WO2006118196A1 - Dpp4阻害剤及びその医薬用途 - Google Patents

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autophagy
amino acid
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Chiori Ijichi
Naoyuki Yamada
Toshihiro Hatanaka
Kenji Takehana
Giovanni Miotto
Oriano Marin
Andrea Carpi
Denis Bertaggia
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Ajinomoto Co., Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a Dpp4 (dipeptidyl peptidase-1) inhibitor, its pharmaceutical use, an autophagy regulator, and a pharmaceutical composition containing the same.
  • Autophagy is an ecosystem in which cells decompose and reuse self-components (organelles and cytoplasmic proteins) due to the depletion of nutrients, and is a nonspecific, buttery proteolysis within cells. Autophagy is required to maintain homeostasis as well as the urgent biological response that occurs when cells undergo nutrient starvation stress. Furthermore, recent studies have revealed that autophagy is associated with canceration, cell death, immune cell antigen presentation, neurodegenerative diseases and cardiomyopathy. In particular, it is believed that autophagy-induced protein degradation and mitochondrial dysfunction are deeply involved in aging, debilitating diseases, and organ atrophy such as the gastrointestinal tract, which is a problem after surgery. Reference 1).
  • Non-patent Document 2 a new organelle called an autophagonome is formed, enclosing the cytoplasmic components so as to envelop the mitochondria and endoplasmic reticulum, and finally the contents are degraded by lysosomes.
  • amino acids are the largest autophagy regulators, and leucine has the strongest autophagy-suppressing action (Non-patent Document 2).
  • Non-patent Document 2 Much of the research so far has focused on morphology and cell physiology, and many of the mechanisms of autophagy regulation are unknown. It is clear that genetic analysis using budding yeast autophagy-deficient strains has led to the identification of genes essential for autophagy, and that many of them are conserved in mammals.
  • Non-patent Document 3 In studies using cultured liver cells, autophagy is induced by amino acid starvation if glucagon is suppressed by amino acids or insulin (Non-patent Document 3). However, little is known about the mechanism by which amino acids are actually recognized by cells and suppress autophagy in vivo. Regarding the mechanism of autophagy regulation by amino acids, one of the inventors of the present invention, Giovanni Miotto et al. It has been known that a protein (leucine receptor) expressed on the liver cell membrane plays an important role in suppressing autophagy in hepatocytes (Non-patent Document 4). However, the molecular reality was unclear.
  • leucine among amino acids, is known to have various physiological and pharmacological actions in addition to the aforementioned autophagy suppression.
  • Membrane proteins (leucine receptors) responsible for autophagy suppression on the liver cell membrane are thought to play an important role in the physiological functions of these various leucines. Identification was expected.
  • Dpp4 is a membrane-bound peptide-degrading enzyme that also cleaves two residues at the N-terminal force of various peptides, and is known to be involved in the activation and inactivation of various peptide hormones in blood as substrates. It is done. Dpp4 is also present in the blood in a free state, but its significance and mechanism of release are unknown. In inflammatory diseases such as hepatitis and inflammatory bowel disease and certain mental disorders, increased or decreased enzyme activity of free Dpp4 in the blood has been reported, but its relation to the pathological condition has not always been clarified. Absent.
  • Dpp4 uses many hormones such as europeptides, immune peptides, and gastrointestinal peptides as substrates, and the second N-terminal sequence is often proline or alanine.
  • the most famous substrate for Dpp4 is GLP-1 (glucagon-like peptide 1), and Dpp4 is known to degrade and inactivate GLP-1. Therefore, Dpp4 inhibitors are expected to have a pharmacological action that maintains the blood concentration of GLP-1 and promotes physiological insulin secretion from j8 cells, and research is underway as a drug discovery target for diabetes drugs.
  • GLP-1 differs from many other substrates in that the second sequence is serine.
  • Dp p4 is known to be distributed and expressed throughout the body, but it is especially distributed in epithelial cells and liver cells such as kidney, digestive tract and skin.
  • Cell membrane-bound Dpp4 plays an important role in determining cell polarity in epithelial cells and is also expected to act as an adhesion factor.
  • T lymphocytes also play a role as a costimulatory signal transduction molecule and are important for CD4 positive T cell activity (Non-patent Document 6).
  • the function and structure of the human Dpp4 gene There is a lot of information at the following URL.
  • Non-Patent Document 1 Science, 2004, 306: 990-995, Biochem. Biophys. Res. Com., 2004, 3 13: 453-458
  • Non-Patent Document 2 Ann. Rev. Nutr. 1987, 7: 539-564
  • Non-Patent Document 3 Science, 2004; 306: 990-995, Biochem. Biophys. Res. Com., 2004; 3 13: 453-458
  • Non-Patent Document 4 J. Biol. Chem., 1994; 269: 25348-25353
  • Non-Patent Document 5 Biochem. Biophys. Res. Com., 2004; 313: 387-458, Neurosci Lett. 2 004; 354: 166-168
  • Non-Patent Document 6 Clinical Science, 2000; 99: 93-104
  • An object of the present invention is to provide a novel Dpp4 inhibitor.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing the Dpp4 inhibitor.
  • Another object of the present invention is to provide an organ preservative for transplantation containing the autophagy regulator.
  • Another object of the present invention is to provide a drug screening method.
  • this protein was successfully isolated and purified, and as a single band protein by SDS-PAGE electrophoresis. Detected. This band was cut out from the gel cartridge, peptide fragmented by reductive alkylation in the gel and enzymatic digestion, and the nano HPLC system (Ultimate: manufactured by Nippon Dionetas Co., Ltd.) was applied to an ion trap mass spectrometer (LCQ: manufactured by Thermo-ELERON) It used for the connected apparatus and mass spectrometry was performed. The obtained data was identified using a database search system (Mascot: manufactured by Matritus Science).
  • MSDB manufactured by Matrix Science, January 6, 2004 was used as a sequence database for searching.
  • rat dipeptidyl peptidase IV (DPP4: EC 3.4.14.5) was identified with a high score. From these results, it was found that pl03 is a rat Dpp4 protein.
  • the inventors examined the effect of leucine on Dpp4 enzyme activity using a cell-free enzyme assay, and by using an autophagy evaluation system using rat hepatocytes, Dpp4 on hepatocyte membranes and hepatocyte autophagy were investigated.
  • the present invention was completed by examining the relationship.
  • the present invention provides a Dpp4 inhibitor comprising a leucine derivative represented by the following general formula (1) or a methionine derivative represented by the following general formula (2).
  • R1 and R3 are each a hydrogen atom (H), an L-amino acid residue, R2 is a hydroxyl group (OH), an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group (NH2), and having 1 to 6 carbon atoms.
  • the present invention also provides a Dpp4 inhibitor characterized by containing L-leucine and / or L-methionine.
  • the present invention also provides a therapeutic agent for diabetes, an anti-obesity agent, an agent for improving abnormal drinking behavior, an anxiolytic agent, or a therapeutic agent for desensitizing pain, comprising the Dpp4 inhibitor.
  • the present invention also provides an autophagy regulator.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising an autophagy regulator.
  • the present invention also provides an organ preservative for transplantation characterized by containing an autophagy regulator.
  • the present invention also provides a drug screening method characterized by binding to membrane-type Dpp4 or free-type Dpp4 as an index.
  • protease and peptidase inhibitors In designing protease and peptidase inhibitors, it is widely used to focus on peptides having a partial structure of the substrate cleavage site, and peptides with such sequences can have competitive inhibitory activity. Is in a range that can be easily inferred by those skilled in the art. In fact, DPP4 inhibitors that convert the proline part of a dipeptide are well known in the world. In Adv.Exp.Med.Biol., 421, 171-178 (1997), compounds such as AA-Pro, Ala-Ala, lie-Ala, and Leu-Phe! Inhibition pKi values are listed!
  • Leu-esters, Leu amides, or dipeptides and derivatives containing Leu as a partial structure have a wide range of DPP4 inhibitory activity, except for Leu-Pro and Leu-Ala. Except for, it is extremely difficult to estimate the substrate selectivity of DPP4, and the Dpp4 inhibitory activity of the compounds shown in the present invention is a novel activity.
  • R1 and R3 represent a hydrogen atom (H) and an L-amino acid residue, respectively.
  • L-amino acid residue from the carboxyl group of the L-amino acid Examples include those formed by elimination of a hydroxyl group. Of these, L-Asp, L-Trp, L-Met, L-As n, L-Tyr, L-Val, L-Arg, L-Orn, L-Leu, L-Phe, L-Gin and L -Preferably an amino acid residue selected from the group consisting of lie.
  • R2 is a hydroxyl group (OH), an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an amino group (NH2), an alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms, glycine Residue, -alanine residue, L-amino acid (excluding proline, alanine, and phalalanin) residue, L-amino acid amide (excluding proline amide, alaninamide, and phalalaninamide) residue, R4 is hydroxyl group ( ⁇ ) , Alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, amino group ( ⁇ 2), alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms, glycine residue, j8-alanine residue, L-amino acid (excluding proline and alanine) Group, L-amino acid amide (excluding proline amide and alaninamide) residues.
  • L-amino acid residues and L-amino acid amide residues include those formed by elimination of an amino group hydrogen atom in these molecules.
  • the amino acid residues of R2 are L-Val, L-Orn, L-Ile, L-Gln, L-Asp, L-Asn, L-Met, L-Lys, L-Thr and L-, respectively.
  • the residue of an amino acid selected from the group consisting of Ser is preferred.
  • the residue of an amino acid selected from the group consisting of L-VaU L-Orn, LI le and L-Gln is more preferred! / ,.
  • R2 is preferably a hydroxyl group (OH).
  • amino acid residues other than L-Pro and L-Ala are preferable, and the same group as described for R2 is also preferable.
  • R1 or R2 is an amino acid residue. It is preferable that either R3 or R4 is an amino acid residue.
  • R1 and R3 are preferably amino acid residues, and R2 and R4 are preferably hydroxyl groups (OH).
  • R1 and R3 are preferably hydrogen atoms, and R2 and R4 are preferably amino acid residues.
  • the dipeptide derivatives and amide derivatives represented by the above general formulas (1) and (2) include, for example, leucine and methionine in which the amino group or carboxyl group is protected, and appropriate protected amino acid derivatives as shown in the following reaction scheme. Alternatively, it can be obtained by condensing amines. Numerous excellent methods for liquid phase synthesis and solid phase synthesis have been reported as peptide synthesis methods, and the method is not limited to a specific synthesis method that can be used for synthesis. [0012] Reaction scheme
  • R (d) H, alkyl group, etc.
  • the present invention also provides a Dpp4 inhibitor comprising L-leucine and / or L-methionine.
  • the above DPP 4 inhibitor can be used as an active ingredient of a therapeutic agent for diabetes, an anti-obesity agent, an agent for improving abnormal drinking behavior, an anxiolytic agent, or a therapeutic agent for painlessness.
  • Dpp4 inhibitors of the present invention L-leucine has already been known to have an effect of improving glucose metabolism (JP 2003-171271, etc.), and its use for the treatment and prevention of diabetes is known.
  • Dpp4 inhibitors since many Dpp4 inhibitors have an anti-diabetic action due to GLP-1 degradation inhibitory activity (Diabetes 53: 2181-2189, 2004, Diabetes Care 26: 2929-2940, 2003), It is clear that the compound represented by (1) has an antidiabetic action.
  • animals that are genetically deficient in Dpp4 are known to have behavioral characteristics such as decreased drinking behavior, increased social activity, and increased sensitivity to pain (Physiology & Behavior 80 (2003)). 123-134), these known findings indicate that the Dpp4 inhibitor of the present invention is used for drinking water. It has been shown to be useful as a dyskinetic drug, an anxiolytic drug, and a pain-relieving drug.
  • the present invention also provides an autophagy regulator characterized by binding to Dpp4. That is, the substance itself that binds to Dpp4 can be used as an autophagy regulator, or an autophagy regulator that contains the substance itself that binds to Dpp4 as an active ingredient is provided.
  • Dpp4 antibody is preferable, and specifically, monoclonal antibody clone 236.3 and monoclonal antibody OX-61 can be mentioned.
  • monoclonal antibody clone 236.3 has an action of suppressing autophagy
  • monoclonal antibody OX-61 has an action of promoting autophagy.
  • the autophagy regulator can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition.
  • a pharmaceutical composition which is a therapeutic agent or a preventive agent for symptoms such as intestinal atrophy after surgery, organ atrophy such as muscle meat associated with chronic inflammation and cancer epidemic.
  • it is a therapeutic or preventive agent for various metabolic-endocrine diseases represented by diabetes, which is thought to be caused by abnormal protein accumulation, or for neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Arno's disease, and Huntington's chorea.
  • pharmaceutical compositions are examples of such a pharmaceutical composition which is a therapeutic agent or a preventive agent for symptoms such as intestinal atrophy after surgery, organ atrophy such as muscle meat associated with chronic inflammation and cancer epidemic.
  • it is a therapeutic or preventive agent for various metabolic-endocrine diseases represented by diabetes, which is thought to be caused by abnormal protein accumulation, or for neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Arno's disease, and Huntington's chorea.
  • pharmaceutical compositions are examples of such a pharmaceutical compositions.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and is a safe and necessary amount by parenteral or oral administration, specifically, intravenous, intraarterial, subcutaneous and intramuscular administration, administration by infusion. Can be administered at once or by infusion or the like. Of these, oral administration is desirable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in various dosage forms, such as tablets, tablets, granules, powders, troches, solutions, fine granules, other injections, creams, It can be made into administration preparations such as suppositories. These preparations can be carried out by a method known per se.
  • Each of the active ingredient and the preparation of the present invention contains a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, excipient, disintegrant, lubricant, fluidity improver, and other substances necessary for the preparation.
  • a formulation can be produced by prescribing a combination of these.
  • pharmaceutical carriers include lactose, glucose, D-manntol, starch, crystalline cellulose, calcium carbonate, kaolin, starch, gelatin, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, polyvinyl pyrrolidone, ethanol, strong ruboxy.
  • the present invention provides a drug screening method characterized by using as an index the binding to Sarakuko, membrane-type Dpp4 or free-type Dpp4.
  • the drug screening method using the monoclonal antibody 0X61 and Z that promote autophagy and the monoclonal antibody clone 236.3 that suppress autophagy as an index and binding to membrane-type and / or free-type Dpp4 is preferable. .
  • Fmoc- ( ⁇ -Boc)-L-lysine 2.814 g (6.00 mmol), diisopropylcarbodiimide 940 mg, dimethylaminopyridine 30 mg are dissolved in 20 ml of DMF, and the whole amount of Leu-Wang Resin is dissolved in a 50 ml syringe for solid phase synthesis. It was shaken at room temperature. The solution was discarded and the resin was washed 6 times with dimethylformamide, methanol, and dichloromethane. 20 ml of 20% piperidine Z-dimethylformamide solution was sucked into a syringe, shaken at room temperature for 10 minutes, and then discarded twice. The resin was washed six times with dimethylformamide, methanol and dichloromethane and dried with a vacuum pump.
  • Example l Inhibitory activity against rhDpp4
  • the reaction solution (25 mM Tris (pH 8.0), lOOuM G-P-pNA, 0.25 ng / ul rhDPP4) was prepared, and the test substance was added to a final concentration of 2 mM (DMSO concentration 1%).
  • the reaction solution was kept at 37 ° C. for 30 minutes, and immediately after the completion, absorbance at 405 nm was measured using a spectrophotometer. Reactions were run on a 20 Oul scale !, 96-well microphone mouthplates were used.
  • the absorbance at 405 nm of 100,33, ll, 3.7,1.2,0.41,0.14 uM pNA solution was measured to obtain the relationship between pNA concentration and absorbance, and the amount of pNA in each reaction solution (substrate cleavage amount)
  • the inhibition rate was calculated as follows: 3-4 wells without test substance were prepared on the same plate, and the amount of substrate cleavage (B) of each test substance added well relative to the average value (A) of the substrate cleavage amount. It was calculated from the ratio using the following formula and expressed in 100%.
  • Fig. 1 shows leucine, isoleucine, parin, and 4-hydroxy-isoleucine among the 20 amino acids constituting the protein and Diprotin A, an existing Dpp4 inhibitor!
  • the Dpp4 inhibitory activity was plotted. From this result, it is clear that leucine inhibits Dpp4.
  • Figure 2 shows the results of examining the effects of 20 amino acids constituting the protein on the Dpp4 enzyme activity, and the vertical axis indicates the substrate cleavage rate after the reaction.
  • Figure 2 shows that, among the 20 types of amino acids, Met has Dpp4 inhibitory activity, similar to Leu.
  • Table 1 summarizes the results of determining the Dpp4 inhibitory activity of the representative compounds represented by the general formula (1) by the above method.
  • Rat liver cells were prepared by collagenase perfusion method using 140-180g male Wistar rats reared by free feeding (Seglen, PO Preparation of isolated liver cells. (1976) In DM Prescott, 13, 29—83. Academic: new York I Lon don) 0 This method was able to prepare 2-2.5 x 108 cells of hepatocytes per individual liver. Proteolysis (autophagy) of the prepared hepatocytes was measured by the method of Venerando et al.
  • hepatocytes were placed in a 10 ml flask as a KRB buffer (24 mM bicarbonate, 6 mM glucose) 3.5 ml cell suspension (1-1.2 x 106 cells / ml) in a carbon dioxide incubator at 37 °. C was kept warm and left for 45 minutes. Thereafter, various chemical treatments were carried out in the presence of 20 uM cycloheximide for the purpose of stopping protein synthesis, and the mixture was further incubated for 30 minutes. At 31 and 42 minutes, 0.35 ml of the hepatocyte suspension was taken out, and ice-cold perchloric acid (final concentration 6%) was added to the latter and stored at 20 ° C. Palin in the supernatant of the acid-soluble fraction was measured and the release of 11 minutes was measured.
  • KRB buffer 24 mM bicarbonate, 6 mM glucose
  • ml cell suspension (1-1.2 x 106 cells / ml) in a carbon dioxide incubator at 37 °. C was
  • the experimental materials are as follows. Monoclonal antibody against Dpp4, MRC 0X61 is otype IgG2a (Oxrora Biotecnnology 8 clone 2 ⁇ 6.3 isotype Ig 2bk (Pierce Endogen). Table 2 shows oral isines against autophagy induced in rat hepatocytes by amino acid starvation, And the effect of autophagy by Dpp4 antibody was shown.
  • Examples include various metabolic and endocrine diseases represented by diabetes, which is thought to be caused by abnormal protein accumulation, or neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and Huntington's chorea (Scien ce, 2004; 306: 990-995, Biochem. Biophys. Res. Com., 2004; 313: 453-458). Furthermore, it is known that autophagy occurs in organs for preservation of organs for transplantation and in reperfusion after transplantation (Arch Histol Cytol, 68 (1): 71-80 (2005)).
  • FIG. 1 is a graph plotting concentration-dependent Dpp4 inhibitory activity for leucine, isoleucine, norin, and 4-hydroxy-isoleucine and Diprotin A, an existing Dpp4 inhibitor.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of examining the effect of 20 kinds of amino acids constituting a protein on DPP 4 enzyme activity, and the vertical axis indicates the substrate cleavage rate after the reaction.

Abstract

　下記一般式（１）で表されるロイシン誘導体又は下記一般式（２）で表されるメチオニン誘導体を含むDpp4阻害剤。 （式中、R1及びR3はそれぞれ水素原子（H）、Ｌ-アミノ酸残基、R2は水酸基（ＯＨ）、炭素数１から６のアルコキシキ基、アミノ基（ＮＨ２）、炭素数1から６のアルキルアミノ基、グリシン残基、β-アラニン残基、Ｌ-アミノ酸（プロリン、アラニン及びフェニルアラニンを除く）残基、Ｌ-アミノ酸アミド（プロリンアミド、アラニンアミド及びフェニルアラニンアミドを除く）残基、R4は水酸基（ＯＨ）、炭素数１から６のアルコキシキ基、アミノ基（ＮＨ２）、炭素数1から６のアルキルアミノ基、グリシン残基、β-アラニン残基、Ｌ-アミノ酸（プロリン及びアラニンを除く）残基、Ｌ-アミノ酸アミド（プロリンアミド及びアラニンアミドを除く）残基を表す。）。これらの誘導体はオートファジー調節剤としても作用する。

Description

Dpp4阻害剤及びその医薬用途 技術分野
[0001] 本発明は、 Dpp4 (ジぺプチジルぺプチダーゼ一 4)阻害剤、その医薬用途、オート ファジー調節剤及びこれを含む医薬組成物に関する。
[0002] (発明の背景）
オートファジーとは栄養源の枯渴により、細胞が自己成分 (オルガネラ、細胞質蛋 白質)を分解，再利用する生態システムであり、細胞内における非特異的でバルタな 蛋白質分解である。オートファジーは細胞が栄養飢餓ストレスを受けたときに起こる緊 急の生体応答のみならず、恒常性の維持に必要とされる。さらに最近の研究により、 オートファジーは、癌化、細胞死、免疫細胞の抗原提示、神経変性疾患及び心筋症 などとのと関わりを持つことが明らかとされている。とりわけ、老化や消耗性疾患あるい は外科手術後に問題とされる筋肉や消化管などの臓器萎縮にはオートファジーによ る蛋白質分解やミトコンドリア機能低下などが深く関与すると考えられている (非特許 文献 1)。
オートファジーの際にはオートファゴノームと呼ばれる新たなオルガネラが形成され 、ミトコンドリア ·小胞体と ヽつたオルガネラをも包み込むようにして細胞質成分を取り 囲み、最終的に内容物をリソソームにて分解する。栄養素の中でもアミノ酸が最大の オートファジー調節因子であり、とりわけ、ロイシンには最も強いオートファジー抑制 作用がある（非特許文献 2)。これまでの研究の多くは形態学、細胞生理が主体であ り、オートファジー調節のメカニズムの多くが不明である。出芽酵母のオートファジー 欠損株を用いた遺伝学解析によってオートファジーに必須な遺伝子群の同定が進 み、それらの多くが哺乳動物でも保存されていることが明ら力とされている。培養肝細 胞を用いた研究では、オートファジーは、アミノ酸飢餓ゃグルカゴンによって誘導され 、アミノ酸やインスリンによって抑制される (非特許文献 3)。しかし、生体内では実際 にどのようなメカニズムでアミノ酸が細胞に認識され、オートファジーを抑制しているか については、ほとんど明らかにはされていない。アミノ酸によるオートファジー調節機 構については、本発明の発明者の一人である Giovanni Miottoらにより、ロイシンによ る肝細胞でのオートファジー抑制には肝細胞膜上に発現する蛋白質 (ロイシン受容 体)が重要な役割を果たすことが知られていた (非特許文献 4)。しかしながら、その 分子実態は明らかではな力 た。
一方、アミノ酸の中でもロイシンには、前述のオートファジー抑制に加えて、種々の 生理作用や薬理作用が知られており、こうした作用の中には、蛋白質の合成促進や 内分泌ホルモンの分泌促進、糖代謝改善作用、食欲亢進作用などの多彩な作用が 知られている (非特許文献 5)。こうした作用が、生体内のどのような機構により発揮さ れるかの詳細なメカニズムは明らかにされてはいない。 Miottoらカ 肝細胞膜上に想 定したオートファジー抑制を担う膜蛋白質 (ロイシン受容体）はこうしたさまざまなロイ シンの生理機能に対しても重要な役割を果たすことが考えられるため、分子の単離 同定が期待されていた。
Dpp4は、各種のペプチドの N末端力も二残基を切断する膜結合型ペプチド分解酵 素であり、血中の種々のペプチドホルモンを基質として、その活性化や不活性化に 関与することが知られる。 Dpp4は血中に遊離の状態でも存在するが、その意義と遊 離のメカニズムは不明である。肝炎、炎症性腸疾患などの炎症性疾患やある種の精 神疾患では、血中の遊離 Dpp4の酵素活性の上昇や低下が報告されているが、病態 との関連は必ずしも明らかにはされていない。 Dpp4は多くの-ユーロペプチド、免疫 ペプチド、消化管ペプチドなどのホルモンを基質とし、その N末端の 2番目の配列が プロリンあるいはァラニンであることが多い。 Dpp4の基質として最も有名なものが GLP -1 (glucagon-like peptide 1)であり、 Dpp4は GLP-1を分解、不活性化することが知ら れる。そのため、 Dpp4阻害剤は GLP-1の血中濃度を維持し、 j8細胞からの生理的な インスリン分泌を促す薬理作用が期待され、糖尿病薬の創薬標的としての研究が進 んでいる。 GLP-1はその他の多くの基質とは異なり二番目の配列がセリンである。 Dp p4は全身に分布して発現することが知られているが、腎臓や消化管、皮膚などの上 皮細胞や肝細胞にとりわけ多く分布する。細胞膜結合型の Dpp4は、上皮細胞におけ る細胞極性の決定に重要な役割を有し、接着因子としての働きも想定されている。ま た、 Tリンパ球では副刺激シグナルの伝達分子としての役割ももち、 CD4陽性 T細胞 の活性ィ匕に重要である（非特許文献 6)。ヒト Dpp4遺伝子の機能及び構造にっ ヽては 下記の URLに多くの情報がある。
http://www.ncbi.nlm.nih. gov/entrez/dispomim.cgi?id=102720
[0004] 非特許文献 1 : Science, 2004, 306: 990-995、 Biochem. Biophys. Res. Com., 2004, 3 13: 453-458
非特許文献 2 : Ann. Rev. Nutr. 1987, 7: 539-564
非特許文献 3 : Science, 2004; 306: 990—995、 Biochem. Biophys. Res. Com., 2004; 3 13: 453-458
非特許文献 4 :J. Biol. Chem., 1994; 269: 25348-25353
非特許文献 5 : Biochem. Biophys. Res. Com., 2004; 313: 387—458、 Neurosci Lett. 2 004; 354: 166-168
非特許文献 6 : Clinical Science, 2000; 99: 93-104
発明の開示
[0005] 本発明は、新規な Dpp4阻害剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記 Dpp4阻害剤を含有する医薬組成物を提供することを目的とす る。
本発明は、又、新規なオートファジー調節剤を提供することを目的とする。 本発明は、又、上記オートファジー調節剤を含有する医薬組成物を提供することを 目的とする。
本発明は、又、上記オートファジー調節剤を含有する移植用臓器保存剤を提供す ることを目的とする。
本発明は、又、薬物スクリーニング法を提供することを目的とする。
[0006] 上記の課題を解決するために発明者らは、まず、膜不透過性のロイシン誘導体 (Le U8-MAP)を用いて、ラット肝細胞の膜上に存在するロイシン結合蛋白質の同定を試 みた。鋭意努力の結果、肝細胞膜上に分子量 103キロダルトンの特異的なロイシン結 合蛋白質 (P103)を認めた。 Leu8-MAPの pl03への結合は過剰の遊離ロイシンにより 阻害されたが、イソロイシンやパリンでは阻害されず、ロイシンに選択的に結合する蛋 白質であった。さらに、肝細胞膜からの pl03の精製条件を種々に検討した結果、本 蛋白質の単離精製に成功し、 SDS-PAGE電気泳動にて単一のバンドの蛋白質として 検出した。このバンドをゲルカゝら切り出し、ゲル内還元アルキル化および酵素消化に よりペプチド断片化し、ナノ HPLCシステム（Ultimate :日本ダイオネタス社製）をイオン トラップ型質量分析計 (LCQ :サーモエレ外ロン社製）に連結させた装置に供して、 質量分析を行った。得られたデータは、データベース検索システム (Mascot:マトリツ タスサイエンス社製）を用いて同定した。 MSDB (マトリックスサイエンス社製、 2004年 1 月 6日版)を検索用の配列データベースとして用いた。その結果、高いスコアでラット' ジぺプチジルぺプチダーゼ IV (DPP4: EC 3.4.14.5)が同定できた。これらの結果から 、 pl03がラット Dpp4蛋白質であることを突き止めた。
さらに、発明者らはロイシンによる Dpp4酵素活性への影響を無細胞系の酵素アツセ ィにより検討し、またラット肝細胞を用いたオートファジー評価系により、肝細胞膜上 の Dpp4と肝細胞オートファジーの関係を調べることにより本発明を完成した。
すなわち、本発明は、下記一般式（1)で表されるロイシン誘導体又は下記一般式（ 2)で表されるメチォニン誘導体を含むことを特徴とする Dpp4阻害剤を提供する。
Figure imgf000006_0001
(式中、 R1及び R3はそれぞれ水素原子 (H)、 L-アミノ酸残基、 R2は水酸基 (OH)、 炭素数 1から 6のアルコキシキ基、アミノ基 (NH2)、炭素数 1から 6のアルキルアミノ基 、グリシン残基、 j8 -ァラニン残基、 L-アミノ酸（プロリン、ァラニン及びフエ-ルァラ- ンを除く）残基、 L-アミノ酸アミド (プロリンアミド、ァラニンアミド及びフエ二ルァラニン アミドを除く）残基、 R4は水酸基 (OH)、炭素数 1から 6のアルコキシキ基、アミノ基 (N H2)、炭素数 1から 6のアルキルアミノ基、グリシン残基、 j8 -ァラニン残基、 L-アミノ酸 (プロリン及びァラニンを除く）残基、 L-アミノ酸アミド (プロリンアミド及びァラニンアミド を除く)残基を表す。）
[0008] 本発明は、又、 L-ロイシン及び/又は L-メチォニンを含むことを特徴とする Dpp4阻 害剤を提供する。 本発明は、又、上記 Dpp4阻害剤を含有する糖尿病治療薬、抗肥満薬、飲水行動 異常の改善薬、抗不安薬又は痛感鈍麻治療薬を提供する。
本発明は、又、オートファジー調節剤を提供する。
本発明は、又、オートファジー調節剤を含むことを特徴とする医薬組成物を提供す る。
本発明は、又、オートファジー調節剤を含むことを特徴とする移植用臓器保存剤を 提供する。
本発明は、又、膜型 Dpp4または遊離型 Dpp4への結合を指標とすることを特徴とす る薬物スクリーニング法を提供する。 発明を実施するための最良の形態
[0009] これまでに Dpp4阻害剤としてある種のジペプチド型化合物がよく知られているが、 たとえば、 Biochem. J., 371, 525-532 (2003)によれば、 Xaa- Yaa- Aminomethyl Coum arineを実験基質として用いて DPP4の基質特異性を検討した結果、 Xaaは幅広 、アミ ノ酸で基質として認識されるが、 Yaaは Pro, Alaに特異的であると示されている。つまり ΑΑ-Pro-, AA-Ala-の配列を持つペプチドは DPP4の特異的でよ!、基質になることが 公知である。
プロテアーゼ、ぺプチダーゼ阻害剤をデザインする上で、基質切断部位の部分構 造を持つペプチドに着目することは広く行われることであり、そのような配列のぺプチ ドが競合阻害活性を持ちうることは、当業者には容易に類推できる範囲にある。実際 、ジペプチドのプロリン部分を構造変換した DPP4阻害剤は世間でよく知られて 、る。 また、 Adv.Exp.Med.Biol., 421, 171-178 (1997)には、 AA- Pro, Ala-Ala, lie- Ala, Le u-Pheなどの化合物につ!、て、それぞれ DPP4に対する阻害 pKi値が記載されて!、る 。一方、 Leuおよびエステル、 Leuアミド、または Leuを部分構造に含むジペプチドや 誘導体が広く DPP4阻害活性を持つことは、 Leu-Pro, Leu-Ala以外には、 Ki値が示さ れている Leu-Pheを除くと、 DPP4の基質選択性力 類推することはきわめて困難であ り、本発明で示されたィ匕合物の Dpp4阻害活性は新規な活性である。
[0010] 本発明の一般式（1)及び（2)において、 R1及び R3はそれぞれ水素原子（H)、 L -ァ ミノ酸残基を表す。ここで、 L-アミノ酸残基としては、 L-アミノ酸のカルボキシル基から 水酸基が脱離してなるものがあげられる。これらのうち、 L-Asp、 L-Trp、 L-Met、 L-As n、 L- Tyr、 L- Val、 L- Arg、 L- Orn、 L- Leu、 L- Phe、 L- Gin及び L- lieからなる群から選 ばれるアミノ酸の残基であるのが好ま 、。
又、本発明の一般式（1)及び (2)において、 R2は水酸基 (OH)、炭素数 1から 6の アルコキシキ基、アミノ基 (NH2)、炭素数 1から 6のアルキルアミノ基、グリシン残基、 -ァラニン残基、 L-アミノ酸 (プロリン、ァラニン及びフエ-ルァラニンを除く）残基、 L-アミノ酸アミド (プロリンアミド、ァラニンアミド及びフエ-ルァラニンアミドを除く）残基 、 R4は水酸基 (ΟΗ)、炭素数 1から 6のアルコキシキ基、アミノ基 (ΝΗ2)、炭素数 1か ら 6のアルキルアミノ基、グリシン残基、 j8 -ァラニン残基、 L-アミノ酸 (プロリン及びァ ラニンを除く）残基、 L-アミノ酸アミド (プロリンアミド及びァラニンアミドを除く）残基を 表す。 )o L-アミノ酸残基及び L-アミノ酸アミド残基としては、これらの分子中のアミノ 基力 水素原子が脱離してなるものがあげられる。これらのうち、 R2のアミノ酸残基が 、それぞれ L- Val、 L- Orn、 L- Ile、 L- Gln、 L- Asp、 L- Asn、 L- Met、 L- Lys、 L- Thr及び L-Serからなる群から選ばれるアミノ酸の残基であるのが好ましぐ L-VaU L-Orn、 L-I le及び L-Glnからなる群から選ばれるアミノ酸の残基であるのがより好まし!/、。 R2として は、水酸基 (OH)であるのも好ましい。尚、 R4のアミノ酸残基としては、 L-Pro及び L- Ala以外のアミノ酸の残基が好ましく、さらに R2につ 、て述べたのと同様の基も好まし い。
一般式（1)及び（2)において、 R1と R2のいずれか一方がアミノ酸残基であるのが好 ましぐ R3と R4のいずれか一方がアミノ酸残基であるのが好ましい。この場合、 R1と R3 がアミノ酸残基で、 R2と R4が水酸基 (OH)であるのが好ましぐ又 R1と R3が水素原子 で、 R2と R4がアミノ酸残基であるのも好ましい。
上記一般式（1)及び（2)で表されるジペプチド誘導体やアミド誘導体は、例えば、 以下の反応スキームに示すように、アミノ基またはカルボキシル基を保護したロイシン やメチォニンと、適切な保護アミノ酸誘導体またはアミン類を縮合することで得ること が出来る。ペプチド合成法として液相合成、固相合成とも数多くの優れた方法が報告 されており、いずれの方法を用いて合成しても良ぐ特定の合成法に限定されるもの ではない。 [0012] 反応スキーム
Figure imgf000009_0001
R (a)： Fmoc, Boc, Cbzなど
R (b) : アミノ酸側鎖
R (c)： Me, Et， Bezny lなど
R (d) : H， アルキル基など
なお、（般式（1)及び (2)で示される化合物には、すでに試薬として入手可能なもの も多数有り、その場合、購入して用いることも可能である。
[0013] 本発明では、又、 L-ロイシン及び/又は L-メチォニンを含むことを特徴とする Dpp4 阻害剤を提供する。
本発明では、上記 DPP4阻害剤を糖尿病治療薬、抗肥満薬、飲水行動異常の改善 薬、抗不安薬又は痛感鈍麻治療薬の有効成分として使用することができる。
すなわち、本発明の Dpp4阻害剤のうち、 L-ロイシンには既に糖代謝改善効果が知 られており（特開 2003-171271など）、糖尿病の治療や予防への用途については公知 であるが、一方で、多くの Dpp4阻害剤が GLP-1の分解阻害活性により抗糖尿病作用 を有することから（Diabetes 53:2181-2189, 2004、 Diabetes Care 26:2929-2940, 2003 )も、本発明の式（1)で表される化合物に抗糖尿病作用があることは明らかである。 また、 Dpp4を遺伝的に欠損した動物においては、飲水行動の低下や、社会活動性 の上昇、痛覚の感受性上昇などの行動学的な特性が知られている（Physiology & Be havior 80 (2003) 123-134)、こうした既知の知見は、本発明の Dpp4阻害剤が飲水行 動異常の改善薬、抗不安薬、痛感鈍麻治療薬として有用であることを示している。
[0014] 本発明では、又、 Dpp4への結合することを特徴とするオートファジー調節剤を提供 する。すなわち、 Dpp4への結合する物質自体をオートファジー調節剤として使用する ことができ、又は Dpp4への結合する物質自体を有効成分とするオートファジー調節 剤を提供する。このような Dpp4への結合する物質としては、 Dpp4抗体が好ましいもの としてあげられ、具体的には、モノクローナル抗体クローン 236.3やモノクローナル抗 体 OX- 61をあげることができる。ここで、モノクローナル抗体クローン 236.3はオートフ アジ一を抑制する作用を有し、一方、モノクローナル抗体 OX- 61はオートファジーを 促進する作用を有する。これらの抗体は市販品として容易に入手することができる。 上記オートファジー調節剤は、医薬組成物の有効成分として使用することができる 。このような医薬組成物としては、手術後の腸管萎縮、慢性炎症や癌悪疫質に伴う筋 肉などの臓器萎縮症などの症状の治療剤、または予防剤である医薬組成物があげら れる。又、異常蛋白質の蓄積が病因と考えられる糖尿病に代表される種々の代謝- 内分泌疾患、またはパーキンソン病、アルッノヽイマ一病、ハンチントン舞踏病などの 神経変性疾患の治療剤、または予防剤である医薬組成物があげられる。
[0015] 本発明の医薬組成物の投与形態は特に制限されず、非経口又は経口投与、具体 的には静脈内、動脈内、皮下および筋肉内投与、輸液による投与により、安全かつ 必要な量を、一気にまたは点滴等により投与できる。このうち、経口投与が望ましい。 本発明の医薬組成物は、種々の剤型、例えば経口剤であれば、例えば、錠剤、力 プセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、液剤、細粒剤、その他、注射剤、クリーム剤、 座剤等の投与製剤とすることができる。これらの製剤化は、それ自体公知の方法によ つて行い得る。本発明の有効成分、製剤のいずれにおいても医薬的に許容される担 体、希釈剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性向上剤、その他製剤として必要な物 質を含有してよぐこれらを適宜組み合わせて処方することにより製剤を製造すること ができる。製剤用担体としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、 D-マン-トール、澱粉、結 晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、デンプン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセ ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノール、力 ルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ステアリン酸 マグネシウム、タルク、ァセチルセルロース、白糖、酸化チタン、安息香酸、パラォキ シ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセル口 ース、卵黄、界面活性剤、白糖、単シロップ、クェン酸、蒸留水、エタノール、グリセリ ン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリ ゥム、リン酸ナトリウム、ブドウ糖、塩ィ匕ナトリウム、フ ノール、チメロサール、パラォキ シ安息香酸エステル、亜硫酸水素ナトリウム等があり、製剤の形に応じて、本発明の 化合物と混合して使用される。
[0016] 本発明では、さら〖こ、膜型 Dpp4または遊離型 Dpp4への結合を指標とすることを特 徴とする薬物スクリーニング法を提供する。このうち、オートファジーを促進するモノク ローナル抗体 0X61及び Z又はオートファジーを抑制するモノクローナル抗体クロー ン 236.3を用いて、膜型及び/又は遊離型 Dpp4との結合を指標とする薬物スクリー ニング法が好ましい。
薬物スクリーニング法については、例えば、何らかの物理ィ匕学的な手法によりアイソ トープゃ蛍光色素などを標識したモノクローナル抗体 0X61やモノクローナル抗体ク ローン 236.3を用いて、膜型 Dpp4を発現する細胞とモノクローナル抗体との結合能 を変化させる活性を指標として、低分子化合物ライブラリーやペプチドライブラリーな どから、その結合能を修飾する物質のスクリーニングを行うことにより、簡便にオートフ アジ一を調節する物質のスクリーニングを行うことができる。このときに、モノクローナ ル抗体 0X61を用いたときには、オートファジーを促進する物質力 また、モノクロ一 ナル抗体クローン 236.3を用いたときには、オートファジーを抑制する物質がスクリー ユング可能である。さらに、膜型 Dpp4を発現する細胞の代りに、ヒトもしくは動物の血 漿より単離精製する力 もしくは組み換え DNA手法により作製したリコンビナント Dpp4 を用いても構わない。
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に より何ら限定されるものではない。
実施例
[0017] 参考例 1： Lys- Leuの合成
1) Leu-Wang Resinの合成 Fmoc- L-ロイシン 2.12g (6.01mmol)、ジイソプロピルカルボジイミド 756mg (6.00mmol)、 ジメチルァミノピリジン 30mg (0.246mmol)を DMF20mlに溶解して、固相合成用の 50ml シリンジ中で Wang Resin (1.20mmol/g)と 3時間室温で震盪した。溶液を捨て、ジメチ ルホルムアミド、メタノール、ジクロロメタンで榭脂を 6回繰り返し洗浄した。ピリジン 2ml 、無水酢酸 2mlを N-メチルピロリドン 20mlに溶解してシリンジに吸い、 2時間室温で震 盪した。溶液を捨て、ジメチルホルムアミド、メタノール、ジクロロメタンで榭脂を 6回繰 り返し洗浄して、真空ポンプで乾燥した。 20%ピぺリジン Zジメチルホルムアミド溶液を シリンジに 20ml吸い、室温で 10分震盪後、溶液を捨て、もう一度同じ操作を繰り返し た。ジメチルホルムアミド、メタノール、ジクロロメタンで榭脂を 6回繰り返し洗浄して真 空ポンプで乾燥した。
[0018] 2) ω - Boc- Lys- Leu- Wang Resinの合成
Fmoc- (ω - Boc)- L-リジン 2.814g (6.00mmol)、ジイソプロピルカルボジイミド 940mg、 ジメチルァミノピリジン 30mgを DMF20mlに溶解して、固相合成用の 50mlシリンジ中で 前記の Leu-Wang Resin全量とー晚室温で震盪した。溶液を捨て、ジメチルホルムァ ミド、メタノール、ジクロロメタンで榭脂を 6回繰り返し洗浄した。 20%ピぺリジン Zジメチ ルホルムアミド溶液をシリンジに 20ml吸い、室温で 10分震盪後、溶液を捨てる操作を 2回行った。ジメチルホルムアミド、メタノール、ジクロロメタンで榭脂を 6回繰り返し洗 浄して真空ポンプで乾燥した。
[0019] 3) Lys- Leuの合成
固相合成用の 5mlシリンジ中で、前記の ω - Boc- Lys- Leu- Wang Resin lOOmgと 95%ト リフルォロ酢酸水溶液 2mlを 1時間室温で放置（時々震盪）して、溶液を回収した。 95% トリフルォロ酢酸水溶液 2ml、ァセトニトリル 2mlの順で榭脂を洗い、洗液と反応溶液と 合わせて減圧濃縮した。主生成物を逆相 HPLC分取後、凍結乾燥して、 Lys-Leu 4.5 mgを得た。
ESI-MS (m/z) [M+H] + 260
他のジペプチドは、参考例 1と同様にして合成した。
[0020] 実施例 l :rhDpp4に対する阻害活性
Recombinant human Dipeptidyl Peptidase IV、rhDPP4, R&D systems, ffll80— SE) の合成基質 GLY- PRO- p- nitroanilide (G- P- pNA, sigma, #G—0513)切断活性に対 する各被検物の阻害能を測定した。 rhDPP4によって G- P-pNAは PROと pNAの間で 切断された。 pNAは 405nmに吸収を示すので、それを測定し切断量を求めた。
反応溶液（25mM Tris (pH8.0), lOOuM G- P- pNA, 0.25ng/ul rhDPP4)を調整し、被 検物は最終濃度 2mM (DMSO濃度 1%)になるように添加した。反応溶液を 37度中に 30 分保温し、終了後直ちに分光光度計を用いて 405nmの吸光度を測定した。反応は 20 Oulスケールで行!、、 96ウェルマイク口プレートを使用した。
同時に 100,33,ll,3.7,1.2,0.41,0.14uMのpNA溶液の405nmにぉける吸光度を測定 し、 pNA濃度と吸光度の関係式を得、各反応液中の pNA量 (基質切断量)を算出した 阻害率は同一プレート上に被検物なしのゥエルを 3—4ゥエル作成し、その基質切 断量の平均値 (A)に対する各被検物添加ゥエルの基質切断量 (B)の割合から以下の 式を用いて求め、 100分率で表記した。
阻害率 (%) = 100 X (1- (B) /(A))
[0021] 図 1に、蛋白質を構成する 20種類のアミノ酸のうち、ロイシン、イソロイシン、パリン、 及び 4-ヒドロキシ-イソロイシンと既存の Dpp4阻害剤である Diprotin Aにつ!/、て濃度依 存的な Dpp4阻害活性をプロットして示した。この結果から、ロイシンが Dpp4を阻害す ることが明らカゝである。図 2に、蛋白質を構成する 20種類のアミノ酸が、 Dpp4酵素活 性に及ぼす影響を検討した結果を、縦軸には反応後の基質切断率で表記して示し た。図 2から 20種類のアミノ酸の中では、 Leuと同様に Metに Dpp4阻害活性があること がわカゝる。
一方、表 1に、一般式（1)であらわされる代表的な化合物の Dpp4阻害活性を上記 の方法によって求めた結果をまとめて示した。
[0022] 表 1 R1 R2 抑制率（％)
NH2 33.2
H NHC2H5 35.0
OCH3 31.1
L-Asp 91.1
L-Trp 89.0
L-Met 88.2
L-Asn 87.3
L-Tyr 87.3
L-Val 83.8
L-Arg 83.7
L-Cys 81.8
し一し eu OH 80.0
L-Phe 71.2
L-Gln 63.8
L-Ile 51.4
L-Glu 49.0
L-Ser 47.9
l_ - His 46.9
し一し ys 38.4
l_ - 0「n 32.0
L-Ala 23.4
L-Thr 18.2
L-Val 68.1
L-Orn 61.2
L-Ile 51.0
L-Gln 50.5
L-Asp 46.6
L-Asn 44.3
H L-Met 43.2
し一し ys 42.7
L-Thr 42.0
L-Ser 41.2
L-Phe 40.4
l_ - His 38.9
^ Ala 35.8
Gly 33.2 実施例 2：ラット肝細胞を用いたオートファジーの測定
自由摂食で飼育した 140- 180g雄の Wistar ratを用いて、 collagenase perfusion法に よりラット肝細胞を調整した（Seglen, P.O. Preparation of isolated liver cells. (1976) In Methods in Cell Biology eds. D.M. Prescott, 13, 29—83. Academic: new York I Lon don) 0この方法で、 1個体の肝臓あたり 2-2.5 x 108 cellsの肝細胞が調整できた。 調整した肝細胞の蛋白質分解 (オートファジー）の測定は、 Venerandoらの方法で 行った。すなわち、肝細胞を 10mlのフラスコ中に KRBバッファー（24 mM bicarbonate, 6 mM glucose) 3.5mlの細胞懸濁液 (1-1.2 x 106 cells/ml)として、炭酸ガスインキュべ ータ中で 37°Cに保温し 45分放置した。その後、蛋白質合成を止める目的で 20uMシク 口へキシミドの存在下に各種の薬剤処理を行い、さらに 30分間に保温した。 31分及 び 42分に 0.35mlの肝細胞懸濁液を取り出し、後者に氷冷 perchloric acid (最終濃度 6 %)を添加し一 20°Cにて保存した。酸可溶性画分の上清中のパリンを測定し、 11分間 のノ リン放出を測定した。
[0024] 実験は独立して三回行った（Venerando, R. , Miotto, G.， Kadowaki, M. , Siliprandi, N. , and Mortimore, G.E. (1994) Multiphasic control of proteolysis by leucine and ala nine in the isolated rat hepatocytes. Am. J. Physiol. 266, C455- C461)。アミノ酸測 定は Tapuhiらの方法で行った（Tapuhi, Y.， Schmidt, D.， Lindner, W.， and Karger, B. L. (1981) Dansylation of amino acids for high-performance liquid chromatography, A nal. Biochem. 115, 123-129)。
実験材料は下記のとおりである。 Dpp4に対するモノクローナル抗体、 MRC 0X61 is otype IgG2a (Oxrora Biotecnnology八 clone 2ό6.3 isotype Ig 2bk (Pierce Endogenノ。 表 2に、アミノ酸飢餓によりラット肝細胞に誘導されるオートファジーに対して、口イシ ン、及び Dpp4抗体によるオートファジーの効果を示した。
[0025] 表 2
1 A .I ff ct of DPP 1¥ modidaiorx an utkifnt n of starvation
Figure imgf000015_0001
M. Oi
liihlbltion si proteolysis (%) Si. Dev. Experiimeri is
A No Addition 0 8.9 13
B Leucine 27.9 11.6 13
C Leu 0X^51 38.1 11.5 6
D clone O -61 - 9.9 6.4 6
E clone 23-6,3 12.3 12.6 7 [0026] ロイシンはこれまでによく知られるように、アミノ酸飢餓によるオートファジーを強く抑 制することが明らかである（Ann. Rev. Nutr. 1987, 7: 539-564)。一方、 Dpp4抗体はク ローンにより、オートファジーに対する効果に差があり、単独で処理した場合には、 0 X- 61はオートファジーを促進し、一方で、 236. 3はオートファジーを抑制する。また 、 OX-61はロイシンとともに添加するとロイシンによるオートファジー抑制効果をさらに 高めることがわかる。こうした結果は、 Dpp4に結合する物質によりアミノ酸飢餓による オートファジー活性を調節できることを示している。したがって、 Dpp4に結合する物質 、たとえば、 Dpp4に対する抗体や、既存の Dpp4阻害剤などにより、オートファジー活 性を調節することができることを示すものである。
アミノ酸以外にオートファジー活性を調節する物質としては、インスリンによるオート ファジーの抑制、グルカゴンによるオートファジーの促進が知られている。一方で、低 分子化合物としては、ビタミン Cがグリア細胞のオートファジーを抑制する効果が報告 されているが（J.ournal of Neurochemistry,2002,82, 538-549)、それ以外にはほとん ど知られていない。また、 Dpp4は各種のペプチドホルモンの活性制御を介して生体 内で栄養代謝を調節すると考えられている（Clinical Science, 2000; 99: 93-104)が、 これまでに栄養飢餓に伴うオートファジーなどの臓器萎縮や細胞死などに関与する ことは知られていない。
[0027] オートファジーは栄養飢餓による生体の正常な応答であり、細胞の生育や正常な 細胞機能に必要なアミノ酸を、生体が自ら再利用する恒常性維持の重要な仕組みで ある。しかしながら、過度の栄養飢餓による臓器萎縮や、その仕組みの破綻は各種 の臓器に様々な異常をきたし、疾患の原因となることも知られてきた。こうした、状況 の中で、栄養飢餓によるオートファジーをアミノ酸以外の物質によって調節することは 、栄養不良や炎症に伴う臓器萎縮や、オートファジー異常が原因となる、種々の疾患 の予防 '治療のために有効な手段である。臓器萎縮としては、手術後の不摂食の持 続に伴う消化管萎縮や慢性炎症、癌悪疫質に伴う筋肉などの臓器萎縮症などがあ げられ、また、オートファジー異常が原因となる疾患としては、異常蛋白質の蓄積が 病因と考えられる糖尿病に代表される種々の代謝 ·内分泌疾患、またはパーキンソン 病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病などの神経変性疾患があげられる（Scien ce, 2004; 306: 990—995、 Biochem. Biophys. Res. Com., 2004; 313: 453—458)。さら に、移植用臓器の保存中および、移植後の再かん流時の臓器で、オートファジーが 起こることが知られている（Arch Histol Cytol, 68(1):71- 80(2005))。
図面の簡単な説明
[図 1]ロイシン、イソロイシン、ノ リン、及び 4-ヒドロキシ-イソロイシンと既存の Dpp4阻害 剤である Diprotin Aにつ 、て濃度依存的な Dpp4阻害活性をプロットして示した図で ある。
[図 2]蛋白質を構成する 20種類のアミノ酸が、 DPP4酵素活性に及ぼす影響を検討し た結果を、縦軸には反応後の基質切断率で表記して示した図である。

Claims

請求の範囲
下記一般式（1)で表されるロイシン誘導体又は下記一般式（2)で表されるメチォ ン誘導体を含むことを特徴とする Dpp4阻害剤。
Figure imgf000018_0001
(式中、 R1及び R3はそれぞれ水素原子 (H)、 L-アミノ酸残基、 R2は水酸基 (OH)、 炭素数 1から 6のアルコキシキ基、アミノ基 (NH2)、炭素数 1から 6のアルキルアミノ基 、グリシン残基、 j8 -ァラニン残基、 L-アミノ酸（プロリン、ァラニン及びフエ-ルァラ- ンを除く）残基、 L-アミノ酸アミド (プロリンアミド、ァラニンアミド及びフエ二ルァラニン アミドを除く）残基、 R4は水酸基 (OH)、炭素数 1から 6のアルコキシキ基、アミノ基 (N H2)、炭素数 1から 6のアルキルアミノ基、グリシン残基、 j8 -ァラニン残基、 L-アミノ酸 (プロリン及びァラニンを除く）残基、 L-アミノ酸アミド (プロリンアミド及びァラニンアミド を除く)残基を表す。）
[2] 一般式（1)中、 R2のアミノ酸残基が、それぞれ L- Val、 L- Orn、 L- Ile、 L- Gln、 L- Asp
、 L-Asn、 L-Met、 L-Lys、 L-Thr及び L-Serからなる群から選ばれるアミノ酸の残基で ある請求項 1記載の Dpp4阻害剤。
[3] L-ロイシン及び/又は L-メチォニンを含むことを特徴とする Dpp4阻害剤。
[4] 請求項 1〜4の!ヽずれか 1項記載の Dpp4阻害剤を含有する糖尿病治療薬、抗肥満 薬、飲水行動異常の改善薬、抗不安薬又は痛感鈍麻治療薬。
[5] Dpp4への結合することを特徴とするオートファジー調節剤。
[6] Dpp4抗体を含む請求項 5記載のオートファジー調節剤。
[7] Dpp4抗体が、モノクローナル抗体クローン 236.3である請求項 6記載のオートファ ジー調節剤。
[8] Dpp4抗体が、モノクローナル抗体 OX-61である請求項 6記載のオートファジー調節 剤。
[9] 請求項 5〜8の 、ずれか 1項記載のオートファジー調節剤を含むことを特徴とする 医薬組成物。
[10] 栄養不良、老化、手術後の腸管萎縮、慢性炎症や癌悪疫質に伴う症状の治療剤、 または予防剤である請求項 9記載の医薬組成物。
[11] 代謝，内分泌疾患、または神経変性疾患の治療剤、または予防剤である請求項 9 記載の医薬組成物。
[12] 請求項 5〜8の 、ずれか 1項記載のオートファジー調節剤を含むことを特徴とする 移植用臓器保存剤。
[13] 膜型 Dpp4または遊離型 Dpp4への結合を指標とすることを特徴とする薬物スクリー- ング法。
[14] オートファジーを促進するモノクローナル抗体 0X61及び Z又はオートファジーを抑 制するモノクローナル抗体クローン 236.3を用いて、膜型及び/又は遊離型 Dpp4と の結合を指標とする請求項 13記載の薬物スクリーニング法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012520888A (ja) * 2009-03-18 2012-09-10 オラテック インダストリーズ リミティド ライアビリティ カンパニー 炎症及び疼痛の処置用の化合物

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010022236A2 (en) * 2008-08-20 2010-02-25 The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Inhibiting obesity progression by inhibiting adipocyte differentiation with a pre-adipocyte autophagy inhibitor
US20130202646A1 (en) * 2010-02-25 2013-08-08 San Diego State University (Sdsu) Foundation Compositions and methods for modulating autophagy

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10182613A (ja) * 1996-10-25 1998-07-07 Tanabe Seiyaku Co Ltd テトラヒドロイソキノリン誘導体
JP2003171271A (ja) * 2001-09-26 2003-06-17 Ajinomoto Co Inc 耐糖能異常用薬剤
WO2004026822A2 (en) * 2002-09-19 2004-04-01 Abbott Laboratories Pharmaceutical compositions as inhibitors of dipeptidyl peptidase-iv (dpp-iv)
WO2005040095A1 (en) * 2003-10-16 2005-05-06 Astrazeneca Ab Inhibitors of dipeptidyl peptidase iv
WO2005049006A1 (ja) * 2003-11-21 2005-06-02 Ajinomoto Co., Inc. 糖尿病治療剤

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10182613A (ja) * 1996-10-25 1998-07-07 Tanabe Seiyaku Co Ltd テトラヒドロイソキノリン誘導体
JP2003171271A (ja) * 2001-09-26 2003-06-17 Ajinomoto Co Inc 耐糖能異常用薬剤
WO2004026822A2 (en) * 2002-09-19 2004-04-01 Abbott Laboratories Pharmaceutical compositions as inhibitors of dipeptidyl peptidase-iv (dpp-iv)
WO2005040095A1 (en) * 2003-10-16 2005-05-06 Astrazeneca Ab Inhibitors of dipeptidyl peptidase iv
WO2005049006A1 (ja) * 2003-11-21 2005-06-02 Ajinomoto Co., Inc. 糖尿病治療剤

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LU Z. ET AL.: "Participation of autophagy in the degeneration process of rat hepatocytes after transplantation following prolonged cold preservation", ARCH. HISTOL. CYTOL., vol. 68, no. 1, 2005, pages 71 - 80, XP003001603 *
MENTLEIN R. ET AL.: "Dipeptidyl-peptidase IV hydrolyses gastric inhibitory polypeptide, glucagon-like peptide-1(7-36)amide, peptide histidine methionine and is responsible for their degradation in human serum", EUR. J. BIOCHEM., vol. 214, no. 3, 15 June 1993 (1993-06-15), pages 829 - 835, XP006000395 *
NISHITANI S. ET AL.: "Pharmacological activities of branched-chain amino acids: specificity of tissue and signal transduction", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 313, no. 2, 9 January 2004 (2004-01-09), pages 387 - 389, XP004480394 *
SHINTANI T. AND KLIONSKY D.J.: "Autophagy in Health and Disease: A Double-Edged Sword", SCIENCE, vol. 306, no. 5690, 5 November 2004 (2004-11-05), pages 990 - 995, XP002378589 *
WEIHOFEN W.A.: "Crystal Structures of HIV-1 Tat-derived Nonapeptides Tat-1(1-9) and Trp2-Tat-(1-9) Bound to the Active Site of Dipeptidyl-peptidase IV(CD)26", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 280, no. 15, 28 January 2005 (2005-01-28), pages 14911 - 14917, XP003001602 *
WRENGER S. ET AL.: "EFFECTS OF NONAPEPTIDES DERIVED FROM THE N-TERMINAL STRUCTURE OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS-1(HIV-1)TAT ON SUPPRESSION OF CD26-DEPENDENT T CELL GROWTH", ADVANCES IN EXPERIMENTAL MEDICINE AND BIOLOGY, vol. 477, 2000, pages 161 - 165, XP003001601 *
YOSHIMORI T.: "Autophagy: a regulated bulk degradation process inside cells", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 313, no. 2, 9 January 2004 (2004-01-09), pages 453 - 458, XP004480405 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012520888A (ja) * 2009-03-18 2012-09-10 オラテック インダストリーズ リミティド ライアビリティ カンパニー 炎症及び疼痛の処置用の化合物

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