WO2006093115A1 - ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の測定法 - Google Patents

ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の測定法 Download PDF

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Kazuki Sakamoto
Yoshikazu Sugimoto
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Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • G01N2333/91142—Pentosyltransferases (2.4.2)

Definitions

  • the present invention relates to a novel antibody against human orthophosphate phosphoribosyltransferase and a method for measuring human orthophosphate phosphoribosyltransferase protein using the antibody.
  • Orotate phosphoribosyl transferase (EC2. 4. 2. 10, hereinafter referred to as “OPRT”) catalyzes the reaction to produce uridyl monophosphate (UM P) from orotate It is an enzyme that plays a role in supplying pyrimidine nucleotides essential for nucleic acid synthesis, and is one of the main rate-limiting enzymes in the nucleic acid precursor supply pathway. Therefore, it is known that its activity is high in tumor tissue and gastrointestinal epithelium where cell proliferation is active.
  • 5-fluorouracil anticancer agents are activated using OPRT as a rate-determining enzyme and exert an antitumor effect, so that the effect is significant for patients with large amounts of OPRT in tumor cells. It is known that the effect of prolonging life is observed, but the effect is small for patients with a small amount of OPRT (see Non-Patent Document 1). Therefore, for example, when treating tumor patients, measuring the amount of OPRT in the excised tumor in advance is an important indicator, such as determining the treatment method and selecting an anticancer drug to be administered. .
  • Non-Patent Document 1 Br. J. Cancer., 2003, Oct, 20; 89 (8): 1486-92.
  • an object of the present invention is to provide a simple and accurate method for measuring human OPRT.
  • the present inventor has prepared polyclonal antibodies against human OPRT as a whole and antibodies against various oligopeptides in the amino acid sequence of human OPRT, and designed and studied a measurement system combining these antibodies.
  • an antibody that recognizes an epitope present in the region of the 86th to 108th amino acids from the N-terminus of human OPRT and an epitope present in the region of the 454th to 474th amino acids from the N-terminus of human OPRT The human OPRT immunoassay system combined with the recognizing antibody was found to be able to easily and accurately measure human OPRT protein, which is significantly more sensitive than other antibody-based measurement systems. Made.
  • the present invention provides an anti-human OPRT antibody that recognizes an epitope present in the 86th to 108th amino acid region from the N-terminus of human OPRT.
  • the present invention also provides an anti-human OPRT antibody that recognizes an epitope present in the region of the N-terminal force amino acids 454 to 474 of human OPRT.
  • the present invention also relates to an anti-human OPRT antibody that recognizes an epitope present in the region of the 86th to 108th amino acids from the N-terminus of human OPRT, and the region of the 454th to 474th amino acids from the N-terminus of human OPRT.
  • a human OPRT protein measurement kit comprising an anti-human OPRT antibody that recognizes an epitope present in the present invention.
  • the present invention relates to an anti-human OPRT antibody that recognizes an epitope present in the region of the 86th to 108th amino acids from the N-terminus of human OPRT, and to the region of the 454th to 474th amino acids from the N-terminus of human OPRT.
  • the present invention provides a method for measuring human OPRT protein, which is used in combination with an anti-OPRT antibody that recognizes existing epitopes.
  • the invention's effect [0008] According to the method of the present invention, an anti-OPRT that recognizes an epitope present in the region of the amino acids from the 428th to 446th N-terminal forces of human OPR T when an antibody using whole human OPRT as an antigen is used. Compared with antibodies, human OPRT protein can be quantified easily and accurately. Furthermore, by quantifying the human OPRT protein in the specimen using the measurement method of the present invention, it is possible to determine whether cancer can be diagnosed, the therapeutic method can be selected simply by predicting the therapeutic effect, and whether or not a pile cancer drug can be administered.
  • FIG. 1 shows the results of Western blotting of anti-OPRT antibody.
  • FIG. 2 is a view showing the results of a sandwich ELISA using a combination of anti-OPRT-A antibody, anti-OPRT-B antibody and anti-OPRT-C antibody.
  • A—B Anti-OPRT—A antibody immobilized—anti-OPRT—B antibody detected.
  • B—A Anti-OPRT—B antibody immobilized—anti-OPRT—A antibody detected.
  • B—C Anti-OPRT—B antibody immobilized—anti-OPRT—C antibody detected.
  • C B Anti-OPRT—C antibody immobilized—anti-OPRT—B antibody detected.
  • FIG. 3 shows a calibration curve of an ELISA system using an anti-OPRT-C antibody as a fixed antibody and an anti-OPRT-A antibody as a detection antibody.
  • Antigens of anti-human OPRT antibodies that recognize epitopes present in the region of the 86th to 108th amino acids from the N-terminus of the human OPRT protein that are useful in the present invention include 86 from the N-terminus of the human OPRT protein. It is possible to use a synthetic peptide having an amino acid sequence containing the 80th to 108th amino acid sequence, or an amino acid sequence containing 80% or more of this amino acid sequence. Hereinafter, an antibody obtained using this antigen is referred to as an anti-OPRT-A antibody.
  • Anti-human OPRT antibody that recognizes an epitope present in the region from the 454th to 474th amino acids from the N-terminal of the human OPRT protein which is useful in the present invention, includes an N-terminal force of the human OPR T protein at the 454th position.
  • a synthetic peptide having an amino acid sequence of ⁇ 474th amino acid sequence or an amino acid sequence containing 80% or more of this amino acid sequence can be used.
  • an antibody obtained using this antigen is referred to as an anti-OPRT-C antibody.
  • Freu Adjuvants such as nd (Freund) adjuvant can be used in combination with antigens, and carriers such as ushisiloglobulin, BS A (Bovine Serum Albumin), and KLH (Keyho limpet hemocyanine: keyhole limpet hemocyanin) Can be used by binding to an antigen.
  • the anti-human OPRT antibody according to the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody that recognizes the epitope present in the region of the amino acid sequence.
  • an anti-human OPRT polyclonal antibody When an anti-human OPRT polyclonal antibody is produced using the above antigen, it can be produced as follows.
  • Antiserum containing anti-human OPRT polyclonal antibody can be obtained by immunizing various animals such as rabbits, rats, mice, goats and the like with the above antigens and collecting them according to a conventional method.
  • rabbits are immunized at a rate of twice every 3 weeks using the above-mentioned synthetic peptide conjugated with KLH as an antigen.
  • Antiserum strength To purify anti-OPRT antibodies, conventional methods for antibody purification, affinity chromatography, ammonium sulfate salting out, ion-exchange column chromatography, molecular sieve column chromatography (gel filtration), protein A Column chromatography etc. may be performed. In addition, these purification means may be combined or repeated for the purpose of increasing the purity of the antibody.
  • an anti-human OPRT monoclonal antibody using the above-mentioned antigen it can be obtained by producing a hyperidoma that produces an anti-human OPRT monoclonal antibody as follows.
  • the above-mentioned iridoma for example, immunizes mammals or birds such as mice and rats with the above-mentioned antigens, and spleen cells and myeloma cells (myeloma cells) of mammals such as mice and rats are combined with those of Koler and Milstein. It can be obtained by cell fusion according to the basic method [Nature, 256, 495 (1975)] and culturing in a selection medium.
  • the immunization method is, for example, by dissolving the prepared antigen in a phosphate buffer, physiological saline, etc., and mixing with an adjuvant if necessary, and then in the animal's subcutaneous, intraspleen, abdominal cavity, vein, etc. for 1 to 3 weeks. It is performed by administering several times until the antibody titer sufficiently rises every time.
  • myeloma cells used for cell fusion include mouse P3-NS-lZlAg4.1, P3-X63-Ag.653, Sp2Z0Agl4, rat YB2Z0, and the like.
  • Bone marrow cells used for cell fusion are 8-azaguanine resistant strains and lack the hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase necessary for the salvage pathway of nucleotide biosynthesis, so in HAT medium (medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine) Then you cannot synthesize nucleotides and cannot survive. Therefore, after cell fusion, by culturing in HAT medium for 1 to 2 weeks, only splenocytes and myeloma fused with splenocytes can be selected.
  • the thus obtained anti-human OPRT antibody of the present invention is useful for immunological measurement of human OPRT protein.
  • sandwich ELISA method radioimmunoassay by competitive method, and enzyme immunoassay. It can also be applied to the immunochromatography method. Of these, sandwich ELISA is particularly preferred.
  • the human OPRT protein measurement kit of the present invention contains an anti-OPRT-A antibody and an anti-OPRT-C antibody. To perform sandwich ELISA using these two antibodies, one anti-OPRT antibody is immobilized on a support (solid phase antibody), and the other anti-OPRT antibody is labeled antibody (detection antibody). And A preferred combination is when anti-OPRT-C antibody is used as an immobilized antibody and anti-OPRT-A antibody is used as a detection antibody.
  • immunoassay is performed by immobilizing one anti-OPRT antibody on a support such as an ELISA plate, then reacting the specimen, and further reacting with a labeled anti-OPRT antibody. Wash and measure the amount of label that produced a sandwich immune reaction.
  • the subject used in the present invention may be human tissue or body fluid in which OPRT can exist, such as tumor tissue, gastrointestinal tissue, blood, lymph, etc., and tumor tissue is particularly preferable. .
  • the support used in the present invention includes, for example, insoluble polysaccharides such as agarose and cellulose, silicone resin, polystyrene resin, polyacrylamide resin, nylon resin, and synthetic resin such as polycarbonate resin. Or an insoluble support such as glass. I can make it.
  • These supports can be used in the form of beads or plates. In the case of beads, a column packed with these can be used. In the case of plates, multiwell plates (96-well multiwell plates, etc.), biosensor chips, etc. can be used.
  • the binding between the anti-OPRT antibody and the support can be performed by a commonly used method such as chemical bonding or physical adsorption. These supports can be commercially available.
  • the reaction between the anti-OPRT antibody and the analyte is usually performed in a buffer solution.
  • a buffer solution for example, phosphate buffer solution, Tris buffer solution, citrate buffer solution, borate buffer solution, carbonate buffer solution and the like are used.
  • incubation conditions for example, incubation is performed at 4 ° C to room temperature for 1 hour to 24 hours. Washing after incubation, whatever Yogu example as long as it does not interfere with the binding of human OPRT protein and anti-OPRT antibody in the subject, a buffer containing a surfactant such as T W een20 like are used.
  • a control sample may be installed in addition to the subject for which human OPRT protein is to be detected.
  • the control sample include a negative control sample containing no human OPRT protein and a positive control sample containing human OPRT protein.
  • the human OPRT protein in the sample can be detected by comparing the result obtained with the negative control sample containing no human OPRT protein and the result obtained with the positive control sample containing human OPRT protein. Is possible.
  • a series of control samples with varying concentrations are prepared, detection results for each control sample are obtained as numerical values, a standard curve is created, and the numerical force of the subject is also applied to the subject based on the standard curve. It is also possible to detect the human OPRT protein contained quantitatively.
  • Labeling of the anti-OPRT antibody can be performed by a generally known method.
  • labeling substances known to those skilled in the art such as fluorescent dyes, enzymes, coenzymes, chemiluminescent substances, radioactive substances, etc. can be used. Specific examples include radioisotopes (32P, 14C).
  • one anti-OPRT antibody-containing solution is placed on a support such as a plate, and the anti-OPRT antibody is fixed to the support. After washing the plate, block with BSA, gelatin, albumin, etc. to prevent non-specific binding of proteins. Wash again and place the specimen on the plate. After incubation, wash and cover the other labeled anti-OPRT antibody. After moderate incubation, the plate is washed and the labeled anti-OPRT antibody remaining on the plate is detected. Detection can be performed by methods known to those skilled in the art. For example, in the case of labeling with a radioactive substance, it can be detected by liquid scintillation or RIA.
  • a substrate is added, and enzymatic changes of the substrate, for example, color development, can be detected with an absorptiometer.
  • the substrate include 2, 2-aminozinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), orthophenol-diamine, 3, 3 ', 5, 5, One tetramethylbenzidine (TME) can be mentioned.
  • TME tetramethylbenzidine
  • a fluorescent substance it can be detected by a fluorometer.
  • recombinant human OPRT obtained by culturing Escherichia coli was used.
  • the manufacturing method is as follows. E. coli BL21 into which full-length cDNA of human OPRT was cloned by PCR and a plasmid prepared to express a fusion protein of glutathione S transferase (GST) and rhOPRT was introduced in the presence of 100 gZmL ampicillin. Shake culture overnight at 37 ° C in LB medium (Wako Pure Chemical Industries) It was. 10 mL of the culture was transferred to an Erlenmeyer flask containing 1 L of LB medium, and further cultured at 37 ° C for 4 hours.
  • GST glutathione S transferase
  • the cells were suspended in lOOmL of collection buffer (50 mM Tris, 8 M Urea, ImM PMSF, 5 mM EDTA, 5 mM DTT pH 7.4), and then gently stirred at 4 ° C for 30 minutes. The suspension was sonicated at 4 ° C and then centrifuged at 15000xg and 4 ° C for 30 minutes.
  • collection buffer 50 mM Tris, 8 M Urea, ImM PMSF, 5 mM EDTA, 5 mM DTT pH 7.4
  • the concentration of urea in the supernatant is gradually reduced to 1 M by dialysis, refolded, passed through a column filled with 2 mL of glutathione (GSH) -Sepharose (Sigma), and the washing solution (20 mM) Washed with Tris, 1M Urea, 5 mM EDTA pH7.4) lOmL.
  • GST-rhOPRT was eluted with an elution buffer (50 mM GSH, 50 mM Tris, pH 9.6) to obtain a rhOPRT solution.
  • the whole blood of the immunized rabbit was collected and centrifuged at 1500 xg for 5 minutes at 4 ° C to separate the serum.
  • 20 mL of the obtained antiserum was diluted twice with PBS (—) to make 40 mL.
  • This antiserum dilution is added to the GST protein-immobilized column to adsorb the GST-reactive antibody, and then the solution is passed through the protein A-immobilized column to bind the antibody (IgG).
  • PBS (—) was used to wash well until the absorbance at 280 nm disappeared. Thereafter, 0.2M Glycine-HCI pH2.5 was passed through the column to elute the antibody adsorbed to the antigen.
  • 1M Tris was added in advance to the test tube receiving the eluted antibody to prevent the recovered antibody from being altered.
  • the obtained antibody fraction was dialyzed overnight at 4 ° C with PBS (-) to obtain a purified antibody.
  • Anti-OPRT polyclonal antibody was obtained by the following operation.
  • Peptide having the amino acid sequence of 86th to 108th from the N-terminal of human OPRT, N-terminal force of human O PRT, peptide having the 428th to 446th amino acid sequence, and 454th to 474th from the N-terminal of human O PRT A peptide having the following amino acid sequence was synthesized to obtain an artificial peptide having the following peptide sequence.
  • a peptide having an amino acid sequence of 86th to 108th from the N-terminus of human OPRT (antigen Name: OPRT A)
  • Peptide KLH conjugates were made for each peptide using 4 mg of the artificial peptide obtained above and 2 mg of maleimide activated KLH (Pierce).
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • the whole blood of the immunized rabbit was collected and centrifuged at 1600xg for 5 minutes at 4 ° C to separate the serum.
  • 20 mL of the obtained antiserum was diluted twice with PBS (—) to make 40 mL.
  • This antiserum diluted solution was added to the antigen peptide column, the antibody (IgG) was bound thereto, and washed well with PBS ( ⁇ ) until the absorbance at 280 nm disappeared. Thereafter, 0.2M Glycine-HC1 pH2.5 was passed through the column to elute the antibody adsorbed to the antigen. At this time, in order to neutralize the pH, 1M Tris was added in advance to the test tube receiving the eluted antibody to prevent the recovered antibody from being altered. The antibody fraction obtained was dialyzed overnight at 4 ° C against PBS (-) to obtain purified antibody. It was.
  • Human lung cancer cell line LC-11 cell homogenate protein concentration 20mgZmL
  • sample preparation solution for electrophoresis 4% SDS, 10% beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 125 mM Tris, pH 6.8
  • SDS sample preparation solution for electrophoresis
  • the sample was electrophoresed with 10% polyacrylamide, transferred electrically to a PVDF filter, and then immersed in Block Ace (blocking agent, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) for blocking.
  • Block Ace blocking agent, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Each polyclonal antibody prepared to 1.2 gZmL in 20 mM PBS (—) is used as the primary antibody for 1 hour of reaction, and 20 mM Tris pH 7.0 containing 500 mM sodium chloride and 0.5% Tween 20 is used.
  • alkaline phosphatase-labeled dextran polymer-conjugated anti-usagi polyclonal antibody (Dako Cytomation) was used as a secondary antibody and reacted for 1 hour.
  • the filter was washed with a washing solution, and an enzyme reaction was performed using a chemiluminescent reagent (CDP-star, Tropix).
  • ⁇ OPRT was detected.
  • FIG. 1 it was confirmed that all of the anti-human OPRT antibodies of the present invention specifically recognize only OPR T.
  • Example 2 Quantification of human OPRT by sandwich ELISA
  • rhOPRT obtained by culturing Escherichia coli was used.
  • the manufacturing method is as follows. 100 g / mL ampicillin was prepared by cloning E. coli BL21 into which a full-length cDNA of human OPRT was cloned by PCR and introduced with a plasmid designed to express a fusion protein of glutathione-S-transferase (GST) and rhOPRT. In the presence, it was cultured overnight at 37 ° C in lOOmL LB medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • 10 mL of the culture solution was transferred to an Erlenmeyer flask containing 1 L of LB medium, and further cultured at 37 ° C for 4 hours. After collection by centrifugation, the cells were suspended in lOOmL collection buffer (50 mM Tris, 8 M Urea, lm M PMSF, 5 mM EDTA, 5 mM DTT pH 7.4) and then gently stirred at 4 ° C for 30 minutes. . The suspension was sonicated at 4 ° C and then centrifuged at 15000xg and 4 ° C for 30 minutes.
  • lOOmL collection buffer 50 mM Tris, 8 M Urea, lm M PMSF, 5 mM EDTA, 5 mM DTT pH 7.4
  • the concentration of urea in the supernatant is gradually reduced to 1M by dialysis, refolded, passed through a column filled with 2 mL of glutathione (GSH) -Sepharose (Sigma), and the washing solution (20 mM Tris, 1M Urea, 5mM E DTA pH7.4) Washed with 10 mL.
  • the binding site of GST-OPRT fusion protein was cleaved by adding 600 U thrombin to dartathione (GS H) -sepharose bound to this fusion protein and reacting at 4 ° C in the presence of 2.5 mM calcium chloride.
  • the mixture of thrombin and rhOPRT was passed through a Benzamidine-Sepharose column to obtain the desired rhO PRT solution.
  • 14 mL of rhOPRT having a concentration of 20 / z gZmL was obtained.
  • 96 hole plate 0.05% Tween After washing twice with 20-containing PBS (-), 0.1 mL of 0.1% BSA-containing PBS (-) was added to block nonspecific adsorption.
  • 0.1 mL of rhOPRT solution prepared to a concentration of 0.47, 0.94, 1.88, 3.75, 7.5 ngZmL was added and reacted at room temperature for 1 hour.

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Abstract

　ヒトＯＰＲＴ免疫測定法の確立。 　ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼのＮ末端から８６番目～１０８番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ抗体と、ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼのＮ末端から４５４番目～４７４番目のアミノ酸の領域に存在するエピトープを認識する抗ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ抗体とを組み合わせて使用する、ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の測定法。  

Description

明 細 書
ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の測定法 技術分野
[0001] 本発明は、ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼに対する新規な抗体及び該 抗体を用いたヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の測定法に関す る。
背景技術
[0002] ォロト酸ホスホリボシノレトランスフェラーゼ (orotate phosphoribosyl transferas e ； EC2. 4. 2. 10、以下「OPRT」と称する）は、ォロト酸からゥリジル 1リン酸（UM P)を生成する反応を触媒する酵素で、核酸合成に必須であるピリミジンヌクレオチド を供給する役割をもち、核酸前駆体供給経路の主要な律速酵素の一つである。従つ て、細胞増殖の盛んな腫瘍組織や消化管上皮でその活性が高 、ことが知られて 、る
[0003] 一方、 5—フルォロウラシル系の抗癌剤は、 OPRTを律速酵素として活性ィ匕され抗 腫瘍効果を発揮するので、腫瘍細胞中の OPRT量が多い患者に対してはその効果 が大きぐ顕著な延命効果が認められるのに対し、 OPRT量が少ない患者に対して は効果が小さいことが知られている (非特許文献 1参照)。従って、例えば腫瘍患者 の治療を行うに際し、予め摘出腫瘍中の OPRT量を測定することは、治療方法の決 定ゃ投与する抗がん剤の選定の指標となるなど、その重要性は高 、。
[0004] 従来、組織中のヒト OPRTの定量は、 mRNA量又は酵素活性を測定することにより 行われてきた。しかしながら、 mRNA量の測定では、転写後の調節機構等によりタン ノ ク質量及び酵素活性を十分に反映していない可能性がある。また、酵素活性の測 定による定量は、主に放射能標識された基質を用いるので、その操作は非常に煩雑 である。ヒト OPRT定量法を臨床での診断や治療に応用するには、簡便かつ正確で あることが重要であり、このような定量法の開発が強く望まれていた。
非特許文献 1 : Br. J. Cancer. , 2003, Oct, 20 ; 89 (8)： 1486— 92.
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0005] 従って本発明は、ヒト OPRTの簡便かつ正確な測定方法を提供することを目的とす る。
課題を解決するための手段
[0006] そこで本発明者は、ヒト OPRT全体に対するポリクローナル抗体及びヒト OPRTのァ ミノ酸配列中の種々のオリゴペプチドに対する抗体を作製し、それらの抗体を組み合 せた測定系を設計して検討してきたところ、ヒト OPRTの N末端から 86番目〜108番 目のアミノ酸の領域に存在するェピトープを認識する抗体と、ヒト OPRTの N末端から 454番目〜474番目のアミノ酸の領域に存在するェピトープを認識する抗体とを組 み合せたヒト OPRT免疫測定系が、他の抗体を用いた測定系に比べて顕著に感度 が高ぐヒト OPRTタンパク質を簡便かつ正確に測定できることを見出し、本発明を完 成した。
[0007] すなわち、本発明は、ヒト OPRTの N末端から 86番目〜108番目のアミノ酸の領域 に存在するェピトープを認識する抗ヒト OPRT抗体を提供するものである。
また、本発明は、ヒト OPRTの N末端力 454番目〜474番目のアミノ酸の領域に 存在するェピトープを認識する抗ヒト OPRT抗体を提供するものである。
また、本発明は、ヒト OPRTの N末端から 86番目〜108番目のアミノ酸の領域に存 在するェピトープを認識する抗ヒト OPRT抗体と、ヒト OPRTの N末端から 454番目〜 474番目のアミノ酸の領域に存在するェピトープを認識する抗ヒト OPRT抗体とを含 有する、ヒト OPRTタンパク質測定用キットを提供するものである。
更に本発明は、ヒト OPRTの N末端から 86番目〜108番目のアミノ酸の領域に存 在するェピトープを認識する抗ヒト OPRT抗体と、ヒト OPRTの N末端から 454番目〜 474番目のアミノ酸の領域に存在するェピトープを認識する抗 OPRT抗体とを組み 合わせて使用する、ヒト OPRTタンパク質の測定法を提供するものである。
なお、ヒト OPRTタンパク質のアミノ酸配列は、 Proceeding of the National Academy of sciences of the United States oi America, vol. 8o, No . 6, 1988, 1754- 1758 【こ記載のちの【こ従った。
発明の効果 [0008] 本発明方法によれば、ヒト OPRT全体を抗原とした抗体を用いた場合や、ヒト OPR Tの N末端力 428番目〜446番目のアミノ酸の領域に存在するェピトープを認識す る抗 OPRT抗体を用いた場合に比べて、ヒト OPRTタンパク質を簡便かつ正確に定 量できる。更に、本発明測定法を利用して検体のヒト OPRTタンパク質を定量すること で、癌の診断、治療効果予測だけでなぐ治療方法の選定、杭がん剤投与の可否を 決定することができる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]抗 OPRT抗体のウェスタンブロッテイングの結果を示す図である。
[図 2]抗 OPRT— A抗体、抗 OPRT— B抗体及び抗 OPRT— C抗体の 2種を組み合 せて用 、たサンドイッチ ELIS A系の結果を示す図である。 図中 A— B：抗 OPRT— A抗体固相化ー抗 OPRT— B抗体検出。 図中 B—A:抗 OPRT— B抗体固相化— 抗 OPRT— A抗体検出。 図中 B— C :抗 OPRT— B抗体固相化ー抗 OPRT— C抗 体検出。 図中 C—A:抗 OPRT— C抗体固相化ー抗 OPRT— A抗体検出。 図中 C B :抗 OPRT— C抗体固相化ー抗 OPRT— B抗体検出。
[図 3]固定ィ匕抗体として抗 OPRT— C抗体を用い、検出抗体として抗 OPRT— A抗体 を用いた ELISA系の検量線を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明に力かるヒト OPRTタンパク質の N末端から 86番目〜108番目のアミノ酸の 領域に存在するェピトープを認識する抗ヒト OPRT抗体の抗原としては、ヒト OPRTタ ンパク質の N末端から 86番目〜108番目のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列の連 続した 80%以上を含むアミノ酸配列を有する合成ペプチドを使用することができる。 以後この抗原を使用して得られた抗体を抗 OPRT— A抗体と称す。
[0011] 本発明に力かるヒト OPRTタンパク質の N末端から 454番目〜474番目のアミノ酸 の領域に存在するェピトープを認識する抗ヒト OPRT抗体の抗原としては、ヒト OPR Tタンパク質の N末端力 454番目〜474番目のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配 列の連続した 80%以上を含むアミノ酸配列を有する合成ペプチドを使用することが できる。以後この抗原を使用して得られた抗体を抗 OPRT— C抗体と称す。
[0012] 上記合成ペプチドを抗原として使用する場合、免疫応答を促進する目的で、 Freu nd (フロイント）アジュバント等のアジュバントを抗原と混合して使用したり、ゥシサイロ グロブリン、 BS A (Bovine Serum Albumin：ゥシ血清アルブミン）、 KLH (Keyho le limpet hemocyanine ： keyhole limpetのへモシァニン)等のキャリアーを 抗原に結合させて使用することができる。
[0013] 本発明にかかる抗ヒト OPRT抗体は、前記アミノ酸配列の領域に存在する上記ェピ トープを認識すればよぐポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であつ てもよい。
上記抗原を用いて抗ヒト OPRTポリクローナル抗体を作製する場合、以下の通り作 製できる。抗ヒト OPRTポリクローナル抗体を含む抗血清は、常法にしたがって、上記 抗原をゥサギ、ラット、マウス、ャギ等各種の動物に必要回数免疫し、採取することに より得られる。好ましくは、上記合成ペプチドに KLHを結合させたものを抗原として 3 週間に 2度の割合でゥサギに免疫する。抗血清力 抗 OPRT抗体を精製するには、 抗体精製の常法にしたカ^、、ァフィユティークロマトグラフィー、硫安塩析、イオン交 換カラムクロマトグラフィー、分子篩カラムクロマトグラフィー（ゲル濾過）、プロテイン A カラムクロマトグラフィー等を行えばよい。また、抗体の純度を高める目的で、これらの 精製手段を組み合わせたり、繰り返したりしてもよい。
ァフィユティークロマトグラフィー (抗原固定ィ匕カラム）を行う場合、上記合成べプチ ドをカラムに固定し、抗血清を充填して抗 OPRT抗体をカラムに吸着させた後、溶出 液を用いて抗 OPRT抗体を外し、これを回収することにより、高純度の抗 OPRT抗体 を得ることができる。
[0014] 上記抗原を用いて抗ヒト OPRTモノクローナル抗体を作製する場合、以下の通り、 抗ヒト OPRTモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを作製することにより得るこ とができる。上記ノ、イブリドーマは、例えば上記抗原をマウス、ラット等の哺乳動物又 は鳥類に免疫し、その脾臓細胞とマウス、ラット等の哺乳動物のミエローマ細胞 (骨髄 腫細胞）とを、 Koler及び Milsteinの基本方法〔Nature、第 256卷、 495項（1975 年)参照〕に従って細胞融合し、選択用培地中で培養することにより得ることができる 。その際の免疫方法は、例えば調製した抗原をリン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解 し、必要に応じアジュバントを混合し、動物の皮下、脾臓内、腹腔、静脈等に 1〜3週 ごとに充分抗体価が上昇するまで、数回投与することにより行われる。細胞融合に用 いられるミエローマ細胞としては、マウス P3— NS— lZlAg4. 1、 P3— X63— Ag8 . 653、 Sp2Z0Agl4、ラット YB2Z0等が挙げられる。細胞融合の際には、融合促 進剤としてポリエチレングリコール、センダイウィルス等を用いることができ、また電気 パルスを用いてもよい。細胞融合に使用する骨髄細胞は 8—ァザグァニン耐性株で ヌクレオチド生合成のサルベージ経路に必要なヒポキサンチン グァニン ホスホリ ボシルトランスフェラーゼを欠くため、 HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ ジンを含む培地）中ではヌクレオチドの合成が出来ず、生き残れない。よって細胞融 合を行った後、 HAT培地にて 1週間〜 2週間培養することにより、脾細胞と骨髄腫が 融合したノ、イブリドーマのみを選択することができる。
[0015] このようにして得られる本発明の抗ヒト OPRT抗体は、ヒト OPRTタンパク質の免疫 学的測定に有用であり、例えば、サンドイッチ ELISA法、競合法によるラジオィムノア ッセィ、ェンザィムィムノアッセィや、ィムノクロマトグラフィー法等に適用することがで きる。このうち、サンドイッチ ELISA法が特に好ましい。
[0016] 本発明のヒト OPRTタンパク質測定用キットは、抗 OPRT— A抗体と、抗 OPRT— C 抗体とを含有する。これらの 2種の抗体を用いてサンドイッチ ELISA法を行うには、 一方の抗 OPRT抗体を支持体に固定ィ匕し（固相化抗体）、他方の抗 OPRT抗体を標 識抗体 (検出抗体）とする。好ましい組み合わせは、抗 OPRT— C抗体を固相化抗体 とし、抗 OPRT— A抗体を検出抗体とする場合である。
[0017] 免疫測定は、例えばサンドイッチ ELISA法の場合、 ELISA用プレート等の支持体 に一方の抗 OPRT抗体を固定ィ匕し、次いで被検体を反応させ、更に標識抗 OPRT 抗体を反応させた後、洗浄し、サンドイッチ免疫反応が生じた標識量を測定する。
[0018] 本発明に用いられる被検体としては、 OPRTが存在し得るヒトの組織、体液であれ ばよぐ例えば腫瘍組織、消化管組織、血液、リンパ液等が挙げられるが、腫瘍組織 が特に好ましい。
[0019] 本発明において用いられる支持体としては、例えば、ァガロース、セルロースなどの 不溶性の多糖類、シリコーン榭脂、ポリスチレン榭脂、ポリアクリルアミド榭脂、ナイ口 ン榭脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙 げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可 能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレ ートの場合、マルチウエルプレート（96穴マルチウエルプレート等）、バイオセンサー チップなどを用いることができる。抗 OPRT抗体と支持体との結合は、化学結合や物 理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体 は巿販のものを用いることができる。
[0020] 抗 OPRT抗体と被検体との反応は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、 例えば、リン酸緩衝液、 Tris緩衝液、クェン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝 液などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、例えば、 4°C〜室温 にて 1時間〜 24時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、 被検体中のヒト OPRTタンパク質と抗 OPRT抗体の結合を妨げないものであれば何 でもよぐ例えば、 TWeen20等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
[0021] 本発明のヒト OPRTタンパク質測定方法においては、ヒト OPRTタンパク質を検出し たい被検体の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ヒ ト OPRTタンパク質を含まない陰性コントロール試料ゃヒト OPRTタンパク質を含む陽 性コントロール試料などがある。この場合、ヒト OPRTタンパク質を含まない陰性コント ロール試料で得られた結果、ヒト OPRTタンパク質を含む陽性コントロール試料で得 られた結果と比較することにより、被検体中のヒト OPRTタンパク質を検出することが 可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各 コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検体の 数値力も標準曲線に基づいて、被検体に含まれるヒト OPRTタンパク質を定量的に 検出することも可能である。
[0022] 抗 OPRT抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物 質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に 公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ (32P、 14C、 1251、 3H、 13 IIなど）、フルォレセイン、ローダミン、ダンシルク口リド、 ゥンベリフエロン、ルシフェラーゼ、パーォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、 β ガラクトシダーゼ、 β ダルコシダーゼ、ホースラディッシュパーォキシダーゼ、グル コアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドォキシダーゼ、マイクロペルォキシダーゼ、ビォ チンなどを挙げることができる。標識物質としてピオチンを用いる場合には、ピオチン 標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンを更 に添加することが好ましい。標識物質と抗 OPRT抗体との結合には、ダルタルアルデ ヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフイド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用 いることがでさる。
[0023] 具体的には、一方の抗 OPRT抗体を含む溶液をプレートなどの支持体にカ卩え、当 該抗 OPRT抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な 結合を防ぐため、例えば BSA、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗 浄し、被検体をプレートにカ卩える。インキュベートの後、洗浄し、他方の標識抗 OPRT 抗体をカ卩える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った 標識抗 OPRT抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例 えば、放射性物質による標識の場合に液体シンチレーシヨンや RIA法により検出す ることができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば 発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、 2, 2—ァ ジノビス（3—ェチルベンゾチアゾリン一 6—スルホン酸）ジアンモ -ゥム塩 (ABTS)、 オルトフエ-レンジァミン、 3, 3 ' , 5, 5，一テトラメチルベンジジン（TME)などを挙げ ることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
実施例
[0024] 以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定さ れるものではない。
[0025] 比較例（抗 rhOPRT抗体を用いた ELISA法による OPRTの定量）
(1)抗原作成
抗原としては、大腸菌を培養して得られた組み換えヒト OPRT (rhOPRT)を利用し た。その製法は次のとおりである。 PCRにてヒト OPRTの全長 cDNAをクローユングし 、グルタチオン S トランスフェラーゼ (GST)と rhOPRTとの融合タンパク質を発現 するように作成されたプラスミドを導入した大腸菌 BL21を、 100 gZmLのアンピシ リン存在下、 lOOmLの LB培地 (和光純薬工業社製）中で 37°Cにて一晩振盪培養し た。その培養液 10mLを 1Lの LB培地の入った三角フラスコに移し、 37°Cで更に 4時 間培養した。遠心による集菌後、 lOOmLの集菌バッファー（50mM Tris、 8M Ur ea、 ImM PMSF、 5mM EDTA、 5mM DTT pH7. 4)に菌体を懸濁後、 4°C で 30分間緩やかに攪拌した。懸濁液を 4°Cで超音波破砕後、 15000xg、 4°Cで 30 分間の遠心処理を行った。その後、上清中の尿素の濃度を透析処理により徐々に 1 Mまで落とし、リフォールディング処理を行い、 2mLのグルタチオン（GSH)—セファ ロース（シグマ社製）を充填したカラムに通し、洗浄液（20mM Tris、 1M Urea、 5 mM EDTA pH7. 4) lOmLにて洗浄した。溶出用バッファー（50mM GSH, 50 mM Tris, pH 9. 6)にて GST— rhOPRTを溶出し、 rhOPRT溶液を得た。
[0026] (2)免疫
GST— rhOPRTを免疫原とし、更にフロイント（Freund)の完全アジュバント（FCA )又はフロイントの不完全アジュバント（FIA)を用いて、ゥサギ (white日本白色種）を 以下により免疫した。
1回目： GST— rhOPRT 0. 2mg+FCA S. C.
2〜8回目： GST— rhOPRT 0. 5mg+FIA S. C.
[0027] (3)抗血清の精製
免疫したゥサギの全血を回収し、これを 1500xg、 4°Cで 5分間遠心して血清を分離 した。得られた抗血清 20mLを PBS (—）にて 2倍希釈し 40mLとした。この抗血清希 釈液を GST蛋白の固定ィ匕カラムに添加し、 GST反応性の抗体を吸着させた後、素 通り溶液をプロテイン A固定ィ匕カラムに通して、抗体 (IgG)を結合させ、 PBS (—）を 用いて、 280nmの吸光度がなくなるまでよく洗浄した。その後 0. 2M Glycine -H CI pH2. 5をカラムに通して抗原に吸着した抗体を溶出させた。なお、この際に pH を中和するために、溶出した抗体を受ける試験管に 1M Trisを予め添加しておき、 回収した抗体の変質を防いだ。得られた抗体画分を PBS ( -)で 4°Cにて一晩透析し 、精製抗体とした。
[0028] (4)サンドイッチ ELISA法によるヒト腫瘍細胞中の OPRTの定量
抗 rhOPRT抗体を 0. ImM炭酸緩衝液 pH9. 6で 5. 0 /z gZmLに調製して 96穴 の ELISA用プレートに 0. lmL分注し、シールをして 4°Cのインキュベーター内で一 晚コーティングを行い、抗体固定化担体を得た。 96穴プレートを 0. 05%ツイーン 20 含有 PBS (—）で 2回洗浄後、 0. 1%BSA含有 PBS (—）を 0. ImL加え非特異吸着 のブロッキングを行った。洗浄液で 2回洗浄した後、 3、 9、 27倍に希釈したヒト胃癌由 来細胞 TMK1細胞のホモジネート（5xl06の細胞より 0. 2mLの蛋白抽出液を調製 した）を 0. ImL添加し室温で 1時間反応させた。洗浄液で 5回洗浄した後、 0. 5 g /mLに希釈液にて希釈したパーォキシダーゼ標識抗 rhOPRT抗体を 0. ImLづっ 分注し、室温で 30分間反応させた。洗浄液で 7回洗浄後、 1. 3mgZmLのオルトフ ェ-レンジァミンと 0. 01%の過酸化水素水、 ImM EDTAを含む 0. 1Mのリン酸 クェン酸緩衝液 pH5. 1 (発色液)を 0. ImL加え、室温暗所にて 30分酵素反応を行 つた。最後に、 0. 1M硫酸 0. ImLを加えて反応を停止し、 492nmの吸光度の測定 を行った。この結果を表 1に示す。
[0029] [表 1] 抗 rhOPRT抗体を用いたサンドィッチ ELISA法による 0PRTの検出 希釈倍率 吸光度 (492nm)
1/3 0.085
1/9 0.055
1/27 0.15
[0030] 吸光度 (492nm)があまりにも低ぐ希釈倍率との相関が全く認められていないため 、 OPRTの全長 cDNAを用いて作成した抗 rhOPRT抗体はサンドイッチ ELISA法 には適して!/、な 、ことが確認された。
[0031] 実施例 1 (抗体の作成）
次の操作により、抗 OPRTポリクローナル抗体を得た。
(1)ペプチド合成
ヒト OPRTの N末端から 86番目〜108番目のアミノ酸配列を有するペプチド、ヒト O PRTの N末端力 428番目〜446番目のアミノ酸配列を有するペプチド、及びヒト O PRTの N末から 454番目〜474番目のアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、以 下のペプチド配列からなる人工ペプチドを得た。
[0032] ヒト OPRTの N末端から 86番目〜108番目のアミノ酸配列を有するペプチド（抗原 名： OPRT A)
Cys— Ser— Thr— Asn— Gin— He— Pro— Met— Leu— He— Arg— Arg— Lys— Glu - Thr - Lys - Asp— Tyr— Gly - Thr - Lys - Arg - Leu (配列番号 1 )
[0033] ヒト OPRTの N末端から 428番目〜446番目のアミノ酸配列を有するペプチド（抗 原名： OPRT— B)
Cys -Leu -Gly- Gin Gin Tyr Asn— S er— Pro— Gin Glu Val lie— Gly Lys Arg— Gly— S er— Asp lie (配列番号 2)
[0034] ヒト OPRTの N末端から 454番目〜474番目のアミノ酸配列を有するペプチド（抗 原名： OPRT— C)
Cys— He— Ser— Ala Ala—Asp— Arg— Leu— Glu Ala Ala Glu— Met— Tyr - Arg - Lys - Ala - Ala - Trp - Glu - Ala - Tyr (配列番号 3)
[0035] (2)抗原結合物の作成
上記によって得た人工ペプチド 4mgとマレイミド活性化 KLH (Pierce) 2mgを用い てペプチド KLH結合物（conjugate)をそれぞれのペプチドにつ!/、て作成した。
[0036] (3)免疫
人工ペプチド—KLHを免疫原とし、更にフロイント（Freund)の完全アジュバント（ FCA)又はフロイントの不完全アジュバント（FIA)を用いて、ゥサギ (white日本白色 種)を以下により免疫した。
1回目： Peptide— KLH 0. 5mg+FCA S. C.
2〜8回目： Peptide— KLH 0. 5mg+FIA S. C.
[0037] (4)抗血清の精製
免疫したゥサギの全血を回収し、これを 1600xg、 4°Cで 5分間遠心して血清を分離 した。得られた抗血清 20mLを PBS (—）にて 2倍希釈し 40mLとした。この抗血清希 釈液を抗原ペプチドカラムに添加し、抗体 (IgG)を結合させ、 PBS ( -)を用いて、 2 80nmの吸光度がなくなるまでよく洗浄した。その後 0. 2M Glycine -HC1 pH2. 5をカラムに通して抗原に吸着した抗体を溶出させた。なお、この際に pHを中和する ために、溶出した抗体を受ける試験管に 1M Trisを予め添加しておき、回収した抗 体の変質を防いだ。得られた抗体画分を PBS ( -)で 4°Cにて一晩透析し、精製抗体 とした。
[0038] (5)ウェスタンブロッテイング法による抗 OPRT抗体の特異性の確認
ヒト肺癌由来細胞 LC - 11細胞のホモジネート（タンパク濃度 20mgZmL)に電気 泳動用試料調製液（4%SDS、 10%beta—メルカプトエタノール、 20%グリセロール 、 125mM Tris、 pH 6. 8)を等量混合し、 2分間煮沸処理を行い、 10 Lを電気 泳動に使用した。試料は 10%ポリアクリルアミドを用いて泳動した後、 PVDFフィルタ 一に電気的に転写し、ブロックエース (ブロッキング剤、大日本製薬社製）に浸してブ ロッキングを行った。 20mM PBS (—）で 1. 2 gZmLに調製した各ポリクローナル 抗体を一次抗体に用い 1時間の反応を行い、 500mM塩ィ匕ナトリウム及び 0. 5%ツイ ーン 20を含む 20mM Tris pH 7. 0 (洗浄液）でフィルターを洗浄後、アルカリフ ォスファターゼ標識デキストランポリマー結合抗ゥサギポリクローナル抗体 (Dako C ytomation)を二次抗体として 1時間反応した。ついで洗浄液でフィルターを洗浄し 、化学発光試薬 (CDP - star、 Tropix)を使用して酵素反応を行!ヽ OPRTの検出 を行った。その結果、図 1に示すように、本発明の抗ヒト OPRT抗体はいずれも OPR Tのみを特異的に認識することが確認された。
[0039] 実施例 2 (サンドイッチ ELISA法によるヒト OPRTの定量）
(1) Standardとしては、大腸菌を培養して得られた rhOPRTを利用した。その製法 は次のとおりである。 PCRにてヒト OPRTの全長 cDNAをクローユングし、グルタチォ ン— S—トランスフェラーゼ (GST)と rhOPRTとの融合タンパク質を発現するように作 成されたプラスミドを導入した大腸菌 BL21を、 100 g/mLのアンピシリン存在下、 lOOmLの LB培地 (和光純薬工業社製）中で 37°Cにて一晩振盪培養した。その培 養液 10mLを 1Lの LB培地の入った三角フラスコに移し、 37°Cで更に 4時間培養し た。遠心による集菌後、 lOOmLの集菌バッファー（50mM Tris、 8M Urea、 lm M PMSF、 5mM EDTA、 5mM DTT pH7. 4)に菌体を懸濁後、 4°Cで 30分 間緩やかに攪拌した。懸濁液を 4°Cで超音波破砕後、 15000xg、 4°Cで 30分間の 遠心処理を行った。その後、上清中の尿素の濃度を透析処理により徐々に 1Mまで 落とし、リフォールディング処理を行い、 2mLのグルタチオン（GSH)—セファロース（ シグマ社製）を充填したカラムに通し、洗浄液（20mM Tris、 1M Urea、 5mM E DTA pH7. 4) lOmLにて洗浄した。この融合タンパクが結合したダルタチオン (GS H)—セファロースに 600Uの thrombinを加え、 2. 5mM塩化カルシウム存在下に 4 °Cでー晚反応させ、 GST— OPRT融合タンパクの結合部位を切断した。 thrombin と rhOPRTの混合物は Benzamidine— Sepharoseカラムを通すことで、 目的の rhO PRT溶液を得た。ブラッドフォード法によるタンパク定量の結果、 20 /z gZmLの濃度 の rhOPRTが 14mL得られた。
[0040] (2)抗 OPRT抗体組み合わせの比較
抗 OPRT— A抗体、抗 OPRT— B抗体及び抗 OPRT— C抗体を 0. ImM炭酸緩 衝液 pH9. 6で 5. 0 g/mLに調製して 96穴の ELISA用プレートに 0. ImL分注し 、シールをして 4°Cのインキュベーター内でー晚コーティングを行い、抗体固定化担 体を得た。 96穴プレートを 0. 05%ツイーン 20含有 PBS (―)で 2回洗浄後、 0. 1% BSA含有 PBS (—）を 0. ImLカロえ非特異吸着のブロッキングを行った。洗浄液で 2 回洗浄した後、 1. 88ngZmLの濃度の rhOPRT溶液を 0. ImL添カ卩し、室温で 1時 間反応させた。洗浄液で 5回洗浄した後、希釈液 (0. 1%BSA, 0. 05% ツイーン 2 0含有 PBS (—））にて 0. 5 gZmLに希釈した抗 OPRT— A抗体、抗 OPRT— B抗 体及び抗 OPRT— C抗体のパーォキシダーゼ標識抗体を 0. ImLづっ分注し、室 温で 30分間反応させた。洗浄液で 7回洗浄後、 1. 3mgZmLのオルトフエ-レンジ ァミンと 0. 01%の過酸化水素水、 ImM EDTAを含む 0. 1Mのリン酸 クェン酸 緩衝液 pH5. 1 (発色液)を 0. ImLカ卩え、室温暗所にて 30分酵素反応を行った。最 後に、 0. 1M硫酸 0. ImLをカ卩えて反応を停止し、 492nmの吸光度の測定を行った 。この結果を図 2に示す。
[0041] 抗 OPRT— B抗体を用いた場合には、いずれの組み合わせのときも、十分な吸光 度が得られなカゝつた。抗 OPRT— A抗体と抗 OPRT— C抗体を組み合わせたとき、 最も高感度に rhOPRTの濃度を測定できることが確認された。
[0042] (3)サンドイッチ ELISA法によるヒト OPRT量の定量性
抗 OPRT— C抗体を 0. ImM炭酸緩衝液 pH9. 6で 5. 0
Figure imgf000013_0001
穴の ELISA用プレートに 0. ImL分注し、シールをして 4°Cのインキュベーター内で ー晚コーティングを行い、抗体固定化担体を得た。 96穴プレートを 0. 05%ツイーン 20含有 PBS (-)で 2回洗浄後、 0. 1%BSA含有 PBS (-)を 0. lmL加え非特異吸 着のブロッキングを行った。洗浄液で 2回洗浄した後、 0. 47、 0. 94、 1. 88、 3. 75 、 7. 5ngZmLの濃度に調製した rhOPRT溶液を 0. lmL添カ卩し室温で 1時間反応 させた。洗浄液で 5回洗浄した後、 0. 5 gZmLに希釈液にて希釈したパーォキシ ダーゼ標識抗 OPRT— A抗体を 0. lmLづっ分注し、室温で 30分間反応させた。洗 浄液で 7回洗浄後、 1. 3mgZmLのオルトフエ-レンジァミンと 0. 01%の過酸化水 素水、 ImM EDTAを含む 0. 1Mのリン酸 クェン酸緩衝液 pH5. 1 (発色液）を 0 . lmLカ卩え、室温暗所にて 5分酵素反応を行った。最後に、 0. 1M硫酸 0. lmLを 加えて反応を停止し、 492nmの吸光度の測定を行った。この結果を図 3に示す。 固相化抗体として抗 OPRT— C抗体を用い、検出抗体として抗 OPRT— A抗体を 用いたとき、定量的に rhOPRTの濃度を測定できることが確認され、ここにサンドイツ チ ELISAシステムが確立した。

Claims

請求の範囲
[1] ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの N末端から 86番目〜108番目のアミ ノ酸の領域に存在するェピトープを認識する抗ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフエ ラーゼ抗体。
[2] ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの N末端から 454番目〜474番目のァ ミノ酸の領域に存在するェピトープを認識する抗ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフ エラーゼ抗体。
[3] ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの N末端から 86番目〜108番目のアミ ノ酸の領域に存在するェピトープを認識する抗ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフエ ラーゼ抗体と、ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの N末端から 454番目〜 474番目のアミノ酸の領域に存在するェピトープを認識する抗ヒトォロト酸ホスホリボ シルトランスフェラーゼ抗体とを含有する、ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフェラー ゼタンパク質測定用キット。
[4] 測定手段がサンドイッチ ELISAである請求項 3記載の測定用キット。
[5] ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの N末端から 86番目〜108番目のアミ ノ酸の領域に存在するェピトープを認識する抗ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフエ ラーゼ抗体と、ヒトォロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの N末端から 454番目〜 474番目のアミノ酸の領域に存在するェピトープを認識する抗ヒトォロト酸ホスホリボ シルトランスフェラーゼ抗体とを組み合わせて使用する、ヒトォロト酸ホスホリボシルト ランスフェラーゼタンパク質の測定法。
[6] 測定手段がサンドイッチ ELISAである請求項 5記載の測定法。
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