WO2006075497A1 - プローブユニット、ヌクレオチド領域の同定装置、及びヌクレオチド領域の同定方法 - Google Patents

プローブユニット、ヌクレオチド領域の同定装置、及びヌクレオチド領域の同定方法 Download PDF

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WO2006075497A1
WO2006075497A1 PCT/JP2005/023539 JP2005023539W WO2006075497A1 WO 2006075497 A1 WO2006075497 A1 WO 2006075497A1 JP 2005023539 W JP2005023539 W JP 2005023539W WO 2006075497 A1 WO2006075497 A1 WO 2006075497A1
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probe
nucleotide
nucleic acid
electrode
target nucleic
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PCT/JP2005/023539
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French (fr)
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Akimitsu Okamoto
Taku Kamei
Isao Saito
Original Assignee
Kyoto University
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors

Definitions

  • Probe unit nucleotide region identification device, and nucleotide region identification method
  • the present invention relates to a probe unit for identifying the state of a nucleotide region at a specific position in a target nucleic acid, a nucleotide identification apparatus comprising this probe, and a nucleotide identification method.
  • a method is known in which a probe and a target nucleic acid are orbridized and the melting temperature is measured. More specifically, the base is identified by utilizing the fact that the base at a predetermined position of the probe forms a base pair with the corresponding base of the target nucleic acid and does not form a base pair.
  • the probe or target nucleic acid is usually labeled using a fluorescent substance or a radioactive substance.
  • a fluorescent substance or a radioactive substance.
  • complicated work in the controlled area is required.
  • a special detector is required, which increases the cost.
  • Electrochemical methods have come to be used as nucleotide detection methods instead of fluorescent or radiolabeling methods.
  • Patent Documents 1 and 2 after hybridizing a target nucleic acid with a nucleic acid probe immobilized on an electrode surface, this reaction solution is electrically responsive like an intercalator to a double-stranded nucleic acid.
  • a method is disclosed in which the presence or absence of a hybrid, and hence the nucleotide at a specific position, is identified by adding a reagent and detecting the redox potential derived from this electroresponsive reagent.
  • thermodynamic background is similar, it cannot be detected as a mismatch and the detection sensitivity is low.
  • target nucleotides are identified based on the presence or absence of hybridization, it is necessary to set the optimal hybridization conditions for each target nucleic acid, and due to fluctuations in hybridization efficiency. Detection errors are likely to occur.
  • Patent Document 3 a nucleic acid probe is connected to an electrode via a spacer, and after the target nucleic acid and the nucleic acid probe are neutralized, an electroresponsive reagent such as an intercalator is added. Discloses a method for identifying the presence / absence of hybridization, and thus the nucleotide at a specific position, by detecting the redox potential derived from this electroresponsive reagent. Since the method of Patent Document 2 uses a spacer, the nucleic acid probe can easily move in the reaction solution, so that the efficiency of hybridization with the target nucleic acid is increased, and the identification efficiency of the specific nucleic acid is improved.
  • Patent Document 3 is also different from the methods of Patent Documents 1 and 2 in that it requires the addition of an electrically responsive reagent and is affected by the hybridization efficiency.
  • Patent Document 4 is a probe having a reverse sequence complementary to each other in a molecule and a sequence complementary to a target nucleic acid sandwiched between them, and has a redox group at one end.
  • a method is disclosed in which a specific nucleotide in a target nucleic acid is identified using a nucleic acid to which a nucleotide is bound and the other end is connected to an electrode.
  • this probe takes a hairpin structure when it is isolated and hybridized within the molecule, and the acid reduction unit and the electrode are close to each other, but when the probe is hybridized with the target nucleic acid, the hairpin structure is opened.
  • the redox unit moves away from the electrode force. By detecting this change as an electrochemical signal, the presence or absence of abnormalities is detected.
  • Patent Document 4 does not require an electrically responsive reagent! Therefore, it is necessary to set the optimal conditions for the hybridization.
  • Patent Document 1 Patent 2573443 Specification
  • Patent Document 2 Japanese Translation of Special Publication 2002-510791
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-61237
  • Patent Document 4 WO2004 / 035829
  • the present invention provides a highly sensitive probe unit, nucleotide identification apparatus, and nucleotide region identification method capable of identifying the state of a target nucleotide region in a target nucleic acid without depending on hybridization efficiency. The issue is to provide.
  • a hole transfer inducer is bound to one end of an oligonucleotide probe and the other end is bound to an electrode, the probe and target nucleic acid are hybridized, and then light and other energy are supplied to the probe. Then, hole movement (hole hopping) occurs via a nucleotide having guanine or cytosine in the probe, and this hole movement is detected as an electric signal at the electrode.
  • nucleotide pairing with guanine in the target nucleic acid is deoxycytidylic acid or cytidylic acid, or when the nucleotide pairing with cytosine in the target nucleic acid is deoxyguanylic acid or guanylic acid, that is, GC base pair Is formed
  • the nucleotide force that binds to guanine is a force that is not deoxycytidylic acid or cytidylic acid.
  • the nucleotide that binds to cytosine is other than deoxyguanylic acid or guanylic acid. In other words, if base pairs do not match, hole movement is unlikely to occur, resulting in a small electrical signal.
  • R, R, R, R, and R are each independently a hydrogen atom, an amino group, or a mono group
  • an oligonucleotide derivative containing a nucleotide derivative represented by the following formula as a probe when detecting an electric signal due to hole movement in the same manner as 0, when the nucleotide paired with the nucleotide derivative is deoxythymidyl acid: The ability to generate a large electrical signal that is likely to cause hole movement. In the case of other nucleotides, the electrical signal that is difficult to cause hole movement is small.
  • the specific nucleotide in the target nucleic acid is deoxythymidylic acid. It is possible to detect whether or not the force is high without sensitivity to the efficiency of the hybridization.
  • Whether or not the nucleotide at a specific position in the target nucleic acid is deoxyadenylic acid can be identified by examining whether or not the corresponding nucleotide in the complementary strand of the target nucleic acid is deoxythymidylic acid.
  • the present invention has been completed based on the above findings, and provides the following probe unit, nucleotide region identification apparatus, and nucleotide region identification method.
  • Item 1 A probe unit for identifying a target nucleotide region in a target nucleic acid, comprising an electrode, a probe that recognizes the target nucleic acid bound to the electrode, and a hole transfer inducer that binds to the probe And a probe unit in which a nucleotide region that is paired with the target nucleotide region is located between the hole transfer inducer binding position and the electrode binding end of the probe.
  • Item 2 A probe unit for identifying a target nucleotide in a target nucleic acid, wherein a nucleotide pairing with the target nucleotide is located between the hole transfer inducer binding position and the electrode binding end of the probe.
  • Item 3 The probe unit according to Item 1, wherein the probe recognizes the target nucleic acid by hybridizing with the target nucleic acid.
  • Item 4 The probe unit according to Item 1, wherein the probe is composed of 6 to 30 nucleotides or derivatives thereof.
  • Item 5 The probe unit according to Item 1, wherein the hole transfer inducing agent is a photosensitizer.
  • Item 6 The probe unit according to Item 5, wherein the photosensitizer is capable of causing photoexcited hole movement.
  • Item 7 The probe unit according to Item 5, wherein the photosensitizer is at least one selected from the group consisting of a quinone sensitizer, a flavin sensitizer, and a benzophenone sensitizer.
  • Item 8 The probe unit according to Item 1, wherein the probe is coupled to the electrode via a spacer.
  • Item 9. The spacer is selected from the group consisting of organic low molecular weight compounds, nucleic acids, and polypeptides.
  • Item 9. The probe unit according to Item 8, which is a substance to be selected.
  • Item 10 The probe unit according to Item 8, wherein the length of the spacer is 1 to 3 nm.
  • Item 11 The probe unit according to Item 1, comprising a plurality of electrode spacers on a spacer coupling surface of the electrode.
  • the probe unit according to Item 2 which has a probe power of 3 ⁇ 4 NA and the nucleotide base paired with the target nucleotide in the probe is guanine or cytosine.
  • R, R, R, R, R, and R each independently represent a hydrogen atom, an amino group, or a mono group.
  • the probe unit according to Item 2 which is an oligonucleotide derivative containing a nucleotide derivative represented by the formula:
  • Item 14 The probe unit according to Item 1, wherein the number of consecutive nucleotides selected from the group having A and T forces in the probe is 3 or less.
  • Item 15 The probe unit according to Item 1, which is a nucleotide other than the nucleotide force and C located on the opposite side of the electrode binding end with respect to the nucleotide bound to the hole transfer inducer in the probe.
  • Item 16 The probe unit according to Item 1, wherein a hole transfer-inducing agent is bound to a nucleotide inside the probe.
  • Item 17 A substrate, a probe unit according to any one or more of Items 1 to 16, and a probe
  • a nucleotide region identification device comprising a probe electrode force and means for detecting an electrochemical signal, the electrode of the probe unit being arranged on the substrate so as to detect the electrochemical signal.
  • Item 18 A method for identifying a nucleotide region of interest comprising:
  • a hole transfer inducer is bound directly or indirectly to the probe or target nucleic acid, and at this time, the target nucleotide region is paired between the hole transfer inducer binding position and the electrode binding position of the probe.
  • the target nucleotide region is located between the position corresponding to the electrode binding position of the probe in the target nucleic acid and the hole transfer inducing agent binding position so that the nucleotide region to be combined is located.
  • Item 19 The method according to Item 18, wherein a hole transfer inducing agent is bound to the probe.
  • Item 20 The method according to Item 18, wherein the second step is performed before the first step.
  • Item 21 The method according to Item 18, wherein the target nucleotide region comprises one target nucleotide force.
  • Item 22 The method according to Item 18, wherein the probe comprises 6 to 30 nucleotides or a derivative thereof.
  • Item 23 The method according to Item 18, wherein the hole transfer inducing agent is a photosensitizer.
  • Item 24 The method according to Item 23, wherein the photosensitizer is capable of causing photoexcited hole movement.
  • Item 25 The method according to Item 23, wherein the photosensitizer is at least one selected from the group consisting of a quinone sensitizer, a flavin sensitizer, and a benzophenone sensitizer.
  • Item 26 The method according to Item 18, wherein the probe force is coupled to the electrode via a spacer.
  • Item 27 The method according to Item 26, wherein the spacer is a substance selected from the group consisting of a low-molecular weight organic compound, a nucleic acid, and a polypeptide.
  • Item 28 The method according to Item 26, wherein the length of the spacer is 1 to 3 nm.
  • Item 29 The method according to Item 18, wherein the electrode comprises a plurality of electrode spacers on a spacer bonding surface.
  • Item 30 Probe power 3 ⁇ 4NA, the nucleotide base pairing with the target nucleotide in the probe is guanine or cytosine, and the target nucleotide base in the target nucleic acid in the third step is cytosine or guanine.
  • R, R, R, R, R, and R are each independently a hydrogen atom, an amino group, or a mono group.
  • Item 22 The method according to Item 21, wherein in the third step, it is determined whether or not the base of the target nucleotide in the target nucleic acid is thymine in the third step.
  • Item 32 The method according to Item 18, wherein the number of consecutive nucleotides selected from the group consisting of A and T forces in the probe is 3 or less.
  • Item 33 The method according to Item 18, wherein the nucleotide is a nucleotide other than the nucleotide force and C located on the opposite side of the electrode-binding end with respect to the nucleotide bound to the hole transfer inducer in the probe.
  • Item 34 The method according to Item 18, wherein a hole transfer-inducing agent is bound to a nucleotide inside the probe.
  • Item 35 The method according to claim 18, wherein the energy is irradiated in an amount of 1 to 100 mW'cm- 2 .
  • Item 36 The method according to Item 23, wherein light having a wavelength of 300 to 600 nm is irradiated.
  • Item 37 A step of hybridizing the probe in the probe unit according to Item 12 and a target nucleic acid
  • a method for identifying a nucleotide region of interest comprising:
  • the target nucleotide region also has a single nucleotide force.
  • the determination step by determining whether the target nucleotide in the target nucleic acid is complementary to the corresponding region in the probe, 38.
  • the method according to item 37 wherein it is determined whether or not the base of the target nucleotide in the target nucleic acid is cytosine or guanine.
  • Item 39 The method according to Item 37, wherein the energy is supplied from 1 to 100 mW'cm- 2 .
  • Item 40 The method according to Item 37, wherein the energy is light and irradiation is performed with light having a wavelength of 300 to 600 nm.
  • Item 41 A step of hybridizing the probe in the probe unit according to Item 13 and a target nucleic acid;
  • a method for identifying a nucleotide region of interest comprising: [0070] Item 42.
  • the target nucleotide region also has one nucleotide force.
  • the determination step by determining whether the target nucleotide in the target nucleic acid is complementary to the corresponding region in the probe, 42.
  • the method according to item 41 wherein it is determined whether or not the base of the target nucleotide in the target nucleic acid is thymine.
  • Item 43 The method according to Item 41, wherein the energy is supplied from 1 to 100 mW ′ cm ⁇ 2 .
  • Item 44 The method according to Item 41, wherein the energy is light and irradiation is performed with light having a wavelength of 300 to 600 nm.
  • Item 45 A method for producing a probe unit for identifying a target nucleotide region in a target nucleic acid, comprising directly or indirectly binding a hole transfer inducer to a probe that recognizes the target nucleic acid, and a probe A process of bonding one end of the electrode to the electrode, and the hole transfer inducer bonding process! A method of binding a hole transfer inducer such that a nucleotide region that is paired with a target nucleotide region is located between the hole transfer inducer binding position of the probe and the electrode binding end.
  • the nucleotide region identification method of the present invention detects an electric signal due to energy-induced hole movement in a nucleic acid probe, and utilizes this phenomenon in which the hole transfer efficiency varies depending on the type of nucleotide to be paired. Since it is a method for identifying the target nucleotide, the nucleotide can be identified with extremely high sensitivity. In addition, if there is a deletion or insertion in the probe in the target nucleic acid and the probe and the target nucleic acid are not one-to-one, the hole transfer efficiency will be reduced. And the nucleotide region of the target nucleic acid, including detection of insertion.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of nucleotide identification using probe 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of nucleotide identification using probe 2.
  • FIG. 3 shows a method for synthesizing an MDA-containing deoxyribonucleoside derivative.
  • FIG. 4 shows a method for synthesizing MDA-containing oligonucleotide derivatives.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of nucleotide identification using probe 3.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of nucleotide identification using probe 4.
  • Figure 7 Shows the results of classifying 25 panelists as ⁇ / ⁇ homozygous, c / c homozygous, or C / T heterozygous by identification of nucleotides using both G and MDA probes.
  • the probe unit of the present invention is a probe unit for identifying a target nucleotide region in a target nucleic acid, and includes an electrode, a probe that recognizes the target nucleic acid bound to the electrode, and hole migration induction that binds to the probe. Agent.
  • the nucleotide region that is paired with the target nucleotide region is located between the electrode binding end and the hole transfer inducing agent binding position.
  • Probes are oligonucleotides or derivatives thereof that recognize target nucleic acids, including those that recognize target nucleic acids by hybridizing under some conditions [0080]
  • the probe unit of the present invention includes an oligonucleotide or a derivative thereof (first probe) or an oligonucleotide derivative containing the nucleotide derivative represented by the above formula (1) (second probe). ).
  • the first probe When the first probe is for detecting a match or mismatch with the target nucleic acid, that is, for identifying the type of nucleotide of interest in the target nucleic acid, the first probe May be sufficient if substantially all nucleotides are complementary to the corresponding region of the target nucleic acid, except for the nucleotide corresponding to the nucleotide to be identified in the target nucleic acid.
  • the nucleotide base corresponding to the nucleotide to be identified is guanine or cytosine.
  • the second probe is for detecting a match or mismatch with the target nucleic acid, that is, for identifying the type of nucleotide of interest in the target nucleic acid
  • the second probe it is sufficient that substantially all nucleotides are complementary to the corresponding region of the target nucleic acid except for the nucleotide corresponding to the nucleotide to be identified in the target nucleic acid.
  • the nucleotide derivative represented by the formula (1) is paired with the target nucleotide in the target nucleic acid.
  • R is an amino group
  • R force is a S methoxy group
  • R and R are hydrogen atoms (methoxybenzodazaadenine; MDA-containing nuclei
  • First and second probe forces When the number of nucleotides to the probe of the target nucleic acid is to be detected, that is, when nucleotide insertion is to be detected, the nucleotides of the target nucleic acid jump out of the double-stranded force when hybridized. In this case, that of the target nucleic acid It suffices that substantially all of the region excluding the protruding region and the probe are complementary.
  • first and second probes are short of nucleotides relative to the target nucleic acid probe.
  • the probe nucleotide jumps out of the double strand when hybridized.
  • the target nucleic acid and the region excluding the protruding region in the probe are substantially all complementary.
  • the nucleotide located on the side opposite to the electrode binding end with respect to the nucleotide to which the hole transfer inducer is bound that is, the nucleotide located on the open end side from the binding position of the hole transfer inducer.
  • Is indispensable to G it is preferable to adopt inosine-containing nucleotides instead of G. Thereby, the hole movement from the hole movement inducing agent to the electrode direction can be performed more efficiently.
  • nucleotide derivative of the general formula (1) typically an MDA-containing nucleotide. This suppresses a decrease in hole movement efficiency due to the presence of A or T. In this case, the nucleotide derivative of the general formula (1) is not involved in the identification of the nucleotide in the target nucleic acid.
  • Each of the first and second probes may be DNA or RNA, but is preferably DNA from the viewpoint of easy hole migration and high detection sensitivity.
  • modified DNA such as phosphoroate DNA and H-phosphonate DNA
  • modified RNA such as 2′-0-RNA and phosphoroate RNA
  • so-called chimeric nucleotides of DNA and RNA can also be used.
  • the length of the probe is not particularly limited, and includes what is called a polynucleotide in addition to what is usually called an oligonucleotide.
  • the length is not limited thereto, but preferably about 6 to 30 bases, more preferably about 6 to 20 bases.
  • the melting temperature (Tm) becomes room temperature or higher, and a stable base pair can be formed with the target nucleic acid at room temperature, and a sufficiently strong electrochemical response to energy supply can be obtained. .
  • the nucleotide that is paired with the nucleotide region to be identified or the region that also has a derivative force thereof is a nucleoside to which a hole transfer inducer is bound. It is only necessary to be positioned between the terminal and the electrode binding end, but if it is too far, the difference in electrochemical signal between matching and mismatching tends to be small. It is desirable to design so that it may be located in the center part.
  • Any hole transfer inducing agent may be used as long as it can induce hole movement in the probe to which it is bonded by irradiation with energy such as light or electron beam.
  • a typical example of the hole transfer inducing agent is a photosensitizer.
  • a photosensitizer is not specifically limited, A well-known thing can be used.
  • quinone-based molecules such as anthraquinone, flavin-based molecules such as lumiflavin, benzophenone-based molecules such as cyanobenzophenone
  • nucleoacid-binding dyes such as bromide thiodium
  • nucleic acids such as tri-ruruthenium Examples include binding metal complexes.
  • quinone-based, flavin-based, and benzophenone-based sensitizers are preferable in terms of high detection sensitivity.
  • the quinone molecule and the flavin molecule are intercalators, the position is kept stable by interlinking between the two strands after hybridization with the target nucleic acid.
  • anthraquinone is preferred because quinone sensitizers are preferred.
  • the hole transfer inducing agent binds to a nucleotide located on the opposite side of the electrode binding end across the nucleotide region corresponding to the nucleotide region to be identified in the probe! It is preferable that the hole transfer inducer is bound to the internal nucleotide rather than the terminal nucleotide of the probe, so that the hole transfer inducer is located between the two strands and the position is kept stable.
  • the hole transfer inducing agent is applied to the probe.
  • it may be bound to the 5 ′ end side from the position where it is paired with the target nucleotide, or may be bound to the 3 ′ end side.
  • the hole transfer inducing agent may be directly bonded to the probe, but the nucleotide in the probe may be aminated, for example, and bonded to this amino group.
  • the binding amount of the hole transfer inducer is preferably about 1 to 20 molecules, more preferably about 1 to 3 molecules per probe. If the above binding amount, And the base identification sensitivity is increased. That is, when the amount of hole transfer inducer is extremely large, even if there is a mismatched base pair, etc., hole transfer occurs, and the matching base pair cannot be specifically detected. Such a problem does not occur.
  • the probe is preferably bonded to the electrode via a spacer.
  • the spacer plays a role in preventing the movement of the hole through the entire probe by contacting the electrode when the probe is bent.
  • the kind of spacer molecule is not particularly limited, and examples thereof include organic low molecular weight compounds; polypeptides; nucleic acids and the like.
  • the spacer should have a functional group for bonding to the electrode at one end.
  • a functional group include a thiol group, a kaic acid residue, a phosphoric acid residue, an amino group, and a piotine residue.
  • the length of the spacer is preferably about 1 to 3 nm. Within the above range, the function of the spacer can be sufficiently achieved, and the terminal force of the probe does not hinder the hole movement to the electrode. This length corresponds to a length of about C to C when the portion excluding the terminal functional group of the spacer is a linear saturated hydrocarbon. Spacer is also the nucleus
  • the spacer When it is an acid, it corresponds to a length of about 1 to 5 nucleotides. When the spacer is a polypeptide, it corresponds to a length of about 1 to 10 amino acids.
  • the spacer has a length of about C to C, particularly about C to C, excluding the terminal functional group.
  • Preferred is a straight chain saturated hydrocarbon.
  • spacers include C to C (especially C to c) alkylthiols and alkylamines.
  • the electrode is for detecting a photocurrent flowing through the probe.
  • the electrode material is not particularly limited, and examples thereof include noble metals such as gold, platinum, platinum black, palladium, and rhodium; carbon such as graphite and glassy bonbon; titanium oxide, tin oxide, Examples thereof include metal oxides such as manganese oxide, lead oxide and ITO; semiconductors such as silicon, germanium, gallium arsenide and zinc oxide; titanium and the like.
  • noble metals such as gold, platinum, platinum black, palladium, and rhodium
  • carbon such as graphite and glassy bonbon
  • titanium oxide, tin oxide examples thereof include metal oxides such as manganese oxide, lead oxide and ITO; semiconductors such as silicon, germanium, gallium arsenide and zinc oxide; titanium and the like.
  • This electrode is, for example, a two-electrode system or a three-electrode system as a means for detecting an electrochemical signal.
  • the working electrode can be used.
  • the area of the electrode is not particularly limited, but it may usually be about lmm 2 to lcm 2 . If it is this range, the probe of the quantity which gives the electric signal of the magnitude
  • a probe of about lftnol to l ⁇ mol, preferably about lpmol to 10 nmol, per lmm 2 may be bound on one electrode. Within this range, it is possible to detect an electrochemical signal that is large enough to be detected even by a single base difference or insertion or deletion of a single base.
  • the probe unit of the present invention preferably includes a plurality of electrode spacers on the probe unit coupling surface of the electrode. This electrode spacer serves to prevent the probe unit from directly contacting the electrode and hindering hole movement through the probe.
  • the electrode spacer has a functional group for bonding to the electrode at one end, and a hydrophilic functional group such as a hydroxyl group, an amino group, or a carboxyl group at the other end. preferable.
  • a hydrophilic functional group such as a hydroxyl group, an amino group, or a carboxyl group at the other end.
  • the length of the electrode spacer is preferably about 1 to 3 nm. Within the above range, the function of the electrode spacer can be sufficiently achieved. This length is C to C when the portion excluding the terminal functional group of the electrode spacer is a linear saturated hydrocarbon.
  • the spacer corresponds to a length of about 10.
  • the spacer is a nucleic acid, it corresponds to a length of about 1 to 5 nucleotides.
  • the electrode spacer is a polypeptide, it corresponds to a length of about 1 to 10 amino acids.
  • the electrode spacer has a length of about C to C, particularly about C to C, excluding the terminal functional group.
  • Preferred is a linear saturated hydrocarbon of 2 10 4 8.
  • a specific example of such an electrode spacer is C
  • the electrode spacer is usually about 1 to 1000 molecules, preferably 100, per probe molecule. If ⁇ 500 molecules are bound to the electrode. If it is within the above range, the effect can be sufficiently obtained.
  • the method for producing a probe unit of the present invention includes a step of binding a hole transfer inducing agent to a probe that recognizes a target nucleic acid, and a step of binding one end of the probe to an electrode.
  • the hole transfer inducer is bound so that the nucleotide region that is paired with the target nucleotide region is located between the hole transfer inducer binding position of the probe and the electrode binding end.
  • the probe and the region, and the probe and the electrode may be bonded by a covalent bond.
  • the nucleotide identification apparatus of the present invention comprises a substrate, one or a plurality of the probe units, and means for detecting an electrochemical signal with the electrode force of the probe unit.
  • the probe unit is arranged on the substrate so that its electrode force electrochemical signal can be detected.
  • the base supports the probe unit, and in the case of using a plurality of probe units, plays a role of insulating the electrodes of these probe units.
  • the base material is not particularly limited as long as it is an electrically insulating material.
  • examples thereof include ceramics such as glass, cement, and ceramics; polymers such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate, polystyrene, and polymethyl methacrylate; silicones and activated charcoal.
  • the electrodes of the probe unit are insulated from each other by a base material, and are connected to a means for detecting an electrochemical signal.
  • the means for detecting an electrochemical signal is not particularly limited as long as a minute current due to hole movement can be detected as a current, voltage, cron amount, resistance value, and the like.
  • a device capable of detecting such a minute current for example, a two-electrode type or a three-electrode type electrochemical cell can be cited.
  • the electrochemical signal detection means includes a reference electrode or a reference electrode and a counter electrode, and a voltmeter or an ammeter. An electrochemical cell is formed as a working electrode together with this to detect photocurrent.
  • the method for identifying the nucleotide region of interest of the present invention comprises:
  • the force that binds the hole transfer inducer to the probe so that the nucleotide region that matches the target nucleotide region is located between the inducer binding position and the electrode binding position, and corresponds to the electrode binding position of the probe in the target nucleic acid.
  • the hole transfer inducer may be bound to either the probe or the target nucleic acid. In either case, the supplied energy is used by the hole transfer inducer to generate holes, causing hole transfer to the electrodes in the duplex.
  • the hall transfer inducer When binding to the probe, the hall transfer inducer is bound so that the nucleotide region that is paired with the target nucleotide region is located between the hole transfer inducer binding position and the electrode binding position of the probe. If you can.
  • the hole transfer inducer may be directly bound, but when binding the probe and target nucleic acid after hybridization, a DNA binding agent such as Hoechst 33258, mitomycin, cisplatin, or distamycin is added. Bind between two strands and bind the DNA A hole transfer inducing agent may be bonded to the mixture. Furthermore, if the hole transfer inducer is a DNA binding agent, you can just bind (bond) it between the two strands.
  • the probe, the spacer, the electrode, the electrode spacer, and the hole transfer inducing agent are as described for the probe unit of the present invention.
  • the probe unit of the present invention described above can be used without performing the second step.
  • the nucleotide region identification method of the present invention can be divided into the following first and second methods.
  • the method for identifying the first nucleotide of the present invention comprises a step of hybridizing the first probe (oligonucleotide) of the probe unit of the present invention and a target nucleic acid; By detecting the chemical signal and energizing the probe that does not hybridize the target nucleic acid, the target nucleotide region in the target nucleic acid and the corresponding region of the probe are compared with the electrochemical signal detected by the electrode force. Determining whether or not the force is completely complementary.
  • the target nucleotide in the target nucleic acid is complementary to the corresponding nucleotide of the probe, so that the base of the target nucleotide in the target nucleic acid is guanine or cytosine. Determine whether or not.
  • the base of the specific nucleotide in the probe that matches the target nucleotide to be identified in the target nucleic acid is guanine
  • the second nucleotide identification method of the present invention is the oligonucleotide identification method including the nucleotide derivative represented by the formula (1) in place of the first probe in the first identification method described above.
  • This is a method using a probe unit provided with a second probe comprising:
  • it is determined whether or not the target nucleotide in the target nucleic acid is complementary to the corresponding nucleotide in the probe, whereby the base of the target nucleotide in the target nucleic acid is thymine. It is determined whether or not the force is.
  • the target nucleic acid may be a single-stranded nucleic acid.
  • the target nucleic acid may be DNA or RNA, but DNA has higher detection sensitivity. In particular, when DNA or a derivative thereof is used as a probe and DNA is used as a target nucleic acid, nucleotides can be identified with high sensitivity.
  • the target nucleic acid is DNA because hole transfer occurs when the nucleotide derivative pairs with deoxythymidine.
  • the detection sensitivity is improved by amplifying the target nucleic acid by a known method such as PCR and then hybridizing it with the probe.
  • the nucleotide identification method of the present invention may include a step of amplifying the target nucleic acid prior to the hybridization step.
  • the target nucleic acid can also be used in the form of a sample containing a lot of contaminants such as blood collected from humans or a nucleic acid extract from foods that may contain microorganisms.
  • the sample is heat-treated at about 60 to 100 ° C. to denature the double-stranded nucleic acid into a single-stranded nucleic acid and preferably used after amplification by PCR or the like.
  • a target nucleic acid having a concentration of about lnM to lmM may be brought into contact with the probe of the present invention.
  • the hybridization conditions vary depending on the degree of complementarity between the oligonucleotide in the probe and the target nucleic acid, for example, 10-100 mM neutral buffer (typically 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7. 0 >>, for example, conditions of 5 to 40 ° C. for 30 seconds to 1 hour
  • 10-100 mM neutral buffer typically 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7. 0 >>, for example, conditions of 5 to 40 ° C. for 30 seconds to 1 hour
  • washing after hybridization is not necessarily required.
  • washing may be performed, for example, with 10 to 100 mM neutral buffer at 5 to 40 ° C for 30 seconds to 1 hour.
  • a crude sample such as a powerful nucleic acid extract can be directly contacted with the probe of the present invention.
  • a rough sample of about 5-40 ° C may be brought into contact with the probe for about 30 seconds to 1 hour.
  • the target nucleic acid probe is Nono Iburidizu usually L ⁇ 100mW'cm- 2 mm, preferably 5 ⁇ 50mW 'cm- 2 about energy density, few msec ⁇ l minutes, as light You just have to supply the right energy. If the energy density is in the above range, hole movement can be sufficiently caused. Moreover, even if the energy density is higher than this, it will only increase the cost.
  • the wavelength of the light is not particularly limited, and the wavelength may be adjusted to the photosensitive region of the hole transfer inducer (in this case, the photosensitizer). Ultraviolet light of about ⁇ 600 ° is preferred. If the wavelength is too short, the polynucleotide or the substrate absorbs light and induces an electric current, which may cause an error.
  • the detection is performed when the electrochemical signal detected by supplying energy to the probe with the target nucleic acid nominated and the target nucleic acid hybridized with the target nucleic acid under the same conditions. Compare with the electrochemical signal to be generated. This is because the absolute value of the signal varies depending on the sequence and length of the target nucleic acid or probe.
  • the signal value after hybridization is, for example, 1.5 or more, preferably When it is 3 or more, it can be determined that the base of the target nucleotide in the target nucleic acid is cytosine or guanine. If it is lower than that, it can be determined that the nucleotide of the target nucleotide is a force other than cytosine or guanine, there is a deletion or insertion in the probe, and it is hybridized 1: 1.
  • the value after hybridization is When the signal value is, for example, 1.5 or more, preferably 3 or more, it can be determined that the target nucleotide in the target nucleic acid is deoxythymidylic acid. If it is lower than that, it can be determined that the target nucleotide has a base other than thymine, and there is a deletion or insertion in the probe, so that it is one-to-one, and it has been hybridized.
  • the probe after hybridizing the target nucleic acid can be made into a single strand by heat treatment or formamide treatment and reused.
  • J H NMR was measured using a Varian Mercury 400 (400 MHz) spectrometer.
  • oligonucleotide was MALDI-TOF MS (Perseptive Voyager Elite, acceleration voltage 2 lkV, negative mode), and 2 ', 3', 4'-trihydroxyacetophenone was used as a matrix.
  • T8 [M -H-] 2370.61) and T1 as internal standards for oligonucleotides
  • Reversed phase HPLC was performed using a CHEMOCOBOND 5-ODS-H column (10 X 150 mm, 4.6 X 150 mm) with Gilson chromatograph model 305 and a UV detector model 118 at 254 nm.
  • the photosensitizer 2-anthraquinone carboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester was synthesized as follows.
  • DNA was synthesized by the phosphoramidite method using an applied Biosystem 392 DNA / RNA synthesizer. Incorporation of amino groups and disulfide groups was carried out using Amino-Modifier C2 T2 and Thio Modifier C6 SS (Glen Research), respectively.
  • the synthesized DNA was applied to reverse-phase HPLC on a 5-ODS-H column (10 x 150mm), and 0.1M triethylamine acetate (PH7.0) was applied with a linear gradient of 5-20% acetonitrile. Elution was performed by flowing at a flow rate of 3.0 mL / min for 30 minutes.
  • SEQ ID NO: 2 was synthesized.
  • CTGAAGTG)-(CH) -S-S- (CH) -T-3 '(nucleic acid part is SEQ ID NO: 2).
  • each oligodeoxynucleotide derivative was determined by comparison with the peak areas of O.lmM standard solutions of dA, dC, dG and dT. [0147] MALDI-TOF MS analysis was performed for each oligodeoxynucleotide derivative, and the following results were obtained.
  • a gold electrode with an area of 2 mm 2 was used. Prior to fixation of the oligodeoxynucleotide derivative, the electrode was immersed in boiling 2M potassium hydroxide for 3 hours and washed with deionized water. The electrode was then immersed in concentrated nitric acid for 1 hour and washed with deionized water.
  • target DNA To allow target DNA to be immobilized on a probe immobilized on a gold electrode, place 1 ⁇ L of a 10 ⁇ L target DNA solution on the gold electrode and place the end of the electrode to prevent evaporation of the solution. Covered with a rubber cap and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • sample 1 (3'-AAGTGAAGTCAC-5 ') (SEQ ID NO: 3) and sample 2 (3'-AAGTGAAATCAC-5') (SEQ ID NO: 4) are used as the target DNA.
  • the target DNA of SEQ ID NO: 3 the base corresponding to C of base number 8 of SEQ ID NO: 1 of probe 1 is matched with G.
  • the target DNA of SEQ ID NO: 4 is mismatched with a base force A corresponding to C of base number 8 of SEQ ID NO: 1 of probe 1.
  • SEQ ID NOs: 3 and 4 are partial sequences of aldehyde dehydrogenase (ALDH2) that works in the alcohol metabolism system.
  • SEQ ID NO: 3 is a force with base number 8 being G. When this force is used as in SEQ ID NO: 4 (G1510A ) Is known to be difficult to metabolize alcohol.
  • Sample 3 (3'-GGGAGTGGCC) with a total length of 91 bases including the base sequence of sample 1
  • CAGTCAAAGTGCCTCAGAAGAACTCATAAG-5 ' (SEQ ID NO: 5) and sample 4 (3'-GGGGAGTGGCCGGGAGTTGGGC) including the base sequence of sample 2 and a total length of 91 bases
  • CCTCAGAAGAACTCATAAG-5 ′ (SEQ ID NO: 6) was also used as the target nucleic acid for probe 1.
  • the base corresponding to the base number 46 of SEQ ID NO: 1 of probe 1 matches with G.
  • the base corresponding to C of base number 46 of SEQ ID NO: 1 of probe 1 is mismatched with A.
  • Sample 5 (3-TATGTGACTTCAC-5 ') (SEQ ID NO: 7) and sample 6 (3'-TATGGTGA TTCAC-5,) (SEQ ID NO: 8) were used as target DNAs for probe 2. .
  • the target DNA of SEQ ID NO: 7 matches with the base force SC corresponding to G of base number 8 of SEQ ID NO: 2 of probe 2.
  • the target DNA of SEQ ID NO: 8 is the same as that of SEQ ID NO: 2 of probe 2. There is a mismatch with the basic power ⁇ corresponding to G of base number 8.
  • the target DNA solution was an aqueous solution containing 10 mM sodium sodium codylate (pH 7.0).
  • This cell was irradiated with monochromatic excitation light through a band pass filter ( ⁇ 25 mm, Asahi Bunko) of 365 ⁇ 5 nm using a 200 W UV lamp (Sumida YLT-MX200).
  • Photocurrent was measured at 25 ° C using a three-electrode system (ALS, model 660A) equipped with a modified Au working electrode (electrode area 2 mm 2 ), a platinum counter electrode, and an SCE reference electrode.
  • the light intensity was measured using a light intensity meter (Ushio UI T-150).
  • the current density was -299 ⁇ 21 nA'cm- 2 , which was about 1.6 times the current density before pairing with the target DNA.
  • the current density is -153, 32 ⁇ ⁇ cm— 2, which is the value before pairing with target DNA. The current density was about the same.
  • the current density is -297 ⁇ 20nA'cm- 2 when C of probe 1 and G of 91-base long target DNA (sample 3) pair. Yes, this value was about 1.6 times the current density before pairing with the target DNA.
  • the current density is -205 ⁇ 25 ⁇ cm- 2, which is the value before pairing with target DNA. It was almost the same as the current density. Regardless of the length of the target DNA, the ability to identify nucleotides accurately is a major factor.
  • probes 1 and 2 immobilized on the electrode surface were determined by the chronocoulometric assay in the presence of noretium (III) hexamine in the Tarlov method (Steel, A, B .: Herne, TM; Tarlov, MJ Anal Chem. 1998, 70, 4670-4677).
  • Step, A, B .: Herne, TM; Tarlov, MJ Anal Chem. 1998, 70, 4670-4677 On the area of 2 mm 2 electrodes, probes 1, 2 of 6.0 X 10 12 per lc m 2 respectively (9.9 ⁇ 0.8pmol / cm 2) had been attached.
  • This compound is a deoxyribonucleoside derivative having methoxybenzodazaadenine (MDA) as a base.
  • MDA methoxybenzodazaadenine
  • oligodeoxyribonucleotide derivative 5, -A AQ UACACT nAAGTG-3 '(SEQ ID NO: 7) by the phosphoramidite method using an applied biosystem 392DNA / RNA synthesizer using compound (u)
  • n is an MDA-containing deoxyribonucleotide derivative; compound (u) equivalent
  • the obtained MDA-containing oligodeoxyribonucleotide derivative was purified by reverse phase HPLC using a 5-ODS-H column (10 ⁇ 150 mm). Elution was carried out at a flow rate of 3.0 ml / min in 0.1 M triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0 at a gradient of 5% to 25% with acetonitrile for 20 minutes.
  • TEAA triethylamine acetate
  • the probe 3 containing the MDA-containing oligonucleotide was immobilized on a gold electrode in the same manner as in Examples 2-4.
  • the nucleotide sequence of the nucleic acid part of probe 3 is 5′-A AQ UAC ACT-AAAGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 9).
  • this probe 3 and samples 5 (SEQ ID NO: 7) and 6 (SEQ ID NO: 8) were respectively allowed to hybridize.
  • the target DNA of SEQ ID NO: 7 the base that matches the MDA of probe 8 with base number 8 is C-matched.
  • the target DNA of SEQ ID NO: 8 is mismatched with a base chain that matches the MDA of probe 3 with base number 8.
  • photoelectrochemical measurement was performed in the same manner as in Example 6. The results are shown in FIG.
  • the current density before pairing with the target DNA was -187 ⁇ 23 nA'cm- 2 .
  • the current density is -282 ⁇ 21 nA'cm- 2, which is the current before pairing with the target DNA.
  • the density was about 1.5 times.
  • MDA-containing nucleotide and target DNA C pair Sample 5
  • the current density was -198 ⁇ 15 nA'cm- 2 , which was comparable to the current density before pairing with the target DNA.
  • probe 4 whose nucleic acid part base sequence was 5'-I ⁇ UAGA AT ⁇ C-S '(sequence number 10) was immobilized on a gold electrode.
  • the base number 9 of probe 4 needs to be a base complementary to T of the target DNA. A or T force in probe 4 Containing nucleotides. Therefore, the MDA-containing nucleotide of base number 9 is not for detecting a polymorphism.
  • Samples 7 and 8 are partial sequences of the human thiopurine S-methyltransferase (TPMT) gene.
  • TPMT human thiopurine S-methyltransferase
  • TPMT is involved in the metabolism of azathioprine, a 6-mercaptopurine, which is a treatment for hematological malignancies.
  • azathioprine a 6-mercaptopurine
  • Most of the mutant alleles of the Japanese are TPMT * 3C.
  • the mutation of TPMT * 3C is the one in which base number 6 becomes A force G, and it is known that this makes it difficult for the therapeutic agent to be metabolized.
  • the target DNA of SEQ ID NO: 11 the base that matches C of base 4 of probe 4 is matched with G.
  • the target DNA of SEQ ID NO: 12 pairs with C of base number 6 of probe 4. Mismatched base strength SA! /, Ru.
  • a 91-base region containing the G1459A position of the ALDH2 gene in its chromosomal DNA was transferred to the forward primer (5'-GGGGTGTGCGCGGGAGTT-3,) (SEQ ID NO: 13), and Amplification was performed by PCR using a reverse primer (5′-CTTATGAGTTCTTCTGA-3,) (SEQ ID NO: 14) to obtain the target DNA.
  • G probe for detecting C or G base sequence of nucleic acid moiety: 5'-A AQ UACACTGA AGTG (SEQ ID NO: 15)
  • MDA probe for detecting T or A base of nucleic acid moiety Array: 5′-A ⁇ UACACT ⁇ AGTG (SEQ ID NO: 16) was used to prepare probes fixed to gold electrodes in the same manner as in Examples 3 and 4, and then in the same manner as in Example 5, Each probe was hybridized with the target DNA, and photoelectrochemical measurement was performed in the same manner as in Example 6.
  • Figure 7a shows the result of plotting the current density detected when using the MDA probe against the current density detected when using the G probe.
  • the controls in Figure 7a indicate the current density detected before each probe was hybridized with the target DNA.
  • Fig. 7b shows the value of the ratio of the current density detected when the MDA probe is used to the current density detected when the G probe is used.
  • the ratio is 1.04 to 1.29 for the C / T heterozygous group, 0.78 or less for the C / C homozygous group, and 1.73 or more for the T / T homozygous group. It is a joining group.

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Abstract

　標的核酸中の目的ヌクレオチド領域を同定するためのプローブユニットであって、電極と、電極に結合した、標的核酸を認識するプローブと、プローブに結合したホール移動誘起剤とを備え、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置しているプローブユニット。このプローブユニットと標的核酸とをハイブリダイズさせた前後のエネルギー誘起ホール移動による電気化学的信号の大きさを比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域の状態を同定できる。

Description

明 細 書
プローブユニット、ヌクレオチド領域の同定装置、及びヌクレオチド領域の 同定方法
技術分野
[0001] 本発明は、標的核酸中の特定位置のヌクレオチド領域の状態を同定するためのプ ローブユニット、このプローブを備えるヌクレオチド同定装置、及びヌクレオチド同定 方法に関する。
従来技術
[0002] 従来、核酸プローブを用いた核酸塩基決定方法としては、プローブと標的核酸とを ノ、イブリダィズさせ、その融解温度を測定する方法が知られている。詳述すれば、プ ローブの所定位置の塩基が標的核酸の対応塩基と塩基対を形成する場合としない 場合とで、融解温度が若干異なることを利用して、塩基を同定している。
[0003] この場合、プローブ又は標的核酸は、通常蛍光物質又は放射性物質を用いて標 識される。放射標識する場合は、管理区域内での煩雑な作業を必要とする。また、蛍 光標識する場合は、特殊な検出器が必要であり、コスト高になる。
[0004] さらに、この方法は、対合する塩基が塩基対を形成する場合としない場合との融解 温度の差ができるだけ大きくなるようなハイブリダ一ゼーシヨン条件を個々の標的核 酸ごとに設定する必要がある。また、塩基間の非特異的な吸着や塩基対形成の不安 定性などによる検出エラーが生じ易い。
[0005] 蛍光又は放射標識する方法に代わるヌクレオチドの検出方法として、電気化学的 方法が用いられるようになってきた。
[0006] 例えば、特許文献 1、 2は、核酸プローブを電極表面に固定したものと標的核酸とを ハイブリダィズさせた後、この反応液に 2本鎖核酸へのインターカレーターのような電 気応答性試薬を添加してこの電気応答性試薬に由来する酸化還元電位を検出する ことにより、ハイブリダィズの有無、ひいては特定位置のヌクレオチドを同定する方法 を開示している。
[0007] しかし、この方法は、ミスマッチ塩基数が少な ヽ場合は、全てマッチする場合との間 で熱力学的バックグランドが同程度であるため、ミスマッチとして検出することができ ず、検出感度が低い。また個々の標的核酸ごとに電気応答性試薬の種類や使用量 を設定する必要があり、これが検出エラーの原因となる。また、ハイブリダィゼーシヨン の有無により標的ヌクレオチドを同定することから、個々の標的核酸ごとに最適なハイ ブリダィゼーシヨン条件を設定する手間を要するとともに、ハイブリダィゼーシヨン効率 の変動により検出エラーが生じ易い。
[0008] また、この方法は、距離依存的一段階電子移動を基礎とした技術であるために、比 較的短い標的核酸でしか正確な同定ができない。従って、現実には生体由来の核 酸を対象にすることができない。また、標的核酸を比較的密に配置する必要があり、 コスト高になる。
[0009] また特許文献 3は、核酸プローブをスぺーサーを介して電極に接続し、標的核酸と 核酸プローブとをノヽイブリダィズさせた後、インターカレーターのような電気応答性試 薬を添加して、この電気応答性試薬に由来する酸化還元電位を検出することにより、 ハイブリダィズの有無、ひ 、ては特定位置のヌクレオチドを同定する方法を開示して いる。特許文献 2の方法は、スぺーサーを用いることから核酸プローブが反応液中で 動き易くなるため、標的核酸とのハイブリダィゼーシヨン効率が高くなつて、特定核酸 の同定効率が向上する。
[0010] 特許文献 3の方法も、電気応答性試薬の添加を必要とする点、及びハイブリダィゼ ーシヨン効率の影響を受ける点で特許文献 1、 2の方法と変わりがな 、。
[0011] また特許文献 4は、分子内に互いに相補的な逆向き配列と、それらに挟まれた標的 核酸に相補的な配列とを有するプローブであって、一方の末端に酸化還元性ュ-ッ トが結合され、他方の末端を電極に接続させたものを用いて標的核酸中の特定ヌク レオチドを同定する方法を開示している。このプローブは、それ単独では、分子内で ノ、イブリダィズすることによりヘアピン構造を採り、酸ィ匕還元ユニットと電極とが近接し ているが、標的核酸とハイブリダィズすることによりヘアピン構造が開いて、酸化還元 ユニットが電極力 遠ざかる。この変化を電気化学的信号として検出することにより、 ノ、イブリダィズの有無を検出する。
[0012] 特許文献 4の方法は、電気応答性試薬を必要としな!/ヽが、標的核酸と核酸プロ一 ブとのハイブリダィゼーシヨン効率に左右されるために、最適なノ、イブリダィゼーショ ン条件を設定する必要がある。
特許文献 1：特許 2573443号明細書
特許文献 2：特表 2002-510791号公報
特許文献 3：特開 2004-61237号公報
特許文献 4： WO2004/035829号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 本発明は、ハイブリダィゼーシヨン効率に依存せずに、標的核酸中の目的ヌクレオ チド領域の状態を同定できる高感度なプローブユニット、ヌクレオチドの同定装置、 及びヌクレオチド領域の同定方法を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0014] 上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の (0及び GOの知見を 得た。
(0 オリゴヌクレオチドからなるプローブの一端部にホール移動誘起剤を結合させ、 他端を電極に結合したものを用いて、プローブと標的核酸とをハイブリダィズさせた 後、プローブに光などのエネルギーを供給すると、プローブ中のグァニン又はシトシ ンを有するヌクレオチドを介してホール移動（ホールホッピング）が起こり、このホール 移動が電極において電気信号として検出される。
[0015] また、標的核酸のプローブとの結合末端部にホール移動誘起剤を結合させたもの と、ホール移動誘起剤結合位置とは反対側の端に電極を結合したプローブとをハイ ブリダィズさせ、エネルギー供給してもホール移動による電気信号が検出される。
[0016] さらに、プローブ及び標的核酸のいずれにホール移動誘起剤を結合させる場合も
、 ノ、イブリダィズさせた後にホール移動誘起剤を結合させ、エネルギー供給しても、 ホール移動による電気信号が検出される。
(ii) 標的核酸中のグァニンと対合するヌクレオチドがデォキシシチジル酸若しくはシ チジル酸である場合、又は標的核酸中のシトシンと対合するヌクレオチドがデォキシ グァニル酸若しくはグァニル酸である場合、即ち GC塩基対が形成される場合は、ホ ール移動が起こり易ぐその結果大きな電気信号が検出されるが、グァニンと対合す るヌクレオチド力 デォキシシチジル酸若しくはシチジル酸以外である力 シトシンと 対合するヌクレオチドがデォキシグァニル酸若しくはグァ -ル酸以外である場合、即 ち塩基対がミスマッチする場合は、ホール移動が起こり難ぐその結果電気信号が小 さくなる。
[0017] この現象を利用することにより、標的核酸中の特定位置のヌクレオチドの塩基がシト シン又はグァニンであるか否かを、ハイブリダィゼーシヨン効率に影響されずに、かつ 高感度で検出できる。
[0018] また、標的核酸がプローブと完全相補的でなぐ欠失や挿入がある場合もホール移 動が起こり難ぐその結果電気信号が小さくなる。
(iii) 以下の式（1)
[0019] [化 1]
Figure imgf000006_0001
[0020] (式中、 R、 R、 R、 R、 R、及び Rは、それぞれ独立して水素原子、アミノ基、モノ
1 2 3 4 5 6
低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲ ン原子、シァノ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、又はァリール基を示す。 ) で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド誘導体をプローブとして用い て、（0と同様にしてホール移動による電気信号を検出すると、上記ヌクレオチド誘導 体と対合するヌクレオチドがデォキシチミジル酸である場合には、ホール移動が起こ り易く大きな電気信号が得られる力 その他のヌクレオチドである場合は、ホール移 動が起こり難く得られる電気信号が小さくなる。
[0021] この現象を利用すれば、標的核酸中の特定ヌクレオチドがデォキシチミジル酸であ る力否かを、ノ、イブリダィゼーシヨン効率に影響されずに、かつ高感度で検出できる。
[0022] また、標的核酸中の特定位置のヌクレオチドがデォキシアデニル酸である力否かは 、標的核酸の相補鎖の対応ヌクレオチドがデォキシチミジル酸である力否かを調べる ことにより同定できる。
[0023] また、標的核酸がプローブと完全相補的でなぐ欠失や挿入がある場合もホール移 動が起こり難ぐその結果電気信号が小さくなる。
[0024] 本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のプローブユニット、ヌク レオチド領域の同定装置、及びヌクレオチド領域の同定方法を提供する。
[0025] 項 1. 標的核酸中の目的ヌクレオチド領域を同定するためのプローブユニットであ つて、電極と、電極に結合した、標的核酸を認識するプローブと、プローブに結合し たホール移動誘起剤とを備え、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合 末端との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置しているプロ ーブユニット。
[0026] 項 2. 標的核酸中の目的ヌクレオチドを同定するためのプローブユニットであって 、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端との間に目的ヌクレオチド と対合するヌクレオチドが位置して 、る項 1に記載のプローブユニット。
[0027] 項 3. プローブが、標的核酸とハイブリダィズすることにより標的核酸を認識するも のである項 1に記載のプローブユニット。
[0028] 項 4. プローブが 6〜30個のヌクレオチド又はその誘導体からなるものである項 1に 記載のプローブユニット。
[0029] 項 5. ホール移動誘起剤が光増感剤である項 1に記載のプローブユニット。
[0030] 項 6. 光増感剤が、光励起ホール移動を起こすことができるものである項 5に記載 のプローブユニット。
[0031] 項 7. 光増感剤が、キノン系増感剤、フラビン系増感剤、及びべンゾフエノン系増 感剤からなる群より選ばれる少なくとも 1種である項 5に記載のプローブユニット。
[0032] 項 8. プローブが、スぺーサーを介して電極に結合している項 1に記載のプローブ ユニット。
[0033] 項 9. スぺーサ一が、有機低分子化合物、核酸、及びポリペプチドからなる群より 選ばれる物質である項 8に記載のプローブユニット。
[0034] 項 10. スぺーサ一の長さが l〜3nmである項 8に記載のプローブユニット。
[0035] 項 11. 電極のスぺーサー結合面に複数の電極スぺーサーを備える項 1に記載の プローブユニット。
[0036] 項 12. プローブ力 ¾NAであり、プローブ中の目的ヌクレオチドに対合するヌクレオ チドの塩基がグァニン又はシトシンである項 2に記載のプローブユニット。
[0037] 項 13. プローブが、標的核酸の目的ヌクレオチドと対合する位置に、下記式（1) [0038] [化 2]
Figure imgf000008_0001
[0039] (式中、 R、 R、 R、 R、 R、及び Rは、それぞれ独立して水素原子、アミノ基、モノ
1 2 3 4 5 6
低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲ ン原子、シァノ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、又はァリール基を示す。 ) で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド誘導体である項 2に記載のプ ローブユニット。
[0040] 項 14. プローブ中の A及び T力もなる群より選ばれるヌクレオチドの連続数が 3以 下である項 1に記載のプローブユニット。
[0041] 項 15. プローブ中の、ホール移動誘起剤が結合したヌクレオチドに対して、電極 結合末端とは反対側に位置するヌクレオチド力 及び C以外のヌクレオチドである項 1 に記載のプローブユニット。
[0042] 項 16. プローブ内部のヌクレオチドにホール移動誘起剤が結合している項 1に記 載のプローブユニット。
[0043] 項 17. 基体と、 1又は複数の項 1〜16のいずれかに記載のプローブユニットと、プ ローブの電極力も電気化学的信号を検出するための手段とを備え、プローブユニット の電極が電気化学的信号を検出できるように基体に配置されて 、るヌクレオチド領域 同定装置。
[0044] 項 18. 目的ヌクレオチド領域の同定方法であって、
標的核酸と電極に結合したプローブとをハイブリダィズさせる第 1工程と、
第 1工程の前又は後に、プローブ又は標的核酸に、直接又は間接的にホール移動 誘起剤を結合させ、このときプローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合位置 との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するようにプローブ にホール移動誘起剤を結合させる力、標的核酸中のプローブの電極結合位置に対 応する位置とホール移動誘起剤結合位置との間に目的ヌクレオチド領域が位置する ように、標的核酸にホール移動誘起剤を結合させる第 2工程と、
上記ノヽイブリダィズ産物へのエネルギー供給により、ホール移動誘起剤結合位置 力 電極へのプローブ中のホール移動を引き起こして電極力 検出される電気化学 的信号を検出し、ハイブリダィズ前のプローブにエネルギー供給した場合に電極から 検出される電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領 域がプローブ中の対応する領域と完全相補的である力否かを判定する第 3工程と を含む目的ヌクレオチド領域の同定方法。
[0045] 項 19. ホール移動誘起剤をプローブに結合させる項 18に記載の方法。
[0046] 項 20. 第 1工程の前に第 2工程を行う項 18に記載の方法。
[0047] 項 21. 目的ヌクレオチド領域が一つの目的ヌクレオチド力 なるものである項 18 に記載の方法。
[0048] 項 22. プローブが 6〜30個のヌクレオチド又はその誘導体からなるものである項 1 8に記載の方法。
[0049] 項 23. ホール移動誘起剤が光増感剤である項 18に記載の方法。
[0050] 項 24. 光増感剤が、光励起ホール移動を起こすことができるものである項 23に記 載の方法。
[0051] 項 25. 光増感剤が、キノン系増感剤、フラビン系増感剤、及びべンゾフエノン系増 感剤からなる群より選ばれる少なくとも 1種である項 23に記載の方法。 [0052] 項 26. プローブ力 スぺーサーを介して電極に結合している項 18に記載の方法
[0053] 項 27. スぺーサ一が、有機低分子化合物、核酸、及びポリペプチドからなる群より 選ばれる物質である項 26に記載の方法。
[0054] 項 28. スぺーサ一の長さが l〜3nmである項 26に記載の方法。
[0055] 項 29. 電極が、スぺーサー結合面に複数の電極スぺーサーを備えるものである 項 18に記載の方法。
[0056] 項 30. プローブ力 ¾NAであり、プローブ中の目的ヌクレオチドに対合するヌクレオ チドの塩基がグァニン又はシトシンであり、第 3工程において標的核酸中の目的ヌク レオチドの塩基がシトシン又はグァニンである力否かを判定する項 21に記載の方法
[0057] 項 31. プローブが、標的核酸の目的ヌクレオチドと対合する位置に、下記式（1) [0058] [化 3]
Figure imgf000010_0001
[0059] (式中、 R、 R、 R、 R、 R、及び Rは、それぞれ独立して水素原子、アミノ基、モノ
1 2 3 4 5 6
低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲ ン原子、シァノ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、又はァリール基を示す。 ) で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド誘導体であり、第 3工程にお いて標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がチミンである力否かを判定する項 21に 記載の方法。
[0060] 項 32. プローブ中の A及び T力 なる群より選ばれるヌクレオチドの連続数が 3以 下である項 18に記載の方法。 [0061] 項 33. プローブ中の、ホール移動誘起剤が結合したヌクレオチドに対して、電極 結合末端とは反対側に位置するヌクレオチド力 及び C以外のヌクレオチドである項 1 8に記載の方法。
[0062] 項 34. プローブ内部のヌクレオチドにホール移動誘起剤が結合している項 18に 記載の方法。
[0063] 項 35. エネルギーを l〜100mW'cm-2照射する請求 18に記載の方法。
[0064] 項 36. 波長 300〜600nmの光を照射する項 23に記載の方法。
[0065] 項 37. 項 12に記載のプローブユニット中のプローブと標的核酸とをハイブリダィ ズさせる工程と、
このプローブにエネルギー供給して電極力 電気化学的信号を検出し、標的核酸 をハイブリダィズさせないプローブにエネルギー供給する場合に電極カゝら検出される 電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域がプロ一 ブ中の対応する領域と完全相補的であるカゝ否かを判定する工程と
を含む目的ヌクレオチド領域の同定方法。
[0066] 項 38. 目的ヌクレオチド領域が一つのヌクレオチド力もなるものであり、判定工程 において、標的核酸中の目的ヌクレオチドがプローブ中の対応する領域と相補的で ある力否かを判定することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がシトシン又 はグァニンである力否かを判定する項 37に記載の方法。
[0067] 項 39. エネルギーを l〜100mW'cm-2供給する項 37に記載の方法。
[0068] 項 40. エネルギーが光であり、波長 300〜600nmの光を照射する項 37に記載の 方法。
[0069] 項 41. 項 13に記載のプローブユニット中のプローブと標的核酸とをハイブリダィ ズさせる工程と、
このプローブにエネルギー供給して電極力 電気化学的信号を検出し、標的核酸 をハイブリダィズさせないプローブにエネルギー供給する場合に電極カゝら検出される 電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域がプロ一 ブ中の対応する領域と完全相補的であるカゝ否かを判定する工程と
を含む目的ヌクレオチド領域の同定方法。 [0070] 項 42. 目的ヌクレオチド領域が一つのヌクレオチド力もなるものであり、判定工程 において、標的核酸中の目的ヌクレオチドがプローブ中の対応する領域と相補的で ある力否かを判定することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がチミンであ るカゝ否かを判定する項 41に記載の方法。
[0071] 項 43. エネルギーを l〜100mW' cm-2供給する項 41に記載の方法。
[0072] 項 44. エネルギーが光であり、波長 300〜600nmの光を照射する項 41に記載の 方法。
[0073] 項 45. 標的核酸中の目的ヌクレオチド領域を同定するためのプローブユニットの 製造方法であって、標的核酸を認識するプローブに直接又は間接的にホール移動 誘起剤を結合させる工程と、プローブの一端を電極と結合させる工程とを含み、ホー ル移動誘起剤結合工程にお！、て、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結 合末端との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するように ホール移動誘起剤を結合させる方法。 発明の効果
[0074] 本発明のヌクレオチド領域の同定方法は、核酸プローブ内のエネルギー誘起ホー ル移動による電気信号を検出し、対合するヌクレオチドの種類によってこのホール移 動効率が異なる現象を利用して標的核酸中の目的ヌクレオチドを同定する方法であ ることから、極めて高感度にヌクレオチドを同定できる。また、標的核酸中にプローブ に対して欠失や挿入があって、プローブと標的核酸とが 1対 1でノヽイブリダィズしな ヽ 場合には、ホール移動効率が低くなるため、このような欠失や挿入の検出も含めて標 的核酸のヌクレオチド領域を同定できる。
[0075] 詳述すれば、標的核酸とプローブとをハイブリダィズさせる場合に、プローブ中の特 定ヌクレオチドと対合するヌクレオチドとの間で 1個でもミスマッチ等の不整合を生じて いると、そこ力 先へはホール移動が起こらない又は殆ど起こらないことから、 1塩基 の違いでも検出できる。このため、この方法は、一塩基多型の検出にも実用できる。 また、標的核酸が例えばゼプトモル（10— 21モル)オーダーの極めて微量しか存在しな い場合にも、その中の目的ヌクレオチドを同定できる。さらに、ホール移動による信号 を検出することから、ハイブリダィゼーシヨン効率に影響されない。 [0076] また、個々の標的核酸ごとにハイブリダィゼーシヨン条件を設定する手間を要さな!/、 とともに、ハイブリダィゼーシヨン条件の差により検出誤差が生じることがない。
[0077] また、ホール移動による電気信号を検出することから、電気応答性試薬の添加を要 さない。このため、電気応答性試薬の種類や添加量の違いによる検出誤差が生じな い。また、個々の標的核酸ごとに、電気応答性試薬の添加及び過剰の電気応答性 試薬の除去を行う手間を要さない。 図面の簡単な説明
[0078] [図 1]プローブ 1を用いたヌクレオチドの同定結果を示すグラフである。
[図 2]プローブ 2を用いたヌクレオチドの同定結果を示すグラフである。
[図 3]MDA含有デォキシリボヌクレオシド誘導体の合成方法を示す図である。
[図 4]MDA含有オリゴヌクレオチド誘導体の合成方法を示す図である。
[図 5]プローブ 3を用いたヌクレオチドの同定結果を示すグラフである。
[図 6]プローブ 4を用いたヌクレオチドの同定結果を示すグラフである。
[図 7]Gプローブ、及び MDAプローブの双方を用いたヌクレオチドの同定により、 25人 のパネラーを、 τ/τホモ接合、 c/cホモ接合、又は C/Tヘテロ接合に分類した結果を 示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0079] 以下、本発明を詳細に説明する。
(I)プローブユニット
本発明のプローブユニットは、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域を同定するため のプローブユニットであって、電極と、電極に結合した、標的核酸を認識するプロ一 ブと、プローブに結合したホール移動誘起剤とを備える。プローブにおいて、 目的ヌ クレオチド領域と対合するヌクレオチド領域は、電極結合末端とホール移動誘起剤結 合位置との間に位置する。
プローブ
プローブは、標的核酸を認識するオリゴヌクレオチド又はその誘導体であり、標的 核酸に何らかの条件下でハイブリダィズすることによりこれを認識するものが含まれる [0080] 本発明のプローブユニットに包含されるのは、オリゴヌクレオチド若しくはその誘導 体 (第一のプローブ）、又は上記式（1)で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌ クレオチド誘導体 (第二のプローブ)である。
[0081] 第一のプローブが、標的核酸とのマッチ又はミスマッチの別を検出するためのもの 、即ち、標的核酸中の目的ヌクレオチドの種類を同定するためのものである場合は、 第一のプローブは、標的核酸中の同定されるべきヌクレオチドに対応するヌクレオチ ドを除き、実質的に全てのヌクレオチドが標的核酸の対応領域と相補的であればよい 。第一のプローブにおいて、同定されるべきヌクレオチドに対応するヌクレオチドの塩 基はグァニン又はシトシンである。
[0082] 第二のプローブが、標的核酸とのマッチ又はミスマッチの別を検出するためのもの 、即ち、標的核酸中の目的ヌクレオチドの種類を同定するためのものである場合は、 第二のプローブも、標的核酸中の同定されるべきヌクレオチドに対応するヌクレオチ ドを除き、実質的に全てのヌクレオチドが標的核酸の対応領域と相補的であればよい 。第二のプローブにおいて、標的核酸中の目的ヌクレオチドに対合するのが式（1)で 表されるヌクレオチド誘導体である。式（1)のヌクレオチド誘導体の中でも、 R又は R
1 2 がァミノ基である化合物が好ましぐ Rがァミノ基であり、 R力 Sメトキシ基であり、 R、 R
1 4 2
、R、Rが水素原子である化合物（メトキシベンゾデァザアデニン； MDA含有ヌクレ
3 5 6
ォチド誘導体)がより好まし ヽ。 MDA含有ヌクレオチド誘導体の構造を以下に示す。
[0083] [化 4]
Figure imgf000014_0001
第一及び第二のプローブ力 標的核酸のプローブに対するヌクレオチド数の過多、 即ちヌクレオチドの挿入を検出するべきものである場合は、ハイブリダィズさせた場合 に標的核酸のヌクレオチドが 2本鎖力も外に飛び出る。この場合は、標的核酸のその 飛び出る領域を除く領域とプローブとは実質的に全てが相補的であればよい。
また、第一及び第二のプローブが、標的核酸のプローブに対するヌクレオチドの不足
、即ちヌクレオチドの欠失を検出するべきものである場合は、ハイブリダィズさせた場 合にプローブのヌクレオチドが 2本鎖から外に飛び出る。この場合は、プローブ中の その飛び出る領域を除く領域と標的核酸とは実質的に全てが相補的であればよい。 第一及び第二のプローブにおいて、ホール移動誘起剤が結合したヌクレオチドに対 して電極結合末端とは反対側に位置するヌクレオチド、即ちホール移動誘起剤の結 合位置より開放末端側に位置するヌクレオチドを Gにせざるを得ない場合、これらの Gに代えて、イノシン含有ヌクレオチドを採用することが好ましい。これにより、ホール 移動誘起剤から電極方向へのホール移動が一層効率的に行われるようになる。
[0085] また、第一及び第二のプローブにお!/、て、標的核酸をハイブリダィズさせる上で、 A又は Tの連続数力 個以上となる場合は、いずれかの A又は Tに代えて一般式（1) のヌクレオチド誘導体 (代表的には MDA含有ヌクレオチド)を採用することが好ま ヽ 。これにより、 A又は Tの存在によるホール移動効率の低下が抑制される。この場合の 一般式（1)のヌクレオチド誘導体は標的核酸中のヌクレオチドの同定には関与しな い。
[0086] 第一及び第二の各プローブは、 DNAであってもよぐ RNAであってもよいが、ホール 移動が起こり易く検出感度が高い点で、 DNAであることが好ましい。また、ホスホロチ ォエート DNA、 H-ホスホネート DNAのような修飾 DNAや、 2'- 0- RNA、ホスホロチォェ ート RNAのような修飾 RNAも使用できる。さらに、 DNAと RNAとのいわゆるキメリックヌク レオチドも使用できる。
[0087] また、プローブの長さは特に限定されず、通常オリゴヌクレオチドと称されるものの 他に、ポリヌクレオチドと称されるものも含まれる。但し、その長さは、それには限定さ れないが、 6〜30塩基程度が好ましぐ 6〜20塩基程度がより好ましい。上記の長さで あれば、融解温度 (Tm)が室温以上になって室温下で標的核酸と安定な塩基対を形 成できるとともに、エネルギー供給に対して十分に強い電気化学的応答が得られる。
[0088] 第一及び第二の各プローブにおいて、同定されるべきヌクレオチド領域に対合する ヌクレオチド又はその誘導体力もなる領域は、ホール移動誘起剤が結合したヌクレオ チドと電極結合末端との間に位置していればよいが、余りに端部であると、マッチする 場合とミスマッチ等する場合との電気化学的信号の差が小さくなる傾向にあるため、 できるだけプローブの中央部に位置するように設計することが望ましい。
ホール移動誘走 3剤
ホール移動誘起剤は、光、電子線等のエネルギー照射によりそれが結合するプロ ーブ中のホール移動を誘起できるものであればよい。ホール移動誘起剤としては、代 表的には光増感剤が挙げられる。光増感剤は、特に限定されず、公知のものを使用 できる。例えば、アントラキノンのようなキノン系分子、ルミフラビンのようなフラビン系 分子、シァノベンゾフエノンのようなベンゾフエノン系分子、臭化工チジゥムのような核 酸結合性色素、トリフ -ルルテニウムのような核酸結合性金属錯体などが挙げられ る。
[0089] 中でも検出感度が高くなる点で、キノン系、フラビン系、及びベンゾフヱノン系増感 剤が好ましい。また、キノン系分子、フラビン系分子はインターカレーターであるため 、標的核酸とのハイブリダィズ後に 2本鎖間にインター力レートしてその位置が安定に 保たれる。特に、キノン系増感剤が好ましぐアントラキノンがより好ましい。
[0090] ホール移動誘起剤は、プローブ中の同定されるべきヌクレオチド領域に対応するヌ クレオチド領域を挟んで、電極結合末端とは反対側に位置するヌクレオチドに結合し て!、ればよ 、。ホール移動誘起剤はプローブの末端ヌクレオチドより内部のヌクレオ チドに結合していることが好ましぐこれによりホール移動誘起剤が 2本鎖間に位置し てその位置が安定に保たれる。
[0091] エネルギー誘起ホール移動はプローブ中を 5'末端側から 3'末端側へ、及び 3'末端 側から 5'末端側への双方向に起こり得ることから、ホール移動誘起剤は、プローブに おいて、 目的ヌクレオチドに対合する位置より 5'末端側に結合していてもよぐ 3'末端 側に結合していてもよい。
[0092] ホール移動誘起剤は、プローブに直接結合していてもよいが、プローブ中のヌクレ ォチドを例えばァミノ化し、このアミノ基に結合させることもできる。
[0093] また、ホール移動誘起剤の結合量は、プローブ 1個当たり 1〜20分子程度が好まし く、 1〜3分子程度がより好ましい。上記の結合量であれば、オリゴヌクレオチド内でホ ール移動を引き起こすことができるとともに、塩基同定感度が高くなる。即ち、ホール 移動誘起剤量が極端に多 、と、ミスマッチ塩基対等が存在して 、てもホール移動が 起こってしまい、マッチする塩基対を特異的に検出できないが、上記範囲であればこ のような問題は生じない。
スぺ. ~"サ■ ~"
プローブは、スぺーサーを介して電極に結合していることが好ましい。スぺーサー は、プローブが折れ曲がる等により電極と接触してプローブ全体を通したホール移動 を妨げるのを防止する役割を果たす。スぺーサ一分子の種類は特に限定されず、例 えば有機低分子化合物；ポリペプチド；核酸などを使用できる。
[0094] スぺーサ一は、一端に電極と結合するための官能基を有して 、ればよ 、。このよう な官能基としては、チオール基、ケィ酸残基、リン酸残基、アミノ基、ピオチン残基な どが挙げられる。
[0095] スぺーサ一の長さは、 l〜3nm程度であることが好ましい。上記の範囲であれば、ス ぺーサ一の機能を十分に果たすことができるとともに、プローブの末端力も電極への ホール移動を妨げない。この長さは、スぺーサ一の末端官能基を除く部分が直鎖状 飽和炭化水素である場合に、 C〜C 程度の長さに該当する。また、スぺーサ一が核
2 10
酸である場合には、ヌクレオチド 1〜5個程度の長さに該当する。また、スぺーサ一が ポリペプチドである場合には、アミノ酸 1〜10個程度の長さに該当する。
[0096] スぺーサ一は、末端官能基を除く部分が C〜C 程度、特に C〜C程度の長さの
2 10 4 8
直鎖状飽和炭化水素であることが好まし 、。このようなスぺーサ一の具体例としては 、 C〜C (特に、 C〜c )のアルキルチオール、アルキルァミンが挙げられる。
2 10 4 8
電極
電極は、プローブ内を流れる光電流を検出するためのものである。
[0097] 電極材料は、特に限定されず、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムの ような貴金属；グラフアイト、グラシ一力一ボンのような炭素；酸ィ匕チタン、酸化スズ、酸 化マンガン、酸化鉛、 ITOのような金属酸化物；シリコン、ゲルマニウム、ガリウム砒素 、酸化亜鉛のような半導体；チタンなどが挙げられる。
[0098] この電極は、例えば電気化学的信号の検出手段として 2電極方式又は 3電極方式 の電気化学セルを用いる場合の作用電極とすることができる。
[0099] 電極の面積は特に限定されないが、通常 lmm2〜lcm2程度とすればよい。この範囲 であれば、一つの電極上に、検出できる程度の大きさの電気信号を与える量のプロ ーブを結合させることができる。
[0100] 一つの電極上には、通常 lmm2当たり lftnol〜l μ mol程度、好ましくは lpmol〜10nm ol程度のプローブが結合されていればよい。この範囲であれば、 1塩基の違いや 1塩 基の挿入又は欠失でも検出できる程度の大きさの電気化学信号を検出することがで きる。
電極スぺーサー
本発明のプローブユニットは、電極のプローブユニット結合面に、複数の電極スぺ 一サーを備えることが好ましい。この電極スぺーサ一は、プローブユニットが電極に 直接接触してプローブを通したホール移動を妨げるのを防止する役割を果たす。
[0101] 電極スぺーサ一は、一端に電極と結合するための官能基を有し、他端部に、水酸 基、アミノ基、カルボキシル基のような親水性の官能基を備えることが好ましい。電極 スぺーサ一の電極結合末端とは反対側の端部に親水性官能基を備えることにより、 電極スぺーサ一とプローブや標的核酸との非特異的な相互作用を防止でき、電極ス ぺーサ一による光誘起ホール移動の阻害が生じない。
[0102] 電極スぺーサ一の長さは、 l〜3nm程度であることが好ましい。上記の範囲であれ ば、電極スぺーサ一の機能を十分に果たすことができる。この長さは、電極スぺーサ 一の末端官能基を除く部分が直鎖状飽和炭化水素である場合に、 C〜C
2 10程度の長 さに該当する。また、スぺーサ一が核酸である場合には、ヌクレオチド 1〜5個程度の 長さに該当する。また、電極スぺーサ一がポリペプチドである場合には、アミノ酸 1〜1 0個程度の長さに該当する。
[0103] 電極スぺーサ一は、末端官能基を除く部分が C〜C 程度、特に C〜C程度の長
2 10 4 8 さの直鎖状飽和炭化水素であることが好まし 、。このような電極スぺーサ一の具体例 としては、 C
2〜C (特に、 C
10 4〜C )のメルカプトアル力ノール、アルキルァミンが挙げら
8
れる。
[0104] 電極スぺーサ一は、プローブ 1分子当たり、通常 1〜1000分子程度、好ましくは 100 〜500分子程度が電極に結合して 、ればよ、。上記範囲であれば十分にその効果 が得られる。
(Π)プローブユニットの製造方法
本発明のプローブユニットの製造方法は、標的核酸を認識するプローブにホール 移動誘起剤を結合させる工程と、プローブの一端を電極と結合させる工程とを含み、 ホール移動誘起剤結合工程にぉ ヽて、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電 極結合末端との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するよ うにホール移動誘起剤を結合させる方法である。
[0105] プローブと領域との間、及びプローブと電極との間は、通常、共有結合により結合 すればよい。
[0106] (III)ヌクレオチド同定装置
本発明のヌクレオチド同定装置は、基体と、 1又は複数の上記プローブユニットと、 プローブユニットの電極力も電気化学的信号を検出するための手段とを備える。プロ ーブユニットは、その電極力 電気化学的信号を検出できるように基体に配置されて いる。
[0107] 基体は、プローブユニットを支持するとともに、複数のプローブユニットを用いる場 合は、これらのプローブユニットの電極間を絶縁する役割を果たす。
[0108] 基体の材料は、電気絶縁性材料であればよく特に限定されな ヽ。例えば、ガラス、 セメント、陶磁器のようなセラミックス；ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポ リカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタタリレートのようなポリマー；シリコーン、活 性炭などが挙げられる。
[0109] プローブユニットの電極は、互いに基体材料で絶縁されており、また電気化学的信 号の検出手段と接続されて!、る。
[0110] 電気化学的信号の検出手段は、ホール移動による微小な電流を、電流、電圧、ク 一ロン量、抵抗値などとして検出できるものであればよぐ特に限定されない。このよう な微小な電流を検出できるものとして、例えば 2電極方式又は 3電極方式の電気化 学セルが挙げられる。この場合、電気化学的信号検出手段は、参照電極又は参照 電極及び対電極、並びに電圧計又は電流計を備えるものであり、プローブの電極を 作用電極としてこれとともに電気化学セルを構成して、光電流を検出する。
(IV)ヌクレオチドの同定 法
本発明の目的ヌクレオチド領域の同定方法は、
標的核酸と電極に結合したプローブとをハイブリダィズさせる第 1工程と、 第 1工程の前又は後に、プローブ又は標的核酸に、直接又は間接的にホール移動 誘起剤を結合させ、このときプローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合位置 との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するようにプローブ にホール移動誘起剤を結合させる力、標的核酸中のプローブの電極結合位置に対 応する位置とホール移動誘起剤結合位置との間に目的ヌクレオチド領域が位置する ように、標的核酸にホール移動誘起剤を結合させる第 2工程と、
上記ノヽイブリダィズ産物へのエネルギー供給により、ホール移動誘起剤結合位置 力 電極へのプローブ中のホール移動を引き起こして電極力 検出される電気化学 的信号を検出し、ハイブリダィズ前のプローブにエネルギー供給した場合に電極から 検出される電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領 域がプローブ中の対応する領域と完全相補的である力否かを判定する第 3工程と を含む。
[0111] ホール移動誘起剤は、プローブ又は標的核酸のいずれに結合させてもよい。いず れの場合も、供給されたエネルギーがホール移動誘起剤によりホールの発生のため に使用されて二本鎖中の電極へのホール移動が起こる。
[0112] プローブに結合させる場合は、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合 位置との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するように、ホ ール移動誘起剤を結合させればょ 、。
[0113] また、標的核酸に結合させる場合は、プローブの電極結合位置に対応する位置と、 ホール移動誘起剤結合位置との間に、同定されるべきヌクレオチド領域が位置する ように、ホール移動誘起剤を結合させればよい。
[0114] ホール移動誘起剤は、直接結合させてもよいが、プローブと標的核酸とをハイプリ ダイズさせた後に結合させる場合は、へキスト 33258、マイトマイシン、シスプラチン、 デイスタマイシンなどの DNA結合剤を 2本鎖間にバインド（結合）させ、その DNA結 合剤にホール移動誘起剤を結合させてもよい。さらに、ホール移動誘起剤が DNA結 合剤である場合は、 2本鎖間にバインド (結合)させるだけでもよ 、。
[0115] プローブ、スぺーサ一、電極、電極スぺーサ一、ホール移動誘起剤については、本 発明のプローブュニットについて説明した通りである。
[0116] 第 1工程の前にホール移動誘起剤をプローブに結合させる場合は、第 2工程を行 わず、上記説明した本発明のプローブユニットを用いることもできる。この場合、本発 明のヌクレオチド領域の同定方法は、以下の第一及び第二の 2方法に分けることが できる。
[0117] 本発明の第一のヌクレオチドの同定方法は、本発明のプローブユニットの第一のプ ローブ (オリゴヌクレオチド）と標的核酸とをハイブリダィズさせる工程と;このプローブ にエネルギー供給して電極力も電気化学的信号を検出し、標的核酸をハイブリダィ ズさせないプローブにエネルギー供給する場合に電極力 検出される電気化学的信 号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域とプローブの対応する 領域とが完全相補的である力否かを判定する工程とを含む方法である。代表的には 、標的核酸中の目的ヌクレオチドとプローブの対応するヌクレオチドとが相補的であ る力否かを判定し、これにより、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がグァニン又 はシトシンであるか否かを判定する。
[0118] 第一の方法において、標的核酸中の同定しょうとする目的ヌクレオチドに対合する プローブ中の特定ヌクレオチドの塩基がグァニンである場合は、標的核酸中の目的 ヌクレオチドの塩基がシトシンであるか否かを判定し、プローブ中の特定ヌクレオチド の塩基がシトシンである場合は、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がグァニンで あるカゝ否かを判定する。
[0119] また、本発明の第二のヌクレオチドの同定方法は、上記の第一の同定方法におい て、第一のプローブに代えて、式（1)で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌク レオチド誘導体からなる第二のプローブを備えたプローブユニットを用いる方法であ る。第二の方法では、代表的には、標的核酸中の目的ヌクレオチドとプローブの対応 するヌクレオチドとが相補的であるか否かを判定し、これにより、標的核酸中の目的ヌ クレオチドの塩基がチミンである力否かを判定する。 標的核酸は、 1本鎖核酸であればよい。標的核酸は DNAであってもよぐ RNAであ つてもよいが、 DNAの方が検出感度が高い。特に、プローブとして DNA又はその誘導 体を用い、標的核酸として DNAを用いる場合には、高感度にヌクレオチドを同定でき る。
[0120] 一般式（1)のヌクレオチド誘導体を含むプローブを用いる場合は、そのヌクレオチド 誘導体がデォキシチミジンと対合する場合に強 、ホール移動が生じることから、標的 核酸は DNAである。
[0121] また、標的核酸を PCRのような公知の方法で増幅した後に、プローブとハイブリダィ ズさせることにより、検出感度が向上する。この場合、本発明のヌクレオチド同定方法 は、ハイブリダィズ工程に先立ち、標的核酸を増幅させる工程を含めばよい。
[0122] また、標的核酸は、例えばヒトから採取された血液や、微生物を含むかもしれな 、 食品からの核酸抽出液のような夾雑物質を多く含むサンプルの形態で用いることもで きる。この場合、サンプルを 60〜100°C程度で熱処理することにより、 2本鎖核酸を 1 本鎖核酸に変性させ、好ましくは PCRなどにより増幅させた後に使用すればよい。 ハイブリダィズ工程
ノ、イブリダィズに際しては、例えば lnM〜lmM程度の濃度の標的核酸を本発明の プローブに接触させればよ ヽ。
[0123] ノ、イブリダィズ条件は、プローブ中のオリゴヌクレオチドと標的核酸との相補性の程 度などによって異なる力 例えば、 10〜100mMの中性バッファー (代表的には 50mM リン酸ナトリウムバッファー (pH7.0》中で、 5〜40°C程度、 30秒間〜 1時間程度の条件 が挙げられる。また、従来のハイブリダィゼーシヨンを利用したヌクレオチドの同定方 法においては、ハイブリダィズ後に洗浄により未結合の核酸を除去しない場合に検 出エラーが生じ易いが、本発明方法は、残存する未結合核酸が核酸内ホール移動 を妨げることがない。従って、ハイブリダィゼーシヨン後の洗浄は必ずしも要さないが、 洗浄を行っても構わない。洗浄は、例えば 10〜100mMの中性バッファーで、 5〜40°C 程度、 30秒間〜 1時間程度の条件で行えばょ 、。
[0124] また、このようなハイブリダィゼーシヨン溶液を使用しなくても、血液サンプル、食品 力もの核酸抽出液のような粗サンプルをそのまま、本発明のプローブと接触させるこ ともできる。この場合は、 5〜40°C程度の粗サンプルを、 30秒間〜 1時間程度プロ一 ブと接触させればよい。
光照射工程
このようにして、標的核酸をノヽイブリダィズさせたプローブに、通常 l〜100mW'cm-2 程度、好ましくは 5〜50mW' cm-2程度のエネルギー密度で、数 msec〜l分間程度、 光のようなエネルギーを供給すればよい。エネルギー密度が上記範囲であれば、十 分にホール移動を起こすことができる。また、これ以上エネルギー密度が高くてもコス ト高になるだけである。
[0125] また、エネルギーが光である場合は、光の波長は特に限定されず、ホール移動誘 起剤（この場合光増感剤）の感光域に合わせた波長にすればよいが、例えば 300〜6 00應程度の紫外光が好ましい。余りに波長が短いと、ポリヌクレオチドや基板が光を 吸収して電流を誘起し、エラーが生じる恐れがある力 上記範囲であればこのような 問題は生じない。
雷気 の 屮, '半 II
判定工程にぉ 、ては、標的核酸をノヽイブリダィズさせたプローブにエネルギー供給 して検出される電気化学的信号と、標的核酸をハイブリダィズさせて ヽな ヽプローブ に同じ条件でエネルギー供給した場合に検出される電気化学的信号とを比較する。 これは、標的核酸やプローブの配列、長さによって信号の絶対値が異なるためであ る。
[0126] オリゴヌクレオチドプローブを用いる第一の方法では、標的核酸とハイブリダィズさ せる前の信号値 (電流、電圧など)を 1とした場合に、ハイブリダィズ後の信号値が例 えば 1.5以上、好ましくは 3以上である場合に、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基 がシトシン又はグァニンであると判定することができる。それより低い場合は、 目的ヌク レオチドの塩基がシトシン又はグァニン以外である力、プローブに対して欠失や挿入 が存在して 1対 1にはハイブリダィズして 、な 、と判定することができる。
[0127] また、オリゴヌクレオチド誘導体プローブを用いる第二の方法では、標的核酸とハイ ブリダィズさせる前の信号値 (電流、電圧など）を 1とした場合に、ハイブリダィズ後の 信号値が例えば 1.5以上、好ましくは 3以上である場合に、標的核酸中の目的ヌクレ ォチドがデォキシチミジル酸であると判定することができる。それより低い場合は、 目 的ヌクレオチドの塩基がチミン以外である力、プローブに対して欠失や挿入が存在し て 1対 1にはノ、イブリダィズして 、な 、と判定することができる。
[0128] なお、標的核酸をハイブリダィズさせた後のプローブは、熱処理やホルムアミド処理 により 1本鎖にして、再使用することができる。
[0129] 実施例
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されない。
<m\^ >
JH NMRは、 Varian Mercury 400(400MHz)スぺクトロメーターを用いて測定した。力 ップリング定数 (J値)は hertzで表した。化学シフトは、残存するクロロフオルムを内部標 準として用いて（H NMRにおいて δ =7.24)テトラメチルシランから下流に ppmで示した
[0130] FAB massは、 JEOL JMS HX-llO ぺクトロメーターで記録した。 DNA合成試薬は
Glen Rsearch力ら購入した。
[0131] オリゴデォキシヌクレオチドの量は MALDI- TOF MS(Perseptive Voyager Elite,ァク セレーシヨン電圧 2 lkV,ネガティブモード)で、マトリクスとして 2',3',4'-トリヒドロキシァ セトフエノンを用い、オリゴヌクレオチドの内部標準として T8 ([M -H— ]2370.61)及び T1
7 ([M -H— ]5108.37)を用いて、決定した。
[0132] 逆相 HPLCは、 Gilsonクロマトグラフモデル 305付きの CHEMOCOBOND 5- ODS- H カラム（10 X 150mm。 4.6 X 150mm)及び 254nmの UV検出器モデル 118を用いて行つ た。
実施例 1
[0133] 2-アントラキノンカルボキシリックアシッド N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成
以下のようにして光増感剤である 2-アントラキノンカルボキシリックアシッド N-ヒドロキ シスクシンイミドエステルを合成した。
[0134] 2-アントラキノンカルボキシリックアシッド（200mg、 0.79mmol)及び N-ヒドロキシスク シンイミド（91mg,0.79mmol)のァセトニトリル (6ml)溶液に、 EDCI (152mg,0.79mmol)を 添加し、この混合物を室温で 2時間攪拌した。この反応混合物を蒸発させ、粗生成物 をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロフオルム /メタノール = 100:1)で精製し、 2 -アントラキノンカルボキシリックアシッド N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを薄黄色 固体として得た。
[0135] 生成物について1 H NMR(CDC1 ,400MHz)を行った結果、 δ 9.08(d,J = 1.6Ηζ,1Η),8.
3
52(dd,J=8.2,1.8Hz,lH),8.47(d,J=8.0Hz,lH),8.39-8.34(2H),7.88-7.85(2H),2.96(s,4H
)の化学シフトが検出された。
[0136] また、 FABMSを行った結果、 m/eWSSO M+H)"]の結果が得られた。
[0137] また、 C H NOについて HRMSを行った結果、計算上の [(Μ+Η^ΒδΟ.ΟΘΘδが 350.0
19 12 6
663の位置に検出された。
実施例 2
[0138] アントラキノン修飾オリゴデォキシヌクレオチド
applied Biosystem 392 DNA/RNAシンセサイザーを用いて、フォスフオルアミダイト 法により DNAを合成した。アミノ基及びジスルフイド基の取り込みは、それぞれ Amino- Modifier C2 T2及び Thio卜 Modifier C6 S- S(Glen Research)を用いて行った。合成し た DNAは、 5- ODS- Hカラム（10 X 150mm)の逆相 HPLCにアプライし、 0.1M酢酸トリエ チルァミン (PH7.0)を 5-20%のァセトニトリルの直線的濃度勾配をつけて 3.0mL/分間の 流量で 30分間流すことにより溶出を行った。
[0139] この方法で、 3'末端にジスルフイド基を含む、 Uがァミノ修飾されたオリゴデォキシヌ クレオチド 5'- d T^^UCACTTCAGTG)- (CH ) - S- S- (CH ) -T- 3' (核酸部分は配列 番号 1)、
Figure imgf000025_0001
配列番号 2)を合成した。
[0140] この 2種のオリゴデォキシヌクレオチドの各 50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH8.0
)溶液 (25 μ Μ,全量 100 μ L)に、実施例 1で得られた 2-アントラキノンカルボキシリック アシッド Ν-ヒドロキシスクシンイミドエステルの 1:1 DMF-ジォキサン（40 L)溶液（50m
M)を添カ卩し、室温で 12時間インキュベートした。
[0141] 反応混合物を逆相 HPLCにアプライした後、 0.1M酢酸トリェチルァミン (pH7.0)を 0- 6 0%のァセトニトリルの直線的濃度勾配をつけて 3.0mL/分間の流量で 1時間流すこと により溶出を行 、、アントラキノン修飾オリゴデォキシヌクレオチドを精製した。
[0142] 得られたアントラキノン修飾オリゴデォキシヌクレオチドは、それぞれ 5'-d(TAQUCAC TTCAGTG)- (CH ) -S-S-(CH ) -T-3' (核酸部分は配列番号 1)、及び 5'-d(TAQUACA
2 6 2 6
CTGAAGTG)-(CH ) -S-S-(CH ) -T- 3' (核酸部分は配列番号 2)である。
2 6 2 6
実施例 3
[0143] チオール化したオリゴデォキシヌクレオチドの調製
3しジスルフイド修飾オリゴデォキシヌクレオチドの 50mMリン酸ナトリウムバッファー (ρ H8.0)溶液（25 μ Μ,全量 100 μ L)に、ジチオスレィトールの 50mMリン酸ナトリウム (ρΗ8 .0)溶液 (0.1M)を 300 /z L添カ卩し、室温で 1時間インキュベートした。反応混合物を逆相 HPLCにアプライした後、 0.1M酢酸トリェチルァミン (ρΗ7.0)を 0- 60%のァセトニトリルの 直線的濃度勾配をつけて 3.0mL/分間の流量で 1時間流すことにより溶出を行い、チ オールィ匕アントラキノン修飾オリゴデォキシヌクレオチドを精製した。
[0144] 得られたチオールィ匕アントラキノン修飾オリゴデォキシヌクレオチドは、それぞれ 5' -d(TAQUCACTTCAGTG)-(CH ) -SH-3' (プローブ 1) (核酸部分は配列番号 1)、及び
2 6
5'-d(TAQUACACTGAAGTG)-(CH ) -SH-3' (プローブ 2) (核酸部分は配列番号 2)で
2 6
ある。
<皙量分析 >
実施例 2及び 3で合成した 6種のオリゴデォキシヌクレオチド誘導体は、以下のよう にして、 MAILDI-TOF MS分析を行うことにより、その構造を確認した。
[0145] 精製された各オリゴデォキシヌクレオチド誘導体の溶液の少量を仔牛腸アルカリ フォスファターゼ (50U/ml)、へビ毒フォスフォジエステラーゼ (0.15U/ml)、及び PIヌク レアーゼ (50U/ml)を用いて 37°Cで 3時間完全消化した。消化 DNA溶液を Cosmosil 5 C- 18ARの HPLC又は CHEMCOBOND 5- ODS-Hカラム (4.6 X 150mm)にアプライし、 0.1M酢酸トリェチルァミン (pH7.0)を 0-20%のァセトニトリルの直線的濃度勾配をつけ て l.OmL/分間の流量で 20分間流すことにより溶出を行った。
[0146] 各オリゴデォキシヌクレオチド誘導体の濃度は、 dA、 dC、 dG及び dTの O.lmM標準 溶液のピーク面積と比較することにより決定した。 [0147] 各オリゴデォキシヌクレオチド誘導体にっ 、て MALDI-TOF MS分析を行!、、以下 の結果が得られた。
(a)ジスルフイド含有アミノ修飾オリゴデォキシヌクレオチド
5 ,_d(TaminoUCACTTCAGTG (CH ) _S_S_(CH ) -T-3' (核酸部分の配列は配列番号
2 6 2 6
1) ;m/z計算上の [M -H]—4342.09力 S4342.75に検出された。
5 '— d(Tamin。uACACTGAAGTG- (CH ) - S- S- (CH ) -T- 3' (核酸部分の配列は配列番
2 6 2 6
号 2) ;m/z計算上の [M - ΗΓ4713.35が 4715.52に検出された。
(b)アントラキノン修飾オリゴデォキシヌクレオチド
5'-d(TAQUCACTTCAGTG-(CH ) - S- S- (CH ) -T- 3' (核酸部分の配列は配列番号 1)
2 6 2 6
； m/z計算上の [Μ -ΗΓ4575.30が 4578.57に検出された。
5'-d(TAQUACACTGAAGTG-(CH ) - S- S- (CH ) -T- 3' (核酸部分の配列は配列番号
2 6 2 6
2) ;m/z計算上の [Μ -H]—4946.56が 4949.27に検出された。
)チオール化オリゴデォキシヌクレオチド
5'-d(TAQUCACTTCAGTG-(CH ) -SH)-3' (核酸部分の配列は配列番号 l) ;m/z計算
2 6
上の [M -H]— 4138.88力 S4140.67に検出された。
5'-d(TAQUACACTGAAGTG-(CH ) -SH)-3' (核酸部分の配列は配列番号 2) ;m/z計
2 6
算上の [M -H]—4507.83が 4510.48に検出された。
実施例 4
[0148] チオール化されたオリゴデォキシヌクレオチドの金電極への固定
面積 2mm2の金電極を使用した。オリゴデォキシヌクレオチド誘導体の固定の前に、 電極を沸騰した 2M水酸ィ匕カリウムに 3時間浸漬し、脱イオン水で洗浄した。次いで、 この電極を濃硝酸に 1時間浸漬し、脱イオン水で洗浄した。
[0149] 電極への化学吸着のために、実施例 3で得られた 2種のチオールィ匕アントラキノン 修飾オリゴデォキシヌクレオチドの溶液 (プローブ 1, 2) (10 M)の 1 Lを電極上に 載置し、溶液が蒸発しないように電極の端にゴムキャップを被せた。これを室温で 2時 間静置した。
[0150] 次いで、金表面を隠すために、 6-メルカプトへキサノールの 10mM Tris- EDTAバッ ファー（PH8.0)溶液 (ImM)の： L Lを金電極上に載せ、溶液の蒸発を防ぐために電極 の端にゴムキャップを被せた。これを室温で 1時間静置した。次いで、この電極を少 量の脱イオン水で洗浄した。
実施例 5
[0151] 標的 DNAのハイブリダィゼーシヨン
標的 DNAを金電極に固定ィ匕されたプローブにノ、イブリダィズさせるために、 10 μ Μの標的 DNA溶液の 1 μ Lを、金電極の上に載せ、溶液の蒸発を防ぐために電極の 端をゴムキャップで覆 ヽ、室温で 30分間静置した。
[0152] 標的 DNAとしては、プローブ 1に対して、サンプル 1 (3 '-AAGTGAAGTCAC-5 ' ) (配 列番号 3)、及びサンプル 2 (3'-AAGTGAAATCAC-5') (配列番号 4)を用いた。配列 番号 3の標的 DNAは、プローブ 1の配列番号 1の塩基番号 8の Cに対応する塩基が G でマッチしている。また、配列番号 4の標的 DNAは、プローブ 1の配列番号 1の塩基 番号 8の Cに対応する塩基力 Aでミスマッチしている。配列番号 3及び 4は、アルコー ル代謝系で働くアルデヒドデヒドロゲナーゼ (ALDH2)の部分配列であり、配列番号 3 は塩基番号 8が Gである力 配列番号 4のように、これ力 である場合（G1510A)は、ァ ルコールを代謝し難 、ことが知られて 、る。
[0153] また、サンプル 1の塩基配列を含む全長 91塩基のサンプル 3 (3'-GGGAGTGGCC
CAGTCAAAGTGCCTCAGAAGAACTCATAAG-5') (配列番号 5)及び、サンプル 2 の塩基配列を含む全長 91塩基のサンプル 4 (3'- GGGAGTGGCCGGGAGTTGGGC
CCTCAGAAGAACTCATAAG-5') (配列番号 6)も、プローブ 1に対する標的核酸と して用いた。配列番号 5の標的 DNAは、プローブ 1の配列番号 1の塩基番号 46のじに 対応する塩基が Gでマッチしている。また、配列番号 6の標的 DNAは、プローブ 1の 配列番号 1の塩基番号 46の Cに対応する塩基が Aでミスマッチしている。
[0154] プローブ 2に対する標的 DNAとしては、サンプル 5 (3 -TATGTGACTTCAC-5') (配 列番号 7)、及びサンプル 6 (3'- TATGTGAェ TTCAC -5，）（配列番号 8)を用いた。配 列番号 7の標的 DNAは、プローブ 2の配列番号 2の塩基番号 8の Gに対応する塩基 力 SCでマッチしている。一方、配列番号 8の標的 DNAは、プローブ 2の配列番号 2の 塩基番号 8の Gに対応する塩基力^でミスマッチしている。
[0155] 標的 DNAの溶液は、 10mM力コジル酸ナトリウム (pH7.0)を含む水溶液とした。
実施例 6
[0156] 雷気 沏 I定
1コンパートメントパイレックス (登録商標）セルを用いて光電気化学的測定を行った
。このセルに、 200Wの UVランプ（Sumida YLT- MX200)を用いて 365±5nmのバンド パスフィルター（ φ 25mm,Asahi Bunko)を通して単色励起光を照射した。光電流を、 修飾 Au作用電極 (電極面積 2mm2)、プラチナ対電極、及び SCE参照電極を備える 3 電極方式 (ALS,モデル 660A)を用いて 25°Cで測定した。光強度を光強度計（Ushio UI T-150)を用いて測定した。光電流測定は、 10mM力コジル酸ナトリウム（pH7.0)の中 で、 =365±5nmの光で、 13.0±0.3mW'cm-2の電力密度で、 SCE電極への印加電 圧を +0.5Vとして行った。
[0157] プローブ 1の結果を図 la及び図 lbに示し、プローブ 2の結果を図 2に示す。図 la及 び図 2は、 20回の実験結果を示し、図 lbは、 10回の実験結果を示す。プローブ 1及び 2において、標的 DNAと対合させる前の電流密度は- 187 ±23 nA'cm— 2であった。
[0158] 図 laに示すように、プローブ 1については、プローブ 1の Cと 12塩基長の標的 DNA
(サンプル 1)の Gとが対合するとき電流密度は- 299±21nA'cm— 2であり、この値は、標 的 DNAと対合させる前の電流密度の約 1.6倍であった。一方、プローブ 1の Cと 12塩 基長の標的 DNA (サンプル 2)の Aとが対合するとき電流密度は- 153士 32ηΑ· cm— 2で あり、この値は標的 DNAと対合させる前の電流密度と同程度であった。
[0159] 図 lbに示すように、プローブ 1については、プローブ 1の Cと 91塩基長の標的 DNA( サンプル 3)の Gとが対合するとき電流密度は- 297±20nA'cm— 2であり、この値は、こ の値は標的 DNAと対合させる前の電流密度の約 1.6倍であった。一方、プローブ 1の Cと 91塩基長の標的 DNA (サンプル 4)の Aとが対合するとき電流密度は- 205±25ηΑ· cm— 2であり、この値は標的 DNAと対合させる前の電流密度と同程度であった。標的 D NAの長さにかかわらず、正確にヌクレオチドを同定できることが分力る。
[0160] 図 2に示すように、プローブ 2については、プローブ 2の Gと標的 DNA (サンプル 5)の Cとが対合するとき、電流密度は- 271 ±25nA'cm— 2であり、この値は、標的 DNAと対合 させる前の電流密度の約 1.4倍であった。一方、プローブ 2の Gと標的 DNA (サンプル 6)の Tとが対合するとき、電流密度は- 170± 12nA'cm— 2であり、この値は、標的 DNAと 対合させる前の電流密度と同程度であった。
実施例 7
[0161] 余雷極に岡定されたオリゴデォキシヌクレオチドの定量
電極表面に固定されたプローブ 1, 2の量を chronocoulometric assayにより、ノレテ- ゥム (III)へキサァミンの存在下で、 Tarlovの方法（Steel,A,B.:Herne,T.M.;Tarlov,M.J. Anal.Chem.1998,70,4670-4677)に従い行った。面積 2mm2の電極上に、それぞれ lc m2当たり 6.0 X 1012個（9.9±0.8pmol/cm2)のプローブ 1、 2が結合していた。
実施例 8
[0162] MDA含有ヌクレオシド誘導体の合成
図 3を参照して説明する。 2-ブタノン (50ml)中に 3-フルォロ- 4-ニトロフエノール（6.0 g、 38.2mmol)、インドメタン (25ml)及び炭酸カリウム（10.0g、 72.0mmol)を含む混合物 を 40°Cで 4時間加熱した。反応混合物を蒸発し、クロ口ホルム (50ml)中に注入した。こ れにより白色固体として 6.81gの 3-フルォロ- 4-ニトロア-ソール（図 3化合物（k) )が得 られた。
[0163] 無水 THF (153ml)中のェチノレシァノアセテート (9.8ml, 93.4mmol)の氷冷溶液に、 窒素ガス下で、 tert-カリウムブトキシド（10.9g、 101.9mmol)を添カ卩した。得られた白色 懸濁液を 15分間撹拌し、化合物 (k) (8.0g、 46.7mmol)を添加した。懸濁液を還流しつ つ 1.5時間加熱した。溶液を水中に注入し、水性混合物をエーテルで 3回抽出し、有 機化合物相を乾燥し、濃縮して油にした。次いで、この油をクロロフオルムに溶解し、 カラムクロマトグラフィーでクロロフオルムを用いて溶出させることにより精製した。精製 物画分を合わせて、濃縮することにより、淡黄色油としてシァノ (2--トロフエ-ル)酢 酸ェチルエステル（図 3ィ匕合物 (1) ) 14.5gを得た。
[0164] 化合物（1) (13.2g、 46.3mmol)の氷酢酸（185ml)溶液に Zn粉末（12.1mg、 185mmol) を添加した。混合物を超音波処理し、 55°Cで 45分間加熱し、さらに 4gの Zn粉末を添 加した。超音波処理後、さらに 105分間加熱し、茶色混合物を濾過した。濾液を濃縮 し、残さを得た。残さをカラムクロマトグラフィーにより精製し、連続的に 0%、 5%、 10 %の酢酸ェチルのへキサン溶液で溶出した。これにより、 2-ァミノ- 5-メトキシ- 1H-ィ ンドール- 3-カルボキシリックアシッドェチルエステル（図 3化合物 (m)) 2.07g (収率 52% )を得た。
[0165] 化合物 (m) (100mg、 0.42mmol)、ナトリウムメトキシド（50mg、 0.93mmol)及びフオルム アミド (20ml)の懸濁液を 220°Cで 1.5時間加熱した。溶液を 25°Cに冷却し、水中に注入 した。茶色固体を集め、乾燥することにより 1,9-ジヒドロ- 6-メトキシ -4H-ピリミド [4,5-b ]インドール- 4-オン（図 3化合物 (n)) (47mg、収率 52%)を得た。
[0166] 化合物 (n) (500mg、 2.3mmol)、フォスフォリルクロリド（25ml)及び 1,4-ジォキサン (25 ml)の混合物を 6時間還流した。混合物を減圧下に濃縮し、残さをエタノール中に注 入した。 5分間撹拌後、茶色の懸濁液を濾過し濾液を水中に注入した。白色固体とし て 4-クロ口- 6-メトキシ- 1H-ピリミド [4,5-b]インドール（図 3化合物 (0))を回収した（620 mg、収率 96%)。
[0167] 化合物 (0) (100mg、 0.43mmol)を無水ァセトニトリル (10ml)に室温で懸濁した。この懸 濁液に水素化ナトリウム（油中 60%、 19mg、 0.47mmol)を添カ卩し、混合物を 10分間還 流しつつ撹拌した。リボース（184mg、 0.47mmol)を添カ卩し、混合物を室温で 1時間撹 拌した。反応混合物を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、へキサン中 の 20%酢酸ェチルで溶出させることより精製した。これにより、 4-クロ口- 6-メトキシ -7- ( 2-デォキシ- 3,5-ジ- 0-p-トルオイル- 13 -D-エリス口-ペントフラノシル） -7H-ピリミド [4 , 5-b]インドール（図 3化合物（p) ) 21 Omg (収率 82%)を得た。
[0168] 20mlメタノール Zアンモニア（- 76°Cで飽和）中の化合物 (p) (500mg、 0.85mmol)を密 閉容器内で 150°Cで 10時間撹拌した。濁った溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマト グラフィによりクロロフオルム中の 10%メタノールを用いて溶出し、 4-ァミノ- 6-メトキシ- 9- (2，-デォキシ- 13 -D-エリス口-ペントフラノシル） -7H-ピリミド [4,5- b]インドール（図 3化合物 (r)) (420mg、 75%)を得た。
[0169] この化合物は、塩基としてメトキシベンゾデァザアデニン (MDA)を有するデォキシリ ボヌクレオシド誘導体である。
実施例 9
[0170] MDA含有オリゴヌクレオチド謙 体の合成 図 4を参照して、実施例 8により得られた MDA含有ヌクレオシド誘導体カゝら MDA含 有オリゴヌクレオチド誘導体を合成した例を説明する。
[0171] Ν,Ν-ジメチルフオルムアミドジメチルァセタール（10ml、 28mmol)を含む、図 3の化 合物（r) (90mg、 0.27mmol)のジメチルフオルムアミド (10ml)溶液を 60°Cの温度下で 3 時間撹拌した。この溶液を減圧下で濃縮した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィ 一（クロロフオルム:メタノール = 10:1)により精製し、白色固体として（図 4化合物（s) ) (120mg、 O.lmmoU 88%)を得た。
[0172] ジメトキシトリチルクロリド (DMT- Cl) (137mg,0.41mmol)を含む、化合物 （120mg、 0 • lmmol)のピリジン (10ml)溶液を室温下で 2時間撹拌した。この溶液を減圧下で濃縮 した。残さをシリカゲルクロマトグラフィー（クロ口ホルム：メタノール：トリェチルァミン） = 90:3 : 5)により精製し、白色固体として（図 4化合物 (t) ) (161mg、 75%)を得た。
[0173] ィ匕合物 (t) (50mg、 72.7mmol)、 Ν,Ν,Ν' ,Ν，-テトライソプロピル- 2-シァノエチルフォス フォロアミダイト（25 μ 1、 79.9 μ mol)及びテトラゾール（7mg、 0. lmmol)の 0.3mlァセトニ トリル溶液を室温下で 2時間撹拌した。混合物を濾過した。これにより、（図 4化合物（ u) )を得た。この化合物 (u)を精製せずに DNA合成に供した。
[0174] 化合物 (u)を用いてアプライドバイオシステム 392DNA/RNAシンセサイザーを用いて フォスフォロアミダイト法によりオリゴデォキシリボヌクレオチド誘導体 5， -AAQUACACT nAAGTG-3' (配列番号 7)である（nは、 MDA含有デォキシリボヌクレオチド誘導体； 化合物 (u)相当）。得られた MDA含有オリゴデォキシリボヌクレオチド誘導体を 5-ODS -Hカラム（10 X 150mm)を用いた逆相 HPLCにより精製した。溶出は、 0.1Mトリェチル ァミンアセテート (TEAA),pH7.0においてァセトニトリルを 20分間で 5%から 25%の勾 配をつけて、流速 3.0ml/分間で行った。
実施例 10
[0175] 雷気 沏 I定
実施例 9で得られたオリゴデォキシリボヌクレオチド誘導体を用いて実施例 2〜4と 同様にして、 MDA含有オリゴヌクレオチドを含むプローブ 3を金電極に固定した。プロ ーブ 3の核酸部分の塩基配列は、 5 ' -AAQUAC ACT-AAAGTG-3 ' (配列番号 9)であ る。 [0176] 実施例 5と同様にして、このプローブ 3と、サンプル 5 (配列番号 7)及び 6 (配列番号 8)とをそれぞれノ、イブリダィズさせた。配列番号 7の標的 DNAは、プローブ 3の塩基 番号 8の MDAに対合する塩基が Cでマッチしている。一方、配列番号 8の標的 DNA は、プローブ 3の塩基番号 8の MDAに対合する塩基カ^でミスマッチしている。さらに 、実施例 6と同様にして、光電気化学的測定を行った。結果を図 5に示す。
[0177] プローブ 3において、標的 DNAと対合させる前の電流密度は- 187 ±23 nA'cm— 2で あった。プローブ 3の MDA含有ヌクレオチドと標的 DNA (サンプル 6)の Tとが対合する とき、電流密度は- 282±21nA'cm— 2であり、この値は、標的 DNAと対合させる前の電 流密度の約 1.5倍であった。一方、 MDA含有ヌクレオチドと標的 DNAの Cとが対合す るとき (サンプル 5)
電流密度は- 198± 15nA'cm— 2であり、この値は、標的 DNAと対合させる前の電流密 度と同程度であった。
実施例 11
[0178] 実施例 2〜4と同様にして、核酸部分の塩基配列が 5'- I^UAGA AT^ C-S' (配 列番号 10)であるプローブ 4を金電極に固定した。プローブ 4の塩基番号 9は、標的 D NAの Tと相補的な塩基であることが必要である力 プローブ 4中に A又は T力 塩基以 上連続しないように塩基番号 9を Aに代えて MDA含有ヌクレオチドにしたものである。 従って、塩基番号 9の MDA含有ヌクレオチドは多型を検出するためのものではない。
[0179] 実施例 5と同様にして、このプローブ 4と、サンプル 7 (3'-CATCT£TAェ TG-5'；配列 番号 11)及び 8 (3 -CATCTATATTG-5'；配列番号 12)とをそれぞれハイブリダィズさ せた。サンプル 7及び 8は、ヒトチォプリン S-メチルトランスフェラーゼ (TPMT)遺伝子の 部分配列である。 TPMTは血液悪性腫瘍の治療剤であるァザチォプリンゃ 6-メルカ ブトプリンの代謝に関与している。 TPMT遺伝子の多型は多数存在する力 日本人の 有する変異アレルの殆どは TPMT * 3Cである。 TPMT * 3Cの変異は、塩基番号 6が A力 Gになったものであり、これにより上記治療剤の代謝が行われ難くなることが知 られている。
[0180] 配列番号 11の標的 DNAは、プローブ 4の塩基番号 6の Cに対合する塩基が Gでマツ チしている。一方、配列番号 12の標的 DNAは、プローブ 4の塩基番号 6の Cに対合す る塩基力 S Aでミスマッチして!/、る。
[0181] さらに、実施例 6と同様にして、光電気化学的測定を行った。 10回の実験結果を図 6に示す。プローブ 4において、標的 DNAと対合させる前の電流密度は- 135± 13ηΑ· cm— 2であった。プローブ 4の Cと標的 DNA (サンプル 7)の Gとが対合するとき、電流密度 は- 234± 14nA'cm— 2であり、この値は、標的 DNAと対合させる前の電流密度の約 1.7 倍であった。一方、プローブ 4の Cと標的 DNA (サンプル 8)の Aとが対合するとき、電流 密度は- 118± 17nA'cm— 2であり、この値は、標的 DNAと対合させる前の電流密度と同 程度であった。
実施例 12
[0182] 25人のパネラーから、同意を得て、その染色体 DNA中の ALDH2遺伝子の G1459A 位置を含む 91塩基の領域を、フォワードプライマー（5'- GGGAGTGGCCGGGAGTT- 3，）（配列番号 13)、及びリバースプライマー (5'- CTTATGAGTTCTTCTGA- 3，）（配列 番号 14)を用いた PCRにより増幅して標的 DNAを得た。
[0183] C又は Gを検出するための Gプローブ (核酸部分の塩基配列： 5'- AAQUACACTGA AGTG (配列番号 15)、及び T又は Aを検出するための MDAプローブ (核酸部分の塩 基配列： 5'- A^UACACT^ AGTG (配列番号 16)を用いて、実施例 3及び 4と同様 にして金電極に固定されたプローブを作成し、次いで、実施例 5と同様にしてこれら のプローブをそれぞれ標的 DNAとハイブリダィズさせ、実施例 6と同様にして光電気 化学的測定を行った。
[0184] Gプローブを用いた場合に検出される電流密度に対して、 MDAプローブを用いた 場合に検出される電流密度をプロットした結果を図 7aに示す。図 7a中のコントロール は、各プローブを標的 DNAとハイブリダィズさせる前に検出された電流密度を示す。
[0185] また、 Gプローブを用いた場合に検出される電流密度に対する MDAプローブを用 いた場合に検出される電流密度の比の値を、図 7bに示す。図 7bにおいて、上記比の 値が 1.04〜 1.29であるのが C/Tヘテロ接合群であり、 0.78以下であるのが C/Cホモ接 合群であり、 1.73以上であるのが T/Tホモ接合群である。
[0186] 図 7a及び bに示されるように、両プローブを用いて電流密度を測定することにより、 2 5人のパネラーは、 T/Tホモ接合、 C/Cホモ接合、又は C/Tヘテロ接合のいずれかの 群に明確に区別された。また、両プローブを用いた結果に相関性が認められることか ら、これらのプローブを用いたヌクレオチドの同定は信頼性の高い方法であることが 分かる。

Claims

請求の範囲
[I] 標的核酸中の目的ヌクレオチド領域を同定するためのプローブユニットであって、電 極と、電極に結合した、標的核酸を認識するプローブと、プローブに結合したホール 移動誘起剤とを備え、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端との 間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置しているプローブュ- ッ卜。
[2] 標的核酸中の目的ヌクレオチドを同定するためのプローブユニットであって、プロ一 ブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端との間に目的ヌクレオチドと対合す るヌクレオチドが位置して 、る請求項 1に記載のプローブユニット。
[3] プローブが、標的核酸とハイブリダィズすることにより標的核酸を認識するものである 請求項 1に記載のプローブユニット。
[4] プローブが 6〜30個のヌクレオチド又はその誘導体力もなるものである請求項 1に記 載のプローブユニット。
[5] ホール移動誘起剤が光増感剤である請求項 1に記載のプローブユニット。
[6] 光増感剤が、光励起ホール移動を起こすことができるものである請求項 5に記載のプ ローブユニット。
[7] 光増感剤が、キノン系増感剤、フラビン系増感剤、及びべンゾフエノン系増感剤から なる群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 5に記載のプローブユニット。
[8] プローブが、スぺーサーを介して電極に結合している請求項 1に記載のプローブュ ニット。
[9] スぺーサ一が、有機低分子化合物、核酸、及びポリペプチドからなる群より選ばれる 物質である請求項 8に記載のプローブユニット。
[10] スぺーサ一の長さが l〜3nmである請求項 8に記載のプローブユニット。
[II] 電極のスぺーサー結合面に複数の電極スぺーサーを備える請求項 1に記載のプロ ーブユニット。
[12] プローブが DNAであり、プローブ中の目的ヌクレオチドに対合するヌクレオチドの塩 基がグァニン又はシトシンである請求項 2に記載のプローブユニット。
[13] プローブが、標的核酸の目的ヌクレオチドと対合する位置に、下記式（1) [化 1]
Figure imgf000037_0001
(式中、 R、 R、 R、 R、 R、及び Rは、それぞれ独立して水素原子、アミノ基、モノ
1 2 3 4 5 6
低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲ ン原子、シァノ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、又はァリール基を示す。 ) で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド誘導体である請求項 2に記載 のプローブユニット。
[14] プローブ中の A及び Tからなる群より選ばれるヌクレオチドの連続数が 3以下である請 求項 1に記載のプローブユニット。
[15] プローブ中の、ホール移動誘起剤が結合したヌクレオチドに対して、電極結合末端と は反対側に位置するヌクレオチドが G及び C以外のヌクレオチドである請求項 1に記 載のプローブユニット。
[16] プローブ内部のヌクレオチドにホール移動誘起剤が結合して 、る請求項 1に記載の プローブユニット。
[17] 基体と、 1又は複数の請求項 1〜16のいずれかに記載のプローブユニットと、プロ一 ブの電極力も電気化学的信号を検出するための手段とを備え、プローブユニットの 電極が電気化学的信号を検出できるように基体に配置されているヌクレオチド領域 同定装置。
[18] 目的ヌクレオチド領域の同定方法であって、
標的核酸と電極に結合したプローブとをハイブリダィズさせる第 1工程と、
第 1工程の前又は後に、プローブ又は標的核酸に、直接又は間接的にホール移動 誘起剤を結合させ、このときプローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合位置 との間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するようにプローブ にホール移動誘起剤を結合させる力、標的核酸中のプローブの電極結合位置に対 応する位置とホール移動誘起剤結合位置との間に目的ヌクレオチド領域が位置する ように、標的核酸にホール移動誘起剤を結合させる第 2工程と、
上記ノヽイブリダィズ産物へのエネルギー供給により、ホール移動誘起剤結合位置 力 電極へのプローブ中のホール移動を引き起こして電極力 検出される電気化学 的信号を検出し、ハイブリダィズ前のプローブにエネルギー供給した場合に電極から 検出される電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領 域がプローブ中の対応する領域と完全相補的である力否かを判定する第 3工程と を含む目的ヌクレオチド領域の同定方法。
[19] ホール移動誘起剤をプローブに結合させる請求項 18に記載の方法。
[20] 第 1工程の前に第 2工程を行う請求項 18に記載の方法。
[21] 目的ヌクレオチド領域が一つの目的ヌクレオチドからなるものである請求項 18に記載 の方法。
[22] プローブが 6〜30個のヌクレオチド又はその誘導体からなるものである請求項 18に 記載の方法。
[23] ホール移動誘起剤が光増感剤である請求項 18に記載の方法。
[24] 光増感剤が、光励起ホール移動を起こすことができるものである請求項 23に記載の 方法。
[25] 光増感剤が、キノン系増感剤、フラビン系増感剤、及びべンゾフエノン系増感剤から なる群より選ばれる少なくとも 1種である請求項 23に記載の方法。
[26] プローブが、スぺーサーを介して電極に結合している請求項 18に記載の方法。
[27] スぺーサ一が、有機低分子化合物、核酸、及びポリペプチドからなる群より選ばれる 物質である請求項 26に記載の方法。
[28] スぺーサ一の長さが l〜3nmである請求項 26に記載の方法。
[29] 電極が、スぺーサー結合面に複数の電極スぺーサーを備えるものである請求項 18 に記載の方法。
[30] プローブが DNAであり、プローブ中の目的ヌクレオチドに対合するヌクレオチドの塩 基がグァニン又はシトシンであり、第 3工程において標的核酸中の目的ヌクレオチド の塩基がシトシン又はグァニンである力否かを判定する請求項 21に記載の方法。 プローブが、標的核酸の目的ヌクレオチドと対合する位置に、下記式（1)
[化 2]
Figure imgf000039_0001
(式中、 R、 R、 R、 R、 R、及び Rは、それぞれ独立して水素原子、アミノ基、モノ
1 2 3 4 5 6
低級アルキルアミノ基、ジ低級アルキルアミノ基、水酸基、低級アルコキシ基、ハロゲ ン原子、シァノ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、又はァリール基を示す。 ) で表されるヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチド誘導体であり、第 3工程にお いて標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がチミンである力否かを判定する請求項 2 1に記載の方法。
[32] プローブ中の A及び T力 なる群より選ばれるヌクレオチドの連続数が 3以下である請 求項 18に記載の方法。
[33] プローブ中の、ホール移動誘起剤が結合したヌクレオチドに対して、電極結合末端と は反対側に位置するヌクレオチドが G及び C以外のヌクレオチドである請求項 18に記 載の方法。
[34] プローブ内部のヌクレオチドにホール移動誘起剤が結合している請求項 18に記載の 方法。
[35] エネルギーを l〜100mW'cm-2照射する請求 18に記載の方法。
[36] 波長 300〜600nmの光を照射する請求項 23に記載の方法。
[37] 請求項 12に記載のプローブユニット中のプローブと標的核酸とをノ、イブリダィズさせ る工程と、 このプローブにエネルギー供給して電極力 電気化学的信号を検出し、標的核酸 をハイブリダィズさせないプローブにエネルギー供給する場合に電極カゝら検出される 電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域がプロ一 ブ中の対応する領域と完全相補的であるカゝ否かを判定する工程と
を含む目的ヌクレオチド領域の同定方法。
[38] 目的ヌクレオチド領域が一つのヌクレオチドからなるものであり、判定工程において、 標的核酸中の目的ヌクレオチドがプローブ中の対応する領域と相補的である力否か を判定することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がシトシン又はグァニン であるか否かを判定する請求項 37に記載の方法。
[39] エネルギーを l〜100mW' cm-2供給する請求項 37に記載の方法。
[40] エネルギーが光であり、波長 300〜600nmの光を照射する請求項 37に記載の方法。
[41] 請求項 13に記載のプローブユニット中のプローブと標的核酸とをノ、イブリダィズさせ る工程と、
このプローブにエネルギー供給して電極力 電気化学的信号を検出し、標的核酸 をハイブリダィズさせないプローブにエネルギー供給する場合に電極カゝら検出される 電気化学的信号と比較することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチド領域がプロ一 ブ中の対応する領域と完全相補的であるカゝ否かを判定する工程と
を含む目的ヌクレオチド領域の同定方法。
[42] 目的ヌクレオチド領域が一つのヌクレオチドからなるものであり、判定工程において、 標的核酸中の目的ヌクレオチドがプローブ中の対応する領域と相補的である力否か を判定することにより、標的核酸中の目的ヌクレオチドの塩基がチミンである力否かを 判定する請求項 41に記載の方法。
[43] エネルギーを l〜100mW' cm-2供給する請求項 41に記載の方法。
[44] エネルギーが光であり、波長 300〜600nmの光を照射する請求項 41に記載の方法。
[45] 標的核酸中の目的ヌクレオチド領域を同定するためのプローブユニットの製造方法 であって、標的核酸を認識するプローブに直接又は間接的にホール移動誘起剤を 結合させる工程と、プローブの一端を電極と結合させる工程とを含み、ホール移動誘 起剤結合工程にお!ヽて、プローブのホール移動誘起剤結合位置と電極結合末端と の間に目的ヌクレオチド領域と対合するヌクレオチド領域が位置するようにホール移 動誘起剤を結合させる方法。
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