WO2006054722A1 - 遺伝子を用いた熱不安定性フェノタイプ症のリスク診断法 - Google Patents

Abstract

　本発明は、高熱時に致死的または後遺症の残る中枢神経症状、あるいは多臓器不全を発症する可能性の高い、インフルエンザ脳症、ライ症候群、RSウイルス感染症、アデノウイルス感染症、ライノウイルス感染症、風疹、日本脳炎、マラリア感染症、乳幼児突然死症候群、川崎病を含む熱不安定性フェノタイプ症の診断方法であって、Transporter, カルニチン回路、長鎖β酸化回路、中鎖・短鎖β酸化回路、電子伝達, ケトン体合成およびATP産生のいずれかに関与する少なくとも１種の酵素の酵素活性が３７°Cを１００％としたとき３９°C以上、特に４１°Cでは健常者よりも有意に低下するか否かを調べることを特徴とする、診断方法に関する。

Description

明 細 書

遺伝子を用いた熱不安定性フエノタイプ症のリスク診断法

技術分野

[0001] 本発明は、熱不安定性フエノタイプ症のリスク診断法に関する。熱不安定性フエノタ イブ症とは、高熱によって誘発され得る致死的多臓器不全、或いは中枢神経障害に 基づく後遺症が残る可能性が健常者と比較して有意に高い体質を意味し、本発明で は、このような熱不安定性フエノタイプ症のリスクを診断することができる。

背景技術

[0002] 小児では 39°C以上の発熱時にしばしば熱性痙攣を発症するが、中には持続的な 高熱をきつかけとして重篤な中枢神経症状を発症し、肝臓、心臓、腎臓などの不全を 伴って死に至る原因不明の疾患群があり、その予防法、診断法、治療法は明らかで なかった。

[0003] 非特許文献 1は、 CPT IIの変異と生化学的機能について調べた文献であり、 37°C と 41°Cでのパルミテート酸ィ匕率を調べている力 温度変化による CPT IIの機能変化と 具体的な疾患との関連について記載はなぐ特に中枢神経症状を伴うインフルェン ザ脳炎'脳症、ライ症候群などとの関連にっ 、ては示唆されて!、な!/、。

[0004] 非特許文献 2は、ライ様症候群にぉ ヽて CPT Iと CPT IIの活性低下の関与を示唆し て!、るが、温度とこれら酵素の活性との関係につ ヽては記載されて 、な 、。

[0005] 非特許文献 3は、インフルエンザ脳炎 '脳症の重症化と CYP2C9多型との関連につ V、て記載して 、るが、温度と酵素活性の関連につ!、ての開示はな!/、。

非特許文献 l : S.E.01pin, et al. J.Inherit.Metab.Dis. 26, 543- 557頁， 2003 非特許文献 2 :阿部博紀、千葉医学 74: 9〜16頁， 1998

非特許文献 3 :船渡忠男ら、臨床病理、 50:2, 140-145頁、 2002

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明は、発熱をきつかけとして重篤な中枢神経症状を発症する熱不安定性フ ノ タイプ症のリスクを予め診断 (予見)することを目的とする。 課題を解決するための手段

[0007] 本発明者らの研究により、インフルエンザ感染をきつかけとして特に重篤な中枢神 経症状、脳浮腫を伴うインフルエンザ脳炎 ·脳症患者群などの熱不安定性フヱノタイ プ症では、体内のエネルギー産生に不可欠なミトコンドリアでの脂肪酸代謝酵素が、 高熱で急速に酵素の活性が失われてしまうタイプの遺伝子変異が高率に潜んでいる ことが明ら力となった。この遺伝子変異は、平熱ではほとんど酵素活性に異常がない 力 酵素活性低下があっても軽度でこれによつて何らかの病状を示すことは通常なく 、高熱にならない限り症状が現れないことが多い。し力も多くの患者では遺伝子変異 がへテロで、半分は正常で半分が変異した酵素が混在している患者が多い。そのた め、日常生活では異常を認められること無く経過する事が多い。これとは別に、生ま れながらにこれら脂肪酸代謝酵素群に遺伝子変異による酵素活性が著明に低下す る先天性代謝障害疾患があるが、この場合生後数ケ月の内にインフルエンザ感染無 しにライ様症候群を示して脳の浮腫と多臓器不全で死に至るケースが報告されてい る (Tamaoki Y., Kimura M., Hasegawa Y., Iga M., Inoue M., Yamagishi Brain De v. 2002;24;675-80) _oインフルエンザ脳炎'脳症を含む熱不安定性フエノタイプ症で は、このような重症な酵素欠損症ではなぐ熱で不安定化する遺伝子変異が病気の 根底に存在して、これが原因となって発症することが明らかになった。

[0008] この事は、インフルエンザ脳炎.脳症以外にも高熱時に全身のエネルギー産生系 が障害されることによって多臓器不全が誘発される一群の疾患、例えばこれまで原因 不明とされてきた乳幼児突然死症候群、インフルエンザ脳炎 ·脳症以外の様々な感 染症、例えば RSウィルス感染症、アデノウイルス感染症、ライノウィルス感染症、風疹 、 日本脳炎、マラリア感染症などで重症化と多臓器不全を示す患者群、アスピリン、 ボルタレン、メフエナム酸服用時に発症するライ症候群、川崎病等も同様な原因で発 症する可能性が高いと推定される。そこで本発明は、これらの疾患を「熱不安定性フ エノタイプ症」として、発症の原因となる熱不安定性遺伝子変異を的確に診断する新 しい診断法の開発を行い、本発明に至った。

[0009] 本発明は、以下のリスク診断方法および診断キットを提供するものである。

1. インフルエンザ脳炎'脳症、ライ症候群、 RSウィルス感染症、アデノウイルス感染 症、ライノウィルス感染症、風疹、日本脳炎、マラリア感染症、川崎病、乳幼児突然死 症候群を含むあるいはこれらに起因する熱不安定性フエノタイプ症のリスクを診断す る方法であって、ミトコンドリアでのエネルギー代謝に関与する各種 Transporter,カル 二チン回路、長鎖 β酸化回路、中鎖 ·短鎖 |8酸化回路、電子伝達、ケトン体合成お よび ΑΤΡ産生のいずれかに関与する少なくとも 1種の酵素の酵素活性が 37°Cを 100 %としたとき、 39°C以上では健常者よりも有意に低下するカゝ否かを調べることを特徴 とする、方法。

2. 前記熱不安定性フエノタイプ症が、インフルエンザ脳炎 '脳症である、項 1に記載 の方法。

3. 37°Cでの前記酵素活性と比べて 39°C以上での前記酵素活性が低下する程度 を前記酵素をコードする遺伝子の SNP、挿入および欠失力もなる群力も選ばれる多 型を調べることにより予測することを特徴とする項 1に記載の方法。

4. ミトコンドリアでのエネルギー代謝に関与する各種 Transporter,カル-チン回路 、長鎖 β酸化回路、中鎖，短鎖 |8酸化回路、電子伝達、ケトン体合成および ΑΤΡ産 生のいずれかに関与する酵素が下記の表に示される中の少なくとも 1種の酵素であ る、項 1に記載の方法。

[表 1]

酵素の名称

Transporter Tncarboxylate transport protein (TCT)

Voltage-depenaent anion channel (VDAC)

Adenine nucleotide Transporter (ANT)

Carnitine Transporter (CRNT; OCTN2; SLC22A5)

Fatty acid plasma membrane transporter (LCFAT)

カルニチン回路 Acyl-CoA synthetase (ACS)

Carnitine palmitoyltransferase 1 liver form (CPT1A; CPTl)

Carnitine palmitoyl transferase 1 muscle form (CPTlb; CPT1B)

Carnitine palmitoyl transferase 2 (CPT2)

Carnitine/Acylcarnitine translocase (CACTI; SLC25A20)

Verylong-chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD)

確 /3酸化回路 TFP mitochondrial trifanctional protein alpha-s bunit (TFP ； HADHA)

TFP mitochondrial trifunctional protein beta-subunit (TFP β； HADHB)

Long-chain acyl-CoA dehydrogenase (LCAD)

中鎖 ·短鎖酸化回路 Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD)

Medium-chain acyl-CoA thiolase (MCKAT)

Short-chain acyl CoA dehydrogenase (SCAD)

Short-chain enoyl^_CoA hydratase (SCEH)

Short-chain hydroxy ac l- CoA dehydrogenase (SCHAD)

Short-chain acyl- CoA thiolase (SCKAT)

電子伝達 Electron Transfer Flavoprotein Alpha subunit； ETFA

Electron Transfer Flavoprotein beta subunit； ETFB

Electron Transfer Flavoprotein dehydrogenase (ETFDH)

NADH-ubiquinone reductase complex (Complex I)

Succinate -ubiquinone reductase (Complex II)

Ubiquinolxytochrome^_c reductase (Complex III)

Cytochrome-c oxidase (complex IV)

ATP産生 ATP synthase

Uncoupling protein (UCP)

ケトン体合成 Hydroxymethylglutai l-CoA synthetase 1、 2 (HMGCSl or 2； HMGS1 or 2)

Hydroxymethylglutaryl-CoA Hgase (HMGCL; HMGL)

[0011] 5. 前記酵素が、 CPT II, ETFA, ETFB, ETFDH, HADHB, HMGCS, VLCAD, LCA Dおよび HADHA力 なる群力 選ばれる少なくとも 1種である項 4に記載の方法。

6. CPT II、 ETFA, ETFB, HADHA, HADHB, HMGCS, VLCAD, LCADおよび ETF DHについて、以下の 22種の 1または 2以上の位置、あるいはこれらと連鎖不平衡の 関係にある遺伝子の SNPを検査し、 2以上の遺伝子多型の組み合わせまたはハプロ タイプの組み合わせを利用することを特徴とする、項 1に記載の方法：

[0012] [表 2] 酵素名 SNP位置

CPT2 (EXON4) 1055

CPT2 (EXON4) 1102

ETFA (I TRON10) +642

ETFB (EXON1) ■320

ETFB (EXON3) -113

ETFB (EXON8) 447

ETFB (EXON8) 461

HADHA (EXON6) 474

HADHA (INTRON6) +26

HADHA (INTRON6) +32

HADHA (EXON18) 2519

HADHA (EXON18) 2619

HADHB (EXON2) 4

HADHB (INTRON12) ■14

HADHB (INTRON14) +4

HADHB (INTRON14) •26

HADHB (EXON17) 1607

HMGCS (INTRON8) ■37

HMGCS (INTRON8) +53

VLCAD (INTRON8) +33

LCAD (EXON9) 997

ETFDH (EXON13) 1989

[0013] 7. 以下の (1)〜(8)のいずれかの SNPの組み合わせを有するか否かを基準として、 熱不安定性フエノタイプ症のリスクを診断する項 1に記載の方法：

[0014] [表 3]

組合せ 酵素 多型位置 （塩基番号） ジエノタイプ リスク

(1) ETFB 447 大

CPT2 1102 G/A

(2) ETFA +642 C/C 大

ETFB -113 G/T

(3) ETFA +642 C/C 大

CPT2 1055 G/G又は G/T

(4) HADHB 4 -/ACT or ACT/ACT 大

HMGCS ■37 C/T orT/T

(5) VLCAD +33 T/G or G/G 大

LCAD 997 A/A

(6) CPT2 1055 T/G又は G/G 大

CPT2 1102 G/A又は A/A

(7) HADHB 4 -/ACT or ACT/ACT 大

ETFDH 1989 G^T

(8) LCAD 997 A/C or C/C 小

HADHA 2619 G/G

HMGCS +53 T/T

8. 遺伝子多型 (SNP)の検出が、ヌクレオチド直接塩基配列決定法、対立遺伝子特 異的オリゴヌクレオチド (ASO)-ドットプロット分析、一塩基プライマー伸長法、 PCR-単 鎖高次構造多型 (SSCP)分析、 PCR-制限酵素断片長多型 (RFLP)分析、インべーダ 一法、定量的リアルタイム PCR検出法および質量分析計を用いた遺伝子多型検出法 (mass array)力 なる群力 選ばれる少なくとも 1つの方法により行われる項 1〜7のい ずれかに記載の方法。

9. 前記酵素をコードする遺伝子の SNP、挿入および欠失カゝらなる群カゝら選ばれる 多型を、対応する少なくとも 1種のプローブを固定ィ匕した固相支持体を用いて測定す ることを特徴とする、項 3に記載の方法。

10. ミトコンドリア β酸ィ匕脂肪酸代謝系に関係する酵素の特定の多型の 1種または 2 種以上の組み合わせを検出可能なプライマー、プローブ、 dNTPミックス、逆転写酵 素、 DNAポリメラーゼ、緩衝液を含む熱不安定性フエノタイプ症のリスクを診断する ための診断キット。

発明の効果 [0016] 本発明によれば、熱不安定性フエノタイプ症のリスクを診断し、そのリスクが高 、とさ れた者、特に乳幼児を含む子供の場合、高熱になる疾患の予防あるいは疾患に罹 患した場合の早期治療により熱不安定性フヱノタイプ症を発症しないように管理する ことが可能になる。

図面の簡単な説明

[0017] [図 1]高熱 Z痙攣時および正常体温条件における IAE患者のァシルカルニチン (C

16:0

+ C )/C比の分布 IAE患者と患者番号 21の家族、およびインフルエンザに感染し

18:1 2

て!、ない 1人のボランティア家族のァシルカル-チン比を分析した。最大カットオフ範 囲 = 0.048そして高リスク患者範囲 = 0.09以上、これらは各々細字の破線および太字 の破線で示される。 +:致死的；▲:後遺症； X：患者番号 21の姉

[図 2]コントロールおよび患者番号 21の肝ホモジネートからの CPT II活性の変化の 37 °Cと 41°Cにおける経時変化を示す。 データは平均士 SD (n = 6)として示される。

[図 3]COS-7細胞中に過剰発現された WTと変異型 CPT IIの 37°Cおよび 41°Cにおけ る活性の比較 WT (FVM-CPT II), F352C (CVM- CPT II), V368I (FIM- CPT Π)およ び F352C + V368I (CIM-CPT Π)の CPT II活性は 37°Cおよび 41°Cで測定された。デ ータは、平均士 SD (n = 5)として示される。

[図 4]リスク診断に使用可能な酵素をコードする遺伝子とその SNPあるいは挿入/欠失 並びにその領域と位置、ジエノタイプ、フエノタイプおよび近傍の配列を示す。

[図 5]有意に患者に高頻度に見られた遺伝子多型

発明を実施するための最良の形態

[0018] エネルギー代謝障害酵素群の遺伝子変異にはこれまでに人種差が報告されており 、 日本では |8酸化回路の長鎖脂肪酸代謝酵素群と電子伝達系の酵素群が、欧米の コーカサス人種では中鎖脂肪酸代謝酵素群に遺伝子変異の多い事が知られている 。高熱によって誘発される熱不安定性遺伝子変異も、同様な遺伝子変異の発症頻度 を背景として 、ると考えられる。

[0019] 熱不安定性フヱノタイプ症の対象となり得る酵素群としては、以下のものが例示され る。

[0020] 1)トランスポーター：カル-チントランスポーター (OCTN2, OCTN),脂肪酸トランス ポーター (CD36) ;電位依存ァ-オンチャンネノレ (voltage- dependent anion channel;VD AC),カル-チン Zァシルカル-チントランスフェラーゼ (CACTI),トリカルボン酸輸 送蛋白（TCT)、アデニンヌクレオチドトランスポーター (ANT)

2)カル-チン回路と関連酵素：ァシルー CoAシンテターゼ (ACS),カル-チンパル ミトィルトランスフェラーゼ 1肝臓型 (CPT1A;CPT1),カル-チンパルミトイルトランスフ エラーゼ 1筋肉型 (CPTlb;CPTlB),カル-チンパルミトイルトランスフェラーゼ 2(CPT2 ),カル-チン/ァシルカル-チントランスロカーゼ (CACTI; SLC25A20)

3)長鎖 β酸化回路：超長鎖ァシル CoAデヒドロゲナーゼ (VLCAD), TFPミトコンドリ アルトリファンクショナルプロテイン α -サブユニット (TFP a； HADHA), TFPミトコンドリ アルトリファンクショナルプロテイン j8 -サブユニット (TFP β； HADHA),

4)中鎖 ·短鎖 β酸ィ匕回路:長鎖ァシル CoAデヒドロゲナーゼ (LCAD), 中鎖ァシル CoAデヒドロゲナーゼ (MCAD), 中鎖ァシル CoAチオラーゼ (LCKAT),短鎖ァシル Co Aデヒドロゲナーゼ (SCAD),短鎖エノィル CoAヒドラターゼ (SCEH),短鎖ヒデォキシ ァシル CoAデヒドロゲナーゼ (SCHAD),短鎖ァシル CoAチオラーゼ (SCKAT),

5)電子伝達：電子伝達フラボプロテイン a -サブユニット (ETFA),電子伝達フラボ プロテイン β -サブユニット (ETFB),電子伝達フラボプロテインデヒドロゲナーゼ (ETF DH), NADH-ュビキノンリダクターゼ複合体 (Complex I)、スクシネート一ュビキノンリ ダクターゼ (Complex 11)、ュビキノール-チトクローム- cリダクターゼ (Complex 111)、チト クローム - cォキシダーゼ (Complex IV)、

6) ATP産生； ATP synthase,アンカップリングプロテイン（UCP)、

7)ケトン体合成：ヒドロキシメチルダルタリル- CoAシンテターゼ 1 or 2(HMGCS1 or 2;HMGS1 or 2),ヒドロキシメチルダルタリル- CoAリガーゼ (HMGCL;HMGL), 本明細書において、「リスクを診断する方法」とは、インフルエンザ脳炎 '脳症、ライ 症候群、 RSウィルス感染症、アデノウイルス感染症、ライノウィルス感染症、風疹、 日 本脳炎、マラリア感染症、川崎病、乳幼児突然死症候群を含むあるいはこれらに起 因する熱不安定性フヱノタイプ症に罹患して高熱 (体温として通常 39°C以上、さらに 4 0°C以上、特に 41°C以上）となった場合に、致死的又は後遺症の残る多臓器不全又 は中枢神経症状を発症する可能性 (リスク)を予見することを意味する。 [0021] 従って、このリスク診断又は予見は、熱不安定性フヱノタイプ症に罹患する前に行う のが重要である。熱不安定性フエノタイプ症は、高齢者を含む大人も罹患するが、特 に乳幼児又は子供が罹患した場合に致死的又は後遺症の残る多臓器不全又は中 枢神経症状を発症しやすい。従って、本発明のリスク診断を行う対象者は、ヒトであれ ば特に限定されないが、例えば 18歳以下、さらに 15歳以下、特に 12歳以下の子供が 好ましぐ乳幼児 (特に乳児）が熱不安定性フ ノタイプ症の罹患を抑制する観点か ら好ましい。

[0022] 子供 (特に乳幼児）を含むヒトのリスク診断の結果、熱不安定性フエノタイプ症に罹 患する可能性が高いと診断された場合には、熱不安定性フエノタイプ症に関連する 高熱を伴う疾患に力からな 、ようにするのが重要であり、ウィルスな 、し細菌感染症 の場合には、うがい、手洗い、マスクの使用、ワクチンなどの予防薬の投与が挙げら れる。熱不安定性フエノタイプ症の原因となり得る、高熱を伴う疾患に罹患した場合 には速やかに治療薬や安全な解熱剤を投与する等により体温を 41°C未満、さらに 40 °C未満、特に 39°C未満、より好ましくは 38.5°C未満に体温をコントロールすることが重 要である。

[0023] 本明細書において、熱不安定性フエノタイプ症に関連する疾患群としては、インフ ルェンザ脳炎'脳症、ライ症候群、 RSウィルス感染症、アデノウイルス感染症、ライノウ ィルス感染症、風疹、日本脳炎、マラリア感染症、乳幼児突然死症候群、川崎病が 挙げられる。

[0024] 本発明は、高熱時においてミトコンドリア β酸化脂肪酸代謝系の酵素活性が急速 に低下することにより致死的または後遺症を残すような重篤な多臓器不全 Ζ中枢神 経症状を引き起こすことを見出したことに基づく。

[0025] このような多臓器不全 Ζ中枢神経症状を生じる場合、酵素活性は平熱 (例えば 37 °C)の活性を 100%とすると、健常者では例えば 41°Cで 5〜10%程度の低下である 。この酵素活性の低下率が 50%を超えると高熱時に多臓器不全 Z中枢神経症状が 現れる可能性がある、さらに低下率が 60%以上、 70%以上、 80%以上、 90%以上 と高くなつて行くにつれて、多臓器不全 Z中枢神経症状の発症の確率は高まってい く。 39°C以上の温度において、酵素活性の低下率が 80%を超える場合には、多臓 器不全 z中枢神経症状を生じる可能性が極めて高い。

[0026] 酵素活性の低下は、本発明の診断対象となる被験者の酵素遺伝子配列を調べ、 該遺伝子配列に基づき遺伝子工学的手法により酵素を製造し、 37°Cと 39°C以上の 温度 (例えば 39°C、 40°C、 41°C)で一定時間処理した後の酵素活性を比較すること により評価することができる。このようにして、 39°C以上（例えば 39°C、 40°C、 41°C) で酵素活性が健常者に比較して有意に低下した酵素の遺伝子配列を調べることで、 この配列を基準にして熱不安定性フエノタイプ症のリスクの大きさを診断ないし評価 することができる。例えば、酵素が CTP IIの場合、 F352Cと V368Iの両方の多型を有 する場合には、発熱時に重篤な中枢神経症状を引き起こす可能性が高ぐ熱不安定 性フエノタイプ症と診断することができる。

[0027] 37°Cでの前記酵素活性と比べて 39°C以上での前記酵素活性が低下する程度は、 前記酵素をコードする遺伝子の SNPを調べることにより予測することができる。

[0028] リスク診断に特に有用な酵素としては、 CPT II, ETFA, ETFB, ETFDH, HADHB, H

MGCS, VLCAD, LCAD, HADHA等が挙げられる。

[0029] リスク診断に使用可能な酵素をコードする遺伝子とその SNPあるいは挿入/欠失並 びにその領域と位置、ジエノタイプ、フエノタイプを以下の表 4にまとめ、さらに SNP近 傍の配列を含めて図 4に示す。

[0030] [表 4]

遺伝子 領域 dbSNP 位置 多型 ジエノタイプ フエノタイプ

VLCAD EXON1 rs6145976 -72 INS/DEL -/gggcgtgcaggacgc 一

VLCAD EXON1 rs2230178 128 SNP G/A G43D

VLCAD intron8 unknown 33 SNP T/G ―

VLCAD intronl 6 rs 17671352 6 SNP T/C ― し CAD intronj unknown 88 INS/DEL CAAA 一

LOAD EXON9 rs2286963 997 SNP A/C K333Q

HADHA EXON6 unknown 474 SNP C/T Y158Y

HADHA INTRON6 unknown 26 SNP G/C 一

HADHA INTRON6 rs75931 75 32 SNP T/C ―

HADHA EXON18 rs7260 2519 SNP A/G ―

HADHA EXON18 rs1049987 2619 SNP G/A 一

HADHA/B promoter rs3806516 -202 SNP C/T 一

HADHB EXON2 rs3839049 4 INS/DEL ACT - 2T

HADHB INTRON12 unknown 一 14 SNP A/G 一

HADHB INTRON14 rs2303893 4 SNP T/A 一

HADHB INTRO 14 rs17528653 -26 SNP T/C 一

HADHB EXON17 rs1056471 1607 SNP G/C ―

HMGCL promoter unknown -497 INS/DEL -/TTTTT ―

H GCL promoter rs6697805 - 91 SNP G/T —

HMGCL EXON5 unknown 443 SNP A/G Q148R

HMGCL EXON7 rs17858097 654 SNP G/A L218L

HMGCL EXON9 unknown 1 131 SNP C/T 一

HMGCL EXON9 rs1 1714 1464 SNP A/C ―

CPT2 promoter rs10888776 -850 SNP G/A 一

CPT2 EXON4 rs2229291 1055 SNP T/G F352C

CPT2 EXON4 rs1799821 1 102 SNP G/A V368I

CPT2 EXON4 unknown 429 INS/DEL _/TG E144V.Y145*

CPT2 EXON4 unknown 1511 SNP C/T P504L

CPT2 EXON5 unknown 1813 SNP G/C V605L

CPT2 EXON5 rs1799822 1939 SNP A/G M647V

ETFA INTRO N1 unknown -776 SNP A/G 一

ETFA INTRON1 unknown -270 INS/DEL -/ACGCGCC 一

ETFA EXON6 rs2229292 512 SNP C/T T171I

ETFA INTRON10 unknown + 642 SNP C/T

ETFB EXON1 unknown -320 SNP C/T ―

ETFB EXON3 unknown -1 13 SNP G/T ―

ETFB EXON8 unknown 447 SNP C/T F149F

ETFB EXON8 rs3177751 461 SNP C/T T154

ETFDH EXON2 rs1 1559290 92 SNP C/T T31 I

ETFDH EXON13 unknown 1989 SNP A/C 一

HMGCS2 EXON1 rs2289459 -1 1 SNP C/T 一

HMGCS2 INTRON8 rs668156 -37 SNP C/T ―

HMGCS2 1NTRON9 rs667246 +53 SNP A/G 一

HMGCS2 INTRON9 rs667226 +68 SNP A/G 一

MCAD EXON13 rs3841786 1263 INS/DEL -/A ―

[0031] 本発明のリスク診断は HADHA、 HADHBの以下の表 5の位置の多型を使用して、単 独の遺伝子多型により実施可能である：

[0032] [表 5] 遺伝子 領域 位置 多型のタイプ Genotype Phenotype

HADHA EX0N6 474 SNP OT Y158Y

HADHA INTR0N6 +26 SNP G>C ―

HADHA INTR0N6 +32 SNP T>C 一

HADHA EX0N18 2519 SNP A>G ―

HADHA EX0N18 2619 SNP G>A 一

HADHB EX0N2 4 INS/DEL ->ACT 1一 2Tins

HADHB INTR0N12 -14 SNP A>G 一

HADHB INTR0N14 +4 SNP T>A ―

HADHB INTR0N14 -26 SNP T>C _

HADHB EX0N17 1607 SNP G>C ―

[0033] また、 2種以上の多型を組み合わせて診断する場合には、以下の表 6に示される組合 せが好ましい。

[0034] [表 6]

またはこれらの各遺伝子多型のアレルと連鎖不平衡の関係にある別のアレルを用い てリスクを判定することができる。 [0036] なお、これらそれぞれの遺伝子多型は隣接する遺伝子多型とともに親から子へ受 け継がれることがしばしばあり、それらのアレルの関係は連鎖不平衡の関係にあると 呼ばれる。連鎖不平衡はアレル間の距離が長くなるほど弱くなる傾向にある。従って 近傍の遺伝子の場合は、強い連鎖不平衡が見られることが多い。本明細書に示され た遺伝子と近隣の遺伝子との間に強い連鎖不平衡の関係にある場合、遺伝子多型 の頻度や遺伝子多型の出現パターンが同じになることがあり、本実施例の遺伝子多 型を予測することができる。一方で、本明細書に記した遺伝子に限らず、他の隣接す る遺伝子を解析することで、本リスク診断に利用することが可能になる。たとえ弱い連 鎖不平衡にあつたとしても、リスク診断をおこな 、うることがある。

例示するならば、 HADHA HADHBは連鎖不平衡の関係にあるものが多い。従って、 この遺伝子に隣接する遺伝子の多型を利用したリスク診断も実施することが可能であ る。

[0037] 連鎖不平衡にある遺伝子多型は制約を受け、限られた遺伝子多型の並びを形成 する。この遺伝子多型のひとつの染色体上にある並びの組み合わせをノヽプロタイプ とよぶ。

本発明のリスク診断は、ミトコンドリア β酸化脂肪酸代謝系に関係する酵素の特定の 多型の 1種または 2種以上の組み合わせを検出可能なプライマー、プローブ、 dNTP ミックス、逆転写酵素、 DNAポリメラーゼ、緩衝液等を含む診断キットを用いて行うこ とがでさる。

[0038] 本発明はこのような診断キットにも関する。

[0039] また、本発明のリスク診断法は、他の方法を用いて実施することもできる。

[0040] 遺伝子多型の検出は本方法に限らず、ダイレクトシーケンシング法、一塩基プライ マー伸長法、 PCR-単鎖高次構造多型 (SCPS)分析、 PCR-制限酵素断片長多型 (RFL P)分析、インベーダー法、および質量分析計を用いて実施することができる。リスク診 断方法に関しては、 DNAに限らず、 RNAを材料にした遺伝子多型解析も可能であり、 定量的リアルタイム PCR検出法による遺伝子発現定量法が実施できる。また、ァミノ 酸置換を伴う遺伝子多型に関しては、を用いたラジオィム抗体ノアッセィ、酵素免疫 測定法 (ELISA)、なども可能である。以上の方法は、効率的に実施するうえでは、ビ ーズ、チップ、膜等の固相支持体に固定ィ匕し、多型を測定する方法が挙げられる。 実施例

以下、本発明について実施例を用いてより詳細に説明する。

実施例 1

本発明者の行った具体的な実験方法と結果を以下に示す。

腿

インフルエンザ脳症患者 31検体、インフルエンザ脳症が疑われる患者 1検体 (各施 設の倫理委員会承認済み、インフォームドコンセントの取得済み）、健常検体 100検 体

她

インフルエンザ脳症患者 31検体、インフルエンザ脳症が疑われる患者 1検体、健常 人コントロール 100検体力も抽出された、ゲノム DNA用いて各遺伝子の増幅を、表 A に示す PCR用プライマー（PCR-F, PCR-R)を用いて行った。それぞれの増幅した遺 伝子を用いて、表 Aに示すプライマー（Seq-F, Seq-R)を用いて、ダイレクトシーケン ス法により塩基配列を解析した。遺伝子多型の参照には、 NCBIのデータベース (http ://www.nlm. nih.ncbi.gov, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)、 HGMD (ht tp：〃 www.hgmd.cf.ac.uk/hgmdO.html)等のデータベースを用いた。表 4中の rsで始ま る番号はデータベースの参照番号で、 unknownと記載されて!、る遺伝子多型につ!ヽ ては、 NCBIに登録されていない遺伝子多型を示している。 CPT2,ETFA,ETFB,ETFD H、 VLCAD、 LCAD,HADHA,HADHBに関しては患者 31検体の遺伝子解析が可能で あった。その他の遺伝子に関しては、 27検体の遺伝子解析が可能であった。一方、 健常人検体は CPT2,ETFA,ETFB,ETFDHに関しては、 100検体で遺伝子解析が可 能であつたが、それ以外の遺伝子は健常人 99検体力も遺伝子解析が可能であった。 健常人コントロールで多く見られたアレルホモで持つものを W、少ない方のアレルを ホモで持つものを M、それぞれのアレルをへテロで持つもの Hと定義した。（表 4,図 4 中 W,H,M) 二一二ーニ一一一ニーニニニ -一ニ

b b b b b bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb bbbbbbbbbbbbbbbbb

s s s s s ssssssssssssssssssssssssssssss sssssssssssssssssc 丄〇vo丄 0V10〇3〇VV00000 J一 l^a8 3

Z^s - 丄 3

DOVOOOVOVOVOD丄 OVOV

d-HOd DVDVD03丄 CI丄 VDOOV〇iOV id - 8d丄 3

d-aod S丄 OD丄 3±H0D丄 0丄丄 ODE) d—8J丄 3

(,ε 0丄 ,9) fiisa

9M3 οε IBiO^qng

〇3丄 00丄 SOVVOW丄 3丄 OVOOO丄 O sola 丄 3

o丄 οονο丄 vvseioosD丄丄 vo丄 eso i^a VJ丄 3

E)V00011E)VV3丄 VOD丄 DD3丄 Z^sO l^s VJ丄 3

丄 VODVOD丄 030丄丄 VOV LSO l⁸ VJ丄 3 d-aod VVIVVVVVVVODDVVVOVVOVVOIVO ys iayj丄 3

丄 丄丄 w丄丄 3D丄丄 ov丄 3丄 οοοννει丄 0V0 JE l^aVd丄 3

a-aod VDDO丄 0丄丄丄 丄 0丄 yZ VJ丄 3 d-aod VWIDD丄丄〇丄丄丄丄 Ε)丄 WVD丄 0丄 0丄 0丄 Ε) d2 l^aVd±3 a-aod 丄 DCDVVVOO丄 DIVWV丄 30丄 i^avj丄 3

j-aod 丄丄 0V VW00V3W丄 00丄丄 VVV丄丄 d "svj丄 3 a-aod 0丄 0丄 330丄丄 03丄 OODD丄 0V yo i³vj丄 3

j-aod VO丄丄 DVODVODVOVOOQ丄 VO dO VJ丄ョ

H-aod V±V0000±VJ-L0V1DV0V1V0V1WV0VV0 y6sVdl3 j-yod D丄 VWVWVDilODVOVlVVlWDlODVIO J6^aVJ丄 3 a-yod 0丄丄丄 0丄 VIVVOSOVVVWOVVOO丄丄丄 d8^sVd丄ョ

d-aod 丄丄丄 W丄 303丄 ±10丄 VDlllV丄 DIVVSVO d8⁸VJ13

y-yod VJ_LL WO丄丄 1±V丄 WO丄 VVWVVVVVVVl ¾U9Z—乙³ Vd丄ョ

d-yod S丄 V丄丄 v丄丄丄丄; D丄丄 丄 ειν丄 VO丄 VVVS丄丄 OVVDV丄 V丄 Jisvd丄 3 a-aod WVOWWOWVOVV丄 丄丄 WEI丄 V "丄 0丄 3 H93\ d丄 3

d-aod 丄 0V1OE)丄 OVOSVVVO丄 J9³VJ丄 3 a-yod V丄丄 VDVV。丄丄 0上 V丄 0丄丄 VVVV丄 ±1V0丄丄丄 00丄 yS³VJ丄 3

d-aod 丄 3VV丄丄 0丄 0丄 3丄 V1D丄 V丄 OVOIVOO丄丄 0丄0 dSSVd丄 3 y-yod 丄 V0丄 丄丄丄 OOOVV丄 0丄 y vj丄 3

丄丄 VW丄 3丄 0丄 0V丄 0丄 WVVWVOV丄 SV30丄丄丄 ^aVd丄 3

d-dOd 丄丄！ J_LLVOV丄 OVOVDV丄 11W丄 OODVVO丄 M£3V:d丄 3

d-dOd D丄 3D丄 丄 V丄丄丄 VIVO丄丄 0丄 01V0丄 V丄丄丄丄 V3 d£⁸Vd±3 a-aod VE)丄丄 0丄 0丄 3丄 3〇丄丄丄丄 0丄 VQOD丄 ^SVJ丄 3

j-aod 丄 0丄丄 丄 3丄

d-aod 30丄丄 030丄 330丄 0030 ³Vd丄ョ d-yod 0丄〇VD丄 D3V丄丄 V30VD000上 0 d LSVJ丄 3

θε 0丄 ,5)

Vd丄ョ

OOSVOVOV丄 OSS丄 ovooovo

0丄 DiOVDVDOOVSVOVDODD SSS 丄 dd

OV丄 33丄 VO丄 OVVOOVO丄 O丄 VCD丄丄丄 5 丄 dO

0丄丄 OW丄丄 DVVW3丄 VOOIVWODOV ISS³Z丄 dO

a-aod 丄 03V 1VVS0V丄丄 VSDVE)丄 E)丄丄丄 OIVSV ys 丄 do d-aod 丄 OSOVDVD丄 00丄 V03丄丄丄丄 00 dSW丄 dO

DOE)丄 0V3丄 0丄 丄 V3D0D 9^sfr³Z丄 dO

V0DV13丄〇3丄 丄 QOVOOO

OVOOD丄 OV00VO丄 3丄 VWVVV丄丄 V0 frsfrw丄 dO

OOVE)丄丄丄 0V03丄 000D丄 0V丄 0丄 3

000丄 V3丄丄 DVDVV3丄 EIVOIVO丄 0丄 ZS Z丄 dd

OVSVOOSOVVOVO丄 丄 0V0丄丄 0 ist^_z丄 d3 y-dod 03VSW0V30VE 0V0DW00 丄 do d-aod 丄丄丄 V丄丄 D丄 V丄丄 ilVOW丄丄 VOOV0VSOD dt^aZldO

a-aod ΰνειοο丄 0丄 000DV331V丄丄 V0

V丄 00011V丄 0丄 V0丄 WVVV1〇3VV3丄 V3 JEW丄 dO

a-aod 丄 丄丄 0V丄 3V00V03 丄 dO

d-aod 000V0丄 0丄 丄 VIVOO丄丄 0丄 OOVV丄丄 V 丄 dO a-bes a-yod OOOODOVDDEI丄 00丄 V00 sz丄 do

d-aod ειοοοοειοο丄 ovooDV IS【3_Z丄

H-HOd 3丄 3V0丄 丄 丄 3V0V0V丄 0V01 0000VW00

d-aod 0DV01E)V〇li)丄 丄 丄 30 dVl l^xe3dlO d-yod OVV丄 VD丄 0丄 VVDD丄丄 VD丄

d-yod DVDD00DVDV1001±0V0V

(,ε ο丄，s) m

ZldO [ oo] t6ZlZ0/^0QZd /lDd 9 r^ ^o/90o∑; OAV --------------一一二一一一 bbbbbbbbbbbbbbbbbbb bbbb bbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbbb

s sssssssssssssssssssssssss sssss d-aOd OVOOQQO丄 O丄 11VOOEI11VO — Sxョー

d-dOd D丄 丄 OOOllOV IS— S^x3— ZSOOWH

H- Od OOVOVVVVOVOVOOVOOOVVO 2S-^3-2SODWH

J-dOd OOVVVDVOOV01VV1VOVOVOVO 〖S ヨ - SSODIAIH

y-dOd 090VVVQ丄 00丄 VOOV丄 VVOOV frS-G^x3-2SOOl H

d-dOd 丄 V丄 0丄 OVO丄 V丄丄丄 E) 2S—Sxョ一 OOWH

b-80d D丄 丄 DiOOVOOVODV丄 VD丄 VD 9S-3^9-2SODWH

j-aod DO丄 VOOO丄 ODVOV丄 VODOO SS- xョ— ZSOOWH

d-dOd 0V1000V00V10V0D0VD0 ョ

J-dOd OIOOVOE)丄 丄 00丄 Z^x3— SSOOWH

y-aOd DOOV丄 VOOODVVOVODVD丄 ZS-Zxョー

d-dOd OVV丄 VV丄 VOVVWD丄 VVO丄丄 VVO丄 DDS IS-Z^X3-2S00IAIH

d-HOd 00丄 D丄 丄 ODOW丄 0丄 S丄丄 0 3S— l^x3-2SOOIAIH

d-dOd OVDV09VCLL090V〇OOVS IS— Lxョー ZSQSWH

( oi ,9) ½2i %

ZSODINH

οε |e qⁿs

H-^b9S d-dOd 丄 0丄丄 VQS丄 00丄 VOVVODV丄 SCIVOV -£ i SH lzl丄ョ

」— bss d-HOd 丄丄丄丄 W丄丄 00丄丄丄 0丄 OV丄 丄 0丄〇丄丄 J一 S L3H0J丄 3

d-dOd 丄丄 V丄 WVOOWV丄丄丄 0丄 WW丄 00丄丄 VOVO !d— Z l³H U丄 3

Λ-UOd 丄 000丄丄丄 VOOVV丄丄 0丄丄丄上 V丄 -Z L³Ha=l丄ョ

d-HOd VVD丄 VO丄丄 VOQO丄 VDVOVV丄丄 W丄 0丄 Q丄 d— L I SH IJ丄ョ

d-HOd V丄丄 OV〇DO丄丄丄 丄丄丄 J一 I L9HCIJ丄 3

H-dOd 丄丄 OV丄 Vldll丄丄 0丄丄 UVVOOVOQOVV丄 H-0 丄 3

d-yOd WD丄 V丄 VV11丄 Ό丄丄 0丄丄 0110丄 0丄丄 VI SO J-O Haj丄ョ

d-dOd 丄 VV1V丄丄丄 VVD丄 0丄丄 VVO丄 d— 6SHd:J丄 3

J-idOd 上 _LLVV丄丄丄 VO丄丄 丄丄丄丄 VOVUOO丄 i— 6^sH lzl丄 3

d-dOd W丄 丄 丄 OVOVV丄 V丄丄！ IV丄丄 OOOVVV H— 83(HaJ丄ョ

d-HOd OV丄丄 111丄丄丄丄丄丄丄 00丄丄丄 Dili丄丄丄 OVD 一 8⁹HCIJ丄 3

d-dOd 丄 VV丄 VO丄 丄丄 丄 VVVODO丄 V id— sua J丄 3

d-dOd 0丄 VVVO丄 丄丄丄丄 V10丄 丄 J— 丄ョ

d-dOd 丄丄 V丄丄丄 000丄 0丄丄丄 D丄丄 0丄 0丄丄丄 0丄 H— 93HaJ丄 3

d-dOd 丄丄 V_LE)E)VV丄 Q丄丄 VV9丄 V11V 1VOVV0丄丄 11丄丄丄 D J— 93HC3zl丄ョ

d-dOd V丄 vioo丄丄 DVOVDVVVVVVV丄丄 vuovoo丄 0丄 hi— sanad丄ョ

J-dOd VDV丄 Ό丄 V上上 上 0丄 VVO丄 上 D J— SSHad丄ョ

d-HOd DO丄 0丄 OOVQOllOOUOV丄 DIVV U— t^Hdd丄ョ

9S d-yod 丄丄 o丄 uvovvvvv丄 ovvv上 丄丄 ovov 丄 3

»S d-HOd VV01〇V丄丄 VVOWOOEI丄 IXVV丄 DVQO

d-dOd 000丄 W丄丄 丄丄 OSS丄丄 丄 丄

&s d-HOd 3丄丄 VVOQVO丄 QIOWVVOVOO丄 V1OVV M— ZSHdd丄 3

J-dOd 丄丄 V丄 V丄 OV上 丄 OOVO丄丄 D丄 DVWO J— Z^HaJ丄ョ

-UOd VOOOO丄 V丄丄 OVOO丄 00丄 OVV丄 00 id— l^H LI丄 3

d-dOd 丄 d- 1 ®Ηα 丄ョ

0丄 0丄 0D0丄 0丄丄 00丄 OOVO 一 naj丄 3

j一 bss 0丄丄 丄 DIOO丄 33丄 00 〖s— Had丄 3

d-^bsS d-dOd 丄 000丄 — 丄 3

j一 bss d-dOd 0丄 OVOOVV丄 11丄 0丄 Ό丄 OWOOVO J— HCLLLョ

(.ε 0丄

HQJ13

ZZ lewqng d-HOd 丄 0丄 01300丄 WI VOOVVD丄 d— 6^sgj丄 3

d- Od 丄 QOODVOVOO丄丄 OVDDVOD J— 63gd丄 3

H-dOd 丄 D ¾d90S—8⁹8J丄 3

J-dOd Q丄 Q丄 0V03QV0丄 009V丄丄 VVO丄 O 一 8³8d丄 3

d-dOd D丄 QODDDVO丄 VSDDN Dll丄 OV H乙 xsgj丄ョ

d-HOd 0丄 0丄丄 VD丄 OVQO丄 丄 J xsgj丄ョ

H-yOd 丄 OOOVOOVOO丄 0丄 V丄 DOOO id— 9⁹8J丄ョ

J-HOd ODVODVIVDDVDIOOOOOIO J一 丄 3

y-dOd 0丄 OODVOO丄丄 OVDVOO丄 ODD dS9ZS— S^SSJ丄 3

J-HOd SVVOVDEIOOOOVO丄 0丄 OLO zl 1982— S^gj丄ョ

d-yOd 09丄 0丄 VODOVO丄 OVDOSO d— t^Sd上 3

J-aOd 丄 D丄 OOOVD丄 ΟΟΌΌΟΰ丄 J一 t^gj丄 3

H-MOd 110011D000WVVVVV10D0 d— ε^θ8 丄ョ

J-aod o丄 OD丄 030丄 o丄 oo丄丄 oovoo d—ssgd丄ョ

y-HOd 0丄 000V00丄 00丄 0丄 ¾J— Z^gj丄 3

J-yOd 丄 0丄 £>Ε»0〇3Ε 0 J — sgj丄 3

H- Od OOVO丄 V00丄 d— l³8d丄 3

[8挲] [εκ)ο]

r6ZlI0/S00Idf/X3d 9

^h

sssssssssssssssss ssssssssssssssssssssssssssssss ssssssssssssss

J-dOd Ό丄 0E)丄〇0丄丄 丄 0 J - sxssv 0 S

H-HOd Ό丄 00丄 DVO丄 00丄丄 O丄丄 OE)OVO

J- d 9丄丄丄 QQE (丄 VDOVOO丄丄丄丄 VO丄

0丄 0丄 09丄 丄 00丄 Ό

丄 丄 OVDDSOEIIVO

D0OLLV009VV0丄 OOOOODV _Ls-

OOllOOVVOOOOOODVOOODDOO - ixssv CHS

- Od OVVOODVOOVOOODOODOOOVOD ^- Lxssv ΟΊδ

d-dOd 0丄 OVOD丄 DEiVCi丄 00300000

0000丄 丄 OEiVO丄 000D3

DV丄 VOV丄丄〇ODO丄 ΟΌΟΟΟ SS-9V2Z10S

DVE>丄 VOVVDWODVODVD丄 0 S - d-JdOd 001〇0V丄丄 00丄 0丄丄丄 OVOIDVO

OOVW丄 0丄丄 VE»丄 OOVDOOVO

丄 0丄 OVVV丄 WOIOUOO

H-HOd 丄丄 0丄 OVO

0000丄丄 VODVOO丄 J-SV2310S

('ε ο丄 ,Q) [ifgi

SV^ZOIS

OVOVOVV丄 VOVOVOWllOOLClOVV

d-HOd OOOVOVOV丄 ODOVOV丄 3丄 0丄 vv LS - ε ιχョ -avow

d-dOd v丄 VQOsvovo丄 οειει丄 owvvvo

J-HOd OVllVOlOOOlVOODllllVO

H-¾dOd Q D丄丄 OWVE)丄 WODO丄 WVO丄 0

J-idOd OOVOVVODVIVOWODDE)丄 0 ts- xョ- avow

d-dOd OOVVVV丄 VD丄丄 0丄 VO丄 OVVVO丄丄丄 0丄 ZS— L Lxョー GVQW

J-dOd 0丄丄丄 DVOOVOOOOllD丄 00 is_"^xョ -avow

H-HOd OVVDIOVOVOVVVOVDVVVVVIIVIVO 2S-0l><3-aVDW

d-dOd 000丄 VD11D丄丄丄 丄 OVOVO is-o ixョ— avow

a-HOd 丄 V丄 DV丄 丄 VWVOVO丄丄 丄 0 ZS-6><3-aVO

d-dOd OVOW丄丄 D丄丄 丄丄 VV1VV丄 VV丄 DO is - 6xョ -avow

OVOOllDVOOllOOOOVlllO zs-8xョ -avow

丄 D丄丄丄丄 丄丄丄 Oil丄 E»0丄 DVD丄丄 is-8^x3-a ow

3丄丄 丄 VQVOVD丄丄 OOLVOEIE) s- ョ -avow

J-dOd D丄 QOV丄丄 0V0〇11丄 0丄丄 OVOO ョ- avow

0丄丄丄丄丄丄丄丄丄 00丄丄丄 0V3丄 QW丄 丄 0

J-HOd DV101V0V0VV0V00DV000 is - 9x3- avow

d-dOd 0丄 丄 0丄 ODD丄〇V 2S-SX3-aVOl

0丄 0丄0 VVD VO VO OllVOVOVOV

d-HOd 丄 0丄 E»V丄 D丄 OVOWV 2s ョ— avow

d-dOd is ョ -avow

0丄丄 0丄 QODVOOOllDVVOOV - εχョ -avow

J-dOd 0V0000丄 丄 丄 is - ε^χ3 - avow

0VV11V11V0VDVVV011V010V10110 ？ s-2^x3-avow

OVO丄 OV丄 0丄 00丄丄 ovoovvvo丄

H-dOd OV丄 WOVOOVOVDOO丄 0Ό丄 0 .zs-ix3-avoifti

d-aod , is-tX3-avoiAi

(X ο丄 ₍g)园

QVOIN

ODWOVOQOVO丄 0丄 OOOD 9S - 0 LX3—

d-dOd 〇D丄 00丄 V丄丄 丄 00上 E)丄 SS-0 L^x3-?SOOWH

0V00丄 丄 0丄丄丄 VOVOS丄 V ャ S-01X3- OVEJOVDWOOOO丄 eS-0 L^X3-2SOOWH

OVVVQVO丄丄丄 0丄 丄 V00丄 0

J-dOd 丄 0丄 OOOOSVDD LS-0 L^x3-2SODWH

a-dod 0丄 00丄 VV3000V0丄 0丄00丄

d-aod OV0110DVDVOWO0DV00 LS-6^x3-3SOOWH

OOVOOOIOOE)丄 000丄 VW 2S-8^x3-2SOOIAIH

d-dOd OVVOVV丄 00丄丄丄丄 0丄 V00丄 00Ό IS-8^X3-2S0DIMH

00丄 VVV丄丄 0D丄 VOQ丄 0V丄丄 OWVO - ョ- ZSCIDWH

丄 0丄 - ョ- OOWH

a-aod 丄 Ό0丄 W丄 0V0丄 0 l¾d- .^x3-3SOO^H

0ODV1VD1V 0D01VDVV0V U- ョ- ODWH

H-dOd 0丄丄 00009DV00VCIV丄 0V0 - 9Xョ- SODWH

0000D001V0VVVVVD0V10 LS-9X3-2SOOWH

[em [^oo] ん tS0/900Z OAV ニニー一一ニ

bbbbbbb bbbbb

sssssss sssss

d-dOd 0Ό丄 丄丄 00丄丄 0

J-dOd 丄 丄 丄丄丄丄 DlODOVi)丄丄丄丄 VO

8-HOd VlOOVOVOlVlOOVODilVOOO Μ ，00WH

d-dOd 00丄丄 0丄 0丄 丄 0丄丄 WOO J一 a OOWH

H-aod 丄 C»VDV〇10V0VD丄 00〇VV〇OQ d-L^nOOWH

丄 000丄 J-L^xanOOWH

0V100V0001VV1D10000

丄 VOODO丄丄丄 C» S^s - ΊΟΟΙ ΙΗ

丄丄丄 丄 00丄 VV丄 Ε»丄 2S-n00IAIH

OVOVOOOVVDVVOVOVVV丄 0丄 0

001DVDV01DV0VD1000V

TOVC OOD丄丄丄 0丄 11丄 VOD J-nODWH

(,ε 丄 's) w

ΊΟΌΙΝΗ

6ε |e¾o¾qns - ^b3s d-dOd 丄 VV丄丄丄 0丄 0丄 0丄丄 νε>νο丄 OQVVOVO丄 a-6^x903V520nS

丄丄 Ό0丄 0丄 丄 00丄 丄 0丄

j一 bss 0丄 0丄 丄丄 V0丄 9丄 ls-6 eozvS201S

d-aod VVSIV丄 0丄 DV丄 VVO丄 1100丄 丄 VOOWVOO J - 6X90ZVS2CnS

H-^bsS 0丄 VOVOOWVO丄

j-aod 丄 00丄丄 00丄 0丄丄丄 丄 03丄 OVV丄丄 d-8^xa02VQ2O1S

DV0000V00111 DV01V110

J-dOd 丄〇丄0\ 000丄 丄 0丄 OV1V0DV0EI

a-dOd 丄丄 DVCiVVOODD丄 00D丄 d-9^xs02V92O1S

j一 S 0VDVOOVOV0O0V011V0V01110O d-9^x902V920nS

丄 OOVOIOOVOOOVDVODVOD

J-^b9S 丄 0丄 ±1Ό丄 V0丄 0丄 OVD丄 Ό丄 0丄 丄

d-dOd VllWVDOVOVQS丄 VOVVV丄

DVOVCLLDV丄丄 30丄 000丄 00丄 0丄 0丄

b-^baS V丄 丄 0丄 VOOOVV丄丄丄丄 \丄110丄

J - d-dOd VOVW丄 Ε»丄 Q丄 0丄00丄 00丄 J-ex902VG2OnS

丄 D丄 D丄 上 丄 VVVO

J-^b9S 0V丄 93丄 OllVEi丄 0丄丄 丄 0

00000D0D001110D1V0

J-dOd

OOVDVVO丄丄 V00V0V3丄 fr^s-ozv ens j一 bss Ό丄 OODSVOOV丄 0V上 Ό丄丄 0丄 0丄 e^s-03V 2O1S

Ό丄 VOOllOVOVOOO丄丄 000

」 - bs_S 丄 0丄 V00VEiV〇V0D9V0

DVOllOilDDVOOVOODO y-osv92ons

」-ba_S d-dOd 0丄00丄丄 Ό丄 V〇0丄 0丄丄丄330 J一 0 V WIS

U ⁰丄ぶ）

in

lewqns

0DD101DV0VD1VDV00DVVV d-6^X9SV220HS

〇丄0丄丄 丄 0丄 丄 0000V 8^S-6^X»9V2?01S

V0VQVV〇1V丄 丄 0丄 0V丄 ODVD丄

0丄 VVO丄丄 V00丄 00丄 WV丄 W丄 V0丄 00 gs-6xssv2201S

OVOVOlllODVOVilVOVOOOVVW

丄丄 00V丄丄 0丄丄 ve>丄丄丄 DVODVVOVOD ^S-6^XA9V?201S

0丄丄 VQ丄 00丄 0丄 VOS丄 0丄 丄 DO es-₆x9QV?20nS

OVO〇VOOVOV丄 000D0丄 VIVO

丄 丄 0VV11WVVV0丄 0V丄 OllDO

d-dOd 11丄 0丄 丄 丄

丄 丄 00丄 00

j-aod Ό丄 0000V0D1〇VV10丄 DVVOO

丄丄 丄

0丄 上 DVOVSV丄 DD丄 OOSVOVOVD

9V0VOV丄 丄 丄丄 V y—z— 9X9sv ens

οε»丄 ovivDD丄 0丄 VSVVVODS丄丄 0

丄丄 OVOQEID丄 y-卜 ₉x3sv CHS

d-dOd 丄 0丄 o〇voovo上 0丄 0丄 ovs丄 0丄 οε>丄

d-dOd 丄 丄 0丄 0D丄 03丄 00丄

d~HOd OOD丄丄 0丄00丄 0丄 ΟΌΟΙΌ丄 0

H-aod 丄 00丄 丄 VWOVOVOVO id - frxssv 0，S

D丄 O V丄丄 VVVOOOVVOOWOOVV丄 W xssvwis

0V丄 VVVO丄 DO丄 VOIVOOO丄 丄 ODV丄 y-sxssv ens

[Οΐ¾ [SW)0]

81- ム 0/900 ΟΛ\ --------------

"bbbbbbbbbbbbb

ssssss ^sssssssssssssssssssssssssssss sssssssss

a - ^b3s VO丄丄 0丄 DOOV丄丄 VWVO丄 00〇0D H一 gxsv dO j一 bss DVIVOVVVODOVOIOVVOVOOOVVI j-gx9VildO

、■ ^hss 丄 OOOWIOOVOW丄丄 VV丄 VOIVQ丄丄 丄 y - Sxsvは dO

V OIOIDV丄 丄 VIOV丄 DVOVO丄丄 00

OOOOOVOO丄 Ό丄 0WV000D H一 χθνは dO

0V0丄 丄 0丄 j一 χθνは dO

VVODVOVVVVVIVOVOVOVVO-LLIVOVO

OVOOVOODIE)丄丄 300丄 0丄 30 j - Sxsv dO

01100000DVDVOODVOD d 3_V dO

V0V0丄 00丄 0丄 0丄 OV丄丄丄丄丄丄 丄

ODVOOOOOO丄丄 0000丄 - Lxsvは dO

0000丄 0Ό丄 丄 VV00DV0丄 dO

01VD1VDVV00000V0V1100 ZS-VUdO

OVOOViOOVDllDVOVOOO

011丄 丄 丄 DVV0丄 V H - VL丄 dO

0V0D0V0V00V0V V0V0V d-VLldO

0丄ぶ） [ιί

V dO

|e qns 丄丄丄 OVWOIV丄 0丄 丄 丄 OVO d - £ L^xaは VOV

V_LLV0丄丄 OVIO丄 0丄丄 丄 0V丄丄 OS丄丄丄丄 V0

0丄 丄 00V丄丄丄 D - 丄 vov

丄丄丄 V_LDV丄 0丄 丄 OlVllO 2d-2 L^xa VOV

OOVVOO丄 OVVWVllO丄 VVVV丄 IIVOVV H -" ^X3 L丄 VOV

ODOOlWJAiVOOlDlV VOOVl

OOQDllV丄 VIQVO丄 Q丄 OWOOVDVOV丄 y一 (UX3 _L丄 vov

DO丄丄丄 VSIOO OOOO丄丄 V丄 V丄 0 VOV

丄 丄 丄 VVDVVODD Ls-O L^ LIVOV

OVlVVOOOVOOOOVODVlllVOVWll 2d-0 L^x9 LlVOV

00丄 VVW01U_LLWDV丄 0丄 11丄 0丄 VDV 2H-6^XS L1V0V

00丄丄 0E)丄丄 DVOWOV丄 9丄丄 0丄 V0

90丄 0V丄 丄 V丄 丄 OVVDVV丄 0丄丄 d-6xs VOV

丄丄 丄丄丄丄 0丄丄 丄 丄 J-6^ L1V0V

OVIVVIIOVWOOOVIIOVVIVIOVO は VOV

30丄 Ό丄 W丄 丄 丄丄 D H - 8X9 VOV

DVOVIVVOVCI丄 00丄 SIODVODOE)

丄 丄 0丄丄丄 丄丄丄 0丄 y- は VOV ilDDDlVOXDlOODVVVlVlOlOOVlD

丄 V丄 DOV丄 CIQODV丄丄丄丄 0丄 S丄 D_LLLLLV3V丄 0 y - vov

V〇_LLLL丄 丄 V1OVD丄丄丄 0丄 J-SX9 vov

V1DVV1111V0V0VX1110000000

11V丄丄 00V丄 00V0丄 0丄 VV丄 3丄 3丄丄 VIOO丄丄 V

00〇丄〇0丄丄丄丄丄 0丄 丄 V00丄丄 一 vov wiv丄 oov丄 WW丄 0D0丄丄丄 VDOV丄 wvc vvi d-e^x9iivov

VDD丄 0丄丄 \ΛΛ丄丄丄 00丄 11V0V0丄丄 VII丄

丄丄 00W丄 V丄 丄

0000D0VD001100VV y一〖ΧΘは VOV

VDDVD011V10VD000V0VD1 d— Ι^χ3は vov

C 0丄 ,5) ½21

/ 丄 丄 0丄 丄丄 V00丄 0丄

D丄 丄 00丄 QOV

丄丄 丄 00丄 0〇VOVOO

丄 丄 0〇011丄丄 0丄 丄

00V0丄 0丄丄 E)丄丄丄丄 0V00丄 VOOQ

VV00V0300丄 D丄丄 0丄 0030

丄 V0丄 丄 VVOVWO丄 03丄

DVOVOO丄 OVODE VO丄

丄 0丄 ΌΕ)丄丄 VOOVO LS - 9"ioowH

Ό0丄 0000丄 VDO丄 丄 OV J- 3，0DWH

OOVO丄 丄 V丄 00V Η-9^χ9Ί001ΛΙΗ

0V0VD0V010DVVVVV00DV

V〇OVE)DVDOV〇E)0丄 3丄丄丄

丄 00丄丄 ODVOOOJLLi)丄 丄

OOVOOOVVOVOVVOODOO

D丄 V0丄 0D丄丄 3丄〇D丄 0丄 3丄 0丄 0丄 0V -|-^ΧΘ-|ΟΟΙΛΙΗ

l 6l 0/S00ldf/I3d 61- ん 900 OAV --------------- - ----- ~ ------ bbbbbbbbbbbbbbbbb bbbbbbbbbbb

ssssssssssssssssssssssssssss ssssssssssssssssssss

d-HOd VOVO丄 0丄丄

d-HOd D3VQ上 0丄 DD丄丄丄 Q丄 OVV丄 0丄0丄丄 OD d-e-Q LX^VHOVH J-dOd QODlOOClDlllVODOOOO丄丄丄 Q _d__e_g _VHaVH 丄 QO丄 03丄丄 OOVVDOVVDVOIV上 9丄 y-2-g _Lx9VHaVH

J-dOd 3丄 丄 丄 丄 J-Z-S txQVHaVH

丄 丄 OOSWOVWIV IS-l-Sl^^VHa H

M-dOd OOSlllVO丄 DO丄 0丄 丄 VIVO丄 V

d-aod VDV0V00V1001111D10V1011101110 J一 L - S L^x3VHaVH

0丄 VII丄 OOOVV丄 DIOOVVO丄 0V丄 0丄 0丄丄 0 d - ^xsVHavH

J-HOd 丄 0丄 005 D丄 0丄 VO丄丄丄 丄丄 V0丄 0 j- LX9VHaVH 丄 0丄 0丄 VVVVVWVVV丄丄丄 00丄 OOV丄 V丄 IS - S L^X3VHCIVH d-HOd VVWWW丄丄丄 00丄 丄。 0丄丄丄 ΌΥΌ丄 V0 y-e L^ HavH d-dOd VV丄 VV〇_LLV〇VSO丄 VOOQDO丄 j- tx®VHavH d-dOd VIQWQWVVWOVOOVOODWOO

d-aod VVD丄 丄丄丄 0V00丄丄 0丄

丄 OVVO丄 D丄 0i〇03VVV0丄丄 0丄 VDV丄 D丄 id -" X3VH( H d-dOd VOV丄 OOVV丄 VIVQCI丄 丄 3WD丄 0 J-t L>^VHaVH d-aod 丄 0丄 丄丄 VOOVDVOV丄 V丄丄丄 丄 d-O L^x^VHa H

00D01〇1V0V丄 Ε)丄丄 V丄丄 VODVOllV丄丄丄 J-O l^X9VHaVH

H-HOd VIOIVOIDVOOVOOVVIVVOOOIVVO H-6^X9VH0VH d-HOd 113丄 丄 0丄 丄 3VVV丄 V0

-U 6 VVVOSVOV丄 Q丄 VVE»丄丄丄丄 丄 0〇丄丄 0V y-8 avH0 H J-idOd VODD丄 00V10V0J I I I丄 上 0丄 j-gxeVHaVH d-dOd 丄丄 0丄 OVV丄丄 丄 0000丄 000

0000丄丄丄丄丄丄丄 VD丄 OOOVC VilV

丄 V丄丄 IIVOOIV丄丄 V丄 νοοοΰ丄 d-9^xsVH0 H

J-dOd 丄 0V丄 03丄丄 丄 0丄 V001V丄丄 000 j-gx9VHa H d-HOd VVO丄 VD上 OOVOV丄丄丄 丄 000 H-gxaVHaVH d-dOd OOVVD丄丄 V丄 丄 VV3丄 DVIVIO丄 9 2-l-QX9VHaVH

OOlVOVlOOVlDOlDOlVOlilV I

H-HOd 丄丄 OlllOV丄 0丄丄 OVODVOQOO丄 E)丄

d-dOd VD丄 丄 00丄丄 OVD丄 0V丄 0D

d-HOd 丄丄丄 VDV丄 30丄丄 V3V000丄 0 y-£X9VHaVH d-HOd V0丄 00丄丄丄 00丄 0110丄

a-aod VDVVVW丄 000丄 0丄丄 DOD丄 VlWllOV丄

J-HOd Ό丄丄丄 OOVOV丄丄 VVV丄 D丄丄 V丄丄 V丄丄 Ό丄丄 D丄丄 丄 J一^ VHaVH a-dOd d-L^X9VHaVH

J-JdOd QO9V00丄 09丄 OVOOOVO丄 Ό d-

(,ε 0丄 ,g) ½2@ m

VHOVH lewqns

H-BOd 0丄 SOW丄 OOVOOOQ丄 VOJ Li)丄 DV Μ-61 は dO d-HOd 0丄 VWOO丄丄 VDVO丄 j一 6 は

V110。丄丄丄 0丄 0丄 。丄 0丄 0丄丄丄 d_8 ixsv dO j-aod 丄丄 V0丄 0丄 D丄丄 丄丄丄 11000丄 Ε» J - 上 dO id-dOd 00丄 丄丄 丄 V H- dO

ODOVOOVOV丄 ODOVOT Ol J- L^X9Vl丄 dO d-dOd W丄 丄 E)丄 丄 丄丄 0丄 d - は dO

OVVOO丄 V0VDVO110VV0丄 09丄 0V 」- 丄 dO

U- Od 丄丄丄丄 丄

d-dOd 000丄 000E)1V0OV〇1V丄

d-dOd VODDOllO丄 丄 ODD丄 xsv dO d-dOd 000丄 0丄丄丄丄 OVIDVO丄 300丄 0丄 00 J-t L^X3Vは dO a-HOd 丄 0丄 0丄 V0丄丄 VVVVOO丄丄

V丄丄丄丄 D丄 D丄 W丄丄 丄丄 丄丄 0

d-HOd 0V000010000010V0 H-Z LxevLldO j-aod 丄丄 OVOVVV丄丄丄 0丄〇00丄丄 D丄丄 VQ丄 00 j_2 lx8V lldO

丄 V0丄 OOWQO丄丄 0丄丄丄 V丄 Ό09 d -" xs_Vは d-dOd OODO丄 丄 OOCLLVQO j一 xsvは dQ

OOOOOVDVVOOVO丄 id— 01X9 VI丄 d〇

J-MOd 00丄 0丄 0丄 D丄！ 丄丄 0丄 HH^X3V dO H-dOd 丄 VOOVO丄 0丄丄 VV丄 00丄丄 OV〇VD丄丄丄 00 は dO d-dOd 011D011丄丄 丄 DlOllO丄丄丄 j- 6XSV L丄 dO a-aod ¾j一 8XSV L丄 dO -bs_S j-aod VV丄丄丄 V_LLV3丄 D丄 0Ό丄 SIVDOVOS丄 J-8X3V dO H- Ό丄 0丄 0丄 OOVOOOOVDVVO丄 D丄 d- .^x9VlldO

丄 丄 0丄 0000900 - 9vは dO

tezizo ozdr/iDd oz -------- ---------- ------ ---- bbbbbbbbbbbbbb b bbbbb b b b b bbbb

sssss sssssssssssssssss ^

d-dOd OOOOOWWVVSSVOOVO丄

d-dOd OOO丄丄 VOWS丄丄丄 丄 OOVO丄 DO

j-aod 0丄 OOOOOOQOOLLOSOOVO丄 ο ε^χ3ανοΊΛ

y-dOd 丄 VOOOO丄 000丄 d-ζχθανοπΛ

DOODDOVIVOODOOOOOVO IS - Ζ ανθΊΛ

d-HOd iXLLODVOOOOOOO丄 丄 3 -^ ανθΊΛ

d-dOd 00丄 丄丄 OOOVODDVOO d-Ζ θανθΊΛ

DO丄 CLLOOVODDE)E)DVOO丄 OVO LS-L^aVOHA

d-dOd 上 V丄 D丄 0丄0丄0丄 OVDO丄 VOVVOO〇〇 Η-Ι^αΥΟΊΛ

d-HOd 00丄 D丄 OQVOODDDSVOO丄 OVQ Zd- l^aVOHA

OVOVV〇OVOOD丄 OOVIOD zs-α οπΛ

000丄 V1〇01V000丄 D丄 0丄丄 is-ανοΊΛ

d-dOd OIVOVDOOVDVVOOVOOD Η-α οΊΛ

d-dOd Ό丄 Cl上 OOD丄 O丄 0丄 E)丄 voo丄丄丄 j-ανοΐΛ

(.ε ο丄 . s) ½¾ ns s=

ανοΐΛ d-^b9S d-dOd 0丄 OOSVQDVOOO丄丄 Q1V丄丄丄 0丄 H— L^xa8HaVH

」一 bss d-aod 丄丄 voo丄 ODV丄 ov丄 o丄 ooo丄 o丄 Q d-^ LxsaHavH

d-dOd 丄 OVVVO丄丄丄 DDVVOVV丄丄丄 OD丄丄 V丄 WVVV d— 9 LX38HC1VH

d-dOd DVV丄丄 0丄 0丄〇丄丄 VD丄丄 ODV丄 OOOVOW丄 丄 9V d-9 L^x»9HaVH

d-^b9S H-aOd X1000丄丄丄 QOVVOVOVVVDVVWO丄 S L^X98HaVH

J-dOd OOVOVlOOOVVVOVViVlOOllVOOVV J-G t^SHaVH

a- ^b9s d-dOd 30丄 0丄 0丄 OiXLLOOD丄 VOOVVV丄 丄 id— ΐ ^χ38ΗανΗ

J - bss J-dOd DDOLUOVO丄 OVVVV丄 OLV丄 QOV丄 DVOV丄丄 VO d-frl^aHaVH

d-^b9S d-HOd 丄 OVOOVWO丄 0丄 OV丄 V丄 VV丄丄 QOOOVO丄 H— S LxsgHGVH

J- bss d-dOd W丄 OVVV丄 丄 J-G l^x^aHaVH

H-^b3S y-aod 丄 vwwvv丄 3OV丄 ooo丄 vvw丄 vov丄 vovovo d-2 i^x»aHavH

J- bss d-HOd 0丄 丄 000丄 VOW丄 VIVIVS d— Z LxsgnaVH

d-aod uoDDV丄丄 viv丄丄 dwwvovovovovv丄 vo丄 y— uxsginavH

j一 b9_S d-UOd 丄丄丄 VV丄 Ό丄丄丄丄丄 O111V0丄丄丄 V丄 V丄 丄 E)3 J- 1 L^saHa H

id- ^b9S d-dOd 丄丄 110VO丄丄丄丄丄 CLLVDDDO丄 OVO d-O LxsaHOVH

d-dOd OOOVOVV丄 VODV丄丄 0丄 ODV丄 00丄 VV J - O LxssHaVH

a-aod Ό丄 ovovoo丄 OVOVODV丄 vosvov d-6^xsaHavH

d-dOd 11V丄丄 O丄 VIOD丄 WOO丄丄 d-6^XQaH0VH

H-HOd VVVVVVVVVVVVVVVVVIIOID OIIOOVD H-8^9HaVH

j一 bs»s d-dOd 9丄 丄 VODVWO丄 0D10V丄丄 J— 8X98HaVH

d-dOd 丄 VWOLLW丄丄 V丄 OllQVVlDVVV丄 D丄 111003V d— xsgnaVH

d-dOd 丄 VO丄丄 OOS丄 丄 0丄 O上 丄 J一 xsgHCIVH

d-^b9S H-dOd WWIQDD丄 V3V0V丄 OV丄 V丄 Dl丄丄 WV1100丄 y— 9^χ98ΗανΗ

J - bss d-HOd VVVVO丄 丄 VVVO丄丄丄 VIOOEI丄 0丄 0丄 VO d-9^X9aHa H

d-dOd VWOO丄 V丄 QO丄 OVODELLVQ丄丄丄 VV H-Q^eaHOVH

」一 bss d-aod 丄 o丄 voo丄 OVDVDODVDVOVO丄 DO d-ex©aHavH

H-dOd VVOVO丄丄 OVDVO丄丄 V丄丄丄丄丄 OCMJJJi)V丄丄 id— SxsgHaVH

j-aod 丄 νε»Ε)丄丄丄 vooiivovov丄 _LLLLV丄丄丄丄丄丄丄 d-exsaHavH

d-dOd 上 Ό丄 丄 0丄0丄 丄丄 VOO d-2xs9Ha H

d-dOd 丄丄 SVOVCIIV丄丄 30V0丄 VOD丄 VOOD =1— ZxsgHdVH

d-dOd 丄丄 OVOVOOOOO H— l^aHOVH

d-dOd 丄 QOOSVOSODVEIOQOD J-lxsaHOVH

Q0VVWi〇VS100Cl丄 OVODV 2S-aVHaVH

9V0丄丄 E)DVV0DV090丄 O丄 IS— 3VH ]VH

d-aod D丄 Q丄丄 ovosvoDOooo丄 o y-avHavH

j-aod 3vooo丄丄丄 ovooo丄 owo丄 j一 gvHavH

(,ε ο丄， s) ½2i fiH g;

9 QVH

6fr lewqng

H-dOd 〇0丄丄 OOVVOOVOOV丄丄 00丄 0丄 0 ¾d— t一 8〖xsvHaVH

。s d-dOd VV丄丄丄 DO丄 0丄丄 ΟΟΟΌϋ丄XLVOE) L^x9VHaVH

a-dOd o丄 ovooo丄 vo丄 o丄 o丄丄丄 OVOOQ丄 y— ε— 8〖 VH IVH

d-dOd CI丄 D丄 OVVO丄 00丄 00丄 000丄 0丄 0丄 J一 ε—

d-HOd 丄丄 0丄 ΟΌΌ丄 VDVO丄丄 03Ό丄 ODVE) d-?-8 l^ HOVH

d-¾JOd OODOVODVC DVOOV丄 0丄丄 OVVO J-2-8 l^x9VH0VH

H-dOd 0丄 OV丄丄 DO丄 0丄丄 0丄 D丄丄丄 OVDSOO d-l-8 lx9VHaVH

d-dOd 0丄 000V丄丄丄 OVO丄 OOVVDOWOD d- L-8 L^VHaVH

d-^b9S d-HOd 丄丄 DO丄丄 OVO -L L^VHaVH

J-dOd 丄 0丄 V09丄 0丄丄 VOO丄丄 OVOOOO丄 d— LX9_VHaVH

- Od V丄丄 VIOWV丄丄 OVO OOO丄 VIO丄 VOVQD id - 9 t^^VHQ H [8W)o] 6∑Tro/soordf/i3d r^ so/90o∑; OAV [0049] [表 14]

¾A (つづき）

AGCTCTTTAAGAAACTGTGTCTGCTCT PCR-R Se " ATACCCGTCCGGTAAGGGAAG PCR-F Se CATTCTTGGCGGGATCGTT PCR-R Se CTGGTGAGGTGTTTGGAGATGTT PCR-F Se CATACTGGGATGTGGCGATAGG PCR-R Se CTCCTGTTAAGGTCAGGTCCCC PCR-F Se TCTCCTAGGGTTGCCTCACCAG PCR-R Se TGGATACTCCCAGGTGTTAAGGG PCR-F Se GAAGAATGGGATATTCAGGGCG Se CCTTCTCCTCCGCCCAATT Se GGGTGACTTGCAACAGCCA Se GCGAAGGAGCAGTTTTTCCCC Se CAGGGACACATGGCAAGGG Se CCCTCTGGCGCAAGCC Se GAGACCCACTGCCCCAGGT PCR-R Se GGTGATGAGGCCAAGTCTGACA PCR-F Se GAACAGATGAGACTGGTTTTGGG PCR-R Se AGCAAAATCTTTGGCTCGGTGAG PCR-F Se CGAAGATCTCGGAGCACACGCT PCR-R Se AAGGTACAGGACGGTCTTCTGCA PCR-F Se GCTCCTTTCCTTTGTCCTATGGG PGR - R Se TGGTAAGACAGAGAATTGGGTGG PCR-F Se CCCGCCTGAGAGGAAGAGG PCR-R Se GAGGCAGGCAAACAGCTGAG PCR-F Se CACAGTGGCAAACTGCTCCA PCR-R Se CGGAGTGGCGAGCTGGTAAGT PCR-F Se TCTGCCAGCCGCTGCA PCR-R Se CTCCTTGAGACTAATGCCCCCA PCR-F Se GCAGGAAGCAGGAGATGAAAATA PCR-R Se AGGGAATGCCTGAGCCG PCR-F Seq-F ATGCCCTCTCGGATCCG PCR-R Seq-R TGACACCTGGTGTATCGAGGTGA PCR-F Seq-F CAATAGAGGCAAACTCCCCACG PCR-R Seq-R

47

LCAD

名前 配列（5' To 3')

LCAD - F TGGCTAACACGGTGAAATC PCR-F

LCAD- R GGAGGACGATCAGCTGAG PCR-R

LCADex1-F GCAAAGGCAGCAGTTTCGCT PCR-F

LCADexl-R GAGTGACTCGCTGCCCCA PCR-R

LCADex2-F CAGTGGCACTAATTTGGATATGAAGA PCR-F qqqqqqqqaqqqqqqqqqqqqqqqqqqqq- Γ Γ- ---------------------------

LCADex2-R AAAGCCCTGAACATACTATGTTTTCTG PCR-R KFRFRFRFFRFRFRRFRFRFRFRFRFRFR

LCADex3- F CATAAGTTCAAAGTTGTGGCCATT PCR-F

LCADex3-R CAAGAGTGCATGAGCGGTATAATC PCR-R

LCADex4-F ACTACCAAACAATTTGATAGGACCTTAAT PCR-F

LCADex4— R CCTTCCTCCTAGCATATAGCTCAGTC PCR-R

LCADex5-F GCAA I I I I ATAATGGTGTAGCCAGTTTG PCR-F

LCADex5-R GAGTCCCTAGATTTAATAGAATTAATGAGTTGTC PCR-R

LCADex6-F TTTCTCCCAATCATAACTTGCAC PCR-F

LCADex6-R CATGTAATCCTCTATGTAAGTCTCCTATCTGA PCR-R

LCADex7-F CAATTTGTGTTTTGTTTTTTTGGAAA PCR-F

LCADex7-R CACAAG I I I I GCATGTATAAATTTGAATG PCR-R

LCADex8-F AATTGTGTGAAAATCACTTGCATAATT PCR-F

LCADex8-R CAAACTTCTATTTACCCCAGGCC PCR-R

LCADex9-F TGATATGTTAAGTGGGTTGAAGTTTATATTTCTA PCR-F

LCADex9-R GCTGAGCTTAAAATTGGCAGAATTC PCR-R

LCADex10-F CCGTTCTAATTGCTTAATAAATGTGCA PCR-F

し CADex10—R CTTTCCCTCTACATTTGATGTACAAAGTAAA PCR-R

LCADex1 1-F TTGAATAGTTTATGAGTTACCTGGTAAGAC PCR-F

LCADex1 1-R TTTTATTTCCTTCTCTATAGAGAGAGC PCR-R

Subtotal 24

[0050] 腿

1.遺伝子多型の検出

インフルエンザ脳症、 CPTII欠損疑!/、でインフルエンザ脳症が疑われる患者から図 4 の 45箇所の遺伝子多型 (一塩基多型: SNP、あるいは挿入、欠失)が検出された。 1. 1単一遣伝子多型で患者 健常人コントロールにおいて、フィッシャーの両側檢定 において有意に唐、者に高 ¾度に靜,られた (Pく 0.05)遣伝 型

HADHA第 6ェキソン領域（EXON6)、 HADHA第 6イントロン領域（INTRON6)、 HAD HA第 18ェキソン領域（EXON18)、 HADHB第 2ェキソン領域（EXON2)、 HADHB第 1 2イントロン領域（INTRON12)、 HADHB第 14イントロン領域（INTRON14)、 HADHB 第 17ェキソン領域 (INTRON17)から患者に高頻度にみられる遺伝子多型を検出し た。それらを図 5に列挙した。

[0051] 開始コドン ATGの Aの位置を塩基番号 1として、ェキソン領域に相当する遺伝子多 型の位置は記載する。イントロン領域に相当する塩基番号はェキソン領域に相当す る位置の終点力も上流側 (一で示す）、下流側（+で示す)の位置ならびに、 NCBIゲ ノムデータベースの核酸番号を記載した。

HADHA塩基番号 474番目のジエノタイプ力 SC/C、 C/Tならびに T/Tのジエノタイプを 持つ SNPを検出した。 SNPは、フエノタイプには影響を与えない cSNPであったが、 マ イナ一アレル Tをもつ人 (健常人 11 + 2名 = 13名、患者 10 + 0 = 10名 )は、マイナー アレル Tをもたない人 (健常人 86名、患者 21名）より、有意 (P=0.028)に患者に高頻 度に存在し、ォッズ比は 3. 15倍であった。従来まで HGMDデータベースや dbSNPs に報告例が無 、新規 SNPであった。

[0052] HADHAェキソン 6の下流 + 26番目（NT— 022184.14番号 5270935)の第 6イントロン 内のジエノタイプが G/G、 G/Cならびに C/Cのジエノタイプを持つ SNPを検出した。 SN Pは、イントロン SNPであったが、 マイナーアレル Cをもつ人（健常人 11 + 2名 = 13名 、患者 10 + 0= 10名）は、マイナーアレル Cをもたない人 (健常人 86名、患者 21名） より、有意 (P=0.0280)に患者に高頻度に存在し、ォッズ比は 3. 15倍であった。従来 まで HGMDデータベースや dbSNPsに報告例が無い新規 SNPであった。

[0053] HADHAェキソン 6の下流 + 32番目（NT— 022184.14番号 5270929)の第 6イントロン 内のジエノタイプが T/T、 T/Cならびに C/Cのジエノタイプを持つ SNPを検出した。 SNP は、イントロン SNPであったが、 マイナーアレル Cをもつ人（健常人 5 + 1名 =6名、患 者 7 + 0 = 7名）は、マイナーアレル Cをもたない人 (健常人 82名、患者 25名）より、有 意であるとはいえないが（P=0.0958)、患者に高頻度にみられ、ォッズ比は 2. 81倍で めつに。

[0054] 1"^01"^塩基番号2519番目のジエノタイプが A/A、 A/Gならびに G/Gのジエノタイプ を持つ SNPを検出した。 SNPは、フエノタイプには影響を与えない cSNPであったが、 マイナーアレル Gをもつ人 (健常人 11 + 2名 = 13名、患者 10 + 0= 10名）は、マイナ 一アレル Gをもたない人 (健常人 86名、患者 21名）より、有意 (P=0.0280)に患者に高 頻度に存在し、ォッズ比は 3. 15倍であった。

[0055] 1"^01"^塩基番号2619番目のジエノタイプが G/G、 G/Aならびに A/Aのジエノタイプ を持つ SNPを検出した。 SNPは、フエノタイプには影響を与えない cSNPであったが、 マイナーアレル Aをもつ人 (健常人 8 + 3名 = 11名、患者 9 + 0 = 9名）は、マイナーァ レル Aをもたない人 (健常人 89名、患者 22名）より、有意 (P=0.0171)に患者に高頻 度に存在し、ォッズ比は 3. 64倍であった。

[0056] HADHB塩基番号 4番目のジエノタイプ力 CT/ACTまたは一/ ACT (挿入)のジエノタ イブを持つ遺伝子多型を検出した。この多型により、 ACTをもつアレルの場合はァミノ 酸番号 2番目にスレオニン (T)、が挿入されるフエノタイプを生じる。 ACT挿入型のァ レルをもつ人（健常人 16 + 0名 = 16名、患者 10 + 0 = 10名）は、 ACT挿入型アレル をもたない人 (健常人 83名、患者 16名）より、有意 (P=0.0005)に患者に高頻度に存 在し、ォッズ比は 4. 86倍であった。

[0057] HADHBェキソン 13の上流一 14番目第 12イントロン内（NT_022184.14番号 532179 1)のジエノタイプが A/A、 A/Gならびに G/Gのジエノタイプを持つ SNPを検出した。 SN Pは、イントロン SNPであったが、 マイナーアレル Gをもつ人（健常人 11 + 2名 = 13名 、患者 10 + 0= 10名）は、マイナーアレル Gをもたない人 (健常人 86名、患者 21名） より、有意 (P=0.0280)に患者に高頻度に存在し、ォッズ比は 3. 15倍であった。従来 まで HGMDデータベースや dbSNPsに報告例が無い新規 SNPであった。

[0058] HADHBェキソン 14の下流 4番目の第 14イントロン内（NT— 022184.14番号 5323009 )のジエノタイプが T/T、 T/Cならびに C/Cのジエノタイプを持つ SNPを検出した。 SNP は、イントロン SNPであったが、 マイナーアレル Cをもつ人（健常人 11 + 2名 = 13名、 患者 10 + 0= 10名）は、マイナーアレル Cをもたない人 (健常人 86名、患者 21名）よ り、有意 (P=0.0280)に患者に高頻度に存在し、ォッズ比は 3. 15倍であった。

[0059] HADHBェキソン 15の上流 26番目の第 14イントロン内（NT_022184.14番号 532365 8)のジエノタイプが T/T、 Τ/Αならびに A/Aのジエノタイプを持つ SNPを検出した。 SNP は、イントロン SNPであったが、 マイナーアレル Aをもつ人（健常人 23 + 3名 = 26名 、患者 15 + 0= 15名）は、マイナーアレル Aをもたない人 (健常人 73名、患者 16名） より、有意（P=0.0271)に多く存在し、ォッズ比は 2. 63倍であった。

[0060] HADHB塩基番号 1607番目のジエノタイプが G/G、 G/Cならびに C/Cのジエノタイプ を持つ SNPを検出した。 SNPは、フエノタイプには影響を与えない cSNPであったが、 マイナーアレル Cをもつ人 (健常人 16 + 3名 = 19名、患者 13 + 1 = 14名）は、マイナ 一アレル Cをもたない人 (健常人 86名、患者 21名）より、有意 (P=0.0280)に患者に高 頻度に存在し、ォッズ比は 3. 47倍であった。

1. 2 2以卜.の遣伝早の鉬.み合わせ解析に用いられた遣伝早多型

以下に検出した遺伝子多型の代表例のみを列挙し、すべての記載は図 4におこなわ れている。

(コーディング領域に見られた遺伝子多型）

CPT II第 4ェキソン領域 (EXON 4)ならびに第 5ェキソン領域 (EXON 5)に、複数の cS NPを検出した。

[0061] 塩基番号 1055番目のジエノタイプ力 ST/T、 T/Gならびに G/Gのジエノタイプを持つ S NPを検出した。この SNPにより、 Tをもつアレルの場合はアミノ酸番号 352番がフエ-ル ァラニン (F)、 Gをもつアレルの場合はシスティン（C)をコードすることから、アミノ酸レ ベルでも (F/F)、 (F/C)ならびに（C/C)のフエノタイプを生じる。

[0062] 一方、塩基番号 1102番目のジエノタイプが G/G、 G/Aならびに A/Aのジエノタイプを 持つ SNPを検出した。この SNPにより、 Gをもつアレルの場合は、アミノ酸番号 368番が ノ リン (V)、 Aをもつアレルの場合はイソロイシン（I)をコードすることから、アミノ酸レべ ルでも（V/V)、（V/I)ならびに (I/I)のフエノタイプを生じる。

[0063] 塩基番号 1939番目のジエノタイプが A/A、 A/Gならびに G/Gのジエノタイプを持つ S NPを検出した。この SNPにより、 Aをもつアレルの場合は、アミノ酸番号 647番がメチォ ニン (M)、 Gをもつアレルの場合はパリン (V)をコードすることから、アミノ酸レベルで も（M/M)、 (M/V)ならびに（V/V)のフエノタイプを生じる。

[0064] ETF遺伝子群にお!、ても cSNPが観察された。 ETFAにお!/、ては、塩基番号 512番目 のジエノタイプ力 SC/Cならびに、 C/Tのジエノタイプを持つ SNPを検出した。この SNPに より、 Cをもつアレルの場合はアミノ酸番号 171番カ Tをもつアレルの場合はイソロイ シン（I)をコードすることから、アミノ酸レベルでも（T/T)ならびに、（T/I)のフエノタイ プを生じる。

[0065] ETFBにお!/、ては、塩基番号 461番目のジエノタイプ力 SC/C、 C/Tならびに T/Tのジ エノタイプを持つ SNPを検出した。この SNPにより、 Cをもつアレルの場合は、アミノ酸 番号 154番がスレオニン（T)、 Tをもつアレルの場合はメチォニン（M)をコードすること から、アミノ酸レベルでも（T/T)、（T/M)ならびに（M/M)のフエノタイプを生じる。

[0066] また、 ETFB力らは、塩基番号 447番目のジエノタイプ力 SC/C、 C/Tならびに T/Tのジ エノタイプを持つ SNPを検出した。この SNPは、フエノタイプには影響を与えない SNPで めつに。

[0067] ETFDH力らは、塩基番号 92番目のジエノタイプ力 SC/C、 C/Tならびに T/Tのジエノタ ィプを持つ SNPを検出した。この SNPにより、 Cをもつアレルの場合は、アミノ酸番号 31 番がスレオニン (T)、 Gをもつアレルの場合はイソロイシン (I)をコードすることから、ァ ミノ酸レベルでも (Τ/Τ)、 (Τ/Ι)ならびに（Ι/Ι)のフエノタイプを生じる。

[0068] ETFBにお!/、ては、塩基番号 -320番目のジエノタイプ力 SC/C、 C/Tならびに T/Tの ジエノタイプを持つ SNPを検出した。さらに塩基番号- 113番目のジエノタイプが G/G ならびに G/Tのジヱノタイプを持つ SNPを検出した。

[0069] ETFDH にお!/、ては、塩基番号 1989番目のジエノタイプが A/A、 A/Cならびに C/C のジエノタイプを持つ SNPを検出した。これらの SNPは、従来まで HGMDデータベース や dbSNPsに報告例が無い新規 SNPであった。

ETFAイントロン領域から SNPを検出した。コンティグ配列 NT_024654.13を用いて 2 548228番目（コンティグ配列 NT_024654.13中では第 10ェキソン開始位置から 642塩 基に相当する力 対応するアミノ酸が存在しないため、イントロン配列であると考えら れる）のジヱノタイプが C/C、 C/Tならび T/Tを持つジヱノタイプを検出した。これらの S NPは、従来まで HGMDデータベースや dbSNPsに報告例が無!、新規 SNPであった。 なお、これらそれぞれの遺伝子多型は隣接する遺伝子多型とともに親から子へ受 け継がれることがしばしばあり、それらのアレルの関係は連鎖不平衡の関係にあると 呼ばれる。連鎖不平衡はアレル間の距離が長くなるほど弱くなる傾向にある。従って 近傍の遺伝子の場合は、強い連鎖不平衡が見られることが多い。本明細書に示され た遺伝子と近隣の遺伝子との間に強い連鎖不平衡の関係にある場合、遺伝子多型 の頻度や遺伝子多型の出現パターンが同じになることがあり、本実施例の遺伝子多 型を予測することができる。一方で、本明細書に記した遺伝子に限らず、他の隣接す る遺伝子を解析することで、本リスク診断に利用することが可能になる。たとえ弱い連 鎖不平衡にあつたとしても、リスク診断をおこな 、うることがある。

例示するならば、 HADHA HADHB近傍の遺伝子多型は連鎖不平衡の関係にあるも のが多い。従って、この遺伝子に隣接する遺伝子の多型を利用したリスク診断も実施 することが可能である。

3. SNPの組み合わせによるインフルエンザ脳症患者リスク診断 (表 B)

3.1患者マーカー候補の探索

次に、以上で得られた遺伝子多型を利用して、リスク診断に利用するために、患者 にのみ、観察される遺伝子多型の組み合わせ、ならびに、患者の多くを占める遺伝 子多型の組み合わせを見つけ出すことを試みた。 2つのあるいはそれ以上の遺伝子 多型を利用することで、患者群カゝら高いォッズ比を示す遺伝子多型をえた。以下に その遺伝子多型の代表例を列挙した。

HADHB第 2ェキソン内の塩基番号 4番目のジエノタイプが ACT/ACTあるいは 一/ ACT (スレオニンの挿入型）を多型に持ち、かつ、 HMGCS2の第 9イントロンの—37番 目（NT_019273.17番号 16279498)のジエノタイプ力 SC/Tあるいは T/Tである組み合わ せは、遺伝子解析が可能であった患者 27例中 5例見られるのに対し、健常人では 99 例中 1例にのみ観察された。 HMGCS2の第 9イントロンの— 37番目のアレル Tと HMGC S2の第 9イントロンの + 68番目（NT— 019273.17番号 16279714)のアレル Gは、強い連 鎖不平衡の関係にある。従って、 G/Gあるいは A/Gのジエノタイプと HADHB第 2ェキ ソンの ACT/ACTあるいは /ACTのジエノタイプを組み合わせて用いた場合、同 一の結果が得られた (患者 27例中 5例見られるのに対し、健常人 99例中 1例)。このい ずれの場合もォッズ比は 22.4倍となる。

[0071] ETFB第 8ェキソン内の塩基番号 447番目のジエノタイプが C/Tかつ、 CPT2の第 4 ェキソンの塩基番号 1102番目のジエノタイプが G/Aである組み合わせは、遺伝子解 祈が可能であった患者 31例中 2例見られるのに対し、健常人では 100例からは見ら れなかった。

[0072] ETFA第 10イントロン内 + 642番目のジエノタイプが C/Cかつ、 ETFBの第 3イントロ ンの塩基番号— 113番目のジエノタイプが G/Tである組み合わせは、遺伝子解析が 可能であった患者 31例中 1例見られるのに対し、健常人では 100例からはみられな かった。

[0073] VLCADェキソン 8の下流 + 33番目の第 8イントロン内（NT— 010718.15番号 6722966 )のジエノタイプ力 ST/Gあるいは G/Gのジエノタイプを持ち、かつ、 LCADの第 9ェキソ ンの塩基番号 997番のジエノタイプが A/A (グルタミンのフエノタイプ）である組み合わ せは、遺伝子解析が可能であった患者 27例中 4例見られるのに対し、健常人では 99 例中からは見られな力つた。

[0074] CPT2の第 4ェキソン内の塩基番号 1055番のジエノタイプ力 C/C (システィンのフエ ノタイプ）を持ちち、かつ ETFA第 10イントロン内の +642番目の遺伝子多型が G/Gあ るいは G/Tである組み合わせは、遺伝子解析が可能であった患者 31例中 9例見られ るのに対し、健常人では 99例中 4例観察された。この場合のォッズ比は 9. 72倍であ つた o

[0075] HADHB第 2ェキソン内の塩基番号 4番目のジエノタイプが ACT/ACTあるいは 一/ ACT (スレオニンの挿入型）を多型を持ち、かつ、 ETFDHの第 13ェキソン内の塩基 番号 1989番の G/Tである組み合わせは、解析可能であった患者 27例中 10例に見 られる一方で、健常人から 99例中 12例に見られた。

[0076] またこれら上記の組み合わせをさらにまとめることで、患者のリスク診断のカバー率 を上げることができる。たとえば、 ETFB 447C/T, CPT2 1102G/A, ETFA+642C/C 、 ETFB- 113 G/T、 VLCAD+33 T/G or G/G、 LCAD 997 A/A、 HADHB 4 -/ACT o r ACT/ACT, HMGCS2 -37 C/T or T/Tの計 8種を用いた場合、これらの条件を満た すものは、 31検体中 11例（1例の組み合わせの重複)から見られ、一方で健常人から は、 99例中 1例のみ見られる組み合わせとなり、患者 35.5%をカバーするのに対し、健 常人では 1%しか見られな!/、と!/、う結果となった (表 B(a))。

[0077] あるいは、 HADHB 4 -/ACT or ACT/ACT, HMGCS2—37 C/T or T/T、 VLCAD+ 33 T/G or G/G、 LCAD 997 A/A、 ETFA642 C/C、 CPT2 1055 G/G or G/Tの計 6 種を用いた場合、患者 31例中 16例となり（2例の組み合わせの重複）、患者 51.6%を カバーするのに対し、健常人 99例中 5例、 5. 1%から検出された (表 B(b) ) 。

[0078] さらに、別の組み合わせとして、 VLCAD+33 T/G or G/G, LCAD 997 A/A, HAD HB1989 G/Tゝ ETFDH1989 G/Tゝ ETFA642 C/Cゝ CPT2 1055 G/G or G/Tの計 6種 を用いた場合、患者 31例中 22例となり（3例の組み合わせの重複）、患者の 71%を力 バーするのに対し、健常人 99例中 14例（1例の組み合わせの重複）、 13. 1%から 検出された (表 B (c)) 。

[0079] 以上に示した結果に代表される方法で、インフルエンザ脳症をはじめとする、熱不 安定性フエノタイプ症のリスク診断マーカーとして使用し得る。

[0080] 3. 2健常人マーカー候補の探索

健常人に特徴的に見られる遺伝子多型マーカーを探索することで、罹患リスクが低 いかどうか、あるいはそれらの遺伝子マーカーを持たない場合は、罹患リスクが高い と考えられる。

[0081] LCADの第 9ェキソンの塩基番号 997番目のジエノタイプが A/Cある!/、は C/Cのジェ ノタイプをもち、かつ、 HADHA遺伝子の第 18ェキソンの塩基番号 2619番目の多型の ジエノタイプが G/Gかつ、 HMGCS2のイントロン領域 + 53 (NCBI)ジエノタイプ力 である組み合わせは、遺伝子解析が可能であった健常人では 99例中 30例 (30.3%)か ら観察される一方で患者からはまったく見られなかった (表 B (d) )。以上のことから、 この組み合わせは、罹患リスクが小さいリスク診断マーカーとして使用しうる。

[0082] [表 15] 表 B

(b)

Genotype patients healthy

HADHB 4 -〉 ACT - /ACT or ACT/ACT

5 1

& HMGCS2 -37 OT C/T or T/T

VLCAD +33 T>G T/G or G/G

4 0

& LCAD 997 A>C A/A

ETFA +642 OT C/C

9 4

& CPT2 1055 T>G G/G or GT

16/31 5/99

TOTAL

(51.6%) (5.1%)

(d)

genotype patients healthy し CAD 997 A>C A/C or C/C

& HADHA 2619 G>C G/G 0 30

& HMGCS2 +53 OT T/T

0/27 30/99

TOTAL

0% 30.30% 実施例 2

材料 方法 この研究は、徳島大学のヒトゲノム解析の倫理審査委員会により承認された。全て の参加者は、書面でのインフォームドコンセントを与えられた。インフルエンザ脳症 (In fluenza- associated encephalopathy; IAE)についてのサーベイランスは、 2000-2003 年のインフルエンザシーズンにおいて、 日本の南西地域で行われた。 IAEの診断は、 臨床的症状に従い行った。 34人の全ての患者はウィルス抗原を有し、突然の発作の 開始と高熱開始後 12時間から 48時間内に生じた昏睡を有していた。 1人の死亡例（ 患者番号 21)では、熱の開始時にジクロフェナクナトリウムを摂取した力 肝における 脂肪変性とライ症候群の典型的な病理学的発見は観察されな力つた。患者番号 21 を含む IAEと診断された 13人の IAE患者と 79人の健常なボランティアは、ゲノム分析 を受けることに同意した。

臨床データ解析

EDTA-処理した末梢血、尿および、咽喉の綿棒力 の標本を患者力 得た。尿中 の有機酸プロフィールと血清中のァシルカル-チンをガスクロマトグラフィ^——マスス ベクトル (Shimazu Model Qp5000, Shimazu, Kyoto, Japan)、 エレクトロスプレータン デムマススペクトル (Model TSQ7000, Thermo- Quest, Tokyo, Japan),により各々分析 した。インフルエンザウイルス抗原は、咽喉の綿棒からの標本について酵素結合ィム ノソルベント検定法 (ELISA) (Becton Dickinson)により検出した。

CPT II活件のアツセィ

CPT II活性は、反応混合物中 1% Tween 20の存在下に CPT II cDNA変異体でトラン スフエタトした COS-7細胞と肝生検材料にぉ 、て、 L- [メチル-³ H]カル-チンとパルミト ィル -CoAから形成されるノルミトイル -L- [^チル-³ H]カル-チンの検出により測定し た。野生型 (WT)と変異型の CPT IIの熱安定性の分析のために、肝と細胞ホモジネー トの活性を 37°Cと 41°Cで測定した。

CPT II突然変異解析

IAE患者、 79人のインフルエンザに罹患していない日本人の全血からのゲノム DNA を記載されるように精製した（Fukao T, Mitchell GA, Song X- Q, Nakamura H, Kasso vska- Bratinova S, et al. Genomics 2000; 68: 144-51.)。 CPT II遺伝子の 5つのエタ ソンの PCRをイントロンベースのプライマー（表 C)を使用して解析した。 PCR産物の配 歹 IJは、 ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer (PE— Applied Biosystems)上で、 ABI DyeD eoxy Terminator Cycle Sequencing Kitを使用して直接分析した。各 PCR産物は、両 ストランドについて配列決定し、分析は少なくとも 2回独立して行った。

[0084] [表 16] 表 C

CPT2遺伝子の PCR増幅に使用したェクソンプライマー； MAまたは MBプライマ-一を変異 の ために使用した。

領域 フォワードブライマ一 リパースプライマー 生鵷の

サイズ（bp)

Exon 1 cttgtgtttagactccagaactcc gtcatgagtgactgcagtcaggttg 292

Exon 2 ctgtcagccttacactgaccc aactctcggggcttggtc 305

Exon 3 Tttagggctatgctgttggg aggaagggaggatgagacgt 358

Exon 4-1 ctctggaggttgatgccatt acccaagcactgaggacaag 1,472

Exon 4-2 tagagttcagtgggtagctggct atccaggcacatctgaagtac 401

Exon 5 tttcctgaggtccttttccatcctg atgaggaagtgatggtagcttttca 425

MA-V352I ggcacaaaccgctggtgtgataaat atttatcacaccagcggtttgtgc

MB-V362I ctactgccgtccactttagcactcttg caagagtgctcaaagtggacggcagtag

[0085] 突然変異誘発および COS-7細朐におけるミュータント CPT IIおよび WTの発現

ヒト CPT IIの全コーディング領域を含む全長 WT cDNAクローン (pCMV6-WT)は、 V. Esser, PhD, the University of Texasから贈呈された。プラスミド pCNV6- WTは、 3 つの全長ミュータント CPT II cDNAクローン， pCMV6-MA (F352C), pCMV6— MB (V3 621)および pCMV6- MA+B (F352C/V362I)を QuickChange (登録商標）部位指定突然 変異誘発キット (site- directed mutagenesis Kit) (Stratagene)により生成するための親 ベクターとして使用した。ミュータント誘発に使用するプライマーは、表 Cに列挙される 。 CPT II cDNAの突然変異と完全性は、配列分析により確認した。 pSVb-ガラクトシダ ーゼコントロールベクター (Promega)は、酵素活性を測定することによりトランスフエク シヨン効率をモニタリングするための内部標準として種々の pCMV-6-CPT IIプラスミ ドと同時トランクフエタトした。偽の (Mock)トランスフエクシヨンをコントロールとして行つ た。トランスフエクシヨンの 72時間後、 COS-7細胞を生理食塩水で 2回洗浄し、 WTとミ ユータントの CPT II活性分析した。

結果 患者とァシルカルニチン比

0〜16才で、潜在的な疾患を持たない 34人の患者 (22人の男子と 12人の女子）が I AEを有した。 22人の患者 (64.7%)は 4歳未満であり、平均年齢は 2才であった。インフ ルェンザ A, Bおよび A+Bウィルス抗原を鼻咽頭綿棒で 91.2%, 5.9%および 2.9%で各 々検出した。 2.9%の患者は既にワクチン接種を行っていた。患者は 1人の致死的な 症例（患者番号 21)を除き、インフルエンザの経過中にアスピリンまたはジクロフェナ クを使用していなカゝつた。

[0086] 患者血清の実験室試験は、 41.2%の IAE患者がカットオフ値の上限である 0.048を 超える血清ァシルカル-チン比 (C + C )/Cの特徴的な上昇を示すことが明らか

16:0 18:1 2

になった（図 1)。特に、重篤な IAE群（7人の患者）、即ち該比が 0. 09を超える患者の 半分以上が致死的（3名の女子)および後遺症（ 1名の男子)の結果となった。これら のデータは、高リスク群の患者はミトコンドリア長鎖脂肪酸代謝の著明な障害を有す る力 これらの患者は発症前の診断では異常を示す症状は観察されていな力つた。 日本人におけるミトコンドリア脂肪酸 酸ィ匕代謝の最も通常の先天異常は 2型あり、 その 1つは CPT II欠乏症であり、長鎖ァシルカル-チンの血清中での蓄積を示す。 他の型はグルタル酸酸性尿タイプ 2(GA2)で、それぞれ 26.6%および 21.9%の頻度を示 す力 その頻度は白人では 11%および 5.5%と比較的低ぐ白人の最も通常の欠乏症 は、中鎖ァシル - CoAデヒドロゲナーゼ (MCAD)の欠乏であり、これは 27.5%.で最も高 頻度である。しかしながら、全ての IAE患者での (C + C )/C比は、体温が正常に

16:0 18:1 2

戻るとともに 0.048〜0.06のボーダーライン比に正常化または減少される。これらの結 果は、該比は 40°C以上の発熱を伴う痙攣の際に一時的に上昇したことを示唆する。 組み合わせの熱不安定性 CPTII多型を有する番号 21の患者の母を除く全てのフアミ リーメンバーは、非感染状態で以下に記載するように 0.042〜0.054のボーダーライン 比を示し、患者番号 21と同一の組み合わせ CPTII多型を有する姉は通常の体温で 0. 042の比を示した。該比が 0.09よりも大き 、ノヽィリスク群の 2人の患者であっても後遺 症なしに 3〜4週間の感染後に回復した例もある。

[0087] 該比が 0.004の 1名の致死的 IAE患者が存在し (図 1)、この患者は異常な尿中グルタ ル酸の増加を示し (データは示さない）、即ちミトコンドリアにおける電子伝達障害に 基づき GA2と診断された死亡例である。該比が 0.09以下の全ての他の IAE患者は重 篤な後遺症なしに回復した。 MCAD欠損症の診断マーカーであるオタタノィルカル- チンは、 日本の IAE患者の全てにお!、て上昇して!/、なかった。

熱不安定性 CPT II多型

0.168の最高のァシルカルニチン比を有する患者番号 21の肝生検のホモジネート における CPT IIの比活性は 0.4士 0.06 nmol/min/mgタンパク質であり、これは 37°C での正常コントロール (1.1士 0.3 nmol/min/mgタンパク質， n=6)の約 36%であった。 この患者の CPT IIは非常に熱不安定であり、 41°C、 120分のインキュベーション後 に比活性は約 50%に低下した力 コントロール CPT IIは同じアツセィ条件下で 91. 4 %にわずかに低下しただけであることは注目に値する（図 2)。患者の CPT IIの熱不 安定性の病因を分析するために、本発明者は患者番号 21とその家族関係のジエノ タイプを分析した。 CPT II遺伝子の配列分析は、患者が 2つのへテロ接合性の多型、 即ち F352C置換と V368I置換を有し、他の報告されている CPT II突然変異は検出さ れないことを明らかにした。 F352C多型変異型は、 日本人についてのみ報告され、今 日までコーカサス人種については報告されていない。そして、 V368I変異型は両方の 人種で見出されるが、 CPT II欠損症については比較的穏やかな有害作用の可能性 が議論されているに過ぎない。患者番号 21とその姉は、 F352C置換と V368I置換に ついて同一のへテロ接合性を有し、その父は F352C置換と V368I置換についてホモ 接合性を有し、その母は V368I置換についてのみへテロ接合性であり、その兄は F35 2C置換についてヘテロ接合性であり、 V368I置換についてホモ接合性であった。家 族'親類において、 CPT IIの他の置換は同定されな力つた。報告されている M647V置 換もまた幾人かの IAE患者にぉ 、て見出されて 、るが、 IAE患者と健常なボランティア の間の頻度にぉ 、て有意差は観察されな力つた。 IAE患者と健常なボランティアの間 の CPT IIのハプロタイプの頻度の比較において（表 3のタイプ 1— 9)、 F352C, V368I および M647Mの組み合わせのマッチする頻度（タイプ 9)は、患者番号 21の遺伝子と 同一であり、健常なボランティアのそれよりも有意に高い（pく 0.025).分析された患 者の限られた数のために、今のところ他に IEA患者において健常なボランティアよりも 有意に高い頻度で見出されたハプロタイプはな力つた (表 D)。 [0089] [表 17] 表 D： IAE患者および ボランティアにおける CPT Πハプロタイプとその

Λプロタイプ 患者 健常ポランティ

ァ

番号 繊 番号 mm p

(%) (%)

タイプ 1 (F F-V/V-M M) 0 0 11 13.9

タイプ 2 (F F-I/I-V V) 0 0 1 1.2

夕イブ 3 (F F-V/1-ΜΛ 1 7.7 3 3.8

タイプ 4 CF/F -I I-M/V) 1 7.7 1 1.2

タイプ 5 (F/F-I/I-M/M) 3 23.1 25 31.6

タイプ 6 (F F-V I-M M) 2 15.4 27 34.2

タイプ 7 (C/C-I I-M ) 1 7.7 5 6.3

タイプ 8 (F/C-I I-M 1VD 1 7.7 0 0

タイプ 9 (F/C-V I-M M) 4 30.8 6 7.6 < 0.025 全数 13 79

[0090] WTと変異型 CPT II cDNAsの in vitro発現につ!、て、 4つの cDNAsを COS- 7細胞で 過剰発現した (図 3) :pCMV6- WTは WT CPT II (FVM- CPT II)を含む； pCMV6- MAは F352C多型を含む (CVM- CPT II); pCMV6- MBは V362I多型を含む (FIM- CPT II);そ して pCMV6- MA+Bは F352C + V368I多型を含む (CIM- CPT 11)。 ベクター単独の CP T II活性は 0.27士 0.03 nmol/min/mg蛋白 (n=6)であり、内因性酵素活性と一致し、以 下に示される全てのデータは、ベクター単独の CPT II活性の値を差し引いたもので ある。 pCMV6-WTで過剰発現された COS-7細胞の CPT II活性は 0.46士 0.07 nmol /min/mg蛋白 (n=5)であった。 CVM— CPT II、 FIM— CPT IIおよび CIM— CPT IIの CPT I I活性は、各々 37。Cで WT FVM-CPT II活性の 62.8士 7.2, 102.5士 19.6および 34.7 士 1.3%であった (図 3)。アミノ酸置換はタンパク質のコンフォーメーション変化並び に熱安定性に影響する可能性があるので、本発明者は 39°C以上の温度の代表例と して 41°Cの熱ストレス条件下に CPT-II活性を分析した。 WT FVM-CPT IIの活性は 41°Cで 120分間のインキュベーション後に 91%にわずかに減少した力 FIM-, CVM -および CIM- CPT IIの活性は 37°Cの活性と比較して、 41°Cで 91%, 48%および 72%に 各々減少した。これらの変異体中において、 CIM-と CVM-CPT IIの両方の酵素活性 は、 37°Cでの WT FVM-CPT II活性の約 25-30%に顕著に低下した。 [0091] この実験例では、 41°Cにおける酵素活性の低下について検討した力 39°C以上 の任意の温度 (例えば 39°C、 40°C、 42°C等）における酵素活性の有意な低下を同 様に検討することで、熱不安定性フエノタイプ症を診断することができる。

[0092] これらの結果は、 CPT IIのホモ接合性置換に由来する力 これらのデータは、図 2 において 41°Cで患者番号 21で見られる CPT II活性の低下を支持する。

考察

脳炎 Z脳症は様々な小児疾患で現れる 1つの症状である。これらのうちで、 IAEは インフルエンザの合併症として報告され、特に日本人の子供において高頻度に見ら れると報告された。本発明では、本発明者は 41.2%の IAE患者が熱性痙攣の間に血 清ァシルカル-チン比の（(C + C )/C力 .048のカットオフ値上限を超える）増加

16:0 18:1 2

を示し、 0.09を超える高リスク患者の 57%が死または重篤な後遺症などの臨床的な結 果を示すことを明らかにした。この比は、長鎖脂肪酸代謝障害のマーカーであり、日 本におけるこの種の表現型を示す最も一般的な疾患は先天性代謝異常症の CPT II 欠損症により、その頻度は人口 10万人に数人といった極めて稀な疾患である。 IAEと 診断された患者群でァシルカル-チンの異常な値が 41.2%検出されたことは特筆す べきことである。研究されたグループにおいて、 CPT II以外に致死的原因疾患を示 すものに GA2がある力 この疾患ではミトコンドリアの電子伝達障害があり、該患者の ァシルカル-チン比は 0.048未満の値を有していた。これらの結果は、致死性 (4人の 患者）と重篤な後遺症（1人の患者)の臨床結果となる全ての重篤な IAE患者は CPT I Iの異常と GA2と 、つたミトコンドリアエネルギー代謝の障害を有して 、た。高熱時の 増加したァシルカル-チン比が全ての追跡調査した患者において正常な体温に戻 ると有意に減少したことは熱不安定性フエノタイプが可逆的であることを示唆しており 注目に値する。これらの知見は、連続する高熱はしばしば嘔吐と絶食を伴い、特にェ ネルギー代謝酵素欠損または熱不安定性多型を有する患者では全身性のエネルギ 一危機を引き起こす。

[0093] 日本人における CPT II欠損症および GA2、さらにコーカサス人種における MCAD欠 損症のようなミトコンドリア脂肪酸 β酸化の先天異常を有する子供は、重篤な急性脳 症および多臓器不全 (ライ様症候群）〖こ感染なしに罹る。もちろんこれらの先天異常 を示す子供力 Sインフルエンザに感染すれば、特に重症となって死に至る可能性は高 V、。本出願のデータはこれまでに調べた IAE患者にお!、て高!、ァシルカル-チン比 を示した患者であってもこれらの酵素欠損症ではなぐ熱不安定性多型または複数 の CPT II熱不安定性多型が重なったケースであった。これらの多型は、酵素活性を 相乗的に低下させる。ほとんど全ての IAE患者は明確なエピソードを示しておらず、 従って、新生児期には無症状のために検出を逃れる。感染とともにアスピリンの服用 により引き起こされるライ症候群患者は、ミトコンドリア脂肪酸 ι8酸ィ匕に関与する酵素 の類似の遺伝的背景を有する患者で発症する可能性もあるが、肝臓での病理学的 所見は IAEにおいて見られるものよりもより強い脂肪変性を伴う。

本発明者は、 CPT IIの熱不安定性 F352C多型と特定のマイルドに有害な V368I多 型が組み合わされることで高熱時に相乗的に CPT IIの機能欠損を誘発することを明 らかにしており、そしてこれらの多型を IAEになりやすい変異型であると提案した。 F35 2C変異体は今まで日本人でのみ報告されており、 V368Iおよび M647Vは日本人およ びコーカサス人種の両方で CPT II欠損症患者の持つ遺伝子多型、並びに無症状 小児において報告されている。し力しながら、 CPT IIは |8酸化の代謝経路の律速酵 素ではなぐ CPT II活性がコントロールの 30%超の場合、脂肪酸 j8酸化は、正常範囲 で異常な症状としては現れない。しかし 39°C以上、例えば 41°Cの熱ストレス条件下 において、患者番号 21の CPT II活性とトランスフエタトされた CIM-および CVM- CPT IIは、 37°Cでの WT CPT IIの 30%未満を示し、脂肪酸 j8酸化障害を示すと推定される 。 F352C, V368Iおよび M647Vのような CPT IIの 3つの多型に関し、 27個の予期される ハプロタイプの中で 9個のハプロタイプが表 3に示すように IAE患者と健常ボランティ ァにおいて観察された。これらのうちで、 IAE患者でのタイプ 9 (F/C-V/I-M/M)の頻 度の相違は、健常者グループに比較して有意に高い発現頻度を示した。 CIM-CPT I I (タイプ 7, C/C-I/I-M/M)は図 3において最も低い酵素活性を示した力 IAE患者と 健常ボランティアの間のタイプ 7の頻度の相違は、今のところ有意ではなぐおそらく 分析された IAE患者の限られた数のためであると考えられた。さら〖こ、これらの知見は 熱不安定性多型および Zまたは熱不安定性フエノタイプ症の病因において、ェネル ギー代謝に関与する他の酵素欠損、或いはマイルドな変異形態の潜在的な関与を 否定するものではない。ミトコンドリア 13酸ィ匕の障害を有する IAE患者に見られる脳症 および急性脳浮腫の分子メカニズムは明らかにされていないが、ミトコンドリア β酸ィ匕 の先天性または後天性の異常を有するマウスの脳毛細血管でのミニプラスミンの蓄 積と、インフルエンザウイルス感染後の血液脳関門のミニプラスミンなどのタンパク質 分解酵素による破壊は、 1つの関連する病因であると証明される可能性がある。

[0095] 熱不安定性多型を有する ΙΑΕ患者のエネルギー代謝異常を考慮すると、クェン酸 サイクルの速度を増カロさせるために、長鎖脂肪酸酸ィ匕を活性化させるための L-カル 二チン投与およびグルコースの投与、さらに高熱によって誘発される酵素の失活を防 ぐ低体温療法は、熱不安定性フエノタイプ症の症例に取り組み場合に治療的に有効 であると証明される力もしれな 、。

産業上の利用可能性

[0096] 1 ·これまで高熱時に脳浮腫や多臓器不全を伴って死に至る原因不明とされていた 疾患を、その発症素因となる疾患感受性遺伝子を同定して、確実な診断ができるよう になる。

[0097] 2 ·発症素因となる疾患感受性遺伝子の同定を基盤に、治療法の開発が可能となる

[0098] さらに、 SNPを持つ力どうかを検査することで、将来熱不安定性フエノタイプ症になる リスクが高いかどうかを判定することが可能となる技術と考えられる。

Claims

請求の範囲 [1] インフルエンザ脳炎 '脳症、ライ症候群、 RSウィルス感染症、アデノウイルス感染症、 ライノウィルス感染症、風疹、日本脳炎、マラリア感染症、川崎病、乳幼児突然死症 候群を含むあるいはこれらに起因する熱不安定性フエノタイプ症のリスクを診断する 方法であって、ミトコンドリアでのエネルギー代謝に関与する各種 Transporter,カル 二チン回路、長鎖 β酸化回路、中鎖 ·短鎖 |8酸化回路、電子伝達、ケトン体合成お よび ΑΤΡ産生のいずれかに関与する少なくとも 1種の酵素の酵素活性が 37°Cを 100 %としたとき、 39°C以上では健常者よりも有意に低下するカゝ否かを調べることを特徴 とする、方法。 [2] 前記熱不安定性フエノタイプ症が、インフルエンザ脳炎 '脳症である、請求項 1に記載 の方法。 [3] 37°Cでの前記酵素活性と比べて 39°C以上での前記酵素活性が低下する程度を前 記酵素をコードする遺伝子の SNP、挿入および欠失力もなる群力も選ばれる多型を 調べることにより予測することを特徴とする請求項 1に記載の方法。 [4] ミトコンドリアでのエネルギー代謝に関与する各種 Transporter,カル-チン回路、長 鎖 β酸化回路、中鎖'短鎖 |8酸化回路、電子伝達およびケトン体合成のいずれかに 関与する酵素が下記の表に示される中の少なくとも 1種の酵素である、請求項 1に記 載の方法。 [表 1] 酵素の名称 Transporter Tncarboxylate transport protein (TCT) Voltage-depenaent anion channel (VDAC) Adenine nucleotide Transporter (ANT) Carnitine Transporter (CRNT; OCTN2; SLC22A5) Fatty acid plasma membrane transporter (LCFAT) カルニチン回路 Acyl-CoA synthetase (ACS) Carnitine palmitoyltransferase 1 liver form (CPT1A; CPTl) Carnitine palmitoyl transferase 1 muscle form (CPTlb; CPT IB) Carnitine palmitoyl transferase 2 (CPT2) Carnitine/Acylcarnitine translocase (CACTI; SLC25A20) Verylong-chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD) 確 /3酸化回路 TFP mitochondrial trifanctional protein alpha-s bunit (TFP ； HADHA) TFP mitochondrial trifunctional protein beta-subunit (TFP β； HADHB)Long-chain acyl-CoA dehydrogenase (LCAD) 中鎖 ·短鎖酸化回路 Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) Medium-chain acyl-CoA thiolase (MCKAT) Short-chain acyl CoA dehydrogenase (SCAD) Short-chain enoyl_CoA hydratase (SCEH) Short-chain hydroxy ac l- CoA dehydrogenase (SCHAD) Short-chain acyl- CoA thiolase (SCKAT) 電子伝達 Electron Transfer Flavoprotein Alpha subunit； ETFA Electron Transfer Flavoprotein beta subunit； ETFBElectron Transfer Flavoprotein dehydrogenase (ETFDH) NADH-ubiquinone reductase complex (Complex I) Succinate -ubiquinone reductase (Complex II) Ubiquinolxytochrome_c reductase (Complex III) Cytochrome-c oxidase (complex IV) ATP産生 ATP synthase Uncoupling protein (UCP) ケトン体合成 Hydroxymethylglutai l-CoA synthetase 1、 2 (HMGCS 1 or 2； HMGS1 or 2) Hydroxymethylglutaryl-CoA Hgase (HMGCL; HMGL) 前記酵素が、 CPT II, ETFA, ETFB, ETFDH, HADHB, HMGCS, VLCAD, LCADお よび HADHAからなる群カゝら選ばれる少なくとも 1種である請求項 4に記載の方法。 CPT II、 ETFA, ETFB, HADHA, HADHB, HMGCS, VLCAD, LCADおよび ETFDH について、以下の 22種の 1または 2以上の位置、あるいはこれらと連鎖不平衡の関係 にある遺伝子の SNPを検査し、 2以上の遺伝子多型の組み合わせまたはハプロタイ プの組み合わせを利用することを特徴とする、請求項 1に記載の方法： [表 2] 酵素名 SNP位置 CPT2 (EXON4) 1055 CPT2 (EXON4) 1102 ETFA (I TRON10) +642 ETFB (EXON1) ■320 ETFB (EXON3) -113 ETFB (EXON8) 447 ETFB (EXON8) 461 HADHA (EXON6) 474 HADHA (INTRON6) +26 HADHA (INTRON6) +32 HADHA (EXON18) 2519 HADHA (EXON18) 2619 HADHB (EXON2) 4 HADHB (INTRON12) ■14 HADHB (INTRON14) +4 HADHB (INTRON14) •26 HADHB (EXON17) 1607 HMGCS (INTRON8) ■37 HMGCS (INTRON8) +53 VLCAD (INTRON8) +33 LCAD (EXON9) 997 ETFDH (EXON13) 1989 以下の (1)〜(8)の！/、ずれかの SNPの組み合わせを有するか否かを基準として、熱不 安定性フヱノタイプ症のリスクを診断する請求項 1に記載の方法： [表 3] 組合せ 酵素 多型位置 （塩基番号） ジエノタイプ リスク

(1) ETFB 447 大

CPT2 1102 G/A

(2) ETFA +642 C/C 大

ETFB -113 G/T

(3) ETFA +642 C/C 大

CPT2 1055 G/G又は G/T

(4) HADHB 4 -/ACT or ACT/ACT 大

HMGCS ■37 OT or T/T

(5) VLCAD +33 T/G or G/G 大

LCAD 997 A/A

(6) CPT2 1055 T/G又は G/G 大

CPT2 1102 G/A又は A/A

(7) HADHB 4 -/ACT or ACT/ACT 大

ETFDH 1989 G/T

(8) LCAD 997 A/C or C/C 小

HADHA 2619 G/G

HMGCS +53 T/T

[8] 遺伝子多型 (SNP)の検出が、ヌクレオチド直接塩基配列決定法、対立遺伝子特異的 オリゴヌクレオチド (ASO)-ドットプロット分析、一塩基プライマー伸長法、 PCR-単鎖高 次構造多型 (SSCP)分析、 PCR-制限酵素断片長多型 (RFLP)分析、インベーダー法、 定量的リアルタイム PCR検出法および質量分析計を用いた遺伝子多型検出法 (mass array)力 なる群力 選ばれる少なくとも 1つの方法により行われる請求項 1〜7のいず れかに記載の方法。

[9] 前記酵素をコードする遺伝子の SNP、挿入および欠失力 なる群力 選ばれる多型 を、対応する少なくとも 1種のプローブを固定化した固相支持体を用いて測定すること を特徴とする、請求項 3に記載の方法。

[10] ミトコンドリア β酸ィ匕脂肪酸代謝系に関係する酵素の特定の多型の 1種または 2種以 上の組み合わせを検出可能なプライマー、プローブ、 dNTPミックス、逆転写酵素、 D NAポリメラーゼ、緩衝液を含む熱不安定性フエノタイプ症のリスクを診断するための 診断キット。