WO2006095769A1 - 低温性微生物由来エンドヌクレアーゼ - Google Patents

低温性微生物由来エンドヌクレアーゼ Download PDF

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WO2006095769A1
WO2006095769A1 PCT/JP2006/304471 JP2006304471W WO2006095769A1 WO 2006095769 A1 WO2006095769 A1 WO 2006095769A1 JP 2006304471 W JP2006304471 W JP 2006304471W WO 2006095769 A1 WO2006095769 A1 WO 2006095769A1
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polypeptide
sequence
nucleic acid
activity
amino acid
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PCT/JP2006/304471
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Naoyuki Awazu
Toshihiro Shodai
Hikaru Takakura
Masanari Kitagawa
Hiroyuki Mukai
Ikunoshin Kato
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Takara Bio Inc.
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Publication date
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide having an endonuclease activity which is useful as a genetic engineering reagent or an industrial enzyme, having a high activity at low to normal temperatures, and a nucleic acid encoding the polypeptide,
  • the present invention relates to a method for producing a peptide, a method for decomposing nucleic acid using the polypeptide, and a method for reducing the viscosity of a protein extract.
  • Endonuclease is an enzyme useful as a genetic engineering reagent. It removes genomic DNA prior to RT-PCR, a reaction that degrades vertical DNA after RNA synthesis reaction using T7 or SP6 RNA polymerase, It is widely used for DNA library synthesis, footprint method, removal of nucleic acid from protein solution, reduction of viscosity of protein extract or pretreatment of 2D electrophoresis sample.
  • Polymeric nuclease is based on its mode of action: (a) endonuclease that hydrolyzes the phosphodiester bond inside the sugar phosphate chain (main chain) of the polymer nucleic acid; The 5 'and Z or 3' end forces of the strand are also classified as exonucleases that sequentially cleave.
  • endonucleases are based on their substrates: (a) deoxyribonuclease (DNase) that degrades DNA, (b) ribonuclease (RNase) that degrades RNA, (c) an enzyme that degrades DNA and RNA (this is simply called (Sometimes called nucleases).
  • DNase deoxyribonuclease
  • RNase ribonuclease
  • nucleases an enzyme that degrades DNA and RNA (this is simply called (Sometimes called nucleases).
  • deoxyribonucleases include (i) oligonucleotides that act on double-stranded and single-stranded DNA and have 3, 1, OH ends, 5, 1 P ends.
  • Deoxyribonuclease I (DNasel), which degrades into (II), (ii) Deoxyribonuclease II which degrades into oligonucleotides with 3, 1 P-terminal, 5, and 1 OH-terminal by acting on double-stranded and single-stranded DNA (DNaseII), (iii) Selectively cleave the phosphodiester bond on the 5th side of cytosine in a single-stranded DNA molecule, and have 3'—OH and 5′—P ends. Examples include endodeoxyribonuclease IV that degrades into tides, (iv) restriction endonucleases (restriction enzymes) that recognize and cleave specific base sequences, and the like.
  • deoxyribonuclease I is classified into EC 3.1.21.1 (see, for example, Non-Patent Document 1), and in addition to the above activities, in both double-stranded DNA strands, at different sites. It has the activity of hydrolyzing phosphodiester bonds, nicking single strands and gradually reducing the molecular weight of macromolecular nucleic acids, and the reaction rate varies depending on the substrate.
  • Double-stranded DNA> A-stranded DNA> It is known that oligo nucleotides are slowed down in order, and that there is no specificity to the base sequence!
  • Deoxyribonuclease I is a spleen 'kidney', liver, heart, serum, etc. of Streptococcus bacteria, Escherichia coli, T4 And its presence in ⁇ phage, etc.
  • Deoxyribonuclease I is used to prevent pseudopositive in a nucleic acid amplification reaction.
  • deoxyribonuclease I prior to PCR
  • the deoxyribonuclease is stable and active even at high temperatures and must be boiled for 30 minutes to inactivate it.
  • the shrimp Pandalus borealis-derived DNase described in Patent Document 1 does not show activity at 12 ° C, but shows activity at 22-37 ° C.
  • the enzyme cannot degrade single-stranded DNA. In order to completely inactivate the enzyme, it is necessary to hold at 94 ° C for 5 minutes.
  • Patent Document 2 describes a DNase and a protease derived from microorganisms in which seawater and marine biological forces are also isolated.
  • the DNase exhibits activity at a temperature of 20 ° C or higher, which is slightly different in temperature sensitivity depending on the microorganism from which it is derived, and is inactivated at 50-60 ° C or higher. Only However, with respect to the DNase, the ability to degrade double-stranded DNA is described. There is no description as to whether or not single-stranded DNA is degraded. In addition, there is no description of any physical properties other than temperature sensitivity, amino acid sequences, or nucleotide sequences of nucleic acids encoding the DNase.
  • the endonuclease (c) which has the activity of degrading DNA and RNA, is an enzyme useful as a reagent for genetic engineering, and further removes nucleic acids from protein solutions and extracts proteins. It is used to reduce the viscosity of liquid or to pre-process 2D electrophoresis samples.
  • Serratia marcescens nuclease see, for example, Patent Document 3 and Non-Patent Document 3
  • silkworm nuclease SW silkworm nuclease SW
  • brown bean nuclease potato
  • Azotobac tor agilis nuclease for example, see Non-Patent Document 4
  • the reaction mechanism is to specifically cleave the phosphodiester bond in the molecule of double-stranded and single-stranded DNA and synthetic polynucleotides to produce di- and mononucleotides.
  • the endonuclease having the above activity can be used by adding to the cell disruption supernatant for the purpose of reducing the viscosity of the protein extract.
  • the protein When the target protein is extracted by cell disruption, the protein may be denatured by heat or mechanical force generated during the disruption process, leading to a decrease in activity. In order to prevent this, it is common to use a buffer cooled with ice during cell disruption or while cooling in ice. In addition, it is necessary to cool the extract in order to suppress the action of proteolytic enzymes in the extract as well as the target protein after heat treatment.
  • Patent Document 1 Pamphlet of International Publication No. 99Z07887
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. 01Z18230
  • Patent Document 3 U.S. Pat.No. 5,173,418
  • Non-patent literature 1 Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (http: //www.chem.qmul.ac.ukZiubmbZ enzyme /)
  • Non-Patent Document 2 Furer B. et al., Nature, No. 346, No. 6282, p. 324 (1990)
  • Non-Patent Document 3 George N. Eaves et al., J. Bacteriol., No. 85, No. 273- 278 pages (19 63 years)
  • Non-Patent Document 4 Audrey Stevens et al., J. Biol. Chem., 235, 3016-3022, 3023-3027 (1960)
  • the object of the present invention is to remove genomic DNA, which is useful as a genetic engineering reagent, and also as an industrial enzyme, a reaction for degrading cage DNA after RNA synthesis reaction, DNA library synthesis, footprint method, Polypeptides having endonuclease activity that are useful in any case, such as removal of nucleic acids from protein solutions, reduction in viscosity of protein extracts, pretreatment of two-dimensional electrophoresis samples and pretreatment during virus purification It is to provide a nucleic acid encoding the peptide.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a polypeptide having the endonuclease activity, a method for degrading a nucleic acid using the polypeptide having the endonuclease activity, and a method for reducing the viscosity of a protein extract. is there.
  • the first invention of the present invention is a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (e) and having an endonuclease activity:
  • the second invention of the present invention is characterized in that it has at least the following physicochemical properties (a) and (b):
  • Substrate specificity works on linear double-stranded DNA, circular double-stranded DNA, single-stranded DNA, RNA;
  • a third invention of the present invention is a nucleic acid selected from the group consisting of the following (a) to (h): a nucleic acid encoding a polypeptide characterized by having an endonuclease activity :
  • nucleic acid encoding an amino acid sequence having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or a part thereof in the sequence listing;
  • nucleic acid encoding an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10 of the Sequence Listing or a part thereof;
  • nucleic acid having one or more bases substituted, deleted, inserted or added in the nucleic acid having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or a part thereof in the sequence listing
  • nucleic acid capable of hybridizing under stringent conditions with the nucleic acid according to any one of the above or a complementary strand thereof;
  • the present invention relates to (a) to (g) V, a nucleic acid having a nucleotide sequence having at least 60% sequence homology with the nucleotide sequence of any of the nucleic acids described above.
  • the fourth invention of the present invention relates to a recombinant DNA comprising the nucleic acid of the third invention of the present invention.
  • a fifth invention of the present invention relates to a transformant comprising the nucleic acid of the third invention of the present invention.
  • the sixth invention of the present invention includes the step of culturing the transformant of the fifth invention of the present invention and the step of recovering the polypeptide having endonuclease activity from the culture. And a method for producing a polypeptide having endonuclease activity.
  • a seventh invention of the present invention relates to a method for decomposing a nucleic acid comprising a step of decomposing a nucleic acid using the polypeptide of the first invention of the present invention.
  • the eighth invention of the present invention relates to a method for reducing the viscosity of a protein extract, which comprises the step of treating a protein extract with the polypeptide of the first invention of the present invention.
  • the invention's effect comprises the step of treating a protein extract with the polypeptide of the first invention of the present invention.
  • a genetic engineering reagent and further as an industrial enzyme removal of genomic DNA, reaction for degrading cage DNA after RNA synthesis reaction, DNA library synthesis, footprint method, nucleic acid in protein solution
  • Polypeptides with endonuclease activity that are useful even in cases such as removal, reduction of viscosity of protein extracts, pretreatment of 2D electrophoresis samples and pretreatment during virus purification, and coding of the polypeptides
  • a method for producing a polypeptide having the endonuclease activity are provided.
  • the polypeptide having endonuclease activity of the present invention is suitable for purification by, for example, pretreatment of a nucleic acid amplification reaction, vertical nucleic acid treatment after RNA synthesis, pretreatment of a protein extract, or removal of nucleic acid in a protein solution. Can be preferably used.
  • Fig. 1 shows the results of a test for measuring the activity of psychrophilic microorganism-derived DNase.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of a thermal stability test of DNase derived from a psychrophilic microorganism.
  • Fig. 3 is a graph showing the results of an optimum temperature test of DNase derived from a psychrophilic microorganism.
  • FIG. 4 is a view showing the results of a substrate specificity test for a psychrophilic microorganism-derived DNase.
  • FIG. 5 shows the results of an effect test of EDTA on the reaction of psychrophilic microorganism-derived DNase.
  • Fig. 6 is a graph showing the optimum pH test results of DNase derived from psychrophilic microorganisms.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of pH stability test of DNase derived from psychrophilic microorganisms.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of an activity measurement test for the endonuclease of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of SDS polyacrylamide electrophoresis test in which the molecular weight of the endonuclease of the present invention was examined.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of a comparative test of the endonuclease of the present invention and Benzonase at low temperatures.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of substrate specificity test for endonuclease of the present invention.
  • FIG. 12 is a diagram showing the optimum pH test results of endonuclease of the present invention.
  • Fig. 13-1 shows the results of examining the effects of various additives of the endonuclease of the present invention. It is a figure which shows a fruit.
  • Fig. 13-2 shows the results of examining the influence of various additives of the endonuclease of the present invention.
  • FIG. 13-3 is a diagram showing the results of examining the influence of various additives of the endonuclease of the present invention.
  • FIG. 13-4 is a diagram showing the results of examining the influence of various additives of the endonuclease of the present invention.
  • FIG. 14 shows the results of electrophoresis showing the effect of reducing viscosity when protein is extracted from E. coli at low temperature using the endonuclease and DNasel of the present invention.
  • FIG. 15 shows the results of electrophoresis showing the effect of reducing the viscosity when protein is extracted from Escherichia coli at a low temperature using the endonuclease and DNasel of the present invention.
  • FIG. 16 is a view showing the results of a comparison test of the endonuclease of the present invention and DNasel in the E. coli genomic DNA degradation reaction.
  • FIG. 17 is a view showing the results of a comparative test of E. coli genomic DNA degradation reaction of endonuclease of the present invention and DNasel.
  • a polypeptide having endonuclease activity refers to a polypeptide that catalyzes a reaction of hydrolyzing a phosphodiester bond inside a sugar phosphate chain (main chain) of a high-molecular nucleic acid.
  • DNase refers to a polypeptide that catalyzes a reaction that acts on double-stranded and single-stranded DNA to degrade it into an oligonucleotide having a 3'-OH terminal and a 5 'P terminal.
  • low temperature refers to a temperature below 20 ° C
  • normal temperature refers to a temperature in the range of 20 to 50 ° C
  • high temperature refers to a temperature higher than 50 ° C. Point to.
  • polypeptide having endonuclease activity of the present invention is also SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 may be a functional equivalent having substantially the same activity.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing one or more, for example, one or more, more specifically, 1 to: a polypeptide having an amino acid sequence in which LO amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added.
  • amino acid sequence of the polypeptide disclosed by the present invention is at least 60%, preferably 70%, more preferably 80%, particularly preferably 90%.
  • Polypeptides having homology and endonuclease activity are within the scope of the present invention.
  • a polypeptide when produced by genetic engineering, it is often expressed as a fusion polypeptide.
  • an N-terminal peptide chain derived from another polypeptide is added to the N-terminal, or an appropriate peptide chain is added to the N-terminal or C-terminal of the target polypeptide.
  • the purification of the target polypeptide can be facilitated by adding and expressing it and using a carrier having affinity for this peptide chain.
  • the nucleic acid encoding the polypeptide having the endonuclease activity of the present invention includes a nucleic acid comprising all or part of the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 3 in the sequence listing,
  • a nucleic acid containing all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 4 in the sequence listing can be mentioned.
  • one or more, for example, 1 or more, more specifically 1 to: L0 amino acids are substituted, deleted, inserted or added, etc.
  • nucleic acid encoding a polypeptide having an amino acid sequence and having an activity as an endonuclease.
  • a base sequence that encodes a polypeptide that can be hybridized with these sequences or their complementary strands under stringent conditions and has activity as the following endonuclease is also within the scope of the present invention. is there.
  • “no ibridation under stringent conditions” is not particularly limited to the present invention, but 0.5% SDS, 0.1% urine serum albumin, 0.1% poly 65 in Bulpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400, 0.01% denatured salmon sperm DNA in 6 X SSC (1 X SSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium quenate, ⁇ 7.0), 65 Even after washing at 65 ° C for 30 minutes in 2X SSC containing 0.5% SDS after incubation at ° C for 12-20 hours, it hybridizes with the nucleic acid of the present invention or its complementary strand. Say that.
  • the above homology can be determined by, for example, the computer program DNASIS-Mac (manufactured by Takara Bio Inc.), computer anomaly FASTA [version 3.0; Pearson WR and Lipman DJ, Pro. Natl. Acad. Sci. 85, No. 8, No. 244, pp. 4-2448 (1988)], computer algorithm BLAST [version 2.0; Altsc hul SF et al., Nucleic Acids Res., No. 25, No. 17, No. 3389] To 3402 (1997)] and the like.
  • a nucleic acid having a different base sequence through degeneracy from a nucleic acid encoding a polypeptide having the endonuclease activity of the present invention belongs to the scope of the present invention.
  • nucleic acid containing a base sequence encoding an amino acid sequence described in the present specification will be explained. It is known that there are 1 to 6 codons (a combination of three bases) that specify amino acids on a gene for each amino acid type. Therefore, many nucleic acids encoding an amino acid sequence can exist depending on the amino acid sequence.
  • nucleic acid of the present invention may be any of DNA, RNA, DNA and RNA chimeric nucleotides as long as it encodes the polypeptide having the endonuclease activity of the present invention, and further contains a modified nucleotide. You may do it.
  • the form can be double stranded, single stranded! /, Or misaligned! /.
  • the polypeptide having endonuclease activity of the present invention has a characteristic that it retains endonuclease activity at a low temperature, as compared with Benzonase Nuclease (manufactured by Novagen), which is a nuclease of Serratia marcescens. It is a polypeptide.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing of the present invention or is an amino acid sequence encoded by a nucleic acid containing all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing,
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing one or more, for example, one or more, more specifically, 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, inserted or added, etc.
  • the physical properties of the polypeptide having activity as an endonuclease are as follows (a) to (1).
  • Substrate specificity shows activity against linear double-stranded DNA, circular double-stranded DNA, -stranded DNA and RNA.
  • pH stability Retains activity in the range of pH 6 to 10 for treatment at 37 ° C for 30 minutes.
  • the polypeptide having endonuclease activity of the present invention is not particularly limited as long as it has the above-mentioned physicochemical properties. For example, it can be obtained from Shewanella sp. AclO strain.
  • the polypeptide having endonuclease activity of the present invention is suitable for removing nucleic acids from protein solutions and reducing the viscosity of protein extracts. In particular, it is suitable for use in the above applications at low temperatures.
  • the reactivity at a low temperature can be calculated as follows.
  • the amount of enzyme cut is determined for the polypeptide having endonuclease activity to be examined.
  • salmon testis-derived DNA manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the substrate solution 40 / ⁇ 8 ⁇ 1, lOOmM tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5), 5 mM magnesium chloride
  • the amount of enzyme that increases the absorbance at 260 nm by 0.001 per minute at 37 ° C is 1 U.
  • the above-mentioned substrate solution 500 1 was mixed with a 2.3 U polypeptide-containing solution (10 mM Tris monohydrochloride buffer (pH 7.5), 10 mM magnesium chloride) determined by the above method. 100 1 Use the reaction solution as the reaction solution.
  • the activity is calculated by reacting the reaction solution at various temperatures of 0, 5, 10, 15, and 20 ° C. for 10 minutes and then measuring the increase in absorbance at 260 nm.
  • the reactivity at low temperature can be evaluated by calculating and comparing the relative activity (%) at each temperature with the endonuclease activity at 20 ° C as 100.
  • the polypeptide having endonuclease activity of the present invention has a relative activity of about 30 to 70% at 0 to 10 ° C, whereas Benzonase Nuclease (manufactured by Novagen) has a relative activity of 0 to 10 ° C. Relative activity at ⁇ ⁇ 20%. Therefore, the polypeptide having an endonuclease activity of the present invention retains a high endonuclease activity at a low temperature, particularly at 0 to 10 ° C., as compared with a commercially available Benzonase Nuclease.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing or the amino acid sequence encoded by a nucleic acid containing all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing,
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing one or more, for example, 1 or more, more specifically 1 to: LO amino acid sequence in which LO amino acids are substituted, deleted, inserted or added, etc.
  • the polypeptide having an endonuclease activity is characterized by being inactivated at a lower temperature than D Nasel derived from sushi spleen. For example, the ability of spleen-derived DNase I to retain its activity even at 90 ° C As described in Example 1, the polypeptide having endonuclease activity of the present invention is completely lost after treatment at 70 ° C for 30 minutes. Live.
  • polypeptide having endonuclease activity are as follows (a) to (h).
  • Substrate specificity shows activity for linear double-stranded DNA, circular double-stranded DNA, and double-stranded DNA.
  • pH stability Retains activity in the pH range of 4 to 10 after treatment at 37 ° C for 30 minutes.
  • the thermal stability can be calculated based on the method described in Example 1-1 (5).
  • the above-mentioned polypeptide having endonuclease activity shows high activity up to 40 ° C, but when it exceeds that, the activity starts to decrease, and when it exceeds 50 ° C, the activity decreases rapidly, and 60 ° C Almost disappears at 70 ° C.
  • the polypeptide having the endonuclease activity of the present invention is very excellent as a reagent for genetic engineering, such as removal of SPCR contamination or RT-PCR genome removal. .
  • the polypeptide having endonuclease activity of the present invention is introduced from a culture of a microorganism producing the polypeptide or a gene encoding the polypeptide. It is possible to mass-produce from the transformant.
  • the psychrophilic microorganism Shewanella sp. AclO strain is aerobically cultured at 15 ° C.
  • Known methods can be used for the method of crushing the grown cells and extracting and purifying DNA, and the method of cleaving the obtained DNA with a restriction enzyme. Details of this method are described in the Molecular Cloning Laboratory Manual, 3rd edition (Sam Brook and Russel, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3 edition, 2001, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the polypeptide having an endonuclease activity of the present invention is a nucleic acid encoding a polypeptide having an endonuclease activity, such as a nucleic acid having a base sequence described in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing, or the like.
  • transformants transformed with a partially integrated recombinant plasmid are used under appropriate culture conditions, for example, E. coli, LB medium (lOgZl tryptone, 5gZl yeast extract, 5gZl NaCl, pH 7.2) It can be expressed in the cells by culturing in).
  • the polypeptide can be obtained by disrupting the cultured cells and purifying the polypeptide.
  • Examples of a method for producing the above-mentioned enzymes and polypeptides by genetic engineering operations include, for example, functionally using an appropriate promoter that functions in the host organism so that the DNA encoding the polypeptide having the endonuclease activity of the present invention can be used.
  • the recombinant DNA may further contain a regulatory factor such as an operator or a terminator.
  • the polypeptide of the present invention further includes an expression vector-derived sequence, such as an expression or translation enhancing sequence (for example, Perfect DB sequence), a tag sequence for purifying the expressed protein (for example, His tag sequence). Etc.), a trigger factor (TF) tag sequence, which is a type of E. coli chaperone, or sequences for removing additional sequences on the N-terminal side of expressed proteins (eg, Factor Xa sequence, HRV 3C sequence, Thrombin sequence, etc.) Amino acid composition Those having an added column are also included in the polypeptide having endonuclease activity of the present invention. Although it does not specifically limit as said polypeptide, For example, the polypeptide which has an endonuclease activity which has an amino acid sequence of sequence number 8 of a sequence table is mentioned.
  • an expression vector-derived sequence such as an expression or translation enhancing sequence (for example, Perfect DB sequence), a tag sequence for purifying the expressed protein (for example, His tag sequence). Etc.
  • any commercially available vector or expression system can be used without any particular limitation.
  • a PET system manufactured by Novagen
  • a vector having a promoter that can function at a low temperature can be suitably used, and examples thereof include a pCold (cold shock expression) vector described in International Publication No. 99Z27117 pamphlet.
  • the cold shock expression system induces expression at low temperatures, the synthesis of the host E. coli-derived protein is suppressed, and only the target protein can be obtained with high efficiency. Compared with the conventional E. coli expression system, the expression level and solubility are reduced. We can expect improvement of degree. Furthermore, the soluble factor tag function and chaperone function of the trigger factor (TF) enable genes that have been difficult to express so far to be expressed as soluble protein with higher probability. That is, in the production method of the present invention, any deviation can be suitably used as long as it is a vector capable of expressing a polypeptide having endonuclease activity.
  • a vector capable of expressing a polypeptide that is in the form of an inclusion body at the time of polypeptide expression but can restore the function by a subsequent refolding operation is also included.
  • a vector for producing a polypeptide having endonuclease activity of the present invention for example, pCold08-Endl (FERM BP-10313) described in Example 1 and pColdTF-Endl described in Example 2 are preferably used. it can. Although not particularly limited, for example, a vector containing the base sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing can be preferably used.
  • the production of the polypeptide having the endonuclease activity of the present invention may be carried out according to a general means for producing a recombinant enzyme. That is, the polypeptide of the present invention is produced. After culturing the obtained recombinant microorganism, the cells can be separated by culture fluid force by a conventional separation means such as centrifugation or filtration. This cell is disrupted to prepare a cell-free extract, which is used as a crude enzyme solution for the following purification operations. When the enzyme is secreted outside the cells, the culture supernatant from which the cells have been removed can be used as a crude enzyme solution.
  • This crude enzyme solution can be used as it is, but if necessary, it can be concentrated by means of ultrafiltration, precipitation, etc. and powdered using Z or an appropriate method for purification. It can also be used.
  • by means of general means for enzyme purification for example, a combination of appropriate cation exchange anion resin, anion exchange resin, hydroxyapatite chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, etc. It can also be purified.
  • Example 2 after culturing a recombinant microorganism capable of producing a polypeptide having the endonuclease activity of the present invention, the cells can be separated from the culture solution by centrifugation.
  • the cell culture supernatant from which the cells were sonicated and removed by centrifugation was purified using Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) and Pheny 1 Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences).
  • Q Sepharose Fast Flow Amersham Biosciences
  • Pheny 1 Sepharose Fast Flow Amersham Biosciences
  • nucleic acid comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing of the present invention thus obtained, or the whole or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 of the sequence listing.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing one or more, for example, one or more, more specifically 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, inserted or added, etc.
  • the polypeptide having the amino acid sequence ability and functioning as an endonuclease uses long and short linear double-stranded DNA, circular double-stranded DNA, single-stranded DNA or RNA as a substrate.
  • the endonuclease of the present invention can degrade any of ⁇ -DNA, pUC119, M13mpl8 single strand DNA, 16S and 23S rRNA.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 of the sequence listing of the present invention or the amino acid sequence encoded by a nucleic acid comprising all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 of the sequence listing
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing one or more, for example, 1 or A polypeptide having an amino acid sequence in which a plurality of amino acids, more specifically, 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and has endonuclease activity, has a long chain and a short linear chain.
  • Single-stranded DNA, circular double-stranded DNA, and single-stranded DNA are used as substrates.
  • polypeptide having endonuclease activity of the present invention degrades all of ⁇ -DNA, pUC119, and M13 mpl8 single strand DNA, and is specific to the substrate shape (single strand, double strand) and base sequence. It is thought that there is no sex.
  • Nucleic acid degradation method using polypeptide having endonuclease activity of the present invention, method for reducing viscosity of protein extract, composition and kit for the method of the present invention of (1) above A polypeptide having endonuclease activity can be suitably used in a method for degrading nucleic acids.
  • a polypeptide having endonuclease activity can be suitably used in a method for degrading nucleic acids.
  • the amount of the remaining E. coli-derived genome is compared with that of the conventional DNasel. Chido can degrade genomic DNA without affecting the target protein.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing or the amino acid sequence encoded by the nucleic acid containing all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing, or the sequence listing
  • the amino acid sequence of No. 10 consists of an amino acid sequence in which one or more, for example, one or more, more specifically, 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and has an endonuclease activity.
  • Polypeptides having an amino acid can be suitably used in a method for degrading nucleic acids that hinders protein purification.
  • the polypeptide having the endonuclease activity of the present invention of (1) can be preferably used in a protein extraction method.
  • a protein extraction reagent kit such as TALON xTractor Buffer Kit (manufactured by Clontech)
  • the polypeptide is added to the extract to reduce the viscosity.
  • the addition of an order of magnitude lower than that of conventional DNasel can lower the viscosity without affecting the target protein.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing or In the amino acid sequence encoded by the nucleic acid including all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing, or in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 in the sequence listing, one or more, for example, one or more Specifically, a polypeptide having an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and having an endonuclease activity, has a viscosity of the extract that hinders protein extraction. It can be used suitably for the reduction method.
  • a composition and a kit for removing nucleic acid in a protein solution of the present invention and reducing the viscosity of a protein extract, etc. are obtained by using the polypeptide having the endonuclease activity of the present invention described in (1) above. It is characterized by containing. Further, a reaction buffer may be included.
  • kits examples include a kit in which the polypeptide of the present invention is contained in a protein extraction reagent kit.
  • the protein extraction reagent kit may contain a protease inhibitor, a lytic enzyme, and a surfactant in addition to the polypeptide having the endonuclease activity of the present invention described in (1) above and the reaction buffer.
  • examples of the protease inhibitor, lytic enzyme, and surfactant include PMSF, Lysozyme, Triton X-100 (registered trademark), and the like.
  • polypeptide having the endonuclease activity of the present invention of (1) above can be used for PCR contamination removal or RT-PCR genome removal.
  • those containing the polypeptide having the endonuclease activity of the present invention of the above (1) can be preferably used. Further, a reaction buffer may be included.
  • kit which made the PCR kit contain the polypeptide which has the endonuclease activity of this invention is mentioned.
  • synthetic primers 1 and 2 described in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing were synthesized with a DNA synthesizer and purified by a conventional method.
  • the synthetic primer 1 has a nucleotide sequence corresponding to amino acid numbers 1 to 7 of the low-temperature microorganism-derived DNase amino acid sequence (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing), and the restriction enzyme EcoRI recognition sequence is represented by the base number 4 Synthetic DNA with ⁇ 9.
  • Synthetic primer 2 has a base sequence corresponding to amino acid numbers 247 to 254 in the DNase amino acid sequence (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) derived from a psychrophilic microorganism, and the recognition sequence of the restriction enzyme BamHI is base numbers 4 to 4 Synthetic DNA possessed by 9.
  • PCR was performed using the synthetic primers. PCR reaction conditions are shown below.
  • pCold08NC2 was constructed using plasmid pMM047 as a starting material based on the description in WO99Z27117 pamphlet.
  • This pCold08NC2 vector was cleaved with the same restriction enzyme EcoRI and restriction enzyme BamHI used when preparing the above EcoRI-BamHI digested DNA fragment, and the end was dephosphorylated to prepare the above EcoRI-BamHI digested DNA.
  • the fragments were mixed and ligated using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • Escherichia coli JM109 was transformed with the ligation reaction solution 101, and the transformant was grown on an LB medium (containing 100 ⁇ g / ml ampicillin) containing 1.5% (wZv) concentration of agar. It was.
  • This recombinant plasmid was designated as pCold08-Endl.
  • the plasmid was named and displayed as pCold08—Endl. From February 16, 2005 (original deposit date), the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center [Tsukuba, Ibaraki, Japan] It is deposited internationally as FERM BP-10313 in East 1st Street, 1st, 1st Central 6th (zip code 305-8566).
  • This pCold08-Endl is a plasmid containing a base sequence (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) encoding the amino acid sequence of amino acid numbers 1-254 of the DNase amino acid sequence derived from the psychrophilic microorganism (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing).
  • the protein expressed from the plasmid has a Perfect DB sequence, a His tag sequence, a Factor Xa sequence and a linker at the N-terminus of the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, and the nucleotide sequence of the nucleic acid encoding the polypeptide is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • pCold08—Endl was used to transform E. coli BL21. Transformation was performed by the calcium chloride method. Transformants were obtained by screening with LB medium (containing 100 g / ml ampicillin) containing 1.5% (wZv) agar.
  • the obtained bacterial cells were suspended in PBS and sonicated to prepare a cell extract, and then separated into a soluble fraction and an insoluble fraction by centrifugation at 15,000 X g. Each fraction of 0.05 OD (OD600) was subjected to SDS-PAGE (5-20% gel) and analyzed by CBB staining and Western blotting using anti-His-Tag antibody.
  • DNase derived from psychrophilic microorganisms which is a His-Tag fusion protein
  • the molecular weight of the fusion protein was around 31 kDa on SDS-PAGE.
  • the molecular weight of the DNase of the present invention from which the tag sequence was removed was around 29 kDa.
  • DNase activity was measured for the soluble fraction of E. coli introduced with pCold08-Endl prepared in (3) above.
  • the ultrasonically disrupted soluble fraction of the control E. coli was also run at the same time. The activity was measured as follows.
  • Eichi Hindlll digest (Takara Bio Inc.) was used as a substrate for activity measurement.
  • lane M is a Hindlll marker
  • lane 1 is the soluble fraction of E. coli into which only the pCold08 vector has been introduced
  • lane 2 is the soluble fraction of E. coli into which pCold08-Endl has been introduced
  • lane 3 is the substrate for the reaction system.
  • the soluble fraction of E. coli into which only pCold08 vector was introduced Lane 4 is the soluble fraction of E. coli into which pCold08-Endl was introduced without adding the substrate to the reaction system.
  • Figure 1 shows that ⁇ -Hindm digest is soluble in Escherichia coli containing only the pCold08 vector.
  • the substrate was not degraded
  • the low molecular smear band was contaminated by E. coli.
  • lane M is a Hindlll marker
  • lanes 1 to 8 are those using DNase derived from a low-temperature microorganism of the present invention
  • lanes 9 to 16 are those using DNasel derived from spleen spleen.
  • lanes 1 and 9 are 4 ° C
  • lane 2 is 10 ° C
  • lane 3 is 20 ° C
  • lanes 4 and 10 are 30 ° C
  • lanes 5 and 11 are 40 ° C
  • lanes 6 and 12 are 50 ° C
  • lanes 7 and 13 are 60.
  • lanes 8 and 14 are 70.
  • Lane 15 is 80.
  • C and Lane 16 are left at 90 ° C for 30 minutes.
  • Fig. 2 shows that DNase from psychrophilic microorganisms shows high activity from 4 ° C (lane 1) to 40 ° C (lane 5). 50 ° C (lane 6) force is also inactivated, 60 ° DNasel derived from force spleen that was almost inactivated at C (lane 7) and completely inactivated at 70 ° C (lane 8) retained activity even at 90 ° C (lane 16).
  • Panel (A) is a psychrophilic microorganisms from DNase of the present invention 5 X 10 _4 OD min
  • panels) is a psychrophilic microorganisms from DNase of the present invention 5 X 10 _5 OD min
  • Panel (C) is ⁇ DNasel derived from spleen spleen is used in lmU
  • panel (D) shows that 0.1 lmU of spleen DNasel is used.
  • Lane M Haichi Hindlll marker Lane 1 at 10 ° C, Lane 2 at 20 ° C, Lane 3 at 30 ° C, Lane 4 at 40 ° C, Lane 5 at 50 ° C, Lane 6 Is 60 ° C and lane 7 is 70 ° C, left for 30 minutes.
  • DNase derived from psychrophilic microorganisms showed high activity from low temperature to normal temperature (10-40 ° C), and the optimum temperature was around 30-40 ° C.
  • DNasel derived from sushi spleen was less active at low V ⁇ temperatures and was more active at higher temperatures.
  • lane M is a Hindlll marker
  • lane 1 is enzyme-free
  • lane 2 is 5 x 10 _6 OD
  • lane 3 is 5 x 10 _5 OD
  • lane 4 is 5 x 10 _4 OD
  • lane 5 Is the case of using 5 ⁇ 10 _3 OD of the psychrophilic microorganism-derived DNase of the present invention.
  • the endonuclease of the present invention degrades all of ⁇ -DNA, pUC119, and M13mpl8 single strand DNA, and has no specificity for substrate shape (single stranded or double stranded) or base sequence. Conceivable.
  • DNase activity was measured in the presence of various concentrations (0, 0.2, 1, 5 mM) of EDTA in the reaction solution.
  • As a control DNasel derived from sushi spleen was used.
  • Hindlll digest was used as a substrate.
  • ⁇ Hindlll digest 1 ⁇ g, soluble fraction of E.
  • panel (A) shows the case using the psychrophilic microorganism-derived DNase of the present invention, and panel) uses the spleen-derived DNasel.
  • Lane M is a Hindlll marker
  • Lane 1 is EDTA OmM
  • Lane 2 is EDTA 0.2 mM
  • Lane 3 is EDTA ImM
  • Lane 4 is EDTA 5 mM. is there.
  • Figure 5 shows that DNase from psychrophilic microorganisms is active in the presence of 5 mM EDTA.
  • Hindlll digest was used as a substrate. Buffers were examined using pH4, 5: sodium acetate buffer, ⁇ 7, 7, 8: sodium phosphate buffer, pH7.5: Tris-HCl buffer, pH9, 10: sodium borate buffer.
  • ⁇ -Hindlll digest L g, prepared above (3), pCold08- Endl soluble fraction 5 X of the introduced E. coli 10_ 4 or 5 X 10 _5 OD minute (OD600), 10 X reaction buffer (400 mM the Buffer solution, lOOmM sodium chloride, 60 mM magnesium chloride, 10 mM calcium chloride) 5 1, nuclease free water was added to this, and the total amount was 50 1 was used as the reaction solution. After reaction at 37 ° C for 30 minutes at various pH values of 4 to 10, 101 of the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and the cleavage products were analyzed. The result is shown in FIG.
  • Fig. 6 shows the case of using 5 x 10 _5 OD for panel (A) and 5 x 10 _4 OD for panel (B).
  • Lane M fly-Hindlll marker Lane 1 is pH 4, Lane 2 is pH 5, Lane 3 is pH 6, Lane 4 is pH 7, Lane 5 is pH 7.5, Lane 6 is pH 8, Lane 7 is pH 9, lane 8 is pHIO.
  • the optimum pH of the cryogenic microbial DNase was 6 to 10.
  • Lane M is a Hindlll marker
  • Lane 1 is pH 4
  • Lane 2 is pH 5
  • Lane 3 is pH 6
  • Lane 4 is pH 7
  • Lane 5 is pH 7.5
  • Lane 6 is pH 8
  • Lane 7 is pH 9
  • Lane 8 is pHIO.
  • Example 2 Examination of expression of endonuclease from psychrophilic microorganisms using cold shock expression system
  • Synthetic primer 3 described in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing was newly synthesized by a DNA synthesizer and purified by a conventional method.
  • Synthetic primer 3 has a base sequence corresponding to amino acid numbers 1 to 7 in the amino acid sequence of DNase derived from psychrophilic microorganisms (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing), and further recognizes the recognition sequence of restriction enzyme Ndel as a base number.
  • PCR was performed using the synthetic primer. PCR reaction conditions are shown below.
  • the pColdTF vector (manufactured by Takara Bio Inc.) was cleaved with the same restriction enzyme Ndel and restriction enzyme BamHI used when the Ndel-BamHI digested DNA fragment was prepared, and the end was dephosphorylated.
  • Ndel and restriction enzyme BamHI used when the Ndel-BamHI digested DNA fragment was prepared, and the end was dephosphorylated.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with Ligation reaction solution 101, and the transformant was grown on LB medium (containing 100 ⁇ g Zml of ampicillin) containing 1.5% (w / v) agar.
  • LB medium containing 100 ⁇ g Zml of ampicillin
  • This recombinant plasmid was designated as pColdTF-Endl.
  • This pColdTF-Endl is a plasmid containing a base sequence (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) encoding the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 254 of the amino acid sequence of DNase derived from a thermophilic microorganism (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing).
  • the protein expressed by the plasmid force has a Perfect DB sequence, His tag sequence, TF tag sequence, HRV 3C sequence, Thrombin sequence, Factor Xa sequence and linker at the N-terminus of the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, and the nucleotide sequence of the nucleic acid encoding the polypeptide is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • pColdTF—Endl was used to transform E. coli BL21. Transformation was performed by the calcium chloride method. Transformants were obtained by screening using LB medium (containing 100 gZml ampicillin) containing 1.5% (wZv) agar.
  • E. coli BL21 transformed with the pColdTF vector alone was also performed at the same time.
  • E. coli BL21 transformed with the pColdTF vector alone was also performed at the same time.
  • LB liquid medium composition : 1% butatotryptone, 0.5% yeast extract, l% NaCl, 100 gZml ampicillin
  • IPTG IPTG at a final concentration of ImM was added to the culture and further cultured at 15 ° C for 24 hours to induce expression.
  • the cells were collected.
  • the obtained cells were suspended in PBS and sonicated to prepare a cell extract, and then separated into a soluble fraction and an insoluble fraction by centrifugation of 15, OOO X g.
  • the endonuclease activity of the soluble fraction of E. coli into which pColdTF-Endl prepared in (3) above was introduced was measured. As a control, it was similarly prepared from E. coli into which only the pColdTF vector was introduced. The activity was measured as follows.
  • Eichi Hindlll digest (Takara Bio Inc.) was used as a substrate for activity measurement.
  • ⁇ Hindlll digest: L g, soluble fraction of E. coli introduced with the above pColdTF—Endl 0.00625 OD (OD600), 10 X reaction buffer (400 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5), lOOmM sodium chloride, 60mM magnesium chloride, 10mM calcium chloride)
  • lane 1 is the absence of soluble fraction
  • lane 2 is the soluble fraction of E. coli into which only the pColdTF vector has been introduced
  • lane 3 is the soluble fraction of E. coli into which pColdTF-Endl has been introduced.
  • the soluble fraction of Escherichia coli into which only non-additive koji and pColdTF vector were introduced did not degrade the substrate ⁇ -Hindlll digest, whereas pC oldTF —
  • the soluble fraction of Escherichia coli into which Endl was introduced degraded the substrate, confirming the activity of the endonuclease from the psychrophilic microorganism of the present invention.
  • Ammonium sulfate was added to the elution fraction containing the endonuclease activity to 2 M, and then 330 ml of supernatant was obtained by centrifugation (18, OOOg, 20 minutes). The resulting supernatant was mixed with 300 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 2 M ammonium sulfate, and 30 ml ( ⁇ 16 mm column) of Phenyl Sepharose Fast Flow (Amersham) (Manufactured by Bioscience). Subsequently, washing with 225 ml of the same buffer was performed to remove unwanted proteins other than the intended one.
  • concentration gradient elution was performed from 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 2 M ammonium sulfate to 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 0 M ammonium sulfate ( 10ml / fr, total 600ml). Endonuclease activity was measured for each fraction, and 90 ml of fr.
  • dialysis was performed twice against 5 L of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), and concentration was performed using Vivaspin (manufactured by VIVASCIENCE) to obtain 5.5 ml of a protein sample.
  • Fig. 9 ⁇ KOO! /
  • Lane Mi molecular weight marker 97, 66, 45, 31, 21, 14 KDa
  • lane 1 shows activity fr. 28-36 fraction dialyzed and concentrated protein sample
  • a major protein band was confirmed around a molecular weight of 25 KDa.
  • Ten residues of N-terminal amino acid sequence analysis were performed on the protein band around 25 KDa.
  • the amino acid sequence of the active protein was measured for its average mass by MALDI-TOF MS measurement method, and the resulting force was also determined.
  • the amino acid sequence of the active protein is shown in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing, and the nucleotide sequence of the nucleic acid encoding the polypeptide is shown in SEQ ID NO: 11 of the sequence listing.
  • This active protein was used for the following activity confirmation.
  • Polypeptide having endonuclease activity prepared in Example 2 (5) above! The endonuclease activity at low temperatures was examined.
  • Benzonas e (registered trademark) Nuclease manufactured by Novagen was used, and for measuring the activity, salmon testis-derived DNA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a substrate.
  • Substrate solution 40 ⁇ g / mU lOOmM Tris monohydrochloride buffer (pH 7.5), 5 mM magnesium chloride) 500 ⁇ 1, and a polypeptide-containing solution having the endonuclease activity prepared in Example 2 (5) above ( 2.
  • the square (country) is the polypeptide having the endonuclease activity prepared in Example 2 (5) above, and the triangle ( ⁇ ) is Benzonase.
  • the polypeptide having the endonuclease activity of the present invention has a relative activity of 30 to 10 ° C.
  • Benzonase Nuclease significantly decreased the relative activity at 0 to 10 ° C to about 0 to 20%, while it was about ⁇ 70%. Therefore, the polypeptide having an endonuclease activity of the present invention has a high endonuclease activity at a low temperature, particularly at 0 to 10 ° C., compared with a commercially available Benzonase Nuclease.
  • Polypeptide having endonuclease activity prepared in Example 2 (5) above! The activity when using various substrates was measured. In addition to ⁇ -Hindlll digest as substrates, DNA (Takara Bio), pUC119 (Takara Bio), M13 mpl8 Single Strand DNA (Takara Bio), 16S and 23S rRNA (Roche) were examined. Using.
  • lanes 1 to 5 fly Hindlll digest, lanes 6 to 10 ⁇ DNA, lane 11 force 15 UC pUC119, lane 16 force 20 ⁇ M13 mpl8 Single
  • Strand DNA and lanes 21-25 used 16S and 23S rRNA, respectively.
  • Lanes 1, 6, 11, 16, and 21 have no enzyme added
  • lanes 2, 7, 12, 17, and 22 have 0.001U minutes
  • lanes 5, 10, 15, 20, and 25 are cases where 1 U of the psychrophilic microorganism-derived endonuclease of the present invention was used.
  • the endonuclease of the present invention comprises linear double-stranded DNA (DNA, 48.5kbp), circular double-stranded DNA (pUC119, 3.2kbp), ⁇ : ⁇ DNA (M13 mpl8
  • RNA Single strand DNA, 7.2 kbp; and RNA (16S and 23S rRNA) were confirmed to be degraded.
  • Hindlll digest was used as a substrate. Buffers were examined using pH4, 5: sodium acetate buffer, ⁇ 6, 7: sodium phosphate buffer, pH7.5, 8: Tris-HCl buffer, pH9, 10: sodium borate buffer.
  • ⁇ -Hindlll digest L g, soluble fraction of E. coli introduced with pColdTF-Endl prepared in Example 2 (3) above 7 X 10 _4 OD (OD600), 10 X reaction buffer (400 mM above buffer) , LOOmM sodium chloride, 1M magnesium chloride, 10mM chloride chloride) 51, and nuclease free water was added to this to make the total volume 50 ⁇ l. After reaction at 37 ° C for 30 minutes at various pHs of ⁇ 4-10, 101 of the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and the cleavage products were analyzed.
  • Lane M Fly Hindlll marker Lane 1 is pH 4
  • Lane 2 is pH 5
  • Lane 3 is pH 6
  • Lane 4 is pH 7
  • Lane 5 is pH 7.5
  • Lane 6 is pH 8
  • Lane 7 is up to ⁇ 9
  • lane 8 is ⁇ .
  • the substrate was cleaved in lanes 3 to 8.
  • the optimum pH of the polypeptide having endonuclease activity of the present invention was 6 to 10.
  • salmon testis-derived DNA manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Substrate solution 40 g / ml, lOOmM Tris monohydrochloride buffer ( PH 7. 5), lOOmM magnesium chloride (excluding when investigating the influence of magnesium ion) 500 1 and 100 1 containing 0.25U polypeptide having endonuclease activity prepared in Example 2 (5) above This was used as a reaction solution.
  • the increase in absorbance at 260 nm was measured at 37 ° C, and the effects of various additives were investigated.
  • Magnesium chloride is added to the reaction solution and the final concentration force s 0, 0.8, 1. ⁇ 4.2, 2, 5, 10, 20, 40, 80, 100, 1 20, 140, 160 mM.
  • the effect of magnesium ion concentration was examined. The results are shown in Figure 13-1.
  • the optimal magnesium ion concentration of the polypeptide having endonuclease activity of the present invention was 60 to 120 mM.
  • Fig. 13-2 the activity when the final concentration of sodium chloride, potassium salt and calcium chloride is 0 mM is shown as 100.
  • the square (country) is salty sodium
  • the circle ( ⁇ ) is salty potassium
  • the triangle ( ⁇ ) is salty calcium.
  • Fig. 13-3 the activity when the final concentration of dithiothreitol and 2-mercaptoethanol is Om M is shown as 100.
  • the square (country) is dithiothreitol and the triangle ( ⁇ ) is 2-mercaptoethanol.
  • the dithiothreitol concentration was high up to 167 mM, and the 2-mercaptoethanol concentration was high up to 333 mM.
  • Example 2 (5) When the polypeptide having endonuclease activity prepared in Example 2 (5) is extracted using a protein extraction reagent kit, TALON xTractor Buffer Kit (Clontech), it is added instead of DNasel. We examined the reduction of viscosity. This was performed according to the protocol of TALON xTractor Buffer Kit. Escherichia coli BL21 wet cells expressed by inserting the yeast AIP2 gene (Gen Bank Acc. No .: U35667) into the pColdTF vector, 6.4 mg, TALON xTractor Buffer 128 1, Lysozyme (50 X) 1.281, In addition, add 3 amounts of each (0. 256U, 2.56U, 25.6U) of DNasel or the polypeptide having the endonuclease activity of the present invention for 30 minutes at 30 ° C or on ice. Reacted.
  • Fig. 15 lanes 1 to 7 were reacted at 30 ° C, lanes 8 to 14 were reacted on ice, and lanes where no band was confirmed in the electrophoretic image were not suitable for pipetting due to viscosity.
  • Lane M fly—Hindlll marker lanes 1 and 8 without enzyme, lanes 2 and 9 are DNasel 0.256U, lanes 3 and 10 are DNasel 2.56U, lanes 4 and 11 Is DNasel 25.6 U, lanes 5 and 12 are polypeptides having endonuclease activity of the present invention 0.256 U, lanes 6 and 13 are polypeptides having endonuclease activity of the present invention 2.56 U, lanes 7 and 14 are This is a case where 25.6 U of the polypeptide having endonuclease activity of the invention is used.
  • Figure 14 shows that when treated on ice, DNasel remained viscous enough to be difficult to pipet even when using 2.56 U, and was unable to be applied properly (lane 10), whereas the endonuclease of the present invention.
  • the active polypeptide a decrease in viscosity due to degradation of genomic DNA was confirmed at 2.56 U (lane 13).
  • Lane M is molecular weight marker 97, 66, 45, 31, 21, 14 KDa
  • lanes 1 and 8 are enzyme-free
  • lanes 2 and 9 are DNas el 0.256 U
  • lane 3 10 is DNasel 2.56U
  • lanes 4 and 11 are DNasel 25.6 U
  • lanes 5 and 12 are polypeptides having endonuclease activity of the present invention 0.256 U
  • lanes 6 and 13 have endonuclease activity of the present invention
  • lanes 7 and 14 are obtained when polypeptide 25.6U having endonuclease activity of the present invention was used.
  • the polypeptide having endonuclease activity of the present invention reduces the viscosity without affecting the target protein that can be observed as a main band by treatment on ice. Confirmed that it can.
  • the polypeptide having endonuclease activity prepared in Example 2 (5) or D Nasel (manufactured by Takara Bio Inc.) was added to the E. coli sonication supernatant and the amount of the remaining E. coli-derived genome was compared.
  • E. coli BL21 cells in which the yeast AIP2 gene was inserted into the pColdTF vector and expressed were added with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) and 10 mM magnesium chloride (5 ml buffer per lg wet cell).
  • the disrupted supernatant was diluted 50 times with the same buffer.
  • DNasel or a polypeptide having the endonuclease activity of the present invention was added in three amounts (0.1 U, 1 U, 10 U), and reacted at 30 ° C. or on ice.
  • the reaction solution 101 after 30 minutes and 2 hours was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and the cleavage products were analyzed.
  • lanes 7 and 14 are obtained using the polypeptide 10U having the endonuclease activity of the present invention.
  • the polypeptide having the endonuclease activity of the present invention was capable of degrading DNA without affecting the target protein by low-temperature reaction.
  • SEQ ID NO: l A sequence of designed oligonucleotide P and R primer for amplifying a gene of encoding DNase.nucleotide 4 to 9 is EcoRI restriction site.
  • SEQ ID NO: 2 A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying a gene of encoding DNase.nucleotide 4 to 9 is BamHI restriction site.
  • SEQ ID NO: 5 A sequence of artificial protein comprising Perfect DB sequence, His Tag sequence, Factor Xa sequence and linker, and DNase.
  • SEQ ID NO: 6 A sequence of a gene encoding an artificial protein comprising Perfect DB sequence, His Tag sequence, Factor Xa sequence and linker, and DNase.
  • SEQ ID NO: 7 A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying a gene of encoding DNase.
  • nucleotide 4 to 9 is Ndel restriction site.
  • SEQ ID NO: 8 A sequence of artificial protein comprising Perfect DB sequence, His Tag sequence, Trigger Factor sequence, HRV 3C sequence, Thrombin sequence, Factor Xa sequence and linker, and endonuclease.
  • SEQ ID NO: 9 A sequence of a gene encoding an artificial protein comprising Perf ct DB sequence, His Tag sequence, Trigger Factor sequence, HRV 3C sequence, T hrombin sequence, Factor Xa sequence and linker, and endonuclease.

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Abstract

　低温において高い活性を有し、タンパク質溶液中の核酸除去やタンパク質抽出液の粘性の低減に優れている、低温性微生物Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｓｐ．　Ａｃ１０株由来のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする核酸。

Description

明 細 書
低温性微生物由来エンドヌクレアーゼ
技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子工学用試薬あるいは工業用酵素として有用な、低温〜常温にお Vヽて高 、活性を有するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドならびに該ポリ ペプチドをコードする核酸、該ポリペプチドの製造方法、さらに該ポリペプチドを用い た核酸の分解方法およびタンパク質抽出液の粘性の低減方法に関する。
背景技術
[0002] エンドヌクレアーゼは遺伝子工学用試薬として有用な酵素であり、 RT— PCRを行う 前のゲノム DNAの除去、 T7あるいは SP6 RNAポリメラーゼを用いた RNA合成反 応後に铸型 DNAを分解する反応、 DNAライブラリ合成、フットプリント法、タンパク質 溶液中の核酸の除去、タンパク質抽出液の粘性の低減あるいは 2次元電気泳動サン プルの前処理などに幅広く利用されて 、る。
高分子核酸分解酵素 (ヌクレアーゼ）は、その作用様式に基づき、（a)高分子核酸 の糖リン酸鎖（主鎖）の内部のリン酸ジエステル結合を加水分解するエンドヌクレア一 ゼ、（b)主鎖の 5'および Zまたは 3'末端力も順次切断を行うェキソヌクレアーゼ、に 分類される。
さらに、エンドヌクレアーゼはその基質に基づき、（a) DNAを分解するデォキシリボ ヌクレアーゼ（DNase)、 (b) RN Aを分解するリボヌクレアーゼ（RNase)、 (c) DNA および RNAを分解する酵素（これを単にヌクレアーゼと ヽうこともある）、に分類するこ とがでさる。
[0003] 上記エンドヌクレアーゼのうち（a)デォキシリボヌクレアーゼとしては、（i)二本鎖およ び一本鎖 DNAに作用して 3，一OH末端、 5，一 P末端を有するオリゴヌクレオチドに 分解するデォキシリボヌクレアーゼ I (DNasel)、 (ii)二本鎖および一本鎖 DNAに作 用して 3，一 P末端、 5，一 OH末端を有するオリゴヌクレオチドに分解するデォキシリ ボヌクレアーゼ II (DNaseII)、（iii)一本鎖 DNA分子内のシトシンの 5，側のホスホジ エステル結合を選択的に切断し、 3'— OH末端、 5'—P末端を有するオリゴヌクレオ チドに分解するエンドデォキシリボヌクレアーゼ IV、 (iv)特定の塩基配列を認識し切 断する制限エンドヌクレアーゼ (制限酵素）、などが例示される。
[0004] 例えばデォキシリボヌクレアーゼ Iは、 EC 3. 1. 21. 1に分類され (例えば、非特 許文献 1参照）、上記活性の他、二本鎖 DNA両鎖において、それぞれ別の部位でホ スホジエステル結合を加水分解し、一本鎖切断 (nicking)をおこし、次第に高分子 核酸を低分子化する活性を有すること、基質によって反応速度が異なり、二本鎖 DN A>—本鎖 DNA>ォリゴヌクレオチドの順に遅くなること、また塩基配列に対する特 異性がな!、か極めて低 、ことが知られて 、る。
[0005] デォキシリボヌクレアーゼ Iは、ヒト、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ラット、マウス、ゥサギ、ニヮト リ、魚類などの脾 '腎'肝 '心臓 ·血清など、 Streptococcus属細菌、大腸菌、 T4ファ ージ、 λファージ、などにその存在が確認されている。
[0006] デォキシリボヌクレアーゼ Iは、核酸増幅反応における偽陽性 (pseudopositive)を 防止するために利用されて 、る。
PCR反応系に铸型 DNAおよび DNAポリメラーゼを添加する前にデォキシリボヌク レアーゼ Iを添加し、コンタミして 、る核酸やプライマーと非特異的結合をして 、る核 酸などを分解するために DNaselが使用されている（例えば、非特許文献 2参照)。
PCRを行う前にデォキシリボヌクレアーゼ Iを失活させる必要がある力 当該デォキ シリボヌクレアーゼは高温でも安定して活性を有し、失活させるためには 30分間煮沸 しなければならない。
[0007] この問題を解決するため、低温〜常温において活性を示す力 中高温において容 易に失活する酵素を用いる方法が開発されて！ヽる。
例えば、特許文献 1記載の小ェビ Pandalus borealis由来 DNaseは、 12°Cでは 活性を示さないが、 22〜37°Cにおいて活性を示すことが記載されている。しかしな がら、該酵素は一本鎖 DNAを分解することはできない。また、該酵素を完全に失活 させるためには 94°Cにて 5分間保持する必要がある。
また、特許文献 2には、海水中および海洋生物力も単離された微生物由来 DNase およびプロテアーゼが記載されている。該 DNaseは由来となる微生物によって温度 感受性が多少異なる力 20°C以上で活性を示し、 50〜60°C以上で失活する。しか しながら、該 DNaseに関して、二本鎖 DNAを分解することは記載されている力 一 本鎖 DNAを分解するかどうかに関する記載はない。また、温度感受性以外の理ィ匕 学的性質やアミノ酸配列、該 DNaseをコードする核酸の塩基配列につ 、ては何ら記 載されていない。
[0008] また、エンドヌクレアーゼのうち（c)の DNAおよび RNAを分解する活性を有するェ ンドヌクレアーゼは、遺伝子工学用試薬として有用な酵素であり、さらにタンパク質溶 液中の核酸の除去、タンパク質抽出液の粘性の低減あるいは 2次元電気泳動サンプ ルの前処理などに使われて 、る。
例えば、 Serratia marcescensのヌクレアーゼ（例えば特許文献 3、非特許文献 3 参照）、カイコのヌクレアーゼ SW、マングマメのヌクレアーゼ、ポテトおよび Azotobac tor agilisのヌクレアーゼ (例えば、非特許文献 4参照）などが知られている。反応機 構は、 2本鎖および 1本鎖 DNA、合成ポリヌクレオチドの分子内のリン酸ジエステル 結合を特異的に切断して^ージ一およびトリヌクレオチドを生成するものである。
[0009] 上記活性を有するエンドヌクレアーゼのうち、一本鎖、二本鎖、その他の形状に関 係なぐすべての種類の DNAおよび RNA基質に作用するものは、タンパク質溶液 中の核酸の除去、タンパク質抽出液の粘性の低減あるいは 2次元電気泳動サンプル の前処理に使われている（例えば、特許文献 3参照)。例えば、ノバジェン社製の Ben zonase (登録商標） Nucleaseがそのような目的で使用されている。
[0010] 上記活性を有するエンドヌクレアーゼは、タンパク質抽出液の粘性を低減させる目 的で、細胞破砕上清に添加して使用できる。細胞破砕によって目的タンパク質を抽 出する際、破砕処理中に生ずる熱や機械力によってタンパク質が変性し、活性の低 下を招くおそれがある。それを防ぐため、細胞破砕の間、氷で冷却した緩衝液を用い たり、氷中で冷やしながら行うのが一般的である。また、破砕処理後も目的タンパク質 が熱に弱いときはもちろん、抽出液中のタンパク質分解酵素の働きを抑えるためにも 抽出液を冷却することが必要である。
さらに、微生物などの急速に増殖する細胞力 得た抽出液には大量の核酸物質が 含まれている力 その後のサンプル処理を容易にするためにも、抽出液の段階で粘 性を低減することが重要になってくる。 そのため、冷却された細胞抽出液の段階で粘性を低減することが必要となる。また 、 目的タンパク質が熱に弱いときは目的タンパク質に影響を与えないためにも、低温 〜常温において上記活性を示すエンドヌクレアーゼを開発することが必要である。 低温でも DNAおよび RNAを分解する活性を保持するエンドヌクレアーゼについて の知見はない。
[0011] 特許文献 1：国際公開第 99Z07887号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 01Z18230号パンフレット
特許文献 3 :米国特許第 5173418号明細書
非特干文献 1： Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (http： / / www. chem. qmul. a c. ukZiubmbZ enzyme/)
非特許文献 2 :Furrer B.ら、 Nature、第 346卷、第 6282号、第 324頁（1990年） 非特許文献 3 : George N. Eavesら、 J. Bacteriol.、第 85卷、第 273〜278頁（19 63年）
非特許文献 4:Audrey Stevensら、 J. Biol. Chem.、第 235卷、第 3016〜3022 頁、第 3023〜3027頁（1960年）
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明の目的は、遺伝子工学用試薬として、さらに工業用酵素として有用な、ゲノ ム DNAの除去、 RNA合成反応後に铸型 DNAを分解する反応、 DNAライブラリ合 成、フットプリント法、タンパク質溶液中の核酸の除去、タンパク質抽出液の粘性の低 減、 2次元電気泳動サンプルの前処理およびウィルス精製時の前処理などの 、ずれ においても有用なエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドならびに該ポリぺプ チドをコードする核酸を提供することにある。
また、本発明の目的は、当該エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの製造 方法ならびに該エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを用いた核酸の分解方 法およびタンパク質抽出液の粘性の低減方法を提供することにある。
課題を解決するための手段 [0013] 本発明者らは鋭意研究の結果、低温性微生物である Shewanella sp. AclO株 力 低温域において活性を有するエンドヌクレアーゼをコードする核酸を見出し、該 遺伝子をクローユングしてエンドヌクレアーゼポリペプチドを製造し、本発明を完成さ せた。
すなわち、本発明の第 1の発明は、下記 (a)〜(e)からなる群より選択されるポリべ プチドであって、かつエンドヌクアレーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチド：
(a)配列表の配列番号 10記載のアミノ酸配列またはその一部を有するポリペプチド
(b)配列表の配列番号 10記載のアミノ酸配列またはその一部を有するアミノ酸配 列において、 1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたポリ ペプチド；
(c)配列表の配列番号 10記載のアミノ酸配列と少なくとも 60%の配列相同性を有 するポリペプチド；
(d)配列表の配列番号 11記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有す るポリペプチド；および
(e)配列表の配列番号 11記載の塩基配列の相補鎖にストリンジ ントな条件下に おいてハイブリダィズ可能な塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリ ペプチド、に関する。
[0014] 本発明の第 2の発明は、少なくとも下記 (a)、（b)の理化学的性質を有することを特 徴とする本発明の第 1の発明のポリペプチド：
(a)基質特異性:線状二本鎖 DNA、環状二本鎖 DNA、一本鎖 DNA、 RNAに作 用する；
(b)低温での反応性: 0〜10°Cでの活性が 20°Cでの活性の 30%以上を保持する 、に関する。
[0015] 本発明の第 3の発明は、下記 (a)〜(h)力もなる群より選択される核酸であって、か つエンドヌクレアーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチドをコードする核酸：
(a)配列表の配列番号 10記載のアミノ酸配列またはその一部を有するアミノ酸配列 をコードする核酸； (b)配列表の配列番号 10記載のアミノ酸配列またはその一部を有するアミノ酸配 列において、 1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたアミ ノ酸配列をコードする核酸；
(c)配列表の配列番号 10記載のアミノ酸配列と少なくとも 60%の配列相同性を有 するアミノ酸配列をコードする核酸；
(d)配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する核酸またはその一部を有する 核酸；
(e)配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する核酸またはその一部を有する 核酸において、 1もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入あるいは付加された核酸
(f)前記 (a)〜 (e) V、ずれか記載の核酸またはその相補鎖とストリンジ ントな条件 下にお ヽてハイブリダィズし得る核酸；
(g)前記 (a)〜 (f) V、ずれか記載の核酸と縮重を介して異なる塩基配列を有する核 酸；および
(h)前記 (a)〜 (g) V、ずれか記載の核酸の塩基配列と少なくとも 60%の配列相同 性を有する塩基配列を有する核酸、に関する。
[0016] 本発明の第 4の発明は、本発明の第 3の発明の核酸を含んでなる、組換え DNA、 に関する。
[0017] 本発明の第 5の発明は、本発明の第 3の発明の核酸を保持してなる、形質転換体、 に関する。
[0018] 本発明の第 6の発明は、本発明の第 5の発明の形質転換体を培養する工程、およ びエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを培養物中から回収する工程を包含 することを特徴とする、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法、に 関する。
[0019] 本発明の第 7の発明は、本発明の第 1の発明のポリペプチドを用いて核酸を分解 する工程を包含する核酸の分解方法、に関する。
[0020] 本発明の第 8の発明は、本発明の第 1の発明のポリペプチドを用いてタンパク質抽 出液を処理する工程を包含するタンパク質抽出液の粘性の低減方法、に関する。 発明の効果
[0021] 本発明により、遺伝子工学用試薬として、さらに工業用酵素として、ゲノム DNAの 除去、 RNA合成反応後に铸型 DNAを分解する反応、 DNAライブラリ合成、フットプ リント法、タンパク質溶液中の核酸の除去、タンパク質抽出液の粘性の低減、 2次元 電気泳動サンプルの前処理およびウィルス精製時の前処理などの ヽずれにぉ ヽて も有用なエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドならびに該ポリペプチドをコー ドする核酸ならびに当該エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法が 提供される。本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、核酸 増幅反応の前処理、 RNA合成後の铸型核酸処理、タンパク質抽出液の前処理、タ ンパク質溶液中の核酸除去による精製にぉ ヽて好適に使用できる。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]図 1は、低温性微生物由来 DNaseの活性測定試験結果を示す図である。
[図 2]図 2は、低温性微生物由来 DNaseの熱安定性試験結果を示す図である。
[図 3]図 3は、低温性微生物由来 DNaseの至適温度試験結果を示す図である。
[図 4]図 4は、低温性微生物由来 DNaseの基質特異性試験結果を示す図である。
[図 5]図 5は、 EDTAの低温性微生物由来 DNaseの反応に対する影響試験結果を 示す図である。
[図 6]図 6は、低温性微生物由来 DNaseの至適 pH試験結果を示す図である。
[図 7]図 7は、低温性微生物由来 DNaseの pH安定性試験結果を示す図である。
[図 8]図 8は、本発明のエンドヌクレアーゼの活性測定試験結果を示す図である。
[図 9]図 9は、本発明のエンドヌクレアーゼの分子量を調べた SDSポリアクリルアミド電 気泳動試験結果を示す図である。
[図 10]図 10は、本発明のエンドヌクレアーゼと Benzonaseとの低温での反応性比較 試験結果を示す図である。
[図 11]図 11は、本発明のエンドヌクレア一ゼの基質特異性試験結果を示す図である
[図 12]図 12は、本発明のエンドヌクレア一ゼの至適 pH試験結果を示す図である。
[図 13- 1]図 13— 1は、本発明のエンドヌクレアーゼの種々添加剤の影響を調べた結 果を示す図である。
[図 13-2]図 13— 2は、本発明のエンドヌクレアーゼの種々添加剤の影響を調べた結 果を示す図である。
[図 13-3]図 13— 3は、本発明のエンドヌクレアーゼの種々添加剤の影響を調べた結 果を示す図である。
[図 13-4]図 13— 4は、本発明のエンドヌクレアーゼの種々添加剤の影響を調べた結 果を示す図である。
[図 14]図 14は、本発明のエンドヌクレアーゼと DNaselの低温で大腸菌からタンパク 質抽出する際の粘性の低減効果を示す電気泳動結果である。
[図 15]図 15は、本発明のエンドヌクレアーゼと DNaselの低温で大腸菌からタンパク 質抽出する際の粘性の低減効果を示す電気泳動結果である。
[図 16]図 16は、本発明のエンドヌクレアーゼと DNaselの大腸菌ゲノム DNA分解反 応比較試験結果を示す図である。
[図 17]図 17は、本発明のエンドヌクレアーゼと DNaselの大腸菌ゲノム DNA分解反 応比較試験結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0023] 本明細書においてエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとは、高分子核酸 の糖リン酸鎖（主鎖）の内部のリン酸ジエステル結合を加水分解する反応を触媒する ポリペプチドのことを 、う。
[0024] 本明細書において DNaseとは、二本鎖および一本鎖 DNAに作用して 3'— OH末 端、 5' P末端を有するオリゴヌクレオチドに分解する反応を触媒するポリペプチド のことをいう。
[0025] 本明細書において低温とは、 20°C未満の温度を指し、常温（中温）とは、 20〜50 °Cの範囲の温度を指し、高温とは、 50°Cより高い温度を指す。
[0026] 以下、本発明を詳細に説明する。
(1)本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコ ードする核酸
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列表の配列番号 10も しくは配列番号 3に示されるアミノ酸配列力 なる力 ある!/、はこれと実質的に同等の 活性を有する機能的同等物であってもよい。
ここで、本明細書に記載の「機能的同等物」として、配列表の配列番号 10もしくは 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1以上の、例えば、 1もしくは複数個、よ り具体的には 1〜： LO個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加などされたアミ ノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
[0027] 本発明によって開示されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列表の配列番号 10もしく は配列番号 3)に少なくとも 60%、好ましくは 70%、より好ましくは 80%、特に好ましく は 90%の相同性を有し、かつ、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、本 発明の範囲内に属するものである。
[0028] さらに、遺伝子工学的にポリペプチドの生産を行う際には融合ポリペプチドとして発 現させることがしばしば行われる。たとえば目的ポリペプチドの発現量を増カロさせるた めに N末端に他のポリペプチド由来の N末端ペプチド鎖を付加したり、 目的ポリぺプ チドの N末端、あるいは C末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、このべプチ ド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより目的ポリペプチドの精製を容易にする ことなどが行われて 、る。従って本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリべプチ ドとは一部異なったアミノ酸配列を有するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリべプチ ドであっても、それが本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドと本質的 に同等の活性を示す限りにおいて、該酵素は「機能的同等物」として本発明の範囲 内に属するものである。
[0029] 本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸としては、 配列表の配列番号 10もしくは配列番号 3に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配 列の全部又は一部を含む核酸、例えば、配列表の配列番号 11もしくは配列番号 4に 示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸が挙げられる。また、配列表の配列番 号 10もしくは配列番号 3のアミノ酸配列において、 1以上の、例えば 1もしくは複数個 、より具体的には 1〜： L0個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加などされたァミノ 酸配列からなり、かつエンドヌクレアーゼとしての活性を有するポリペプチドをコード する核酸も挙げられる。 [0030] また、さらにこれらの配列あるいはその相補鎖とストリンジェントな条件下でノヽイブリ ダイズ可能で、かつ下記エンドヌクレアーゼとしての活性を有するポリペプチドをコー ドする塩基配列も本発明の範囲内である。ここで、「ストリンジェントな条件下でノ、イブ リダィズ可能」とは、特に本発明を限定するものではないが、 0. 5%SDS、 0. 1%ゥ シ血清アルブミン、 0. 1%ポリビュルピロリドン、 0. 1%フイコール 400、 0. 01%変性 サケ精子DNAを含む6 X SSC (1 X SSCは、0. 15M NaCl、 0. 015M クェン酸 ナトリウム、 ρΗ7. 0である）中、 65°Cにて 12〜20時間インキュベートした後、 0. 5% SDSを含む 2 X SSC中、 65°Cにて 30分間洗浄を行っても、本発明の核酸またはそ の相補鎖とハイブリダィズして 、ることを言う。
[0031] さらに、本発明によって開示された塩基配列（配列表の配列番号 11もしくは配列番 号 4)に少なくとも 60%、好ましくは 70%、より好ましくは 80%、特に好ましくは 90% の相同性を有する核酸は、本発明の範囲内に属するものである。
[0032] 上記相同性は、例えばコンピュータープログラム DNASIS— Mac (タカラバイオ 社製）、コンピュータァノレゴリズム FASTA〔バージョン 3. 0 ; Pearson W. R.およ び Lipman D. J. 、 Pro. Natl. Acad. Sci. USA,第 85卷、第 8号、第 244 4〜2448頁（1988年）〕、コンピュータアルゴリズム BLAST〔バージョン 2. 0 ;Altsc hul S. F.ら、 Nucleic Acids Res.、第 25卷、第 17号、第 3389〜3402頁（19 97年)〕などによって測定することができる。
[0033] 本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸と縮重を介 して異なる塩基配列を有する核酸は、本発明の範囲内に属するものである。
ここで本明細書に記載の「アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸」なる用語 につ 、て説明する。遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（3つの塩基の組み合わせ） はアミノ酸の種類ごとに 1〜6種類ずつが存在することが知られている。従って、ある アミノ酸配列をコードする核酸は、そのアミノ酸配列にもよる力 多数存在することが できる。
本明細書中に開示された塩基配列と同一の塩基配列を有する核酸ではなくても、 それが本発明中に開示されたアミノ酸配列をコードする限り該核酸は本発明に包含 されるちのである。 また、本発明の核酸は、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコ ードするものであれば DNA、 RNA、 DNAと RNAのキメラヌクレオチドのいずれであ つてもよく、さらに修飾ヌクレオチドを含有していてもよい。その形態は、二本鎖、一本 鎖の!/、ずれであってもよ!/、。
[0034] 本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、 Serratia marcescens のヌクレアーゼである Benzonase Nuclease (ノバジェン社製）と比較して、低温に ぉ ヽて高 、エンドヌクレアーゼ活性を保持する特徴を有したポリペプチドである。
[0035] 本発明の配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列、ある 、は配列表の配列番 号 11に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸によりコードされるアミノ酸配 列、また、配列表の配列番号 10のアミノ酸配列において、 1以上の、例えば 1もしくは 複数個、より具体的には 1〜10個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加などされ たアミノ酸配列力 なり、かつエンドヌクレアーゼとしての活性を有するポリペプチドの 理ィ匕学的性質は、以下 (a)〜 (1)の通りである。
(a)基質特異性:線状二本鎖 DNA、環状二本鎖 DNA,—本鎖 DNA、 RNAに対 して活性を示す。
(b)低温での反応性: 0〜10°Cでの活性が 20°Cでの活性の 30%以上を保持して いる。
(c)活性を有する温度範囲： 0〜50°C
(d) pH安定性： 37°C、 30分間の処理に対し、 pH6〜 10の範囲で活性を保持して いる。
(e)分子量： SDS— PAGE法により 25〜31kDaである。
(f)至適マグネシウムイオン濃度： 60〜 120mM
(g)至適ナトリウムイオン濃度： 0〜167mM
(h)至適カリウムイオン濃度： 0〜167mM
(i)至適カルシウムイオン濃度： 0〜42mM
(j)至適ジチオスレィトール濃度： 0〜 167mM
(k)至適 2—メルカプトエタノール濃度： 0〜333mM
(1)至適硫酸アンモニゥム濃度： 0〜83mM [0036] 本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、上記理化学的性質を有 しているものであれば特に限定はされないが例えば、 Shewanella sp. AclO株か ら得ることがでさる。
[0037] 生化学的特性を解析したところ、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリべ プチドは、タンパク質溶液中の核酸の除去やタンパク質抽出液の粘性の低減に適し ている。特に、低温での上記用途での使用に適している。
[0038] 本明細書において、低温での反応性は、以下のようにして算出することができる。
まず、調べたいエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドについて、酵素ュ-ッ ト量を決定する。例えば、基質としてサケ精巣由来 DNA (和光純薬社製)を用い、基 質溶液 (40 /ζ 8Ζπι1、 lOOmM トリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 5mM 塩化マグネ シゥム） 500 μ 1にエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドのサンプル 100 μ 1を 加えた反応系で、 37°Cにおいて 260nmの吸光度を 1分間に 0. 001増加させる酵素 量を 1Uとする。
次に、上記基質溶液 500 1に、これに上記方法により決定された 2. 3Uのエンド ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド含有溶液（10mM トリス一塩酸緩衝液 (pH7 . 5)、 10mM 塩化マグネシウム） 100 1をカ卩えたものを反応液とする。
当該活性測定は、上記反応液を 0、 5、 10、 15、 20°Cの各種温度において、 10分 間反応させた後、 260nmの吸光度の増加量を測定することにより算出する。
次に 20°Cでのエンドヌクレアーゼ活性を 100として各温度における相対活性（％) を計算し比較することにより低温での反応性を評価することができる。
例えば、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは 0〜10°Cでの相 対活性が 30〜70%程度であるのに対して、 Benzonase Nuclease (ノバジェン社 製）は、 0〜10°Cでの相対活性力^〜 20%程度まで著しく低下する。従って、本発明 のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、市販の Benzonase Nucleaseと 比較して、低温において、特に 0〜10°Cにおいて、高いエンドヌクレアーゼ活性を保 持している。
[0039] また、配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列、あるいは配列表の配列番号 4 に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列、ま た、配列表の配列番号 3のアミノ酸配列において、 1以上の、例えば 1もしくは複数個 、より具体的には 1〜： LO個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加などされたァミノ 酸配列からなり、かつエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、ゥシ脾由来 D Naselと比較してより低温で失活する特徴を有している。例えば、ゥシ脾由来 DNase Iは 90°Cでも活性を保持している力 実施例 1記載のように本発明のエンドヌクレア一 ゼ活性を有するポリペプチドは 70°C、 30分処理で完全に失活する。
[0040] 前記エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの理ィ匕学的性質は、以下 (a)〜（ h)の通りである。
(a)基質特異性:線状二本鎖 DNA、環状二本鎖 DNA,—本鎖 DNAに対して活 性を示す。
(b) 70°C、 30分処理で完全に失活する。
(c)分子量： SDS— PAGE法により 27〜31kDaである。
(d)至適温度： 30〜40°C
(e)温度安定性： 40°Cで 30分間、活性を保持して!/ヽる。
(f)至適 pH : 6〜： LO
(g) pH安定性： 37°C、 30分間の処理に対し、 pH4〜 10の範囲で活性を保持して いる。
(h)阻害剤の影響： 5mM EDTAによって活性が阻害される。
[0041] 上記熱安定性については、実施例 1一（5)記載の方法に基づいて算出することが できる。また、上記エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、 40°Cまでは高い 活性を示すが、それを超えると活性が低下し始め、 50°Cを超えると急速に活性が低 下し、 60°Cでほぼ活性がなくなり、 70°Cで完全に失活する。このことは、本発明のェ ンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド力 SPCRのコンタミネーシヨン除去や RT— PCRのゲノム除去などの遺伝子工学用試薬として非常に優れたものであることを示 すものである。
[0042] (2)本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドを生産 する微生物の培養物から、あるいは当該ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した 形質転換体から大量生産することが可能である。
[0043] 特に限定はされないが、例えば、低温性微生物 Shewanella sp. AclO株を 15 °Cで好気培養する。増殖した菌体を破砕して DNAを抽出、精製する方法、また得ら れた DNAを制限酵素で切断する方法等は公知の方法を用いる事ができる。当該方 法の詳細は、モレキュラー クローユング ァ ラボラトリー マニュアル 第 3版〔Sam brookおよび Russel、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3 edi tion、 2001年、 Cold Spring Harbor Laboratory Press発行〕に記載されてい る。
[0044] 本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ活性 を有するポリペプチドをコードする核酸、特に限定はされな 、が例えば配列表の配列 番号 11記載の塩基配列を有する核酸又はその一部が組み込まれた組換えプラスミ ドで形質転換された形質転換体を適切な培養条件、例えば大腸菌を宿主とする場合 には、 LB培地（lOgZl トリプトン、 5gZl 酵母エキス、 5gZl NaCl、pH7. 2)中で 培養することにより、その菌体内に発現させることができる。該ポリペプチドは上記の 培養菌体を破砕し、該ポリペプチドを精製することにより、得ることができる。
[0045] 遺伝子工学的な操作による上記酵素、ポリペプチドの製造方法としては、例えば、 本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNAが宿主生 物で機能する適当なプロモーターに機能的に接続された組換え DNAを挿入したベ クタ一を用いて形質転換された宿主細胞、または該組換え DNAが宿主細胞 DNAに インテグレーションされた宿主細胞を、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド が発現できる条件のもとに培養し、さらに当該ポリペプチドを培養液力 回収する方 法が挙げられる。前記の組換え DNAは、オペレータやターミネータ等の調節因子を さらに含んでいてもよい。
[0046] また、上記本発明のポリペプチドに、さらに発現ベクター由来の配列、例えば、発現 あるいは翻訳増強配列（例えば、 Perfect DB配列等）、発現タンパク質精製用のタ グ配列（例えば、 Hisタグ配列等）、大腸菌シャペロンの一種であるトリガーファクター (TF)タグ配列あるいは発現タンパク質の N末端側の付加配列を除去するための配 列（例えば、 Factor Xa配列、 HRV 3C配列、 Thrombin配列等）などのアミノ酸配 列を付加したものも本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドに含まれ る。前記ポリペプチドとしては、特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号 8 記載のアミノ酸配列を有するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが挙げら れる。
[0047] 本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを製造するためのベクター には、特に限定はなぐ市販のベクター、発現系のいずれもが使用できる。特に、限 定はされないが例えば PETシステム (ノバジェン社製)を用いることができる。さらに、 低温で機能し得るプロモーターを有するベクターが好適に使用でき、例えば国際公 開第 99Z27117号パンフレットに記載の pCold (コールドショック発現）系ベクターが 挙げられる。
本発明の製造方法の一態様としては、国際公開第 99Z27117号パンフレットに記 載の pCold系ベクターで製造する方法が例示される。
コールドショック発現系は、低温で発現誘導するため、宿主大腸菌由来のタンパク 質の合成が抑制され、 目的タンパク質のみを高効率で得ることができ、従来の大腸菌 発現系と比較して発現量や可溶性度の向上が期待できる。さらに、トリガーファクター (TF)の可溶ィ匕タグ機能およびシャペロン機能により、これまで発現が困難であった 遺伝子を、より高 、確率で可溶ィ匕タンパク質として発現させることが可能となる。 すなわち、本発明の製造方法においては、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリべ プチドを発現できるベクターであれば 、ずれもが好適に使用できる。
また、当該エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを得られるならば、ポリぺプ チド発現時は封入体の形態であるが、その後のリホールディング操作により当該機能 を回復できるものを発現できるベクターも含まれる。
本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを製造するためのベクターと しては、例えば、実施例 1記載の pCold08—Endl (FERM BP— 10313)および 実施例 2記載の pColdTF— Endlが好適に使用できる。特に限定はされないが、例 えば配列表の配列番号 9記載の塩基配列を含むベクターが好適に使用できる。
[0048] 本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを製造するには、一般の組 み換え酵素製造の手段に準じて行えば良い。即ち、本発明のポリペプチドを生産し 得る組み換え微生物を培養後、遠心分離、濾過等の通常の分離手段により菌体を 培養液力 分離することができる。この菌体を破砕して無細胞抽出液を調製し、粗酵 素液として以下の精製操作に用いる。また、酵素が菌体外に分泌されている場合に は、菌体が除去された培養液上清を粗酵素液とすることができる。この粗酵素液はそ のまま使用することもできるが、必要に応じて、限外濾過、沈澱法等の手段により濃 縮し、および Zまたは適当な方法を用いて粉末ィ匕して精製に用いることもできる。ま た、酵素精製の一般的手段、例えば適当な陽イオン交換榭脂、陰イオン交換榭脂、 ヒドロキシアパタイト等によるクロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィー、疎 水クロマトグラフィー、ゲル濾過等の組合わせによって精製することもできる。
例えば、実施例 2において、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド を生産し得る組み換え微生物を培養後、遠心分離により菌体を培養液から分離する ことができる。この菌体を超音波破砕し、遠心分離により菌体が除去された培養液上 清を、 Q Sepharose Fast Flow (アマシャムバイオサイエンス社製）および Pheny 1 Sepharose Fast Flow (アマシャムバイオサイエンス社製）で精製し、本発明の エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを製造することができる。
[0049] このようにして得られた本発明の配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列、あ るいは配列表の配列番号 11に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸により コードされるアミノ酸配列、また、配列表の配列番号 10のアミノ酸配列において、 1以 上の、例えば 1もしくは複数個、より具体的には 1〜10個のアミノ酸が置換、欠失、挿 入または付加などされたアミノ酸配列力 なり、かつエンドヌクレアーゼとしての機能 を有するポリペプチドは、長鎖および短鎖線状二本鎖 DNA、環状二本鎖 DNA、一 本鎖 DNAまたは RNAを基質とする。さらにその分解効率は、長鎖線状二本鎖 DNA ^短鎖線状二本鎖 DNA >環状二本鎖 DNA >—本鎖 DNA = RN Aの順に低くなる 。また、本発明のエンドヌクレアーゼは、 λ -DNA, pUC119、 M13mpl8 single strand DNA、 16Sおよび 23S rRNAのいずれも分解することができる。
[0050] また、本発明の配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列、あるいは配列表の配 列番号 4に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸によりコードされるアミノ酸 配列、また、配列表の配列番号 3のアミノ酸配列において、 1以上の、例えば 1もしく は複数個、より具体的には 1〜10個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加などさ れたアミノ酸配列からなり、かつエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、長 鎖および短鎖線状二本鎖 DNA、環状二本鎖 DNA、一本鎖 DNAを基質とする。そ の分解効率は、長鎖線状二本鎖 DNA 短鎖線状二本鎖 DNA >環状二本鎖 DNA >一本鎖 DNAの順に低くなる。また、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリ ペプチドは、 λ— DNA、 pUC119、 M13 mpl8 single strand DNAのいずれ も分解しており、基質の形状 (一本鎖、二本鎖)や塩基配列に対する特異性はないと 考えられる。
[0051] (3)本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを用いた核酸の分解方法 、タンパク質抽出液の粘性の低減方法および該方法のための組成物ならびにキット 上記（1)の本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、核酸の分解 方法において好適に使用することができる。特に限定はされないが例えば、大腸菌 超音波破砕上清に添加し、低温で反応させ、残存する大腸菌由来ゲノムの量を従来 の DNaselの場合と比較すると、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリぺプ チドは、 目的タンパク質に影響を与えずにゲノム DNAを分解することができる。 上記方法において、特に配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列、あるいは 配列表の配列番号 11に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸によりコード されるアミノ酸配列、また、配列表の配列番号 10のアミノ酸配列において、 1以上の、 例えば 1もしくは複数個、より具体的には 1〜10個のアミノ酸が置換、欠失、挿入また は付加などされたアミノ酸配列からなり、かつエンドヌクレアーゼ活性を有するポリべ プチドが、タンパク質精製において障害となる核酸の分解方法に好適に使用できる。
[0052] また、上記（1)の本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、タンパ ク質の抽出方法において好適に使用することができる。特に限定はされないが、タン パク質抽出用試薬キット、例えば TALON xTractor Buffer Kit (クロンテック社 製)を用いて氷上でタンパク質抽出を行う際に、当該ポリペプチドを抽出液に添加し 、粘性低減効果を比較してみると、従来の DNaselの場合と比較して 1オーダー低い 添加量でも目的タンパク質に影響を与えずに粘性を下げることができる。
上記方法において、特に配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列、あるいは 配列表の配列番号 11に示される塩基配列の全部又は一部を含む核酸によりコード されるアミノ酸配列、また、配列表の配列番号 10のアミノ酸配列において、 1以上の、 例えば 1もしくは複数個、より具体的には 1〜10個のアミノ酸が置換、欠失、挿入また は付加などされたアミノ酸配列からなり、かつエンドヌクレアーゼ活性を有するポリべ プチドは、タンパク質抽出において障害となる抽出液の粘性の低減方法に好適に使 用できる。
[0053] 本発明のタンパク質溶液中の核酸の除去やタンパク質抽出液の粘性の低減などを 行うための組成物ならびにキットは、上記（1)記載の本発明のエンドヌクレアーゼ活 性を有するポリペプチドを含有することを特徴とする。さらに、反応用バッファーを含 んでいてもよい。
前記キットとしては、例えばタンパク質抽出用試薬キットに本発明のポリペプチドを 含有させたキットが挙げられる。タンパク質抽出用試薬キットには、上記（1)記載の本 発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、反応用バッファー以外に、プロ テアーゼ阻害剤、溶菌酵素、界面活性剤を含んでいてもよい。前記プロテアーゼ阻 害剤、溶菌酵素、界面活性剤としては、 PMSF、 Lysozyme, Triton X— 100 (登 録商標)などが例示される。
[0054] さらに上記（1)の本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、 PCRの コンタミ除去や RT—PCRのゲノム除去に用いることができる。
当該方法のための糸且成物ならびにキットは、上記（1)の本発明のエンドヌクレアーゼ 活性を有するポリペプチドを含むものが好適に使用できる。さらに、反応用バッファー を含んでいてもよい。
前記キットとしては、特に限定はされないが例えば PCR用キットに本発明のエンドヌ クレアーゼ活性を有するポリペプチドを含有させたキットが挙げられる。
実施例
[0055] 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する力 本発明は以下の実施 例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本 的な操作についてはモレキュラー クローユング 了 ラボラトリー マ-ユアノレ 第 3 版〔Sambrookおよび Russel、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd edition, 2001年、 Cold Spring Harbor Laboratory Press発行〕に記 載の方法によった。
[0056] 実施例 1 コールドショック発現系を用いた低温性微生物由来 DNaseの発現検討
(1)発現ベクターの構築
低温性微生物 Shewanella sp. AclO株ゲノムDNA配列からendonuclease I (GenBank Acc. No. ： P25736)と相同的なポリペプチドをコードする ORFを推 定した。
該 ORFの配列をもとに配列表の配列番号 1及び 2記載の合成プライマー 1及び 2を DNA合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー 1は、低温性微生 物由来 DNaseのアミノ酸配列（配列表の配列番号 3)のアミノ酸番号 1〜7に相当す る塩基配列をもち、さらに制限酵素 EcoRIの認識配列を塩基番号 4〜9にもつ合成 D NAである。また、合成プライマー 2は、低温性微生物由来 DNaseのアミノ酸配列（配 列表の配列番号 3)のアミノ酸番号 247〜254に相当する塩基配列をもち、さらに制 限酵素 BamHIの認識配列を塩基番号 4〜9にもつ合成 DNAである。
[0057] 上記合成プライマーを用いて、 PCRを行った。 PCRの反応条件を以下に示す。
すなわち、铸型 DNA (低温性微生物 Shewanella sp. Ac 10株ゲノム DNA) 1 1、 10 1の 10 X Ex Taq Buffer (タカラバイオ社製）、 8 μ 1の dNTP混合液（タカ ラバイオ社製）、 lOOpmolの合成プライマー 1、 lOOpmolの合成プライマー 2、 2. 5 Uの TaKaRa Ex Taq (タカラバイオ社製）をカ卩え、滅菌水をカ卩えて全量を 100 1 とした。前記反応液を TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (タカラバイオ社製） にセットし、 94°C 30秒、 58°C 30秒、 72°C 1分を 1サイクルとする 30サイクルの反 応を行なった。
[0058] 反応終了後、該反応液 100 μ 1を 1. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。確認さ れた目的の約 0. 8kbpの DNAフラグメントを電気泳動ゲルより回収'精製し、ェタノ ール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収 DNAを 5 1の滅菌水に懸濁し、制 限酵素 EcoRI (タカラバイオ社製)及び制限酵素 BamHI (タカラバイオ社製)で 2重 消化し、 1. 0%ァガロースゲル電気泳動によりその EcoRI— BamHI消化物を抽出 精製し、 EcoRI— BamHI消化 DNA断片を得た。
[0059] 次に、国際公開第 99Z27117号パンフレットの記載に基づき、プラスミド pMM04 7を出発材料として pCold08NC2を構築した。
この pCold08NC2ベクターを上記 EcoRI - BamHI消化 DNA断片を調製した時 に用いたのと同じ制限酵素 EcoRIおよび制限酵素 BamHIで切断し、末端を脱リン 酸処理したものを調製し、上記 EcoRI— BamHI消化 DNA断片と混合し、 DNAライ ゲーシヨンキット (タカラバイオ社製)を用いて連結した。その後、ライゲーシヨン反応 液 10 1を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その形質転換体を 1. 5% (wZv)濃 度の寒天を含む LB培地 (アンピシリン 100 μ g/ml含む）上で生育させた。
[0060] この組み換えプラスミドを pCold08— Endlとした。当該プラスミドは、 pCold08— E ndlと命名、表示され、平成 17年（2005年） 2月 16日（原寄託日）より独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター〔日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 地 1中央第 6 (郵便番号 305— 8566)〕に FERM BP— 10313として国際寄託され ている。この pCold08— Endlは、低温性微生物由来 DNase アミノ酸配列（配列表 の配列番号 3)のアミノ酸番号 1〜254のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列表 の配列番号 4)を含むプラスミドである。前記プラスミドから発現させたタンパク質は、 該アミノ酸配列の N末に Perfect DB配列、 His tag配列、 Factor Xa配列ならび にリンカ一を有している。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号 5に、当 該ポリペプチドをコードする核酸の塩基配列を配列表の配列番号 6に示す。
[0061] (2)形質転換体の調製
pCold08— Endlを用いて、大腸菌 BL21を形質転換した。なお、形質転換は塩化 カルシウム法により行った。形質転換体は、 1. 5% (wZv)濃度の寒天を含む LB培 地（アンピシリン 100 g/ml含む）を用 V、てスクリ一ユングすることにより得た。
[0062] (3)低温性微生物由来 DNaseの発現
上記（2)で得られた形質転換体を用いて、低温性微生物由来 DNaseの発現を調 ベた。対照としてインサートを導入して ヽな 、pCold08ベクターのみを用いて形質転 換した大腸菌 BL21も同時に行った。培養には、 5mlの LB液体培地 (組成： 1%バタ トトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl、 100 g/mlアンピシリン）を用! /、て 3 7°Cで培養し、濁度が OD600 = 0. 8程度に達した時点で 15°C、 15分間培養後、培 養液に終濃度 ImMの IPTGをカ卩え、更に 15°Cで 24時間培養を行うことで発現を誘 導した。発現誘導を 24時間行ったのち、菌体を回収した。得られた菌体を PBSに懸 濁、超音波破砕し、細胞抽出液を調製、ついで 15, 000 X gの遠心分離により可溶 性画分と不溶性画分に分けた。それぞれの画分の 0. 05OD分 (OD600)について SDS— PAGE (5— 20%ゲル）に供し、 CBB染色および抗 His— Tag抗体を用いた Western blottingにより解析した。
その結果、 pCold08— Endlを導入した菌体のみに、 His— Tag融合タンパク質で ある低温性微生物由来 DNaseの発現が確認された。該融合タンパク質の分子量は 、 SDS— PAGEにおいて 31kDa付近であった。また、 tag配列を除去した本発明の DNaseの分子量は、 29kDa付近であった。
(4)低温性微生物由来 DNase活性の測定
上記（3)で調製した、 pCold08— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分について 、 DNase活性を測定した。前記の対照大腸菌の超音波破砕可溶性画分のものも同 時に行った。活性測定は以下のようにして行った。
活性測定にはえ一 Hindlll digest (タカラバイオ社製)を基質として用いた。 λ— Hindlll digest ： L g、上記（3)で調製したタンパク質サンプル 0. 025OD分（OD 600)、 10 X反応緩衝液 (400mM トリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 lOOmM 塩化 ナトリウム、 60mM 塩化マグネシウム、 10mM 塩化カルシウム） 5 1、これに nucl ease free水をカ卩えて、全量を 50 1としたものを反応液とした。 20°Cで 2時間反応 後、反応液の 10 1を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なつ た。結果を図 1に示す。
図 1において、レーン Mはえ Hindlllマーカー、レーン 1は pCold08ベクターの みを導入した大腸菌の可溶性画分、レーン 2は pCold08— Endlを導入した大腸菌 の可溶性画分、レーン 3は基質を反応系に添加して!/、な!/ヽ pCold08ベクターのみを 導入した大腸菌の可溶性画分、レーン 4は基質を反応系に添加して 、な 、pCold08 —Endlを導入した大腸菌の可溶性画分である。
図 1より、 λ—Hindm digestを pCold08ベクターのみを導入した大腸菌の可溶 性画分 (レーン 1)は基質が分解しないのに対し、 pCold08— Endlを導入した大腸 菌の可溶性画分 (レーン 2)は基質が分解し、低温性微生物由来の DNaseの活性が 確認された。また、レーン 2とレーン 4の比較より、低分子のスメァなバンドは大腸菌由 来の混入物であった。
[0064] (5)低温性微生物由来 DNaseの熱安定性
上記（3)で調製した、 pCold08— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分について 、熱安定性を調べた。 PBS中、各種温度 (4°C〜90°C)で 30分放置後、 DNase活性 を測定した。対照としてゥシ脾臓由来の DNasel (タカラバイオ社製)を用いた。活性 測定にはえ一 Hindlll digestを基質として用いた。 λ— Hindlll digest 1 g、 上記（3)で調製した、 pCold08— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分 0. 02OD 分（OD600)またはゥシ脾由来 DNasel 8U、 10 X反応緩衝液（400mM トリスー 塩酸緩衝液（PH7. 5)、 lOOmM 塩ィ匕ナトリウム、 60mM 塩化マグネシウム、 10m M 塩化カルシウム） 5 1、これに nuclease free水をカ卩えて、全量を 50 1とした ものを反応液とした。 20°C (ゥシ脾由来 DNaselは 37°C)で 30分反応後、反応液の 1 0 1を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図 2 に示す。
図 2において、レーン Mはえ Hindlllマーカー、レーン 1〜8は本発明の低温'性 微生物由来 DNaseを用いた場合、レーン 9〜16はゥシ脾由来 DNaselを用いた場 合である。
また、図 2において、レーン 1および 9は 4°C、レーン 2は 10°C、レーン 3は 20°C、レ ーン 4および 10は 30°C、レーン 5および 11は 40°C、レーン 6および 12は 50°C、レー ン 7および 13は 60。C、レーン 8および 14は 70。C、レーン 15は 80。C、レーン 16は 90 °Cで、それぞれ 30分間放置したものである。
図 2より、低温性微生物由来 DNaseは 4°C (レーン 1)〜40°C (レーン 5)までは高い 活性を示している力 50°C (レーン 6)力も失活がみられ、 60°C (レーン 7)でほぼ失活 し、 70°C (レーン 8)で完全に失活した力 ゥシ脾由来 DNaselは 90°C (レーン 16)で も活性を保持していた。
[0065] (6)低温性微生物由来 DNaseの至適温度 上記（3)で調製した、 pCold08— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分について 、至適温度を調べた。対照としてゥシ脾由来 DNasel (タカラバイオ社製)を用いた。 活性測定にはえ—Hindlll digestを基質として用いた。 λ—Hindlll digest 1 μ g、上記（3)で調製した、 pCold08— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分 5 X 10— 4または 5 X 10_5OD分（OD600) (ゥシ脾由来 DNasel 0. lmUまたは lmU)、 10 X反応緩衝液 (400mM トリス一塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 lOOmM 塩ィ匕ナトリウム、 60mM 塩化マグネシウム、 10mM 塩化カルシウム） 5 1、これに nuclease fre e水を加えて、全量を 50 1としたものを反応液とした。 10〜70°Cの各種温度で 30分 反応後、反応液の 10 1を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を 行なった。結果を図 3に示す。
図 3において、パネル (A)は本発明の低温性微生物由来 DNaseを 5 X 10_4OD分 、パネル ）は本発明の低温性微生物由来 DNaseを 5 X 10_5OD分、パネル（C)は ゥシ脾由来 DNaselを lmU、パネル（D)はゥシ脾由来 DNaselを 0. lmU用いた場 合である。全てのパネルにおいて、レーン Mはえ一 Hindlllマーカー、レーン 1は 10 °C、レーン 2は 20°C、レーン 3は 30°C、レーン 4は 40°C、レーン 5は 50°C、レーン 6は 60°C、レーン 7は 70°Cで、それぞれ 30分間放置したものである。
図 3より、低温性微生物由来 DNaseは低温から常温（10〜40°C)において高い活 性を示し、その至適温度は 30〜40°C付近であった。一方、ゥシ脾由来 DNaselは低 Vヽ温度では活性は低ぐ高温ほど高活性であった。
(7)低温性微生物由来 DNaseの基質特異性
上記（3)で調製した、 pCold08— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分について 、種々の基質を用いた場合の活性を測定した。基質として λ -Hindlll digest以外 に、 DNA (タカラバイオ社製）、 pUC119 (タカラバィォ社製）、 M13 mpl8 Sin gle Strand DNA (タカラバイオ社製)を検討に用いた。基質 l /z g、上記（3)で調 製した、 pCold08— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分 5 X 10_3、 5 X 10_4、 5 X 10_5または 5 X 10_6OD分（OD600)、 10 X反応緩衝液（400mM トリス—塩酸緩 衝液（pH7. 5)、 100mM 塩ィ匕ナトリウム、 60mM 塩化マグネシウム、 10mM 塩 化カルシウム） 5 1、これに nuclease free水を加えて、全量を 50 μ 1としたものを 反応液とした。 37°Cで 30分反応後、反応液の 10 1を 1%ァガロースゲル電気泳動 に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図 4に示す。
図 4において、レーン Mはえ Hindlllマーカー、レーン 1は酵素無添加、レーン 2 は 5 X 10_6OD分、レーン 3は 5 X 10_5OD分、レーン 4は 5 X 10_4OD分、レーン 5 は 5 X 10_3OD分の本発明の低温性微生物由来 DNaseを用いた場合である。
図 4より、線状二本鎖 DNA( DNA、 48. 5kbp)、環状二本鎖 DNA(pUC119、 3. 2kbp) , ^^:^DNA (M13 mpl8 Single Strand DNA, 7. 2kbp)のいず れの基質も分解された。本発明のエンドヌクレア一ゼの基質分解効率は、長鎖線状 二本鎖 DNA =短鎖線状二本鎖 DNA >環状二本鎖 DNA >—本鎖 DN Aの順に低 くなる。また、本発明のエンドヌクレアーゼは、 λ -DNA, pUC119、 M13mpl8 si ngle strand DNAのいずれも分解しており、基質の形状（一本鎖、二本鎖）や塩 基配列に対する特異性はないと考えられる。
(8) EDTAの低温性微生物由来 DNaseの反応に対する影響
上記（3)で調製した、 pCold08— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分について 、 EDTAの反応に対する影響を調べた。反応液中に各種濃度 (0、 0. 2、 1、 5mM) の EDTA存在下で DNase活性を測定した。対照としてゥシ脾由来 DNaselを用いた 。活性測定にはえ— Hindlll digestを基質として用いた。 λ— Hindlll digest 1 μ g、上記（3)で調製した、 pCold08— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分 5 X 1 0_4OD分（OD600)またはゥシ脾由来 DNasel lmU、 10 X反応緩衝液（400mM トリス—塩酸緩衝液（pH7. 5)、 100mM 塩化ナトリウム、 60mM 塩化マグネシゥ ム、 10mM 塩化カルシウム） 5 1、これに nuclease free水をカ卩えて、全量を 50 1としたものを反応液とした。 37°Cで 30分反応後、反応液の 10 1を 1%ァガロース ゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図 5に示す。
図 5において、パネル (A)は本発明の低温性微生物由来 DNaseを、パネル ）は ゥシ脾由来 DNaselを用いた場合である。いずれのパネルにおいても、レーン Mはえ —Hindlllマーカー、レーン 1は EDTA OmM、レーン 2は EDTA 0. 2mM、レー ン 3は EDTA ImM、レーン 4は EDTA 5mMを反応系に添カ卩した場合である。 図 5より、 5mM EDTA存在下では、低温性微生物由来 DNaseは活性が認めら れなかった (パネル (A)レーン 4) 1S ゥシ脾由来 DNaselは活性を保持して 、た (パ ネル（B)レーン 4)。
[0068] (9)低温性微生物由来 DNaseの至適 pH
上記（3)で調製した、 pCold08— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分について 、至適 pHを調べた。
活性測定にはえ— Hindlll digestを基質として用いた。緩衝液は、 pH4、 5 :酢酸 ナトリウム緩衝液、 ρΗ6、 7、 8 :リン酸ナトリウム緩衝液、 pH7. 5 :トリス—塩酸緩衝液 、 pH9、 10 :ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いて検討した。
λ -Hindlll digest ： L g、上記（3)で調製した、 pCold08— Endlを導入した 大腸菌の可溶性画分 5 X 10_4または 5 X 10_5OD分 (OD600)、 10 X反応緩衝液（ 400mM 上記緩衝液、 lOOmM 塩化ナトリウム、 60mM 塩化マグネシウム、 10m M 塩化カルシウム） 5 1、これに nuclease free水をカ卩えて、全量を 50 1とした ものを反応液とした。 pH4〜10の各種 pHにおいて、 37°Cで 30分反応後、反応液の 10 1を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図 6に示す。
図 6にお!/、て、パネル (A)は 5 X 10_5OD分、パネル（B)は 5 X 10_4OD分を用い た場合である。いずれのパネルにおいても、レーン Mはえ—Hindlllマーカー、レー ン 1は pH4、レーン 2は pH5、レーン 3は pH6、レーン 4は pH7、レーン 5は pH7. 5、 レーン 6は pH8、レーン 7は pH9、レーン 8は pHIOである。
その結果、パネル (B)のレーン 3〜8において基質が切断されたことから、低温性微 生物由来 DNaseの至適 pHは 6〜 10であった。
[0069] (10)低温性微生物由来 DNaseの pH安定性
上記（3)で調製した、 pCold08— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分について 、 pH安定性を調べた。
各種 40mM緩衝液中（pH4、 5 :酢酸ナトリウム緩衝液、 pH6、 7、 8 :リン酸ナトリウ ム緩衝液、 pH7. 5 :トリス—塩酸緩衝液、 pH9、 10 :ホウ酸ナトリウム緩衝液）、 37°C で 30分放置後、 DNase活性を測定した。活性測定にはえ—Hindlll digestを基質 として用いた。 λ—Hindlll digest 1 g、各種緩衝液 37°Cで 30分放置後のサン プル 5 X 10_4OD分（OD600)、 10 X反応緩衝液 (400mM トリス—塩酸緩衝液 (p H7. 5)、 100mM 塩化ナトリウム、 60mM 塩化マグネシウム、 10mM 塩化カル シゥム） 5 1、これに nuclease free水を加えて、全量を 50 μ 1としたものを反応液 とした。 37°Cで 30分反応後、反応液の 10 1を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、 切断産物の解析を行なった。結果を図 7に示す。
図 7において、レーン Mはえ Hindlllマーカー、レーン 1は pH4、レーン 2は pH5 、レーン 3は pH6、レーン 4は pH7、レーン 5は pH7. 5、レーン 6は pH8、レーン 7は p H9、レーン 8は pHIOである。
その結果、レーン 1〜8において基質が切断されたことから、低温性微生物由来 D Naseは pH4〜10にお!/ヽて活性を保持して!/ヽた。
[0070] 実施例 2 コールドショック発現系を用いた低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの 発現検討
(1)発現ベクターの構築
上記実施例 1で構築した組み換えプラスミド pCold08— Endlの発現系よりも更に 工業的スケールでの製造に適した発現系の構築を試みた。
上記実施例 1 (1)で合成した合成プライマー 2に加え、新たに配列表の配列番号 7 記載の合成プライマー 3を DNA合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プ ライマー 3は、低温性微生物由来 DNaseのアミノ酸配列（配列表の配列番号 3)のァ ミノ酸番号 1〜7に相当する塩基配列をもち、さらに制限酵素 Ndelの認識配列を塩 基番号 4〜9にもつ合成 DNAである。
[0071] 上記合成プライマーを用いて、 PCRを行った。 PCRの反応条件を以下に示す。
すなわち、铸型 DNA(pCold08— Εη(11) 1 /ζ 1、 10 1の lO X Ex Taq Buffer ( タカラバィォ社製）、 8 /z lの dNTP混合液 (タカラバイオ社製）、 lOOpmolの合成ブラ イマ一 2、 lOOpmolの合成プライマー 3、 2. 5Uの TaKaRa Ex Taq (タカラバイオ 社製）を加え、滅菌水をカ卩えて全量を 100 μ 1とした。前記反応液を TaKaRa PCR Thermal Cycler SP (タカラバイオ社製）にセットし、 94°C 30秒、 58°C 30秒、 7 2°C 1分を 1サイクルとする 30サイクルの反応を行なった。
[0072] 反応終了後、該反応液 100 μ 1を 1. 0%ァガロースゲル電気泳動に供した。確認さ れた目的の約 0. 8kbpの DNAフラグメントを電気泳動ゲルより回収'精製し、ェタノ ール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収 DNAを 5 1の滅菌水に懸濁し、制 限酵素 Ndel (タカラバイオ社製)及び制限酵素 BamHI (タカラバイオ社製)で 2重消 化し、 1. 0%ァガロースゲル電気泳動によりその Ndel— BamHI消化物を抽出精製 し、 Ndel— BamHI消化 DNA断片を得た。
[0073] 次に、 pColdTFベクター（タカラバイオ社製）を上記 Ndel— BamHI消化 DNA断 片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素 Ndelおよび制限酵素 BamHIで切断し、 末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記 Ndel— BamHI消化 DNA断片と混合し 、 DNAライゲーシヨンキット (タカラバイオ社製)を用いて連結した。その後、ライゲー シヨン反応液 10 1を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その形質転換体を 1. 5% (w/v)濃度の寒天を含む LB培地（アンピシリン 100 μ gZml含む）上で生育させた
[0074] この組み換えプラスミドを pColdTF— Endlとした。この pColdTF— Endlは、低温 性微生物由来 DNaseのアミノ酸配列（配列表の配列番号 3)のアミノ酸番号 1〜254 のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列表の配列番号 4)を含むプラスミドである。 前記プラスミド力 発現させたタンパク質は、該アミノ酸配列の N末に Perfect DB配 列、 His タグ配列、 TFタグ配列、 HRV 3C配列、 Thrombin 配列、 Factor Xa 配列ならびにリンカ一を有して 、る。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列 番号 8に、当該ポリペプチドをコードする核酸の塩基配列を配列表の配列番号 9に示 す。
[0075] (2)形質転換体の調製
pColdTF— Endlを用いて、大腸菌 BL21を形質転換した。なお、形質転換は塩 化カルシウム法により行った。形質転換体は、 1. 5% (wZv)濃度の寒天を含む LB 培地 (アンピシリン 100 gZml含む）を用 V、てスクリ一ユングすることにより得た。
[0076] (3)低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの発現
上記（2)で得られた形質転換体を用いて、低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの 発現を調べた。対照としてインサートを導入して ヽな 、pColdTFベクターのみを用い て形質転換した大腸菌 BL21も同時に行った。培養には、 5mlの LB液体培地 (組成 : 1%バタトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 l%NaCl、 100 gZmlアンピシリン）を用 いて 37°Cで培養し、濁度が OD600 = 0. 8程度に達した時点で 15°C、 15分間培養 後、培養液に終濃度 ImMの IPTGをカ卩え、更に 15°Cで 24時間培養を行うことで発 現を誘導した。発現誘導を 24時間行ったのち、菌体を回収した。得られた菌体を PB Sに懸濁、超音波破砕し、細胞抽出液を調製、ついで 15, OOO X gの遠心分離により 可溶性画分と不溶性画分に分けた。
[0077] (4) pColdTF—Endlを導入した大腸菌の可溶性画分でのエンドヌクレアーゼ活性 の測定
上記（3)で調製した pColdTF— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分可溶性画 分について、エンドヌクレアーゼ活性を測定した。対照として pColdTFベクターのみ を導入した大腸菌より同様に調製した。活性測定は以下のようにして行った。
活性測定にはえ一 Hindlll digest (タカラバイオ社製)を基質として用いた。 λ— Hindlll digest ： L g、上記 pColdTF—Endlを導入した大腸菌の可溶性画分 0. 00625OD分（OD600)、 10 X反応緩衝液（400mM トリス—塩酸緩衝液（pH7. 5 )、 lOOmM 塩化ナトリウム、 60mM 塩化マグネシウム、 10mM 塩化カルシウム）
5 1、これに nuclease free水をカ卩えて、全量を 50 μ 1としたものを反応液とした。 3 7°Cで 30分反応後、反応液の 10 1を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、切断産 物の解析を行なった。結果を図 8に示す。
図 8において、レーン 1は可溶性画分無添加、レーン 2は pColdTFベクターのみを 導入した大腸菌の可溶性画分、レーン 3は pColdTF— Endlを導入した大腸菌の可 溶性画分である。
図 8に示したように、無添カ卩および pColdTFベクターのみを導入した大腸菌の可溶 性画分（レーン 1、 2)は、基質である λ -Hindlll digestを分解しないのに対し、 pC oldTF— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分 (レーン 3)は、基質を分解し、本発 明の低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの活性が確認された。
[0078] (5)低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの発現、精製および活性測定
上記（2)で得られた形質転換体を用いて、低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの 発現、精製および活性測定を行なった。 100mlの LB液体培地 (組成： 1%バクトトリ プトン、 0. 5%酵母エキス、 l%NaCl、 100 /z gZmlアンピシリン） 2本を用いて 37°C で濁度が OD600 = 0. 6程度に達する時点まで培養した。得られた培養液を 20Lの LB液体培地に植菌し、濁度が OD600 = 0. 6程度に達した時点で 15°C、 15分間培 養後、培養液に終濃度 ImMの IPTGをカ卩え、更に 15°Cで 24時間培養を行うことで 発現を誘導した。発現誘導を 24時間行ったのち、 36. 4gの湿菌体を回収した。得ら れた菌体を 360mlの 10mM トリスー塩酸緩衝液（pH7. 5)、 ImM PMSFに懸濁 後、超音波破砕し、遠心分離（18, OOOg, 20分）により 370mlの可溶性画分を得た
[0079] 上記可溶性画分 370mlを用いて精製を以下のように行なった。
すなわち、榭脂容積にして 100ml分の Q Sepharose Fast Flow (アマシャムバ ィォサイエンス社製）を φ 35mmのカラムに充填し、 500mlの 10mM トリス—塩酸 緩衝液 (PH7. 5)、 ImM PMSFで平衡化した。その後、上記可溶性画分 370mlを 供し、 300mlの同緩衝液、 300mM 塩化ナトリウムを含む同緩衝液で順次榭脂を 洗浄した後、 300mlの 1M 塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出した。得られたェ ンドヌクレアーゼ活性を含む溶出画分に 2Mになるように硫酸アンモ-ゥムを添加し た後、遠心分離（18, OOOg, 20分）により 330mlの上清を得た。得られた上清を、 3 00mlの 10mM トリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 2M 硫酸アンモ-ゥムで平衡化さ れた 30ml分（φ 16mmのカラム）の Phenyl Sepharose Fast Flow (アマシャム ノィォサイエンス社製）に供した。続いて 225mlの同緩衝液で洗浄を行い目的以外 の不要タンパク質の除去を行った。洗浄後、 10mM トリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5) 、 2M 硫酸アンモ-ゥムから 10mM トリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 0M 硫酸アン モ -ゥムへの濃度勾配溶出を行った（10ml/fr,合計 600ml)。各画分についてェ ンドヌクレアーゼ活性測定を行い、活性が認められた 90mlの fr. 28〜36を回収した 。次に、 5Lの 10mM トリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5)に対して 2回透析を行ない、 Viv aspin(VIVASCIENCE社製）を用いて濃縮を行ない、 5. 5mlのタンパク質サンプ ルを得た。
[0080] その一部について 5— 20%SDSポリアクリルアミド電気泳動に供し、活性が認めら れた fr. 28〜36画分を透析、濃縮したタンパク質サンプルの分子量を調べた。結果 を図 9に示す。
図 9【こお!/、て、レーン Miま分子量マーカー 97, 66、 45、 31、 21、 14KDa、レー ン 1は活性が認められた fr. 28〜36画分を透析、濃縮したタンパク質サンプルである その結果、分子量 25KDa付近に主なタンパク質のバンドが確認された。 25KDa付 近のタンパク質のバンドにっ 、て N末端アミノ酸配列解析を 10残基行った。その結 果、配列表の配列番号 3のアミノ酸番号 36〜45のアミノ酸配列に一致したこと力 活 性タンパク質はタグ配列および目的タンパク質の N末領域の一部が欠落していること が分力つた。当該活性タンパク質のアミノ酸配列は、 MALDI— TOF MS測定法に よって平均質量を測定し、その結果力も決定した。当該活性タンパク質のアミノ酸配 列を配列表の配列番号 10に、当該ポリペプチドをコードする核酸の塩基配列を配列 表の配列番号 11に示す。
[0081] この活性タンパク質を以下の活性確認に使用した。
定量的な活性測定にはサケ精巣由来 DNA (和光純薬社製)を基質として用いた。 基質溶液 (40 /ζ 8Ζπι1、 lOOmM トリス—塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 5mM 塩化マグ ネシゥム） 500 μ 1、これに上記調製したタンパク質サンプル 100 μ 1を加えたものを反 応液とした。 37°Cにおいて 260nmの吸光度を 1分間に 0. 001増加させる酵素量を 1Uとした。その結果、得られたエンドヌクレア一ゼの総活性は 79万 Uであった。
[0082] 実施例 3 低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの性質検討
(1)低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの低温での反応性
上記実施例 2 (5)で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドにつ！/、て 、低温でのエンドヌクレアーゼ活性を調べた。対照としてノバジェン社製の Benzonas e (登録商標） Nucleaseを用い、活性測定にはサケ精巣由来 DNA (和光純薬社製 )を基質として用いた。基質溶液 (40 μ g/mU lOOmM トリス一塩酸緩衝液 (pH7 . 5)、 5mM 塩化マグネシウム） 500 μ 1、これに上記実施例 2 (5)で調製したエンド ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド含有溶液（2. 3U、 10mM トリス—塩酸緩衝 液 (pH7. 5)、 10mM 塩化マグネシウム） 100 1を加えたものを反応液とした。活 性測定は、 0、 5、 10、 15、 20°Cの各種温度において、 10分間反応後の 260nmの 吸光度の増加量を測定して行った。 Benzonaseにつ 、ても上記組成の反応液を用 いて同様に活性測定した。結果を図 10に示す。
図 10において、四角（國）は上記実施例 2 (5)で調製したエンドヌクレアーゼ活性を 有するポリペプチド、三角（▲)は Benzonaseである。
図 10に示したように、 20°Cでの活性を 100として相対活性（％)を計算し比較すると 、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは 0〜10°Cでの相対活性が 30〜70%程度であるのに対して、 Benzonase Nucleaseは、 0〜10°Cでの相対活 性が 0〜20%程度まで著しく低下した。従って、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を 有するポリペプチドは、市販の Benzonase Nucleaseと比較して、低温において、 特に 0〜 10°Cにお 、て、高 、エンドヌクレアーゼ活性を保持して 、た。
(2)低温性微生物由来エンドヌクレア一ゼの基質特異性
上記実施例 2 (5)で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドにつ！/、て 、種々の基質を用いた場合の活性を測定した。基質として λ -Hindlll digest以外 に、 DNA (タカラバイオ社製）、 pUC119 (タカラバィォ社製）、 M13 mpl8 Sin gle Strand DNA (タカラバイオ社製）、 16Sおよび 23S rRNA (ロシュ社製）を検 討に用いた。基質 1 g、上記実施例 2 (5)で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有 するポリペプチド 1U, 0. 1U, 0. 01Uまたは 0. 001U、 10 X反応緩衝液（400mM トリス—塩酸緩衝液（pH7. 5)、 100mM 塩化ナトリウム、 60mM 塩化マグネシゥ ム、 10mM 塩化カルシウム） 5 1、これに nuclease free水をカ卩えて、全量を 50 μ 1 としたものを反応液とした。 37°Cで 30分反応後、反応液の 10 1を 1%ァガロースゲ ル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図 11に示す。
図 11において、基質として、レーン 1から 5はえ Hindlll digest,レーン 6から 10 ίまえ DNA、レーン 11力ら 15ίま pUC119、レーン 16力ら 20ίま M13 mpl8 Single
Strand DNA、そしてレーン 21から 25は 16Sおよび 23S rRNAをそれぞれ用い た。また、レーン 1、 6、 11、 16、 21は酵素無添加、レーン 2、 7、 12、 17、 22は 0. 00 1U分、レーン 3、 8、 13、 18、 23«0. 01U分、レーン 4、 9、 14、 19、 24 «0. 1U分 、レーン 5、 10、 15、 20、 25は 1U分の本発明の低温性微生物由来エンドヌクレア一 ゼを用いた場合である。 図 11に示したように、本発明のエンドヌクレアーゼは、線状二本鎖 DNA ( DNA、 48. 5kbp)、環状二本鎖 DNA (pUC119、 3. 2kbp) , ^ ^:^DNA (M13 mpl8
Single Strand DNA, 7. 2kbp；)、 RNA(16Sおよび 23S rRNA)のいずれの 基質も分解することが確認できた。また、本発明のエンドヌクレア一ゼの基質分解効 率は、長鎖線状二本鎖 DNA =短鎖線状二本鎖 DNA >環状二本鎖 DNA >—本 鎖 DNA RNAの順に低くなつて!/、た。
[0084] (3)低温性微生物由来エンドヌクレア一ゼの至適 pH
上記実施例 2 (3)で調製した pColdTF— Endlを導入した大腸菌の可溶性画分に ついて、至適 pHを調べた。
活性測定にはえ— Hindlll digestを基質として用いた。緩衝液は、 pH4、 5 :酢酸 ナトリウム緩衝液、 ρΗ6、 7 :リン酸ナトリウム緩衝液、 pH7. 5、 8 :トリス—塩酸緩衝液 、 pH9、 10 :ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いて検討した。
λ -Hindlll digest ： L g、上記実施例 2 (3)で調製したpColdTF—Endlを導 入した大腸菌の可溶性画分 7 X 10_4OD分 (OD600)、 10 X反応緩衝液 (400mM 上記緩衝液、 lOOmM 塩化ナトリウム、 1M 塩化マグネシウム、 10mM 塩化力 ルシゥム） 5 1、これに nuclease free水を加えて、全量を 50 μ 1としたものを反応 液とした。 ρΗ4〜10の各種 pHにおいて、 37°Cで 30分反応後、反応液の 10 1を 1 %ァガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった。結果を図 12に示す 図 12において、レーン Mはえ Hindlllマーカー、レーン 1は pH4、レーン 2は pH 5、レーン 3ίま pH6、レーン 4ίま pH7、レーン 5ίま pH7. 5、レーン 6ίま pH8、レーン 7ίま ρΗ9、レーン 8は ρΗΙΟである。
その結果、レーン 3〜8において基質が切断されたこと力 本発明のエンドヌクレア ーゼ活性を有するポリペプチドの至適 pHは 6〜 10であった。
[0085] (4)低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの種々添加剤の影響
上記実施例 2 (5)で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドにつ！/、て 、種々添加剤の影響を調べた。活性測定にはサケ精巣由来 DNA (和光純薬社製） を基質として用いた。基質溶液 (40 g/ml、 lOOmM トリス一塩酸緩衝液 (PH 7. 5)、 lOOmM 塩化マグネシウム（マグネシウムイオンの影響検討時は除く）） 500 1 、これに上記実施例 2 (5)で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド 0 . 25Uを含む 100 1をカ卩えたものを反応液とした。 37°Cにおいて 260nmの吸光度 の増加量を測定し、種々添加剤の影響を調べた。
[0086] 1.マグネシウムイオンの影響
上記反応液糸且成に最終濃度力 s0、 0. 8、 1. Ί 4. 2、 5、 10、 20、 40、 80、 100, 1 20, 140, 160mMとなるように塩化マグネシウムを添カ卩し、マグネシウムイオン濃度 の影響を調べた。結果を図 13— 1に示す。
図 13— 1において、塩化マグネシウムの最終濃度が lOOmMのときの活性を 100と し した o
図 13— 1より、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの至適マグネ シゥムイオン濃度は 60〜 120mMであった。
[0087] 2.ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンの影響
上記反応液糸且成に最終濃度力 0、 8、 17、 42、 83、 167、 333mMとなるようにそれ ぞれ塩化ナトリウム、塩ィ匕カリウムあるいは塩ィ匕カルシウムを添加し、各イオン濃度の 影響を調べた。結果を図 13— 2に示す。
図 13— 2において、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、塩化カルシウムの最終濃度が 0 mMのときの活性を 100として表示した。また、四角（國）は塩ィ匕ナトリウム、丸（參）は 塩ィ匕カリウム、三角（▲)は塩ィ匕カルシウムである。
図 13— 2より、ナトリウムイオンおよびカリウムイオン濃度は 167mMまで、カノレシゥ ムイオン濃度は 42mMまで高 、活性であった。
[0088] 3.還元剤の影響
上記反応液糸且成に最終濃度力 0、 8、 17、 42、 83、 167、 333mMとなるようにジチ オスレィトールあるいは 2—メルカプトエタノールを添カ卩し、各還元剤の影響を調べた 。結果を図 13— 3に示す。
図 13— 3において、ジチオスレィトール、 2—メルカプトエタノールの最終濃度が Om Mのときの活性を 100として表示した。また、四角（國）はジチオスレィトール、三角（ ▲)は 2—メルカプトエタノールである。 図 13— 3より、ジチオスレィトール濃度は 167mMまで、 2—メルカプトエタノール濃 度は 333mMまで高 、活性であった。
[0089] 4. リン酸カリウム、硫酸アンモ-ゥムの影響
上記反応液糸且成に最終濃度力 0、 4、 8、 17、 42、 83、 167、 333mMとなるようにリ ン酸カリウムあるいは硫酸アンモ-ゥムを添加し、各添加剤の影響を調べた。結果を 図 13— 4に示す。
図 13— 4において、リン酸カリウム、硫酸アンモ-ゥムの最終濃度が OmMのときの 活性を 100として表示した。また、四角（國）はリン酸カリウム、三角（▲)は硫酸アンモ ニゥムである。
図 13— 4より、リン酸カリウム濃度は 4mMでも低い活性となり、本発明のエンドヌク レアーゼ活性を有するポリペプチドの反応緩衝液としてはリン酸緩衝液は不向きであ ることがわかった。硫酸アンモ-ゥム濃度は 83mMまで高 、活性であった。
[0090] (5)低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの低温で大腸菌力もタンパク質抽出する 際の粘性の低減効果
上記実施例 2 (5)で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを、タン パク質抽出用試薬キット、 TALON xTractor Buffer Kit (クロンテック社製）を用 いて抽出を行う際に、 DNaselの代わりに添カ卩し、粘性の低減を検討した。 TALON xTractor Buffer Kitのプロトコールに準じて行った。酵母の AIP2遺伝子（Gen Bank Acc. No. ： U35667)を pColdTFベクターに挿入し発現させた大腸菌 BL 21湿菌体 6. 4mgに、 TALON xTractor Buffer 128 1、 Lysozyme (50 X ) 1 . 28 1、さら【こそれぞれ 3通りの量（0. 256U, 2. 56U、 25. 6U)の DNaselまた【ま 本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを添カ卩し、 30°Cまたは氷上で 30分間反応させた。
[0091] 反応液の 10 μ 1を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析を行なった 。結果を図 14に示す。
また、 1 %ァガロースゲル電気泳動に使用した残りの抽出処理液にサンプル緩衝液 を加えて煮沸後、抽出処理液 4 湘当分をそれぞれ SDS— PAGEに供した。結果 を図 15に示す。 図 14において、レーン 1から 7は 30°Cで反応させたもの、レーン 8から 14は氷上で 反応させたもので、電気泳動画像でバンドが確認されないレーンは、粘性のためピ ペッティングできず適切にアプライできなかったものを示し、レーン Mはえ— Hindlll マーカー、レーン 1、 8は酵素無添加、レーン 2、 9は DNasel 0. 256U、レーン 3、 1 0は DNasel 2.56U、レーン 4、 11は DNasel 25. 6U、レーン 5、 12は本発明の エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド 0. 256U、レーン 6、 13は本発明のェ ンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド 2.56U、レーン 7、 14は本発明のエンド ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド 25. 6Uを用いた場合である。
図 14より、氷上で処理した場合、 DNaselは 2. 56Uの使用でもピペッティングが困 難なほどの粘性が残り、適切にアプライできな力つた（レーン 10)のに対し、本発明の エンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドでは 2. 56Uでゲノム DNAの分解によ る粘性の低減が確認された (レーン 13)。
図 15において、レーン 1から 7は 30°Cで反応させたもの、レーン 8から 14は氷上で 反応させたもので、電気泳動画像でバンドが確認されないレーンは、粘性のためピ ペッティングできず適切にアプライできなかったものを示し、レーン Mは分子量マーカ 一 97, 66、 45、 31、 21、 14KDa、レーン 1、 8は酵素無添加、レーン 2、 9は DNas el 0. 256U、レーン 3、 10は DNasel 2.56U、レーン 4、 11は DNasel 25. 6U、 レーン 5、 12は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド 0. 256U、レ ーン 6、 13は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド 2.56U、レーン 7、 14は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド 25. 6Uを用いた場 合である。
図 15より、氷上で処理した場合、 DNaselは 0. 256U使用したとき、ピペッティング が困難なほどの粘性が残り、適切にアプライできな力つた (レーン 9)。それに対し、本 発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは 0. 256U使用で適切にァプラ ィでき（レーン 12)、ゲノム DNAの分解による粘性の低減が DNaselより 1オーダー低 い添加量で確認できた。
以上のことから、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、氷上処 理によりメインバンドとして観察できる目的タンパク質に影響を与えずに粘性を下げる ことができることを確認した。
[0092] (6)低温性微生物由来エンドヌクレアーゼの大腸菌超音波破砕上清中のゲノム DN Aの分解
上記実施例 2 (5)で調製したエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドまたは D Nasel (タカラバイオ社製)を大腸菌超音波破砕上清に添加し、残存する大腸菌由来 ゲノムの量を比較した。
酵母の AIP2遺伝子を pColdTFベクターに挿入し発現させた大腸菌 BL21菌体に 10mM トリス—塩酸緩衝液（pH7. 5)、 10mM 塩化マグネシウムを添カ卩し（lg湿 菌体当たり 5mlの緩衝液）、破砕上清を同緩衝液で 50倍希釈した。希釈上清 50 1 に DNaselまたは本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをそれぞれ 3通りの量（0. 1U、 1U、 10U)を添カ卩し、 30°Cまたは氷上で反応させた。 30分およ び 2時間後の反応液 10 1を 1%ァガロースゲル電気泳動に供し、切断産物の解析 を行なった。 30分反応後の結果を図 16に、 2時間反応後の結果を図 17に示す。 図 16および図 17において、レーン 1から 7は 30°Cで反応させたもの、レーン 8力 1 4は氷上で反応させたもので、レーン Mはえ—Hindlllマーカー、レーン 1、 8は酵素 無添加、レーン 2、 9は DNasel 0. 1U、レーン 3、 10は DNasel 1U、レーン 4、 11 は DNasel 10U、レーン 5、 12は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリぺプ チド 0. 1U、レーン 6、 13は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド
1U、レーン 7、 14は本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド 10U を用いた場合である。
図 16および図 17において、氷上で反応させた場合、 DNasel (レーン 10、 11)と本 発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド（レーン 13、 14)を比較すると、 本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの方がゲノム DNAの分解が 良好に進行することが確認された。
以上のことから、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、低温反 応で、 目的タンパク質に影響を与えずに DNAを分解できることを確認した。
産業上の利用可能性
[0093] 本発明により、 PCRのコンタミ除去、 RT—PCRのゲノム除去、タンパク質溶液中の 核酸の除去やタンパク質抽出液の粘性の低減などに有用な、エンドヌクレアーゼ活 性を有するポリペプチドならびに該ポリペプチドをコードする遺伝子が提供される。 配列表フリーテキスト
SEQ ID NO:l; A sequence of designed oligonucleotide Pし R primer for amplifying a gene of encoding DNase. nucleotide 4 to 9 is EcoRI restriction site.
SEQ ID NO:2; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying a gene of encoding DNase. nucleotide 4 to 9 is BamHI restriction site."
SEQ ID NO:5; A sequence of artificial protein comprising Perfect DB sequence, Hi s Tag sequence, Factor Xa sequence and linker, and DNase.
SEQ ID NO:6; A sequence of a gene encoding an artificial protein comprising Perfe ct DB sequence, His Tag sequence, Factor Xa sequence and linker, and DNase. SEQ ID NO:7; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying a gene of encoding DNase. nucleotide 4 to 9 is Ndel restriction site."
SEQ ID NO:8; A sequence of artificial protein comprising Perfect DB sequence, Hi s Tag sequence, Trigger Factor sequence, HRV 3C sequence, Thrombin sequence, Factor Xa sequence and linker, and endonuclease.
SEQ ID NO:9; A sequence of a gene encoding an artificial protein comprising Perfe ct DB sequence, His Tag sequence, Trigger Factor sequence, HRV 3C sequence, T hrombin sequence, Factor Xa sequence and linker, and endonuclease.

Claims

請求の範囲
[1] 下記 (a)〜（e)力もなる群より選択されるポリペプチドであって、かつエンドヌクァレ ーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチド：
(a)配列表の配列番号 10記載のアミノ酸配列またはその一部を有するポリペプチド
(b)配列表の配列番号 10記載のアミノ酸配列またはその一部を有するアミノ酸配 列において、 1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたポリ ペプチド；
(c)配列表の配列番号 10記載のアミノ酸配列と少なくとも 60%の配列相同性を有 するポリペプチド；
(d)配列表の配列番号 11記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有す るポリペプチド；および
(e)配列表の配列番号 11記載の塩基配列の相補鎖にストリンジ ントな条件下に おいてハイブリダィズ可能な塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリ ペプチド。
[2] 少なくとも下記 (a)、 (b)の理化学的性質を有することを特徴とする請求項 1記載の ポリペプチド：
(a)基質特異性:線状二本鎖 DNA、環状二本鎖 DNA、一本鎖 DNA、 RNAに作 用する；
(b)低温での反応性: 0〜10°Cでの活性が 20°Cでの活性の 30%以上を保持する；
[3] 下記 (a)〜 (h)力もなる群より選択される核酸であって、かつエンドヌクレアーゼ活 性を有することを特徴とするポリペプチドをコードする核酸：
(a)配列表の配列番号 10記載のアミノ酸配列またはその一部を有するアミノ酸配列 をコードする核酸；
(b)配列表の配列番号 10記載のアミノ酸配列またはその一部を有するアミノ酸配 列において、 1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたアミ ノ酸配列をコードする核酸；
(c)配列表の配列番号 10記載のアミノ酸配列と少なくとも 60%の配列相同性を有 するアミノ酸配列をコードする核酸；
(d)配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する核酸またはその一部を有する 核酸；
(e)配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する核酸またはその一部を有する 核酸において、 1もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入あるいは付加された核酸
(f)前記 (a)〜 (e) V、ずれか記載の核酸またはその相補鎖とストリンジ ントな条件 下にお ヽてハイブリダィズし得る核酸；
(g)前記 (a)〜 (f) V、ずれか記載の核酸と縮重を介して異なる塩基配列を有する核 酸；および
(h)前記 (a)〜 (g) V、ずれか記載の核酸の塩基配列と少なくとも 60%の配列相同 性を有する塩基配列を有する核酸。
[4] 請求項 3記載の核酸を含んでなる、組換え DNA。
[5] 請求項 3記載の核酸を保持してなる、形質転換体。
[6] 請求項 5記載の形質転換体を培養する工程、およびエンドヌクレアーゼ活性を有す るポリペプチドを培養物中から回収する工程を包含することを特徴とする、エンドヌク レアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
[7] 請求項 1記載のポリペプチドを用いて核酸を分解する工程を包含する核酸の分解 方法。
[8] 請求項 1記載のポリペプチドを用いてタンパク質抽出液を処理する工程を包含する タンパク質抽出液の粘性の低減方法。
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