WO2006090711A1 - 生理活性リゾリン脂質の分析方法 - Google Patents

生理活性リゾリン脂質の分析方法 Download PDF

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WO2006090711A1
WO2006090711A1 PCT/JP2006/303109 JP2006303109W WO2006090711A1 WO 2006090711 A1 WO2006090711 A1 WO 2006090711A1 JP 2006303109 W JP2006303109 W JP 2006303109W WO 2006090711 A1 WO2006090711 A1 WO 2006090711A1
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WO
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phosphate
lpa
sphingosine
complex
analysis
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PCT/JP2006/303109
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Inventor
Kiyoshi Satouchi
Tamotsu Tanaka
Kaoru Hirano
Original Assignee
Fukuyama University
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing bioactive lysophospholipids, and more particularly, to a method for simultaneous analysis of sphingosine-1-phosphate and lysophosphatidic acid.
  • Lipids are classified into simple lipids, complex lipids, and unsaponifiables, and triglycerides as energy sources, phospholipids that compose cell membranes, and cholesterol, which is a raw material for steroid hormones, are representative lipids. .
  • phosphatidic acid has been known as an intermediate in lipid biosynthesis, but phosphatidic acid produced by activated phospholipase D acting on phosphatidylcholine in the cell membrane during hormone reception functions as a second messenger. Serum is a force that is essential for cell culture as a classic growth factor. This action is based on phosphatidic acid, a lysophosphatidic acid from which one fatty acid is off (hereinafter abbreviated as LPAJ), and ceramide in the hydrophobic group.
  • LPAJ lysophosphatidic acid from which one fatty acid is off
  • S1P sphingosine_1_phosphoric acid
  • the present invention provides:
  • a complex of S1P and LPA in the sample and a phosphate-captured zinc complex is formed, and the complex is analyzed using a matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometer.
  • Phosphate-capturing zinc complex is 1,3-bis [bis (pyridine-2-ylmethyl) amino] propan-2-olatozinc (II) complex (hereinafter referred to as “Zn L 3+ j”) )
  • Matrix-assisted laser desorption including phosphate-capturing zinc complex and non-natural S1P ionization reagent kit for analysis of S1P by time-of-flight mass spectrometry;
  • Matrix-assisted laser desorption / ionization including phosphate capture zinc complex, non-natural S1P and non-natural LPA Reagent kit for simultaneous analysis of S1P and LPA by time-of-flight mass spectrometry;
  • Matrix-assisted laser desorption / ionization 'Use of phosphate-trapping zinc complexes in SIP analysis by time-of-flight mass spectrometry and
  • FIG. 1 shows the structural formula and molecular weight of LPA and S1P, complex LPA / Zn L 3+ and SIP
  • FIG. 2 shows the results of mass spectrometry of internal standards S1P (C20) and S1P (C18) by MALDI-TOF / MS.
  • FIG. 3 shows the sensitivity ratio of S1P (C18) and S1P (C20), that is, a calibration curve.
  • Fig. 4 shows the results of mass spectrometry of internal standard SIP (C20) and LPA (C17: 0) by MALD and TOF / MS.
  • FIG. 5 shows the results of mass spectrometry of S1P and LPA in human plasma by MALDI-TOF / MS.
  • the compound to be analyzed in the present invention is S1P.
  • the analyte compound in the present invention is both S1P and LPA.
  • S1P and LPA can be analyzed at the molecular species level.
  • the analysis sample in the present invention is not particularly limited as long as it contains S1P or LPA.
  • a sample from a living body organ, organ, blood, serum, plasma, saliva, urine, ascites, lymph, etc.
  • animal and plant cell cultures cell fractions, foods, beverages, medicines, cosmetics and the like.
  • phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, and sphingomyelin are selectively hydrolyzed by treatment with enzymes such as phospholipase D and phospholipase A or A.
  • the analysis method of the present invention can be applied.
  • R is a hydrogen atom which may be the same or different from each other; an alkyl group having 1 to 16 carbon atoms; an acyl group, an alkoxycarbonyl group, an acyl alkyl group, an alkoxy group, a non-phenylalkyl group, a carboxy group; Alkyl group, force ruberamoylalkyl group, cyanoalkyl group, hydroxyalkyl group, aminoalkyl group or haloalkyl group (wherein the carbon number of the alkyl part of these groups is:! To 16); carboxyl group; force A zinc complex represented by general formula (2): a ruberamoyl group; a cyan group; a hydroxy group; an amino group; or a halogeno group
  • the complex represented by the general formula (1) is preferred, particularly the following formula (3):
  • a complex of S1P and a phosphate-captured zinc complex or a complex of S1P and LPA and a phosphate-captured zinc complex is used for S1P and LPA in phospholipids separated by sample force.
  • the molar ratio of S1P and LPA to the phosphate-trapping zinc complex is 1:10 to: 1: 5 ⁇ 5, preferably 1: 2 to: 1: 1.
  • the complex of S1P and LPA and a phosphate-captured zinc complex is a 1: 1 complex.
  • S1P and LPA are _2 valence.
  • a valent cation complex is formed.
  • the analysis method of the present invention is based on the change in mass due to the change of the total charge of S1P and LPA from -2 to 1 (Fig. 1).
  • Matrix-assisted laser desorption / ionization in the present invention A time-of-flight mass spectrometer (M ALDI-TOF / MS) is designed to irradiate a crystallized matrix molecule with laser light while capturing sample molecules. This is a device that performs mass separation based on the difference in flight speed of each ion after applying accelerating voltage to the ion by accelerating the Sampnore molecule.
  • the commercial product name “Voyager-DESTR” manufactured by Applied Biosystems
  • Ultraflex TOF / TOF trade name “Ultraflex TOF / TOF”
  • MALDI-TOF / MS uses 2 ', 4', 6 '—trihydroxy monoacetophenone (THAP) as a matrix in the case of monovalent cation type phosphate capture zinc complex / S1P or LPA complex. However, it can be implemented in the positive ion detection mode.
  • THAP trihydroxy monoacetophenone
  • analysis can be performed according to the molecular type of S1P or LPA, for example, the type of bound fatty acid. Furthermore, when the analysis method of the present invention is combined with selective hydrolysis by various enzymes such as phospholipase, molecular species of phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidinoreserin, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, sphingomyelin (bound fatty acids and Analysis by binding position to glycerin).
  • enzymes such as phospholipase, molecular species of phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidinoreserin, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, sphingomyelin (bound fatty acids and Analysis by binding position to glycerin).
  • S1P or LPA as an internal standard (the S1P or LPA to be measured is different from the number of carbons, the number of double bonds, or the position of the bond, for example, S1P Measure the detection efficiency of S1P and LPA to be measured against C20 or C17, etc., LPA has C17: 0, and C19: 0, etc.), and prepare a calibration curve for each S1P or LPA molecular species to be measured in advance.
  • the internal standard is preferably S1P (C20 or C17) for S1P and LPA (C17: 0 or C19: 0) for LPA.
  • the present invention also relates to a reagent kit for analysis of S1P by matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry, which kit includes a phosphate-capturing zinc complex and a non-natural S1P (C20 or C17 etc.).
  • a non-natural S1P S1P (C20 or C17) is preferable.
  • the present invention relates to a reagent kit for simultaneous analysis of S1P and LPA by matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry, which comprises a phosphate-capturing zinc complex, a non-natural SIP ( C20 or C17) and non-natural LPA (C17: 0 or C19: 0 etc.).
  • S1P C20 or C17
  • LPA C17: 0 or C19: 0
  • non-natural type LPA is preferred as the non-natural type LPA.
  • the present invention provides phosphate capture in matrix-assisted laser desorption / ionization 'time-of-flight mass spectrometry analysis of S1P or matrix-assisted laser desorption / ionization' time-of-flight mass spectrometry in simultaneous analysis of S1P and LPA. Relates to the use of functional zinc complexes.
  • the analysis method of the present invention can quickly and accurately measure the molecular species of S1P and LPA in a small amount of sample, diagnosis of various diseases and pathologies related to S1P and LPA, S1P and The function of LPA at the cell level or individual level can be elucidated.
  • diseases, conditions or functions include ovarian cancer, fallopian tube cancer, breast cancer, uterine cancer, cardiovascular disease, heart failure, immune disease, asthma, allergic disease, angiogenesis, inflammation, diabetes, arteries.
  • Sclerosis myofibroblastosis, seizure, stress disorder, abnormal brain function, thrombus, abnormal bone metabolism, abnormal blood coagulation, wound, gene expression, apoptosis, arachidonic acid metabolism, cell proliferation, cell differentiation, There are platelet activation and N0 synthesis.
  • S1P (C20) was purchased from Avanti Polar Lipids, Inc.
  • FIG. 4 shows S1P (C20) and LPA (C17:
  • Example 3 The phospholipid concentrated in Example 3 was dissolved in 0.1 ml of a 0.1% ammonia / methanol solution, and 10 ⁇ l thereof was mixed with 5 ⁇ l of ImM Zn L 3+ solution. Apply 0.5 ⁇ l of this solution to the plate.
  • the intensity (Count) force of each peak detected on the mass spectrum was taken as the base value (base), and the resulting value was taken as the true intensity of the ion (Count-base).
  • Naturally occurring carbon has 12 C and 13 C in a ratio of about 100: 1. For this reason, as shown in Fig. 4, even if it is a single molecular species, the molecule is composed only of 12 C and contains only one 13 C [M + 1 ] + Or [M + 2 ] + containing two of these are detected. This complicates the molecular quantification of naturally occurring LPA. For example, [M] + in a complex of LPA (C18: 2) with a phosphate-trapping zinc complex is detected as m / z1021. [M + 2] + is detected as m / z1023. This is the same as [M] + in the complex of LPA (C18: l) with phosphate-trapping zinc complex.
  • LPA includes a saturated LPA molecular species bound with a saturated fatty acid such as palmitic acid and an unsaturated LPA molecular species bound with an unsaturated fatty acid such as linoleic acid.
  • the detection efficiencies of the unsaturated unsaturated LPA molecular species were twice that of the saturated LPA molecular species. This time, the non-natural LPA used as the internal standard is saturated. Therefore, in order to correct the difference in detection efficiency, in the case of unsaturated LPA molecular species, the observed ion intensity was corrected by half (detection efficiency correction).
  • S1P and LPA can be measured quickly and accurately with a small amount of sample, diagnosis of various diseases and pathologies related to S1P and LPA, cell level of S1P and LPA or individual Elucidation of functions at the level.

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Abstract

　スフィンゴシン－１－リン酸やリゾホスファチジン酸を少量の試料で迅速かつ精度良く測定する分析方法を提供する。 　試料中に存在するスフィンゴシン－１－リン酸とリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体を形成し、この複合体をマトリックス支援レーザー脱離イオン化・飛行時間型質量分析計を用いて分析することを特徴とする、スフィンゴシン－１－リン酸の分析方法。

Description

明 細 書
生理活性リゾリン脂質の分析方法
技術分野
[0001] 本発明は、生理活性リゾリン脂質の分析方法、特に、スフインゴシン— 1 _リン酸とリ ゾホスファチジン酸の同時分析方法に関する。
背景技術
[0002] 脂質は単純脂質、複合脂質及び不ケン化物に分類され、エネルギー源としてのトリ グリセリド、細胞膜を構成するリン脂質、ステロイドホルモンの原料であるコレステロ一 ルがそれぞれの代表的な脂質である。
[0003] これらの脂質の中で、リン脂質に対する認識は、従来の構造脂質から機能脂質へと 大きく変わってきている。例えば、ホスファチジン酸は脂質生合成の中間体として知ら れてきたが、ホルモン受容の際、活性化されたホスホリパーゼ Dが細胞膜のホスファ チジルコリンに働いて生じるホスファチジン酸は、そのセカンドメッセンジャーとして機 能する。また、血清は古典的な増殖因子として細胞培養に必須である力 この作用は ホスファチジン酸力 脂肪酸が 1分子はずれたリゾホスファチジン酸 (本明細書以降「 LPAJと略す）や、セラミドを疎水基に持つリン脂質であるスフインゴミエリンより生じる スフインゴシン _ 1 _リン酸 (本明細書以降「S 1P」と略す）によるところが大きいと考え られる。単純な化学構造を有する、 S1Pや LPAが意外にも重要な生理活性を示し、 またそれらの受容体が存在することから注目をされてレ、る。
[0004] S 1Pや LPAは上記のような重要な生体機能を有すると考えられることから、その分 析は重要であるが、これらの脂質の生体内での存在が一過性で非常に微量であり、 かつ、誘導体化しにくいため、従来から用いられてきた分析法では分析を行い難い（ American Heart Journal, Volume 146, Number 1, 62-66(2003))。そのため、そのまま でイオン化できるエレクトロスプレーイオンィ匕法による質量分析がよく使われている (A nalytical Biochemistry, 290， 302-313(2001)及び Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. ， 13(7), July, 2004)。しかし、この分析法では、共存する不純物によって検出感度が 影響を受けやすいこと、また、共存する不純物によってイオン源が汚れやすぐ多検 体分析に耐えないなどの欠点力 Sあった (Rapid Communications in Mass Spectrometr y, 17， 87-96(2003)) 0
発明の開示
[0005] したがって、多検体の SIPや LPAを少量の試料で迅速かつ精度良く測定する方法 が求められている。
[0006] 本発明者は、上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、リン酸捕獲性亜鉛錯 体で複合体化した S1Pや LPAをカチオンとして検出する、マトリックス支援レーザー 脱離イオン化 ·飛行時間型質量分析計 (MALDI-TOF/MS)による分析法を完成した
[0007] すなわち、本発明は、
(1)試料中に存在する S1Pとリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体を形成し、この複合 体をマトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析計を用いて分析す ることを特徴とする、 S1Pの分析方法；
(2)試料中に標準物質として非天然型 S1Pを添加する前記発明（1)記載の分析方 法；
(3)試料中の S1P及び LPAとリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体を形成し、この複合 体をマトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析計を用いて分析す ることを特徴とする、 S1P及び LPAの同時分析方法；
(4)試料中に標準物質として非天然型 S1P及び非天然型 LPAを添加する前記発明 (3)記載の分析方法；
(5)リン酸捕獲性亜鉛錯体が 1 , 3—ビス [ビス（ピリジン— 2—ィルメチル)ァミノ]プロ パン— 2—オラートニ亜鉛 (II)錯体 (本明細書以降「Zn L3+jと略す）である前記発明
(1)〜（4)のレ、ずれか一つに記載の分析方法；
(6)リン酸捕獲性亜鉛錯体及び非天然型 S1Pを含む、マトリックス支援レーザー脱離 イオン化 '飛行時間型質量分析による S1Pの分析用試薬キット；
(7)リン酸捕獲性亜鉛錯体、非天然型 S1P及び非天然型 LPAを含む、マトリックス支 援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析による S1P及び LPAの同時分析用 試薬キット； (8)マトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析による SIPの分析 におけるリン酸捕獲性亜鉛錯体の使用；及び
(9)マトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析による S1P及び LP Aの同時分析におけるリン酸捕獲性亜鉛錯体の使用
である。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]図 1は、 LPA及び S1Pの構造式及び分子量、複合体 LPA/Zn L3+及び SIP
/Zn L3+の構造式及び m/zを示す。
[図 2]図 2は、内部標準 S1P (C20)と S1P (C18)の MALDI-TOF/MSによる質量分析 結果を示す。
[図 3]図 3は、 S1P (C18)と S1P (C20)の感度比、すなわち検量線を示す。
[図 4]図 4は、内部標準 SIP (C20)と LPA (C17： 0)の MALDト TOF/MSによる質量 分析結果を示す。
[図 5]図 5は、ヒト血漿中の S1P及び LPAの MALDI-TOF/MSによる質量分析結果を 示す。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明における分析対象化合物は、 S1Pである。あるいは、本発明における分析 対象化合物は、 S1P及び LPAの両方である。本発明により、 S1P及び LPAが分子 種レベルで分析できる。
[0010] 本発明における分析試料は、 S1Pや LPAを含むものであれば特に限定されず、例 えば、生体からの試料 (器官、臓器、血液、血清、血漿、唾液、尿、腹水、リンパ液な ど）、動植物細胞の培養物、細胞画分、食品、飲料、医薬、化粧品等が挙げられる。 さらに、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールァミン 、ホスファチジルイノシトール、スフインゴミエリンなどのリン脂質は、ホスホリパーゼ D およびホスホリパーゼ A又は Aなどの酵素で処理して選択的に加水分解し SIPや L
1 2
PAに変換した後に、本発明の分析方法を適用できる。
[0011] 本発明におけるリン酸捕獲性亜鉛錯体は、二価のリン酸（— 0— P ( =〇）—（0_) ) を捕獲できる亜鉛錯体化合物をいい、例えば、 WO03Z053932A1及び WO2004 /078828A1に記載の亜鉛錯体、すなわち、
一般式 (1) :
Figure imgf000006_0001
{式中、 Rは、相互に同一又は異なっていてもよぐ水素原子；炭素数が 1〜： 16である アルキル基；ァシル基、アルコキシカルボニル基、ァシルアルキル基、アルコキシ力ノレ ボニルアルキル基、カルボキシアルキル基、力ルバモイルアルキル基、シァノアルキ ル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基（ここで、これらの 基のアルキル部分の炭素数は、：!〜 16である）；カルボキシル基；力ルバモイル基；シ ァノ基；ヒドロキシノレ基；アミノ基；或いはハロゲノ基である }で示される亜鉛錯体、 一般式 (2) :
Figure imgf000006_0002
で示される亜鉛錯体
が挙げられる。 リン酸捕獲性亜鉛錯体としては、一般式（1)で表される錯体が好ましぐ特に下式 ( 3) :
Figure imgf000006_0003
で示される Zn L3+が好ましい。
本発明においては、 S1Pとリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体、又は S1P及び LPA とリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体は、試料力 分離したリン脂質中の S1Pや LPA をリン酸捕獲性亜鉛錯体と水性媒体 (例えば水、水'メタノール混合媒体など）中で混 合、撹拌することによって調製できる。 S1P及び LPAとリン酸捕獲性亜鉛錯体の量比 は、モル比で、 1 : 10〜： 1 : 0· 5、好ましくは、 1 : 2〜： 1 : 1である。 S1P及び LPAとリン 酸捕獲性亜鉛錯体との複合体は 1： 1複合体であり、例えば、リン酸捕獲性亜鉛錯体 力 ¾価であれば、 S1Pや LPAが _ 2価であるから、 1価の陽イオン型複合体が形成さ れる。本発明の分析方法は、 S1Pや LPAの総電荷が— 2価から 1価に変化すること による質量変化に基づく（図 1)。
[0014] 本発明におけるマトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析計 (M ALDI-TOF/MS)は、サンプル分子を取り込みながら結晶化したマトリックス分子にレ 一ザ一光を照射することによりサンプノレ分子をイオンィ匕し、加速電圧によってイオン に運動エネルギーを与えた後、各イオンの飛行速度の違いにより質量分離を行う装 置であり、例えば、市販の商品名「Voyager-DESTR」（製造元：アプライドバイオシス テムズ）や商品名「Ultraflex TOF/TOF」（製造元：ブルカーダルト二タス）を例示でき る。
[0015] MALDI-TOF/MSは、 1価陽イオン型のリン酸捕獲性亜鉛錯体/ S1P又は LPA複 合体の場合、 2' , 4' , 6' —トリヒドロキシ一ァセトフエノン (THAP)をマトリックスと し、陽イオン検出モードで実施できる。
[0016] 本発明の分析方法によれば、 S1Pや LPAの分子種別、例えば、結合している脂肪 酸の種類別に分析できる。さらに、本発明の分析方法は、ホスホリパーゼなどの各種 酵素による選択的加水分解と組み合わせれば、ホスファチジルコリン、ホスファチジ ノレセリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルイノシトール、スフインゴミ エリンなどのリン脂質の分子種 (結合脂肪酸やグリセリンへの結合位置別）を分析でき る。
[0017] 本発明の分析方法においては、内部標準としての S1Pや LPA (測定すべき S1P又 は LPAとは結合脂肪酸の炭素数、二重結合の数又は結合の位置が異なるもの、例 えば S1Pは C20あるいは C17等、 LPAは C17： 0あるレ、は C19： 0等）に対する測定 すべき S1Pや LPAの検出効率を測定して、予めそれぞれの測定すべき S1Pや LPA 分子種の検量線を作成しておき、試料に既知量の内部標準としての S1P又は LPA を添加後、内部標準のピークカウントと測定すべき SIPや LPA分子種のピークカウン トをそれぞれ測定し、検量線に基づいて測定すべき S1Pや LPA分子種を定量するこ とができる。内部標準としては、 S1Pに対しては S1P (C20又は C17)、 LPAに対して は LPA (C17： 0又は C19： 0)が好ましレ、。
[0018] また、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析によ る S1Pの分析用試薬キットに関し、このキットは、リン酸捕獲性亜鉛錯体及び非天然 型 S1P (C20あるいは C17等）を含む。非天然型 S1Pとしては S1P (C20又は C17) が好ましい。
[0019] さらに、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析に よる S1P及び LPAの同時分析用試薬キットに関し、このキットは、リン酸捕獲性亜鉛 錯体、非天然型 SIP (C20あるいは C17等）及び非天然型 LPA (C17： 0あるいは C 19 : 0等）を含む。非天然型 S1Pとしては S1P (C20又は C17)、非天然型 LPAとして は LPA (C17： 0又は C19： 0)が好ましレ、。
[0020] 加えて、本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析 による S1Pの分析又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析 による S1P及び LPAの同時分析におけるリン酸捕獲性亜鉛錯体の使用に関する。
[0021] 本発明の分析方法は、多検体の S1Pや LPAの分子種を少量の試料で迅速かつ 精度良く測定できるので、 S1Pや LPAが関係する種々の疾患や病態の診断や、 S1 Pや LPAの細胞レベルもしくは個体レベルでの機能の解明ができる。上記の疾患や 病態又は機能としては、例えば、卵巣ガン、卵管ガン、乳ガン、子宮ガン、心環状動 脈疾患、心不全、免疫疾患、喘息、アレルギー性疾患、血管新生、炎症、糖尿病、動 脈硬化症、筋繊維芽細胞症、発作、ストレス性疾患、脳機能の異常、血栓、骨代謝 異常、血液の凝固異常、創傷、遺伝子の発現、アポトーシス、ァラキドン酸代謝、細 胞増殖、細胞分化、血小板の活性化、 N〇合成などがある。
実施例
[0022] 実施例 1
S1P (C20)及び LPA(C17 : 0)の調製
内部標準としての S IP (C20)及び LPA (C17： 0)を以下のようにして調製した。 1. S1P(C20)
S1P(C20)は、 Avanti Polar Lipids, Inc. より購入した。
2. LPA(C17:0)
市販の 1 2—ジヘプタデカノィル一ホスホコリン（C 17： 0/C17： 0— PC)を市販の 蛇毒由来ホスホリパーゼ Aで処理し、 1_ヘプタデカノィル一 2_リゾ一ホスホコリン を得た。この 1_ヘプタデカノィル _2—リゾ一ホスホコリンをキャベツより調製したホス ホリパーゼ Dで処理して LPA (C17： 0)を得た。
[0023] 実施例 2
検量線の作成
内部標準物質である S1P(C20)の一定量（3.2nmol)と種々の量（0.32 ol 1. 6nmol 3.2nmol 6.4nmolあるレヽは 12.8nmol)の SIP (C18)とを混合し、 0.1%ァ ンモユア/メタノール液 100 μ 1に溶解した。それぞれの溶液の 10 μ 1に ImMの Zn L3 +溶液 5 μΐを加えて混合した。この混合液 0.5 /ilをプレートにスポットし、直ちに THA
P溶液（THAP10mg/mlァセトニトリル溶液） 0· 5 /i 1を重層し、プレート上で混合した
。乾燥後、 MALDI-TOF/MSを用いて測定を行い、検量線を作成した。図 2に S1P(C
20)及び SIP (C18)を共に 3.2nmol混合したサンプルについて測定した結果を示し た。なお、図 2の測定条件は以下の通りである。
測定モード ：リフレタター (Reflector) 加速電圧 ：20000V
グリッド電圧 :72.500% 遅延 :200ns pulse
レーザー強度 ：2500 測定回数 ：256
真空度 ：4.70X10— 7Torr
また、これらの測定結果から得られた検量線を図 3に示した。
[0024] さらに、図 4には、本測定法で内部標準物質に用いる S1P(C20)及び LPA(C17:
0)を共に 3.2nmol混合したサンプルについて測定した結果を示した。なお、図 4の 測定条件は以下の通りである。
測定モード ：リフレタター (Reflector) 加速電圧 ：20000V
グリッド電圧 :72.500% 遅延 :200ns pulse
レーザー強度 ：2450 測定回数 ：256 真空度 ：4. 85 X 10 Torr
[0025] 実施例 3
ヒト血漿からの S IP及び LPAの分離
ヒト血漿 3ml ( X 4)に 6N塩酸 0. 6ml、クロ口ホルム 4ml及びメタノール 8mlを加え撹 拌し、さらに内部標準として 3. 2画 1の S 1P (C20)と 16. lnmolの LPA (C17： 0)と を加え撹拌した。これにクロ口ホルム 3mlと水 3. 75mlを加え抽出し、上層を得た。さら に上層をクロ口ホルム 6. 9mlで 2回抽出し、クロ口ホルム層を集め濃縮した。残渣にク ロロホノレム 2. 5mlと 0. 1 %アンモニア Zメタノール溶液 5mlと水 2mlを加えてこれを溶 解した。さらに、クロ口ホルム 2. 5mlと水 2. 5mlを加え攪拌した。下層を廃棄し、上層 をクロ口ホルム 5mlで洗浄、分液し下層を廃棄した。上層にクロ口ホルム 5mlと 4N塩酸 100 μ ΐとをカロえ抽出した。上層をさらにクロ口ホルム 5mlで 2回抽出し、下層を集めて 、濃縮した。残渣をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒:クロ口ホルム Zメタノ ール/ 28%アンモニア水 = 60/35/8 (V/V/V) )で展開した後、 S 1P及び LP Aに相当するバンドのシリカゲルを搔き取り、これを抽出し、濃縮した。
[0026] 実施例 4
S 1P及び LPAの分析
実施例 3で濃縮したリン脂質を 0. 1 %アンモニア/メタノール溶液 0. 1mlに溶解し 、その 10 μ 1を ImMの Zn L3+溶液 5 μ 1と混合した。この溶液 0. 5 μ 1をプレートにスポ
2
ットして、直ちに 0· 5 μ 1の ΤΗΑΡ溶液（THAP10mg/mlァセトニトリル溶液）を重層し 、プレート上で混合した。数分間乾燥し、 MALDI-TOF/MSを用いて測定を行った。 M ALDI-TOF/MSによる測定結果を図 5及び表 1に示した。なお、図 5の測定条件は以 下の通りである。
測定モード ：リフレタター (Reflector) 加速電圧 ：20000V
グリッド電圧 ：72. 500% 遅延 ：200ns pulse
レーザー強度 ：2500 測定回数 ：256
真空度 : 5. 72 X 10— 'Torr [0027] 表 ヒト血漿 1 1 mlからの S1 Pと LPAの検出結果
S1 P
Count Count-base nmol/ 11 ml nmol/ ml
C18 2,361 1 ,459 8.0 0.72
C20 (内） 1 ,494 592 - - base 902
Count Count-base 15%同位体補正 検出効率補正 nmol/ 11 ml nmol/ ml
16:0 1 1 ,397 10,495 10,495 10,495 18.4 1.67
17:0 (内) 10,143 9,241 9,241 9,241 - -
18:2 8,134 7,232 7,232 3,616 6.5 0.59
18:1 4,360 3,458 2,373 1 ,187 2.1 0.19
18:0 4,564 3,662 3,144 1 ,572 2.7 0.25
20:4 2,518 1 ,616 1 ,616 808 1.4 0.13
22:6 1 ,498 596 596 298 0.5 0.05 base 902 - - - -
Total 2.88 表 1における「base」、「Count- base」、「15%同位体補正」及び「検出効率補正」は 次の意味である。
マススペクトル上で検出されたそれぞれのピークの強度（Count)力 ベースラインの 値（base)を差し弓 Iレ、た値をそのイオンの真の強度とした（Count- base)。
[0028] 天然に存在する炭素は12 Cと13 Cとが 100 : 1程度の割合で存在する。このため、図 4 に示すように、たとえ単一分子種であっても、その分子が12 Cからのみ構成される〔M〕 +だけでなぐ分子中に13 Cを 1個含む〔Μ + 1〕+、あるいはこれを 2個含む〔M + 2〕 + が検出される。このことは天然に存在する LPAの分子種別定量をやや複雑にしてい る。例えば、 LPA(C18 : 2)のリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体の〔M〕 +は m/zl0 21として検出される力 その〔M + 2〕+は m/zl023として検出される。これは LPA ( C18 : l)のリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体の〔M〕+と同じになってしまう。従って、 このような場合には検出された m/zl023のイオン強度の内、 LPA (C18 : 2)の〔M + 2〕+に由来する部分を差し引き、その残りが LPA (C18 : 1)のリン酸捕獲性亜鉛錯 体との複合体の〔M〕 +と解釈すべきである。 LPAのリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合 体では〔M + 2〕 +は〔M〕+の約 15%で出現することがわかっているので、この値を用 レ、て補正した（15%同位体補正)。
[0029] また、 LPAはパルミチン酸などの飽和脂肪酸の結合した飽和型 LPA分子種とリノ ール酸などの不飽和脂肪酸の結合した不飽和型 LPA分子種が存在する。検出効率 を比較した結果、レ、ずれの不飽和型 LPA分子種の検出効率も飽和型 LPA分子種 のそれに比べて 2倍であった。今回、内部標準に用いた非天然型 LPAは飽和型で ある。そこで、検出効率の違いを補正するために、不飽和型 LPA分子種の場合には 、観察されたイオン強度を 2分の 1に補正した (検出効率補正)。
産業上の利用可能性
[0030] 本発明により、 S1Pや LPAを少量の試料量で迅速かつ精度良く測定することがで き、 S1Pや LPAが関係する種々の疾患や病態の診断や、 S1Pや LPAの細胞レベル もしくは個体レベルでの機能の解明ができる。

Claims

請求の範囲
[1] 試料中に存在するスフインゴシン— 1—リン酸とリン酸捕獲性亜鉛錯体との複合体 を形成し、この複合体をマトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分 析計を用いて分析することを特徴とする、スフインゴシン _ 1 _リン酸の分析方法。
[2] 試料中に標準物質として非天然型スフインゴシン— 1—リン酸を添加する請求の範 囲第 1項記載の分析方法。
[3] 試料中のスフインゴシン 1 リン酸及びリゾホスファチジン酸とリン酸捕獲性亜鉛 錯体との複合体を形成し、この複合体をマトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行 時間型質量分析計を用いて分析することを特徴とする、スフインゴシン 1 リン酸及 びリゾホスファチジン酸の同時分析方法。
[4] 試料中に標準物質として非天然型スフインゴシン 1 リン酸及び非天然型リゾホ スファチジン酸を添加する請求の範囲第 3項記載の分析方法。
[5] リン酸捕獲性亜鉛錯体が 1 , 3 -ビス [ビス（ピリジン— 2—ィルメチル)ァミノ]プロパ ンー 2—オラートニ亜鉛 (II)錯体である請求の範囲第 1〜4項のレ、ずれか 1項記載の 分析方法。
[6] リン酸捕獲性亜鉛錯体及び非天然型スフインゴシン— 1 _リン酸を含む、マトリック ス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析によるスフインゴシン _ 1 _リン 酸の分析用試薬キット。
[7] リン酸捕獲性亜鉛錯体、非天然型スフインゴシン— 1 _リン酸及び非天然型リゾホス ファチジン酸を含む、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析 によるスフインゴシン一 1 _リン酸及びリゾホスファチジン酸の同時分析用試薬キット。
[8] マトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析によるスフインゴシン - 1 _リン酸の分析におけるリン酸捕獲性亜鉛錯体の使用。
[9] マトリックス支援レーザー脱離イオン化 '飛行時間型質量分析によるスフインゴシン
1 リン酸及びリゾホスファチジン酸の同時分析におけるリン酸捕獲性亜鉛錯体の 使用。
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