WO2006125714A2 - Allele des opca-gens aus coryneformen bakterien - Google Patents

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WO2006125714A2
WO2006125714A2 PCT/EP2006/062010 EP2006062010W WO2006125714A2 WO 2006125714 A2 WO2006125714 A2 WO 2006125714A2 EP 2006062010 W EP2006062010 W EP 2006062010W WO 2006125714 A2 WO2006125714 A2 WO 2006125714A2
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amino acid
acid sequence
seq
polypeptide
proteinogenic
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PCT/EP2006/062010
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French (fr)
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Natalie Schischka
Brigitte Bathe
Georg Thierbach
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Evonik Degussa Gmbh
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Priority to AT06777211T priority patent/ATE530568T1/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan

Definitions

  • the invention relates to mutants and alleles of the opcA gene coding for variants of the OpcA subunit of glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC: 1.1.1.49) and to methods for the preparation of amino acids, in particular L-lysine and L-tryptophan using of bacteria that contain these alleles.
  • Amino acids are used in human medicine, in the pharmaceutical industry, in the food industry and especially in animal nutrition.
  • Process improvements may include fermentation measures such as stirring and oxygen supply, or nutrient media composition, such as sugar concentration during fermentation, or product form processing by, for example, ion exchange chromatography or the intrinsic performance characteristics of the microorganism itself.
  • Microorganisms are used methods of mutagenesis, selection and mutant selection. In this way, one obtains strains that are resistant to antimetabolites or auxotrophic for regulatory metabolites and produce the amino acids.
  • One known antimetabolite is the lysine analog S- (2-aminoethyl) -L-cysteine (AEC).
  • the nucleotide sequence of the Corynebacterium glutamicum glucose-6-phosphate dehydrogenase OpcA subunit gene is described, inter alia, in the National Library of Medicin's National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) database (Bethesda, MD, USA) under the number AX121828. It can furthermore be taken from the patent application EP1108790 as Sequence No. 1744.
  • Wild-type gene as shown in the NCBI database in SEQ ID NO: 1 and the resulting amino acid sequence of the encoded glucose-6-phosphate dehydrogenase in SEQ ID NO: 2 and 4.
  • SEQ ID NO: 3 upstream and downstream nucleotide sequences are additionally indicated.
  • the inventors have set themselves the task of providing improved strains of microorganisms which produce increased amounts of amino acids, in particular L-lysine and L-tryptophan.
  • the invention relates to mutants of coryneform bacteria which are produced in vitro and / or in vivo and which preferentially excrete amino acids and which contain a gene or allele which codes for the OpcA subunit of glucose-6-phosphate dehydrogenase. characterized in that the amino acid sequence of the polypeptide contains amino acids individually or jointly selected from the group consisting of
  • the amino acid L-histidine is preferred, at position 219 the amino acid L-asparagine, at position 233 the amino acid L-serine and at position 261 the amino acid L-histidine.
  • the polypeptide contained in the mutants of the present invention may also be referred to as OpcA polypeptide, glucose-6-phosphate dehydrogenase OpcA polypeptide, glucose-6-phosphate dehydrogenase OpcA subunit, or OpcA polypeptide subunit become.
  • the OpcA polypeptide is also referred to as "glucose 6-phosphate dehydrogenase assembly protein".
  • the genus Corynebacterium is preferred. Particularly preferred
  • Amino acid segregating strains based on the following types:
  • Corynebacterium efficiens such as the strain DSM44549,
  • Corynebacterium glutamicum such as strain ATCC13032,
  • thermoaminogenes such as strain FERM BP-1539, and
  • Corynebacterium ammoniagenes such as strain ATCC6871, the species Corynbacterium glutamicum being most preferred.
  • Corynebacterium glutamicum Some representatives of the species Corynebacterium glutamicum are also known in the art under other species. These include, for example:
  • ATCC American Type Culture Collection
  • DSM German Collection of Microorganisms and Cell Cultures
  • FERM European Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • Proteinogenic amino acids are the amino acids found in natural proteins, ie proteins of microorganisms, plants, animals and humans. These include in particular
  • Amino acids selected from the group consisting of L-aspartic acid, L-asparagine, L-threonine, L-serine, L-glutamic acid, L-glutamine, glycine, L-alanine, L-cysteine, L-valine, L-methionine, L- Isoleucine, L-leucine, L-tyrosine, L-phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophan, L-proline and L-arginine.
  • the L-amino acids also include L-homoserine.
  • the mutants according to the invention preferably excrete said proteinogenic amino acids, in particular L-lysine and L-tryptophan.
  • amino acids also includes their salts such as the lysine monohydrochloride or lysine sulfate in the case of the amino acid L-lysine.
  • the invention furthermore relates to mutants of coryneform bacteria which contain an opcA allele which codes for an OpcA polypeptide which comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2, which contains one or more of the amino acid substitutions selected from the group:
  • L-tyrosine is replaced by another proteinogenic amino acid, preferably L-histidine,
  • L-lysine is replaced with another proteinogenic amino acid, preferably L-asparagine,
  • L-proline is replaced by another proteinogenic amino acid, preferably L-serine, and
  • L-tyrosine is replaced with another proteinogenic, preferably L-histidine, amino acid.
  • the invention furthermore relates to mutants of coryneform bacteria which contain an opcA allele which codes for an OpcA polypeptide, which is characterized in that the amino acid sequence of the polypeptide has one or more of the amino acids selected from the group:
  • the allele comprises a nucleotide sequence identical to the nucleotide sequence of a polynucleotide obtainable by a polymerase chain reaction (PCR) using a primer pair each having at least 15 contiguous nucleotides selected from the nucleotide sequence between position 1 and 334 of SEQ ID NO: 3 and selected from the complementary nucleotide sequence between position 1600 and 1292 of SEQ ID NO: 3.
  • PCR polymerase chain reaction
  • An example of such a primer pair is the primer pair opcA-Al and opcA-El shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12.
  • Chromosomal DNA of coryneform bacteria which have been treated in particular with a mutagen, is preferred as the starting material ("template" DNA).
  • the chromosomal DNA of the genus Corynebacterium is particularly particularly preferably of the species Corynebacterium glutamicum.
  • the invention further provides mutants of coryneform bacteria containing an opcA allele encoding an OpcA polypeptide comprising an amino acid sequence 319 L-amino acid in length, wherein the amino acid sequence of the polypeptide comprises one or more of the amino acids from the group:
  • the invention furthermore relates to mutants of coryneform bacteria which contain an opcA allele which contains the amino acid sequence corresponding to position 107 to 261 of SEQ ID NO: 6 for an OpcA polypeptide which, at position 107 to 261 of the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of the encoded polypeptide comprises an amino acid sequence corresponding to positions 98 to 270 of SEQ ID NO: 6 or positions 83 to 285 of SEQ ID NO: 6 or positions 63 to 305 of SEQ ID NO: 6 or positions 38 to 315 of SEQ ID NO: 6 or positions 8 to 315 of SEQ ID NO: 6 or positions 2 to 315 of SEQ ID NO: 6 or positions 2 to 317 of SEQ ID NO: 6 or positions 2 to 319 of SEQ ID NO: 6
  • the length of the encoded polypeptide comprises 319 amino acids.
  • the invention furthermore relates to mutants of coryneform bacteria which contain an opcA allele which codes for an OpcA polypeptide, the amino acid sequence of the polypeptide having one or more of the amino acids selected from the group:
  • amino acid sequence is also at least 90%, preferably at least 92% or at least 94% or at least 96%, and most preferably at least 97% or at least 98% or at least 99% or 100% identical to the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6 or 2.
  • the invention further provides mutants of coryneform bacteria containing an opcA allele encoding an OpcA polypeptide, wherein the amino acid sequence of the polypeptide comprises one or more of the amino acids selected from the group consisting of
  • any proteinogenic amino acid except L-tyrosine, preferably L-histidine and its nucleotide sequence is also at least 90%, preferably at least 92% or at least 94% or at least 96%, and most preferably at least 97% or at least 98% or at least 99% or 100% identical to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 1.
  • nucleotide sequence of an opcA allele having at least 99% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the nucleotide sequence of this opcA allele in addition to the nucleotide exchanges, has thymine for cytosine at position 319, adenine for cytosine at position 657, cytosine for thymine at position 697, and thymine for cytosine at position 781 (see SEQ ID NO: 5) for cytosine nucleotide substitutions Thymine at position 402 thymine against cytosine at position 600, and guanine against cytosine at position 648 (See SEQ ID NO: 7).
  • guanine versus cytosine at position 648 and comparable formulations - means that the nucleobase guanine present in the wild-type sequence of the coding region at position 648 (see SEQ ID NO: 1) has been replaced by cytosine (See SEQ ID NO : 7).
  • the opcA allele coding for an OpcA polypeptide containing one or more of the amino acid substitutions of the invention contained in the mutants of the present invention may have one (1) or more conservative amino acid substitutions (e.) In addition to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO ) contain.
  • the polypeptide contains at most two (2), at most three (3), at most four (4) or at most five (5) conservative amino acid substitutions.
  • the aromatic amino acids are called conservative substitutions when phenylalanine, tryptophan and tyrosine are interchangeable.
  • the hydrophobic amino acids are called conservative exchanges when leucine, isoleucine and valine are exchanged.
  • the polar amino acids are called conservative exchanges when glutamine and asparagine are interchanged.
  • the basic amino acids are called conservative exchanges when arginine, lysine and histidine are interchanged.
  • the acidic amino acids are called conservative substitutions when aspartic acid and
  • Glutamic acid are exchanged for each other.
  • the hydroxyl-containing amino acids are called conservative substitutions when serine and threonine are interchanged.
  • the invention relates to mutants of coryneform bacteria which contain an opcA allele which codes for an OpcA polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • aminopeptidases the terminal methionine is removed during protein synthesis.
  • the invention also relates to opcA alleles which encode for OpcA polypeptides according to the invention, as shown by way of example as SEQ ID NO: 6, and which contain one or more insertion (s) or deletion (s).
  • the polypeptide contains a maximum of 5, a maximum of 4, a maximum of 3 or a maximum of 2 insertions or deletions of amino acids.
  • mutants of the invention classical in vivo mutagenesis methods can be used with cell populations of coryneform bacteria using mutagenic substances such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethyl methanesulfonate (EMS), 5-bromouracil, or ultraviolet light become.
  • Mutagenesis methods are described, for example, in the Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) or Tosaka et al.
  • Typical mutageneses using MNNG include concentrations of 50 to 500 mg / l or even higher concentrations up to a maximum of 1 g / l, an incubation time of 1 to 30 minutes at a pH of 5.5 to 7.5. Under these conditions, the number of viable cells is reduced by a proportion of about 50% to 90% or about 50% to 99% or about 50% to 99.9% or more.
  • a suitable nutrient medium amino acids, preferably L-lysine or L-tryptophan, excrete.
  • suitable nutrient media and test conditions are described inter alia in US 6,221,636, in US 5,840,551, in US 5,770,409, in US 5,605,818, in US 5,275,940 and in US 4,224,409.
  • suitable robotic systems such as Zimmermann et al. (VDI Reports No. 1841, VDI-Verlag, Dusseldorf, Germany 2004, 439-443) or Zimmermann (Chemie Ingenierieurtechnik 77 (4), 426-428 (2005)) described, numerous mutants can be examined in a short time. In this way, mutants are identified that in comparison to the parent strain or non-mutagenized parent strain increased amino acids in the nutrient medium or in the
  • Excrete cell interior include, for example, those mutants whose amino acid secretion is increased by at least 0.5%.
  • DNA is made available from the mutants or isolated and purified with the aid of the polymerase
  • the DNA is isolated from those mutants which excrete amino acids to an increased extent in comparison to the starting strain or accumulate them in the cell interior.
  • any primer pairs can be selected from the nucleotide sequence located upstream and downstream of the mutation according to the invention and the nucleotide sequence complementary thereto.
  • a primer of a primer pair here preferably comprises at least 15, at least 18, at least 20, at least 21 or at least 5
  • the corresponding second primer of a primer pair comprises at least 15, at least 18, at least 20, at least 21, or at least 24 contiguous nucleotides selected from the complementary nucleotide sequence of position 1600 and 1118 of SEQ ID NO: 3. If amplification of the coding region is desired, the primer pair is preferably selected from the nucleotide sequence between position 1 and 334 of SEQ ID NO: 3 and from the complementary nucleotide sequence between position 1600 and 1292 of SEQ ID NO: 3 selected.
  • the primer pair is preferably selected from the nucleotide sequence between position 335 and 652 of SEQ ID NO: 3 and from the complementary nucleotide sequence between position 1291 and 1118 selected from SEQ ID NO: 3.
  • primer pairs examples include the primer pair opcA-Al and opcA-El reproduced under SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 and the primer pair opcA-intl and opcA-int2 reproduced under SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14.
  • the primer can also be equipped with recognition sites for restriction enzymes, with a biotin group or other accessories as described in the prior art.
  • the total length of the primer is generally at most 30, 40, 50 or 60 nucleotides.
  • thermostable DNA polymerases are used ("template DNA") by amplification by means of PCR
  • template DNA examples of such DNA polymerases are the Taq polymerase from Thermus aquaticus, which is sold, inter alia, by the company Qiagen (Hilden, Germany) Vent polymerase from Thermococcus litoralis, which is sold, inter alia, by the company New England Biolabs (Frankfurt, Germany) or the Pfu polymerase from Pyrococcus furiosus, which is sold, inter alia, by the company Stratagene (La Jolla, USA). Preference is given to polymerases with "proof-reading" activity.
  • Proof-reading activity means that these polymerases are able to detect incorrectly incorporated nucleotides and to remedy the error by repolymerization (Lottspeich and Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Academic Publishing House, Heidelberg, Germany (1998)).
  • Examples of polymerases with "proof-reading” activity are the Vent polymerase and the Pfu polymerase.
  • the conditions in the reaction mixture are set according to the manufacturer.
  • the polymerases are from
  • the manufacturer is generally supplied along with the usual buffer, which typically has concentrations of 10-100 mM Tris / HCl and 6-55 mM KCl at pH 7.5-9.3. Magnesium chloride is added at a concentration of 0.5-10 mM if it is not included in the manufacturer's supplied buffer. Deoxynucleoside triphosphates are also added to the reaction mixture in a concentration of 0.1-16.6 rtiM.
  • the primers are presented in the reaction mixture with a final concentration of 0.1-3 ⁇ M and the template DNA in the optimal case with 10 2 to 10 5 copies. You can also use 10 6 to 10 7 copies.
  • the corresponding polymerase is added to the reaction mixture in an amount of 2-5 units.
  • a typical reaction mixture has a volume of 20-100 ⁇ l.
  • bovine serum albumin Tween-20, gelatin, glycerol, formamide or DMSO may be added to the reaction (Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer - A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory Press, USA 1995).
  • a typical PCR run consists of three different, consecutively repeating ones 7
  • the reaction is started with a temperature increase to 92 0 C - 98 0 C for 4 to 10 minutes to denature the submitted DNA. Then a step to denature the DNA presented followed repeatedly first 10-60 seconds at about 92-98 0 C, then a step for bonding the primer to the introduced DNA 10-60 seconds at a certain temperature depending on the primers (Annealing temperature), which experience has shown to be 5O 0 C to 60 0 C and can be calculated individually for each primer pair, for details of which the skilled artisan of Rychlik et al (Nucleic Acids Research 18 (21): 6409- 6412), followed by a synthesis step for extending the primers presented ("extension") at the respective optimum activity for the polymerase, usually depending on the polymerase in the range of 73 0 C to 67 0 C preferably 72 0 C to 68 0 C.
  • this extension step depends on the performance of the polymerase and the length of the PCR product to be amplified. In a typical PCR, this step takes 0.5-8 minutes, preferably 2-4 minutes. These three steps are repeated 30 to 35 times, optionally up to 50 times. A final “extension” step of 4 - 10 minutes completes the reaction.
  • the polynucleotides prepared in this manner are also referred to as amplicons, the term nucleic acid fragment is also common.
  • nucleotide sequence is entered into a program for the translation of DNA sequence into an amino acid sequence. Suitable programs are for example the
  • Patent program available from patent offices, such as the United States Patent Office (USPTO), or the “Translate Tool” available on the ExPASy Proteomics Server on the World Wide Web (Gasteiger et al., Nucleic Acids Research 31, 3784). 3788 (2003)).
  • mutants are identified whose opcA alleles encode OpcA polypeptides containing the mutations of the invention.
  • the invention accordingly provides a mutant of a coryneform bacterium which is obtainable by the following steps:
  • nucleic acid from d) providing nucleic acid from the mutant obtained in b), e) Preparation of a nucleic acid molecule / amplificate / nucleic acid fragment using the polymerase chain reaction, the nucleic acid from d), and a primer pair consisting of a first primer comprising at least 15 contiguous nucleotides selected from the nucleotide sequence between position 1 and 334 of SEQ ID NO: 3 and a second primer comprising at least 15 contiguous nucleotides selected from the complementary nucleotide sequence between position 1600 and 1292 of SEQ ID NO: 3,
  • mutants generated in this manner typically contain one (1) copy of one of the described opcA alleles.
  • the method described here is likewise the subject of the invention.
  • the coding regions of an opcA allele of a mutant according to the invention are reproduced by way of example in SEQ ID NO: 5.
  • the coding region of the wild-type gene is represented as SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 contains at position 319 to 321 the coding for the amino acid L-tyrosine TAT codon.
  • SEQ ID NO: 5 at position 319 contains the nucleobase cytosine. By this thymine cytosine transition arises at position 319 to 321 coding for the amino acid L-histidine CAT codon.
  • SEQ ID NO: 1 contains at position 655 to 657 the coding for the amino acid L-lysine AAA codon.
  • SEQ ID NO: 5 at position 657 contains the nucleobase cytosine. This adenine cytosine transversion produces the AAC codon coding for the amino acid L-asparagine at positions 655 to 657.
  • SEQ ID NO: 1 contains at position 697-699 the coding for the amino acid L-proline CCA codon.
  • SEQ ID NO: 5 at position 697 contains the nucleobase thymine. By this cytosine thymine transition arises at position 697 to 699 coding for the amino acid L-serine TCA codon.
  • SEQ ID NO: 1 contains at position 781 to 783 the coding for the amino acid L-tyrosine TAT codon.
  • SEQ ID NO: 5 at position 781 contains the nucleobase cytosine. By this thymine cytosine transition arises at position 781 to 783 coding for the amino acid L-histidine CAT codon.
  • Nucleotide sequence contain further base exchanges, which have resulted from the mutagenesis treatment, but do not manifest themselves in an altered amino acid sequence. Such mutations are also referred to in the art as silent or neutral mutations. These silent mutations may also be included in the coryneform bacterium used for the mutagenesis treatment. Examples of such silence
  • Mutations are the cytosine-thymine transition at position 402, the thymine-cytosine transition at position 600 and the guanine-cytosine transversion at position 648 as shown in SEQ ID NO: 7.
  • coryneform bacteria used for the mutagenesis preferably already have the ability to excrete the desired amino acid into the surrounding nutrient medium or fermentation broth or to enrich it in the cell interior.
  • feed back resistant aspartate kinases are aspartate kinases that are less susceptible to inhibition by mixtures of lysine and threonine or mixtures of AECs compared to wild type
  • lysC FBR alleles The genes or alleles coding for these desensitized aspartate kinases are also referred to as lysC FBR alleles.
  • Table 1 describes numerous lysC FBR alleles encoding aspartate kinase variants which have amino acid changes compared to the wild type protein.
  • the coding region of the wild type lysC gene of Corynebacterium glutamicum according to the accession number
  • AX756575 of the NCBI database is shown in SEQ ID NO: 19 and the protein encoded by this gene is shown in SEQ ID NO: 20.
  • L-lysine-secreting coryneform bacteria typically have one or more of the amino acid changes listed in Table 1.
  • lysC FBR alleles The following lysC FBR alleles: lysC A279T (exchange of alanine at position 279 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 for threonine), lysC A279V (exchange of alanine at position 279 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against 4
  • lysC S301F exchange of serine at position 301 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 for phenylalanine
  • lysC T308I exchange of threonine at position 308 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 for isoleucine
  • lysC S301Y Exchange of serine at position 308 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 for tyrosine
  • lysC G345D exchange of glycine at position 345 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 for aspartic acid
  • lysC R320G replacement of arginine at position 320 of the coded
  • Aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against glycine lysC T311I (exchange of threonine at position 311 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 for isoleucine), lysC S381F (replacement of serine at position 381 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against phenylalanine) and lysC S317A (replacement of serine at position 317 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against alanine).
  • lysC FBR Allel lysC T311I exchange of threonine at position 311 of the coded
  • Aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against isoleucine and a lysC FBR allele containing at least one substitution selected from the group A279T (exchange of alanine at position 279 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 for threonine) and S317A (replacement of serine at position 317 of the encoded aspartate kinase protein according to SEQ ID NO: 20 against alanine).
  • lysC FBR allele lysC T311I is included in strain DM1797 deposited with DSMZ under number DSM16833.
  • DM1797 is a mutant of Corynebacterium glutamicum ATCC13032.
  • a lysC FBR allele containing amino acid substitution A279T is included in the mutant deposited with the NRRL under number NRRL B-11474. 5
  • mutant designated DM1825 which contains an opcA allele encoding an OpcA polypeptide at position 107 of the amino acid sequence L-histidine, at position 219 L-asparagine, at position 233 L-serine and at position 261 L-histidine.
  • the nucleotide sequence of the coding region of the opcA allele of mutant DM1825 is shown as SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence of the encoded polypeptide as SEQ ID NO: 8 and 10, respectively.
  • SEQ ID NO: 7 contains at position 319 cytosine instead of thymine, at position 402 thymine instead of cytosine, at position 600 cytosine instead of thymine, at position 648 cytosine instead of guanine, at position 657 cytosine instead of adenine, at position 697 thymine instead of cytosine and at position 781 cytosine instead of thymine.
  • the phrase "at position 648 cytosine instead of guanine" - and comparable formulations - means that the nucleobase guanine present in the wild-type sequence of the coding region at position 648 (see SEQ ID NO: 1) has been replaced by cytosine (See SEQ ID NO: 7 ).
  • upstream and downstream (SEQ ID NO: 7) nucleotide sequences are indicated.
  • L-lysine-secreting coryneform bacteria can be used, which is an attenuated
  • Homoserine dehydrogenase or homoserine kinase or have other properties as known in the art.
  • Cryptophan-producing coryneform bacteria typically have a "feed back" -resistant or desensitized anthranilate synthase.
  • "Feed-back" -resistant anthranilate synthase is understood as meaning anthranilate synthases which have a lower susceptibility to inhibition (5 to 10%, 10% to 15%) compared to wild-type % or 10% to 20%) by tryptophan or 5- Fluorotryptophan (Matsui et al., Journal of Bacteriology 169 (11): 5330-5332 (1987)) or similar analogs.
  • the genes or alleles coding for these desensitized anthranilate synthases are also referred to as trpE FBR alleles. Examples of such mutants or alleles are described, for example, in US Pat. No. 6,180,373 and EP0338474.
  • the mutants obtained show an increased excretion or production of the desired amino acid in a fermentation process compared to the starting strain or parent strain used.
  • the invention also provides an isolated polynucleotide encoding an OpcA polypeptide of glucose-6-phosphate dehydrogenase, characterized in that the amino acid sequence of the polypeptide comprises one or more of the amino acids selected from the group:
  • the polynucleotide according to the invention can be isolated from a mutant according to the invention. 7
  • in vitro methods can be used for the mutagenesis of the opcA gene.
  • isolated polynucleotides which are a coryneform bacterium opcA gene, preferably the wild-type gene described in the prior art
  • Corynebacterium glutamicum subjected to a mutagenic treatment.
  • the isolated polynucleotides may be, for example, isolated total DNA or chromosomal DNA or else amplicons of the opcA gene, which were prepared by means of the polymerase chain reaction (PCR). Such amplicons are also referred to as PCR products; the term nucleic acid fragment is also common.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the skilled artisan will find, inter alia, in the handbook of Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) and Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag , Heidelberg, Germany, 1994). It is also possible to first incorporate the opcA gene to be mutagenized into a vector, for example into a bacteriophage or into a plasmid.
  • Suitable methods for in vitro mutagenesis include Miller's Hydroxylamine treatment (Miller, JH: A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor , 1992), the use of mutagenic oligonucleotides (TA Brown: Genetic Engineering for Beginners, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 and RM Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995)) and the use of a polymerase chain reaction using a DNA polymerase that has a high error rate.
  • a DNA polymerase is, for example, the Mutazyme DNA Polymerase (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, No. 600550) from Stratagene (LaJoIIa, CA).
  • the invention furthermore relates to an isolated polynucleotide which codes for an OpcA polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, which contains one or more of the amino acid substitutions selected from the group:
  • the invention furthermore relates to an isolated polynucleotide which codes for an OpcA polypeptide having an amino acid sequence with a length of 319 Amino acids and this contains one or more of the amino acids selected from the group:
  • the invention furthermore relates to an isolated polynucleotide which codes for an OpcA polypeptide which contains, from position 107 to 261 of the amino acid sequence, the amino acid sequence corresponding to position 107 to 261 of SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequence of the encoded polypeptide comprises an amino acid sequence corresponding to positions 98 to 270 of SEQ ID NO: 6 or positions 83 to 285 of SEQ ID NO: 6 or positions 63 to 305 of SEQ ID NO: 6 or positions 38 to 315 of SEQ ID NO: 6 or positions 8 to 315 of SEQ ID NO: 6 or positions 2 to 315 of SEQ ID NO: 6 or positions 2 to 317 of SEQ ID NO: 6 or positions 2 to 319 of SEQ ID NO: 6
  • the length of the encoded polypeptide comprises 319 amino acids.
  • the invention further relates to an isolated
  • Nucleotide sequence of a polynucleotide obtainable by a polymerase chain reaction (PCR) using the primer pair whose nucleotide sequences each comprise at least 15 contiguous nucleotides selected from the nucleotide sequence between position 1 and 334 of SEQ ID NO: 3 and the complementary nucleotide sequence between Positions 1600 and 1292 of SEQ ID NO: 3 are selected.
  • An example of a suitable primer pair is shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12.
  • Chromosomal DNA of coryneform bacteria which have been treated in particular with a mutagen, is preferred as the starting material ("template" DNA).
  • template DNA is particularly preferred.
  • the chromosomal DNA of the genus Corynebacterium is particularly particularly preferably of the species Corynebacterium glutamicum.
  • the invention furthermore relates to an isolated polynucleotide which hybridizes with the nucleotide sequence complementary to SEQ ID NO: 5 or 7 under stringent conditions and codes for an OpcA polypeptide whose amino acid sequence has one or more amino acids selected from the group: a) at position 107 of the amino acid sequence any proteinogenic amino acid except L-tyrosine, preferably L-histidine,
  • the stringency of the hybridization including the washing steps is influenced or determined by varying the buffer composition, the temperature and the salt concentration.
  • the hybridization reaction is generally performed at relatively low stringency compared to the washing steps (Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
  • a buffer corresponding to 5x SSC buffer at a temperature of about 5O 0 C - 68 0 C are used.
  • probes can also hybridize with polynucleotides which have less than 90% identity to the nucleotide sequence of the probe used. Such hybrids are less stable and are removed by washing under stringent conditions.
  • This can, for example, by lowering the salt concentration to 2x SSC and 0.5x optionally thereafter SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995) can be achieved, with a temperature of about 5O 0 C - 68 0 C, about 52 0 C - 68 0 C, about 54 0 C - 68 0 C, about 56 0 C - 68 0 C, about 58 0 C - 68 0 C, about 6O 0 C - 68 0 C, about 62 0 C - 68 0 C, about 64 0 C - 68 0 C, about 66 0 C - 68 0 C is set.
  • the SSC buffer contains sodium dodecyl sulfate (SDS) at a concentration of 0.1%.
  • polynucleotide fragments By gradually increasing the hybridization temperature in steps of about 1 - 2 0 C of 5O 0 C to 68 0 C polynucleotide fragments can be isolated which at least 90% or at least 91%, preferably at least 92% or at least 93% or at least 94% or at least 95% or at least 96% and most preferably at least 97% or at least 98% or at least 99% identity to the sequence or complementary sequence of the probe used and encode an OpcA polypeptide containing the amino acid exchange of the invention.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide thus obtained is determined by known methods. Further instructions for hybridization are available on the market in the form of so-called kits (eg DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No.
  • the nucleotide sequences thus obtained encode OpcA polypeptides which at least 90% preferably at least 92% or at least 94% or at least 96%, and most preferably at least 97% or at least 98% or at least 99% are identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 2 and one or more of the amino acid substitutions according to the invention.
  • amino acid sequence which is also at least 90%, preferably at least 92% or at least 94% or at least 96%, and most preferably at least 97% or at least 98% or at least 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO : 6 or SEQ ID NO: 2.
  • the invention further relates to an isolated
  • Polypeptide has one or more of the amino acids selected from the group:
  • nucleotide sequence which is also at least 90%, preferably at least 92% or at least 94% or at least 96%, and most preferably at least 97% or at least 98% or at least 99% identical to the nucleotide sequence of SEQ ID NO : 5 or SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 7 An example of a polynucleotide encoding an OpcA polypeptide of the invention having a nucleotide sequence at least 99% identical to that of SEQ ID NO: 5 is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the nucleotide sequence of this opcA allele has, in addition to the nucleotide exchanges, thymine for cytosine at position 319, adenine for cytosine at position 657, cytosine for thymine at position 697, and thymine for cytosine at position 781 (see SEQ ID NO: 5) for cytosine nucleotide substitutions Thymine at position 402, thymine against cytosine at position 600, and guanine against cytosine at position 648 (see SEQ ID NO: 7).
  • nucleobase guanine present in the wild-type sequence of the coding region at position 648 has been replaced by cytosine (see SEQ ID NO: 7).
  • the invention further provides an isolated polynucleotide encoding an OpcA polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the encoded polypeptide contains one (1) or more conservative amino acid substitutions.
  • the polypeptide contains at most two (2), at most three (3), at most four (4) or at most five (5) conservative amino acid substitutions.
  • the invention further provides an isolated polynucleotide encoding an opcA polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 including at least one (1) amino acid extension at the N- or C-terminus.
  • This extension is not more than 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 or 2 amino acids or amino acid residues.
  • the invention also relates to opcA alleles which code for polypeptide variants of SEQ ID NO: 6 which contain one or more insertions or deletions. Preferably, these contain a maximum of 5, a maximum of 4, a maximum of 3 or a maximum of 2 insertions or deletions of amino acids.
  • the invention further relates to an isolated
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, 7 or 9.
  • the subject of the invention is an isolated polynucleotide containing the opcA allele of the mutant DM1825.
  • the invention also provides an isolated polynucleotide comprising part of the coding region of an opcA allele according to the invention, wherein the isolated polynucleotide in each case comprises the part of the coding region comprising one or more of the amino acid substitutions according to the invention.
  • the term "part of the coding region” means that either the start codon (typically ATG or GTG) or the last coding codon (in the present case GTC corresponding to position 955-957 of SEQ ID NO: 5) or both in the isolated polynucleotide are missing ,
  • nucleic acid molecule or DNA fragment comprising at least one amino acid sequence corresponding to positions 98 to 270 of SEQ ID NO: 2, or for at least one amino acid sequence corresponding to positions 83 to 285 of SEQ ID NO: 2, or that for at least one amino acid sequence corresponding to position 63 to 305 of SEQ ID NO: 2, or which encodes at least one amino acid sequence corresponding to positions 38 to 315 of SEQ ID NO: 2, which comprises one or more of the amino acid substitutions selected from the group:
  • Amino acid preferably L-serine
  • Nucleic acid molecules which are suitable for at least one amino acid sequence corresponding to positions 98 to 270 of SEQ ID NO: 6, or at least corresponding to positions 83 to 285 of SEQ ID NO: 6, or at least corresponding to position 7
  • SEQ ID NO: 16 shows the amino acid sequence encoded by this reading frame.
  • Position 10 in SEQ ID NO: 16 corresponds to position 107 of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10.
  • Position 122 in SEQ ID NO: 16 corresponds to position 219 of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10.
  • Position 136 in SEQ ID NO: 16 corresponds to position 233 of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10.
  • Position 164 in SEQ ID NO: 16 corresponds to position 261 of SEQ ID N0: 2, 4, 6, 8 or 10.
  • nucleic acid molecules which have at least one nucleotide sequence corresponding to positions 292 to 810 of SEQ ID NO: 5 or I 1 or at least one nucleotide sequence corresponding to positions 247 to 855 of SEQ ID NO: 5 or I 1 or at least one nucleotide sequence corresponding to positions 187 to 915 of SEQ ID NO: 5 or I 1 or at least one nucleotide sequence corresponding to position 112 to 948 of SEQ ID NO: 5 or 1, or at least one nucleotide sequence corresponding to position 22 to 948 of SEQ ID NO: 5 or 7.
  • the reading frame corresponding to positions 292 to 810 of SEQ ID NO: 5 is shown as SEQ ID NO: 15.
  • the associated coded amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 16.
  • the reading frame corresponding to positions 292 to 810 of SEQ ID NO: 7 is shown as SEQ ID NO: 17.
  • the associated coded amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 18.
  • the reading frames of the invention may further contain one or more mutations resulting in one or more conservative amino acid changes.
  • the mutations preferably lead to a maximum of 4%, to a maximum of 2% or to a maximum of 1% conservative amino acid substitutions.
  • the reading frames of the invention may contain one or more silent mutations.
  • the reading frames according to the invention preferably contain at most 4% and more preferably at most 2% to at most 1% silent mutations.
  • the isolated polynucleotides of the present invention can be used to produce recombinant strains of microorganisms which, in an improved manner, release amino acids into the surrounding medium or accumulate them inside the cell, as compared to the parent strain.
  • a common method for incorporating mutations into genes of coryneform bacteria is that of allele exchange, also known as "gene replacement.”
  • a DNA fragment containing the mutation of interest is transformed into the desired strain of a coryneform bacterium transferred and the mutation by at least two recombination events or "cross over" events in the chromosome of the desired strain incorporated or exchanged existing in the relevant strain sequence of a gene against the mutated sequence.
  • Schwarzer and Pühler used this method to incorporate a lysA allele which was deletion into the C. glutamicum chromosome instead of the wild-type gene. Allele which carried an insert incorporated into the chromosome of C. glutamicum in place of the wild-type gene.
  • Schfer et al. used this method to delineate the homolog operon of C. glutamicum Nakagawa et al (EP 1108790) and Ohnishi et al (Applied Microbiology and Biotechnology 58 (2), 217-223 (2002)) used this method to detect various mutations starting from to incorporate the isolated alleles into the chromosome of C.
  • a polynucleotide according to the invention may be used which comprises the entire coding region, as shown for example in SEQ ID NO: 5 or 7, or which comprises a part of the coding region, such as the nucleotide sequence corresponding to at least the amino acid sequence corresponding to position 98 to 270 of SEQ ID NO: 6 and 8, respectively, and represented as SEQ ID NOS: 15 and 17.
  • the part of the coding region corresponding to at least SEQ ID NO: 15 or 17 has a length of ⁇ 519 nucleobases. Such parts are preferred
  • Coding region whose length is ⁇ 747 nucleobases, such as nucleic acid molecules encoding at least one amino acid sequence corresponding to position from 63 to 305 of SEQ ID NO: 6 or 8, respectively.
  • Very particular preference is given to those parts of the coding region whose length is ⁇ 834 nucleobases, for example nucleic acid molecules which code for at least one amino acid sequence corresponding to the position from 38 to 315 of SEQ ID NO: 6 or 8.
  • the DNA fragment containing the mutation of interest in this method is typically present in a vector, in particular a plasmid, which is preferably not or only to a limited extent replicated by the strain to be mutated.
  • a vector in particular a plasmid, which is preferably not or only to a limited extent replicated by the strain to be mutated.
  • an auxiliary or intermediate host in which the vector is replicable is generally a 4
  • Bacterium of the genus Escherichia preferably of the species Escherichia coli used.
  • plasmid vectors examples include those of Shufer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)) described pK * mob and pK * mobsacB vectors, such as pKl ⁇ mobsacB, and the vectors described in WO 02/070685 and WO 03/014362. These are replicative in Escherichia coli, but not in coryneform bacteria.
  • Particularly suitable vectors are those which contain a conditionally negatively dominant gene such as the sacB gene (levansucrase gene) of, for example, Bacillus or the galK gene (galactose kinase gene) of, for example, Escherichia coli.
  • conditionally negatively dominant gene refers to a gene which, under certain conditions, is, for example, toxic to the host, but under other conditions has no negative effect on the host carrying the gene.
  • These allow selection for recombination events in which the vector is eliminated from the chromosome.
  • Nakamura et al. US Pat. No. 6,303,383 describe a temperature-sensitive plasmid for coryneform bacteria which can only replicate at temperatures below 31 ?? C.
  • the vector is then by conjugation, for example by the method of Schwarzer (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) or transformation, for example, by the method of Dunican and Shivnan (Bio / Technology 7, 1067-1070 (1989)) or the Method of Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)) into the coryneform bacterium.
  • the transfer of the DNA can also be achieved by particle bombardment.
  • Another object of the invention is accordingly a process for the preparation of a coryneform bacterium, wherein
  • iv) at position 261 has another amino acid, preferably L-serine, and 4
  • step c) the coryneform bacterium obtained according to step a) and b) increases.
  • Another inventive method for producing a microorganism is that one
  • step c) increases the microorganism obtained in step a) and b).
  • Microorganisms particularly preferably coryneform bacteria and bacteria of the genus Escherichia, which contain the polynucleotides according to the invention.
  • the invention also relates to microorganisms prepared using the isolated polynucleotides. Such microorganisms or bacteria are also referred to as recombinant microorganisms or recombinant bacteria.
  • vectors containing the polynucleotides of the invention are the subject of the invention.
  • hosts containing these vectors are also the subject of the invention.
  • the isolated polynucleotides of the invention may also be used to obtain overexpression of the polypeptides encoded by them.
  • Overexpression is generally understood to mean an increase in the intracellular concentration or activity of a ribonucleic acid, a protein or an enzyme.
  • N-terminal amino acids in particular the N-terminal methionine, can be cleaved off from the polypeptide formed by host-specific enzymes, so-called aminopeptidases.
  • the said increase in the concentration or activity of a gene product can be achieved, for example, by increasing the copy number of the corresponding polynucleotides by at least one copy.
  • a widely used method for increasing the copy number consists of incorporating the corresponding gene or allele in a vector, preferably a plasmid, which is replicated by a coryneform bacterium.
  • a vector preferably a plasmid, which is replicated by a coryneform bacterium.
  • Suitable plasmid vectors are, for example, pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) or those of Tauch et al. (Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)) described pSELF vectors.
  • Another common method of achieving overexpression is the chromosomal method
  • Gene amplification In this method, at least one additional copy of the gene or allele of interest is inserted into the chromosome of a coryneform bacterium.
  • a C. glutamicum non-replicative plasmid containing the gene of interest is transformed into a coryneform bacterium. After homologous recombination by means of a "cross over" event, the resulting strain contains at least two copies of the gene or allele in question.
  • one or more copies of the gene of interest are inserted into at least two recombination events in a desired location of the C. glutamicum chromosome.
  • a copy of a lysC allele which codes for an L-lysine-insensitive aspartate kinase was incorporated into the gluB gene of C. glutamicum.
  • At least one further copy, preferably in tandem arrangement to the already existing gene or allele, of the at least two recombination events at the natural site incorporated gene of interest was achieved.
  • Another method for achieving overexpression is to link the corresponding gene or allele in a functional manner (operably linked) with a promoter or an expression cassette.
  • Suitable promoters for Corynebacterium glutamicum are described, for example, in the review article by Patek et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311-323 (2003)) Furthermore, the well-known Mann et al. (Gene 69 (2), 301-315 (1988)) and Mann and Brosius (Gene 40 (2-3), 183-190 (1985)) 4
  • Promoters T3, T7, SP6, M13, lac, tac and trc are used.
  • Such a promoter may, for example, be inserted upstream of the coding region of an opcA allele of the invention, typically at a distance of about 1-500 or 1-334 nucleotides from the start codon of a recombinant coryneform bacterium.
  • Such a promoter can of course also be inserted upstream of the opcA allele of a mutant according to the invention. It is furthermore possible to use an isolated polynucleotide according to the invention which is suitable for a variant of the invention
  • OpcA polypeptide encodes to associate with a promoter and incorporate the resulting expression unit into an extrachromosomally replicating plasmid or into the chromosome of a coryneform bacterium.
  • the promoter and regulatory region or ribosome binding site located upstream of the structural gene can be mutated. Measures to extend the lifetime of mRNA also improve expression. Furthermore, by preventing degradation of the enzyme protein, enzyme activity is also enhanced. Alternatively, overexpression of the gene or allele concerned can be achieved by altering the composition of the medium and culture.
  • the activity or concentration of the corresponding protein is generally increased by at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, up to a maximum of 1000 % or 2000%, based on the activity or concentration of the protein in the parent microorganism or parent strain increased.
  • the parent microorganism or parent strain increased under a starting microorganism or
  • Parent strain is understood to be a microorganism on which the measures of the invention are carried out.
  • the concentration of the protein can be monitored by 1- and 2-dimensional protein gel separation and subsequent optical identification of the protein concentration Appropriate evaluation software are determined in the gel.
  • a common method for preparing the protein gels in coryneform bacteria and for identifying the proteins is that described by Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001)).
  • Protein concentration can also be assessed by Western blot hybridization with an antibody specific for the protein to be detected (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2 nd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, ColD Spring Harbor, NY, 1989), and subsequently optical evaluation with corresponding software for concentration determination (Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5: 32-39, Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)).
  • a method according to the invention for overexpression comprises, inter alia, copying the copy number of a polynucleotide according to the invention which codes for an OpcA polypeptide variant with an amino acid sequence which contains one or more of the amino acids selected from the group
  • a further method according to the invention consists in linking a promoter functionally to the polynucleotide.
  • the invention furthermore relates to microorganisms which have an increased concentration of an OpcA polypeptide according to the invention in their cell interior.
  • these microorganisms have an increased activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase in their cell interior.
  • L-amino acids in the mutants or recombinant strains according to the invention one or more enzymes of the respective biosynthetic pathway, glycolysis, anaplerotic, the citric acid cycle, the pentose phosphate cycle, the amino acid export and optionally overexpress regulatory proteins.
  • endogenous genes is generally preferred.
  • endogenous genes or “endogenous nucleotide sequences” is meant the genes or nucleotide sequences or alleles present in the population of a species.
  • a dapA gene coding for a dihydrodipicolinate synthase such as, for example, the wild-type dapA gene of Corynebacterium glutamicum described in EP 0 197 335,
  • a gene encoding a glucose-6-phosphate dehydrogenase such as that described in JP-A-09224661 and US Pat 4
  • EP-A-1108790 describes wild-type zwf gene of Corynebacterium glutamicum
  • a gene pyc coding for a pyruvate carboxylase such as, for example, the wild-type pyc gene of Corynebacterium glutamicum described in DE-A-198 31 609 and EP 1108790,
  • Item 472 indicated.
  • the position 472 of the protein with the N terminal sequence MTA corresponds to the position 455 of the protein with the N-terminal sequence MST according to FIG. 2A.
  • Fig. 2B of WO 02/31158 is further an amino acid substitution D (aspartic acid) against E
  • a lysC FBR allele coding for a feedback-resistant aspartate kinase variant in particular correspondingly
  • a lysE gene coding for a lysine export protein such as, for example, the lysE gene of the wild-type Corynebacterium glutamicum described in DE-A-195 48 222,
  • a gene pgi coding for the glucose-6-phosphate isomerase such as, for example, the pgi gene of Corynebacterium glutamicum described in US Pat. Nos. 6,586,214 and 6,465,238,
  • a gene hom coding for the homoserine dehydrogenase such as, for example, the hom gene of Corynebacterium glutamicum described in EP-A-0131171,
  • thrB a homoserine kinase encoding gene thrB, such as that of Peoples et al. (Molecular Microbiology 2 (1988): 63-72)) of Corynebacterium glutamicum and described thrB gene
  • a gene pfkB coding for the phosphofructokinase such as, for example, the pfkB gene of Corynebacterium glutamicum described in WO 01/00844 (Sequence No. 57),
  • the term "attenuation” in this context describes the reduction or elimination of the intracellular activity of one or more enzymes (proteins) in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example by using a weak promoter or by using a gene or allele, which codes for a corresponding enzyme with a low activity or inactivates the corresponding gene or enzyme (protein) and optionally combines these measures.
  • the activity or concentration of the corresponding protein is generally 0 to 75%, 0 to 50%, 0 to 25%, 0 to 10% or 0 to 5% of the activity or concentration of the wild-type protein, respectively the activity or concentration of the protein in the initial microorganism lowered. 5
  • Transitions, transversions, insertions and deletions of at least one (1) base pair or nucleotide may be considered as mutations for the generation of an attenuation.
  • mutation-induced amino acid exchange on enzyme activity one speaks of missense mutations or nonsense mutations.
  • the missense mutation results in the replacement of a given amino acid in one protein for another, in particular a non-conservative amino acid substitution.
  • the functionality or activity of the protein is impaired and reduced to a value of 0 to 75%, 0 to 50%, 0 to 25%, 0 to 10% or 0 to 5%.
  • the nonsense mutation leads to a stop codon in the
  • the isolated coryneform bacteria obtained by the measures of the invention show an increased excretion or production of the desired amino acid in a fermentation process compared to the starting strain or parent strain used.
  • Isolated bacteria are to be understood as meaning the mutants according to the invention and recombinant bacteria, in particular coryneform bacteria, which contain an opcA allele which codes for an OpcA polypeptide having one or more of the described amino acid exchanges at position 107, 219 , 233 and 261.
  • the performance of the isolated bacteria or fermentation process using the same with respect to one or more of the parameters selected from the group of product concentration (product per volume), product yield (product formed per carbon source consumed), and product formation (product formed per volume and time) or other process parameters and combinations thereof, is at least 0.5%, at least 1%, at least 1.5% or at least 2% based on the parent strain or parent strain or the fermentation process using the same improved.
  • the isolated coryneform bacteria according to the invention can be used continuously - as in the
  • PCT / EP2004 / 008882 described or batchwise in the batch process (sentence cultivation) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) are cultivated for the purpose of producing L-amino acids.
  • a general summary of well-known cultivation methods can be found in the textbook by Chmiel (Bioprocess Engineering 1. Introduction to Bioprocess Engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (Bioreaktoren und peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).
  • the culture medium or fermentation medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of
  • Culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology, of the American Society for Bacteriology (Washington, DC, USA, 1981).
  • the terms culture medium and fermentation medium or medium are mutually exchangeable.
  • sugars and carbohydrates such as e.g. Glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, sucrose-containing solutions from sugar beet or cane production, starch, starch hydrolyzate and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid , Stearic and linoleic acids, alcohols such as glycerin, methanol and ethanol, and organic acids such as acetic acid. These substances can be used individually or as a mixture.
  • sugars and carbohydrates such as e.g. Glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, sucrose-containing solutions from sugar beet or cane production, starch, starch hydrolyzate and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid , Stearic and lin
  • organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate may be used.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • phosphorus source can phosphoric acid
  • the culture medium must further contain salts, for example, in the form of chlorides or sulfates of metals such as sodium, potassium, magnesium, calcium and iron, such as magnesium sulfate or ferric sulfate, necessary for growth.
  • salts for example, in the form of chlorides or sulfates of metals such as sodium, potassium, magnesium, calcium and iron, such as magnesium sulfate or ferric sulfate, necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids such as homoserine and vitamins such as thiamine, biotin or pantothenic acid in addition to the above substances can be used.
  • suitable precursors of the respective amino acid can be added to the culture medium.
  • the said feedstocks may be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in a suitable manner during the cultivation.
  • pH control of the culture basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid are suitably used.
  • the pH is generally adjusted to a value of 6.0 to 9.0, preferably 6.5 to 8.
  • antifoams such as, for example, fatty acid polyglycol esters, can be used.
  • suitable selective substances such as antibiotics, may be added to the medium.
  • Oxygen-containing gas mixtures such as air entered into the culture.
  • the use of liquids enriched with hydrogen peroxide is also possible.
  • the fermentation at elevated pressure, for example at a pressure of 0.03 to 0.2 MPa, driven.
  • the temperature of the culture is normally from 2O 0 C to 45 0 C and preferably at 25 0 C to 40 0 C.
  • the cultivation is continued until a maximum of the desired amino acid has formed. This goal is usually 5
  • Suitable fermentation media are described inter alia in US 6,221,636, in US 5,840,551, in US 5,770,409, in US 5,605,818, in US 5,275,940 and in US 4,224,409.
  • L-amino acids Methods for the determination of L-amino acids are known from the prior art.
  • the analysis may be as described by Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) described by anion exchange chromatography followed by ninhydrin derivatization, or it can be done by reversed phase HPLC, as in Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).
  • the invention accordingly provides a process for the preparation of an L-amino acid in which
  • the fermentation broth prepared in this way is then collected and preferably further processed to a solid or liquid product.
  • a fermentation broth is understood to mean a
  • Fermentation medium in which a microorganism has been cultured for a certain time and at a certain temperature.
  • the fermentation medium or the medium used during the fermentation contains / contain all substances or components which ensure an increase of the microorganism and a formation of the desired amino acid.
  • the resulting fermentation broth accordingly contains a) the biomass of the microorganism resulting from the multiplication of the cells of the microorganism, b) the desired amino acid formed during the fermentation, c) the organic by-products formed during the fermentation and d) the by the fermentation unused components of the fermentation medium used /
  • Fermentation media or the starting materials such as vitamins such as biotin, amino acids such as homoserine or salts such as magnesium sulfate.
  • the organic by-products include substances which are optionally produced by the microorganisms used in the fermentation next to the respective desired L-amino acid and optionally excreted. These include L-amino acids, which in comparison to 5
  • desired amino acid less than 30%, 20% or 10%.
  • organic acids which carry one to three carboxyl groups such as acetic acid, lactic acid, citric acid, malic acid or fumaric acid.
  • sugar such as trehalose.
  • Typical industrial fermentation broths have an amino acid content of 40 g / kg to 180 g / kg or 50 g / kg to 150 g / kg.
  • the content of biomass (as dried biomass) is generally 20 to 50 g / kg.
  • a group of products containing L-lysine comprises concentrated, aqueous, alkaline solutions of purified L-lysine (EP-B-0534865).
  • Another group as described, for example, in US Pat. Nos. 6,340,486 and 6,465,025, comprises aqueous, acidic, biomass-containing concentrates of L-lysine-containing fermentation broths.
  • the most common group of solid products comprises powdered or crystalline forms of purified or pure L-lysine, which is typically in the form of a salt such as L-lysine monohydrochloride.
  • Another group of solid product forms is described for example in EP-B-0533039. The one described there
  • the product form contains most of the starting materials used and not consumed during the fermentative production and, if appropriate, the biomass of the microorganism used with a proportion of> 0% to 100%.
  • EP-B-0534865 describes a process for preparing aqueous, basic L-lysine-containing solutions from fermentation broths. In the process described there, the biomass is separated from the fermentation broth and discarded.
  • a base such as sodium, potassium or
  • Ammonium hydroxide is adjusted to a pH between 9 to 11.
  • the mineral components inorganic salts are separated from the broth after concentration and cooling by crystallization and either used as fertilizer or discarded.
  • the biomass can be completely or partially removed from the fermentation broth by separation methods such as, for example, centrifugation, filtration, decanting or a combination thereof or left completely in it.
  • the biomass or the biomass-containing fermentation broth is inactivated during a suitable process step, for example by thermal treatment (heating) or by acid addition.
  • the chemical constituents of the biomass include the cell envelope, for example the peptidoglycan and the arabinogalactan, the protein or polypeptide, for example the glucose-6-phosphate dehydrogenase polypeptide, lipids and phospholipids and nucleic acids (DNA and RNA), for example polynucleotides containing the inventive mutation.
  • nucleic acids are typically in the form of fragments having a length of, inter alia, ⁇ 40-60 bp,> 60-80 bp,> 80
  • the biomass is completely or almost completely removed so that no (0%) or at most 30%, at most 20%, at most 10%, at most 5%, at most 1% or at most 0.1% biomass remains in the product produced.
  • the biomass is not removed or only in minor proportions, so that all (100%) or more than 70%, 80%, 90%, 95%, 99% or 99.9% biomass remains in the product produced. Accordingly, in a method according to the invention, the biomass is removed in proportions of ⁇ 0% to ⁇ 100%.
  • the fermentation broth obtained after the fermentation can be adjusted to an acidic pH before or after complete or partial removal of the biomass with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid or organic acid such as propionic acid (GB 1,439,728 or EP 1,331,220 ). It is also possible the fermentation broth with the completely contained Acidify biomass (US 6,340,486 or US 6,465,025). Finally, the broth may also be stabilized by the addition of sodium bisulfite (NaHSO 3 , GB 1,439,728) or another salt, for example, ammonium, alkali or alkaline earth salt of the sulfurous acid.
  • an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid or organic acid such as propionic acid
  • an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid or organic acid such as propionic acid
  • the fermentation broth with the completely contained Acidify biomass US 6,340,486 or US 6,465,025
  • organic or inorganic solids are partially or completely removed.
  • Components of the fermentation medium remain at least partially (> 0%), preferably at least 25%, more preferably at least 50% and most preferably at least 75% in the product. If appropriate, these also remain completely (100%) or almost completely ie> 95% or> 98% in the product. In this sense, the term means
  • Frermentation broth base means that a product contains at least part of the constituents of the fermentation broth.
  • the broth is withdrawn or thickened or concentrated by known methods, for example by means of a rotary evaporator, thin-film evaporator, falling-film evaporator, by reverse osmosis or by nanofiltration.
  • This concentrated fermentation broth can then be worked up by freeze-drying, spray-drying, spray granulation or other methods, for example in the circulating fluidized bed according to PCT / EP2004 / 006655, into free-flowing products, in particular a finely divided powder or preferably coarse-grained granules.
  • a desired product is isolated from the resulting granules by sieving or dust separation. It is also possible to dry the fermentation broth directly ie without prior concentration by spray drying or spray granulation.
  • free-flowing refers to powders that consist of a series of glass discharge vessels of different sizes
  • Outlet openings leak at least from the vessel with the opening 5 mm (millimeters) unhindered (small: soaps, oils, fats, waxes 94, 12 (1968)).
  • finely divided is meant a powder with a predominant proportion (> 50%) of a particle size of 20 to 200 ⁇ m in diameter.
  • coarse-grained is meant a product having a predominant proportion (> 50%) of a particle size of 200 to 2000 ⁇ m in diameter.
  • the particle size can be determined by methods of
  • the free-flowing, finely divided powder can in turn be converted by suitable compacting or granulation process into a coarse-grained, free-flowing, storable and substantially dust-free product.
  • dust-free means that the product contains only small amounts ( ⁇ 5%) of particle sizes smaller than 100 ⁇ m in diameter.
  • Product which is at least one (1) year or longer, preferably at least 1.5 years or longer, more preferably two (2) may be stored for years or more in a dry and cool environment without substantial loss ( ⁇ 5%) of the particular amino acid.
  • Another object of the invention is accordingly a process for the preparation of an L-amino acid, preferably L-lysine or L-tryptophan, containing product, preferably animal feed additive, from fermentation broths, characterized by the steps
  • step b) or c) an acid selected from the group sulfuric acid, phosphoric acid or hydrochloric acid is added.
  • step a) or b) water is removed from the L-amino acid-containing fermentation broth (concentration).
  • auxiliaries such as starch, gelatin, cellulose derivatives or similar substances, such as are commonly used in food or feed processing as binders, gelling or thickening agents, or of other substances such as silicas, silicates (EP0743016A) stearates.
  • oils mineral oils, vegetable oils or mixtures of vegetable oils can be used. Examples of such oils are soybean oil, olive oil, soybean oil / lecithin mixtures. In the same way are too
  • the treatment of the surfaces with the oils mentioned achieves an increased abrasion resistance of the product and a reduction in the dust content.
  • the content of oil in the product is 0.02 to 2.0 wt .-%, preferably 0.02 to 1.0 wt .-%, and most preferably 0.2 to 1.0 wt .-% based on the Total amount of feed additive.
  • the proportion of dust, ie particles with a particle size ⁇ 100 ⁇ m, is preferably> 0 to 1% by weight, more preferably at most 0.5% by weight. 5
  • the product can also be applied to a known and customary in animal feed processing organic or inorganic carrier such as silicas, silicates, shot, bran, flours, starches sugar or other and / or with conventional
  • Thickening or binding agents are mixed and stabilized. Application examples and processes for this purpose are described in the literature (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, page 817).
  • the corresponding amino acid can be added during the process in the form of a concentrate or, if appropriate, a substantially pure substance or its salt in liquid or solid form. These can be added individually or as mixtures to the obtained or concentrated fermentation broth, or also during the drying or granulation process.
  • the ratio of the ions is preferably adjusted so that the ionic ratio according to the following formula
  • the fermentation broth-based solid product thus prepared has a lysine content (as lysine base) from 10 wt% to 70 wt% or 20 wt% to 70 wt%, preferably 30 wt% to 70 wt% and most preferably 40 wt% % to 70 wt .-% based on the dry matter of the product.
  • a lysine content from 10 wt% to 70 wt% or 20 wt% to 70 wt%, preferably 30 wt% to 70 wt% and most preferably 40 wt% % to 70 wt .-% based on the dry matter of the product.
  • Maximum levels of lysine base of 71% by weight, 72% by weight, 73% by weight are also possible.
  • the fermentation broth-based solid product thus prepared has an amino acid content of at least 5% by weight, 10% by weight, 20% by weight, 30% by weight and maximum 50% by weight, 60% by weight, 70% by weight, 80% by weight, 90% by weight or up to 95% by weight.
  • the water content of the solid product is up to 5 wt .-%, preferably up to 4 wt .-%, and particularly preferably less than 3 wt .-%.
  • the subject of the invention is therefore also a fermentation broth-based feed additive containing L-lysine, which has the following features
  • the invention furthermore also provides a fermentation-broth-based feed additive containing L-tryptophan, which has the following features
  • the mutant Corynebacterium glutamicum DM1825 of the present invention containing L-histidine at position 107, L-lysine at position 219, L-proline at position 233 and L-tyrosine at position 261 of the amino acid sequence of the OpcA polypeptide was incorporated on April 5, 2005 the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) as DSM 17223 deposited.
  • the Corynebacterium glutamicum strain DM1797 was used as a starting strain for N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) mutagenesis.
  • the strain DM1797 is an aminoethylcysteine-resistant mutant of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 and deposited under the name DSM16833 in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany).
  • strain DM1797 was dissolved in 10 ml LB-Bouillon (Merck, Darmstadt, Germany), which were contained in a 100 ml Erlenmeyer flask for 24 hours at 33 0 C and 200 rpm on a rotary shaker of the type Certomat BS-I (B Braun Biotech International, Melsungen,
  • the cell suspension was then diluted 1: 1000, 1: 10000 and 1: 100000 with 0.9% NaCl solution and aliquots plated on brain-heart agar (Merck, Darmstadt, Germany). In this way, about 2500 mutants were isolated.
  • the clones were initially propagated on brain heart agar plates (Merck, Darmstadt, Germany) for 24 hours at 33 0 C. Starting from these agar plate cultures, one preculture was in each case inoculated (10 ml of medium in the 100 ml Erlenmeyer flask). The medium MM was used as medium for the preculture. The preculture was incubated for 24 hours at 33 ° C. and 240 rpm on a shaker. From this preculture, a major culture was inoculated so that the initial OD (660 nm) of the major culture was 0.1 OD. The medium MM was also used for the main culture.
  • CSL Corn Steep Liquor
  • MOPS morpholinopropanesulfonic acid
  • saline solution was adjusted to pH 7 with ammonia water and autoclaved. Subsequently, the sterile substrate and vitamin solutions as well as the dry autoclaved CaCO 3 were added.
  • Culturing was done in volumes of 10 ml contained in 100 ml baffled Erlenmeyer flasks. The temperature was at 33 0 C, the number of revolutions was 250 rpm and the humidity 80%.
  • the optical density (OD) was determined at a measuring wavelength of 660 nm with the Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Kunststoff).
  • the amount of lysine formed was determined using an amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany)
  • Clone DM1825 was isolated by the method of Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) isolated chromosomal DNA. By means of the polymerase chain reaction, a DNA segment carrying the opcA gene was amplified. For this purpose, the following oligonucleotides were used as primers:
  • opcA-Al (SEQ ID NO: 11): 5 S cacctggcgc aggccataat 3 S
  • opcA-El (SEQ ID NO: 12): 5 S cgcgtgcgcg tactacatca 3 S
  • the primers shown were synthesized by the company MWG Biotech (Ebersberg, Germany). They allow the amplification of a ca. 1.05 kb DNA segment carrying the opcA gene.
  • the primer opcA-Al binds to the region corresponding to position 302 to 321 of the strand complementary to SEQ ID NO: 3.
  • the primer opcA-El binds to the region corresponding to position 1335 to 1316 of the strand according to SEQ ID NO: 3.
  • the PCR reaction was carried out with the Phusion High Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt, Germany).
  • the reaction mixture was prepared according to the manufacturer and contained at 50 ul total volume 10 ul of the supplied 5 x Phusion HF buffer, deoxynucleoside triphosphates in a concentration of 200 uM, primer in a concentration of 0.5 uM, about 50 ng template DNA and 2 units Phusion polymerase. By adding H2O, the volume was adjusted to 50 ⁇ l.
  • the PCR approach was first subjected to preliminary denaturation at 98 ° C. for 30 seconds. This was followed 35x repetitively denaturation step at 98 0 C for 20 seconds, a step for binding the primer to the submitted DNA at 6O 0 C for 20 seconds and the 7
  • Extension step to extend the primers at 72 0 C for 60 seconds. After the final extension step for 5 minutes at 72 ° C., the PCR mixture was subjected to agarose gel electrophoresis (0.8% agarose). A DNA fragment of about 1.85 kb in length was identified, isolated from the gel and purified using the QIAquick Gel Extraction Kit from Qiagen, (Hilden, Germany).
  • the nucleotide sequence of the amplified DNA fragment or PCR product was determined by Agowa (Berlin, Germany). The obtained sequence of
  • Coding region of the opcA allele is shown in SEQ ID NO: 7.
  • amino acid sequence of the corresponding glucose-6-phosphate dehydrogenase protein resulting from the program Patentin is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the nucleotide sequence of the coding region of the opcA allele of mutant DM1825 contains cytosine at position 319, cytosine at position 657, thymine at position 697 and cytosine at position 781 (See SEQ ID NO: 5).
  • the wild-type gene (see SEQ ID NO: 1) contains at position 319 thymine, at position 657 adenine, at position 697 cytosine and at position 781 thymine.
  • opcAYl07H opcAK219N
  • opcAP233S opcAY26lH.
  • opcA allele of DM1825 contains three additional nucleotide exchanges at positions 402, 600 and 648 (see SEQ ID NO: 7), which do not result in an amino acid exchange ("silent mutations").
  • the polymerase chain reaction amplified a fragment containing the coding region of the opcA allele carrying the mutations opcAYl07H, opcAK219N, opcAP233S and opcAY26lH.
  • the template used was the chromosomal DNA obtained in Example 3.
  • the oligonucleotides used in Example 3 opcA-Al (SEQ ID NO: 11) and opcA-EL (SEQ ID NO: 12) were selected.
  • the PCR reaction was performed with Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt, Germany). The reaction had the composition described above. The PCR was carried out with one exception as above: the 72 ° C extension step in the 35-fold repetition was performed for each 30 seconds only.
  • Plasmid DNA was isolated from a transformant using the QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen (Hilden, Germany) and checked by treatment in each case once with the restriction enzyme BamHI and once with the restriction enzyme EcoRI with subsequent agarose gel electrophoresis (0.8%) , The plasmid was designated pCRII_opcAaa4ex and is shown in FIG.
  • the plasmid was treated with the restriction endonuclease EcoRI and electrophoresed in 0.8% Agarose gel separated. The fragment, about 1.05 kb in size, was then isolated from the gel and purified with the QIAquick Gel Extraction Kit from Qiagen.
  • the thus purified DNA fragment contains the described mutations in opcA and has EcoRI compatible ends (opcAaa4ex fragment). It was subsequently used in Schfer et al. (Gene, 145, 69-73 (1994), mobilizable vector pKl ⁇ mobsacB incorporated to form an allele, respectively
  • pKl ⁇ mobsacB was digested with the restriction enzyme EcoRI and the ends were dephosphorylated with alkaline phosphatase (alkaline phosphatase, Boehringer Mannheim, Germany).
  • the prepared vector was mixed with the opcAaa4ex fragment and the batch was treated with the Ready-To-Go T4 DNA ligase kit (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany).
  • E. coli strain S17-1 (Simon et al., Bio / Technology 1: 784-791, 1993) was transformed with the ligation mixture (Hanahan, In. DNA cloning, A practical approach., Vol CoId Spring Habor, New York, 1989). Selection for plasmid-carrying cells was made by plating out the transformation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2 nd Ed Cold Spring Habor, New York, 1989..), The mg with 25/1 kanamycin had been supplemented.
  • Plasmid DNA was isolated from a transformant using the QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen and checked by restriction digestion in each case once with the enzyme BamHI and once with the enzyme EcoRI and subsequent agarose gel electrophoresis.
  • the plasmid was named pK18mobsacB_opcAaa4ex and is shown in FIG.
  • the vector pKl ⁇ mobsacB opcAaa4ex described in Example 4 was prepared according to the protocol of Shufer et al. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) into the C. glutamicum strain DM1797 by conjugation.
  • the vector can not self-replicate in DM1797 and will only be retained in the cell if it is integrated into the chromosome as a result of a recombination event.
  • transconjugants ie of clones with integrated pKl ⁇ mobsacB opcAaa4ex, was carried out by plating out the conjugation mixture on LB agar supplemented with 25 mg / l kanamycin and 50 mg / l nalidixic acid. Kanamycin-resistant transconjugants were then supplemented with kanamycin (25 mg / 1) supplemented LB agar plates and incubated for 24 hours at 33 0 C.
  • the clones were cultured unsupported in LB liquid medium for 30 hours, then streaked on LB agar supplemented with 10% sucrose for 24 hours 33 0 C incubated.
  • the plasmid pK18mobsacB_opcAaa4ex like the starting plasmid pK10mobsacB, contains, in addition to the kanamycin
  • the allelic exchange or the incorporation of the mutation takes place or the original copy remains in the chromosome of the host.
  • a clone was sought in which the desired exchange, i. H. the incorporation of the mutations opcAYl07H, opcAK219N, opcAP233S and opcAY26lH was carried out.
  • the sequence of the opcA gene was determined from 20 clones with the phenotype "growth in the presence of sucrose” and "non-growth in the presence of kanamycin". In this way, a clone was identified which carries the mutations opcAYl07H, opcAK219N, opcAP233S and opcAY26lH. This strain was designated as C. glutamicum DMl797_opcAaa4ex.
  • FIG. 1 Map of the plasmid pCRII_opcAaa4ex
  • FIG. 2 Map of the plasmid pKl ⁇ mobsacB opcAaa4ex
  • the abbreviations and designations used have the following meaning.
  • the number of base pairs (bps) are approximations obtained as part of the reproducibility of measurements.
  • Kan kanamycin resistance gene
  • opcA cloned DNA fragment containing the
  • sacB sacB gene
  • RP4-mob mob region with the replication origin for the transfer (oriT)

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Abstract

Die Erfindung betrifft Mutanten und Allele des opcA-Gens coryneformer Bakterien kodierend für Varianten der OpcA- Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (EC: 1.1.1.49) und Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan unter Verwendung von Bakterien, die diese Allele enthalten.

Description

Allele des opcA-Gens aus coryneformen Bakterien
Gegenstand der Erfindung sind Mutanten und Allele des opcA- Gens kodierend für Varianten der OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (EC: 1.1.1.49) und Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L- Lysin und L-Tryptophan unter Verwendung von Bakterien, die diese Allele enthalten.
Stand der Technik
Aminosäuren finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren. Ein bekannter Antimetabolit ist das Lysinanalogon S- (2-Aminoethyl) -L-Cystein (AEC) .
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L- Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure- Produktion untersucht. Eine zusammenfassende Darstellung über verschiedenste Aspekte der Genetik, des Stoffwechsels und der Biotechnologie von Corynebacterium glutamicum findet sich bei Pühler (chief ed.) im Journal of Biotechnology 104 (1-3), 1-338, 2003.
Moritz et al . (European Journal of Biochemistry 267, 3442- 3452 (2000) ) berichten über physiologische und biochemische Untersuchungen an der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase von Corynebacterium glutamicum. Nach Untersuchungen von Moritz et al . besteht die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase aus einer Zwf-Untereinheit und einer OpcA-Untereinheit .
Eine Methode zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase ist bei Moritz et al . (European Journal of Biochemistry 267, 3442-3452 (2000) beschrieben.
Die Nukleotidsequenz des für die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase von Corynebacterium glutamicum kodierenden Gens ist unter anderem in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA) unter der Nummer AX121828 allgemein verfügbar. Sie kann weiterhin der Patentanmeldung EP1108790 als Sequenz Nr. 1744 entnommen werden.
Weitere Datenbanken wie beispielsweise die
Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder die des Swiss Institute of Bioinformatics
(Swissprot, Geneve, Switzerland) oder die der Protein Information Resource Database (PIR, Washington, DC, USA) können ebenfalls genutzt werden. Die mikrobielle Biosynthese von L-Aminosäuren in coryneformen Bakterien ist ein komplexes System und vielschichtig mit diversen anderen Stoffwechselwegen in der Zelle vernetzt. Daher kann keine Vorhersage gemacht werden, ob durch Mutation das OpcA-Polypeptid der Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase dergestalt verändert, dass die Produktion von L-Aminosäuren verbessert wird. Der besseren Übersichtlichkeit halber ist die Nukleotidsequenz der für die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus Corynebacterium glutamicum kodierenden zwf-Gens
(„Wildtyp-Gen") gemäß den Angaben der NCBI-Datenbank in SEQ ID NO :1 und die sich daraus ergebende Aminosäuresequenz der kodierten Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase in SEQ ID NO: 2 und 4 dargestellt. In SEQ ID NO: 3 sind stromaufwärts (upstream) und stromabwärts (downstream) gelegene Nukleotidsequenzen zusätzlich angegeben.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, verbesserte Stämme von Mikroorganismen bereitzustellen, die erhöhte Mengen von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L- Tryptophan, produzieren.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung sind durch in vitro und/oder in vivo erzeugte, beziehungsweise isolierte Mutanten coryneformer Bakterien, die bevorzugt Aminosäuren ausscheiden, und welche ein Gen bzw. Allel enthalten, das für die OpcA-Untereinheit der Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids Aminosäuren einzeln oder gemeinsam enthält, ausgewählt aus der Gruppe,
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin.
An Position 107 der Aminosäuresequenz wird die Aminosäure L-Histidin, an Position 219 die Aminosäure L-Asparagin, an Position 233 die Aminosäure L-Serin und an Position 261 die Aminosäure L-Histidin bevorzugt.
Das Polypeptid, das in den erfindungsgemäßen Mutanten enthalten ist, kann ebenfalls als OpcA-Polypeptid, OpcA- Polypeptid der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, als OpcA- Untereinheit der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, oder als OpcA-Polypeptid Untereinheit bezeichnet werden. In der EP 1 108 790 (siehe SEQ ID NO: 1744 in Tabelle 1) wird das OpcA- Polypeptid auch als „glucose 6-phosphate dehydrogenase assembly protein" bezeichnet.
Bei den coryneformen Bakterien wird die Gattung Corynebacterium bevorzugt. Besonders bevorzugt sind
Aminosäure ausscheidende Stämme, die auf folgenden Arten beruhen:
Corynebacterium efficiens, wie zum Beispiel der Stamm DSM44549,
Corynebacterium glutamicum, wie zum Beispiel der Stamm ATCC13032,
Corynebacterium thermoaminogenes wie zum Beispiel der Stamm FERM BP-1539, und
Corynebacterium ammoniagenes, wie zum Beispiel der Stamm ATCC6871, wobei die Art Corynbacterium glutamicum ganz besonders bevorzugt wird.
Einige Vertreter der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik auch unter anderen Artbezeicnungen bekannt. Hierzu gehören beispielsweise:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, und Brevibacterium divaricatum ATCC14020.
Bekannte Vertreter Aminosäure ausscheidender Stämme coryneformer Bakterien sind beispielsweise
die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum DM58-l/pDM6 (= DSM4697) beschrieben in EP 0 358 940,
Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) beschrieben in Menkel et al . (Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)), Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= FermBP-7382) beschrieben in EP 1 108 790, Corynebacterium glutamicum NRRL B-11474 beschrieben in US 4,275,157 Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP- 3304) beschrieben in US 5,250,423,
oder die L-Tryptophan produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum K76 (=FermBP-1847) beschrieben in US 5,563,052,
Corynebacterium glutamicum BPS13 (=FermBP-1777) beschrieben in US 5,605,818, und
Corynebacterium glutamicum FermBP-3055 beschrieben in US 5,235,940. Angaben zur taxonomisehen Einordnung von Stämmen dieser Gruppe von Bakterien findet man unter anderem bei Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991)) und in der US- A-5,250,434.
Stämme mit der Bezeichnung ,,ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „DSM" können von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung „FERM" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Die genannten Stämme von Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539, FERM BP-1540, FERM BP-1541 und FERM BP-1542) sind in der US-A 5,250,434 beschrieben. Stämme mit der Bezeichnung „NRRL" können von der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS, Peoria, Illinois, US) bezogen werden.
Unter proteinogenen Aminosäuren versteht man die Aminosäuren, die in natürlichen Proteinen, das heißt in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen vorkommen. Hierzu gehören insbesondere L-
Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparaginsäure, L- Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L- Glutamin, Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L- Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L- Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Prolin und L-Arginin. Zu den L-Aminosäuren gehört ebenfalls das L- Homoserin.
Die erfindungsgemäßen Mutanten scheiden bevorzugt die genannten proteinogen Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Tryptophan aus. Der Begriff Aminosäuren umfasst auch deren Salze wie beispielsweise das Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat im Falle der Aminosäure L-Lysin.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das die Minsäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche enthält, ausgewählt aus der Gruppe:
a) an Position 107 wird L-Tyrosin gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Histidin, ausgetauscht,
b) an Position 219 wird L-Lysin gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Asparagin, ausgetauscht,
c) an Position 233 wird L-Prolin gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Serin, ausgetauscht, und
d) an Position 261 wird L-Tyrosin gegen eine andere proteinogene, bevorzugt L-Histidin, Aminosäure ausgetauscht .
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin, c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
wobei das Allel eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines Primerpaars erhältlich ist, deren Nukleotidsequenzen jeweils mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen, die aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO: 3 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO: 3 ausgewählt werden. Ein Beispiel für ein derartiges Primerpaar ist das in SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 dargestellte Primerpaar opcA-Al und opcA-El . Als Ausgangsmaterial (,,template"-DNA) wird chromosomale DNA coryneformer Bakterien bevorzugt, die insbesondere mit einem Mutagen behandelt worden sind. Besonders bevorzugt wird die chromosomale DNA der Gattung Corynebacterium und ganz besonders bevorzugt die der Art Corynebacterium glutamicum.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz mit einer Länge entsprechend 319 L-Aminosäuren umfasst, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid, das an Position 107 bis 261 der Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz entsprechend Position 107 bis 261 von SEQ ID NO: 6 enthält. Bevorzugt enthält die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO: 6 oder Position 83 bis 285 von SEQ ID NO: 6 oder Position 63 bis 305 von SEQ ID NO: 6 oder Position 38 bis 315 von SEQ ID NO: 6 oder Position 8 bis 315 von SEQ ID NO: 6 oder Position 2 bis 315 von SEQ ID NO: 6 oder Position 2 bis 317 von SEQ ID NO: 6 oder Position 2 bis 319 von SEQ ID NO: 6. Ganz besonders bevorzugt umfasst die Länge des kodierten Polypeptids 319 Aminosäuren.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin
und dessen Aminosäuresequenz außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% oder 100 %identisch ist mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 6 oder 2.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptid eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe,
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin und dessen Nukleotidsequenz außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% oder 100 % identisch ist mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5 oder 1.
Ein Beispiel für eine Nukleotidsequenz eines opcA-Allels, das mindestens 99% Identität mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID N0:5 besitzt, ist in SEQ ID N0:7 gezeigt. Die Nukleotidsequenz dieses opcA-Allels besitzt zusätzlich zu den Nukleotidaustauschen Thymin gegen Cytosin an Position 319, Adenin gegen Cytosin an Position 657, Cytosin gegen Thymin an Position 697 und Thymin gegen Cytosin an Position 781 (Siehe SEQ ID NO: 5) die Nukleotidaustausche Cytosin gegen Thymin an der Position 402 Thymin gegen Cytosin an der Position 600, und Guanin gegen Cytosin an der Position 648 (Siehe SEQ ID N0:7). Die Formulierung „Guanin gegen Cytosin an der Position 648" - und vergleichbare Formulierungen - bedeutet, dass die in der Wildtypsequenz der Kodierregion an der Position 648 vorhandene Nukleobase Guanin (Siehe SEQ ID NO: 1) durch Cytosin ersetzt worden ist (Siehe SEQ ID NO: 7) .
Es ist bekannt, dass konservative Aminosäureaustausche die Enzymaktivität nur unwesentlich verändern. Dementsprechend kann das in den erfindungsgemäßen Mutanten enthaltene opcA- Allel, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Aminosäureaustausche enthält, zusätzlich zu der in SEQ ID NO: 6 gezeigten Aminosäuresequenz einen (1) oder mehrere konservative Aminosäureaustausch (e) enthalten. Bevorzugt enthält das Polypeptid höchstens zwei (2), höchstens drei (3), höchstens vier (4) oder höchstens fünf (5) konservative Aminosäureaustausche .
Bei den aromatischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den hydrophoben Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Leucin, Isoleucin und Valin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den polaren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Glutamin und Asparagin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den basischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Arginin, Lysin und Histidin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den sauren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Asparaginsäure und
Glutaminsäure gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Serin und Threonin gegeneinander ausgetauscht werden.
Gegenstand der Erfindung sind schließlich Mutanten coryneformer Bakterien, die ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 umfasst.
Es ist bekannt, dass durch wirtseigene Enzyme, sogenannte Aminopeptidasen, das endständige Methionin bei der Proteinsynthese entfernt wird.
Gegenstand der Erfindung sind auch opcA-Allele, die für erfindungsgemäße OpcA-Polypeptide, wie beispielhaft als SEQ ID NO: 6 gezeigt, kodieren und die eine oder mehrere Insertion (en) oder Deletion(en) enthalten. Bevorzugt enthält das Polypeptid maximal 5, maximal 4, maximal 3 oder maximal 2 Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren.
Durch derartige Insertionen und Deletionen oder konservative Aminosäureaustausche wird die enzymatische Aktivität der die entsprechende OpcA-Untereinheit enthaltenden Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasen im wesentlichen nicht berührt. „Im wesentlichen nicht berührt" bedeutet, dass sich die enzymatische Aktivität der genannten Varianten um maximal 10%, maximal 7,5%, maximal 5%, maximal 2,5% oder maximal 1% von der Aktivität einer Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase unterscheidet, welche eine OpcA-Polypeptid-Untereinheit mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 enthält, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäuraustausche ausgewählt aus der Gruppe
a) an Position 107 L-Histidin anstelle L-Tyrosin
b) an Position 219 L-Asparagin anstelle L-Lysin
c) an Position 233 L-Serin anstelle L-Prolin, und
d) an Position 261 L-Histidin anstelle L-Tyrosin
enthält.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mutanten können klassische in-vivo Mutageneseverfahren mit Zellpopulationen coryneformer Bakterien unter Verwendung mutagener Stoffe wie beispielsweise N-Methyl-N' -Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG) , Ethylmethansulfonat (EMS) , 5-Bromuracil, oder ultraviolettes Licht verwendet werden. Mutagenesemethoden sind beispielsweise im Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al . (Eds . ) , American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) oder bei Tosaka et al. (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978) ) oder bei Konicek et al (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)) beschrieben. Typische Mutagenesen unter Verwendung von MNNG umfassen Konzentrationen von 50 bis 500 mg/1 oder auch höhere Konzentrationen bis zu maximal 1 g/l, eine Inkubationszeit von 1 bis 30 Minuten bei einem pH von 5,5 bis 7,5. Unter diesen Bedingungen wird die Zahl der lebensfähigen Zellen um einen Anteil von ca. 50% bis 90% oder ca. 50% bis 99% oder ca. 50% bis 99,9% oder mehr reduziert .
Aus der mutagenisierten Zellpopulation werden Mutanten beziehungsweise Zellen entnommen und vermehrt. Vorzugsweise wird in einem weiteren Schritt deren Fähigkeit untersucht, 4
in einer Satzkultur (batch) unter Verwendung eines geeigneten Nährmediums Aminosäuren, bevorzugt L-Lysin oder L-Tryptophan, auszuscheiden. Geeignete Nährmedien und Testbedingungen sind unter anderem in der US 6,221,636, in der US 5,840,551, in der US 5,770,409, in der US 5,605,818, in der US 5,275,940 und in der US 4,224,409 beschrieben. Bei Verwendungen von geeigneten Roboteranlagen, wie beispielsweise bei Zimmermann et al . (VDI Berichte Nr. 1841, VDI-Verlag, Düsseldorf, Deutschland 2004, 439-443) oder Zimmermann (Chemie Ingenenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005) ) beschrieben, können zahlreiche Mutanten in kurzer Zeit untersucht werden. Auf diese Weise werden Mutanten identifiziert, die im Vergleich zum Elternstamm beziehungsweise nicht mutagenisierten Ausgangsstamm vermehrt Aminosäuren in das Nährmedium oder in das
Zellinnere ausscheiden. Dazu gehören beispielsweise solche Mutanten, deren Aminosäuresekretion um mindestens 0,5% erhöht ist.
Anschließend wird aus den Mutanten DNA bereitgestellt, beziehungsweise isoliert und mit Hilfe der Polymerase-
Kettenreaktion unter Verwendung von Primerpaaren, die die Amplifizierung des opcA-Gens beziehungsweise der erfindungsgemäßen opcA-Allele oder der erfindungsgemäßen Mutationen an den Positionen 107, 219, 233 und 261 der Aminosäuresequenz des OpcA-Polypeptides erlauben, das entsprechende Polynukleotid synthetisiert. Vorzugsweise wird die DNA aus solchen Mutanten isoliert, die im Vergleich zum Ausgangsstamm in erhöhtem Maße Aminosäuren ausscheiden oder im Zellinneren anreichern.
Hierzu können beliebige Primerpaare aus der stromaufwärts und stromabwärts der erfindungsgemäßen Mutation gelegenen Nukleotidsequenz und der dazu komplementären Nukleotidsequenz ausgewählt werden. Ein Primer eines Primerpaares umfasst hierbei bevorzugt mindestens 15, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 21 oder mindestens 5
24 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 652 von SEQ ID NO : 3. Der dazugehörige zweite Primer eines Primerpaares umfasst mindestens 15, mindestens 18, mindestens 20, mindestens 21 oder mindestens 24 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz von Position 1600 und 1118 von SEQ ID NO: 3. Ist die Amplifikation der Kodierregion gewünscht, so wird das Primerpaar vorzugsweise aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO: 3 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO: 3 ausgewählt. Ist die Amplifikation eines Teils der Kodierregion, wie beispielsweise in SEQ ID NO: 15 und 17 dargestellt, erwünscht, so wird das Primerpaar vorzugsweise aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 335 und 652 von SEQ ID NO: 3 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1291 und 1118 von SEQ ID NO: 3 ausgewählt.
Geeignete Primerpaare sind beispielsweise das unter SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 wiedergegebene Primerpaar opcA-Al und opcA-El und das unter SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14 wiedergegebene Primerpaar opcA-intl und opcA-int2. Der Primer kann überdies mit Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, mit einer Biotin-Gruppe oder weiteren Accessoirs, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind, ausgerüstet sein. Die Gesamtlänge des Primers beträgt im Allgemeinen maximal 30, 40, 50 oder 60 Nukleotide.
Für die Herstellung von Polynukleotiden durch Amplifikation ausgewählter Sequenzen, wie dem erfindungsgemäßen opcA- Allel, aus vorgelegter, beispielsweise chromosomaler DNA
(„template DNA") durch Amplifikation mittels PCR, werden im Allgemeinen thermostabile DNA-Polymerasen eingesetzt. Beispiele derartiger DNA-Polymerasen sind die Taq- Polymerase aus Thermus aquaticus, die unter anderem von der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) vertrieben wird, die Vent-Polymerase aus Thermococcus litoralis, die unter anderem von der Firma New England Biolabs (Frankfurt, Deutschland) vertrieben wird oder die Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus, die unter anderem von der Firma Stratagene (La Jolla, USA) vertrieben wird. Bevorzugt werden Polymerasen mit „proof-reading"-Aktivität . „proof- reading"-Aktivität bedeutet, dass diese Polymerasen in der Lage sind, fehlerhaft eingebaute Nukleotide zu erkennen und den Fehler durch erneute Polymerisation zu beheben (Lottspeich und Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland (1998) ) . Beispiele für Polymerasen mit ,,proof-reading"-Aktivität sind die Vent- Polymerase und die Pfu-Polymerase.
Die Bedingungen im Reaktionsansatz werden nach Angaben des Herstellers eingestellt. Die Polymerasen werden vom
Hersteller im Allgemeinen zusammen mit dem gebräuchlichen Puffer geliefert, welcher üblicherweise Konzentrationen von 10 - 100 rtiM Tris/HCl und 6 - 55 rtiM KCl bei pH 7,5 - 9,3 aufweist. Magnesiumchlorid wird in einer Konzentration von 0,5 - 10 rtiM zugesetzt, falls es nicht in dem vom Hersteller gelieferten Puffer enthalten ist. Dem Reaktionsansatz werden weiterhin Desoxynucleosidtriphosphate in einer Konzentration von 0,1 - 16,6 rtiM zugesetzt. Die Primer werden im Reaktionsansatz mit einer Endkonzentration von 0,1 - 3 μM vorgelegt und die Template-DNA im optimalen Fall mit 102 bis 105 Kopien. Es können auch 106 bis 107 Kopien eingesetzt werden. Die entsprechende Polymerase wird dem Reaktionsansatz in einer Menge von 2-5 Units zugegeben. Ein typischer Reaktionsansatz hat ein Volumen von 20 - 100 μl .
Als weitere Zusätze können der Reaktion Rinderserumalbumin, Tween-20, Gelatin, Glycerin, Formamid oder DMSO beigesetzt werden (Dieffenbach und Dveksler, PCR Primer - A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, USA 1995) .
Ein typischer PCR-Verlauf besteht aus drei unterschiedlichen, sich aufeinanderfolgend wiederholenden 7
Temperaturstufen. Vorab wird die Reaktion mit einer Temperaturerhöhung auf 920C - 980C für 4 bis 10 Minuten gestartet, um die vorgelegte DNA zu denaturieren. Dann folgen sich wiederholend zuerst ein Schritt zur Denaturierung der vorgelegten DNA von 10 - 60 Sekunden bei ungefähr 92-980C, dann ein Schritt zum Binden der Primer an die vorgelegte DNA von 10 - 60 Sekunden bei einer bestimmten, von den Primern abhängigen Temperatur („Annealing-Temperatur") , die erfahrungsgemäß bei 5O0C bis 6O0C liegt und sich für jedes Primerpaar einzeln berechnen läßt. Genaue Informationen dazu findet der Fachmann bei Rychlik et al . (Nucleic Acids Research 18 (21) : 6409-6412) . Anschließend folgt ein Synthese-Schritt zur Verlängerung der vorgelegten Primer („Extension") bei dem jeweils für die Polymerase angegebenen Aktivitätsoptimum, üblicherweise je nach Polymerase im Bereich von 730C bis 670C bevorzugt 720C bis 680C. Die Dauer dieses Extensionschrittes hängt von der Leistungsfähigkeit der Polymerase und Länge des zu amplifizierenden PCR-Produktes ab. In einer typischen PCR dauert dieser Schritt 0,5 - 8 Minuten, bevorzugt 2 - 4 Minuten. Diese drei Schritte werden 30 bis 35 mal, gegebenenfalls bis zu 50 mal wiederholt. Ein abschließender „Extension"-Schritt von 4 - 10 Minuten beendet die Reaktion. Die auf diese Weise hergestellten Polynukleotide werden auch als Amplifikate bezeichnet; der Begriff Nukleinsäurefragment ist ebenfalls gebräuchlich.
Weitere Anleitungen und Informationen zur PCR findet der Fachmann beispielsweise im Handbuch „PCR-Strategies" (Innis, Feifand und Sninsky, Academic Press , Inc., 1995), im Handbuch von Diefenbach und Dveksler „PCR Primer - a laboratory manual" (CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1995), im Handbuch von Gait „Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham „PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) . Die Nukleotidsequenz wird anschließend beispielsweise nach dem Kettenabbruchverfahren von Sanger et al . (Proceedings of the National Academies of Sciences, U. S.A., 74, 5463- 5467 (1977)) mit den von Zimmermann et al . (Nucleic Acids Research 18, 1067pp (1990) ) angegebenen Modifikationen bestimmt und das von dieser Nukleotidsequenz kodierte Polypeptid insbesondere bezüglich der Aminosäuresequenz analysiert. Dazu wird die Nukleotidsequenz in ein Programm zur Übersetzung von DNA-Sequenz in eine Aminosäuresequenz eingegeben. Geeignete Programme sind beispielsweise das
Programm „Patentin", das bei Patentämtern, beispielsweise dem US-Patentamt (USPTO) erhältlich ist, oder das „Translate Tool", das auf dem ExPASy Proteomics Server im World Wide Web (Gasteiger et al . , Nucleic Acids Research 31, 3784-3788 (2003)) verfügbar ist.
Auf diese Weise werden Mutanten identifiziert, deren opcA- Allele für OpcA-Polypeptide kodieren, welche die erfindungsgemäßen Mutationen enthalten.
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend eine Mutante eines coryneformen Bakteriums, die durch folgende Schritte erhältlich ist:
a) Behandlung eines coryneformen Bakteriums, das die Fähigkeit besitzt Aminosäuren auszuscheiden, mit einem mutagenen Agenz,
b) Isolierung und Vermehrung der in a) erzeugten Mutante,
c) vorzugsweise Bestimmung der Fähigkeit der Mutante in einem Medium mindestens 0,5% mehr Aminosäure auszuscheiden oder im Zellinneren anzureichern als das in a) eingesetzte coryneforme Bakterium,
d) Bereitstellung von Nukleinsäure aus der in b) erhaltenen Mutante, e) Herstellung eines Nukleinsäuremoleküls/ Amplifikates/ Nukleinsäurefragments unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion, der Nukleinsäure aus d) , und eines Primerpaares bestehend aus einem ersten Primer umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO: 3 und einem zweitem Primer umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID N0:3,
f) Bestimmung der Nukleotidsequenz des in e) erhaltenen Nukleinsäuremoleküls, und Bestimmung der kodierten Aminosäuresequenz ,
g) gegebenfalls Vergleich der in f) bestimmten Aminosäuresesequenz mit SEQ ID NO: 6, und
h) Identifizierung einer Mutante, die ein Polynukleotid enthält, das für ein Polypeptid kodiert, welches eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe
i) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
ii) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
iii) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
iv) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin. Die auf diese Weise erzeugten Mutanten enthalten typischerweise eine (1) Kopie eines der beschriebenen opcA Allele. Das hier beschriebene Verfahren ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
In der SEQ ID NO: 5 ist beispielhaft die Kodierregionen eines opcA-Allels einer erfindungsgemäßen Mutante wiedergegeben. Die Kodierregion des Wildtypgens ist als SEQ ID NO :1 wiedergegeben.
SEQ ID NO :1 enthält an Position 319 bis 321 das für die Aminosäure L-Tyrosin kodierende TAT Kodon. SEQ ID NO: 5 enthält an Position 319 die Nukleobase Cytosin. Durch diese Thymin Cytosin Transition entsteht an Position 319 bis 321 das für die Aminosäure L-Histidin kodierende CAT Kodon.
SEQ ID NO :1 enthält an Position 655 bis 657 das für die Aminosäure L-Lysin kodierende AAA Kodon. SEQ ID NO: 5 enthält an Position 657 die Nukleobase Cytosin. Durch diese Adenin Cytosin Transversion entsteht an Position 655 bis 657 das für die Aminosäure L-Asparagin kodierende AAC Kodon.
SEQ ID NO: 1 enthält an Position 697 bis 699 das für die Aminosäure L-Prolin kodierende CCA Kodon. SEQ ID NO: 5 enthält an Position 697 die Nukleobase Thymin. Durch diese Cytosin Thymin Transition entsteht an Position 697 bis 699 das für die Aminosäure L-Serin kodierende TCA Kodon.
SEQ ID NO: 1 enthält an Position 781 bis 783 das für die Aminosäure L-Tyrosin kodierende TAT Kodon. SEQ ID NO: 5 enthält an Position 781 die Nukleobase Cytosin. Durch diese Thymin Cytosin Transition entsteht an Position 781 bis 783 das für die Aminosäure L-Histidin kodierende CAT Kodon.
Darüber hinaus kann die in SEQ ID NO: 5 dargestellte
Nukleotidsequenz weitere Basenaustausche enthalten, die sich durch die Mutagenesebehandlung ergeben haben, sich jedoch nicht in einer veränderten Aminosäuresequenz äußern. Derartige Mutationen werden in der Fachwelt auch als stille oder neutrale Mutationen bezeichnet. Diese stillen Mutationen können ebenfalls in dem für die Mutagenesebehandlung eingesetzten coryneformen Bakterium bereits enthalten sein. Beispiele für derartige stille
Mutationen sind die Cytosin-Thymin Transition an Position 402, die Thymin-Cytosin Transition an Position 600 und die Guanin-Cytosin Transversion an Position 648 wie in SEQ ID NO: 7 dargestellt.
Die für die Mutagenese verwendeten coryneformen Bakterien besitzen bevorzugt bereits die Fähigkeit, die gewünschte Aminosäure in das sie umgebende Nährmedium beziehungsweise Fermentationsbrühe auszuscheiden oder im Zellinneren anzureichern.
L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien besitzen typischerweise eine „feed back" resistente beziehungsweise desensibilisierte Aspartatkinase. Unter „feed back" resistenten Aspartatkinasen versteht man Aspartatkinasen, die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch Mischungen von Lysin und Threonin oder Mischungen von AEC
(Aminoethylcystein) und Threonin oder Lysin allein oder AEC allein aufweisen. Die für diese desensibilisierten Aspartatkinasen kodierenden Gene beziehungsweise Allele werden auch als lysCFBR-Allele bezeichnet. Im Stand der Technik (Tabelle 1) sind zahlreiche lysCFBR-Allele beschrieben, die für Aspartatkinase-Varianten kodieren, welche Aminosäureaustausche im Vergleich zum Wildtypprotein besitzen. Die Kodierregion des Wildtyp lysC-Gens von Corynebacterium glutamicum entsprechend der Zugangsnummer
AX756575 der NCBI Datenbank ist in SEQ ID NO: 19 und das von diesem Gen kodierte Protein in SEQ ID NO: 20 dargestellt. Tabelle 1 lysC -Allele kodierend für feed back resistente
Aspartatkinasen
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L-Lysin ausscheidende coryneforme Bakterien besitzen typischerweise einen oder mehrere der in Tabelle 1 aufgelisteten Aminosäureaustausche .
Bevorzugt werden folgende lysCFBR-Allele : lysC A279T (Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Threonin) , lysC A279V (Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen 4
Valin) , lysC S301F (Austausch von Serin an Position 301 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Phenylalanin) , lysC T308I (Austausch von Threonin an Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Isoleucin) , lysC S301Y (Austausch von Serin an Position 308 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Tyrosin) , lysC G345D (Austausch von Glycin an Position 345 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Asparaginsäure) , lysC R320G (Austausch von Arginin an Position 320 des kodierten
Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Glycin), lysC T311I (Austausch von Threonin an Position 311 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Isoleucin) , lysC S381F (Austausch von Serin an Position 381 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Phenylalanin) und lysC S317A (Austausch von Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Alanin) .
Besonders bevorzugt werden das lysCFBR-Allel lysC T311I (Austausch von Threonin an Position 311 des kodierten
Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Isoleucin) und ein lysCFBR-Allel enthaltend mindestens einen Austausch ausgewählt aus der Gruppe A279T (Austausch von Alanin an Position 279 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Threonin) und S317A (Austausch von Serin an Position 317 des kodierten Aspartatkinaseproteins gemäß SEQ ID NO: 20 gegen Alanin) .
Das lysCFBR-Allel lysC T311I ist in dem bei der DSMZ unter der Nummer DSM16833 hinterlegten Stamm DM1797 enthalten. DM1797 ist eine Mutante von Corynebacterium glutamicum ATCC13032.
Ein lysCFBR-Allel das den Aminosäureaustausch A279T enthält ist in dem bei der NRRL unter der Nummer NRRL B-11474 hinterlegten Mutante enthalten. 5
Nach der oben beschriebenen Art und Weise wurde, ausgehend von Stamm DM1797, eine als DM1825 bezeichnete Mutante isoliert, die ein opcA-Allel enthält, das für ein OpcA- Polypeptid kodiert, bei dem an Position 107 der Aminosäuresequenz L-Histidin, an Position 219 L-Asparagin, an Position 233 L-Serin und an Position 261 L-Histidin enthalten ist. Die Nukleotidsequenz der Kodierregion des opcA-Allels der Mutante DM1825 ist als SEQ ID NO: 7 und die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids als SEQ ID NO: 8 beziehungsweise 10 dargestellt. SEQ ID NO: 7 enthält an Position 319 Cytosin anstelle Thymin, an Position 402 Thymin anstelle Cytosin, an Position 600 Cytosin anstelle Thymin, an Position 648 Cytosin anstelle Guanin, an Position 657 Cytosin anstelle Adenin, an Position 697 Thymin anstelle Cytosin und an Position 781 Cytosin anstelle Thymin. Die Formulierung „an Position 648 Cytosin anstelle Guanin" - und vergleichbare Formulierungen - bedeutet, dass die in der Wildtypsequenz der Kodierregion an Position 648 vorhandene Nukleobase Guanin (Siehe SEQ ID N0:l) durch Cytosin ersetzt worden ist (Siehe SEQ ID N0:7).
In der SEQ ID NO: 9 sind die stromaufwärts (upstream) und stromabwärts (downstream) von SEQ ID NO: 7 gelegenen Nukleotidsequenzen mit angegeben.
Darüberhinaus können L-Lysin ausscheidende coryneforme Bakterien verwendet werden, die eine abgeschwächte
Homoserin-Dehydrogenase oder Homoserinkinase aufweisen oder andere Eigenschaften besitzen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind.
L-Tryptophan produzierende coryneforme Bakterien besitzen typischerweise eine „feed back" resistente beziehungsweise desensibilisierte Anthranilatsynthase . Unter „feed back" resistenter Anthranilatsynthase versteht man Anthranilatsynthasen, die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung (5 bis 10%, 10% bis 15% oder 10% bis 20%) durch Tryptophan oder 5- Fluorotryptophan (Matsui et al . , Journal of Bacteriology 169 (11): 5330 - 5332(1987)) oder ähnliche Analoga aufweisen. Die für diese desensibilisierten Anthranilatsynthasen kodierenden Gene beziehungsweise Allele werden auch als trpEFBR -Allele bezeichnet. Beispiele für derartige Mutanten beziehungsweise Allele sind beispielsweise in der US 6180373 und EP0338474 beschrieben.
Die erhaltenen Mutanten zeigen eine im Vergleich zum eingesetzten Ausgangsstamm beziehungsweise Elternstamm erhöhte Ausscheidung beziehungsweise Produktion der gewünschten Aminosäure in einem Fermentationsprozess .
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein isoliertes Polynukleotid, das für ein OpcA-Polypeptid der Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe :
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin.
Das erfindungsgemäße Polynukleotid kann aus einer erfindungsgemäßen Mutante isoliert werden. 7
Weiterhin können für die Mutagenese des opcA-Gens in-vitro Methoden eingesetzt werden. Bei der Verwendung von in-vitro Methoden werden isolierte Polynukleotide, welche ein opcA- Gen eines coryneformen Bakteriums, vorzugsweise das im Stand der Technik beschriebene Wildtyp-Gen von
Corynebacterium glutamicum, enthalten, einer mutagenen Behandlung unterzogen.
Bei den isolierten Polynukleotiden kann es sich beispielsweise um isolierte Gesamt-DNA beziehungsweise chromosomale DNA oder auch um Amplifikate des opcA-Gens handeln, die mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt wurden. Derartige Amplifikate werden auch als PCR-Produkte bezeichnet; der Begriff Nukleinsäurefragment ist ebenfalls gebräuchlich. Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) . Es ist ebenfalls möglich, das zu mutagenisierende opcA-Gen zunächst in einen Vektor, beispielsweise in einen Bakteriophagen oder in ein Plasmid einzubauen.
Geeignete Methoden für die in-vitro Mutagenese sind unter anderem die Behandlung mit Hydroxylamin nach Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics . A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, 1992), die Verwendung mutagener Oligonukleotide (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 und R. M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995) ) und der Einsatz einer Polymerasekettenreaktion unter Verwendung einer DNA-Polymerase, die eine hohe Fehlerquote aufweist. Eine derartige DNA-Polymerase ist beispielsweise die Mutazyme DNA Polymerase (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, Nr.600550) der Firma Stratagene (LaJoIIa, CA, USA).
Weitere Anleitungen und Übersichten zur Erzeugung von Mutationen in-vivo oder in-vitro können dem Stand der Technik und bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) , dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe enthält:
a) Austausch von L-Tyrosin an Position 107 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L- Histidin,
b) Austausch von L-Lysin an Position 219 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L- Asparagin,
c) Austausch von L-Prolin an Position 233 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L- Serin, und
d) Austausch von L-Tyrosin an Position 261 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L- Histidin.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches eine Aminosäuresequenz mit einer Länge von 319 Aminoäuren umfasst und diese eine oder mehrere der Aminosäuren enthält, ausgewählt aus der Gruppe:
a) an Position 107 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches von Position 107 bis 261 der Aminosäuresquenz die Aminosäuresequenz entsprechend Position 107 bis 261 von SEQ ID NO : 6 enthält. Bevorzugt enthält die Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO: 6 oder Position 83 bis 285 von SEQ ID NO: 6 oder Position 63 bis 305 von SEQ ID NO: 6 oder Position 38 bis 315 von SEQ ID NO: 6 oder Position 8 bis 315 von SEQ ID NO: 6 oder Position 2 bis 315 von SEQ ID NO: 6 oder Position 2 bis 317 von SEQ ID NO: 6 oder Position 2 bis 319 von SEQ ID NO: 6. Ganz besonders bevorzugt umfasst die Länge des kodierten Polypeptids 319 Aminosäuren.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes
Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
und das eine Nukleotidsequenz umfasst, welche mit der
Nukleotidsequenz eines Polynukleotids identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung des Primerpaars erhältlich ist, deren Nukleotidsequenzen jeweils mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen, die aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO: 3 und aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO: 3 ausgewählt werden. Ein Beispiel für geeignetes Primerpaar ist in SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 dargestellt. Als Ausgangsmaterial (,,template"-DNA) wird chromosomale DNA coryneformer Bakterien bevorzugt, die insbesondere mit einem Mutagen behandelt worden sind. Besonders bevorzugt wird die chromosomale DNA der Gattung Corynebacterium und ganz besonders bevorzugt die der Art Corynebacterium glutamicum.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, das mit der zu SEQ ID NO: 5 oder 7 komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert und für ein OpcA-Polypeptid kodiert, dessen Aminosäuresequenz eine oder mehrere Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe: a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin.
Anleitungen zur Hybridisierung von Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotiden findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al . (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255- 260 (1991)) . Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen die Sonde d.h. ein Polynukleotid umfassend die zu SEQ ID NO: 5, 7 oder 9 komplementäre Nukleotidsequenz und die Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten beziehungsweise identifizierten Polynukleotide, mindestens 90% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird im Allgemeinen bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996) . Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein Puffer entsprechend 5x SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 5O0C - 680C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 90% Identität zur Nukleotidequenz der eingesetzten Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System User 's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 5O0C - 680C, ca. 520C - 680C, ca. 540C - 680C, ca. 560C - 680C, ca. 580C - 680C, ca. 6O0C - 680C, ca. 620C - 680C, ca. 640C - 680C, ca. 660C - 680C eingestellt wird. Temperaturbereiche von ca. 640C - 680C oder ca. 660C - 680C werden bevorzugt. Es ist gegebenenfalls möglich, die Salzkonzentration bis auf eine Konzentration entsprechend 0,2x SSC oder 0,Ix SSC zu senken. Gegebenenfalls enthält der SSC-Puffer Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Konzentration von 0,1%. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1 - 20C von 5O0C auf 680C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die mindestens 90% oder mindestens 91%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 93% oder mindestens 94% oder mindestens 95% oder mindestens 96% und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% Identität zur Sequenz beziehungsweise komplementären Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen und für ein OpcA-Polypeptid kodieren, welches den erfindungsgemäßen Aminosäureaustausch enthält. Die Nukleotidsequenz des auf diese Weise erhaltenen Polynukleotids wird mit bekannten Methoden bestimmt. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558). Die so erhaltenen Nukleotidsequenzen kodieren für OpcA-Polypeptide, die mindestens 90% bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch sind mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 2 und einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Aminosäureaustausche enthalten.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
und das eine Aminosäuresequenz umfasst, die außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 2.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes
Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz des 4
Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
und das eine Nukleotidsequenz umfasst, die außerdem zu mindestens 90%, bevorzugt mindestens 92% oder mindestens 94% oder mindestens 96%, und ganz besonders bevorzugt mindestens 97% oder mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 1.
Ein Beispiel für ein Polynukleotid, das für ein erfindungsgemäßes OpcA-Polypeptid kodiert, und eine Nukleotidsequenz besitzt, die mindestens 99% identisch ist mit der von SEQ ID NO: 5, ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt. Die Nukleotidsequenz dieses opcA-Allels besitzt zusätzlich zu den Nukleotidaustauschen Thymin gegen Cytosin an Position 319, Adenin gegen Cytosin an Position 657, Cytosin gegen Thymin an Position 697 und Thymin gegen Cytosin an Position 781 (siehe SEQ ID NO: 5) die Nukleotidaustausche Cytosin gegen Thymin an Position 402, Thymin gegen Cytosin an Position 600, und Guanin gegen Cytosin an Position 648 (siehe SEQ ID NO: 7) . Die Formulierung „Guanin gegen Cytosin an der Position 648" - und vergleichbare Formulierungen - 5
bedeutet, dass die in der Wildtypsequenz der Kodierregion an der Position 648 vorhandene Nukleobase Guanin (Siehe SEQ ID NO: 1) durch Cytosin ersetzt worden ist (Siehe SEQ ID NO : 7 ) .
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein OpcA-Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 umfasst. Gegebenenfalls enthält das kodierte Polypeptid einen (1) oder mehrere konservative Aminosäuraustausch (e) . Bevorzugt enthält das Polypeptid höchstens zwei (2), höchstens drei (3), höchstens vier (4) oder höchstens fünf (5) konservative Aminosäureaustausche .
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes Polynukleotid, dass für ein opcA-Polypeptid kodiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 einschließlich einer Verlängerung am N- oder C-Terminus um mindestens eine (1) Aminosäure umfasst. Diese Verlängerung beträgt nicht mehr als 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 oder 2 Aminosäuren beziehungsweise Aminosäurereste.
Gegenstand der Erfindung sind schließlich auch opcA-Allele, die für Polypeptid Varianten von SEQ ID NO: 6 kodieren, die eine oder mehrere Insertionen oder Deletionen enthalten. Bevorzugt enthalten diese maximal 5, maximal 4, maximal 3 oder maximal 2 Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein isoliertes
Polynukleotid, das die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 5, 7 oder 9 umfasst.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein isoliertes Polynukleotid enthaltend das opcA-Allel der Mutante DM1825.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein isoliertes Polynukleotid, das einen Teil der Kodierregion eines erfindungsgemäßen opcA-Allels umfasst, wobei das isolierte Polynukleotid in jedem Fall den Teil der Kodierregion umfasst, der einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Aminosäureaustausche enthält. Der Begriff „Teil der Kodieregion" bedeutet, dass entweder das Startkodon (typischerweise ATG oder GTG) , oder das letzte kodierende Kodon (im vorliegenden Fall GTC entsprechend Position 955 - 957 von SEQ ID NO:5), oder beide in dem isolierten Polynukleotid fehlen.
Insbesondere ist ein Nukleinsäure-Molekül beziehungsweise DNA-Fragment umfasst, das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO : 2 , oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 83 bis 285 von SEQ ID NO: 2, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 63 bis 305 von SEQ ID NO: 2, oder das für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 38 bis 315 von SEQ ID NO: 2 kodiert, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche umfasst, ausgewählt aus der Gruppe:
a) Austausch von L-Tyrosin an Position 107 entsprechend SEQ ID NO: 2 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Histidin,
b) Austausch von an L-Lysin an Position 219 entsprechend SEQ ID NO: 2 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Asparagin,
c) Austausch von L-Prolin an Position 233 entsprechend SEQ ID NO : 2 gegen eine andere proteinogene
Aminosäure, bevorzugt L-Serin, und
d) Austausch von L-Tyrosin an Position 261 entsprechend SEQ ID NO: 2 gegen eine andere proteinogene Aminosäure, bevorzugt L-Histidin.
Bevorzugt werden Nukleinsäuremoleküle, die für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO: 6, oder mindestens entsprechend Position 83 bis 285 von SEQ ID NO: 6, oder mindestens entsprechend Position 7
63 bis 305 von SEQ ID NO: 6, oder mindestens entsprechend Position 38 bis 315 von SEQ ID NO: 6, oder mindestens entsprechend Position 8 bis 315 von SEQ ID NO: 6 kodieren.
Das Leseraster kodierend für die Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO: 6 ist ebenfalls als SEQ ID NO: 15 dargestellt. SEQ ID NO: 16 zeigt die von diesem Leseraster kodierte Aminosäuresequenz . Die Position 10 in SEQ ID NO: 16 entspricht der Position 107 von SEQ ID N0:2, 4, 6, 8 oder 10. Die Position 122 in SEQ ID NO: 16 entspricht der Position 219 von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 10. Die Position 136 in SEQ ID NO: 16 entspricht der Position 233 von SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 10. Die Position 164 in SEQ ID NO: 16 entspricht der Position 261 von SEQ ID N0:2, 4, 6, 8 oder 10.
Ganz besonders bevorzugt werden Nukleinsäuremoleküle, die mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 292 bis 810 von SEQ ID NO: 5 oder I1 oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 247 bis 855 von SEQ ID NO : 5 oder I1 oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 187 bis 915 von SEQ ID NO: 5 oder I1 oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 112 bis 948 von SEQ ID NO: 5 oder 1, oder mindestens eine Nukleotidsequenz entsprechend Position 22 bis 948 von SEQ ID NO: 5 oder 7 umfassen.
Das Leseraster entsprechend Position 292 bis 810 von SEQ ID NO: 5 ist als SEQ ID NO: 15 dargestellt. Die dazugehörige kodierte Aminosäuresequenz ist als SEQ ID NO: 16 dargestellt. Das Leseraster entsprechend Position 292 bis 810 von SEQ ID NO: 7 ist als SEQ ID NO: 17 dargestellt. Die dazugehörige kodierte Aminosäuresequenz ist als SEQ ID NO: 18 dargestellt.
Die erfindungsgemäßen Leseraster können darüberhinaus eine oder mehrere Mutationen enthalten, die zu einem oder mehreren konservativen Aminosäureaustauschen führen. Bevorzugt führen die Mutationen zu maximal 4%, zu maximal 2% oder zu maximal 1% konservativen Aminosäureaustauschen. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Leseraster eine oder mehrere stille Mutationen enthalten. Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Leseraster höchstens 4% und besonders bevorzugt höchstens 2% bis höchstens 1% stille Mutationen.
Die erfindungsgemäßen, isolierten Polynukleotide können dazu verwendet werden, um rekombinante Stämme von Mikroorganismen herzustellen, die im Vergleich zum Ausgangs- beziehungsweise Elternstamm in verbesserter Weise Aminosäuren in das sie umgebende Medium abgeben oder im Zellinneren anhäufen.
Eine verbreitete Methode zum Einbau von Mutationen in Gene coryneformer Bakterien ist die des Allelaustausches, die auch unter der Bezeichnung „gene replacement" bekannt ist. Bei diesem Verfahren wird ein DNA-Fragment, welches die interessierende Mutation enthält, in den gewünschten Stamm eines coryneformen Bakteriums überführt und die Mutation durch wenigstens zwei Rekombinationsereignisse beziehungsweise „cross over"-Ereignisse in das Chromosom des gewünschten Stammes inkorporiert beziehungsweise die im betreffenden Stamm vorhandene Sequenz eines Gens gegen die mutierte Sequenz ausgetauscht.
Von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991) wurde diese Methode verwendet um ein lysA-Allel, welches eine Deletion trug, in das Chromosom von C. glutamicum anstelle des Wildtypgens einzubauen. In gleicher Weise wurde ein lysA-Allel welches eine Insertion trug in das Chromosom von C. glutamicum anstelle des Wildtypgens eingebaut. Von Schäfer et al . (Gene 145, 69-73 (1994)) wurde diese Methode eingesetzt um eine Deletion in das hom- thrB Operon von C. glutamicum einzubauen. Von Nakagawa et al. (EP 1108790) und Ohnishi et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)) wurde diese Methode eingesetzt um verschiedene Mutationen ausgehend von den isolierten Allelen in das Chromosom von C. glutamicum einzubauen. Auf diese Weise gelang es Nakagawa et al . eine als Val59Ala bezeichnete Mutation in das Homoserin- Dehydrogenase Gen (hom) , eine als Thr311Ile bezeichnete Mutation in das Aspartatkinase-Gen (lysC bzw. ask) , eine als Pro458Ser bezeichnete Mutation in das Pyruvat- Carboxylase-Gen (pyc) und eine als Ala213Thr bezeichnete Mutation in das als Glucose-6-phoshat-Dehydrogenase Gen bezeichnete zwf-Gen von C. glutamicum Stämmen einzubauen.
Für ein erfindungsgemäßes Verfahren kann ein erfindungsgemäßes Polynukleotid verwendet werden, welches die gesamte Kodierregion umfasst, wie beispielsweise in SEQ ID NO : 5 oder 7 gezeigt, oder welches einen Teil der Kodierregion umfasst, wie beispielsweise die Nukleotidsequenz, die für mindestens die Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO: 6 beziehungsweise 8 kodiert und die als SEQ ID NO: 15 und 17 dargestellt sind. Der Teil der Kodierregion entsprechend mindestens SEQ ID NO: 15 oder 17 hat eine Länge von ≥ 519 Nukleobasen. Bevorzugt werden solche Teile der
Kodierregion, deren Länge ≥ 747 Nukleobasen beträgt, wie beispielsweise Nukleinsäuremoleküle, die für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position von 63 bis 305 von SEQ ID NO : 6 beziehungsweise 8 kodieren. Ganz besonders bevorzugt werden solche Teile der Kodierregion, deren Länge ≥ 834 Nukleobasen beträgt, wie beispielsweise Nukleinsäuremoleküle, die für mindestens eine Aminosäuresequenz entsprechend Position von 38 bis 315 von SEQ ID NO : 6 beziehungsweise 8 kodieren.
Das DNA-Fragment enthaltend die interessierende Mutation liegt bei dieser Methode typischerweise in einem Vektor, insbesondere einem Plasmid, vor, das vorzugsweise von dem mit der Mutation zu versehenden Stamm nicht oder nur begrenzt repliziert wird. Als Hilfs- oder Zwischenwirt, in dem der Vektor replizierbar ist, wird im Allgemeinen ein 4
Bakterium der Gattung Escherichia, bevorzugt der Spezies Escherichia coli, verwendet.
Beispiele für derartige Plasmidvektoren sind die von Schäfer et al . (Gene 145, 69-73 (1994)) beschriebenen pK*mob und pK*mobsacB Vektoren, wie beispielsweise pKlδmobsacB, und die in der WO 02/070685 und WO 03/014362 beschriebenen Vektoren. Diese sind in Escherichia coli, aber nicht in coryneformen Bakterien replikativ. Besonders geeignet sind Vektoren, die ein konditional negativ dominant wirkendes Gen wie beispielsweise das sacB-Gen (Levansucrase-Gen) von beispielsweise Bacillus oder das galK-Gen (Galaktosekinase-Gen) von beispielsweise Escherichia coli enthalten. (Unter einem konditional negativ dominant wirkenden Gen versteht man ein Gen, das unter bestimmten Bedingungen nachteilig beispielsweise toxisch für den Wirt ist, unter anderen Bedingungen aber keine negativen Auswirkungen auf den das Gen tragenden Wirt hat.) Diese ermöglichen die Selektion auf Rekombinationsereignisse, bei denen der Vektor aus dem Chromosom eliminiert wird. Weiterhin wurde von Nakamura et al . (US-A-6, 303, 383) ein Temperatur-sensitives Plasmid für coryneforme Bakterien beschrieben, das lediglich bei Temperaturen unterhalb von 310C replizieren kann.
Der Vektor wird anschließend durch Konjugation beispielsweise nach der Methode von Schäfer (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) oder Transformation beispielsweise nach der Methode von Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) oder der Methode von Thierbach et al . (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)) in das coryneforme Bakterium überführt. Gegebenenfalls kann die Überführung der DNA auch durch Partikelbeschuss erzielt werden.
Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"- 4
Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation und erhält ein rekombinantes Bakterium.
Zur Identifizierung und Charakterisierung der erhaltenen Stämme können unter anderem die Methoden der Southern
Blotting Hybridisierung, der Polymerase-Kettenreaktion, der Sequenzbestimmung, die Methode des „Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) (Lay et al . Clinical Chemistry 43, 2262-2267 (1997)) oder Methoden der Enzymologie eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung eines coryneformen Bakteriums, bei dem man
a) ein erfindungsgemäßes Polynukleotid in ein coryneformes Bakterium überführt,
b) das im Chromosom des coryneformen Bakteriums vorhandene opcA-Gen, das für eine
Aminosäuresequenz mit L-Tyrosin an Position 107, L-Lysin an Position 219, L-Prolin an Position 233 und L-Tyrosin an Position 261 kodiert, gegen das
Polynukleotid aus a) austauscht, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, die eine oder mehrere der Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe
i) an 107 Position eine andere Aminosäure, bevorzugt L-Histidin,
ii) an 219 Position eine andere Aminosäure, bevorzugt L-Asparagin,
iii) an 233 Position eine andere Aminosäure, bevorzugt L-Serin, und
iv) an 261 Position eine andere Aminosäure, bevorzugt L-Serin besitzt, und 4
c) das gemäß Schritt a) und b) erhaltene coryneforme Bakterium vermehrt.
Auf diese Weise erhält man ein rekombinantes coryneformes Bakterium, welches anstelle des Wildtyp opcA-Gens ein (1) erfindungsgemäßes opcA-Allel enthält.
Ein weiteres erfindungsgemässes Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus besteht darin, dass man
a) ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, das für ein opcA-Polypeptid kodiert, in einen Mikrorganismus überführt,
b) das Polynukleotid in dem Mikroorganismus repliziert, und
c) den gemäß Schritt a) und b) erhaltenen Mikroorganismus vermehrt.
Auf diese Weise erhält man einen rekombinanten
Mikroorganismus, welcher mindestens eine (1) Kopie oder mehrere Kopien eines erfindungsgemäßen Polynukleotids enthält, das für eine OpcA-Polypeptid kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweist, ausgewählt aus der Gruppe:
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und 4
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind dementsprechend Wirte beziehungsweise Wirtszellen, bevorzugt
Mikroorganismen, besonders bevorzugt coryneforme Bakterien und Bakterien der Gattung Escherichia, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten. Gegenstand der Erfindung sind gleichfalls Mikrorganismen, die unter Verwendung der isolierten Polynukleotide hergestellt wurden. Derartige Mikroorganismen oder Bakterien werden auch als rekombinante Mikroorganismen oder rekombinante Bakterien bezeichnet. In gleicher Weise sind Vektoren, die die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten, Gegenstand der Erfindung. Schließlich sind Wirte, die diese Vektoren enthalten, ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Die erfindungsgemäßen, isolierten Polynukleotide können ebenfalls zur Erzielung einer Überexpression der von ihnen kodierten Polypeptide verwendet werden.
Unter Überexpression versteht man allgemein eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration oder Aktivität einer Ribonukleinsäure, eines Proteins oder eines Enzyms. Im Falle der vorliegenden Erfindung werden opcA-Allele beziehungsweise Polynukleotide überexprimiert, die für OpcA-Polypeptide kodieren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Aminosäuresequenzen des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe :
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin.
Es ist bekannt, dass durch wirtseigene Enzyme - sogenannte Aminopeptidasen - N-terminale Aminosäuren, insbesondere das N-terminale Methionin, vom gebildeten Polypeptid abgespalten werden können.
Die genannte Erhöhung der Konzentration oder Aktivität eines Genproduktes lässt sich beispielsweise dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der entsprechenden Polynukleotide um mindestens eine Kopie erhöht.
Eine weit verbreitete Methode zur Erhöhung der Kopienzahl besteht darin, dass man das entsprechende Gen oder Allel in einen Vektor, bevorzugt ein Plasmid, einbaut, der von einem coryneformen Bakterium repliziert wird. Geeignete Plasmidvektoren sind beispielsweise pZl (Menkel et al . , Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) oder die von Tauch et al . (Journal of Biotechnology 99, 79- 91 (2002)) beschriebenen pSELF-Vektoren. Ein
Übersichtsartikel zum Thema Plasmide in Corynebacterium glutamicum findet sich bei Tauch et al . (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).
Eine andere verbreitete Methode zur Erzielung einer Überexpression ist das Verfahren der chromosomalen
Genamplifikation . Bei dieser Methode wird mindestens eine zusätzliche Kopie des interessierenden Gens oder Allels in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums eingefügt. In einer Ausführungsform, wie sie beispielsweise bei Reinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) für das hom-thrB-Operon beschrieben ist, wird ein in C. glutamicum nicht-replikatives Plasmid, welches das interessierende Gen enthält, in ein coryneformes Bakterium überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines „cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens beziehungsweise Allels.
In einer anderen Ausführungsform, die in der WO 03/040373 und US-2003-0219881-A1 beschrieben ist, wird eine oder mehrere Kopie (n) des interessierenden Gens mittels mindestens zweier Rekombinationsereignisse in einen gewünschten Ort des Chromosoms von C. glutamicum eingefügt. Auf diese Weise wurde beispielsweise eine Kopie eines lysC- Allels, das für eine L-Lysin insensitive Aspartatkinase kodiert, in das gluB-Gen von C. glutamicum eingebaut.
In einer weiteren Ausführungsform, die in der WO 03/014330 und US-2004-0043458-A1 beschrieben ist, wird mittels mindestens zweier Rekombinationsereignisse am natürlichen Ort mindestens eine weitere Kopie, vorzugsweise in tandem- Anordnung zu dem bereits vorhandenen Gen oder Allel, des interessierenden Gens eingebaut. Auf diese Weise wurde beispielsweise eine tandem-Duplikation eines lysCFBR-Allels am natürlichen lysC-Genort erzielt.
Eine weitere Methode zur Erzielung einer Überexpression besteht darin, das entsprechende Gen beziehungsweise Allel in funktioneller Weise (operably linked) mit einem Promotor beziehungsweise einer Expressionskassette zu verknüpfen. Geeignete Promotoren für Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise in dem Übersichtsartikel von Patek et al . (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003) beschrieben. Weiterhin können die hinlänglich bekannten von Mann et al . (Gene 69(2), 301-315 (1988)) und Mann und Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)) beschriebenen 4
Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc verwendet werden. Ein derartiger Promotor kann beispielsweise stromaufwärts der Kodierregion eines erfindungsgemäßen opcA-Allels, typischerweise im Abstand von ungefähr 1 - 500 oder 1 -334 Nukleotiden vom Startkodon, eines rekombinanten coryneformen Bakteriums eingefügt werden. Ein derartiger Promotor kann naturgemäß ebenfalls stromaufwärts des opcA- Allels einer erfindungsgemäßen Mutante eingefügt werden. Es ist weiterhin möglich ein erfindungsgemäßes isoliertes Polynukleotid, das für eine erfindungsgemäße Variante des
OpcA-Polypeptides kodiert, mit einem Promotor zu verknüpfen und die erhaltene Expressionseinheit in ein extrachromosomal replizierendes Plasmid oder in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums einzubauen.
Darüberhinaus kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression des betreffenden Gens oder Allels durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Durch die Maßnahmen der Überexpression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus beziehungsweise Elternstammes erhöht. Unter einem Ausgangs-Mikroorganismus oder
Elternstamm versteht man einen Mikroorganismus, an dem die Massnahmen der Erfindung durchgeführt werden.
Die Konzentration des Proteins kann über 1- und 2- dimensionale Proteingelauftrennung und anschließende optische Identifizierung der Proteinkonzentration mit enstprechender Auswertesoftware im Gel bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al . (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)) beschriebene Vorgehensweise. Die
Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot- Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al . , Molecular cloning: a laboratory manual . 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N. Y., 1989) und anschließender optischer Auswertung mit ensprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)) bestimmt werden.
Gegenstand der Erfindung sind dementsprechend Verfahren zur Überexpression der erfindungsgemäßen OpcA-Polypeptide . Ein erfindungsgemässes Verfahren zur Überexpression besteht unter anderem darin, dass man die Kopienzahl eines erfindungsgemässen Polynukleotids, das für eine OpcA- Polypeptid-Variante mit einer Aminosäuresequenz kodiert, welche eine oder mehrere der Aminosäuren enthält, ausgewählt aus der Gruppe
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und 4
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
um mindestens eine (1) oder um mehrere Kopien erhöht. Ein weiteres erfindungsgemässes Verfahren besteht darin, dass man einen Promotor funktionell mit dem Polynukleotid verknüpft .
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Mikroorganismen, die eine erhöhte Konzentration eines erfindungsgemäßen OpcA-Polypeptides in ihrem Zellinneren aufweisen.
Gegebenenfalls besitzen diese Mikrorganismen eine erhöhte Aktivität der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase in ihrem Zellinneren .
Zusätzlich kann es für die verbesserte Produktion von L- Aminosäuren vorteilhaft sein, in den erfindungsgemäßen Mutanten oder rekombinanten Stämme eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat- Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine überzuexprimieren. Die Verwendung endogener Gene wird im allgemeinen bevorzugt.
Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nukleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Art vorhandenen Gene beziehungsweise Nukleotidsequenzen oder Allele.
So kann für die Herstellung von L-Lysin eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
• ein für ein Dihydrodipicolinat-Synthase kodierendes Gen dapA, wie beispielsweise das in der EP 0 197 335 beschriebene dapA-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,
• ein für eine Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierendes Gen zwf, wie beispielsweise das in der JP-A-09224661 und 4
EP-A-1108790 beschriebene zwf-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,
• die in der US-2003-0175911-A1 beschriebenen zwf-Allele von Corynebacterium glutamicum, die für ein Protein kodieren, bei dem beispielsweise das L-Alanin an Position 243 der Aminosäuresequenz durch L-Threonin ersetzt ist oder bei dem die L-Asparaginsäure an Position 245 durch L-Serin ersetzt ist,
• ein für eine Pyruvat-Carboxylase kodierendes Gen pyc, wie beispielsweise das in der DE-A-198 31 609 und EP 1108790 beschriebene pyc-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,
• das für das in der EP 1 108 790 beschriebene pyc-Allel von Corynebacterium glutamicum, das für ein Protein kodiert, bei dem L-Prolin an Position 458 der Aminosäuresequenz durch L-Serin ersetzt ist,
• die in der WO 02/31158 beschriebene pyc-Allele von Corynebacterium glutamicum, die für Proteine kodieren, welche gemäß Aspruch 1 einen oder mehrere der Aminosäureaustausche ausgewählt aus der Gruppe L- Glutaminsäure an Position 153 ersetzt durch L- Asparaginsäure, L-Alanin an Position 182 ersetzt durch L- Serin, L-Alanin an Position 206 ersetzt durch L-Serin, L- Histidin an Position 227 ersetzt durch L-Arginin, L- Alanin an Position 452 ersetzt durch Glycin und L- Asparaginsäure an Position 1120 ersetzt durch L- Glutaminsäure tragen (Figur 2A von WO 02/31158 gibt zwei verschiedene Startpositionen für die Pyruvat-Carboxylase an, die sich um eine Länge entsprechend 17 Aminosäuren unterscheiden. Dementsprechend entspricht die Position
153 nach Anspruch 1 von WO 02/31158 der Position 170 von Fig.2A von WO 02/31158, die Position 182 nach Anspruch 1 der Position 199 von Fig.2A, die Position 206 nach Anspruch 1 der Position 223 von Fig. 2A, die Position 227 5
nach Anspruch 1 der Position 244 von Fig.2A, die Position 452 nach Anspruch 1 der Position 469 von Fig. 2A, die Position 1120 nach Anspruch 1 der Position 1137 von Fig.2B. In Figur 2A von WO 02/31158 ist weiterhin ein Aminosäureaustausch A (Alanin) gegen G (Glycin) an
Position 472 angegeben. Die Position 472 des Proteins mit der N terminalen Sequenz MTA entspricht der Position 455 des Proteins mit der N-terminalen Sequenz MST gemäß Fig. 2A. In Fig. 2B von WO 02/31158 ist weiterhin ein Aminosäureaustausch D (Asparaginsäure) gegen E
(Glutaminsäure) an Position 1133 des Proteins mit dem N- Terminus MTA angegeben.),
• ein für eine Aspartatkinase kodierendes lysC Gen wie beispielsweise das als SEQ ID NO: 281 in der EP-A-1108790 (Siehe auch Zugangsnummer AX120085 und 120365) und das als SEQ ID NO: 25 in der WO 01/00843 (Siehe Zugangsnummer AX063743) beschriebene von lysC-Gen des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum,
• ein für eine feed-back resistente Aspartatkinase Variante kodierendes lysCFBR Allel, insbesondere entsprechend
Tabelle 1,
• ein für ein Lysin-Export-Protein kodierendes Gen lysE, wie beispielsweise das in der DE-A-195 48 222 beschriebene lysE-Gen von des Wildtyps Corynebacterium glutamicum,
• das für das Zwal-Protein kodierende Gen zwal des Wildtyps von Corynebacterium glutamicum (US 6,632,644)
überexprimiert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Verwendung der erfindungsgemäßen Allele des opcA-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe 5
• ein für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierendes Gen pgi, wie beispielsweise das in der US 6,586,214 und US 6,465,238 beschriebene pgi-Gen von Corynebacterium glutamicum,
• ein für die Homoserin-Dehydrogenase kodierendes Gen hom, wie beispielsweise das in der EP-A-0131171 beschriebene hom-Gen von Corynebacterium glutamicum,
• ein für die Homoserin-Kinase kodierendes Gen thrB, wie beispielsweise das von Peoples et al . (Molecular Microbiology 2 (1988): 63 - 72)) beschriebene thrB-Gen von Corynebacterium glutamicum und
• ein für die Phosphofruktokinase kodierendes Gen pfkB, wie beispielsweise das in der WO 01/00844 (Sequenz Nr. 57) beschriebene pfkB-Gen von Corynebacterium glutamicum,
abzuschwächen oder auszuschalten.
Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt. 5
Als Mutationen zur Erzeugung einer Abschwächung kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen von mindestens einem (1) Basenpaar bzw. Nukleotid in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des durch die Mutation hervorgerufenen Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense mutations") oder Nichtsinnmutationen („nonsense mutations") gesprochen. Die Fehlsinnmutation führt zu einem Austausch einer gegebenen Aminosäure in einem Protein gegen eine andere, wobei es sich insbesondere um einen nichtkonservativen Aminosäureaustausch handelt. Hierdurch wird die Funktionsfähigkeit bzw. Aktivität des Proteins beeinträchtigt und auf einen Wert von 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% reduziert. Die Nichtsinnmutation führt zu einem Stopp-Kodon im
Kodierbereich des Gens und damit zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), die dazu führen, dass falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als Folge der Mutation ein Stopp-Kodon im Kodierbereich, so führt dies ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation.
Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) , dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden. Weitere Maßnahmen sind im Stand der Technik beschrieben. 5
Die durch die Massnahmen der Erfindung erhaltenen isolierten coryneformen Bakterien zeigen eine im Vergleich zum eingesetzten Ausgangsstamm beziehungsweise Elternstamm erhöhte Ausscheidung beziehungsweise Produktion der gewünschten Aminosäure in einem Fermentationsprozess .
Unter isolierten Bakterien sind die erfindungsgemäßen, isolierten beziehungsweise erzeugten Mutanten und rekombinanten Bakterien, insbesonders coryneformer Bakterien, zu verstehen, welche ein opcA-Allel enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid kodiert, das einen oder mehrere der beschriebenen Aminosäureaustausche an den Position 107, 219, 233 und 261 enthält.
Die Leistung der isolierten Bakterien bzw. des Fermentationsprozesses unter Verwendung derselben bezüglich eines oder mehrerer der Parameter ausgewählt aus der Gruppe der Produkt-Konzentration (Produkt pro Volumen) , der Produkt-Ausbeute (gebildetes Produkt pro verbrauchter Kohlenstoff-Quelle) und der Produkt-Bildung (gebildetes Produkt pro Volumen und Zeit) oder auch anderer Prozess- Parameter und Kombinationen davon, wird um mindestens 0,5%, mindestens 1%, mindestens 1,5% oder mindestens 2% bezogen auf den Ausgangstamm bzw. Elternstamm bzw. den Fermentationsprozess unter Verwendung derselben verbessert.
Die erfindungsgemäßen, isolierten coryneformen Bakterien können kontinuierlich - wie beispielsweise in der
PCT/EP2004/008882 beschrieben- oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung allgemeiner Art über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) verfügbar.
Das zu verwendende Kulturmedium beziehungsweise Fermentationsmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von
Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology,, der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten. Die Begriffe Kulturmedium und Fermentationsmedium beziehungsweise Medium sind gegenseitig austauschbar .
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Laktose, Fructose, Maltose, Melasse, Saccharose-haltige Lösungen aus der Zuckerrüben- oder Zuckerrohrherstellung, Stärke, Stärkehydrolysat und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin, Methanol und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze beispielsweise in Form von Chloriden oder Sulfaten von Metallen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und Eisen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren beispielsweise Homoserin und Vitamine beispielsweise Thiamin, Biotin oder Pantothensäure zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen der jeweiligen Aminosäure zugesetzt werden.
Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH - Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Der pH wird im Allgemeinen auf einen Wert von 6,0 bis 9,0 vorzugsweise 6,5 bis 8 eingestellt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder
Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Verwendung von Flüssigkeiten, die mit Wasserstoffperoxid angereichert sind, ist ebenfalls möglich. Gegebenenfalls wird die Fermentation bei Überdruck, beispielsweise bei einem Druck von 0,03 bis 0,2 MPa, gefahren. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 2O0C bis 450C und vorzugsweise bei 250C bis 4O0C. Bei batch-Verfahren wird die Kultivierung solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum der gewünschten Aminosäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise 5
innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere Kultivierungszeiten möglich .
Geeignete Fermentationsmedien sind unter anderem in der US 6,221,636, in der US 5,840,551, in der US 5,770,409, in der US 5,605,818, in der US 5,275,940 und in der US 4,224,409 beschrieben.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al . (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al . (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure bei dem man
a) ein isoliertes coryneformes Bakterium in einem geeignetem Medium fermentiert, wobei das Bakterium ein für ein OpcA-Polypeptid kodierendes Gen enthält, welches eines oder mehrere der Aminosäuren besitzt, ausgewählt aus der Gruppe
i) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
ii) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
iii) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und iv) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, und
b) die L-Aminosäure in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen des isolierten coryneformen Bakteriums anreichert .
Die auf diese Weise hergestellte Fermentationsbrühe wird anschließend gesammelt und vorzugsweise zu einem festen oder flüssigen Produkt weiterverarbeitet.
Unter einer Fermentationsbrühe versteht man ein
Fermentationsmedium, in dem ein Mikroorganismus für eine gewisse Zeit und bei einer gewissen Temperatur kultiviert wurde. Das Fermentationsmedium beziehungsweise die während der Fermentation eingesetzten Medium enthält/enthalten sämtliche Substanzen beziehungsweise Komponenten, die eine Vermehrung des Mikroorganismus und eine Bildung der gewünschten Aminosäure sicherstellt.
Bei Abschluss der Fermentation enthält die entstandene Fermentationsbrühe dementsprechend a) die infolge der Vermehrung der Zellen des Mikroorganismus entstandene Biomasse des Mikroorganismus, b) die im Laufe der Fermentation gebildete gewünschte Aminosäure, c) die im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte und d) die durch die Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile des/der eingesetzten Fermentationsmediums/
Fermentationsmedien beziehungsweise der Einsatzstoffe wie beispielsweise Vitamine wie Biotin, Aminosäuren wie Homoserin oder Salze wie Magnesiumsulfat.
Zu den organischen Nebenprodukte gehören Stoffe, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen gegebenenfalls neben der jeweiligen erwünschten L- Aminosäure erzeugt und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Hierzu zählen L-Aminosäuren, die im Vergleich zur 5
erwünschten Aminosäure weniger als 30%, 20% oder 10% ausmachen. Hierzu gehören weiterhin organische Säuren, die ein bis drei Carboxyl-Gruppen tragen wie zum Beispiel Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Apfelsäure oder Fumarsäure. Schließlich gehören dazu auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose.
Typische für industrielle Zwecke geeignete Fermentationsbrühen haben einen Aminosäuregehalt von 40 g/kg bis 180 g/kg oder 50 g/kg bis 150 g/kg. Der Gehalt an Biomasse (als getrocknete Biomasse) beträgt im Allgemeinen 20 bis 50 g/kg.
Im Falle der Aminosäure L-Lysin sind im Stand der Technik im wesentlichen vier verschiedene Produktformen bekannt.
Eine Gruppe L-Lysin haltiger Produkte umfasst konzentrierte, wässrige, alkalische Lösungen von aufgereinigtem L-Lysin (EP-B-0534865) . Eine weitere Gruppe, wie beispielsweise in der US 6,340,486 und US 6,465,025 beschrieben, umfasst wässrige, saure, Biomasse-haltige Konzentrate von L-Lysin-haltigen Fermentationsbrühen. Die bekannteste Gruppe fester Produkte umfasst pulverförmige oder kristalline Formen von aufgereinigtem beziehungsweise reinem L-Lysin, das typischerweise in Form eines Salzes wie zum Beispiel L-Lysin-Monohydrochlorid vorliegt. Eine weitere Gruppe fester Produktformen ist beispielsweise in der EP-B-0533039 beschrieben. Die dort beschriebene
Produktform enthält neben L-Lysin den größten Teil der während der fermentativen Herstellung verwendeten und nicht verbrauchten Einsatzstoffe und gegebenfalls die Biomasse des eingesetzten Mikroorganismus mit einem Anteil von >0% - 100%.
Entsprechend der verschiedenen Produktformen kennt man verschiedenste Verfahren, bei denen die L-Aminosäure aus der Fermentationsbrühe gesammelt, isoliert oder gereinigt 5
wird, um das L-Aminosäure haltige Produkt oder die gereinigte L-Aminosäure herzustellen.
Zur Herstellung von festen, reinen L-Aminosäuren werden im wesentlichen Methoden der Ionenaustauschchromatographie gegebenfalls unter Verwendung von Aktivkohle und Methoden der Kristallisierung angewendet. Im Falle des Lysin erhält man auf diese Weise die entsprechende Base oder ein entsprechendes Salz wie beispielsweise das Monohydrochlorid (Lys-HCl) oder das Lysinsulfat (LVS2-H2SO4) .
Im Falle des Lysin ist in der EP-B-0534865 ein Verfahren zur Herstellung wässriger, basischer L-Lysin haltiger Lösungen aus Fermentationsbrühen beschrieben. Bei dem dort beschriebenen Verfahren wird die Biomasse aus der Fermentationsbrühe abgetrennt und verworfen. Mittels einer Base wie beispielsweise Natrium-, Kalium- oder
Ammoniumhydroxid wird ein pH-Wert zwischen 9 bis 11 eingestellt. Die mineralischen Bestandteile (anorganischen Salze) werden nach Konzentrierung und Abkühlung durch Kristallisation aus der Brühe abgetrennt und entweder als Dünger verwendet oder verworfen.
Bei Verfahren zur Herstellung von Lysin unter Verwendung der erfindungsgemäßen Bakterien werden solche Verfahren bevorzugt, bei denen Produkte erhalten werden, die Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten. Diese werden insbesondere als Tierfuttermitteladditive verwendet.
Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden wie z.B. der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Gegebenenfalls wird die Biomasse beziehungsweise die Biomasse enthaltene Fermentationsbrühe während eines geeigneten Verfahrensschrittes inaktiviert beispielsweise durch thermische Behandlung (Erhitzen) oder durch Säurezugabe. Die chemischen Bestandteile der Biomasse sind unter anderem die Zellhülle, beispielsweise das Peptidoglykan und das Arabinogalaktan, das Protein bzw. Polypeptid, beispielsweise das Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Polypeptid, Lipide und Phospholipide und Nukleinsäuren (DNA und RNA) , beispielsweise Polynukleotide enthaltend die erfindungsgemäße Mutation. Als Folge der Massnahmen der Inaktivierung und/oder der weitereren Verfahrensschritte (beispielsweise Ansäuerung, Sprühtrocknung, Granulation etc.) liegen Nukleinsäuren typischerweise als Fragmente mit eine Länge von unter anderem ≥40 - 60 bp, >60 - 80 bp, >80
- 100 bp, >100 - 200 bp, >200 - 300 bp, >300 - 400 bp, >400
- 500 bp, >500 - 750 bp, >750 - 1000 bp, >1000 -1250 bp, >1250 - 1500 bp, >1500 - 1750 bp, >1750 - 2000 bp, >2000 - 2500 bp, >2500 - 3000 bp, >3000 - 4000 bp, >4000 - 5000 bp vor.
In einer Verfahrensweise wird die Biomasse vollständig oder nahezu vollständig entfernt, sodass keine (0 %) oder höchstens 30%, höchstens 20%, höchstens 10%, höchstens 5%, höchstens 1% oder höchstens 0,1% Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einer weiteren Verfahrensweise wird die Biomasse nicht oder nur in geringfügigen Anteilen entfernt, sodass sämtliche (100%) oder mehr als 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder 99,9% Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einem erfindungsgemäßen Verfahren wird dementsprechend die Biomasse in Anteilen ≥ 0% bis ≤ 100% entfernt .
Schließlich kann die nach der Fermentation erhaltene Fermentationsbrühe vor oder nach der vollständigen oder teilweisen Entfernung der Biomasse mit einer anorganischen Säure wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure oder organischen Säure wie beispielsweise Propionsäure auf einen sauren pH Wert gestellt werden (GB 1,439,728 oder EP 1 331 220). Es ist gleichfalls möglich die Fermentationsbrühe mit der vollständig enthaltenen Biomasse anzusäuern (US 6,340,486 oder US 6,465,025). Schließlich kann die Brühe auch durch Zusatz von Natriumbisulfit (NaHSO3, GB 1,439,728) oder einem anderen Salz beispielsweise Ammonium-, Alkali- oder Erdalkalisalz der schwefligen Säure stabilisiert werden.
Bei der Abtrennung der Biomasse werden gegebenenfalls in der Fermentationsbrühe enthaltene organische oder anorganische Feststoffe teilweise oder ganz entfernt. Die in der Fermentationsbrühe gelösten organischen Nebenprodukte und die gelösten nicht verbrauchten
Bestandteile des Fermentationsmediums (Einsatzstoffe) bleiben mindestens teilweise (> 0%) , bevorzugt zu mindestens 25%, besonders bevorzugt zu mindestens 50% und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 75% im Produkt. Gegebenenfalls bleiben diese auch vollständig (100%) oder nahezu vollständig das heißt > 95% oder > 98% im Produkt. In diesem Sinne bedeutet der Begriff
„Fermentationsbrühebasis", dass ein Produkt mindestens einen Teil der Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält.
Anschließend wird der Brühe mit bekannten Methoden wie z.B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose oder durch Nanofiltration Wasser entzogen beziehungsweise eingedickt oder konzentriert. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren wie zum Beispiel in der zirkulierenden Wirbelschicht gemäß PCT/EP2004/006655 beschrieben, zu rieselfähigen Produkten insbesondere zu einem feinteiligen Pulver oder vorzugsweise grobkörnigem Granulat aufgearbeitet werden. Gegebenenfalls wird aus dem erhaltenen Granulat durch Sieben oder Staubabtrennung ein gewünschtes Produkt isoliert. Es ist ebenfalls möglich, die Fermentationsbrühe direkt d. h. ohne vorherige Aufkonzentrierung durch Sprühtrocknung oder Sprühgranulation zu trocknen.
Unter „rieselfähig" versteht man Pulver, die aus einer Serie von Glasauslaufgefäßen mit verschieden großen
Auslauföffnungen mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5 mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).
Mit „feinteilig" ist ein Pulver mit überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngröße von 20 bis 200 μm Durchmesser gemeint .
Mit „grobkörnig" ist ein Produkt mit einem überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngröße von 200 bis 2000 μm Durchmesser gemeint.
Die Korngrößenbestimmung kann mit Methoden der
Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden. Die entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur
„Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" von R. H. Müller und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) oder im Lehrbuch „Introduction to Particle Technology" von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998) beschrieben.
Das rieselfähige, feinteilige Pulver kann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden.
Der Begriff „staubfrei" bedeutet, daß das Produkt lediglich geringe Anteile (< 5 %) an Körngrößen unter 100 μm Durchmesser enthält.
„Lagerbar", im Sinne dieser Erfindung, bedeutet ein
Produkt, das mindestens ein (1) Jahr oder länger, bevorzugt mindestens 1,5 Jahre oder länger, besonders bevorzugt zwei (2) Jahre oder länger in trockener und kühler Umgebung gelagert werden kann ohne das ein wesentlicher Verlust (< 5%) der jeweiligen Aminosäure auftritt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung eines L-Aminosäure, bevorzugt L-Lysin oder L-Tryptophan, haltigen Produktes, bevorzugt Tierfuttermittel-Additivs, aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte
a) Kultivierung und Fermentation eines L-Aminosäure ausscheidenden coryneformen Bakteriums, welches mindestens ein opcA-Allel enthält, das für ein OpcA- Polypeptid kodiert, welches eine oder mehrere der Aminosäuren besitzt, ausgewählt aus der Gruppe
i) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
ii) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
iü) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
iv) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, und
in einem Fermentationsmedium,
b) Entfernung der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100 Gew.-%, und
c) Trocknung der gemäß a) und/oder b) erhaltenen Fermentationsbrühe, um das Produkt in der gewünschten Pulver- oder Granulatform zu erhalten 4
wobei gegebenenfalls vor Schritt b) oder c) eine Säure ausgewählt aus der Gruppe Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Salzsäure hinzugefügt wird.
Vorzugsweise wird im Anschluss an Schritt a) oder b) Wasser aus der L-Aminosäure haltigen Fermentationsbrühe entfernt (Aufkonzentration) .
Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten (EP0743016A) Stearaten.
Weiterhin ist es vorteilhaft die Oberfläche der erhaltenen Granulate mit Ölen zu versehen so wie es in der WO 04/054381 beschrieben ist. Als Öle können Mineralöle, pflanzliche Öle oder Mischungen pflanzlicher Öle verwendet werden. Beispiele für derartige Öle sind Sojaöl, Olivenöl, Sojaöl/Lecithingemische . In gleicher Weise sind auch
Silikonöle, Polyethylenglykole oder Hydroxyethycellulose geeignet. Durch die Behandlung der Oberflächen mit den genannten Ölen erzielt man eine erhöhte Abriebfestigkeit des Produktes und einen Verringerung des Staubanteils. Der Gehalt an Öl im Produkt beträgt 0,02 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt 0,02 bis 1,0 Gew.-%, und ganz besonders bevorzugt 0,2 bis 1,0 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Futtermitteladditivs .
Bevorzugt sind Produkte mit einem Anteil von ≥ 97 Gew.-% einer Korngröße von 100 bis 1800 μm oder einem Anteil von ≥ 95 Gew.-% einer Korngröße von 300 bis 1800 μm Durchmesser. Der Anteil an Staub d. h. Partikeln mit einer Korngrösse < 100 μm liegt bevorzugt bei > 0 bis 1 Gew.- besonders bevorzugt bei maximal 0,5 Gew.-%. 5
Alternativ kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen
Verdickungs- oder Bindemitteln vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
Schließlich kann das Produkt auch durch
Beschichtungsverfahren („Coating") mit Filmbildnern wie beispielsweise Metallcarbonate, Kieselsäuren, Silikate, Alginate, Stearate, Stärken, Gummis und Celluloseether, wie in der DE-C-4100920 beschrieben, in einen Zustand gebracht werden, in dem es stabil gegenüber der Verdauung durch Tiermägen insbesondere dem Magen von Wiederkäuern ist.
Zur Einstellung einer gewünschten Aminosäurekonzentration im Produkt kann je nach Anforderung die entsprechende Aminosäure während des Verfahrens in Form eines Konzentrates oder gebenenfalls einer weitgehend reinen Substanz beziehungsweise dessen Salz in flüssiger oder fester Form hinzugefügt werden. Diese können einzeln oder als Mischungen zur erhaltenen oder aufkonzentrierten Fermentationsbrühe, oder auch während des Trocknungs- oder Granulationsprozesses hinzugefügt werden.
Im Falle des Lysin wird bei der Herstellung Lysin-haltiger Produkte das Verhältnis der Ionen bevorzugt so eingestellt, dass das Ionenverhältnis entsprechend nachstehender Formel
2x [SO4 2"] + [Cl"] - [NH4 +] - [Na+] - [K+] -2x [Mg+] -2x [Ca2+] / [L-Lys]
0,68 bis 0,95, bevorzugt 0,68 bis 0,90 ergibt so wie von Kushiki et al . in der US 20030152633 beschrieben.
Im Falle des Lysin hat das auf diese Weise hergestellte feste Produkt auf Fermentationsbrühebasis einen Lysingehalt (als Lysinbase) von 10 Gew.-% bis 70 Gew.-% oder 20 Gew.-% bis 70 Gew.-%, bevorzugt 30 Gew.-% bis 70 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 40 Gew.-% bis 70 Gew.-% bezogen auf die Trockenmasse des Produkts. Maximale Gehalte an Lysinbase von 71 Gew.-% , 72 Gew.-%, 73 Gew.-% sind ebenfalls möglich.
Im Falle einer elektrisch neutralen Aminosäure wie dem L- Tryptophan hat das auf diese Weise hergestellte feste Produkt auf Fermentationsbrühebasis einen Aminosäuregehalt von mindestens 5 Gew.-%, 10 Gew.-%, 20 Gew.-%, 30 Gew.-% und maximal 50 Gew.-%, 60 Gew.-%, 70 Gew.-%, 80 Gew.-%, 90 Gew.-% oder bis 95 Gew.-%.
Der Wassergehalt des festen Produktes beträgt bis zu 5 Gew.-%, bevorzugt bis zu 4 Gew.-%, und besonders bevorzugt weniger als 3 Gew.-%.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein L-Lysin haltiges Futtermitteladditiv auf Fermentationsbrühebasis, welches folgende Merkmale aufweißt
a) einen Lysingehalt (als Base) von mindestens 10 Gew.-% bis maximal 73 Gew.-%,
b) einen Wassergehalt von höchstens 5 Gew.-%, und
c) einen Biomassegehalt ensprechend mindestens 0,1 % der in der Fermentationsbrühe enthaltenen Biomasse, wobei die gegebenenfalls inaktivierte Biomasse aus erfindungsgemäßen coryneformen Bakterien gebildet wird.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin auch ein L- Tryptophan haltiges Futtermitteladditiv auf Fermentationsbrühebasis, welches folgende Merkmale aufweißt
a) einen Tryptophangehalt von mindestens 5 Gew.-% bis maximal 95 Gew.-%, 7
b) einen Wassergehalt von höchstens 5 Gew.-%, und
c) einen Biomassegehalt ensprechend mindestens 0,1 % der in der Fermentationsbrühe enthaltenen Biomasse, wobei die gegebenenfalls inaktivierte Biomasse aus erfindungsgemäßen coryneformen Bakterien gebildet wird.
Eine Mutante von Corynebacterium glutamicum mit der Bezeichnung DM1797, die den Aminosäureaustausch lysC T311I in der Aspartatkinase enthält, wurde am 28. Oktober 2004 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 16833 hinterlegt.
Die erfindungsgemäße Mutante Corynebacterium glutamicum DM1825, die L-Histidin an Position 107, L-Lysin an Position 219, L-Prolin an Position 233 und L-Tyrosin an Position 261 der Aminosäuresequenz des OpcA-Polypeptids enthält, wurde am 05. April 2005 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM 17223 hinterlegt.
Beispiel 1
Mutagenese des L-Lysin produzierenden Stammes DM1797
Der Corynebacterium glutamicum Stamm DM1797 wurde als Ausgangsstamm für die Mutagenese mit N-Methyl-N' -Nitro-N- Nitrosoguanidin (MNNG) eingesetzt. Der Stamm DM1797 ist eine Aminoethylcystein-resistente Mutante von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 und unter der Bezeichnung DSM16833 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
Der Stamm DM1797 wurde in 10 ml LB-Bouillon (Merck, Darmstadt, Deutschland) , die in einem 100 ml Erlenmeyerkolben enthalten waren, für 24 Stunden bei 330C und 200 rpm auf einem Rotations-Schüttler vom Typ Certomat BS-I (B. Braun Biotech International, Melsungen,
Deutschland) kultiviert. Anschließend wurde die Kultur abzentrifugiert, das Sediment in 10 ml 0,9% NaCl-Lösung resuspendiert, die erhaltene Suspension erneut abzentrifugiert und das erhaltene Sediment in 10 ml 0,9% NaCl-Lösung aufgenommen. 5 ml dieser Zellsuspension wurden mit 400μg/ml MNNG für 15 Minuten bei 3O0C und 200 rpm auf einem Schüttler (siehe oben) behandelt. Anschließend wurde der Mutageneseansatz abzentrifugiert und das Sediment in 10 ml 2% Na-Thiosulfat in 0,9% NaCl-Puffer (pH = 6,0) aufgenommen. Die Zellsuspension wurde anschließend im Verhältnis 1:1000, 1:10000 und 1:100000 mit 0,9% NaCl- Lösung verdünnt, und Aliquots auf Hirn-Herz-Agar (Merck, Darmstadt, Deutschland) ausplattiert. Auf diese Weise wurden ungefähr 2500 Mutanten isoliert.
Beispiel 2
Leistungstest der Mutanten des Stammes DM1797 Die in Beispiel 1 erhaltenen Mutanten wurden in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurden die Klone zunächst auf Hirn-Herz-Agarplatten (Merck, Darmstadt, Deutschland) für 24 Stunden bei 330C vermehrt. Ausgehend von diesen Agarplattenkulturen wurde je eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben) . Als Medium für die Vorkultur wurde das Medium MM verwendet. Die Vorkultur wurde 24 Stunden bei 330C und 240 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde ebenfalls das Medium MM verwendet.
Medium MM
CSL 5 g/l
MOPS 20 g/l
Glucose (getrennt autoklaviert) 50 g/l
Salze :
(NH4) 2SO4) 25 g/l
KH2PO4 0,1 g/l
MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l
CaCl2 * 2 H2O 10 mg/1
FeSO4 * 7 H2O 10 mg/1
MnSO4 * H2O 5,0mg/l
Biotin (sterilfiltriert) 0,3 mg/1
Thiamin * HCl (sterilfiltriert) 0,2 mg/1 7
CaCO3 25 g/l
CSL (Corn Steep Liquor) , MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert . Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgte in Volumina von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen enthalten waren. Die Temperatur betrug bei 330C, die Umdrehungszahl war 250 rpm und die Luftfeuchte 80%.
Nach 24 Stunden wurde die optische Dichte (OD) bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch
Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt. Eine Mutante, die sich durch eine erhöhte Lysinbildung auszeichnete, wurde als DM1825 bezeichnet.
Tabelle 1
Figure imgf000071_0001
Beispiel 3
Sequenzierung des opcA-Gens der Mutante DM1825 7
Aus dem Klon DM1825 wurde mit der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde ein DNA-Abschnitt amplifiziert, welcher das opcA-Gen trägt. Hierfür wurden folgende Oligonukleotide als Primer verwendet :
opcA-Al (SEQ ID NO: 11) : 5S cacctggcgc aggccataat 3S
opcA-El (SEQ ID NO: 12) : 5S cgcgtgcgcg tactacatca 3S
Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert. Sie ermöglichen die Amplifizierung eines ca. 1,05 kb langen DNA-Abschnittes, welcher das opcA-Gen trägt. Der Primer opcA-Al bindet an die Region entsprechend Position 302 bis 321 des zu SEQ ID NO: 3 komplementären Stranges. Der Primer opcA-El bindet an die Region ensprechend Position 1335 bis 1316 des Stranges gemäß SEQ ID NO: 3.
Die PCR-Reaktion wurde mit der Phusion High Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland) durchgeführt. Der Reaktionsansatz wurde nach Herstellerangaben angesetzt und enthielt bei 50 μl Gesamtvolumen 10 μl des mitgelieferten 5 x Phusion HF Buffer, Desoxynucleosidtriphosphate in einer Konzentration von jeweils 200 μM, Primer in einer Konzentration von 0,5 μM, ungefähr 50 ng Template-DNA und 2 Units Phusion Polymerase. Durch Zugabe von H2O wurde das Volumen auf 50 μl eingestellt .
Der PCR-Ansatz wurde zuerst einer einleitenden Denaturierung bei 980C für 30 Sekunden unterzogen. Darauf folgten sich 35x wiederholend ein Denaturierungsschritt bei 980C für 20 Sekunden, ein Schritt zum Binden der Primer an die vorgelegte DNA bei 6O0C für 20 Sekunden und der 7
Extensionsschritt zur Verlängerung der Primer bei 720C für 60 Sekunden. Nach dem abschliessenden Extensionsschritt für 5 Minuten bei 720C wurde der PCR-Ansatz einer Agarosegel- Elektrophorese (0,8% Agarose) unterworfen. Ein DNA-Fragment von ca. 1,85 kb Länge wurde identifiziert, aus dem Gel isoliert und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen, (Hilden, Deutschland) aufgereinigt .
Die Nukleotidsequenz des amplifizierten DNA-Fragmentes bzw. PCR-Produktes wurde von der Firma Agowa (Berlin, Deutschland) bestimmt. Die erhaltene Sequenz der
Kodierregion des opcA-Allels ist in der SEQ ID NO: 7 dargestellt. Die sich mit Hilfe des Programmes Patentin ergebende Aminosäuresequenz des dazugehörigen Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase Proteins ist in der SEQ ID NO: 8 dargestellt.
Die Nukleotidsequenz der Kodierregion des opcA-Allels der Mutante DM1825 enthält an Position 319 Cytosin, an Position 657 Cytosin, an Position 697 Thymin und an Position 781 Cytosin (Siehe SEQ ID NO: 5) . Das Gen des Wildtyps (Siehe SEQ ID NO: 1) enthält an der Position 319 Thymin, an Position 657 Adenin, an Position 697 Cytosin und an Position 781 Thymin. Diese Austausche der Nukleobasen führen zu Aminosäureaustauschen an den Positionen 107, 219, 233, und 261 der resultierenden Aminosäuresequenz (Vergleiche SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 6) . Diese
Mutationen werden im Folgenden als opcAYl07H, opcAK219N, opcAP233S und opcAY26lH bezeichnet. Weiterhin enthält das opcA-Allel von DM1825 noch drei weitere Nukleotidaustausche an den Positionen 402, 600 und 648 (Siehe SEQ ID N0:7), die nicht zu einem Aminosäureaustausch führen („stille Mutationen")
Beispiel 4
Konstruktion des Austauschvektors pKlδmobsacB opcAaa4ex 7
Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurde ein Fragment enthaltend die Kodierregion des opcA-Allels amplifiziert, das die Mutationen opcAYl07H, opcAK219N, opcAP233S und opcAY26lH trägt. Als Template wurde die in Beispiel 3 gewonnene chromosomale DNA verwendet. Als Primer wurden die in Beispiel 3 eingesetzten Oligonukleotide opcA-Al (SEQ ID NO: 11) und opcA-El (SEQ ID NO: 12) ausgewählt .
Die PCR-Reaktion wurde mit der Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland) durchgeführt. Der Reaktionsansatz hatte die oben beschriebene Zusammensetzung. Die PCR wurde mit einer Ausnahme wie oben durchgeführt: der 72 °C-Extensionsschritt in der 35-fachen Wiederholung wurde jeweils nur für 30 Sekunden durchgeführt.
Das amplifizierte DNA Fragment von ca. 1,05 kb, welches die Kodierregion des opcA-Gens aus DM1825 trägt, wurde mit dem Zero Blunt TOPO Kit der Firma Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) in den Vektor pCR®Blunt II-TOPO ligiert. Anschliessend wurde der E. coli Stamm ToplO (Grant et al . , Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87
(1990) 4645-4649) mit dem Ligationsansatz nach Angaben des Kit-Herstellers (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) transformiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Merck, Darmstadt, Deutschland) , der mit 25 mg/1 Kanamycin supplementiert worden war. Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) isoliert und durch Behandlung jeweils einmal mit dem Restriktionsenzym BamHI und einmal mit dem Restriktionsenzym EcoRI mit anschliessender Agarosegel-Elektrophorese (0,8 %) überprüft. Das Plasmid wurde als pCRII_opcAaa4ex bezeichnet und ist in Figur 1 dargestellt.
Das Plasmid wurde mit der Restriktionsendonuklease EcoRI behandelt und durch Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Das so herausgespaltene, ca. 1,05 kb große Fragment wurde anschließend aus dem Gel isoliert und mit dem QIAquick Gel Extraction Kit der Firma Qiagen aufgereinigt .
Das dergestalt gereinigte DNA-Fragment enthält die beschriebenen Mutationen in opcA und besitzt EcoRI kompatible Enden (opcAaa4ex-Fragment) . Es wurde anschließend in den von Schäfer et al . (Gene, 145, 69-73 (1994) beschriebenen, mobilisierbaren Vektor pKlδmobsacB eingebaut, um einen Allel- beziehungsweise
Mutationsaustausch zu ermöglichen. Hierzu wurde pKlδmobsacB mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und die Enden mit alkalischer Phosphatase (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim, Deutschland) dephosphoryliert . Der so vorbereitete Vektor wurde mit dem opcAaa4ex-Fragment gemischt und der Ansatz mit dem Ready-To-Go T4 DNA Ligase Kit (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland) behandelt.
Anschließend wurde der E. coli Stamm S17-1 (Simon et al. , Bio/Technologie 1: 784-791, 1993) mit dem Ligationsansatz transformiert (Hanahan, In. DNA cloning. A practical approach. VoI .1. ILR-Press, CoId Spring Habor, New York, 1989) . Die Selektion auf Plasmid-tragende Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Tansformationsansatzes auf LB-Agar (Sambrock et al . , Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. CoId Spring Habor, New York, 1989), der mit 25 mg/1 Kanamycin supplementiert worden war.
Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktionsspaltung jeweils einmal mit dem Enzym BamHI und einmal mit dem Enzym EcoRI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese überprüft. Das Plasmid wurde pKl8mobsacB_opcAaa4ex genannt und ist in Figur 2 dargestellt .
Beispiel 5 Einbau der Mutationen opcAYl07H, opcAK219N, opcAP233S und opcAY26lH in den Stamm DM1797
Der in Beispiel 4 beschriebene Vektor pKlδmobsacB opcAaa4ex wurde nach dem Protokoll von Schäfer et al . (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) in den C. glutamicum Stamm DM1797 durch Konjugation transferiert. Der Vektor kann in DM1797 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er als Folge eines Rekombinationsereignisses im Chromosom integriert vorliegt. Die Selektion von Transkonjuganten, d. h. von Klonen mit integriertem pKlδmobsacB opcAaa4ex erfolgte durch Ausplattieren des Konjugationsansatzes auf LB-Agar, der mit 25 mg/1 Kanamycin und 50 mg/1 Nalidixinsäure supplementiert worden war. Kanamycin-resistente Transkonjuganten wurden anschließend auf mit Kanamycin (25 mg/1) supplementierten LB-Agarplatten ausgestrichen und für 24 Stunden bei 330C inkubiert. Zur Selektion von Mutanten, bei denen als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses die Exzision des Plasmides stattgefunden hatte, wurden die Klone 30 Stunden unselektiv in LB-Flüssigmedium kultiviert, anschließend auf LB-Agar, der mit 10% Sucrose supplementiert worden war ausgestrichen und 24 Stunden bei 330C bebrütet.
Das Plasmid pKl8mobsacB_opcAaa4ex enthält ebenso wie das Ausgangsplasmid pKlδmobsacB neben dem Kanamycin-
Resistenzgen eine Kopie des für die Levan-Sucrase aus Bacillus subtilis kodierenden sacB-Gens . Die durch Sucrose induzierbare Expression des sacB-Gens führt zur Bildung der Levan-Sucrase, die die Synthese des für C. glutamicum toxischen Produktes Levan katalysiert. Auf mit Sucrose supplementiertem LB-Agar wachsen daher nur solche Klone, bei denen das integrierte pKl8mobsacB_opcAaa4ex als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses exzisiert hat. In Abhängigkeit von der Lage des zweiten Rekombinationsereignisses in bezug auf den Mutationsort 7
findet bei der Exzision der Allelaustausch bzw. der Einbau der Mutation statt oder es verbleibt die ursprüngliche Kopie im Chromosom des Wirtes .
Anschließend wurde ein Klon gesucht, bei dem der gewünschte Austausch, d. h. der Einbau der Mutationen opcAYl07H, opcAK219N, opcAP233S und opcAY26lH, erfolgt war. Hierzu wurde von 20 Klonen mit dem Phänotyp „Wachstum in Gegenwart von Sucrose" und „Nicht-Wachstum in Gegenwart von Kanamycin" die Sequenz des opcA-Gens bestimmt. Auf diese Weise wurde ein Klon identifiziert, der die Mutationen opcAYl07H, opcAK219N, opcAP233S und opcAY26lH trägt. Dieser Stamm wurde als C. glutamicum DMl797_opcAaa4ex bezeichnet.
Beispiel 6
Vergleich der Leistung des Stammes DMl797_opcAaa4ex mit der des AusgangsStammes DM1797
Der Leistungtest wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Der Stamm DM1797 opcAaa4ex zeigte im Vergleich zu DM1797 eine erhöhte Lysinausscheidung ähnlich wie DM1825 (Siehe Tabelle 1) .
Kurze Beschreibung der Figuren:
Figur 1: Karte des Plasmids pCRII_opcAaa4ex
Figur 2: Karte des Plasmids pKlδmobsacB opcAaa4ex
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung. Bei der Angabe der Basenpaarzahl (bps) handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
pUC Replikationsursprung pUC
Kan : Kanamycin Resistenz-Gen
EcoRI : Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
BamHI : Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
opcA: kloniertes DNA-Fragment enthaltend die
Kodierregion des opcA-Allels der Mutante DM1825
sacB: sacB-Gen
RP4-mob: mob-Region mit dem Replikationsursprung für den Transfer (oriT)
oriV: Replikationsursprung V

Claims

7Patentansprüche
1. Isolierte Mutanten coryneformer Bakterien, welche ein Gen enthalten, das für ein OpcA-Polypeptid der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids Aminosäuren einzeln oder gemeinsam enthält, ausgewählt aus der Gruppe,
d) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin,
e) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin,
f) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, und
g) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin.
2. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den coryneformen Bakterien um ein Bakterium ausgewählt aus der Gruppe Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes und Corynebacterium aminogenes handelt.
3. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um
Corynebacterium glutamicum handelt.
4. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1, 2, oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um L-Aminosäure ausscheidende Bakterien handelt. 7
5. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um L-Lysin oder um L-Tryptophan ausscheidende Bakterien handelt.
6. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren, einzeln oder gemeinsam, ausgewählt sind aus der Gruppe
a) L-Histidin an Position 107,
b) L-Asparagin an Position 219,
c) L-Serin an Position 233, und
d) 261 L-Histidin an Position ist.
7. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, der (die) Aminosäuren in dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 ausgetauscht vorliegen.
8. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass der (die) Aminosäuren in dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 ausgetauscht vorliegen.
9. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen eine
Nukleotidsequenz umfasst, die mit der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von DNA gewonnen aus einem coryneformen Bakterium und unter Verwendung eines Primerpaares bestehend aus einem ersten Primer, umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO : 3 und einem zweitem Primer, umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO:3 erhältlich ist.
10. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Länge entsprechend 319 L-Aminosäuren umfasst.
11. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid von Position 107 bis 261 der Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz entsprechend Position 107 bis 261 von SEQ ID NO: 6 enthält.
12. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, das das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 90% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6.
13. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, das das Gen eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 90%, identisch ist mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7.
14. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Protein eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe
a) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6,
b) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6, einschließlich eines oder mehrerer konservativer Aminosäureaustausch (e) , und c) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6, einschließlich einer oder mehrerer Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren,
umfasst .
15. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen die Nukleotidsequenz, die zu 100 % identisch ist mit der von SEQ ID NO : 5 oder SEQ ID NO: 7, umfasst.
16. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 und 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass diese durch folgende Schritte erhältlich sind:
a) Behandlung coryneformer Bakterien, die die
Fähigkeit besitzen Aminosäuren auszuscheiden, mit einem mutagenen Agenz,
b) Isolierung und Vermehrung der in a) erzeugten Mutanten,
c) Bereitstellung von Nukleinsäure aus der in b) erhaltenen Mutanten,
d) Herstellung eines Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion, der
Nukleinsäure aus c) , und eines Primerpaares bestehend aus einem ersten Primer umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO: 3 und einem zweitem Primer umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO: 3, e) Bestimmung der Nukleotidsequenz des in d) erhaltenen Nukleinsäuremoleküls, und Bestimmung der kodierten Aminosäuresequenz,
f) gegebenfalls Vergleich der in f) bestimmten Aminosäuresesequenz mit SEQ ID NO: 6 und
g) Identifizierung einer Mutante, die ein Polynukleotid enthält, das für ein Polypeptid kodiert, welches eine oder mehrere Aminosäuren enthält, ausgewählt aus der Gruppe: an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene
Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, und an Position
261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin.
17. Mutanten coryneformer Bakterien gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an Schritt b) eine Mutante ausgewählt wird, die die Fähigkeit besitzt in einem Medium mindestens 0,5% mehr der gewünschten L-Aminosäure auszuscheiden oder im Zellinneren anzuhäufen als das in Schritt a) von Anspruch 17 eingesetzte coryneforme Bakterium.
18. Ein isoliertes Polynukleotid, das für ein OpcA- Polypeptid der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids Aminosäuren einzeln oder gemeinsam enthält, ausgewählt aus der Gruppe,
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin.
19. Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuren des kodierten Proteins, einzeln oder gemeinsam, ausgewählt aus der Gruppe :
a) L-Histidin an Position 107,
b) L-Asparagin an Position 219,
c) L-Serin an Position 233, und
d) L-Histidin an Position 261 ist.
20. Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der (die) Aminosären in dem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 ausgetauscht vorliegen.
21. Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit einer Länge von 319 Aminosäuren umfasst.
22. Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid von Position 107 bis 261 der Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenz entsprechend Position 107 bis 261 von SEQ ID NO: 6 enthält.
23. Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass es mit der Nukleotidsequenz eines Polynukleotids identisch ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von DNA gewonnen aus einem coryneformen 4
Bakterium und unter Verwendung eines Primerpaares bestehend aus einem ersten Primer, umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz zwischen Position 1 und 334 von SEQ ID NO: 3, und einem zweitem Primer, umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der komplementären Nukleotidsequenz zwischen Position 1600 und 1292 von SEQ ID NO: 3 erhältlich ist.
24. Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass es mit zu SEQ ID NO: 5, komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen einen Waschschritt mit einem Puffer entsprechend 2xSSC bei einer Temperatur von 520C bis 680C umfassen.
25. Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 90% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO : 6.
26. Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynukleotid eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens 90%, identisch ist mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7.
27. Isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Protein eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe
a) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6,
b) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 einschließlich eines oder mehrerer konservativer Aminosäureaustausch (e) , und 5
c) Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6 einschließlich einer oder mehrerer Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren
umfasst .
28. Isoliertes Polynukleotid gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 20 oder 27 dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 umfasst.
29. Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 umfasst.
30. Ein isoliertes Polynukleotid, welches ein Nukleinsäure-Molekül umfasst, das mindestens für ein Leseraster mit einer Aminosäuresequenz entsprechend Position 98 bis 270 von SEQ ID NO: 2 kodiert, wobei diese eine oder mehrere der Aminosäureaustausche umfasst, ausgewählt aus der Gruppe:
a) an Position 107 wird L-Tyrosin gegen eine andere proteinogene Aminosäure ausgetauscht,
b) an Position 219 wird L-Lysin gegen eine andere proteinogene Aminosäure ausgetauscht,
c) an Position 233 wird L-Prolin gegen eine andere proteinogene Aminosäure ausgetauscht, und
d) an Position 261 wird L-Tyrosin gegen eine andere proteinogene Aminosäure ausgetauscht.
31. Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass in der an einer oder mehreren Positionen ausgetauschten Sequenz enthalten sind:
a) L-Histidin an Position 107, b) L-Asparagin an Position 219,
c) L-Serin an Position 233, und/oder
d) L-Histidin an Position 261 ist.
32. Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens für ein Leseraster mit einer Aminosäuresequenz entsprechend den Positionen 98 bis 270 von SEQ ID NO: 6 kodiert.
33. Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz an einer oder mehrerer Positionen konservative
Aminosäureaustausche enthält, ausgenommen an den Positionen 107, 219, 233 und 261.
34. Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass es eine oder mehrere stille Mutationen enthält.
35. Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens die Nukleotidsequenz entsprechend den Positionen 292 bis 810 von SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 7 umfasst.
36. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten coryneformen Bakteriums, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) ein isoliertes Polynukleotid gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 18 bis 29 oder 31 bis 35 in ein coryneformes Bakterium überführt,
b) das im Chromosom des coryneformen Bakteriums vorhandene opcA-Gen, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz mit L-Tyrosin an Position 107, L-Lysin an Position 219, L-Prolin an Position 233 und L-Tyrosin an Position 261 kodiert, gegen das Polynukleotid aus a) 7
austauscht, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, in der an einer oder mehreren Positionen Aminosäuren ausgetauscht sind, ausgewählt aus der Gruppe:
i) an Position 107, bevorzugt gegen L-
Histidin,
ii) an Position219, bevorzugt gegen L- Asparagin,
iii) an Position 233, bevorzugt gegen L-Serin, und
iv) an Position 261, bevorzugt gegen L- Histidin, und
c) das gemäß Schritt a) und b) erhaltene coryneforme Bakterium vermehrt.
37. Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass man ein isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 29 verwendet.
38. Verfahren gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass man ein isoliertes Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 31 bis 35 verwendet.
39. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) ein isoliertes Polynukleotid gemäß einem oder mehreren der Anspruch 18 bis 29 oder 31 bis 35 in einen Mikroorganismus überführt,
b) das isolierte Polynukleotid in dem Mikroorganismus repliziert, und
c) den gemäß Schritt a) und b) erhaltenen Mikroorganismus vermehrt.
40. Ein rekombinanter Mikroorganismus, der das isolierte Polynukleotid den gemäß Ansprüchen 18 bis 29 oder 31 bis 35 enthält.
41. Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein coryneformes Bakterium oder um ein Bakterium der Gattung Escherichia handelt.
42. Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem coryneformen Bakterium um die Gattung Corynebacterium handelt .
43. Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bakterium der Gattung Corynebacterium um die Art Corynebacterium glutamicum handelt.
44. Ein Vektor, der das isolierte Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 18 bis 29 oder 31 bis 35 enthält.
45. Ein rekombinanter Mikroorganismus, der den Vektor gemäß Anspruch 44 enthält.
46. Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein coryneformes Bakterium oder um ein Bakterium der Gattung Escherichia handelt.
47. Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem coryneformen Bakterium um die Gattung Corynebacterium handelt .
48. Rekombinanter Mikroorganismus gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bakterium der Gattung Corynebacterium um die Art Corynebacterium glutamicum handelt.
49. Verfahren zur Überexpression eines OpcA-Polypeptides in einem Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kopienzahl eines Polynukleotids gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 18 bis 29 oder 31 bis 35 in dem Mikroorganismus um mindestens eine (1) Kopie erhöht .
50. Verfahren zur Überexpression eines OpcA-Polypeptides in einem Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Promotor oder eine Expressionskassette funktionell mit einem Polynukleotid verknüpft, das für ein OpcA-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, welche eine oder mehrere der Aminosäuren enthält ausgewählt aus der Gruppe
a) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
b) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
c) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Prolin, bevorzugt L-Serin, und
d) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Tyrosin, bevorzugt L-Histidin.
51. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure dadurch gekennzeichnet, dass man
a) ein isoliertes coryneformes Bakterium in einem geeignetem Medium fermentiert, wobei das Bakterium mindestens eine Kopie eines für ein
OpcA-Polypeptid kodierende Polynucleotids enthält, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids eine oder mehrere der Aminosäuren besitzt aufweist, ausgewählt aus der Gruppe
i) an Position 107 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L- Tyrosin, bevorzugt L-Histidin,
ii) an Position 219 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-Lysin, bevorzugt L-Asparagin,
iii) an Position 233 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L-
Prolin, bevorzugt L-Serin, und
iV) an Position 261 der Aminosäuresequenz jede proteinogene Aminosäure ausgenommen L- Tyrosin, bevorzugt L-Histidin, und
b) die gewünschte L-Aminosäure in der
Fermentationsbrühe oder in den Zellen des Bakteriums anreichert.
52. Verfahren gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem isolierten coryneformen Bakterium um eine Mutante gemäß einen oder mehreren der Ansprüche 1 bis 17 handelt.
53. Verfahren gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem isolierten coryneformen Bakterium um ein rekombinantes coryneformes Bakterium, gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 40 bis 48 handelt.
54. Verfahren gemäß den Ansprüchen 51 bis 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die gewünschte L-Aminosäure isoliert oder sammelt
55. Verfahren gemäß Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass man die gewünschte L-Aminosäure reinigt.
56. Verfahren gemäß den Ansprüchen 51 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass man die gewünschte L-Aminosäure gemeinsam mit Bestandteilen aus der Fermentationsbrühe und/oder der Biomasse (> 0 bis 100 %) isoliert oder sammelt.
57. Verfahren gemäß Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) aus der in Schritt b) von Anspruch 51 erhaltenen Fermentationsbrühe die gebildete Biomasse in einer Menge von 0 bis 100 % entfernt, und
b) aus der so erhaltenen Brühe ein im wesentlichen trockenes und geformtes Produkt durch eine Methode ausgewählt aus der Gruppe Granulation, Kompaktierung, Sprühtrocknung und Extrusion herstellt.
58. Verfahren nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass man der Fermentationsbrühe vor oder nach Schritt a) eine Säure ausgewählt aus der Gruppe Schwefelsäure, Salzsäure und Phosphorsäure hinzufügt.
59. Verfahren nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass man aus der vor oder nach in Schritt a) erhaltenen Brühe Wasser entfernt.
60. Verfahren gemäß Schritt 57, dadurch gekennzeichnet, dass man das in oder während Schritt b) erhaltene geformte Produkt mit einem Öl besprüht.
61. L-Lysin haltiges Futtermitteladditiv auf Fermentationsbrühebasis, welches folgende Merkmale aufweißt
a) einen Lysingehalt (als Base) von mindestens 10 Gew.-% bis maximal 73 Gew.-%,
b) einen Wassergehalt von höchstens 5 Gew.-%, und c) einen Biomassegehalt ensprechend mindestens 0,1 % der in der Fermentationsbrühe enthaltenen Biomasse, wobei die gegebenenfalls inaktivierte Biomasse aus Bakterien gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 17 oder 40 bis 43 oder 45 bis
48 gebildet wird.
62. L-Tryptophan haltiges Futtermitteladditiv auf
Fermentationsbrühebasis, welches folgende Merkmale aufweißt
a) einen Tryptophangehalt von mindestens 5 Gew.-% bis maximal 95 Gew.-%,
b) einen Wassergehalt von höchstens 5 Gew.-%, und
c) einen Biomassegehalt ensprechend mindestens 0,1 % der in der Fermentationsbrühe enthaltenen Biomasse, wobei die gegebenenfalls inaktivierte
Biomasse aus Bakterien gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 17 oder 40 bis 43 oder 45 bis 48 gebildet wird.
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