 commercialisés par Pharmacia). Pour comparer des protéines issues d'organismes différents (par exemple l'un sain et l'autre malade), on utilise une paire de marqueurs fluorescents excitables (et donc émettant) à des longueurs d'onde distinctes, communément les colorants Cy3 et Cy 5. La comparaison des intensités des signaux de fluorescence donne la concentration relative pour la même protéine entre l'organisme sain et l'organisme anormal. La fluorimétrie et la fluorimétrie induite par laser (LIF) sont maintenant bien maîtrisées pour permettre la détection de molécules fluorescentes à très faibles concentrations (Somiari, id).
Dans les techniques de spectrométrie de masse, on utilise des marqueurs isotopiques non radioactifs, c'est à dire des marqueurs différant uniquement par leur masse, leur formule chimique restant identique. Dans un des deux marqueurs, n atomes de deutérium ont pris la place de n atomes d'hydrogène, la différence de masse entre les deux marqueurs étant donc égale à n. Le même principe peut être réalisé en remplaçant des atomes de carbone C12 avec du carbone lourd C13.
Par exemple pour étudier deux populations différentes de protéines en spectrométrie de masse, on associe chaque population à un des marqueurs. Dans le spectre de masse, la fragmentation des molécules aboutit à la formation de certains ions caractéristiques des marqueurs et des molécules étudiées. Les pics correspondant à des ions qui différent de n unités de masse sont repérés et leur intensité relative représente la proportion d'une protéine donnée dans chaque population. On peut ainsi effectuer des comparaisons relatives entre les populations protéiques de cellules ou d'organes sains et anormaux. Les données de spectrométrie de masse permettent ainsi de reconstituer la structure des molécules.
On peut aussi utiliser la spectrométrie de masse pour la réalisation des dosages quantitatifs, à condition de disposer d'un étalon interne isotopique, c'est-à-dire de la même molécule que celle qui est étudiée, mais marquée isotopiquement avec plusieurs atomes de deutérium ou de C13. De la sorte, d'une part la molécule à doser et son étalon isotopique interne peuvent être obtenus dans les mêmes conditions par les techniques de séparation chimique (par co- migration en chromatographie liquide ou par les techniques électrophorétiques), et d'autre part, en revanche ils peuvent être identifiés et distingués sur le spectre de masse, grâce à leur différence de masse moléculaire.
Aujourd'hui la méthode de spectrométrie de masse faisant appel à un étalon interne la plus utilisée pour la protéomique quantitative est la méthode dite ICAT pour "Isotope-Coded Affmity Tag" (Gygi S.P., Rist B., Griffm T.J., Eng J., Aebersold R., J. Proteome Res. 2002, 1, pp. 47-54). Cependant, cette méthode présente un certain nombre d'inconvénients. D'une part, la réaction d'association avec le marqueur ICAT n'est jamais totale, ce qui est un problème en soit, mais aussi implique une étape de purification de l'échantillon avant le passage en MS pour éliminer les molécules non marquées. Par ailleurs, du fait de la faible réactivité chimique des marqueurs ICATs, elle ne permet pas de doser les molécules à faible concentration (nanomolaire). En outre, ce type de marqueurs ne réagit que sur les groupements thiols des cystéines. Plus généralement, une autre limitation importante des méthodes de dosage par spectrométrie de masse est qu'en pratique, il n'est pas toujours possible de disposer d'un étalon isotopique interne car cela nécessite de réaliser une synthèse avec des isotopes lourds des composés à doser. Aussi une méthode a-t-elle été proposée, consistant à dériver les composés avec un groupement contenant lui-même des isotopes lourds. Par exemple la demande de brevet US 2003 0054570 propose de modifier les cystéines par des composés contenant un groupement arginine et pouvant se lier à la fonction thiol des cystéines grâce à une chaîne carbonée contenant des isotopes légers ou lourds. Dans la demande US 2003 0087322, le marqueur peut contenir différents isotopes lourds et possède une fonction ayant une affinité biologique donnée permettant d'isoler sélectivement les molécules dérivées sur colonne d'affinité.
Néanmoins, ces marqueurs isotopiques souffrent tous d'un déficit de réactivité et ne permettent pas de doser des molécules en très faible concentration. Ils demandent un protocole de préparation long et délicat. D'autres marqueurs isotopiques ont été décrits dans la littérature, mais tous sont limités quant à la sensibilité à atteindre. De telles méthodes ne s'adressent au demeurant qu'à certaines familles chimiques et fournissent donc des résultats partiels sur le protéome ou le peptidome étudié.
Comme déjà indiqué, les dosages quantitatifs sont réalisés soit par fluorimétrie soit par spectroscopie de masse, tandis que la détermination de la structure des molécules est réalisée par spectroscopie de masse, ces deux techniques d'analyse complémentaires devant être réalisées ensemble pour disposer de données utiles complètes. Or, outre les inconvénients précédemment exposés, elles sont longues et complexes à mettre en œuvre et rien n'existe pour mener ce travail en régime de routine. En particulier, l'emploi de marqueurs spécifiques, chacun étant susceptible d'être détecté par une technique, augmente encore la lourdeur du travail préparatoire des analyses.
Pour éviter ce problème, il a été proposé de réaliser un marquage à l'aide d'un colorant de fluorescence lui-même dérivé par un groupement fonctionnel détectable après fragmentation en spectrométrie de masse. Le marqueur fluorogène utilisé est le naphthalène 2,3 dialdéhyde (NDA), marqueur bien connu pour réagir avec les aminés primaires en donnant des composés fluorescents. Celui-ci est dérivé, selon la méthode retenue, soit par un ion cyanure, soit par un groupement β-mercaptoéthanol.
Cependant, sur les peptides, la réaction de marquage utilisant le NDA et le cyanure n'est pas totale. Le cyanure réagit lentement et incomplètement avec le NDA. Ceci conduit à un taux de substitution médiocre et à des résultats d'analyse biaises : l'analyse quantitative est difficile, et en outre des espèces en faible concentration peuvent tout simplement ne pas être identifiées.
Le groupe CN présente au demeurant des risques liés à sa toxicité lors des manipulations, et il est de toutes façons d'un intérêt très limité. D'une part il ne peut pas fournir un marqueur isotopique car un seul atome de carbone pourrait être remplacé, ce qui est insuffisant pour obtenir des résultats interprétables en spectrométrie de masse. D'autre part, contrairement aux marqueurs de la présente invention, on ne peut pas modifier sa structure par dérivation pour avoir deux marqueurs différents utilisables dans la même analyse, l'un pouvant par exemple servir à fournir un étalon interne.
En ce qui concerne le β-mercaptoéthanol, les possibilités de substitutions isotopiques sont encore extrêmement réduites, tout comme les possibilités de dérivation. De plus, le rendement d'ionisation de l'espèce marquée avec le β-mercaptoéthanol est faible. On évite au demeurant autant que possible son emploi du fait de sa forte et désagréable odeur. Ainsi, à l'heure actuelle, ces méthodes n'ont pas donné de résultats probants, ni apporté d'amélioration notable en spectrométrie de masse.
La présente invention a pour but de remédier à ces inconvénients. Plus précisément, un objectif de la présente invention est de disposer de moyens de marquage moléculaire permettant aussi bien le dosage quantitatif que la détermination structurale des entités étudiées. Un second objectif de la présente invention est de disposer d'un marqueur de haute réactivité chimique autorisant l'analyse de substances biologiques en concentration micromolaire ou moindre encore. Un autre objectif de la présente invention est de disposer d'une méthode de grandes sélectivité et sensibilité vis-à-vis des molécules cibles. Un objectif de l'invention est aussi de permettre le dosage de la plus grande partie des molécules représentatives du profil protéique ou peptidique d'un milieu étudié, à savoir celles portant une fonction aminé primaire. Encore un autre objectif de l'invention est de pouvoir réaliser le dosage simultané des aminés primaires présentes dans deux milieux d'origine différente, par une seule série de mesures réalisée sur un échantillon unique, pour comparer directement les profils protéiques ou peptidiques des deux milieux.
Ce but est atteint d'une part grâce à un procédé et à un kit de marquage des aminés primaires et d'autre part grâce à un procédé d'analyse des aminés primaires, objets de l'invention. Plus précisément l'invention se rapporte à un procédé de marquage d'entités portant une fonction aminé primaire (N) en vue de leur analyse quantitative et structurale consistant essentiellement à faire réagir en une étape lesdites aminés primaires avec : - un réactif (F) capable de former un composé fluorescent avec lesdites aminés primaires, et - un réactif (S) capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé.
Un autre objet de l'invention est un kit comprenant au moins : - un réactif (F) capable de former un composé fluorescent avec les aminés primaires (N),
- un réactif (S) capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé.
Les trois composants, à savoir l'aminé primaire à analyser, le réactif colorant (F) et le réactif de substitution (S) réagissent en une étape, avec un rendement réactionnel proche de 100%.
Les composés obtenus sont fluorescents. Ils donnent par ionisation une fragmentation préférentielle résultant en la perte de la chaîne latérale apportée par le réactif de substitution
(S) facilement identifiable en spectrométrie de masse. Cette fragmentation très spécifique permet par exemple de réaliser des expériences de suivi dans le temps de la fragmentation unique ou multiple ("single réaction monitoring" ou "multiple réaction monitoring") très efficaces, sélectives et sensibles.
Il a pu être développé également sur la base du procédé de marquage et du kit selon l'invention, un procédé d'analyse des aminés primaires, de haute sensibilité, fiable, rapide et facile à mettre en œuvre, destiné à l'étude des peptides et des protéines ou encore des acides aminés, contenus dans de très faibles volumes et/ou à très faibles concentrations, à la fois en termes quantitatifs (dosage) et en termes de structure (identification).
Certains des colorants de fluorimétrie utilisables en tant que marqueurs des aminés primaires dans la présente invention sont déjà connus. Cependant, ces marqueurs de fluorescence n'ont été utilisés jusqu'à présent que pour une détermination quantitative de molécules connues
(par comparaison à un étalon), l'émission à la longueur d'onde de fluorescence étant proportionnelle à la concentration dans l'échantillon. L'utilisation de ce type de réactifs est proposée ici pour l'étude à la fois quantitative et structurale des aminés primaires, en vue d'une identification complète de molécules d'intérêt. Ce résultat particulièrement intéressant est obtenu notamment grâce à la dérivation de ces molécules fluorogènes par des groupements ionisables, rendant ainsi ces marqueurs utilisables pour le dosage en spectrométrie de masse des très faibles concentrations d'aminés primaires. On obtient alors un marqueur binaire associé à la molécule cible, les produits de réaction étant détectables tels quels par deux méthodes d'analyse distinctes, même à des concentrations micromolaires, voire nanomolaires. En effet, de manière inattendue, la réaction des aminés primaires avec le marqueur binaire selon l'invention présente un rendement et une spécificité excellents, la totalité des aminés primaires et elles seules réagissant avec les réactifs de marquage. Les techniques d'analyse employées montrent également une sensibilité exceptionnelle vis-à-vis des aminés marquées selon l'invention, ce qui permet d'atteindre le résultat souhaité. Sans chercher à fournir une théorie explicative à l'effet synergique observé, l'hypothèse peut être formulée que la présence d'un réactif apportant un groupement ionisable favorise l'association des trois composants aminé primaire-réactif fluorogène-réactif de substitution. Il semble même que la présence de l'aminé soit décisive pour la fixation du réactif de substitution ionisable sur le réactif fluorogène.
Dans la description qui va suivre et sauf indication contraire explicite, l'invention s'étendra à toute entité portant une fonction aminé primaire, c'est-à-dire aussi bien aux protéines, aux peptides et aux acides aminés, qu'à d'autres molécules portant une telle fonction pouvant exister dans un milieu, biologique ou non, à étudier. La fonction aminé primaire est une des fonctions les plus répandues parmi les molécules biologiques. Cette prévalence est mise à profit par la présente invention, qui a ainsi pour objet un procédé de dosage des aminés primaires, destiné à l'étude des entités aminées.
Dans le procédé et le kit selon l'invention, le réactif (F) correspond à une molécule capable de former un composé fluorescent avec les aminés primaires.
Le réactif (F) est de préférence un dialdéhyde aromatique fluorogène, qui peut être choisi avantageusement parmi les alpha-dialdéhydes aromatiques donnant des dérivés fluorescents de la famille des isoindoles. De façon non limitative, il est choisi parmi les réactifs suivants : naphthalène2,3dialdéhyde (NDA), orthophthal-dialdéhyde (OPA), anthracène dialdéhyde (APA), et leurs dérivés substitués.
Figure imgf000009_0001
naphthalène2,3dialdéhyde (NDA)
Figure imgf000010_0001
orthophthal-dialdéhyde (OPA)
Figure imgf000010_0002
anthracène dialdéhyde (APA)
Ces réactifs donnent avec les aminés primaires des dérivés ayant de bons rendements de fluorescence. La stabilité des composés formés a été vérifiée par des études de spectrométrie de masse : elle est suffisante pour conduire les analyses dans de bonnes conditions (Manica D.P., Lapos J.A., Jones A.D., Ewing A.G., Anal. Biochem., 2003, 322, ρp.68-78).
Dans le procédé et le kit selon l'invention, le réactif (S) correspond à une molécule capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé. La faculté d'ionisation du groupement apporté par. le réactif (S) est considérée avant fixation sur le réactif (F). Dans la présente invention, un groupement ionisable est défini comme un groupe dont le pKa est compris entre 2 et 12. Les expressions "groupement ionisable", "thiol ionisable", ... feront quant à elles référence à la faculté d'ionisation dudit groupement avant ou après sa fixation au réactif (F).
Le réactif (S) est de préférence capable de substituer le réactif (F) en alpha de l'aminé primaire (N). C'est avantageusement un thiol ionisable, qui peut être choisi parmi les composés de formule R — SH, où R est une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée portant un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'une aminé primaire. De tels thiols de formule générale R — SH sont en effet facilement ionisables. Utilisés en combinaison avec le dialdéhyde aromatique ils forment, après réaction avec Pamine à étudier, des composés fluorescents dérivés par un groupement soufré.
La perte spécifique de la chaîne thiol lors de la fragmentation du composé marqué aboutit à la formation d'un ion caractéristique majoritaire, bien identifiable en spectrométrie de masse, ce qui explique la haute sélectivité de la méthode. Il est recommandé, pour éviter les confusions avec les aminés à étudier, de ne pas utiliser un composé de formule R — SH où R porterait un groupement fonctionnel aminé primaire.
De manière préférée, le réactif (S) est un composé de formule R — SH, où R est une chaîne carbonée du type — (CH2)X — A, avec x > 2, et A est un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'un groupe aminé primaire. Selon un mode de réalisation préféré non limitatif de l'invention, le groupement fonctionnel A est choisi parmi les groupes aminé secondaire, aminé tertiaire, aminé quaternaire ou du type guanidinium, ou parmi les groupes acides COOH, SO4H, SO3H5 BO3H. La présence d'un tel groupement fonctionnel sur le thiol accroît la polarité du thiol, ce qui d'une part augmente sa réactivité vis-à-vis du réactif (F) et d'autre part favorise la formation d'un ion caractéristique majoritaire jouant excellemment son rôle de marqueur en spectrométrie de masse. Les aminothiols et les carboxythiols sont particulièrement préférés.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le kit de marquage est utilisé pour le marquage d'aminés dans des échantillons différents, souvent en vue de réaliser une comparaison entre les milieux desquels proviennent ces échantillons, qui peuvent par exemple être prélevés sur deux organismes différents à comparer du point de vue de leur profil protéique ou peptidique. Cette paire d'échantillons peut aussi être constituée d'un échantillon provenant d'un milieu à étudier et d'un échantillon étalon.
Les réactifs de substitutions (S) du type R-SH sont facilement synthétisés et il est facile d'obtenir un réactif (S) marqué isotopiquement soit par des atomes de deutérium soit par des atomes de C13 (réactif lourd) et gardant les mêmes qualités chromatographiques que le réactif léger. C'est le cas en particulier des aminothiols (par exemple aminothiols linéaires de formule B1B2N-(CH2)X-SH, où Bi et B2 ne sont pas l'hydrogène en même temps) et des carboxythiols (par exemple carboxythiols linéaires de formule HOOC-(CH2)X-SH) qui permettent d'obtenir des étalons isotopiques bons marchés, pouvant être utilisés en fiuorimétrie, en fluorimétrie induite par laser et en spectrométrie de masse. Il est également aisé de synthétiser des réactifs (S) du type A — (CH2)X — SH dont le groupement A — (CH2)X — est différent : on peut par exemple faire varier la valeur de x pour avoir des chaînes — (CH2)X — plus ou moins longues, ou bien faire varier B, et B2 portés par l'aminé dans les aminothiols.
Ainsi, dans le procédé de marquage selon l'invention, un au moins des atomes du réactif (S) peut être remplacé par un isotope stable. Le kit de marquage correspondant comprend alors i) un premier réactif (S) et ii) un second réactif (S') de même formule que le premier réactif (S) dont au moins un atome est remplacé par un isotope lourd stable. De préférence, en spectrométrie de masse, quatre atomes au moins sont substitués par leur isotope lourd.
De manière alternative ou simultanée, dans le procédé de marquage selon l'invention, un au moins des atomes du réactif (F) peut également être remplacé par un isotope stable. Dans ce cas, le kit de marquage correspondant comprend i) un premier réactif (F) et ii) un second réactif (F') de même formule que le premier réactif (F) dont au moins un atome est remplacé par un isotope stable.
Lorsque l'on utilise deux versions (S) et (S') du réactif de substitution ou deux versions (F) et (F') du réactif colorant, on appelle "réactif léger" celui qui ne contient pas d'isotope et "réactif lourd" celui qui contient au moins un isotope lourd stable d'un de ses atomes. Par extension, on appellera "composé léger" le composé marqué avec le réactif léger et "composé lourd" celui qui est marqué avec le réactif lourd.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le kit de marquage d'entités portant une fonction aminé primaire présentes dans deux échantillons comprend un premier réactif (Si) et un second réactif (S2) de formules respectives R, — SH et R2 — SH, dans lesquels R, et R2 sont des chaînes carbonées linéaires ou ramifiées portant un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'une aminé primaire, et où Ri et R2 ont des masses différentes. Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux car il évite d'avoir recours à la synthèse d'un composé lourd servant d'étalon interne en spectrométrie de masse.
Lorsque l'on utilise deux versions (S,) et (S2) du réactif de substitution, on appelle "réactif léger" celui qui a la chaîne carbonée la plus courte, et "réactif lourd" celui qui a la chaîne carbonée la plus longue. Par extension on appelle "composé léger" le composé marqué avec le réactif léger et "composé lourd" celui qui est marqué avec le réactif lourd.
Selon un autre mode particulier de réalisation du procédé et du kit de marquage selon l'invention, le réactif (S) comprend au moins un carbone asymétrique et il est optiquement pur. On peut de la sorte facilement séparer les couples d'énantiomères d'une aminé primaire optiquement active. En effet, ce réactif forme avec une aminé primaire ayant un carbone asymétrique un couple de diastéréoisomères dont certaines propriétés physiques sont différentes, notamment leur hydrophobie. Les diastéréoisomères, élues à des vitesses différentes, pourront donc être séparés et analysés individuellement.
Selon une caractéristique intéressante du procédé de marquage selon l'invention, les réactifs (F) et (S) peuvent être introduits dans un échantillon biologique pour marquer les entités portant une fonction aminé primaire dudit échantillon biologique. En effet, comme déjà indiqué, dans le procédé selon l'invention, les deux réactifs sont capables de réagir sélectivement avec les aminés primaires, en une étape, pour donner des composés détectables tels quels, par fluorimétrie et par spectroscopie de masse. Cette réaction présente le grand avantage de conserver un bon rendement et une grande sélectivité vis-à-vis des aminés primaires même dans un milieu complexe tel qu'un milieu biologique. Les entités marquées, formées avec l'ensemble des aminés primaires présentes dans ledit milieu, peuvent ensuite être séparées, identifiées et quantifiées grâce au procédé d'analyse selon l'invention qui sera décrit plus loin.
Le procédé de marquage et le kit conformes à l'invention ci-dessus décrite peuvent être appliquées au marquage des aminés primaires provenant de toutes sortes de milieux biologiques, par exemple humain, animal, végétal, microbiologique, viral et de tout type d'environnement et de prélèvements, d'organismes sains, malades ou présentant une quelconque anomalie. Ils sont particulièrement adaptés au marquage des aminés primaires dans un échantillon biologique.
Enfin, un autre objet de l'invention est un procédé d'analyse des aminés primaires présentes dans un échantillon, mettant en œuvre le procédé de marquage précédemment décrit. Ce procédé d'analyse comprend essentiellement les étapes consistant à : a) marquer les aminés primaires par le procédé de marquage tel que décrit ci-dessus, b) traiter l'échantillon par au moins une technique séparative pour obtenir des fractions, c) soumettre les fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes : fluorimétrie, spectrométrie de masse.
Le kit de marquage selon l'invention peut bien entendu être avantageusement utilisé pour la mise en œuvre du procédé d'analyse ci-dessus.
Le procédé d'analyse selon l'invention permet aussi l'analyse des aminés primaires présentes dans deux échantillons, en ayant recours à deux réactifs de substitutions ou à deux réactifs colorants formant les couples "léger-lourd" décrits précédemment notés [(F)5(S)] à savoir un couple S-S', Si-S2, ou F-F'. Ce procédé comprend essentiellement les étapes suivantes : a) marquer les aminés primaires des deux échantillons par un procédé de marquage tel que décrit précédemment, chacun à l'aide d'un couple de réactifs de marquage [(F)5(S)] différent, b) traiter les échantillons par au moins une technique séparative pour obtenir deux séries de fractions distinctes, c) soumettre les deux séries de fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes : fluorimétrie, spectrométrie de masse.
Bien entendu, le procédé d'analyse peut être réalisé à l'aide du kit de marquage des aminés primaires décrit précédemment en utilisant différents couples de réactifs.
De manière particulièrement avantageuse, le procédé d'analyse selon l'invention permet de réaliser l'analyse des aminés primaires présentes dans deux milieux distincts, en une seule série de mesures sur un échantillon unique obtenu par réunion des deux milieux. Le procédé comprend alors essentiellement les étapes suivantes : a) marquer les aminés primaires des deux milieux par un procédé de marquage tel que décrit précédemment, chacun à l'aide d'un couple de réactifs de marquage [(F),(S)] différent, b) réunir les deux milieux en un échantillon unique, c) traiter l'échantillon par au moins une technique séparative pour obtenir une série unique de fractions, d) soumettre les fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes : fluorimétrie, spectrométrie de masse.
On appellera "milieu" une solution contenant des substances connues ou indéterminées en plus ou moins grand nombre, pouvant provenir par exemple d'un prélèvement biologique, ou encore préparée pour les besoins expérimentaux, et on appellera "échantillon" la fraction prélevée sur un milieu en vue de la soumettre à l'analyse. A noter que dans le cas général, un échantillon donné est prélevé à partir d'un milieu donné et les deux termes pourront être synonymes.
On forme ainsi après marquage, un échantillon unique à partir de deux prélèvements sur des milieux distincts, pour obtenir par une seule série de mesures des informations qualitatives et quantitatives sur les deux milieux, qu'il est alors possible de comparer de manière directe. Ce mode d'analyse est de ce fait extrêmement puissant et constitue un résultat particulièrement important de la présente invention.
Le procédé d'analyse selon l'invention peut être mis en œuvre selon divers protocoles présentant différents avantages, ce que permet parfaitement la méthode de marquage des aminés primaires revendiquée.
Selon un mode de réalisation intéressant, dans le procédé d'analyse selon l'invention le second échantillon comprend au moins une aminé primaire connue à une concentration connue. Il peut ainsi constituer un étalon interne vis-à-vis du premier échantillon, permettant un dosage quantitatif.
Selon un autre mode de réalisation intéressant, dans le procédé d'analyse selon l'invention, les étapes de marquage sont réalisées après l'étape de séparation.
Selon encore un autre mode de réalisation intéressant du procédé de l'invention, seules les fractions fluorescentes sont analysées par spectrométrie de masse. Ceci permet de n'enregistrer que les résultats utiles provenant des fractions contenant une molécule d'intérêt et d'optimiser le travail de traitement des données en aval.
Le procédé d'analyse selon l'invention s'applique particulièrement à l'analyse quantitative et structurale des aminés primaires présentes dans des échantillons biologiques. L'échantillon peut provenir de différentes origines. Il peut être par exemple humain, animal, végétal, microbiologique, viral. Il peut provenir de tout type d'environnement et de prélèvements, d'organismes sains, malades ou présentant une quelconque anomalie.
L'intérêt de disposer d'un marqueur unique de haute réactivité chimique pour les études en spectrométrie de masse et ftuorimétrie classique ou induite par laser est multiple, du fait des potentialités offertes par le double marquage permettant un puissant couplage de ces techniques, notamment :
- distinguer et identifier des molécules ayant les mêmes temps de migration en techniques séparatives : elles donnent des pics identiques en fluorimétrie, alors que la spectrométrie de masse permettra leur séparation et leur quantification grâce à la mesure de l'abondance des ions de ratios m/z différents.
- avoir deux méthodes de détection totalement différentes permettant de confirmer l'exactitude et la précision du résultat obtenu par une des méthodes et ainsi diminuer le risque d'erreur.
- signaler à l'expérimentateur que des molécules en très faible concentration, détectées par fluorimétrie induite par laser, ne pourront pas l'être en spectrométrie de masse (dont les seuils de détections des concentrations sont supérieurs).
- lorsque le détecteur de fluorescence est installé entre l'étape de séparation et la source d'ionisation ou la plaque de dépôt (MALDI)5 on pourra effectuer des acquisitions de données en spectrométrie de masse uniquement pour les molécules marquées : les molécules fluorescentes peuvent être détectées et orientées rapidement vers la source d'ionisation ou la plaque de dépôt. - pouvoir identifier plus facilement des molécules autres que les aminés primaires (et donc non marquées) à partir d'un même spectre de masse, par analyse d'abord des données se rapportant aux aminés primaires puis des données restantes.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples suivants qui illustrent des modes de réalisations possibles de la présente invention sans toutefois la limiter à ceux-ci. La puissance et l'universalité de la méthode de marquage et d'analyse des aminés primaires seront particulièrement mis en relief.
Exemple 1
Marquage, séparation et analyse d'un échantillon
Dans cet exemple, un protocole type est décrit, avec les indications nécessaires à son adaptation à différents types de milieux à étudier. Le réactif fluorogène est le NDA. Le réactif de substitution est le N,Ndiméthylaminoéthylthiol de formule HS-CH2-CH2-N(Me)2.
Le marquage d'un échantillon d'un volume de 1 μl contenant des peptides ou des protéines à des concentrations de l'ordre de la nM, est réalisé en une étape, à température ambiante. On ajoute 5 μl d'une solution de NDA à 5 μmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7, avec 5 μl d'une solution d'aminothiol à 15 μmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7. On mélange au vortex pendant une minute, on laisse réagir au moins 10 minutes.
Pour une bonne fiabilité des résultats, on considère que la quantité de NDA doit être au moins 3 à 10 fois plus importante que la quantité totale des aminés primaires. La concentration en aminothiol doit être de préférence au moins 2 à 3 fois plus importante que celle du NDA. Pour un échantillon particulièrement concentré en protéines, peptides et acides aminés, on peut augmenter les volumes des solutions de NDA et de thiol afin que toutes les molécules contenant des fonctions aminés primaires soient marquées, le reste des manipulations restant identique.
Dans un second temps, l'échantillon marqué est soumis aux techniques séparatives connues avant analyse. Par exemple, 1 μl d'échantillon marqué est injecté en μHPLC phase inverse (colonne C18, 3 μm, 3 mm de diamètre interne, 15 cm de longueur) à un débit de 5 μl/mn. On utilise un solvant tel que acétonitrile/eau acidifiée avec 0,1% de TFA (acide trifluoroacétique) selon un gradient du type suivant : Temps (min) % H2O; 0, 1 % TFA; pH = 2 % AcN
0 64 36
9 64 36
30 30 70
Un autre solvant, par exemple un solvant méthanol / eau avec un gradient adapté en fonction des différentes molécules à analyser peut aussi être utilisé pour faire migrer les différentes molécules. Tout type de colonne chromatographique peut être employé, les colonnes de phase inverse étant très habituellement choisies pour ce sujet, mais des colonnes échangeuses d'ions peuvent aussi être utilisées sans difficulté avec des conditions d'élution adaptées. La séparation peut également être réalisée par électrophorèse capillaire (CE).
Dans un troisième temps, l'échantillon est analysé par fluorimétrie et/ou par spectrométrie de masse.
Un détecteur de fluorescence induite par laser (ZETALIF 2000™, modèle 410 ou 442, Picometrics, Ramonville, France) est connecté en sortie de colonne chromatographique pour recevoir les fractions obtenues. L'excitation de l'échantillon est réalisée à une longueur d'onde de 442 nm ou de 410 nm qui sont les deux longueurs d'onde proches des maxima d'absorption dans le visible des composés isoindoles. L'émission fluorescente est détectée au dessus de 460 nm ou de 430 nm.
A la sortie du fluorimètre, est connectée la source ESI d'un spectromètre de masse (ESIQtof, Ultima™, Micromass Waters), ou un "spotter" (déposeur automatique d'échantillons) pour l'ionisation MALDI.
Exemple 2
Étude quantitative sans standard isotopique par analyse en infusion directe en spectrométrie de masse (MS) ionisation electrospray (ESI).
Le but est de déterminer la masse d'un acide aminé ou d'un peptide donné contenu dans un échantillon, sans séparation préalable. Principe
On utilise un marqueur de fluorescence (F) et deux marqueurs de substitution (Sl et S2). Dans cet exemple le marqueur (F) est le NDA. Les marqueurs Sl et S2 sont des aminothiols portant des substituants différents, à savoir le marqueur léger N,Ndiméthyl-aminoéthylthiol (Sigma), noté Gl, et le marqueur lourd N5N diéthylaminoéthylthiol (Sigma), noté G2. Lors de la fragmentation, chacun des ions moléculaires perd la chaîne aminothiol. Ainsi, le premier perd une chaîne de masse 105, le second perd une chaîne de masse 133, donnant chacun le même fragment à m/z = 704,6.
Réalisation d'un courbe étalon
Une gamme de concentration du peptide à doser est réalisée à partir d'une préparation standard du commerce. Le marquage du peptide est réalisé avec NDA+G2 comme décrit à l'exemple 1. Le peptide marqué avec Gl, à une concentration fixe, est aussi présent dans chaque solution. Les différentes solutions sont analysées. Lors de la fragmentation, chacun des ions moléculaires perd la chaîne aminothiol. Ainsi, le premier perd une chaîne de masse 105, le second perd une chaîne de masse 133, donnant chacun le même fragment à m/z = 704,6. A partir du spectre de masse, on repère les pics et on calcule le rapport de la hauteur des pics correspondant au peptide marqué avec NDA+G1, et avec NDA+G2. En faisant varier la concentration du peptide marqué avec NDA+G2 et en gardant constante la concentration du peptide marqué avec NDA+G1, on obtient une droite d'étalonnage : le rapport des teneurs mesurées expérimentalement (peptide marqué NDA+G2 / peptide marqué NDA+G1) est porté en ordonnée. Le rapport calculé à partir des valeurs de la gamme utilisée est porté en abscisse.
Dosage du peptide dans un échantillon
Pour déterminer la concentration du peptide dans un échantillon quelconque, il suffit de faire réagir les marqueurs NDA+G1 (de rapport m/z = 809,7) avec les aminés primaires dudit échantillon, d'y ajouter une quantité connue du peptide marqué avec NDA+G2 (de rapport m/z = 837,8) puis de déterminer le rapport (peptide marqué NDA+G2 / peptide marqué NDA+G1) expérimental à partir des valeurs obtenues sur le spectre de masse. On lit alors le rapport théorique correspondant d'où on tire la concentration du peptide dans l'échantillon étudié.
Illustration : dosage de la leucine-enképhaline Le dosage a été réalisé sur un échantillon test de composition connue, afin de valider la méthode. • Protocole de marquage
- Solution 1 : 10 μl de marqueur Gl à 2 mmol/1 (diluée dans H2O)5 10 μl de NDA (Sigma) à 0,2 mmol/1, 2 μl de NEt3 à 100 mmol/1 (Sigma) et 80 μl de leucine-enképhaline standard (Sigma) à 10 μmol/1 dans l'eau. - Gamme de solutions 2 :10 μl de marqueur G2 à 2 mmol/1 (diluée dans H2O), 10 μl de NDA (Sigma) à 0,2 mmol/1, 2 μl de NEt3 à 100 mmol/1 (Sigma) et 80 μl de leucine-enképhaline standard (Sigma) aux concentrations de 0,5 μmol/1 à 50 μmol/1 dans l'eau.
• Protocole de dilution
-10 μl de solution 1 et 10 μl de solution 2 sont introduits dans 980 μl de solution acétonitrile/eau (1:1) avec 0.1% de HCOOH. La solution diluée est introduite par infusion dans la source ESI du spectromètre de masse ESIQtof (Ultima, Micromass Waters), grâce à une pompe à seringue. La concentration en leucine-enképhaline marquée G2 des différentes solutions diluées se situe donc entre 5 nmol/1 et 500 nmol/1 et la concentration en leucine- enképhaline marquée Gl est de 100 nmol/1 dans toutes les solutions diluées.
• La courbe étalon obtenue est présentée Figure 1.
C'est une droite d'équation y = 0,982 x - 0,061, avec un coefficient de régression linéaire R2 = 0,996. La pente est très proche de 1 et l'ordonnée à l'origine est proche de zéro. Ce résultat montre d'une part que la méthode de dosage est linéaire sur une échelle de concentration de deux décades, la limite de quantification en spectrométrie de masse simple étant inférieure à 5 nmole/1 - niveau inégalé à ce jour -, et d'autre part que la dérivation des marqueurs n'affecte pas les propriétés d'ionisation du peptide marqué. Cette propriété très importante permet d'atteindre des seuils de sensibilité inédits, et qui n'ont pas pu être atteints en utilisant comme co-réactif le KCN (voir les études menées de façon comparable, par exemple K. Linnemayr et al, J. Mass Spectrom., 1999, 34, pp. 427-434).
Le spectre de masse présenté Figure 2 à titre d'exemple, illustre le type de graphe que l'on obtient. Il s'agit ici du spectre de la leucine-enképhaline à 10"6 mol/1, marquée avec NDA+G1 et NDA+G2 dans la proportion de 1 :2. - Le pic de rapport m/z = 837,8 est celui de l'ion moléculaire monochargé (M+H)+ correspondant à la leucine-enképhaline marquée avec NDA+G2.
- Le pic de rapport m/z = 809,7 est celui de l'ion moléculaire monochargé (M+H)+ correspondant à la leucine-enképhaline marquée avec NDA+G1.
- Le pic de rapport m/z = 704,6 est celui du fils des deux ions moléculaires précédents; il représente le total de la leucine-enképhaline marquée avec NDA+G1 et NDA+G2, et ayant perdu le co-réactif aminothiol (Gl ou G2). - On constate que le pic de rapport m/z = 809,7 est environ deux fois supérieur au pic de rapport m/z = 837,8, ce qui correspond bien au rapport des concentrations injectées de Gl et G2.
Le fait que la fragmentation donne une perte abondante du marqueur aminothiol permet de caractériser avec certitude le peptide marqué et non pas un autre ion isobare, ayant le même rapport m/z, mais non marqué (des molécules ne portant pas de fonction aminé primaire). Par exemple, pour un marqueur aminothiol donnant un ion de masse 133, il est facile de repérer un couple de pics distants de 133 unités, correspondant à l'ion moléculaire d'un peptide et à son marqueur. La fragmentation des peptides marqués selon l'invention au niveau de l' aminothiol étant particulièrement importante, la perte du groupe marqueur est bien visible et facilement identifiable, ce qui confère une sélectivité quasi totale à la méthode.
Le fait de pouvoir distinguer avec certitude les aminés primaires des autres molécules apporte un avantage très appréciable pour l'étude des milieux complexes.
Enfin, cet exemple montre bien la relation linéaire, établie par la droite étalon, entre le rapport des hauteurs de pic et le rapport des concentrations, même lorsque les deux co- réactifs (Gl et G2) sont différents.
Dans cet exemple, Gl et G2 peuvent être aussi une molécule de même structure chimique, avec G2 contenant 6 atomes de deutérium, ou de C13. Sur les mêmes échantillons, en reportant le rapport d'intensité des deux pics des composés lourds sur les deux pics des composés légers en fonction de la concentration de l'enképhaline marquée avec la chaîne lourde, on obtient une courbe d'étalonnage qui est une droite. Le dosage de l'enképhaline peut aussi être fait en CE/LIF, en μHPLC/fluorescence, ou en μHPLC/fluorescence.
Exemple 3
Étude quantitative sans standard isotopique interne, par analyse par fluorimétrie laser (LIF) et spectrométrie de masse par ionisation electrospray (ESI-MS), avec marquage précolonne.
Le marquage est réalisé avant la séparation par chromatographie. On peut faire appel aussi bien à la chromatographie liquide (LC) qu'à la technique d'électrophorèse capillaire (CE). Le détecteur LIF est connecté à la sortie de la colonne chromatographique (ou sur le capillaire). A la sortie du fluorimètre, est connectée la source d'un spectromètre de masse Le but est de déterminer la quantité d'un acide aminé ou d'un peptide donné contenu dans un échantillon, avec séparation préalable. L'espèce à doser doit être identifiée avec certitude avant analyse quantitative. Plusieurs espèces peuvent être étudiées dans un même échantillon.
Selon la méthode proposée, la MS permet d'identifier les espèces aminés primaires préalablement séparées, et notamment de nouveaux peptides, protéines ou acides aminés marqués. Ces peptides ou protéines ou acides aminés marqués, sont aisément identifiables par la perte de neutre du marqueur ionisable (S) (dans le présent exemple, un aminoacylthiol). La détection LIF permet de quantifier les aminés primaires correspondantes grâce à la surface des pics. La MS permet en outre la détermination structurale des nouvelles molécules détectées.
Le mode opératoire suivi est illustré dans le présent exemple par le dosage d'une solution modèle d'arginine.
Préparation des échantillons
L'arginine (Sigma) est marquée par le NDA et l'aminothiol Gl (N5N diméthyl2aminoéthyl- thiol) selon le principe décrit à l'exemple 1. On prend 1 μl d'échantillon d'arginine à diverses concentrations (de 50 nmol/1 à 1000 nmol/1), puis on ajoute 5 μl de solution de NDA à la concentration de 5 μmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7, avec 5 μl d'aminothiol Gl à 15 μmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7.
Séparation et analyse La séparation a lieu en chromatographie liquide (Chromatographe HPLC Alliance Waters) sur une colonne de 3,5 μm, 2,1x150 mm (Waters X-Terra RP-18^E), avec un débit de 400 μl/mn et un solvant préparé à partir du tampon A = (eau, 1% d'acide trifluoroacétique, pH=2) et de l'acétonitrile. Le gradient d'élution est de 64% de tampon A / 36% d'acétonitrile pour le T0 en conditions isocratiques pendant 9 minutes, puis gradient linéaire jusqu'à 30% de tampon A / 70% d'acétonitrile, en 21 minutes. D'autres gradients de migration peuvent être choisis sans difficulté par l'homme de l'art.
Le volume d'injection est de 5 μl (ou plus petit). A la sortie de la colonne est connecté un capillaire sur lequel est fixé le détecteur LIF (ZETALIF 2000, Picometrics, 410 nm). Le capillaire est connecté à la source ESI d'un spectromètre de masse ESIqTOF. Sur le spectre de masse, on repère l'ion moléculaire (M+H)+, on note le rapport masse/charge (m/z). Cet ion est obtenu par la perte importante et sélective par l'arginine marquée par le NDA+G1 d'un groupe (M+H-105) correspondant à l'aminothiol Gl. La perte est sélective de l'ion parent (M+H)+. On répète l'analyse avec les échantillons à différentes concentrations en arginine et on établit la courbe étalon mettant en relation la concentration en arginine (exprimée en nmol/1) et la surface du pic chromatographique. La courbe étalon (non représentée) est une droite d'équation y = 6.710-4 [arginine] + 0.089. Pour un échantillon à étudier, 1 a MS permet d'abord d'identifier l' arginine sans ambiguïté grâce à l'ion de masse (M+H-105) associé à l'ion moléculaire, tandis que la fluorescence détectée par le détecteur LIF permet de doser l'acide aminé identifié grâce à la courbe étalon. Le spectre MS apporte aussi des données quantitatives, permettant la confirmation du dosage par fluorimétrie.
Exemple 4
Étude quantitative avec standard isotopique interne, par analyse par fluorimétrie (LIF) et spectrométrie de masse par ionisation electrospray (ESI-MS), avec marquage précolonne.
Principe
Le principe et le but du dosage sont les mêmes qu'à l'exemple 3, le dispositif d'analyse est identique (colonne de séparation, fluorimètre, MS). Par contre, on travaille ici avec un étalon interne (donc sans recourir à une courbe étalon).
Le composé à doser étant connu (F arginine dans le présent exemple), on effectue la réaction de marquage avec un couple de marqueurs (F)+(S léger) dans le milieu à étudier, et on prépare une solution contenant ledit composé à une concentration définie, celui-ci étant marqué avec un couple de marqueurs (F)+(S lourd). Les deux solutions sont réunies en un échantillon unique qui est analysé.
Préparation des échantillons
L' arginine à doser est marquée par le NDA et l'aminothiol léger Gl (N5N diméthyl2amino- éthylthiol) selon le principe décrit à l'exemple 1. On prépare en parallèle une solution d' arginine standard à 100 nmol/1, qu'on marque avec le NDA et l'aminothiol lourd G2 (N,N diéthyl2aminoéthylthiol).
- NDA : 5 μl de solution à 5 μmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7;
- aminothiol : 5 μl à 15 μmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7.
Puis les deux solutions sont mélangées volume à volume pour former un échantillon unique qui est soumis à analyse comme décrit à l'exemple précédent. Les composés marqués sont élues à des vitesses différentes selon le marqueur associé, et donnent deux signaux fluorescents distincts proportionnels à leur concentration. Le spectre de masse permet de vérifier la nature du composé dosé par la masse des deux ions moléculaires associés à un ion fils unique, le rapport des hauteurs des pics donnant le rapport des concentrations en arginine "lourde" (étalon interne) et "légère" (à doser). On peut ainsi faire un dosage quantitatif de l'arginine dans un milieu quelconque.
Exemple 5
Analyse comparative d'échantillons provenant de deux milieux différents par spectrométrie de masse ESI-MS et détection LIF, avec marquage précolonne.
Le marquage est réalisé avant la séparation par chromatographie liquide (LC) ou électrophorèse capillaire (CE). Comme dans l'exemple 3 le détecteur LIF est connecté en sortie de colonne LC ou sur le capillaire de CE, puis le capillaire entre dans la source du spectromètre de masse. Le but est de fournir un outil permettant de comparer des milieux complexes, tels que des milieux biologiques, par exemple des microdialysats, l'un issu d'un organisme sain et l'autre d'un organisme présentant une anomalie (maladie ou autre). Ils contiennent un mélange de peptides dont on souhaite connaître la proportion relative dans chaque milieu.
Les différences relevées entre les deux milieux permettront de sélectionner certains peptides pour les étudier quantitativement et qualitativement en vue par exemple de mieux connaître les mécanismes de la maladie et la traiter, ou de disposer d'une molécule indicatrice de son évolution. Un fois ce ou ces peptides sélectionnés, on pourra appliquer les méthodes décrites dans les exemples précédents, ou des variantes de celles-ci adaptées au type d'information recherchée, pour approfondir leur étude spécifique.
Principe
On utilise ici un marqueur de fluorescence (F) et deux marqueurs de substitution (S) et (S'). Les marqueurs (S) et (S') seront chimiquement identiques, mais' dans (S'), certains atomes d'hydrogène ou de carbone ont été remplacés par un isotope lourd stable. Selon la méthode proposée, le premier milieu (Ml) est traité avec le couple de marqueurs (F)+(S) (léger), le deuxième milieu (M2) est traité avec le couple de marqueurs (F)+(S') (lourd). Tous les composés portant une fonction aminé primaire présents dans les milieux vont être marqués par l'un ou l'autre couple de marqueurs. Après marquage, les milieux sont mélangés pour former un échantillon mixte, qui est analysé.
Le spectre de masse permet d'identifier les pics correspondants aux composés lourds et légers associés à un même peptide présent dans les deux milieux, et de calculer le ratio lourd/léger pour faire un dosage relatif, en se fondant sur la différence d'intensité des ions dont le rapport m/z diffère du nombre d'atomes de deutérium ou de C13 introduits dans le marqueur de substitution (S'). En effet, comme précédemment expliqué, chacun des composés marqués est identifié grâce à sa perte spécifique à haut rendement du marqueur de substitution. La détection LIF permet quant à elle de quantifier de façon absolue la concentration totale des composés marqués (F)+(S) et (F)+(S') (lourd + léger) qui co- migrent.
Illustration : analyse de deux solutions contenant de la met-enképhaline Le mode opératoire suivi est illustré dans le présent exemple par l'analyse de deux solutions modèles de met-enképhaline. Dans cet exemple le marqueur (F) sera le NDA. Le marqueur (S) sera l'aminothiol Gl (HS-CH2-CH2-N(CH3)2) et (S') sera I'hexadeutérodiméthyl2 aminoéthylthiol (HS-CH2-CH2-N(CD3)2), noté GlD. Ces deux marqueurs ont une différence de masse = 6.
» Analyse qualitative
Préparation des échantillons On prépare les deux solutions modèles de met-enképhaline représentant les milieux Ml et M2 de concentrations Cl et C2 inconnues (ici de 500 nmol/1 et 100 nmol/1, respectivement), qui devront être déterminées.
On prend lμl de milieu Ml, on ajoute 5 μl de solution de NDA à 5 μmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7 avec 5 μl d'aminothiol léger Gl à 15 μmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7. On répète l'opération avec le milieu M2, le NDA et l'aminothiol GlD. Puis les deux solutions sont mélangées volume à volume.
Séparation et analyse
La séparation est effectuée en chromatographie liquide (Chromatographe HPLC Alliance Waters) sur une colonne de 3,5 μm, 2,1x150 mm (Waters X-Terra RP-18Ji), avec un débit de 400 μl/mn et un solvant préparé à partir du tampon A = (eau, 1% d'acide trifluoroacétique, pH=2) et de l'acétonitrile. Le gradient d'élution est de 64% de tampon A /
36% d'acétonitrile pour le T0 en conditions isocratiques pendant 9 minutes, puis gradient linéaire jusqu'à 30% de tampon A / 70% d'acétonitrile, en 21 minutes. D'autres gradients de migration peuvent être définis sans difficulté par l'homme de l'art. Le volume d'injection est de 5 μl (ou plus petit). A la sortie de la colonne est connecté un capillaire sur lequel est fixé le détecteur LIF (ZETALIF 2000, Picometrics, 410 nm). Le capillaire est aussi connecté à la source ESI d'un spectromètre de masse ESIqTOF.
Le spectre de masse obtenu (non représenté) montre des ions (M+H)+ (pic m/z = 827,6) et (M+H+6)+ (pic m/z = 833,6) correspondant au composé marqué avec l'un ou l'autre des couples de marqueurs. A ces ions on peut associer un ion fils unique obtenu après la perte d'une part de la molécule marquée de NDA + Gl (à M+H-105 pour la perte de l'aminothiol léger Gl) et d'autre part de la molécule marquée NDA + GlD (à M+H-6-105 pour la perte de l'aminothiol lourd GlD). Insistons encore une fois sur le fait que la perte est massive et est sélective de l'ion parent (M+H)+ ou (M+6+H)+.
Le repérage de couples de pics présentant une différence de rapport m/z = 105 ou 105+6, permet d'affirmer que le composé détecté a bien été soumis au marquage et est donc bien une aminé primaire. La masse de cet ion fils est de 827,7 ce permet d'identifier la méthionine enképhaline avec certitude. Le rapport des hauteurs des deux pics (M+H)+ / (M+H+6)+ mesuré sur le spectre est de 5.
On conclut donc que le rapport des concentrations de la met-enképhaline dans le deux milieux étudiés est de 5.
• Analyse quantitative
Réalisation d'une courbe étalon
Le composé étudié étant identifié, on peut maintenant préparer des solutions de différentes concentrations avec un produit du commerce pour établir une courbe étalon. Le protocole de dosage de la met-enképhaline marquée par NDA+G1 est le suivant.
On mélange lμl de solution de met-enképhaline (Sigma) à diverses concentrations (de 50 nmol/1 à 1000 nmol/1), avec 5 μl de solution de NDA à 5 μmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7, 5μl d'aminothiol Gl à 15 μmol/1 dans un tampon tétraborate de sodium à pH=8,7.
Les différentes solutions sont analysées en HPLC-LIF selon le même mode opératoire que ci-dessus. La fluorescence détectée par le détecteur LIF au niveau du pic du chromatogramme correspondant au composé étudié est fonction de la concentration en met- enképhaline. La courbe étalon obtenue est une droite d'équation (avec la concentration exprimée en nmol/1) : y = 310"4 [met-enképhaline] + 0,170.
Dosage dans l'échantillon mixte Les couples de marqueurs utilisés pour préparer l'échantillon mixte de cet exemple étant chimiquement identiques, les molécules de met-enképhaline marquées comigrent et forment un pic unique en chromatographie, dont la fluorescence est proportionnelle à la concentration de met-enképhaline. La valeur de la fluorescence mesurée est de 0,350 RFU (Relative Fluorescence Unit). Il suffît de reporter l'intensité de la fluorescence mesurée au niveau du pic chromatographique sur la courbe étalon pour obtenir la valeur absolue de la concentration totale en met-enképhaline de l'échantillon mixte. Elle est égale à 600 nmol/1 en tenant compte de la dilution.
La concentration respective dans chaque milieu est calculée à partir du rapport 1:5 précédemment obtenu. Le résultat du calcul indique que le milieu Ml contient 500 nmol/1, tandis que le milieu M2 contient 100 nmol/1, ce qui est conforme aux concentrations fixées pour les solutions modèles de cet exemple.
Ainsi, le dosage relatif en MS et absolu en fluorescence permet de déterminer la concentration absolue du peptide léger dans le mélange lourd plus léger. La MS permet de le doser et de l'identifier sans ambiguïté grâce à la masse des ions (M+H-105), et M+H-l 11).
Remarque
Pour améliorer la sensibilité de détection on peut doser la "molécule en MS/MS par la méthode dite "père recherche fils" (single ion monitoring ou multiple ion monitoring) ou encore "fils recherche père", bien connues de l'homme du métier. Ceci permet de disposer d'une valeur obtenue par une technique distincte à partir d'un même échantillon.
Exemple 6
Marquage post colonne
Les molécules portant une fonction aminé primaire peuvent être marquées après la séparation chromatographique. Dans ce cas, le flux de liquide est soumis à la réaction de marquage en sortie de colonne chromatographique, puis dosé par détection LIF, et enfin entre dans la source ESI-MS. Cette méthode évite à l'expérimentateur d'effectuer la réaction dé marquage précolonne. Cette technique est illustrée par le marquage avec le marqueur de fluorescence (F)=aminothiol Gl et marqueur de substitution (S)=NDA. La séparation se fait en milieu pH=8,7 dans une micro-colonne Cl 8 de 0,3 mm de diamètre avec un débit de 5 μl/mn. A la sortie de la colonne est disposée une puce de réaction (Upchurch) à deux entrées-une sortie comportant une chambre de mélange. Le flux de liquide provenant de la colonne chromatographique entre dans l'entrée 1, un mélange NDA (4,3 μmol) et d'aminothiol Gl (12,9 μmol/1) entre dans l'entrée 2 avec un débit de 5 μl/mn. La réaction de marquage se fait dans la puce de réaction. La sortie de la puce de réaction est raccordée au détecteur de fluorescence ou au détecteur LIF puis au spectromètre de masse, pour réaliser l'analyse comme précédemment décrit.
Exemple 7
Marquage par des couples de réactifs [(F)5(S)] différents, de même hydrophobie.
L'objectif ici est de mimer la technique d'électrophorèse DIGE (Différenciai Gel Electrophoresis) c'est-à-dire de d'utiliser deux agents fluorogènes excitables à deux longueurs d'onde différentes, mais ayant la même hydrophobie (Marouga R., David S., Hawkins E., Anal. Bioanal. Chem., 2005, 382, pp. 669-78). Par la technique DIGE on peut distinguer par fluorimétrie des composés ayant été co-élués. Cependant, une fois la fraction intéressante identifiée sur le gel, sa récupération en vue d'analyse complémentaire est problématique. L'intérêt de la méthode d'analyse selon l'invention est d'obtenir des composés marqués co-élués en sortie de chromatographe, pouvant être analysés par fluorimétrie et par MS sans traitement intermédiaire.
On utilise pour cela deux couples de marqueurs [(F,),(S,)] et [(F2)XS2)] .
- [(F1X(Si)] : anthracène dialdéhyde (ADA) et aminothiol à chaîne carbonée courte par exemple HSCH2N(CFL)2
- [(Fi)5(S2)] : naphtalène dialdéhyde (NDA) et aminothiol à chaîne carbonée plus longue par exemple HSCH2N(CH2CH3),.
L'hydrophobie du groupement fluorescent peut être modulée en utilisant des colorants portant des chaînes carbonées plus ou moins ramifiées.
Après marquage, on obtient les adduits qui, ayant la même hydre-phobie en HPLC en phase inverse, ont le même temps d'élution. La sortie de la colonne HPLC est connectée au détecteur LIF, puis le capillaire entre dans la source du spectromètre de masse.. Le protocole opératoire est similaire à celui qui est présenté dans l'exemple 4. Les composés co-élués ont des propriétés de fluorescence différentes, des propriétés d'ionisation en MS proches, mais des masses différentes. Ainsi, par fluorescence et MS associées, ces composés sont différentiables et identifiables (analyse qualitative). Il sont dosables quantitativement si on dispose des aminés primaires étalon interne.

Claims

REVENDICATIONS
1- Procédé de marquage d'entités portant une fonction aminé primaire (N) en vue de leur analyse quantitative et structurale caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à faire réagir en une étape lesdites aminés primaires avec :
- un réactif (F) capable de former un composé fluorescent avec lesdites aminés primaires, et
- un réactif (S) capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé.
2- Procédé de marquage selon la revendication 1 caractérisé en ce que le réactif (F) est un dialdéhyde aromatique fluorogène.
3- Procédé de marquage selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le réactif
(F) est choisi parmi les alpha-dialdéhydes aromatiques donnant des dérivés fluorescents de la famille des isoindoles.
4- Procédé de marquage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le réactif (F) est choisi parmi le naphthalène2,3 dialdéhyde (NDA), Forthophthal- dialdéhyde (OPA), l'anthracène dialdéhyde (APA), et leurs dérivés substitués.
5- Procédé de marquage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le réactif (S) est capable de substituer le réactif (F) en alpha de l'aminé primaire (N).
6- Procédé de marquage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le réactif (S) est un thiol comportant un groupement ionisable.
7- Procédé de marquage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le réactif (S) est un composé de formule R — SH, où R est une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée comportant un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'une aminé primaire.
8- Procédé de marquage selon la revendication précédente caractérisé en ce que le réactif (S) est un composé de formule R — SH, où R est une chaîne carbonée du type —
(CH2)x — A, avec x > 2, et A est un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'un groupe aminé primaire. 9- Procédé de marquage selon la revendication précédente caractérisé en ce que le groupement fonctionnel A est choisi parmi les groupes aminé secondaire, aminé tertiaire, aminé quaternaire ou du type guanidinium, ou parmi les groupes acides COOH, SO4H, SO3H, BO3H.
10- Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'wi au moins des atomes du réactif (S) est remplacé par un isotope lourd stable.
11- Procédé de marquage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que un au moins des atomes du réactif (F) est remplacé par un isotope lourd stable.
12- Procédé de marquage selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le réactif (S) comprend au moins un carbone asymétrique et est optiquement pur.
13- Procédé de marquage selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les réactifs (F) et (S) sont introduits ensemble dans un échantillon biologique pour marquer les entités portant une fonction aminé primaire dudit échantillon biologique.
14- Kit de marquage d'entités portant une fonction aminé primaire (N) présentes dans un échantillon caractérisé en ce qu'il comprend au moins :
- un réactif (F) capable de former un composé fluorescent avec lesdites aminés primaires,
- un réactif (S) capable de substituer le réactif (F) avec un groupement ionisable et de former un ion majoritaire par fragmentation dudit composé.
15- Kit de marquage selon la revendication précédente caractérisé en ce que le réactif (F) est un dialdéhyde aromatique fluorogène.
16- Kit de marquage selon la revendication 14 ou 15 caractérisé en ce que le réactif
(F) est choisi parmi les alpha-dialdéhydes aromatiques donnant des dérivés fluorescents de la famille des isoindoles.
17- Kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 16 caractérisé en ce que le réactif (F) est choisi parmi le naphthalène2,3dialdéhyde (NDA), l'orthophthaldialdéhyde (OPA), l'anthracène dialdéhyde (APA), et leurs dérivés substitués. 18- Kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 17 caractérisé en ce que le réactif (S) est capable de substituer le réactif (F) en alpha de l'aminé (N).
19- Kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 18 caractérisé en ce que le réactif (S) est un thiol comportant un groupement ionisable.
20- Kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 19 caractérisé en ce que le réactif (S) est un composé de formule R — SH5 où R est une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée comportant un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'une aminé primaire.
21- Kit de marquage selon la revendication 14 à 20 caractérisé en ce que le réactif (S) est un composé de formule R — SH, où R est une chaîne carbonée du type — (CH2)x — A, avec x > 2, et A est un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'un groupe aminé primaire.
22- Kit de marquage selon la revendication 14 à 21 caractérisé en ce que le groupement fonctionnel A est choisi parmi les groupes aminé secondaire, aminé tertiaire, aminé quaternaire ou du type guanidinium, ou parmi les groupes acides COOH, SO4H, SO3H, BO3H.
23- Kit de marquage d'entités portant une fonction aminé primaire, lesdites entités étant présentes dans deux échantillons distincts caractérisé en ce qu'il comprend i) un kit de marquage selon l'une quelconque des revendications 14 à 22 comprenant le premier réactif (S) et ii) un second réactif (S') de même formule que le premier réactif (S) dont au moins un atome est remplacé par un isotope lourd stable.
24- Kit de marquage d'entités portant une fonction aminé primaire, lesdites entités étant présentes dans deux échantillons distincts caractérisé en ce qu'il comprend i) un kit de marquage selon l'une quelconque des revendications 14 à 22 comprenant le premier réactif (F) et ii) un second réactif (F') de même formule que le premier réactif (F) dont au moins un atome est remplacé par un isotope lourd stable.
25- Kit de marquage d'entités portant une fonction aminé primaire, lesdites entités étant présentes dans deux échantillons distincts caractérisé en ce qu'il comprend i) un kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 22 comprenant le premier réactif (Sl) de formule Rl — SH et ii) un second réactif (S2) de formule R2 — SH, dans lesquels Rl et R2 sont des chaînes carbonées linéaires ou ramifiées portant un groupement fonctionnel à caractère acide ou basique autre qu'une aminé primaire, et Rl et R2 sont différents.
26- Kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 25 caractérisé en ce que le réactif (S) comprend au moins un carbone asymétrique.
27- Application du kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 26 au marquage des aminés primaires dans des échantillons biologiques.
28- Procédé d'analyse des aminés primaires présentes dans un échantillon, caractérisé en ce qu' il comprend essentiellement les étapes suivantes : a) marquer les aminés primaires par un procédé selon l'une des revendications 1 à 13, b) traiter l'échantillon par au moins une technique séparative pour obtenir des fractions, c) soumettre les fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes : fluorimétrie, spectrométrie de masse.
29- Procédé d'analyse des aminés primaires présentes dans deux échantillons caractérisé en ce qu' il comprend essentiellement les étapes suivantes : a) marquer les aminés primaires des deux échantillons par un procédé selon l'une des revendications 1 à 13, chacun à l'aide d'un couple de réactifs de marquage [(F)5(S)] différent, b) traiter les échantillons par au moins une technique séparative pour obtenir deux séries de fractions distinctes, c) soumettre les deux séries de fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes : fluorimétrie, spectrométrie de masse.
30- Procédé d'analyse des aminés primaires présentes dans deux milieux distincts caractérisé en ce qu' il comprend essentiellement les étapes suivantes : a) marquer les aminés primaires des deux milieux par un procédé selon l'une des revendications 1 à 13, chacun à l'aide d'un couple de réactifs de marquage [(F)9(S)] différent, b) réunir les deux milieux en un échantillon unique, c) traiter l'échantillon par au moins une technique séparative pour obtenir une série unique de fractions, d) soumettre les fractions obtenues à une au moins des techniques analytiques suivantes : fluorimétrie, spectrométrie de masse. 31- Procédé d'analyse selon la revendication 29 ou 30 caractérisé en ce que le second échantillon ou le second milieu comprend au moins une aminé primaire connue à une concentration connue.
32- Procédé d'analyse selon l'une des revendications 28 à 31 caractérisé en ce que l'étape de marquage est réalisée après l'étape de séparation.
33- Procédé d'analyse selon l'une des revendications 28 à 32 caractérisé en ce que seules les fractions fluorescentes sont analysées par spectrométrie de masse.
34- Procédé d'analyse selon l'une des revendications 28 à 33 caractérisé en ce que l'étape a) de marquage des aminés primaires est réalisée à l'aide d'un kit de marquage selon l'une des revendications 14 à 26.
35- Application du procédé selon l'une des revendications 28 à 34 à l'analyse quantitative et structurale des aminés primaires présentes dans des échantillons ou dans des milieux biologiques.
PCT/FR2006/002070 2005-09-09 2006-09-08 Methode de dosage des amines primaires a tres faible concentration WO2007028906A2 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0509209 2005-09-09
FR0509209A FR2890743B1 (fr) 2005-09-09 2005-09-09 Methode de dosage des amines primaires a tres faible concentration

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2007028906A2 true WO2007028906A2 (fr) 2007-03-15
WO2007028906A3 WO2007028906A3 (fr) 2007-06-07

Family

ID=36579693

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2006/002070 WO2007028906A2 (fr) 2005-09-09 2006-09-08 Methode de dosage des amines primaires a tres faible concentration

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2890743B1 (fr)
WO (1) WO2007028906A2 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008094043A3 (fr) * 2007-03-19 2008-10-02 Brains Online Holding B V Méthode pour déterminer une substance à analyser contenant un groupe amino primaire, et kit pour marquer ladite substance à analyser
WO2010046624A1 (fr) * 2008-10-22 2010-04-29 Oxtox Limited Procédé de test pour la détection d’amines primaires
CN115386056A (zh) * 2022-06-20 2022-11-25 中国人民解放军96901部队25分队 一种电致变色共轭有机聚合物材料及制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4835599A (en) * 1998-06-29 2000-01-17 Edwin F. Ullman Assay for homocysteine

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008094043A3 (fr) * 2007-03-19 2008-10-02 Brains Online Holding B V Méthode pour déterminer une substance à analyser contenant un groupe amino primaire, et kit pour marquer ladite substance à analyser
US8323979B2 (en) 2007-03-19 2012-12-04 Brains Online Holding B.V. Method for the determination of an analyte comprising a primary amino group, and kit for labeling said analyte
WO2010046624A1 (fr) * 2008-10-22 2010-04-29 Oxtox Limited Procédé de test pour la détection d’amines primaires
US8541239B2 (en) 2008-10-22 2013-09-24 Oxtox Limited Assay method for detecting primary amines
CN115386056A (zh) * 2022-06-20 2022-11-25 中国人民解放军96901部队25分队 一种电致变色共轭有机聚合物材料及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2007028906A3 (fr) 2007-06-07
FR2890743A1 (fr) 2007-03-16
FR2890743B1 (fr) 2007-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xu et al. Analytical methods for amino acid determination in organisms
Qu et al. Validated quantitation of underivatized amino acids in human blood samples by volatile ion-pair reversed-phase liquid chromatography coupled to isotope dilution tandem mass spectrometry
Gałęzowska et al. Determination of amino acids in human biological fluids by high-performance liquid chromatography: Critical review
US20160139134A1 (en) Method for analysis of compounds with amino group and analytical reagent therefor
Zhang et al. Simultaneous determination of arginine and seven metabolites in plasma by reversed-phase liquid chromatography with a time-controlled ortho-phthaldialdehyde precolumn derivatization
Szökő et al. Analysis of biological samples by capillary electrophoresis with laser induced fluorescence detection
US20100320373A1 (en) Mass spectrometric quantitative detection of methyl malonic acid and succinic acid using hilic on a zwitterionic stationary phase
Prior et al. Chiral capillary electrophoresis with UV-excited fluorescence detection for the enantioselective analysis of 9-fluorenylmethoxycarbonyl-derivatized amino acids
Moroz et al. Single-cell analyses of nitrergic neurons in simple nervous systems
Poinsot et al. Recent advances in amino acid analysis by CE
Pang et al. High-throughput multiplexed capillary electrophoresis in drug discovery
Bonfilio et al. Recent applications of analytical techniques for quantitative pharmaceutical analysis: A review
Pelosi et al. From radioactive ligands to biosensors: binding methods with olfactory proteins
Er et al. Determination of seventeen free amino acids in human urine and plasma samples using quadruple isotope dilution mass spectrometry combined with hydrophilic interaction liquid chromatography–Tandem mass spectrometry
Zhu et al. Post-column derivatization for fluorescence and chemiluminescence detection in capillary electrophoresis
Prior et al. Enantioselective micellar electrokinetic chromatography of dl‐amino acids using (+)‐1‐(9‐fluorenyl)‐ethyl chloroformate derivatization and UV‐induced fluorescence detection
WO2007028906A2 (fr) Methode de dosage des amines primaires a tres faible concentration
Chou et al. High performance liquid chromatography with fluorimetric detection for the determination of total homocysteine in human plasma: method and clinical applications
Naghashian-Haghighi et al. Determination of enantiomeric excess of some amino acids by second-order calibration of kinetic-fluorescence data
JPH0154668B2 (fr)
Hsieh et al. Development of a selective three-dimensional HPLC system for enantiomer discriminated analysis of lactate and 3-hydroxybutyrate in human plasma and urine
Wabaidur et al. Determination of dopamine in pharmaceutical formulation using enhanced luminescence from europium complex
Zhao et al. Determination of free D-alanine in the human plasma by capillary electrophoresis with optical fiber light-emitting diode-induced fluorescence detection
JP6296533B2 (ja) システイン及びシスチンの定量方法
JP5119554B2 (ja) チオール化合物の同時連続分析方法およびそれに使用する同時連続分析装置

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06808096

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2