WO2006105622A1 - Nouveaux supports, en particulier pour 1 ' immunodetection molecules d'interet - Google Patents

Nouveaux supports, en particulier pour 1 ' immunodetection molecules d'interet Download PDF

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WO2006105622A1
WO2006105622A1 PCT/BE2006/000030 BE2006000030W WO2006105622A1 WO 2006105622 A1 WO2006105622 A1 WO 2006105622A1 BE 2006000030 W BE2006000030 W BE 2006000030W WO 2006105622 A1 WO2006105622 A1 WO 2006105622A1
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WO
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container
detection
polymer
plasma
pcr
Prior art date
Application number
PCT/BE2006/000030
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English (en)
Inventor
Ernst Heinen
Gilbert Legeay
Fabienne Poncin-Epaillard
Willy Zorzi
Benaissa Elmoualij
Véronique Legeais
Eric Rouault
Original Assignee
Universite De Liege
Centre National De La Recherche Scientifique
Association Pour Les Transferts De Technologies Du Mans
Universite Du Maine
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Publication date
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Priority to US11/910,554 priority patent/US20080206795A1/en
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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C59/00—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor
    • B29C59/14—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by plasma treatment
    • B29C59/142—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by plasma treatment of profiled articles, e.g. hollow or tubular articles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above

Definitions

  • Novel carriers particularly for the immunodetection of molecules of interest
  • the present invention relates to novel types of carriers designed primarily for the detection and assay of molecules of interest, particularly those present at very low concentrations. These supports can also allow the transfer, storage and manipulation of molecules of interest.
  • the target areas of application are numerous.
  • the present invention relates more particularly to immuno-detection, selective capture, manipulation as well as storage of molecules of interest. These supports can therefore be used in the industrial sectors of
  • the preparation of the samples and more particularly the protocol for extracting the protein from the matrix; the supports (tubes, pipettes, tips, etc.), which must be treated in such a way as to improve the fixation of the molecule of interest (antibodies or antigen, etc.);
  • the detection method which must be ultrasensitive (eg quantitative immuno-PCR).
  • the aim of the invention is to improve the preparation of the sample as a function of the type of antigen that it is desired to detect, more particularly as regards the support.
  • Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathy are fatal neurodegenerative diseases that affect both humans and animals (Bovine and Feline Spongiform Encephalopathy, Scrapie of Sheep and Goats for Animals, Creutzfeldt-Jakob Disease, Gerstmann Disease). St Hurssler-Scheinker, fatal familial insomnia or Kuru for humans). All prion diseases share the same molecular mechanism that involves the conversion of a normal cellular prion protein (PrPc) into an infectious form, insoluble in nonionic detergents and partially resistant to proteases, generally called PrPsc.
  • PrPc normal cellular prion protein
  • This infectious protein has a secondary structure particularly rich in b sheets, which gives it a very hydrophobic character; it therefore tends to aggregate to form insoluble fibrils in water.
  • PrPrec normal prion protein
  • vCJD Creutzfeldt-Jakob
  • kits for detecting an infectious protein usually begins with a development of the technology on the recombinant form of this protein, non-infectious and therefore easier to handle.
  • the present invention provides a detection kit using ELISA and iPCRq technologies on the recombinant prion protein, PrPrec.
  • Immunodetection sandwich In this case, it is necessary to coater a capture antibody on the surface of the support for carrying out the diagnostic test. Depending on the type of antibody used, the nature of the support should be optimized; an antibody being a soluble molecule in an aqueous medium (serum), it will therefore prefer to attach to a support having a hydrophilic nature.
  • the prion protein being highly hydrophobic in the infectious form, it is therefore preferable to store it in containers whose wall has a hydrophilic character.
  • the prion protein will be more likely to be pushed away from the walls and will not tend to adhere to it. There will be less loss of protein of interest.
  • the invention therefore proposes new types of supports for detecting and dosing molecules of interest. These supports can also be used for the storage of (complex or simplified) samples as well as for the manipulation of the molecules of interest (sampling systems reducing the loss of samples on the walls). These supports will be different in that the wall has undergone an electromagnetic plasma treatment and a polymer deposit that modifies the nature of its surface, depending on the application that one wishes to make.
  • i-PCR L 1 immuno-Polymerase Chain Reaction
  • i-PCRq quantitative i-PCR
  • micro- (and nano-) miniaturization of technologies becomes possible and allows microdosing of prion proteins, and more generally of proteins.
  • the miniaturization of the detection and / or assay tests by the use of samples of volumes and concentrations always lower and lower, causes an exacerbation of the importance of the surface of the support. This is also true in the field of sample handling, as well as that of storage, in which it is preferable that the support attracts antigen or regrowth, depending on the intended applications.
  • the invention therefore aims at controlling the functionality, the uniformity as well as the reproducibility of the support surfaces, in particular for microdosing and for the storage of certain molecules.
  • “Plasma treatment of polymeric materials to enhance immobilization of analytes” (Patent No. WO9534814).
  • This invention provides a method of surface treatment of a polymeric material with a gas plasma (ionized oxygen). This treatment makes it possible to increase the immobilization of the antigen used to carry out the diagnosis.
  • This invention provides a method of modifying a solid surface to improve its biocompatibility. This method uses a biocompatible agent capable of activating covalent bonds with the surface of the solid.
  • This invention provides a method of immobilizing biomolecules on a support.
  • the biomolecule itself is grafted onto a solid and hydrophilic polymeric support having been previously ionized.
  • This technique is applicable to the immobilization of a wide variety of biomolecules such as enzymes, hormones, lectins, drugs, vitamins, antibodies, etc. These products can be used for therapeutic or diagnostic applications.
  • the invention therefore proposes to specifically functionalize these supports, using a clean, reproducible and easily industrializable technology known as "electromagnetic plasmas".
  • electromagnetic plasmas a plasma gas treatment of varying nature, pressure, power and frequency; followed in some cases and preferably by a physical treatment depositing on the surface of the support of polymers of medical grade or other organic molecules, poly vinylpyrrolidone and celluloses ...
  • the present invention therefore proposes, among other things, new types of supports (tubes, tips and multi-well plates) that enable the detection, dosing, manipulation and storage of molecules of interest.
  • these supports according to the invention are "activated” by covering their surface with antibodies, antigens, ligands and / or specific receptors fixed by physico-chemical bonds.
  • the support is "neutralized” and therefore allows the improvement of the sensitivity of the assay (mainly at low concentrations) but also the improvement of the reproducibility of the assay.
  • These supports can in particular be used for the detection and assay of prion proteins, as described in the examples below.
  • the invention has been applied more particularly to multi-well supports polypropylene (PP), polystyrene (PS) and polycarbonate (PC), but can be applied to other types of media such as commercial products, consumables laboratory (tips, tubes,.) and medical consumables (catheter,.) and artificial organs.
  • PP polypropylene
  • PS polystyrene
  • PC polycarbonate
  • Electromagnetic plasmas These are electrical discharges carried out either at ambient pressure (in this case they are called crown discharges, corona or DBD), or under partial vacuum (approximately 0.1 to 5 torr, ie 1 to 10 mPa). These electric discharges contain excited gas atoms (N2, 02, etc.), but of rather low energy (some eV). These excited species will bombard the surface of the supports and will therefore break some of the chemical bonds constituting this object (-CC-- bonds, -C-0, --CH, etc.), which will give rise to so-called species. "Radicals" (--C 0 ; --0 °, etc.) generally unstable. It has been estimated that the surface density of reactive species is 10 to 100 radicals per square nanometer. As the energy of the bombardment is low, the sites are created in a slice of material (the support) of thickness less than 10 nanometers.
  • These groups have a hydrophilic character and gives a possibility of adhesion with something that we will bring: a paint, a glue, bio-compatible polymers. Adhesion will be acquired spontaneously by the establishment of low energy bonds called hydrogen bonds. If they are numerous, the adhesion will be excellent.
  • the radicals make it possible to initiate a polymerization, on the condition of bringing into contact with molecules capable of polymerizing, in an oxygen-free medium, and in general by heating for several hours: polymer chains are hooked by strong bonds, covalent type, on the support. This system is over. heavy to achieve but the adhesion is excellent.
  • containers or plastic supports can be chosen from the following nonlimiting list:
  • PP Polypropylene
  • PET polyester terephthalate
  • PC Polycarbonate
  • PS Polystyrene
  • the supports used are commercial supports having the desired dimensional characteristics for the analyzes (boxes, flat supports, multi-well systems, balls, etc.). They are clean and have no pollutants, which can come from manufacturing.
  • the plasma treatment containers or plastic materials may be selected 'from the following nonlimiting list: Plasma types: o Carbon Dioxide (CO2); o Carbon tetrafluoride (CF4); o Nitrogen (N2); o Oxygen (02); o Argon (Ar).
  • CO2 Carbon Dioxide
  • CF4 Carbon tetrafluoride
  • N2 Nitrogen
  • Oxygen 02
  • Argon Ar
  • the treatment by polymer deposition on the plastic containers or supports can be effcetué with a solution of non-limiting list of polymer following:
  • Polymer Chemical Treatments Polyvinylpyrrolidone (or PVP) K30 and K90; polyvinyl alcohol (or PVA) 88 and 98% in H 2 O; o carboxymethyl cellulose (or CMC); hydroxypropylmethyl cellulose (or HPMC) 0.2%; o Polyethylene glycol (or PEG) E 4000; o Polyhydroxyethyl methacrylate (or PHEMA).
  • a 8-well PCR-type polycarbonate strip is used, marketed by the German firm RoboScreen (reference number 0501000102).
  • the plasma treatment of the polycarbonate support is carried out in a reactor with a capacity of 20 liters working in radiofrequency.
  • the reactor is evacuated to degass the support for 10 minutes, then E2006 / 000030
  • the nitrogen (N 2) is introduced into the reactor at a flow rate of 10 cm 3 / min.
  • the support is subjected to a working pressure of approximately 3.4 10 -1 mbar and a radioelectric power of 100 W.
  • the support is then brought back to atmospheric pressure, under a neutral atmosphere.
  • the support is deposited (for about 5 minutes and at room temperature) in a dilute aqueous solution of polyvinylpyrrolidone grade K30. The support is then dried completely under an air stream at about 40 ° C.
  • the support is stored in a neutral atmosphere (N2), and protected from light in sealed packaging.
  • N2 neutral atmosphere
  • Plasma treatment alone O PS (-N 2, -CO 2 and -CF 4) o PC (-N 2, -CO 2 and -CF 4) o PP (-N 2, -CO 2, -CF 4, Ar and O 2)
  • Plasma treatment + polymer deposition o PP-N2 (- PVP, -PVA, -CMC, -HPMC, PEG and PHEMA) GD PC-N2 (- PVP, -PVA, -CMC, -HPMC, PEG and PHEMA) I) Analysis of the media produced:
  • the commercial supports used consist of: 95 to 100% of polymers (or plastics) such as polycarbonate, polyester terephthalate, polystyrene or polypropylene,
  • additives liquid petrolatum, paraffin or stearate. These additives have the disadvantage of emerging from the support over the days and forming a polluting film covering the plastic surface.
  • Wetting test This test is performed by the water drop test. During this, a drop of water is deposited on the surface of the support and the internal angle thereof is measured in order to estimate the hydrophobic (or hydrophilic) nature of the support.
  • Plasma-treated support Contact angle of 20 to 30 °, therefore relatively hydrophilic and generally not stable over time
  • Coating Buffer 0.05M NaHCCG - Na2CO3 O ; 05M - pH 9.4.
  • PBS buffer 0.14M NaCl - 8mM Na2HPO4.2H2O - 1.5mM KH2PO4
  • Saturation buffer PBS buffer + 3% BSA - pH 7.4.
  • Dilution buffer A PBS buffer + BSA 1% + Tween 20 0.1%
  • Dilution buffer B PBS buffer + 1% BSA - pH 7.4.
  • BSA wash buffer 1/5% PBS + BSA buffer - pH 7.4.
  • Tween wash buffer PBS buffer + 0.1% Tween 20 - pH
  • Monoclonal capture antibodies SAF32 (Eurogentec) and 12F10 (Bio-Rad).
  • PrPrec Recombinant prion protein
  • TMB 3,3 ', 5,5' tetramethyl benzedine
  • Streptavidin coupled to a reporter DNA Streptavidin coupled to a reporter DNA (Strep-DNA): Oioigine Protein Research Center (Ulg)
  • ELISA ELISA-type wells marketed by the German company Greiner (catalog number 655081) is used.
  • the working volume is 50 ⁇ l / well.
  • the steps of the protocol are as follows: Coat, overnight at 4 ° C., of the SAF32 capture monoclonal antibody diluted to a concentration of 1 ⁇ g / ml in coating buffer (50 ⁇ l / well).
  • PrPrec bovine protein (Roboscreen) diluted at various concentrations in dilution buffer A (50 ⁇ l / well).
  • Washings (300 ⁇ l / well): 2 in Tween wash buffer followed by 2 in BSA wash buffer.
  • ELISA ELISA-type wells marketed by the German company Greiner (catalog number 762061) is used.
  • the working volume is 100 ⁇ l / well.
  • the capture monoclonal antibody 12F10 diluted to a concentration of 10 ⁇ g / ml in coating buffer (100 ⁇ l / well).
  • PrPrec protein bovine (Prionics) diluted at different concentrations in dilution buffer B (100 .mu.l / well).
  • the plasma modified support 02 is less effective than the Argon modified support.
  • An improvement in the detection limit of a factor close to 4 is observed for the Argon-treated support compared to that treated with O 2.
  • the PP Ar has a larger detection range than the control. untreated, resulting in better discrimination power. The latter therefore seems better suited to this type of application.
  • All these polymer deposits improve the detection limit by a factor of at least 4 and the discrimination power by a factor of 2.5 minimum.
  • iPCRq For the iPCRq, an iPCRq (Roboscreen) type bar containing 8 wells is used and the working volume is 50 ⁇ l / well.
  • the steps of the protocol are the following: Coating, overnight at 4 ° C., the Saf32 monoclonal capture antibody diluted to a concentration of 10 ⁇ g / ml in coating buffer (50 ⁇ l / well). 2- Washing with 250 ⁇ l / well of PBS buffer (5 washes).
  • PrPrec protein Robot
  • dilution buffer B 50 ⁇ l / well
  • 6- Washes 250 ⁇ l / well: 3 in Tween wash buffer followed by 3 in BSA wash buffer.
  • the invention therefore proposes
  • a transfer container, storage or detection Poui * entities in particular biological solubilized or suspended, characterized in that it is made of a material (plastic, glass, mineral or organic compound), preferably in polypropylene or polycarbonate, surface treated with a plasma followed by a polymer deposit.
  • the polymer deposit is obtained by dipping or placed in contact with a solution, preferably an aqueous solution, of an organic polymer, for example a polyethylene glycol, preferably at room temperature
  • the polymer deposit is produced directly after the plasma treatment, p.e. 1 to 10 minutes, preferably within 5 minutes
  • such a container may constitute a support for the assay of biological entities, making it possible to minimize the losses of these molecules by adsorption and / or by altering their native properties.
  • Such a container can also be a support for the transfer and manipulation of biological or other molecules, reducing the loss of material on the walls thereof.
  • It can be isolated tubes, strip or multi-well plates or consumables of different shapes (tips, cannulae, cups).
  • the plasma used is a gas plasma (preferably N 2, Ar or CFA) of variable pressure, power and frequency,
  • the plasma treatment is followed by one or more deposits of organic molecules or of polymers of medical grade,

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  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L' invention concerne les supports ou conteneurs pour entités biologiques solubilisées ou en suspension dont les parois sont en matières plastiques traitées en surface par un plasma electromagnétique suivi par un dépôt de polymere . Il peut s'agir de tubes ou de plaques multi-puits. Il en resulte entre autre la possibilité d'effectuer des stockages, des transferts et des réactions dans le cadre de microdosages d’entités biologiques, plus particulièrement de la proteine prion, avec une sensibilité accrue.

Description

Nouveaux supports, en particulier pour 1 ' immunodétection de molécules d'intérêt
La présente invention concerne de nouveaux types de supports conçus principalement pour la détection et le dosage de molécules d'intérêt, en particulier celles présentes à de très faibles concentrations. Ces supports peuvent également permettre le transfert, le stockage et la manipulation de molécules d'intérêt.
Les domaines d'applications visés sont nombreux. La présente invention se rapporte cependant plus particulièrement à 1 ' immuno-détection, la capture sélective, la manipulation ainsi que le stockage de molécules d'intérêt. Ces supports pourront donc être utilisés dans les secteurs industriels de
1 'agroalimentaire, de la santé animale et humaine, et plus particulièrement dans les laboratoires d'analyses médicales et vétérinaires. A titre indicatif, au niveau mondial, le marché du diagnostic in vitro représente 24 milliards d'euros dont 7,4 millions rien que pour l'Europe (900 millions pour les instruments et 6,5 milliards pour les réactifs) . La détection et le dosage d'antigènes spécifiques ont donc une importance économique considérable dans les domaines du diagnostic médical, environnemental et agroalimentaire. En particulier, dans le domaine vétérinaire, pour la détection de la protéine prion chez les bovins (encéphalopathie spongiforme bovine) , les ovins (la tremblante du mouton) et les caprins ; et dans le domaine de la médecine humaine pour la détection de la protéine prion et des biomarqueurs de maladies neurodégénératives . De nos jours, on ressent constamment le besoin d'améliorer la sensibilité des tests de diagnostic in vitro ; notamment afin de pouvoir diagnostiquer les maladies à un stade précoce, antérieur à l'apparition des premiers symptômes cliniques. Le développement de tels kits de diagnostic nécessite donc 1 ' intégration de trois critères primordiaux que sont :
- la préparation des échantillons, et plus particulièrement le protocole d'extraction de la protéine de la matrice ; - les supports (tubes, pipettes, tips, .), qui doivent être traités de manière à notamment améliorer la fixation de la molécule d'intérêt (anticorps ou antigène, .) ;
- la méthode de détection qui doit être ultrasensible (ex : immuno-PCR quantitative) .
L'invention vise l'amélioration de la préparation de l'échantillon en fonction du type d'antigène que l'on désire détecter, plus particulièrement en ce qui concerne le support .
L'utilisation de technologies de détection de plus en plus sensible entraîne une exacerbation du rôle du support, et notamment de ses « propriétés ». En effet, ces technologies ultra-sensibles sont souvent utilisées pour réaliser une détection d'antigène à une concentration très proche de la limite de détection. II est donc primordial de pouvoir optimiser le matériel de manière à minimiser ses interférences et de permettre une réduction du bruit de fond. La plupart des tests de diagnostic in vitro, nécessitant une immobilisation de la molécule d'intérêt à doser, requièrent l'utilisation de supports permettant la réalisation du diagnostic ; mais aussi des systèmes réduisant au maximum les pertes, notamment par adsorption sur les parois, lors du stockage ou du prélèvement de matériel .
Les maladies à prion (ou encéphalopathie spongiforme transmissible) sont des maladies neurodégénératives fatales qui affectent aussi bien les hommes que les animaux (encéphalopathie spongiforme bovine et féline, tremblante du mouton et des chèvres pour les animaux ; maladies de Creutzfeldt-Jakob, de Gerstmann-Strâussler-Scheinker, insomnie familiale fatale ou encore Kuru pour les humains) . Toutes les maladies à prion partagent le même mécanisme moléculaire qui implique la conversion d'une protéine prion cellulaire normale (PrPc) en une forme infectieuse, insoluble dans les détergents non ioniques et partiellement résistante aux protéases, généralement appelée PrPsc . Cette protéine infectieuse a une structure secondaire particulièrement riche en feuillets b, ce qui lui donne un caractère très hydrophobe ; elle a donc tendance à s'agréger pour former des fibrilles insolubles dans l'eau. Dans les laboratoires, on travaille en général avec une forme recombinante de la protéine prion normale (PrPrec) , qui est produite à partir d'Escherichia coli.
Jusqu'à présent, il n'existe pas de kits de détection permettant la détection de la protéine prion infectieuse chez les humains et animaux vivants. En effet, les tests utilisés actuellement dans le domaine alimentaire pour les analyses de carcasses bovines sont tous basés sur un diagnostic post-mortem. Ces derniers consistent en général en une confirmation par histopathologie ou immunohistopathologie. Une série de tests post-mortem dits rapides est apparue ces derniers mois. Ils sont tous basés -A -
sur l'utilisation d'anticorps : ELISA sandwich (Bio-Rad) , ELISA direct (Enfer Scientific) ou encore Western-Blot (Prionics) .
De plus, ces dernières, années un nouveau variant de
Creutzfeldt-Jakob (vCJD) est apparu. Il a été montré que cette maladie était liée à une contamination de l'individu par la protéine prion suite à l'ingestion de viande infectée par la maladie de la vache folle. Il a aussi été montré que cette maladie pouvait être transmise par la voie sanguine (par transfusion) . Mi-2005, près de 180 personnes étaient atteintes de vCJD en Europe. Sur les 158 détectées en Angleterre, 148 répondent aux critères pur donner leur sang. Depuis 2004, 3 personnes sont déjà décédées à la suite d'une transfusion de sang contaminé par la protéine prion.
Etant donné qu'il y a plus de 80 millions de poches de sang qui sont distribuées chaque année au niveau mondial, il devient donc évident qu'il est nécessaire de pouvoir mettre au point un kit de détection de la protéine prion suffisamment sensible et robuste que pour permettre sa détection dans le sang, afin notamment de s'assurer que les poches de sang transfusées soient saines et éviter une nouvelle affaire du « sang contaminé ».
La mise au point d'un kit de détection d'une protéine infectieuse débute en général par une mise au point de la technologie sur la forme recombinante de cette protéine, non infectieuse et donc plus facile à manipuler. Dans le cas de la protéine prion, la présente invention propose un kit de détection utilisant les technologies ELISA et iPCRq sur la protéine prion recombinante, PrPrec. On comprendra que suivant le type d'essai à réaliser, la nature du support va avoir une influence considérable.
Immunodétection en sandwich : Dans ce cas, il est nécessaire de coater un anticorps de capture sur la surface du support permettant la réalisation du test de diagnostic. Suivant le type d'anticorps utilisé, la nature du support devra être optimalisée ; un anticorps étant une molécule soluble dans un milieu aqueux (sérum) , il préférera donc se fixer sur un support ayant une nature hydrophile .
Immunodétection en direct :
Dans, ce cas, il est nécessaire de coater directement la molécule à doser. Prenons le cas de la protéine prion comme exemple. Cette protéine étant fortement hydrophobe sous la forme infectieuse, il sera préférable d'utiliser un support ayant un caractère hydrophobe. En effet, Cette protéine étant repoussée par la solution aqueuse, elle va chercher à se positionner dans un environnement hydrophobe et sera donc fortement attirée par les parois d'un tel support.
Stockage et transfert :
Toujours pour la protéine prion, étant fortement hydrophobe sous la forme infectieuse, il est donc préférable de la stocker dans des conteneurs dont la paroi présente un caractère hydrophile. Ainsi, dans cet environnement, la protéine prion aura plus tendance à être repoussée loin des parois et n'aura pas tendance à aller s'y adhérer. Il y aura donc moins de perte de protéine d'intérêt.
Le matériel utilisé pour le transfert et la manipulation de cette protéine devra donc aussi présenter un caractère hydrophile afin d'éviter les pertes de matériel sur les parois . Pour un même antigène, il sera donc nécessaire d'utiliser différents types de conteneurs, ou supports, suivant l'application que l'on désire en faire.
L'invention propose donc de nouveaux types de supports permettant la détection et le dosage de molécules d'intérêt. Ces supports peuvent être également utilisés 0 pour le stockage d'échantillons (complexes ou simplifiés) ainsi que pour la manipulation des molécules d'intérêt (systèmes de prélèvement réduisant les pertes d'échantillons sur les parois). Ces supports seront différents dans le fait que la paroi a subit un traitement 5 au plasma électromagnétique et un dépôt de polymère qui modifie la nature de sa surface, suivant l'application que l'on désire en faire.
Tous les supports qui ont été utilisés dans les exemples o qui vont suivre sont des supports commerciaux, déjà optimisés par les fabricants, que 1 ' on a traité au plasma électromagnétique suivi d'un dépôt de polymère. Ce traitement a, dans pratiquement tous les cas, amélioré encore les performances de ces supports pour la réalisation 5 d'une immuno-détection. Il faut remarquer que l'invention ne s'applique pas uniquement à des supports déjà présents sur le marché, mais que d'autres types de supports peuvent être produits et traité suivant l'invention.
Q Ces supports sont destinés avantageusement à la réalisation d'essais de détection et/ou de dosage de moléculaire par les techniques de ligand-PCR ou d' immuno-détection tels que I1ELISA, l'i-PCR ou l'i-PCRq. - Etat de l ' art
Le traitement de surfaces de polymère par plasma est connu. On citera par exemple la publication "Surface engineering of biomaterials with plasma techniques", F. PONCIN - EPAILLARD and G. LEGEAY, J. Biomater. Sci . Polymer Edn, Vol. 14, n°10, p 1005-1028 (2003).
Par ailleurs, on connaît actuellement différentes techniques d1 immuno-détection qui utilisent comme support des plaques (multi-puits ou non) et sur la surface desquels des anticorps de capture, des antigènes et/ou des couples ligand/récepteur spécifiques ont été fixés par liaisons chimiques .
Durant l ' immuno-détection par ELISA, les différentes molécules d'intérêt sont reconnues et dosées avec un seuil de sensibilité qui est en général de l'ordre du nanomolaire. L1 immuno-Polymerase Chain Reaction » (i-PCR) possède un seuil de sensibilité de l'ordre du femtomolaire; de par le fait que la détection de l'antigène est réalisée suite à une amplification PCR d'un ADN reporter couplé à un anticorps spécifique de la molécule d'intérêt. Les immuno-détections par i-PCR quantitative (i-PCRq) ainsi que par ligand-PCR sont introduites dans le document de brevet WO0131056.
Avec ces seuils de sensibilité très bas, la miniaturisation micro- (et nano-) des technologies devient possible et permet des microdosages de protéines prions, et de façon plus générale de protéines. Cependant avec une telle sensibilité, il est normal que des phénomènes parasites liés à la "qualité et/ou à la nature (propriétés) " des surfaces des supports apparaissent. La miniaturisation des essais de détection et/ou de dosage, par l'utilisation d'échantillons de volumes et de concentrations toujours de plus en plus faibles, entraîne une exacerbation de l'importance de la surface du support. C'est aussi vrai dans le domaine de la manipulation d'échantillon, ainsi que celui du stockage, dans lesquels il est préférable que le support attire l'antigène ou le repousse, suivant les applications visées.
L'invention vise donc à la maîtrise de la fonctionnalité, de l'uniformité ainsi que de la reproductibilité des surfaces de supports, en particulier pour microdosages et pour le stockage de certaines molécules .
A l'heure actuelle, l'utilisation de polymères de synthèse est largement répandue dans la fabrication des différents consommables utilisés dans le domaine du diagnostic in vitro. L'importance de l'interaction des réactifs avec ces supports a notamment stimulé le développement de différentes mises au point permettant d'améliorer la fixation d'antigènes sur la surface de ceux-ci :'
« Plasma treatment of polymeric materials to enhance immobilization of analytes e » (Brevet n°WO9534814) . Cette invention fournit une méthode de traitement de surface d'un matériel polymérique avec un plasma de gaz (oxygène ionisé). Ce traitement permet d'augmenter l'immobilisation de l'antigène utilisé pour réaliser le diagnostic.
- « Method of improving the biocompatibility of solid surfaces » (United States Patent n°4973493) . Cette invention fournit une méthode de modification d'une surface solide en vue d'améliorer sa biocompatibilité. Cette méthode utilise un agent biocompatible capable d'activer des liaisons covalentes avec la surface du solide.
- « Immobilized biomolecules and method of making same » (United States Patent n°5034428 et 4829098) .
Cette invention fournit une méthode d'immobilisation de biomolécules sur un support. Dans celle-ci, la biomolécule elle-même est greffée sur un support polymère solide et hydrophile ayant été préalablement ionisé. Cette technique est applicable à l'immobilisation d'une grande variété de biomolécules telles que des enzymes, hormones, lectines, drogues, vitamines, anticorps, .. Ces produits peuvent être utilisés pour des applications thérapeutiques ou diagnostiques .
- « Radio frequency plasma deposited polymers that enhance cell growth » (brevet des Etats-Unis n°4919659) . Ce document divulgue une méthode pour augmenter la capacité de fixation de cellules en culture. La surface du matériel est soumise à une décharge de plasma de gaz qui provoque le dépôt d'un polymère sur le matériel exposé. Ce traitement augmente 1 ' adsorption, et donc l'attachement, des cellules en croissance. Les gaz préférés sont les oxydes d'acétone, de méthanol et d'êthylène.
Selon l'invention, plusieurs types de supports commerciaux, ayant les caractéristiques dimensionnelles souhaitables pour les analyses (boîtes, supports plans, systèmes multi-puits, billes, etc.), subissent une modification de surface. Ils peuvent être en polystyrène (PS) , polyester téréphtalate (PET) , polycarbonate (PC) ou encore en polypropylène (PP) . Ces matériaux sont hydrophobes, c'est-à-dire qu'ils sont difficilement mouillables, et par ailleurs ils ne sont pas collables (ou adhérisables) .
L'invention propose donc de fonctionnaliser spécifiquement ces supports, en utilisant une technologie propre, reproductible et facilement industrialisable, connue sous le nom de « Plasmas électromagnétiques » . Cette dernière est réalisée par un traitement par plasma de gaz de nature, pression, puissance et fréquence variables ; suivis dans certains cas et de préférence par un traitement physique déposant sur la surface du support des polymères de grade médical ou d'autres molécules organiques, poly vinylpyrrolidone et celluloses ...
Ces supports ont été testés en réalisant des immuno-dosages par ELISA et iPCRq. Les résultats sont appliquables à d'autres techniques ultra-sensibles comme celle du ligand-PCR, techniques décrites dans le document WO0131056 susmentionné. De manière surprenante une nette amélioration de la sensibilité a été constatée aux très faibles concentrations .
La présente invention propose donc, entre autres, de nouveaux types de supports (de type tubes, tips et plaques multi-puits) qui permettent la détection, le dosage, la manipulation et le stockage de molécules d'intérêts.
Pour les applications visant à la détection et/ou le dosage de molécules d'intérêts, ces supports selon l'invention sont « activés » en recouvrant leur surface d'anticorps, d'antigènes, dé ligands et/ou de récepteurs spécifiques fixés par liaisons physico-chimiques. Selon un aspect de l'invention, le support est "neutralisé" et par conséquent permet l'amélioration de la sensibilité du dosage (principalement aux faibles concentrations) mais aussi l'amélioration de la reproductibilité du dosage. Ces supports peuvent notamment être utilisés pour la détection et le dosage de protéines prions, comme décrit dans les exemples ci-dessous.
L'invention a été appliquée plus particulièrement à des supports multi-puits en polypropylène (PP) , polystyrène (PS) et polycarbonate (PC) , mais peut être appliqué à d'autres types de supports tels que les produits commerciaux, les consommables de laboratoire (tips, tubes, .) et les consommables médicaux (cathéter, .) et les organes artificiels.
Selon l'invention, on propose de traiter les matériaux biocompatibles et les supports par un plasma électromagnétique suivi par un dépôt de polymère.
L'invention sera mieux comprise à l'examen des exemples non limitatifs qui' suivent.
Obtention des supports
On utilise la technologie des «Plasmas électromagnétiques». Il s'agit de décharges électriques réalisées soit à 0 pression ambiante (dans ce cas elles sont appelées décharges couronnes, corona ou encore DBD) , soit sous vide partiel (environ 0,1 à 5 torr, soit 1 à 10 mPa) . Ces décharges électriques renferment des atomes de gaz (N2, 02, etc.) excités, mais d'énergie assez faible (quelques eV) . Ces espèces excitées vont bombarder la surface des supports et vont donc casser certaines des liaisons chimiques constituants cet objet (liaisons -C-C--, --C-0, --C-H, etc.), ce qui va donner naissance à des espèces dites « radicalaires » (--C0 ; --0°, etc.) généralement instables. Il a été estimé que la densité surfacique d'espèces réactives est de 10 à 100 radicaux par nanomètre carré. L'énergie du bombardement étant faible, les sites sont crées dans une tranche de matière (le support) d'épaisseur inférieure à 10 nanomètres .
Sans être tenus par une interprétation quelconque on peut envisager que les radicaux (instables) vont présenter plusieurs options de vie : 1) les radicaux se recombinent entre eux et l'effet est perdu,
2) les radicaux se recombinent avec des antioxydants présents dans la matière et l'effet est perdu,
3) les radicaux se recombinent avec des atomes d'oxygène et d'eau se trouvant soit dans la matière mais surtout lors de la remise à l'air et l'effet est positif : les radicaux se transforment en sites chimiques stables (tels que -C-OH ; --C=O, --C=O OH, etc.) . Ces groupes ont un caractère hydrophile et donne une possibilité d'adhérence avec quelque chose que l'on va apporter : une peinture, une colle, des polymères bio-compatibles. L'adhérence sera acquise spontanément, par l'établissement de liaisons de faible énergie appelée liaisons hydrogène. Si elles sont nombreuses, l'adhérence sera excellente. 4) les radicaux permettent d'amorcer une polymérisation, à condition de mettre en présence de molécules capables de polymériser, en milieu sans oxygène, et en général en chauffant plusieurs heures : des chaînes de polymère sont accrochées par des liaisons fortes, de type covalentes, sur le support. Ce système est plus . lourd à réaliser mais l'adhérence est excellente.
5) si on réalise le plasma en présence d'un gaz fluoré, notamment CF4 qui n'est ni toxique ni agressif, des atomes de fluor vont se fixer sur les radicaux libres. Des groupes -CF, --CF2, --CF3 se formeront, ceux-ci étant très hydrophobes et donc non adhésifs. Cette propriété permet notamment la fabrication de supports anti-adhérents, très utiles comme récipients de stockage ou de transfert d' échantillon.
Dans le cadre de l'invention, les conteneurs ou supports en plastique peuvent être choisis parmi la liste non limitative suivante :
o Polypropylène (PP) ; o polyester téréphtalate (PET) ; o Polycarbonate (PC) ; o Polystyrène (PS) .
Les supports utilisés sont des supports commerciaux ayant les caractéristiques dimensionnelles souhaitables pour les analyses (boîtes, supports plans, systèmes multi- puits, billes, etc.). Ils sont propres et ne comportent pas de polluants, pouvant provenir de la fabrication.
Dans le cadre de l'invention, le traitement par plasma des conteneurs ou supports en plastique peuvent être choisis " parmi la liste non limitative suivante : Types de plasma : o Dioxyde de Carbone (C02) ; o Tétrafluorure de carbone (CF4) ; o Azote (N2) ; o Oxygène (02) ; o Argon (Ar) .
Dans le cadre de l'invention, le traitement par dépôt de polymère sur les conteneurs ou supports en plastique peut être effcetué avec une solution de polymère de liste non limitative suivante :
Traitements chimiques par polymère : o Polyvinylpyrrolidone (ou PVP) K30 et K90 ; o polyvinyl alcool (ou PVA) 88 et 98% dans H20; o carboxymethyl cellulose (ou CMC) ; o hydroxypropylmethyl cellulose (ou HPMC) 0,2%; o Polyethylène glycol (ou PEG) E 4000 ; o Polyhydroxyethyl méthacrylate (ou PHEMA) .
Exemple
Obtention d'un support fonctionnalisé selon l'invention : le support PC-PVP K30.
On utilise une barrette en polycarbonate de type PCR, contenant 8 puits, commercialisée par la firme allemande RoboScreen (n° de référence 0501000102) .
Le traitement au plasma du support en polycarbonate est réalisé dans un réacteur d'une capacité de 20 litres travaillant en radiofréquence. Le réacteur est mis sous vide pour dégazer le support pendant 10 minutes, Ensuite de E2006/000030
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1 ' azote (N2) est introduit dans le réacteur à un débit de 10 cm3/min. Pendant 10 minutes, le support est .soumis à une pression de travail d'environ 3,4 10-1 mbar et une puissance radioélectrique de 100 W. Le support est ensuite ramené à pression atmosphérique, sous atmosphère neutre
(N2) . Une fois ramené à pression atmosphérique, le support est déposé (pendant environ 5 minutes et à température ambiante) dans une solution aqueuse diluée de polyvinylpyrrolidone de grade K30. Le support est ensuite séché complètement, sous flux d'air à environ 4O0C.
Une fois séché, le support est stocké sous atmosphère neutre (N2) , et à l'abri de la lumière dans des emballages étanches .
D'autres supports peuvent être obtenus de manière analogue, en modifiant éventuellement le type de réacteur utilisé (Radiofréquences ou micro ondes) , le type de plasma utilisé comme indiqué ci-dessus, et la nature du polymère utilisé comme indiqué ci-dessus.
Les supports suivants ont donc été réalisés pour les travaux :
Traitement au plasma seul : O PS (-N2, -C02 et -CF4) o PC (-N2, -CO2 et -CF4) o PP (-N2, -CO2, -CF4, Ar et 02)
Traitement au plasma + dépôt de polymère : o PP-N2 (- PVP, -PVA, -CMC, -HPMC, PEG et PHEMA) GD PC-N2 (- PVP, -PVA, -CMC, -HPMC, PEG et PHEMA) I) Analyse des supports produits :
Analyse physico-chimique
Les supports commerciaux utilisés sont constitués de : 95 à 100% de polymères (ou plastiques) tels que polycarbonate, polyester téréphtalate, polystyrène ou polypropylène,
0 à 5 % d'additifs (huile de vaseline, de paraffine ou de stéarate) . Ces additifs présentent le désavantage de ressortir du support au fil des jours et de former un film polluant recouvrant la surface plastique.
Test de mouillage Ce test est réalisé par le test de la goutte d'eau. Durant celui-ci, une goutte d'eau est déposée sur la surface du support et l'angle intérieur de celle-ci est mesuré afin d'estimer le caractère hydrophobe (ou hydrophile) du support .
Support non traité
Angle de contact de 90 à 95°, donc relativement hydrophobe.
Support traité au plasma Angle de contact de 20 à 30°, donc relativement hydrophile et généralement peu stable dans le temps
Cas particulier des dépôts fluorés :
Angle de contact de 110 à 120° , donc très hydrophobe et géjnéralement très stable dans le temps
Support traité au plasma puis dépôt de polymère
Angle de contact de 20 à 40°, donc relativement hydrophile et généralement très stable dans le temps (plusieurs mois) Application des supports pour 1 ' immunodétection
Immunodétection de la protéine prion recombinante :
Solutions utilisées et origines :
Tampon de coatage : NaHCCG 0,05M - Na2CO3 0;05M - pH 9,4. Tampon PBS : NaCl 0,14M - Na2HPO4.2H2O 8 mM - KH2PO4 1,5 mM
- KCl 2,7 mM pH 7,4.
Tampon de saturation : tampon PBS + BSA 3% - pH 7,4. Tampon de dilution A : tampon PBS + BSA 1% + Tween 20 0,1%
- pH 7,4. Tampon de dilution B : tampon PBS + BSA 1% - pH 7,4.
Tampon de lavage BSA : tampon PBS + BSA 1/5% - pH 7,4.
Tampon de lavage Tween : tampon PBS + Tween 20 0,1% - pH
7,4.
Anticorps monoclonaux de capture : SAF32 (Eurogentec) et 12F10 (Bio-Rad) .
Anticorps monoclonaux de détection 12F10 couplé à la peroxydase (Bio-rad) et 4F7 biotinylé (Roboscreen) .
Protéine prion recombinante (PrPrec) : origine Roboscreen et Prionics . Streptavidine couplée à la « Horse-radish Peroxidase »
(Strep-HRP) : origine Dako .
3,3' ,5,5' tétraméthyl benzedine (TMB) : origine
BD-Pharmingen.
Streptavidine couplée à un ADN reporter (Strep-DNA) : Oioigine Centre de Recherche sur les Protéines Prions (Ulg)
Mix PCR : H20 38% - primers 12% - SYBRGreen 50% E2006/000030
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Protocole « ELISA 1 » (couple d'anticorps : SAF32/12F10) .
Pour cet ELISA, on utilise une plaque contenant 96 puits de type ELISA commercialisée par la firme allemande Greiner (n° de catalogue 655081) . Le volume de travail est de 50 μl/puits.
Les étapes du protocole sont les suivantes : 1- Coatage, pendant une nuit à 4°C, de l'anticorps monoclonal de capture SAF32 dilué à une concentration de 1 μg/ml en tampon de coatage (50 μl/puits) .
2- Lavage avec 300 μl/puits de tampon PBS (4 lavages) .
3- Blocage, pendant 2 heures à température ambiante, des sites non saturés par l'anticorps de capture avec du tampon de saturation (300 μl/puits) .
4- Lavage avec 300 μl/puits de tampon PBS (4 lavages) .
5- Incubation, pendant 1 heure à température ambiante, de la protéine PrPrec bovine (Roboscreen) diluée à différentes concentrations en tampon de dilution A (50 μl/puits) .
6- Lavages (300 μl/puits) : 2 en tampon PBS suivis de 2 en tampon de lavage BSA.
7- Incubation, pendant 1 heure à température ambiante, de l'anticorps monoclonal de détection 12F10 couplé à la peroxydase dilué 1Ox en tampon de dilution A (50 μl/puits) .
8- Lavages (300 μl/puits) : 2 en tampon de lavage Tween suivis de 2 en tampon de lavage BSA.
9- Incubation, pendant 30 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière, du substrat de la peroxydase, le THP (50 μl/puits) .
10- Arrêt de la réaction enzymatique par ajout d'H2SO4 2N (25 μl/puits) .
11- Lecture de l ' absorbance de la solution à 450 nm sur un spectrophotomètre (Labsystems Multiskans MS) . Protocole « ELISA 2 » (couple d'anticorps : 12F10/4F7 biot)
Pour cet ELISA, on utilise une barrette contenant 8 puits de type ELISA commercialisée par la firme allemande Greiner (n° de catalogue 762061) . Le volume de travail est de 100 μl/puits.
Les étapes du protocole sont les suivantes :
1- Coatage, pendant une nuit à 4°C, de l'anticorps monoclonal de capture 12F10 dilué à une concentration de 10 μg/ml en tampon de coatage (100 /il/puits) .
2- Lavage avec 300 μl/puits de tampon PBS (5 lavages) .
3- Blocage, pendant 2 heures à température ambiante, des sites non saturés par l'anticorps de capture avec du tampon de saturation (300 μl/puits) . 4- Lavage avec 300 μl/puits de tampon PBS (5 lavages) .
5- Incubation, pendant 1 heure à température ambiante, de la protéine PrPrec bovine (Prionics) diluée à différentes concentrations en tampon de dilution B (100 μl/puits) .
6- Lavage avec 300 μl/puits de tampon PBS (5 lavages) . 7- Incubation, pendant 1 heure à température ambiante, de l'anticorps monoclonal de détection 4F7 biotinylé dilué à 1 μg/ml en tampon de dilution B (lOOμl/puits) .
8- Lavages (300 μl/puits) : 3 en tampon de lavage Tween suivis de 3 en tampon de lavage BSA. 9- Incubation, pendant 30 minutes à température ambiante, de la Strep-HRP diluée à 83 μg/ml en tampon de dilution B
(100 μl/puits) .
10- Lavage avec 300 μl/puits de tampon PBS (5 lavages) . 12- Incubation, pendant 30 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière, du substrat de la peroxydase, le TMB (lOOμl/puits) .
13- Arrêt de la réaction enzymatique par ajout d'H2SO4 2N (50 μl/puits) .
14- Lecture de l ' absorbance de la solution à 450 nm sur un spectrophotomètre (Labsystems Multiskans MS) .
Résultats de dosages ELISA réalisés sur de nouveaux supports préparés comme décrit ci-dessus.
I) Tests des supports PP traités par plasma seul (ELISA 1) La performance des tubes a été testée, en triplicat, en suivant le protocole ELISA 1 décrit ci-dessus.
Densité optique (la valeur du témoin sans antigène déjà déduite)
PrP (ng/m) PP témoin PP CF4 PP CO2 PP N2
1000 1,047 0,022 1,205 1,291
100 0,728 0,002 0,774 0,993
50 0,317 0,000 0,352 0,696
25 0,114 0,002 0,219 0,266
12,5 0,045 0,001 0,041 0,088
6,25 0,038 0,003 0,001 0,020
3,125 0,036 0, 000 0,004 0,023
Limite de détection (ng/ml)
26,92 47,86 21,38 R-®nge de détection
Figure imgf000021_0001
ng/ml ^ 30 à 500 Λ.50 à 1000 ^20 à 1000 Pouvoir de discrimination • ^ 0,52 Λ/ 0,95 0,89 Valeur moyenne du bruit de fond = 0,1
Les résultats sont également présentés sous forme de graphique à la fig. 1
Ces résultats indiquent que le traitement au plasma CF4 n'est pas adéquat pour le dosage de la molécule d'intérêt mais pourrait s'avérer un choix judicieux pour le stockage de molécules. Pour 1 ' immuno-détection, le traitement par plasma N2 donne les meilleurs résultats de cette série.
II) Tests des supports PP traités par plasma seul
(ELISA 2) .
La performance des tubes a été testée, en duplicat, et en suivant le protocole ELISA 2 décrit ci-dessus.
Densité optique (la valeur du témoin sans antigène déjà déduite)
PrP (ng/m) PP témoin PP Ar PP 02
1000 2,488 3 3
100 1,076 2,271 0,505
50 0,46 1,212 0,19
25 0,276 0,237 0,083
12,5 0,086 0,153 0,124
6,25 0,045 0,132 0,073
3,125 0, 052 0,037 0,033
Limite de détection (ng/ml)
22 , 91 15 , 85 67 , 61 Range de détection
D. O ^ 2,3 v2,8 ^,2,8 ng/ral ^20 à 1000 vlS à 1000 ^10 à 1000
Pouvoir de discrimination (ng/ml)
~ 0,42 ~ 0,35 ~ 0,33 Valeur moyenne du bruit de fond = 0,11
Les résultats sont également présentés sous forme de graphique à la fig. 2
Pour ce dosage ELISA, le support modifié par plasma 02 est de moins grande efficacité que celui modifié à l'Argon. Une amélioration de la limite de détection d'un facteur proche de 4 est observée pour le support traité à l'Argon par rapport à celui traité à 1 ' 02. De plus, le PP Ar possède un range de détection plus grand que le témoin non traité, entraînant un meilleur pouvoir de discrimination. Ce dernier semble donc mieux adapté à ce type d'application.
III) Tests des supports PP traités par plasma N2 et dépôt de polymère.
La performance des tubes a été testée, en suivant le protocole ELISA 2 décrit ci-dessus.
Densité optique (la valeur du témoin sans antigène déjà déduite)
PrP PP PVP PVA98 CMC HPMC (ng/m) témoin
4 0 , 021 0 , 257 0 , 19 0 , 116 0 , 173 20 0,087 1,66 1,138 1,119 1,176 100 0,824 3 2,747 2,826 3 1000 2,011 3 3 3 3
Limite de détection (ng/ml)
33,88 3,89 5,25 6,61 7,74 Range de détection
D.O ^.1,8 ^.2,8 ^2,8 —2,8 -v- 2,8 ng/ml *-35 à 1000^4 à 560-v5 à 560*^7 à 560 -v8 à 560 Pouvoir de discrimination (ng/ml)
~ 0,54 ~ 0,20 ~ 0,20 ~ 0,20 ~ 0,20
Les résultats sont également présentés sous forme de graphique à la fig. 3.
Tous ces dépôts de polymère, selon l'invention, améliorent la limite de détection d'un facteur de 4 au minimum et le pouvoir de discrimination d'un facteur 2,5 au minimum.
Résultats de dosages iPCRq réalisés sur de nouveaux supports préparés comme décrit ci-dessus.
Protocole « iPCRq » (couple d'anticorps : Saf32/4F7biot)
Pour l' iPCRq, on utilise une barrette de type iPCRq (Roboscreen) contenant 8 puits et le volume de travail est de 50 μl/puits.
Les étapes du protocole sont les suivantes : 1- Coatage, pendant une nuit à 4°C, de l'anticorps monoclonal de capture Saf32 dilué à une concentration de 10 μg/ml en tampon de coatage (50 μl/puits) . 2- Lavage avec 250 μl/puits de tampon PBS (5 lavages) .
3- Blocage, pendant 1 heures à 37°C, des sites non saturés par l'anticorps de capture avec du tampon de saturation
(250 /il/puits) . 4- Lavage avec 250 μl/puits de tampon PBS (5 lavages) .
5- Incubation, pendant 1 heure à température ambiante, de la protéine PrPrec humaine (Roboscreen) diluée à différentes concentrations en tampon de dilution B (50 μl/puits) . 6- Lavages (250 μl/puits) : 3 en tampon de lavage Tween suivis de 3 en tampon de lavage BSA.
7- Incubation, pendant 1 heure à température ambiante, de l'anticorps monoclonal de détection 4F7 biotinylé dilué à 1 μg/ml en tampon de dilution B (50μl/puits) . 8- Lavages (250 μl/puits) : 3 en tampon de lavage Tween suivis de 3 en tampon de lavage BSA.
9- Incubation, pendant 30 minutes à température ambiante, du complexe Strep-DNA dilué en tampon de dilution B (50 μl/puits) . 10- Lavages (250 μl/puits) : 10 en tampon PBS suivis de 10 en H20.
12- Ajout du mix PCR (50μl/puits) .
13- Réalisation de la PCR et lecture de la fluorescence en temps réel sur un thermocycleur Applied Biosystems Gène Amp 5700 :
. 10 minutes à 950C (activation de la Taq polymerase)
. 10 à 70 cycles de :
15 secondes à 95°C (dénaturâtion)
1 minute à 600C (hybridation oligonucléotides et éφongation)
I) Tests des supports PC traités par plasma N2 et dépôt de polymère . La performance des tubes a été testée, en suivant le protocole iPCRq décrit ci-dessus.
Cycle threshold (Ct) PrP PC PVP K3-0 PEG E 4000 PHEMA PVA (ng/m) témoin
Sans Ag 38,83 40,00 40,00 40,00 40,00
10 38,31 40,00 38,06 40,00 40,00
100 34,79 39,28 36,93 38,43 38,92 1000 34,85 38,85 33,98 40,00 36,81
Limite de détection (ng/ml)
<10 10>..<100 < 10 100 >.<1000 10>.<100
Les résultats sont également présentés sous forme de graphique à la fig. 4.
Tous ces dépôts de polymères améliorent le seuil de détection et permettent d'obtenir un bruit de fond très faible pour le témoin sans antigène (Ct=40) . Un dépôt de polymère, le PEG E 4000, présente une meilleure gamme de sensibilité de détection et s'avère donc être le meilleur candidat de cette série, pour la réalisation de tests de détection de la protéine prion.
De manière générale 1 ' invention propose donc
- un conteneur de transfert, de stockage ou de détection pouï* entités (en particulier biologiques) solubilisées ou en suspension, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une matière (plastique, verre, composé minéral ou organique) , de préférence en polypropylène ou polycarbonate , traitée en surface par un plasma suivi d'un dépôt de polymère. - le dépôt de polymère est obtenu par trempage ou mise en contact avec une solution, de préférence aqueuse, d'un polymère organique, par exemple un polyéthylèneglycol, de préférence à température ambiante
- le dépôt de polymère est réalisé directement après le traitement au plasma, p.e. 1 à 10 minutes, de préférence endéans 5 minutes
- pareil conteneur peut constituer un support pour le dosage d'entités biologiques, permettant de minimiser les pertes de ces molécules, par adsorption et/ou par altérations de leurs propriétés natives.
- pareil conteneur peut être aussi un support pour le transfert et la manipulation de molécules biologiques ou autres, réduisant les pertes de matériel sur les parois de celui-ci.
- il peut s'agir de tubes isolés, en strip ou en plaques multi-puits ou de consommables de forme différentes (tips, canules, cupules) .
- le plasma utilisé est un plasma de gaz (de préférence N2, Ar ou CFA), de pression, de puissance et de fréquence variables,
- le traitement par plasma est suivi d'un ou plusieurs dépôjts de molécules organiques ou de polymères de grade médical,

Claims

- Revendications :
1) Procédé de traitement d'un conteneur de transfert, de stockage ou de détection pour entités microbiologiques solubilisées, dans lequel le conteneur est traité en surface par un plasma électromagnétique suivi d'une opération de dépôt de polymère, au moins sur les parois destinées à être en contact avec la solution d'entités microbiologiques, par trempage dans une solution dudit polymère .
2) Procédé selon la revendication 1 pour lequel la solution de polymère est une solution aqueuse à 0,05-10% en poids, de préférence 0,1 à 5%.
3) Procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel l'opération de trempage ou mise en contact avec la solution de polymère est réalisée endéans les 10 minutes, de préférence endéans 1 à 5 minutes, du traitement par plasma électromagnétique .
4) Procédé selon n'importe laquelle des revendications précédentes caractérisé en ce que le plasma est un plasma de gaz N2 , Ar ou CF4.
5) Procédé selon n'importe laquelle des revendications précédentes dans lequel le polymère est du poly vinylpyrrolidone, du poly (alcool vinylique) , des dérivés de cellulose (CMC ou HPMC) , du polyethylène glycol (PEG) ou du polyhydroxyethyl méthacrylate (PHEMA) . 6) Procédé selon n'importe laquelle des revendications précédentes caractérisée en ce que le polymère est du polyéthylène glycol PEG E 4000.
7) Conteneur obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 6.
8) Conteneur selon la revendications précédente caractérisé en ce qu'il s'agit d'un tube isolé, des tubes en strip ou en plaques multi-puits ou un consommables de formes variées (tips, canules, cupules) .
9) Conteneur selon la revendication précédente caractérisé en ce qu'il est en polypropylène, polycarbonate ou polystyrène .
10) Utilisation du conteneur ou support selon n'importe laquelle des revendications 1 à 9 pour la détection et le dosage d'entités biologiques et/ou antigéniques par ELISA.
11) Utilisation d'un support selon la revendication précédente pour la détection et le dosage de la protéine prion.
12) Utilisation d'un support selon une des revendications 1 à 2 et 6 à 8 pour la détection et le dosage d'entités biologiques et/ou antigéniques par immuno-PCR, immuno-PCR quantitative ou ligand-PCR.
13) !,Utilisation selon la revendication précédente, utilisant un ADN "reporter", p.e. selon le document WO01311056. 14) Utilisation selon la revendication précédente pour la détection et le dosage de la protéine prion.
15) Procédé de détection et/ou de dosage d'une entité microbiologique caractérisé en ce qu'on utilise une technique ELISA, i-PCR ou ligand-PCR et qu'au moins un conteneur de solutions à analyser est un conteneur selon une des revendications précédentes.
16) Procédé selon la revendication précédente dans lequel le polymère déposé ou greffé est le polyéthylène glycol, par exemple le PEG E 4000.
17) Procédé selon la revendication 15 ou 16 dans lequel l'entité microbiologiuque est une protéine prion.
18) Kit pour le dosage d'entités microbiologiques comprenant au moins un conteneur ou support selon l'une des revendications revendication 7 à 9.
19) Kit selon la revendication précédente comprenant également au moins un récipient pour stocker ou transférer une solution desdits entités microbiologiques, ou conteneur selon les revendications 7 à 9, et dont les parois en contact avec ladite solution ont été traitées par un plasma au CF4.
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