WO2007011074A1 - 神経系細胞に選択的なｒｎａ発現ベクター - Google Patents

神経系細胞に選択的なｒｎａ発現ベクター Download PDF

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present
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Shunsuke Kobayashi
Kaijiro Anzai
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Nihon University
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    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Definitions

  • the present invention relates to a promoter for selectively expressing RNA in nervous system cells, a vector for selectively expressing RNA in neural cells, and a method for selectively expressing RNA in nervous system cells using the vector.
  • the present invention also relates to an expression vector for RNA interference selective for neural cells and an NA interference method selective for neural cells using the vector.
  • RNA interference (RNAi) technology is a technology that can specifically knock down protein expression in living cells, and is a powerful tool for functional analysis of target proteins and the development of therapeutic drugs.
  • SiRNA small interfering RNA
  • RNAi RNA interference
  • RNAi RNA interference
  • BC1 RNA is a low molecular non-translatable RNA transcribed by Pol III and is expressed specifically in nervous system cells.
  • Various types of promoter sequences are involved in the transcription of the BC1 RNA gene.
  • the 5 'flanking region of the gene in addition to the, ⁇ , ⁇ internal promoter consisting of A box and B box sequences similar to the tRNA gene and the BC1 RNA-specific GCAAG / CTTGC motif
  • the TATA-like and PSE sequences present in are also essential for transcription of BCl RNA [3, 4].
  • the BC1 RNA gene has additional transcriptional regulatory elements in its upstream region.
  • Pur's binding site '(GGN) n is an element required for transcription [5]
  • the E2-box sequence is an element that activates transcription [6].
  • BCRE BCl RNA-repressing element
  • these upstream elements can also function in the RNA polymerase II (Pol II) system [8].
  • BC1 RNA is transcribed with ⁇ ⁇ , but the promoter of the gene can be said to be a fusion of Pol II type and Pol III type. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and the problem to be solved is a promoter that selectively expresses RNA in nervous system cells, RNA in neural cells (for example, small RNA ) To provide a vector for expression and a method for expression of RNA selective to nervous system cells using the vector.
  • the present inventor has conducted extensive studies as follows, and as a result, the internal promoter of the BCl RNA gene from the transcriptional activation region located upstream of the BCl RNA gene required for transcription of BCl RNA. It has been found that a vector containing up to a continuous region can express RNA selectively in nervous system cells. In addition, although BC1 RNA is not expressed in humans and is expressed in rodents, the vector can selectively express RNA also in human-derived neural cells. The headline, the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a promoter comprising a polynucleotide comprising from the E2 site located upstream of the BCl RNA gene to the internal promoter sequence in the BC1 RNA gene in the base sequence of the BCl RNA gene.
  • a promoter comprising the following polynucleotide (a) or (b).
  • the RNA is preferably a low molecular RNA such as aptamer, shRNA, siRNA or microRNA.
  • the nervous system cell is, for example, a human-derived nervous system cell or a rodent-derived nervous system cell.
  • the vector of the present invention can be used for RNA interference.
  • the transformant is, for example, a nervous system cell.
  • Cells are, for example, human-derived neural cells or rodent-derived neural cells.
  • a method for expressing RNA selectively in a nervous system cell comprising introducing the vector according to (4) or (5) into the nervous system cell.
  • the RNA is preferably a low molecular RNA such as aptamer, shRNA, siRNA or microRNA.
  • the nervous system cell is, for example, a human-derived neural cell or a rodent-derived neural cell.
  • RNA interference method comprising introducing the vector according to (4) or (5) into a nervous system cell and selectively expressing the shRNA or siRNA in the nervous system cell.
  • Neural cells are, for example, human-derived neural cells or rodent-derived neural cells.
  • a transgenic non-human mammal generated from the ES cells described in (9) can be mentioned.
  • a neural cell selective a promoter for expressing RNA, a vector for selectively expressing RNA in neural cells, and a method for expressing RNA selectively in neural cells.
  • RNA can be expressed selectively in nervous system cells. Therefore, for example, KNAi can be induced specifically in nervous system cells by expressing in the nervous system cells low molecular RNAs such as siRNA and shRNA (short hairpin RNA) used in RNAi.
  • RNAi low molecular RNAs
  • shRNA short hairpin RNA
  • a functional RNA such as an aptamer or microRNA in a nervous system cell, it is possible to analyze the function of the protein of the nervous system cell.
  • the present invention can be applied not only to rodents but also to human-derived cells, it can be used for functional analysis of proteins and drug discovery research in various nervous cells. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 shows that the promoter of the present invention functions specifically in nervous system cells.
  • FIG. 1 A Northern plot analysis of BC1 RNA specifically transcribed in nervous system cells.
  • the left panel shows the result of hybridizing the total RNA from NG108-15 cells or NIH3T3 cells with the probe shown in (B).
  • the right panel is a gel odor modification of the gel.
  • (B) Schematic representation of the BCI RNA gene and the constructed reporter gene clone K3-tag. Shows the DNA sequence that affects the transcription of BC1 RNA (see [3-8]). The positions of the BC1 probe and tag probe are also shown.
  • C The top panel is clone The result of hybridizing the total RNA from the cells into which the K3-tag was introduced and the cells into which the K3-tag was not introduced was hybridized with the tag probe.
  • the lower panel is a brominated chime stain of gel.
  • FIG. 2 is a diagram relating to RNAi using small RNA transcribed by the promoter of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the inhibitory effect on the expression of BACE1 in primary cultured neurons into which pBCl-i / BACEl has been introduced.
  • Anti-BACE1 levels of endogenous BACE1 in cells expressing GFP 36 hours after co-transfection of rat primary cultured hippocampal neurons with pBCl-i and pEGFP or pBCl-i / BACEl and pEGFP It was examined by immunostaining with antibodies.
  • Panel (a) is a GFP signal of a neuron co-transfected with pBCl-i and pEGFP, and panel (b) is an endogenous BACE1 signal.
  • Panel (c) shows the GFP signal of neurons co-transfected with pBCl-i / BACE l and pEGFP, and panel (d) shows the endogenous BACE1 signal.
  • FIG. 4 shows that the promoter of the present invention also functions in human neural cells SH-SY5Y, and that pBCl-i / BACEl suppresses endogenous BACE1 expression.
  • BC1 RNA is RNA that is specifically transcribed in rodent nervous system cells.
  • the upper panel shows the results of hypridating total RNA from rodent NG108-15 cells or human SH-SY5Y cells with the BC1 probe.
  • Bottom panel is brominated A gel stained with ethidium is shown.
  • the upper panel shows the result of hybridizing total UNA from SH-SY5Y cells with or without clone K3-tag introduced to the tag probe.
  • the lower panel shows' brominated zyme staining of the gel.
  • C Suppression of BACE1 expression in SH-SY5Y cells by pBCl-i / BACEl.
  • RNAi systems that are selective for nervous system cells based on vectors is important for molecular cytological studies of the function of nervous system genes and the development of treatments for neurological diseases.
  • RNA is known to be efficiently expressed by RNA polymerase III promoters such as U6, HI or tRNA [2, 15-17].
  • RNA polymerase III promoters such as U6, HI or tRNA [2, 15-17].
  • these Pol III promoters are known to function in all cells, and most of the genes transcribed by Pol III do not exhibit transcription site specificity. That is, in general, the transcription system by the ⁇ ⁇ promoter This is not suitable for selective RNAi according to T JP2006 / 315078.
  • the present inventors focused on the fact that among the genes transcribed by Pol III, the rodent BC1 HNA gene is specifically transcribed into nervous system cells.
  • the BC1 RNA gene exhibits neuronal cell selectivity that is unique to the BC1 RNA gene, and because the BC1 RNA gene is a low-molecular non-translatable RNA, We hypothesized that any small RNA could be selectively transcribed into the nervous system using a mouth motor.
  • RNAi amyloid ⁇ (A j3) peptide
  • RNAi target was selected for the purpose of applying the BCl RNA gene promoter to the expression of shRNAs with short hairpin structures used in RNAi.
  • a suitable promoter region for selective expression of UNA from the nervous system cell is derived from the base sequence of the BCl RNA gene. Selected, the pBC 1 -i vector was constructed.
  • the pBCl-i vector is a vector containing a continuous sequence from the upstream transcriptional activation region necessary for efficient transcription of BCl RNA to the internal promoter.
  • BACE 1 which is an enzyme essential for the production of amyloid ⁇ (A j3) peptide, was selected as an RNAi target.
  • BCl RNA gene is a gene specific to rodents, it was found that the above-mentioned beta was also active in SH-SY5Y of human nervous system tumor cells and suppressed the expression of the target protein. That is, the present inventor selected BCl RNA We found that the promoter region of the gene also produces RNA in human-derived tumor cells SH-SY5Y, and confirmed that it functions in pBCl-i / BACEl human-derived cells.
  • the present invention has been completed as described above, and the present invention is mainly directed to the selection of nervous system cells; a promoter for expressing NA, a vector containing the promoter, and RNA for selective selection of nervous system cells.
  • the present invention relates to a vector to be expressed, and a method for selectively expressing RNA in nervous system cells using the vector.
  • the low molecular RNA expression system such as shRNA using the solid of the present invention is an important component in the development of future RNAi-selective RNAi, creation of transgenic animals, therapeutic methods, application to therapeutic agents, etc. Become an element.
  • BC1 NA is a non-mRNA (RNA that does not encode a protein) specific to cells of the nervous system, and is RNA transcribed by RNA polymerase III (Pol III).
  • BCl RNA includes, for example, a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 is described in GenBank accession number: M16113.
  • BC1 RNA is regulated by both an internal promoter for Pol III and a flanking region that is a transcriptional activation sequence that may be 5 'upstream of the BCl RNA gene.
  • This 5, upstream region is known to contain several unique gene sequences that appear to be components of the Pol II transcription system (Fig. 1B).
  • the present invention provides a promoter (hereinafter also referred to as “the promoter of the present invention”) that selectively transcribes or expresses RNA in nervous system cells.
  • the promoter of the present invention is at least 5 ′ above the BCl RNA gene in the base sequence of the BCl RNA gene. This refers to a polynucleotide comprising the E2 site located in the flow region (from -248 to -243) to the internal promoter sequence.
  • the E2 site is an array consisting of CAATTG, which is a kind of E-box array generally represented by CANNTG.
  • the BC 1 RNA gene has an internal promoter, a Pur binding sequence (GGGGTTGGGG (SEQ ID NO: 4)) present between nucleotide numbers +1 to +78, and an A-box sequence known as Pol III promoter ( TAGCTCAGTGGT (SEQ ID NO: 5)) and B-box sequence (GGTTCGGTCC (SEQ ID NO: 6)), and the GCAAG / CTTGC motif (AGAGCGCTTGCCTAGCAAGCGCAAGGCCCTG (SEQ ID NO: 7)) located in the region between them.
  • the promoter of the present invention includes at least a continuous region from the E2 site to the internal promoter sequence, the promoter of BCHE (-638 to --685) located further upstream of the BC1 RNA gene on the 5 ′ end side. You may include the polynucleotide up to this point. That is, the promoter of the present invention includes a part or almost all of the continuous base sequence up to the ⁇ 637th position as long as the base sequence of the BC1 RNA gene includes the ⁇ 248th to + 78th base sequences. Polynucleotides containing are also included.
  • the promoter of the present invention includes, for example, a polynucleotide containing at least the ⁇ 324th to + 78th base sequence (SEQ ID NO: 2) in the base sequence of the BC1 RNA gene (FIG. 2B “BC1 promoter”). .
  • a promoter or promoter region means a nucleotide that affects gene transcription, and may contain a transcriptional regulatory sequence such as an enhancer or silencer in addition to a region having promoter activity.
  • Promoter activity means the transcription ability from gene to mRNA.
  • the promoter of the present invention also includes a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide consisting of a base sequence that is complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a polynucleotide having substantially the same activity as the promoter of the present invention. Renucleotides are preferred.
  • “having substantially the same activity as the promoter of the present invention” means that the activity of a polynucleotide having a promoter activity, the degree of the activity of which comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 It means 0% or more, preferably 20% or more, more preferably 30% or more.
  • the promoter activity of the promoter of the present invention can be measured by quantifying RNA generated by transcription according to a known method.
  • a reporter gene linked to a promoter sequence is introduced into the cell, and the resulting RNA is quantified by Northern blot RT-PCR.
  • RNA generated using an in vitro transcription system is quantified by Northern plot or RT-PCR.
  • in vitro radioactivity labeling or transcription using a fluorescently labeled nucleotide as a substrate the radioactivity and fluorescence contained in the resulting RNA are measured, and the resulting RNA is quantified.
  • stringent conditions include, for example, 50% formamide, 5 X SSPE (or SSC), 5 X Denhardt's solution, 1% SDS, 0.1 mg / ml salmon.
  • a condition of 42 ° C can be mentioned in a solution containing sperm DNA (hybridization buffer). In this case, the stringency is 90-95%, 37. In C, 85 ⁇ 90%, 32. In C, it is considered to be 85-90%.
  • Hybridization can be performed at 68 ° C in an aqueous solution that does not contain formamide.
  • stringent conditions include, for example, “2 X SS 0.1% SDS, 42 ° C.”, “1 X SSC !, 0.1% SDS, 37”
  • Examples of more stringent conditions include ⁇ 1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C '' and ⁇ 0.5 X SSC, 0.1% SDS, 50 ° C ''. .
  • cleaning may be performed under the conditions of “0,2 X SSC, 0.1% SDS, 52 ° C.”.
  • hybridization can be performed by a known method.
  • the method of hybridization is, for example, “Molecular Cloning, A Reference can be made to Laboratory Manual 2nd ed. J (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), “Current Protocols in Molecular Biology J (John Wiley & Sons (1987-1997)), etc.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is, for example, at least the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • examples thereof include polynucleotides containing nucleotide sequences having identity (homology) of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 97% or more.
  • a value indicating the identity can be calculated by using a known program such as BLAST.
  • polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is, for example, one in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or Examples thereof include a polynucleotide containing a base sequence in which a mutation such as deletion, substitution or addition has occurred in a plurality of nucleic acids.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is, for example, (a) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 1 to 10 (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) nucleic acid-deleted nucleotide sequence, Ob) SEQ ID NO: 2 A nucleotide sequence in which 1 to 10 (for example,:!
  • nucleic acid is added to the nucleotide sequence represented by (C) 1 to 10 (for example, 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) nucleic acid in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (D) a salt mutated by a combination of (a) to (c) above. Array, and the like.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which mutation such as deletion, substitution or addition has occurred in one or more nucleic acids Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.J (Cold Spring Harbor Press (1989)),
  • a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis such as the QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) is used by known techniques such as the Kunkel method and the Gapped duplex method.
  • GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System manufactured by Invitrogen
  • TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System manufactured by Takara Bio Inc.
  • the promoter of the present invention includes a gene polymorphism of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the gene polymorphism can be easily known by using a known database, for example, GenBank (http: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • Genetic polymorphisms include single nucleotide polymorphism (SNP), VNTR (variable number of tandem repeat), and microsatellite polymorphism.
  • the promoter of the present invention is obtained by a known hybridization method such as colony hybridization, plaque hybridization, Southern blotting, etc. using a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof as a probe.
  • CDNA library and genomic library Refer to “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed-” (Cold Spring Harbor Press (1989) for information on how to make a library. You can also use a commercially available cDNA library or genomic library.
  • the nucleotide sequence of the promoter of the present invention can be confirmed by sequencing by a conventional method, for example, the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad Sci. USA 74: 5463) It can be carried out. It is also possible to analyze the sequence using an appropriate DNA sequencer.
  • the present invention provides a vector comprising the promoter of the present invention.
  • the vector of the present invention can link an exogenous polynucleotide so that RNA is selectively expressed in a nervous system cell under the control of the expression of the promoter of the present invention.
  • Ligated vectors are also included in the present invention.
  • the vector of the present invention is useful for expressing RNA selectively in nervous system cells.
  • the origin of the basic vector of the vector of the present invention is not particularly limited as long as RNA can be expressed selectively in nervous system cells.
  • E. coli-derived plasmid, Bacillus subtilis-derived plasmid, yeast-derived plasmid Bacteriophage such as ⁇ phage, retrovirus such as Moroni leukemia virus, detoxified animal such as adenovirus, adeno-associated virus, vaccinia virus or baculovirus, or insect virus can be used.
  • vectors such as pBluescript SK + vector, pBR322 vector, pUCl8 / 19 vector, M13 vector, pREP4 vector, pCEP4 vector, and pcDNA series vector can also be used.
  • the vector of the present invention may contain a terminator, a multicloning site (MCS), a selection marker, and the like as long as RNA can be expressed selectively in nervous system cells.
  • the terminator is preferably included in the vector of the present invention if necessary to terminate the transcription of the exogenous polynucleotide incorporated in the vector.
  • An example of the terminator is a terminator for ⁇ ⁇ such as oligo (T) sequence.
  • selection markers include drug resistance genes (neomycin resistance gene, hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene, etc.), fluorescent proteins (GP, EGFP, etc.) and the like.
  • a linker may be added as necessary.
  • a ligase reaction can be used to introduce a foreign polynucleotide into a vector.
  • the purified DNA can be cleaved with an appropriate restriction enzyme, and the resulting DNA fragment can be ligated to a vector by inserting it into an appropriate restriction enzyme site or multiple cloning site in a vector. .
  • the region from the region containing the BC2 RNA gene 5'-side E2 site to the region containing the BC1 RNA internal promoter sequence (-324 to 1078) in the base sequence of the BC1 RNA gene is used as a terminator.
  • the vector (pBCl-i) inserted into the pBluescript II SK + vector with the (T) sequence added is included in the vector of the present invention.
  • the exogenous polynucleotide is a polynucleotide encoding RNA that is selectively expressed in nervous system cells, and is ligated to the vector of the present invention so as to be transcribed under the control of the promoter of the present invention.
  • the exogenous polynucleotide may be inserted and linked so as to be appropriately transcribed under the control of the promoter of the present invention. More specifically, it may be incorporated into the appropriate restriction enzyme cleavage site downstream of the promoter of the present invention in the direction in which the foreign polynucleotide is correctly transcribed.
  • the promoter of the present invention may be incorporated in an appropriate restriction enzyme cleavage site existing upstream of the exogenous polynucleotide in the direction in which the promoter of the present invention functions correctly.
  • RNA expressed selectively in nervous system cells is not particularly limited, and is 1S, preferably small RNA.
  • small RNAs include aptamers, shRNAs, siRNAs, and microRNAs.
  • Low molecule The base length of NA is, for example, 10 to 300 bases, preferably 15 to 100 bases, more preferably 15 to 60 bases.
  • Abutama is a 20 to 60 mer oligonucleotide that can specifically bind to a predetermined protein like an antibody and inhibit the function of the protein. Also, It is known that ptama-I binds not only to proteins but also to compounds and peptides. Thus, the aptamer is not limited to the target to be bound, but can bind to the target with higher affinity and specificity than general antibodies. ⁇ In addition, aptamers have the advantage of being easy to synthesize and label, so they are expected to be powerful tools in protein functional analysis and drug discovery research.
  • the abutama for a given subject can be selected by a known method, for example, SELEX (in vitro selection method).
  • the vector that selectively expresses Abutaman is a neural cell-selective vector that synthesizes DNA from the base sequence of the selected Abutaman, and uses the obtained DNA as a foreign polynucleotide to control the promoter of the present invention. It can be prepared by ligating to a vector so that aptamer is expressed below.
  • the promoter of the present invention can be applied to the expression of sh (short hairpin) RNA or siRNA in cultured neural cells.
  • shRN A and siRN A are small RNAs used for RNAi.
  • Vectors used for RNAi can be broadly classified into two types: hairpin type and tandem type.
  • the hairpin vector is an expression vector in which the shRNA base sequence is inserted downstream of the promoter sequence. The shRNA transcribed from the expression vector introduced into the cell is transported from the nucleus to the cytoplasm and processed by Dicer into a double-stranded siRNA similar to siRNA.
  • a tandem vector is a vector in which a sense strand and a antisense strand, each having a promoter sequence, are inserted. Each separately transcribed sense strand and antisense strand anneal to form siRNA.
  • both hairpin type and tandem type vectors can be employed.
  • shRNA The sequence of shRNA or siRNA can be selected by a known method. Moreover, it can also select from well-known literature.
  • siRNA (15-25mer) is a short base sequence complementary to the base sequence of the target mRNA or It can be designed as a complementary base sequence.
  • shRNA consists of a short base sequence (sense strand) complementary to the base sequence of the target mRNA, a base sequence complementary to this short base sequence (antisense strand), and the space between these two base sequences. It can be designed to be a sequence consisting of a spacer sequence (about 10 bases).
  • the reverse strand sequence (sense strand, spacer, antisense strand, in which the sense strand and antisense strand are separated by a spacer) ) Is designed to produce an shRNA arrangement ( Figure 2B).
  • the design can be changed from siRNA to shRNA using Invitrogen's design service.
  • a vector that selectively expresses siRNA or shRNA in a nervous system cell comprises synthesizing DNA from the siRNA or shRNA base sequence designed as described above, and converting the obtained DNA into exogenous It can be prepared by linking to a vector so that siRNA or shRNA is expressed as a nucleotide under the control of the promoter of the present invention.
  • the vector containing the promoter of the present invention thus prepared can be used for RNAi as a vector for expression of shRNA or siRNA in nervous system cells.
  • Micro RNA is a functional RNA of about 15-25mer that does not encode protein. MicroRNAs are thought to be involved in various life phenomena by playing roles such as translational regulators.
  • RNA sequences can be obtained from known databases.
  • the vector for selectively expressing microRNAs in neural cells is the synthesis of DNA from the base sequence of the microRNA obtained as described above, and the promoter of the present invention using the obtained DNA as a foreign polynucleotide. It can be prepared by ligating to a vector so as to express a microRNA under the control of A transformant can be produced by introducing the vector of the present invention into a host, and the transformant is also included in the scope of the present invention.
  • the vector of the present invention is, for example, a transformant. It can also be manufactured by amplifying with
  • the host used in the present invention is not particularly limited.
  • bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeast (Pichia, Sacc aromyces), mold (Aspergillus), animal cells,
  • Escherichia coli examples include Escherichia coli K12 strain and B strain, or JM109 strain, XLl-Blue strain, and C600 strain, which are derived from these wild strains. These strains can be easily obtained from, for example, the American 'Type Culture' Collection (ATCC). Examples of Bacillus subtilis include Bacillus subtilis.
  • the method for introducing the vector into the host is not particularly limited.
  • known methods such as the electopore method, the calcium phosphate method, the lipofuxion method, the DEAE dextran method, the spheroplast method, the lithium acetate method, etc.
  • the method of culturing the transformant of the present invention can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the culture medium is preferably a medium capable of efficiently cultivating the transformant, and can be appropriately selected from known media by those skilled in the art.
  • the culture conditions are not particularly limited, but are performed at a temperature of 10 ° C to 45 ° C, preferably 10 ° C to 40 ° C for 5 to 120 hours, preferably 5 to 100 hours. .
  • the culture may be performed under a selective pressure applied by a drug selection marker.
  • a drug selection marker For example, when E. coli transformed with a vector containing an ampicillin resistant gene is cultured, ampicillin may be added to the medium as needed during the culture.
  • the transformant into which the vector of the present invention has been introduced is cultured, and the vector of the present invention can be collected from the resulting culture.
  • the culture means any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells.
  • the culture is recovered by centrifugation, and the vector of the present invention can be collected from the obtained culture by the alkaline method. Transformation Use a commercially available kit (QIAGEN) to collect vectors from the transformant! /
  • the present invention by introducing the vector of the present invention into a nervous system cell, a nervous system cell that selectively expresses RNA, preferably a small molecule: RNA, can be obtained. Therefore, the present invention provides a nervous system cell into which the vector of the present invention has been introduced, and also expresses RNA selectively in a nervous system cell comprising introducing the vector of the present invention into the nervous system cell. Provide a method. Furthermore, the present invention also provides ES cells into which a vector into which the promoter of the present invention has been inserted has been introduced, or cells that have been induced to differentiate from ES cells under appropriate differentiation conditions.
  • RNA preferably a small molecule: RNA
  • neural cells mean neurons and cultured cells derived from nerves.
  • the neuron may be a peripheral nervous system neuron or a central nervous system neuron.
  • cultured cells established cultured cells may be used, or primary cultured neural cells may be used.
  • the origin of nervous system cells is not particularly limited, and examples thereof include neural cells derived from rodents such as humans, monkeys, horses, rabbits, dogs, cats, rats, and mice.
  • rodents such as humans, monkeys, horses, rabbits, dogs, cats, rats, and mice.
  • it is a nervous system cell derived from human or rodent.
  • Examples of established cell lines include NG108-15 cells and SH-SY5Y cells. These cell lines can be cultured by known methods, for example, 10% FBS ( ⁇ shea fetal serum) in containing DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), 37 ° C, 5% C0 2 under the conditions of Can be cultured.
  • FBS ⁇ shea fetal serum
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • Examples of primary cultured neural cells include hippocampal-derived neural cells.
  • the primary culture of hippocampal nervous system cells is, for example, by collecting hippocampus from the brain of embryonic day 18 rats, isolating neuronal cells from the collected hippocampus, and then using 0.5 mM L- on cells coated with polylysine.
  • Glutamine, 2% B-27 Supplement can be cultured in Nuerobasal medium for 2 days.
  • “selectively” means via the promoter of the present invention: It means that it is expressed exclusively in nervous system cells. In cells other than nervous system cells, the expression of the RNA is not observed or is observed, but it is very small compared to the expression level in neural cells (for example, the expression level of nervous system cells 30% or less, preferably 20% or less, more preferably 10% or less, and even more preferably 5% or less.
  • the vector can be introduced into the nervous system cells by a known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method, or a DEAE dextran method.
  • the gene can be introduced by contacting the viral vector with a nervous system cell.
  • the gene can be introduced by adding a viral vector to a culture solution of nervous system cells and further culturing. At this time, an appropriately concentrated viral vector may be used.
  • RNA such as low molecular weight RNA can be selectively expressed in nervous system cells as described above. Therefore, the present invention provides a method for expressing RNA selectively in nervous system cells, which comprises introducing the vector of the present invention into neural cells.
  • the RNA to be expressed is shRNA or siRNA
  • the target mRNA is degraded by shRNA or siRNA. Therefore, the present invention provides an RNA interference method comprising introducing the vector of the present invention into a nervous system cell and expressing the shRNA or siRNA selectively in the nervous system cell.
  • the RNA to be expressed is an aptamer, the function of the target protein is inhibited by the abutama.
  • the present invention provides a protein knockdown method comprising introducing the vector of the present invention into a nervous system cell and selectively expressing abamamono in the nervous system cell.
  • the expression of RNA in neural cells can be confirmed by a known method. For example, when a gene is introduced into a nervous system cell, a vector containing a DNA encoding a fluorescent protein together with the vector of the present invention is introduced into the cell, and the fluorescence of the fluorescent protein The introduction of the vector of the present invention can be confirmed using as an index.
  • the expression of the target mRNA can be confirmed by a known method such as Northern plot, in situ hybridization, RT-PCR, quantitative PCR + preferably, a method by Northern blot It is.
  • Northern blotting can be performed, for example, according to the method described in Examples.
  • the expression of the target protein can be measured by a known method such as Western plot, immunocytochemistry, immunohistochemistry, ELISA, RIA and other immunochemical methods, and mass spectrometry.
  • stamp stamp lot immunocytochemistry can be performed according to the method described in the Examples.
  • a transgenic non-human mammal that selectively expresses RNA in neural cells can be produced.
  • mammal in the present invention means any non-human mammal such as horsetail, horse, buda, goat, usagi, inu, cat, mouse, rat, hamster and guinea pig, and is preferably Is a mouse, rabbit, rat or hamster, particularly preferably a mouse. .
  • the transgenic non-human mammal of the present invention can be applied to totipotent cells by the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofussion method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc. It can be produced by introducing a betater containing the promoter of the present invention.
  • Examples of totipotent cells into which the vector of the present invention is introduced include fertilized eggs, unfertilized eggs, early embryos, ES cells, etc. ES cells are preferred.
  • Introducing a gene into a cell also has the advantage that DNA and DNA can be directly injected into a fertilized egg. S and ES cells can be cultured and mice can be generated from ES cells. Therefore, the method using various ES cells is more efficient. preferable.
  • the present invention provides ES cells into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the transgenic non-human mammal of the present invention causes a cell into which the vector of the present invention has been introduced to assemble with an early embryo, or is injected into a blastocyst space to obtain a chimeric embryo, and the obtained chimeric embryo is imitated. It can be produced by transplanting into the uterus of a pregnant female and generating it to an individual.
  • the transgenic non-human mammal of the present invention can be obtained by selecting those from which the target RNA is expressed selectively in the nervous system cells. Nervous cells derived from the transgenic non-human mammal of the present invention are also included in the present invention.
  • the transgenic non-human mammal of the present invention includes the above-mentioned animals and their progeny.
  • the above-mentioned progeny is obtained by mating the transgenic non-human mammals of the present invention or by mating the transgenic non-human mammal of the present invention with a normal non-human mammal. Can do.
  • the transgenic non-human mammal of the present invention expresses RNA selectively in nervous system cells, it can be used for the study of proteins expressed in nervous system cells.
  • the expression of a predetermined mRNA or protein can be suppressed, it can also be used as a model animal for diseases caused by gene or protein deficiency in the development of therapeutic agents and treatment methods.
  • Reporter plasmid clone K3-tag was constructed from clone Kl-tag according to a previously reported method [6-8].
  • the rat genome From the DNA library, the BC1 RNA gene region cloned from the BC1 RNA sequence as a probe was used as a cage, and the 5 'primer and Hind III were added to the Xho I site for insertion into the vector. It was obtained by PCR using a 3'-side primer with a site added.
  • a short hairpin RNA (shRNA) containing one stem is then formed between the selected sequence (sense strand) and a sequence complementary to the sense strand (reverse sequence) (antisense strand).
  • shRNA short hairpin RNA
  • a sequence into which a spacer was inserted was prepared, and this sequence was inserted into the pBCl-i vector using Hind III and BamHI sites on the cloning site (FIGS. 2A and 2B). The obtained vector was designated as pBCl-i / BACEl.
  • NG108-15 cells, NIH3T3 cells and SH-SY5Y cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FBS fetal bovine serum
  • hippocampal neurons Primary cultures of hippocampal neurons were prepared from embryonic day 18 (E18) rat brain. Cells were maintained for 2 days in neurobasal medium containing 0.5 mM L-glutamine and 2% B-27 Supplement on a glass coated with polylysine.
  • the vector was introduced into the cells using LipofectAmine 2000 reagent according to the method described in the manufacturer's instructions (Invitrogen).
  • DNA 1-2 ⁇ g
  • LipofectAmine 2000 added to opti medium 95 ⁇ 1 and mixed, and left at room temperature for 30 minutes.
  • Cells that were 60-70% confluent in a 3.5 cm diameter dish were cultured for 5 hours using this solution, and then the culture medium was replaced with DMEM and cultured for 1-2 days.
  • RNA was extracted from cultured cells by the AGPC method [12]. RNA (10 g) was denatured, separated on a formamide-denatured agarose gel, and transferred to a nitrocellulose membrane. Hybridization is performed at 42 ° in hybridization buffer (5 X SSPE, 5 X Denhardt's reagent, 50% formamide, 1% SDS, 0.1 mg / ml salmon testis DNA) using a probe labeled with 32 P. I went in C.
  • hybridization buffer 5 X SSPE, 5 X Denhardt's reagent, 50% formamide, 1% SDS, 0.1 mg / ml salmon testis DNA
  • the nitrocellulose membrane was washed with 2 ⁇ SSC-0.1% SDS at room temperature for 30 minutes, followed by washing with 0.2 ⁇ SSC-0.1% SDS at 52 ° C. for 10 minutes twice.
  • the hyperpredation signal was detected by autography.
  • Cells into which the vector had been introduced were collected after 24 hours of culture.
  • the collected cells are lysed to prepare a cell lysate.
  • the obtained cell lysate is separated by SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane, and procking buffer (ie, TBST (20 mM containing 5% skim milk) Blocking was performed with Tris-HCl, H 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20)).
  • procking buffer ie, TBST (20 mM containing 5% skim milk
  • Blocking was performed with Tris-HCl, H 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20).
  • the protein was reacted with anti-BACE1 antibody (Calbiochem) in blocking buffer for 2 hours. After washing the membrane, it was incubated with goat anti-rabbit IgG antibody (Amersham Biosciences) conjugated with horseradish peroxidase for 1 hour. Finally, the membrane was washed with
  • the promoter of the present invention was applied to produce shRNA for the purpose of performing RNAi in cultured neural cells.
  • BCl RNA is selectively expressed in rat neural cell line NG108-15 cells, and non-neural cell line NIH3T3 cells have very low BC1 RNA expression. This was confirmed by plot analysis (Fig. 1A).
  • FIG. 1B shows the regulatory sequence for BC 1 RNA transcription in the BC 1 RNA gene.
  • Various elements are present in the gene and in adjacent regions located upstream.
  • E2 site E-bo sequence, -248
  • BCRE BCl RNA repressive element, -683
  • BCl RNA transcription Suppress. Therefore, we next examined whether the adjacent region containing this E2 site could effectively and selectively transcribe BCl RNA in cultured nervous system cells.
  • a reporter plasmid clone K3-tag (Fig. IB), which has a promoter containing an E2 site and has a specific tag sequence (20 bases long) in the 3 'part of the BCl UNA gene, was introduced into the cells. did. BC1 RNA newly synthesized from the reporter gene was detected by the tag probe in NG108-15 cells, which are neural cells, but not detected in NIH3T3 cells, which are non-neural cells ( Figure 1C). .
  • This results show that the promoter sequence of the present invention including the E2 site can be used to transcribe small RNAs selectively in nervous system cells.
  • a pBCl-i vector which is a plasmid vector DNA, was constructed.
  • the pBCl-i vector has a 5 'half region of the BC1 RNA structural gene that contains the internal promoter required for Pol III transcription and a flanking region that is a transcriptional activation sequence upstream (-324 ⁇ +78) (Fig. 2 A, B).
  • BACE1 is expressed in all tissues, but it is expressed at the highest level in the brain and is known as a key enzyme for the progression of Alzheimer's disease. So far, it has been shown that the expression of BACE1 can be effectively suppressed when this target thickness self-array is made into a double-stranded siRNA and introduced into primary cultured neurons [11]. In addition, it is said that no significant abnormalities are observed in mice modified to lack BACE1 or cells in which BACE1 is knocked down [9-11, 13]. Therefore, when BACE1 is knocked down by RNAi using the target sequence described in the literature, it is considered that there is no need to consider cell abnormalities other than BACE1 knockdown, and only a decrease in BACE1 can be considered.
  • pBCl-i / BACEl or pBCl-i vector was introduced into NG108-15 cells and NIH3T3 cells, and Western blot analysis using anti-BACE1 antibody was performed to detect intracellular BACE1 protein. went.
  • FIG. 2C BACE1 expression was suppressed in NG108-15 cells, but not in NIH3T3 cells. This indicates that the promoter of the present invention functions selectively in nervous system cells, and that the transcript transcribed via this promoter is effective as siRNA.
  • RNAi vector of the present invention pBCl-i / BACEl, selectively suppresses BACE1 expression in primary hippocampal neurons.
  • BC1 RNA is detected in rodent-derived NG108-15 cells but not in human-derived SH-SY5Y cells. It was confirmed that it was not expressed.
  • RNAi transcribed from the promoter of the present invention In order to examine whether the expression of the target gene can be suppressed in SH-SY5Y cells, pBCl-i / BACEl was introduced into SH-SY5Y cells.
  • the expression level of BACE1 decreased in the cells into which pBCl-i / BACEl had been introduced (FIG. 4C).
  • the promoter of the present invention can also be applied to human nervous system cells, and that the effect is also observed in RNAi in human nervous system cells.
  • the promoter of the present invention does not function in rodent fibroblastoma NIH3T3, the force S that functions in rodent nervous system tumor cells, NG108-15,
  • the RNAi vector pBCl-i / BACEl selectively suppressed BACE1 expression in NG108-15 cells and primary hippocampal neurons ( Figures 1-3).
  • the expression vector system of the present invention is an effective tool for gene transfer for nervous system selective RNAi that will be performed in rodents in the future. It means that it can be used for the development of RNAi.
  • the pBCl-i vector system of the present invention produces a fusion RNA of the half-half BC1 RNA and a short double-stranded hairpin RNA (shRNA) with a target sequence.
  • shRNA short double-stranded hairpin RNA
  • tRNA-siRNA fusion transcripts exist more reliably in the cytoplasm and are more effectively processed by dicers than U6-siRNA [17].
  • BC1 RNA is brain cytoplasmic RNA, and its 5th half region is derived from tRNA Ala [18].
  • the fusion RNA generated in the pBCl-i vector system of the present invention corresponds to a fusion transcription product of tRNA-siRNA.
  • the promoter of the present invention was also active in SH-SY5Y cells, which are human neuroblastomas, and BACE1 expression was suppressed in cells into which pBCl-i / BACEl had been introduced (FIG. 4).
  • the RNAi system based on the vector of the present invention is useful for the treatment of diseases.
  • BC200 NA is transcribed in a nervous system cell-specific manner: Pol III [19]. The mechanism of transcriptional regulation of BC200 RNA is not well understood.
  • RNA transcription system By applying the vector system of the present invention to BC200 RNA, it will be possible to create another siRNA transcription system based on a vector that works in primates.
  • Industrial Applicability-According to the present invention a promoter that selectively expresses RNA in nervous system cells, a selective cell in neural cells: a vector for expressing RNA, and a method for selectively expressing RNA in neural cells Is provided.
  • RNA can be selectively expressed in neural cells. Therefore, for example, by expressing siRNA, shRNA and low molecular weight RNA used for RNAi in neural cells, RNAi can be specifically induced in nervous system cells.
  • the functional analysis of proteins in nervous system cells can be performed by specifically expressing functional RNA such as Abutama in neural cells.
  • the present invention can be applied not only to rodents but also to human-derived cells, it can be used for functional analysis of proteins and drug discovery research in various nervous cells. Sequence listing free text
  • Sequence number 3 Synthetic DNA Sequence number 8: Primer
  • RNA polymerase III Positive and negative regulators for neuronal BC l RNA transcription by RNA polymerase III are possible members of the RNA polymerase II transcription system, Mol. Brain Res. I ll (2003) 211-215.
  • RNA a neural RNA polymerase III product encoded by a monomeric Alu element, Proc. Natl. Acd. Sci. USA 90 (1993) 11563-11567.

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Abstract

本発明は、神経系細胞選択的にRNAを発現させるプロモーター、前記プロモータを含有するベクターおよび前記ベクターを用いたRNAの発現方法に関する。本発明のベクターを用いることにより、神経系細胞選択的にshRNAなどのRNAを発現させることができる。

Description

明 細 書 神経系細胞に選択的な RNA発現べクタ一 技術分野
本発明は、 神経系細胞選択的に RNAを発現させるプロモーター、 神経系細胞 に選択的に' RNAを発現させるベクターおよぴ前記べクタ一を用いる神経系細胞 選択的な RNAの発現方法に関する。また、本発明は、神経系細胞に選択的な RNA 干渉用発現ベクターおよび前記ベクターを用いる神経系細胞に選択的な NA干 渉方法に関する。 背景技術
RNA干渉 （RNAi) の技術は、 生細胞内でのタンパク質発現を特異的にノック ダウンすることが可能な技術であり、 ターゲットとするタンパク質の機能的解析 や、 治療薬の開発にとっての強力なツールの一つである [1]。 RNAiで用いられる siRNA (small interfering RNA) は、 ； RNA polymerase III (Pol III) プロモー ターを用いた発現ベクターシステムによって、 生細胞中に産生されることが知ら れている [2]。 しかし、？ο1 ΠΙプロモーターを用いた発現ベクターシステムは、部 位特異的な転写には適していないため、 転写部位選択的な RNAiのシステムの構 築は、 タンパク質の機能解析や、 治療薬の開発において重要なテーマとなってい る。
ところで、 Pol IIIで転写される遺伝子は数多く知られており、 siRNAの他に は、 例えば、 BC1 RNAが挙げられる。 BC1 RNAは、 Pol IIIで転写される低分 子の非翻訳性の RNAであり、神経系細胞特異的に発現している。 BC1 RNA遺伝 子の転写には、色々なタイプのプロモーター配列が関与している。例えば、 tRNA 遺伝子に類似した A box, B box配列と BC1 RNA特異的な GCAAG/CTTGCモ チーフからなる ΡοΙ ΙΠ系の内部プロモーターに加えて、遺伝子の 5' 側隣接領域 に存在する TATA様配列と PSE配列も BCl RNAの転写に必須である [3、 4]。 さらに、 BC1 RNA遺伝子は、 その上流領域にさらなる転写調節エレメントを有 している。 例えば、 Pur ひ結合サイ ト'である（GGN)nは、 転写に必要なエレメン トであり [5]、 E2-box配列は転写を活性化するエレメントである [6]。一方、 BCRE (BCl RNA-repressing element) は、 転写を抑制的に調節する [7]。 興味深いこ とに、 これらの上流にあるエレメントは、 RNA polymerase II (Pol II)システムに おいても機能することができる [8]。 このように、 BC1 RNAは ΡοΙ ΙΠで転写され るが、 その遺伝子のプロモーターは Pol IIタイプと Pol IIIタイプの融合型であ るといえる。 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その解決しようとす る課題は、 神経系細胞選択的に RNAを発現させるプロモーター、 神経系細胞に おける RNA (例えば、 低分子 RNA) 発現用のべクタ一およぴ前記べクタ一を用 いる神経系細胞選択的な RNAの発現方法などを提供することにある。
本発明者は、 上記課題を解決するため、 以下のように鋭意検討を重ねた結果、 BCl RNAの転写に必要な BCl RNA遺伝子の上流に位置する転写活性化領域か ら BCl RNA遺伝子の内部プロモーターまでの連続する領域を含むベクターは、 神経系細胞選択的に RNAを発現できることを見出した。 また、. BC1 RNAは、 ヒ トには発現せず、 げっ歯類で発現する RNAであるにも関わらず、 前記ベクター は、ヒ ト由来の神経系細胞においても選択的に RNAを発現できることを見出し、 本発明を完成するに至つた。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 ) BCl RNA遺伝子の塩基配列において BCl RNA遺伝子の上流に位置する E2サイトから BC1 RNA遺伝子中の内部プロモーター配列までを含むポリ ヌクレオチドからなるプロモーター。
( 2 ) BC1 RNA遺伝子の塩基配列において少なくとも- 324番目から +78番目の 塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプロモーター。
(3) 以下の (a)または (b)のポリヌクレオチドからなるプロモーター。
(a) 配列番号 2で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b) 配列番号 2で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレ ォチドとストリンジ工ントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオ チド
(4) (1) 〜 （3) のいずれか 1項に記載のプロモーターを含む^ クター。
(5) (1)〜 （3) のいずれか 1項に記載のプロモーターの発現制御下に神経 系細胞選択的に RNA を発現させるように外来性ポリヌクレオチドを連結 させたベクター。
上記 （5) において、 RNAは、 好ましくは、 ァプタマ一、 shRNA、 siRNAま たはマイクロ RNAなどの低分子 RNAである。 また、 神経系細胞は、 例えば、 ヒ ト由来の神経系細胞またはげつ歯類由来の神経系細胞である。 . 本発明のベクターは、 RNA干渉に用いることができる。
(6) (4). または （5) に記載のベクターが導入された形質転換体。
上記 （6) において、 形質転換体は、 例えば、 神経系細胞である。 神経系.細胞 は、 例えば、 ヒ ト由来の神経系細胞またはげつ歯類由来の神経系細胞である。
(7) (4)または（5)に記載のベクターを神経系細胞に導 することを含む、 神経系細胞選択的に RNAを発現させる方法。
上記 （7) において、 RNAは、 好ましくは、 ァプタマ一、 shRNA、 siRNAま たはマイクロ RNAなどの低分子 RNAである。 また、 神経系細胞は、 例えば、 ヒ ト由来の神経系細胞またはげつ歯類由来の神経系細胞である。
(8) (4) または （5) に記載のベクターを神経系細胞に導入し、 shRNAま たは siRNAを神経系細胞選択的に発現させることを含む、 RNA干渉方法。 神経系細胞は、 例えば、 ヒ ト由来の神経系細胞またはげつ歯類由来の神経系細 胞である。
(9) (4) または （5) に記載のベクターが導入された ES細胞。 ( 1 0 ) ( 4 ) または （5 ) に記載のベクターが導入されたトランスジエニック 非ヒ ト哺乳動物。
上記 .（1 0 ) において、 例えば、 （9 ) に記載の ES細胞から発生させたトラ ンスジエニック非ヒト哺乳動物を挙げることができる。 本発明により、 神経系細胞選択的に： RNAを発現させるプロモーター、 神経系 細胞に選択的に RNAを発現させるベクターおよび神経系細胞選択的に RNAを発 現させる方法が提供される。
本発明により、 神経系細胞選択的に RNAを発現させることができる。 したが つて、 例えば、 RNAiに用いられる siRNA、 shRNA (short hairpin RNA) とい つた低分子 RNA を神経系細胞に発現させることにより、 神経系細胞特異的に KNAiを誘導することができる。 また、 ァプタマ一またはマイクロ RNAなどの 機能的な RNAを神経系細胞に特異的に発現させることにより、 神経系細胞のタ ンパク質の機能解析を行うことができる。
また、 本発明はげつ歯類だけでなく、 ヒ ト由来の細胞においても適用できるた め、 種々の神経系細胞におけるタンパク質の機能的解析や創薬研究に役立てるこ とができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明のプロモーターが、 神経系細胞で特異的に機能することを示す 図である。
(A) 神経系細胞で特異的に転写された BC1 RNAのノーザンプロット解析。 左 のパネルは、 NG108-15細胞あるいは NIH3T3細胞からの total RNAを、（B) に 示したプローブとハイブリダィズさせた結果を示す。 右のパネルは、 ゲルの臭 化工チジゥム染色である。（B) BCI RNA遺伝子と、構築したレポーター遺伝子 clone K3-tag の略図。 BC1 RNAの転写に影響を及す DNA配列を示す （[3-8] 参照） 。 BC1 プローブと tagプローブの位置も示す。（C) 上のパネルは、 clone K3-tagを導入した細胞おょぴ導入しなかった細胞からの total RNAを、 tagプ ローブとハイブリダィズさせた結果を示す。 下のパネルは、 ゲルの臭化工チジ ゥム染色である。
図 2は、 本発明のプロモーターによって転写された低分子の RNAを利用した RNAiに関する図である。
(A) pBCl-iベタターの構造。ターミネーターの配列は 5'-TTTTT-3である。 MCS はマルチクローユングサイトである。 （Β) 本発明のプロモーターによって転写 される ]3 -secretase 1 (BACE1)をターゲットとした siRNAのための鎵型 DNA の配列。 （C) pBCl-i/BACElを導入した神経系細胞における BACE1発現の抑 制。 NG108-15細胞または NIH3T3細胞に、 pBCl-i/BACElあるいはコント口 ール （CR) として pBCl-iベクターを導入した。 24時間後、 BACE1の発現レ ベルをウェスタンブロット解析により調べた。 用いたサンプルの確かさは、 抗 体を用いて ]3 -actinタンパク質のレベルに変化がないことで示した（下パネル）。 図 3は、 pBCl-i/BACElを導入した初代培養ニューロンにおける BACE1の発 現に対する抑制効果を示す図である。 ラット初代培養海馬ニューロンに、 pBCl-i と pEGFP、 あるいは pBCl-i/BACEl と pEGFPを共導入 （co-transfection) し た 36時間後に、 GFPを発現している細胞の内在性 BACE1 レベルを抗 BACE1 抗体で免疫染色して調べた。
パネル (a)は pBCl-i と pEGFPを co-transfectionしたニューロンの GFPシグ ナルであり 、 パネル (b)は内在性 BACE1 のシグナルである。 パネル (c)は pBCl-i/BACE lと pEGFPを co-transfectionしたニューロンの GFPシグナル であり、 パネル (d)は内在性の BACE1のシグナルである。 ，
図 4は、 本発明のプロモーターがヒ トの神経系細胞 SH-SY5Y でも機能し、 pBCl-i/BACElが内在性の BACE1の発現を抑制することを示す図である。
(A) BC1 RNAは、 げっ歯類の神経系細胞で特異的に転写される RNAである。 上パネルはげつ歯類の NG108-15 細胞またはヒ トの SH-SY5Y細胞の total RNAを BC1 プローブとハイプリダイズさせた結果を示す。 下パネルは、 臭化 ェチジゥム染色したゲルを示す。 （B) 上パネルは、 clone K3-tagを導入または 未導入の SH-SY5Y細胞からの total UNAを、 tagプローブとハイブリダイズ させた結果を示す。 下パネルは、 'ゲルの臭化工チジゥム染色を示す。 （C) pBCl-i/BACEl による SH-SY5Y 細胞中での BACE1 発現の抑制。 細胞に pBCl-i/BACElまたはコントロールとして pBCiベクターを導入した。 24時間 後、 抗 BACE1抗体を用いて BACE1 レベルを調べた （上パネル） 。 用いたサ ンプルの確かさは、 抗体を用いて i3 -actinタンパク質のレベルに変化がないこ とで示した （下パネル） 。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態について説明する。 以下の実施の形態は、 本発明を 説明するための例示であり、 本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではな レ、。 本発明は、 その要旨を逸脱しない限り、 さまざまな形態で実施をすることが できる。
なお、 本明細書において引用した文献、 および公開公報、 特許公報その他の特 許文献は、 参照として本明細書に組み込むものとする。 また、 2 0 0 5年 7月 2 2日に出願し、 本願優先権主張の基礎となる米国仮出願 US60/702，019号の開示 内容は、 その全体が参 として本明細書に組み入れられる。 1 . 概要
ベクターを基にした神経系細胞選択的な RNAiシステムの構築は、 神経系遺伝 子の機能の分子細胞学的研究や神経系疾患の治療法の開発にとって重要である。
RNAiのための短い二本鎖： RNAは、 U6、 HIまたは tRNAなどの RNAポリメラ ーゼ IIIプロモーターにより、効率良く発現されることが知られている [2、 15- 17]。 し力 し、 これらの Pol IIIプロモーターは全ての細胞で機能し、 Pol IIIにより転 写される遺伝子のほとんどが転写部位特異性を示さないことが知られている。 す なわち、 一般的に、 ΡοΙ ΙΠプロモーターによる転写システムは、 細胞のタイプに T JP2006/315078 よる選択的な RNAiには適していないといえる。
本発明者は、 Pol IIIにより転写される遺伝子の中で、 げっ歯類 BC1 HNA遺伝 子は神経系細胞に特異的に転写されることに着目した。 そして、 BC 1 RNA遺伝 子の示す神経系細胞選択性は、 BC1 RNA遺伝子に独特の性質であり、また、 BC1 RNA遺伝子が低分子の非翻訳性の RNAであることから、 BCl RNA遺伝子のプ 口モーターを用いれば、 どのような小さな RNAでも神経系に選択的に転写でき ると仮定した。
そこで、 本発明者は、 BC1 RNA遺伝子のプロモーターを、 ： NA発現システム に応用することを試みた。 まず、 RNAi に用いられる短いヘアピン構造を有する shRNAの発現に BCl RNA遺伝子プロモーターを応用する目的で、 神経系細胞 選択的に UNAを発現させるのに適切なプロモータ一領域を BCl RNA遺伝子の 塩基配列から選択し、 pBC 1 -iベクターを構築した。 pBCl-iベクターは、 BCl RNA の効率的な転写に必要な上流の転写活性化領域から内部プロモータ一までの連続 的な配列を含むベクターである。 また、 RNAiのターゲットとして、 アミロイド β (A j3 )ぺプチドの生成に必須な酵素である BACE 1を選択した。そして、 BACE1 に対する shRNAをコードする DNA配列を pBCl-iのプロモーター部分にリンク させ、その構築物 pBCl -i/BACE 1を培養神経系細胞に遺伝子導入した。その結果、 このプロモーターをターゲッ ト配列にリ ンク したベクターは、 げっ歯類の NG108-15細胞中で機能し、 BACE1 タンパク質の発現を抑制したが、 非神経系 の細胞である NIH3T3細胞では機能しなかった。 また、 このベクターは、 ラット の初代培養海馬ニューロンにおいても同様の効果を示した。 すなわち、 本発明者 は、 pBCl-i に含まれるプロモーターは、 げっ歯類の神経系腫瘍細胞 NG108-15 においても、 ラットの培養海馬ニューロンにおいても、 BACE1 タンパク質の発 現を特異的に抑制することを見出した。
さらに、 BCl RNA遺伝子はげつ歯類に特異的な遺伝子であるが、 前記のベタ ターはヒトの神経系腫瘍細胞の SH-SY5Yでも活性を示し、 ターゲットタンパク 質の発現を抑えることがわかった。 すなわち、 本発明者は、 選択した BCl RNA 遺伝子のプロモーター領域が、 ヒ ト由来の神経系腫瘍細胞 SH-SY5Yにおいても RNAを産生することを見い出し、 pBCl-i/BACEl ヒ ト由来の細胞で機能す ることを確認した。
本発明は以上のように完成されたものであり、 本発明は主に、 神経系細胞選択 的に； NAを発現させるプロモーター、 当該プロモーターを含むベクターであつ て、 神経系細胞選択的に RNAを発現させるベクター、 および当該ベクターを利 用する神経系細胞選択的に RNAを発現させる方法に関する。
本発明のベタタ一を利用した shRNAなどの低分子 RNA発現システムは、 将 来の神経系細胞選択的な RNAiの開発、 遺伝子導入動物の作成、 治療方法、 治療 剤への応用などにおいて重要な構成要素となる。
以下、 本発明を詳細に説明する。
2 . 本発明のプロモーターおよびベクター - ( 1 ) 本発明のプロ ーター
BC1 NAは、 神経系の細胞に特異的な non-mRNA (タンパク質をコードしな い RNA) であり、 RNAポリメラーゼ III (Pol III) で転写される RNAである。 BCl RNAには、 例えば、 配列番号 1で表される塩基配列を含むポリヌクレオチ ドが挙げられる。 ここで、配列番号 1で表される塩基配列は、 GenBank accession number： M16113に記載されている。
本発明者は、 これまでに、 BC1 RNAの転写が、 Pol IIIのための内部プロモー ターと BCl RNA遺伝子の 5' 上流に存在し得る転写活性化配列である隣接領域 の両方によって調節されることを報告している。 この 5， 上流領域には、 Pol II による転写システムの構成因子と思われるいくつかのユニークな遺伝子上の配列 が含まれることが知られている （図 1 B) 。
本発明は、神経系細胞選択的に RNAを転写または発現させるプロモーター（以 下、 「本発明のプロモーター」 とも称する） を提供する。 本発明のプロモーター は、 BCl RNA遺伝子の塩基配列において少なくとも BCl RNA遺伝子の 5 ' 上 流領域 （-248番〜 -243番） に位置する E2サイ トから、 内部プロモーター配列ま でを含むポリヌクレオチドを意味する。 ここで、 E2サイ トは、 CAATTGからな る配列で、 一般に CANNTGで表わざれる E-box配列の一種である。 また、 BC 1 RNA遺伝子の内部プロモーターには、 塩基番号 +1~+78の間に存在する Purひ結 合配列 （GGGGTTGGGG (配列番号 4 ) ) 、 Pol IIIプロモーターとして知られ る A-box 配列 （ TAGCTCAGTGGT (配列番号 5 ) ) および B-box 配列 ( GGTTCGGTCC (配列番号 6 ) ) 、 並びにそれらに挟まれた領域にある GCAAG/CTTGCモチーフ（AGAGCGCTTGCCTAGCAAGCGCAAGGCCCTG (配 列番号 7 ) ) が含まれる。
本発明めプロモーターは、 少なくとも E2サイ トから内部プロモーター配列ま での連続する領域を含む限り、 5'末端側にさらに BC1 RNA遺伝子の上流部分に 位置する BCHE(-638番〜 -685番）の手前までのポリヌクレオチドを含有させても よレ、。 すなわち、 本発明のプロモーターは、 BC1 RNA遺伝子の塩基配列にお.い て- 248番目力 ら +78番目の塩基配列を含む限り、 -637番目までの連続する塩基配 列の一部またほ全部を含有するポリヌクレオチドも含まれる。 本発明のプロモー ターは、 例えば、 BC1 RNA遺伝子の塩基配列において少なく とも- 324番目から +78番目の塩基配列 （配列番号 2 ) を含むポリヌクレオチドが含まれる （図 2 B 「BC1 promoter」 ) 。 .
本明細書では、 プロモーターまたはプロモーター領域は、 遺伝子の転写に影響 を及ぼすヌクレオチドを意味し、 プロモーター活性を有する領域に加え、 ェンハ ンサーやサイレンサーなどの転写調節配列を含んでいてもよい。 なお、 プロモー ター活性とは、 遺伝子から mRNAへの転写能力を意味する。
また、 本発明のプロモーターは、 配列番号 2で表される塩基配列に相補的な塩 基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジヱントな条件下でハイブリダイズ するポリヌクレオチドも含まれる。 配列番号 2で表される塩基配列に相捕的な塩 基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジヱントな条件下でハイプリダイズ するポリヌクレオチドは、 本発明のプロモーターと実質的に同じ活性を有するポ リヌクレオチドであることが好ましい。
本発明において、 「本発明のプロモーターと実質的に同じ活性を有する」 とは、 プロモーター活性を有し、 その活性の程度が配列番号 2で表される塩基配列から • なるポリヌクレオチドによる活性の 1 0 %以上、 好ましくは 2 0 %以上、 より好 ましくは 3 0 %以上有することを意味する。
本発明のプロモーターのプロモーター活性は、 転写で生じた RNAを公知の方 法に従って定量することで、 測定することができる。 例えば、 プロモーター配列 に連結したレポーター遺伝子を細胞内へ導入し、 生じた RNAをノーザンブロッ トゃ RT-PCRによって定量する。あるいは、 in vitroの転写系を用いて生じる RNA をノーザンプロットや RT-PCRによって定量する。 または、 in vitroで放射能標 識ゃ蛍光標識したヌクレオチドを基質として用いて転写させることにより、 生じ た RNAに含まれる放射活性や蛍光を測定し、 生じた RNAを定量する。
本明細書において、 ストリンジェントな条件は、 ハイブリダィゼーシヨン時の 条件として、例えば、 50%ホルムアミ ド、 5 X SSPE (または SSC) , 5 X Denhardt's solution, 1%SDS、 0.1mg/ml salmon sperm DNAを含む溶液 （ハイブリダィゼ ーシヨンバッファー） 中で 42°Cという条件を挙げることができる。 この場合、 stringencyは 90~95%で、 37。Cでは 85~90%、 32。Cでは 85~90%と考えられる。 ホルムアミ ドを含まない aqueous solution中では、 68°Cでハイブリダイゼーショ ンを行うこともできる。
また、 本明細書において、 ストリンジェントな条件は、 ハイプリダイゼーショ ン後の洗浄条件として、 例えば、 「2 X SS 0.1%SDS、 42°C」 、 「1 X SSC！、 0.1%SDS、 37°C」 、 よりストリンジェントな条件としては、 例えば、 「1 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」 、 「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 50°C」 等の条件を挙げることがで きる。 「2 X SSC、 0.1%SDS、 室温」 に続き、 「0,2 X SSC、 0.1%SDS、 52°C」 の 条件で洗浄してもよい。
本明細書において、 ハイブリダィゼーシヨンは、 公知の方法によって行うこと ができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 例えば、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.J (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))、 「Current Protocols in Molecular BiologyJ (John Wiley & Sons (1987-1997)) 等を参照することができる。
本発明において、 配列番号 2で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなる ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレ ォチドは、 例えば、 配列番号 2で表される塩基配列と少なくとも 8 0 %以上、 好 ましくは 9 0 %以上、 より好ましくは 9 5 %以上、 さらに好ましくは 9 7 %以上 の同一性 （相同性） を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。 同 一性を示す値は、 BLAST などの公知のプログラムを利用することにより算出す ることができる。
また、 配列番号 2で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレ ォチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、 例えば、配列番号 2で表される塩基配列において 1個または複数個の核酸に欠失、 置換または付加などの変異の生じた塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられ る。
ここで、 配列番号 2で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌク レオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、 例えば、 （a)配列番号 2で表される塩基配列中の 1〜 1 0個 （例えば、 1〜 5個、 好ましくは 1〜3個、 より好ましくは 1〜2個、 さらに好ましくは 1個） の核酸 が欠失した塩基配列、 Ob)配列番号 2で表される塩基配列に 1〜 1 0個 （例えば、 ：!〜 5個、 好ましくは 1〜3個、 より好ましくは 1〜2個、 さらに好ましくは 1 個） の核酸が付加した塩基配列、 （c)配列番号 2で表される塩基配列中の 1〜 1 0 個 （例えば、 1〜5個、 好ましくは 1〜3個、 より好ましくは 1〜2個、 さらに 好ましくは 1個） の核酸が他の核酸で置換された塩基配列、 （d)上記 (a)〜(c)の組 合せにより変異された塩基配列などがあげられる。
配列番号 2で表される塩基配列において 1個または複数個の核酸に欠失、 置換 または付加などの変異の生じた塩基配列を含むポリヌクレオチドは、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.J (Cold Spring Harbor Press (1989))、
「Current Protocols in Molecular Biology」 （John Wiley & Sons (1987-1997)； 特に Section8.1-8.5)、 Hashimoto-Goto et al. (1995) Gene 152: 271-5、 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82： 488-92、 Kramer and Fritz (1987) Method. Enzymol. 154： 350-67、 Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載 の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
また、 ポリヌクレオチドに変異を導入するには、 Kunkel法や Gapped duplex 法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、 例えば QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (ストラタジーン社製） 、 GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (ィンビトロジェン社製） 、 TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K、 Mutan-Super Express Km等： タカラバイオ社製） 等を用いて行うことができる。
また、 本発明のプロモーターは、 配列番号 2で表される塩基配列の遺伝子多型 を含む。 遺伝子多型は、 公知のデータベース、 例えば、 GenBank (http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov)を利用することにより、容易に知ることができる。 遺伝子多型には、一塩基多型（SNP) , VNTR(variable number of tandem repeat), およびマイクロサテライ ト多型がある。
本発明のプロモーターは、 配列番号 2で表される塩基配列からなるポリヌクレ ォチド、 またはその断片をプローブとして、 コロニーハイプリダイゼーシヨン、 プラークハイブリダィゼーシヨン、 サザンブロット等の公知のハイブリダィゼー ション法により、 cDNAライブラリーおよびゲノムライブラリ一から得ることが できる。ライプラリ一の作製方法については、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed -」 （Cold Spring Harbor Press (1989》を参照することができる。 また、 市販の cDNAライブラリ一およびゲノムライブラリ一を用いてもよい。 本発明のプロモーターの塩基配列の確認は、 慣用の方法により配列決定するこ とにより行うことができる。 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェーンターミネ ーション法 (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74： 5463) 等により 行うことができる。 また、 適当な DNAシークェンサ一を利用して配列を解析す ることも可能である。
( 2 ) 本発明のベクター
本発明は、 本発明のプロモーターを含むベクターを提供する。 本発明のベクタ 一は、 好ましくは、 本発明のプロモーターの発現制御下に神経系細胞選択的に RNAを発現させるように外来性ポリヌクレオチドを連結させることができ、この ように外来性ポリヌクレオチドを連結させたベクターも本発明に含まれる。 本発 明のベクターは神経系細胞選択的に RNAを発現させるのに有用である。
本発明のベクターは、 神経系細胞選択的に RNAを発現させ得る限り、 基本と なるベクターの由来は特に限定されず、 例えば、 大腸菌由来のプラスミ ド、 枯草 菌由来のプラスミ ド、 酵母由来のプラスミ ド、 λファージなどのバタテリオファ 一ジ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウィルス、 アデノウイルス、 アデノ 随伴ウィルス、 ワクシニアウィルスもしくはバキュ口ウィルスなどの無毒化した 動物または昆虫ウィルスを使用することができる。 また、 例えば、 pBluescript ll SK+ ベクター、 pBR322ベクター、 pUCl8/19ベクター、 M13ベクター、 pREP4 ベクター、 pCEP4ベクター、 pcDNA系ベクターなどの市販のベクターを利用す ることもできる。
本発明のベクターは、 神経系細胞選択的に RNAを発現させ得る限り、 ターミ ネーター、 マルチクローニングサイ ト (MCS) 、 選択マーカーなどを含んでいて もよい。 例えば、 ターミネータ一は、 ベクターに組み込まれた外来性のポリヌク レオチドの転写を終結させるのに必要であれば、 本発明のベクターに含むことが 好ましい。 ターミネータ一は、 例えば、 oligo(T)配列などの ΡοΙ ΙΠ用ターミネ一 ターが挙げられる。 また、 選択マーカーとしては、 例えば、 薬剤耐性遺伝子 （ネ ォマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子、 ピューロマイシン耐性遺 伝子等） 、 蛍光タンパク質 （GP 、 EGFP等） などが挙げられる。 さらに、 必要 に応じリンカーの付加を行ってもよい。 ベクターに外来性のポリヌクレオチドを揷入するには、 リガーゼ反応を利用す ることができる。 例えば、 精製された DNAを適当な制限酵素で切断し、 得られ た DNA断片をべクター中の適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイ トに挿入することでベクターに連結する方法などが採用される。
実施例において、 BC1 RNA遺伝子の塩基配列において BC1 RNA遺伝子の 5 ' 側の E2サイ トを含む領域から BC1 RNAの内部プロモーター配列を含む領域ま で （-324〜十 78) を、 ターミネータ一として oligo(T)配列を付加した pBluescript II SK+ベクターに挿入したベクター（pBCl-i)は、本発明のベクターに含まれる。 ( 3 ) 外来性のポリヌクレオチド
本発明において、 外来性のポリヌクレオチドは、 神経系細胞選択的に発現され る RNAをコードするポリヌレオチドであり、 本発明のプロモーターの制御下で 転写されるように、 本発明のベクターに連結されるものである。 . ベクターに本発明のプロモーターまたは外来性のポリヌクレオチドを揷入する には、 外来性のポリヌクレオチドが本発明のプロモーターの制御を受けて適切に 転写されるように挿入し連結すればよい。 より具体的には、 本発明のプロモータ 一の下流に存在する適当な制限酵素切断部位に、 外来性のポリヌクレオチドが正 しく転写される方向に組み込めばよい。 または、 外来性のポリヌクレオチドの上 流に存在する適切な制限酵素切断部位に、 本発明のプロモーターが正しく機能す る方向に組み込めばよい。
本発明において、 神経系細胞選択的に発現される RNAは、 特に限定されない 1S 好ましくは低分子 RNAである。 低分子 RNAには、 ァプタマ一、 shRNA、 siRNA, マイクロ RNAなどをあげることができる。 低分子： NAの塩基長は、 例 えば、 10〜300塩基、 好ましくは 15〜： 100塩基、 より好ましくは 15〜60塩基で ある。
アブタマ一は、 抗体のように所定のタンパク質に対して特異的に結合し、 タン パク質の機能を阻害し得る 20〜60mer のオリゴヌクレオチドである。 また、 ァ プタマ一はタンパク質以外にも、 化合物、 ペプチドなどにも結合することが知ら れている。 このように、 ァプタマ一は結合する対象に制約がないだけではなく、 一般の抗体よりも高い親和性と特異性をもって対象に結合することが可能である。 ■ さらに， ァプタマ一は、 その合成やラベル化が容易といった利点もあるため、 タ ンパク質の機能解析や創薬研究における強力なツールとしても期待されている分 子である。
所定の対象に対するアブタマ一は、 公知の方法で選択することができ、 例えば SELEX (in vitro selection法） によつて選択することができる。
本発明において、 アブタマ一を神経系細胞選択的に発現するベクターは、 選択 されたアブタマ一の塩基配列から DNAを合成し、 得られた DNAを外来性のポ リヌクレオチドとして本発明のプロモーターの制御下でァプタマ一を発現するよ うにベクターに連結することで、 作製することができる。
また、 培養神経系細胞における sh (short hairpin) RNAまたは siRNAの発現 に対して、本発明のプロモーターを適用することができる。 shRN Aおよぴ siRN A は、 RNAiに用いられる低分子 RNAである。 RNAiに用いるベクターは、 ヘアピ ン型とタンデム型の 2種類に大別できる。 まず、 ヘアピン型ベクターは、 プロモ 一ター配列の下流に shRNAの塩基配列を挿入した発現ベクターである。 細胞に 導入された発現ベクターから転写された shRNAは、 核から細胞質へ輸送され、 Dicerによるプロセシングを受けて siRNAと同様の 2本鎖 siRNAになる。 それ に対して、 タンデム型ベクターはそれぞれがプロモーター配列をもつセンス鎖と アンチセンス鎖の錶型配列が揷入されたベクターである。 それぞれ別々に転写さ れたセンス鎖とアンチセンス鎖がアニーリングして siRNA を形成する。 本発明 においては、 ヘアピン型およびタンデム型のいずれのベクターも採用することが できる。
shRNAまたは siRNAの配列は、 公知の方法で選択することができる。 また、 公知の文献から選択することもできる。 siRNA (15〜25mer) は、 ターゲットと " なる mRNA の塩基配列に相補的な短い塩基配列、 またはこの短い塩基配列に相 補的な塩基配列として設計することができる。 また、 shRNA は、 ターゲットと なる mRNA の塩基配列に相補的な短い塩基配列 （センス鎖） と、 この短い塩基 配列に相補的な塩基配列 (アンチセンス鎖) と、 これら 2つの塩基配列の間のス ぺーサ一配列 （約 1 0塩基程度） とからなる配列となるように設計することがで きる。 例えば、 実施例では、 BACEに対する効果的な siRNA配列情報 （19mer) から、 センス鎖とアンチセンス鎖をスぺーサ一で分離した逆向きの繰り返し配列 (センス鎖一スぺ サ一一アンチセンス鎖） を設計し、 shRNA配^を作製して いる （図 2 B) 。 また、 例えば、 インビトロジェン社の設計サービスを利用して、 siRNAから shRNAへの設計変更することもできる。
本発明において、 siRNAまたは shRNAを神経系細胞選択的に発現するべクタ 一は、 上記のように設計された siRNAまたは shRNAの塩基配列から DNAを合 成し、 得られた DNAを外来性のポリヌクレオチドとして本発明のプロモーター の制御下で siRNAまたは shRNAを発現するよう'にべクターに連結することで、 作製することができる。 このように作製された本発明のプロモーターを含有する ベクターは、.神経系細胞において shRNAまたは siRNAの発現用のベクターとし て、 RNAiに用いることができる。
また、 マイクロ RNA (miRNA) は、 タンパク質をコードしない約 15〜25mer の機能的な RNAであ 。 マイクロ RNAは、翻訳調節因子としての役割などを担 うことで様々な生命現象に関わると考えられている。
マイクロ： RNAの配列は、 公知のデータベースから入手することができる。 本発明において、 マイクロ RNAを神経系細胞選択的に発現するベクターは、 上記のように入手したマイクロ RNAの塩基配列から DNAを合成し、 得られた DNA を外来性のポリヌクレオチドとして本発明のプロモーターの制御下でマイ クロ RNAを発現するようにベクターに連結することで、作製することができる。 本発明のベクターを宿主に導入することで、 形質転換体を作製することができ、 当 該形質転換体も本発明の範囲に含まれる。 本発明のベクターは、 例えば、 形質転換体 で増幅することで、 製造することもできる。
本発明において使用される宿主は、特に限定されるものではないが、例えば大腸菌、 枯草菌などの細菌、酵母 (Pichia、 Sacc aromyces),カビ（Aspergillus)、動物細胞、
+ 昆虫細胞、 植物細胞等が挙げられる。 なお、 本発明において神経系細胞を形質転換体 の宿主として用いる場合については、 後述する。
大腸菌としては、 例えば、 大腸菌 K12株や B株、 あるいはそれら野生株由来の派 生株である JM109株、 XLl-Blue株、 C600株などを挙げることができる。 これら菌 株は、 例えば、 アメリカン 'タイプカルチャー ' コレクション （ATCC) などから容 易に入手することができる。枯草菌としては、例えば、バチルス ·ズブチリス (Bacillus subtilis)などが挙げられる。
宿主へのベクターの導入方法としては、 特に限定されるものではないが、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法、 リン酸カルシウム法、 リポフエクシヨン法、 DEAE デ キストラン法、 スフエロプラスト法、 酢酸リチウム法等の公知の方法があげられる。 本発明の形質転換体を培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の方法に したがって行う'ことができる。 培養培地は、 形質転換体の培養を効率的に行うこ とができる培地が望ましく、 当業者であれば公知の培地から適宜選択することが できる。培養条件は、特に限定されないが、 10°C〜45°C、好ましくは、 10°C〜40°C の温度下で、 5〜： 120時間、 好ましくは 5〜： 100時間程度行う。.
また、 培養中に形質転換体からベクターの脱落を防ぐために、 薬剤選択マーカ 一による選択圧をかけた状態で培養してもよい。 例えば、 アンピシリン耐性遺伝 子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、 培養中に、 必要に応じ てアンピシリンを培地に添加してもよい。
本発明のベクターを導入した形質転換体を培養し、 得られる培養物から本発明 のベクターを採取することができる。 ここで、培養物とは、培養上清、培養細胞、 培養菌体または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。 例えば、 形質転換体を培養した後、 培養物を遠心処理により回収し、 得られた 培養物からアルカリ法により本発明のベクターを採取することができる。 形質転 換体からベクターを採取するには、市販のキット（QIAGEN)を利用してもよ！/
3 . 神経系細胞選択的に RNAを発現させる方法
本発明において、 本発明のベクターを神経系細胞に導入することで、 選択的に RNA、 好ましくは低分子: RNAを発現する神経系細胞を得ることができる。 した がって、 本発明は、 本発明のベクターが導入された神経系細胞を提供し、 また、 本発明のベクターを神経系細胞に導入することを含む神経系細胞選択的に RNA を発現させる方法を提供する。 さらに、 本発明は、 本発明のプロモーターを挿入 したベクターを導入した ES細胞、 または適当な分化条件により ES細胞から分 化誘導された細胞なども提供する。
本発明において、 神経系細胞とは、 ニューロンおよび神経由来の培養細胞を意 味する。 ニューロンは、 末梢神経系ニューロンを使用してもよいし、 中枢神経系 ニューロンを使用してもよい。 培養細胞は、 株化培養細胞を使用してもよいし、 初代培養神経系細胞を使用してもよい。
本発明において、神経系細胞の由来は、特に限定されず、例えば、 ヒ ト、サル、 ゥマ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 ラット、 マウスなどのげつ歯類由来の神経系細胞が あげられ、 好ましくはヒ トまたはげつ歯類由来の神経系細胞である。
株化培養細胞は、 例えば、 NG108-15 細胞、 SH-SY5Y細胞をあげることがで きる。 これらの細胞株は、 公知の方法で培養することができ、 例えば、 10% FBS (ゥシ胎児血清） 含有 DMEM (ダルベッコ変法イーグル培地） 中で、 37°C、 5% C02の条件下で培養することができる。
初代培養神経系細胞は、例えば、海馬由来の神経系細胞を挙げることができる。 海馬神経系細胞の初代培養は、 例えば、 胎生 18 日のラットの脳から海馬を採取 し、 採取した海馬から神経系細胞を単離した後、 細胞をポリリジンコートしたガ ラス上で 0.5 mM L-グルタミン、 2% B-27 Supplement (インビトロジェン） 含 有 Nuerobasal培地で 2日間培養することができる。
本発明において、 「選択的に」 とは、 本発明のプロモーターを介した： RNAが 神経系細胞に限定して発現することを意味する。 神経系細胞以外の細胞では、 当 該 RNAの発現が観察されないか、 観察されることはあっても神経系細胞での発 現量に比較してごく少量 （例えば、 神経系細胞の発現量の 3 0 %以下、 好ましく は 2 0 %以下、 より好ましくは 1 0 %以下、 さらに好ましくは 5 %以下） である ことを意味する。
神経系細胞に対するベクターの導入方法は、例えばエレク トロポレーション法、 リン酸カルシウム法、 リポフエクション法、 DEAEデキストラン法などの公知の 方法で行うことができる。 また、 ベクターがウィルスベクターの場合は、 神経系 細胞にウィルスベクターを接触させることで遺伝子導入することができる。 例え ば、 神経系細胞の培養液にウィルスベクターを添加し、 さらに培養することで遺 伝子導入することができる。 このとき、 ウィルスベクターは適宜濃縮したものを 用いてもよい。
本発明では、 上記のようにして、 低分子 RNAなどの RNAを、 神経系細胞選択 的に発現させることができる。 したがって、 本発明は、 本発明のベクターを神経 系細胞に導入することを含む、 神経系細胞選択的に RNAを発現させる方法を提 供する。 また、 発現させる RNAが shRNAまたは siRNAである場合、 shRNA または siRNAにより標的 mRNAが分解される。 したがって、 本発明は本発明の ベクタ一を神経系細胞に導入し、神経系細胞選択的に shRNAまたは siRNAを発 現させることを含む、 RNA干渉方法を提供する。 さらに、 発現させる RNAがァ プタマーである場合は、 アブタマ一により標的タンパク質の機能が阻害される。 したがって、 本発明は、 本発明のベクターを神経系細胞に導入し、 神経系細胞選 択的にアブタマ一を発現させることを含む、 タンパク質のノックダウン方法を提 供する。 神経系細胞における RNAの発現は、 公知の方法で確認することができる。 例 えば、 神経系細胞への遺伝子導入の際に、 本発明のベクターとともに蛍光タンパ ク質をコードする DNAを含むベクターを細胞に導入し、 蛍光タンパク質の蛍光 を指標に本発明のベクターの導入を確認することができる。
また、 標的 mRNAの発現は、 ノーザンプロット、 in situ ハイブリダィゼーシ ョン、 RT-PCR、定量的 PCRなどの公知の方法によつて確認することができる力 + 好ましくは、ノーザンブロットによる方法である。ノーザンブロットは、例えば、 · 実施例に記載の方法にしたがって行うことができる。
また、 標的タンパク質の発現は、 ウェスタンプロット、 免疫細胞化学法、 免疫 組織化学法、 ELISA、 RIAなどの免疫化学的方法、 質量分析法などの公知の方法 よって測定することができる。 ゥヱスタンプロットおょぴ免疫細胞化学法は、 例 えば、 実施例に記載の方法にしたがって行うことができる。
4 . トランスジエニック非ヒ ト哺乳動物
本発明のプロモーターを含むベクターを非ヒ ト哺乳動物に組み込むことにより 神経系細胞に RNAを選択的に発現するトランスジ ニック非ヒ ト哺乳動物を作 成することができる。
本発明における 「哺乳動物」 とは、 ゥシ、 ゥマ、 ブダ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 マウス、 ラット、 ハムスターおよびモルモッ ト等の任意の非ヒ ト哺乳動物 を意味し、 好ましくはマウス、 ゥサギ、 ラットまたはハムスターであり、 特に好 ましくはマウスである。.
本発明のトランスジエニック非ヒ ト哺乳動物は、 全能性細胞に対して、 リン酸 カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェ クシヨン法、 パーティクルガン法、 DEAE-デキストラン法などにより、 本発明の プロモーターを含むベタターを導入することにより作製することができる。 本発 明のベクターを導入する全能性細胞として、 受精卵、 未受精卵、 初期胚、 ES 細 胞などを挙げることができ、 ES細胞が好ましい。
細胞への遺伝子の揷入は、受精卵に直接 DNAを注入する方法も採用できる力 S、 ES細胞は、培養が可能であり、 しかも ES細胞からマウス等を発生させることが できるという利点を有しているため、 各種 ES細胞を用いる方法がより効率的で 好ましい。 本発明は、 本発明のベクターを導入した ES細胞を提供する。
本発明のトランスジエニック非ヒ ト哺乳動物は、 本発明のベクターを導入した 細胞を初期胚と集合させ、 または胚盤胞腔に注入してキメラ胚を得、 得られたキ メラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植し、 個体まで発生させることによって作製 することができる。 得られた動物の中から神経系細胞選択的に目的の RNAを発 現しているものを選択することにより、 本発明のトランスジヱニック非ヒ ト哺乳 動物を得ることができる。 本発明のトランスジエニック非ヒ ト哺乳動物に由来す る神経系細胞も、 本発明に含まれる。
本発明のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物は、 上記動物のほか、 その子孫も 含む。前記子孫'は、本発明のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物同士を交配させ、 または、 本発明のトランスジエニック非ヒ ト哺乳動物と通常の非ヒ ト哺乳動物と を交配させることにより得ることができる。
本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物は、 神経系細胞選択的に RNAを 発現するため、 神経系細胞に発現するタンパク質の研究に用いることができる。 また、 所定の mRNAまたはタンパク質の発現を抑制することができるため、 遺 伝子またはタンパク質の欠損に由来する疾患のモデル動物として、 治療剤や治療 方法の開発に用いることもできる。 実施例
以下、 実施例により本発明を具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら実施例 に限定されるものではない。 実施例
1 . 材料と方法
( 1 ) プラスミ ド DNAの調製
レポータープラスミ ド clone K3-tagは、既報の方法にしたがって、 clone Kl-tag から構築した [6-8]。 pBCl-iベクターを調製するために、 BC1 RNA遺伝子の 5，側の E2サイ トを含 む上流領域から BC1 RNA 遺伝子の内部プロモーター配列とを含む領域まで (-324〜十 78)を、 ラッ トゲノム DNAライブラリ一力 ら BC1 RNA配列をプロ—ブと してクローニングした BC1 RNA遺伝子領域を鎵型とし、 ベクターへの揷入のた めに Xho Iサイ トを付加した 5'側のプライマーと Hind IIIサイ トを付加した 3' 側プライマーとを用いた PCRにより得た。
5，側プライマー： TGTGCTCGAGTGTGTTCACTTAGCCCTCC (配列番号 8 ) 3，側プライマー： TTTTAAGCTTCGGAGCTGAGGACCGAAC (配列番号 9 ) そして、 得られた DNA断片を、 予め Pol III用ターミネータ一として 5塩基長 の T配列をマルチクローニングサイ トの Spe lサイ トに付加した pBluescript II SK+ ベクターの Xho Iサイ トと Hind IIIサイ トの間へ挿入した。 得られたベタ ターを、 pBCl-iベクターとした （図 2 A) 。
次に、 pBCl-i/BACElを調製するために、 哺乳動物細胞において BACE1に対 する効果的な siRNAであることが明らかな、 19ヌクレオチドの配列を選択した
[11]。 そして、 一つのステムを含む短いヘアピン RNA (shRNA)を形成するよう に、 選択した配列 （センス鎖） とセンス鎖に相補的な配列 （逆向きの配列） （ァ ンチセンス鎖） との間にスぺーサーを挿入した配列を作製し、 この配列をマルチ クローユングサイ トの Hind IIIと BamHIサイ トを用いて pBCl-iベクターに揷 入した（図 2 A、 B )。 得られたベクターを、 pBCl-i/BACElとした。
( 2 ) 細胞培養と遺伝子導入
NG108-15細胞、 NIH3T3細胞および SH-SY5Y細胞は、 10%牛胎児血清（FBS) 含有ダルベッコ変法イーグル培地 （DMEM) で培養した。
海馬ニューロンの初代培養は、 胎生 18 日 （E18) ラッ トの脳から調製した。 細 胞はポリ リジンでコートしたガラスの上で、 0.5 mM L-グルタミン、 2%の B-27 Supplement (ィンビトロジェン） 含有 neurobasal培地で 2 日間維持した。
細胞へのベクターの導入は、 LipofectAmine 2000試薬を用い、 製造元 （インビ トロジェン） の説明書に記載の方法にしたがって行った。 DNA ( 1〜 2 μ g ) を opti medium 100 μ 1 に加えたものと、 5 μ 1 の LipofectAmine2000を opti medium 95 μ 1に加えて混和したものとを合わせ、室 温で 30分放置後、 さらに opti medium 800 μ 1を加えて 1mlとした。直径 3.5 cm のディッシュに 60〜70% コンフルェントとなっている細胞を、 この溶液を用い て 5時間培養した後、 培養液を DMEMに交換して、 1〜2 日間培養した。
( 3 ) ノーザンプロッ ト解析
Total RNAは、 培養細胞から AGPC法 [12]によって抽出した。 RNA (10 g) は、 変性させ、 ホルムアミ ド変性ァガロースゲルで分離し、 ニトロセルロース膜 に転写した。 ハイプリダイゼーシヨンは、 32P で標識したプローブを用いてハイ ブリダイゼーションバッファー （5 X SSPE、 5 X Denhardt's試薬、 50% ホルム アミ ド、 1% SDS、 0.1 mg/ml サケ精巣 DNA) 中で 42°Cでー晚行った。
二トロセルロース膜は、 2 x SSC-0.1% SDSで室温で 30分洗浄し、続いて 0.2 x SSC-0.1% SDSで 52°Cで 10分間の洗浄を 2回行った。 ハイプリダイゼーション シグナルは、 オートラジォグラフィ一で検出した。
( 4 ) ウェスタンブロット解析
ベクターを導入した細胞を、 24時間培養した後、 回収した。 回収した細胞を溶 解して細胞溶解液を調製し、得られた細胞溶解液を SDS-PAGEで分離後、 PVDF 膜に転写し、プロッキングバッファー（すなわち、 5% スキムミルクを含む TBST (20 mM Tris-HCl, H 7.5、 150 mM NaCl、 0.05% Tween 20)) で一晚ブロッキ ングした。 タンパク質は抗 BACE1抗体 （Calbiochem) とブロッキングバッファ 一中で 2時間反応させた。 その膜を洗浄した後、 西洋ヮサビ過酸化酵素を結合し たャギ抗ゥサギ IgG抗体 （Amersham Biosciences) と 1時間インキュベートし た。 最後に、 膜を TBST で洗浄し、 タンパク質のシグナルを ECL キッ ト (.Amersham Biosciences; で検出した。
( 5 ) 免疫細胞化学
初代海馬ニューロ ンに、 pEGP と pBCl-i/BACEl を共導入した (co-transfection) 。 36時間ィンキュベーションした後、 細胞を FBSで洗い、 4%パラホルムアルデヒド含有 PBSで 10分間固定した後、 1% Triton-XlOO含有 PBSで 15分間処理した。 固定された細胞を、 5%スキムミルク含有 PBS中で抗 BACE1抗体と 2時間ィンキュベートした。細胞を PBSで洗浄し、 Alexa Fluor 546 を結合したャギ抗ゥサギ IgG抗体 （Molecular Probes) を加え、 1時間インキュ ペートした。 蛍光シグナルは、 DP-70イメージングシステムとリンクしたォリン パス倒立顕微鏡を用いて観察した。 · ロ
( 1 ) 培養神経系細胞で効率的な転写を起こす BCl RNA遺伝子のプロモータ一 領域
本実施例では、 培養神経系細胞で RNAiを行うことを目的として、 shRNAを 産生するために本発明のプロモーターを応用した。
まず、 BCl RNAがラット神経系細胞株である NG108-15細胞で選択的に発現 し、 非神経系細胞株である NIH3T3細胞では、 BC1 RNAの発現が非常に低レべ ルであること 、 ノーザンプロット解析により確かめた （図 1 A) 。
図 1 Bは、 BC 1 RNA遺伝子における、 BC 1 RNA転写の調節配列を示している。 様々なエレメントが遺伝子内部とその上流に位置する隣接領域に存在している。 隣接領域には、 BC1 RNA転写を活性化する E2サイ ト （E-bo 配列、 -248) が存 在し、 さらに上流域に存在する BCRE (BCl RNA repressive element, -683) は BCl RNA転写を抑制する。 そのため、 この E2サイ トを含む隣接領域が、 培養 神経系細胞中で効果的かつ選択的に BCl RNAの転写を起こすかどうかを、 次に 検討した。
検討では、 E2サイ トを含むプロモーターを有し、さらに BCl UNA遺伝子の 3' 部分に特異的な tag 配列 （20 塩基長） をつけたレポータープラスミ ド clone K3-tag (図 I B) を細胞に導入した。 そのレポーター遺伝子から新たに合成され た BC1 RNAは、 tag プローブにより、 神経系細胞である NG108-15細胞では検 出されたが、 非神経系細胞の NIH3T3細胞では検出されなかった （図 1 C) 。 こ の結果は、 E2 サイ トを含む本発明のプロモーター配列が、 神経系細胞選択的に 低分子の RNAを転写させることに利用できることを示している。
( 2 ) げっ歯類の神経系細胞中における、 本発明のプロモーターから生じる • s RNAによる遺伝子発現の抑制
本発明のプロモーターを用いた神経系細胞選択的な RNAiの可能性を確かめる ために、 プラスミ ドベクター DNAである pBCl-iベクターを構築した。 pBCl-i ベクターは Pol IIIによる転写に必要な内部プロモーターを含む BC1 RNA構造 遺伝子の 5 ' 側半分の領域およびその上流に存在する転写活性化配列である隣接 領域を有している （-324〜+78) (図 2 A、 B) 。
次に、 BACEl mRNAをターゲットにした短い逆向きのく り返し配列を、 ステ ム付の shRNAを形成するように、 pBCl-iベクターのマルチクローニングサイ ト につなぎ、 pBCl-i/BACElを作製した （図 2 B ) 。 挿入した塩基配列を配列番号 3に記載する。
配列番号 3 ：
GCTTTGTGGAGATGGTGGActtccggtcaTCCACCATCTCCACAAAGC
ここで、 BACE1 は、 全ての組織で発現しているが、 脳で最も高レベルに発現 し、 アルツハイマー病の進行の鍵となる酵素として知られている。 なお、 これま ■ でに、 このターゲット厚己列を二本鎖の siRNA にして、 初代培養ニューロンに導 入すると、 BACE1の発現を効果的に抑制できるということが示されている [11]。 また、 BACE1 を欠損するように改変したマウスや BACE1 をノックダウンした 細胞では、重大な異常性は観察されないと言われている [9-11、 13]。 したがって、 文献に記載のターゲット配列を用いて RNAiにより BACE1をノックダウンさせ た場合は、 BACE1 のノックダウン以外の細胞の異常を考慮する必要が無く、 BACE1の減少のみに注目できると考えられる。
続いて、 NG108-15細胞と NIH3T3細胞について、 pBCl-i/BACElあるいは対 照として pBCl-iベクターを導入し、 細胞内の BACE1タンパク質を検出するた めに抗 BACE1抗体を用いたウェスタンブロット解析を行った。 その結果、 図 2 Cに示すように、 BACE1発現は NG108-15細胞では抑制され たのに対し、 NIH3T3細胞では抑制されなかった。 このことは、 本発明のプロモ 一ターが神経系細胞選択的に機能し、 このプロモータ一を介して転写された転写 産物は siRNAとして効果があることを示している。
次に、 pBCl-i/BACElが、 ラット初代海馬ニューロンでも機能するか否かを調 ベた。 ニューロンに、 pBCl-i/BACElと導入のマーカーとして pEGFP発現べク ターとを共導入した。 GFPを発現している-ユーロンの BACE1タンパク質レべ ルは、 抗 BACE1抗体を用いた免疫蛍光染色で調べた （図 3 ) 。
その結果、 コントロールである pBCl-iベクター （図 3 「CR」 ) を導入した二 ユーロンに比べて、 pBCl-i/BACElを導入したニューロンでは、明らかな BACE1 のタンパク質レベルの減少が観察された。したがって、本発明の RNAiベクター、 pBCl-i/BACElは、 初代海馬ニューロン中で選択的に BACE1の発現を抑制する ことが明らかとなった。 . ( 3 ) ヒ ト神 ¾系細胞における RNAiに対する、 本発明のプロモーターの効果 神経系細胞で選択的に転写される BC1 RNA遺伝子は、 げっ歯類に特異的な遺 伝子である。 そのため、 これまでに、 BC1 RNA遺伝子プロモーターのヒ ト神経 系細胞での活性は調べ れていなかった。 そこで、 本実施例では、 ヒト神経系細 胞である SH-SY5Y細胞における、 本発明のプロモーターの活性を調べることを 目的とした。
図 4 Aに示すように、 BC1 RNAはげつ歯類由来の NG108-15細胞では検出さ れるが、 ヒ ト由来の SH-SY5Y細胞では検出されないことから、 ヒ ト神経系細胞 では、 BC1 RNAが発現していないことが確認された。
次に、 SH-SY5Y細胞に clone K3-tagを導入したところ、 その遺伝子から tag 配列を含む BC1 RNAが転写された （図 4 B) 。 この結果は、 本発明のプロモー ターがヒトの神経系細胞でも機能することを意味している。
さらに、 本発明のプロモーターから転写された: RNAi用の低分子の： RNAが、 SH-SY5Y 細胞でターゲッ ト遺伝子の発現を抑制できるかを調べるために、 SH-SY5Y細胞に pBCl-i/BACElを導入した。
その結果、 BACE1の発現量は、 pBCl-i/BACElを導入した細胞で減少した（図 4 C) 。 このことは、 本発明のプロモーターが、 ヒ ト神経系細胞へも応用できる ことを示しており、 ヒ ト神経系細胞における RNAiにおいても効果が認められる ことを示している。 以上のように、 本実施例では、 本発明のプロモーターは、 げっ歯類の神経系腫 瘍細胞である NG108-15では機能する力 S、げっ歯類の線維芽細胞腫 NIH3T3では 機能しないこと、 そして、 RNAiベクター pBCl-i/BACElは、 NG108-15細胞と 初代海馬ニューロン中で選択的に BACE1 の発現を抑制することを示した （図 1 〜3 ) 。 これらの結果は、 本発明の発現ベクターシステムが、 今後、 げっ歯類で 行われるであろう神経系選択的な RNAiのための遺伝子導入において、 ひとつの 有効なツールとなり、 神経系組織選択的な RNAiの開発に利用されうることを意 味している。. ' 本発明の pBCl-iベクターシステムでは、 BC1 RNAの 5，側の半分と、 ターゲッ ト配列を有する二本鎖の短いヘアピンタイプ RNA (shRNA). との融合型 RNA を生じる。 近年、 tRNA-siRNA の融合転写産物は、 より確実に細胞質に存在し、 U6-siRNAよりも効果的にダイサ一にプロセッシングを受けるということが示さ れている [17]。 ここで、 BC1 RNAは、 脳の細胞質 RNAで、 その 5，側半分の領域 は tRNAAlaに由来している [18]。 したがって、 本発明の pBCl-iベクターシステ ムで生じる融合型 RNAは、 tRNA-siRNAの融合転写産物に相当するものである といえる。 すなわち、 このことは、 pBCl-i/BACElからの低分子の融合型転写産 物と tRNA-siRNAベクターからの低分子の融合型転写産物とのどちらについて も、 転写後のプロセッシングには同様なメカニズムが施されることを示唆してい る。 なお、 r»BCl-i/BACElからの融合型転写産物を発現している細胞は、 BACE1 発現の減少を除いては何も異常は見られなかった。
興味深いことに、 本発明のプロモーターはヒ トの神経芽腫である SH-SY5Y細 胞においても活性を持ち、 pBCl-i/BACElを導入した細胞では BACE1発現が抑 制された（図 4 ) 。 このことは、げっ歯類とヒ トの神経系培養細胞では、 BC1 RNA の転写のために同様な因子が使われていることを示唆している。 したがって、 本 発明のベクターを基にした RNAiシステムは、疾病の治療法に有用である。なお、 霊長類の脳では、 BC200 NAが、 神経系細胞特異的に： Pol IIIで転写されている [19]。 し力、し、 BC200 RNAの転写調節機構についてはよくわかっていない。 本 発明のベクターシステムを BC200 RNAに応用することで、 霊長類で働くベクタ 一を基にした、 もうひとつの siRNA転写システムを作り上げることが可能にな るだろう。 産業上の利用の可能性 - 本発明により、 神経系細胞選択的に RNAを発現させるプロモーター、 神経系 細胞に選択的に: RNAを発現させるベクターおよび神経系細胞選択的に RNAを発 現させる方法が提供される。
本発明により、 神経系細胞に選択的に RNAを発現させることができる。 した がって、 例えば、 RNAiに用いられる siRNA、 shRNAといつた低分子 RNAを神 経系細胞に発現させることにより、 神経系細胞特異的に RNAiを誘導することが できる。 また、 アブタマ一などの機能的な RNAを神経系細胞に特異的に発現さ せることにより、 神経系細胞のタンパク質の機能解析を行うことができる。 また、 本発明はげつ歯類だけでなく、 ヒ ト由来の細胞においても適用できるた め、 種々の神経系細胞におけるタンパク質の機能的解析や創薬研究に役立てるこ とができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 3 ：合成 DNA 配列番号 8 ：プライマー
配列番号 9 ：プライマー 参考文献
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Claims

請 求 の 範 囲
1 . BCl RNA遺伝子の塩基配列において BCl RNA遺伝子の上流に位置する E2サイ トから BC1 RNA遺伝子中の内部プロモーター配列までを含むポリ ヌクレオチドからなるプロモーター。
2 . BCl RNA遺伝子の塩基配列において少なくとも- 324番目から +78番目の 塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるプロモーター。
3 . 以下の (a)または (b)のポリヌクレオチドからなるプロモーター。
(a) 配列番号 2で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b) 配列番号 2で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレ ォチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオ チド
4 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のプロモーターを含むベクター。 .
5 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のプロモーターの発現制御下に神経系 細胞選択'的に UNA を発現させるように外来性ポリヌクレオチドを連結さ せたベクター。
6 . RNAが低分子 RNAである、 請求項 5に記載のベクター。
7 . 低分子 RNAが、 ァプタマ一、 shRNA、 siRNAおよびマイクロ RNAから なる群から選択されるいずれか 1つである、 請求項 6に記載のベクター。
8 . 神経系細胞がヒ ト由来の神経系細胞またはげつ歯類由来の神経系細胞であ る、 請求項 5に記載のベクター。
9 . RNA干渉に用いられる請求項 4または 5に記載のベクター。
1 0 . 請求項 4または 5に記載のベクターが導入された形質転換体。
1 1 . 神経系細胞である、 請求項 1 ◦に記載の形質転換体。
1 2 . 神経系細胞がヒ ト由来の神経系細胞またはげつ歯類由来の神経系細胞で ある、 請求項 1 1記載の形質転換体。
1 3 . 請求項 4または 5に記載のベクターを神経系細胞に導入することを含む、 神経系細胞選択的に RNAを発現させる方法。
1 4 . RNAが低分子 RNAである、 請求項 1 3に記載の方法。
1 5 . .低分子 RNAが、 ァプタマ一、 shRNA、 siRNAおよびマイクロ RNAから なる群から選択されるいずれか 1つである、 請求項 1 4に記載の方法。
1 6 . 神経系細胞がヒ ト由来の神経系細胞またはげつ歯類由来の神経系細胞で ある、 請求項 1 3に記載の方法。
1 7 . 請求項 4または 5に記載のベクターを神経系細胞に導入し、 shRNAまた は siRNAを神経系細胞選択的に発現させることを含む、 RNA干渉方法。
1 8 . 神経系細胞がヒ ト由来の神経系細胞またはげつ歯類由来の神経系細胞で ある、 請求項 1 7に記載の方法。
1 9 . 請求項 4または 5に記載のベクターが導入された ES細胞。
2 0 . 請求項 4または 5に記載のベクターが導入されたトランスジエニック非 ヒ ト哺轧動物。 .
2 1 . 請求項 1 9に記載の ES細胞から発生させた、請求項 2 0に記載のトラン スジエニック非ヒ ト哺乳動物。
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